JP2004504808A

JP2004504808A - Compositions and methods for treatment and diagnosis of prostate cancer

Info

Publication number: JP2004504808A
Application number: JP2001570749A
Authority: JP
Inventors: シュー，ジャンチュン; ディロン，デイビン　シー．; ミッチャム，ジェニファー　エル．; ハーロッカー，スーザン　エル．; ジャン，ユーキウ; カロス，マイケル　ディー．; ファンガー，ゲイリー　リチャード; レッター，マーク　ダブリュ．; ストルク，ジョン　エー．; デイ，クレイグ　エイチ．; ベドビック，トーマス　エス．; カーター，ダリック; リー，サミュエル　エックス．; ワン，エイジュン; スケイキー，ヤシール　エー．ダブリュ．; ヘプラー，ウィリアム　ティー．; ヘンダーソン，ロバート　エー．
Original assignee: コリクサ　コーポレイション
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2001-03-27
Publication date: 2004-02-19
Also published as: WO2001073032A2; WO2001073032A3; EP1311673A2; CA2403909A1; AU2001249549A1

Abstract

癌、特に前立腺癌に治療及び診断のための組成物及び方法が開示される。例示的な組成物は１又は複数の前立腺特異的ポリペプチド、その免疫原性部分、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、及びそのようなポリペプチドを発現する細胞に特異的なＴ細胞、を含んで成る。開示される組成物は、例えば、疾患、特に前立腺癌の診断、予防及び／又は治療のために有用である。Compositions and methods for treating and diagnosing cancer, especially prostate cancer, are disclosed. An exemplary composition comprises one or more prostate-specific polypeptides, immunogenic portions thereof, polynucleotides encoding such polypeptides, antigen presenting cells expressing such polypeptides, and such polypeptides. A T cell specific for the cell expressing the peptide. The disclosed compositions are useful, for example, for the diagnosis, prevention and / or treatment of diseases, especially prostate cancer.

Description

【０００１】
発明の技術分野：
本発明は一般的に、癌、例えば前立腺癌の治療及び診断に関する。本発明はより特定には、前立腺−特異的タンパク質の少なくとも一部を含んで成るポリペプチド、及びそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。そのようなポリペプチド及びポリヌクレオチドは、医薬組成物、例えばワクチン、及び前立腺癌の診断及び処理のための他の組成物において有用である。
【０００２】
発明の背景：
癌は世界中で有意な健康問題である。癌の検出及び治療の進歩が行われて来たが、ワクチン又は他の一般的に好結果をもたらす予防又は処理方法は入手できない。一般的に化学療法又は手術、及び放射線の組み合わせに基づかれる現在の治療は、多くの患者において不適切であることがわかっている。
前立腺癌は、男性問題での最も共通する形の癌であり、そして５０歳以上の男性において３０％の発生率が推定される。圧倒的な臨床学的証拠は、ヒト前立腺癌が骨に転移する性質を有し、そしてその疾病がアンドロゲン難治性状態にアンドロゲン依存性から不可避的に進行し、高められた患者の死亡率を導くように思えることを示す。この一般的疾病は現在、アメリカ合衆国における男性間での癌死亡のうち第２の主要な原因である。
【０００３】
疾病のための治療への相当な研究にもかかわらず、前立腺癌は処理するのに困難なまま存続する。通常、治療は手術及び／又は放射線治療法に基づかれているが、しかしそれらの方法は、有意な割合の患者において無効果である。２種のこれまで同定されている前立腺特異的タンパク質、すなわち前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、及び前立腺（ＰＳＡ）、及び前立腺ホスファターゼ（ＰＡＰ）は、治療及び診断可能性を制限して来た。例えば、ＰＳＡレベルは、前立腺癌の存在と十分に必ずしも相互関係するものではなく、非前立腺患者、例えば良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の割合において陽性である。さらに、ＰＳＡ測定は、前立腺体積と相互関係し、そして転移のレベルを示さない。
【０００４】
それらの及び他の癌についての治療への相当な研究にしてもかかわらず、前立腺癌は、効果的に診断し、そして処理するには困難のまま存続する。従って、そのような癌を検出し、そして処理するための改良された方法についての必要性が当業者に存在する。本発明は、それらの必要性を満たし、そして他の関連する利点をさらに提供する。
【０００５】
発明の要約：
１つの観点においては、本発明は、（ａ）配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２ａｎｄ３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２で提供される配列；
（ｂ）配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２ａｎｄ３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２で提供される配列の相補体；
【０００６】
（ｃ）配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２及び３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２で提供される配列の少なくとも２０の連続した残基から成る配列；
（ｄ）配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２及び３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２で提供される配列に対して、中位の緊縮条件下でハイブリダイズする配列；
【０００７】
（ｅ）配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２及び３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２の配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する配列；
（ｆ）配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２及び３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列；及び
【０００８】
（ｇ）配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２及び３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２で提供される配列の縮重変異体；
から成る群から選択された配列を含んで成るポリヌクレオチド組成物を提供する。
【０００９】
１つの好ましい態様においては、本発明のポリヌクレオチド組成物は、他の正常組織についてのレベルよりも、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、及び最も好ましくは少なくとも約１０倍、高いレベルで、試験される前立腺組織サンプルの少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％及び最も好ましくは少なくとも約５０％で発現される。
もう１つの観点においては、本発明は、上記ポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド組成物を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、配列番号：１１２−１１４，１７２，１７６，１７８，３２７，３２９，３３１，３３６，３３９，３７６−３８０，３８３，４７７−４８３，４９６，５０４，５０５，５１９，５２０，５２２，５２５，５２７，５３２，５３４，５３７−５５１，５５３−５６８，５７３−５８６，５８８−５９０，５９２，７０６−７０８，７７５，７７６，７７８，７８０，７８１，８１１，８１４，８１８，８２６，８２７，８５３，８５５，８５８，８６０−８６２，８６６−８７７，８７９，８８３−８９３，８９５，８９７，８９８，９０９−９１５，９２０−９２８，９３２−９３４，９４０，９４１及び９４３で示される配列から成る群から選択されたアミノ配列を含んで成るポリペプチド組成物を提供する。
一定の好ましい態様においては、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドは、免疫原性であり、すなわちそれらは、本明細書にさらに記載されるように、免疫応答、特に体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘発することができる。
【００１１】
本発明はさらに、開示されるポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド配列のフラグメント、変異体及び／又は誘導体を提供し、ここで前記フラグメント、変異体及び／又は誘導体は好ましくは、１１２−１１４，１７２，１７６，１７８，３２７，３２９，３３１，３３６，３３９，３７６−３８０，３８３，４７７−４８３，４９６，５０４，５０５，５１９，５２０，５２２，５２５，５２７，５３２，５３４，５３７−５５１，５５３−５６８，５７３−５８６，５８８−５９０，５９２，７０６−７０８，７７５，７７６，７７８，７８０，７８１，８１１，８１４，８１８，８２６，８２７，８５３，８５５，８５８，及び８６０−８６２に示されるポリペプチド配列、又は
【００１２】
配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２ａｎｄ３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列の免疫原活性のレベルの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％及びより好ましくは少なくとも約９０％の免疫原活性のレベルを有する。
【００１３】
本発明はさらに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクター、及びそのような発現ベクターにより形質転換されるか又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
他の観点においては、本発明は、上記のようなポリペプチド又はポリヌクレオチド、及び生理学的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物を提供する。
本発明の関連する関する観点においては、予防又は治療用途のための医薬組成物、例えばワクチン組成物が提供される。そのような組成物は一般的に、本発明の免疫原ポリペプチド又はポリヌクレオチド、及び免疫刺激剤、例えばアジュバント、並びに生理学的に許容できるキャリヤーを含んで成る。
【００１４】
本発明はさらに、（ａ）本発明のポリペプチド、又はそのフラグメントに対して特異的に結合する抗体又はその抗原−結合フラグメント；及び（ｂ）生理学的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物を提供する。
さらなる観点において、本発明は、（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提供細胞、及び（ｂ）医薬的に許容できるキャリヤー又は賦形剤を含んで成る医薬組成物を提供する。典型的な抗原提供細胞は、樹状突起細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞及びＢ細胞を包含する。
関連する観点においては、（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提供細胞、及び（ｂ）免疫刺激剤を含んで成る医薬組成物が提供される。
【００１５】
他の観点においては、本発明はさらに、上記のような少なくとも１つのポリペプチドを含んで成る融合タンパク質、及びそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、典型的には、生理学的に許容できるキャリヤー及び／又は免疫刺激剤を含んで成る医薬組成物が提供される。
他の観点においては、本発明はさらに、上記のような少なくとも１つのポリペプチドを含んで成る融合タンパク質、及びそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、典型的には、生理学的に許容できるキャリヤー及び／又は免疫刺激剤を含んで成る医薬組成物、例えばワクチン組成物の形で提供する。融合タンパク質は、上記のような複数の免疫原ポリペプチド又はそのタンパク質／変異体を含んで成り、そしてさらに、ポリペプチドの発現、精製及び／又は免疫原性を促進し、そして／又は増強するための１又は複数のポリペプチドセグメントを含んで成ることができる。
【００１６】
さらなる観点においては、本発明は、患者における免疫応答性、好ましくはヒト患者におけるＴ細胞応答を刺激するための、本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含んで成る方法を提供する。患者は、前立腺癌を有し、この場合、前記方法は疾病の処理を提供し、又はそのような疾病の危険性を有すると思われる患者は予防的に処理され得る。
さらなる観点においては、本発明は、上記のような医薬組成物を患者に投与することを含んで成る、患者における癌の進行を阻害するための方法を提供する。前記患者は前立腺癌を有し、この場合、前記方法は疾病の処理を提供し、又はそのような疾病の危険性を有すると思われる患者は予防的に処理され得る。
【００１７】
他の観点においては、本発明はさらに、本発明のポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞と生物学的サンプルとを接触せしめることを含んで成る、生物学的サンプルから腫瘍細胞を除去するための方法を提供し、ここで前記接触段階は、サンプルからポリペプチドを発現する細胞の除去を可能にするのに十分な条件下で及び十分な時間、行われる。
関連する観点においては、上記のように処理された生物学的サンプルを患者に投与することを含んで成る、患者における癌の進行を阻害するための方法が提供される。
【００１８】
他の観点においては、本発明はさらに、（ａ）（ｉ）本明細書に開示されるポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を含んで成るポリペプチド；（ｉｉ）そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）そのようなポリペプチドを発現する抗原提供細胞の１又は複数の成分と共に、患者から単離されたＣＤ４^＋及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞をインキュベートし；そして（ｂ）有効量の前記増殖されたＴ細胞を、前記患者に投与し、それにより、患者における癌の進行を阻害する段階を含んで成る、患者における癌の進行を阻害するための方法を提供する。増殖された細胞は、患者への投与の前、クローン化され得るが、しかし必ずしも必要ではない。
【００１９】
さらなる観点においては、本発明は、患者における癌、好ましくは前立腺癌の存在又は不在を決定するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルと、上記に示されるポリペプチドに結合する結合剤とを接触せしめ；（ｂ）前記結合剤に結合するポリペプチドの量を、前記サンプルにおいて検出し；そして（ｃ）前記ポリペプチドの量を、前もって決定されたカット−オフ値に比較し、そしてそれから、患者における癌の存在又は不在を決定する段階を含んで成る。好ましくは態様においては、結合剤は、抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２０】
他の観点においては、本発明は、患者における癌の進行をモニターするための方法も提供する。そのような方法は、（ａ）第１の点で患者から得られた生物学的サンプルと、上記のようなポリペプチドに結合する結合剤とを接触せしめ；（ｂ）前記結合剤に結合するポリペプチドの量を、前記サンプルにおいて検出し；（ｃ）続く点で患者から得られた生物学的サンプルを用いて、段階（ａ）及び（ｂ）を反復し；そして（ｄ）段階（ｃ）において検出されたポリペプチドの量と、段階（ｂ）において検出された量とを比較し、そしてそれから、患者における癌の進行をモニターする段階を含んで成る。
【００２１】
他の観点においては、本発明は患者における癌の存在又は不在を決定するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルと、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを接触せしめ；（ｂ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡのレベルをサンプルにおいて検出し；そして（ｃ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルと前もって決定されたカット−オフ値とを比較し、そしてそれから、患者における癌の存在又は在を決定する段階を含んで成る。
【００２２】
一定の態様においては、ｍＲＮＡの量は、例えば本発明のポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドの補体にハイブリダイズする少なくとも１つのオリヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応により検出される。他の態様においては、ｍＲＮＡの量は、本発明のポリヌクレオチド又はそのようなポリヌクレオチドの補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ハイブリダイゼーション技法により検出される。
【００２３】
関連する観点においては、患者における癌の進行をモニターするための方法が提供され、ここで前記方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルと、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを接触せしめ；（ｂ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、前記サンプルにおいて検出し；（ｃ）続く点で患者から得られた生物学的サンプルを用いて、段階（ａ）及び（ｂ）を反復し；そして（ｄ）段階（ｃ）において検出されるポリヌクレオチドの量と、段階（ｂ）において検出される量とを比較し、そしてそれから、患者のおける癌の進行モニターする段階を含んで成る。
【００２４】
さらなる観点においては、本発明は、上記のようなポリペプチドに結合する抗体、例えばモノクローナル抗体、及びそのような抗体を含んで成る診断キットを提供する。上記のような１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを含んで成る診断用キットもまた提供される。
本発明のそれらの及び他の観点は、次の特定の記載に基づいて明らかに成るであろう。本明細書に開示されるすべての引例は、引用により本明細書中に組み込まれる。
【００２５】
配列番号１は、Ｆ１−１３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２は、Ｆ１−１２についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３は、Ｆ１−１２についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４は、Ｆ１−１６についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５は、Ｈ１−１についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号６は、Ｈ１−９についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７は、Ｈ１−４についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８は、Ｊ１−１７についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号９は、Ｊ１−１７についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０は、Ｌ１−１２についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
【００２６】
配列番号１１は、Ｌ１−１２についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２は、Ｎ１−１８６２についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３は、Ｎ１−１８６２についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４は、Ｊ１−１３についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５は、Ｊ１−１３についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６は、Ｊ１−１９についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７は、Ｊ１−１９についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８は、Ｊ１−２５についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９は、Ｊ１−２５についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０は、Ｊ１−２４についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
【００２７】
配列番号２１は、Ｊ１−２４についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２は、Ｋ１−５８についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３は、Ｋ１−５８についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４は、Ｋ１−６３についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５は、Ｋ１−６３についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６は、Ｌ１−４についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７は、Ｌ１−４についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８は、Ｌ１−１４についての決定された５’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９は、Ｌ１−１４についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０は、Ｊ１−１２についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
【００２８】
配列番号３１は、Ｊ１−１６についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２は、Ｊ１−２１についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３は、Ｋ１−４８についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４は、Ｋ１−５５についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５は、Ｌ１−２についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６は、Ｌ１−６についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７は、Ｎ１−１８５８についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８は、Ｎ１−１８６０についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９は、Ｎ１−１８６１についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０は、Ｎ１−１８６４についての決定された３’側ｃＤＮＡ配列である。
【００２９】
配列番号４１は、Ｐ５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２は、Ｐ８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３は、Ｐ９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４は、Ｐ１８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５は、Ｐ２０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６は、Ｐ２９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７は、Ｐ３０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８は、Ｐ３４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９は、Ｐ３６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０は、Ｐ３８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３０】
配列番号５１は、Ｐ３９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２は、Ｐ４２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３は、Ｐ４７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４は、Ｐ４９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５は、Ｐ５０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６は、Ｐ５３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７は、Ｐ５５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８は、Ｐ６０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３１】
配列番号５９は、Ｐ６４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０は、Ｐ６５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１は、Ｐ７３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２は、Ｐ７５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３は、Ｐ７６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４は、Ｐ７９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５は、Ｐ８４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６は、Ｐ６８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７は、Ｐ８０（Ｐ７０４Ｐとしても言及される）についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８は、Ｐ８２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９は、Ｕ１−３０６４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０は、Ｕ１−３０６５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３２】
配列番号７１は、Ｖ１−３６９２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２は、１Ａ−３９０５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３は、Ｖ１−３６８６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４は、Ｒ１−２３３０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５は、１Ｂ−３９７６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６は、Ｖ１−３６７９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７は、１Ｇ−４７３６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８は、１Ｇ−４７３８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７９は、１Ｇ−４７４１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０は、１Ｇ−４７４４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３３】
配列番号８１は、１Ｇ−４７３４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８２は、１Ｈ−４７７４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８３は、１Ｈ−４７８１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８４は、１Ｈ−４７８５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８５は、１Ｈ−４７８７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８６は、１Ｈ−４７９６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８７は、１Ｉ−４８０７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８８は、１Ｉ−４８１０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８９は、１Ｉ−４８１１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９０は、１Ｊ−４８７６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３４】
配列番号９１は、１Ｋ−４８８４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９２は、１Ｋ−４８９６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９３は、１Ｇ−４７６１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９４は、１Ｇ−４７６２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９５は、１Ｈ−４７６６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９６は、１Ｈ−４７７０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９７は、１Ｈ−４７７１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９８は、１Ｈ−４７７２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９９は、１Ｄ−４２９７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１００は、１Ｄ−４３０９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３５】
配列番号１０１は、１Ｄ．１−４２７８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０２は、１Ｄ−４２８８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０３は、１Ｄ−４２８３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０４は、１Ｄ−４３０４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０５は、１Ｄ−４２９６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０６は、１Ｄ−４２８０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０７は、Ｆ１−１２（Ｐ５０４Ｓとしても言及される）についての決定された十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０８は、Ｆ１−１２についての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号１０９は、Ｊ１−１７についての決定された十分な長さのｃＤＮＡ配列である。　配列番号１１０は、Ｌ１−１２（Ｐ５０１Ｓとしても言及される）についての決定された十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
【００３６】
配列番号１１１は、Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓとしても言及される）についての決定された十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１２は、Ｊ１−１７についての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号１１３は、Ｌ１−１２（Ｐ５０１Ｓとしても言及される）についての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号１１４は、Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓとしても言及される）についての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号１１５は、Ｐ８９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１６は、Ｐ９０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１７は、Ｐ９２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１８は、Ｐ９５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１９は、Ｐ９８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２０は、Ｐ１０２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３７】
配列番号１２１は、Ｐ１１０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２２は、Ｐ１１１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２３は、Ｐ１１４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２４は、Ｐ１１５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２５は、Ｐ１１６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２６は、Ｐ１２４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２７は、Ｐ１２６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２８は、Ｐ１３０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２９は、Ｐ１３３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３０は、Ｐ１３８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３８】
配列番号１３１は、Ｐ１４３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３２は、Ｐ１５１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３３は、Ｐ１５６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３４は、Ｐ１５７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３５は、Ｐ１６６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３６は、Ｐ１７６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３７は、Ｐ１７８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３８は、Ｐ１７９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３９は、Ｐ１８５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４０は、Ｐ１９２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３９】
配列番号１４１は、Ｐ２０１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４２は、Ｐ２０４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４３は、Ｐ２０８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４４は、Ｐ２１１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４５は、Ｐ２１３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４６は、Ｐ２１９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４７は、Ｐ２３７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４８は、Ｐ２３９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４９は、Ｐ２４８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５０は、Ｐ２５１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４０】
配列番号１５１は、Ｐ２５５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５２は、Ｐ２５６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５３は、Ｐ２５９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５４は、Ｐ２６０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５５は、Ｐ２６３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５６は、Ｐ２６４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５７は、Ｐ２６６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５８は、Ｐ２７０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５９は、Ｐ２７２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６０は、Ｐ２７８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４１】
配列番号１６１は、Ｐ１０５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６２は、Ｐ１０７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６３は、Ｐ１３７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６４は、Ｐ１９４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６５は、Ｐ１９５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６６は、Ｐ１９６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６７は、Ｐ２２０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６８は、Ｐ２３４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６９は、Ｐ２３５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７０は、Ｐ２４３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４２】
配列番号１７１は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７２は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１についての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号１７３は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７４は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７５は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７６は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１３についての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号１７７は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７８は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１４についての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号１７９は、１Ｇ−４７３６についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８０は、１Ｇ−４７３８についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
【００４３】
配列番号１８１は、１Ｇ−４７４１についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８２は、１Ｇ−４７４４についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８３は、１Ｇ−４７７４についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８４は、１Ｇ−４７８１についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８５は、１Ｇ−４７８５についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８６は、１Ｇ−４７８７についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８７は、１Ｇ−４７９６についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８８は、１Ｇ−４８０７についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８９は、１Ｉ−４８１０についての決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９０は、１Ｉ−４８１１についての決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００４４】
配列番号１９１は、１Ｊ−４８７６についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９２は、１Ｋ−４８４４についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９３は、１Ｋ−４８９６についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９４は、１Ｇ−４７６１についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９５は、１Ｇ−４７６２についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９６は、１Ｈ−４７６６についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９７は、１Ｈ−４７７０についての決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９８は、１Ｈ−４７７１についての決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９９は、１Ｈ−４７７２についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２００は、１Ｄ−４３０９についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
【００４５】
配列番号２０１は、１Ｄ．１−４２７８についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０２は、１Ｄ−４２８８についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０３は、１Ｄ−４２８３についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０４は、１Ｄ−４３０４についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０５は、１Ｄ−４２９６についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０６は、１Ｄ−４２８０についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０７は、１０−ｄ８ｆｗｄについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０８は、１０−ｈ１０ｃｏｎについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０９は、１１−Ｃ８ｒｅｗについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１０は、７．ｇ６ｆｗｄについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４６】
配列番号２１１は、７．ｇ６ｒｅｖについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１２は、８−ｂ５ｆｗｄについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１３は、８−ｂ５ｒｅｖについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１４は、８−ｂ６ｆｗｄについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１５は、８−ｂ６ｒｅｖについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１６は、８−ｄ４ｆｗｄについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１７は、８−ｄ９ｒｅｖについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１８は、８−ｇ３ｆｗｄについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１９は、８−ｇ３ｒｅｖについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２０は、８−ｈ１１ｒｅｖについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４７】
配列番号２２１は、ｇ−ｆ１２ｆｗｄについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２２は、ｇ−ｆ３ｒｅｖについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２３は、Ｐ５０９Ｓについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２４は、Ｐ５１０Ｓについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２５は、Ｐ７０３ＤＥ５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２６は、９−Ａ１１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２７は、８−Ｃ６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２８は、８−Ｈ７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２９は、ＪＰＴＰＮ１３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３０は、ＪＰＴＰＮ１４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４８】
配列番号２３１は、ＪＰＴＰＮ２３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３２は、ＪＰＴＰＮ２４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３３は、ＪＰＴＰＮ２５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３４は、ＪＰＴＰＮ３０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３５は、ＪＰＴＰＮ３４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３６は、ＪＰＴＰＮ３５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３７は、ＪＰＴＰＮ３６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３８は、ＪＰＴＰＮ３８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３９は、ＪＰＴＰＮ３９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４０は、ＪＰＴＰＮ４０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４９】
配列番号２４１は、ＪＰＴＰＮ４１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４２は、ＪＰＴＰＮ４２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４３は、ＪＰＴＰＮ４５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４４は、ＪＰＴＰＮ４６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４５は、ＪＰＴＰＮ５１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４６は、ＪＰＴＰＮ５６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４７は、ＪＰＴＰＮ６４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４８は、ＪＰＴＰＮ６５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４９は、ＪＰＴＰＮ６７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５０は、ＪＰＴＰＮ７６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５０】
配列番号２５１は、ＪＰＴＰＮ８４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５２は、ＪＰＴＰＮ８５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５３は、ＪＰＴＰＮ８６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５４は、ＪＰＴＰＮ８７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５５は、ＪＰＴＰＮ８８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５６は、ＪＰ１Ｆ１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５７は、ＪＰ１Ｆ２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５８は、ＪＰ１Ｃ２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５９は、ＪＰ１Ｂ１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６０は、ＪＰ１Ｂ２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５１】
配列番号２６１は、ＪＰ１Ｄ３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６２は、ＪＰ１Ａ４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６３は、ＪＰ１Ｆ５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６４は、ＪＰ１Ｅ６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６５は、ＪＰ１Ｄ６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６６は、ＪＰ１Ｂ１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６７は、ＪＰ１Ａ６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６８は、ＪＰ１Ｅ８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６９は、ＪＰ１Ｄ７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７０は、ＪＰ１Ｄ９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５２】
配列番号２７１は、ＪＰ１Ｃ１０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７２は、ＪＰ１Ａ９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７３は、ＪＰ１Ｆ１２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７４は、ＪＰ１Ｅ１２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７５は、ＪＰ１Ｄ１１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７６は、ＪＰ１Ｃ１１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７７は、ＪＰ１Ｃ１２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７８は、ＪＰ１Ｂ１２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７９は、ＪＰ１Ａ１２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８０は、ＪＰ８Ｇ２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５３】
配列番号２８１は、ＪＰ８Ｈ１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８２は、ＪＰ８Ｈ２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８３は、ＪＰ８Ａ２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８４は、ＪＰ８Ａ４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８５は、ＪＰ８Ｃ３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８６は、ＪＰ８Ｇ４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８７は、ＪＰ８Ｂ６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８８は、ＪＰ８Ｄ６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８９は、ＪＰ８Ｆ５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９０は、ＪＰ８Ａ８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５４】
配列番号２９１は、ＪＰ８Ｃ７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９２は、ＪＰ８Ｄ７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９３は、ＪＰ８Ｄ８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９４は、ＪＰ８Ｅ７についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９５は、ＪＰ８Ｆ８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９６は、ＪＰ８Ｇ８についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９７は、ＪＰ８Ｂ１０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９８は、ＪＰ８Ｃ１０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９９は、ＪＰ８Ｅ９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３００は、ＪＰ８Ｅ１０についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５５】
配列番号３０１は、ＪＰ８Ｆ９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０２は、ＪＰ８Ｈ９についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０３は、ＪＰ８Ｃ１２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０４は、ＪＰ８Ｅ１１についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０５は、ＪＰ８Ｅ１２についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０６は、ペプチドＰＳ２＃１２についてのアミノ酸配列である。
配列番号３０７は、Ｐ７１１Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０８は、Ｐ７１２Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０９は、ＣＬＯＮＥ２３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１０は、Ｐ７７４Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５６】
配列番号３１１は、Ｐ７７５Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１２は、Ｐ７１５Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１３は、Ｐ７１０Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１４は、Ｐ７６７Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１５は、Ｐ７６８Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１６−３２５は、前もって単離された遺伝子の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２６は、Ｐ７０３ＰＤＥ５についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２７は、Ｐ７０３ＰＤＥ５についての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３２８は、Ｐ７０３Ｐ６．２６についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２９は、Ｐ７０３Ｐ６．２６についての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３０は、Ｐ７０３ＰＸ−２３についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５７】
配列番号３３１は、Ｐ７０３ＰＸ−２３についての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３２は、Ｐ５０９Ｓについての決定された十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３３は、Ｐ７０７Ｐ（１１−Ｃ９としても言及される）についての決定された延長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３４は、Ｐ７１４Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３５は、Ｐ７０５Ｐ（９−Ｆ３としても言及される）についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３６は、Ｐ７０５Ｐについての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３７は、ペプチドＰ１Ｓ＃１０のアミノ酸配列である。
配列番号３３８は、ペプチドｐ５のアミノ酸配列である。
配列番号３３９は、Ｐ５０９Ｓについての予測されるアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号３４０は、Ｐ７７８Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４１は、Ｐ７８６Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４２は、Ｐ７８９Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４３は、ホモサピエンスＭＭ４６ｍＲＮＡに対する相同性を示すクローンのための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４４は、ホモサピエンスＴＮＦ−α刺激されたＡＢＣタンパク質（ＡＢＣ５０）ｍＲＮＡに対する相同性を示すクローンのための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４５は、Ｅ−カドヘリンに関してホモサピエンスｍＲＮＡに対する相同性を示すクローンのための決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５９】
配列番号３４６は、ヒト核−コードされたミトコンドリアセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）に対する相同性を示すクローンのための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４７は、ホモサピエンス天然耐性−関連マクロファージタンパク質２（ＮＲＡＭＰ２）に対する相同性を示すクローンのための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４８は、ホモサピエンスホスホグルコムターゼ−関連タンパク質（ＰＧＭＲＰ）に対する相同性を示すクローンのための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４９は、プロテオソームサブユニットｐ４０に関してヒトｍＲＮＡに対する相同性を示すクローンのための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５０は、Ｐ７７７Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６０】
配列番号３５１は、Ｐ７７９Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５２は、Ｐ７９０Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５３は、Ｐ７８４Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５４は、Ｐ７７６Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５５は、Ｐ７８０Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５６は、Ｐ５４４Ｓについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５７は、Ｐ７４５Ｓについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５８は、Ｐ７８２Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５９は、Ｐ７８３Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６０は、未知の１７９８４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６１】
配列番号３６１は、Ｐ７８７Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６２は、Ｐ７８８Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６３は、未知の１７９９４についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６４は、Ｐ７８１Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６５は、Ｐ７８５Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６６−３７５は、Ｂ３０５Ｄのスプライス変異体についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７６は、配列番号３６６によりコードされる予測されるアミノ酸配列配列である。
配列番号３７７は、配列番号３７２によりコードされる予測されるアミノ酸配列配列である。
【００６２】
配列番号３７８は、配列番号３７８によりコードされる予測されるアミノ酸配列配列である。
配列番号３７９は、配列番号３７４によりコードされる予測されるアミノ酸配列配列である。
配列番号３８０は、配列番号３７５によりコードされる予測されるアミノ酸配列配列である。
配列番号３８１は、Ｂ７１６Ｐについての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８２は、Ｐ７１１Ｐについての決定された十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
【００６３】
配列番号３８３は、Ｐ７１１Ｐについての予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３８４は、Ｐ１０００ＣについてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８５は、ＣＧＩ−８２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８６は、２３３２０についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８７は、ＣＧＩ−６９についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８８は、Ｌ−イジトール−２−デヒドロゲナーゼについてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８９は、２３３７９についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９０は、２３３８１についてのｃＤＮＡ配列である。
【００６４】
配列番号３９１は、ＫＩＡＡ０１２２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９２は、２３３９９についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９３は、前もって同定された遺伝子についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９４は、ＨＣＬＢＰについてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９５は、トランスグルタミナーセについてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９６は、前もって同定された遺伝子についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９７は、ＰＡＰについてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９８は、Ｅｔｓ転写因子ＰＤＥＦＰについてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９９は、ｈＴＧＲについてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４００は、ＫＩＡＡ０２９５についてのｃＤＮＡ配列である。
【００６５】
配列番号４０１は、２２５４５についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０２は、２２５４７についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０４は、２２５５０についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０５は、２２５５１についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０６は、２２５５２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０７は、２２５５３（Ｐ１０２０Ｃとしても言及される）についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０８は、２２５５８についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０９は、２２５６２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１０は、２２５６５についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０８は、２２５５８についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０９は、２２５６２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１０は、２２５６５についてのｃＤＮＡ配列である。
【００６６】
配列番号４１１は、２２５６７についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１２は、２２５６８についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１３は、２２５７０についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１４は、２２５７１についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１５は、２２５７２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１６は、２２５７３についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１７は、２２５７３についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１８は、２２５７５についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１９は、２２５８０についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２０は、２２５８１についてのｃＤＮＡ配列である。
【００６７】
配列番号４２１は、２２５８２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２２は、２２５８３についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２３は、２２５８４についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３４は、２２５８５についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２５は、２２５８６についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２６は、２２５８７についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２７は、２２５８８についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２８は、２２５８９についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２９は、２２５９０についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３０は、２２５９１についてのｃＤＮＡ配列である。
【００６８】
配列番号４３１は、２２５９２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３２は、２２５９３についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３３は、２２５９４についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３４は、２２５９５についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３５は、２２５９６についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３６は、２２８４７についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３７は、２２８４８についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３８は、２２８４９についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３９は、２２８５１についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４０は、２２８５２についてのｃＤＮＡ配列である。
【００６９】
配列番号４４１は、２２８５３についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４２は、２２８５４についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４３は、２２８５５についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４４は、２２８５６についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４５は、２２８５７についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４６は、２３６０１についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４７は、２３６０２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４８は、２３６０５についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４９は、２３６０６についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５０は、２３６１２についてのｃＤＮＡ配列である。
【００７０】
配列番号４５１は、２３６１４についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５２は、２３６１８についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５３は、２３６２２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５４は、葉酸ヒドロラーゼについてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５５は、ＬＩＭタンパク質についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５６は、既知の遺伝子についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５７は、既知の遺伝子についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５８は、前もって同定された遺伝子についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５９は、２３０４５についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６０は、２３０３２についてのｃＤＮＡ配列である。
【００７１】
配列番号４６１は、クローン２３０５４についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６２−４６７は、既知の遺伝子についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６８−４７１は、Ｐ７１０ＰについてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７２は、Ｐ１００１ＣについてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７３は、Ｐ７７５Ｐ（２７５０５としても言及される）の第１のスプライス変異体についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７４は、Ｐ７７５Ｐ（１９９４７としても言及される）の第２のスプライス変異体についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７５は、Ｐ７７５Ｐ（１９９４１としても言及される）の第３のスプライス変異体についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７２】
配列番号４７６は、Ｐ７７５Ｐ（１９９３７としても言及される）の第４のスプライス変異体についての決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７７は、配列番号４７４によりコードされる第１の予測されるアミノ酸配列である。
配列番号４７８は、配列番号４７４によりコードされる第２の予測されるアミノ酸配列である。
配列番号４７９は、配列番号４７５によりコードされる予測されるアミノ酸配列である。
配列番号４８０は、配列番号４７３によりコードされる第１の予測されるアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号４８１は、配列番号４７３によりコードされる第２の予測されるアミノ酸配列である。
配列番号４８２は、配列番号４７３によりコードされる第３の予測されるアミノ酸配列である。
配列番号４８３は、配列番号４７３によりコードされる第４の予測されるアミノ酸配列である。
配列番号４８４は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２の最初の３０個のアミノ酸である。
配列番号４８５は、ＰＣＲプライマーＡＷ０２５である。
配列番号４８６は、ＰＣＲプライマーＡＷ００３である。
配列番号４８７は、ＰＣＲプライマーＡＷ０２７である。
配列番号４８８は、ＰＣＲプライマーＡＷ０２６である。
配列番号４８９−５０１は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである。
【００７４】
配列番号５０２は、抗−Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体２０Ｄ４のための相補性決定領域の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０３は、抗−Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体Ｊａ１のための相補性決定領域の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０４＆５０５は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである。
配列番号５０６は、抗−Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体８Ｈ２のための相補性決定領域の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０７は、抗−Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体７Ｈ８のための相補性決定領域の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０８は、抗−Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体２Ｄ４のための相補性決定領域の決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７５】
配列番号５０９−５２２は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである。
配列番号５２３は、Ｐ７０３Ｐに対する抗体を生ぜしめるために使用されるＰ７０３Ｐの成熟形である。
配列番号５２４は、Ｐ７０３Ｐの推定上の十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２５は、配列番号５２４によりコードされる推定上のアミノ酸配列である。
配列番号５２６は、Ｐ７９０Ｐの十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２７は、Ｐ７９０Ｐの予測されるアミノ酸配列である。
配列番号５２８＆５２９は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号５３０は、配列番号３６６のスプライス変異体のｃＤＮＡ配列である。
【００７６】
配列番号５３１は、配列番号５３０の読み取り枠のｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３２は、配列番号５３１の配列によりコードされる予測されるアミノ酸である。
配列番号５３３は、Ｐ７７５Ｐの推定上のＯＲＦのＤＮＡ配列である。
配列番号５３４は、配列番号５３３によりコードされる予測されるアミノ酸配列である。
配列番号５３５は、Ｐ５１０Ｓのための第１の十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３６は、Ｐ５１０Ｓのための第２の十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３７は、配列番号５３５によりコードされる予測されるアミノ酸配列である。
配列番号５３８は、配列番号５３６によりコードされる予測されるアミノ酸配列である。
配列番号５３９は、ペプチドＰ５０１Ｓ−３７０である。
配列番号５４０は、ペプチドＰ５０１Ｓ−３７６である。
【００７７】
配列番号５４１−５５１は、Ｐ５０１Ｓのエピトープである。
配列番号５５２は、Ｐ７１２Ｐのための延長されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５３−５６８は、配列番号５５２内の予測される読み取り枠によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５６９は、Ｐ７７６Ｐのための延長されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７０は、コンチグ６として言及されるＰ７７６Ｐのスプライス変異体のための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７１は、コンチグ７として言及されるＰ７７６Ｐのスプライス変異体のための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７２は、コンチグ１４として言及されるＰ７７６Ｐのスプライス変異体のための決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７８】
配列番号５７３は、配列番号５７０の第１の予測されるＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５７４は、配列番号５７０の第２の予測されるＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５７５は、配列番号５７１の予測されるＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５７６−５８６は、配列番号５６９の予測されるＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５８７は、Ｐ７６７Ｐ及びＰ７７７Ｐの配列のＤＮＡコンセンサス配列である。
配列番号５８８−５９０は、配列番号５８７の予測されるＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号５９１は、Ｐ１０２０Ｃのための延長されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９２は、配列番号Ｐ１０２０Ｃの配列によりコードされる予測されるアミノ酸配列である。
配列番号５９３は、５０７４８として言及されるＰ７７５Ｐのスプライス変異体である。
配列番号５９４は、５０７１７として言及されるＰ７７５Ｐのスプライス変異体である。
配列番号５９５は、４５９８５として言及されるＰ７７５Ｐのスプライス変異体である。
配列番号５９６は、３８７６９として言及されるＰ７７５Ｐのスプライス変異体である。
配列番号５９７は、３７９２２として言及されるＰ７７５Ｐのスプライス変異体である。
配列番号５９８は、４９２７４として言及されるＰ５１０Ｓのスプライス変異体である。
配列番号５９９は、３９４８７として言及されるＰ５１０Ｓのスプライス変異体である。
配列番号６００は、５１６７．１６として言及されるＰ５０４Ｓのスプライス変異体である。
【００８０】
配列番号６０１は、５１６７．１として言及されるＰ５０４Ｓのスプライス変異体である。
配列番号６０２は、５１６３．４６として言及されるＰ５０４Ｓのスプライス変異体である。
配列番号６０３は、５１６３．４２として言及されるＰ５０４Ｓのスプライス変異体である。
配列番号６０４は、５１６３．３４として言及されるＰ５０４Ｓのスプライス変異体である。
配列番号６０５は、５１６３．１７として言及されるＰ５０４Ｓのスプライス変異体である。
配列番号６０６は、１０６４０として言及されるＰ５０１Ｓのスプライス変異体である。
配列番号６０１−６１５は、ＰＣＲプライマーの配列である。
配列番号６１６は、Ｐ７０３Ｐ及びＰＳＡの融合体の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１７は、Ｐ７０３Ｐ及びＰＳＡの融合体のアミノ酸配列である。
配列番号６１８−６８９は、前立腺−特異的クローンの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９０は、遺伝子ＤＤ３のｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９１−６９７は、前立腺−特異的クローンの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９８は、Ｐ７１４Ｐのための延長されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９９−７０１は、Ｐ７０４Ｐのスプライス変異体のためのｃＤＮＡ配列である。
【００８１】
配列番号７０２は、Ｐ５５３Ｓ−１４として言及されるＰ５５３Ｓのスプライスされた変異体のｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０３は、Ｐ５５３Ｓ−１２として言及されるＰ５５３Ｓのスプライスされた変異体のｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０４は、Ｐ５５３Ｓ−１０として言及されるＰ５５３Ｓのスプライスされた変異体のｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０５は、Ｐ５５３Ｓ−６として言及されるＰ５５３Ｓのスプライスされた変異体のｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０６は、配列番号７０５によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７０７は、配列番号７０２によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７０８は、配列番号７０２によりコードされる第２のアミノ酸配列である。
配列番号７０９−７７２は、前立腺−特異的クローンの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７３は、前立腺−特異的トランスグルタミナーゼ遺伝子（Ｐ５５８Ｓとしても言及される）のための第１の十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
【００８２】
配列番号７７４は、前立腺−特異的トランスグルタミナーゼ遺伝子のための第２の十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７５は、配列番号７７３の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７７６は、配列番号７７４の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７７７は、Ｐ７８８Ｐのための十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７８は、配列番号７７７の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７７９は、Ｐ７８８Ｐの多形変異体のための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８０は、配列番号７７９の配列によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７８１は、Ｐ７０３Ｐからのペプチド４のアミノ酸配列である。
配列番号７８２は、Ｐ７０３Ｐからのペプチド４をコードするｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８３−７９８は、Ｐ７０３ＰのエピトープをコードするｃＤＮＡ配列である。
【００８３】
配列番号７９９−８１４は、Ｐ７０３Ｐのエピトープのアミノ酸配列である。
配列番号８１５及び８１６は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号８１７は、Ｅ．コリにおいて発現されるＰ７８８ＰのＮ−末端部分をコードするｃＤＮＡ配列である。
配列番号８１８は、Ｅ．コリにおいて発現されるＰ７８８ＰのＮ−末端部分のアミノ酸配列である。
配列番号８１９は、Ｍ．ツベルクロシス抗原Ｒａ１２のアミノ酸配列である。
配列番号８２０及び８２１は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号８２２は、Ｒａ１２−Ｐ５１０Ｓ−Ｃ構造体のためのｃＤＮＡ配列である。
配列番号８２３は、Ｐ５１０Ｓ−Ｃ構造体のためのｃＤＮＡ配列である。
【００８４】
配列番号８２４は、Ｐ５１０Ｓ−Ｅ３構造体のためのｃＤＮＡ配列である。
配列番号８２５は、Ｒａ１２−Ｐ５１０Ｓ−Ｃ構造体のためのアミノ酸配列である。
配列番号８２６は、Ｐ５１０Ｓ−Ｃ構造体のためのアミノ酸配列である。
配列番号８２７は、Ｐ５１０Ｓ−Ｅ３構造体のためのアミノ酸配列である。
配列番号８２８−８３３は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号８３４は、Ｒａ１２−Ｐ７７５Ｐ−ＯＲＦ３構造体のためのｃＤＮＡ配列である。
配列番号８３５は、Ｒａ１２−Ｐ７７５Ｐ−ＯＲＦ３構造体のためのアミノ酸配列である。
配列番号８３６及び８３７は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号８３８は、Ｐ７０３ＰＨｉｓ標識融合タンパク質のための決定されたアミノ酸配列である。
【００８５】
配列番号８３９は、Ｐ７０３ＰＨｉｓ標識融合タンパク質のための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８４０及び８４１は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号８４２は、Ｐ７０５ＰＨｉｓ標識融合タンパク質のための決定されたアミノ酸配列である。
配列番号８４３は、Ｐ７０５ＰＨｉｓ標識融合タンパク質のための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８４４及び８４５は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号８４６は、Ｐ７１１ＰＨｉｓ標識融合タンパク質のための決定されたアミノ酸配列である。
配列番号８４７は、Ｐ７１１ＰＨｉｓ標識融合タンパク質のための決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８６】
配列番号８４８は、Ｍ．ツベルクロシス抗原Ｒａ１２のアミノ酸配列である。
配列番号８４９及び８５０は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号８５１は、Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｅ２構造体のための決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８５２は、Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｅ２構造体のための決定されたアミノ酸配列である。
配列番号８５３は、Ｐ５０１Ｓのエピトープのためのアミノ酸配列である。
配列番号８５４は、配列番号８５３をコードするＤＮＡ配列である。
配列番号８５５は、Ｐ５０１Ｓのエピトープのためのアミノ酸配列である。
配列番号８５６は、配列番号８５５をコードするＤＮＡ配列である。
配列番号８５７は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである。
配列番号８５８は、Ｐ５０１Ｓのエピトープのためのアミノ酸配列である。
【００８７】
配列番号８５９は、配列番号８５８をコードするＤＮＡ配列である。
配列番号８６０−８６２は、Ｐ５０１ＳのＣＤ４エピトープのアミノ酸配列である。
配列番号８６３−８６５は、配列番号８６０−８６２の配列をコードするＤＮＡ配列である。
配列番号８６６−８７７は、Ｐ７０３Ｐの推定上のＣＴＬエピトープのためのアミノ酸配列である。
配列番号８７８は、Ｐ７８９Ｐのための十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号８７９は、配列番号８７８によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号８８０は、コンチグ６として言及されるＰ７７６Ｐのスプライス変異体のための決定された十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号８８１−８８２は、コンチグ７として言及されるＰ７７６Ｐのスプライス変異体のための決定された十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号８８３−８８７は、配列番号８８０によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号８８８−８９３は、コンチグ７として言及されるＰ７７６Ｐのスプライス変異体によりコードされるアミノ酸配列である。
【００８８】
配列番号８９４は、ヒトトランスメンブランプロテアーゼセリン２のための十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号８９５は、配列番号８９４によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号８９６は、ヒトトランスメンブランプロテアーゼセリン２の最初の２０９個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列である。
配列番号８９７は、ヒトトランスメンブランプロテアーゼセリン２の最初の２０９個のアミノ酸である。
配列番号８９８は、Ｐ５０１Ｓのペプチド２９６−３２２のアミノ酸配列である。
配列番号８９９−９０２は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号９０３は、Ｐ５０１Ｓ−特異的Ｔ細胞クローン４Ｅ５のためのＴ細胞受容体のＶｂ鎖の決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８９】
配列番号９０４は、Ｐ５０１Ｓ−特異的Ｔ細胞クローン４Ｅ５のためのＴ細胞受容体のＶａ鎖の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９０５は、配列番号９０３によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号９０６は、配列番号９０４によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号９０７は、停止コドンを包含するＰ７６８Ｐのための十分な長さの読み取り枠である。
配列番号９０８は、停止コドンを有さないＰ７６８Ｐのための十分な長さの読み取り枠である。
配列番号９０９は、配列番号９０８によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号９１０−９１５は、Ｐ７６８Ｐの予測されるドメインのためのアミノ酸配列である。
【００９０】
配列番号９１６は、Ｐ８３５Ｐの十分な長さのｃＤＮＡである。
配列番号９１７は、前もって同定されたクローンＦＬＪ１３５８１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９１８は、停止コドンを包含するＰ８３５Ｐのための読み取り枠のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９１９は、停止コドンを有さないＰ８３５Ｐのための読み取り枠のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９２０は、Ｐ８３５Ｐのための十分な長さのアミノ酸配列である。
配列番号９２１−９２８は、Ｐ８３５Ｐの細胞外及び細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
【００９１】
配列番号９２９は、Ｐ１０００Ｃのための十分な長さのｃＤＮＡ配列である。
配列番号９３０は、停止コドンを包含するＰ１０００Ｃのための読み取り枠のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９３１は、停止コドンを有さないＰ１０００Ｃのための読み取り枠のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９３２は、Ｐ１０００Ｃのための十分な長さのアミノ酸配列である。
配列番号９３３は、配列番号９３２のアミノ酸１−１００である。
配列番号９３４は、配列番号９３２のアミノ酸１００−４９２である。
配列番号９３５−９３７は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号９３８は、発現された十分な長さのＰ７６７Ｐコード領域のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９３９は、発現された端が切られたＰ７６７Ｐコード領域のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９４０は、配列番号９３９によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号９４１は、配列番号９３８によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号９４２は、Ｐ７０３ＰのＣＤ４エピトープのＤＮＡ配列である。
配列番号９４３は、Ｐ７０３ＰのＣＤ４エピトープのアミノ酸配列である。
【００９２】
発明の特定の記載：
本発明は、一般的に、癌、特に前立腺癌の治療及び診断のための組成物及びそれらの用途に向けられる。さらに下記で記載されるように、本発明の典型的な組物は、ポリペプチド、特に免疫原性ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体及び他の結合剤、抗原提供細胞（ＡＰＣ）及び免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）を含むが、但しそれだけには限定されない。
【００９３】
本発明の実施は、特にことわらない限り、ウィルス学、免疫学、微生物学、分子生物学及び組換えＤＮＡ技法の従来の方法を使用し、それらの多くは、例示目的のために下記に記載される。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，など．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓなど．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこ。
本明細書に引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、引用により本明細書に組み込まれる。
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形は、特にことわらない限り、複数形も包含する。
【００９４】
ポリペプチド組成物：
本明細書において使用される場合、用語“ポリペプチド”とは、その従来の意味で、すなわちアミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは、特定の長さの生成物に限定されず；従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質はポリペプチドの定義内に包含され、そしてそのような用語は、特にことわらない限り、本明細書においては、交換可能的に使用され得る。この用語は、ポリペプチドの後−発現修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化及び同様のもの、並びに当業界において知られている他の修飾（天然に存在し、及び天然に存在しない）を言及せず、又は排除する。ポリペプチドは、完全なタンパク質又はその副配列であり得る。本発明において興味ある特定のポリペプチドは、エピトープを含んで成るアミノ酸副配列、すなわちポリペプチドの免疫原性質を実質的に担当し、そして免疫応答を誘発できる抗原決定基である。
【００９５】
本発明の特に典型的なポリペプチドは、配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２及び３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、又は配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２及び３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に対して、
【００９６】
中位の緊縮条件下で、又は他方では、高い緊縮条件下でハイブリダイズする配列によりコードされるそれらのポリペプチドを含んで成る。特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号：１１２−１１４，１７２，１７６，１７８，３２７，３２９，３３１，３３６，３３９，３７６−３８０，３８３，４７７−４８３，４９６，５０４，５０５，５１９，５２０，５２２，５２５，５２７，５３２，５３４，５３７−５５１，５５３−５６８，５７３−５８６，５８８−５９０，５９２，７０６−７０８，７７５，７７６，７７８，７８０，７８１，８１１，８１４，８１８，８２６，８２７，８５３，８５５，８５８，８６０−８６２，８６６−８７７，８７９，８８３−８９３，８９５，８９７，８９８，９０９−９１５，９２０−９２８，９３２−９３４，９４０，９４１及び９４３のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を含んで成る。
【００９７】
本発明のポリペプチドは時々、それらの同定が、前立腺組織サンプルにおけるそれらの高められた発現レベルに少なくとも一部、基づかれている表示として、前立腺−特異的タンパク質又は前立腺−特異的ポリペプチドとして本明細書において定義される。従って、“前立腺−特異的ポリペプチド”又は“前立腺−特異的タンパク質”は一般的に、本明細書において提供される代表的アッセイを用い決定される場合、他の正常な組織における発現のレベルよりも、少なくとも２倍、及び好ましくは少なくとも５倍、高いレベルで、前立腺組織サンプルの実質的な割合で、例えば試験される前立腺組織サンプルの好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、及び最も好ましくは約５０％以上で発現される、本発明のポリペプチド配列、又はそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を言及する。腫瘍細胞における発現のその高められたレベルに基づいての本発明の前立腺―特異的ポリペプチド配列は、下記にさらに記載されるように、診断マーカー及び治療標的物として特に使用される。
【００９８】
一定の好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、免疫原性であり、すなわち、それらは前立腺癌を有する患者からの抗血清及び／又はＴ−細胞と、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ又はＴ−細胞刺激アッセイ）内で検出可能的に反応する。免疫原活性についてのスクリーニングは、当業者に良く知られている技法を用いて行われ得る。例えば、そのようなスクリーニングは、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨｕｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載されるそれらの方法を用いて行われ得る。１つの典型的な例においては、ポリペプチドが、固体支持体上に固定され、そして固定されたポリペプチドへの血清内の抗体の結合を可能にするために、患者の血清と接触せしめられ得る。次に、未結合の血清が除去され、そして結合された抗体が、例えば^１２５Ｉ−ラベルされたタンパク質Ａを用いて検出される。
【００９９】
当業者により認識されるように、本明細書に開示されるポリペプチドの免疫原性部分はまた、本発明により包含される。“免疫原性部分”とは、本明細書において使用される場合、ポリペプチドを認識するＢ−細胞及び／又はＴ−細胞表面抗原受容体とそれ自体、免疫学的に反応する（すなわち、特異的に結合する）、本発明の免疫原性ポリペプチドのフラグメントである。免疫原性部分は一般的に、良く知られている技法、例えばＰａｕｌ，ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３^ｒｄｅｄ．，２４３−２４７（ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，１９９３）及びそこに引用される文献に要約されるそれらの技法を用いて同定され得る。
【０１００】
そのような技法は、抗原−特異的抗体、抗血清及び／又はＴ−細胞系又はクローンと反応する能力についてのポリペプチドのスクリーニングを包含する。本明細書において使用される場合、抗血清及び抗体は、それらが抗原に対して特異的に結合する場合（すなわち、それらがＥＬＩＳＡ又は他のイムノアッセイにおいてタンパク質と反応し、そして関係ないタンパク質と検出できるほど反応しない場合）、“抗原−特異的”である。そのような抗血清及び抗体は、本明細書に記載されるようにして、及び良く知られている技法を用いて調製され得る。
【０１０１】
１つの好ましい態様においては、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、十分な長さのポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルで抗血清及び／又はＴ−細胞と反応する部分である（例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴ−細胞反応アッセイにおいて）。好ましくは、免疫性部分の免疫原活性のレベルは、十分な長さのポリペプチドについての免疫原性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％及び最も好ましくは約９０％以上である。多くの場合、例えば約１００％又は１５０％、もしくはそれ以上の免疫原活性を有する、その対応する十分な長さのポリペプチドの免疫原活性よりも高いレベルの免疫原活性を有する好ましい免疫原性部分が同定されるであろう。
【０１０２】
一定の他の態様においては、典型的な免疫原性部分は、Ｎ−末端リーダー配列及び／又はトランスメンブランドメインが欠失されているペプチドを包含することができる。他の典型的な免疫原性部分は、成熟タンパク質に対して、小さなＮ−及び／又はＣ−末端欠失（例えば、１〜３０個のアミノ酸、好ましくは５〜１５個のアミノ酸）を含むであろう。
もう１つの態様においては、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチド、特に本明細書に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はその免疫性フラグメント又は変異体に対して生成されたＴ細胞及び／又は抗体と免疫学的に反応する１又は複数のポリペプチドを含んで成ることができる。
【０１０３】
本発明のもう１つの態様においては、本明細書に記載される１又は複数のポリペプチドと免疫学的に反応するＴ細胞及び／又は抗体を誘発することができる１又は複数のポリペプチド、又は本明細書に開示されるポリヌクレオチド、又はその免疫原性フラグメント又は変異体に含まれる連続した核酸配列、又は中位〜高い緊縮の条件下で１又は複数のそれらの核酸配列に対してハイブリダイズする１又は複数の核酸配列によりコードされる１又は複数のポリペプチドを含んで成るポリペプチドが提供される。
【０１０４】
もう１つの観点においては、本発明は、本明細書に示されるポリペプチド組成物の少なくとも約５，１０，１５，２０，２５，５０又は１００個、又はそれ以上の、例えばすべて中間の長さのアミノ酸、例えば配列番号：１１２−１１４，１７２，１７６，１７８，３２７，３２９，３３１，３３６，３３９，３７６−３８０，３８３，４７７−４８３，４９６，５０４，５０５，５１９，５２０，５２２，５２５，５２７，５３２，５３４，５３７−５５１，５５３−５６８，５７３−５８６，５８８−５９０，５９２，７０６−７０８，７７５，７７６，７７８，７８０，７８１，８１１，８１４，８１８，８２６，８２７，８５３，８５５，８５８，８６０−８６２，８６６−８７７，８７９，８８３−８９３，８９５，８９７，８９８，９０９−９１５，９２０−９２８，９３２−９３４，９４０，９４１及び９４３で示されるそれらのもの、又は配列番号：１−１１１，１１５−１７１，１７３−１７５，１７７，１７９−３０５，３０７−３１５，３２６，３２８，３３０，３３２−３３５，３４０−３７５，３８１，３８２及び３８４−４７６，５２４，５２６，５３０，５３１，５３３，５３５，５３６，５５２，５６９−５７２，５８７，５９１，５９３−６０６，６１８−７０５，７０９−７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０−８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６−９１９，９２９−９３１，９３８，９３９及び９４２の配列で示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるそれらのものを含んで成るポリペプチドフラグメントを提供する。
【０１０５】
もう１つの観点においては、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド組成物の変異体を提供する。一般的に本発明により包含されるポリペプチド変異体は典型的には、本明細書に示されるポリペプチド配列に対して、その長さにそって、少なくとも約７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％又は９９％又はそれ以上の同一性（下記のようにして決定される）を示すであろう。
１つの好ましい態様においては、本発明により提供されるポリペプチドフラグメント及び変異体は、本明細書に特異的に示される十分な長さのポリペプチドと反応する抗体及び／又はＴ−細胞と免疫学的に反応する。
【０１０６】
もう１つの好ましい態様においては、本発明により提供されるポリペプチドフラグメント及び変異体は、本明細書に特異的に示される十分な長さのポリペプチドにより示されるレベルの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％及び最も好ましくは少なくとも約９０％又はそれ以上の免疫原活性のレベルを示す。
ポリペプチド“変異体”とは、本明細書において使用される場合、１又は複数の置換、欠失、付加及び／又は挿入により、本明細書に特異的に開示されるポリペプチドとは典型的に異なるポリペプチドである。そのような変異体は、天然に存在することができ、又は例えば本発明の上記１又は複数のポリペプチド配列の修飾、及び当業界において良く知られている多くの技法のいずれかを用いての、本明細書に記載されるようなそれらの免疫原活性の評価により合成的に生成され得る。
【０１０７】
例えば、本発明のポリペプチドの１つの典型的な変異体は、１又は複数の部分、例えばＮ−末端リーダー配列又はトランスメンブランドメインが除去されているそれらのものを包含する。他の典型的な変異体は、小さな部分（例えば、１〜３０個のアミノ酸、好ましくは５〜１５個のアミノ酸）が成熟タンパク質のＮ−及び／又はＣ−末端から除去されている変異体を包含する。
【０１０８】
多くの場合、変異体は保存性置換を含むであろう。“保存性置換”は、ペプチド化学の当業者が実質的に変更されていないポリペプチドの二次構造及び水治療性質を予測できるように、１つのアミノ酸が、類似する性質を有するもう１つのアミノ酸により置換されている置換である。上記に記載されるように、修飾は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造体において行われ得、そしてさらに、所望する特性、例えば免疫原特性を有する変異体又は誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を得ることができる。本発明のポリペプチドの同等の、又はさらに改良された免疫原性変異体又はその一部を創造するためにポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者は典型的には、表１に従って、コードするＤＮＡ配列の１又は複数のコドンを変更するであろう。
【０１０９】
例えば、一定のアミノ酸は、基質分子上の抗体の抗原−結合領域又は結合部位との相互作用結合能力の測定できる損失を伴なわないで、タンパク質構造における他のアミノ酸により置換され得る。それは、タンパク質の生物学的機能的活性を定義するタンパク質の相互作用能力及び性質であるので、一定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列及びもちろん、その基本的なＤＮＡコード配列いおいて行われ得、そしてそれにもかかわらず、同様の性質を有するタンパク質を得ることができる。従って、種の変更は、それらの生物学的有用性又は活性の測定できる損失を伴なわないで、開示される組成物のペプチド配列、又は前記ペプチドをコードする、対応するＤＮＡ配列において行われ得る。
【０１１０】
【表１】

【０１１１】
そのような変更を行う場合、アミノ酸の水治療指数が考慮され得る。タンパク質に対して相互反応性生物学的機能を付与する場合のその水治療指数の重要性は、当業界において一般的に理解されている（ＫｙｔｅａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２；引用により本明細書に組み込まれる）。アミノ酸の相対的水治療特性が、他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原及び同様のものとタンパク質との相互作用を定義する、得られるタンパク質の二次構造に寄与することが認められる。個々のアミノ酸は、疎水性及び電荷特徴に基づいて水治療指数を割り当てされいる（ＫｙｔｅａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。それらの値は次の通りである；イソロイン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（＋０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパーテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【０１１２】
一定のアミノ酸が、類似する水治療指数又は評点を有する他のアミノ酸により置換され得、そしてさらに、類似する生物学的活性を有するタンパク質をもたら、すなわち、生物学的機能的に同等のタンパク質をさらに得ることができることが知られている。そのような変更を行う場合、水治療指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±以１以内のそれらの置換が特に好ましく、そして±０．５以内のそれらの置換がさらにより特別には好ましい。同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行われ得ることはまた、当業界において理解されている。アメリカ特許第４，５５４，１０１号（引用により本明細書中に特別に組み込まれる）は、その隣接するアミノ酸の親水性により支配されるように、タンパク質の最高の局部平均親水性は、タンパク質の生物学的性質と相互関係することを言及する。
【０１１３】
アメリカ特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、次の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられて来た：アルギン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパーテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸が、類似する親水性値を有するもう１つのアミノ酸により置換され得、そしてさらに、生物学的に同等のもの及び特に、免疫学的に同等のタンパク質を得ることができることは理解されている。そのような変更においては、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のそれらの置換が好ましく、そして±０．５以内の置換がさらにより特別には、好ましい。
【０１１４】
上記で概略されるように、従ってアミノ酸置換は一般的に、アミノ酸側鎖置換基、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ及び同様のものの相対的類似性に基づかれている。種々の前記特性を考慮しての典型的な置換は、当業者に良く知れられており、そしてアルギニン及びリシン；グルタメート及びアスパーテート；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；及びバリン、ロイン及びイソロイシンを包含する。
【０１１５】
さらに、いずれかのポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を高めるために、さらに修飾され得る。可能な修飾は、５’及び／又は３’末端でのフランキング配列の付加；主鎖におけるホスホジエステラーゼ連鎖よりもむしろホスホチオエート又は２’Ｏ−メチルの使用；及び／又は非従来の塩基、例えばイノシン、キュエオシン、ワイブトシン、及びアセチル−メチル、チオ−及び他の修飾された形のアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの封入を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１１６】
アミノ酸置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性及び／又は両性性質における類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電されたアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミンを包含し；正に荷電されたアミノ酸はリシン及びアルギニンを包含し；そして類似する親水性値を有する荷電されていない極性ヘッド基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン及びバリン；グリシン及びアラニン；アスパラギン及びグルタミン；及びセリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを包含する。
【０１１７】
保存性変化を提供することができる他のグループのアミノ酸は、次のものを包含する：（１）ａｌａ，ｐｒｏ，ｇｌｙ，ｇｌｕ，ａｓｐ，ｇｌｎ，ａｓｎ，ｓｅｒ，ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｙｒ，ｔｈｒ；（３）ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ，ｍｅｔ，ａｌａ，ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ，ａｒｇ，ｈｉｓ；及び（５）ｐｈｅ，ｔｙｒ，ｔｒｐ，ｈｉｓ。変異体はまた、又は他方では、非保存性変化を含むことができる。好ましい態様においては、変異体のポリペプチドは、５個又はそれよりも少ないアミノ酸の置換、欠失又は付加により、生来の配列とは異なる。変異体はまた（又は他方では）、例えばポリペプチドの免疫原性、二次構造及び水治療性質に最少の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加により修飾され得る。
【０１１８】
上記に示されるように、ポリペプチドは、タンパク質の移行を、同時翻訳的に又は後―翻訳的に方向づける、タンパク質のＮ−末端でのシグナル（又はリーダー）配列を含んで成ることができる。前記ポリペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製又は同定の容易さのために、又は固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するために、リンカー又は他の配列に接合され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に接合され得る。
【０１１９】
ポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列は、それらの２種の配列におけるアミノ酸の配列が、下記のように、最大の対応性について一列整列される場合、同じであるなら、“同一”であると言われる。２種の配列間の比較は典型的には、配列類似性の局部領域を同定し、そして比較するために、比較窓にわたって配列を比較することによって行われる。“比較窓”とは、本明細書において使用される場合、少なくとも約２０、通常３０〜約７０、４０〜約５０個の連続した位置のセグメントを言及し、ここで１つの配列が、２種の配列が最適に一列整列された後、同じ数の連続位置の対照配列に比較され得る。
【０１２０】
比較のための配列の最適な一列整列は、デフォールトパラメーターを用いて、生物情報化学ソフトウェアーのＬａｓｅｒｇｅｎｅ組みにおけるＭｅｇａｌｉｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行われ得る。このプログラムは、次の文献に記載されるいくつかの一列整列スキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａｍｏｄｅｌｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｃｈａｎｇｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｍａｔｒｉｃｅｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｄｉｓｔａｎｔｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．ＩｎＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣＶｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８；ＨｅｉｎＪ．（１９９０）ＵｎｉｆｉｅｄＡｐｐｒｏａｃｈｔｏＡｌｉｇｎｍｅｎｔａｎｄＰｈｙｌｏｇｅｎｅｓｐｐ．６２６−６４５ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙｖｏｌ．１８３，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄＭｕｌｌｅｒＷ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）ＮｕｍｅｒｉｃａｌＴａｘｏｎｏｍｙ − ｔｈｅＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＮｕｍｅｒｉｃａｌＴａｘｏｎｏｍｙ，ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓｓ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：７２６−７３０。
【０１２１】
他方では、比較のための配列の最適な一列整列は、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ２：４８２の局部同一アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性一列整列アルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性方法についての調査により、それらのアルゴリズム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＢＬＡＳＴ，ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター処理された実行により、又は調査により行われ得る。
【０１２２】
％配列同一性及び配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムの１つの好ましい例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．，（１９７７）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌなど．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されるＢＬＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドについての％配列同一性を決定するために、本明細書に記載されるパラメーターと共に使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して入手できる。
【０１２３】
アミノ酸配列に関しては、評点マトリックスが、累積評点を計算するために使用され得る。個々の方向におけるワードヒット（ｗｏｒｄｈｉｔｓ）の拡張は、次の場合に停止される：累積一列整列評価が、その最大の達成された値から量Ｘ、低下する場合：累積評点が、１又は複数の負の評点残基一列整列の蓄積のために、ゼロ又はそれ以下に進行する場合；又はいずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ，Ｔ及びＸは、一列整列の感度及び速度を決定する。
【０１２４】
１つの好ましいアプローチにおいては、“配列同一性の％”は、少なくとも２０の位置の比較窓にわたって、２種の最適に一列整列された配列を比較することによって決定され、ここで比較窓におけるポリペプチド配列の部分は、２種の配列の最適な一列整列に関して、対照配列（付加又は欠失を包含しない）に比較して、２０％又はそれ以下、通常５−１５％又は１０〜１２％の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んで成ることができる。百分率は、同一のアミノ酸残基が、適合される位置の数を得るために、両配列に存在する位置の数を決定し、対照配列における位置の合計数により前記適合された位置の数を割り算し、そして配列同一性の％を得るために、前記結果に１００を掛け算することによって計算される。
【０１２５】
他の例示的態様においては、ポリペプチドは、本明細書に記載されるような複数のポリペプチドを含んで成るか、又は本明細書に記載されるような少なくとも１つのポリペプチド及び未関係の配列、例えば既知の腫瘍タンパク質を含んで成る融合ポリペプチドであり得る。融合パートナーは例えば、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくはヒトにより認識されるＴヘルパーエピトープの供給を助けることができ、又は生来の組換えタンパク質よりも高い収でのタンパク質（発現エンハンサー）の発現を助けることができる。一定の好ましい融合パートナーは、免疫学的及び発現増強融合パートナーである。他の融合パートナーは、ポリペプチドの融解性を高めるために、又は所望する細胞内区画へのポリペプチドの標的化を可能にするために、選択され得る。さらに融合パートナーは、ポリペプチド精製を促進する親和性標識を包含する。
【０１２６】
融合ポリペプチドは一般的に、化学的接合を包含する標準の技法を用いて調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現システムにおいて、融合されていないポリペプチドに対して、高められたレベルの生成を可能にする組換えポリペプチドとして発現される。手短には、ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、別々にアセンブリーされ、そして適切な発現ベクター中に連結される。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端が、配列の読み取り枠が整合して存在するよう、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、ペプチドリンカーを伴なって又はそれを伴わないで連結される。これは、両成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチド中への翻訳を可能にする。
【０１２７】
ポリペプチドリンカ−配列は、個々のポリペプチドがその二次及び三次構造に祈りたたむことを確保するための十分な距離、第１及び第２ポリペプチド成分を分離するために使用され得る。そのようなポリペプチドリンカー配列は、当業界において良く知られている標準の技法を用いて、融合ポリペプチド中に導入される。適切なペプチドリンカー配列は、次の要因に基づいて選択され得る：（１）柔軟な延長されたコンホメーションを採用するためのそれらの能力；（２）第１及び第２ポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用する二次構造を採用するそれらの無能性；及び（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応する疎水性又荷電された残基の欠失。
【０１２８】
好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ，Ａｓｎ及びＳｅｒ残基を含む。他の類似する中性アミノ酸、例えばＴｈｒ及びＡｌａがまた、リンカー配列に使用され得る。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａなど．，Ｇｅｎｅ４０：３９−４　，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８２５８−８２６２、１９８８；アメリカ特許第４，９３５，２３３号及びアメリカ特許第４，７５１，１８０号に開示されるそれらの配列を包含する。リンカー配列は一般的に、１〜約５０個の長さのアミノ酸であり得る。リンカー配列は、第１及び第２ポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、そして立体的障害を妨げるために使用され得る非必須Ｎ−末端アミノ領域を有する場合、必要とされない。
【０１２９】
連続されたＤＮＡ配列は、適切な転写又は翻訳調節要素に操作可能的に連結され。ＤＮＡの発現を胆当する調節要素は、第１ポリペプチドをコードするＤＮＡの５’側のみに位置する。同様に、翻訳及び転写終結シグナルを終結するために必要とれる停止コドンは、第２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
融合ポリペプチドは、未関連の免疫原タンパク質、例えば再現応答を誘発できる免疫原タンパク質と共に、本明細書に記載されるようなポリペプチドを含んで成る。そのようなタンパク質の例は、破傷風、結核及び肝炎タンパク質を包含する（例えば、Ｓｔｏｕｔｅなど．，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３６：８６−９１，１９９７を参照のこと）。
【０１３０】
１つの好ましい態様においては、免疫学的融合パートナーは、マイコバクテリウムｓｐ．，例えばマイコバクテリウム・ツベルキロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）−由来のＲａ１２フラグメントから誘導される。異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現及び／又は免疫原性の増強へのそれらの使用のためのＲａ１２組成物及び方法は、アメリカ特許出願６０／１５８，５８５号（その開示は引用により本明細書に組み込まれる）に記載される。手短には、Ｒａ１２は、マイコバクテリウム・ツベルキロシスＭＴＢ３２Ａ核酸の副配列であるポリヌクレオチド領域を言及する。ＭＴ３２Ａは、Ｍ．ツベルキロシスのビルレント及び非ビルレント株における遺伝子によコードされる、３２ＫＤの分子量のセリンプロレアーゼである。
【０１３１】
ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は記載されている（例えば、アメリカ特許出願６０／１５８，５８５号；また、Ｓｋｅｉｋｙなど．，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎ．（１９９９６７：３９９８−４００７（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ−末端フラグメントは、高レベルで発現し、そして精製工程を通して可溶性ポリペプチドとして存続する。さらに、Ｒａ１２は、それが融合される異種免疫原ポリペプチドの免疫原性を増強することができる。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ｋＤのＣ−末端フラグメントを含んで成る。他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは一般的に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする、少なくとも約１５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも約６０個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、又は少なくとも約３００個のヌクレオチドを含んで成る。
【０１３２】
Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、生来の配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチド又はその一部をコードする内因性配列）を含んで成り、又はそのような配列の変異体を含んで成ることができる。Ｒａ１２ポリヌクレオチド変異体は、コードされる融合ポリペプチドの生物学的活性が、生来のＲａ１２ポリペプチドを含んで成る融合ポリペプチドに対して、実質的に低められないように、１又は複数の置換、付加、欠失及び／又は挿入を含むことができる。変異体は好ましくは、生来のＲａ１２ポリペプチド又はその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性及び最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【０１３３】
他の好ましい態様においては、免疫学的融合パートナーは、タンパク質Ｄ、すなわちグラム陰性細菌ヘモフィラス・インフルエンザＢから誘導される（ＷＯ９１／１８９２６号）。好ましくは、タンパク質Ｄ誘導体はタンパク質のほぼ１／３（例えば、最初のＮ−末端の１００〜１１０個のアミノ酸）を含んで成り、そしてタンパク質Ｄ誘導体は脂質化され得る。一定の好ましい態様においては、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９個の残基は、追加の外因性Ｔ−細胞エピトープを有するポリペプチドを供給するために、及びＥ．コリにおける発現レベルを高めるために（従って、発現エンハンサーとして機能する）、Ｎ−末端上に包含される。脂質末端は、抗原提供細胞への抗原の最適な提供を確保する。他の融合パートナーは、インフルエンザウィルスからの非構造タンパク質、ＮＳ１（ヘマグルチニン）を含む。典型的には、Ｎ−末端の８個のアミノ酸が使用され得るが、但し、Ｔ−ヘルパーエピトープを含む異なったフラグメントも使用され得る。
【０１３４】
もう１つの態様においては、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして知られているタンパク質、又はその一部（好ましくは、Ｃ−末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ４３：２６５−２９２，１９８６）として知られているＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成する、ストレプトコーカス・プネウモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から誘導される。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン主鎖における一定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。
【０１３５】
ＬＹＴＡタンパク質のＣ−末端ドメインは、コリン又はコリン類似体、例えばＤＥＡＥに対する親和性を担当できる。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用であるＥ．コリＣ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの生成のために開発されて来た。アミノ末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製は記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７９５−７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい態様においては、ＬＹＴＡの反復体部分は、融合ポリペプチド中に組み込まれ得る。反復体部分は、残基１７８で開始するＣ−末端領域に見出される。特に好ましい部分は、残基１８８−３０５を組み込む。
【０１３６】
さらにもう１つの例示的な態様は、融合ポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチドを包含する。ここで融合パートナーは、アメリカ特許第５，６３３，２３４号に記載されるように、エンドソーム／リソソーム区画にポリペプチドを方向づけることができる標的化シグナルを含んで成る。本発明の免疫原ポリペプチドは、この標的化シグナルとともに融合される場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子とより効果的に会合し、そしてそれにより、ポリペプチドに対して特異的なＣＤ４^＋Ｔ−細胞の増強されたインビボ刺激を提供する。
【０１３７】
本発明のポリペプチドは、種々の良く知られた合成及び／又は組換え技法のいずれかを用いて調製され、その後者は、下記にさらに記載される。一般的に約１５０個よりも少ないアミノ酸のポリペプチド、その一部及び他の変異体は、当業者に良く知られている技法を用いて、合成手段により生成され得る。１つの例示的な例においては、そのようなポリペプチドは、市販の固相技法、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成方法（ここで、アミノ酸は、成長するアミノ酸鎖に連続的に付加される）のいずれかを用いて合成される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動化された合成のための装置は、供給者、例えばＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）から市販されており、そして製造業者の説明書に従って操作され得る。
【０１３８】
一般的に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）が単離される。“単離された”ポリペプチドは、その元の環境から除去されるポリペプチドである。例えば、天然に存在するタンパク質又はポリペプチドは、それが天然のシステムにおける同時存在する材料のいくつか又はすべてから分離される場合、単離される。好ましくは、そのようなポリペプチドはまた、精製され、例えば少なくとも約９０％の純度、より好ましくは少なくとも約９５％の純度、及び最も好ましくは少なくとも約９９％の純度である。
【０１３９】
ポリヌクレオチド組成物
本発明は、他の面において、ポリヌクレオチド組成物を提供する。用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」は、粒子の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子を意味するために本質的に互換的に使用される。「単離された」は、本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチドが他のコーディング配列から実質的に離れていること、および無関係のコーディングＤＮＡの大きい部分、例えば、染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはポリペプチドコーディング領域を含有しないことを意味する。もちろん、これは本来単離されたＤＮＡ分子を意味し、そして人間の手によりセグメントに後に付加された遺伝子またはコーディング領域を排除しない。
【０１４０】
当業者は理解するように、本発明のポリヌクレオチド組成物は、ゲノム配列、余分のゲノムおよびプラスミドコード化配列およびタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよびその他を発現するか、あるいは発現するように適合可能な、より小さい操作された遺伝子セグメントを包含することができる。このようなセグメントは自然に単離されるか、あるいは人間の手によりにより合成的に修飾することができる。
【０１４１】
また、当業者は認識するように、本発明のポリヌクレオチドは一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二本鎖であることができ、そしてＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成的）またはＲＮＡ分子であることができる。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有しかつ１対１の方法でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を包含することができる。追加のコーディングまたは非コーディング配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在することができるが、存在することは不必要であり、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に結合することができるが、結合することは不必要である。
【０１４２】
ポリヌクレオチドは天然配列（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質またはその一部分をコードする内因性配列）を含んでなることができるか、あるいはこのような配列の変異型、好ましくは免疫原性変異型をコードする配列を含んでなることができる。
【０１４３】
したがって、本発明の他の面によれば、配列番号１〜１１１、１１５〜１７１、１７３〜１７５、１７７、１７９〜３０５、３０７〜３１５、３２６、３２８、３３０、３３２〜３３５、３４０〜３７５、３８１〜３８２および３８４〜４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９〜５７２、５８７、５９１、５９３〜６０６、６１８〜７０５，７０９〜７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０〜８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６〜９１９，９２９〜９３１，９３８，９３９及び９４２のいずれか１つに記載されるポリヌクレオチド配列のいくつかまたはすべて、
【０１４４】
配列番号１〜１１１、１１５〜１７１、１７３〜１７５、１７７、１７９〜３０５、３０７〜３１５、３２６、３２８、３３０、３３２〜３３５、３４０〜３７５、３８１〜３８２および３８４〜４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９〜５７２、５８７、５９１、５９３〜６０６、６１８〜７０５，７０９〜７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０〜８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６〜９１９，９２９〜９３１，９３８，９３９及び９４２のいずれか１つに記載されるポリヌクレオチド配列の相補体、および
【０１４５】
配列番号１〜１１１、１１５〜１７１、１７３〜１７５、１７７、１７９〜３０５、３０７〜３１５、３２６、３２８、３３０、３３２〜３３５、３４０〜３７５、３８１〜３８２および３８４〜４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９〜５７２、５８７、５９１、５９３〜６０６、６１８〜７０５，７０９〜７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０〜８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６〜９１９，９２９〜９３１，９３８，９３９及び９４２のいずれか１つに記載されるポリヌクレオチド配列のデジェネレイト変異型を含んでなるポリヌクレオチド組成物が提供される。ある好ましい態様において、本明細書に記載するポリヌクレオチド配列は、前述したように、免疫原性ポリヌクレオチドをコードする。
【０１４６】
他の関係する態様において、本発明は、配列番号１〜１１１、１１５〜１７１、１７３〜１７５、１７７、１７９〜３０５、３０７〜３１５、３２６、３２８、３３０、３３２〜３３５、３４０〜３７５、３８１〜３８２および３８４〜４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９〜５７２、５８７、５９１、５９３〜６０６、６１８〜７０５，７０９〜７７４，７７７，７８９，８１７，８２３，８２４，８７８，８８０〜８８２，８９４，８９６，９０７，９０８，９１６〜９１９，９２９〜９３１，９３８，９３９及び９４２で本明細書に開示する配列に対して実質的同一性を有するポリヌクレオチド変異型、例えば、本明細書に記載する方法（例えば、後述するように、標準パラメーターを使用してＢＬＡＳＴ分析）を使用して本発明のポリヌクレオチドに比較して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれより高い配列同一性を有するポリヌクレオチド変異型を提供する。当業者は認識するように、コドンデジェネラシー、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決定およびその他を考慮することによって、これらの値を適当に調節して、２つのヌクレオチド配列によりコードされる対応する同一性を決定することができる。
【０１４７】
典型的には、ポリヌクレオチド変異型は、好ましくは詳しく本明細書に記載するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに関して、変異型ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの免疫原性が実質的に減少しないように、１またはそれ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有するであろう。用語「変異型」は、また、異種由来の相同的遺伝子を包含することを理解すべきである。
【０１４８】
追加の態様において、本発明は、本明細書に開示する配列の１またはそれ以上に対して同一であるか、あるいは相補的である配列の種々の長さの隣接ストレッチを含んでなるポリヌクレオチドフラグメントを提供する。例えば、本明細書に開示する配列の１またはそれ以上の少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００またはそれより長い隣接ヌクレオチドならびにそれらの間のすべての中間的長さのものを含んでなるポリヌクレオチドが本発明により提供される。容易に理解されるように、「中間的長さのもの」は、これに関して、記載値間の任意の長さ、例えば、１６、１７、１８、１９、およびその他；３０、３１、３２、およびその他；５０、５１、５３、およびその他；１００、１０１、１０２、１０３、およびその他；１５０、１５１、１５２、１５３、およびその他を意味し、２００〜５００；５００〜１，０００、およびその他のすべての整数を包含する。
【０１４９】
本発明の他の態様において、中〜高いストリンジェンシイの条件下に本発明において提供されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメント、またはその相補的配列に対してハイブリダイゼーションすることができるポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は分子生物学の分野においてよく知られている。
【０１５０】
例示の目的で、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適当な中程度のストリンジェント条件は、下記の条件を包含する：５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の前洗浄；５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣにおける一夜のハイブリダイゼーション；次いで０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの各々を使用する６５℃において２０分間の洗浄。当業者は理解するように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシイは、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションを実行する温度を変更することによって、容易に操作することができる。例えば、他の態様において、適当な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は前述の条件を包含するが、ただしハイブリダイゼーションの温度は、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃に増加する。
【０１５１】
ある好ましい態様において、前述のポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド変異型、フラグメントおよびハイブリダイゼーション配列は、本明細書に詳しく記載するポリペプチド配列と免疫学的に交差反応するポリペプチドをコードする。他の好ましい態様において、このようなポリヌクレオチドは、本明細書に詳しく記載するポリペプチド配列についての免疫原活性レベルの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％の免疫原活性レベルを有するポリペプチドをコードする。
【０１５２】
本発明のポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントは、コーディング配列それ自体の長さを無視して、他のＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコーディングセグメント、およびその他と組合わせ、それらの全体の長さをかなり変化させることができる。したがって、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントを使用することができ、全長さは調製の容易さおよび意図する組換えＤＮＡプロトコルにおける使用により制限されることが考えられる。例えば、約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対長さ、およびその他（すべての中間長さを包含する）の全長さを有する例示的ポリヌクレオチドセグメントは本発明の多数の実行において有効であると考えられる。
【０１５３】
ポリヌクレオチド配列を比較するとき、２つの配列中のヌクレオチド配列が、後述するように、最大対応で整列する場合、２つの配列中のヌクレオチド配列は「同一」であると言われる。典型的には、２つの配列間の比較は、比較ウィンドウ上で配列を比較して配列類似性の局所的領域を同定し、比較することによって行なわれる。「比較ウィンドウ」は、本明細書において使用するとき、少なくとも約２０、通常３０〜約７５、好ましくは４０〜約５０の隣接位置のセグメントを意味し、ここで２つの配列間が最適に整列された後、配列を同数の隣接位置の参照配列と比較することができる。
【０１５４】
比較のための配列の最適な整列は、バイオインフォーマチックスソフトウェアのレーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）組中のメガリン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム（ＤＮＡＳＴＲ，Ｉｎｃ．、ウイスコンシン州マディソン）に従いデフォルトパラメーターを使用して実行することができる。このプログラムは下記の文献に記載されているいくつかの整列スキームに具体化される：Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａｍｏｄｅｌｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｃｈａｎｇｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｄｉｓｔａｎｔｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．ＩｎＤａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．（編者）ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントンＤ．Ｃ．Ｖｏｌ．５、Ｓｕｐｐｌ．３、ｐｐ．３４５−３５８；
【０１５５】
ＨｅｉｎＪ．（１９９０）ＵｎｉｆｉｅｄＡｐｐｒｏａｃｈｔｏＡｌｉｇｎｍｅｎｔａｎｄＰｈｙｌｏｇｅｎｅｓｐｐ．６２６−６４５ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ．１８３、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ；Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ、Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ、Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒＷ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ、Ｎ．Ｎｅｓ、Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ、Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ、Ｒ．Ｒ．（１９７３）ＮｕｍｅｒｉｃａｌＴａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＮｕｍｅｒｉｃａｌＴａｘｏｎｏｍｙ、ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンフランシスコ；Ｗｉｌｂｕｒ、Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：７２６−７３０。
【０１５６】
選択的に、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ２：４８２の局所的同一性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の局所的同一性アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性の方法のサーチ、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＥＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡｉｎｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．、ウイスコンシン州マディソン）、または検査により実行することができる。
【０１５７】
配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために適当なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９７７）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、例えば、本明細書に記載するパラメーターとともにを使用して、本発明のポリヌクレオチドについての配列類似性の百分率を決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトウェアは、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公衆用に入手可能である。
【０１５８】
１つの例示的例において、例えば、ヌクレオチド配列、パラメーターＭ（１対の合致する残基についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して、累積スコアを計算することができる。各方向におけるワードのヒットのエクステンションは下記の場合に中止される：１またはそれ以上の負のスコアの残基の整列の蓄積のために、累積がゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターはＷ、ＴおよびＸは整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は下記の値をデフォルトとして使用する：１１のワード長さ、および１０のエクステンション（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５参照）整列、５０の（Ｂ）、１０のエクステンション（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較。
【０１５９】
好ましくは、「配列同一性の百分率」は、少なくとも２０の位置の比較ウィンドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで２つの配列間の最適な整列についての参照配列（これらは付加または欠失を含まない）に比較して、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の一部分は２０％以下、通常５〜１５、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。同一核酸塩基が両方の配列の中に存在する位置の数を決定して合致した位置の数を確定し、合致した位置の数を参照配列中の位置の全数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、１００を掛けて配列同一性の百分率を決定することによって、百分率を計算する。
【０１６０】
当業者は認識するように、遺伝暗号のデジェネラシーの結果として、本明細書に記載するようにポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が存在する。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を支持する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差のために変化するポリヌクレオチドは、本発明により特別に意図される。さらに、本発明において提供されるポリヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子のアレレは本発明の範囲内に入る。アレレは、ヌクレオチドの１またはそれ以上の突然変異、例えば、欠失、付加および／または置換の結果として、変更された内因性遺伝子である。生ずるｍＲＮＡおよびタンパク質は変更された構造または機能を有することができるが、有することは不必要である。アレレは標準２つの配列間（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベースの配列の比較により同定することができる。
【０１６１】
したがって、本発明の他の態様において、本明細書に記載するポリペプチドの免疫原性変異型および／または誘導体を調製するために、突然変異誘発アプローチ、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用する。このアプローチにより、ポリペプチドをコードする根元的ポリヌクレオチドの突然変異誘発により、ポリペプチド配列中の特異的修飾を行うことができる。これらの技術は、例えば、１またはそれ以上のヌクレオチド配列をポリヌクレオチドの中に導入することによって、前述の考えの１またはそれ以上を組込んだ、配列の変異型を調製し、試験する簡単なアプローチを提供する。
【０１６２】
部位特異的突然変異誘発により、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特異的ポリヌクレオチド配列、ならびに十分な数の調節ヌクレオチドを使用して突然変異を産生して、トラバースされる欠失結合部の両側に安定な二重らせんを形成することができる。選択したポリヌクレオチド配列において突然変異を使用して、ポリヌクレオチドそれ自体の性質を改良し、変更し、減少し、修飾し、またはそうでなければ変化させ、コード化されたポリペプチドの性質、活性、組成、安定性、または一次配列を変更することができる。
【０１６３】
本発明のある態様において、本発明は、コード化されたポリペプチドの１またはそれ以上の性質、例えば、ポリペプチドワクチンの免疫原性を変更するために、開示されたポリヌクレオチド配列の突然変異誘発を意図する。部位特異的突然変異誘発の技術はこの分野においてよく知られており、そしてポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の変異型の調製に広く使用される。例えば、部位特異的突然変異誘発はＤＮＡ分子の特定の部分を変更するためにしばしば使用される。このような態様において、典型的には約１４〜約２３ヌクレオチドを含んでなるか、あるいはそのような長さのプライマーを使用し、配列の結合部の両側の約５〜約１０残基が変更される。
【０１６４】
当業者は理解するように、部位特異的突然変異誘発技術において、一本鎖および二本鎖の両方の形態で存在するファージベクターがしばしば使用されてきている。典型的には、部位特異的突然変異誘発において有効なベクターはＭ１３ファージのようなベクターを包含する。これらのファージは容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は一般にこの分野においてよく知られている。また、問題の遺伝子をプラスミドからファージに転移させる工程を排除する二本鎖プラスミドが部位特異的突然変異誘発において日常的に使用される。
【０１６５】
本発明に従う部位特異的突然変異誘発は、まず一本鎖ベクターを獲得するか、あるいは所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列の中に含む二本鎖ベクターの２つの鎖を溶融分離することによって実行される。所望の突然変異した配列を支持するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に合成的に、調製された。次いでこのプライマーを一本鎖ベクターとアニールし、ＤＮＡ重合酵素、例えば、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩクレノーフラグメントに暴露して、突然変異を支持する鎖の合成を完結する。こうして、ヘテロ二本鎖が形成され、ここで１つの鎖はオリジナル非突然変異化配列をコードし、そして第２鎖は所望の突然変異を支持する。次いで、このヘテロ二本鎖を使用して適当な細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）細胞を形質転換し、突然変異した配列配置を支持する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【０１６６】
選択したペプチドをコードするＤＮＡセグメントを部位特異的突然変異誘発により調製する方法は、潜在的に有効な種を産生する手段を提供し、ペプチド配列変異型およびそれらをコードするＤＮＡ配列を得ることができる他の方法が存在するので、その方法に限定されない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターを突然変異誘発因子、例えば、ヒドキシルアミンで処理して配列変異型を得る。これらの方法およびプロトコルに関する特定の詳述は下記の教示の中に見出される：Ｍａｌｏｙ他、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓ他、１９８２、各々はその目的で引用することによって本明細書の一部とされる。
【０１６７】
本明細書において使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発手順」は、その初期濃度に関して特定の核酸分子の濃度を増加させるか、あるいは検出可能なシグナル、例えば、増幅の濃度を増加させる、鋳型依存的プロセスおよびベクター仲介増殖を意味する。本明細書において使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的エクステンションを包含するプロセスを意味する。
【０１６８】
鋳型依存的プロセスという用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の核酸合成を意味し、ここで核酸の新しく合成された鎖の配列は相補的塩基対合のよく知られているルールにより支配された（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７参照）。典型的には、ベクター仲介法はＤＮＡまたはＲＮＡ分子の中への核酸フラグメントの導入、ベクターのクローナル増幅、および増幅された核酸フラグメントの回収を包含する。このような方法の例は米国特許第４，２３７，２２４号により提供され、これはその全体において引用することによって特別に本明細書の一部とされる。
【０１６９】
本発明のポリペプチド変異型を製造する他のアプローチにおいて、米国特許第５，８３７，４５８号に記載されているように、リカーシブ配列組換えを使用することができる。このアプローチにおいて、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復サイクルを実行して、例えば、免疫原性活性が増強される、本発明の個々のポリヌクレオチド変異型を「進化」させる。
【０１７０】
本発明の他の態様において、本発明において提供されるポリヌクレオチド配列は核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして好都合に使用することができる。それ自体、本明細書に開示する１５ヌクレオチド長さの隣接配列と同一であるか、あるいはそれに対して相補的である少なくとも約１５隣接ヌクレオチドの配列領域を含んでなる核酸セグメントは特定の実用性を有すると考えられる。また、より長い隣接する同一または相補的配列、例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（すべての中間長さを包含する）およびなおさらに全長までの配列はある態様において使用されるであろう。
【０１７１】
このような核酸プローブは、問題の配列に対して特異的にハイブリダイゼーションする能力を有するために、所定の試料中の相補的配列の存在を検出するとき使用することができる。しかしながら、他の使用、例えば、突然変異体種プライマー、または他の遺伝学的構築物の製造において使用するプライマーを調製するための配列情報の使用がまた考えられる。
【０１７２】
本明細書に記載するポリヌクレオチド配列に対して同一であるか、あるいはそれに対して相補的である、１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、またはさらに１００〜２００ヌクレオチドまたはその他（その上中間長さを包含する）の隣接ヌクレオチドストレッチから成る配列領域を有するポリヌクレオチド分子は、例えば、サザンおよびノザンブロッティング、において使用するハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。
【０１７３】
これは、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方の中の遺伝子産物、またはそのフラグメントの分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに１またはそれ以上の相補的ストレッチのサイズは究極的には意図する使用または特定の核酸セグメントの適用に依存するであろう。より小さいフラグメントは一般にハイブリダイゼーション態様において使用され、ここで隣接相補的領域の長さは、例えば、約１５〜約１００ヌクレオチドの間で、変化することができるが、検出しようとする長さの相補的配列に従い、より大きい隣接相補的ストレッチを使用することができる。
【０１７４】
約１５〜２５ヌクレオチド長さのハイブリダイゼーションプローブを使用して、安定でありかつ選択的である二重らせん分子を形成することができる。しかしながら、ハイブリッドの安定性および選択性を増加し、これにより得られた特定のハイブリッド分子の品質および程度を改良するために、１５塩基長さより大きいストレッチにわたって隣接相補的配列を有する分子は一般に好ましい。一般に、１５〜２５隣接ヌクレオチド、所望ならば、これより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計することが好ましいであろう。
【０１７５】
ハイブリダイゼーションプローブは本明細書に記載する任意の配列の任意の部分から選択することができる。必要であるすべては、本明細書に記載する配列を概観するか、あるいは配列の任意の部分に対して、プローブまたはプライマーとして利用しようとする、約１５〜２５ヌクレオチド長さから全長までの配列を概観することである。プローブおよびプライマーの配列の選択は種々の因子により支配されることがある。例えば、全配列の末端に向かってプライマーを使用することができる。
【０１７６】
小さいポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、例えば、自動化オリゴヌクレオチド合成装置を使用して普通に実施されているように、フラグメントを直接的に合成することによって、容易に調製することができる。また、フラグメントは、核酸複製技術、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（引用することによって本明細書の一部とされる）のＰＣＲ^ＴＭ技術を適用することによって、選択した配列を組換え体産生のために組換えベクターの中に導入することによって、そして分子生物学の当業者に一般に知られている他の組換えＤＮＡ技術により、得ることができる。
【０１７７】
本発明のヌクレオチド配列は、問題の全遺伝子または遺伝子フラグメントの相補的ストレッチを有する二重らせん分子を選択的に形成する能力を有するために、使用することができる。もくろむ適用に依存して、典型的にはハイブリダイゼーションの条件を変化させて、ターゲット配列に対するプローブの選択性の程度を変化させる。高い感度を必要とする適用のために、典型的には相対的ストリンジェントの条件を使用してハイブリッドを形成する、例えば、約５０℃〜約７０℃の温度における塩濃度を約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍとすることによって、例えば、相対的低い塩および／または高い温度の条件を選択する。このような選択的条件は、存在する場合、プローブと鋳型またはターゲット鎖との間のわずかのミスマッチを許容し、そして関係する配列の単離に特に適当であろう。
【０１７８】
もちろん、いくつかの適用について、例えば、根元的鋳型に対してハイブリダイゼーションした突然変異体プライマー鎖を使用して突然変異体を調製しようとする場合、ヘテロ二本鎖の形成を可能とするために、典型的には低いストリンジェント（減少したストリンジェンシイ）のハイブリダイゼーション条件を必要とするであろう。これらの環境において、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度において、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することができる。
【０１７９】
これにより、交差ハイブリダイゼーション性種を対照ハイブリダイゼーションに関する正のハイブリダイゼーションシグナルとして容易に同定することができる。いずれの場合においても、温度の増加と同一方法でハイブリッド二重らせんを脱安定化する働きをする、増加する量のホルムアミドの添加により、条件をいっそうストリンジェントすることができることが一般に理解される。こうして、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作することができ、こうして一般に所望の結果に依存して選択された方法であろう。
【０１８０】
本発明の他の態様によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド組成物が提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドはタンパク質合成の有効な、ターゲッテッドインヒビターであること証明され、結局、疾患に寄与するタンパク質の合成を阻害することによって疾患を治療することができる、療法的アプローチを提供する。タンパク質合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効率は十分に確立されている。例えば、ポリガラクトウロナーゼおよびムスカリン２型アセチルコリンレセプターの合成は、それらのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。
【０１８１】
さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、同義薬剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡ_ＡレセプターおよびヒトＥＧＦを使用して証明された（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８８Ｊｕｎ１０；２４０（４８５８）：１５４４−６；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、ＣａｎｃｅｒＣｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）２２５−３２；Ｐｅｒｉｓ他、ＢｒａｉｎＲｅｓＭｏｌＢｒａｉｎＲｅｓ．１９９８Ｊｕｎ１５；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号および米国特許第５，６１０，２８８号）。また、種々の異常な細胞増殖、例えば、癌を阻害しかつ治療するために使用できるアンチセンス構築物が記載された（米国特許第５，７４７，４７０号；米国特許第５，５９１，３１７号および米国特許第５，７８３，６８３号）。
【０１８２】
したがって、ある態様において、本発明は、本明細書に記載するポリヌクレオチド配列に特異的に結合することができる任意の配列のすべて、または一部分、またはそれらの補体を含んでなるオリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはその誘導体を含んでなる。他の態様において、オリゴヌクレオチドはＲＮＡまたはその誘導体を含んでなる。第３態様において、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート化修飾バックボーンを含んでなる修飾ＤＮＡである。第４態様において、オリゴヌクレオチド配列はペプチド核酸またはその誘導体を含んでなる。
【０１８３】
各場合において、好ましい組成物は、本明細書に記載するポリヌクレオチドの１またはそれ以上の部分に対して相補的である、より好ましくは実質的相補的である、なおより好ましくは完全に相補的である配列領域を含んでなる。所定の遺伝子配列に対して特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択したターゲット配列の分析および二次構造、Ｔ_ｍ、結合エネルギー、および相対安定性に基づく。宿主細胞におけるターゲットｍＲＮＡに対する特異的結合を減少または阻害する二量体、ヘアピン、または他の二次構造を形成する相対不能性に基づいて、アンチセンス組成物を選択することができる。
【０１８４】
ｍＲＮＡの高度に好ましいターゲット領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンまたはその付近における領域、およびｍＲＮＡの５’領域に対して実質的に相補的である配列である。これらの二次構造の分析およびターゲット部位の選択の考察は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析のソフトウェアおよび／またはＢＬＡＳＴＮ２．０．５アルゴリズムソフトウェアのバージョン４（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９７Ｓｅｐ１；２５（１７）：３３８９−４０２）を使用して、実行することができる。
【０１８５】
また、ＭＰＧ（２７残基）と呼ぶ、短いペプチドベクターを使用してアンチセンスデリバリー法の使用が考えられる。ＭＰＧペプチドは、ＨＩＶｇｐ４１の融合配列に由来する疎水性ドメイン、およびＳＶ４０Ｔ−抗原の核局在化配列からの親水性ドメインを含有する（Ｍｏｒｒｉｓ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９７Ｊｕｌ１５；２５（１４）：２７３０−６）。ＭＰＧペプチドのいくつかの分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドを被覆し、そして比較的高い効率（９０％）で１時間よりも短い時間で培養した哺乳動物細胞の中に送出されることができる。さらに、ＭＰＧとの相互作用はヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性および原形質膜を横切る能力の両方を強く増加させることが証明された。
【０１８６】
本発明の他の態様によれば、腫瘍細胞中の本発明の腫瘍ポリペプチドおよびタンパク質の発現を阻害するリボザイム分子の設計および調製において、本明細書に記載するポリヌクレオチド組成物を使用する。リボザイムは、部位特異的融合において核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムはエンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８７Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ１９８７Ａｐｒ２４；４９（２）：２１１−２０）。
【０１８７】
例えば、多数のリボザイムは、高度の特異性で、ホスホエステル転移反応を促進し、しばしばオリゴヌクレオチド基質中のいくつかのホスホエステルのただ１つを切断する（Ｃｅｃｈ他、Ｃｅｌｌ１９８１Ｄｅｃ；２７（３Ｐｔ２）：４８７−９６；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０Ｄｅｃ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｐ、Ｎａｔｕｒｅ１９９２Ｍａｙ１４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、化学反応前に、基質が特異的塩基対合相互作用を介してリボザイムの内部のガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合するという要件に寄与する。
【０１８８】
天然に存在する酵素ＲＮＡの６つの基本的変種が現在知られている。各々は生理学的条件下にトランスでＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる（こうして他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般に、酵素核酸は最初にターゲットＲＮＡに結合することによって作用する。このような結合は酵素核酸のターゲット結合部分を通して起こり、ここで結合部分はターゲットＲＮＡを切断する作用する分子の酵素部分に密接に近接して保持される。
【０１８９】
こうして、酵素核酸はまず相補的塩基対合を通してターゲットＲＮＡを認識し、それに結合し、いったん正しい部位に結合すると、ターゲットＲＮＡを酵素的に切断する作用をする。このようなターゲットＲＮＡの戦略的切断は、コード化タンパク質の合成を指令するその能力を破壊する。酵素核酸がそのＲＮＡターゲットに結合し、それを切断した後、それはそのＲＮＡから解放され、他のターゲットを探索し、反復的に新しいターゲットに結合し、それを切断することができる。
【０１９０】
リボザイムの酵素的性質は多数の技術、例えば、アンチセンス技術（ここで核酸分子は核酸ターゲットに単にに結合し、その翻訳をブロックする）より有利である。なぜなら、療法的治療を行うために必要なリボザイムの濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度よりも低いからである。この利点は酵素的に作用するリボザイムの能力を反映する。こうして、単一リボザイム分子はターゲットＲＮＡの多数の分子を切断することができる。
【０１９１】
さらに、リボザイムは高度に特異的なインヒビターであり、阻害の特異性はターゲットＲＮＡに結合する塩基対合メカニズムに依存するばかりでなく、かつまたターゲットＲＮＡの切断のメカニズムに依存する。切断部位付近における、単一ミスマッチ、または塩基置換は、リボザイムの触媒活性を完全に排除することができる。アンチセンス分子における同様なミスマッチはそれらの作用を妨害しない（Ｗｏｏｌｆ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９２Ａｕｇ１５；８９（１６）：７３０５−９）。こうして、リボザイムの作用の特異性は、同一ＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれより大きい。
【０１９２】
酵素核酸分子は、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎δウイルス、グラフＩイントロンまたはＲＮアーゼＰＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列とアソシエートした）またはニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）ＶＳＲＮＡのモチーフで形成することができる。ハンマーヘッドのモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９２Ｓｅｐ１１；２０（１７）：４５５９−６５により記載された。ヘアピンのモチーフの例は下記の文献に記載された：Ｈａｍｐｌｅ他の欧州特許出願公開Ｎｏ．ＥＰ０３６０２５７、ＨａｍｐｌｅおよびＴｒｉｔｚ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８９Ｊｕｎ１３；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｌｅ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０Ｊａｎ２５；１８（２）：２９９−３０４および米国特許第５，６３１，３５９号。
【０１９３】
肝炎δウイルスのモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９２Ｄｅｃ　１；３１（４７）：１１８４３−５２に記載された；ＲＮアーゼＰのモチーフの例はＧｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ他、Ｃｅｌｌ１９８３Ｄｅｃ；３５（３Ｐｔ２）：８４９−５７に記載された；ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）ＶＳＲＮＡのモチーフは下記の文献に記載された：ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｃｅｌｌ１９９０Ｍａｙ１８；６１（４）：６８５−９６；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９１Ｏｃｔ１；８８（１９）：８８２６−３０；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９３Ｍａｒ２３；３２（１１）：２７９５−９；そしてグループＩイントロンの例は米国特許第４，９８７，０７１号に記載された。
【０１９４】
本発明の酵素核酸分子において重要であるすべては、それがターゲット遺伝子のＲＮＡ領域の１またはそれ以上に対して相補的である特異的基質結合部位を有すること、およびそれが分子にＲＮＡ切断活性を付与する基質結合部位内またはそれを取り囲むヌクレオチド配列を有することである。こうして、リボザイム構築物は本明細書に記載する特定のモチーフに限定する必要はない。
【０１９５】
リボザイムは、国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９３／２３５６９および国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ　９４／０２５９５（各々は特別に引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているように設計し、そして合成して、記載するように、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏにおいて試験することができる。また、このようなリボザイムはデリバリーのために最適化することができる。特定の例が提供されるが、当業者は認識するように、他の種における同等のＲＮＡターゲットを必要に応じて利用することができる。
【０１９６】
リボザイム結合性アームの長さを変更するか、あるいは血清リボヌクレアーゼによるリボザイムの分解を防止する修飾（下記の文献を参照のこと：国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９２／０７０６５；国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９３／１５１８７；国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９１／０３１６２；欧州特許出願公開Ｎｏ．９２１１０２９８；米国特許第５，３３４，７１１号；および国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９４／１３６８８、これらには酵素ＲＮＡ分子の糖部分に行うことができる種々の化学的修飾が記載されている）、および細胞におけるリボザイムの効能を増強する修飾を有し、かつ幹ＩＩ塩基が除去されてＲＮＡ合成時間が短縮されかつかつ化学的要件が減少されたリボザイムを化学的に合成することによって、リボザイム活性を最適化することができる。
【０１９７】
Ｓｕｌｌｉｖａｎ他（国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９４／０２５９５）は、酵素ＲＮＡ分子の一般的デリバリー法を記載している。リボザイムはこの分野において知られている種々の方法により細胞に投与することができ、このような方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：リポソーム中の包膜、イオントホレシス、または他のベヒクル、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル、および生物接着性微小球の中への組込み。いくつかの適用のために、リボザイムは前述のベヒクルを使用するか、または使用しないで細胞または組織にｅｘｖｉｖｏで直接送出すことができる。
【０１９８】
選択的に、ＲＮＡ／ベヒクルの組合わせは直接的吸入、直接的注射またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により局所的に送出すことができる。他の送出し経路は下記のものを包含するが、これらに限定されない：血管内、筋肉内、皮下または関節注射、エーロゾル吸入、経口（錠剤または丸剤の形態）、局所的、全身的、眼、腹腔内および／またはくも膜下デリバリー。リボザイムのデリバリーおよび投与のいっそう詳述な説明は、国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ　９４／０２５９５および国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ　９３／２３５６９（各々は特別に引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されている。
【０１９９】
細胞内に高い濃度の１またはそれ以上のリボザイムを蓄積する他の手段は、リボザイムをコードする配列をＤＮＡ発現ベクターの中に組込むことである。リボザイム配列の転写は、真核ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）のためのプロモーターから推進される。ｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写物はすべての細胞において高いレベルで発現されるであろう；所定の細胞型における所定のｐｏｌＩＩプロモーターのレベルは、付近に存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサー、およびその他）の特質に依存するであろう。
【０２００】
また、原核ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用することができるが、ただし原核ＲＮＡポリメラーゼ酵素は適当な細胞において発現される。このようなプロモーターから発現されたリボザイムは、哺乳動物細胞において機能することが示された。このような転写単位は哺乳動物細胞の中への導入のための種々のベクターの中に組込むことができ、このようなベクターは下記のものを包含するが、これらに限定されない：プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスのベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルスのベクター）。
【０２０１】
本発明の他の態様において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）組成物が提供される。ＰＮＡはヌクレオ塩基がプソイドペプチドバックボーンに結合されているＤＮＡ模擬物である（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ．１９９７７（４）４３１−３７）。ＰＮＡは伝統的にＲＮＡまたはＤＮＡ配列が使用されてきている多数の方法において利用することができる。しばしばＰＮＡ配列は対応するＲＮＡまたはＤＮＡよりも技術においてよりよく実行し、ＲＮＡまたはＤＮＡに対して固有でない実用性を有する。
【０２０２】
調製方法、特性、および使用法を包含するＰＮＡの概観は、Ｃｏｒｅｙ、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１９９７Ｊｕｎ；１５（６）：２２４−９に記載されている。それ自体、ある態様において、ＡＣＥｍＲＮＡ配列の１またはそれ以上の部分に対して相補的であるＰＮＡ配列を調製し、このようなＰＮＡ組成物を使用して、ＡＣＥ特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節し、変更し、減少し、または軽減し、これによりこのようなＰＮＡ組成物が投与された宿主細胞におけるＡＣＥ活性レベルを変更することができる。
【０２０３】
ＰＮＡはＤＮＡの正常のホスホジエステルバックボーンを置換する２−アミノエチル−グリシン連鎖を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１Ｄｅｃ６；２５４（５０３７）：１４９７−５００；Ｈａｎｖｅｙ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９２Ｎｏｖ２７；２５８（５０８７）：１４８１−５；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ、ＢｉｏｏｒｇＭｅｄＣｈｅｍ．１９９６Ｊａｎ；４（１）：５−２３）。この化学は３つの重要な結果を有する：第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと対照的に、ＰＮＡは中性分子である；第２に、ＰＮＡはアキラルであり、立体選択的合成を開発する必要性を回避する；そして、第３に、ＰＮＡ合成は固相ペプチド合成のために標準ＢｏｃまたはＦｍｏｃプロトコルを使用するが、修飾されたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を包含する他の方法が使用されてきている。
【０２０４】
ＰＮＡモノマーまたはレディーメイドオリゴマーは、パーセプティブ・バイオシステム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチュセッツ州ファーミンガム）から商業的に入手可能である。ＢｏｃまたはＦｍｏｃプロトコルによるＰＮＡ合成は、マニュアルまたは自動化プロトコルを使用して簡単である（Ｎｏｒｔｏｎ他、ＢｉｏｏｒｇＭｅｄＣｈｅｍ．１９９５　Ａｐｒ；３（４）：４３７−４５）。マニュアルプロトコルは、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡファミリーの同時合成を使用する。
【０２０５】
ペプチド合成におけるように、特定のＰＮＡ合成の成功は選択した配列の性質に依存するであろう。例えば、理論的にはＰＮＡはヌクレオチド塩基の任意の組合わせを組込むことができるが、隣接プリンの存在は産物における１またはそれ以上の欠失に導くことができる。この困難を期待して、隣接プリンを有するＰＮＡの産生において、非効率的に付加されると推測される残基のカップリングを反復すべきであることが示唆される。次いで、ＲＮＡを逆相高圧液体クロマトグラフィーにより精製して、産物の収率および純度をペプチド合成間に観測されたものに類似させる。
【０２０６】
所定の適用のためのＰＮＡの修飾は、固相合成間のアミノ酸のカップリングまたはカルボン酸基を含有する化合物の暴露されたＮ末端アミンへの結合により、達成することができる。選択的に、ＰＮＡは合成後に導入されたリシンまたはシステインへのカップリングにより修飾することができる。ＰＮＡを修飾できる容易さは、よりすぐれた溶解度または特定の機能の要件のための最適化を促進する。いったん合成されると、ＰＮＡの同一性およびそれらの誘導体は質量分析により確認することができる。
【０２０７】
いくつかの研究が実行され、これらの研究においてＰＮＡの修飾が利用されてきている（例えば、Ｎｏｒｔｏｎ他、ＢｉｏｏｒｇＭｅｄＣｈｅｍ．１９９５Ａｐｒ；３（４）：４３７−４５；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ他、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．１９９５Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１（３）：１７５−８３；Ｏｒｕｍ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９９５Ｓｅｐ；１９（３）：４７２−８０；Ｆｏｏｔｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９６Ａｕｇ２０；３５（３３）；１０６７３−９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９５Ａｕｇ１１；２３（１５）：３００３−８；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９５Ｊｕｎ６；９２（１２）：５５９２−６；Ｂｏｆｆａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９５Ｍａｒ１４；９２（６）１９０１−５；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ他、Ｂｌｏｏｄ１９９６Ａｕｇ１５；８８（４）：１４１１−７；Ａｒｍｉｔａｇｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９７Ｎｏｖ１１；９４（２３）：１２３２０−５；Ｓｅｅｇｅｒ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９９７Ｓｅｐ；２３（３）：５１２−７）。米国特許第５，７００，９２２号において、キメラ分子および診断、生物におけるタンパク質の修飾、および治療剤に対して感受性な症状の治療におけるそれらの使用が論じられている。
【０２０８】
ＰＮＡのアンチセンス結合性を特性決定する方法は、Ｒｏｓｅ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３Ｄｅｃ１５；６５（２４）：３５４５−９、およびＪｅｎｓｅｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９７Ａｐｒ２２；３６（１６）：５０７２−７において論じられている。Ｒｏｓｅは、毛管ゲル電気泳動を使用して、ＲＮＡのそれらの相補的オリゴヌクレオチドに対する結合を決定し、相対的結合の反応速度および化学量を測定している。同様な型の測定は、Ｊｅｎｓｅｎ他によりＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭを使用して実施された。
記載されかつ当業者にとって明らかなＰＮＡの他の用途は下記の用途を包含する：ＤＮＡ鎖の侵入、アンチセンス阻害、突然変異の分析、転写のエンハンサー、核酸の精製、転写活性遺伝子の単離、転写因子結合のブロッキング、ゲノム切断、バイオセンサー、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびその他。
【０２０９】
ポリヌクレオチドの同定、特性決定および発現
本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術により同定し、調製し、および／または操作することができる（下記の文献を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、および他の同様な参考文献）。例えば、ポリヌクレオチドは、いっそう詳述に後述するように、ｃＤＮＡのミクロアレイを腫瘍関連発現についてスクリーニングすることによって、同定することができる（すなわち、本明細書において提供される代表的アッセイを使用して測定して、正常組織におけるよりも腫瘍において少なくとも２倍大きい発現）。
【０２１０】
このようなスクリーニングは、例えば、アフィメトリックス・インコーポレーテッド（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）のミクロアレイ技術を製造業者の使用説明書に従い使用して（かつ本質的に下記の文献に記載されているように、Ｓｃｈｅｎａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１０６１４−１０６１９、１９９６およびＨｅｌｌｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：２１５０−２１５５、１９９７）実行することができる。選択的に、ポリヌクレオチドは本明細書に記載するタンパク質を発現する細胞、例えば、腫瘍細胞から調製したｃＤＮＡから増幅することができる。
【０２１１】
試料の中に存在する問題のターゲット配列を増幅するために、多数の鋳型依存的プロセスが入手可能である。最もよく知られている増幅方法の１つは、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，８００，１５９号（それらの各々はその全体において引用することによって本明細書の一部とされる）に詳細に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ^ＴＭ）である。簡単に述べると、ＰＣＲ^ＴＭにおいて、ターゲット配列の反対の相補的鎖上の領域に対して相補的である２つのプライマー配列を調製する。
【０２１２】
過剰のデオキシヌクレオチド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）と一緒に、反応混合物に添加する。ターゲット配列が試料の中に存在する場合、プライマーはターゲットに結合し、ポリメラーゼはヌクレオチド上への付加によりターゲット配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合物の上昇および低下により、伸長されたプライマーはターゲットから解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーはターゲットおよび反応生成物に結合し、このプロセスを反復する。好ましくは、逆転写およびＰＣＲ^ＴＭ増幅手順を実行して、増幅されたｍＲＮＡを定量する。ポリメラーゼ連鎖反応法はこの分野においてよく知られている。
【０２１３】
多数の他の鋳型依存的プロセスの多くはＰＣＲ^ＴＭ増幅技術の変法であり、この分野において既知でありかつ容易に入手可能である。例示的に、いくつかのこのような方法は下記のものを包含する：リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲと呼ばれる）、例えば、欧州特許出願公開Ｎｏ．　３２０，３０８および米国特許第４，８８３，７５０号に記載されている；Ｑベータレプリカーゼ、ＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載されている；鎖置換増幅（ＳＤＡ）および修復連鎖反応（ＲＣＲ）。なお他の増幅法は英国特許出願第２，２０２，３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５に記載されている。
【０２１４】
他の核酸増幅手順は、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（ＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ　８８／１０３１５）、例えば、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３８Ｒを包含する。欧州特許出願公開Ｎｏ．　３２９，８２２には、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のサイクル的合成を包含する、核酸増幅法が記載されている。ＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ　８９／０６７００には、ターゲット一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）に対するプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーションに基づく核酸配列の増幅スキーム、および引き続く配列の多数のＲＮＡコピーの転写が記載されている。他の増幅法、例えば、「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「ワンサイデッドＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ、１９８９）は当業者によく知られている。
【０２１５】
本発明のポリヌクレオチドの増幅された部分を使用して、よく知られている技術に従い適当なライブラリー（例えば、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から全長遺伝子を単離することができる。このような技術において、増幅に適当な１またはそれ以上のポリヌクレオチドのプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡまたはゲノム）をスクリーニングする。好ましくは、より大きい分子を含むように、ライブラリーをサイズで選択する。また、ランダムプライムドライブラリーは遺伝子の５’および上流領域を同定するために好ましいことがある。ゲノムライブラリーはイントロンを獲得し、５’配列を伸長するために好ましい。
【０２１６】
ハイブリダイゼーション技術のために、よく知られている技術を使用して部分的配列を標識化することができる（例えば、ニックトランスレーションまたは^３２Ｐを使用する末端標識化により）。次いで、変性された細菌コロニーを含有するフィルター（またはファージプラークを含有する菌叢）を標識化プローブとハイブリダイゼーションさせることによって、細菌またはバクテリオファージを一般にスクリーニングする（下記の文献を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）。ハイブリダイゼーションするクローニングまたはプラークを選択し、拡張し、ＤＮＡをそれ以上の分析のために単離する。
【０２１７】
例えば、部分的配列からのプライマーおよびベクターからのプライマーを使用するＰＣＲにより、ｃＤＮＡクローンを分析して追加の配列を定量することができる。制限地図および部分的配列を発生させて、１またはそれ以上のオーバーラップするクローンを同定することができる。次いで、標準技術を使用して完全な配列を決定することができ、このような技術は１系列の欠失クローンの発生を包含する。次いで、生ずるオーバーラップする配列を単一の隣接配列に組立てることができる。よく知られている技術に従い、適当なフラグメントを結合することによって、全長のｃＤＮＡ分子を発生させることができる。
【０２１８】
選択的に、部分的ｃＤＮＡ配列から全長のコーディング配列を得るために、増幅技術、例えば、前述の技術は有効であることがある。１つのこのような増幅技術は逆ＰＣＲであり（Ｔｒｉｇｌｉａ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：８１８６、１９９８参照）、これは遺伝子の既知領域においてフラグメントを発生させるために制限酵素を使用する。次いで分子内結合によりフラグメントを環化し、既知領域に由来する分岐プライマーを使用するＰＣＲのための鋳型として使用する。選択的アプローチにおいて、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に対して特異的なプライマーを使用する増幅により、部分的配列に隣接する配列を取出すことができる。典型的には、同一リンカープライマーおよび既知領域に対して特異的な第２プライマーを使用して増幅の第２ラウンドに、増幅された配列を付す。
【０２１９】
この手順に対する変法は、既知配列から反対方向のエクステンションを開始する２つのプライマーを使用し、ＷＯ　９６／３８５９１に記載されている。他のこのような技術は、「ｃＤＮＡ末端の急速増幅」またはＲＡＣＥとして知られている。この技術は既知配列の５’および３’に存在する配列を同定するために内部のプライマーおよび外部のプライマーの使用を包含し、これらのプライマーはポリＡ領域またはベクター配列に対してハイブリダイゼーションする。追加の技術は捕捉ＰＣＲ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ他、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌｉｃ．１：１１１９−１９、１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒ他、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：３０５５−６０、１９９１）を包含する。また、増幅を用いる他の方法を使用して全長のｃＤＮＡ配列を得ることができる。
【０２２０】
ある場合において、発現された配列タグ（ＥＳＴ）データベース、例えば、遺伝子バンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能である配列の中に提供された配列の分析により、全長のｃＤＮＡ配列を得ることが可能である。一般に、オーバーラップするＥＳＴについての検索はよく知られているプログラム（例えば、ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ検索）に従い実行することができ、そしてこのようなＥＳＴを使用して隣接する全長の配列を発生させることができる。また、全長のＤＮＡ配列はゲノムフラグメントの分析により得ることができる。
【０２２１】
本発明の他の態様において、本発明のポリヌクレオチド、またはその融合タンパク質または機能的同等物をコードするポリヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを組換えＤＮＡ分子において使用して、適当な宿主細胞中のポリペプチドの発現を指令することができる。遺伝暗号の固有のデジェネラシーのために、実質的に同一または機能的同等のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を産生し、これらの配列を使用して所定のポリペプチドのクローニングし、発現させることができる。
【０２２２】
当業者は理解するように、ある場合において、天然に存在しないコドンを有するポリペプチドエンコーディングヌクレオチド配列を産生することが好都合であることがある。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質の発現速度を増加させるか、あるいは所望の性質、例えば、天然に存在する配列から発生した転写物のそれより長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写物を産生することができる。
【０２２３】
その上、本発明のポリヌクレオチド配列は一般にこの分野において知られている方法を使用して操作して、種々の反応のためのポリペプチドエンコーディング配列を変更することができ、このような変更は遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する変更を包含するが、これらに限定されない。例えば、ランダムフラグメント化によるＤＮＡシャフリングおよび遺伝子フラグメントのＰＣＲ組立ておよび合成オリゴヌクレオチドを使用して、ヌクレオチド配列を操作することができる。さらに、部位特異的突然変異誘発を使用して新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変更し、コドン優先を変化させ、スプライス変異型を産生し、または突然変異を導入し、およびその他をすることができる。
【０２２４】
本発明の他の態様において、天然の、修飾された、または組換えの核酸配列を異種配列に結合して、融合タンパク質をコードするようにすることができる。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、商業的に入手可能な抗体が認識することができるキメラタンパク質をコードすることは有効であることがある。また、ポリペプチドをコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含有するように、融合タンパク質を操作し、こうして異種部分から離れた位置において、ポリペプチドを切断し、精製することができる。
【０２２５】
この分野においてよく知られている化学的方法を使用して、所望のポリペプチドをコードする配列を全体的にまたは部分的に合成することができる（下記の文献を参照のこと：Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｈ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３；Ｈｏｒｎ他（１９８０）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２）。選択的に、ポリペプチドのアミノ酸配列、またはそのを合成する化学的方法を使用して、タンパク質それ自体を製造することができる。例えば、種々の固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ、Ｊ．Ｔ．他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：２０２−２０４）を使用してペプチド合成を実行することができ、そして例えば、ＡＢＩ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ、カリフォルニア州パロアルト）を使用して、自動化合成を達成することができる。
【０２２６】
新しく合成されたペプチドは、調製用高性能液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、ＷＨＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）またはこの分野において入手可能な他の匹敵する技術により、実質的精製することができる。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解法）により確認することができる。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列、またはその任意の部分を直接的合成間に変更し、および／または化学的方法に従い他のタンパク質からの配列、またはその任意の部分と組合わせて、変異型ポリペプチドを産生することができる。
【０２２７】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチド、または機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を適当な発現ベクター、例えば、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳のために必要な因子を含有するベクターの中に挿入することができる。この分野においてよく知られている方法を使用して、問題のポリペプチドをコードする配列および適当な転写および翻訳の制御因子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎｖｉｖｏ遺伝的組換えを包含する。このような技術は、例えば、下記の文献に記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．他（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．他（１９８９）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．。
【０２２８】
ポリヌクレオチド配列を含有させかつ発現させるために、種々の発現ベクター／宿主系を利用することができる。これらの下記のものを包含するが、これらに限定されない：微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞；または動物細胞系。
【０２２９】
発現ベクターの中に存在する「制御因子」または「調節配列」は、ベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域−これらは宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う−である。このような因子は、それらの強度および特異的を変化させることができる。利用するベクター系および宿主に依存して、任意の数の転写および翻訳の因子（構成的および誘導可能なプロモーターを包含する）を使用することができる。例えば、細菌系においてクローニングするとき、誘導可能なプロモーター、例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラジョラ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターまたはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、マリイランド州ガイサースバーグ）およびその他を使用することができる。
【０２３０】
哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスからのプロモーターは一般に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の多数のコピーを含有する細胞系統を発生させることが必要である場合、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択可能なマーカーとともに好都合に使用することができる。
【０２３１】
細菌系において、発現されたポリペプチドに意図する使用に依存して、任意の数の発現ベクターを選択することができる。例えば、大量を必要とするとき、例えば、抗体を誘導するために、精製が容易である融合タンパク質の高いレベルの発現を指令するベクターを使用することができる。このようなベクターは下記のものを包含するが、これらに限定されない：多機能大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニングおよび発現ベクター、例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここで問題のポリペプチドをコードする配列をベクターの中にβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端のＭｅｔおよび引き続く７残基の配列とインフレームで結合してハイブリッドタンパク質を産生することができる；ｐＩＮベクター（ＶａｎＨｅｅｋｅ、Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）；およびその他。
【０２３２】
また、ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウイスコンシン州マディソン）を使用して、外来ポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着により溶解細胞から精製し、次いで遊離グルタチオンの存在下に溶離することができる。このような系において作られたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または因子ＸＡプロテアーゼ切断部位を含むように設計して、問題のクローニングされたポリペプチドをＧＳＴ部分から任意に解放させることができる。
【０２３３】
酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的または誘導可能なプロモーター、例えば、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨを含有する多数のベクターを使用することができる。概観については、下記の文献を参照のこと：Ａｕｓｕｂｅｌ他（前掲）およびＧｒａｎｔ他（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４。
【０２３４】
植物発現ベクターを使用する場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は多数のプロモーターにより推進可能である。例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターを単独で、またはＴＭＶからのオメガリーダー配列と組合わせてを使用することができる（Ｔａｋａｍａｔｓｕ、Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯＪ．　６：３０７−３１１）。選択的に、植物プロモーター、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小さいサブユニットまたは熱ショックプロモーターを使用することができる（Ｃｏｒｕｚｚｉ、Ｇ．他（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：１６７１−１６８０；Ｂｏｒｇｌｉｅ、Ｒ．他（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．他（１９９１）ＲｅｓｕｌｔｓＰｒｏｂｌ．ＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体仲介トランスフェクションにより、植物細胞の中に導入することができる。
【０２３５】
このような技術はｍｎｔ一般的に入手可能な概観の中に記載されている（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｈｏｂｂｓ、Ｓ．またはＭｕｒｒｙ、Ｌ．Ｅ．、ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌＹｅａｒｂｏｏｋｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；ｐｐ．１９１−１９６）。
また、昆虫系を使用して問題のポリペプチドを発現させることができる。例えば、１つのこのような系において、オートグラファ・カリフォミカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｍｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用して、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞またはトリコプルシア・ラーバエ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｌｕｓｉａｌａｒｖａｅ）における外来遺伝子を発現させる。
【０２３６】
ポリペプチドをコードする配列をウイルスの非必須領域、例えば、ポリヘドリン遺伝子の中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの条件下に配置することができる。ポリペプチドエンコーディング配列の首尾よい挿入はポリヘドリン遺伝子を不活性化し、コートタンパク質を欠如する組換えウイルスを産生する。次いで、例えば、問題のポリペプチドを発現するすることができるスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓ．　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞またはトリコプルシア・ラーバエ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａｅ）を感染するために、組換えウイルスを使用することができる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【０２３７】
哺乳動物宿主細胞において、一般に多数のウイルスに基づく系が入手可能である。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合において、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列から成るアデノウイルス転写／翻訳複合体の中に、問題のポリペプチドをコードする配列を結合することができる。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域中の挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現することができる生存可能なウイルスを得ることができる（Ｌｏｇａｎ、Ｊ．およびＳｈｅｎｋ、Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることができる。
【０２３８】
また、特異的開始シグナルを使用して、問題のポリペプチドをコードする配列のいっそう効率よい翻訳を達成することができる。このようなシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクターの中に挿入する場合、追加の転写または翻訳シグナルは不必要であることがある。
【０２３９】
しかしながら、コーディング配列のみ、またはその一部分を挿入する場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因的翻訳制御シグナルを準備すべきである。さらに、開始コドンはインサート全体の翻訳を保証するために正しいリーディングフレームであるべきである。外因的翻訳因子および開始コドンは、天然および合成の種々の由来であることができる。使用する特定の細胞系に適当であるエンハンサー、例えば、文献に記載されているものを含めることによって、発現効率を増強することができる（Ｓｃｈａｒｆ、Ｄ．他（１９９４）ＲｅｓｕｌｔｓＰｒｏｂｌ．ＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）。
【０２４０】
さらに、挿入された配列の発現をモジュレートするか、あるいは所望の方式で発現されたタンパク質をプロセシングする能力について、宿主株を選択することができる。このようなポリペプチドの修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化を包含するが、これらに限定されない。また、タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後のプロセシングを使用して、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能を促進することができる。このような翻訳活性のために特異的な細胞機構および特徴的なメカニズムを有する、異なる宿主細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷ１３８を選択して、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証することができる。
【０２４１】
組換えタンパク質の長期間の、高い収率の産生のために、安定な発現が一般に好ましい。例えば、発現ベクターを使用して問題のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞系統を形質転換することができ、ここで発現ベクターはウイルスの複製起点および／または内因性発現因子、および同一または別のベクター上の選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。ベクターの導入後、細胞を濃縮培地中で１〜２日間増殖させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択可能なマーカーの目的は選択に対する耐性を与えることであり、その存在は導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンを細胞型に対して適当な組織培養技術により増殖させることができる。
【０２４２】
任意の数の選択系を使用して、形質転換された細胞系統を回収することができる。これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない：単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ他（１９９７）Ｃｅｌｌ１１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ、Ｉ．他（１９９０）Ｃｅｌｌ２２：８１７−２３）（これらはそれぞれｔｋ．ｓｕｐ．−またはａｐｒｔ．ｓｕｐ．−細胞において使用することができる）。
【０２４３】
また、抗代謝物質、抗生物質または除草剤耐性を選択基準として使用することができる；例えば、ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ．他（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０）；ｎｐｔ、これはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ、Ｆ．他（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４０）；およびａｌｓまたはｐａｔ、これはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前掲）。
【０２４４】
追加の選択可能な遺伝子が記載されてきている、例えば、ｔｒｐＢ、これはトリプトファンの代わりにインドールを細胞が利用できるようにする、またはｈｉｓＤ、これはヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞が利用できるようにする（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４−５１）。可視マーカーの使用は、アントシアニン、ベータ−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのようなマーカーとともに普及されるようになり、形質転換体を同定するばかりでなく、かつまた特異的ベクター系に帰する一時的または安定なタンパク質の発言を定量するために広く使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ．Ａ．他（１９９５）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０２４５】
マーカー遺伝子の存在／非存在は問題の遺伝子がまた存在することを示唆するが、その存在および発現を確認することが必要である。例えば、ポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含有する組換え細胞はマーカー遺伝子の機能の非存在により同定することができる。選択的に、ポリペプチドをコードする配列と縦列でマーカー遺伝子を単一プロモーターの制御下に配置することができる。通常、誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は縦列遺伝子の発現をその上示す。
【０２４６】
選択的に、所望のポリヌクレオチド配列を含有しかつそれを発現する宿主細胞は、この分野において知られている種々の手順により同定することができる。これらの手順は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションおよびタンパク質のバイオアッセイまたはイムノアッセイ技術、これらは、例えば、核酸またはタンパク質を検出しおよび／または定量する、膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する。
【０２４７】
生産物に対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する、ポリヌクレオチドコード化生産物の発現を検出しかつ測定する、種々のプロトコルはこの分野において知られている。例は酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化免疫吸着アッセイ（ＦＡＣＳ）を包含する。所定のポリペプチド上の２つの非妨害性エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を利用する、２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイはいくつかの用途について好ましいことがあるが、競合結合アッセイを使用することもできる。これらおよび他のアッセイは、なかでも、下記の文献に記載されている：Ｈａｍｐｔｏｎ、Ｒ．他（１９９０）ＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＡＰＳＰｒｅｓｓ、ミネソタ州セントポール、およびＭａｄｄｏｘ、Ｄ．Ｅ．他（１９８３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６。
【０２４８】
広範な種類の標識および結合技術はこの分野において知られており、そして種々の核酸およびアミノ酸のアッセイにおいて使用することができる。ポリヌクレオチドに関係する配列を検出する標識化ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブは、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化または標識化ヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅を包含する。選択的に、配列、またはその任意の部分をｍＲＮＡプローブの産生のためのベクターの中にクローニングすることができる。
【０２４９】
このようなベクターはこの分野において知られており、商業的に入手可能であり、そして適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６および標識化ヌクレオチドの添加によりｉｎ　ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために使用することができる。これらの手順は種々の商業的に入手可能なキットを使用して実施することができる。使用できる適当なリポーター分子または標識は、ラジオヌクレオチド、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成因子、ならびに基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、およびその他を包含する。
【０２５０】
細胞培養物からのタンパク質の発現および回収に適当な条件下に、問題のポリヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞を培養することができる。組換え細胞が産生するタンパク質は、使用する配列および／またはベクターに依存して分泌されるか、あるいは細胞内に含有されることができる。当業者は理解するように、原核または真核細胞膜を通すコード化ペプチドの分泌を指令するシグナル配列を含有するように、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを設計することができる。他の組換え構築物を使用して、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチドに、問題のポリペプチドをコードする配列を結合することができる。
【０２５１】
このような精製促進ドメインは下記のものを包含するが、これらに限定されない：金属キレート化ペプチド、例えば、固定化金属上の精製を可能とするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上の精製を可能とするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティー精製系において使用するドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ．、ワシントン州シアトル）。精製促進するために、精製ドメインとコード化ポリペプチドとの間に切断可能なリンカー配列、例えば、因子ＸＡまたはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）に含めることができる。
【０２５２】
１つのこのような発現ベクターは、問題のポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸とを含有する融合タンパク質を発現させる。ヒスチジン残基はＰｏｒａｔｈ、Ｊ．他（１９９２）Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１に記載されているようにＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上の精製を促進するが、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製する手段を提供する。融合タンパク質を含有するベクターは、Ｋｒｏｌｌ、Ｄ．Ｊ．他（１９９３）、ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２：４４１−４５３に記載されている。
【０２５３】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチド、およびそのフラグメントは固相技術を使用して直接的ペプチド合成により製造することができる（ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄＪ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）。タンパク質合成はマニュアル技術または自動化により実行することができる。自動化合成は、例えば、アプライド・バイオシステムス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３１Ａペプチド合成装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して達成することができる。選択的に、種々のフラグメントを別々に化学的に合成し、化学的方法を使用して組合わせて全長の分子を産生することができる。
【０２５４】
抗体組成物、そのフラグメントおよび他の結合因子
他の面によれば、本発明は、さらに、本明細書に開示する腫瘍ポリペプチド、またはその一部分、変異型または誘導体に対して免疫学的結合性を示す、結合因子、例えば、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。抗体およびその抗原結合性フラグメントは、それが本発明のポリペプチドと検出可能なレベルで反応し（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、同様な条件下に無関係のポリペプチドと検出可能に反応しない場合、本発明のポリペプチドに「特異的に結合する」、「免疫学的に結合する」、および／またはそれと「免疫学的に反応性」であると言われる。
【０２５５】
免疫学的に結合性は、本明細書において使用するとき、一般に免疫グロブリン分子と、免疫グロブリンがそれに対して特異的である抗原との間で起こる型の非共有結合の相互作用を意味する。免疫学的結合性相互作用は相互作用の解離定数（Ｋ_ｄ）で表すことができ、ここでより小さいＫ_ｄはより大きいアフィニティーを表す。選択したポリペプチドの免疫学的結合性は、この分野においてよく知られている方法により定量することができる。
【０２５６】
１つのこのような方法は抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定することを含み、ここでそれらの速度は複合体の相手の濃度、相互作用のアフィニティー、および両方の方向における速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依存する。こうして、「オンの速度定数」（Ｋ_ｏｎ）および「オフの速度定数」（Ｋ_ｏｆｆ）の両方は、濃度および会合および解離の実際の速度を計算することによって決定することができる。Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎの比は、アフィニティーに関係しないすべてのパラメーターの削除を可能とし、こうして解離定数Ｋ_ｄに等しい。一般に、下記の文献を参照のこと：Ｄａｖｉｅｓ他（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３。
【０２５７】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原の結合に参加する免疫グロブリン分子の部分を意味する。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端の可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは「超可変性領域」と呼ばれ、これらの領域は「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られている、いっそう保存されたフランキングストレッチ間に介在する。
【０２５８】
こうして、用語「ＦＲ」は免疫グロブリン中の超可変性領域間にかつそれに隣接して自然に見出されるアミノ酸配列を意味する。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変性領域および重鎖の３つの超可変性領域は三次元空間中で互いに関して位置して抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は結合した抗原の三次元表面に対して相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変性領域は「相補性決定領域）または「ＣＤＲ」と呼ばれる。
【０２５９】
さらに、結合因子は癌、例えば、前立腺癌をもつ患者または癌をもたない患者を、本明細書において提供される代表的アッセイにより、区別することができる。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、好ましくは疾患を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において癌の存在を示すシグナルを発生させる。選択的に、またはさらに、抗体は癌をもたない個体の少なくとも約９０％において疾患の非存在を示すシグナルを発生させるであろう。
【０２６０】
結合因子がこの要件を満足するかどうかを決定するために、癌をもつか、あるいはもなたい患者からの生物学的試料（例えば、血液、血清、痰、尿および／または腫瘍バイオプシー）を本明細書に記載するように結合因子に結合するポリペプチドの存在についてアッセイすることができる。好ましくは、統計的に有意な数の疾患をもつか、あるいはもなたい試料をアッセイする。各結合因子は上記基準を満足すべきである；しかしながら、当業者は認識するように、結合因子を組合わせて使用して感度を改良することができる。
【０２６１】
上記要件を満足する任意の因子は結合因子であることができる。例えば、結合因子はペプチド成分、ＲＮＡ分子またはポリペプチドをもつか、あるいはもなたいリボソームであることができる。好ましい態様において、結合因子は抗体またはその抗原結合性フラグメントである。抗体はこの分野において知られている種々の技術により調製することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８。
【０２６２】
一般に、細胞培養技術、例えば、本明細書に記載するようなモノクローナル抗体の発生により、または抗体遺伝子を適当な細菌または哺乳動物細胞宿主の中にトランスフェクトして、組換え抗体の産生を可能とすることによって、抗体を製造することができる。１つの技術において、ポリペプチドを含んでなる免疫原を種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）に最初に注射する。この工程において、本発明のポリペプチドは修飾を含まない免疫原として働くことができる。
【０２６３】
選択的に、特に比較的短いポリペプチドについて、ポリペプチドを担体タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンに結合させる場合、よりすぐれた免疫応答を誘発させることができる。好ましくは１またはそれ以上のブースター免疫化を組込んだ前もって決定したスケジュールに従い、免疫原を動物宿主に注射し、周期的に動物から血を取る。次いで、例えば、適当な固体支持体にカップリングされたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリペプチドに対して特異的なポリクローナル抗体をこのような抗血清から精製することができる。
【０２６４】
例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術、およびそれに対する改良された技術を使用して、問題の抗原性ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体を調製することができる。簡単に述べると、これらの方法は所望の特異性（すなわち、問題のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生することができる永久分裂能化細胞系統の調製を包含する。このような細胞系統は、例えば、前述したように免疫化された動物から得られた脾細胞から、産生することができる。次いで、例えば、骨髄腫細胞の融合相手、好ましくは免疫化された動物と同系であるものとの融合により、脾細胞を免疫化する。
【０２６５】
種々の融合技術を使用することができる。例えば、脾細胞および骨髄腫細胞を非イオン性洗浄剤と数分間組合わせ、次いでハイブリッド細胞の増殖を支持するが、骨髄腫細胞の増殖を支持しない選択培地上に低密度でプレートする。好ましい選択技術において、ＨＡＴ（ハイポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間後、通常約１〜２週後、ハイブリッドのコロニーが観測される。単一コロニーを選択し、それらの培養上清をポリペプチドに対する結合性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマは好ましい。
【０２６６】
モノクローナル抗体を増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離することができる。さらに、種々の技術、例えば、適当な脊椎動物宿主、例えば、マウスの腹腔の中へのハイブリドーマ細胞の注射を使用して、収率を増加させることができる。次いで、モノクローナル抗体を腹水または血液から収集することができる。慣用技術、例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出により、汚染物質を抗体から除去することができる。本発明のポリペプチドは精製プロセス、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程において使用することができる。
【０２６７】
抗体分子の免疫学的結合性を示すことができる抗原結合部位を含んでなる、多数の療法上有効な分子がこの分野において知られている。タンパク質分解性酵素パパインはＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかのフラグメントを産生し、それのうちの２つ（「Ｆ（ａｂ）」）の各々は無傷の抗原結合部位を含む共有結合のヘテロダイマーを含んでなる。酵素はＩｇＧ分子を切断していくつかのフラグメントを産生することができ、これらのフラグメントは両方の抗原結合部位を含んでなる「Ｆ（ａｂ’）_２」フラグメントを包含する。
【０２６８】
「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ、稀な場合においてＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的タンパク質分解的切断により製造することができる。しかしながら、Ｆｖフラグメントはこの分野において知られている組換え技術により普通に誘導される。Ｆｖフラグメントは、天然抗体分子の抗原認識および結合能力の多くを保持する抗原結合部位を含む、非共有結合のＶ_Ｈ：：Ｖ_Ｌヘテロダイマーを包含する。Ｉｎｂａｒ他（１９７２）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎ他（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈ他（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９：４０９１−４０９６。
【０２６９】
一本鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは共有結合したＶ_Ｈ：：Ｖ_Ｌヘテロダイマーであり、リンカーをコードするポリペプチドにより結合されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする遺伝子を包含する遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎ他（１９８８）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８５（１６）：５８７９−５８８３。自然に凝集した−しかし化学的に分離された−抗体のＶ領域からの軽および重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造に構造的に類似する三次元構造にフォールドするｓＦｖ分子に変換するために、化学的構造を区別する、多数の方法が記載されてきている。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｈｕｓｔｏｎ他に対する米国特許第５，０９１，５１３号および米国特許第５，１３２，４０５号：およびＬａｄｎｅｒ他に対する米国特許第４，９４６，７７８号。
【０２７０】
前述の分子の各々は、それぞれ重鎖および軽鎖のＦＲ組間に介在する、重鎖および軽鎖のＣＤＲ組を包含し、これらはＣＤＲＳに対する支持を提供し、互い関係するＣＤＲの空間的関係を定める。本明細書において使用するとき、用語「ＣＤＲ組」は重鎖および軽鎖のＶ領域の３つの超可変性領域を意味する。重鎖または軽鎖のＮ末端から進行して、これらの領域はそれぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表示される。
【０２７１】
したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のＶ領域の各々からのＣＤＲ組を含んでなる、６つのＣＤＲを包含する。単一ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）を含んでなるポリペプチドを本明細書において「分子認識単位」と呼ぶ。多数の抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は結合した抗原との広範な接触を形成し、ここで大部分の広範な接触は重鎖ＣＤＲ３との接触であることが証明された。こうして、分子認識単位は抗原結合部位の特異的に主として関係する。
【０２７２】
本明細書において使用するとき、用語「ＦＲ組」は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲ組のＣＤＲをフレームする、４つのフランキングアミノ酸配列を意味する。いくつかのＦＲ残基は結合した抗原と接触することができる；しかしながら、ＦＲは抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基へのＶ領域のフォールディングに主として関係する。ＦＲにおいて、ある種のアミノ残基およびある種の構造的特徴は非常に高度に保存される。
【０２７３】
これに関して、すべてのＶ領域の配列は約９０アミノ酸残基の内部のジサルファイドループを含有する。Ｖ領域が結合性部位にフォールドするとき、ＣＤＲは抗原結合表面を形成する突起するループモチーフとして展示される。一般に、精確なＣＤＲアミノ酸配列に無関係に−ある種の「カノニカル」構造にフォールドされたＣＤＲループの形状に影響を及ぼすＦＲの保存された構造的領域が存在することが認識されている。さらに、ある種のＦＲ残基は非共有結合のドメイン間接触に参加し、抗体の重鎖および軽鎖の相互作用を安定化することが知られている。
【０２７４】
非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含んでなる、多数の「ヒト化」抗体分子が記載されてきており、これらは下記のものを包含する：齧歯類Ｖ領域を有するキメラ抗体およびヒト定常領域に融合されたそれらの関連するＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｇｌｉｏ他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗ他（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎ他（１９８７）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４７：３５７７−３５８３）、適当なヒト抗体の定常ドメインとの融合前にヒト支持ＦＲの中にグラフト化された齧歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓ他（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５）、および組換え的にベニヤ化された齧歯類ＦＲにより支持された齧歯類ＣＤＲ（欧州特許出願公開Ｎｏ．５１９，５９６、１９９２年１２月２３日発行）。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるそれらの部分の療法的用途の期間および有効性を制限する、齧歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小とするように設計される。
【０２７５】
本明細書において使用するとき、用語「ベニヤ化ＦＲ」および「組換え的にベニヤ化されたＦＲ」は、天然ＦＲポリペプチドフォールディング構造の実質的にすべてを保持する抗原結合部位を含んでなる異種分子を提供するために、例えば、齧歯類の重鎖または軽鎖のＶ領域からの、ＦＲ残基をヒトＦＲ残基で選択的に置換することを意味する。ベニヤ化技術は、抗原結合部位のリガンド結合特性が主として重鎖および軽鎖の構造および相対的位置により決定されたという理解に基づく。
【０２７６】
Ｄａｖｉｅｓ他（１９９０）Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　５９：４３９−４７３。こうして、抗原結合特異性はヒト化抗体においてのみ保存することができ、ここでＣＤＲ構造、互いとのそれらの相互作用、およびＶ領域ドメインの残部とのそれらの相互作用は注意して維持される。ベニヤ化技術技術を使用することによって、免疫系が容易に直面する外部の（例えば、溶媒アクセス可能な）ＦＲ残基をヒト残基で選択的に置換して、弱く免疫原性の、または実質的に非免疫原性のベニヤ化表面を含んでなるハイブリッド分子を形成する。
【０２７７】
ベニヤ化プロセスにおいて、Ｋａｂａｔ他、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．ＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔＰｒｉｎｔｉｎｇＯｆｆｉｃｅ、１９８７）により収集されたヒト抗体可変ドメインについての入手可能な配列データ、Ｋａｂａｔデータベースに対する最新情報、および他のアクセス可能な米国および外国のデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を使用する。Ｖ領域のみアミノ酸の溶媒アクセス可能性は、ヒトおよびネズミ抗体フラグメントについて既知の三次元構造から推定することができる。ネズミ抗原結合部位のベニヤ化において、２つの一般的工程が存在する。
【０２７８】
最初に、問題の抗体分子の可変ドメインのＦＲを、上に同定した源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較する。次いで、最も相同的なヒトＶ領域を対応するネズミアミノ酸と残基対残基で比較する。ヒト対応物と異なるネズミＦＲ中の残基を、この分野においてよく知られている組換え技術によりヒト部分の中に存在する残基と置換する。少なくとも部分的に暴露された（溶媒アクセス可能な）部分を使用してのみ残基の交換を実施し、そしてＶ領域の三次構造に対して有意な効果を有することができるアミノ酸残基、例えば、プロリン、グリシンおよび帯電したアミノ酸の置換において注意を払う。
【０２７９】
この方法において、生ずる「ベニヤ化」ネズミ抗原結合部位はこうして下記の残基を保持するように設計される：ネズミＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接する残基、埋没されたまたはほとんど埋没された（溶媒アクセス可能）として同定された残基、重鎖および軽鎖ドメイン間の非共有結合的（例えば、静電的および疎水性）接触に参加すると考えられる残基、およびＣＤＲループの「カノニカル」三次構造に影響を及ぼすと考えられるＦＲの保存された構造的領域からの残基。次いで、これらの設計基準を使用して組換えヌクレオチド配列を調製し、これらの組換えヌクレオチド配列はネズミ抗原結合部位の重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲを見掛けのヒトＦＲに組合わせ、ネズミ抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体を発現させるために、これらのヒトＦＲを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトすることができる。
【０２８０】
本発明の他の態様において、本発明のモノクローナル抗体を１またはそれ以上の治療剤に対してカップリングさせることができる。これに関して適当な治療剤は、放射性核種、分化インデューサー、薬剤、トキシン、およびそれらの誘導体を包含する。好ましい放射性核種は、^９０Ｙ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１８６Ｒｅ、^２１１Ａｔ、および^２１２Ｂｉを包含する。好ましい薬剤は、メトトレキセート、およびピリミジンおよびプリンアナローグを包含する。好ましい分化インデューサーは、ホルボールエステルおよび酪酸を包含する。好ましいトキシンは、リシン、アブリン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシン、シゲラ［赤痢菌］（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）トキシン、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を包含する。
【０２８１】
治療剤を適当なモノクローナル抗体に直接的または間接的（すなわち、リンカー基を介して）にカップリング（例えば、共有結合）させることができる。治療剤と抗体との間の直接的反応は、各々が他と反応することができる置換基を有するとき、可能である。例えば、一方の求核基、例えば、アミノまたはスルフヒドリル基は、他方のカルボニル含有基、例えば、無水物または酸ハロゲン化物、またはすぐれた離脱基（例えば、ハライド）を含有するアルキル基と反応することができる。
【０２８２】
選択的に、リンカー基を介して治療剤および抗体をカップリングさせることが望ましいことがある。リンカー基は、治療剤から抗体を離して、結合可能性を妨害するスペーサーとして機能することができる。また、リンカー基は治療剤上または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させ、こうしてカップリング効率を増加させる働きをすることができる。また、化学的反応性の増加は、そうでなければ不可能である、治療剤の使用、または治療剤上の官能基の使用を促進することができる。
【０２８３】
当業者にとって明らかになるように、ホモ−およびヘテロ−機能性の両方の、種々の二機能性および多機能性試薬（例えば、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、イリノイ州ロックフォード、のカタログに記載されている試薬）をリンカー基として使用することができる。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化された炭水化物残基を通して、実施することができる。このような方法を記載する多数の参考文献が存在する。例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌ他に対する米国特許第４，６７１，９５８号。
【０２８４】
本発明の免疫複合体の抗体部分を含有しないとき、治療剤はいっそう効力のある場合、細胞の中への内在化時にまたはその間に切断可能なリンカー基を使用することが望ましいことがある。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されてきている。これらのリンカー基からの治療剤の細胞内解放のメカニズムは下記の反応による切断を包含する：ジサルファイド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒに対する米国特許第４，４８９，７１０号）、光不安定性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒ他に対する米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導化アミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎ他に対する米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体仲介加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌに対する米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒ他に対する米国特許第４，５６９，７８９号）。
【０２８５】
２以上の治療剤を抗体にカップリングさせることが望ましいことがある。１つの態様において、治療剤の多数の分子を１つの抗体分子にカップリングさせる。他の態様において、２以上の型の治療剤を１つの抗体にカップリングさせることができる。特定の態様に無関係に、２以上の治療剤との免疫複合体を種々の方法で調製することができる。例えば、２以上の治療剤を抗体分子に直接カップリングさせるか、あるいは多数の結合部位を提供するリンカーを使用することができる。選択的に、担体を使用することができる。
【０２８６】
担体は種々の方法、例えば、直接的またはリンカー基を介する共有結合により治療剤を有することができる。適当な担体は、タンパク質、例えば、アルブミン（例えば、Ｋａｔｏ他に対する米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチドおよび多糖、例えば、アミノデキストリン（例えば、Ｓｈｉｈ他に対する米国特許第４，６９９，７８４号）を包含する。また、担体は非共有結合により、または、例えば、リポソームベヒクル内の、包膜（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および米国特許第４，８７３，０８８号）により治療剤を支持することができる。
【０２８７】
放射性核種因子に対して特異的担体は、放射性ハロゲン化小分子およびキレート化化合物を包含する。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号には、代表的な放射性ハロゲン化小分子およびそれらの合成が記載されている。放射性核種のキレートはキレート化化合物から形成することができ、これらのキレート化化合物は窒素および硫黄原子、例えば、金属、または金属酸化物、放射性核種と結合するためのドナー原子を含有する化合物を包含する。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎ他に対する米国特許第４，６７３，５６２号には、代表的キレート化合物およびそれらの合成が開示されている。
【０２８８】
Ｔ細胞組成物
本発明は、他の面において、本明細書に記載する腫瘍ポリペプチド、またはそれらの変異型または誘導体に対して特異的なＴ細胞を提供する。一般に、このような細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏにおいて、標準プロトコルに従い調製することができる。例えば、Ｔ細胞は、商業的に入手可能な細胞分離系、例えば、下記のものを使用して、患者の骨髄、末梢血液、または骨髄または末梢血液の画分から単離することができる：ネキセル・セラピューディクス・インコーポレーテッド（ＮｅｘｅｌｌＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アービン）から入手可能であるＩｓｏｌｅｘ^ＴＭＳｙｓｔｅｍ（また、下記の文献を参照のこと：米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３）。選択的に、Ｔ細胞は関係するまたは無関係のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞系統または培養物から誘導することができる。
【０２８９】
ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）でＴ細胞を刺激することができる。このような刺激は、問題のポリペプチドに対して特異的であるＴ細胞の発生を可能とするために十分な条件下にかつ時間の間実行される。好ましくは、本発明の腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをデリバリーベヒクル、例えば、微小球内に存在させて、特異的Ｔ細胞の発生を促進する。
【０２９０】
Ｔ細胞が特異的の増殖し、サイトカインを分泌し、またはペプチドで被覆されたまたはポリペプチドをコードする遺伝子を発現するターゲット細胞を殺す場合、Ｔ細胞は本発明のポリペプチドに対して特異的であると考える。種々の標準技術に従い、Ｔ細胞の特異性を評価することができる。例えば、クロム解放アッセイまたは増殖アッセイにおいて、陰性対照に比較して、溶解および／または増殖の３倍以上の増加の刺激指数はＴ細胞の特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、下記の文献に記載されているように実行することができる：Ｃｈｅｎ他、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４：１０６５−１０７０、１９９４。選択的に、Ｔ細胞増殖の検出は種々の既知技術により達成することができる。
【０２９１】
例えば、Ｔ細胞増殖はＤＮＡ合成速度の増加を測定することによって検出することができる（例えば、トリチウム化チミジンを使用するＴ細胞培養物のパルス標識化、およびＤＮＡの中に導入されたトリチウム化チミジン量の測定による）。典型的には、３〜７日間の腫瘍ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、Ｔ細胞増殖を少なくとも２倍増加させるであろう。
【０２９２】
前述したように２〜３時間接触させると、標準サイトカインアッセイにより測定して、Ｔ細胞を活性化させ、ここでサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＴＮＦ−γ）解放レベルの２倍の増加はＴ細胞活性化を示す（下記の文献を参照のこと：Ｃｏｌｉｇａｎ他、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ１９９８））。腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現性ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋であることができる。腫瘍ポリペプチド特異的Ｔ細胞は標準技術により拡大することができる。好ましい態様において、Ｔ細胞は患者、関係するドナーまたは無関係のドナーに由来し、下記の刺激および拡大後に患者に投与される。
【０２９３】
療法上の目的で、腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の数をｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおいて拡張することができる。Ｔ細胞増殖因子、例えば、インターロイキン−２、および／または腫瘍ポリペプチドを合成する刺激因子の細胞を添加するか、あるいは添加しないで、腫瘍ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチドに対して、Ｔ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで暴露することができる。選択的に、腫瘍ポリペプチドの存在下に増殖する１またはそれ以上のＴ細胞の数をクローニングにより拡張することができる。細胞をクローニングする方法はこの分野においてよく知られており、そして限界希釈法を包含する。
【０２９４】
医薬組成物
追加の態様において、本発明は、単独で、または１またはそれ以上の治療法と組合わせて細胞または動物に投与するための、１またはそれ以上の本明細書に開示するポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／または抗体組成物と、薬学上許容される担体とを含んでなる処方物に関する。
【０２９５】
理解されるように、必要に応じて、本明細書に開示する組成物はその上他の薬剤、例えば、他のタンパク質またはポリペプチドまたは種々の療法上活性な薬剤と組合わせて投与することができる。事実、追加の薬剤がターゲット細胞または宿主組織との接触時に有意な悪い作用を引き起こさないかぎり、添加することができる他の成分に対する制限は事実上存在しない。次いで、組成物は特定の場合において必要に応じて種々の他の薬剤と一緒に送出すことができる。このような組成物は宿主細胞または他の生物学的源から精製することができるか、あるいは選択的に本明細書に記載するように化学的に合成することができる。同様に、このような組成物は置換されたまたは誘導化されたＲＮＡまたはＤＮＡ組成物をさらに含んでなることができる。
【０２９６】
したがって、本発明の他の面において、１またはそれ以上の本明細書に開示するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはＴ細胞組成物と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物が提供される。ある好ましい態様において、本発明の医薬組成物は、予防的および治療的ワクチン適用において使用するための本発明の免疫原性ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド組成物を含んでなる。一般に、ワクチン組成物は、例えば、下記の文献に記載されている：Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、″ＶａｃｃｉｎｅＤｅｓｉｇｎ（ｔｈｅｓｕｂｕｎｉｔａｎｄａｄｊｕｖａｎｔａｐｐｒｏａｃｈ））″、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（ＮＹ、１９９５）。一般に、このような組成物は、１またはそれ以上の本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド組成物と、１またはそれ以上の免疫刺激因子とを含んでなるであろう。
【０２９７】
当業者にとって明らかなように、本明細書に記載する任意の医薬組成物は本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学上許容される塩を含有することができる。このような塩は、例えば、薬学上許容される無毒の塩基、例えば、有機塩基の塩（例えば、第一級、第二級および第三級アミンおよび塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム）を包含する。
【０２９８】
他の態様において、本発明の例示的免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物は、ポリペプチドがｉｎ　ｓｉｔｕで発生されるように、１またはそれ以上の前述のポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる。前述したように、ポリヌクレオチドはこの分野において知られている種々のデリバリー系により投与することができる。
【０２９９】
事実、多数の遺伝子デリバリー技術はこの分野においてよく知られており、例えば、下記の文献に記載されている：Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　１５：１４３−１９８、１９９８、およびその中に引用された参考文献。もちろん、適当なポリヌクレオチド発現系は、患者における発現の必要な調節ＤＮＡ調節配列を含有するであろう（例えば、適当なプロモーターおよび終結シグナル）。選択的に、細菌デリバリー系は、この場合において、細胞表面上のポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、あるいはこのようなエピトープを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を包含することができる。
【０３００】
したがって、ある態様において、本明細書に開示する免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の既知のウイルスをベースとする系を使用して、発現のために適当な哺乳動物宿主細胞の中に導入される。１つの例示的態様において、レトロウイルスは遺伝子デリバリー系のために好都合かつ有効なプラットフォームを提供する。この分野において知られている技術に従い、本発明のポリペプチドをコードする選択されたポリヌクレオチドをベクターの中に挿入し、レトロウイルス粒子の中にパッケージすることができる。
【０３０１】
次いで、組換えウイルスを単離し、被検体に送出すことができる。多数の例示的レトロウイルス系が記載されてきている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ．Ｄ．（１９９０）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１：５−１４；Ｓｃａｒｐａ他（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓ他（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８０３３−８０３７；およびＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９）。
【０３０２】
さらに、多数の例示的アデノウイルスをベースとする系も記載されてきている。宿主ゲノムの中に統合するレトロウイルスと異なり、アデノウイルスは染色体外に存続し、こうして挿入突然変異誘発に関連する危険を最小にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔ他（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ他（１９９４）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈ他（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒ他（１９９４）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６−６２９；およびＲｉｃｈ他（１９９３）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：４６１−４７６）。
【０３０３】
また、種々のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系がポリヌクレオチドのデリバリーのために開発された。ＡＡＶベクターは、この分野においてよく知られている技術を使用して容易に構築することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：米国特許第５，１７３，４１４号および米国特許第５，１３９，９４１号；国際公開Ｎｏ．ＷＯ９２／０１０７０およびＷＯ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ他（１９８８）Ｍｏｌｅｃｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ他（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ９０（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｂ．Ｊ．（１９９２）ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｎ．（１９９２）ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ、Ｒ．Ｍ．（１９９４）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１：１６５−１６９；およびＺｈｏｕ他（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５。
【０３０４】
遺伝子転移により本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを送出すために有効な追加のウイルスベクターは、ウイルスのポックスファミリー、例えば、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスに由来するものを包含する。１例として、新規な分子を発現するワクシニアウイルス組換え体を次のようにして構築することができる。
【０３０５】
まず、ワクシニアプロモーターおよびフランキングワクシニアＤＮＡ配列、例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列に隣接するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡを適当なベクターの中に挿入する。次いで、このベクターを使用して細胞をトランスフェクトし、この細胞を同時にワクシニアで感染させる。相同的組換えはワクシニアプロモーター＋問題のポリペプチドをコードする遺伝子をウイルスゲノムの中に挿入する働きをする。５−ブロモデオキシウリジンの存在下に細胞を培養し、それに対して耐性であるウイルスプラークを取り上げることによって、生ずるＴＫ．ｓｕｐ（−）組換え体を選択することができる。
【０３０６】
ワクシニアをベースとする感染／トランスフェクション系を好都合に使用して、生物の宿主細胞中で１またはそれ以上の本明細書に記載するポリペプチドの誘導可能な、一時的発現または共発現を提供することができる。この特定の系において、まず、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体で細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏ感染させる。このポリメラーゼは絶妙な特異性を展示し、ここでそれはＴ７ポリメラーゼを支持する鋳型のみを転写する。感染後、細胞をポリヌクレオチドまたは問題のポリヌクレオチドでトランスフェクトし、Ｔ７プロモーターにより推進する。
【０３０７】
ワクシニアウイルス組換え体からの細胞質中で発現されたポリメラーゼはトランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次いでこれは宿主翻訳機構によりポリペプチドに翻訳される。この方法はＲＮＡおよびその翻訳産物の高いレベルの、一時的、細胞質産生を提供する。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６。
【０３０８】
選択的に、アビポックスウイルス、例えば、フォウル痘およびカナリポックスウイルスをまた使用して問題のコーディング配列を送出すことができる。組換え体アビポックスウイルスは、哺乳動物病原体から免疫原を発現し、非トリ種に添加したとき、保護的免疫性を与えることが知られている。アビポックスベクターの使用はヒトまたは他の哺乳動物種において特定の望ましい。なぜなら、アビポック遺伝子のメンバーは感受性トリ種において産生的にのみ複製することができ、形質転換哺乳動物細胞において感染性ではないからである。アビポックウイルスはこの分野において知られており、そしてワクシニアウイルスの産生に関して前述したように、遺伝的組換えを使用する。例えば、下記の文献を参照のこと：ＷＯ　９１／０３４２９；およびＷＯ　９２／０３５４５。
【０３０９】
また、本発明のポリヌクレオチド組成物のデリバリーのために、多数のアルファウイルス、例えば、下記の文献に記載されているベクターを使用することができる：米国特許第５，８４３，７２３号；米国特許第６，０１５，６８６号；米国特許第６，００８，０３５号および米国特許第６，０１５，６９４号。ベネゼラウマ脳炎（ＶＥＥ）を使用することもでき、その例示的例は米国特許第５，５０５，９４７号および米国特許第５，６４３，５７６号に記載されている。
【０３１０】
その上、複合体ベクター、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載されているアデノウイルスキメラベクターを本発明における遺伝子デリバリーのために使用することもできる。
【０３１１】
これらおよび他の既知のウイルスをベースとするデリバリー系についての追加の情報は、例えば、下記の文献に記載されている：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３１７−３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒ他、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒ他、Ｖａｃｃｉｎｅ８：１７−２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、米国特許第４，７６９，３３０号、および米国特許第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，３４５，２４２；ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６−６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１−４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２１５−２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１４９８−１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８８：２８３８−２８４８、１９９３；およびＧｕｚｍａｎ他、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７、１９９３。
【０３１２】
ある態様において、ポリヌクレオチドをターゲット細胞のゲノムの中に統合することができる。この統合は相同的組換え（遺伝子置換）を介する特異的位置および向きであることができるか、あるいはランダムの、非特異的位置（遺伝子増強）に統合することができる。なお他の態様において、ポリヌクレオチドは細胞の中にＤＮＡの別々の、エピソームセグメントとして安定に維持することができる。このようなポリヌクレオチドのセグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期に対して独立に、またはそれと同期に維持および複製を可能とするために十分なに配列をコードする。発現構築物が細胞に送出され、そして細胞の中にポリヌクレオチドが止まる方法は、使用する発現構築物の型に依存する。
【０３１３】
本発明の他の態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、下記の文献に記載されているように、「裸」ＤＮＡとして投与／送出される：Ｕｌｍｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−１７４９、１９９３およびＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１６９１−１６９２、１９９３。細胞の中に効率よく輸送される、生物分解性ビーズ上にＤＮＡを被覆することによって、裸ＤＮＡの吸収を増加させることができる。
【０３１４】
なお他の態様において、本発明の組成物は粒子衝撃アプローチを介して送出すことができ、それらの多数は記載されてきている。１つの例示的例において、気体推進粒子加速は装置、例えば、パウダージェット・ファーマシューティカルス（Ｐｏｗｄｅｒｊｅｔ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）ＰＬＣ（英国オックスフォード）およびパウダージェット・ワクチンス・インコーポレーテッド（ＰｏｗｄｅｒｊｅｔＶａｃｃｉｎｅｓＩｎｃ．）（ウイスコンシン州マディソン）製の装置を使用して達成可能であり、それらのいくつかの例は下記の文献に記載されている：米国特許第５，８４６，７９６号；米国特許第６，０１０，４７８号；米国特許第５，８６５，７９６号；米国特許第５，５８４，８０７号；およびＥＰ特許Ｎｏ．０，５００，７９９。このアプローチは針を含まないデリバリーアプローチを提供し、ここで微視的粒子、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの粒子の乾燥粉末状処方物は、手で保持する装置により発生されたヘリウムガスのジェット中で高速に加速され、粒子は問題のターゲット組織の中に推進される。
【０３１５】
関係する態様において、本発明の組成物の針を含まないガス推進注入に有効な他の装置および方法は、バイオジェット・インコーポレーテッド（Ｂｉｏｊｅｔ，Ｉｎｃ）（オレゴン州ポートランド）により提供される装置を包含し、それらのいくつかの例は下記の文献に記載されている：米国特許第４，７９０，８２４号；米国特許第５，０６４，４１３号；米国特許第５，３１２，３３５号；米国特許第５，３８３，８５１号；米国特許第５，３９９，１６３号；米国特許第５，５２０，６３９号および米国特許第５，９９３，４１２号。
【０３１６】
他の態様によれば、本明細書に記載する医薬組成物は１またはそれ以上の免疫刺激因子と、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞および／またはＡＰＣ組成物とを含んでなるであろう。免疫刺激因子は、外因的抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞仲介）を増強または強化する、本質的に任意の物質を意味する。免疫刺激因子の１つの好ましい型はアジュバントを含んでなる。多数のアジュバントは、急速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油、および免疫応答の刺激因子、例えば、脂質Ａ、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）またはヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来タンパク質を含有する。
【０３１７】
ある種のアジュバントは商業的に入手可能であり、それらの例は次の通りである：フロインド不完全アジュバントおよびフロインド完全アジュバント（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト）；メルクアジュバント６５（ＭｅｒｃｋａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、ニュージャージイ州ローウェイ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ、ペンシルベニア州フィラデルフィア）；アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル（明礬）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン的またはアニオン的に誘導化された多糖；ポリホスファゼン；生物分解性微小球；モノホスホリル脂質Ａおよびｑｕｉｌ　Ａ。また、サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、−７、−１２、および他の増殖因子をアジュバントとして使用することができる。
【０３１８】
本発明のある態様において、アジュバント組成物は好ましくは主としてＴｈ１型の免疫応答を誘導するものである。高いレベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞仲介免疫応答の誘導に好適である傾向がある。対照的に、高いレベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導に好適である傾向がある。
【０３１９】
本発明において提供されるワクチンの適用後、患者はＴＨ１型およびＴｈ２型応答を包含する免疫応答を支持するであろう。好ましい態様において、応答は主としてＴｈ１型であり、Ｔｈ１型サイトカインのレベルはＴｈ２型サイトカインのレベルよりも大きい程度に増加するであろう。これらのサイトカインのレベルは標準アッセイにより容易に評価することができる。サイトカインファミリーの概観については、下記の文献を参照のこと：ＭｏｓｍａｎおよびＣｏｆｆｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５−１７３、１９８９。
【０３２０】
主としてＴｈ１型応答を誘導するある種の好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ、とアルミニウム塩との組合わせを包含する。ＭＰＬ^ＴＭアジュバントは、コリクサ・コーポレーション（ＣｒｉｘａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能である（ワシントン州シアトル；例えば、下記の文献を参照のこと：米国特許第４，４３６，７２７号；米国特許第４，８７７，６１１号；米国特許第４，８６６，０３４号および米国特許第４，９１２，０９４号）。また、ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（ここでＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）は主としてＴｈ１応答を誘導する。
【０３２１】
このようなオリゴヌクレオチドはこの分野においてよく知られており、そして例えば、下記の文献に記載されている：ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８および米国特許第６，００８，２００号および米国特許第５，８５６，４６２号。また、免疫刺激性ＤＮＡ配列が、例えば、Ｓａｔｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：３５２、１９９６に記載された。他の好ましいアジュバントは、サポニン、例えば、ＱｕｉｌＡ、またはその誘導体を含んでなり、ＱＳ２１およびＱＳ７ａＱＵＩＬＡＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ．、マサチュセッツ州ファーミンガム）；エシン；ジギトニン；またはジョスソフィラ（Ｇｙｓｓｏｆｐｉｌａ）またはケノポジウム・キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍｑｕｉｎｏａ）サポニンを包含する。他の好ましい処方物は、２以上のサポニンと、本発明のアジュバントの組合わせ、例えば、少なくとも２つの下記のグループの組合わせとを含む：ＱＳ２１、ＱＳ７、ＱｕｉｌＡ、β−エオシン、またはジギトニン。
【０３２２】
選択的に、サポニン処方物を、キトサンまたは他のポリカチオン性ポリマー、ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンをベースとするポリマーマトリックス、多糖または化学的に修飾された多糖から構成された粒子、リポソームおよび脂質をベースとする粒子、グリセロールモノエステルから構成された粒子、およびその他から構成されたワクチンと組合わせることができる。
【０３２３】
また、サポニンをコレステロールの存在下に処方して、粒状構造物、例えば、リポソームまたはＩＳＣＯＭを形成することができる。さらに、サポニンを、非粒状溶液または懸濁液中で、または粒状構造物、例えば、小層状リポソームまたはＩＳＣＯＭ中で、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと一緒に処方することができる。また、サポニンを賦形剤、例えば、Ｃａｒｂｏｐｌ^ＴＭと処方して粘度を増加させるか、あるいは乾燥粉末の形態で粉末状賦形剤、例えば、ラクトースと処方することができる。
【０３２４】
１つの態様において、アジュバント系は、モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体との組合わせ、例えば、ＷＯ　９４／００１５３に記載されているような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ^ＴＭアジュバントとの組合わせ、またはＷＯ　９６／３３７３９に記載されているような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている低い反応の組成物を包含する。他の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含んでなる。水中油型エマルジョンのＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ^ＴＭアジュバントおよびトコフェロールを使用する、他の特に好ましいアジュバント処方物は、ＷＯ　９５／１７２１０に記載されている。
【０３２５】
他の増強されたアジュバント系はＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドとサポニン誘導体との組合わせを包含し、特にＣｐＧとＱＳ２１との組合わせはＷＯ　００／０９１５９に開示されている。好ましくは、処方物はさらに水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含んでなる。
【０３２６】
本発明の医薬組成物において使用するための追加の例示的アジュバントは下記のものを包含する：モンタニドＩＳＡ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス国）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、米国カリフォルニア州）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバントのＳＢＡＳ系列（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ、ベルギー国リクセンサルト、から入手可能である）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ^ＴＭ；Ｃｏｒｉｘａ、モンタナ州ハミルトン）、ＲＣ−５９（Ｃｏｒｉｘａ、モンタナ州ハミルトン）、および他のアミノアルキルグルコサミン４−ホスフェート（ＡＧＰ）、例えば、係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号および同第０９／０７４，７２０号（それらの開示は引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているもの、およびポリオキシエチレンエーテルのアジュバント、例えば、ＷＯ９９／５２５４９Ａ１に記載されているもの。
【０３２７】
他の好ましいアジュバントは、下記の一般式のアジュバント分子を包含する：
（１）　　　　　　　ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ａ−Ｒ
ここでｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ_１−５０アルキルまたはフェニルＣ_１−５０アルキルである。
【０３２８】
本発明の１つの態様は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含んでなるワクチン処方物から成り、ここでｎは１〜５０、好ましくは４〜２４、最も好ましくは９であり、Ｒ成分はＣ_１−５０、好ましくはＣ_４−Ｃ_２０アルキル、最も好ましくはＣ_１２アルキルであり、そしてＡは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は０．１〜２０％，好ましくは０．１〜１０％、最も好ましくは０．１〜１％の範囲である。好ましいポリオキシエチレンエーテルは下記のグループから選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−５５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０３２９】
ポリオキシエチレンエーテル、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテルはメルクインデックス（ＭｅｒｃｋＩｎｄｅｘ）（第１２版：エントリー７７１７）に記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載されている。上記一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、必要に応じて、他のアジュバントと組合わせるすることができる。例えば、好ましいアジュバントの組合わせは、係属中の英国特許出願ＧＢ９８２０９５６．２に記載されているように、ＣｐＧを使用することが好ましい。
【０３３０】
本発明の他の態様によれば、本明細書に記載する免疫原性組成物は抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球および効率よいＡＰＣであるように操作できる他の細胞を介して宿主に送出される。このような細胞は遺伝学的に修飾して抗原提示能力を増加させ、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改良し、それ自体が抗腫瘍作用を有するようにし、および／または受容体と免疫学的にコンパティブルである（すなわち、合致したＨＬＡハプロタイプ）ようにすることができるが、それは不必要である。ＡＰＣは一般に種々の生物学的流体および器官、例えば、腫瘍および腫瘍周辺組織から単離することができ、そしてオートロガス、同種異系、同系または異種細胞であることができる。
【０３３１】
本発明のある態様において、抗原提示細胞として樹状細胞またはそれらの子孫を使用する。樹状細胞は高度に効力のあるＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ　３９２：２４５−２５１、１９９８）そして予防的または治療的抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバントとして有効であることが示された（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９参照）。
【０３３２】
一般に、樹状細胞はそれらの典型的な形状（ｉｎｓｉｔｕ星状、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて可視の顕著な細胞質プロセス（樹枝突起）を有する）、高い効率で抗原を取り上げ、プロセスし、提示する能力、素朴なＴ細胞応答を活性化する能力に基づいて同定ことができる。もちろん、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏにおいて樹状細胞上に普通に見出されない特異的細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように、樹状細胞を操作することができ、そしてこのような修飾された樹状細胞は本発明により意図される。樹状細胞の代替物として、分泌された小胞性抗原負荷樹状細胞（エキソソームと呼ばれる）をワクチンにおいて使用することができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ他、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．４：５９４−６００、１９９８参照）。
【０３３３】
樹状細胞および子孫は、末梢血液、骨髄、腫瘍浸潤性細胞、腫瘍周辺組織−浸潤性細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血液または任意の他の適当な組織または流体から得ることができる。例えば、樹状細胞はｅｘｖｉｖｏにおいてサイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαの組合わせを末梢血液から収集した単球の培養物に添加することによって分化させることができる。選択的に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または推定の分化、成熟および増殖を誘導する１またはそれ以上の他の化合物の組合わせを培地に添加することによって、末梢血液、臍帯血液または骨髄から収集したＣＤ３４陽性細胞を樹状細胞に分化させることができる。
【０３３４】
樹状細胞は、簡単な方法で２つの十分に特性決定された表現型を識別することを可能とする、「未熟」および「成熟」細胞として好都合にカテゴリー化される。しかしながら、この命名法は分化のすべての可能な中間段階を排除すると解釈すべきではない。未熟細胞は、抗原を吸収しかつプロセシングする高い能力を有するＡＰＣとして特性決定され、これらはＦｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高い発現と相関する。成熟表現型は典型的にはこれらのマーカーの低い発現により特性決定されるが、Ｔ細胞の活性化に関係する細胞表面の分子、例えば、クラスＩおよびクラスＩＩ　ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）および共同刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）の高い発現により特性決定される。
【０３３５】
一般に、ＡＰＣｓに本発明のポリヌクレオチド（またはその部分または変異体）をトランスフェクトさせることにより、コード化ポリペプチド、またはその免疫原性部分を細胞表面に発現させることができる。このようなトランスフェクション処理を生体外で行い、このトランスフェクトされた細胞を含有する薬剤を、本願明細書中に述べるよう治療目的に使用することができる。あるいは、樹状またはその他の抗原提示細胞をターゲットとする遺伝子運搬手段を患者に投与することによって、トランスフェクションが生体内で起こるようにすることもできる。
【０３３６】
例えば樹状細胞の生体内および生体外トランスフェクション処理は、ＷＯ９７／２４４４７に記載されているような公知の方法で、またはＭａｈｖｉｅｔａｌがＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄｃｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ７５：４５６−４６０（１９９７）に記述している遺伝子銃アプローチを利用して行うことができる。
【０３３７】
樹状細胞の抗原ローディングは樹状細胞または前駆細胞を腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（そのまま、またはプラスミドベクターに挿入して）またはＲＮＡと一緒に；または抗原発現組換え細菌またはウィルス（例えばワクシニア、鶏痘ウィルス、アデノウィルスまたはレンチウィルスベクター）と一緒にインキュベートすることによって達成される。ローディングに先立ち、ポリペプチドを、（例えばキャリヤ分子のような）Ｔ細胞ヘルプを提供する免疫パートナーと共有結合させる。あるいは、ポリペプチドとは別に、またはポリペプチドの存在において、樹状細胞を非共有結合免疫パートナーでパルス処理してもよい。
【０３３８】
本発明の薬剤には、当業者に公知の適当なキャリヤを使用できるが、キャリヤのタイプは投与態様に応じて異なるのが普通である。本発明の薬剤は局所、経口、経鼻腔、経粘膜、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、筋肉内など、該当の投与態様に合わせて調合すればよい。
【０３３９】
このような薬剤中に使用されるキャリヤは生体適合性であり、生物分解性であってもよい。或る実施例では、活性成分の放出レベルが比較的一定となるように調合することが好ましい。しかし、他の実施例では、投与と同時に比較的迅速に放出することが好ましい。このような薬剤の調合は公知技術を使用する当業者のレベルで充分可能である。この点で有用なキャリヤとしては、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、でんぷん、セルロース、デクストランなどの微粒子が挙げられる。
【０３４０】
抑制放出キャリヤとしては、非流動性親水コア（例えば架橋多糖類またはオリゴ糖）および必要に応じてリン脂質のような両親媒性化合物からなる外層を含む超分子バイオベクターが挙げられる（米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４・２００７８号、ＷＯ９４／２３７０１号およびＷＯ９６／０６６３８号を参照）。抑制放出調合物に含まれる活性化合物の量は、着床部位、放出速度および放出時間および治療または予防すべき状態の性質に応じて異なる。
【０３４１】
他の実施例では、本発明の薬剤のキャリヤとして、生物分解性ミクロスフェア（例えば、ポリアクテート　ポリグリコレート）を使用する。適当な生物分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；５，０７５，１０９号；５，９２８，６４７号；５，８１１，１２８号；５，８２０，８８３号；５，８５３，７６３号；５，８１４，３４４号；５，４０７，６０９号および５，９４２，２５２号に開示されている。ＷＯ９９／４０９３４号に開示され、本願明細書にも参考として引用している変性Ｂ型肝炎コアタンパク質キャリヤ系も種々の用途に好適である。他のキャリヤ／デリバリ系は米国特許第５，９２８，６４７号に開示されているような顆粒タンパク質複合体を使用し、この複合体は宿主におけるクラスＩ−被制限細胞毒Ｔリンパ球応答を誘発することがある。
【０３４２】
本発明の薬剤は多くの場合、１種または２種以上の緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水または燐酸塩緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデクストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン、酸化防止剤、静菌剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤、助剤（例えば、水酸化アンモニウム）、患者の血液で調剤を等張、高張、または劣張化する溶質、懸濁化剤、濃縮剤および／または保存剤をも含む。本発明の薬剤は凍結乾燥物として調合することもできる。
【０３４３】
本発明の薬剤は密閉アンプルまたは密閉水薬びんのような１回服用分または複数回服用分の容器で提供される。このような容器は使用まで無菌性と安定性を維持するように密閉される。一般に、調剤は油性または水性ビークル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態で保存される。凍結乾燥状態で保存され、使用の直前に無菌液を添加するだけでよい形態も可能である。
特定の薬剤を使用するため、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、筋肉内投与に適した調合を行うことは既に種々開発されており、その幾つかを以下に説明する。
【０３４４】
用途によっては、本発明の薬剤を経口方式で動物に投与することができる。その場合、これらの薬剤を不活性希釈剤または同化可能な食用キャリヤで調剤するか、または硬質または軟質ゼラチンカプセルに封入するか、または圧縮して錠剤にするか、または食品と直接組合わせることができる。
活性化合物を賦形剤と組合せ、錠剤、舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハーなどの形態で使用できる（例えば、Ｍａｔｈｉｗｉｔｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９９７Ｍａｒ２７；３８６（６６２３）：４１０−４；Ｈｗａｎｇｅｔａｌ．，ＣｒｉｔＲｅｖＴｈｅｒｄｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ１９９８：１５（３）−２４３−８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号を参照）。
【０３４５】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは種々の助剤、例えば、トラガカント、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンのようなバインダー；燐酸ジカルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などのような分散剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑剤；およびスクロース、ラクトース、サッカリンのような甘味料、またはペパーミント、ウィンターグリーン・オイル、チェリー・フレーバリングのような香料をも含むことができる。
【０３４６】
服用形態がカプセルである場合、上記材料の他に、液状キャリヤをも含むことができる。コーティングのため、または服用形態を物理的に変えるため、他に種々の材料を含むことがある。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルはセラック、糖またはこれら両者でコーティングすることがある。当然のことながら、服用形態に関係なく、使用される材料は薬学的に純粋であり、使用量が実質的に無害でなければならない。
【０３４７】
多くの場合、これらの調剤は少なくとも約０．１％またはそれ以上の活性化合物を含有するが、活性成分の％は一様ではなく、調剤全体の重量または容積の約１または２％から約６０％または７０％またはそれ以上である。それぞれの治療目的に有用な薬剤中の活性化合物量は、所与の化合物の１回服用分で必要な摂取量が確保されるように調合される。可溶性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与径路、貯蔵期間、およびその他の薬学的留意点は製薬分野の当業者が熟知であり、多様な投与および治療方法が望ましい。
【０３４８】
経口投与の場合、本発明の薬剤は１種または２種以上の賦形剤と組合わせて、うがい薬、歯磨き剤、口腔剤、吸入剤、舌下錠などの形態に調剤させることができる。活性成分を、例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、炭酸水素カリウムを含む口腔剤に組込んだり、歯磨き剤に組込んだり、水、バインダー、研磨剤、香料、発泡剤、湿潤剤を含む組成物に治療に有効な量を添加することもできる。舌下に挟むなど、口腔内で溶かす錠剤または溶液の形態に調剤することもできる。
【０３４９】
場合によっては、本発明の薬剤を非経口、静脈内、筋肉内または腹腔内投与することが望ましい。このようなアプローチは公知であり、そのいくつかは米国特許第５，５４３，１５８号、ｌ５，６４１，５１５号および５，３９９，３６３号に開示されている。或る実施例では、遊離塩基または薬学的に許容できる塩の形態を取る活性化合物を、ヒドロキシプロピルセルロースのような計面活性剤と混合した水溶液として調合する。グリセロール、液状ポリエチレン・グリコール、およびこれらの混合物及びオイル中に分散させる調合も可能である。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの調合物は微生物の生長を防止する保存剤を含むのが普通である。
【０３５０】
注射用の形態としては、無菌の水溶液または水性ぶんさん液またはその場でこのような無菌の注射用水溶液または水性分散液を調製できる無菌粉末（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号参照）がある。いずれの場合でも、無菌でなければならず、容易に注射できるだけの流動性が必要である。製造および貯蔵の段階において、安定であり、細菌や黴のような微生物の汚染作用から保護されねばならない。キャリヤは水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレン・グリコールなど）これらの適当な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であればよい。
【０３５１】
レシチンのようなコーティングを利用するか、分散液の場合なら必要な粒度を維持するか、および／または界面活性剤を使用することによって適正な流動性を維持することができる。微生物の作用は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベンス、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって容易に防止できる。多くの場合、糖または塩化ナトリウムのような等張剤を含むことが好ましい。注射薬のを長く吸収させるためには、吸収を遅らせる、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンのような吸収遅延剤を含有させればよい。
【０３５２】
非経口投与水溶液の形態を取る実施例では、必要に応じて溶液を適当に緩衝し、希釈液を先ず充分な量の食塩水またはグルコースで等張化する。このような水溶液は静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。これに使用できる無菌水性媒は本発明の開示内容に照らして当業者が容易に理解するところである。例えば、１回分を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解させ、１０００ｍｌの皮下注入液に添加するか、または所定の注入部位に注入する（例えば、“ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ１０３５−１０３８および１５７０−１５８０）。患者の状態に応じて、投与量をある程度変化させる必要がある。また、ヒトに投与する場合、当然のことながら、食品医薬品局の生物製剤基準部が定める無菌性、発熱性、その他一般的な安全性と純粋性の基準を満たさねばならない。
【０３５３】
本発明の他の実施例では、薬剤を中性または塩形態に調合する。医薬として許容可能な塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）酸添加塩があり、この塩は塩化水素酸または燐酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸酒石酸、マンデル酸のような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、および有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導できる。調合を終えたら溶液は投与形態に適合した態様で、且つ治療目的に適った量が投与される。
【０３５４】
キャリヤは溶媒、分散媒、ビークル、コーティング、希釈剤、抗菌および抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤、緩衝液、キャリヤ溶液、懸濁液、コロイドなどをも含む。薬剤として活性の物質にこれらの媒質や作用剤を使用することは公知である。公知の媒質または作用剤が活性成分と不適合でない限り、治療剤剤中に使用することができる。構成要素に補足的な活性成分を組込むことも可能である。尚、“薬剤として許容可能な”とは、ヒトに投与した場合、アレルギーなどのような有害な反応を発生させない分子および組成物を意味する。
【０３５５】
或る実施例では、薬剤を鼻腔内スプレー、吸入および／またはその他のエアロゾル投与ビークルによって投与することができる。遺伝子、核酸およびペプチドを鼻腔エアロゾルスプレーを介して直接肺へ投与する方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および５，８０４，２１２号に開示されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂を利用して薬剤を投与する方式（Ｔａｋｅｎａｇａｅｔａｌ．，ＪＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ１９９８Ｍａｒ２；５２（１−２）：８１−７）およびリソホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）も公知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態で粘膜を介して薬剤を投与する方式も米国特許第５，７８０，０４５号に開示されている。
【０３５６】
或る実施例では、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子，気胞などを利用して、本発明の薬剤を適当な宿主細胞／器官に導入する。特に、本発明の薬剤は脂質粒子、リポソーム、気胞、ナノスフェア、ナノ粒子などに封入して投与するように調合することができる。あるいは、共有または非共有の形でキャリヤ・ビークルの表面に結合させることもできる。
【０３５７】
有望なキャリヤとしてのリポソームおよびリポソーム状剤の形成および利用は当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｏｌ１９９８Ｊｕｌ；１６（７）：３０７−２１；Ｔａｋａｋｕｒａ，ＮｉｐｐｏｎＲｉｎｓｈｏ１９９８Ｍａｒ；５６（３）：６９１−５；Ｃｈａｎｄｒａｎｅｔａｌ．，ＩｎｄｉａｎＪＥｘｐＢｉｏｌ．１９９７Ａｕｇ；３５（８）：８０１−９；Ｍａｒｇａｌｉｔ，ＣｒｉｔＲｅｖＴｈｅｒＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ．１９９５；１２（２−３）：２３３−６１；参考のため本願明細書中に引用した米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，７９５，５８７号）。
【０３５８】
リポソームを他の方法ではトランスフェクションが困難な多くの種類の細胞、例えば、Ｔ細胞懸濁液、１次肝細胞菌株、ＰＣ１２細胞と併用して成功を収めている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９０Ｓｅｐ２５；２６５（２７）：１６３３７−４２；Ｍｕｌｌｅｒｅｔａｌ．，ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９９０Ａｐｒ；９（３）：２２１−９）。さらにまた、リポソームはウィルス−ベース投与系に典型のＤＮＡ長さの制約がない。遺伝子、種々の薬剤、放射線治療剤、酵素、ウィルス、転写調節因子、アロステリック・エフェクタなどを種々の培養細胞系および動物に導入するために利用され、成功を収めている。また、リポソームの使用が自己免疫反応や由々しき中毒事故の要因となるとは考えられない。
【０３５９】
或る実施例では、リン脂質を水性媒中に分散させ、自然発生的に多層同心二重気胞（多層気胞（ＭＬＶｓ）とも呼称される）を発生させることによってリポソームを形成する。
【０３６０】
他の実施例では、本発明の薬剤の、薬剤として許容可能なナノカプセル調剤を可能にする。一般に、ナノカプセルは薬剤を安定且つ再生可能に封入することができる（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏｅｔａｌ．，ＤｒｕｇＤｅｖＩｎｄＰｈａｍ．１９９８Ｄｅｃ；２４（１２）：１１１３−２８参照）。細胞内重合過負荷に起因する副作用を回避するため、ポリマーを利用してこの超微粒子（約０．１μｍ）を生体内で分解できるようにする。この粒子の製法は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒｅｔａｌ．，ＣｒｉｔＲｅｖＴｈｅｒＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ．１９８８；５（１）：１−２０；Ｍｕｈｌｅｎｅｔａｌ．，ＥｕｒＪＰｈａｒｍＢｉｏｐｈａｍ．１９９８Ｍａｒ；４５（２）：１４９−５５；Ｚａｍｂａｕｘｅｔａｌ．，ＪＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ１９９８Ｊａｎ２；５０（１−３）：３１−４０；ｏｙｏｂｉ米国特許第５，１４５，６８４号に開示されている。
【０３６１】
癌の治療方法
本発明の別の観点として、上記薬剤を癌、特に前立腺癌の免疫治療に利用することができる。この治療方法では、上記薬剤を、典型的には温血動物、好ましくはヒトに投与する。患者は癌に罹っていてもいなくてもよい。即ち、上記薬剤を使用することによって、癌の発生を防止するか、または癌患者を治療することができる。原発腫瘍の外科的切除および／または放射線治療または従来の化学的治療剤投与の前後に薬剤およびワクチンを投与する。上述したように、薬剤の投与は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、肛門、膣、局所、経口など、適宜の方法で投与すればよい。
【０３６２】
或る実施例では、免疫療法は内因性宿主免疫システムをの生体内刺激に依存する積極的な免疫療法であり、免疫反応変性剤（例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与で腫瘍を抑制するというものである。
【０３６３】
他の実施例では、免疫療法は、直接または間接的に抗腫瘍作用を仲介し、必ずしも無傷の宿主免疫システムに依存しない、定評のある腫瘍免疫反応性を有する薬剤（エフェクタ細胞または抗体）を投与する消極的な免疫療法である。エフェクタ細胞の例としては、上記Ｔ細胞、Ｔリンパ球（ＣＤ８^＋細胞毒Ｔリンパ球およびＣＤ４^＋Ｔ−ヘルパー腫瘍浸潤リンパ球）、キラー細胞（ＮａｔｕｒａｌＫｉｌｌｅｒ細胞およびリンパ球活性化キラー細胞）、Ｂ細胞およびポリペプチドを発現する抗原提示細胞（樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。
【０３６４】
養子免疫療法のためには、ポリペプチドに特異なＴ細胞レセプタおよび抗体レセプタをクローニングし、発現させて、他のベクターまたはエフェクタ細胞に移行させればよい。消極的免疫療法では、抗体または抗イディオタイプの抗体を発生させるためにもポリペプチドを利用することができる（米国特許第４，９１８，１６４号参照）。
【０３６５】
エフェクタ細胞は、試験管内培養によって養子免疫療法に充分な量を得ることができる。単一の抗原特異性エフェクタ細胞を数十億個にまで増殖させて、生体内での抗原認識を可能にする培養条件は公知である。このような試験管内培養条件としては、多くの場合、シトカイン（例えば、ＩＬ−２）および非分割支持細胞の存在において、間歇的な抗原による刺激が利用される。上述したように、免疫反応性のポリペプチドを利用することによって抗原特異性Ｔ細胞菌株を急速に増殖させ、免疫療法に必要な細胞数を発生させることができる。
【０３６６】
具体的には、公知の技術で、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞および／またはＢ細胞のような抗原提示細胞を免疫反応性ポリペプチドでパルス処理するか、または１種または２種以上のポリヌクレオチドをトランスフェクトすればよい。例えば、抗原提示細胞に、組換えウィルスまたは他の発現システムでの発現を促進するのに好適なプロモータを有するポリヌクレオチドをトランスフェクトすることができる。
【０３６７】
療法に使用するため培養されるエフェクタ細胞は成長して広く分布し、長期にわたって生体内に生存できなければならない。研究結果によれば、培養されたエフェクタ細胞を生体内で成長させ、ＩＬ−２で補足される抗原による刺激を繰返すことで、長期に亙って多数のエフクタ細胞を生存させることができる（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ１５７：１７７，１９９７）
【０３６８】
ポリペプチドを発現するベクターを患者から採取された抗原提示細胞に導入し、生体外でのクローニング処理で増殖させ、これを再び同じ患者に移植することができる。公知の手段で、好ましくは無菌の状態で、静脈内、腔内、腹腔内または腫瘍内投与で患者に再導入することができる。
【０３６９】
治療薬の投与経路、頻度および用量は個々の患者に応じて異なり、標準的な技術によって容易に決定することができる。一般に、薬剤やワクチンは注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内投与（例えば、吸入）または経口で投与される。好ましくは、１ヶ月間隔で６回投与し、その後、ブースタワクチン投与を行う。個々の患者にはそれぞれ異なるプロトコルが適切な場合がある。投与した時に、抗腫瘍免疫反応を促進することができ、少なくとも（治療前に比較して）１０−５０％レベルアップすれば、それが適量である。
【０３７０】
免疫反応は患者の抗腫瘍抗体を測定するか、または試験管内で患者の腫瘍細胞を殺すことができる細胞溶解性エフェクタ細胞の、ワクチンによる発生によってモニターすることができる。このようなワクチンは免疫反応を起こさせ、ワクチンを投与されない患者よりも臨床転帰を改善させることが可能でなければならない。（例えば、回復が早く、完全に、または部分的に、または長期に亙って生存）。一般に、１種または２種以上のポリペプチドを含む薬剤およびワクチンでは、１回の投与量中に存在する各ポリペプチドの量は宿主体重１ｋｇ当り約２５μｇ〜５ｍｇである。適量は患者のサイズに応じて異なるが、約０．１ｍＬ〜約５ｍＬが普通である。
【０３７１】
一般に、投与量と治療方法が妥当であるためには、治療および／または予防効果を発揮するに充分な量の活性化合物が投与されねばならない。このような効果はワクチンを投与されない患者よりも臨床転帰が改善されている（例えば、回復が早く、完全に、または部分的に、または長期に亙って生存）ことでモニターすることができる。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫反応は改善された臨床転帰と相関する。このような免疫反応は治療の前後に患者から得られたサンプルを使用して行われる標準的な増殖、細胞毒性またはサイトカイン分析によって評価することができる。
【０３７２】
癌検出・診断のための薬剤、方法及びキット
一般に、患者から得られる生体サンプル（例えば、血液、血清、痰および／または腫瘍組織）中の、１つまたは２つ以上の前立腺腫瘍タンパク質および／またはこのようなタンパク質を符号化するポリヌクレオチドの存在に基づいて、患者の癌を検出することができる。換言すれば、このようなタンパク質をマーカーとして利用することによって前立腺癌のような癌の有無を検出できる。
【０３７３】
このようなタンパク質はその他の癌の検出にも役立つ。一般に、本発明の結合剤は、生体サンプル中の結合剤に結合する抗原のレベル検出を可能にする。ポリヌクレオチド・プライマーおよびプローブを利用することによって、腫瘍タンパク質を符号化するｍＲＮＡレベルを検出することができ、癌の有無をも示唆する。一般に、前立腺腫瘍配列は正常組織よりも３倍以上のレベルで存在する。
【０３７４】
サンプル中のポリペプチド・マーカーを検出するのに結合剤を使用する種々の分析方法は当業者に公知である。例えば、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい。一般に、患者における癌の有無は（ａ）患者から得られた生体サンプルを結合と接触させ；（ｂ）サンプル中の、結合剤と結合するポリペプチドのレベルを測定し；（ｃ）ポリペプチドのレベルを所定の合格値と比較することによって判定できる。
【０３７５】
好ましい実施例では、この分析において、固形支持材に固定した結合剤を使用し、これにポリペプチドを結合させ、サンプルの残余の部分から取り除く。結合しているポリペプチドを検出するため、リポーター・グループを含有し、結合剤／ポリペプチドと特異的に結合する検出試薬を使用する。検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体と特異的に結合する結合剤またはこの結合剤と特異的に結合する抗免疫グロブリン、Ｇタンパク質、Ａタンパク質またはレクチンなどである。或いは、ポリペプチドをリポーター・グループで標識し、結合剤をサンプルと共にインキュベートした後、固定結合剤に結合させる、競合アッセイを利用することもできる。この分析に使用できるポリペプチドとしては、完全長前立腺腫瘍タンパク質および、上記のように結合剤が結合するポリペプチド部分が挙げられる。
【０３７６】
固形支持材は、腫瘍タンパク質を付着させることができるなら、公知のいかなる材料であってもよい。例えば、マイクロタイタープレートのテスト・ウェル、ニトロセルロースなどのような膜を利用できる。ガラス、ファイバーグラス、ラテックス、またはポリスチレン、ポリ塩化ビニルのようなプラスチック材からなるビーズやディスクでもよい。さらには、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されているような磁気粒子はファイバーオプチック・センサーでもよい。結合剤を固形支持材に固定するには、特許文献などに数多く記載されている種々の公知技術を利用すればよい。
【０３７７】
本発明において、“固定”とは吸着のような非共有結合と（結合剤と支持材の官能基との間の直接的なリンケージまたは架橋剤を介してのリンケージである）共有結合との双方を含む。マイクロタイタープレートのウェルまたは膜への吸着による固定が好ましい。この場合、適当な緩衝液中で結合剤を、適当な時間に亙って固形支持材と接触させることで吸着が得られる。接触時間は温度にも左右されるが、典型的には約１時間〜約１日である。一般に、（ポリスチレンやポリ塩化ビニルのような）プラスチック製マイクロタイターのウェルを、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの結合剤と接触させれば、充分な量の結合剤を固定することができる。
【０３７８】
結合剤を固形支持材に共有結合させるには、支持材とも結合剤のヒドロキシルまたはアミノ基とも反応する二元機能試薬と支持材とを反応させることによって達成される。例えば、ベンゾキノンを使用するか、または支持材のアルデヒド基を結合パートナーの活性水素と縮合することによって、結合剤を、適当なポリマー・コーティングを有する支持材と共有結合させることができる（ＰｉｅｒｃｅＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣａｔａｌｏｇａｎｄＨａｎｄｂｏｏｋ，１９９１，Ａ１２−Ａ１３）。
【０３７９】
或る実施例では、２抗体サンドイッチ方式分析を採用する。この分析法では、マイクロタイター・プレートのような固形支持材に固定された抗体を、サンプルと接触させることによって、サンプル中のポリペプチドを固定抗体と結合させる。結合しなかったサンプルを、固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去し、リポーター・グループを含む検出試薬（好ましくはポリペプチドの異なる部位に結合できる第２抗体）を添加する。固形支持材と結合したままの検出試薬量を、特定リポーター・グループに適した方法を利用して測定する。
【０３８０】
具体的には、上記のように抗体を支持材に固定したら、支持材上の残余のタンパク質結合部位をブロックする。ブロック剤は公知のものでよく、例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０（商標）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などがある。次いで、固定された抗体をサンプルと一緒にインキュベートし、ポリペプチドを抗体と結合させる。インキュベーションに先立って、サンプルを燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような適当な希釈剤で希釈する。
【０３８１】
一般に、好適な接触時間（即ち、インキュベーション時間）は前立腺癌のある個人から得られたサンプル中のポリペプチドの存在を検出するのに充分な時間である。接触時間は結合および非結合ポリペプチド間の平衡が少なくとも約９５％となる結合レベルを達成するのに充分な時間であることが好ましい。当業者には明らかなように、平衡を達成するのに必要な時間は、一定時間に亙って起こる結合レベルを評価することによって容易に測定できる。
【０３８２】
次いで、例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標）を含有するＰＢＳのような適当な緩衝液で固形支持材を洗浄することによって非結合サンプルを除去する。リポーター・グループを含有する第２抗体を固形支持材に加える。好ましリポーター・グループは上述したようなものである。
【０３８３】
次に、結合ポリペプチドを検出するのに充分な時間に亙って、検出試薬を、固定された抗体−ポリペプチド複合体と一緒にインキュベートする。検出に適当な時間は、一定時間に亙って起こる結合のレベルを評価することによって決定することができる。次いで、結合しなかった検出試薬を除去し、結合した検出試薬を、リポーター・グループを利用して検出する。（１１５ページ、１行目まで）リポーター・グループを検出する方法はリポーター・グループの性質に応じて異なる。
【０３８４】
放射性グループならば、シンチレーション・カウントまたはオートラジオグラフィが適当である。染料、発光性グループおよび蛍光性グループならば、分光分析を利用すればよい。ビオチンは異なるリポーター・グループ（通常は放射性または蛍光性グループまたは酵素）と結合しているアビジンを利用して検出すればよい。酵素リポーター・グループは（特定時間に亙って）基質を加え、次いで反応物質の分光分析またはその他の分析を行うことによって検出するのが普通である。
【０３８５】
前立腺癌のような癌の有無を判定するには、固形支持体と結合したままのリポーター・グループから検出される信号を、所定の合格値に相当する信号と比較する。好ましい実施例では、癌を検出するための合格値は固定された抗体を癌のない患者からのサンプルと一緒にインキュベートする時に得られる平均信号である。所定の合格値より３標準偏差高い信号を発するサンプルは癌に関して陽性と考えられる。
【０３８６】
他の好ましい実施例では、Ｓａｃｋｅｔｔｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｔｙ：ＡＢａｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＬｉｔｔｌｅＢｒｏｗｎａｎｄＣｏ．，１９８５，ｐ．１０６−７に記載の方法に従い、ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｏｒＣｕｒｖｅを利用して合格値を設定する。この実施例では、診断テスト結果に照らしたそれぞれ妥当と思われる合格値に相当する複数対の真陽性率（即ち、感度）と偽陽性率（１００％−特異度）のプロットから合格値を算出する。偽陽性率を極力小さくするため合格値をプロットに沿って左へずらし、偽陰性率を極力小さくするため右へずらしてもよい。一般に、この方法で設定された合格値よりも高い信号を発するサンプルは癌に関して陽性と考えられる。
【０３８７】
関連する実施例においては、フロースルーまたはストリップ・テスト・フオーマットで分析を行い、結合剤をニトロセルロースのような膜に固定する。フロースルー・テストでは、サンプルが膜を通過すると、サンプル中のポリペプチドが固定された結合剤と結合する。次に、第２結合剤を含む溶液が膜を通過すると、標識されたこの第２結合剤が結合剤−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２結合剤の検出が上述したように行われる。ストリップ・テスト・フォーマットでは、結合剤が結合する膜の一端がサンプルを含有する溶液に浸漬される。
【０３８８】
サンプルは膜に沿って第２結合剤を含む部位を固定されている結合剤の部位に向かって移動する。固定計都合剤の部位における第２結合剤濃度が癌の存在を示唆する。前記部位における第２結合剤の濃度は視認可能な線を画くパターンを形成する。このパターンが存在しなければ、結果が陰性であることを示唆する。膜に固定される結合剤の量は、サンプルが上記フオーマットにおける２−抗体サンドイッチ分析において陽性信号を発するに充分なレベルのポリペプチドを含む時はっきり視認できるように設定される。
【０３８９】
この分析に使用される好ましい結合剤は抗体およびその抗原結合フラグメントである。膜に固定される抗体の量は約２５ｎｇ〜約１μｇであり、より好ましくは約５０ｎｇ〜約５００ｎｇである。このテストは極めて少量のサンプルで行うことができる。
【０３９０】
本発明の腫瘍タンパク質または結合剤と併用できる分析プロトコルが他にも種々存在することはいうまでもない。上記のプロトコルはあくまでも例である。例えば、サンプル中のポリペプチドと結合するを検出するのに腫瘍ポリペプチドを利用する上記プロトコルは容易に変更することができる。腫瘍タンパク質に特異な抗体の検出は癌の存在と相関する。
【０３９１】
サンプル中の腫瘍タンパク質と特異に反応するＴ細胞の存在に基づいて癌を検出することもできる。患者から分離されたＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むサンプルを腫瘍ポリペプチド、これを符号化するポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣと一緒にインキュベートし、Ｔ細胞の特異活性化の有無を検出する。適当なサンプルとしては、例えば、分離Ｔ細胞がある。Ｔ細胞は（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心沈殿法のような）公知技術によって患者から分離することができる。
【０３９２】
ポリペプチド（５−２５μｇ／ｍｌ）と一緒に２−９日間３７℃において、試験管内でＴ細胞をインキュベートする。対照として腫瘍ポリペプチドが存在しないＴ細胞サンプルをもインキュベートすることが望ましい。ＣＤ４^＋Ｔ細胞については、Ｔ細胞の増殖評価によって活性化を検出することが好ましい。ＣＤ８^＋につては、細胞毒活性の評価によって活性化を検出することが好ましい。疾病のない患者よりも増殖レベルが少なくとも２倍高く、および／または細胞毒活性が少なくとも２０％高ければ、患者に癌が存在することを示唆する。
【０３９３】
上述のように、サンプル中の腫瘍タンパク質を符号化するｍＲＮＡのレベルに基づいて癌を検出することもできる。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に基づく分析に、少なくとも２種ノオリゴヌクレオチド・プライマーを使用することにより、サンプルからの腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅することができ、その場合、オリゴヌクレオチド・プライマーの少なくとも一方が腫瘍タンパク質を符号化するポリヌクレオチドに対して特異である（即ち、これと雑種を形成する）。増幅されたｃＤＮＡを分離し、ゲル電気泳動のような公知技術で検出する。同様に、腫瘍タンパク質を符号化するポリヌクレオチドと特異に交雑するオリゴヌクレオチドを雑種形成分析に利用すれば、サンプル中の腫瘍タンパク質を符号化するポリヌクレオチドの存在を検出することができる。
【０３９４】
分析条件下で交雑を可能にするためには、オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブは少なくとも１０個、好ましくは２０個のヌクレオチドに相当する長さの本発明の腫瘍タンパク質符号化ポリヌクレオチドの部分と、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含まねばならない。好ましくは、オリゴヌクレオチド・プライマーおよび／またはプローブは上記の条件下でポロペプチド符号化ポリヌクレオチドと交雑する。
【０３９５】
診断に使用されるオリゴヌクレオチド・プライマーおよび／またはプローブは好ましくは少なくとも１０−４０個のヌクレオチドに相当する長さを有する。このましいじっしれいでは、オリゴヌクレオチド・プライマーは上記配列を有するＤＮＡ分子の、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド、より好ましく葉少なくとも１５個の連続するヌクレオチドをふくむ。ＰＣＲ分析も交雑分析も公知である（Ｍｕｌｌｉｓｅｔａｌ．，Ｃｏｌ；ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈｅｄ．，ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）。
【０３９６】
好ましい分析では、ＰＣＲを逆転写と併用するＲＴ−ＰＣＲを利用する。ＲＮＡは生体組織のようなサンプルから抽出され、逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、ｃＤＮＡを生成し、これを分離し、ゲル電気泳動などを利用して可視化する。増幅はテスト患者から得たサンプルと健常者から得たサンプルで行う。増幅反応は２桁の範囲で数回希釈したｃＤＮＡで行う。テスト患者のサンプルを数回希釈した結果、健常者に比較して発現が２倍以上増大し、陽性と判定される。
【０３９７】
他の実施例では、癌進行のマーカとして本発明の薬剤を使用することができる。この実施例では、癌診断のための上記分析を継続的に実施し、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベル変化を評価する。例えば、６ヶ月〜１年間、２４−７２時間ずつ分析を行い、必要に応じてその後も行う。検出されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが増大する患者では、癌が進行中である場合が多い。逆に、レベルが一定のままか、または低下する場合、癌は進行していない。
【０３９８】
生体診断分析を直接腫瘍において行う。この分析では、腫瘍細胞を結合剤と直接接触させる。結合した結合剤は直接またはリポーター・グループを介して間接的に検出する。結合剤は組織学的にも利用できる。この場合、ポリヌクレオチド・プローブを使用することもできる。
【０３９９】
感度を高めるには、所与のサンプル内で、多重腫瘍タンパク質マーカを分析すればよい。種々のタンパク質に対して特異な結合剤を単一の分析内で組合わせることができる。多重プライマーまたはプローブを同時に使用することができる。腫瘍タンパク質マーカの選択は一連の実験に基づいて行い、最適感度となるようにする。腫瘍タンパク質の分析を、たの既知腫瘍抗原分析と組合わせてもよい。
【０４００】
本発明は上記診断方法に使用されるキットをも提供する。このキットは２つまたｈ２つ以上の、診断分析に必要な成分を含む。成分は化合物、試薬、容器および／または装置を含む。キット内の１つの容器はモノクローン抗体またはそのフラグメントを収容する。このキットは抗体結合を直接または間接的に検出するリポーター・グループを含む検出試薬をも収容する。
【０４０１】
あるいは、生体サンプル中の腫瘍たんぱく質を符号化するｍＲＮＡレベルを検出するようにキットを構成することもできる。このようなキットは多くの場合、上述のように，腫瘍たんぱく質を符号化するポリヌクレオチドと雑種形成する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド・プローブまたはプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたは雑種形成分析に使用することができる。この種のキット中に存在するその他の成分としては、第２オリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬または腫瘍たんぱく質を符号化するポリヌクレオチドの検出を容易にする容器が挙げられる。
下記の例は説明のためのものであり、本発明を制限するものではない。
【０４０２】
例
実施例１．前立腺特異性ポリペプチドの分離および特徴づけ
この例は前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーからの幾つかの前立腺特異性ポリペプチドの分離に係わる。
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｌａｓｍｉｄＣｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８９７）を使用し、メーカーのプロトコルに従って、前立腺腫瘍ポリＡ^＋ＲＮＡからヒトの前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを構成した。具体的には、ポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で前立腺腫瘍組織を均質化し、メーカーの指示に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。
【０４０３】
次いで、メーカーのプロトコルに従って、ＱｉａｇｅｎｏｌｉｇｏｔｅｘｓｐｉｎｃｏｌｕｍｎｍＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＳａｎｔａＣｌａｒｉｔａ，ＣＡ９１３５５）を使用して、ポリＡ^；ＲＮＡを精製した。ＮｏｔＩ／Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ１８プライマーを使用して第１ストランドｃＤＮＡを合成した。二重鎖ｃＤＮＡを合成し、ＥｃｏＲＩ／ＢＡＸＩアダプタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）と結合させ、ＮｏｔＩで消化した。ＣｈｒｏｍａＳｐｉｎ−１０００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）でサイズ分画した後、ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位に結合させ、電気穿孔により、ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ細胞に形質変換した。
【０４０４】
同じ方法を利用して、正常なヒト膵臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、６個の組織試料（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から作成した。独立コロニーの数、挿入断片を有するコロニーの％、平均挿入断片サイズを測定すると共に、配列分析によってｃＤＮＡライブラリーを特徴づけた。前立腺腫瘍ライブラリーは１．６４ｘ１０^７個の独立コロニーを含み、コロニーの７０％が挿入断片を有し、平均挿入断片サイズは１７４５塩基対であった。正常な膵臓ｃＤＮＡライブラリーは３．３ｘ１０^６個のコロニーを含み、コロニーの６９％が挿入断片を有し、平均挿入断片サイズは１１２０塩基対であった。いずれのライブラリーでも、配列分析の結果、クローンの大部分が完全な長さのｃＤＮＡ配列を有し、ｍＲＮＡから合成され、ｒＲＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡ汚染は極めて少ないことが判明した。
【０４０５】
Ｈａｒａｅｔａｌ（Ｂｌｏｏｄ，８４：１８９−１９９，１９９４）が報告している方法に幾つかの変更を加え、上記前立腺腫瘍および正常な膵臓ｃＤＮＡライブラリーを利用して、ｃＤＮＡライブラリー減算を行った。具体的には、下記のようにして前立腺特異性減算ｃＤＮＡライブラリーを形成した。正常な膵臓ｃＤＮＡライブラリー（７０μｇ）をＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ，およびＳｆｕＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼ・クレナウ・フラグメントとフィリング−イン反応させた。
【０４０６】
フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、ＤＮＡを１００μｌのＨ_２Ｏに溶解させ、過熱変性し、１００μｌ（１００μｇ）のＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチン（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と混合した。メーカーの勧めに従い、氷上で、得られた混合物を２７０Ｗ太陽灯で２０分間照射した。追加のＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチン（５０μｌ）を添加し、ビオチン化反応を繰返した。ブタノールで５回抽出した後、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、２３μｌのＨ_２Ｏに溶解させてドライバーＤＮＡを形成した。
【０４０７】
トレーサーＤＮＡ形成のため、１０μｇの前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて消化し、フェノールクロロホルムで抽出してから、Ｃｈｒｍｏｍａｓｐｉｎ−４００カラム（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に通した。エタノール沈殿後、トレーサーＤＮＡは５μｌのＨ_２Ｏに溶解された。トレーサーＤＮＡを１５μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーションバッファー（１．５ＭのＮａＣｌ／１０ｍＭＥＤＴＡ／５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５／０．２％ドデシル硫酸ナトリウム）と混合し、ミネラルオイル重層後完全に熱変性した。
【０４０８】
サンプルは直ぐに６８℃の水槽に移され、２０時間インキュベーションされた（長時間ハイブリダイゼーション［ＬＨ］）。次に反応混合液をストレプトアビジン処理にかけてからフェノール／クロロフォルム抽出した。この工程をさらに３回繰り返した。サブトラクション処理されたＤＮＡを沈殿させ、１２μｌのＨ_２Ｏに溶解、８μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーションバッファーと混合してから、６８℃にて２時間ハイブリダイゼーションにかけた（短時間ハイブリダイゼーション［ＳＨ］）。
【０４０９】
ビオチン化２本鎖ＤＮＡを除いた後、サブトラクション処理されたｃＤＮＡをクロラムフェニコールｐＢＣＳＫ＋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ（ＬａＪｏｌｌａ）、カリフォルニア州（ＣＡ）９２０３７）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に連結し、エレクトロポレーションによりＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ細胞内に形質転換し、前立腺腫瘍特異的サブトラクション処理ｃＤＮＡライブラリー（「前立腺サブトラクションＩ」と呼ぶ）が作製された。
【０４１０】
サブトラクションｃＤＮＡライブラリーを解析するため、サブトラクション処理した前立腺腫瘍特異的ライブラリーより無作為に取り上げた１００個の独立クローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、そのインサートの大きさに基づいてグループ分けした。代表的なｃＤＮＡクローンは、パーキンエルマー／アプライドバイオシステムズ部門（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）自動シークエンサーモデル３７３Ａ（フォスターシティー（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を用いたＤＮＡ配列決定によりさらに特性分析された。
【０４１１】
以後Ｆ１−１３、Ｆ１−１２、Ｆ１−１６、Ｈ１−１、Ｈ１−９およびＨ１−４と呼ぶ６個のｃＤＮＡクローンがサブトラクション処理された前立腺特異的ｃＤＮＡライブラリー中に豊富に存在することが示された。Ｆ１−１２について決定された３’および５’ｃＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号２および３に示されており、Ｆ１−１３、Ｆ１−１６、Ｈ１−１、Ｈ１−９およびＨ１−４について決定された３’ｃＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号１および４−７に示されている。
【０４１２】
単離クローンのｃＤＮＡ配列はＥＭＢＬおよびＧｅｎＢａｎｋデータベース（９６版）を用い、遺伝子バンク内の既知配列と比較された。４種類の前立腺腫瘍ｃＤＮＡクローンＦ１−１３、Ｆ１−１６、Ｈ１−１およびＨ１−４は次の同定済み蛋白質をコードしていることが判明した：前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト腺カリクレイン、ヒト腫瘍発現増進遺伝子、およびミトコンドリアチトクロームＣ酸化酵素サブユニットＩＩ。Ｈ１−９は以前同定された自律的複製配列に同一であることが判明した。Ｆ１−１２に関するｃＤＮＡ配列には有意な相同体は見出されなかった。
【０４１３】
次の研究ではＦ１−１２の全長ｃＤＮＡ配列（Ｐ５０４Ｓとも呼ぶ）の単離が行われた。この配列は配列番号１０７に示されており、対応する推定アミノ酸配列は配列番号１０８に記載されている。Ｐ５０４ＳのｃＤＮＡスプライス変異体は配列番号６００−６０５に示されている。
【０４１４】
より少ない前立腺腫瘍特異遺伝子をクローン化するために、上記前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーから正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーおよび先のサブトラクション前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリーで最も多く存在した３種類の遺伝子、即ちヒト腺カリクレイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびミトコンドリアチトクロームＣ酸化酵素サブユニットＩＩの遺伝子を差し引いてｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを行った。具体的にはｐＣＤＮＡ３．１に入ったヒト腺カリクレイン、ＰＳＡおよびミトコンドリアチトクロームＣ酸化酵素サブユニットＩＩのｃＤＮＡをそれぞれ１μｇドライバーＤＮＡに加え、上記同様にサブトラクション処理し、以後「スパイクサブトラクション前立腺腫瘍特異ｃＤＮＡライブラリー」とよぶ第２回目サブトラクション処理済みｃＤＮＡライブラリーを得た。
【０４１５】
２２個のｃＤＮＡクローンがスパイクサブトラクション前立腺腫瘍特異ｃＤＮＡライブラリーより単離された。Ｊ１−１７、Ｌ１−１２、ＮＪ−１８６２、Ｊ１−１３、Ｊ１−１９、Ｊ１−２５、Ｊ１−２４、Ｋ１−５８、Ｋ１−６３、Ｌ１−４およびＬ１−１４と呼ばれるクローンについて決定された３’および５’ｃＤＮＡは配列番号８−９、１０−１１、１２−１３、１４−１５、１６−１７、１８−１９、２０−２１、２２−２３、２４−２５、２６−２７および２８−２９にそれぞれ示されている。Ｊ１−１２、Ｊ１−１６、Ｊ１−２１、Ｋ１−４８、Ｋ１−５５、Ｌ１−２、Ｌ１−６、Ｎ１−１８５８、Ｎ１−１８６０、Ｎ１−１８６１、Ｎ１−１８０４と称されるクローンについて決定された３’ｃＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号３０−４０に示されている。
【０４１６】
これら配列と上記遺伝子バンク内の配列との比較からは、最も多く存在した５種類のＤＮＡ種のうち３種（Ｊ１−１７、Ｌ１−１２およびＮ１−１８６２；それぞれ配列番号８−９、１０−１１および１２−１３）とは有意な相同性を示されなかった。残り２最多存在種のうちの１種（Ｊ１−１２；配列番号３０）はこれまでに同定されたヒト肺界面活性剤関連蛋白質と同一であることが見出され、そして残りの１種（Ｋ１−４８；配列番号３３）は２−アリールプロピオニル−ＣｏＡエピメラーゼのＲ．ｎｏｒｖｇｉｃｕｓｍＲＮＡと相同性を有すると判定された。
【０４１７】
スパイクサブトラクション前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリーより単離された量的に少ない腫瘍１７種のうち４種（Ｊ１−１６、Ｋ１−３５、Ｌ１−６およびＮ１−１８６４；それぞれ配列番号３１、３４、３６および４０）は非ヒト配列と相同性を示すことが見出され、２種（Ｌ１−２およびＮ１−１８６１；それぞれ配列番号３５および３９）は既知ヒト配列と相同性を示すことが見出された。ポリペプチドＪ１−１３、Ｊ１−１９、Ｊ１−２４、Ｊ１−２５、Ｋ１−５８、Ｋ１−６３、Ｌ−４、Ｌ１−１４（それぞれ配列番号１４−１５、１６−１７、２０−２１、１８−１９、２２−２３、２４−２５、２６−２７、２８−２９）に対して相同性は認められなかった。
【０４１８】
続く研究ではＪ１−１７、Ｌ１−１２およびＮ１−１８６２（それぞれ配列番号１０９−１１１）の全長ｃＤＮＡ配列の単離が行われた。対応する推定アミノ酸配列は配列番号１１２−１１４に示されている。Ｌ１−１２はまたＰ５０１Ｓとも呼ばれる。ｐ５０１ＳのｃＤＮＡスプライス変異体は配列番号６０６に示されている。
【０４１９】
別の実験では、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーから３種類の正常前立腺ポリＡ＋ＲＮＡのプールより調製された正常前立腺ｃＤＮＡをサブトラクションすることで（「前立腺サブトラクション２」と称する）さらに４種類のクローンが同定された。以後Ｕ１−３０６４、Ｕ１−３０６５、Ｖ１−３６９２および１Ａ−３９０５と称される、これらクローンの決定ｃＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号６９−７２に示されている。決定されたこれら配列と遺伝子バンクとの配列比較からは、Ｕ１−３０６５との有意な相同性は見出されなかった。
【０４２０】
スパイクによる第２サブトラクション（「前立腺サブトラクションスパイク２」と称する）は、前立腺腫瘍特異ｃＤＮＡライブラリーより正常前立腺ｃＤＮＡライブラリーを持つスパイクでサブトラクションし、さらにＰＳＡ、Ｊ１−１７、肺表面活性剤関連蛋白質、ミトコンドリアＤＮＡ、チトクロームｃ酸化酵素サブユニットＩＩ、Ｎ１−１８６２、自律複製配列、Ｌ１−１２および腫瘍発現増大遺伝子でスパイクされ除かれた。以後Ｖ１−３６８６、Ｒ１−２３３０、１Ｂ−３９７６およびＶ１−３６７９と呼ばれる４種類の追加クローンが単離された。これらクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号７３−７６に示されている。これら配列と遺伝子バンク内配列との比較からは、Ｖ１−３６８６およびＲ１−２３３０との有意な相同性は見出されなかった。
【０４２１】
上記３種類の前立腺サブトラクション（前立腺サブトラクション２、スパイクサブトラクション前立腺腫瘍特異ｃＤＮＡライブラリー、および前立腺サブトラクションスパイク２）を更に分析した結果、１Ｇ−４７３６、１Ｇ−４７３８、１Ｇ−４７４１、１Ｇ−４７４４、１Ｇ−４７３４、１Ｈ−４７７４、１Ｈ４７８１、１Ｈ−４７８５、１Ｈ４７８７、１Ｈ４７９６、１Ｉ−４８１０、１Ｉ−４８１１、１Ｊ−４８７６、１Ｋ−４８８４および１Ｋ−４８９６と称される１６個の更なるクローンが同定された。
【０４２２】
これらクローンの配列と上記遺伝子バンクの配列との比較からは、１Ｇ−４７４１、１Ｇ−４７３４、１Ｉ−４８０７、ＩＪ−４８７６および１Ｋ−４８９６（それぞれ配列番号７９、８１、８７、９０および９２）との有意な相同性は示されなかった。更なる単離クローン分析より、それぞれ配列番号１７９−１８８および１９１−１９３に示される１Ｇ−４７３６、１Ｇ−４７３８、１Ｇ−４７４１、１Ｇ−４７４４、１Ｈ−４７７４、１Ｈ４７８１、１Ｈ−４７８５、１Ｈ４７８７、１Ｈ４７９６、１Ｉ−４８０７、１Ｊ−４８７６、１Ｋ−４８８４および１Ｋ−４８９６の延長ｃＤＮＡ配列が決定され、さらにそれぞれ配列番号１８９および１９０に示される１Ｉ−４８１０および１Ｉ−４８１１に関する追加の部分ｃＤＮＡ配列が決定された。
【０４２３】
前立腺サブトラクションスパイク２の追加研究より、さらに３個のクローンが分離された。それらの配列は上記同様にして決定され、最新のＧｅｎｅＢａｎｋと比較された。３クローン全てが既知遺伝子であるシステインリッチ蛋白質、ＬＩＡＡ０２４２およびＫＩＡＡ０２８０（それぞれ配列番号３１７、３１９および３２０）と相同性を有することが見出された。シンテニ（Ｓｙｎｔｅｎｉ）マイクロアレイ（シンテニ（Ｓｙｎｔｅｎｉ）、パロアルト（ＰａｌｏＡｌｔｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））によるこれらクローンの更なる分析からは、これら３種類全てのクローンが大部分の前立腺腫瘍および前立腺ＢＰＨ、ならびに試験した正常前立腺組織の多くで過剰発現されているものの、その他の正常組織ではいずれも発現が低いことが示された。
【０４２４】
更なるサブトラクションが、正常前立腺ｃＤＮＡライブラリーを正常膵臓ｃＤＮＡでサブトラクションすることで実施された（「前立腺サブトラクション３」と称する）。その結果１Ｇ−４７６１、１Ｇ−４７６２、１Ｈ−４７６６、１Ｈ−４７７０、１Ｈ−４７７１および１Ｈ−４７２２（配列番号９３−９８）と称される６個の追加クローンが同定された。これら配列と遺伝子バンク配列との比較からは、１Ｇ−４７６１および１Ｈ４７１１（それぞれ配列番号９３および９７）に対し有意な相同性は示されなかった。単離クローンの更なる分析から、それぞれ配列番号１９４−１９６および１９９に示される１Ｇ−４７６１、１Ｇ−４７６２、１Ｈ−４７６６および１Ｈ−４７７２に関する延長ｃＤＮＡ配列が決定され、そしてそれぞれ配列番号１９７および１９８に示される１Ｈ−４７７０および１Ｈ−４７７１に関する追加部分ｃＤＮＡ配列が決定された。
【０４２５】
前立腺癌患者３例のポリＡ＋ＲＮＡプールより調製された前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーでサブトラクションし（前立腺サブトラクション４）たところ、１Ｄ−４２９７、１Ｄ−４３０９、１Ｄ．１−４２７８、１Ｄ−４２８８、１Ｄ−４２８３、１Ｄ−４３０４、１Ｄ−４２９６および１Ｄ−４２８０（配列番号９９−１０７）と称される８個のクローンが同定された。これらの配列は上記遺伝子バンクの配列と比較された。１Ｄ−４２８３および１Ｄ−４３０４（それぞれ配列番号１０３および１０４）との有意な相同性は見出されなかった。単離クローンの更なる分析から、それぞれ配列番号２００−２０６に示される１Ｄ−４３０９、１Ｄ．１−４２７８、１Ｄ−４２８８、１Ｄ−４２８３、１Ｄ−４３０４、１Ｄ−４２９６および１Ｄ−４２８０に関する延長ｃＤＮＡ配列が決定された。
【０４２６】
上記前立腺サブトラクション１および前立腺サブトラクション２で単離されたｃＤＮＡクローンはコロニーＰＣＲで増幅され、マイクロアレイ技術（シンテニ（Ｓｙｎｔｅｎｉ）、パルアルト（ＰａｌｏＡｌｔｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を用い、前立腺腫瘍、正常前立腺および各種その他組織中に於けるそれらのｍＲＮＡ発現レベルが決定された。簡単に述べると、各産物がアレイ中に特有位置を占める様にＰＣＲ増幅産物をスライド上にアレイフォーマットにドットした。試験対象となる組織サンプルよりｍＲＮＡを抽出し、逆転写し、蛍光標識ｃＤＮＡプローブを作製した。マイクロアレイを標識ｃＤＮＡプローブでプロービングし、スライドをスキャンして蛍光強度を測定した。
【０４２７】
この強度はハイブリダイゼーション強度に比例する。２つのクローンが、前立腺腫瘍および正常前立腺で過剰に発現され、そして試験したその他全ての正常組織（肝臓、膵臓、皮膚、骨髄、脳、乳房、副腎、膀胱、精巣、唾液腺、大腸、腎臓、卵巣、肺、脊髄、骨格筋および結腸）では発現が低レベルであることが見出された。Ｐ５０９ＳおよびＰ５１０Ｓについて決定されたｃＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号２２３および２２４に示されている。これら配列と上記遺伝子バンク中の配列との比較からは、これまでに同定された幾つかのＥＳＴと相同性が示された。
【０４２８】
さらに研究はＰ５０９Ｓの完全長ｃＤＮＡ配列の分離を行った。この配列は配列番号３３２に示されており、対応する推定アミノ酸配列は配列番号３３９に示されている。２種類のＰ５１０Ｓに関する変種完全長ｃＤＮＡ配列が配列番号５３５および５３６に、対応する推定アミノ酸配列がそれぞれ配列番号５３７および５３８に示されている。Ｐ５１０Ｓの更なるスプライス変異体が配列番号５９８および５９９に示されている。
前立腺特異的ｃＤＮＡの特性決定の間に単離された追加の前立腺−特異的クローンの決定されたｃＤＮＡ配列を配列番号：６１８−６８９、６９１−６９７及び７０９−７７２に示す。これらの配列と公共のデータベースの配列との比較により、それらのの配列の何れとも有意な相同性が無いことが示された。
【０４２９】
実施例２．前立腺特異的ポリペプチドの組織特異性の決定
遺伝子特異的プライマーを用い、代表的前立腺特異的ポリペプチドＦ１−１６、Ｈ１−１、Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓとも称される）、Ｌ１−１２（Ｐ５０１Ｓとも称される）、Ｆ１−１２（Ｐ５０４Ｓとも称される）およびＮ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓとも称される）のｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを利用して各種正常および腫瘍組織について調べた。簡単に述べると、全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ試薬を用い、上記の如く各種正常および腫瘍組織から抽出された。第１鎖合成は全ＲＮＡ１−２μｇを使い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＢＲＬライフテクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））により４２℃、１時間行われた。次にｃＤＮＡが遺伝子特異プライマーを用いたＰＣＲにより増幅された。ＲＴ−ＰＣＲの判定量性を保証するために、β−アクチンを各検討組織の内部コントロールとして用いた。
【０４３０】
まず第１鎖ｃＤＮＡの連続希釈体を調製し、βアクチン特異プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。次にβアクチン鋳型が直線増幅され、そして初期コピー数の差を反映できる十分な感度が得られる希釈率が選ばれた。これら条件下に於いて、各組織からの各逆転写反応についてβアクチンレベルが決定された。ＤＮａｓｅ処理すること、および逆転写酵素を加えずに調製された第１鎖ｃＤＮＡを用いた場合に陰性のＰＣＲ結果であることを確認することによって、ＤＮＡの混入は最小限に留められた。
【０４３１】
ｍＲＮＡ発現レベルを、４種類の腫瘍組織（２患者の前立腺組織、３患者の乳癌、結腸癌、肺癌）および前立腺、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、平滑筋、皮膚、胃、精巣、骨髄および脳を含む１６種類の正常組織について検討した。Ｆ１−１６は前立腺腫瘍組織、結腸癌および正常前立腺に於いて高レベルに、そして正常肝臓、皮膚および精巣では低レベルに発現されること、さらに検討したその他組織では検出されないことが判明した。Ｈ１−１は前立腺腫瘍、肺癌、乳癌、正常前立腺、正常結腸および正常脳で高いレベルに、正常肺、膵臓、骨格筋、皮膚、小腸、骨髄では遙か低レベルに、そして試験したその他組織では検出されないことが見出された。
【０４３２】
Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓ）およびＬ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）は、前立腺で特異的に過剰発現されると思われ、そして両遺伝子とも前立腺腫瘍と正常前立腺組織で高レベルに発現されていたが、検討したそのいずれの他組織での発現は低レベルで検出できなかった。Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）は前立腺腫瘍の６０％で過剰発現されていること、そして正常結腸および腎臓でも検出可能であることが見出された。即ちＲＴ−ＰＣＲの結果は、Ｆ１−１６、Ｈ１−１、Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓ）、Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）およびＬ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）は前立腺特異的であるか、または前立腺にて有意に高いレベルで発現されていることを示している。
【０４３３】
さらなるＲＴ−ＰＣＲ研究は、Ｆ１−１２（Ｐ５０４Ｓ）が前立腺腫瘍において過剰発現されていること、そして正常腎臓でも検出されるが試験したその他全ての組織では検出されないことを示した。同様にＲ１−２３３０は前立腺腫瘍の４０％で過剰発現され、そして正常腎臓および肝臓で検出可能であるが、試験したその他全ての組織では検出されないことが示された。Ｕ１−３０６４は前立腺腫瘍の６０％で過剰発現され、そして乳癌および結腸癌でも検出可能であるが、正常組織では検出されないことが示された。
Ｒ１−２２３０、Ｕ１−３０６４および１Ｄ−４２７９のＲＴ−ＰＣＲ特性分析は、これら３抗原が前立腺および／または前立腺腫瘍にて過剰発現されていることを示した。
【０４３４】
４種類の前立腺腫瘍と２種類の正常前立腺サンプル、２種類のＢＰＨ前立腺ならびに正常結腸、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、脳、胃、精巣、小腸および骨髄を用いたノーザン分析は、Ｌ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）が前立腺腫瘍および正常前立腺では過剰発現されているが、その他試験した正常組織では検出できないことを示した。Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓ）は２種類の前立腺腫瘍で検出されたが、その他試験した組織では検出されなかった。Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）は３種類の前立腺腫瘍で過剰発現され、そして正常前立腺、結腸および腎臓でも発現されているが、試験したその他組織では発現されていないことが見出された。Ｆ１−１２（Ｐ５０４Ｓ）は２前立腺腫瘍では高発現されていたが、試験したその他全ての組織では検出されないことが見出された。
【０４３５】
上記マイクロアレイ技術を用い、ここに記した代表的な抗原の前立腺腫瘍、乳癌および以下正常組織に於ける発現レベルを決定した：前立腺、肝臓、膵臓、皮膚、骨髄、脳、乳房、副腎、膀胱、精巣、唾液腺、大腸、腎臓、卵巣、肺、脊髄、骨格筋および結腸。Ｌ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）は正常前立腺および前立腺腫瘍において過剰発現されていること、そして正常骨格筋でいくらかの発現が検出されることが見出された。Ｊ１−１２およびＦ１−１２（Ｐ５０４Ｓ）は前立腺腫瘍で過剰発現され、試験したその他全ての組織ではより低いか、または検出できないことが見出された。
【０４３６】
Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）は前立腺腫瘍および正常前立腺において高レベルに発現され、正常大腸および正常結腸では低レベルに発現され、そして試験したその他全ての組織では検出されないことが見出された。Ｒ１−２３３０は前立腺腫瘍および正常前立腺では過剰発現されており、そしてその他試験した全ての組織ではより低レベルに発現されることが見出された。１Ｄ−４２７９は前立腺腫瘍および正常前立腺で過剰発現されており、正常脊髄ではより低レベルに発現され、試験したその他の組織では検出できないことが見出された。
【０４３７】
Ｐ５０１Ｓ（配列番号１１０）がどの程度乳癌で発現しているかについて特異的に解析した別のマイクロアレイでは、乳癌だけでなく転移性乳癌でも（２／３１）軽度の過剰発現があること、そして正常組織では無視できるほど低発現であることが示された。このデータは、Ｐ５０１Ｓが各種乳癌ならびに前立腺腫瘍でも過剰発現されていることを示唆している。
【０４３８】
Ｖａｓｍａｔｚｉｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３００−３０４、１９９８）により各種腫瘍および正常組織に記載された３２種類のＥＳＴ（発現配列タグ）を上記マイクロアレイ技術を用いて検討した。これらクローンの内の２クローン（Ｐ１０００ＣおよびＰ１００１Ｃと称する）が前立腺腫瘍および正常前立腺で過剰発現されていること、および試験したその他全ての組織（正常大動脈、胸腺、休止および活性化ＰＢＭＣ、上皮細胞、脊髄、副腎、胎児組織、皮膚、唾液腺、大腸、骨髄、肝臓、肺、樹状細胞、胃、リンパ節、脳、心臓、小腸、骨格筋、結腸および腎臓）では低ないし検出不能レベルに発現されていることが見出された。
【０４３９】
Ｐ１０００ＣおよびＰ１００１Ｃについて決定されたｃＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号３８４および４７２に示されている。Ｐ１００１Ｃの配列はこれまでに単離されているＪＭ２７蛋白質に関するヒトｍＲＮＡと相同性をしめすことが判明した。配列番号３８４と公開データベース中配列との更なる比較から、４９２アミノ酸配列をコードするｐ１０００Ｃの全長ｃＤＮＡ配列が同定された（配列番号９２９）。ＰＳＯＲＴＩＩプログラムを用いたアミノ酸配列分析より、アミノ酸８４−１００由来の推定膜貫通ドメインが同定された。停止コドンを含むＰ１００ＣのオープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列は配列番号９３０に示されており、停止コドンを含まないオープンリーディングフレームのそれは配列番号９３１に示されている。Ｐ１０００Ｃの完全長アミノ酸配列は配列番号９３２に示されている。配列番号９３３および９３４はそれぞれアミノ酸１−１００および１００−４９２を示している。
【０４４０】
Ｆ１−１２の完全長ｃＤＮＡ（Ｐ５０４Ｓとも称される；配列番号１０８）にコードされているポリペプチドの発現を免疫組織学的分析により調べた。標準的技術により完全長５０４Ｓ蛋白質に対しウサギ抗Ｐ５０４Ｓポリクローナル抗体を作製した。続いてポリクローナル抗体の単離および特性分析を、当分野周知の技術により実施した。免疫組織学的分析は、Ｐ５０４Ｓポリペプチドが試験した前立腺癌サンプル（ｎ＝５）の１００％で発現されていることを示した。
【０４４１】
ウサギ抗Ｐ５０４Ｓポリクローナル抗体は良性前立腺細胞を一様に細胞質顆粒を染色し染めるのではなく、むしろ核を軽く染色した。正常組織分析からは、コードされたポリペプチドが試験したヒト組織全てではないが、幾つかの組織で発現されていることが示された。ウサギ抗Ｐ５０４Ｓポリクローナル抗体による陽性の細胞質染色像は正常ヒト腎臓、肝臓、脳、結腸および肺関連マクロファージに見出されたが、一方心臓および骨髄は陰性であった。
【０４４２】
このデータは、Ｐ５０４Ｓポリペプチドが前立腺癌組織内に存在すること、そして良性前立腺肥大組織と前立腺癌組織との間には染色に定性的および定量的な違いが存在することを示しており、このポリペプチドが前立腺腫瘍で選択的に検出されることから、前立腺癌の診断に有用であることを示唆している。
【０４４３】
実施例３．ＰＣＲベースサブトラクションによる前立腺特異的ポリペプチドの単離および特性分析
正常前立腺を１０種類のその他正常組織ｃＤＮＡ（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、胎盤、骨格筋、脾臓および胸腺）でサブトラクションされ、次に第１ラウンドＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡを含む、ｃＤＮＡサブトラクションライブラリーはクローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）より購入した。このライブラリーをメーカーのプロトコールに従って第２ラウンドＰＣＲ増幅にかけた。
【０４４４】
得られたｃＤＮＡ断片をベクターｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ベクター（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウイスコンシン州（ＷＩ））にサブクローニングし、ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ’ Ｅ．ｃｏｌｉ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を形質転換した。独立したクローンよりＤＮＡを単離し、パーキンエルマー／アプライドバイオシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）部門、自動シークエンサーモデル３７３Ａを用いて配列決定した。
【０４４５】
４９個の陽性クローンについて配列決定した。これらクローンのＤＮＡ配列を上記遺伝子バンク内の配列と比較したところ、そのうちの以後Ｐ５、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１８、Ｐ２０、Ｐ３０、Ｐ３４、Ｐ３６、Ｐ３８、Ｐ３９、Ｐ４２、Ｐ４９、Ｐ５０、Ｐ５３、Ｐ５５、Ｐ６０、Ｐ６４、Ｐ６５、Ｐ７３、Ｐ７５、Ｐ７６、Ｐ７９およびＰ８４と呼ぶ２５クローンについては有意な相同性が認められなかった。これらクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列は、配列番号４１−４５、４７−５２および５４−６５にそれぞれ示されている。Ｐ２９、Ｐ４７、Ｐ６８、Ｐ８０およびＰ８２（それぞれ配列番号４６、５３および６６−６８）は、これまでに同定されたＤＮＡ配列とある程度相同性を示すことが判明した。発明者の知りうる限りにおいて、これまでこれら配列が前立腺内に存在することは示されていない。
【０４４６】
標準的完全長クローニング法にて配列番号６７の配列をプローブとして用いる別の研究からは、Ｐ８０（Ｐ７０４Ｐとしても知られる）のスプライ変異体と思われる３種類のｃＤＮＡ配列が単離された。これら配列は配列番号６９９−７０１に示されている。
【０４４７】
上記ＰＣＲをベースとした技術を用いた別の研究からは、さらに１８０種類の追加クローンが単離され、そのうち２３クローンが既知配列と有意な相同性を持たないことが見出された。これらクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列は配列番号１１５−１２３、１２７、１３１、１３７、１４５、１４７−１５１、１５３、１５６−１５８および１６０に示されている。２３クローン（配列番号１２４−１２６、１２８−１３０、１３２−１３６、１３８−１４４、１４６、１５２、１５４、１５５および１５９）はこれまでに同定されたＥＳＴといくらかの相同性を示すことが見出された。
【０４４８】
さらに１０クローン（配列番号１６１−１７０）は既知遺伝子とある程度の相同性を持つことが判明した。Ｐ２０を含むより大型のｃＤＮＡクローンは、Ｐ７０３Ｐと称される遺伝子のスプライト変異体である。ＤＥ１、ＤＥ１３およびＤＥ１４と称される変異体について決定されたＤＮＡ配列がそれぞれ配列番号１７１、１７５および１７７に示されており、そして対応する推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１７２、１７６および１７８に示されている。Ｐ７０３の延長スプライス型について決定されたｃＤＮＡ配列は配列番号２２５に示されている。ＤＥ２およびＤＥ６と称されるスプライス変異体のＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号１７３および１７４に示されている。
【０４４９】
腫瘍組織（前立腺（ｎ＝５）、乳房（ｎ＝２）、結腸および肺）、正常組織（前立腺（ｎ＝５）、結腸、腎臓、肝臓、肺（ｎ＝２）、卵巣（ｎ＝２）、骨格筋、皮膚、胃、小腸および脳）、および活性化ならびに非活性化ＰＢＭＣの代表クローンに於けるｍＲＮＡ発現レベルを、上記ＲＴ−ＰＣＲより決定した。発現は特記無い限り各組織について１サンプルづつ検討された。
【０４５０】
Ｐ９は、同等の発現を示した正常結腸を除き、試験した全正常試験組織に比べて、正常前立腺および前立腺腫瘍で高く発現していることが判明した。Ｐ７０３Ｐ遺伝子の一部であるＰ２０は、試験した全１２種類の正常組織に比べて正常前立腺および前立腺腫瘍で高く発現していることが見出された。肺（２例のうち１）を除く全ての正常組織に比べた場合、乳癌（ｎ＝２）、結腸癌および肺癌でＰ２０はいくらか増加を示した。肺および胃を除くその他正常細胞に比べ、正常前立腺、前立腺腫瘍および乳癌でＰ１８の発現増加が認められた。
【０４５１】
正常前立腺では、その他多くの正常組織に比べ若干のＰ５発現の増加が観察された。しかし、正常肺およびＰＢＭＣにおいて、いくらかの発現増加が見られた。Ｐ５の発現増加は前立腺腫瘍（５例中２例）、乳癌および１例の肺癌サンプルでも観察された。Ｐ３０に関しては、正常前立腺および前立腺腫瘍において、試験した残り１２種類の他正常組織中有６組織と類似の発現レベルが認められた。
【０４５２】
乳癌、１肺癌サンプルおよび１結腸癌サンプル、ならびに正常ＰＢＭＣにおいて発現増加が認められた。Ｐ２９は前立腺腫瘍（５例中５例）および正常前立腺（５例中５例）に於いて、大部分の正常組織と比較した時過剰発現が認められた。しかし、Ｐ２９の実質的発現が正常結腸および正常肺（２例中２例）に観察された。Ｐ８０は、試験したその他全ての正常組織に比べ前立腺腫瘍（５例中５例）および正常前立腺（５例中５例）で過剰発現が認められ、そして結腸癌でも発現増加が認められた。
【０４５３】
さらなる研究の結果、以後１０−ｄ８、１０−ｈ１０、１１−ｃ８、７−ｇ６、８−ｂ５、８−ｂ６、８−ｄ４、８−ｄ９、８−ｇ３、８−ｈ１１、９ｇ−１２および９−ｆ３と称される追加クローンが単離された。１０−ｄ８、１０−ｈ１１、１１−ｃ８、８−ｄ４、８−ｄ９、８−ｈ１１、９ｇ−１２および９−ｆ３について決定された配列は配列番号２０７、２０８、２０９、２１６、２１７、２２０、２２１および２２２にそれぞれ記されている。
【０４５４】
７−ｇ６、８−ｂ５、８−ｂ６および８−ｇ３について決定された正方向および逆方向のＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号２１０と２１１、２１２と２１３、２１４と２１５および２１８と２１９に記載されている。これら配列と遺伝子バンク配列との比較から、９−ｆ３の配列に対し有意な相同性がないことが示された。１０−ｄ８、１１−ｃ８および８−ｈ１１のクローンは既に単離されているＥＳＴといくらかの相同性を示し、そして１０−ｈ１０、８−ｂ５、８−ｂ６、８−ｄ４、８−ｄ９、８−ｇ３および９−ｆ１２は既に同定された遺伝子といくらかの相同性を示すことが見いだされた。
【０４５５】
これらクローンのｍＲＮＡ発現レベルは上記マイクロアレイ技術を用い決定された。クローン７−Ｇ６、８−Ｇ３、８−Ｂ５、８−Ｂ６、８−Ｄ４、８−Ｄ９、９−Ｆ３、９−Ｆ１２、９−Ｈ３、１０−Ａ２、１０−Ａ４、１１−Ｃ９および１１−Ｆ２が前立腺腫瘍および正常前立腺で過剰発現されていることが見いだされた。８−Ｆ１１の発現増加は前立腺腫瘍および正常な前立腺、膀胱、骨格筋および結腸で見られた。１０−Ｈ１０の発現増加は、前立腺腫瘍および正常な前立腺、膀胱、肺、結腸、脳および大腸に見られた。９−Ｂ１の発現増加は前立腺癌、乳ガンおよび正常前立腺、唾液腺、大腸および皮膚に見られ、１１−Ｃ８の発現増加は前立腺腫瘍および正常の前立腺と大腸に見られた。
【０４５６】
上記のＰＣＲをベースとした正常前立腺サブトラクションより得た追加ｃＤＮＡの１断片が前立腺特異的であることが、マイクロアレイ技術およびＲＴ−ＰＣＲにより見いだされた。このクローン（９−Ａ１１と称される）について決定されたｃＤＮＡ配列は配列番号２２６に示されている。この配列と公開データベースとの比較したところ、既知遺伝子ＨＯＸＢ１３と９９％の同一性が示された。
さらに研究を行い、クローン８−Ｃ６および８−Ｈ７を単離した。これらクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号２２７および２２８に示されている。これら配列は単離済みのＥＳＴといくらか相同性を示すことが見いだされた。
【０４５７】
ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションをベースとする方法を用いてクローンＰ２０（Ｐ７０３Ｐとも呼ばれる）に関するより長いｃＤＮＡ配列を得、遺伝子の５’末端をさらに伸ばした３種類の追加のｃＤＮＡ断片を得た。これらＰ７０３ＰＤＥ５、Ｐ７０３Ｐ６．２６およびＰ７０３ＰＸ−２３（配列番号３２６、３２８および３３０、それぞれ対応する推定アミノ酸配列が配列番号３２７、３２９および３３１に示される）と呼ばれる断片は、ｃＤＮＡライブラリー（＃１４１−２６）をＰ７０３Ｐの一部をプローブとして用いるスクリーニングにかけることで、回収された追加の５’配列Ｐ７０３ＰＤＥ５を含む。
【０４５８】
Ｐ７０３Ｐ６．２６は３種類の前立腺腫瘍ｃＤＮＡ混合体より回収され、そしてＰ７０３ＰＸ＿２３はｃＤＮＡライブラリー（＃４３８−４８）より回収された。まとめると、追加配列は推定シグナル配列の一部と共に推定成熟型セリンプロテアーゼの全てを含んでいる。Ｐ７０３Ｐの完全長ｃＤＮＡ配列は配列番号５２４に、そして対応するアミノ酸配列は配列番号５２５に示されている。
【０４５９】
コンピューターアルゴリズムを用いたところ、Ｐ７０３Ｐの以下の領域が潜在的なＨＬＡＡ２−結合ＣＴＬエピトープを示すことが予測された：配列番号５２５のアミノ酸１６４−１７２（配列番号８６６）；配列番号５２５のアミノ酸１６０−１６８（配列番号８６７）；配列番号５２５のアミノ酸配列２３９−２４７（配列番号８６８）；配列番号５２５のアミノ酸１１８−１２６（配列番号８６９）；配列番号５２５のアミノ酸１１２−１２０（配列番号８７０）；配列番号５２５のアミノ酸１５５−１６４（配列番号８７１）；配列番号５２５のアミノ酸１１７−１２６（配列番号８７２）；配列番号５２５のアミノ酸１６４−１７３（配列番号８７３）；配列番号５２５のアミノ酸１５４−１６３（配列番号８７４）；配列番号５２５のアミノ酸１６３−１７２（配列番号８７５）；配列番号５２５のアミノ酸５８−６６（配列番号８７６）；および配列番号５２５のアミノ酸５９−６７（配列番号８７７）。
【０４６０】
Ｐ７０３Ｐはトロンビンの様な既に同定済みのプロテアーゼにいくらかの相同性を示すことが判明した。トロンビン受容体は主に高い転移性を示す乳ガン細胞および乳ガン生検サンプルに発現していることが分かっている。トロンビン受容体アンチセンスｃＤＮＡの導入は、培養転移性乳ガン細胞の浸潤を阻害することが示されている。トロンビン受容体に対する抗体は、トロンビン受容体の活性化およびトロンビン誘導血小板活性化を阻害する。さらに受容体の係留リガンドドメインを組み立てるペプチドは、トロンビンによる血小板凝集を阻害する。Ｐ７０３Ｐは前立腺癌では、癌細胞または間質細胞上のプロテアーゼ活性化受容体を介しその役割を果たすだろう。
【０４６１】
Ｐ７０３Ｐの持つ潜在的トリプシン様プロテアーゼ活性は、癌細胞膜上のプロテアーゼ活性化受容体を活性化して癌発生を促進するか、または隣接細胞（間質細胞の様な）上のプロテアーゼ活性化受容体を活性化して増殖因子および／またはプロテアーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）を分泌し、これが腫瘍形成、浸潤および転移を促進するかもしれない。即ちＰ７０３Ｐはプロテアーゼ活性化受容体の活性化を通じ癌進行および／または転移を促進するのだろう。従ってＰ７０３Ｐ−受容体相互作用を遮断するポリペプチドおよび抗体は、前立腺癌の治療に有効に利用できるだろう。
【０４６２】
Ｐ７０３Ｐの発現が腫瘍ステージの指標であるグレアソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）重症度の上昇に伴って増加するか決定するために、グレアソンスコア５ないし＞８の範囲の前立腺腫瘍サンプルに定量ＰＣＲ分析を行った。Ｐ７０３Ｐ発現の平均レベルはグレアソンスコアの上昇に伴い増加し、Ｐ７０３Ｐの発現が疾患重傷度の増加と相関するらしいことが示された。
【０４６３】
前立腺腫瘍プールを正常組織のプールでサブトラクションしたＰＣＲをベースとしたサブトラクションライブラリー（ＪＰ：ＰＣＲサブトラクションと称する）を用いた別の研究より１３個の追加クローンが単離され、そのうちの７個は既知ＧｅｎＢａｎｋ配列と有意な相同性を共有しなかった。これら７個のクローン（Ｐ７１１Ｐ、Ｐ７１２Ｐ、ｎｏｖｅｌ２３、Ｐ７７４Ｐ、Ｐ７７５Ｐ、Ｐ７１０ＰおよびＰ７６８Ｐ）について決定されたｃＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号３０７−３１１、３１３および３１５に示している。
【０４６４】
残りの６クローン（配列番号３１６および３２１−３２５）は既知遺伝子といくらかの相同性を示した。マイクロアレイ分析より、これら１３個のクローン全てが正常非前立腺組織に比べ前立腺腫瘍、ＢＰＨおよび正常前立腺において３またはそれ以上の倍率で過剰発現していることが示された。クローンＰ７１１Ｐ、Ｐ７１２Ｐ、ｎｏｖｅｌ２３およびＰ７６８Ｐは試験した大部分の前立腺腫瘍およびＢＰＨ組織（ｎ＝２９）ならびに正常前立腺組織の多く（ｎ＝４）で過剰発現を示したが、全ての正常組織ではバックグランドないし低いレベルの発現であった。クローンＰ７７４Ｐ、Ｐ７７５ＰおよびＰ７１０Ｐは比較的低い発現を示し、発現を示す前立腺腫瘍およびＢＰＨサンプルも少数であり、正常前立腺では陰性ないし低い発現であった。
【０４６５】
更なる研究よりＰ７１２Ｐ（配列番号５５２）に関する延長ｃＤＮＡ配列が単離された。配列番号５５２の配列内に存在する１６個の推定オ−プンリーディングフレームによりコードされたアミノ酸配列は配列番号５５３−５６８に示されている。
【０４６６】
Ｐ７１１Ｐに関する完全長ｃＤＮＡは、配列番号３０７の部分配列を用いて前立腺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることで得た。具体的には標準的技術を用いて定方向クローニングされた前立腺ｃＤＮＡライブラリーを調製した。このライブラリーの１００万個のコロニーをＬＢ／Ａｍｐプレートに接種した。ナイロン膜フィルターを用いてこれらクローンをつり上げ、そしてこれらフィルターによって取り上げられたｃＤＮＡを変性し、ＵＶ光を用いてフィルターに架橋結合した。配列番号３０７のＰ７１１ＰｃＤＮＡ断片を放射線標識し、これらフィルターのハイブリダイゼーションに用いた。陽性クローンを選択し、ｃＤＮＡを調製、自動パーキンエルマー／アプライドバイオシステムズシークエンサーを用い配列決定した。決定されたＰ７１１Ｐの全長配列は配列番号３８２に、そして対応する推定アミノ酸配列は配列番号３８３に示されている。
【０４６７】
ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションをベースとする方法を用いて、上記２クローン、即ち以後それぞれここではＰ７０７ＰおよびＰ７１４Ｐと称される１１−Ｃ９および９−Ｆ３より追加のｃＤＮＡ配列情報を得た（配列番号３３３および３３４）。最新のＧｅｎＢａｎｋとの比較より、Ｐ７０７Ｐは既知遺伝子ＨｏｘＢ１３のスプライス変異体であることが判明した。これに対しＰ７１４Ｐについては有意な相同性は認められなかった。配列番号３３４を標準的全長クローニング法に於けるプローブとして用いた別の研究から、Ｐ７１４Ｐに関する延長ｃＤＮＡ配列を得た。この配列は配列番号６９８に示されている。この配列はリボソームＬ２３Ａ蛋白質をコードする遺伝子にある程度の相同性を示すことが見いだされた。
【０４６８】
クローン８−Ｂ３、Ｐ−８９、Ｐ９８、Ｐ１３０およびＰ２０１（１９９８年、２月９日出願、米国特許出願第０９／０２０，９５６に開示される様に）は、Ｐ７０５Ｐ（配列番号３３５で、対応する推定アミノ酸配列は配列番号３３６に示される）と呼ばれる１個の連続配列内に含まれていることが見いだされており、それは既知遺伝子ＮＫＸ３．１のスプライス変異体であることが決定されている。
【０４６９】
Ｐ７７５Ｐに関する更なる研究の結果、全てＰ７７５Ｐ遺伝子のスプライス変異体である４個の追加配列（配列番号４７３−４７６）が単離された。配列番号４７４の配列は２個のオ−プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことが見いだされている。これらＯＲＦにコードされる推定アミノ酸配列は配列番号４７７および４７８に示されている。配列番号４７５のｃＤＮＡ配列は配列番号４７９のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを含むことが見いだされている。配列番号４７３のｃＤＮＡ配列は４つのＯＲＦを含むことが見いだされている。これらＯＦＲによりコードされるｃＤＮＡ配列は配列番号４８０−４８３に示されている。追加のＰ７７５Ｐのスプライス変異体は配列番号５９３−５９７に示されている。
【０４７０】
続く研究よりキャッツアイ症候群領域として知られる染色体２２ｑ１１．２上のゲノム領域が同定され、その領域は５個の前立腺遺伝子Ｐ７０４Ｐ、Ｐ７１２Ｐ、Ｐ７７４Ｐ、Ｐ７７５ＰおよびＢ３０５Ｄを含でいた。このゲノム領域内にあるこれら５遺伝子の相対位置を図１０に示す。従ってこの領域は悪性腫瘍と関連すると思われ、そしてその他潜在的腫瘍遺伝子がこの領域に含まれている可能性がある。これら研究はさらにＰ７７５Ｐ（配列番号５３３に示す）に関する、配列番号５３４のアミノ酸配列をコードしている潜在的オ−プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）も同定した。
【０４７１】
配列番号３２５のクローン（Ｐ５５８Ｓと呼ぶ）とＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎｅＳｅｑＤＮＡデータベースとの比較からは、Ｐ５５８Ｓが、２つの形を持つことが知られている前立腺特異的トランスグルタミナーゼ遺伝子と同一であることが示された。この２つの形の完全長配列はそれぞれ配列番号７７３および７７４、対応するアミノ酸配列は配列番号７７５および７７６に示されている。配列番号７７４のｃＤＮＡ配列は１５対塩基のインサートを有しており、その結果対応するアミノ酸配列中に５アミノ酸の挿入が生じた（配列番号７７６）。この挿入は配列番号７７３の配列内には存在していない。
【０４７２】
Ｐ７６８Ｐ（配列番号３１５）に関する更なる研究により、推定完全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定された。停止コドンを持つＯＲＦのｃＤＮＡ配列は配列番号９０７に示されている。停止コドンを持たないＯＦＲのｃＤＮＡ配列は配列番号９０８に示されており、対応するアミノ酸配列は配列番号９０９に示されている。この配列はラットカルシウム輸送蛋白質と８０％の同一性を示し、Ｐ７６７Ｐがヒトカルシウム輸送蛋白質である可能性を示唆した。Ｐ７６８Ｐ内の膜貫通ドメインの位置は、ＰＳＯＲＴＩＩコンピューターアルゴリズムを用い推測された。６個の膜貫通ドメインがアミノ酸位置１１８−１３４、１７２−１８８、２１１−２２７、２３０−２４６、２８２−２９８および３４８−３６４に推測された。配列番号９１０−９１５のアミノ酸配列はそれぞれＰ７６８Ｐのアミノ酸１−１３４、１３５−１８８、１８９−２２７、２２８−２４６、２４７−２９８および２９９−５１１を表している。
【０４７３】
実施例４．ポリペプチドの合成
ポリペプチドはパーキンエルマー／アプライドバイオシステムズ４３０Ａペプチド合成装置を用い、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸）活性化を利用したＦＭＯＣ化学を利用して合成される。ペプチドのアミノ末端には、固定面へ共役し、結合し、またはペプチド標識する方法を提供するためにＧｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ配列を取り付けても良い。固相支持体からのペプチド切断は、次の切断混合液を利用し実施される：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）。
【０４７４】
２時間切断した後、ペプチドは冷メチル−ｔ−ブチル−エーテルで沈殿される。次にペプチド沈渣は０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水に溶解され、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製される前に凍結乾燥される。０％−６０％（０．１％ＴＦＡを含む）のアセトニトリル勾配水溶液（０．１％ＴＦＡを含む）を用いペプチドを溶出する。精製分画を凍結乾燥した後、ペプチドはエレクトロスプレーまたはその他タイプのマススペクトロメトリーにより、およびアミノ酸分析により特性分析される。
【０４７５】
実施例５．ＰＣＲベースサブトラクションを用いた前立腺特異ポリペプチドの更なる単離および特性分析
上記の様に前立腺原発性腫瘍ｍＲＮＡより作成されたｃＤＮＡを、正常前立腺由来ｃＤＮＡでサブトラクションした。サブトラクションは、より長い断片を生成するように改良されたＰＣＲをベースとするプロトコール（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用い実施された。
【０４７６】
このプロトコールでは、テスターおよびドライバーの２本鎖ｃＤＮＡは別々に、６種類のヌクレオチド制限部位（ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａＩＩおよびＳｔｕＩ）を認識する５種類の制限酵素で消化された。この消化では、クローンテックプロトコールのＲｓａＩ消化で生じる平均サイズ３００ｂｐではなく、平均サイズ６００ｂｐのｃＤＮＡが生じた。この改良はサブトラクション効率に影響しなかった。次に異なるアダプターを使って２種類のテスター集団が作成され、そしてドライバーライブラリーはアダプターなしの状態で維持された。
【０４７７】
次にテスターおよびドライバーライブラリーは、過剰のドライバーｃＤＮＡを用いハイブリダイゼーションされた。第１ハイブリダイゼーション段階では、ドライバーは２種類のテスターｃＤＮＡ集団それぞれに別々にハイブリダイゼーションされた。その結果、（ａ）ハイブリダイゼーションしていないテスターｃＤＮＡ、（ｂ）他のテスターｃＤＮＡとハイブリダイゼーションしたテスターｃＤＮＡ、（ｃ）ドライバーｃＤＮＡとハイブリダイゼーションしたテスターｃＤＮＡ、および（ｄ）ハイブリダイゼーションしなかったドライバーｃＤＮＡの集団が生じた。
【０４７８】
次に２つの別々のハイブリダイゼーション反応液をまとめ、追加の変性ドライバーｃＤＮＡ存在下に再ハイブリダイゼーションを行った。この２回目のハイブリダイゼーション後に、（ａ）ないし（ｄ）の集団に加え、あるアダプターを持つテスターｃＤＮＡで第２アダプターを持つテスターｃＤＮＡをハイブリダイゼーションした５番目の集団（ｅ）が生成された。その結果第２ハイブリダイゼーション段階では、アダプター特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅に鋳型として利用できる差別的に発現された配列が濃縮された。
【０４７９】
末端部分を充足し、アダプター特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。ドライバーｃＤＮＡとハイブリダイゼーションしなかったテスターｃＤＮＡを含む集団（ｅ）のみが対数的に増幅された。次に第２ＰＣＲ増幅段階を実施し、バックグランドを下げ、さらに差別的に増幅された配列を濃縮した。
このＰＣＲをベースとするサブトラクション技術は、差別的に発現したｃＤＮＡを正規化するため、前立腺腫瘍組織内で過剰発現されている稀な転写体を回収することができる。この様な転写体は従来のサブトラクション法で回収することは困難であろう。
【０４８０】
前立腺腫瘍内で過剰発現されていることが既知の遺伝子に加え、７７個のクローンがさらに同定された。これら部分ｃＤＮＡの配列は配列番号２９ないし３０５に示されている。これらクローンの大部分はデータベース配列と有意な相同性を示さなかった。例外はＪＰＴＰＮ２３（配列番号２３１；ブタバロシン含有蛋白質に類似）、ＪＰＴＰＮ３０（配列番号２３４；プロテオソームに関するラットｍＲＮＡに類似）ＪＰＴＰＮ３０（配列番号２３４；ラットノルベギカス（ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）細胞質ＮＡＤＰ−依存型イソシトレートデヒドロゲナーゼに類似）、ＪＰＴＰＮ４６（配列番号２４４；ヒトサブクローンＨ８４ｄ４ＤＮＡ配列に類似）、Ｊｐ１ｄ６（配列番号２６５；Ｇ．ｇａｌｌｕｓダイニン軽鎖−Ａに類似）、ＪＰ８Ｄ６（配列番号２８８；ヒトＢＡＣクローンＲＧ０１６Ｊ０４に類似）、ＪＰ８Ｆ５（配列番号２８９；ヒトサブクローンＨ８３ｂ５ＤＮＡ配列に類似）およびＪＰ８Ｅ９（配列番号２９９；ヒトＡｌｕ配列に類似）であった。
【０４８１】
ＰＣＲをベースとした、正常前立腺プールに対し前立腺腫瘍プールをサブトラクションすること（ＰＴ−ＰＮＰＣＲサブトラクションと呼ぶ）を含むサブトラクションライブラリーを用いた追加研究から、さらに３個の追加クローンが得られた。これらクローンのｃＤＮＡ配列と最新のＧｅｎＢａｎｋとの比較からは、Ｐ７１５ＰおよびＰ７６７Ｐ（配列番号３１２および３１４）と称される２クローンについて、有意な相同性は示されなかった。
【０４８２】
マイクロアレイ分析を用い各種組織中のｍＲＮＡ発現レベルを測定したところ、３クローン全てが前立腺腫瘍およびＢＰＨ組織内で過剰発現していることが見いだされた。具体的にはクローンＰ７１５Ｐは大部分の前立腺腫瘍およびＢＰＨ組織において３倍またはそれ以上過剰発現されており、また多くの正常前立腺サンプルおよび胎児組織でも発現増加が認められるが、その他全ての正常組織での発現は陰性または低かった。クローン７６７Ｐは複数の前立腺腫瘍およびＢＰＨ組織で過剰発現され、半数の正常前立腺サンプルでは軽度の発現レベルを示し、その他の試験した全正常組織ではバックグランドまたは低発現であった。
【０４８３】
上記マイクロアレイによる、ＰＴ−ＰＮＰＣＲサブトラクションライブラリーおよび正常組織ｃＤＮＡのプールでサブトラクションされた前立腺腫瘍由来のｃＤＮＡを含むＤＮＡサブトラクションライブラリーを更に分析した結果、前立腺腫瘍で過剰発現することが確定された２７個のクローンがさらに単離された（配列番号３４０−３６５および３８１）。配列番号３４１、３４２、３４５、３４７、３４８、３４９、３５１、３５５−３５９、３６１、３６２および３６４のクローンは正常前立腺で発現していることが見いだされた。
【０４８４】
各種正常組織内では全２６クローンとも発現が低いかまたは検出されないことが見いだされたが、Ｐ５４４Ｓ（配列番号３３６）は例外で、小腸にて発現していることが見いだされた。２６クローンのうち１１（配列番号３４０−３４９および３６２）はこれまでに同定されている配列にいくらか相同性を示すことが判明した。配列番号３５０、３５１、３５３−３６１および３６３−３６５のクローンについては有意な相同性は認められなかった。
【０４８５】
配列番号３６２とＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎｅＳｅｑＤＮＡデータベースとの比較からは、このクローン（Ｐ７８８Ｐと称す）はＧｅｎｅＳｅｑ登録番号Ｘ２７２６２と同一で、ＧｅｎｅＳｅｑ登録番号Ｙ００９３１に見いだされる蛋白質をコードしている。Ｐ７８８Ｐの完全長ｃＤＮＡ配列は図１２Ａ（配列番号７７７）に示されており、対応する推定アミノ酸は図１２Ｂ（配列番号７７８）に示されている。続いて配列番号７７９の配列には認められない多形を含むＰ７８８Ｐの完全長ｃＤＮＡ配列を、３個人に由来する複数のＲＮＡ鋳型から調製したｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、複数回クローン化した。Ｐ７８８Ｐのこの多形について決定されたｃＤＮＡ配列は配列番号７７９に示されており、対応するアミノ酸配列はは配列番号７８０に示されている。配列番号７８０の配列は配列番号７７８の配列と６カ所のアミノ酸残基で異なっていた。Ｐ７８８Ｐ蛋白質は７個の潜在的膜貫通ドメインをＣ−末端部分に有しており、そして細胞外Ｎ−末端老域を持つ原形質膜蛋白質と推定されている。
【０４８６】
配列番号３５２のクローン（Ｐ７９０Ｐと称す）について更に研究したところ、配列番号５２６の完全長ｃＤＮＡ配列が単離された。対応する推定アミノ酸は配列番号５２７に示されている。２回の定量的ＰＣＲ実験のデータよりＰ７９０Ｐが試験した前立腺腫瘍サンプル中１１／１５で過剰発現されていること、そして脊髄では発現が低レベルであること、ならびに試験したその他正常サンプルでは発現が見られないことが示された。さらなるＰＣＲ実験およびマイクロアレイ実験のデータは、正常前立腺および前立腺腫瘍では過剰発現していること、そしてその他試験した組織では発現がほとんどないか、または全くないことが示された。その後Ｐ７９０Ｐは従来同定されているＧ−蛋白質結合前立腺組織受容体と有意な相同性を示すことが判明した。
【０４８７】
配列番号３５４のクローン（Ｐ７７６Ｐと称す）について更に研究したところ、配列番号５６９に示す延長ｃＤＮＡ配列が単離された。Ｐ７７６Ｐの３種類の追加スプライス変異体について決定されたｃＤＮＡ配列を配列番号５７０−５７２に示す。配列番号５７０に含まれ２個の推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、配列番号５７１に推定ＯＲＦが含まれる１個の推定ＯＲＦ、そして配列番号５６９内に含まれる１１個の推定ＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５７３−５８６に示されている。更に研究したところ、配列番号５７０クローンに関する完全長配列（配列番号８８０に示される）が単離された。
【０４８８】
配列番号５７１のクローンについて完全長クローニングを試みた結果、２種類の配列（配列番号８８１および８８２に示す）が単離され、一方のクローンは位置１２９３にある多形の挿入／欠失以外は同一であった。具体的には、配列番号８８２のクローン（クローンＦ１と称す）は位置１２９３の位置にＣを持つ。配列番号８８１のクローン（クローンＦ２と称す）は位置１２９３の位置に１塩基対の欠失を持つ。配列番号８８０内に位置する５個のオープンリーディングフレームによりコードされる推定アミノ酸配列は配列番号８８３−８８７に、そして配列番号８８１および８８２のクローンにコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号８８８−８９３に示されている。
【０４８９】
クローンＰ７６７Ｐ（配列番号３１４）およびＰ７７７Ｐ（配列番号３５０）のｃＤＮＡ配列とＧｅｎＢａｎｋヒトＥＳＴデータベースとの比較より、２クローンが多くのＥＳＴ配列と共通して合致することが示され、Ｐ７６７ＰおよびＰ７７７Ｐが同一遺伝子であることが示唆された。Ｐ７６７Ｐ、Ｐ７７７Ｐおよび複数のＥＳＴクローンのＤＮＡ配列アラインメントより得たＤＮＡ配列を配列番号５８７に示す。配列番号５８７内に存在する３個の推定ＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列は配列番号５８８−５９０に示す。
【０４９０】
配列番号３４２のクローン（Ｐ７８９Ｐと称す）はこれまでに同定された遺伝子と相同性を示すことが判明した。Ｐ７８９Ｐの完全長ｃＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号７３５および７３６に示す。
【０４９１】
実施例６．マウスのペプチドプライミングおよびＣＴＬ細胞株の継代
６．１　本実施例はＰ５０２Ｓ遺伝子を発現している細胞に特異的なＣＴＬ細胞株の調製を例示する。
ヒトＨＬＡＡ２Ｋｂ（Ｄｒ．Ｌ．Ｓｈｅｒｍａｎ，スクリプス（Ｓｃｒｉｐｐｓ）研究所、ラジョラ（ＬａＪｏｌｌａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））に関するトランス遺伝子を発現しているマウスを、以下変更を加えＴｈｅｏｂａｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：１１９９３−１１９９７、１９９５記載の様にＰ５０２Ｓ遺伝子（ここではＪ１−１７とも称する、配列番号８）より得たＰ２Ｓ＃１２ペプチド（ＶＬＧＷＶＡＥＬ；配列番号３０６）で免疫した。
【０４９２】
マウスは１００μｇのＰ２Ｓ＃１２および不完全フレンドアジュバント中に乳剤化されたＢ型肝炎ウイルス蛋白質に由来する１２０μｇのＩ−Ａ^ｂ結合ペプチドで免疫された。３週後これらマウスを屠殺し、ナイロンメッシュを使って単細胞懸濁液を調製した。次に細胞を１０％ＦＳＣ、２ｍＭグルタミン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ガイザイースブルグ（Ｇａｉｔｅｈｒｓｂｒｕｇ）、メリーランド（ＭＤ）、ピルビン酸ナトリウム（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、非必須アミノ酸（ＧｂｉｃｏＢＲＬ）、２×１０^−５Ｍ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを含む完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ガイザイースブルグ（Ｇａｉｔｅｈｒｓｂｒｕｇ）、メリーランド（ＭＤ）中に６×１０^６細胞／ｍｌに懸濁し、放射線照射照射された（３０００ｒａｄｓ）、Ｐ２Ｓ＃１２でパルス（５ｍｇ／ｍｌＰ２Ｓ＃１２および１０ｍｇ／ｍｌβ２−ミクログロブリン）処理したＬＰＳブラスト存在下に（７μｇ／ｍｌの硫酸デキストランおよび２５μｇ／ｍｌのＬＰＳ存在下に３日間培養したＡ２トランスジェニック脾臓細胞）培養した。
【０４９３】
６日後、細胞（５×１０^５／ｍｌ）を２．５×１０^６／ｍｌのペプチドパルス処理した放射線照射（２０，０００ｒａｄｓ）ＥＬ４Ａ２Ｋｂ細胞（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：８１５−８１８，１９９２）および３×１０^６／ｍｌＡ２トランスジェニック脾臓細胞フィーダー細胞で再刺激した。細胞を２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２存在下に培養した。細胞はさらに１週ベースで、細胞株クローニング調製について記載されている様にして再刺激された。
【０４９４】
Ｐ２Ｓ＃１２細胞株は、ペプチドパルスされたＥＬ４Ａ２Ｋｂ腫瘍細胞（１×１０^４細胞／ウエル）を刺激体として用い、そしてＡ２トランス遺伝子脾臓細胞をフィーダー細胞（５×１０^５細胞／ウエル）として１４日間３０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２存在下に増殖される限界希釈分析によりクローン化され、細胞は以前同様に再刺激された。２１日目に増殖したクローンを単離し、培養して維持した。これらクローンの幾つかがコントロールの繊維芽細胞に対するよりも、Ｐ５０２Ｓで形質転換されたヒト繊維芽細胞（ＨＬＡＡ２Ｋｂ発現）に対し有意に高い反応性（溶解）を示した。例を図１に示す。
このデータはＰ２Ｓ＃１２が、ヒトＨＬＡＡ２Ｋｂ分子と関連して発現されるＰ５０２Ｓ蛋白質の自然処理型エピトープを表すことを示している。
【０４９５】
６．２　本実施例はマウスＣＴＬ細胞株の調製およびＰ５０１Ｓ遺伝子を発現している細胞に特異的なＣＴＬクローンを例示する。
この一連の実験は、上記同様にして実施された。マウスをＰ５０１Ｓ遺伝子（ここではＬ１−１２とも呼ばれる、配列番号１１０）より得たＰ１Ｓ＃１０ペプチド（配列番号３３７）で免疫した。Ｐ１Ｓ＃１０ペプチドは公開されているＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ（Ｐａｒｋｅｒ、ＫＣら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：１６３、１９９４）により定義された潜在的ＨＬＡ−Ａ２結合配列に関するＰ５０１Ｓの推定ポリペプチドの分析より得た。
【０４９６】
Ｐ１Ｓ＃１０ペプチドは実施例４記載の様に合成され、Ｔ細胞をベースとする競合アッセイを用いＨＬＡ−Ａ２結合について経験的に試験された。推定Ａ２結合ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２結合インフルエンザマトリックスペプチド、ｆｌｕＭ５８に特異的であるＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬクローン（Ｄ１５０Ｍ５８）に対するＨＬＡ−Ａ２特異ペプチド提示と競合する能力について試験された。
【０４９７】
競合アッセイでは、ＣＴＬ上にＨＬＡ−Ａ２を結合させるため、Ｄ１５０Ｍ５８ＣＴＬの培養体に１００−２００μｇ／ｍｌの試験ペプチドが加えられた。３０分後、標準的ＴＮＦバイオアッセイを用い、試験ペプチドまたはコントロールペプチドと共に培養したＣＴＬを、それらの抗原がｆｌｕＭ５８ペプチドに対し反応するか試験した。図３に示す様に、ペプチドＰ１Ｓ＃１０はｆｌｕＭ５８のＨＬＡ−Ａ２拘束提示を競合し、ペプチドＰ１Ｓ＃１０がＨＬＡ−Ａ２に結合することを示した。
【０４９８】
ヒトＨＬＡＡ２Ｋｂに関するトランス遺伝子を発現しているマウスを、Ｔｈｅｏｂａｌｄら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１１９９３−１１９９７，１９９５）報告を以下の如く変更して用い免疫した。マウスを６２．５μｇのＰ１Ｓ＃１０および不完全フレンドアジュバント中に乳剤化されたＢ型肝炎ウイルス蛋白質に由来する１２０μｇのＩ−Ａ^ｂ結合ペプチドで免疫した。３週後これらマウスを屠殺し、ナイロンメッシュを用い単細胞懸濁液を調製した。
【０４９９】
次に細胞を完全培地（上記）中に６×１０^６細胞／ｍｌに懸濁し、放射線照射した（３０００ｒａｄｓ）Ｐ２Ｓ＃１２パルス処理済み（２μｇ／ｍｌＰ１Ｓ＃１０および１０ｍｇ／ｍｌβ２−ミクログロブリン）ＬＰＳブラスト（７μｇ／ｍｌの硫酸デキストランおよび２５μｇ／ｍｌのＬＰＳ存在下に３日間培養したＡ２トランスジェニック脾臓細胞）存在下に培養した。６日後、細胞（５×１０^５／ｍｌ）を上記の２．５×１０^６／ｍｌのペプチドパルス処理した放射線照射（２０，０００ｒａｄｓ）ＥＬ４Ａ２Ｋｂ細胞および３×１０^６／ｍｌＡ２トランスジェニック脾臓細胞フィーダー細胞で再刺激した。細胞を２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２存在下に培養した。細胞はさらに１週ベースで再刺激し、クローニングに備えた。インビトロ刺激を３回繰り返した後、図４に示す様にＰ１Ｓ＃１０パルス処理したＪｕｒｋａｔＡ２Ｋｂ標的細胞およびＰ５０１Ｓ−形質転換Ｊｕｒｋａｔ標的細胞を認識する１細胞株胞株が生成された。
【０５００】
Ｐ１Ｓ＃１０特異的ＣＴＬ細胞株は、ペプチドパルスされたＥＬ４Ａ２Ｋｂ腫瘍細胞（１×１０^４細胞／ウエル）を刺激体として用い、Ａ２トランスジェニック脾臓細胞をフィーダー細胞（５×１０^５細胞／ウエル）として１４日間３０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２存在下に増殖される限界希釈分析によりクローン化された。２１日目に生存クローンが単離され、培養し維持された。図５に示す様に、これらクローンのうちの５クローンが、Ｐ５０１Ｓ形質転換ＪｕｒｋａｔＡ２Ｋｂ標的細胞に対し特異的細胞溶解性活性を示した。このデータはＰ１Ｓ＃１０が、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１分子と関連して発現されるＰ５０１Ｓ蛋白質の自然処理エピトープを表すことを示している。
【０５０１】
実施例７．前立腺抗原を有する裸ＤＮＡ免疫を用いたインビボでのＣＴＬプライミング　前立腺特異抗原Ｌ１−１２は、上記の如くＰ５０１Ｓとも呼ばれる。ＨＬＡＡ２ＫｂＴｇマウス（Ｄｒ．Ｌ．Ｓｈｅｒｍａｎ、スクリプス研究所、ラジョラ、カリフォルニア州提供）を１００μｇのベクターＶＲ１０１２中Ｐ５０１Ｓを用いて筋肉内または経皮的に免疫した。マウスは３回、２週間隔免疫された。最終免疫から２週後、免疫脾臓細胞をＪｕｒｋａｔＡ２Ｋｂ−Ｐ５０１Ｓ形質導入刺激細胞と共に培養した。インビトロ刺激２週後、ＣＴＬ活性をＰ５０１Ｓ形質導入標的細胞に対し調べた。８匹のマウスの内２匹が強い抗Ｐ５０１ＳＣＴＬ反応を生じた。これらの結果は、Ｐ５０１Ｓが少なくとも１個自然処理されたＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬエピトープを含むことを示している。
【０５０２】
実施例８．前立腺特異ポリペプチドを認識するヒトＴ細胞の能力
本実施例は前立腺腫瘍ペプチドに対し特異的なＴ細胞のヒト腫瘍認識能力を例示する。
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をＶａｎＴｓａｉら、（ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１８：６５−７５，１９９８）に従って樹状細胞を用い、Ｐ５０２Ｓ（Ｊ１−１７とも呼ばれる）由来のＰ２Ｓ−１２ペプチド（配列番号３０６）に対しインビトロでプライムした。得られたＣＤ８^＋Ｔ細胞の微量培養体を、γ−インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｌａｌｖａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５７参照）を用い、自家繊維芽細胞またはＰ５０２Ｓ遺伝子を発現する様に形質導入された繊維芽細胞が提示するＰ２Ｓ−１２ペプチドを認識するそれらの能力について試験した。
【０５０３】
簡単に述べると、Ｔ細胞の力価数を３μｇ／ｍｌのヒトβ２−ミクログロブリンおよび１μｇ／ｍｌのＰ２Ｓ−１２ペプチドまたはコントロールのＥ７５ペプチド存在下、１０^４繊維芽細胞について二重アッセイした。さらにＴ細胞は同時にＰ５０２Ｓ遺伝子で形質導入された自家繊維芽細胞、またはコントロールとしてＨＥＲ−２／ｎｅｕで形質導入された繊維芽細胞についてもアッセイされた。アッセイ前、繊維芽細胞は１０ｎｇ／ｍｌのγ−インターフェロンで４８時間処理され、クラスＩＭＨＣの発現をアップレギュレーションした。微量培養体の一つ（＃５）が、γ−インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイでペプチドパルス処理した繊維芽細胞ならびに形質導入繊維芽細胞の両方に強い認識を示した。
【０５０４】
図２Ａは、Ｐ２Ｓ−１２ペプチドでパルス処理された繊維芽細胞上のＴ細胞数の増加に伴って、γ−インターフェロンのスポット数も大きく増加するが（実線）、コントロールＥ７５ペプチドでは増加しない（破線）ことを示す。これは、これらＴ細胞のＰ２Ｓ−１２ペプチドを特異的に認識する能力を示している。
【０５０５】
図２Ｂに示す様にこの微量培養体も、Ｐ５０２Ｓ遺伝子を発現するがＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子は発現しない様形質導入された繊維芽細胞上のＴ細胞が増加するのに伴ってγ−インターフェロンスポット数が増加するが、ことを示した。これらの結果は、Ｐ２Ｓ−１２ペプチドが自然処理されたＰ５０２Ｓ蛋白質エピトープであること証明する更なる証拠を提供している。さらに、このことはヒトＴ細胞レパートリーの中にこのエピトープを認識できる高親和性Ｔ細胞が存在することも示している。これらＴ細胞はＰ５０２Ｓ遺伝子を発現するヒト腫瘍を認識することもできる。
【０５０６】
実施例９．ヒト血液中での前立腺抗原特異的ＣＴＬ反応の誘導
本実施例は、正常人の血液に於いてＣＴＬ反応を惹起する前立腺特異抗原の能力について例示する。
自家樹状細胞（ＤＣ）は、正常人ドナーのＰＢＭＣに由来する単球培養体より、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地中に５日間増殖させることで分化させた。培養後、一晩ＤＣをＭ．Ｏ．Ｉ５の組換え体Ｐ５０１Ｓ発現ワクシニアウイルスで感染させ、２μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドを加え８時間成熟させた。
【０５０７】
ウイルスをＵＶ照射により不活性化し、ＣＤ８＋細胞を磁性ビーズを用いポジティブ選別して単離し、２４ウエルプレート内にて初代培養を開始した。レトロウイルスによりＰ５０１ＳおよびＣＤ８０を発現するよう形質導入された自己繊維芽細胞を使って５回刺激サイクルを実施した後、自己Ｐ５０１Ｓ形質導入繊維芽細胞で刺激したとき特異的にインターフェロンガンマを生ずるＣＤ８＋細胞株を同定した。
【０５０８】
細胞株３Ａ−１のＰ５０１Ｓ特異活性は、Ｐ５０１Ｓで形質導入された自己Ｂ−ＬＣＬに追加の刺激サイクルを行うことで維持できるだろう。細胞傷害性アッセイ（^５１Ｃｒ放出）およびインターフェロンガンマ生産（ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎｇａｍｍａＥｌｉｓｐｏｔ；上記およびＬａｖａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５，１９９７参照）より測定したところ、細胞株３Ａ−１はＰ５０１Ｓを発現する様形質導入された自己Ｂ−ＬＣＬを特異的に認識するが、ＰＧＦＰ形質導入自己Ｂ−ＬＣＬは認識しないことが示された。これらアッセイの結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。
【０５０９】
実施例１０．前立腺特異抗原Ｐ７０３Ｐ内に含まれる自然処理ＣＴＬエピトープの同定
９ｍｅｒのペプチドＰ５（配列番号３３８）はＰ７０３Ｐ抗原（Ｐ２０とも呼ばれる）より得た。ｐ５ペプチドはヒトＨＬＡ−Ａ２ドナー中の免疫源であり、自然処理されたエピトープである。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｐ５ペプチドでパルス処理された単球を用いインビトロ刺激を反復することでプライムできる。これらＣＴＬはＥＬＩＳＰＯＴ（上記）およびクロム放出アッセイに於いて、ｐ５−パルス処理された標的細胞、およびＰ７０３Ｐ形質導入された標的細胞を特異的に認識する。さらに、ｐ５を使ったＨＬＡ−Ａ２Ｋｂトランスジェニックマウスの免疫化によりＨＬＡ−Ａ２ＫｂまたはＨＬＡ−Ａ２が形質導入されたＰ７０３Ｐを発現する各種標的細胞を認識するＣＴＬ細胞株が生成された。
【０５１０】
ｐ５が自然処理されたエピトープであることを示した最初の研究は、ＨＬＡ−Ａ２Ｋｂトランスジェニックマウスを用いて行われた。ＨＬＡ−Ａ２Ｋｂトランスジェニックマウスは、１４０μｇのＢ型肝炎ウイルスコアペプチド（Ｔｈペプチド）のフレンド不完全アジュバント液と共に１００μｇのｐ５ペプチドで足蹠に皮下免疫された。免疫後３週目に免疫マウスの脾臓細胞をペプチドパルス処理したＬＰＬ芽細胞でインビトロ刺激した。ＣＴＬ活性は、最初のインビトロ刺激後５日目にクロム放出アッセイにより調べた。レトロウイルスで形質導入された、コントロール抗原Ｐ７０３ＰおよびＨＬＡ−Ａ２ｂを発現する細胞を標的として用いた。ｐ５−パルス処理された標的細胞およびＰ７０３Ｐを発現する標的細胞の両方を特異的に認識するＣＴＬ細胞株が同定された。
【０５１１】
ヒトでのインビトロプライミング実験は、ｐ５ペプチドがヒトに於いて免疫原性であることを示した。樹状細胞（ＤＣ）は正常人ドナーのＰＢＭＣより、５日間１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地中で培養することで分化させた。培養後、ＤＣを１μｇ／ｍｌのｐ５ペプチドでパルス処理し、ＣＤ８＋Ｔ細胞リッチＰＢＭＣと共培養した。ＣＴＬ細胞株はｐ５−パルス処理した単球を用い週ベースで刺激された。ＣＴＬ培養開始５ないし６週後に、ｐ５−パルス処理標的細胞のＣＴＬ認識が示された。ＣＴＬはさらにＰ７０３Ｐを発現するよう形質導入されたヒト細胞を認識することが示され、ｐ５が自然処理されたエピトープであることが示された。
【０５１２】
さらにＨＬＡクラスＩＩ分子と関連して細胞表面上にてＣＤ４Ｔ細胞により認識される前立腺腫瘍特異的抗原Ｐ７０３Ｐ由来ペプチドエピトープ（ペプチド４と呼ぶ）を同定する研究を次の様にして行った。ペプチド４のアミノ酸配列は配列番号７８１に示されており、対応するｃＤＮＡ配列は配列番号７８２に示されている。
【０５１３】
１０アミノ酸づつ重複する、Ｐ７０３Ｐのカルボキシ末端に由来する１２種類の１５−ｍｅｒペプチドが標準的手順により作製された。樹状細胞（ＤＣ）はＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用い、標準的プロトコールにより正常女性ドナーのＰＢＭＣと共培養より得た。ＣＤ４Ｔ細胞は同一ドナーより、ＭＡＣＳビーズとネガティブ選別法を用いＤＣとして生成された。ＤＣは一晩、それぞれペプチド最終濃度が０．２５μｇ／ｍｌである１５−ｍｅｒのペプチドのプールでパルス処理された。パルス処理されたＤＣは洗浄され、１×１０^４細胞／ウエルの割合で９６−ウエル型Ｖ底プレートに接種され、精製ＣＤ４Ｔ細胞を１×１０^５／ウエルで加えられた。
【０５１４】
培養体には６０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２が添加され、３７℃にてインキュベーションされた。培養体は生成されたＤＣを用いて上記同様週ベースに再刺激され、上記同様抗原提示細胞でパルス処理され、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および１０ｕ／ｍｌのＩＬ−２が補給された。４回インビトロ刺激サイクルを行った後、９６細胞株（１ウエルに各細胞株に対応する）をコントロールとして用いられる乳グロビン由来の無関係なペプチドのプールを使ったプール刺激に対する特異的増殖およびサイトカイン産生について試験した。
【０５１５】
Ｐ７０３Ｐペプチドのプール＃１に反応して、特異的増殖（３Ｈ増殖アッセイにより測定した）およびサイトカイン産生（インターフェロンガンマＥＬＩＳＡアッセイにより測定された）を示した細胞株１株（１−Ｆ９と呼ぶ）が同定された。この細胞株はさらに、ペプチドプールの特異認識、プール中の個別ペプチドの特異認識、および関連拘束アリルを同定するためのＨＬＡミスマッチ分析について試験された。
【０５１６】
細胞株１−Ｆ９は、ペプチドプール＃１および同様にペプチド４（配列番号７８１）に反応し特異的に増殖し、そしてインターフェロンガンマを生産することが見出された。ペプチド４は配列番号３２７のアミノ酸１２６−１４０に対応する。ペプチド力価実験を行い、特異的ペプチドに対する細胞株１−Ｆ９の感受性について調べた。この細胞株はペプチド４と０．２５ｎｇ／ｍｌ程度の低濃度で特異的に反応することが見出され、Ｔ細胞が非常に感受性であり、従ってこのエピトープに対し高い親和性を持つと思われることを示した。
【０５１７】
Ｐ７０３Ｐ反応のＨＬＡ拘束を決定するために、Ｔ細胞の作製に使用したドナーと一部一致する抗原提示細胞（ＡＰＣ）のパネルを作った。ＡＰＣはペプチドでパルスされ、細胞株１−Ｆ９と共に増殖およびサイトカインアッセイに使用された。ＨＬＡ−ＤＲＢ０７０１およびＨＬＡ−ＤＱＢ０２アリルがドナーと一致するＡＰＣはＴ細胞にペプチドを提示することができ、Ｐ７０３Ｐ−特異的反応がこれらアリルの一つに拘束されていることが示唆された。
【０５１８】
抗体ブロッキングアッセイを使って、拘束アリルがＨＬＡ−ＤＲ０７０１またはＨＬＡ−ＤＱ０２であるか決定した。抗ＨＬＡ−ＤＲブロッキング抗体Ｌ２４３または無関係なイソ型が一致するＩｇＧ２ａを、２５０ｎｇ／ｍｌのペプチドＲＭＰＴＶＬＱＣＶＮＶＳＶＶＳ（配列番号７８１）でパルス処理したＴ細胞およびＡＰＣ培養体に加えた。標準的なインターフェロンガンマおよび増殖アッセイを行った。コントロール抗体はＴ細胞のペプチドパルス処理ＡＰＣの認識能力に影響を及ぼさなかったが、いずれのアッセイでも抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体はＴ細胞のペプチドパルス処理ＡＰＣを特異的に認識する能力を完全に遮断した。
【０５１９】
ペプチドエピトープＲＭＰＴＶＬＱＣＶＮＶＳＶＶＳ（配列番号７８１）が自然処理されるか決定するために、組換え体Ｐ７０３Ｐ蛋白質でパルス処理されたＡＰＣを認識する１−Ｆ９細胞株の能力について検討した。これら実験には複数の組換え体Ｐ７０３Ｐ源が用いられた；大腸菌由来Ｐ７０３Ｐ、酵母（Ｐｉｃｈｉａ）由来Ｐ７０３Ｐおよびバキュロウイルス由来Ｐ７０３Ｐである。使用した無関係な蛋白質コントロールは大腸菌由来のＬ３Ｅ、肺特異的抗原およびバキュロウイルス由来乳グロビンである。
【０５２０】
インターフェロンガンマＥＬＩＳＡアッセイでは、細胞株Ｉ−Ｆ９は大腸菌型Ｐ７０３Ｐおよび酵母由来組換え体Ｐ７０３Ｐの両方を効率的に認識できたが、バキュロウイルス由来Ｐ７０３Ｐは効果的には認識されなかった。その後のウエスタンブロット分析では、大腸菌および酵母Ｐ７０３Ｐ蛋白質標本は無傷であったが、バキュロウイルスＰ７０３Ｐ標本はおよそ７５％が分解していた。即ちＰ７０３Ｐ由来ペプチドＲＭＰＴＶＬＱＣＶＮＶＳＶＶＳ（配列番号７８１）はＰ７０３Ｐ由来の自然処理された得プチドエピトープであり、ＨＬＡ−ＤＲＢ−０７０１に関連してＴ細胞に提示される。
【０５２１】
さらなる研究では、１０アミノ酸づつ重複する、Ｐ７０３ＰＮ−末端由来の１２種類の１５−ｍｅｒペプチド（配列番号５２５のアミノ酸２７−１５４に相当する）が標準的手順により作製され、そして本質的には上記同様にしてＣＤ４細胞により認識されるそれらの能力が決定された。ＤＣは一晩、各ペプチドの最終濃度が０．２５μｇ／ｍｌである１５−ｍｅｒのペプチドのプールでパルス処理された。多くの個別ＣＤ４Ｔ細胞株（６５／４８０）が、Ｐ７０３Ｐペプチドプールに反応して有意な増殖およびサイトカイン放出（ＩＦＮ−ガンマ）を示したが、コントロールペプチドプールに対してはこれらを示さなかった。特異活性を示したＣＤ４Ｔ細胞株は適当なＰ７０３Ｐペプチドプールで再刺激され、各プールの個別ペプチドについて再アッセイされ、そしてＩＦＮ−γ放出アッセイおよび増殖アッセイにてペプチドプールのペプチド投与量力価がアッセイされた。
【０５２２】
１６種類の免疫源ペプチドが試験したペプチド抗原の全セットから得たＴ細胞により認識された。これらペプチドのアミノ酸配列は配列番号７９９−８１４に示されており、対応するｃＤＮＡ配列は配列番号７８３−７９８にそれぞれ示されている。幾つかの例では、Ｔ細胞株のペプチド反応性は単一ペプチドにマッピングされたが、幾つかは各プール中のなかの１より多いペプチドにマッピングされた。
【０５２３】
これらペプチドに対し合理的な親和性を持つ各ペプチドプールから、代表的な認識パターンを示したＣＤ４Ｔ細胞株を選びだし更に解析した（Ｉ−１Ａ、−６Ａ；ＩＩ−４Ｃ、−５Ｅ；ＩＩＩ−６Ｅ、ＩＶ−４Ｂ、−３Ｆ、−９Ｂ，−１０Ｆ、Ｖ−５Ｂ−４Ｄおよび−１０Ｆ）。これらＣＤ４Ｔ細胞株は適当な個別ペプチドで再刺激され、大腸菌で作製された組換え体Ｐ７０３Ｐ蛋白質の切断型（配列番号５２５のアミノ酸９６−２５４）、バキュロウイルス発現システムで作製された完全長Ｐ７０３Ｐ、および大腸菌で作製されたインフルエンザウイルスＮＳ１およびＰ７０３Ｐの融合体によりパルス処理された自己ＤＣを用い再アッセイされた。
【０５２４】
試験したＴ細胞株のうち、細胞株Ｉ−１Ａは切断型Ｐ７０３Ｐ（大腸菌）を特異的に認識したが、他のＰ７０３Ｐの組換え体型は認識しなかった。この細胞株はＴ細胞惹起に用いたペプチドも認識した。細胞株２−４Ｃは、Ｐ７０３Ｐ（大腸菌）切断型およびバキュロウイルスで作製されたＰ７０３Ｐの完全長型、ならびにペプチドを認識した。試験したＴ細胞株の残りは、ペプチドにのみ特異的であるか（ＩＩ−５Ｅ、ＩＩ−６Ｆ、ＩＶ−４Ｂ、ＩＶ−３Ｆ、ＩＶ−９Ｂ、ＩＶ−１０Ｆ、Ｖ−５ＢおよびＶ−４Ｄ）または試験したいずれの抗原にも非反応性であった（Ｖ−１０Ｆ）。
【０５２５】
これら結果は、Ｔ細胞株Ｉ−１Ａに認識されるペプチド配列ＲＰＬＬＡＮＤＬＭＬＩＫＬＤＥ（配列番号８１４、即ち配列番号５２５のアミノ酸１１０−１２４に相当）およびＴ細胞株ＩＩ−４Ｃにより認識されるペプチド配列ＳＶＳＥＳＤＴＩＲＳＩＳＩＡＳ（配列番号８１１；配列番号５２５のアミノ酸１２５−１３９に相当）およびＩＳＩＡＳＱＣＰＴＡＧＮＳＣＬ（配列番号８１０；配列番号５２５のアミノ酸１３５−１４９に相当）がＰ７０３蛋白質の自然処理エピトープであることを示している。
【０５２６】
更なる研究において、１０アミノ酸によりオーバーラップし、そしてＰ７０３Ｐ（配列番号：５２５）のアミノ酸４７〜２５４を含む領域に由来する１５−マーペプチド４５個を、標準的手法により生じさせ、そしてＣＤ４細胞により認識されるそれらの能力を実質的に上記のようにして決定した。以前の実験において使用されたのとは異なるＨＬＡ　ＤＲ及びＤＱ対立遺伝子を有する提供者のＰＢＭＣからＤＣが調製された。ＤＣをペプチドのプールにより一晩パルスした。この場合、各ペプチドの最終濃度は０．２５μｇ／ｍＬであり、各プールは１０ペプチドを含有した。
【０５２７】
刺激性ペプチドプールに応答して特異的増殖及びサイトカイン生産（γ−インターフェロンＥＬＩＳＡアッセイにより測定された）を示す１２の細胞系を同定した。これらの細胞系は更に、ペプチドプールの特異的認識、プール中の個々のペプチドの特異的認識、及び組換えＰ７０３Ｐタンパク質の特異的認識について試験された。細胞系３Ａ５Ｈ及び３Ａ９Ｈが、組換えタンパク質及び一つの個別のペプチド並びにペプチドプールに応答して、特異的に増殖し、そしてγ−インターフェロンを生産した。
【０５２８】
特定のペプチドにより負荷された標的に対する再刺激の後、３Ａ９Ｈのみが全長Ｐ７０３Ｐを発現するアデノウイルスに感染した線維芽細胞の細胞溶解物に暴露された標的に特異的に応答した。これらの結果が示すところによれば、細胞系３Ａ９Ｈは哺乳類細胞において合成されたタンパク質に由来する抗原ペプチドに応答することが出来る。特異的ＣＤ４細胞系がそれに対して応答したペプチドは、Ｐ７０３Ｐ（配列番号：９４３）のアミノ酸１５５−１７０に対応する。このペプチドのＤＮＡ配列を配列番号：９４２に示す。
【０５２９】
実施例１１．前立腺に於ける乳癌由来抗原の発現
示差表示法による乳癌からの抗原Ｂ３０５Ｄの単離は、１９９６年８月２０日出願の米国特許出願第０８／７００，０１４号に記載されている。本抗原の複数の異なるスプライス型が単離されている。これらスプライス型について決定されたｃＤＮＡ配列は、配列番号３６６−３７５に示されており、配列番号２９２、２９８および３０１−３０３の配列に対応する推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号２９９−３０６に示されている。
【０５３０】
さらなる研究で、位置８８４にグアニンの付加残基を含み、オープンリーディングフレーム内にフレームシフトを生じせしめることが分かっている配列番号３６６のｃＤＮＡ配列のスプライス変異体（配列番号５３０）が単離された。このＯＦＲについて決定されたＤＮＡ配列は配列番号５３１に示されている。このフレームシフトにより、Ｂ３０５Ｄの他イソ型に共通したＣ−末端ドメインを含むが、Ｎ−末端領域が異なる蛋白質配列（配列番号５３２に示されている）が生じる。
【０５３１】
各種腫瘍および正常組織中のＢ３０５Ｄの発現レベルは、リアルタイムＰＣＲおよびノーザン分析により検討された。結果は、Ｂ３０５Ｄが乳癌、前立腺癌、正常前立腺および正常精巣で高く発現されており、検討したその他組織（結腸癌、肺癌、卵巣癌および正常骨髄、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、皮膚、小腸、胃）ではその発現は低いかまたは検出されないことを示した。前立腺腫瘍パネルについてリアルタイムＰＣＲを用いたところ、前立腺腫瘍でのＢ３０５Ｄの発現はグレアソン等級の上昇に伴って増加することが示され、前立腺癌が進行するとＢ３０５Ｄの発現が増加することが示された。
【０５３２】
実施例１２．全遺伝子プライミングおよび前立腺特異抗原Ｐ５０１Ｓによる刺激を用いたインビトロでのヒトＣＴＬの生成
Ｐ５０１Ｓワクシニア感染ＤＣによるインビトロ全遺伝子プライミング（例えばＹｅｅら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５７（９）：４０７９−８６，１９９６参照）を利用して、上記インターフェロンγＥＬＩＳＰＯＴ分析により決定した時に、Ｐ５０１Ｓ（Ｌ１−１２としても知られる）で形質導入された自己繊維芽細胞を特異的に認識するヒトＣＴＬ細胞株が誘導された。Ｐ５０１Ｓで形質導入されたＨＬＡ−ミスマッチＢ−ＬＣＬ細胞株のパネルを用いて、これらＣＴＬ細胞株がＨＬＡＢクラスＩアリルに拘束されると思われることが示された。
【０５３３】
具体的には、樹状細胞（ＤＣ）は正常人ドナーのＰＢＭＣに由来する単球培養体より、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地中に５日間増殖させることで分化させた。培養後ＤＣ細胞を一晩感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）５の組換え体Ｐ５０１Ｓワクシニアウイルスで感染させ、３μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドを加え一晩成熟させた。ウイルスをＵＶ照射により不活性化された。ＣＤ８＋Ｔ細胞は磁性ビーズシステムを用い単離され、標準的培養技術を用いて初代培養が開始された。
【０５３４】
培養体をレトロウイルスによりＰ５０１ＳおよびＣＤ８０が形質導入された自己初代繊維芽細胞を使って７−１０日ごとに再刺激した。４回の再刺激サイクル後、自己Ｐ５０１ＳおよびＣＤ８０−形質導入された自己の繊維芽細胞で刺激したとき特異的にインターフェロンガンマを生ずるＣＤ８＋Ｔ細胞株を同定した。反応の拘束アリルを基底するために、Ｐ５０１Ｓで形質導入されたＨＬＡミスマッチＢ−ＬＣＬ細胞株のパネルが作られた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりインターフェロン−γを測定し、Ｐ５０１Ｓ特異反応がＨＬＡＢアリルにより拘束されるらしいことが示された。これらアッセイの結果は、Ｐ５０１Ｓに対するＣＤ８＋ＣＴＬが惹起可能なことを示している。
【０５３５】
認識されるエピトープを同定するために、Ｐ５０１ＳをコードするｃＤＮＡを様々な制限消化して断片にし、レトロウイルス発現ベクターであるｐＢＩＢ−ＫＳにサブクローニングした。レトロウイルス上清は、ヘルパーパッケージング細胞株Ｐｈｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏのトランスフェクションにより作製された。次に上清を用い、ＣＴＬスクリーニング用にＪｕｒｋａｔ／Ａ２Ｋｂ細胞を形質導入した。ＣＴＬはＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、Ｐ５０１Ｓ断片の「ライブラリー」で形質導入されたこれらＡ２Ｋｂ標的についてスクリーニングされた。
【０５３６】
最初の陽性断片Ｐ５０１Ｓ／Ｈ３およびＰ５０１Ｓ／Ｆ２が配列決定され、それらがそれぞれ配列番号１１３のアミノ酸１０６−５５３およびアミノ酸１３６−５４７をコードしていることが見出された。配列番号１１３のアミノ酸１０６−３５１をコードする様にＨ３の切断が行われたが、これはＣＴＬを刺激できなきなかったことからエピトープはアミノ酸残基３５１−５４７にあるとされた。アミノ酸１−４７２（断片Ａ）およびアミノ酸１−３５１（断片Ｂ）をコードする別の断片も作られた。断片Ｂだけでなく、断片ＡもまたＣＴＬを刺激したことから、エピトープはアミノ酸残基３５１−４７２にあることが判明した。
【０５３７】
この領域を表す重複する２０−ｍｅｒおよび１８−ｍｅｒのペプチドについて、Ｊｕｒｋａｔ／Ａ２Ｋｂ細胞をパルス処理しＩＦＮ−ガンマアッセイでＣＴＬについて試験した。ペプチドＰ５０１Ｓ−３６９（２０）とＰ５０１Ｓ−３６９（１８）のみがＣＴＬを促進した。この領域を表す９−ｍｅｒおよび１０−ｍｅｒのペプチドを合成して、同様に試験した。ペプチドＰ５０１Ｓ−３７０（配列番号５３９）が強い反応を示す最小の９−ｍｅｒであった。ペプチドＰ５０１Ｓ−３７６（配列番号５４０）も弱い反応を示したことから、これが交叉反応エピトープでることが示唆された。
【０５３８】
続く研究では、Ｐ５０１Ｓで形質導入された初代ヒトＢ細胞の、ＭＨＣクラスＩ拘束、Ｐ５０１Ｓ特異的、自己ＣＤ８Ｔ細胞をプライムする能力が検討された。初代Ｂ細胞はＣＤ４０リガンドおよびＩＬ−４存在下に培養し、組換え体Ｐ５０１ＳのベクターｐＢＩＢで高頻度に形質導入され、そしてブラストシジン−Ｓで選別されることによりホモ接合体ＨＬＡ−Ａ２ドナーのＰＢＭＣより得た。インビトロプライミングを行う場合には、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を自己由来ＣＤ４０リガンド＋１Ｌ−４で誘導したＰ５０１Ｓ−形質導入Ｂ細胞と９６ウエル微量培養形式で共培養した。
【０５３９】
これらＣＴＬ微量培養体はＰ５０１Ｓ−形質導入Ｂ細胞で再刺激されてから、特異性についてアッセイされた。この最初のスクリーニングの後、バックグランドより高い有意なシグナルを示した微量培養体を自己由来ＥＢＶ−形質導入Ｂ細胞（ＢＬＣＬ）にクローン化し、さらにＰ５０１Ｓで形質導入した。検出にはＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴを用い、これらＣＤ８Ｔ細胞クローンの幾つかがＰ５０１Ｓに対し特異的であることが見出され、ＢＬＣＬ／Ｐ５０１Ｓには反応するがコントロール抗原で形質導入されたＢＬＣＬには反応しないことが示された。
【０５４０】
さらに抗Ｐ５０１ＳＣＤ８Ｔ細胞特異性はＨＬＡ−Ａ２拘束性であることが示された。第１に抗ＨＬＡ−Ａ−Ａ、Ｂ、Ｃモノクローナル抗体（Ｗ６．３２）、抗−ＨＬＡ−Ｂ、Ｃモノクローナル抗体（Ｂ１．２３．２）およびコントロールモノクローナル抗体を用いた抗体遮断実験は、抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗体のみがＰ５０１Ｓ発現自己由来ＢＬＣＬの認識を遮断することを示した。第２に、抗Ｐ５０１ＳＣＴＬはまたＨＬＡ−Ａ２が一致した、Ｐ５０１Ｓで形質導入された異種ＢＬＣＬを認識したが、対応するＥＧＦＰで形質導入されたコントロールＢＬＣＬは認識しなかった。
【０５４１】
自然に処理されたＰ５０１ＳのＣＤ８、クラスＩ拘束ペプチドエピトープは次の様にして同定された。樹状細胞（ＤＣ）はパーコル（Ｐｅｒｃｏｌ）勾配で単離された後、差別的接着にかけられてから１％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地存在下に５日間培養された。培養後、２μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドを加えて更に２４時間ＤＣを培養した。ＣＤ８細胞はＰＢＭＣよりＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６＋集団を磁性ビーズを使ってサブトラクションすることで濃縮された。
【０５４２】
ウエル当たり１０，０００個のＰ５０１Ｓ発現ＤＣと１００，０００個のＣＤ８＋細胞を含むプライミング培養体を、１０％ヒト血清、５ｎｇ／ｍｌＩＬ−１２および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−６を含むＲＰＭＩの入った９６ウエル型Ｖ底プレートに準備した。培養体は７日ごとに、レトロウイルスによりＰ５０１ＳとＣＤ８０を発現するよう形質導入された自己由来繊維芽細胞で刺激され、４８−７２時間ＩＮＦ−ガンマにより処理されてＭＨＣクラスＩの発現をアップレギュレーションした。刺激時および刺激後２と５日目に１０ｕ／ｍｌのＩＬ−２が加えられた。
【０５４３】
刺激サイクル４回後、γ−ＩＦＮＥｌｉｓｐｏｔアッセイに於いて、ＩＦＮガンマ処理された、Ｐ５０１Ｓ／ＣＤ８０を発現する自己由来繊維芽細胞に反応しＩＦＮ−ガンマを産生するが、ＩＦＮ−ガンマ−処理したＰ７０３Ｐ／ＣＤ８０発現自己由来繊維芽細胞との反応ではこれを産生しない１株のＰ５０１Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株（２Ａ２と呼ぶ）が同定された。細胞株２Ａ２は７５，０００ＰＢＭＣ／ウエル、１０，０００Ｂ−ＬＣＬ／ウエル、３０ｎｇ／ｍｌＯＫＴ３および５０ｕ／ｍｌＩＬ−２存在下に０．５細胞／ウエルまたは２細胞／ウエルの割合で９６ウエルプレートにクローン化された。形質導入繊維芽細胞に対する反応に強いＰ５０１Ｓ特異性を示した１２クローンが単離された。
【０５４４】
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析を、それぞれＰｅｒｃＰ、ＦＩＴＣおよびＰＥで標識されたＣＤ３−、ＣＤ４＋およびＣＤ８−特異的抗体を行いてＰ５０１Ｓ特異クローンについて行った。プライミング培養体中での富ＣＤ８Ｔ細胞の使用に一致し、Ｐ５４０１Ｓ−特異的クローンがＣＤ３＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４−であることが決定された。
【０５４５】
Ｐ５０１Ｓ特異的ＣＴＬにより認識される関連Ｐ５０１Ｓエピトープを同定するために、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸配列の大部分をカバーする１８−２０ｍｅｒまたは３０ｍｅｒペプチドのプールを自己由来Ｂ−ＬＣＬに負荷し、γ−ＩＦＮＥｌｉｓｐｏｔアッセイにより、４Ｅ５および４Ｅ７と呼ばれる２種類のＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬクローンを刺激する能力について試験した。Ｐ５０１Ｓ（配列番号１１３）のアミノ酸４１１−４８６をカバーする５種類の１８−２０ｍｅｒのペプチドからなる１つのプールは、両Ｐ５０１Ｓ−特異的クローンにより認識されることが見出た。
【０５４６】
これらクローンに認識される特異的１８−２０ｍｅｒペプチドを同定するために、２種類のＰ５０１Ｓ−特異的ＣＴＬクローン、４Ｅ５および４Ｅ７を刺激する能力について、陽性プールを構成する各１８−２０ｍｅｒペプチドをγ−ＩＦＮＥｌｉｓｐｏｔアッセイで個別に試験した。４Ｅ５および４Ｅ７はいずれもＰ５０１Ｓのアミノ酸４５３−４７２に広がる１つの２０ｍｅｒ−ペプチド（配列番号８５３；配列番号８５４に示されたｃＤＮＡ配列）を特異的に認識した。
【０５４７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される最小エピトープは多くの場合９または１０−ｍｅｒペプチド配列であることから、配列番号８５３の全配列をカバーする、１アミノ酸づつ異なる１０−ｍｅｒペプチドを合成した。これら１０−ｍｅｒペプチドのそれぞれについて、２種類のＰ５０１Ｓ−特異クローン（１Ｄ５および１Ｅ１２と呼ぶ）を刺激する能力を試験した。Ｐ５０１Ｓ−特異クローンを特異的に刺激する１個の１０−ｍｅｒペプチド（配列番号８５５；配列番号８５６に示したｃＤＮＡ配列）。このエピトープはＰ５０１Ｓのアミン酸４６３−４７２をカバーしている。この配列は自然の処理が可能であり、そして正常ＰＢＭＣに於いてＣＴＬ反応が同定できるＰ５０１Ｓ由来の最小の１０−ｍｅｒエピトープを規定している。即ち、このエピトープが前立腺癌のワクチン成分として、および治療薬および／または診断薬としての使用に適した候補である。
【０５４８】
配列番号８５５のＰ５０１Ｓ−由来配列に関するクラスＩ拘束要素を同定するために、ＨＬＡ遮断分析およびミスマッチ分析を行った。γ−ＩＦＮＥｌｉｓｐｏｔアッセイでは、Ｐ５０１Ｓ形質導入自己由来繊維芽細胞に対するクローン４Ａ７および４Ｅ５の特異反応は２５ｕｇ／ｍｌのＷ６／３２（汎クラスＩ遮断抗体）およびＢ１．２３．２（ＨＬＡ−Ｂ／Ｃ遮断抗体）との前インキュベーションにより遮断された。これらの結果は、配列番号８５５特異的反応がＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃアリルにより拘束されていることを示す。
【０５４９】
ＨＬＡミスマッチ分析では、ＨＬＡＢ５１が共通である自己由来Ｂ−ＬＣＬ（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ｂ８、Ｂ５１、Ｃｗ１、Ｃｗ７）および異種Ｂ−ＬＣＬ（ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、Ｂ１８、Ｂ５１、Ｃｗ５、Ｃｗ１４）を１時間、２０ｕｇ／ｍｌの配列番号８５５のペプチドでパルスし、洗浄後γ−ＩＦＮＥｌｉｓｐｏｔアッセイを用いクローン４Ａ７および４Ｅ５刺激能について試験された。Ｂ１．２３．２（ＨＬＡ−Ｂ／Ｃ遮断抗体）を使った抗体遮断アッセイも行われた。配列番号８５５−特異反応は自己由来（Ｄ３２６）および異種（Ｄ１０７）Ｂ−ＬＣＬの両方を使って検出され、さらにこの反応は２５ｕｇ／ｍｌのＢ１．２３．２ＨＬＡ−Ｂ／Ｃ遮断抗体との前インキュベーションにより遮断された。これらの結果は、配列番号８５５のペプチドに対するＰ５０１Ｓ特異反応はＨＬＡ−Ｂ５１クラスＩアリルに拘束されることを示している。Ｄ３３２６からのＨＬＡ−Ｂ５１アリルの分子クローニングおよび配列分析は、Ｄ３２６のＨＬＡ−Ｂ５１サブタイプがＨＬＡ−Ｂ５１０１１であることを示している。
【０５５０】
配列番号８５５の１０−ｍｅｒのＰ５０１Ｓ由来エピトープに基づき、配列番号８５７および８５８の配列を持った２種類の９−ｍｅｒを合成し、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて細胞株２Ａ２由来の２種類のＰ５０１Ｓ−特異的ＣＴＬクローンに対する刺激能について試験した。配列番号８５５の１０−ｍｅｒペプチドならびに配列番号８５８の９−ｍｅｒペプチドはＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬを刺激して、ＩＦＮ−ガンマを産生できたが、配列番号８５７の９−ｍｅｒペプチドは刺激できなかった。これらの結果は、配列番号８５８のペプチドがＰ５０１Ｓ−特異的ＣＴＬにより認識される９−ｍｅｒのＰ５０１Ｓ由来エピトープであることを示している。配列番号８５８のエピトープをコードするＤＮＡ配列は配列番号８５９にしめされている。
【０５５１】
配列番号８５５および８５８特異反応のＰ５０１Ｓ由来ペプチドに関するクラスＩ拘束アリルを同定するために、ＨＬＡＢおよびＣアリルのそれぞれをインビトロプライミング実験で用いたドナーからクローン化した。配列分析は、関連するアリルがＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｃｗ０１およびＨＬＡ−Ｃｗ０７であることを示した。これらアリルのそれぞれを発現ベクター内にサブクローニングし、Ｐ５０１Ｓ遺伝子と共にＢＡ−１３細胞内にコトランスフェクションした。次にトランスフェクションされたＶＡ−１３細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを持ちいＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬの特異的刺激能力について試験した。
【０５５２】
Ｐ５０１ＳおよびＨＬＡ−Ｂ５１がトランスフェクションされたＶＡ−１３細胞はＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬを刺激して、γ−ＩＦＮを分泌させることができた。ＨＬＡ−Ｂ５１のみ、またはＰ５０１Ｓ＋その他ＨＬＡアリルがトランスフェクションされたＶＡ−１３細胞は、Ｐ５０１Ｓ特異的ＣＴＬを刺激できなかった。これらの結果は、Ｐ５０１Ｓ−特異的反応に関する拘束アリルがＨＬＡＢ５１アリルであることを示している。配列分析は、関連する拘束アリルのサブタイプがＨＬＡ−Ｂ５１０１１であることを示した。
【０５５３】
Ｐ５０１Ｓ−特異的ＣＴＬがＰ５０１Ｓを発現している前立腺腫瘍細胞を認識できるかを決定するために、Ｐ５０１Ｓ陽性細胞株ＬｎＣＡＰおよびＣＲＬ２４２２（共にＰ５０１ＳｍＲＮＡおよび蛋白質を“中程度”の量発現している）、ならびにＰＣ−３（Ｐ５０１ＳｍＲＮＡと蛋白質を低量発現している）、さらにＰ５０１Ｓ−陰性細胞株ＤＵ−１４５を、レトロウイルスを使ってＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬを生成するのに使用したドナーよりクローン化されたＨＬＡ−Ｂ５１０１１アリルで形質導入した。ＨＬＡ−Ｂ５１０１１−またはＥＧＦＯ−形質導入され、選択された腫瘍細胞をガンマインターフェロンおよびアンドロゲン（それぞれ刺激機能およびＰ５０１Ｓをアップレギュレーションする）で処理し、Ｐ５０１Ｓ−特異的ＣＴＬクローンの４Ｅ５および４Ｅ７と共にガンマインターフェロンＥｌｉｓｐｏｔアッセイに用いた。
【０５５４】
４Ｅ５および４Ｅ７は共にＨＬＡ−Ｂ５１０１１アリルが形質導入されたＬｎＣＡＰおよびＣＲＬ２４２２細胞を効率的かつ特異的に認識したが、ＥＧＦＰが形質導入された同一細胞株は認識しなかった。さらに両ＣＴＬクローンはＨＬＡ−Ｂ５１０１１が形質導入されたＰＣ−３細胞を特異的に認識したが、Ｐ５０１Ｓ−陰性腫瘍細胞株であるＤＵ−１４５は認識しなかった。ガンマインターフェロンまたはアンドロゲンによる処理はＣＴＬの腫瘍細胞認識能を高めなかった。これらの結果は、インビトロにて全遺伝子をプライミングして作製されたＰ５０１Ｓ−特異的ＣＴＬがＰ５０１Ｓを発現する前立腺腫瘍細胞株を特異的かつ効率的に認識することを示している。
【０５５５】
Ｐ５０１Ｓの自然処理されたＣＤ４エピトープは次の様にして同定された。
Ｐ５０１Ｓに特異的なＣＤ４細胞を上記同様に調製した。Ｐ５０１Ｓ遺伝子のアミノ末端部分の約５０％に広がる（配列番号１１３のアミノ酸１−３２５）１６種類の重複ペプチドのシリーズを合成した。プライミングに備え、ペプチドを４種類のペプチドプールにまとめ、ＴＮＦ−アルファと共に４μｇ／ｍｌで樹状細胞（ＤＣ）を２４時間パルスした。つぎにＤＣを洗浄し、ネガティブ選別したＣＤ４＋Ｔ細胞を９６ウエルＵ底プレート中に混合した。
【０５５６】
培養体を新しいＤＣ上で、ペプチドプールを加えて毎週刺激した。合計４回刺激サイクルを行った後に、細胞をさらに１週間休息させてから、γ−ＩＦＮＥＬＩＳＡおよび増殖アッセイを用いて、ペプチドプールを使ってパルスされたＡＰＣに対する特異性を試験した。これらアッセイでは、４ｕｇ／ｍｌの関連ペプチドプールまたはｕｇ／ｍｌの無関係ペプチドの何れかが負荷された接着単球がＡＰＣとして用いられた。次に特異的サイトカイン分泌または増殖を示したＴ細胞株について、プール中に存在する個別のペプチドについての認識を試験した。プールＡおよびＢより、これらプール由来の個別ペプチドを認識するＴ細胞株が同定できた。
【０５５７】
プールＡからは、細胞株ＡＤ９およびＡＥ１０がペプチド１（配列番号８６２）を特異的に認識し、細胞株ＡＦ５がペプチド３９（配列番号８６１）を認識した。プールＢでは、ペプチド５８（配列番号８６０）を認識する細胞株ＢＣ６が同定できた。これら細胞株のそれぞれが特異ペプチドにより刺激され、力価アッセイおよびＨＥＫ２９３細胞にＰ５０１Ｓまたは無関係抗原を発現するアデノウイルスを感染させ生成した細胞溶解物を用いて、ペプチドの特異認識について試験された。
【０５５８】
これらアッセイでは、ＡＰＣ接着単球は１０、１または０．１μｇ／ｍｌの個別Ｐ５０１Ｓペプチドでパルス処理され、そしてＤＣは一晩１：５に希釈されたアデノウイルス感染細胞溶解物でパルス処理された。細胞株ＡＤ９、ＡＥ１０およびＡＦ５は０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でも関連するＰ５０１Ｓ由来ペプチドを有意に認識した。さらに細胞株ＡＤ９は、アデノウイルスＰ５０１Ｓ感染細胞由来の溶解物に対しても有意（８．１倍の刺激指数）特異活性を示した。これらの結果は、抗親和性ＣＤ４Ｔ細胞株がＰ５０１Ｓ由来エピトープに対し生成できること、および少なくとも配列番号８６２のＰ５０１Ｓ由来配列に特異的なこれらＴ細胞のサブセットが、ヒト細胞により自然に処理されるエピトープに対し特異的であるこをと示している。配列番号８６０−８６２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号８６３−８６５に示されている。
【０５５９】
ＡＤ９のＰ５０１Ｓ特異的活性をさらに特性分析するために、この細胞株を抗ＣＤ３を使ってクローン化した。Ｐ５０１Ｓ−１ペプチド（配列番号８６２）に特異的な１Ａ１、１Ａ９および１Ｆ５と呼ばれる３種類のクローンが同定された。Ｐ５０１Ｓ−１特異反応に関するＨＬＡ拘束アリルを決定するために、これらクローンそれぞれについて増殖およびガンマインターフェロンアッセイを利用したクラスＩＩ抗体遮断アッセイおよびＨＬＡミスマッチアッセイを使い試験した。
【０５６０】
抗体遮断アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを利用したガンマインターフェロン産生測定では、３クローン全てのペプチドパルスＡＰＣ認識能力が、汎クラスＩＩ遮断抗体またはＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体との共インキュベーションにより特異的に遮断されたが、ＨＬＡ−ＤＱまたは無関係な抗体によっては遮断されなかった。同一細胞を用い同時に実施された増殖アッセイもこの結果を確認した。これらデータは、クローンのＰ５０１Ｓ特異反応がＨＬＡ−ＤＲアリルにより拘束されていることを示す。別の研究はＰ５０１Ｓ−特異反応に関する拘束アリルがＨＬＡ−ＤＲＢ１５０１であることを示した。
【０５６１】
実施例１３．マイクロアレイ分析による前立腺特異的抗原の同定
この実施例では、特定の前立腺特異的ポリペプチド類の、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーからの分離について述べる。
上記のヒト前立腺腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、マイクロアレイ分析を利用し選抜して、前立腺腫瘍および／または正常前立腺の組織において、前立腺以外の正常組織（精巣を除く）と比較して少なくとも３倍の過剰発現を示すクローンを同定した。３７２のクローンを同定し、そして３１９のクローンの配列決定に成功した。
【０５６２】
表Ｉはこれらクローンの要約を示し、これらのクローンは配列番号：３８５〜４００に示してある。これら配列のうち、配列番号：３８６，３８９，３９０および３９２は新規な遺伝子であり、そして配列番号：３９３と３９６は、以前に同定された配列である。その外の配列（配列番号：３８５，３８７，３８８，３９１，３９４，３９５および３９７〜４００）は表Ｉに示すように既知の配列である。
【０５６３】
【表２】

【０５６４】
ＣＧＩ−８２は、前立腺組織内で、試験を行った他の正常組織と比べて４．０６倍の過剰発現を示した。ＣＧＩ−８２は、前立腺腫瘍の４３％および正常前立腺の２５％で過剰発現を行い、試験を行った他の正常組織には検出されなかった。Ｌ−イジトール−２−デヒドロゲナーゼは、前立腺組織中で、試験を行った他の正常組織と比べて４．９４倍の過剰発現を示した。Ｌ−イジトール−２−デヒドロゲナーゼは、前立腺腫瘍の９０％で過剰発現し、正常前立腺の１００％で過剰発現し、試験を行った他の正常組織中には検出されなかった。Ｅｔｓ転写因子ＰＤＥＦは前立腺組織内で、試験を行った他の正常組織と比べて５．５５倍の過剰発現を示した。
【０５６５】
Ｅｔｓ転写因子ＰＤＥＰは、前立腺腫瘍の４７％で過剰発現し、正常前立腺の２５％で過剰発現し、そして試験を行った他の正常組織中には検出されなかった。ｈＴＧＲ１は、前立腺組織中で、試験を行った他の正常組織と比べ９．１１倍の過剰発現を示した。ｈＴＧＲ１は、前立腺腫瘍の６３％で過剰発現し、正常前立腺を含む試験を行った正常組織には検出されなかった。ＫＩＡＡ０２９５は、前立腺組織中で、他の被検正常組織と比べて５．５９倍の過剰発現を示した。ＫＩＡＡ０２９５は、前立腺腫瘍の４７％で過剰発現し、正常前立腺組織を含む被検正常組織中では発現が低く検出できなかった。前立腺酸性ホスファターゼは、前立腺組織中で、他の被検正常組織と比べて９．１４倍の過剰発現を示した。
【０５６６】
前立腺酸性ホスファターゼは、前立腺腫瘍の６７％で過剰発現し、正常前立腺の５０％で過剰発現し、そして他の被検正常組織中には検出されなかった。トランスグルタミナーゼは、前立腺組織中で、他の被検正常組織と比べて１４．８４倍の過剰発現を示した。トランスグルタミナーゼは、前立腺腫瘍の３０％の過剰発現し、正常前立腺の５０％で過剰発現し、そして他の被検正常組織中には検出されなかった。高密度リポタンパク質結合タンパク質（ＨＤＬＢＰ）は、前立腺組織内で、他の被正常組織と比べて２８．０６倍の過剰発現を示した。
【０５６７】
ＨＤＬＢＰは、前立腺腫瘍の９７％で過剰発現し、正常前立腺の７５％で過剰発現し、そして、他のすべての被検正常細胞には検出できなかった。ＣＧＩ−６９は、前立腺組織内で、他の被検正常組織と比べて３．５６倍の過剰発現を示した。ＣＧＩ−６９は低存在度（ｌｏｗａｂｕｎｄａｎｔ）遺伝子であり、前立腺腫瘍の９０％及び正常前立腺組織の７５％に検出される。この遺伝子の正常組織内での発現は非常に低かった。ＫＩＡＡ０１２２は、前立腺組織内で、他の被検正常組織に比べて４．２４倍の過剰発現を示した。ＫＩＡＡ０１２２は、前立腺腫瘍の５７％で過剰発現し、そして正常前立腺組織を含むすべての正常組織中には検出できなかった。
【０５６８】
１９１４２．２ｂａｎｇｕｒは、前立腺組織内で、他の被検正常組織と比べて２３．２５倍の過剰発現を示した。１９１４２．２ｂａｎｇｕｒは、前立腺腫瘍の９７％および正常前立腺の１００％で過剰発現した。１９１４２．２ｂａｎｇｕｒは、他の被検正常組織では検出できなかった。５５６６．１Ｗａｎｇは、前立腺組織内で、他の被検正常組織と比べて３．３１倍の過剰発現を示した。５５６６．１Ｗａｎｇは、前立腺腫瘍の９７％及び正常前立腺の７５％で過剰発現し、そして正常な骨髄、膵臓および活性化ＰＢＭＣ内でも過剰発現した。新規のクローン２３３７９（Ｐ５５３Ｓとも呼称する）は前立腺組織中で、他の被検正常組織と比べて、４．８６倍の過剰発現を示した。
【０５６９】
クローン２３３７９は、前立腺腫瘍の９７％及び正常前立腺の７５％で検出できたが、他のすべての被検正常組織内では検出できない。新規のクローン２３３９９は、前立腺組織内で、他の被検正常組織と比べて４．０９倍の過剰発現を示した。クローン２３３９９は、前立腺腫瘍の２７％で過剰発現し、正常な前立腺組織を含むすべての被検正常組織内に検出できなかった。新規なクローン２３３２０は、前立腺組織内で他の被検正常組織と比べて３．１５倍の過剰発現を示した。クローン２３３２０は、すべての前立腺腫瘍におよび正常前立腺組織の５０％に検出できた。またクローン２３３２０は、正常な結腸および気管内でも発現した。他の正常細胞は、この遺伝子を、高レベルでは発現しない。
【０５７０】
標準の方法を利用して続いて行ったＰ５５３Ｓに関する完全長クローン化試験によって、このクローンが、不完全なスプライスされた形態のＰ５０１Ｓであることが明らかになった。Ｐ５５３Ｓの四つのスプライス変異体の決定されたｃＤＮＡ配列は、配列番号：７０２〜７０５に示してある。配列番号：７０５がコードするアミノ酸配列は、配列番号：７０６に示してある。配列番号：７０２のｃＤＮＡ配列は、二つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有していることが分かった。これら二つのＯＲＦがコードするアミノ配列は配列番号：７０７と７０８に示してある。
【０５７１】
実施例１４．電子サブトラクション法（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓｕｂｔｒａｃｔｉｉｏｎ）による前立腺特異的抗原の同定
この実施例では、電子サブトラクション法を使用して行う前立腺特異的抗原の同定について説明する。
ＧｅｎＢａｎｋのヒトＥＳＴデータベース中の潜在前立腺特異的遺伝子（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅ）を、電子サブトラクション法（Ｖａｓｍａｔｉｚｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：３００−３０４，１９９８に記載されているのと類似の方法）で同定した。各種の前立腺ライブラリーから誘導したＥＳＴクローン（４３，４８２）の配列を、ＧｅｎＢａｎｋのパブリックヒトＥＳＴデータベースから得た。各前立腺ＥＳＴ配列を、ヒトＥＳＴデータベースに対するＢＬＡＳＴＮ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｒｍａｔｉｏｎ）サーチの際の質問配列（ｑｕｅｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅ）として使用した。
【０５７２】
同一とみなされたすべてのマッチ（ｍａｔｃｈ）（マッチング配列の長さ＞１００塩基対、この領域の同一マッチの密度＞７０％）を、一つのクラスターにまとめた（並べた）。２００以上のＥＳＴを含有するクラスターは、恐らく、反復要素またはリポソームタンパク質の遺伝子のような高度に発現される遺伝子であるから廃棄した。二つ以上のクラスターがコモンクラスターを共有する場合、それらのクラスターをスーパークラスター」にまとめて、４，３４５の前立腺スーパークラスターを得た。
【０５７３】
ＧｅｎＢａｎｋｒｅｌｅａｓｅ中の４７９のヒトｃＤＮＡライブラリーの記録を、ダウンロードして、これらｃＤＮＡライブラリーの記録のデータベースをつくった。これら４７９のｃＤＮＡライブラリーを、次の三つのグループにまとめた。すなわち、プラスグループ（発現が望ましい正常な前立腺と前立腺腫瘍のライブラリーおよび乳房（ｂｒｅａｓｔ）細胞系ライブラリー）、マイナスグループ（発現が望ましくない他の正常成人の組織からのライブラリー）、ならびにその他のグループ（発現が関連性がない（ｉｒｒｅｌｅｖａｘｔ）と考えられる、胎児組織、乳児組織、女性にのみ見られる組織、前立腺以外の腫瘍および前立腺細胞系以外の細胞系からのライブラリー）である。これらライブラリーのグループの要約を表ＩＩに示す。
【０５７４】
【表３】

【０５７５】
各スーパークラスターを、そのスーパークラスター内のＥＳＴについて分析した。各ＥＳＴクローンの組織源に注目し利用してスーパークラスターを次の四グループに分類した。すなわちタイプ１−前記プラスグループのライブラリーのみに見られるＥＳＴクローンであって、前記マイナスまたはその他のグループのライブラリーには発現が検出されないＥＳＴクローン；タイプ２−前記プラスおよびその他のグループのライブラリーのみから誘導されるＥＳＴクローンであって、前記マイナスグループでは発現が検出されないＥＳＴクローン；タイプ３−前記プラス、マイナスおよびその他のグループのライブラリーから誘導されるＥＳＴクローンであって、前記プラスグループから誘導されるＥＳＴの数が前記マイナスまたはその他のグループより高いＥＳＴクローン；ならびにタイプ４−前記プラス、マイナスおよびその他のグループのライブラリーから誘導されるＥＳＴクローンであって、前記プラスグループから誘導される数が、前記マイナスグループから誘導される数より高いＥＳＴクローンである。この分析によって、４，３４５の乳房のクラスターが同定された（表ＩＩＩ参照）。これらのクラスターから、３，１７２のＥＳＴクローンを、ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．に発注し、そして９６ウェルプレートの冷凍グリセリンストックとして受け取った。
【０５７６】
【表４】

【０５７７】
ＥＳＴクローンの挿入断片を、Ｓｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ分析用のアミノ連結ＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。２以上のＰＣＲ産物を特定のクローンについて得たとき、そのＰＣＲ産物は発現分析に使用しなかった。電子サブトラクション法由来の合計２，５２８のクローンを、マイクロアレイ分析で分析して、腫瘍組織ｍＲＮＡ対正常組織ｍＲＮＡのレベルが高い電子サブトラクションのブレストクローンを同定した。
【０５７８】
このようなスクリーンは、Ｓｙｎｔｅｎｉ（米国カリフォルニア州パロ・アルト）のマイクロアレイを使用し、生産者の指示にしたがい、そして事実上、Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０６１４−１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：２１５０−２１５５，１９９７に記載されているようにして実施した。これらの分析において前記クローンをチップ上に配列し、次にそのチップを、正常前立腺と腫瘍前立腺のｃＤＮＡおよび各種の他の正常組織からつくった蛍光プローブでプローブした。そのスライドガラスを走査してその蛍光強度を測定した。
【０５７９】
発現比が３より大きいクローン（すなわち、前立腺腫瘍と正常前立腺のｍＲＮＡのレベルが他の正常組織ｍＲＮＡのレベルの少なくとも３倍であるクローン）を、前立腺腫瘍特異的配列として同定した（表ＩＶ）。これらクローンの配列は配列番号：４０１〜４５３に示してあり、特定の新規な配列は、配列番号：４０７，４１３，４１６〜４１９，４２２，４２６，４２７および４５０に示してある。
【０５８０】
【表５】

【０５８１】
【表６】

【０５８２】
配列番号：４０７（Ｐ１０２０Ｃとも呼称される）のクローンについてさらに研究して、配列番号：５９１に示した伸長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ｃＤＮＡ配列を単離した。この伸長ｃＤＮＡ配列は、配列番号：５９２の予測アミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを含有することが分かった。Ｐ１０２０ＣｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ヒト内因性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋポル遺伝子およびタンパク質といくらか類似性を示すことが分かった。
【０５８３】
実施例１５．前立腺特異的抗原の、マイクロアレイ分析によるさらなる同定
この実施例では、追加の前立腺特異的ポリペプチドの、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーからの単離について述べる。
上記のようなヒト前立腺腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、マイクロアレイ分析法を使用し選抜して、前立腺腫瘍組織および／または正常前立腺組織内で、前立腺以外の正常組織（精巣を含まない）と比べて少なくとも３倍の過剰発現を示すクローンを同定した。１４２のクローンを同定して配列を決定した。これらクローンのうち特定のクローンを配列番号：４５４〜４６７に示してある。これらの配列のうち、配列番号：４５９〜４６０は新規の遺伝子である。その他の配列（配列番号：４５４〜４５８と４６１〜４６７）は既知の配列である。
【０５８４】
決定されたｃＤＮＡ配列の配列番号：４６１は、ＢＬＡＳＴプログラムを使ってＧｅｎｂａｎｋデータベースの配列と比較した結果、以前に同定された膜貫通プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）と相同性であることが明らかになった。このクローンの完全長ｃＤＮＡ配列は配列番号：８９４に示してあり、対応するアミノ配列は配列番号：８９５に示してある。ＴＭＰＲＳＳ２の第一の２０９のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列は配列番号：８９６に示し、第一の２０９のアミノ酸は配列番号：８９７に示してある。
【０５８５】
配列番号：４６２の配列（Ｐ８３５Ｐと呼称される）は、関連するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をもっていない以前に同定されたクローンＦＬＪ１３５１８（受託番号ＡＫ０２３６４３；配列番号：９１７）であることが分かった。このクローンを使用してＧｅｎｅｓｅｑＤＮＡデータベースをサーチして、七つの膜貫通ドメインが存在することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体タンパク質（ＤＮＡＧｅｎｓｅｑ受託番号Ａ０９３５１；アミノ酸Ｇｅｎｅｓｅｑ受託番号Ｙ９２３６５）として以前に同定されたクローンと一致した。これらドメイン間のフラグメントの配列は配列番号：９２１〜９２８に示してあり、そして配列番号９２１，９２３，９２５および９２７は細胞外ドメインを表し、配列番号９２２，９２４，９２６および９２８は細胞内ドメインを表す。
【０５８６】
配列番号：９２１〜９２８は、それぞれ、Ｐ８３５Ｐのアミノ酸１〜２８，５３〜６１，８３〜１０３，１２４〜１４３，１６５〜２０１，２２６〜２３８，２６３〜２７２および２９７〜３８１を示す。Ｐ８３５Ｐの完全長ｃＤＮＡの配列は配列番号：９１６に示してある。ストップコドンを含む、Ｐ８３５ＰのオープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列を配列番号９１８に示し、そしてストップコドンなしのオープンリーディングフレームを配列番号：９１９に示し、そして対応するアミノ酸配列を配列番号：９２０に示してある。
【０５８７】
実施例１６．前立腺特異的抗原Ｐ７１０Ｐのさらなる特性決定
この実施例では、Ｐ７１０Ｐの完全長クローニングについて述べる。
上記前立腺ｃＤＮＡライブラリーを上記Ｐ７１０Ｐフラグメントでスクリーニングした。１００万個のコロニーを、ＬＢ／アンピシリンプレート上に平板培養した。ナイロン膜フィルターを使用してこれらのコロニーを持ち上げ、次いでこれらフィルターでピックアップされたｃＤＮＡを、ＵＶ光で変性して、該フィルターに架橋させた。そのＰ７１０Ｐフラグメントを放射能で標識し、そのフラグメントを使用して該フィルターとハイブリッドを形成させた。
【０５８８】
正のｃＤＮＡクローン（ｐｏｓｉｔｉｖｅｃＤＮＡｃｌｏｎｅ）を選択し、それらｃＤＮＡを回収し次いで自動ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒによって配列を決定した。四種の配列が得られ、配列番号：４６８〜４７１に示してある。これらの配列は、Ｐ７１０Ｐ遺伝子の異なるスプライス変異体のようである。続いて、Ｐ７１０ＰのｃＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋの配列と比較したところ、ＤＤ３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１０３９０７およびＡＦ１０３９０８）と相同であることが明らかになった。ＤＤ３のｃＤＮＡの配列は配列番号：６９０に示してある。
【０５８９】
実施例１７．前立腺特異的抗原のタンパク質発現
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、バキュロウィルス及び哺乳動物の細胞内での前立腺特異的抗原の発現及び精製を記載する。
ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ内でのＰ５０１Ｓの発現
ＰＳ５０１Ｓの全長の発現を、ｐＥＴ１７ｂ内のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２の最初の３０アミノ酸（配列番号４８４）から下流にリーダー配列をもたないＰ５０１Ｓ（配列番号１１３のアミノ酸３６〜５５３）をまずクローニングすることにより達成した。特に、Ｐ５０１ＳＤＮＡを、プライマーＡＷ０２５（配列番号４８５）とＡＷ００３（配列番号４８６）を用いてＰＣＲを行うために使用した。ＡＷ０２５は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むセンス・クローニング・プライマーである。ＡＷ００３は、ＥｃｏＲＩ部位を含むアンチセンス・クローニング・プライマーである。
【０５９０】
ＤＮＡ増幅を、５μｌ１０×Ｐｆｕバッファー、１μｌ２０ｍＭｄＮＴＰｓ、１０μｍ濃度における１μｌの各ＰＣＲプライマー、４０μｌ水、１μｌＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌｅ，ＣＡ）、及び１００ｎｇ／μｌにおける１μｌＤＮＡを用いて行った。９５℃における変性を３０秒間、その後、１０サイクルの９５℃３０秒間、６０℃１分間、及び７２℃３分間を行い、２０サイクルの９５℃３０秒間、６５℃１分間、及び７２℃３分間、そして最後に、１サイクルの７２℃１０分間を行った。このＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩを用いてＲａ１２ｍ／ｐＥＴ１７ｂにクローニングした。（Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｆという）得られた融合構築物の配列をＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【０５９１】
この融合構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ／ｐＬｙｓＳ及びＣｏｄｏｎＰｌｕｓＥ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に形質転換させ、そしてカナマイシンを含むＬＢブロス中で一夜培養した。得られたカルチャーをＩＰＴＧにより誘導した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファー中）５％非脂肪ミルクでブロックし、そして３回洗浄し、そして１時間マウス抗−Ｈｉｓタグ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とともにインキュベートした。この膜を、３回洗浄し、そして３０分間ＨＲＰ−プロテインＡ（Ｚｙｍｅｄ）でプローブした。最後に、この膜を３回洗浄し、そしてＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色させた。発現は、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットにより検出されなかった。同様に、Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｆ融合がＣＥ６ファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ内での発現のために使用されたとき、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットにより発現は検出されなかった。
【０５９２】
Ｐ５０１ＳのＮ−末端断片（配列番号１１３のアミノ酸３６−３２５）を、以下のように、ＰＥＴ１７ｂ内にＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２の最初の３０アミノ酸の下流にクローン化した。Ｐ５０１ＳＤＮＡを使用して、プライマーＡＷ０２５（配列番号４８５）とＡＷ０２７（配列番号４８７）を使用したＰＣＲを行った。ＡＷ０２７は、ＥｃｏＲＩ部位と終止コドンを含むアンチセンス・クローニング・プライマーである。ＤＮＡ増幅を本質的に先に記載したように行った。得られたＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位においてｐＥＴ１７ｂ内のＲａ１２にクローニングした。（Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｎという）融合構築物を、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【０５９３】
本質的に先に記載したように、上記Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｎ融合構築物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ，φＬｙｓＳ、及びＣｏｄｏｎＰｌｕｓ内での発現のために使用した。Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析を使用して、３６ＫＤａの予想分子量においてタンパク質バンドを観察した。おそらく上記組換えタンパク質の凝集に因り、いくつかの高分子量のバンドも観察された。ＣＥ６ファージによるＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ内での発現のためにＲａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｆ融合物を使用したとき、Ｗｅｓｔｅｎブロットにより発現は検出されなかった。
【０５９４】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２の最初の３０アミノ酸（配列番号４８４）の下流によるＰ５０１ＳのＣ−末端部分（配列番号１１３のアミノ酸２５７〜５５３）を含む融合構築物を、以下のように調製した。Ｐ５０１ＳＤＮＡを使用して、プライマーＡＷ０２６（配列番号４８８）とＡＷ００３（配列番号４８６）を使用したＰＣＲを行った。ＡＷ０２６は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むセンス・クローニング・プライマーである。本質的に先に記載したようにＤＮＡ増幅を行った。得られたＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位においてｐＥＴ１７ｂ内のＲａ１２にクローン化した。（Ｒａ１２−ｐ５０１Ｓ−Ｃという）融合構築物のための配列を確認した。
【０５９５】
先に記載したように、上記Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｃ融合構築物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ｐＬｙｓＳ、及びＣｏｄｏｎＰｌｕｓ内での発現のために使用した。少量のタンパク質がＷｅｓｔｅｒｎブロットにより検出され、いくつかの分子量も観察された。ＣＥ６ファージにより誘導されるＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ内での発現のために上記Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｃ融合物を使用したとき、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットによっても発現が検出された。
【０５９６】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２の下流にあるＰ５０１Ｓの断片（配列番号１１３のアミノ酸３６〜２９８）を含む融合構築物（配列番号８４８）を、以下のように調製した。Ｐ５０１ＳＤＮＡを使用して、プライマーＡＷ０４２（配列番号８４９）とＡＷ０５３（配列番号８５０）を用いたＰＣＲを行った。ＡＷ０４２は、Ｅ．ｃｏＲＩ部位を含むセンス・クローニング・プライマーである。ＡＷ０５３は、終止部位とＸｈｏＩ部位をもつアンチセンス・プライマーである。ＤＮＡ増幅を、先に記載したように行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位においてｐＥＴ１７ｂ内のＲａ１２にクローン化した。（Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｅ２といわれる）得られた融合構築物を、室温で２時間ＴＢ培地中Ｂ８３４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞内で発現させた。
【０５９７】
発現されたタンパク質を、封入体を洗浄することにより精製し、そしてＮｉ−ＮＴＡカラム上を流した。この精製されたタンパク質は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８），１００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭβ−Ｍｅ、及び５％グリセロールを含有するバッファー中に可溶のままであった。上記の発現された融合タンパク質に関する決定されたｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号８５１と８５２に提供する。
【０５９８】
ｂ）バキュロウィルス内でのＰ５０１Ｓの発現
昆虫細胞内でＰ５０１Ｓタンパク質を発現させるために、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウィルス発現系（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｄｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。全長Ｐ５０１Ｓ（配列番号１１３）を、ＰＣＲにより増幅し、そしてドナー・プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＩのＸｂａＩ部位内にクローン化した。組換えｂａｃｍｉｄとバキュロウィルスを、製造者の指示に従って調製した。この組換えバキュロウィルスをｓｆ９細胞内で増幅させ、そして高力価のウィルス保存株を、ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を感染させて組換えタンパク質を製造するために使用した。全長タンパク質の同定を、上記組換えタンパク質のＮ−末端シークエンシングにより、そしてＷｅｓｔｅｒｎブロット分析により確認した（図７）。
【０５９９】
特に、６ウェル・プレート内で６０万個のＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を、未処理対照ウィルスＢＶ／ＥＣＤ−ＰＤ（レーン２）か又は異なる量又はＭＯＩｓにおけるＰ５０１Ｓのための組換えバキュロウィルスで感染させ（レーン４〜８）、あるいは感染させなかった（レーン３）。細胞溶解産物を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で造らせ、そして（以下に記載するように調製した）抗−Ｐ５０１Ｓモノクローナル抗体Ｐ５０１Ｓ−１０Ｅ３−Ｇ４Ｄ３によるＷｅｓｔｅｒｎブロットにより分析した。レーン１は、ビオチン化されたタンパク質分子量マーカー（ＢｉｏＬａｂｓ）である。
【０６００】
昆虫細胞内での組換えＰ５０１Ｓの局在化を以下のようにして調べた。Ｐ５０１Ｓを過剰発現する昆虫細胞を、核、ミトコンドリア、膜、サイトゾルの画分に分画した。各画分からの等量のタンパク質を、Ｐ５０１Ｓに対するモノクローナル抗体によるウェスタン・ブロットにより分析した。分画のスキームに因り、核画分とミトコンドリア画分の両者が、いくつかの血漿膜成分を含有する。しかしながら、上記膜画分は、ミトコンドリアと核を基本的に含有しない。Ｐ５０１Ｓは、上記膜成分を含有する全ての画分中に存在することが判った。これは、Ｐ５０１Ｓが、上記組換えタンパク質を発現している昆虫タンパク質の血漿膜に会合されているかもしれないということを示唆している。
【０６０１】
ｃ）哺乳動物細胞内でのＰ５０１Ｓの発現
全長Ｐ５０１Ｓ（５５３アミノ酸；配列番号１１３）を、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＲ１０１２（Ｖｉｃｏｌ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びｐＢＩＢという、レトロウィルス・ベクターｐＢＭＮの修飾形態を含む、さまざまな哺乳動物発現ベクター内にクローン化した。ＨＥＫ２９３線維芽細胞内へのＰ５０１Ｓ／ｐＣＥＰ４とＰ５０１Ｓ／ｐＶＲ１０１２のトランスフェクションを、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行った。簡単に言えば、２μｌのＦｕｇｅｎｅ試薬を、１００μｌの無血清培地内で希釈し、そして５〜１０分間室温でインキュベートした。この混合物を、１μｇのＰ５０１ＳプラスミドＤＮＡに添加し、短時間混合し、そして室温で３０分間インキュベートした。このＦｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ混合物を、細胞に添加し、そして２４〜４８時間インキュベートした。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３線維芽細胞内での組換えＰ５０１Ｓの発現を、Ｐ５０１Ｓに対するモノクローナル抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎブロットにより検出した。
【０６０２】
ＣＨＯ−Ｋ細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）内へのＰ５０１Ｓ／ｐＣＥＰ４のトランスフェクションを、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒトランスフェクション試薬（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＳｙｓｔｅｍｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。簡単に言えば、１５μｌのＧｏｎｅＰｏｒｔｅｒを、５００μｌの無血清培地中で希釈し、そして１０分間室温でインキュベートした。このＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ／培地混合物を、２μｇのプラスミドＤＮＡに添加し、これを５００μｌの無血清培地中で希釈し、短時間混合し、そして室温で３０分間インキュベートした。ＣＨＯ−Ｋ細胞を、ＰＢＳ中で濯いで血漿タンパク質を除去し、そして上記ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ／ＤＮＡミックスを添加し、そして５時間インキュベートする。次に、トランスフェクトされた細胞に、等容精の２倍培地を与え、そして２４〜４８時間インキュベートした。
【０６０３】
Ｐ５０１Ｓにより一過性に感染されたＣＨＯ−Ｋ細胞のＦＡＣＳ分析は、Ｐ５０１Ｓの表面発現を証明した。以下に記載するような、Ｐ５０１Ｓペプチドに対するウサギ・ポリクローナル抗血清を用いて発現を検出した。フロー・サイトメトリーによる分析を、ＦａＣＳｃａｎ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて行い、そしてそのデータをｔｈｅＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを用いて分析した。
【０６０４】
ｄ）バキュロウイルスにおけるＰ７０３Ｐの発現
複数の隣接する制限部位を有する完全長Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ５（配列番号３２６）のｃＤＮＡは、プラスミドｐＣＤＮＡ７０３を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって得た。生じた制限フラグメント（約８００塩基対）を、同一の制限酵素で消化したトランスファーベクター内にライゲーションした。インサートの配列はＤＮＡ配列決定で確認した。組換えトランスファープラスミドｐＦＢＰ７０３は、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、バクミドＤＮＡ及びバキュロウイルスを作製するために使用した。ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞は、上述の様に組換えＰ７０３Ｐタンパク質を得るために、組換えウイルスＢＶＰ７０３に感染した。
【０６０５】
ｅ）Ｅ．コリにおけるＰ７８８Ｐの発現
Ｃ末端性６×Ｈｉｓタグを融合したＰ７８８Ｐの短いＮ末端部分（配列番号７７７の残基１〜６４４；Ｐ７８８Ｐ−Ｎとも称する）を以下の様にＥ．コリで発現した。Ｐ７８８ＰのｃＤＮＡを、プライマーＡＷ０８０及びＡＷ０８１（配列番号８１５及び８１６）を用いて増幅した。ＡＷ０８０は、ＮｄｅＩ部位を有するセンスのクローニングプライマーである。ＰＣＲ増幅した７８８Ｐ、及びベクターｐＣＲＸ１をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化した。ベクターとインサートをライゲーションし、そしてＮｏｖａＢｌｕｅ細胞を形質転換した。コロニーをインサートについて無作為にスクリーニングし、そして次に配列決定した。
【０６０６】
Ｐ７８８Ｐ−Ｎクローン＃６は、設計したコンストラクトと同一であることが確認された。発現コンストラクトＰ７８８Ｐ−Ｎ＃６／ｐＣＲＸ１で、Ｅ．コリＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬコンピテント細胞を形質転換した。誘導後、ほとんどの細胞が良好に生育し、３時間後にＯＤ６００が２．０以上に達した。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、約７５ｋＤに過剰発現したバンドを示した。６×Ｈｉｓタグ抗体を用いるウェスタンブロット解析は、当該バンドがＰ７８８Ｐ−Ｎであることを確認した。Ｐ７８８Ｐ−Ｎに関して決定されたｃＤＮＡ配列を配列番号８１７に示し、同時に相当するアミノ酸配列を配列番号８１８を示す。
【０６０７】
ｆ）Ｅ．コリにおけるＰ５１０Ｓの発現
Ｐ５１０Ｓタンパク質は９個の潜在的な膜貫通ドメインを有し、そして原形質膜に存在すると推定される。このタンパク質のＣ末端ドメイン、及び推定されるＰ５１０Ｓの第３の細胞外ドメインは、以下の様にＥ．コリで発現した。
【０６０８】
Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｃと称される発現コンストラクトは、Ｎ末端に６Ｈｉｓタグ、続いて結核（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原Ｒａ１２（配列番号８１９）及びＰ５１０ＳのＣ末端部分（配列番号５３８のアミノ残基１１７６〜１２６１）を有する様に設計された。完全長のＰ５１０Ｓは、プライマーＡＷ０５６及びＡＷ０５７（それぞれ配列番号８２０及び８２１）を用いるＰＣＲによって、Ｐ５１０Ｓ−Ｃフラグメントを増幅するために使用した。ＡＷ０５６はＥｃｏＲＩ部位を有するセンスのクローニングベクターである。ＡＷ０５７は、停止部位及びＸｈｏＩ部位を有するアンチセンスのプライマーである。増幅したＰ５０１Ｓフラグメント及びＲａ１２／ｐＣＲＸ１をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、そして次に精製した。インサートとベクターを共にライゲーションし、そしてＮｏｖａＢｌｕｅを形質転換した。
【０６０９】
コロニーをインサート及び配列に関して無作為にスクリーニングした。タンパク質の発現のために、発現コンストラクトでＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。ミニ誘導スクリーニングは、発現条件を最適化するために実施した。誘導後、当該細胞は良好に生育し、３時間後にはＯＤ６００ｎｍが２．０以上に達した。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、約３０ｋＤの高度に過剰発現したバンドを示した。これは推定した分子量以上であるが、ウェスタンブロット解析はポジティブであり、このバンドがＨｉｓタグ含有タンパク質であることを示した。最適化した培養条件は以下の通りである。
【０６１０】
一晩の培養液／昼間の培養液（ＬＢ＋カナマイシン＋クロラムフェニコール）を、１Ｌの２×ＹＴに対して２５ｍｌの培養液の比率で、２×ＹＴ（カナマイシン及びクロラムフェニコールを有する）中で希釈する。３７℃でＯＤ６００＝０．６となるまで生育させる。ＴＯの試料としてアリコートを採取する。１ｍＭのＩＰＴＧを加え、そして３０℃で３時間生育させる。Ｔ３試料を採取し、細胞を遠心沈澱させ、そして−８０℃で保存する。Ｒａ１２−Ｐ５１０Ｓ−Ｃコンストラクトに関して決定したｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８２２及び８２５に示す。
【０６１１】
発現コンストラクトＰ５１０Ｓ−Ｃは、５′側に加えられた開始コドン及びグリシン（ＧＧＡ）コドン、そして次にＰ５１０ＳＣ末端フラグメント、続いてインフレームの６×ヒスチジンタグ及びｐＥＴ２８６ベクター由来の停止コドンを有する様に設計された。クローニング戦略はＲａ１２−Ｐ５１０Ｓ−Ｃで使用したものと類似しているが、但し、利用したＰＣＲプライマーは、それぞれ配列番号８２８及び８２９に示したものであり、そしてｐＥＴ２８ｂにおいてＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ切断を使用した。配列番号８２８のプライマーは５′のＮｃｏＩ部位を作製し、そして開始コドンを加えた。
【０６１２】
配列番号８２９のアンチセンスプライマーは、Ｐ５１０ＳＣ末端フラグメント上にＸｈｏＩ部位を作製する。クローンは配列決定で確認した。タンパク質発現のために、発現コンストラクトでＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬコンピテント細胞を形質転換した。２．０以上のＯＤ６００は、誘導から３０時間後に得られた。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、約１１ｋＤの過剰発現したバンドを示した。ウェスタンブロット解析は、当該バンドがＮ末端のタンパク質配列決定を行った場合に、Ｐ５１０Ｓ−Ｃであることを確認した。最適化した培養条件は以下の通りである：
【０６１３】
一晩の培養液／昼間の培養液（ＬＢ＋カナマイシン＋クロラムフェニコール）を、１Ｌの２×ＹＴに対して２５ｍｌの培養液の比率で、２×ＹＴ（カナマイシン及びクロラムフェニコールを有する）中で希釈する。３７℃でＯＤ６００＝０．６となるまで生育させる。ＴＯの試料としてアリコートを採取する。１ｍＭのＩＰＴＧを加え、そして３０℃で３時間生育させる。Ｔ３試料を採取し、細胞を遠心沈澱させ、そして−８０℃で精製まで保存する。Ｐ５１０Ｓ−Ｃコンストラクトに関して決定したｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８２３及び８２６に示す。
【０６１４】
Ｐ５１０Ｓの推定される第３の細胞外ドメイン（Ｐ５１０Ｓ−ＥＳ；配列番号５３８の残基３２８〜６７６）を以下の通りにＥ．コリで発現させた。Ｐ５１０Ｓフラグメントは、配列番号８３０及び８３１に示すプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。配列番号８３０のプライマーは、ｐＰＤＭにライゲーションする際に使用するために、ＮｄｅＩ部位を有するセンスプライマーである。配列番号８３１のプライマーは、ｐＰＰＭにライゲーションする際に使用するために加えられたＸｈｏＩ部位を有するアンチセンスプライマーである。生じたフラグメントは、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位でｐＰＤＭにクローニングされた。クローンは配列決定によって確認した。タンパク質の発現のために、当該クローンでＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬコンピテント細胞を形質転換した。
【０６１５】
誘導から３時間後にはＯＤ６００ｎｍが２．０以上に達した。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、約３９ｋＤの過剰発現したバンドを示し、そしてＮ末端の配列決定は、Ｐ５１０Ｓ−Ｅ３であることを確認した。最適化した培養条件は以下の通りである。一晩の培養液／昼間の培養液（ＬＢ＋カナマイシン＋クロラムフェニコール）を、１Ｌの２×ＹＴに対して２５ｍｌの培養液の比率で、２×ＹＴ（カナマイシン及びクロラムフェニコールを有する）中で希釈する。３７℃でＯＤ６００＝０．６となるまで生育させる。ＴＯの試料としてアリコートを採取する。１ｍＭのＩＰＴＧを加え、そして３０℃で３時間生育させる。Ｔ３試料を採取し、細胞を遠心沈澱させ、そして精製まで−８０℃で保存する。Ｐ５０１Ｓ−Ｅ３コンストラクトに関して決定したｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８２４及び８２７に示す。
【０６１６】
ｇ）Ｅ．コリでのＰ７７５Ｓの発現
抗原Ｐ７７５Ｐは、多類のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。配列番号４８３のタンパク質をコードする第３のＯＲＦは、最良なエモーチフ（ｅｍｏｔｉｆ）スコアを有する。結核抗原Ｒａ１２（配列番号８１９）及びＮ末端の６×Ｈｉｓタグを有するＰ７７５Ｐ−ＯＲＦ３は以下の通りに調製した。Ｐ７７５Ｐ−ＯＲＦ３は、配列番号８３２のセンスＰＣＲプライマー及び配列番号８３３のアンチセンスプライマーを用いて増幅した。Ｐ７７５Ｐ及びＲａ１２／ｐＣＲＸ１のＰＣＲ増幅フラグメントは、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した。ベクターとインサートをライゲーションし、そして次にＮｏｖａＢｌｕｅ細胞を形質転換した。
【０６１７】
コロニーをインサートについて無作為にスクリーニングし、そして次に配列決定した。所望の配列を有するクローンでＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓコンピテント細胞を形質転換した。誘導から２時間後、細胞密度は約１．８のＯＤ６００に達した。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、約３１ｋＤの過剰発現したバンドを示した。６×Ｈｉｓタグ抗体を用いるウエスタンブロットは、当該バンドがＲａ１２−Ｐ７７５Ｐ−ＯＲＦ３であることを確認した。融合コンストラクトに関して決定されたｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８３４及び８３５に示す。
【０６１８】
ｈ）Ｅ．コリにおけるＰ７０３ＰＨｉｓタグ融合タンパク質の発現
Ｐ７０３Ｐのコード領域に関するｃＤＮＡは、配列番号８３６及び８３７のプライマーを用いるＰＣＲによって調製した。ＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、そしてＥｃｏ７２Ｉ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した、インフレームでＨｉｓタグを有する修飾型ｐＥＴ２８ベクター内にクローニングされた。正確なコンストラクトはＤＮＡ配列解析によって確認し、そして次にＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ発現宿主細胞を形質転換した。発現した組換えＰ７０３Ｐに関して決定されたアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号８３８及び８３９に示す。
【０６１９】
ｉ）Ｅ．コリにおけるＰ７０５ＰＨｉｓタグ融合タンパク質の発現
Ｐ７０５Ｐのコード領域に関するｃＤＮＡは、配列番号８４０及び８４１のプライマーを用いるＰＣＲによって調製した。ＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、そしてＥｃｏ７２Ｉ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した、インフレームでＨｉｓタグを有する修飾型ｐＥＴ２８ベクター内にクローニングされた。正確なコンストラクトはＤＮＡ配列解析によって確認し、そして次にＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＢＬ（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞を形質転換した。発現した組換えＰ７０５Ｐに関して決定されたアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号８４２及び８４３に示す。
【０６２０】
ｊ）Ｅ．コリにおけるＰ７１１ＰＨｉｓタグ融合タンパク質の発現
Ｐ７１１Ｐのコード領域に関するｃＤＮＡは、配列番号８４４及び８４５のプライマーを用いるＰＣＲによって調製した。ＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、そしてＥｃｏ７２Ｉ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した、インフレームでＨｉｓタグを有する修飾型ｐＥＴ２８ベクター内にクローニングされた。正確なコンストラクトはＤＮＡ配列解析によって確認し、そして次にＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞を形質転換した。発現した組換えＰ７１１Ｐに関して決定されたアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号８４６及び８４７に示す。
【０６２１】
ｋ）Ｅ．ｃｏｌｉでのＰ７６７Ｐの発現
Ｐ７６７Ｐの全長コード領域（配列番号：５９０のアミノ酸２−３７４）を、プライマーＰＤＭ−４６８０及びＰＤＭ−４６９（それぞれ、配列番号：９３５及び９３６）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡの増幅は、１０μＬの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μＬの１０ｍＭｄＮＴＰ、２μＬづつのＰＣＲプライマー１０μＭ濃度、８３μＬの水、１．５μＬのＰｆｕＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）、及び１μＬのＤＮＡ１００ｎｇ／μＬにより行なわれた。変性を９６℃にて２分間行い、次に９６℃にて２０秒、６６℃にて１５秒及び７２℃にて２分間の４０サイクルを行い、最後に７２℃にて４分間を１サイクル行なった。
【０６２２】
ＰＣＲ生成物はＸｈｏＩにより消化し、そしてＥｃｏ７２Ｉ及びＸｈｏＩ似より消化された５’末端に末端を合せたヒスチジジンタグと共に、修飾されたｐＥＴ２８にクローニングした。配列分析を通して、構築物が正しいことを確認し、そして大腸菌ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ及びＢＬ２１ＣｏｎｄｏｎＰｌｕｓ　ＲＰ細胞に形質転換した。組換えＢ７６７Ｐタンパク質のｃＤＮＡコード領域を配列番号：９３８に記載し、そして対応するアミノ酸配列を配列番号：０４１に示す。全長Ｐ７６７Ｐは、検出又は精製のために十分な高レベルで発現しなかった。
【０６２３】
Ｐ７６７Ｐの端が切られたコード領域（Ｂ７６７Ｐ−Ｂ；配列番号：５９０のアミノ酸４７−３７４）は、プライマーＰＤＭ−５７３及びＰＤＭ−４６９（それぞれ、配列番号：９３７及び９３６）、並びに全長Ｐ７６７Ｐについて前記したＰＣＲ条件を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生成物をＸｈｏＩにより消化し、そして、Ｅｃｏ７２Ｉ及びＸｈｏ１により消化した修飾されたｐＥＴ２８ベクターにクローニングした。配列分析により構築物が正しいことを確認し、そして大腸菌ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ及びＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＲＰ細胞に形質転換した。封入体ペレット中にタンパク質が発現されることが見出された。発現されたＢ７６７Ｐ−Ｂタンパク質のコード領域を配列番号：９３９に記載し、対応するアミノ酸配列を配列番号：９４０に示す。
【０６２４】
実施例１８．前立腺特異的ポリペプチドに対する抗体の調製及び特性決定
ａ）Ｐ７０３Ｐ、Ｐ５０４Ｓ及びＰ５０９Ｓに対するポリクローナル抗体の調製及び特性決定
Ｐ７０３Ｐ、Ｐ５０４Ｓ及びＰ５０９Ｓに対するポリクローナル抗体を以下の通りにして調製した。
【０６２５】
Ｅ．コリ組換発現系において発現された各前立腺腫瘍抗原を適当な抗生物質を有するＬＢブロスの中で一夜、３７℃にて振盪インキュベーター内で増殖させた。翌朝、１０ｍｌの一夜培養物を２Ｌのバッフル付きエーレンマイヤーフラスコの中の適当な抗生物質の入った２×ＹＴに加えて５００ｍｌにした。この培養物の光学密度（５６０ｎｍにて）が０．４〜０．６に達したら、細胞をＩＰＴＧ（１ｍＭ）で誘導した。ＩＰＴＧによる誘導から４時間後、細胞を遠心分離により回収した。これらの細胞をリン酸緩衝食塩水で洗い、そして再度遠心分離した。この上清液を捨て、そしてそれらの細胞をその後の使用のために凍結させておくか、又は直ちに処理した。２０ｍｌの溶解バッファーを細胞ペレットに加え、そしてボルテックスにかけた。
【０６２６】
Ｅ．コリ細胞を破裂させるため、この混合物をフレンチプレスに１６，０００ｐｓｉの圧力にかけた。これらの細胞を再度遠心分離し、次いでその上清液及びペレットを組換タンパク質の分配についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検定した。細胞ペレットに局在したタンパク質については、ペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０，１％のＣＨＡＰＳに際懸濁し、そして封入体ペレットを洗浄し、そして再び遠心分離した。この手順を更に２回繰り返した。洗浄した封入体を１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０と１０ｍＭのイミダゾールを含む８Ｍの尿素又は６ＭのグアニジンＨＣＬのいずれかで可溶化させた。
【０６２７】
この可溶化させたタンパク質を５ｍｌのニッケル−キレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に加え、そして室温にて連続撹拌しながら４５ｍｉｎ〜１時間インキュベーションした。インキュベーション後、その樹脂及びタンパク質の混合物をディスポーザブルカラムに通し、そしてフロースルー画分を集めた。次いでこのカラムを１０〜２０カラム容量の可溶化バッファーで洗った。次に抗原を８Ｍの尿素、１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０及び３００ｍＭのイミダゾールを用いてカラムから溶出させ、そして３ｍｌのフラクションで集めた。更なる精製のためにどのフラクションをプールするかを決定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを泳動させた。
【０６２８】
最終精製工程として、強力なアニオン交換樹脂、例えばＨｉＰｒｅｐＱ（Ｂｉｏｒａｄ）を適当なバッファーで平衡にし、そして上記のプールしたフラクションをこのカラムに載せた。各抗原を上昇していく塩勾配を利用してこのカラムから溶出させた。カラムに流しながらフラクションを集め、そしてこのカラムからのどのフラクションをプールするかを決定するために別のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを泳動させた。このプールしたフラクションを１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０に対して透析した。次いでこのタンパク質を０．２２ミクロンのフィルターで濾過してからバイアルに詰め、そしてその抗原を免疫のために必要となるまで凍結した。
【０６２９】
４００μｇづつの前立腺抗原を１００μｇのムラミルジペプチド（ＭＤＰ）と組合せた。４週間毎にウサギを等容量の不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）と混合した抗原１００μｇでブーストした。各ブーストの７日後、動物の採血を行った。血清は血液を４℃にて１２〜４時間インキュベーションし、次いで遠心分離することにより作製した。
【０６３０】
９６穴プレートを５０μｌ（一般に１μｇ）の組換タンパク質と４℃で２０時間インキュベーションすることによって抗原でコーティングした。このウェルに２５０μｌのＢＳＡブロッキングバッファーを加え、そして室温で２時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳ／０．０１％のＴｗｅｅｎで６回洗った。ウサギ血清をＰＢＳに希釈した。５５μｌの希釈した血清を各ウェルに加え、そして室温で３０分インキュベーションした。プレートを上述の通りに洗浄し、１：１００００の希釈率の５０μｌのヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を加え、そして室温で３０分インキュベーションした。プレートを再び上述の通りに洗浄し、そして１００μｌのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質を各ウェルに加えた。暗所にて室温において１５分インキュベーション後、比色反応を１００μｌの１ＮのＨ_２ＳＯ_４で停止させ、そして４５０ｎｍで直ちに測定した。全てのポリクローナル抗体が適当な抗原に対して免疫反応性を示した。
【０６３１】
ｂ）Ｐ５０１Ｓに対する抗体の調製及び特性決定
前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓのカルボキシ末端に対して特異的なネズミモノクローナル抗体を以下の通りにして調製した。
Ｐ５０１Ｓの切頭フラグメント（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１３のアミノ酸３５５〜５２６）を作り、そしてｐＥＴ２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、そしてＥ．コリの中でヒスチジンタグの付いたチオレドキシン融合タンパク質として発現させた。このｔｒｘ−Ｐ５０１Ｓ融合タンパク質をニッケルクロマトグラフィーにより精製し、トロンビンで消化してｔｒｘフラグメントを除去し、そして酸沈殿手順、それに続く逆相ＨＰＬＣにより更に精製した。
【０６３２】
マウスを切頭Ｐ５０１Ｓタンパク質で免疫した。抗Ｐ５０１Ｓポリクローナル血清を潜在的に含むマウス由来の採血血清を精製Ｐ５０１Ｓ及びｔｒｘ−Ｐ５０１Ｓタンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイを利用し、Ｐ５０１Ｓ−特異的反応性について試験した。Ｐ５０１Ｓと特異的に反応するようである採血血清を次にウェスタン分析によりＰ５０１Ｓ反応性についてスクリーニングした。Ｐ５０１Ｓ特異的抗体成分を含むマウスを殺し、そして脾臓細胞を用い、標準の技法を利用して抗Ｐ５０１Ｓ抗体産生ハイブリドーマを作製した。
【０６３３】
ハイブリドーマ上清液をＰ５０１Ｓ特異的反応性について、まずＥＬＩＳＡにより、次いでＰ５０１Ｓ形質導入細胞との反応性のＦＡＣＳ分析により試験した。これらの結果に基づき、１０ＥＳと命名したモノクローナルハイブリドーマを更なるサブクローニングのために選定した。いくつかのサブクローンができ、ＥＬＩＳＡを用いてＰ５０１Ｓに対する特異的反応性について試験し、そしてＩｇＧアイソタイプについて分類した。この分析の結果を以下の表Ｖに示す。試験した１６のサブクローンのうち、モノクローナル抗体１０Ｅ３−Ｇ４−ＤＳを更なる研究のために選択した。
【０６３４】
【表７】

【０６３５】
Ｐ５０１Ｓに対する１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３の特異性をＦＡＣＳ分析により調べた。詳しくは、細胞を固定し（２％のホルムアルデヒド、１０分）、浸透化させ（０．１％のサポニン、１０分）、そして０．５〜１μｇ／ｍｌの１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３で染色し、次いで第二ＦＩＴＣ接合ヤギ抗−マウスＩｇ抗体（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）とインキュベーションさせた。次に細胞をＥｘｃａｌｉｂｕｒフルオレセンス活性化セルソーターを用い、ＦＩＴＣ蛍光について分析した。形質導入された細胞のＦＡＣＳ分析のため、Ｂ−ＬＣＬにＰ５０１Ｓをレトロウィルス的に形質導入した。感染細胞の分析のため、Ｂ−ＬＣＬをＰ５０１Ｓを発現するワクシニアベクターで感染させた。これらのアッセイにおける特異性を実証するため、別の抗原（Ｐ７０３Ｐ）を形質導入したＢ−ＬＣＬ及び非感染Ｂ−ＬＣＬベクターを利用した。
【０６３６】
１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３はＰ５０１Ｓ−形質導入Ｂ−ＬＣＬに結合し、更にはＰ５０１Ｓ感染化Ｂ−ＬＣＬにも結合するが、非感染細胞又はＰ７０３Ｐ形質導入細胞とは結合しないことが示された。
１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３により認識されるエピトープが細胞の表層上か又は細胞内区画内に見い出せるかを検討するため、Ｂ−ＬＣＬにＰ５０１Ｓ又はコントロール抗原としてのＨＬＡ−Ｂ８を形質導入し、そして上述の通りに固定及び浸透化させるか、又は上述の通り１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３で直接染色して分析した。１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３によるＰ５０１Ｓの特異的な認識は浸透化を要することが見い出され、この抗体により認識されるエピトープが細胞内にあることが示唆された。
【０６３７】
１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３と、高、中及び超低レベルのＰ５０１Ｓをそれぞれ発現することで知られる３つの前立腺腫瘍細胞系Ｌｎｃａｐ、ＰＣ−３及びＤＵ−１４５との反応性を、上述の通り細胞を浸透化させ、そして処理することにより調べた。ＰＣ−３よりもＬｎｃａｐとのより高い１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３の反応性が認められ、そしてＰＣ−３との反応性はＤＵ−１４５との反応性よりも高かった。これらの結果はリアルタイムＰＣＲと一致し、そしてこの抗体がこのような腫瘍細胞系内のＰ５０１Ｓを特異的に認識し、そして前立腺腫瘍細胞系内で認識されるエピトープが細胞内にあることも実証する。
【０６３８】
１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３のＰ５０１Ｓに対する特異性はウェスタンブロット分析によっても実証された。前立腺腫瘍細胞系Ｌｎｃａｐ、ＤＵ−１４５及びＰＣ−３、Ｐ５０１Ｓで過渡的にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞及び非トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞由来のリゼートを作った。これらのリゼートの１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３によるウェスタンブロット分析はＬｎｃａｐ、ＰＣ−３及びＰ５０１ＳトランスフェクションＨＥＫ細胞内で４６ｋＤａの免疫反応性バンドが示されたが、ＤＵ−１４５細胞もしくは非トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞では示されなかった。
【０６３９】
Ｐ５０１ＳｍＲＮＡ発現はこれらの結果と一致し、なぜなら半定量ＰＣＲ分析はＰ５０１ＳｍＲＮＡがＬｎｃａｐ内で発現され、ＰＣ−３ではより弱いが検出可能なレベルで発現され、そしてＤＵ−１４５細胞では全く発現されないことを示したからである。細菌的に発現され、精製された組換Ｐ５０１Ｓ（Ｐ５０１ＳＳｔｒ２と称する）は、発現ベクターＶＲ１０１２又はｐＣＥＰ４のいずれかを用いてＨＥＫ２９３細胞内で過渡的に発現された全長Ｐ５０１Ｓと同様に、１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３（２４ｋＤａ）により認識された。Ｐ５０１の推定分子量は６０．５ｋＤａであるが、トランスフェクションＰ５０１Ｓ及び「天然」Ｐ５０１Ｓは共にその疎水性的性質により若干低い移動度で泳動した。
【０６４０】
前立腺腫瘍及び正常組織切片パネル（前立腺、副腎、胸、頸、結腸、十二指腸、胆嚢、回腸、腎臓、卵巣、膵臓、耳下腺、骨格筋、脾臓及び精巣）に対し免疫組織化学分析を実施した。組織サンプルをホルマリン溶液の中で２４時間かけて固定し、そしてパラフィンに包埋し、そして１０ミクロンの切片にスライスした。組織切片を浸透化させ、そして１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３抗体と１時間インキュベーションした。ＨＲＰ−ラベル化抗マウス、それに続くＤＡＢクロモゲンとのインキュベーションを利用してＰ５０１Ｓ免疫反応性を可視化させた。Ｐ５０１Ｓは正常前立腺及び前立腺腫瘍組織の双方で高度に発現されるが、試験したその他の組織では検出されないことが見い出された。
【０６４１】
１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３により認識されるエピトープを同定するため、エピトープマッピングアプローチを追究した。１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３を作るのに利用したＰ５０１Ｓのフラグメントを横断（スパン）する一連の１３通りの重複２０〜２１ｍｅｒ（５個のアミノの重複；ＳＥＱＩＤＮＯ：４８９〜５０１）を作った。平底９６穴マイクロタイタープレートに、マウスを免疫するのに用いたペプチド又はＰ５０１Ｓフラグメントのいずれかを１μｇ／ｍｌにて３７℃で２時間かけてコーティングした。次にウェルをアスピレーションにかけ、そして１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むリン酸緩衝液食塩水で室温で２時間かけてブロッキングし、次いで０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗った。精製抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３をＰＢＳＴ中の２倍希釈系列（１０００ｎｇ〜１６ｎｇ）で加え、そして室温で３０分インキュベーションした。
【０６４２】
その後ＰＢＳＴで６回洗い、そして１：２００００のＨＲＰ−接合ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅＦ（ａｂ’）フラグメント（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ）と３０分インキュベーションした。次にプレートを洗い、そしてテトラメチルベンジジンの中で１５分インキュベーションした。反応を１Ｎの硫酸の添加により停止させ、そしてプレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。図８に示すように、ＳＥＱＩＤＮＯ：４９６のペプチド（Ｐ５０１Ｓのアミノ酸４３９〜４５９に相当）及びＰ５０１Ｓフラグメントとの間で反応性が認められたが、残りのペプチドとは反応性が認められず、１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３により認識されるエピトープがＳＥＱＩＤＮＯ：１１３のアミノ酸４３９〜４５９に存在することを示す。
【０６４３】
Ｐ５０１Ｓの組織特異性を更に評価するため、マルチアレー免疫組織化学分析を、全ての主要正常器官を包含する約４７００通りのヒト組織及びこれらの組織に由来する新生物に対して実施した。これらのヒト組織サンプルのうちの６５が前立腺起源である。直径０．６ｍｍの組織切片をホルマリン固定し、そしてパラフィン包埋した。サンプルを１０ｍＭのクエン酸バッファーｐＨ６．０を用いてＨＩＥＲで予備処理し、そして１０分煮沸した。切片を１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３で染色し、そしてＰ５０１Ｓ免疫反応をＨＲＰで可視化させた。６５の前立腺組織サンプルの全て（５つが正常、５５が未処置前立腺腫瘍、５がホルモン難治前立腺腫瘍）が陽性であり、異なる核周囲染色を示した。調べたその他の認識は全てＰ５０１Ｓ発現に関して陰性であった。
【０６４４】
ｃ）Ｐ５０３Ｓに対する抗体の調製及び特徴付け
Ｐ５０３Ｓ（配列番号：１１４のアミノ酸１１３〜２４１）の１つのフラグメントは、Ｐ５０１Ｓに対して、上に記載したように本質的にバクテリアから発現、及び精製し、ウサギ及びマウスの両者を免疫化するために使用した。マウス・モノクローナル抗体は、上に記載したように、通常のハイブリドーマ技術を使用して単離した。ウサギ・モノクローナル抗体は、イムジェニックス・ファーマソイティカルズ（ＩｍｍｇｅｎｉｃｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（バンクーバー、ＢＣ、カナダ）において、選択的リンパ球抗体法（ＳｅｌｅｃｔｅｄＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＡｎｔｉｂｏｄｙＭｅｔｈｏｄ（ＳＬＡＭ））を使用して単離した。下の表ＶＩは、Ｐ５０３Ｓに対して開発（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）されたモノクローナル抗体を列挙する。
【０６４５】
【表８】

【０６４６】
ウサギ・モノクローナル抗体２０Ｄ４及びＪＡ１に対する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をエンコードするＤＮＡ配列を決定し、それぞれ、配列番号：５０２及び５０３に提供した。
この抗体のそれぞれのエピトープ結合領域をさらに良好に定義するため、一系列の重複ペプチド（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ）を産生させたが、それは配列番号：１１４のアミノ酸１０９〜２１３にまたがる（ｓｐａｎ）。これらのペプチドは、以下のようにＥＬＩＳＡによって、抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体のエピトープ・マップに使用された。免疫原として使用された、Ｐ５０３Ｓの組換え型フラグメントは、陽性対照として使用した。９６ウェルのマイクロタイター・プレートを、４℃で一晩、２０ｎｇ／ウェルで、ペプチド又は組換え型抗原でコートした。
【０６４７】
プレートを吸引し、さらに室温において２時間、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むリン酸で緩衝された食塩水でブロックし、次に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中で洗浄した。ＰＢＳＴ中に希釈された、精製されたウサギ・モノクローナル抗体を、上記のウェルに添加し、室温で３０分、インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄すること、そして、さらに３０分間、１：２０００希釈のプロテイン−Ａ　ＨＲＰコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でのインキュベーションをこれに続けた。プレートを、ＰＢＳＴ中で６回洗浄し、さらに１５分間、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質でインキュベートした。この反応を、１Ｎ硫酸の添加によって停止し、さらにプレートを、ＥＬＩＳＡプレート・リーダーを使用して、４５０ｎｍで読みとった。マウス・モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡは、組織培養液からの上清を用いて実施したが、この試験法において適切に進行した。
【０６４８】
上記抗体の全ては、負の対照（ネガティブ・コントロール）ＳＰ２上清を例外として、組換え型Ｐ５０３Ｓフラグメントに結合した。２０Ｄ４、ＪＡ１、及び１Ｄ１２は、ペプチド＃２１０１（配列番号：５０４）に厳密に結合したが、このペプチドは配列番号：１１４のアミノ酸１５１〜１６９に一致する。１Ｃ３は、ペプチド＃２１０２（配列番号：５０５）に結合したが、このペプチドは、配列番号：１１４のアミノ酸１６５〜１８４に一致する。９Ｃ１２は、ペプチド＃２０９９（配列番号：５２２）に結合したが、このペプチドは、配列番号：１１４のアミノ酸１２０〜１３９に一致する。その他の抗体が結合した領域は、本研究においては、調べられていない。
【０６４９】
エピトープ・マッピングに続いて、抗体を、Ｐ５０３Ｓを安定して発現した１つの細胞系統に対するＦＡＣＳ分析によって試験し、抗体が細胞表面のエピトープに結合することを確認した。対照のプラスミドで、きちんと形質導入された細胞を、負の対照として使用した。細胞は、生きたまま、固定液を用いずに染色した。０．５ｕｇの抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体を添加し、さらに細胞を３０分間、氷上でインキュベートし、ＦＩＴＣラベルされたヤギ抗ウサギ、又はマウス二次抗体で２回の洗浄、及び２０分間のインキュベートをした。２回洗浄後、細胞をエクスカリバー蛍光活性化セル・ソーター（Ｅｘｃａｌｉｂｕｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ）で分析した。モノクローナル抗体１Ｃ３、１Ｄ１２、９Ｃ１２、２０Ｄ４、及びＪＡ１は、Ｐ５０３の細胞表面エピトープに結合することを発見したが、８Ｄ３は結合することが発見されなかった。
【０６５０】
どの組織がＰ５０３Ｓを発現するかを決定するため、本質的には上述のように、通常組織（前立腺、副腎、乳房、頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、大腸、十二指腸、胆嚢、回腸、腎臓、卵巣、膵臓、耳下腺、骨格筋、脾臓、精巣）のパネル上で、免疫組織化学的分析を行った。ＨＲＰ標識された抗マウス、又は抗ウサギ抗体を使用し、次にＴＭＢでのインキュベーションを行って、Ｐ５０３Ｓの免疫反応性を可視化した。Ｐ５０３Ｓは、前立腺組織中で高度に発現されることが発見され、頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、大腸、回腸、腎臓においては、それより低いレベルの発現であり、副腎、乳房、十二指腸、胆嚢、卵巣、膵臓、耳下腺、骨格筋、脾臓、及び精巣においては、いかなる発現も観測されなかった。
【０６５１】
ウエスタンブロット分析を、抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体の特異性を特徴づけるために使用した。バクテリア中で発現され、かつバクテリアから精製された組換え型（ｒｅｃ）Ｐ５０３Ｓ、及び完全長Ｐ５０３Ｓを形質移入されたＨＥＫ２９３細胞からの可溶化液（ライセート）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質をニトロセルロースに移し、そして次に、抗体濃度１μｇ／ｍｌにおいて、各々の抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体（２０Ｄ４、ＪＡ１、１Ｄ１２、６Ｄ１２、９Ｃ１２）でウエスタンブロットを行った。ヤギ抗マウスモノクローナル抗体、又はプロテイン・Ａ−セファロース（ｐｒｏｔｅｉｎＡ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の何れかに複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）された、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ））を使用して、タンパク質を検出した。モノクローナル抗体２０Ｄ４は、妥当な分子量１４ｋＤａの組換え型Ｐ５０３Ｓ（アミノ酸１１３〜２４１）、及び完全長Ｐ５０３Ｓを形質移入されたＨＥＫ２９３細胞可溶化液中の２３．５ｋＤａの化学種を検出した。他の抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体は、ウエスタンブロットによって、類似の特異性を示した。
【０６５２】
ｄ）Ｐ７０３Ｐに対する抗体の調製及び特徴付け
ウサギを、組換え型Ｐ７０３Ｐタンパク質の、切断型（Ｐ７０３Ｐｔｒｌ；配列番号：１７２）又は完全長成熟型（Ｐ７０３Ｐｆｌ；配列番号：５２３）のいずれかで免疫化したが、このタンパク質は上述のようにバクテリア中で発現され、かつバクテリアから単離された。アフィニティー精製されたポリクローナル抗体は、固体支持体に結合された免疫原Ｐ７０３Ｐｆｌ又はＰ７０３Ｐｔｒｌを使用して作成された。ウサギ・モノクローナル抗体は、イムジェニック・ファーマソイティカル（ＩｍｍｇｅｎｉｃｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）において、ＳＬＡＭ技術を使用して単離した。下の表ＶＩＩは、Ｐ７０３Ｐに対して産生されたポリクローナル抗体、及びモノクローナル抗体の両者を列挙する。
【０６５３】
【表９】

【０６５４】
ウサギ・モノクローナル抗体８Ｈ２、７Ｈ８、及び２Ｄ４に対する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をエンコードするＤＮＡ配列を決定し、それぞれ、配列番号：５０６〜５０８に提供する。
エピトープ・マッピング研究を、上述のように行った。モノクローナル抗体２Ｄ４、及び７Ｈ８は、それぞれ、配列番号：５０９（配列番号：１７２のアミノ酸１４５〜１５９に一致する）、及び配列番号：５１０（配列番号：１７２のアミノ酸１１〜２５に一致する）のペプチドに、特異的に結合することが発見された。ポリクローナル抗体９４２７が、配列番号：５１５〜５１７のペプチドに結合することと共に、ポリクローナル抗体２５９４が、配列番号：５１１〜５１４のペプチドと結合することが発見された。
【０６５５】
抗Ｐ７０３Ｐ抗体の特異性は、以下のようにウエスタンブロット分析によって決定した。（１）バクテリアによって発現された組換え型抗原；（２）完全長Ｐ７０３Ｐを発現しているプラスミドで形質移入されていないか、又は形質移入されたＨＥＫ２９３細胞及びＬｔｋ−／−細胞の可溶化液；さらに（３）これらの細胞培養液から単離された上清について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。タンパク質は、ニトロセルロースに移し、さらに次に、抗Ｐ７０３Ｐポリクローナル抗体＃２５９４を、１ｕｇ／ｍｌの抗体濃度で使用して、ウエスタンブロットを行った。
【０６５６】
タンパク質は、抗ウサギ抗体に複合化されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用して検出した。３５ｋＤａの免疫反応性バンドが、組換え型Ｐ７０３Ｐについて観測された。組換え型Ｐ７０３Ｐは、わずかに高分子量で移動するのは、それがエピトープをぶら下げているからである。完全長Ｐ７０３Ｐを形質移入された細胞からの可溶化液及び上清中、Ｐ７０３Ｐに一致する３０ｋＤａのバンドが観測された。特異性を確実にするため、対照プラスミドで確実に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞からの可溶化液をさらに試験したが、Ｐ７０３Ｐ発現に対して陰性であった。他の抗Ｐ７０３Ｐ抗体は、類似の結果を示した。
【０６５７】
抗Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体を使用して、免疫組織化学的研究を上述のように行った。Ｐ７０３Ｐは、正常な前立腺、及び前立腺腫瘍組織中で、高いレベルで発現されることが発見されているが、試験した全てのその他の組織（乳ガン、肺ガン、及び正常な腎臓）中では検出されなかった。
【０６５８】
ｅ）Ｐ５０４Ｓに対する抗体の調製及び特徴付け
完全長Ｐ５０４Ｓ（配列番号：１０８）は、Ｐ５０１Ｓに対し、上述のように本質的にバクテリアで発現され、かつ単離され、イムジェニックス・ファーマソイティカル（ＩｍｍｇｅｎｉｃｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（バンクーバー、ＢＣ、カナダ）で、選択的リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）を使用して、ウサギ・モノクローナル抗体を産生するために使用した。抗Ｐ５０４Ｓモノクローナル抗体１３Ｈ４は、ウエスタンブロットにより、ガン細胞中で、発現された組換え型Ｐ５０４Ｓ、及び天然型Ｐ５０４Ｓの両者に結合することが示された。
【０６５９】
様々な前立腺組織中のＰ５０４Ｓの発現を評価するための、１３Ｈ４を使用した免疫組織化学的研究を、上述のように行った。前立腺ガン（ＰＣ）を伴う根治的前立腺切除術の６５症例、前立腺生検の２６症例、及び良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）の１３症例を含む、全部で１０４の症例は、抗Ｐ５０４Ｓモノクローナル抗体１３Ｈ４で染色した。Ｐ５０４Ｓは、前立腺切除術において、ＰＣの６４／６５（９８．５％）で、さらに前立腺生検の２６／２６（１００％）において、細胞質顆粒染色を強く示した。Ｐ５０４Ｓは、ガン（ｃａｒｓｉｎｏｍａｓ）（ＰＣの症例の９１．２％において４＋、５．５％において３＋、２．２％において２＋、１．１％において１＋）及び前立腺上皮内腫瘍（全ての症例で４＋）において、強く、かつ拡散して染色された。
【０６６０】
Ｐ５０４Ｓの発現は、グレーソン・スコア（Ｇｌｅａｓｏｎｓｃｏｒｅ）に伴って変化しなかった。ＰＣの周りのＮＰ／ＢＰＨの症例のわずか１７／９１（１８．７％）、及びＢＰＨ症例の１／１３（１５．４％）が、病巣であり（全ての症例で１＋、２＋〜４＋はなし）、かつ、ラージ腺（ｌａｒｇｅｇｌａｎｄｓ）中で、Ｐ５０４Ｓに対し、弱い陽性であった。Ｐ５０４Ｓの発現は、生検又は前立腺切除術のいずれかにおける小萎縮性腺（ｓｍａｌｌａｔｒｏｐｈｉｃｇｌａｎｄｓ）、ポストアトロフィック過形成（ｐｏｓｔａｔｒｏｐｈｉｃｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、基底細胞過形成、移行細胞化生（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌｃｅｌｌｍｅｔａｐｌａｓｉａ）においては、発見されなかった。
【０６６１】
Ｐ５０４Ｓは、従って、前立腺ガンの全てのグレーソン・スコア（Ｇｌｅａｓｏｎｓｃｏｒｅｓ）（９８．５〜１００％の敏感さ）において、過剰発現されていることが発見され、かつ、大きな正常前立腺においては、症例の１９／１０４において（８２．３％の特異性）、病巣陽性（ｆｏｃａｌｐｏｓｉｂｉｖｉｔｉｅｓ）のみが示されることが発見された。これらの発見は、Ｐ５０４Ｓが、前立腺ガンの診断のために有用に使用されうることを示す。
【０６６２】
実施例１９．細胞表面発現の特徴付け及び前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの染色体の所在
この実施例は、前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓが細胞の表面で発現されることを示す研究を、Ｐ５０１Ｓの、蓋然性のある染色体の所在を決定するための研究とともに記述する。
タンパク質Ｐ５０１Ｓ（配列番号：１１３）は、１１の膜貫通ドメインを有することが示唆される。抗Ｐ５０１Ｓモノクローナル抗体１０Ｅ−Ｇ４−Ｄ３（実施例１７中に上述したもの）によって、認識されたエピトープが細胞内にあるという発見に基づき、以下の膜貫通決定因子（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）は、Ｐ５０１Ｓの細胞外ドメインの予言を許すだろう。図９は、膜貫通ドメインの予言された所在、及び実施例１７中に記述された細胞内エピトープを示す、Ｐ５０１Ｓタンパク質の図式的表現である。
【０６６３】
下線を付した配列は、予言された膜貫通ドメインを表し、太字の配列は、予言された細胞外ドメインを表し、さらに、イタリックの配列は、予言された細胞内ドメインを表す。太字かつ下線の両者が付された配列は、ポリクローナル・ウサギ血清を産生するために使用された配列を表す。膜貫通ドメインの所在は、トスナディ（Ｔｕｓｎａｄｙ）及びシモン（Ｓｉｍｏｎ）によって記述されたように、ＨＨＭＴＯＰを使用して予言された（ＰｒｉｎｃｅｐｌｅｓＧｏｖｅｒｎｉｎｇＡｍｉｎｏＡｃｉｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＩｎｔｅｇｒａｌＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎｓ：ＡｐｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔｏＴｏｐｏｌｏｇｙＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８３：４８９〜５０６，１９９８）。
【０６６４】
図９に基づき、アミノ酸２７４〜２９５及び３２３〜３４２に一致する膜貫通ドメインが側面に位置したＰ５０１Ｓドメインは、細胞外であることが予言される。配列番号：５１８のペプチドは、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸３０６〜３２０に一致し、予言された細胞外ドメイン中にある。配列番号：５１９のペプチド、これは、アスパラギニンとヒスチジンの置換を除いて、配列番号：５１８のペプチドと同一であるが、上述のように合成した。担体タンパク質に対する結合を容易にするため、このペプチドのＣ末端にＣｙｓ−Ｇｌｙが付加された。
【０６６５】
固体支持体からのペプチドの開裂は、以下の開裂混合物を使用して行った：トリフルオロ酢酸：エタンジオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間の開裂の後、このペプチドを、冷エーテル中で沈殿させた。ペプチドの粒は、次に１０％（ｖ／ｖ）酢酸中に溶解し、Ｃ１８逆相ｈｐｌｃによって精製する前に、凍結乾燥した。水（０．０５％ＴＦＡを含む）中、５〜６０％アセトニトリル（０．０５％ＴＦＡを含む）のグラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用し、このペプチドを溶離した。ペプチドの純度は、ｐｈｌｃ及びマス・スペクトルによって確認し、＞９５％であることを決定した。精製したペプチドは、上述のように、ウサギ・モノクローナル抗体抗血清を産生するために使用した。
【０６６６】
Ｐ５０１Ｓの表面発現をＦＡＣＳ分析により試験した。細胞を１０μｇ／ｍｌのポリクローナル抗Ｐ５０１Ｓペプチド血清により染色し、洗浄し、２次ＦＩＴＣコンジュゲート・ヤギ・抗ウサギ・Ｉｇ抗体（ＩＣＮ）と一緒にインキュベートし、洗浄し、そしてＥｘｃａｌｉｂｕｒ蛍光細胞分析分離装置を用いてＦＩＴＣ蛍光について分析した。形質導入細胞のＦＡＣＳ分析のために、Ｂ−ＬＣＬをレトロウイルス的にＰ５０１Ｓにより形質導入した。これらの分析の特異性を証明するために、関連性のない抗原（Ｐ７０３Ｐ）により形質導入したＢ−ＬＣＬ又は形質導入しなかったＢ−ＬＣＬを平行して染色した。
【０６６７】
前立腺癌細胞株のＦＡＣＳ分析のために、Ｌｎｃａｐ、ＰＣ−３、及びＤＵ−１４５を使用した。前立腺癌細胞株を細胞分離メジュームを用いて組織培養皿から分離し、そして前記のとおり染色した。全てのサンプルをＦＡＣＳ分析の前にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により処理し、そしてデータをＰＩ排除（すなわち、無傷の、そして非透過性）細胞から得た。配列番号５１９のペプチドに対して製造されたウサギ・ポリクローナル血清は、ポリクローナル血清により認識されるエピトープが細胞外のものであることを証明する、Ｐ５０１Ｓを発現するために形質導入された細胞の表面の特異的な認識を示した。
【０６６８】
Ｐ５０１Ｓが細胞表面に発現されているとき、生化学的に測定するために、Ｌｎｃａｐ細胞の周辺膜を分離し、そしてウエスタン・ブロット分析に供した。具体的には、Ｌｎｃａｐ細胞を５ｍｌの均質化バッファー（２５０ｍＭスクロース、１０ｍＭＨＥＰＥＳ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．１、１つの完全プロテアーゼ阻害剤錠（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ））中、ダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）・ホモジナイザーを用いてすりつぶした。ライゼート・サンプルを１０００ｇ、５分間４℃で遠心分離した。次にその上清を８０００ｇ、１０分間、４℃で遠心分離した。８０００ｇの遠心分離からの上清を回収し、そして３０分間、４℃での１００，０００ｇの遠心分離に供して周辺膜を回収した。
【０６６９】
次にサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして前記の条件を用いたマウス・モノクローナル抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３（実施例１７中に前記）によりウエスタン・ブロットした。組換え精製Ｐ５０１Ｓ、並びにＰ５０１により形質導入し、そしてそれを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞をＰ５０１Ｓ検出の陽性対照として含んだ。ＬＣＬ細胞ライセートを陰性対照として含んだ。Ｐ５０１Ｓを、Ｌｎｃａｐ全細胞ライセート中、８０００ｇ（内膜）画分中、及び１００，０００ｇ（原形質膜）画分中にも検出することができた。これらの結果は、Ｐ５０１Ｓが周辺膜で発現され、そしてそこに配置されていることを示している。
【０６７０】
配列番号５１９のペプチドに対して製造されたウサギ・ポリクローナル抗血清が、このペプチド並びに配列番号５１８の対応の天然ポリペプチドを特異的に認識することを証明するために、ＥＬＩＳＡ分析を実施した。この分析のために、平底９６ウェル・マイクロタイター・プレートを配列番号５１９のペプチド、完全に予測された細胞外ドメインに及ぶ配列番号５２０のより長いポリペプチド、Ｐ５０１Ｓ特異的抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３により認識されるエピトープを表す配列番号５２１のペプチド、又は免疫性ペプチド配列を含まない（配列番号１１３の３５５〜５２６アミノ酸に対応の）Ｐ５０１Ｓ断片のいずれかにより１μｇ／ｍｌで２時間３７℃でコートした。
【０６７１】
ウェルを吸引し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水により室温で２時間ブロッキングし、そして続いて０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により洗浄した。精製抗Ｐ５０１Ｓポリクローナル・ウサギ血清をＰＢＳＴ中に２倍希釈（１０００ｎｇ〜１２５ｎｇ）で加え、そして室温で３０分間インキュベートした。引き続きこれをＰＢＳＴにより６回洗浄し、１：２００００でＨＲＰコンジュゲート・ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅＦ（ａｂ’）断片と一緒に３０分間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、そしてテトラメチル・ベンジジン中、１５分間インキュベートした。１Ｎ硫酸の添加により反応を停止させ、そしてプレートをＥＬＩＳＡプレート・リーダーを用いて４５０ｎｍで読んだ。図１１に示すとおり、抗Ｐ５０１Ｓポリクローナル・ウサギ血清は、免疫に用いた配列番号５１９のペプチド、並びに配列番号５２０のより長いペプチドを特異的に認識したが、しかし関連のないＰ５０１Ｓ由来のペプチド及び断片は認識しなかった。
【０６７２】
さらなる研究において、ウサギをＰ５０１Ｓの配列由来のポリペプチドにより免疫し、そして図９に示すとおり細胞外又は細胞内のいずれかであるかを予測した。前記のとおり、ポリクローナル・ウサギ血清を分離し、そしてその血清中のポリクローナル抗体を精製した。Ｐ５０１Ｓとの特異的反応性を測定するために、Ｐ５０１Ｓ若しくは関連性のない抗原Ｐ７０３Ｐにより形質導入したＢ−ＬＣＬ、又はワクシニア・ウイルス発現Ｐ５０１Ｓを注入したＢ−ＬＣＬのいずれかを用いたＦＡＣＳ分析を使用した。表面発現のために、死細胞及び損傷細胞を前記のとおり分析から除外した。細胞内染色のために、前記のとおり細胞を固定し、そして透過化処理した。Ｐ５０１Ｓの１８１〜１９８アミノ酸に対応の配列番号５４８のペプチドに対して産生されたウサギ・ポリクローナル血清がＰ５０１Ｓの表面エピトープを認識することが分かった。
【０６７３】
異なる実験において無傷又は透過化処理細胞がこのポリクローナル血清により認識されたので、Ｐ５０１Ｓの５４３〜５５３アミノ酸に対応の配列番号５５１のペプチドに対して産生されたウサギ・ポリクローナル血清は、細胞外又は細胞内いずれかの可能性をもつエピトープを認識することがわかった。同様の推理的な論法に基づき、それぞれＰ５０１Ｓの１０９〜１２２、５３９〜５５３、５０９〜５２０、３７〜５４、３４２〜３５９、２９５〜３２３、２１７〜２７４、１４３〜１６０、及び７５〜８８アミノ酸に対応する配列番号５４１〜５４７、５４９、及び５５０の配列は抗体に認識される潜在的な表面エピトープであると考えられうる。
【０６７４】
さらなる研究において、マウス・モノクローナル抗体を細胞外ドメインと予測されるＰ５０１Ｓの２９６〜３２２アミノ酸に対して作った。Ａ／ＪマウスをＰ５０１Ｓ／アデノウイルスにより免疫し、続いてＰ５０１Ｓの２９６〜３２２アミノ酸を含むＰ５０１Ｎと称するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換えタンパク質、及びＫＬＨと結合した２９６〜３２２ペプチド（配列番号８９８）により追加免疫した。続いてマウスを、抗ペプチド・ハイブリドーマ産生のための脾臓Ｂ細胞融合のために利用した。４Ｆ４（ＩｇＧ１、カッパ）、４Ｇ５（ＩｇＧ２ａ、カッパ）、及び９Ｂ９（ＩｇＧ１、カッパ）と称する、結果として得られた３種のクローンを抗体製造のために生育させた。４Ｇ５ｍＡｂを、その上清をＰｒｏｔｅｉｎＡ−セフアロース・カラムを通過させ、続いて０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．３を用いて溶出することで精製した。精製抗体を１Ｍトリス、ｐＨ８の添加により中和し、そしてバッファーをＰＢＳに交換した。
【０６７５】
ＥＬＩＳＡ分析のために、９６ウェル・プレートを、全て２μｇ／ｍｌの濃度でＰ５０１Ｓペプチド２９６〜３２２（長Ｐ５０１Ｓと称する）、関連のないＰ７７５ペプチド、Ｐ５０１Ｓ〜Ｎ、Ｐ５０１ＴＲ２、長Ｐ５０１Ｓ−ＫＬＨ、Ｐ５０１Ｓペプチド３０６〜３１９（短Ｐ５０１と称する）−ＫＬＨ又は関連のないペプチド２０７３−ＫＬＨによりコートし、３７℃で６０分間インキュベートした。コーティング後、０．１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳにより５回洗浄し、そして次に０．５％ＢＳＡ、０．４％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳにより室温で２時間ブロッキングした。
【０６７６】
上清又は精製ｍＡｂの添加に続き、そのプレートを室温で６０分間インキュベートした。プレートを前記のとおり洗浄し、そしてロバ抗マウスＩｇＨＲＰ結合２次抗体を添加し、そして室温で３０分間インキュベートし、引き続き前記のとおり最後の洗浄をした。ＴＭＢ基質を加え、そして暗闇の中室温で１５分間インキュベートした。前記反応を１ＮＨ_２ＳＯ_４の添加により停止させ、そして吸光度を４５０ｎＭで読んだ。３種のハイブリッド・クローンの全てが２９６〜３２２ペプチド、及び組換えタンパク質Ｐ５０１Ｎを認識するｍＡｂを分泌した。
【０６７７】
ＦＡＣＳ分析のために、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬を用いてＰ５０１Ｓ／ＶＲ１０１２発現構築物により一時的に形質導入した。培養２日後細胞を採取し、そして洗浄し、次に精製４Ｇ５ｍＡｂと一緒に水上で３０分間インキュベートした。ＰＢＳによる数回の洗浄の後、０．５％ＢＳＡ、０．０１％アザイド、ヤギ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣを前記細胞に添加し、そして氷上３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして１％ヨウ化プロピジウム含有洗浄バッファーにより再懸濁し、そしてＦＡＣＳ分析に供した。ＦＡＣＳ分析は、Ｐ５０１Ｓの２９６〜３２２アミノ酸が細胞外ドメイン内に存在し、そして細胞表面に発現されていることを確かにした。
【０６７８】
Ｐ５０１Ｓの染色体配置を、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４ＲａｄｉａｔｉｏｎＨｙｂｒｉｄパネル（ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて決定した。配列番号５２８及び５２９のＰＣＲプライマーを製造者の指示に導いハイブリッド・パネルからのＤＮＡプールによるＰＣＲに使用した。３８サイクルの増幅の後、反応産物を１．２％アガロース・ゲルにより分離し、そしてその結果をＷｈｉｔｅｈｅａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈｗｅｂｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）を通して分析し、有望な染色体配置を決定する。この方法を用いて、Ｐ５０１Ｓを第１染色体の長腕、ＷＩ−９６４１のｑ３２〜ｑ４２の間に位置付けた。第１染色体のこの領域は、遺伝性前立腺癌において前立腺癌感受性に関連している（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：１３７１−１３７４，１９９６、及びＢｅｒｔｈｏｎｅｔａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６２：１４１６−１４２４，１９９８）これらの結果は、Ｐ５０１Ｓが前立腺癌悪性腫瘍において役割を担いうることを示唆する。
【０６７９】
実施例２０．前立腺特異性抗原Ｐ５０１Ｓの発現調節
ステロイド（アンドロゲン）ホルモン調節は前立腺癌における一般的な治療の様相である。多くの前立腺組織特異性抗原の発現がアンドロゲンに対応することはこれまでに証明されている。アンドロゲン処理に対する前立腺特異性抗原Ｐ５０１Ｓの対応を以下の組織培養系により試験した。
【０６８０】
前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰからの細胞を１．５×１０^６細胞／Ｔ７５フラスコ（ＲＮＡ分離用）又は３×１０^５細胞／６ウェル・プレートのウェル（ＦＡＣＳ分析用）で播種し、そして１０％チャコール・ストリップ（ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）牛胎児血清（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で一晩培養した。さまざまな時点で加えた１ｎＭの合成アンドロゲン・メチルトリエノロン（Ｒ１８８１；ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）とともに１０％チャコール・ストリップ牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、さらに７２時間細胞培養を続けた。次にＲＮＡ分離及びＦＡＣＳ分析のためにアンドロゲン添加後０，１，２，４，８，１６，２４，２８、及び７２時間で細胞を採取した。ＦＡＣＳ分析を抗Ｐ５０１Ｓ抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３及び透過化細胞を用いて実施した。
【０６８１】
ノザン分析のために、５〜１０μｇの総ＲＮＡをホルムアルデヒド変性ゲルにより泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｈｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に転写し、交差結合し、そしてメチレン・ブルーにより染色した。次にそのフィルターをＣｈｕｒｃｈ’ｓバッファー（２５０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４，７０ｍＭＨ_３ＰＯ_４，１ｍＭＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ，１％ＢＳＡ，ｐＨ７．２）により６５℃で１時間プレハイブリダイズした。Ｐ５０１ＳＤＮＡをＨｉｇｈＰｒｉｍｅランダム・プライムＤＮＡラベリング・キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いて^３２Ｐにより標識した。組み込まれていない標識をＭｉｃｒｏＳｐｉｎＳ３００−ＨＲカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）を用いて除去した。
【０６８２】
次に前記ＲＮＡフィルターを標識ｃＤＮＡを含む新しいＣｈｕｒｃｈ’ｓバッファーにより一晩ハイブリダイズさせ、１×ＳＣＰ（０．１ＭＮａＣｌ，０．０３ＭＮａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．００１ＭＮａ_２ＥＤＴＡ）、１％サルコシル（ｎ−ラウロイルサルコシン）により洗浄し、そしてＸ線フィルムに感光させた。
ＦＡＣＳ及びノザン分析の両者を用いて、Ｐ５０１Ｓメッセージ及びタンパク質レベルがアンドロゲン処理に対応して減少することが分かった。
【０６８３】
実施例２１．前立腺特異的薬剤の融合タンパク質の調製
この実施例は前立腺特異的抗原Ｐ７０３Ｐと端を切り取った形の既知の前立腺抗原ＰＳＡとの融合タンパク質の調製を記載する。端を切り取った形のＰＳＡは活性セリン部位のあたりに２１アミノ酸の欠失を有する。融合タンパク質についての発現構築体も停止コドンの直前である３′末端に制限部位を有し、追加の抗原のためのｃＤＮＡを加えることについて援助する。
【０６８４】
ＰＳＡについての全長ｃＤＮＡを配列番号６０７及び６０８のプライマーを用いてヒト前立腺腫瘍組織からのＲＮＡのプールからＲＴ−ＰＣＲにより得て、ｐＣＲ−ブランドＩＩ−ＴＯＰＯベクター中にクローン化した。得られたｃＤＮＡを鋳型として用いて、２組のプライマー（配列番号６０９及び６１０並びに配列番号６１１及び６１２）を用いてＰＣＲにより、ＰＳＡの２つの異ったフラグメントを作成した。予測したサイズを有するＰＣＲ生成物を鋳型として用いて配列番号６１１及び６１３のプライマーを用いてＰＣＲにより、端を切り取った形のＰＳＡを作成した。これはＰＳＡを生じた（アミノ酸中のデルタ２０８〜２１８）。５′末端に６×ヒスチジン標識を有する成熟した形のＰ７０３ＰについてのｃＤＮＡをＰ７０３Ｐ及び配列番号６１４及び６１５のプライマーを用いてＰＣＲにより調製した。
【０６８５】
次いで、Ｐ７０３Ｐと端を切り取った形のＰＳＡとの融合についてのｃＤＮＡ（ＦＯＰＰという）を、改変したＰ７０３ＰｃＤＮＡ及び端を切り取った形のＰＳＡｃＤＮＡを鋳型として、配列番号６１４及び６１５のプライマーを用いて得た。ＦＯＰＰｃＤＮＡを発現ベクターｐＣＲＸ１のＮｄｅＩ部位及びＸｈｏＩ部位中にクローン化し、ＤＮＡ配列決定により確認した。融合構築体ＦＯＰＰについての決定したｃＤＮＡ配列を配列番号６１６として提供し、アミノ酸配列を配列番号６１７として提供した。
【０６８６】
融合ＦＯＰＰを以下のように大腸菌中に単一組換えタンパク質として発現させた。発現プラスミドｐＣＲＸ１ＦＯＰＰを大腸菌株ＢＬ２１−コドンプラスＰＩＬ中に形質転換した。形質転換体は１ｍＭのＩＰＴＧを用いる誘発によりＦＯＰＰタンパク質を発現することが分かった。対応する発現クローンの培養を５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する２５ｍｌのＬＢブロス中に接種し、約１のＯＤ６００までの３７℃で増殖させ、４℃で一夜貯蔵した。培養を５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する１リットルのＴＢＬＢ中に希釈し、０．４のＯＤ６００まで３７℃で増殖させた。１ｍＭの最終濃度となるまでＩＰＴＧを加え、培養を３０℃で３時間インキュベートした。
【０６８７】
細胞を５，０００ＲＰＭで８分間遠心分離することによりペレット化した。タンパク質を精製するために、細胞ペレットを２５ｍｌの１０ｍＭのトリス−ＣｌｐＨ８．０，２ｍＭのＰＭＳＦ（完全なプロテアーゼ阻害剤）及び１５μｇのリゾチーム中に懸濁した。細胞を４℃で３０分間溶解させ、数回超音波処理し、溶解物を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。封入体を含有する沈澱物を１０ｍＭのトリス−ＣｌｐＨ８．０及び１％のＣＨＡＰＳで２回洗浄した。封入体を４０ｍｌの１０ｍＭのトリス−ＣｌｐＨ８．０，１００ｍＭのリン酸ナトリウム及び８Ｍの尿素に溶解した。
【０６８８】
溶液を８ｍｌのＮｉＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）に室温で１時間結合させた。混合物を２５ｍｌのカラムに注ぎ、５０ｍｌの１０ｍＭのトリス−ＣｌｐＨ６．３，１００ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５％のＤＯＣ及び８Ｍの尿素で洗浄した。結合タンパク質を３５０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのトリス−ＣｌｐＨ８．０，１００ｍＭのリン酸ナトリウム及び８Ｍの尿素で溶出させた。ＦＯＰＰタンパク質を含有する分画を一緒にして、１０ｍＭのトリス−ＣｌｐＨ４．６に対して広範囲にわたって透析し、分取し、−７０℃で貯蔵した。
【０６８９】
実施例２２．前立腺がん患者の末梢血中の前立腺特異的抗原Ｐ５０１ＳのリアルタイムのＰＣＲ特性付け
正常な個体及び転移前立腺がん患者の新鮮な血液から、循環する上皮細胞を単離し、ｍＲＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲ手順を用いてｃＤＮＲを調製した。リアルタイムＰＣＲを遺伝子発現レベルを決定するために遺伝子特異的プライマーとプローブの両方を用いて、Ｔａｑｍａｎ（商標）手順で実施した。
免疫磁性ビーズ分離法（ＤｙｎａｌＡ．Ｓ．、ノルウェー国オスロ）を用いて血液サンプルから上皮細胞を富化した。単離細胞を溶解させ、磁性ビーズを除去した。次いで、溶解物をＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２５で被覆した磁性ビーズを用いてポリＡ＋ｍＲＮＡ単離のために処理した。緩衝液中のビーズを洗浄した後、ビーズ／ポリＡ＋ＲＮＡサンプルを１０ｍＭのトリスＨＣｌｐＨ８．０に懸濁し、逆転写をさせた。
【０６９０】
生じたｃＤＮＡを遺伝子特異的プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲにかけた。ベータアクチン含量も測定し、標準化のために用いた。正常のサンプルの平均＋３標準偏差よりも多いＰ５０１Ｓを有するサンプルは陽性と考えた。血液サンプルについてのリアルタイムのＰＣＲをＴａｑｍａｎ（商標）手順を用いるが、ただし、前進及び逆向プライマー並びにＰ５０１Ｓに特異的なプローブを用いて５０サイクルまで拡大して実施した。試験した８サンプル中、６つのサンプルはＰ５０１Ｓ及びβ−アクチンシグナルに陽性であった。残りの２つのサンプルにはβ−アクチンまたはＰ５０１Ｓは検出されなかった。４つの試験した正常なサンプル中にはＰ５０１Ｓシグナルは認められなかった。
【０６９１】
実施例２３．ＳＣＩＤマウス継代前立腺腫瘍における前立腺特異的抗原Ｐ７０３Ｐ及びＰ５０１Ｓの発現
前立腺がんの治療における抗原の有効性を考える時、アンドロゲン切除療法中の腫瘍における抗原の継続した存在が重要である。テストステロンの存在下でＳＣＩＤマウスにおいて増殖した前立腺腫瘍サンプル中の前立腺特異的抗原Ｐ７０３Ｐ及びＰ５０１Ｓの存在を次のように評価した。
【０６９２】
骨まで転移した２つの前立腺腫瘍を患者から除去し、ＳＣＩＤマウスに移植し、テストストロンの存在下に増殖させた。腫瘍をＳＹＢＲグリーンアッセイ法を用いる定量リアルタイムＰＣＲを用いて、Ｐ７０３Ｐ、Ｐ５０１Ｓ及びＰＳＡのｍＲＮＡ発現について評価した。前立腺腫瘍中のＰ７０３Ｐ及びＰ５０１Ｓの発現を陽性の対照として、正常な腸及び正常な心臓におけるその不存在を負の対照として用いた。両方の場合において、特異的ｍＲＮＡは遅い継代腫瘍において存在した。骨の転移はテストストロンの存在において増殖したので、これは、これらの遺伝子の存在はアンドロゲン切除療法中になくならなかっただろうということを暗示する。
【０６９３】
実施例２４．抗− Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体はインビボにおける腫瘍の増殖を阻害する
抗−Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体２０Ｄ４のネズミにおける腫瘍形成を抑制する能力を次のように調べた。
１０匹のマウスにＰ５０３Ｓを発現したＨＥＫ２９３細胞を皮下注射した。５匹のマウスは０日、５日及び９日（腫瘍細胞の注射時）に１５０μｇの２０Ｄ４を静脈注射で受け取った。腫瘍のサイズを５０日間測定した。２０Ｄ４を受け取らなかった５匹のマウスの内、３匹は約２週間後に検出可能な腫瘍を形成し、それは研究の間中大きくなり続けた。それに対して、２０Ｄ４を受け取った５匹のマウスのいずれもが腫瘍を形成しなかった。これらの結果は、抗−Ｐ５０３ＳＭａｂ２０Ｄ４がインビボにおける強力な抗−腫瘍活性を発揮することを示す。
【０６９４】
実施例２５．Ｐ５０１Ｓ特異的Ｔ細胞クローンからのＴ細胞受容体クローンの特徴付け
Ｔ細胞は限定された寿命を有する。しかしながら、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖のクローン化及びそれに続く転移はＴ細胞特異性の無限の伝播を本質的に可能にする。腫瘍抗原ＴＣＲ鎖のクローン化は、ＴＣＲＭＨＣ制限アレレを共有する患者から単離されたＴ細胞にその特異性の転移を可能にする。次いで、このようなＴ細胞を発達させ、抗原を発現する腫瘍を担う患者に腫瘍抗体特異性を導入するために選択の転移環境で用いることができるだろう。前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓに特異的なＣＤ８　Ｔ細胞クローンからのＴ細胞受容体アルファ及びベータ鎖を以下のように単離し、配列決定した。
【０６９５】
ＣＴＬクローン４Ｅ５（前記実施例１２に記載された）からの２×１０^６細胞からの全ｍＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて単離し、ｃＤＮＡを合成した。このクローン中のＶａ及びＶｂ配列を決定するために、一連のＶａ及びＶｂサブタイプ特異的プライマーを合成し、各クローンから生じたｃＤＮＡとのＲＴ−ＰＣＲ反応に用いた。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、各クローンがＶｂ７サブファミリーに対応する共通のＶｂ配列を発現したことを示した。さらに、そのクローンから生じたｃＤＮＡを用いて、発現したＶａ配列はＶａ６であると決定された。クローン４Ｅ５から全長ＴＣＲアルファ及びベータ鎖をクローン化するために、開始及び停止コードＴＣＲヌクレオチドにわたるプライマーを設計した。
【０６９６】
プライマーは次のとおりであった：ＴＣＲＶアルファー６　５′（センス）：ＧＧＡＴＣＣ−−−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−ＡＴＧＴＣＡＣＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＧＣＴ（配列番号８９９）ＢａｍＨＩ部位ＫｏｚａｋＴＣＲアルファ配列ＴＣＲアルファ３′（アンチセンス）：ＧＴＣＧＡＣ−−−ＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＡＧ（配列番号９００）ＳａｌＩ部位ＴＣＲアルファ不変配列ＴＣＲＶベーター７　５′（センス）：ＧＧＡＴＣＣ−−−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−−ＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴ（配列番号９０１）ＢａｍＨＩ部位ＫｏｚａｋＴＣＲアルファ配列ＴＣＲベータ３′（アンチセンス）：ＧＴＣＧＡＣ−−−ＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣ（配列番号９０２）ＳａｌＩ部位ＴＣＲベータ不変配列。ＣＴＬクローン及び上記プライマーから合成したｃＤＮＡを用いて、校正熱安定性ポリメラーゼＰＷＯ（Ｒｏｃｈｅ、ニュージャージー州ナットレイ）を用いて標準的な３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲ反応を確立した。
【０６９７】
得られた特異的なバンド（アルファについては約８５０塩基対、ベータについては約９５０塩基対）をＰＣＲブラントベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、大腸菌に形質転換した。全長のアルファ及びベータ鎖を含有するプラスミドを形質転換された大腸菌を同定し、対応するプラスミドの大規模調製を引き起こした。全長のＴＣＲアルファ及びベータ鎖を含有するプラスミドを配列決定のために提出した。配列決定反応Ｖｂ及びＶａ鎖について決定されたｃＤＮＡ配列を有する全長のＴＣＲアルファ及びベータ鎖のクローン化がそれぞれ配列番号９０３及び９０４で示されることを証明した。対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９０５及び９０６に示す。Ｖａ配列はＶａ６．２と９９％同一（３４８／３４８）であり、ＶｂはＶｂ７（３３６／３３８）と９９％同一であることがヌクレオチド配列アラインメントで分かった。
【０６９８】
実施例２６．前立腺抗原Ｐ５０３Ｓを用いての前立腺特異的細胞の捕捉
上記の通り、Ｐ５０３Ｓは前立腺細胞の表面に見出される。マウスＩｇＧに特異的な二次被覆マイクロスフェアビーズを、精製されたＰ５０３Ｓ−特異的モノクローナル抗体１Ｄ１２に連結した。次に、結合されたＰ５０３Ｓ抗体を用いて、組換えＰ５０３Ｓを発現するＨＥＫ細胞を捕捉した。これは、血液中の前立腺細胞の検出、従って前立腺癌の検出において通常使用することが出来る、前立腺−特異的細胞捕捉のためのモデル系を提供する。
【０６９９】
Ｐ５０３ＳでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を収得し、そして洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．６％クエン酸ナトリウム）中に適当な体積で再溶解しサンプル当り少なくとも５細胞とした。ビーズを用いる全ての手法のために丸底エッペンドルフチューブを用いた。ストック濃度は表ＶＩＩＩに示すとおりである。
【０７００】
【表１０】

【０７０１】
ブロックされた免疫磁気（イムノマグネティック）ビーズを次のようにして前洗浄した：必要な全てのビーズをプールし、そして１ｍＬの洗浄緩衝液で１回洗浄した。ビーズを、１％のＢＳＡ（ｖ／ｖ）を含む洗浄緩衝液３体積中に再懸濁し、そして４℃にて１５分間回転させながらインクベートした。次に、ビーズを２体積の洗浄緩衝液で３回洗浄し、元の体積に再懸濁した。ブロックされていないビーズをプールし、２体積の洗浄緩衝液で３回洗浄し、そして元の体積に再懸濁した。
【０７０２】
一次抗体を二次ビーズと共に、新たなエッペンドルフ中で４℃にて３０分間、回転させながらインキュベートした。サンプルの均一な混合のため、約２００μＬの戦場緩衝液を加えて全体積を増加させた。抗体−ビーズ溶液を新たなエッペンドルフに移し、同体積の洗浄緩衝液で２回洗浄し、そして元体積に再懸濁した。各サンプルに標的細胞を加え、そして４℃にて４５分間回転させながらインキュベートした。チューブをマグネットの移し、ビーズを撹拌しないように注意しながら上清を除去、そして１ｍＬの洗浄緩衝液で２回洗浄した。次に、サンプルを、ＤｙｎａｂｅａｄｓｍＲＮＡｄｉｒｅｃｔｍｉｃｒｏｋｉｔ（ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ）を用いるＲＴ−ＰＣＲのために準備した。
【０７０３】
上皮細胞濃縮物をマグネット内に置き、そして上清を除去した。次に、上皮細胞濃縮ビーズを、ルナシン（Ｒｕｎａｓｉｎ）（サンプル当り２Ｕ／μＬ）を添加した細胞溶解／結合緩衝液１００μＬ中に再懸濁し、そして使用するまで−７０℃で凍結した。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ_２５）Ｄｙｎａｂｅａｄｓを次のようにして前洗浄した：必要な全てのビーズをプールし（２３μＬ／サンプル）、過剰体積の細胞溶解／結合緩衝液で３回洗浄し、そして元の体積に再懸濁した。細胞溶解上清をマグネットにより分離し、そして新たなエッペンドルフに移した。サンプル当り２０μＬのＯｌｉｇｏ（ｄＴ２５）Ｄｙｎａｂｅａｄｓを添加し、室温にて５分間回転させた。マグネットを用いて上清を分離し、そして廃棄し、ｍＲＮＡをビーズにアニールさせた。ビーズ／ｍＲＮＡ複合体を緩衝液で洗浄し、そして冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に再懸濁した。
【０７０４】
ＲＴ−ＰＣＲのため、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ上清を分離し、そしてＭＰＲをもちいて廃棄した。１５個以下の細胞を含む各サンプルにつき、次のものを加えて全量３０μＬとした：１．５μＬの水、１．５μＬのＢＳＡ、６μＬの第１鎖緩衝液、０．７５ｍＬの１０ｍＭｄＮＴＰ混合物、３μＬのルナシン（Ｒｕｎａｓｉｎ）、３μＬの０．１ＭｄＴＴ、及び１．５μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ。得られた溶液を４２℃にて１時間インキュベートし、水中に１：５で希釈し、８０℃にて２分間加熱して、ｃＤＮＡをビーズから脱着させ、そしてすぐにＭＰＳ上に置いた。ｃＤＮＡを含有する上清を新たなチューブに移し、そして−２０℃で貯蔵した。
表ＩＸは、Ｐ５０３ＳでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞の捕捉のパーセントをＲＴ−ＰＣＲにより測定した結果を示す。
【０７０５】
【表１１】

【０７０６】
上記したことから、本発明の特定の態様を明細書中に説明のために記載したけれども、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく種々の改変をなし得ることが分かるであろう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によって以外は制限されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、対照の線維芽細胞に比較して、代表的な前立腺−特異的ポリペプチドＰ５０２Ｓを発現する線維芽細胞を殺害するＴ細胞の能力を示す。％溶解性は、示されるように、一連のエフェクター：標的物の比として示される。
【図２Ａ】
図２Ａは、代表的な前立腺−特異的ポリペプチドｐ５０２Ｓを発現する細胞を認識するＴ細胞の能力を示す。個々の場合、γ−インターフェロンスポットの数が、異なった数の応答体のために示される。図２Ａにおいては、データは、対照Ｅ７５ペプチドによりパルスされた線維芽細胞に比較して、Ｐ２Ｓ−１２ペプチドによりパルスされた線維芽細胞について示される。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、代表的な前立腺−特異的ポリペプチドｐ５０２Ｓを発現する細胞を認識するＴ細胞の能力を示す。個々の場合、γ−インターフェロンスポットの数が、異なった数の応答体のために示される。図２Ｂにおけては、データは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現する線維芽細胞に比較して、Ｐ５０２Ｓを発現する線維芽細胞について示される。
【図３】
図３は、Ｐ５０１Ｓに由来するＰ１Ｓ＃１０ペプチドがＨＬＡ−Ａ２を結合することを示すペプチド競争結合アッセイを示す。ペプチドＰ１Ｓ＃１０は、ＴＮＦ開始バイオアッセイにおいてＤ１５０Ｍ５８をＣＴＬクローン化するためにＦｌｕ　Ｍ５８ペプチドＨＬＡ−Ａ２制限された提供を阻害する。Ｄ１５０Ｍ５８ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２結合インフルエンザマトリックスペプチドＦｌｕＭ５８に対して特異的である。
【図４】
図４は、ＥＧＦＰ−トランスダクトされたＪｕｒｋａｔＡ２Ｋｂに比較して、Ｐ１Ｓ＃１０−パルスされたＪｕｒｋａｔＡ２ｋｂ標的物及びＰ５０１Ｓ−トランスダクトされたＪｕｒｋａｔＡ２ｋｂ標的物を特異的に溶解する、Ｐ１Ｓ＃１０免疫化されたマウスから生成されたＴ細胞の能力を示す。％溶解率は、示されるように一連のエフェクター：標的物の比として示される。
【図５】
図５は、代表的な前立腺−特異的ポリペプチドＰ５０１Ｓを発現するＪｕｒｋａｔＡ２ｋｂ細胞を認識し、そして特異的に溶解するＴ細胞クローンの能力を示して、それにより、Ｐ１Ｓ＃１０ペプチドがｐ５０１Ｓポリペプチドの天然においてプロセッシングされたエピトープであり得ることを示す。
【図６Ａ】
図６Ａは、代表的な前立腺−特異的抗原（Ｐ５０１Ｓ）に対するＣＤ８^＋細胞系（３Ａ−１）の特異性を示すグラフである。図６Ａは、^５１Ｃｒ開放アッセイの結果を示す。％特異的溶解率は、示されるように一連のエフェクター：標的物の比として示される。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、代表的な前立腺−特異的抗原（Ｐ５０１Ｓ）に対するＣＤ８^＋細胞系（３Ａ−１）の特異性を示すグラフである。図６Ｂは、示されるような種々のエフェクター：標的物の比で、Ｐ５０１Ｓによりトランスダクトされた自己由来のＢ−ＬＣＬにより刺激された３Ａ−１細胞によるインターフェロン−γの生成を示す。
【図７】
図７は、バキュロウィルスにおけるＰ５０１Ｓの発現を示すウェスターンブロットである。
【図８】
図８は、Ｐ５０１Ｓに対するエピトープマッピング研究の結果を示す。
【図９】
図９は、トランスメンブランドメイン、及び予測される細胞内及び細胞外ドメインの位置を示すＰ５０１Ｓタンパク質の図示である。
【図１０】
図１０は、染色体２２ｑ１１．２のＣａｔＥｙｅＳｙｎｄｒｏｍｅ領域内の前立腺遺伝子Ｐ７７５Ｐ、Ｐ７０４Ｐ，Ｂ３０５Ｄ，Ｐ７１２Ｐ及びＰ７７４Ｐの位置を示すゲノム地図である。
【図１１】
図１１は、Ｐ５０１Ｓに対して生ぜしめられたウサギポリクローナル抗血清の特異性を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１２Ａ（１）】
図１２Ａ（１）は、クローンＰ７８８Ｐのための全長ｃＤＮＡ（配列番号７７７）の部分を示す図である。
【図１２Ａ（２）】
図１２Ａ（２）は、クローンＰ７８８Ｐのための全長ｃＤＮＡ（配列番号７７７）の部分を示す図である。
【図１２Ａ（３）】
図１２Ａ（３）は、クローンＰ７８８Ｐのための全長ｃＤＮＡ（配列番号７７７）の部分を示す図である。
【図１２Ｂ】
図１２Ｂは、クローンＰ７８８Ｐのための全長ｃＤＮＡ（配列番号７７７）から予測されるアミノ酸配列（配列番号７７８）を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION:
The present invention relates generally to the treatment and diagnosis of cancer, eg, prostate cancer. The invention more particularly relates to polypeptides comprising at least a portion of a prostate-specific protein, and polynucleotides encoding such polypeptides. Such polypeptides and polynucleotides are useful in pharmaceutical compositions, such as vaccines, and other compositions for the diagnosis and treatment of prostate cancer.
[0002]
Background of the Invention:
Cancer is a significant health problem worldwide. Although advances have been made in the detection and treatment of cancer, vaccines or other generally successful methods of prevention or treatment are not available. Current treatments, which are generally based on a combination of chemotherapy or surgery and radiation, have proven inadequate in many patients.
Prostate cancer is the most common form of cancer in male problems, and an estimated 30% incidence in men over the age of 50. Overwhelming clinical evidence has the property that human prostate cancer has the potential to metastasize to bone, and that the disease inevitably progresses from an androgen-dependent to an androgen-refractory state, leading to increased patient mortality Show what seems like. This common illness is currently the second leading cause of cancer deaths among men in the United States.
[0003]
Despite considerable research into treatment for disease, prostate cancer remains difficult to treat. Usually, treatment is based on surgery and / or radiation therapy, but those methods are ineffective in a significant proportion of patients. Two previously identified prostate-specific proteins, prostate-specific antigen (PSA), and prostate (PSA), and prostate phosphatase (PAP) have limited therapeutic and diagnostic potential. For example, PSA levels do not always correlate well with the presence of prostate cancer and are positive in the proportion of non-prostate patients, eg, benign prostatic hyperplasia (BPH). In addition, PSA measurements correlate with prostate volume and do not indicate the level of metastasis.
[0004]
Despite considerable research into treatment for these and other cancers, prostate cancer remains difficult to diagnose and treat effectively. Thus, there is a need in the art for improved methods for detecting and treating such cancers. The present invention fulfills those needs, and further provides other related advantages.
[0005]
SUMMARY OF THE INVENTION:
In one aspect, the invention provides (a) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340- 375, 381, 382 and 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880-882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942;
(B) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and the complement of the sequence provided in 942;
[0006]
(C) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and a sequence consisting of at least 20 contiguous residues of the sequences provided in 942;
(D) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942, a sequence that hybridizes under moderately stringent conditions;
[0007]
(E) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- Sequences having at least 75% identity to the sequences of 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942;
(F) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- Sequences having at least 90% identity to the sequences of 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942;
[0008]
(G) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and degenerate variants of the sequences provided in 942;
A polynucleotide composition comprising a sequence selected from the group consisting of:
[0009]
In one preferred embodiment, the polynucleotide compositions of the present invention have levels at least about 2-fold, preferably at least about 5-fold, and most preferably at least about 10-fold higher than levels for other normal tissues. , At least about 20%, more preferably at least about 30% and most preferably at least about 50% of the prostate tissue sample being tested.
In another aspect, the present invention provides a polypeptide composition comprising an amino acid sequence encoded by the above polynucleotide sequence.
[0010]
The invention further provides SEQ ID NOs: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522. 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 706-708, 775, 776, 778, 780, 781, 811, 814, 818, 826, 827 853, 855, 858, 860-862, 866-877, 879, 883-893, 895, 897, 898, 909-915, 920-928, 923-934, 940, 941 and 943. Comprising an amino sequence selected from Provided is a polypeptide composition.
In certain preferred embodiments, the polypeptides and / or polynucleotides of the invention are immunogenic, ie, they are immune response, particularly humoral and / or cellular, as described further herein. A sexual immune response can be elicited.
[0011]
The present invention further provides fragments, variants and / or derivatives of the disclosed polypeptide and / or polynucleotide sequences, wherein said fragments, variants and / or derivatives are preferably 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553 568, 573-586, 588-590, 592, 706-708, 775, 776, 778, 780, 781, 811, 814, 818, 826, 827, 853, 855, 858, and 860-862. A peptide sequence, or
[0012]
Sequence number: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476, 524, 526 , 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880-882, 894 , 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942, at least about 50%, preferably at least about 70%, of the level of immunogenic activity of the polypeptide sequence encoded by the polynucleotide sequence set forth in % And more preferably less It has a level of immunogenic activity of at least about 90%.
[0013]
The present invention further provides polynucleotides encoding the above polypeptides, expression vectors comprising such polynucleotides, and host cells transformed or transfected with such expression vectors.
In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a polypeptide or polynucleotide as described above, and a physiologically acceptable carrier.
In a related related aspect of the invention, there is provided a pharmaceutical composition, eg, a vaccine composition, for prophylactic or therapeutic use. Such compositions generally comprise the immunogenic polypeptide or polynucleotide of the invention, and an immunostimulant, such as an adjuvant, and a physiologically acceptable carrier.
[0014]
The invention further provides a pharmaceutical composition comprising (a) an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a polypeptide of the invention, or a fragment thereof; and (b) a physiologically acceptable carrier. I will provide a.
In a further aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising (a) an antigen-presenting cell that expresses a polypeptide as described above, and (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Typical antigen presenting cells include dendritic cells, macrophages, monocytes, fibroblasts and B cells.
In a related aspect, there is provided a pharmaceutical composition comprising (a) an antigen-providing cell that expresses a polypeptide as described above, and (b) an immunostimulatory agent.
[0015]
In another aspect, the invention further relates to fusion proteins comprising at least one polypeptide as described above, and polynucleotides encoding such fusion proteins, typically physiologically acceptable. Pharmaceutical compositions are provided that comprise a carrier and / or an immunostimulant.
In another aspect, the invention further relates to fusion proteins comprising at least one polypeptide as described above, and polynucleotides encoding such fusion proteins, typically physiologically acceptable. It is provided in the form of a pharmaceutical composition comprising a carrier and / or an immunostimulant, for example a vaccine composition. The fusion protein comprises a plurality of immunogenic polypeptides or proteins / variants thereof as described above, and further to promote and / or enhance expression, purification and / or immunogenicity of the polypeptide. May comprise one or more polypeptide segments.
[0016]
In a further aspect, the invention provides a method comprising administering a pharmaceutical composition as described herein, for stimulating an immune responsiveness in a patient, preferably a T cell response in a human patient. I do. The patient has prostate cancer, in which case the method provides for treatment of the disease, or a patient suspected of being at risk for such disease can be treated prophylactically.
In a further aspect, the present invention provides a method for inhibiting the progression of cancer in a patient, comprising administering to the patient a pharmaceutical composition as described above. The patient has prostate cancer, in which case the method provides for treatment of the disease, or a patient suspected of being at risk for such disease can be treated prophylactically.
[0017]
In another aspect, the present invention further provides for removing tumor cells from a biological sample, comprising contacting the biological sample with T cells that specifically react with a polypeptide of the present invention. Wherein the contacting step is performed under conditions and for a time sufficient to allow removal of cells expressing the polypeptide from the sample.
In a related aspect, there is provided a method for inhibiting the progression of cancer in a patient, comprising administering to the patient a biological sample processed as described above.
[0018]
In another aspect, the invention further provides (a) (i) a polypeptide comprising at least an immunogenic portion of a polypeptide disclosed herein; (ii) encoding such a polypeptide. A polynucleotide; and (iii) CD4 isolated from the patient, together with one or more components of an antigen presenting cell expressing such a polypeptide.⁺And / or CD8⁺ Incubating the T cells; and (b) administering to the patient an effective amount of the expanded T cells, thereby inhibiting the progression of the cancer in the patient, comprising the step of inhibiting the progression of the cancer in the patient. A method for inhibiting is provided. The expanded cells can be, but need not be, cloned prior to administration to the patient.
[0019]
In a further aspect, the present invention provides a method for determining the presence or absence of a cancer, preferably prostate cancer, in a patient, wherein said method comprises the steps of (a) determining the presence or absence of a biological sample obtained from the patient. Contacting with a binding agent that binds to the polypeptide shown above; (b) detecting in the sample the amount of polypeptide that binds to the binding agent; and (c) determining the amount of the polypeptide in advance. Comparing to the determined cut-off value, and then determining the presence or absence of cancer in the patient. In a preferred embodiment, the binding agent is an antibody, more preferably a monoclonal antibody.
[0020]
In another aspect, the invention also provides a method for monitoring cancer progression in a patient. Such methods include (a) contacting a biological sample obtained from a patient at a first point with a binding agent that binds a polypeptide as described above; (b) binding to the binding agent. (C) repeating steps (a) and (b) with a biological sample obtained from the patient at a subsequent point; and (d) step (c). C.) Comparing the amount of the polypeptide detected in step (b) with the amount detected in step (b), and then monitoring the progression of the cancer in the patient.
[0021]
In another aspect, the present invention provides a method for determining the presence or absence of cancer in a patient, wherein the method comprises the steps of (a) obtaining a biological sample obtained from the patient; Contacting the oligonucleotide with the oligonucleotide that hybridizes to the nucleotide; (b) detecting in the sample the level of the polynucleotide that hybridizes to the oligonucleotide, preferably mRNA; and (c) detecting the level of the polynucleotide that hybridizes to the oligonucleotide. Comparing the level to a predetermined cut-off value, and then determining the presence or presence of cancer in the patient.
[0022]
In certain embodiments, the amount of mRNA is detected by a polymerase chain reaction, for example, using at least one oligonucleotide primer that hybridizes to a polynucleotide of the invention, or the complement of such a polynucleotide. In other embodiments, the amount of mRNA is detected by hybridization techniques using an oligonucleotide probe that hybridizes to a polynucleotide of the invention or the complement of such a polynucleotide.
[0023]
In a related aspect, there is provided a method for monitoring the progression of cancer in a patient, said method comprising: (a) hybridizing to a polynucleotide of the invention with a biological sample obtained from the patient. (B) detecting in said sample the amount of polynucleotide that hybridizes to said oligonucleotide; and (c) using a biological sample obtained from the patient at a subsequent point in the step ( repeating a) and (b); and (d) comparing the amount of polynucleotide detected in step (c) with the amount detected in step (b), and then comparing the amount of cancer in the patient. Monitoring the progress.
[0024]
In a further aspect, the invention provides antibodies, eg, monoclonal antibodies, that bind to a polypeptide as described above, and diagnostic kits comprising such antibodies. A diagnostic kit comprising one or more oligonucleotide probes or primers as described above is also provided.
These and other aspects of the invention will become apparent based on the following specific description. All references disclosed herein are incorporated herein by reference.
[0025]
SEQ ID NO: 1 is the determined cDNA sequence for F1-13.
SEQ ID NO: 2 is the determined 3 'cDNA sequence for F1-12.
SEQ ID NO: 3 is the determined 5 'cDNA sequence for F1-12.
SEQ ID NO: 4 is the determined 3 'cDNA sequence for F1-16.
SEQ ID NO: 5 is the determined 3 'cDNA sequence for H1-1.
SEQ ID NO: 6 is the determined 3 'cDNA sequence for H1-9.
SEQ ID NO: 7 is the determined 3 'cDNA sequence for H1-4.
SEQ ID NO: 8 is the determined 3 'cDNA sequence for J1-17.
SEQ ID NO: 9 is the determined 5 'cDNA sequence for J1-17.
SEQ ID NO: 10 is the determined 3 'cDNA sequence for L1-12.
[0026]
SEQ ID NO: 11 is the determined 5 'cDNA sequence for L1-12.
SEQ ID NO: 12 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1862.
SEQ ID NO: 13 is the determined 5 'cDNA sequence for N1-1862.
SEQ ID NO: 14 is the determined 3 'cDNA sequence for J1-13.
SEQ ID NO: 15 is the determined 5 'cDNA sequence for J1-13.
SEQ ID NO: 16 is the determined 3 'cDNA sequence for J1-19.
SEQ ID NO: 17 is the determined 5 'cDNA sequence for J1-19.
SEQ ID NO: 18 is the determined 3 'cDNA sequence for J1-25.
SEQ ID NO: 19 is the determined 5 'cDNA sequence for J1-25.
SEQ ID NO: 20 is the determined 5 'cDNA sequence for J1-24.
[0027]
SEQ ID NO: 21 is the determined 3 'cDNA sequence for J1-24.
SEQ ID NO: 22 is the determined 5 'cDNA sequence for K1-58.
SEQ ID NO: 23 is the determined 3 'cDNA sequence for K1-58.
SEQ ID NO: 24 is the determined 5 'cDNA sequence for K1-63.
SEQ ID NO: 25 is the determined 3 'cDNA sequence for K1-63.
SEQ ID NO: 26 is the determined 5 'cDNA sequence for L1-4.
SEQ ID NO: 27 is the determined 3 'cDNA sequence for L1-4.
SEQ ID NO: 28 is the determined 5 'cDNA sequence for L1-14.
SEQ ID NO: 29 is the determined 3 'cDNA sequence for L1-14.
SEQ ID NO: 30 is the determined 3 'cDNA sequence for J1-12.
[0028]
SEQ ID NO: 31 is the determined 3 'cDNA sequence for J1-16.
SEQ ID NO: 32 is the determined 3 'cDNA sequence for J1-21.
SEQ ID NO: 33 is the determined 3 'cDNA sequence for K1-48.
SEQ ID NO: 34 is the determined 3 'cDNA sequence for K1-55.
SEQ ID NO: 35 is the determined 3 'cDNA sequence for L1-2.
SEQ ID NO: 36 is the determined 3 'cDNA sequence for L1-6.
SEQ ID NO: 37 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1858.
SEQ ID NO: 38 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1860.
SEQ ID NO: 39 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1861.
SEQ ID NO: 40 is the determined 3 'cDNA sequence for N1-1864.
[0029]
SEQ ID NO: 41 is the determined cDNA sequence for P5.
SEQ ID NO: 42 is the determined cDNA sequence for P8.
SEQ ID NO: 43 is the determined cDNA sequence for P9.
SEQ ID NO: 44 is the determined cDNA sequence for P18.
SEQ ID NO: 45 is the determined cDNA sequence for P20.
SEQ ID NO: 46 is the determined cDNA sequence for P29.
SEQ ID NO: 47 is the determined cDNA sequence for P30.
SEQ ID NO: 48 is the determined cDNA sequence for P34.
SEQ ID NO: 49 is the determined cDNA sequence for P36.
SEQ ID NO: 50 is the determined cDNA sequence for P38.
[0030]
SEQ ID NO: 51 is the determined cDNA sequence for P39.
SEQ ID NO: 52 is the determined cDNA sequence for P42.
SEQ ID NO: 53 is the determined cDNA sequence for P47.
SEQ ID NO: 54 is the determined cDNA sequence for P49.
SEQ ID NO: 55 is the determined cDNA sequence for P50.
SEQ ID NO: 56 is the determined cDNA sequence for P53.
SEQ ID NO: 57 is the determined cDNA sequence for P55.
SEQ ID NO: 58 is the determined cDNA sequence for P60.
[0031]
SEQ ID NO: 59 is the determined cDNA sequence for P64.
SEQ ID NO: 60 is the determined cDNA sequence for P65.
SEQ ID NO: 61 is the determined cDNA sequence for P73.
SEQ ID NO: 62 is the determined cDNA sequence for P75.
SEQ ID NO: 63 is the determined cDNA sequence for P76.
SEQ ID NO: 64 is the determined cDNA sequence for P79.
SEQ ID NO: 65 is the determined cDNA sequence for P84.
SEQ ID NO: 66 is the determined cDNA sequence for P68.
SEQ ID NO: 67 is the determined cDNA sequence for P80 (also referred to as P704P).
SEQ ID NO: 68 is the determined cDNA sequence for P82.
SEQ ID NO: 69 is the determined cDNA sequence for U1-3064.
SEQ ID NO: 70 is the determined cDNA sequence for U1-3065.
[0032]
SEQ ID NO: 71 is the determined cDNA sequence for V1-3692.
SEQ ID NO: 72 is the determined cDNA sequence for 1A-3905.
SEQ ID NO: 73 is the determined cDNA sequence for V1-3686.
SEQ ID NO: 74 is the determined cDNA sequence for R1-2330.
SEQ ID NO: 75 is the determined cDNA sequence for 1B-3976.
SEQ ID NO: 76 is the determined cDNA sequence for V1-3679.
SEQ ID NO: 77 is the determined cDNA sequence for 1G-4736.
SEQ ID NO: 78 is the determined cDNA sequence for 1G-4738.
SEQ ID NO: 79 is the determined cDNA sequence for 1G-4741.
SEQ ID NO: 80 is the determined cDNA sequence for 1G-4744.
[0033]
SEQ ID NO: 81 is the determined cDNA sequence for 1G-4733.
SEQ ID NO: 82 is the determined cDNA sequence for 1H-4774.
SEQ ID NO: 83 is the determined cDNA sequence for 1H-4781.
SEQ ID NO: 84 is the determined cDNA sequence for 1H-4785.
SEQ ID NO: 85 is the determined cDNA sequence for 1H-4787.
SEQ ID NO: 86 is the determined cDNA sequence for 1H-4796.
SEQ ID NO: 87 is the determined cDNA sequence for 1I-4807.
SEQ ID NO: 88 is the determined cDNA sequence for 1I-4810.
SEQ ID NO: 89 is the determined cDNA sequence for 1I-4811.
SEQ ID NO: 90 is the determined cDNA sequence for 1J-4876.
[0034]
SEQ ID NO: 91 is the determined cDNA sequence for 1K-4884.
SEQ ID NO: 92 is the determined cDNA sequence for 1K-4896.
SEQ ID NO: 93 is the determined cDNA sequence for 1G-4761.
SEQ ID NO: 94 is the determined cDNA sequence for 1G-4762.
SEQ ID NO: 95 is the determined cDNA sequence for 1H-4766.
SEQ ID NO: 96 is the determined cDNA sequence for 1H-4770.
SEQ ID NO: 97 is the determined cDNA sequence for 1H-4771.
SEQ ID NO: 98 is the determined cDNA sequence for 1H-4772.
SEQ ID NO: 99 is the determined cDNA sequence for 1D-4297.
SEQ ID NO: 100 is the determined cDNA sequence for 1D-4309.
[0035]
SEQ ID NO: 101 is a 1D. The determined cDNA sequence for 1-4278.
SEQ ID NO: 102 is the determined cDNA sequence for 1D-4288.
SEQ ID NO: 103 is the determined cDNA sequence for 1D-4283.
SEQ ID NO: 104 is the determined cDNA sequence for 1D-4304.
SEQ ID NO: 105 is the determined cDNA sequence for 1D-4296.
SEQ ID NO: 106 is the determined cDNA sequence for 1D-4280.
SEQ ID NO: 107 is the determined full length cDNA sequence for F1-12 (also referred to as P504S).
SEQ ID NO: 108 is the predicted amino acid sequence for F1-12.
SEQ ID NO: 109 is the determined full length cDNA sequence for J1-17. SEQ ID NO: 110 is the determined full length cDNA sequence for L1-12 (also referred to as P501S).
[0036]
SEQ ID NO: 111 is the determined full length cDNA sequence for N1-1862 (also referred to as P503S).
SEQ ID NO: 112 is the predicted amino acid sequence for J1-17.
SEQ ID NO: 113 is the predicted amino acid sequence for L1-12 (also referred to as P501S).
SEQ ID NO: 114 is the predicted amino acid sequence for N1-1862 (also referred to as P503S).
SEQ ID NO: 115 is the determined cDNA sequence for P89.
SEQ ID NO: 116 is the determined cDNA sequence for P90.
SEQ ID NO: 117 is the determined cDNA sequence for P92.
SEQ ID NO: 118 is the determined cDNA sequence for P95.
SEQ ID NO: 119 is the determined cDNA sequence for P98.
SEQ ID NO: 120 is the determined cDNA sequence for P102.
[0037]
SEQ ID NO: 121 is the determined cDNA sequence for P110.
SEQ ID NO: 122 is the determined cDNA sequence for P111.
SEQ ID NO: 123 is the determined cDNA sequence for P114.
SEQ ID NO: 124 is the determined cDNA sequence for P115.
SEQ ID NO: 125 is the determined cDNA sequence for P116.
SEQ ID NO: 126 is the determined cDNA sequence for P124.
SEQ ID NO: 127 is the determined cDNA sequence for P126.
SEQ ID NO: 128 is the determined cDNA sequence for P130.
SEQ ID NO: 129 is the determined cDNA sequence for P133.
SEQ ID NO: 130 is the determined cDNA sequence for P138.
[0038]
SEQ ID NO: 131 is the determined cDNA sequence for P143.
SEQ ID NO: 132 is the determined cDNA sequence for P151.
SEQ ID NO: 133 is the determined cDNA sequence for P156.
SEQ ID NO: 134 is the determined cDNA sequence for P157.
SEQ ID NO: 135 is the determined cDNA sequence for P166.
SEQ ID NO: 136 is the determined cDNA sequence for P176.
SEQ ID NO: 137 is the determined cDNA sequence for P178.
SEQ ID NO: 138 is the determined cDNA sequence for P179.
SEQ ID NO: 139 is the determined cDNA sequence for P185.
SEQ ID NO: 140 is the determined cDNA sequence for P192.
[0039]
SEQ ID NO: 141 is the determined cDNA sequence for P201.
SEQ ID NO: 142 is the determined cDNA sequence for P204.
SEQ ID NO: 143 is the determined cDNA sequence for P208.
SEQ ID NO: 144 is the determined cDNA sequence for P211.
SEQ ID NO: 145 is the determined cDNA sequence for P213
SEQ ID NO: 146 is the determined cDNA sequence for P219.
SEQ ID NO: 147 is the determined cDNA sequence for P237.
SEQ ID NO: 148 is the determined cDNA sequence for P239.
SEQ ID NO: 149 is the determined cDNA sequence for P248.
SEQ ID NO: 150 is the determined cDNA sequence for P251.
[0040]
SEQ ID NO: 151 is the determined cDNA sequence for P255.
SEQ ID NO: 152 is the determined cDNA sequence for P256.
SEQ ID NO: 153 is the determined cDNA sequence for P259.
SEQ ID NO: 154 is the determined cDNA sequence for P260.
SEQ ID NO: 155 is the determined cDNA sequence for P263.
SEQ ID NO: 156 is the determined cDNA sequence for P264.
SEQ ID NO: 157 is the determined cDNA sequence for P266.
SEQ ID NO: 158 is the determined cDNA sequence for P270.
SEQ ID NO: 159 is the determined cDNA sequence for P272.
SEQ ID NO: 160 is the determined cDNA sequence for P278.
[0041]
SEQ ID NO: 161 is the determined cDNA sequence for P105.
SEQ ID NO: 162 is the determined cDNA sequence for P107.
SEQ ID NO: 163 is the determined cDNA sequence for P137.
SEQ ID NO: 164 is the determined cDNA sequence for P194.
SEQ ID NO: 165 is the determined cDNA sequence for P195.
SEQ ID NO: 166 is the determined cDNA sequence for P196.
SEQ ID NO: 167 is the determined cDNA sequence for P220.
SEQ ID NO: 168 is the determined cDNA sequence for P234.
SEQ ID NO: 169 is the determined cDNA sequence for P235.
SEQ ID NO: 170 is the determined cDNA sequence for P243.
[0042]
SEQ ID NO: 171 is the determined cDNA sequence for P703P-DE1.
SEQ ID NO: 172 is the predicted amino acid sequence for P703P-DE1.
SEQ ID NO: 173 is the determined cDNA sequence for P703P-DE2.
SEQ ID NO: 174 is the determined cDNA sequence for P703P-DE6.
SEQ ID NO: 175 is the determined cDNA sequence for P703P-DE13.
SEQ ID NO: 176 is the predicted amino acid sequence for P703P-DE13.
SEQ ID NO: 177 is the determined cDNA sequence for P703P-DE4.
SEQ ID NO: 178 is the predicted amino acid sequence for P703P-DE14.
SEQ ID NO: 179 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4736.
SEQ ID NO: 180 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4738.
[0043]
SEQ ID NO: 181 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4741.
SEQ ID NO: 182 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4744.
SEQ ID NO: 183 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4774.
SEQ ID NO: 184 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4781.
SEQ ID NO: 185 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4785.
SEQ ID NO: 186 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4787.
SEQ ID NO: 187 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4796.
SEQ ID NO: 188 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4807.
SEQ ID NO: 189 is the determined 3 'cDNA sequence for 1I-4810.
SEQ ID NO: 190 is the determined 3 'cDNA sequence for 1I-4811.
[0044]
SEQ ID NO: 191 is the determined extended cDNA sequence for 1J-4876.
SEQ ID NO: 192 is the determined extended cDNA sequence for 1K-4844.
SEQ ID NO: 193 is the determined extended cDNA sequence for 1K-4896.
SEQ ID NO: 194 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4761.
SEQ ID NO: 195 is the determined extended cDNA sequence for 1G-4762.
SEQ ID NO: 196 is the determined extended cDNA sequence for 1H-4766.
SEQ ID NO: 197 is the determined 3 'cDNA sequence for 1H-4770.
SEQ ID NO: 198 is the determined 3 'cDNA sequence for 1H-4771.
SEQ ID NO: 199 is the determined extended cDNA sequence for 1H-4772.
SEQ ID NO: 200 is the determined extended cDNA sequence for 1D-4309.
[0045]
SEQ ID NO: 201 is a 1D. The determined extended cDNA sequence for 1-4278.
SEQ ID NO: 202 is the determined extended cDNA sequence for 1D-4288.
SEQ ID NO: 203 is the determined extended cDNA sequence for 1D-4283.
SEQ ID NO: 204 is the determined extended cDNA sequence for 1D-4304.
SEQ ID NO: 205 is the determined extended cDNA sequence for 1D-4296.
SEQ ID NO: 206 is the determined extended cDNA sequence for 1D-4280.
SEQ ID NO: 207 is the determined cDNA sequence for 10-d8fwd.
SEQ ID NO: 208 is the determined cDNA sequence for 10-h10con.
SEQ ID NO: 209 is the determined cDNA sequence for 11-C8rew.
SEQ ID NO: 210 corresponds to The determined cDNA sequence for g6fwd.
[0046]
SEQ ID NO: 211 is 7. The determined cDNA sequence for g6rev.
SEQ ID NO: 212 is the determined cDNA sequence for 8-b5fwd.
SEQ ID NO: 213 is the determined cDNA sequence for 8-b5rev.
SEQ ID NO: 214 is the determined cDNA sequence for 8-b6fwd.
SEQ ID NO: 215 is the determined cDNA sequence for 8-b6rev.
SEQ ID NO: 216 is the determined cDNA sequence for 8-d4fwd.
SEQ ID NO: 217 is the determined cDNA sequence for 8-d9rev.
SEQ ID NO: 218 is the determined cDNA sequence for 8-g3fwd.
SEQ ID NO: 219 is the determined cDNA sequence for 8-g3rev.
SEQ ID NO: 220 is the determined cDNA sequence for 8-h11rev.
[0047]
SEQ ID NO: 221 is the determined cDNA sequence for g-f12fwd.
SEQ ID NO: 222 is the determined cDNA sequence for g-f3rev.
SEQ ID NO: 223 is the determined cDNA sequence for P509S.
SEQ ID NO: 224 is the determined cDNA sequence for P510S.
SEQ ID NO: 225 is the determined cDNA sequence for P703DE5.
SEQ ID NO: 226 is the determined cDNA sequence for 9-A11.
SEQ ID NO: 227 is the determined cDNA sequence for 8-C6.
SEQ ID NO: 228 is the determined cDNA sequence for 8-H7.
SEQ ID NO: 229 is the determined cDNA sequence for JPTPN13.
SEQ ID NO: 230 is the determined cDNA sequence for JPTPN14.
[0048]
SEQ ID NO: 231 is the determined cDNA sequence for JPTPN23.
SEQ ID NO: 232 is the determined cDNA sequence for JPTPN24.
SEQ ID NO: 233 is the determined cDNA sequence for JPTPN25.
SEQ ID NO: 234 is the determined cDNA sequence for JPTPN30.
SEQ ID NO: 235 is the determined cDNA sequence for JPTPN34.
SEQ ID NO: 236 is the determined cDNA sequence for JPTPN35.
SEQ ID NO: 237 is the determined cDNA sequence for JPTPN36.
SEQ ID NO: 238 is the determined cDNA sequence for JPTPN38.
SEQ ID NO: 239 is the determined cDNA sequence for JPTPN39.
SEQ ID NO: 240 is the determined cDNA sequence for JPTPN40.
[0049]
SEQ ID NO: 241 is the determined cDNA sequence for JPTPN41.
SEQ ID NO: 242 is the determined cDNA sequence for JPTPN42.
SEQ ID NO: 243 is the determined cDNA sequence for JPTPN45.
SEQ ID NO: 244 is the determined cDNA sequence for JPTPN46.
SEQ ID NO: 245 is the determined cDNA sequence for JPTPN51.
SEQ ID NO: 246 is the determined cDNA sequence for JPTPN56.
SEQ ID NO: 247 is the determined cDNA sequence for JPTPN64.
SEQ ID NO: 248 is the determined cDNA sequence for JPTPN65.
SEQ ID NO: 249 is the determined cDNA sequence for JPTPN67.
SEQ ID NO: 250 is the determined cDNA sequence for JPTPN76.
[0050]
SEQ ID NO: 251 is the determined cDNA sequence for JPTPN84.
SEQ ID NO: 252 is the determined cDNA sequence for JPTPN85.
SEQ ID NO: 253 is the determined cDNA sequence for JPTPN86.
SEQ ID NO: 254 is the determined cDNA sequence for JPTPN87.
SEQ ID NO: 255 is the determined cDNA sequence for JPTPN88.
SEQ ID NO: 256 is the determined cDNA sequence for JP1F1.
SEQ ID NO: 257 is the determined cDNA sequence for JP1F2.
SEQ ID NO: 258 is the determined cDNA sequence for JP1C2.
SEQ ID NO: 259 is the determined cDNA sequence for JP1B1.
SEQ ID NO: 260 is the determined cDNA sequence for JP1B2.
[0051]
SEQ ID NO: 261 is the determined cDNA sequence for JP1D3.
SEQ ID NO: 262 is the determined cDNA sequence for JP1A4.
SEQ ID NO: 263 is the determined cDNA sequence for JP1F5.
SEQ ID NO: 264 is the determined cDNA sequence for JP1E6.
SEQ ID NO: 265 is the determined cDNA sequence for JP1D6.
SEQ ID NO: 266 is the determined cDNA sequence for JP1B1.
SEQ ID NO: 267 is the determined cDNA sequence for JP1A6.
SEQ ID NO: 268 is the determined cDNA sequence for JP1E8.
SEQ ID NO: 269 is the determined cDNA sequence for JP1D7.
SEQ ID NO: 270 is the determined cDNA sequence for JP1D9.
[0052]
SEQ ID NO: 271 is the determined cDNA sequence for JP1C10.
SEQ ID NO: 272 is the determined cDNA sequence for JP1A9.
SEQ ID NO: 273 is the determined cDNA sequence for JP1F12.
SEQ ID NO: 274 is the determined cDNA sequence for JP1E12.
SEQ ID NO: 275 is the determined cDNA sequence for JP1D11.
SEQ ID NO: 276 is the determined cDNA sequence for JP1C11.
SEQ ID NO: 277 is the determined cDNA sequence for JP1C12.
SEQ ID NO: 278 is the determined cDNA sequence for JP1B12.
SEQ ID NO: 279 is the determined cDNA sequence for JP1A12.
SEQ ID NO: 280 is the determined cDNA sequence for JP8G2.
[0053]
SEQ ID NO: 281 is the determined cDNA sequence for JP8H1.
SEQ ID NO: 282 is the determined cDNA sequence for JP8H2.
SEQ ID NO: 283 is the determined cDNA sequence for JP8A2.
SEQ ID NO: 284 is the determined cDNA sequence for JP8A4.
SEQ ID NO: 285 is the determined cDNA sequence for JP8C3.
SEQ ID NO: 286 is the determined cDNA sequence for JP8G4.
SEQ ID NO: 287 is the determined cDNA sequence for JP8B6.
SEQ ID NO: 288 is the determined cDNA sequence for JP8D6.
SEQ ID NO: 289 is the determined cDNA sequence for JP8F5.
SEQ ID NO: 290 is the determined cDNA sequence for JP8A8
[0054]
SEQ ID NO: 291 is the determined cDNA sequence for JP8C7.
SEQ ID NO: 292 is the determined cDNA sequence for JP8D7.
SEQ ID NO: 293 is the determined cDNA sequence for JP8D8.
SEQ ID NO: 294 is the determined cDNA sequence for JP8E7.
SEQ ID NO: 295 is the determined cDNA sequence for JP8F8.
SEQ ID NO: 296 is the determined cDNA sequence for JP8G8.
SEQ ID NO: 297 is the determined cDNA sequence for JP8B10.
SEQ ID NO: 298 is the determined cDNA sequence for JP8C10.
SEQ ID NO: 299 is the determined cDNA sequence for JP8E9.
SEQ ID NO: 300 is the determined cDNA sequence for JP8E10.
[0055]
SEQ ID NO: 301 is the determined cDNA sequence for JP8F9.
SEQ ID NO: 302 is the determined cDNA sequence for JP8H9.
SEQ ID NO: 303 is the determined cDNA sequence for JP8C12.
SEQ ID NO: 304 is the determined cDNA sequence for JP8E11.
SEQ ID NO: 305 is the determined cDNA sequence for JP8E12.
SEQ ID NO: 306 is the amino acid sequence for peptide PS2 # 12.
SEQ ID NO: 307 is the determined cDNA sequence for P711P.
SEQ ID NO: 308 is the determined cDNA sequence for P712P.
SEQ ID NO: 309 is the determined cDNA sequence for CLONE23.
SEQ ID NO: 310 is the determined cDNA sequence for P774P.
[0056]
SEQ ID NO: 311 is the determined cDNA sequence for P775P.
SEQ ID NO: 312 is the determined cDNA sequence for P715P.
SEQ ID NO: 313 is the determined cDNA sequence for P710P.
SEQ ID NO: 314 is the determined cDNA sequence for P767P.
SEQ ID NO: 315 is the determined cDNA sequence for P768P.
SEQ ID NOs: 316-325 are the determined cDNA sequences of the previously isolated genes.
SEQ ID NO: 326 is the determined cDNA sequence for P703PDE5.
SEQ ID NO: 327 is the predicted amino acid sequence for P703PDE5.
SEQ ID NO: 328 is the determined cDNA sequence for P703P6.26.
SEQ ID NO: 329 is the predicted amino acid sequence for P703P6.26.
SEQ ID NO: 330 is the determined cDNA sequence for P703PX-23
[0057]
SEQ ID NO: 331 is the predicted amino acid sequence for P703PX-23.
SEQ ID NO: 332 is the determined full length cDNA sequence for P509S.
SEQ ID NO: 333 is the determined extended cDNA sequence for P707P (also referred to as 11-C9).
SEQ ID NO: 334 is the determined cDNA sequence for P714P.
SEQ ID NO: 335 is the determined cDNA sequence for P705P (also referred to as 9-F3).
SEQ ID NO: 336 is the predicted amino acid sequence for P705P.
SEQ ID NO: 337 is the amino acid sequence of peptide P1S # 10.
SEQ ID NO: 338 is the amino acid sequence of peptide p5.
SEQ ID NO: 339 is the predicted amino acid sequence for P509S.
[0058]
SEQ ID NO: 340 is the determined cDNA sequence for P778P.
SEQ ID NO: 341 is the determined cDNA sequence for P786P.
SEQ ID NO: 342 is the determined cDNA sequence for P789P.
SEQ ID NO: 343 is the determined cDNA sequence for a clone that shows homology to Homo sapiens MM46 mRNA.
SEQ ID NO: 344 is the determined cDNA sequence for a clone that shows homology to Homo sapiens TNF-α stimulated ABC protein (ABC50) mRNA.
SEQ ID NO: 345 is the determined cDNA sequence for a clone that shows homology to Homo sapiens mRNA for E-cadherin
[0059]
SEQ ID NO: 346 is the determined cDNA sequence for a clone that exhibits homology to human nucleus-encoded mitochondrial serine hydroxymethyltransferase (SHMT).
SEQ ID NO: 347 is the determined cDNA sequence for a clone that shows homology to Homo sapiens natural resistance-related macrophage protein 2 (NRAMP2).
SEQ ID NO: 348 is the determined cDNA sequence for a clone that shows homology to Homo sapiens phosphoglucomutase-related protein (PGMRP).
SEQ ID NO: 349 is the determined cDNA sequence for a clone that shows homology to human mRNA for proteosomal subunit p40
SEQ ID NO: 350 is the determined cDNA sequence for P777P.
[0060]
SEQ ID NO: 351 is the determined cDNA sequence for P779P.
SEQ ID NO: 352 is the determined cDNA sequence for P790P.
SEQ ID NO: 353 is the determined cDNA sequence for P784P.
SEQ ID NO: 354 is the determined cDNA sequence for P776P.
SEQ ID NO: 355 is the determined cDNA sequence for P780P.
SEQ ID NO: 356 is the determined cDNA sequence for P544S.
SEQ ID NO: 357 is the determined cDNA sequence for P745S.
SEQ ID NO: 358 is the determined cDNA sequence for P782P.
SEQ ID NO: 359 is the determined cDNA sequence for P783P.
SEQ ID NO: 360 is the determined cDNA sequence for unknown 17984.
[0061]
SEQ ID NO: 361 is the determined cDNA sequence for P787P.
SEQ ID NO: 362 is the determined cDNA sequence for P788P.
SEQ ID NO: 363 is the determined cDNA sequence for unknown 17994.
SEQ ID NO: 364 is the determined cDNA sequence for P781P.
SEQ ID NO: 365 is the determined cDNA sequence for P785P.
SEQ ID NOs: 366-375 are the determined cDNA sequences for the splice variant of B305D.
SEQ ID NO: 376 is the predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 366.
SEQ ID NO: 377 is the predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 372.
[0062]
SEQ ID NO: 378 is the predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 378.
SEQ ID NO: 379 is the predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 374.
SEQ ID NO: 380 is the predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 375.
SEQ ID NO: 381 is the determined cDNA sequence for B716P.
SEQ ID NO: 382 is the determined full length cDNA sequence for P711P.
[0063]
SEQ ID NO: 383 is the predicted amino acid sequence for P711P.
SEQ ID NO: 384 is the cDNA sequence for P1000C.
SEQ ID NO: 385 is the cDNA sequence for CGI-82.
SEQ ID NO: 386 is the cDNA sequence for 23320.
SEQ ID NO: 387 is the cDNA sequence for CGI-69.
SEQ ID NO: 388 is the cDNA sequence for L-iditol-2-dehydrogenase.
SEQ ID NO: 389 is the cDNA sequence for 23379.
SEQ ID NO: 390 is the cDNA sequence for 23381.
[0064]
SEQ ID NO: 391 is the cDNA sequence for KIAA0122.
SEQ ID NO: 392 is the cDNA sequence for 23399.
SEQ ID NO: 393 is the cDNA sequence for the previously identified gene.
SEQ ID NO: 394 is the cDNA sequence for HCLBP.
SEQ ID NO: 395 is the cDNA sequence for transglutaminase.
SEQ ID NO: 396 is the cDNA sequence for a previously identified gene.
SEQ ID NO: 397 is the cDNA sequence for PAP.
SEQ ID NO: 398 is the cDNA sequence for Ets transcription factor PDEFP.
SEQ ID NO: 399 is the cDNA sequence for hTGR.
SEQ ID NO: 400 is the cDNA sequence for KIAA0295.
[0065]
SEQ ID NO: 401 is the cDNA sequence for 22545.
SEQ ID NO: 402 is the cDNA sequence for 22547.
SEQ ID NO: 404 is the cDNA sequence for 22550.
SEQ ID NO: 405 is the cDNA sequence for 22551.
SEQ ID NO: 406 is the cDNA sequence for 22552.
SEQ ID NO: 407 is the cDNA sequence for 22553 (also referred to as P1020C).
SEQ ID NO: 408 is the cDNA sequence for 22558.
SEQ ID NO: 409 is the cDNA sequence for 22562.
SEQ ID NO: 410 is the cDNA sequence for 22565.
SEQ ID NO: 408 is the cDNA sequence for 22558.
SEQ ID NO: 409 is the cDNA sequence for 22562.
SEQ ID NO: 410 is the cDNA sequence for 22565.
[0066]
SEQ ID NO: 411 is the cDNA sequence for 22567.
SEQ ID NO: 412 is the cDNA sequence for 22568.
SEQ ID NO: 413 is the cDNA sequence for 22570.
SEQ ID NO: 414 is the cDNA sequence for 22571.
SEQ ID NO: 415 is the cDNA sequence for 22572.
SEQ ID NO: 416 is the cDNA sequence for 22573.
SEQ ID NO: 417 is the cDNA sequence for 22573.
SEQ ID NO: 418 is the cDNA sequence for 22575.
SEQ ID NO: 419 is the cDNA sequence for 22580.
SEQ ID NO: 420 is the cDNA sequence for 22581.
[0067]
SEQ ID NO: 421 is the cDNA sequence for 22852.
SEQ ID NO: 422 is the cDNA sequence for 22585.
SEQ ID NO: 423 is the cDNA sequence for 22584.
SEQ ID NO: 434 is the cDNA sequence for 22585.
SEQ ID NO: 425 is the cDNA sequence for 22586.
SEQ ID NO: 426 is the cDNA sequence for 22587.
SEQ ID NO: 427 is the cDNA sequence for 22588.
SEQ ID NO: 428 is the cDNA sequence for 22589.
SEQ ID NO: 429 is the cDNA sequence for 22590.
SEQ ID NO: 430 is the cDNA sequence for 22591.
[0068]
SEQ ID NO: 431 is the cDNA sequence for 22592.
SEQ ID NO: 432 is the cDNA sequence for 22593.
SEQ ID NO: 433 is the cDNA sequence for 22594.
SEQ ID NO: 434 is the cDNA sequence for 22595.
SEQ ID NO: 435 is the cDNA sequence for 22596.
SEQ ID NO: 436 is the cDNA sequence for 22847.
SEQ ID NO: 437 is the cDNA sequence for 22848.
SEQ ID NO: 438 is the cDNA sequence for 22849.
SEQ ID NO: 439 is the cDNA sequence for 222851.
SEQ ID NO: 440 is the cDNA sequence for 22852.
[0069]
SEQ ID NO: 441 is the cDNA sequence for 22853.
SEQ ID NO: 442 is the cDNA sequence for 22854.
SEQ ID NO: 443 is the cDNA sequence for 22855.
SEQ ID NO: 444 is the cDNA sequence for 22856.
SEQ ID NO: 445 is the cDNA sequence for 22857.
SEQ ID NO: 446 is the cDNA sequence for 23601.
SEQ ID NO: 447 is the cDNA sequence for 23602.
SEQ ID NO: 448 is the cDNA sequence for 23605.
SEQ ID NO: 449 is the cDNA sequence for 23606.
SEQ ID NO: 450 is the cDNA sequence for 23612.
[0070]
SEQ ID NO: 451 is the cDNA sequence for 23614.
SEQ ID NO: 452 is the cDNA sequence for 23618.
SEQ ID NO: 453 is the cDNA sequence for 23622.
SEQ ID NO: 454 is the cDNA sequence for folate hydrolase.
SEQ ID NO: 455 is the cDNA sequence for LIM protein.
SEQ ID NO: 456 is a cDNA sequence for a known gene.
SEQ ID NO: 457 is the cDNA sequence for the known gene.
SEQ ID NO: 458 is the cDNA sequence for the previously identified gene.
SEQ ID NO: 459 is the cDNA sequence for 23045.
SEQ ID NO: 460 is the cDNA sequence for 23032.
[0071]
SEQ ID NO: 461 is the cDNA sequence for clone 23054.
SEQ ID NOs: 462-467 are cDNA sequences for known genes.
SEQ ID NOs: 468-471 are the cDNA sequences for P710P.
SEQ ID NO: 472 is the cDNA sequence for P1001C.
SEQ ID NO: 473 is the determined cDNA sequence for the first splice variant of P775P (also referred to as 27505).
SEQ ID NO: 474 is the determined cDNA sequence for the second splice variant of P775P (also referred to as 19947).
SEQ ID NO: 475 is the determined cDNA sequence for the third splice variant of P775P (also referred to as 19941).
[0072]
SEQ ID NO: 476 is the determined cDNA sequence for the fourth splice variant of P775P (also referred to as 19937).
SEQ ID NO: 477 is the first predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 474.
SEQ ID NO: 478 is the second predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 474.
SEQ ID NO: 479 is the predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 475.
SEQ ID NO: 480 is the first predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 473.
[0073]
SEQ ID NO: 481 is the second predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 473.
SEQ ID NO: 482 is the third predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 473.
SEQ ID NO: 483 is the fourth predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 473.
SEQ ID NO: 484 is The first 30 amino acids of the tuberulosis antigen Ra12.
SEQ ID NO: 485 is PCR primer AW025.
SEQ ID NO: 486 is PCR primer AW003.
SEQ ID NO: 487 is a PCR primer AW027.
SEQ ID NO: 488 is PCR primer AW026.
SEQ ID NOs: 489-501 are peptides used for epitope mapping studies.
[0074]
SEQ ID NO: 502 is the determined cDNA sequence of the complementarity-determining region for anti-P503S monoclonal antibody 20D4.
SEQ ID NO: 503 is the determined cDNA sequence of the complementarity-determining region for anti-P503S monoclonal antibody Ja1.
SEQ ID NOs: 504 & 505 are peptides used for epitope mapping studies.
SEQ ID NO: 506 is the determined cDNA sequence of the complementarity-determining region for anti-P703P monoclonal antibody 8H2.
SEQ ID NO: 507 is the determined cDNA sequence of the complementarity-determining region for anti-P703P monoclonal antibody 7H8.
SEQ ID NO: 508 is the determined cDNA sequence of the complementarity-determining region for anti-P703P monoclonal antibody 2D4.
[0075]
SEQ ID NOS: 509-522 are peptides used in epitope mapping studies.
SEQ ID NO: 523 is the mature form of P703P used to raise antibodies to P703P.
SEQ ID NO: 524 is the putatively full length cDNA sequence for P703P.
SEQ ID NO: 525 is the putative amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 524.
SEQ ID NO: 526 is the full length cDNA sequence for P790P.
SEQ ID NO: 527 is the predicted amino acid sequence for P790P.
SEQ ID NOs: 528 & 529 are PCR primers.
SEQ ID NO: 530 is the cDNA sequence of the splice variant of SEQ ID NO: 366.
[0076]
SEQ ID NO: 531 is the cDNA sequence of the open reading frame of SEQ ID NO: 530.
SEQ ID NO: 532 is the predicted amino acid encoded by the sequence of SEQ ID NO: 531.
SEQ ID NO: 533 is the DNA sequence of the putative ORF of P775P.
SEQ ID NO: 534 is the predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 533.
SEQ ID NO: 535 is the first full length cDNA sequence for P510S.
SEQ ID NO: 536 is the second full length cDNA sequence for P510S.
SEQ ID NO: 537 is the predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 535.
SEQ ID NO: 538 is the predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 536.
SEQ ID NO: 539 is peptide P501S-370.
SEQ ID NO: 540 is peptide P501S-376.
[0077]
SEQ ID NOs: 541-551 are epitopes for P501S.
SEQ ID NO: 552 is the extended cDNA sequence for P712P.
SEQ ID NOS: 553-568 are amino acid sequences encoded by the predicted open reading frame in SEQ ID NO: 552.
SEQ ID NO: 569 is the extended cDNA sequence for P776P.
SEQ ID NO: 570 is the determined cDNA sequence for the P776P splice variant, referred to as contig 6
SEQ ID NO: 571 is the determined cDNA sequence for the P776P splice variant, referred to as contig 7.
SEQ ID NO: 572 is the determined cDNA sequence for the P776P splice variant, referred to as contig 14.
[0078]
SEQ ID NO: 573 is the amino acid sequence encoded by the first predicted ORF of SEQ ID NO: 570.
SEQ ID NO: 574 is the amino acid sequence encoded by the second predicted ORF of SEQ ID NO: 570.
SEQ ID NO: 575 is the amino acid sequence encoded by the predicted ORF of SEQ ID NO: 571.
SEQ ID NOs: 576-586 are amino acid sequences encoded by the predicted ORF of SEQ ID NO: 569.
SEQ ID NO: 587 is the DNA consensus sequence for P767P and P777P.
SEQ ID NOs: 588-590 are amino acid sequences encoded by the predicted ORF of SEQ ID NO: 587.
[0079]
SEQ ID NO: 591 is the extended cDNA sequence for P1020C.
SEQ ID NO: 592 is the predicted amino acid sequence encoded by the sequence of SEQ ID NO: P1020C.
SEQ ID NO: 593 is a splice variant of P775P, referred to as 50748.
SEQ ID NO: 594 is a splice variant of P775P, referred to as 50717.
SEQ ID NO: 595 is a splice variant of P775P, referred to as 45585.
SEQ ID NO: 596 is a splice variant of P775P, referred to as 37769.
SEQ ID NO: 597 is a splice variant of P775P, referred to as 37922.
SEQ ID NO: 598 is a splice variant of P510S, referred to as 49274.
SEQ ID NO: 599 is a splice variant of P510S, referred to as 39487.
SEQ ID NO: 600 is a splice variant of P504S, referred to as 5167.16.
[0080]
SEQ ID NO: 601 is a splice variant of P504S, referred to as 5167.1.
SEQ ID NO: 602 is a splice variant of P504S, referred to as 5163.46.
SEQ ID NO: 603 is a splice variant of P504S, referred to as 5163.42.
SEQ ID NO: 604 is a splice variant of P504S, referred to as 5163.34.
SEQ ID NO: 605 is a splice variant of P504S, referred to as 5163.17.
SEQ ID NO: 606 is a splice variant of P501S, referred to as 10640.
SEQ ID NOs: 601 to 615 are sequences of PCR primers.
SEQ ID NO: 616 is the determined cDNA sequence of the fusion of P703P and PSA.
SEQ ID NO: 617 is the amino acid sequence of the fusion of P703P and PSA.
SEQ ID NOs: 618-689 are the determined cDNA sequences of prostate-specific clones.
SEQ ID NO: 690 is the cDNA sequence of gene DD3.
SEQ ID NOs: 691-697 are the determined cDNA sequences of prostate-specific clones.
SEQ ID NO: 698 is the extended cDNA sequence for P714P.
SEQ ID NOs: 699-701 are the cDNA sequences for the splice variant of P704P.
[0081]
SEQ ID NO: 702 is the cDNA sequence of a spliced variant of P553S, referred to as P553S-14.
SEQ ID NO: 703 is the cDNA sequence of a spliced variant of P553S, referred to as P553S-12.
SEQ ID NO: 704 is the cDNA sequence of a spliced variant of P553S, referred to as P553S-10.
SEQ ID NO: 705 is the cDNA sequence of a spliced variant of P553S, referred to as P553S-6.
SEQ ID NO: 706 is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 705.
SEQ ID NO: 707 is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 702.
SEQ ID NO: 708 is the second amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 702.
SEQ ID NOs: 709-772 are the determined cDNA sequences of prostate-specific clones.
SEQ ID NO: 773 is the first full length cDNA sequence for a prostate-specific transglutaminase gene (also referred to as P558S).
[0082]
SEQ ID NO: 774 is a second full length cDNA sequence for a prostate-specific transglutaminase gene.
SEQ ID NO: 775 is the amino acid sequence encoded by the sequence of SEQ ID NO: 773.
SEQ ID NO: 776 is the amino acid sequence encoded by the sequence of SEQ ID NO: 774.
SEQ ID NO: 777 is the full length cDNA sequence for P788P.
SEQ ID NO: 778 is the amino acid sequence encoded by the sequence of SEQ ID NO: 777.
SEQ ID NO: 779 is the determined cDNA sequence for the polymorphic variant of P788P.
SEQ ID NO: 780 is the amino acid sequence encoded by the sequence of SEQ ID NO: 779.
SEQ ID NO: 781 is the amino acid sequence of peptide 4 from P703P.
SEQ ID NO: 782 is the cDNA sequence encoding peptide 4 from P703P.
SEQ ID NOs: 783-798 are the cDNA sequences encoding the epitope for P703P.
[0083]
SEQ ID NO: 799-814 is the amino acid sequence of the epitope for P703P.
SEQ ID NOs: 815 and 816 are PCR primers.
SEQ ID NO: 817 is 5 is a cDNA sequence encoding the N-terminal portion of P788P expressed in E. coli.
SEQ ID NO: 818 7 is the amino acid sequence of the N-terminal part of P788P expressed in E. coli.
SEQ ID NO: 819 corresponds to M. It is an amino acid sequence of tuberculosis antigen Ra12.
SEQ ID NOs: 820 and 821 are PCR primers.
SEQ ID NO: 822 is the cDNA sequence for the Ra12-P510S-C construct.
SEQ ID NO: 823 is the cDNA sequence for the P510S-C construct.
[0084]
SEQ ID NO: 824 is the cDNA sequence for the P510S-E3 construct.
SEQ ID NO: 825 is the amino acid sequence for the Ra12-P510SC structure.
SEQ ID NO: 826 is the amino acid sequence for the P510S-C construct.
SEQ ID NO: 827 is the amino acid sequence for P510S-E3 construct.
SEQ ID NOs: 828-833 are PCR primers.
SEQ ID NO: 834 is the cDNA sequence for the Ra12-P775P-ORF3 construct.
SEQ ID NO: 835 is the amino acid sequence for Ra12-P775P-ORF3 construct.
SEQ ID NOs: 836 and 837 are PCR primers.
SEQ ID NO: 838 is the determined amino acid sequence for the P703P His-tagged fusion protein.
[0085]
SEQ ID NO: 839 is the determined cDNA sequence for the P703P His-tagged fusion protein.
SEQ ID NOs: 840 and 841 are PCR primers.
SEQ ID NO: 842 is the determined amino acid sequence for the P705P His tag fusion protein.
SEQ ID NO: 843 is the determined cDNA sequence for the P705P His-tagged fusion protein.
SEQ ID NOs: 844 and 845 are PCR primers.
SEQ ID NO: 846 is the determined amino acid sequence for the P711P His-tagged fusion protein.
SEQ ID NO: 847 is the determined cDNA sequence for the P711P His-tagged fusion protein.
[0086]
SEQ ID NO: 848 is It is an amino acid sequence of tuberculosis antigen Ra12.
SEQ ID NOs: 849 and 850 are PCR primers.
SEQ ID NO: 851 is the determined cDNA sequence for the Ra12-P501S-E2 construct.
SEQ ID NO: 852 is the determined amino acid sequence for the Ra12-P501S-E2 construct.
SEQ ID NO: 853 is the amino acid sequence for an epitope of P501S.
SEQ ID NO: 854 is a DNA sequence encoding SEQ ID NO: 853.
SEQ ID NO: 855 is the amino acid sequence for the epitope for P501S.
SEQ ID NO: 856 is a DNA sequence encoding SEQ ID NO: 855.
SEQ ID NO: 857 is a peptide used for epitope mapping studies.
SEQ ID NO: 858 is the amino acid sequence for an epitope of P501S.
[0087]
SEQ ID NO: 859 is the DNA sequence encoding SEQ ID NO: 858.
SEQ ID NOs: 860-862 is the amino acid sequence of the CD4 epitope of P501S.
SEQ ID NOS: 863-865 are DNA sequences encoding the sequences of SEQ ID NOs: 860-862.
SEQ ID NOs: 866-877 are the amino acid sequences for the putative CTL epitope of P703P.
SEQ ID NO: 878 is a full length cDNA sequence for P789P.
SEQ ID NO: 879 is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 878.
SEQ ID NO: 880 is the determined full length cDNA sequence for the P776P splice variant referred to as contig 6.
SEQ ID NOs: 881-882 are determined full-length cDNA sequences for the P776P splice variant, referred to as contig 7.
SEQ ID NOs: 883-887 are the amino acid sequences encoded by SEQ ID NO: 880.
SEQ ID NOs: 888-893 are the amino acid sequences encoded by the P776P splice variant referred to as contig 7.
[0088]
SEQ ID NO: 894 is a full length cDNA sequence for the human transmembrane protease serine 2.
SEQ ID NO: 895 is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 894.
SEQ ID NO: 896 is the cDNA sequence encoding the first 209 amino acids of human transmembrane protease serine 2.
SEQ ID NO: 897 is the first 209 amino acids of human transmembrane protease serine 2.
SEQ ID NO: 898 is the amino acid sequence of peptide 296-322 of P501S.
SEQ ID NOs: 899-902 are PCR primers.
SEQ ID NO: 903 is the determined cDNA sequence of the Vb chain of the T cell receptor for P501S-specific T cell clone 4E5.
[0089]
SEQ ID NO: 904 is the determined cDNA sequence of the Va chain of the T cell receptor for P501S-specific T cell clone 4E5.
SEQ ID NO: 905 is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 903.
SEQ ID NO: 906 is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 904.
SEQ ID NO: 907 is a full length open reading frame for P768P which includes a stop codon.
SEQ ID NO: 908 is a full length open reading frame for P768P without the stop codon.
SEQ ID NO: 909 is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 908.
SEQ ID NOs: 910-915 are the amino acid sequences for the predicted domain of P768P.
[0090]
SEQ ID NO: 916 is a full length cDNA of P835P.
SEQ ID NO: 917 is the cDNA sequence of the previously identified clone FLJ13581.
SEQ ID NO: 918 is the reading frame cDNA sequence for P835P, including a stop codon.
SEQ ID NO: 919 is the cDNA sequence of the open reading frame for P835P without the stop codon.
SEQ ID NO: 920 is the full length amino acid sequence for P835P.
SEQ ID NOs: 921-928 are the amino acid sequences of the extracellular and intracellular domains of P835P.
[0091]
SEQ ID NO: 929 is the full length cDNA sequence for P1000C.
SEQ ID NO: 930 is the cDNA sequence of the open reading frame for P1000C, including a stop codon.
SEQ ID NO: 931 is the open reading frame cDNA sequence for P1000C without the stop codon.
SEQ ID NO: 932 is a full length amino acid sequence for P1000C.
SEQ ID NO: 933 is amino acids 1-100 of SEQ ID NO: 932.
SEQ ID NO: 934 is amino acids 100-492 of SEQ ID NO: 932.
SEQ ID NOs: 935-937 are PCR primers.
SEQ ID NO: 938 is the cDNA sequence for the full length P767P coding region expressed.
SEQ ID NO: 939 is the expressed truncated P767P coding region cDNA sequence.
SEQ ID NO: 940 is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 939.
SEQ ID NO: 941 is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 938.
SEQ ID NO: 942 is the DNA sequence of the CD4 epitope of P703P.
SEQ ID NO: 943 is the amino acid sequence of the CD4 epitope of P703P.
[0092]
Specific description of the invention:
The present invention is generally directed to compositions for the treatment and diagnosis of cancer, especially prostate cancer, and their uses. As described further below, typical compositions of the invention include polypeptides, particularly immunogenic polypeptides, polynucleotides encoding such polypeptides, antibodies and other binding agents, antigen-providing cells. (APC) and immune system cells (eg, T cells), but are not limited thereto.
[0093]
The practice of the present invention will employ, unless otherwise indicated, conventional methods of virology, immunology, microbiology, molecular biology and recombinant DNA techniques, many of which are described below for illustrative purposes. Is done. Such techniques are explained fully in the literature. For example, Sambrook, etc. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, ed. & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference.
As used in this specification and in the claims, the singular encompasses the plural unless specifically stated otherwise.
[0094]
Polypeptide composition:
As used herein, the term “polypeptide” is used in its conventional sense, ie, as a sequence of amino acids. Polypeptides are not limited to products of a particular length; thus, peptides, oligopeptides and proteins are included within the definition of polypeptide, and such terms are used herein unless otherwise indicated. Can be used interchangeably. The term refers to post-expression modifications of the polypeptide, such as glycosylation, acetylation, phosphorylation and the like, as well as other modifications (naturally occurring and non-naturally occurring) known in the art. Not mentioned or excluded. A polypeptide can be a complete protein or a subsequence thereof. Particular polypeptides of interest in the present invention are amino acid subsequences that comprise the epitope, ie, antigenic determinants that are substantially responsible for the immunogenic properties of the polypeptide and are capable of eliciting an immune response.
[0095]
Particularly exemplary polypeptides of the invention include SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880-882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942, or the polynucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1-111. , 115-171, 173-175, 177, 179 −305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587 , 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880-882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939. And 942 to the polynucleotide sequence set forth in any one of:
[0096]
Comprise those polypeptides that are encoded by sequences that hybridize under moderate stringency conditions, or on the other hand, under high stringency conditions. In certain embodiments, the polypeptide of the present invention comprises SEQ ID NOs: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504. 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 706-708, 775, 776, 778, 780, 781, 811, 814, 818, 826, 827, 853, 855, 858, 860-862, 866-877, 879, 883-893, 895, 897, 898, 909-915, 920-928, 923-934, 940, 941 and 943 as shown in any one of Comprising an amino acid sequence.
[0097]
Polypeptides of the invention are sometimes referred to as prostate-specific proteins or prostate-specific polypeptides, as an indication that their identification is based at least in part on their increased expression levels in prostate tissue samples. Defined in the description. Thus, a "prostate-specific polypeptide" or "prostate-specific protein" is generally less than the level of expression in other normal tissues as determined using the representative assays provided herein. At a high level, at least 2 times, and preferably at least 5 times, in a substantial proportion of the prostate tissue sample, for example, preferably about 20% or more, more preferably about 30% or more of the prostate tissue sample being tested. And most preferably, about 50% or more expressed polypeptide sequences of the invention, or polynucleotide sequences encoding such polypeptides. Prostate-specific polypeptide sequences of the present invention based on their increased levels of expression in tumor cells are of particular use as diagnostic markers and therapeutic targets, as further described below.
[0098]
In certain preferred embodiments, the polypeptides of the invention are immunogenic, ie, they are combined with antisera and / or T-cells from a patient having prostate cancer and an immunoassay (eg, ELISA or T-cell stimulation). Reacts detectably within the assay). Screening for immunogenic activity can be performed using techniques well known to those skilled in the art. For example, such screening can be performed using those methods described in Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In one typical example, the polypeptide can be immobilized on a solid support and contacted with the patient's serum to allow binding of the antibodies in the serum to the immobilized polypeptide. . Next, unbound serum is removed and the bound antibody is removed, for example,¹²⁵Detected using I-labeled protein A.
[0099]
As will be appreciated by those of skill in the art, immunogenic portions of the polypeptides disclosed herein are also encompassed by the present invention. An "immunogenic moiety," as used herein, is itself immunologically reactive (ie, specific) with a B-cell and / or T-cell surface antigen receptor that recognizes a polypeptide. ), Fragments of the immunogenic polypeptides of the invention. Immunogenic moieties are generally prepared using well-known techniques, eg, Paul, Fundamental Immunology, 3^rd ed. , 243-247 (Raven Press, 1993) and those techniques summarized in the references cited therein.
[0100]
Such techniques include screening polypeptides for the ability to react with antigen-specific antibodies, antisera and / or T-cell lines or clones. As used herein, antisera and antibodies are used when they specifically bind to an antigen (ie, they react with a protein in an ELISA or other immunoassay and can be detected as unrelated proteins) Is less antigen-specific). Such antisera and antibodies can be prepared as described herein and using well-known techniques.
[0101]
In one preferred embodiment, the immunogenic portion of the polypeptide of the invention is a portion that reacts with antisera and / or T-cells at a level that is not substantially lower than the reactivity of a full-length polypeptide. (Eg, in an ELISA and / or T-cell response assay). Preferably, the level of immunogenic activity of the immunogenic portion is at least about 50%, preferably at least about 70%, and most preferably about 90% or more immunogenic for a full-length polypeptide. In many cases, a preferred immunogenicity having a higher level of immunogenic activity than its corresponding full-length polypeptide having, for example, about 100% or 150% or more immunogenic activity. Parts will be identified.
[0102]
In certain other embodiments, an exemplary immunogenic moiety can include a peptide in which the N-terminal leader sequence and / or the transmembrane domain has been deleted. Other typical immunogenic portions include small N- and / or C-terminal deletions (e.g., 1-30 amino acids, preferably 5-15 amino acids) relative to the mature protein. There will be.
In another embodiment, the polypeptide of the invention is a polypeptide of the invention, particularly a polypeptide having an amino acid sequence disclosed herein, or a T fragment produced against an immunogenic fragment or variant thereof. It can comprise one or more polypeptides that immunologically react with cells and / or antibodies.
[0103]
In another aspect of the invention, one or more polypeptides capable of eliciting T cells and / or antibodies that immunologically react with one or more polypeptides described herein, or Hybridization to contiguous nucleic acid sequences contained in the polynucleotides disclosed herein, or immunogenic fragments or variants thereof, or to one or more of those nucleic acid sequences under conditions of moderate to high stringency A polypeptide comprising one or more polypeptides encoded by one or more nucleic acid sequences is provided.
[0104]
In another aspect, the invention provides a polypeptide comprising at least about 5, 10, 15, 20, 25, 50 or 100, or more, eg, all intermediate lengths of the polypeptide compositions provided herein. For example, SEQ ID NOs: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525 , 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 706-708, 775, 776, 778, 780, 781, 811, 814, 818, 826, 827, 853. , 855, 858, 860-862, 866-877, 879, 8 3-893, 895, 897, 898, 909-915, 920-928, 936-934, 940, 941 and those shown in 943, or SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569- 572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880-882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931. 938, 939 and 942 It provides polypeptide fragments comprising one of those encoded by a polynucleotide sequence that.
[0105]
In another aspect, the invention provides variants of the polypeptide compositions described herein. In general, the polypeptide variants encompassed by the present invention will typically have at least about 70%, 75%, 80%, Shows 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more identity (determined as described below) Will.
In one preferred embodiment, the polypeptide fragments and variants provided by the invention are immunologically linked to antibodies and / or T-cells that react with the full-length polypeptides specifically set forth herein. Reactively react.
[0106]
In another preferred embodiment, the polypeptide fragments and variants provided by the present invention have at least about 50%, preferably at least about 50%, of the levels exhibited by the full-length polypeptides specifically set forth herein. It exhibits a level of immunogenic activity of at least about 70% and most preferably at least about 90% or more.
A polypeptide “variant,” as used herein, is typically representative of a polypeptide specifically disclosed herein by one or more substitutions, deletions, additions, and / or insertions. Are different polypeptides. Such variants may be naturally occurring, or may be modified, for example, using one or more of the above-described modifications of the polypeptide sequence of the invention and any of a number of techniques well known in the art. Can be produced synthetically by evaluation of their immunogenic activity as described herein.
[0107]
For example, one exemplary variant of a polypeptide of the invention includes one or more portions, such as those in which the N-terminal leader sequence or transmembrane domain has been removed. Other exemplary variants include variants in which a small portion (eg, 1-30 amino acids, preferably 5-15 amino acids) has been removed from the N- and / or C-terminus of the mature protein. Include.
[0108]
In many cases, the variants will contain conservative substitutions. A "conservative substitution" is one in which one amino acid has another property with similar properties, so that one of skill in the art of peptide chemistry can predict the secondary structure and hydrotherapeutic properties of a substantially unchanged polypeptide. Is a substitution replaced by As described above, modifications can be made in the structures of the polynucleotides and polypeptides of the present invention, and further provide for a function encoding a variant or derivative polypeptide having desired properties, such as immunogenic properties. Target molecule can be obtained. Where it is desired to alter the amino acid sequence of a polypeptide of the invention to create an equivalent or even an improved immunogenic variant or portion thereof, one of skill in the art will typically According to Table 1, one or more codons of the encoding DNA sequence will be changed.
[0109]
For example, certain amino acids can be replaced by other amino acids in the protein structure without measurable loss of ability to interact with the antigen-binding region or binding site of the antibody on the substrate molecule. Since it is the protein's ability to interact and define its biological functional activity, certain amino acid sequence substitutions can be made in the protein sequence and, of course, in its basic DNA coding sequence; And nevertheless, proteins with similar properties can be obtained. Thus, species changes can be made in the peptide sequences of the disclosed compositions, or the corresponding DNA sequences encoding said peptides, without a measurable loss of their biological utility or activity. .
[0110]
[Table 1]

[0111]
In making such changes, the hydrotherapeutic index of the amino acid may be considered. The importance of its hydrotherapeutic index in conferring interactive biological function on a protein is generally understood in the art (Kyte and Doolittle, 1982; incorporated herein by reference). ). The relative hydrotherapeutic properties of amino acids contribute to the secondary structure of the resulting protein, which defines the interaction of the protein with other molecules, such as enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, and the like. It is recognized that. Individual amino acids have been assigned a hydrotherapeutic index based on hydrophobicity and charge characteristics (Kyte and Doolittle, 1982). The values are as follows: isoloin (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1). Alanine (+1.8); glycine (+0.4); threonine (-0.7); serine (-0.8); tryptophan (-0.9); tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
[0112]
Certain amino acids can be replaced by other amino acids having similar hydrotherapeutic indices or scores, and further result in a protein having similar biological activity, i.e., It is known that more can be obtained. When making such changes, substitutions of amino acids whose hydrotherapy index is within ± 2 are preferred, those substitutions within ± 1 are particularly preferred, and those within ± 0.5 are even more particularly preferred. Is preferred. It is also understood in the art that similar amino acid substitutions can be made effectively on the basis of hydrophilicity. U.S. Pat. No. 4,554,101, which is specifically incorporated herein by reference, states that the highest local average hydrophilicity of a protein, as governed by the hydrophilicity of its adjacent amino acids, Mention that they correlate with biological properties.
[0113]
The following hydrophilicity values have been assigned to amino acid residues as described in U.S. Patent No. 4,554,101: Algin (+3.0); Lysine (+3.0); Aspartate ( Glutamate (+ 3.0 ± 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (−0.4); Proline (-0.5 ± 1); Alanine (-0.5); Histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); Leucine (-1.8); Isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4). It is understood that an amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophilicity value, and furthermore to be able to obtain biologically equivalent and especially immunologically equivalent proteins. In such changes, substitutions of amino acids whose hydrophilicity values are within ± 2 are preferred, those substitutions within ± 1 are preferred, and those within ± 0.5 are even more particularly preferred.
[0114]
As outlined above, amino acid substitutions are therefore generally based on amino acid side-chain substituents, for example, their hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the relative similarity of the like. Typical substitutions in view of various of the above properties are well known to those skilled in the art and include arginine and lysine; glutamate and aspartate; serine and threonine; glutamine and asparagine; and valine, loin and isoleucine. I do.
[0115]
In addition, any polynucleotide may be further modified to increase stability in vivo. Possible modifications include the addition of flanking sequences at the 5 'and / or 3' end; the use of phosphothioate or 2'O-methyl rather than a phosphodiesterase linkage in the backbone; and / or non-conventional bases such as inosine, Includes, but is not limited to, encapsulation of cueosin, wibutosin, and acetyl-methyl, thio- and other modified forms of adenine, cytidine, guanine, thymine and uridine.
[0116]
Amino acid substitutions may be further made based on similarities in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity and / or amphoteric nature of the residues. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamine; positively charged amino acids include lysine and arginine; and amino acids having an uncharged polar head group with similar hydrophilicity values Include leucine, isoleucine and valine; glycine and alanine; asparagine and glutamine; and serine, threonine, phenylalanine and tyrosine.
[0117]
Other groups of amino acids that can provide conservative changes include: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his. A variant may also, or on the other hand, contain non-conservative changes. In preferred embodiments, the variant polypeptide differs from the native sequence by 5 or fewer amino acid substitutions, deletions or additions. The variants may also (or on the other hand) be modified, for example, by deletion or addition of amino acids that minimally affect the immunogenicity, secondary structure and hydrotherapeutic properties of the polypeptide.
[0118]
As indicated above, the polypeptide can comprise a signal (or leader) sequence at the N-terminus of the protein that directs translocation of the protein, either co-translationally or post-translationally. The polypeptide may also include a linker or other sequence for ease of synthesis, purification or identification of the polypeptide (eg, poly-His), or to enhance binding of the polypeptide to a solid support. Can be joined. For example, a polypeptide can be conjugated to an immunoglobulin Fc region.
[0119]
When comparing polypeptide sequences, two sequences are “identical” if they are identical if the sequence of amino acids in the two sequences is aligned for maximum correspondence as described below. It is said that there is. Comparisons between two sequences are typically performed by comparing the sequences over a comparison window to identify and compare local regions of sequence similarity. A "comparison window" as used herein refers to a segment of at least about 20, usually 30 to about 70, 40 to about 50 contiguous positions, where one sequence comprises two species Can be compared to a control sequence at the same number of consecutive positions.
[0120]
Optimal alignment of sequences for comparison can be performed using the Megalin program (DNASTAR, Inc., Madison, WI) in the Lasergene suite of bioinformatics software using default parameters. This program embodies several single row alignment schemes described in the following literature: Dayhoff, M .; O. (1978) A model of evolutionary change in proteins-Materials for detecting persistent relations. In Dayhoff, M .; O. (Ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. Hein J. 345-358; (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc. Higgins, D., San Diego, CA; G. FIG. and Sharp, P.M. M. (1989) CABIOS 5: 151-153; Myers, E. et al. W. and Muller W.S. (1988) CABIOS 4: 11-17; Robinson, E .; D. (1971) Comb. Theor 11: 105; Santou, N.M. Nes, M.C. (1987) Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Snearth, P .; H. A. and Sokal, R.A. R. (1973) Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.C. J. and Lipman, D.A. J. (1983) Proc. Natl. Acad. , Sci. ScL USA 80: 726-730.
[0121]
On the other hand, optimal alignment of sequences for comparison can be found in Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482 using the same localization algorithm as in Needleman and Wunsch (1970) Mol. Biol. 48: 443, by the search for similarity method of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, by examining the similarity method, their algorithms (Wisconsin Softwares Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., STAP, ATFST, ATFST, ATFA, TFTF, ATFST, ATFA, TFAP, ATFA, ATFA, ATFST, ATFA, ATFA, ATFA, ATFA, STATFA, ATFA, ATFA, ATFA, ATFA, ATFA, TFA, TFA, TFA,,,,,))). It can be done by processed execution or by investigation.
[0122]
One preferred example of an algorithm that is suitable for determining% sequence identity and sequence similarity is Altschul et al., Respectively. , (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 and Altschul et al. , (1990) J. Am. Mol. Biol. 215: BLST and BLAST 2.0 algorithms described in 403-410. BLAST and BLAST 2.0 can be used with the parameters described herein to determine% sequence identity for polynucleotides and polypeptides of the invention. Software for performing BLAST analysis is available through the National Center for Biotechnology Information.
[0123]
For amino acid sequences, a score matrix can be used to calculate the cumulative score. Expansion of word hits in the individual directions is stopped if: the cumulative alignment score decreases by an amount X from its maximum achieved value: if the cumulative score is one or more. If progressing to zero or less due to accumulation of a negative score residue alignment in the sequence; or if the end of either sequence is reached. The BLAST algorithm parameters W, T and X determine the sensitivity and speed of the alignment.
[0124]
In one preferred approach, "% sequence identity" is determined by comparing two optimally aligned sequences over a comparison window of at least 20 positions, wherein the polypeptides in the comparison window Portions of the sequence may be 20% or less, usually 5-15% or 10-12% added, relative to a control sequence (not including additions or deletions), for optimal alignment of the two sequences. Alternatively, it can comprise a deletion (ie, a gap). The percentage determines the number of positions where the same amino acid residue is matched in both sequences, and divides the number of matched positions by the total number of positions in the control sequence to obtain the number of positions matched. And to obtain the% sequence identity, it is calculated by multiplying the result by 100.
[0125]
In other exemplary embodiments, the polypeptide comprises a plurality of polypeptides as described herein, or at least one polypeptide as described herein and an unrelated The sequence can be, for example, a fusion polypeptide comprising a known oncoprotein. A fusion partner can, for example, assist in providing a T helper epitope (an immunological fusion partner), preferably a T helper epitope recognized by humans, or a protein with a higher yield than the native recombinant protein (an expression enhancer). ) Can be assisted. Certain preferred fusion partners are immunological and expression enhancing fusion partners. Other fusion partners can be selected to enhance the melting of the polypeptide or to allow targeting of the polypeptide to a desired intracellular compartment. Further, fusion partners include an affinity tag to facilitate polypeptide purification.
[0126]
Fusion polypeptides can generally be prepared using standard techniques, including chemical conjugation. Preferably, the fusion polypeptide is expressed in an expression system as a recombinant polypeptide that allows for increased levels of production relative to the unfused polypeptide. Briefly, DNA sequences encoding polypeptide components are assembled separately and ligated into an appropriate expression vector. The 3 'end of the DNA sequence encoding one polypeptide component is accompanied by a peptide linker at the 5' end of the DNA sequence encoding the second polypeptide component so that the open reading frame of the sequence is in alignment. Or without it. This allows for translation into a single fusion polypeptide that retains the biological activity of both component polypeptides.
[0127]
The polypeptide linker sequence can be used to separate the first and second polypeptide components a sufficient distance to ensure that an individual polypeptide prays to its secondary and tertiary structure. Such polypeptide linker sequences are introduced into the fusion polypeptide using standard techniques well known in the art. Suitable peptide linker sequences can be selected based on the following factors: (1) their ability to adopt a flexible extended conformation; (2) functions on the first and second polypeptides. Their inability to adopt secondary structures that interact with the functional epitope; and (3) deletion of hydrophobic or charged residues that react with the polypeptide functional epitope.
[0128]
Preferred peptide linker sequences include Gly, Asn and Ser residues. Other similar neutral amino acids, such as Thr and Ala, can also be used for the linker sequence. Amino acid sequences that can be usefully used as linkers are described in Maratea et al. Murphy et al., Gene 40: 39-4}, 1985; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1988; and their sequences disclosed in U.S. Pat. Nos. 4,935,233 and 4,751,180. The linker sequence may generally be from 1 to about 50 amino acids in length. A linker sequence is not required if the first and second polypeptides have a non-essential N-terminal amino region that can be used to separate functional domains and prevent steric hindrance.
[0129]
The contiguous DNA sequence is operably linked to the appropriate transcription or translation control elements. The regulatory element that directs the expression of the DNA is located only on the 5 'side of the DNA encoding the first polypeptide. Similarly, stop codons required to terminate translation and transcription termination signals are only present 3 'to the DNA sequence encoding the second polypeptide.
The fusion polypeptide comprises the polypeptide as described herein together with an unrelated immunogenic protein, eg, an immunogenic protein capable of eliciting a reproducible response. Examples of such proteins include tetanus, tuberculosis and hepatitis proteins (see, for example, Stout et al., New Engl. J. Med., 336: 86-91, 1997).
[0130]
In one preferred embodiment, the immunological fusion partner is Mycobacterium sp. , For example, derived from a Ra12 fragment from Mycobacterium tuberculosis. Ra12 compositions and methods for the expression of heterologous polynucleotide / polypeptide sequences and / or their use in enhancing immunogenicity are described in US Patent Application No. 60 / 158,585, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Which is incorporated in the above). Briefly, Ra12 refers to a polynucleotide region that is a subsequence of Mycobacterium tuberculosis MTB32A nucleic acid. MT32A is available from A serine prolease with a molecular weight of 32 KD, encoded by genes in virulent and non-virulent strains of Tuberculos.
[0131]
The nucleotide and amino acid sequences of MTB32A have been described (e.g., U.S. Patent Application No. 60 / 158,585; see also Skeky et al., Infection and Immun. (1999 67: 3998-4007, incorporated herein by reference). The C-terminal fragment of the MTB32A coding sequence is expressed at high levels and persists as a soluble polypeptide throughout the purification process.In addition, Ra12 is a heterologous immunogenic polypeptide to which it is fused. One preferred Ra12 fusion polypeptide comprises a 14 kD C-terminal fragment corresponding to amino acid residues 192 to 323 of MTB32A. Other preferred Ra12 polynucleotides are generally R At least about 15 contiguous nucleotides, at least about 30 nucleotides, at least about 60 nucleotides, at least about 100 nucleotides, at least about 200 nucleotides, or at least about 20 nucleotides that encode a portion of a 12 polypeptide. It comprises 300 nucleotides.
[0132]
A Ra12 polynucleotide can comprise a native sequence (ie, an endogenous sequence that encodes a Ra12 polypeptide or a portion thereof), or can comprise a variant of such a sequence. The Ra12 polynucleotide variant may have one or more substitutions such that the biological activity of the encoded fusion polypeptide is not substantially reduced relative to the fusion polypeptide comprising the native Ra12 polypeptide. , Additions, deletions and / or insertions. The variant preferably has at least about 70% identity, more preferably at least about 80% identity, and most preferably at least about 90% identity to the polynucleotide sequence encoding the native Ra12 polypeptide or a portion thereof. % Identity.
[0133]
In another preferred embodiment, the immunological fusion partner is derived from protein D, the gram-negative bacterium Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Preferably, the protein D derivative comprises approximately one-third of the protein (eg, the first N-terminal 100-110 amino acids), and the protein D derivative can be lipidated. In certain preferred embodiments, the first 109 residues of the lipoprotein D fusion partner are used to provide a polypeptide having an additional exogenous T-cell epitope, and Included on the N-terminus to increase expression levels in E. coli (and thus function as expression enhancers). Lipid termini ensure optimal presentation of antigen to antigen-presenting cells. Other fusion partners include the non-structural protein from influenza virus, NS1 (hemagglutinin). Typically, the N-terminal 8 amino acids may be used, although different fragments containing a T-helper epitope may be used.
[0134]
In another aspect, the immunological fusion partner is a protein known as LYTA, or a portion thereof (preferably, the C-terminal portion). LYTA is derived from Streptococcus pneumoniae, which synthesizes N-acetyl-L-alanine amidase known as the amidase LYTA (encoded by the LytA gene; Gene 43: 265-292, 1986). You. LYTA is an autolytic enzyme that specifically degrades certain bonds in the peptidoglycan backbone.
[0135]
The C-terminal domain of the LYTA protein can be responsible for the affinity for choline or choline analogs such as DEAE. This property is useful for expression of fusion proteins. It has been developed for the generation of E. coli C-LYTA expression plasmids. Purification of hybrid proteins containing a C-LYTA fragment at the amino terminus has been described (see Biotechnology 10: 799-798, 1992). In a preferred embodiment, the repeat portion of LYTA can be incorporated into a fusion polypeptide. The repeat portion is found in the C-terminal region starting at residue 178. Particularly preferred moieties incorporate residues 188-305.
[0136]
Yet another exemplary embodiment includes fusion polypeptides and the polynucleotides that encode them. Here, the fusion partner comprises a targeting signal capable of directing the polypeptide to the endosomal / lysosomal compartment as described in US Pat. No. 5,633,234. The immunogenic polypeptides of the present invention, when fused with this targeting signal, associate more effectively with MHC class II molecules, and thereby have CD4 specific for the polypeptide.⁺Provides enhanced in vivo stimulation of T-cells.
[0137]
The polypeptides of the present invention are prepared using any of a variety of well-known synthetic and / or recombinant techniques, the latter of which are described further below. Polypeptides, generally less than about 150 amino acids, portions thereof, and other variants, can be produced by synthetic means, using techniques well known to those skilled in the art. In one illustrative example, such polypeptides are prepared using any of the commercially available solid phase techniques, such as the Merrifield solid phase synthesis method, where the amino acids are added sequentially to a growing chain of amino acids. Is synthesized using Merrifield, J .; Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. Equipment for automated synthesis of polypeptides is commercially available from suppliers, such as Perkin Elmer / Applied BioSystems Division (Foster City, CA) and can be operated according to the manufacturer's instructions.
[0138]
Generally, polypeptide compositions of the present invention (including fusion polypeptides) are isolated. An "isolated" polypeptide is a polypeptide that is removed from its original environment. For example, a naturally occurring protein or polypeptide is isolated if it is separated from some or all of the coexisting materials in the natural system. Preferably, such polypeptides are also purified, eg, at least about 90% pure, more preferably at least about 95% pure, and most preferably at least about 99% pure.
[0139]
Polynucleotide composition
The invention, in another aspect, provides a polynucleotide composition. The terms "DNA" and "polynucleotide" are used interchangeably to mean an isolated DNA molecule that does not include the total genomic DNA of the particle species. "Isolated", as used herein, means that the polynucleotide is substantially separated from other coding sequences, and that a large portion of unrelated coding DNA, such as a chromosomal fragment or other functional It means that it contains no gene or polypeptide coding region. Of course, this means a DNA molecule originally isolated, and does not exclude genes or coding regions that were later added to the segment by human hand.
[0140]
As those skilled in the art will appreciate, the polynucleotide compositions of the present invention express or are adaptable to express genomic sequences, extra genomic and plasmid coding sequences and proteins, polypeptides, peptides and the like. , Smaller engineered gene segments. Such segments can be isolated naturally or modified synthetically by human hand.
[0141]
Also, as the skilled artisan will appreciate, the polynucleotides of the present invention can be single-stranded (coding or antisense) or double-stranded, and are DNA (genomic, cDNA or synthetic) or RNA molecules. be able to. RNA molecules can include HnRNAs that contain introns and correspond to DNA molecules in a one-to-one manner, and mRNA molecules that do not contain introns. Additional coding or non-coding sequences can be, but need not be, present in the polynucleotides of the invention, and the polynucleotides may bind to other molecules and / or support materials. Yes, but it is unnecessary to combine.
[0142]
The polynucleotide may comprise a native sequence (ie, an endogenous sequence encoding a polypeptide / protein of the invention or a portion thereof), or may be a variant, preferably an immunogenic variant, of such a sequence. Can be included.
[0143]
Thus, according to another aspect of the invention, SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381-382 and 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880-882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942, or some or all of the polynucleotide sequences described in any one of:
[0144]
SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381-382 and 384-476, 524, 526; 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880-882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942 and the complement of the polynucleotide sequence set forth in any one of:
[0145]
SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381-382 and 384-476, 524, 526; 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880-882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942, a polynucleotide composition comprising a degenerate variant of the polynucleotide sequence described in any one of. In certain preferred embodiments, the polynucleotide sequences described herein encode an immunogenic polynucleotide, as described above.
[0146]
In other related aspects, the present invention provides SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381. 382 and 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823 824, 878, 880-882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939, and 942, polynucleotide variants having substantial identity to the sequences disclosed herein. The type, for example, the method described herein (eg, standard BLAST analysis using a meter), and preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, Polynucleotide variants with 97%, 98% or 99% or higher sequence identity are provided. As the skilled artisan will appreciate, by taking into account codon degeneracy, amino acid similarity, reading frame localization and the like, these values may be adjusted appropriately to the corresponding nucleotides encoded by the two nucleotide sequences. Identity can be determined.
[0147]
Typically, the polynucleotide variant preferably substantially reduces the immunogenicity of the polypeptide encoded by the variant polynucleotide, with respect to the polypeptide encoded by the polynucleotide sequence described herein. Will contain one or more substitutions, additions, deletions and / or insertions. It should be understood that the term "variant" also encompasses homologous genes from heterologous origin.
[0148]
In an additional aspect, the invention relates to polynucleotide fragments comprising contiguous stretches of various lengths of sequences that are identical or complementary to one or more of the sequences disclosed herein. I will provide a. For example, at least 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 or 1000 or longer contiguous nucleotides of one or more of the sequences disclosed herein, and Polynucleotides comprising all intermediate lengths therebetween are provided by the present invention. As will be readily understood, "intermediate length" refers in this regard to any length between the recited values, such as 16, 17, 18, 19, and others; 30, 31, 32, and Other; 50, 51, 53, and others; 100, 101, 102, 103, and others; 150, 151, 152, 153, and others, 200-500; 500-1,000, and all others Integers are included.
[0149]
In another embodiment of the present invention, a polynucleotide composition capable of hybridizing under moderate to high stringency conditions to a polynucleotide provided herein, or a fragment thereof, or a complementary sequence thereof, is provided. Provided. Hybridization techniques are well known in the field of molecular biology.
[0150]
For illustrative purposes, moderate stringency conditions suitable for testing hybridization of a polynucleotide of the present invention with other polynucleotides include the following conditions: 5 × SSC, 0.5% SDS Pre-wash in a solution of 1.0 mM EDTA, pH 8.0; overnight hybridization at 50-60 ° C., 5 × SSC; then 2 ×, 0.5 × and 0.1 × SDS containing 0.1% SDS Wash at 65 ° C. for 20 minutes using each of 0.2 × SSC. As those skilled in the art will appreciate, stringency of hybridization can be readily manipulated, for example, by changing the salt content of the hybridization solution and / or the temperature at which hybridization is performed. For example, in other embodiments, suitable highly stringent hybridization conditions include those described above, except that the temperature of hybridization is increased, for example, to 60-65 ° C or 65-70 ° C.
[0151]
In certain preferred embodiments, the aforementioned polynucleotides, eg, polynucleotide variants, fragments, and hybridization sequences, encode polypeptides that immunologically cross-react with the polypeptide sequences detailed herein. In other preferred embodiments, such polynucleotides have at least about 50%, preferably at least about 70%, more preferably at least about 90% of the level of immunogenic activity for the polypeptide sequences detailed herein. Encodes a polypeptide having an immunogenic activity level.
[0152]
The polynucleotides of the present invention, or fragments thereof, may contain other DNA sequences, ignoring the length of the coding sequence itself, such as promoters, polyadenylation signals, additional restriction sites, multiple cloning sites, other coding Combined with segments, and others, their overall length can vary considerably. Thus, nucleic acid fragments of almost any length can be used, and the total length will be limited by ease of preparation and use in the intended recombinant DNA protocol. For example, about 10,000, about 5,000, about 3,000, about 2,000, about 1,000, about 500, about 200, about 100, about 50 base pairs in length, and others (all intermediate lengths) Exemplary polynucleotide segments having a total length of about 12.5% are considered to be effective in many implementations of the invention.
[0153]
When comparing polynucleotide sequences, a nucleotide sequence in two sequences is said to be "identical" if the nucleotide sequences in the two sequences are aligned in maximal correspondence, as described below. Typically, a comparison between two sequences is performed by comparing the sequences on a comparison window to identify and compare local regions of sequence similarity. A "comparison window" as used herein, refers to a segment of at least about 20, usually 30 to about 75, preferably 40 to about 50, contiguous positions, where the two sequences are optimally aligned. After that, the sequence can be compared to a reference sequence at the same number of adjacent positions.
[0154]
Optimal alignment of sequences for comparison should be performed using default parameters according to the Megaline program (DNASTR, Inc., Madison, WI) in the Lasergene suite of Bioinformatics Software. Can be. This program is embodied in several alignment schemes described in the following references: Dayhoff, M .; O. (1978) A model of evolutionary change in proteins-Materials for detecting ditension relations. In Dayhoff, M .; O. (Editor) Atlas of Protein Sequence and Structures, National Biomedical Research @ Foundation, Washington, D.C. C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358;
[0155]
Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology Vol. 183, Academic Press, Inc. Higgins, D.C., San Diego, CA; G. FIG. And Sharp, P .; M. (1989) CABIOS 5: 151-153; Myers, E .; W. And Muller W.S. (1988) CABIOS 4: 11-17; Robinson, E .; D. (1971) Comb. Theor 11: 105; Santou, N.M. Nes, M .; (1987) Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Snearth, P .; H. A. And Sokal, R .; R. (1973) Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.W. J. And Lipman, D.A. J. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 80: 726-730.
[0156]
Alternatively, optimal alignment of sequences for comparison can be found in Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482, local identity algorithm, Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Mol. Biol. 48: 443, by the search for similarity method of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 Search for methods of similarity, computerized implementation of these algorithms (GAP, BESTEIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Softwares Software Package, Genetics Computer Group, 5GC Group. , Madison, Wis.), Or by inspection.
[0157]
One preferred example of an algorithm suitable for determining percent sequence identity and sequence similarity is the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, which are described in Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Am. Mol. Biol. 215: 403-410. BLAST and BLAST 2.0 can be used, for example, with the parameters described herein, to determine the percentage of sequence similarity for polynucleotides of the invention. Software for performing BLAST analysis is publicly available through the National Center for Biological Information.
[0158]
In one illustrative example, using, for example, the nucleotide sequence, parameters M (reward score for a pair of matching residues; always> 0) and N (penalty score for mismatching residues; always <0) , The cumulative score can be calculated. The word hit extension in each direction is aborted if: the accumulation becomes less than zero due to the accumulation of an alignment of one or more negatively scored residues; or When reaching the end. The BLAST algorithm parameters W, T and X determine the sensitivity and speed of the alignment. The BLASTN program (for nucleotide sequences) uses the following values as defaults: a wordlength of 11, and an extension (E) of 10, and a BLOSUM62 scoring matrix (Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA $ 89: 10915) Alignment, 50 (B), 10 extensions (E), M = 5, N = -4 and comparison of both strands.
[0159]
Preferably, the "percent sequence identity" is determined by comparing the two optimally aligned sequences on a comparison window of at least 20 positions, where a reference for an optimal alignment between the two sequences is made. Compared to the sequence (which does not contain any additions or deletions), the portion of the polynucleotide sequence in the comparison window that is less than 20%, usually 5-15, or 10-12% additions or deletions (ie, gaps) ). Determining the number of positions where the same nucleobase is present in both sequences to determine the number of matched positions, dividing the number of matched positions by the total number of positions in the reference sequence (ie, window size); The percentage is calculated by multiplying by 100 to determine the percentage of sequence identity.
[0160]
As the skilled artisan will appreciate, as a result of the degeneracy of the genetic code, there are a number of nucleotide sequences that encode a polypeptide as described herein. Some of these polynucleotides support minimal homology to the nucleotide sequence of any native gene. Nevertheless, polynucleotides that vary due to differences in codon usage are specifically contemplated by the present invention. Further, alleles of a gene comprising a polynucleotide sequence provided in the present invention are within the scope of the present invention. Alleles are endogenous genes that have been altered as a result of one or more mutations, such as deletions, additions and / or substitutions, of nucleotides. The resulting mRNA and protein can have an altered structure or function, but need not have one. Alleles can be identified between two standard sequences (eg, by hybridization, amplification, and / or comparison of sequences in a database).
[0161]
Thus, in another aspect of the present invention, a mutagenesis approach, eg, site-directed mutagenesis, is used to prepare immunogenic variants and / or derivatives of the polypeptides described herein. . This approach allows specific modifications in the polypeptide sequence to be made by mutagenesis of the underlying polynucleotide that encodes the polypeptide. These techniques provide a simple method for preparing and testing variants of a sequence that incorporates one or more of the foregoing considerations, for example, by introducing one or more nucleotide sequences into a polynucleotide. Provide an approach.
[0162]
Site-directed mutagenesis generates a mutation using a specific polynucleotide sequence encoding the DNA sequence of the desired mutation, as well as a sufficient number of regulatory nucleotides to generate a mutation in the traversed deletion junction. A stable double helix can be formed on both sides. Using mutations in a selected polynucleotide sequence to improve, alter, reduce, modify, or otherwise alter the properties of the polynucleotide itself, the nature, activity, etc. of the encoded polypeptide , Composition, stability, or primary sequence can be altered.
[0163]
In one aspect of the invention, the invention provides for mutagenesis of the disclosed polynucleotide sequences to alter one or more properties of the encoded polypeptide, for example, the immunogenicity of the polypeptide vaccine. Intended. Techniques for site-directed mutagenesis are well known in the art and are widely used for the preparation of both polypeptide and polynucleotide variants. For example, site-directed mutagenesis is often used to alter certain parts of a DNA molecule. In such embodiments, typically comprising about 14 to about 23 nucleotides, or using primers of such length, about 5 to about 10 residues on each side of the junction of the sequence are altered. Is done.
[0164]
As the skilled artisan will appreciate, phage vectors that exist in both single-stranded and double-stranded form have often been used in site-directed mutagenesis techniques. Typically, vectors effective in site-directed mutagenesis include vectors such as M13 phage. These phages are readily commercially available and their use is generally well known in the art. Also, double-stranded plasmids that eliminate the step of transferring the gene of interest from the plasmid to the phage are routinely used in site-directed mutagenesis.
[0165]
Site-directed mutagenesis according to the present invention involves first obtaining a single-stranded vector or melt-separating the two strands of a double-stranded vector containing in its sequence a DNA sequence encoding the desired peptide. Performed by Oligonucleotide primers supporting the desired mutated sequence were generally prepared synthetically. The primer is then annealed to the single-stranded vector and exposed to a DNA polymerase, such as E. coli polymerase I Klenow fragment, to complete the synthesis of the strand supporting the mutation. Thus, a heteroduplex is formed, where one strand encodes the original non-mutated sequence and the second strand carries the desired mutation. The heteroduplex is then used to transform appropriate cells, for example, E. coli cells, and clones containing a recombinant vector that supports the mutated sequence arrangement are selected.
[0166]
The method of preparing DNA segments encoding selected peptides by site-directed mutagenesis provides a means to generate potentially effective species, and may provide peptide sequence variants and DNA sequences encoding them. There are other possible methods, so there is no limitation. For example, a recombinant vector encoding the desired peptide sequence is treated with a mutagen, such as hydroxylamine, to obtain a sequence variant. Specific details regarding these methods and protocols can be found in the teachings below: Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby 1994; and Maniatis et al., 1982, each of which is cited for that purpose. Are hereby incorporated by reference.
[0167]
As used herein, the term "oligonucleotide-directed mutagenesis procedure" increases the concentration of a particular nucleic acid molecule with respect to its initial concentration, or increases the concentration of a detectable signal, e.g., amplification. , Means template-dependent processes and vector-mediated propagation. As used herein, the term "oligonucleotide-directed mutagenesis procedure" refers to a process that involves template-dependent extension of a primer molecule.
[0168]
The term template-dependent process refers to the nucleic acid synthesis of an RNA or DNA molecule, where the sequence of a newly synthesized strand of nucleic acid is governed by well-known rules of complementary base pairing (eg, Watson, 1987). Typically, vector-mediated methods involve the introduction of a nucleic acid fragment into a DNA or RNA molecule, clonal amplification of the vector, and recovery of the amplified nucleic acid fragment. An example of such a method is provided by U.S. Patent No. 4,237,224, which is specifically incorporated by reference herein in its entirety.
[0169]
In another approach for producing a polypeptide variant of the invention, recursive sequence recombination can be used, as described in US Pat. No. 5,837,458. In this approach, repeated cycles of recombination and screening or selection are performed to, for example, "evolve" individual polynucleotide variants of the invention that have enhanced immunogenic activity.
[0170]
In another aspect of the present invention, the polynucleotide sequences provided in the present invention can be conveniently used as probes or primers for nucleic acid hybridization. As such, a nucleic acid segment comprising a sequence region of at least about 15 contiguous nucleotides that is identical to or complementary to a 15 nucleotide long contiguous sequence disclosed herein has particular utility. It is thought to have. Also, longer contiguous identical or complementary sequences, eg, about 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 (including all intermediate lengths) and even up to full length, may be present in certain embodiments. Will be used in
[0171]
Such nucleic acid probes can be used to detect the presence of a complementary sequence in a given sample because of their ability to specifically hybridize to the sequence in question. However, other uses, such as mutant species primers, or the use of sequence information to prepare primers for use in the production of other genetic constructs are also contemplated.
[0172]
10-14, 15-20, 30, 50 or even 100-200 nucleotides or the like (or even intermediate) that are identical to or complementary to the polynucleotide sequences described herein. Polynucleotide molecules having sequence regions consisting of contiguous stretches of nucleotides (including lengths) are specifically contemplated as hybridization probes for use, for example, in Southern and Northern blotting.
[0173]
This allows the analysis of gene products, or fragments thereof, both in various cell types and also in various bacterial cells. The overall size of the fragment, as well as the size of one or more complementary stretches, will ultimately depend on the intended use or application of a particular nucleic acid segment. Smaller fragments are generally used in hybridization embodiments, where the length of the adjacent complementary region can vary, for example, between about 15 and about 100 nucleotides, but is complementary to the length to be detected. Depending on the target sequence, larger adjacent complementary stretches can be used.
[0174]
Hybridization probes of about 15-25 nucleotides in length can be used to form stable and selective double helix molecules. However, molecules having flanking complementary sequences over stretches of more than 15 bases in length are generally preferred to increase the stability and selectivity of the hybrid and thereby improve the quality and extent of the particular hybrid molecule obtained. In general, it will be preferable to design nucleic acid molecules with gene-complementary stretches of 15 to 25 contiguous nucleotides, if desired.
[0175]
Hybridization probes can be selected from any portion of any of the sequences described herein. All that is required is to provide a sequence from about 15 to 25 nucleotides in length to the full length that is intended to review the sequences described herein or to utilize as a probe or primer for any portion of the sequence. It is an overview. The choice of probe and primer sequences may be governed by various factors. For example, a primer can be used toward the end of the entire sequence.
[0176]
Small polynucleotide segments or fragments can be readily prepared, for example, by directly synthesizing the fragment, as is commonly done using an automated oligonucleotide synthesizer. Fragments can also be synthesized using nucleic acid replication techniques, such as the PCR of US Pat. No. 4,683,202, which is incorporated herein by reference.^TMBy applying the selected sequences into recombinant vectors for recombinant production, and by other recombinant DNA techniques commonly known to those skilled in molecular biology, by applying techniques. Obtainable.
[0177]
The nucleotide sequences of the present invention can be used because of their ability to selectively form double helix molecules with complementary stretches of the entire gene or gene fragment of interest. Depending on the intended application, typically the conditions of hybridization are varied to vary the degree of selectivity of the probe for the target sequence. For applications requiring high sensitivity, hybrids are typically formed using conditions of relative stringency, for example, by increasing the salt concentration at a temperature of about 50 ° C to about 70 ° C from about 0.02M to about By about 0.15M, for example, relatively low salt and / or high temperature conditions are selected. Such selective conditions, if present, allow for slight mismatches between the probe and the template or target strand, and may be particularly suitable for isolating the sequence of interest.
[0178]
Of course, for some applications, for example when trying to prepare mutants using mutant primer strands hybridized to the underlying template, to allow for the formation of heteroduplexes, Will typically require low stringency (reduced stringency) hybridization conditions. In these environments, at conditions ranging from about 20 ° C. to about 55 ° C., salt conditions such as about 0.15 M to about 0.9 M salt conditions can be used.
[0179]
This allows the cross-hybridizing species to be easily identified as a positive hybridization signal for the control hybridization. In each case, it is generally understood that the conditions can be made more stringent by the addition of increasing amounts of formamide, which serves to destabilize the hybrid duplex in the same manner as increasing the temperature. Thus, hybridization conditions can be readily manipulated, and thus will generally be the method of choice depending on the desired result.
[0180]
According to another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide composition comprising an antisense oligonucleotide. Antisense oligonucleotides have proven to be effective, targeted inhibitors of protein synthesis, and ultimately provide a therapeutic approach that can treat disease by inhibiting the synthesis of proteins that contribute to the disease. The efficiency of antisense oligonucleotides to inhibit protein synthesis is well established. For example, the synthesis of polygalacturonase and muscarinic acetylcholine receptor type 2 is inhibited by antisense oligonucleotides directed against their respective mRNA sequences (US Pat. Nos. 5,739,119 and US Pat. 5,759,829).
[0181]
Further examples of antisense inhibition include nucleoprotein cyclin, synonymous drug resistance gene (MDG1), ICAM-1, E-selectin, STK-1, striatal GABA_AProven using receptors and human EGF (Jaskulski et al., Science 1988 Jun 10; 240 (4858): 1544-6; Vasanthakumar and Ahmed, Cancer Commun. 1989; 1 (4) 225-32; Peris et al., Brain Res MoI Brain Res. 1998 Jun 15; 57 (2): 310-20; U.S. Patent No. 5,801,154; U.S. Patent No. 5,789,573; U.S. Patent No. 5,718,709 and U.S. Patent. No. 5,610,288). Also described are antisense constructs that can be used to inhibit and treat a variety of abnormal cell growths, such as cancer (US Pat. No. 5,747,470; US Pat. No. 5,591,317 and U.S. Pat. No. 5,783,683).
[0182]
Thus, in one aspect, the invention provides an oligonucleotide sequence comprising all or a portion of any sequence capable of specifically binding to a polynucleotide sequence described herein, or a complement thereof. provide. In one embodiment, the antisense oligonucleotide comprises DNA or a derivative thereof. In other embodiments, the oligonucleotide comprises RNA or a derivative thereof. In a third aspect, the oligonucleotide is a modified DNA comprising a phosphorothioated modified backbone. In a fourth aspect, the oligonucleotide sequence comprises a peptide nucleic acid or derivative thereof.
[0183]
In each case, preferred compositions are complementary, more preferably substantially complementary, and even more preferably completely complementary, to one or more portions of the polynucleotides described herein. . Selection of an antisense composition specific for a given gene sequence depends on the analysis of the selected target sequence and the secondary structure, T_m, Binding energy, and relative stability. Antisense compositions can be selected based on the relative inability to form dimers, hairpins, or other secondary structures that reduce or inhibit specific binding to a target mRNA in a host cell.
[0184]
Highly preferred target regions of the mRNA are regions at or near the AUG translation initiation codon, and sequences that are substantially complementary to the 5 'region of the mRNA. Analysis of these secondary structures and consideration of target site selection can be found, for example, in software for OLIGO primer analysis and / or BLASTN 2.0.5 algorithm software version 4 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1; 25 ( 17): 3389-402).
[0185]
Also, the use of an antisense delivery method using a short peptide vector called MPG (27 residues) can be considered. The MPG peptide contains a hydrophobic domain from the fusion sequence of HIV gp41 and a hydrophilic domain from the nuclear localization sequence of the SV40 T-antigen (Morris et al., Nucleic Acids Res. 1997 Jul 15; 25 (14) ): 2730-6). Some molecules of the MPG peptide cover the antisense oligonucleotide and can be delivered with relatively high efficiency (90%) into cultured mammalian cells in less than an hour. In addition, interaction with MPG has been demonstrated to strongly increase both the stability of oligonucleotides to nucleases and their ability to cross the plasma membrane.
[0186]
According to another aspect of the present invention, the polynucleotide compositions described herein are used in the design and preparation of ribozyme molecules that inhibit the expression of the tumor polypeptides and proteins of the present invention in tumor cells. Ribozymes are RNA-protein complexes that cleave nucleic acids in site-specific fusions. Ribozymes have a specific catalytic domain with endonuclease activity (Kim and Cech, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987 Dec; 84 (24): 8788-92; Forster and Symons, Cell 1987 Apr 24; 49 ( 2): 211-20).
[0187]
For example, many ribozymes, with a high degree of specificity, promote phosphotransesterification reactions and often cleave only one of several phosphoesters in an oligonucleotide substrate (Cech et al., Cell 1981 Dec; 27 (3 Michel and Westof, J. Mol. Biol. 1990 Dec 5; 216 (3): 585-610; Reinhold-Hurek and Shup, Nature 1992 May 14; 357 (6374): 173-6. ). This specificity contributes to the requirement that the substrate bind to a guide sequence ("IGS") internal to the ribozyme via a specific base-pairing interaction before the chemical reaction.
[0188]
Six basic variants of naturally occurring enzyme RNA are currently known. Each can catalyze the hydrolysis of RNA phosphodiester bonds in trans under physiological conditions (thus being able to cleave other RNA molecules). Generally, enzymatic nucleic acids act by first binding to a target RNA. Such binding occurs through the target binding portion of the enzymatic nucleic acid, where the binding portion is held in close proximity to the enzymatic portion of the working molecule that cleaves the target RNA.
[0189]
Thus, the enzyme nucleic acid first recognizes the target RNA through complementary base pairing, binds to it, and once bound to the correct site, acts to enzymatically cleave the target RNA. Such strategic cleavage of the target RNA destroys its ability to direct the synthesis of the encoded protein. After the enzymatic nucleic acid binds to and cleaves its RNA target, it is released from the RNA and can search for other targets, repeatedly bind to new targets and cleave it.
[0190]
The enzymatic properties of ribozymes are advantageous over a number of techniques, for example, antisense techniques, where a nucleic acid molecule simply binds to a nucleic acid target and blocks its translation. This is because the concentration of ribozyme required to perform therapeutic treatment is lower than the concentration of antisense oligonucleotide. This advantage reflects the ability of the ribozyme to act enzymatically. Thus, a single ribozyme molecule can cleave multiple molecules of the target RNA.
[0191]
In addition, ribozymes are highly specific inhibitors, and the specificity of inhibition depends not only on the base-pairing mechanism that binds to the target RNA, but also on the mechanism of cleavage of the target RNA. A single mismatch or base substitution near the cleavage site can completely eliminate the catalytic activity of the ribozyme. Similar mismatches in antisense molecules do not interfere with their action (Woolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992 Aug 15; 89 (16): 7305- 9). Thus, the specificity of the action of ribozymes is greater than that of antisense oligonucleotides that bind to the same RNA site.
[0192]
An enzymatic nucleic acid molecule can be formed with a motif of a hammerhead, hairpin, hepatitis delta virus, Graph I intron or RNase P RNA (associated with an RNA guide sequence) or Neurospora VS RNA. Examples of hammerhead motifs are described in Rossi et al., Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11; 20 (17): 4559-65. Examples of hairpin motifs are described in the following document: Hample et al. EP 0360257, Hample and Tritz, Biochemistry 1989 Jun 13; 28 (12): 4929-33; Hampton et al., Nucleic Acids Res. 1990 Jan 25; 18 (2): 299-304 and U.S. Patent No. 5,631,359.
[0193]
Examples of hepatitis delta virus motifs are described in Perrotta and Been, Biochemistry 1992 Dec９２1; 31 (47): 11843-52; examples of RNase P motifs are Guerrier-Takada et al., Cell 1983 Dec; 35 ( 3 Pt 2): 849-57; the motif of Neurospora VS RNA was described in the following references: Savile and Collins, Cell 1990 May 18; 61 (4): 686-96; Savile. And Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991 Oct 1; 88 (19): 8826-30; Collins and Olive, Biochemistry 1993 Mar 23; 32 (11): 2795-9; and examples of Group I introns are described in U.S. Patent No. 4,987,071. Was done.
[0194]
All that is important in the enzymatic nucleic acid molecule of the present invention is that it has a specific substrate binding site that is complementary to one or more of the RNA regions of the target gene, and that it has RNA cleavage activity in the molecule. To have a nucleotide sequence within or surrounding the substrate binding site to be conferred. Thus, the ribozyme construct need not be limited to the particular motifs described herein.
[0195]
Ribozymes are described in International Patent Application Publication No. WO 93/23569 and International Patent Application Publication No. Designed and synthesized as described in WO $ 94/02595, each of which is incorporated herein by reference, and tested in vitro and in vivo as described. can do. Also, such ribozymes can be optimized for delivery. Although specific examples are provided, those of skill in the art will recognize that equivalent RNA targets in other species may be utilized as needed.
[0196]
Either alter the length of the ribozyme binding arm or modify it to prevent ribozyme degradation by serum ribonuclease (see the following document: International Patent Application Publication No. WO 92/07065; International Patent Application Publication No. WO International Patent Application Publication No. WO 91/03162; European Patent Application Publication No. 92110298; US Pat. No. 5,334,711; and International Patent Application Publication No.WO 94/13688, which includes enzyme RNA Various chemical modifications that can be made to the sugar portion of the molecule have been described), and have modifications that enhance the efficacy of ribozymes in cells, and have reduced stem II bases to reduce RNA synthesis time and By chemically synthesizing ribozymes with reduced chemical requirements, ribozyme activity It can be optimized.
[0197]
Sullivan et al. (International Patent Application Publication No. WO 94/02595) describe a general method for delivering enzymatic RNA molecules. Ribozymes can be administered to cells by various methods known in the art, including but not limited to: envelopes in liposomes, iontophoresis, or Incorporation into other vehicles such as hydrogels, cyclodextrins, biodegradable nanocapsules, and bioadhesive microspheres. For some applications, ribozymes can be delivered ex vivo directly to cells or tissues with or without the aforementioned vehicles.
[0198]
Alternatively, the RNA / vehicle combination can be delivered locally by direct inhalation, direct injection or use of a catheter, infusion pump or stent. Other delivery routes include, but are not limited to, intravascular, intramuscular, subcutaneous or joint injection, aerosol inhalation, oral (in tablet or pill form), topical, systemic, ocular Intraperitoneal and / or subarachnoid delivery. A more detailed description of ribozyme delivery and administration is provided in International Patent Application Publication No. WO 94/02595 and International Patent Application Publication No. WO 93/23569, each of which is incorporated herein by reference.
[0199]
Another means of accumulating high concentrations of one or more ribozymes in cells is to incorporate a ribozyme-encoding sequence into a DNA expression vector. Transcription of the ribozyme sequence is driven from a promoter for eukaryotic RNA polymerase I (pol I), RNA polymerase II (pol II), or RNA polymerase III (pol III). Transcripts from the pol II or pol III promoter will be expressed at high levels in all cells; the level of a given pol II promoter in a given cell type will depend on the presence of nearby gene regulatory sequences (enhancers, silencers). , And others).
[0200]
Alternatively, a prokaryotic RNA polymerase promoter can be used, provided that the prokaryotic RNA polymerase enzyme is expressed in appropriate cells. Ribozymes expressed from such promoters have been shown to function in mammalian cells. Such transcription units can be incorporated into a variety of vectors for introduction into mammalian cells, such vectors include, but are not limited to: plasmid DNA vectors, A viral DNA vector (eg, an adenovirus or adeno-associated virus vector) or a viral RNA vector (eg, a retrovirus, Semliki Forest virus, Sindbis virus vector).
[0201]
In another aspect of the invention, a peptide nucleic acid (PNA) composition is provided. PNA is a DNA mimic in which nucleobases are attached to the pseudopeptide backbone (Good and Nielsen, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997 7 (4) 431-37). PNAs can be used in a number of ways in which RNA or DNA sequences have traditionally been used. Often, PNA sequences perform better in technology than the corresponding RNA or DNA, and have utility that is not unique to RNA or DNA.
[0202]
An overview of PNAs, including methods of preparation, properties, and uses, is provided in Corey, Trends in Biotechnol 1997 Jun; 15 (6): 224-9. As such, in certain embodiments, preparing a PNA sequence that is complementary to one or more portions of the ACE mRNA sequence and using such a PNA composition to modulate the translation of an ACE-specific mRNA Alter, decrease, or alleviate, thereby altering the level of ACE activity in a host cell to which such a PNA composition has been administered.
[0203]
PNA has a 2-aminoethyl-glycine linkage that replaces the normal phosphodiester backbone of DNA (Nielsen et al., Science 1991 Dec 6; 254 (5037): 1497-500; Hanvey et al., Science 1992 Nov 27; 258 (5087). Hyrup and Nielsen, Bioorg Med Chem. 1996 Jan; 4 (1): 5-23). This chemistry has three important consequences: first, in contrast to DNA or phosphorothioate oligonucleotides, PNA is a neutral molecule; second, PNA is achiral, developing a stereoselective synthesis. Avoiding the need; and third, PNA synthesis uses the standard Boc or Fmoc protocol for solid phase peptide synthesis, but other methods have been used, including the modified Merrifield method.
[0204]
PNA monomers or ready-made oligomers are commercially available from Perceptive Biosystems (Farmingham, Mass.). PNA synthesis with the Boc or Fmoc protocols is straightforward using manual or automated protocols (Norton et al., Bioorg Med Chem. 1995 @ Apr; 3 (4): 437-45). Manual protocols use the production of chemically modified PNAs or the simultaneous synthesis of closely related PNA families.
[0205]
As in peptide synthesis, the success of a particular PNA synthesis will depend on the nature of the sequence chosen. For example, while PNA can theoretically incorporate any combination of nucleotide bases, the presence of adjacent purines can lead to one or more deletions in the product. In anticipation of this difficulty, it is suggested that in the production of PNAs with adjacent purines, the coupling of residues that would be added inefficiently should be repeated. The RNA is then purified by reverse-phase high-pressure liquid chromatography to resemble the product yield and purity as observed during peptide synthesis.
[0206]
Modification of the PNA for a given application can be achieved by coupling of amino acids during solid phase synthesis or coupling of a compound containing a carboxylic acid group to the exposed N-terminal amine. Alternatively, PNA can be modified by coupling to lysine or cysteine introduced after synthesis. The ease with which PNAs can be modified facilitates optimization for better solubility or specific functional requirements. Once synthesized, the identity of PNAs and their derivatives can be confirmed by mass spectrometry.
[0207]
Several studies have been performed and modifications of PNAs have been utilized in these studies (eg, Norton et al., Bioorg Med Chem. 1995 Apr; 3 (4): 437-45; Petersen et al., J. Pept. Sci. 1995 May-Jun; 1 (3): 175-83; Orum et al., Biotechniques 1995 Sep; 19 (3): 472-80; Footer et al., Biochemistry 1996 August 20; 35 (33); 10673-9; Nucleic Acids Res. 1995 Aug 11; 23 (15): 3003-8; Pardridge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995 Jun 6; 92 (12): 5592-6; Natl.Acad.Sci.USA 1995 Mar 14; 92 (6) 1901-5; Gambacorti-Passerini et al., Blood 1996 August 15; 88 (4): 1411-7; Armitage et al., Proc. Acad. Sci. USA 197 Nov 11; 94 (23): 12320-5; Seeger et al., Biotechniques 1997 Sep; 23 (3): 512-7). U.S. Patent No. 5,700,922 discusses chimeric molecules and their use in diagnosis, modification of proteins in organisms, and treatment of conditions susceptible to therapeutic agents.
[0208]
Methods for characterizing the antisense binding of PNA are described in Rose, Anal. Chem. 1993 Dec 15; 65 (24): 3545-9, and Jensen et al., Biochemistry 1997 Apr 22; 36 (16): 5072-7. Rose uses capillary gel electrophoresis to determine the binding of RNA to their complementary oligonucleotides and to measure the kinetics and stoichiometry of relative binding. A similar type of measurement is described by Jensen et al. In BIAcore.^TMWas carried out using
Other uses of PNAs described and apparent to those skilled in the art include the following uses: DNA strand invasion, antisense inhibition, mutational analysis, enhancers of transcription, purification of nucleic acids, isolation of transcriptionally active genes, Blocking transcription factor binding, genomic cleavage, biosensors, in situ hybridization, and more.
[0209]
Polynucleotide identification, characterization and expression
Polynucleotide compositions of the present invention can be identified, prepared, and / or manipulated by a variety of well-established techniques (see, eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, and other similar references). For example, polynucleotides can be identified by screening cDNA microarrays for tumor-associated expression, as described in more detail below (ie, using the representative assays provided herein). At least two times greater in tumor than in normal tissue).
[0210]
Such screening is described, for example, using Affymetrix, Inc. (Affymetrix, Inc., Santa Clara, Calif.) Microarray technology according to the manufacturer's instructions (and essentially as described below). Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619, 1996 and Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997). . Alternatively, the polynucleotide can be amplified from a cell that expresses a protein described herein, for example, cDNA prepared from a tumor cell.
[0211]
A number of template-dependent processes are available for amplifying the target sequence of interest present in a sample. One of the best known amplification methods is disclosed in U.S. Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,800,159, each of which is incorporated in its entirety. The polymerase chain reaction (PCR) described in detail in (herein incorporated by reference).^TM). Briefly, PCR^TMIn, two primer sequences are prepared that are complementary to regions on opposite complementary strands of the target sequence.
[0212]
An excess of deoxynucleotide triphosphate is added to the reaction mixture along with a DNA polymerase (eg, Taq polymerase). If the target sequence is present in the sample, the primer binds to the target and the polymerase extends the primer along the target sequence by addition on nucleotides. As the reaction mixture rises and falls, the extended primer dissociates from the target to form a reaction product, and excess primer binds to the target and reaction product and repeats the process. Preferably, reverse transcription and PCR^TMAn amplification procedure is performed to quantify the amplified mRNA. Polymerase chain reaction is well known in the art.
[0213]
Many of the many other template-dependent processes are PCR^TMA variation on amplification technology that is known in the art and readily available. Illustratively, some such methods include: ligase chain reaction (referred to as LCR), for example, as described in European Patent Application Publication No. No. 3,320,308 and U.S. Pat. No. 4,883,750; Q Beta Replicase, PCT International Patent Application Publication No. PCT / US87 / 00880; Strand Displacement Amplification (SDA) and Repair Chain Reaction (RCR). Still other amplification methods are described in UK Patent Application No. 2,202,328 and PCT International Patent Application Publication No. PCT / US89 / 01025.
[0214]
Other nucleic acid amplification procedures include a transcription-based amplification system (TAS) (PCT International Publication No. WO 88/10315), for example, nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) and 38R. European Patent Application Publication No. $ 329,822 describes a nucleic acid amplification method that involves the cyclic synthesis of single-stranded RNA ("ssRNA"), ssDNA, and double-stranded DNA (dsDNA). PCT International Patent Application Publication No. WO 89/06700 describes an amplification scheme for nucleic acid sequences based on the hybridization of a promoter / primer sequence to a target single-stranded DNA ("ssDNA"), and the subsequent transcription of multiple RNA copies of the sequence. Other amplification methods are well known to those skilled in the art, for example, "RACE" (Frohman, 1990) and "One Sided PCR" (Ohara, 1989).
[0215]
The amplified portion of the polynucleotide of the present invention can be used to isolate a full-length gene from a suitable library (eg, a tumor cDNA library) according to well-known techniques. In such a technique, a library (cDNA or genome) is screened using one or more polynucleotide probes or primers suitable for amplification. Preferably, libraries are selected by size to include larger molecules. Also, a random primed library may be preferred for identifying the 5 'and upstream regions of a gene. Genomic libraries are preferred for gaining introns and extending 5 'sequences.
[0216]
For hybridization techniques, partial sequences can be labeled using well known techniques (eg, nick translation or³²End labeling using P). Bacteria or bacteriophages are then generally screened by hybridizing filters containing modified bacterial colonies (or flora containing phage plaques) with labeled probes (see Sambrook, supra). Et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). The cloning or plaque to hybridize is selected and expanded, and the DNA is isolated for further analysis.
[0217]
For example, cDNA clones can be analyzed to quantify additional sequences by PCR using primers from partial sequences and primers from a vector. Restriction maps and partial sequences can be generated to identify one or more overlapping clones. The complete sequence can then be determined using standard techniques, such techniques involving the generation of a series of deleted clones. The resulting overlapping sequences can then be assembled into a single adjacent sequence. By combining appropriate fragments according to well-known techniques, full-length cDNA molecules can be generated.
[0218]
Alternatively, amplification techniques, such as those described above, may be effective for obtaining full-length coding sequences from partial cDNA sequences. One such amplification technique is inverse PCR (see Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16: 8186, 1998), which uses restriction enzymes to generate fragments in known regions of the gene. The fragment is then circularized by intramolecular conjugation and used as a template for PCR using branched primers from known regions. In a selective approach, sequences adjacent to the partial sequence can be removed by amplification using primers for the linker sequence and primers specific for the known region. Typically, the amplified sequence is subjected to a second round of amplification using the same linker primer and a second primer specific for the known region.
[0219]
A variation on this procedure uses two primers that initiate extensions in opposite directions from the known sequence and is described in WO 96/38591. Another such technique is known as "rapid amplification of cDNA ends" or RACE. This technique involves the use of internal and external primers to identify sequences present 5 'and 3' of the known sequence, which primers hybridize to the polyA region or vector sequence. Additional techniques include capture PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 1119-19, 1991) and walking PCR (Parker et al., Nucl. Acids Res. 19: 3055-60, 1991). Alternatively, full-length cDNA sequences can be obtained using other methods that utilize amplification.
[0220]
In some cases, analysis of sequences provided in an expressed sequence tag (EST) database, for example, sequences available from GenBank, makes it possible to obtain full-length cDNA sequences. In general, searches for overlapping ESTs can be performed according to well-known programs (eg, NCBI BLAST search), and such ESTs can be used to generate adjacent full-length sequences. . The full-length DNA sequence can be obtained by analyzing a genomic fragment.
[0221]
In another embodiment of the present invention, a polynucleotide of the invention, or a polynucleotide sequence encoding a fusion protein or functional equivalent thereof, or a fragment thereof, is used in a recombinant DNA molecule to produce the polynucleotide in a suitable host cell. The expression of the peptide can be directed. Producing, by virtue of the inherent degeneracy of the genetic code, other DNA sequences encoding substantially identical or functionally equivalent amino acid sequences, and using these sequences to clone and express a given polypeptide Can be.
[0222]
As the skilled artisan will appreciate, in some cases it may be advantageous to produce a polypeptide encoding nucleotide sequence with non-naturally occurring codons. For example, select codons preferred by a particular prokaryotic or eukaryotic host to increase the rate of expression of the protein or to increase the desired properties, such as a longer half-life of transcripts generated from naturally occurring sequences. Recombinant transcripts can be produced.
[0223]
Moreover, the polynucleotide sequences of the present invention can be manipulated using methods generally known in the art to alter the polypeptide encoding sequence for various reactions, such alterations being Includes, but is not limited to, changes that modify the cloning, processing, and / or expression of the product. For example, DNA shuffling by random fragmentation and PCR assembly of gene fragments and synthetic oligonucleotides can be used to manipulate the nucleotide sequence. In addition, use site-directed mutagenesis to insert new restriction sites, alter glycosylation patterns, change codon preferences, produce splice variants, or introduce mutations, and so on. be able to.
[0224]
In another aspect of the invention, a natural, modified or recombinant nucleic acid sequence can be linked to a heterologous sequence to encode a fusion protein. For example, to screen a peptide library for inhibitors of polypeptide activity, it may be useful to encode a chimeric protein that can be recognized by commercially available antibodies. Also, engineering the fusion protein to include a cleavage site located between the sequence encoding the polypeptide and the heterologous protein sequence, thus cleaving and purifying the polypeptide at a location remote from the heterologous portion. Can be.
[0225]
Sequences encoding the desired polypeptides can be synthesized, in whole or in part, using chemical methods well known in the art (see, for example, Carruthers, M .; H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232. Alternatively, the protein itself can be produced using the amino acid sequence of the polypeptide, or a chemical method of synthesizing it. For example, peptide synthesis can be performed using various solid-phase techniques (Roberge, JT, et al. (1995) Science 269: 202-204) and, for example, the ABI 431A peptide synthesizer (Perkin @ Elmer, (Palo Alto, Calif.) Can be used to achieve automated synthesis.
[0226]
The newly synthesized peptides can be obtained by preparative high performance liquid chromatography (eg, Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY) or in the field. Substantial purification can be achieved by other comparable techniques possible. The composition of the synthetic peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (eg, Edman degradation). Further, the amino acid sequence of the polypeptide, or any portion thereof, may be altered during direct synthesis and / or combined with sequences from other proteins, or any portion thereof, according to chemical methods to provide a mutant polypeptide Can be produced.
[0227]
In order to express the desired polypeptide, the nucleotide sequence encoding the polypeptide, or functional equivalent, is a suitable expression vector, such as a vector containing the necessary elements for transcription and translation of the inserted coding sequence. Can be inserted inside. Methods well known in the art can be used to construct expression vectors containing a sequence encoding the polypeptide of interest and appropriate transcriptional and translational regulators. These methods include in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. Such techniques are described, for example, in the following documents: Sambrook, J .; (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.M. Y. And Ausubel, F .; M. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.M. Y. .
[0228]
A variety of expression vector / host systems can be utilized to contain and express the polynucleotide sequence. These include, but are not limited to: microorganisms, such as bacteria transformed with a recombinant bacteriophage, plasmid, or cosmid DNA expression vector; yeast transformed with a yeast expression vector; viral expression. Insect cell lines infected with a vector (eg, baculovirus); transformed with a viral expression vector (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or a bacterial expression vector (eg, Ti or pBR322 plasmid) Plant cells; or animal cell lines.
[0229]
The "regulators" or "regulatory sequences" present in the expression vector are the untranslated regions of the vector—enhancers, promoters, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions—these interact with host cell proteins for transcription and translation. Is performed. Such factors can change their strength and specificity. Any number of transcription and translation elements, including constitutive and inducible promoters, can be used, depending on the vector system and host utilized. For example, when cloning in bacterial systems, inducible promoters can be used, such as the hybrid lacZ promoter of PBLUESCRIPT phagemid (Stratagene, La Jolla, CA) or the PSPORT1 plasmid (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) and others. .
[0230]
In mammalian cell systems, promoters from mammalian genes or mammalian viruses are generally preferred. If it is necessary to generate a cell line that contains multiple copies of the sequence encoding the polypeptide, vectors based on SV40 or EBV may be conveniently used with an appropriate selectable marker.
[0231]
In bacterial systems, any number of expression vectors may be selected, depending on the use intended for the expressed polypeptide. For example, when large quantities are required, for example, to elicit antibodies, vectors that direct high level expression of fusion proteins that are easy to purify can be used. Such vectors include, but are not limited to: multifunctional E. coli cloning and expression vectors, such as BLUESCRIPT (Stratagene), wherein the sequence encoding the polypeptide of interest is a vector. Can be combined in-frame with the amino-terminal Met of β-galactosidase and the sequence of the subsequent 7 residues to produce a hybrid protein; the pIN vector (Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) ) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509);
[0232]
Alternatively, a foreign polypeptide can be expressed as a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) using a pGEX vector (Promega, Madison, WI). Generally, such fusion proteins are soluble and can be purified from lysed cells by adsorption to glutathione-agarose beads and then eluted in the presence of free glutathione. Proteins made in such a system can be designed to include a heparin, thrombin, or factor XA protease cleavage site to optionally release the cloned polypeptide of interest from the GST moiety.
[0233]
In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH can be used. For an overview, see: Ausubel et al. (Supra) and Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544.
[0234]
When using plant expression vectors, expression of the polypeptide-encoding sequence can be driven by a number of promoters. For example, viral promoters, such as the 35S and 19S promoters of CaMV, can be used alone or in combination with the omega leader sequence from TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. # 6: 307-311). ). Alternatively, plant promoters, such as the small subunit of RUBISCO or the heat shock promoter, can be used (Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Borglie, R. et al. (1984). And Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105). These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection.
[0235]
Such techniques are described in mnt publicly available overviews (see, eg, Hobbs, S. or Murry, LE, McGraw Hill Yearbook of Science and Technology). (1992) McGraw Hill, New York, NY; pp. 191-196).
In addition, insect systems can be used to express the polypeptide of interest. For example, in one such system, Autographa califormica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) is used as a vector, and Spodoptera frugiperda cells or Trichophlavia cells are used. To express the foreign gene.
[0236]
The sequence encoding the polypeptide can be cloned into a nonessential region of the virus, eg, the polyhedrin gene, and placed under conditions of the polyhedrin promoter. Successful insertion of the polypeptide encoding sequence inactivates the polyhedrin gene and produces a recombinant virus lacking the coat protein. The recombinant virus can then be used, for example, to infect S. frugiperda cells or Trichophrusia larvae that can express the polypeptide of interest (Engelhard). (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 3224-3227).
[0237]
In mammalian host cells, a number of viral-based systems are generally available. In cases where an adenovirus is used as an expression vector, sequences encoding the polypeptide of interest can be ligated into an adenovirus transcription / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. Insertions in non-essential E1 or E3 regions of the viral genome can be used to obtain viable viruses capable of expressing the polypeptide in infected host cells (Logan, J. and Shenk, T., et al. 1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers, such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer, can be used to increase expression in mammalian host cells.
[0238]
Also, specific initiation signals can be used to achieve more efficient translation of the sequence encoding the polypeptide of interest. Such signals include the ATG start codon and adjacent sequences. When the sequence encoding the polypeptide, its initiation codon, and upstream sequences are inserted into the appropriate expression vector, no additional transcription or translation signal may be necessary.
[0239]
However, when inserting only the coding sequence, or a portion thereof, exogenous translational control signals, including the ATG start codon, should be provided. In addition, the start codon should be in the correct reading frame to ensure translation of the entire insert. Exogenous translation factors and initiation codons can be of various natural and synthetic origins. Expression efficiency can be enhanced by including enhancers that are appropriate for the particular cell line used, such as those described in the literature (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20). : 125-162).
[0240]
In addition, host strains can be chosen for their ability to modulate the expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Also, post-translational processing that cleaves the "prepro" form of the protein can be used to promote correct insertion, folding and / or function. Different host cells, such as CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293, and W138, which have specific cellular and characteristic mechanisms for such translational activity, are selected to correct the modification of foreign proteins and Processing can be guaranteed.
[0241]
For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is generally preferred. For example, an expression vector can be used to transform a cell line that stably expresses the polynucleotide of interest, wherein the expression vector is a viral origin of replication and / or an endogenous expression factor, and the same or another vector. The above selectable marker gene can be included. After the introduction of the vector, the cells can be allowed to grow for 1-2 days in an enriched media, after which the media can be replaced with a selective media. The purpose of a selectable marker is to confer resistance to selection, the presence of which allows for the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated by tissue culture techniques appropriate to the cell type.
[0242]
Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines. These include, but are not limited to: the herpes simplex virus thymidine kinase gene (Wigler et al. (1997) Cell 11: 223-32) and the adenine phosphoribosyltransferase gene (Lowy, I. et al. (1990). Cell 22: 817-23) (these can be used in tk.sup.- or aprt.sup.- cells, respectively).
[0243]
Also, antimetabolite, antibiotic or herbicide resistance can be used as selection criteria; for example, dhfr, which confers resistance to methotrexate (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-70); npt, which confers resistance to aminoglycosides, neomycin and G-418 (Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-140); and als or pat , Which confer resistance to chlorsulfuron and phosphinothricin acetyltransferase, respectively (Murry, supra).
[0244]
Additional selectable genes have been described, for example, trpB, which makes cells available for indole instead of tryptophan, or hisD, which makes cells available for histinol instead of histidine. (Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 804-51). The use of visible markers has become popular with markers such as anthocyanins, beta-glucuronidase and its substrate GUS, and luciferase and its substrate luciferin, which not only identifies transformants, but also specific vector systems. (RHodes, CA et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55: 121-131).
[0245]
The presence / absence of the marker gene indicates that the gene in question is also present, but its presence and expression need to be confirmed. For example, if a sequence encoding a polypeptide is inserted within a marker gene sequence, recombinant cells containing the sequence can be identified by the absence of marker gene function. Alternatively, the marker gene can be placed under the control of a single promoter in tandem with the sequence encoding the polypeptide. Usually, expression of the marker gene in response to induction or selection further indicates expression of the tandem gene.
[0246]
Alternatively, host cells containing and expressing the desired polynucleotide sequence can be identified by various procedures known in the art. These procedures include, but are not limited to: DNA-DNA or DNA-RNA hybridization and protein bioassays or immunoassay techniques, which detect, for example, nucleic acids or proteins and / or Includes membrane, solution, or chip-based techniques for quantifying.
[0247]
Various protocols for detecting and measuring the expression of a polynucleotide-encoded product using polyclonal or monoclonal antibodies specific for the product are known in the art. Examples include an enzyme-linked immunoassay (ELISA), a radioimmunoassay (RIA), and a fluorescence-activated immunosorbent assay (FACS). Although a two-site, monoclonal-based immunoassay utilizing monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on a given polypeptide may be preferred for some applications, using a competitive binding assay You can also. These and other assays are described, inter alia, in the following references: Hampton, R.A. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Minn., And Maddox, D .; E. FIG. (1983) J. Am. Exp. Med. 158: 1211-1216.
[0248]
A wide variety of labels and conjugation techniques are known in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Labeled hybridization or PCR probes that detect sequences related to polynucleotides include oligo labeling, nick translation, end-labeling or PCR amplification using labeled nucleotides. Alternatively, the sequence, or any portion thereof, can be cloned into a vector for the production of an mRNA probe.
[0249]
Such vectors are known in the art, are commercially available, and synthesize RNA probes in vitro by the addition of a suitable RNA polymerase, eg, T7, T3, or SP6, and a labeled nucleotide. Can be used for These procedures can be performed using various commercially available kits. Suitable reporter molecules or labels that can be used include radionucleotides, enzymes, fluorescent, chemiluminescent, or chromogenic factors, as well as substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and the like.
[0250]
Host cells transformed with the polynucleotide sequence of interest can be cultured under conditions suitable for the expression and recovery of the protein from cell culture. The protein produced by the recombinant cell can be secreted or contained intracellularly depending on the sequence and / or the vector used. As those skilled in the art will appreciate, expression vectors containing the polynucleotides of the present invention can be designed to contain signal sequences that direct secretion of the encoded peptide through prokaryotic or eukaryotic cell membranes. Other recombinant constructs can be used to join a sequence encoding the polypeptide of interest to nucleotides encoding a polypeptide domain that facilitates purification of the soluble protein.
[0251]
Such purification-promoting domains include, but are not limited to: metal-chelating peptides, such as the histidine-tryptophan module, which allows for purification on immobilized metals, purification on immobilized immunoglobulins. Possible protein A domains and domains used in the FLAGS extension / affinity purification system (Immunex Corp., Seattle, WA). To facilitate purification, a cleavable linker sequence between the purification domain and the encoding polypeptide, such as factor XA or enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA), can be included.
[0252]
One such expression vector expresses a fusion protein containing the polypeptide of interest and a nucleic acid encoding the six histidine residues preceding the thioredoxin or enterokinase cleavage site. Histidine residues are described in Porath, J .; Et al. (1992) Prot. Exp. Purif. While facilitating purification on IMIAC (immobilized metal ion affinity chromatography) as described in 3: 263-281, the enterokinase cleavage site provides a means to purify the desired polypeptide from the fusion protein. Vectors containing fusion proteins are described in Kroll, D .; J. (1993) DNA Cell Biol. 12: 441-453.
[0253]
In addition to recombinant production methods, the polypeptides of the invention, and fragments thereof, can be produced by direct peptide synthesis using solid-phase techniques (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154). Protein synthesis can be performed by manual techniques or by automation. Automated synthesis can be accomplished, for example, using an Applied Biosystems 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer). Alternatively, the various fragments can be chemically synthesized separately and combined using chemical methods to produce the full-length molecule.
[0254]
Antibody compositions, fragments thereof and other binding agents
According to another aspect, the present invention further provides a binding agent, e.g., an antibody and a binding agent thereof, that exhibits immunological binding to a tumor polypeptide disclosed herein, or a portion, variant or derivative thereof. An antigen binding fragment is provided. Antibodies and antigen-binding fragments thereof react with a polypeptide of the present invention at detectable levels (eg, in an ELISA assay) and do not detectably react with an unrelated polypeptide under similar conditions. It is said to "bind specifically", "bind immunologically", and / or "immunologically reactive" therewith a polypeptide of the invention.
[0255]
Immunologically binding, as used herein, generally refers to a type of non-covalent interaction that occurs between an immunoglobulin molecule and an antigen to which the immunoglobulin is specific. The immunologically binding interaction is the dissociation constant of the interaction (K_d) Where the smaller K_dRepresents greater affinity. The immunological binding of the selected polypeptide can be quantified by methods well known in the art.
[0256]
One such method involves measuring the rates of antigen binding site / antigen complex formation and dissociation, where the rates are the concentration of the complex partner, the affinity of the interaction, and the rate in both directions. Depending on geometric parameters that affect the Thus, the "on rate constant" (K_on) And the "off rate constant" (K_off) Can be determined by calculating the concentration and the actual rates of association and dissociation. K_off/ K_onRatio allows for the elimination of all parameters not related to affinity, thus dissociation constant K_dbe equivalent to. See generally, the following references: Davies et al. (1990) Ann. Rev .. Biochem. 59: 439-473.
[0257]
The “antigen-binding site” or “binding portion” of an antibody refers to that portion of the immunoglobulin molecule that participates in binding the antigen. The antigen binding site is formed by amino acid residues in the N-terminal variable ("V") region of the heavy ("H") and light ("L") chains. The three highly branched stretches within the heavy and light chain V regions are called "hypervariable regions" and these regions are more conserved, known as "framework regions" or "FR". Interposed between the flanking stretches.
[0258]
Thus, the term "FR" refers to an amino acid sequence that occurs naturally between and adjacent to the hypervariable regions in an immunoglobulin. In an antibody molecule, the three hypervariable regions of the light chain and three hypervariable regions of the heavy chain are positioned relative to each other in a three-dimensional space to form an antigen binding surface. The antigen binding surface is complementary to the three-dimensional surface of the bound antigen, and the three hypervariable regions of each of the heavy and light chains are called "complementarity determining regions" or "CDRs."
[0259]
In addition, binding agents can distinguish patients with or without cancer from cancer, eg, prostate cancer, by the representative assays provided herein. For example, antibodies or other binding agents that bind to an oncoprotein preferably generate a signal indicating the presence of cancer in at least about 20% of patients with the disease, more preferably at least about 30% of the patients. Alternatively or additionally, the antibody will generate a signal indicating the absence of disease in at least about 90% of individuals without cancer.
[0260]
To determine whether a binding agent satisfies this requirement, a biological sample from a patient with or without cancer (eg, blood, serum, sputum, urine, and / or tumor biopsy) is used. One can assay for the presence of a polypeptide that binds to a binding agent as described herein. Preferably, a sample with or without a statistically significant number of diseases is assayed. Each binding agent should satisfy the above criteria; however, as the skilled artisan will appreciate, combinations of binding agents can be used to improve sensitivity.
[0261]
Any factor that satisfies the above requirements can be a binding factor. For example, the binding agent can be a ribosome with or without a peptide component, an RNA molecule or a polypeptide. In a preferred embodiment, the binding agent is an antibody or an antigen-binding fragment thereof. Antibodies can be prepared by various techniques known in the art. See, for example, the following references: Harlow and Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
[0262]
Generally, cell culture techniques, such as the generation of monoclonal antibodies as described herein, or the transfection of the antibody gene into a suitable bacterial or mammalian cell host to allow for the production of recombinant antibodies. By doing so, an antibody can be produced. In one technique, an immunogen comprising a polypeptide is first injected into a variety of mammals (eg, a mouse, rat, rabbit, sheep or goat). In this step, the polypeptide of the invention can serve as an immunogen without modification.
[0263]
Alternatively, particularly for relatively short polypeptides, a better immune response can be elicited when the polypeptide is coupled to a carrier protein, such as bovine serum albumin or keyhole limpet hemocyanin. The immunogen is injected into the animal host and blood is periodically bled from the animal, preferably according to a predetermined schedule incorporating one or more booster immunizations. Polyclonal antibodies specific for the polypeptide can then be purified from such antisera, for example, by affinity chromatography using the polypeptide coupled to a suitable solid support.
[0264]
See, for example, Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976, and improved techniques thereto, can be used to prepare monoclonal antibodies specific to the antigenic polypeptide of interest. Briefly, these methods involve the preparation of an immortalized cell line that can produce antibodies with the desired specificity (ie, reactivity with the polypeptide of interest). Such a cell line can be produced, for example, from splenocytes obtained from an animal immunized as described above. The splenocytes are then immunized, for example, by fusion of the myeloma cells with a fusion partner, preferably one that is syngeneic with the immunized animal.
[0265]
Various fusion techniques can be used. For example, spleen cells and myeloma cells are combined with a non-ionic detergent for a few minutes and then plated at low density on a selective medium that supports the growth of hybrid cells but does not support the growth of myeloma cells. In a preferred selection technique, HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) selection is used. After a sufficient time, usually about 1-2 weeks, hybrid colonies are observed. Single colonies are selected and their culture supernatants are tested for binding to the polypeptide. Hybridomas with high reactivity and specificity are preferred.
[0266]
Monoclonal antibodies can be isolated from the supernatant of growing hybridoma colonies. In addition, various techniques can be used to increase yields, for example, injection of hybridoma cells into the peritoneal cavity of a suitable vertebrate host, such as a mouse. The monoclonal antibody can then be collected from ascites or blood. Contaminants can be removed from the antibody by conventional techniques, such as chromatography, gel filtration, precipitation, and extraction. The polypeptides of the present invention can be used in a purification process, for example, an affinity chromatography step.
[0267]
A number of therapeutically effective molecules are known in the art that comprise an antigen binding site that can exhibit the immunological binding of an antibody molecule. The proteolytic enzyme papain preferentially cleaves the IgG molecule to produce several fragments, two of each ("F (ab)"), each of which has a covalent bond containing an intact antigen binding site. A heterodimer. The enzyme can cleave an IgG molecule to produce several fragments, which fragments comprise "F (ab '), comprising both antigen binding sites.₂"Fragments.
[0268]
"Fv" fragments can be produced by preferential proteolytic cleavage of IgM, in rare cases, IgG or IgA immunoglobulin molecules. However, Fv fragments are commonly derived by recombinant techniques known in the art. Fv fragments are non-covalent V that contain an antigen-binding site that retains much of the antigen-recognition and binding ability of the native antibody molecule._H:: V_LIncludes heterodimers. Inbar et al. (1972) Proc. {Natl. {Acad. {Sci. {USA} 69: 2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem. {15: 2706-2710; and Ehrlich et al. (1980) Biochem. $ 19: 4091-4096.
[0269]
Single-chain Fv ("sFv") polypeptides have a covalent V_H:: V_LV that is a heterodimer and is linked by a polypeptide that encodes a linker_HAnd V_LIs expressed from a gene fusion that includes the gene encoding Huston et al. (1988) Proc. {Natl. {Acad. {Sci. {USA} 85 (16): 5879-5883. To convert light and heavy polypeptide chains from the naturally aggregated-but chemically separated-antibody V region into sFv molecules that fold into a three-dimensional structure that is structurally similar to the structure of the antigen binding site Describe a number of ways to distinguish chemical structures. See, for example, US Pat. Nos. 5,091,513 and 5,132,405 to Huston et al .; and US Pat. No. 4,946,778 to Ladner et al.
[0270]
Each of the foregoing molecules comprises a set of heavy and light chain CDRs, interposed between the heavy and light chain FR sets, respectively, which provides support for the CDRS and the spatial relationship of the interrelated CDRs. Is determined. As used herein, the term “CDR set” refers to the three hypervariable regions of the heavy and light chain V regions. Proceeding from the N-terminus of the heavy or light chain, these regions are designated "CDR1," "CDR2," and "CDR3," respectively.
[0271]
Thus, the antigen binding site encompasses six CDRs, comprising a set of CDRs from each of the heavy and light chain V regions. A polypeptide comprising a single CDR (eg, CDR1, CDR2 or CDR3) is referred to herein as a "molecular recognition unit." By crystallographic analysis of a number of antigen-antibody complexes, the amino acid residues of the CDR form extensive contacts with the bound antigen, where the majority of the extensive contacts are with the heavy chain CDR3 Was proved. Thus, the molecular recognition unit is specifically concerned primarily with the antigen binding site.
[0272]
As used herein, the term "set of FRs" refers to the four flanking amino acid sequences that frame the CDRs of the set of CDRs of the heavy or light chain V region. Some FR residues can make contact with the bound antigen; however, FR is primarily involved in folding the V region into FR residues immediately adjacent to the antigen-binding site, particularly the CDRS. In FR, certain amino residues and certain structural features are very highly conserved.
[0273]
In this regard, all V region sequences contain an internal disulfide loop of about 90 amino acid residues. When the V region folds into the binding site, the CDRs are displayed as protruding loop motifs that form the antigen binding surface. It is generally recognized that, regardless of the exact CDR amino acid sequence-there is a conserved structural region of the FR that affects the shape of the CDR loops folded into certain "canonical" structures. In addition, certain FR residues are known to participate in non-covalent interdomain contacts and to stabilize antibody heavy and light chain interactions.
[0274]
A number of "humanized" antibody molecules comprising antigen binding sites derived from non-human immunoglobulins have been described, including: chimeric antibodies with rodent V regions and human Their related CDRs fused to the constant region (Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299; Lobglio et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224; Shaw et al. (1987) J 138: 4534-4538; and Brown et al. (1987) Cancer Res. 47: 3577-3584), rodents grafted into human supporting FRs prior to fusion with the constant domains of appropriate human antibodies. CDR (Riechmann et al. (1988) Nature 3) 2: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1544-1536; and Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525), and rods supported by recombinantly veneered rodent FRs. Dental CDR (European Patent Application Publication No. 519,596, issued December 23, 1992). These "humanized" molecules are designed to minimize undesired immunological responses to rodent anti-human antibody molecules, which limit the duration and effectiveness of those portions in therapeutic use in human recipients Is done.
[0275]
As used herein, the terms “venerized FR” and “recombinantly veneered FR” are heterologous comprising an antigen binding site that retains substantially all of the native FR polypeptide folding structure. To provide a molecule, it is meant to selectively replace FR residues with human FR residues, for example, from the V region of a rodent heavy or light chain. The veneering technique is based on the understanding that the ligand binding properties of the antigen binding site were determined primarily by the structure and relative position of the heavy and light chains.
[0276]
Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem. $ 59: 439-473. Thus, antigen binding specificity can only be preserved in humanized antibodies, where CDR structures, their interaction with each other, and their interaction with the rest of the V region domain are carefully maintained . By using the veneering technology technique, the external (eg, solvent accessible) FR residues that are readily encountered by the immune system are selectively replaced with human residues to produce a weakly immunogenic, or substantially To form a hybrid molecule comprising a non-immunogenic veneered surface.
[0277]
In the veneering process, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition (U.S. Dept. of Health and Human Services, US Government Printing on Human Government Printing with Antibody Collected by US Government Printing, 1973). Use available sequence data, updates to the Kabat database, and other accessible US and foreign databases (both nucleic acids and proteins). The solvent accessibility of amino acids only in the V region can be deduced from the known three-dimensional structures for human and murine antibody fragments. In veneering of a murine antigen binding site, there are two general steps.
[0278]
First, the FRs of the variable domains of the antibody molecule in question are compared with the corresponding FR sequences of the human variable domains obtained from the sources identified above. The most homologous human V regions are then compared residue-to-residue with the corresponding murine amino acid. Residues in the murine FR that differ from their human counterparts are substituted for residues present in the human part by recombinant techniques well known in the art. Amino acid residues that can perform residue exchange only using at least partially exposed (solvent accessible) moieties and have a significant effect on the tertiary structure of the V region, eg, Care is taken in the substitution of proline, glycine and charged amino acids.
[0279]
In this method, the resulting “venerized” murine antigen binding site is thus designed to retain the following residues: murine CDR residues, residues substantially adjacent to the CDR, buried or almost buried (Solvent accessible), residues believed to participate in non-covalent (eg, electrostatic and hydrophobic) contacts between heavy and light chain domains, and a CDR loop “canonical” "Residues from conserved structural regions of the FR that are thought to affect tertiary structure. A recombinant nucleotide sequence is then prepared using these design criteria, and these recombinant nucleotide sequences are combined with the apparent human FRs, both the heavy and light chain CDRs of the murine antigen binding site, and These human FRs can be used to transfect mammalian cells to express recombinant human antibodies that exhibit the antigen specificity of the molecule.
[0280]
In another aspect of the invention, the monoclonal antibodies of the invention can be coupled to one or more therapeutic agents. Suitable therapeutic agents in this regard include radionuclides, differentiation inducers, drugs, toxins, and derivatives thereof. Preferred radionuclides are⁹⁰Y,¹²³I,¹²⁵I,¹³¹I,¹⁸⁶Re,²¹¹At, and²¹²Bi. Preferred agents include methotrexate, and pyrimidine and purine analogs. Preferred differentiation inducers include phorbol esters and butyric acid. Preferred toxins include ricin, abrin, diphtheria toxin, cholera toxin, gelonin, Pseudomonas exotoxin, Shigella (Shigella) toxin, and pokeweed antiviral proteins.
[0281]
The therapeutic agent can be coupled (eg, covalently) directly or indirectly (ie, via a linker group) to the appropriate monoclonal antibody. A direct reaction between a therapeutic agent and an antibody is possible when each has a substituent capable of reacting with the other. For example, reacting one nucleophilic group, eg, an amino or sulfhydryl group, with another carbonyl-containing group, eg, an anhydride or acid halide, or an alkyl group containing a good leaving group (eg, a halide). Can be.
[0282]
Optionally, it may be desirable to couple the therapeutic agent and the antibody via a linker group. The linker group can function as a spacer, separating the antibody from the therapeutic agent and preventing binding. Also, a linker group can serve to increase the chemical reactivity of a substituent on a therapeutic agent or an antibody, and thus increase coupling efficiency. Also, increased chemical reactivity can facilitate the use of therapeutic agents, or the use of functional groups on therapeutic agents, that would otherwise not be possible.
[0283]
As will be apparent to those of skill in the art, various bifunctional and multifunctional reagents, both homo- and hetero-functional, are described in catalogs such as Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. Reagent) can be used as a linker group. Coupling can be carried out, for example, through amino groups, carboxyl groups, sulfhydryl groups or oxidized carbohydrate residues. There are numerous references describing such methods. For example, U.S. Patent No. 4,671,958 to Rodwell et al.
[0284]
When not containing the antibody portion of the immunoconjugate of the invention, it may be desirable to use a linker group that is cleavable when internalized into the cell, if the therapeutic agent is more potent. A number of different cleavable linker groups have been described. The mechanism of intracellular release of a therapeutic agent from these linker groups involves cleavage by the following reactions: reduction of disulfide bonds (eg, US Pat. No. 4,489,710 to Spitler); Irradiation (eg, US Pat. No. 4,625,014 to Senter et al.), Hydrolysis of derivatized amino acid side chains (eg, US Pat. No. 4,638,045 to Kohn et al.), Serum complement mediated hydrolysis ( For example, U.S. Pat. No. 4,671,958 to Rodwell, and acid-catalyzed hydrolysis (e.g., U.S. Pat. No. 4,569,789 to Blattler et al.).
[0285]
It may be desirable to couple more than one therapeutic agent to the antibody. In one embodiment, multiple molecules of the therapeutic are coupled to one antibody molecule. In other embodiments, more than one type of therapeutic agent can be coupled to one antibody. Regardless of the particular embodiment, the immunoconjugate with the two or more therapeutic agents can be prepared in various ways. For example, two or more therapeutic agents can be directly coupled to the antibody molecule, or a linker that provides multiple binding sites can be used. Alternatively, a carrier can be used.
[0286]
The carrier can have the therapeutic agent in a variety of ways, for example, directly or covalently via a linker group. Suitable carriers include proteins, such as albumin (eg, US Pat. No. 4,507,234 to Kato et al.), Peptides and polysaccharides, such as aminodextrins (eg, US Pat. No. 4,699,784 to Shih et al.). ). The carrier may also support the therapeutic agent by non-covalent attachments, or by an envelope, for example, in a liposome vehicle (eg, US Pat. No. 4,429,008 and US Pat. No. 4,873,088). Can be.
[0287]
Carriers specific for radionuclide agents include small radiohalogenated molecules and chelating compounds. For example, U.S. Pat. No. 4,735,792 describes representative radiohalogenated small molecules and their synthesis. Radionuclide chelates can be formed from chelating compounds, which include nitrogen and sulfur atoms, such as metals or metal oxides, compounds containing a donor atom for binding to the radionuclide. I do. For example, U.S. Pat. No. 4,673,562 to Davison et al. Discloses representative chelates and their synthesis.
[0288]
T Cell composition
The invention, in another aspect, provides T cells specific for a tumor polypeptide described herein, or a variant or derivative thereof. Generally, such cells can be prepared in vitro or ex vivo according to standard protocols. For example, T cells can be isolated from a patient's bone marrow, peripheral blood, or a fraction of bone marrow or peripheral blood using a commercially available cell separation system, such as the following: Isolex available from Thexel Therapeutics, Inc., Irvine, CA^TM System (see also the following references: US Pat. No. 5,240,856; US Pat. No. 5,215,926; WO 89/06280; WO 91/16116 and WO 92/07243). Alternatively, the T cells can be derived from a related or unrelated human, non-human mammal, cell line or culture.
[0289]
T cells can be stimulated with a polypeptide, a polynucleotide encoding a polypeptide, and / or an antigen presenting cell (APC) that expresses such a polypeptide. Such a stimulus is performed under conditions and for a time sufficient to permit the generation of T cells that are specific for the polypeptide of interest. Preferably, a tumor polypeptide or polynucleotide of the invention is present in a delivery vehicle, eg, a microsphere, to promote generation of specific T cells.
[0290]
A T cell is specific for a polypeptide of the invention if it proliferates specifically, secretes cytokines, or kills target cells coated with a peptide or expressing a gene encoding a polypeptide. Think there is. T cell specificity can be assessed according to various standard techniques. For example, in a chromium release or proliferation assay, a stimulation index of a 3-fold or more increase in lysis and / or proliferation compared to a negative control indicates T cell specificity. Such assays can be performed, for example, as described in the following references: Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070, 1994. Alternatively, detection of T cell proliferation can be achieved by various known techniques.
[0291]
For example, T cell proliferation can be detected by measuring an increase in the rate of DNA synthesis (eg, pulse labeling of T cell cultures using tritiated thymidine, and tritiated thymidine incorporated into DNA). By measuring the amount). Typically, contact with a tumor polypeptide (100 ng / ml to 100 μg / ml, preferably 200 ng / ml to 25 μg / ml) for 3 to 7 days will increase T cell proliferation by at least 2-fold.
[0292]
Contact for 2-3 hours as described above activates T cells as measured by a standard cytokine assay, where a two-fold increase in cytokine (eg, TNF or TNF-γ) release levels is due to T cell activity (See the following literature: Colligan et al., Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Wiley Interscience (Green 1998)). T cells activated in response to tumor polypeptides, polynucleotides or polypeptide-expressing APCs have CD4⁺And / or CD8⁺Can be. Tumor polypeptide-specific T cells can be expanded by standard techniques. In a preferred embodiment, the T cells are derived from the patient, a related donor or an unrelated donor, and are administered to the patient after stimulation and expansion as described below.
[0293]
CD4 proliferating in response to tumor polypeptides, polynucleotides or APCs for therapeutic purposes⁺Or CD8⁺The number of T cells can be expanded in vitro or in vivo. Tumor polypeptides, or immunogenic portions of such polypeptides, with or without the addition of cells of T cell growth factors, eg, interleukin-2, and / or stimulators that synthesize tumor polypeptides T cells can be exposed in vitro to a short peptide corresponding to Alternatively, the number of one or more T cells that grow in the presence of the tumor polypeptide can be expanded by cloning. Methods for cloning cells are well known in the art and include limiting dilution.
[0294]
Pharmaceutical composition
In an additional aspect, the invention provides one or more of the polynucleotides, polypeptides, or polypeptides disclosed herein for administration to a cell or animal, alone or in combination with one or more therapies. It relates to a formulation comprising a T cell and / or antibody composition and a pharmaceutically acceptable carrier.
[0295]
As will be appreciated, if desired, the compositions disclosed herein can be administered in combination with other agents, such as other proteins or polypeptides or various therapeutically active agents. it can. In fact, there is virtually no limit on the other components that can be added, unless the additional agent causes significant adverse effects upon contact with the target cell or host tissue. The composition can then be delivered with various other agents as needed in certain cases. Such compositions can be purified from host cells or other biological sources, or can be optionally chemically synthesized, as described herein. Similarly, such compositions can further comprise a substituted or derivatized RNA or DNA composition.
[0296]
Accordingly, in another aspect of the present invention, a medicament comprising one or more of the polynucleotides, polypeptides, antibodies, and / or T cell compositions disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier. A composition is provided. In certain preferred embodiments, the pharmaceutical compositions of the invention comprise the immunogenic polynucleotide and / or polypeptide compositions of the invention for use in prophylactic and therapeutic vaccine applications. In general, vaccine compositions are described, for example, in the following references: F. Powell and M.W. J. Newman, "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach))", Plenum Press (NY, 1995). Generally, such a composition will comprise one or more polynucleotide and / or polypeptide compositions of the invention and one or more immunostimulants.
[0297]
As will be apparent to those skilled in the art, any of the pharmaceutical compositions described herein can contain pharmaceutically acceptable salts of the polynucleotides and polypeptides of the present invention. Such salts include, for example, pharmaceutically acceptable non-toxic bases, such as salts of organic bases (eg, salts of primary, secondary and tertiary amines and basic amino acids) and salts of inorganic bases. (Eg, sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, and magnesium).
[0298]
In other embodiments, an exemplary immunogenic composition, eg, a vaccine composition, of the present invention comprises DNA encoding one or more of the foregoing polypeptides, such that the polypeptide is generated in situ. It becomes. As mentioned above, the polynucleotides can be administered by various delivery systems known in the art.
[0299]
In fact, many gene delivery techniques are well known in the art and are described, for example, in the following references: Rolland, Crit. Rev .. Therap. Drug Carrier \ Systems 15: 143-198, 1998, and references cited therein. Of course, a suitable polynucleotide expression system will contain the necessary regulatory DNA regulatory sequences for expression in the patient (eg, a suitable promoter and termination signal). Alternatively, the bacterial delivery system, in this case, expresses the immunogenic portion of the polypeptide on the cell surface or provides for the administration of a bacterium that secretes such an epitope (eg, Bacillus-Calmette-Guerrin). Can be included.
[0300]
Thus, in certain embodiments, the polynucleotides encoding the immunogenic polypeptides disclosed herein can be prepared using any of a number of known virus-based systems, using suitable mammalian host cells for expression. Introduced inside. In one exemplary embodiment, retroviruses provide a convenient and effective platform for gene delivery systems. According to techniques known in the art, a selected polynucleotide encoding a polypeptide of the invention can be inserted into a vector and packaged into a retroviral particle.
[0301]
The recombinant virus can then be isolated and delivered to the subject. A number of exemplary retroviral systems have been described (e.g., U.S. Pat. No. 5,219,740; Miller and Rosman (1989) Bio Technologies 7: 980-990; Miller, AD (1990) Human). Gene Therapy 1: 5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; and Boris-Lawrie and Teur (93). Opin. Genet. Develop. 3: 102-109).
[0302]
In addition, a number of exemplary adenovirus-based systems have been described. Unlike retroviruses, which integrate into the host genome, adenoviruses persist extrachromosomally, thus minimizing the risks associated with insertional mutagenesis (Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Virol. 57: 267). Bet et al. (1993) J. Virol. 67: 5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5: 717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68: 933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1: 51-58; Berkner, KL (1988) Bio Technologies 6: 616-629; and Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4: 461-476).
[0303]
Also, various adeno-associated virus (AAV) vector systems have been developed for delivery of polynucleotides. AAV vectors can be readily constructed using techniques well known in the art. See, for example, U.S. Patent Nos. 5,173,414 and 5,139,941; WO 92/01070 and WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molecl. Cell. Biol. 8: 3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B .; J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N.M. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129; Kotin, R .; M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1: 165-169; and Zhou et al. Exp. Med. 179: 1867-1875.
[0304]
Additional viral vectors useful for delivering a polynucleotide encoding a peptide of the invention by gene transfer include those derived from the pox family of viruses, eg, vaccinia virus and avianpox virus. As an example, a vaccinia virus recombinant expressing a novel molecule can be constructed as follows.
[0305]
First, a DNA encoding a polypeptide is inserted into an appropriate vector so as to be adjacent to a vaccinia promoter and a flanking vaccinia DNA sequence, for example, a sequence encoding thymidine kinase (TK). The vector is then used to transfect cells, which are simultaneously infected with vaccinia. Homologous recombination serves to insert the vaccinia promoter plus the gene encoding the polypeptide of interest into the viral genome. Culturing the cells in the presence of 5-bromodeoxyuridine and picking up viral plaques that are resistant to TK. A sup (-) recombinant can be selected.
[0306]
A vaccinia-based infection / transfection system is advantageously used to provide inducible, transient or co-expression of one or more of the polypeptides described herein in a host cell of an organism. be able to. In this particular system, cells are first infected in vitro with a vaccinia virus recombinant encoding bacteriophage T7 RNA polymerase. This polymerase exhibits exquisite specificity, where it transcribes only the template that supports T7 polymerase. After infection, the cells are transfected with the polynucleotide or polynucleotide of interest and driven by the T7 promoter.
[0307]
The polymerase expressed in the cytoplasm from the vaccinia virus recombinant transcribes the transfected DNA into RNA, which is then translated into a polypeptide by the host translation machinery. This method provides high levels of transient, cytoplasmic production of RNA and its translation products. See, for example, the following references: Eloy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA (1990) 87: 6743-6747; Fuerst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA (1986) 83: 8122-8126.
[0308]
Alternatively, avipoxviruses such as fowlpox and canalipoxviruses can also be used to deliver the coding sequence in question. Recombinant avipoxviruses are known to express immunogens from mammalian pathogens and confer protective immunity when added to non-avian species. The use of avipox vectors is particularly desirable in humans or other mammalian species. This is because members of the avipoc gene can only replicate productively in susceptible avian species and are not infectious in transformed mammalian cells. Avipoc virus is known in the art and uses genetic recombination as described above for the production of vaccinia virus. See, for example, the following documents: WO 91/03429; and WO 92/03545.
[0309]
Also, a number of alphaviruses can be used to deliver the polynucleotide compositions of the present invention, for example, the vectors described in the following references: US Pat. No. 5,843,723; US Pat. No. 6,015,686; US Pat. No. 6,008,035 and US Pat. No. 6,015,694. Venezuelan equine encephalitis (VEE) can also be used, and illustrative examples are described in US Pat. No. 5,505,947 and US Pat. No. 5,643,576.
[0310]
In addition, complex vectors such as those described by Michael et al. Biol. Chem. (1993) 268: 6866-6869 and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099-6103, can also be used for gene delivery in the present invention.
[0311]
Additional information on delivery systems based on these and other known viruses is described, for example, in Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17-21, 1990; U.S. Patent No. 4,603,112; U.S. Patent No. 4,769,330; and U.S. Patent No. 5,017,487. WO 89/01973; U.S. Patent No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 91: 215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88: 2838-2848, 1993; and Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202-1207, 1993.
[0312]
In some embodiments, the polynucleotide can be integrated into the genome of the target cell. This integration can be at a specific location and orientation via homologous recombination (gene replacement) or can be integrated at a random, non-specific location (gene augmentation). In yet other embodiments, the polynucleotide can be stably maintained as a separate, episomal segment of DNA in the cell. Such polynucleotide segments or "episomes" encode sequences sufficient to permit maintenance and replication independently or synchronously with the host cell cycle. The manner in which the expression construct is delivered to the cell and the polynucleotide stops in the cell depends on the type of expression construct used.
[0313]
In other aspects of the invention, the polynucleotides are administered / delivery as "naked" DNA, for example, as described in the following references: Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993 and Cohen. Science 259: 1691-1692, 1993. By coating the DNA on biodegradable beads, which are efficiently transported into cells, the absorption of naked DNA can be increased.
[0314]
In still other embodiments, the compositions of the present invention can be delivered via a particle bombardment approach, many of which have been described. In one illustrative example, gas-propelled particle acceleration is provided by a device, such as Powderjet Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) and Powderjet Vaccines Inc. (Madison, Wisconsin). U.S. Pat. No. 5,846,796; U.S. Pat. No. 6,010,478; U.S. Pat. No. 5,865,796; U.S. Pat. No. 5,584,807; 0,500,799. This approach provides a needle-free delivery approach, where a dry powdered formulation of microscopic particles, e.g., polynucleotide or polypeptide particles, is jetted with helium gas generated by a hand-held device. Accelerated at high speed, the particles are propelled into the target tissue of interest.
[0315]
In a related aspect, another device and method useful for needle-free gas propulsion infusion of the composition of the present invention comprises a device provided by Biojet, Inc. (Portland, Oreg.). And some examples thereof are described in the following references: US Pat. No. 4,790,824; US Pat. No. 5,064,413; US Pat. No. 5,312,335; US U.S. Patent No. 5,383,851; U.S. Patent No. 5,399,163; U.S. Patent No. 5,520,639 and U.S. Patent No. 5,993,412.
[0316]
According to another aspect, a pharmaceutical composition described herein comprises one or more immunostimulants and an immunogenic polynucleotide, polypeptide, antibody, T cell and / or APC composition of the invention. Will be included. Immunostimulant refers to essentially any substance that enhances or enhances the immune response (antibody and / or cell mediated) to an exogenous antigen. One preferred type of immunostimulant comprises an adjuvant. Many adjuvants are substances designed to protect the antigen from rapid catabolism, such as aluminum hydroxide or mineral oil, and stimulators of the immune response, such as lipid A, Bordetella pertussis or human form Contains proteins from Mycobacterium tuberculosis.
[0317]
Certain adjuvants are commercially available, examples of which are: Freund's incomplete adjuvant and Freund's complete adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc.). AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); aluminum salts such as aluminum hydroxide gel (alum) or aluminum phosphate; calcium, iron or zinc salts; acylated tyrosine Insoluble suspensions; acylated sugars; polysaccharides derivatized cationically or anionically; polyphosphazenes; biodegradable microspheres; monophosphoryl lipid A and quill @ A. Also, cytokines such as GM-CSF, interleukin-2, -7, -12, and other growth factors can be used as adjuvants.
[0318]
In one embodiment of the invention, the adjuvant composition is preferably one that induces a predominantly Th1-type immune response. High levels of Th1-type cytokines (eg, IFN-γ, TNFα, IL-2 and IL-12) tend to be suitable for inducing a cell-mediated immune response to the administered antigen. In contrast, high levels of Th2-type cytokines (eg, IL-4, IL-5, IL-6 and IL-10) tend to be suitable for inducing a humoral immune response.
[0319]
After application of the vaccine provided in the present invention, the patient will support an immune response, including TH1-type and Th2-type responses. In a preferred embodiment, the response is predominantly Th1 type and the level of Th1 type cytokine will increase to a greater extent than the level of Th2 type cytokine. The levels of these cytokines can be easily assessed by standard assays. For an overview of the cytokine family, see: Mosman and Coffman, Ann. Rev .. Immunol. 7: 145-173, 1989.
[0320]
Certain preferred adjuvants that predominantly induce a Th1-type response include, for example, a combination of monophosphoryl lipid A, preferably 3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A, and an aluminum salt. MPL^TMAdjuvants are available from Crixa Corporation (Seattle, WA; see, for example, US Pat. No. 4,436,727; US Pat. No. 4,877,611; U.S. Pat. Nos. 4,866,034 and 4,912,094). Also, oligonucleotides containing CpG (where the CpG dinucleotide is unmethylated) primarily induce a Th1 response.
[0321]
Such oligonucleotides are well known in the art and are described, for example, in the following references: WO 96/02555, WO 99/33488 and US Pat. No. 6,008,200 and US Pat. 5,856,462. Immunostimulatory DNA sequences have also been described, for example, in Sato et al., Science 273: 352, 1996. Other preferred adjuvants comprise saponins, such as Quil A, or a derivative thereof, and include QS21 and QS7aQUILA Biopharmaceuticals Inc. Esin; Digitonin; or Gyssofila or Chenopodium quinoa saponins. Other preferred formulations comprise a combination of two or more saponins and an adjuvant of the invention, for example, a combination of at least two of the following groups: QS21, QS7, Quil A, β-eosin, or digitonin.
[0322]
Optionally, saponin formulations can be prepared from chitosan or other polycationic polymers, polylactide and polylactide-co-glycolide particles, poly-N-acetylglucosamine based polymer matrices, polysaccharides or chemically modified polysaccharides. It can be combined with composed particles, liposome and lipid based particles, particles composed of glycerol monoester, and vaccines composed of others.
[0323]
Saponins can also be formulated in the presence of cholesterol to form particulate structures such as liposomes or ISCOMs. In addition, saponins can be formulated with non-particulate solutions or suspensions or in particulate structures, such as microlamellar liposomes or ISCOMs, together with polyoxyethylene ethers or esters. Saponin may also be used as an excipient, for example, Carbopl.^TMTo increase the viscosity, or can be formulated in dry powder form with a powdered excipient, such as lactose.
[0324]
In one embodiment, the adjuvant system comprises a combination of a monophosphoryl lipid A and a saponin derivative, for example, QS21 and 3D-MPL as described in WO 94/00153.^TMCombinations with adjuvants or low-reaction compositions wherein QS21 is quenched with cholesterol, as described in WO 96/33739. Another preferred formulation comprises an oil-in-water emulsion and tocopherol. Oil-in-water emulsion QS21, 3D-MPL^TMOther particularly preferred adjuvant formulations using adjuvants and tocopherols are described in WO 95/17210.
[0325]
Other enhanced adjuvant systems include the combination of oligonucleotides containing CpG with saponin derivatives, particularly the combination of CpG with QS21 is disclosed in WO 00/09159. Preferably, the formulation further comprises an oil-in-water emulsion and tocopherol.
[0326]
Additional exemplary adjuvants for use in the pharmaceutical compositions of the present invention include: Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, CA, USA), ISCOMS (CSL), MF- 59 (Chiron), the SBAS series of adjuvants (e.g., available from SBAS-2 or SBAS-4, SmithKline Beecham, Lixensart, Belgium), Detox (Enhanzyn)^TMCorixa, Hamilton, MT), RC-59 (Corixa, Hamilton, MT), and other aminoalkylglucosamine 4-phosphates (AGPs), such as pending U.S. patent applications Ser. Nos. 08 / 853,826 and 83; No. 09 / 074,720 (the disclosures of which are incorporated herein by reference), and adjuvants of polyoxyethylene ethers, such as those described in WO 99/52549 A1. What you have.
[0327]
Other preferred adjuvants include adjuvant molecules of the general formula:
(1) @HO (CH₂CH₂O)_n-AR
Where n is 1 to 50, A is a bond or —C (O) —, and R is C_1-50Alkyl or phenyl C_1-50Alkyl.
[0328]
One aspect of the present invention comprises a vaccine formulation comprising a polyoxyethylene ether of general formula (I), wherein n is 1 to 50, preferably 4 to 24, most preferably 9; The component is C_1-50, Preferably C₄-C₂₀Alkyl, most preferably C₁₂Is alkyl, and A is a bond. The concentration of polyoxyethylene ether ranges from 0.1 to 20%, preferably 0.1 to 10%, most preferably 0.1 to 1%. Preferred polyoxyethylene ethers are selected from the following groups: polyoxyethylene-9-lauryl ether, polyoxyethylene-9-steolyl ether, polyoxyethylene-8-steolyl ether, polyoxyethylene-4-lauryl. Ethers, polyoxyethylene-55-lauryl ether, and polyoxyethylene-23-lauryl ether.
[0329]
Polyoxyethylene ethers, such as polyoxyethylene lauryl ether, are described in the Merck Index (12th edition: entry 7717). These adjuvant molecules are described in WO 99/52549. The polyoxyethylene ether according to the above general formula (I) can be combined with another adjuvant, if necessary. For example, a preferred adjuvant combination preferably uses CpG, as described in pending UK Patent Application GB9820956.2.
[0330]
According to another aspect of the present invention, the immunogenic composition described herein is an antigen presenting cell (APC), such as dendritic cells, macrophages, B cells, monocytes and efficient APCs. It is delivered to the host via other operable cells. Such cells can be genetically modified to increase antigen-presenting ability, improve activation and / or maintenance of T cell responses, make them themselves antitumor, and / or It can be made immunologically compatible (ie, a matched HLA haplotype), but that is not required. APCs can generally be isolated from a variety of biological fluids and organs, such as tumors and peritumoral tissues, and can be autologous, allogeneic, syngeneic or xenogenic cells.
[0331]
In one embodiment of the present invention, dendritic cells or their progeny are used as antigen presenting cells. Dendritic cells are highly potent APCs (Banchereau and Steinman, Nature 392: 245-251, 1998) and may be effective as physiological adjuvants to elicit prophylactic or therapeutic anti-tumor immunity. (See Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529, 1999).
[0332]
In general, dendritic cells have their typical shape (in situ astrocytes, with pronounced cytoplasmic processes visible in vitro (dendrites)), the ability to pick up, process and present antigens with high efficiency, naive Can be identified based on their ability to activate a strong T cell response. Of course, dendritic cells can be engineered to express specific cell surface receptors or ligands not normally found on dendritic cells in vivo or ex vivo, and such modified dendritic cells can be engineered. Cells are contemplated by the present invention. As an alternative to dendritic cells, secreted vesicular antigen-loaded dendritic cells (called exosomes) can be used in vaccines (see Zitvogel et al., Nature Med. 4: 594-600, 1998).
[0333]
Dendritic cells and progeny can be obtained from peripheral blood, bone marrow, tumor infiltrating cells, peritumoral tissue-infiltrating cells, lymph nodes, spleen, skin, umbilical cord blood or any other suitable tissue or fluid. For example, dendritic cells are differentiated ex vivo by adding a combination of cytokines such as GM-CSF, IL-4, IL-13 and / or TNFα to a culture of monocytes collected from peripheral blood. Can be. Optionally, a combination of GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 ligand, LPS, flt3 ligand and / or one or more other compounds that induce putative differentiation, maturation and proliferation is added to the medium. Thus, CD34-positive cells collected from peripheral blood, umbilical cord blood, or bone marrow can be differentiated into dendritic cells.
[0334]
Dendritic cells are conveniently categorized as "immature" and "mature" cells, which allow to distinguish between two well-characterized phenotypes in a simple manner. However, this nomenclature should not be construed as excluding all possible intermediate stages of differentiation. Immature cells have been characterized as APCs having a high capacity to absorb and process antigens, which correlate with high expression of Fcγ and mannose receptors. The mature phenotype is typically characterized by low expression of these markers, but cell surface molecules involved in T cell activation, such as class I and class II MHC, adhesion molecules such as CD54 and It is characterized by high expression of CD11) and costimulatory molecules (eg, CD40, CD80, CD86 and 4-1BB).
[0335]
Generally, by transfecting APCs with a polynucleotide of the present invention (or a portion or variant thereof), the encoded polypeptide, or an immunogenic portion thereof, can be expressed on the cell surface. Such transfection treatment can be performed in vitro, and the agent containing the transfected cells can be used for therapeutic purposes as described herein. Alternatively, transfection can occur in vivo by administering to the patient a gene delivery vehicle that targets dendritic or other antigen presenting cells.
[0336]
For example, the in vivo and in vitro transfection of dendritic cells may be performed by a known method as described in WO97 / 24447, or by Mahvi et al in Immunology and cell Biology 75: 456-460 (1997). This can be done using a gene gun approach.
[0337]
Antigen loading of dendritic cells involves dendritic cells or progenitor cells together with tumor polypeptides, DNA (neat or inserted into a plasmid vector) or RNA; or antigen-expressing recombinant bacteria or viruses (eg vaccinia, fowlpox) Virus, adenovirus or lentiviral vector). Prior to loading, the polypeptide is covalently linked to an immune partner that provides T cell help (such as a carrier molecule). Alternatively, dendritic cells may be pulsed with a non-covalently bound immune partner separately from or in the presence of the polypeptide.
[0338]
Suitable carriers known to those skilled in the art can be used for the agents of the present invention, but the type of carrier usually varies depending on the mode of administration. The drug of the present invention may be prepared in accordance with the administration mode, such as topical, oral, nasal, transmucosal, intravenous, intracranial, intraperitoneal, subcutaneous, or intramuscular.
[0339]
The carriers used in such agents are biocompatible and may be biodegradable. In certain embodiments, it may be preferable to formulate the active ingredient release level so that it is relatively constant. However, in other embodiments, it is preferable to release relatively quickly upon administration. The preparation of such agents is well possible at the level of those skilled in the art using known techniques. Carriers useful in this regard include microparticles such as poly (lactide-co-glycolide), polyacrylate, latex, starch, cellulose, dextran, and the like.
[0340]
Suppressed release carriers include supramolecular biovectors that include a non-flowable hydrophilic core (eg, a cross-linked polysaccharide or oligosaccharide) and, optionally, an outer layer of an amphiphilic compound such as a phospholipid (US Pat. 5,151,254 and PCT applications WO 94/20078, WO 94/23701 and WO 96/06638). The amount of active compound included in a controlled release formulation will vary depending upon the site of implantation, the rate and time of release and the nature of the condition to be treated or prevented.
[0341]
In another embodiment, biodegradable microspheres (eg, polyactate-polyglycolate) are used as carriers for the agents of the present invention. Suitable biodegradable microspheres are described, for example, in U.S. Patent Nos. 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; Nos. 5,853,763; 5,814,344; 5,407,609 and 5,942,252. The modified hepatitis B core protein carrier system disclosed in WO 99/40934 and cited herein by reference is also suitable for various uses. Another carrier / delivery system uses a granular protein complex as disclosed in US Patent No. 5,928,647, which elicits a class I-restricted cytotoxin T lymphocyte response in a host. Sometimes.
[0342]
The agents of the present invention often comprise one or more buffers (eg, neutral or phosphate buffered saline), carbohydrates (eg, glucose, mannose, sucrose or dextran), mannitol, protein A polypeptide or amino acid, for example, glycine, an antioxidant, a bacteriostat, a chelating agent such as EDTA or glutathione, an auxiliary (eg, ammonium hydroxide), isotonic, hypertonic, or hypotonic in the patient's blood. Also includes solutes to suspend, suspending agents, concentrating agents and / or preservatives. The agents of the present invention can also be formulated as a lyophilizate.
[0343]
The agents of the invention may be provided in single or multi-dose containers, such as sealed ampoules or sealed vials. Such containers are sealed to maintain sterility and stability until use. In general, the formulations are stored in suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous vehicles. A form is also possible in which the preparation is stored in a lyophilized state and only a sterile solution needs to be added immediately before use.
Formulations suitable for oral, parenteral, intravenous, intranasal, and intramuscular administration for the use of certain drugs have already been developed in various ways, some of which are described below.
[0344]
For some uses, the agents of the present invention can be administered to animals in an oral manner. These agents may then be formulated with an inert diluent or assimilable edible carrier, or enclosed in hard or soft gelatin capsules, compressed into tablets, or directly combined with the food. it can.
The active compound can be combined with excipients and used in the form of tablets, sublingual tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like (eg, Mathiwits et al., Nature 1997 Mar 27; 386 (6623). Hwang et al., Crit Rev The drug Carrier System 1998: 15 (3) -243-84; U.S. Patent No. 5,641,515; U.S. Patent No. 5,580,579 and U.S. Patent. No. 5,792,451).
[0345]
Tablets, troches, pills, capsules and the like are various auxiliaries, for example, binders such as tragacanth, acacia, corn starch, gelatin; excipients such as dicalcium phosphate; dispersants such as corn starch, potato starch, alginic acid and the like. Glidants such as magnesium stearate; and sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin, or flavoring agents such as peppermint, wintergreen oil, cherry flavoring.
[0346]
When the dosage form is a capsule, it can contain, in addition to the above materials, a liquid carrier. Various other materials may be included for coating or for physically changing the dosage form. For example, tablets, pills, or capsules may be coated with shellac, sugar or both. Of course, regardless of the form in which they are taken, the materials used must be pharmaceutically pure and the amount used should be substantially harmless.
[0347]
In many cases, these preparations contain at least about 0.1% or more of the active compound, but the percentage of active ingredient is not uniform, from about 1 or 2% to about 60% by weight or volume of the total preparation. % Or 70% or more. The amount of active compound in the medicament useful for each therapeutic purpose is adjusted so that a single dose of a given compound ensures the required intake. The solubility, bioavailability, biological half-life, route of administration, shelf life, and other pharmaceutical considerations are well known to those skilled in the pharmaceutical arts, and a variety of administration and treatment methods are desirable.
[0348]
For oral administration, the agents of the invention can be formulated in combination with one or more excipients into forms such as mouthwashes, dentifrices, buccal preparations, inhalants, sublingual tablets and the like. The active ingredient may, for example, be incorporated into an oral cavity containing sodium borate, glycerin, potassium bicarbonate, into a dentifrice, into a composition comprising water, a binder, an abrasive, a fragrance, a foaming agent, a humectant. A therapeutically effective amount can be added. It can also be dispensed in the form of a tablet or solution that dissolves in the mouth, such as under the tongue.
[0349]
In some cases, it may be desirable to administer the agents of the invention parenterally, intravenously, intramuscularly, or intraperitoneally. Such approaches are known, some of which are disclosed in U.S. Patent Nos. 5,543,158, 15,641,515 and 5,399,363. In some embodiments, the active compound, which is in the form of a free base or a pharmaceutically acceptable salt, is formulated as an aqueous solution mixed with a surfactant such as hydroxypropylcellulose. Glycerol, liquid polyethylene glycols, and mixtures thereof and dispersions in oils are also possible. Under ordinary conditions of storage and use, these preparations usually contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.
[0350]
Injectable forms include sterile aqueous solutions or suspensions or sterile powders from which such sterile aqueous solutions or dispersions can be prepared (see, for example, US Pat. No. 5,466,468). There is. In all cases, they must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. It must be stable and protected against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and molds during the manufacturing and storage stages. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing water, ethanol, polyol (glycerol, propylene glycol, and the like), a suitable mixture thereof, and / or a vegetable oil.
[0351]
Proper fluidity can be maintained by utilizing a coating such as lecithin, maintaining the required particle size in the case of dispersion, and / or using a surfactant. The action of microorganisms can be readily prevented by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. In order to prolong the absorption of the injection, an absorption delaying agent such as aluminum monostearate or gelatin may be contained to delay the absorption.
[0352]
In embodiments where the solution is in the form of an aqueous solution for parenteral administration, the solution may be suitably buffered, if necessary, and the diluent first rendered isotonic with sufficient saline or glucose. Such aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration. Sterile aqueous media that can be used for this will be readily apparent to those skilled in the art in light of the present disclosure. For example, one dose may be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and added to 1000 ml of a subcutaneous injection solution or injected into a predetermined injection site (for example, “REMINGTON's Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pp 1035-1038). And 1570-1580). Some variation in dosage is necessary depending on the condition of the patient. In addition, when administered to humans, it must, of course, meet the sterility, pyrogenicity, and other general safety and purity standards as set forth by the Biologics Standards Division of the Food and Drug Administration.
[0353]
In another embodiment of the invention, the drug is formulated in a neutral or salt form. Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts (formed with the free amino groups of proteins), which may be inorganic acids such as hydrochloric or phosphoric acid, or acetic acid, oxalic tartaric acid, mandelic acid. Formed with such organic acids. Salts formed with free carboxyl groups are inorganic bases, such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium hydroxide, ferric hydroxide, and organic bases, such as isopropylamine, trimethylamine, histidine, procaine Can be derived from such. Upon formulation, the solutions will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in such amount as is suitable for therapeutic purposes.
[0354]
Carriers also include solvents, dispersion media, vehicles, coatings, diluents, antibacterial and antifungal agents, tonicity agents, absorption delaying agents, buffers, carrier solutions, suspensions, colloids, and the like. The use of these media and agents in pharmaceutically active substances is known. As long as the known media or agents are not incompatible with the active ingredient, they can be used in therapeutic agents. It is also possible to incorporate supplementary active ingredients into the components. The term “pharmaceutically acceptable” means molecules and compositions that do not produce an adverse reaction such as allergy when administered to a human.
[0355]
In some embodiments, the medicament can be administered by intranasal spray, inhalation and / or other aerosol administration vehicles. Methods for administering genes, nucleic acids and peptides directly to the lung via a nasal aerosol spray are disclosed, for example, in US Patent Nos. 5,756,353 and 5,804,212. Similarly, a method of administering a drug using intranasal fine particle resin (Takenaga et al., J Controlled Release 1998 Mar 2: 52 (1-2): 81-7) and a lysophosphatidyl-glycerol compound (US Patent No. No. 5,725,871) is also known. Similarly, a method of administering drugs via mucosa in the form of a polytetrafluoroethylene support matrix is disclosed in U.S. Patent No. 5,780,045.
[0356]
In some embodiments, liposomes, nanocapsules, microparticles, lipid particles, air bubbles, and the like are used to introduce the agents of the present invention into appropriate host cells / organs. In particular, the agents of the present invention can be formulated for administration encapsulated in lipid particles, liposomes, air bubbles, nanospheres, nanoparticles and the like. Alternatively, it can be bound to the surface of the carrier vehicle in a covalent or non-covalent manner.
[0357]
The formation and use of liposomes and liposomal agents as potential carriers are known to those skilled in the art (eg, Lasic, Trends Biotechl 1998 Jul; 16 (7): 307-21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 Mar; 56 (3). Candran et al., Indian J Exp Biol. 1997 Aug; 35 (8): 801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995; 12 (2-3): 233-61; (US Pat. No. 5,567,434; US Pat. No. 5,795,587) incorporated herein by reference.
[0358]
Liposomes have been successfully used in combination with many types of cells that are otherwise difficult to transfect, such as T cell suspensions, primary hepatocyte strains, and PC12 cells (Rennenisen et al., J Biol). Chem. 1990 Sep 25; 265 (27): 16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. 1990 Apr; 9 (3): 221-9). Furthermore, liposomes do not have the DNA length limitations typical of virus-based administration systems. It has been successfully used to introduce genes, various drugs, radiotherapeutic agents, enzymes, viruses, transcription factors, allosteric effectors, etc. into various cell lines and animals. Also, the use of liposomes is not expected to cause autoimmune reactions or serious poisoning accidents.
[0359]
In some embodiments, liposomes are formed by dispersing phospholipids in an aqueous medium and spontaneously generating multi-layered concentric double vacuoles (also referred to as multi-layered vacuoles (MLVs)).
[0360]
In another embodiment, a pharmaceutically acceptable nanocapsule formulation of the agent of the present invention is provided. In general, nanocapsules can stably and reproducibly encapsulate a drug (see, for example, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pham. 1998 Dec; 24 (12): 1113-28). In order to avoid side effects due to intracellular polymerization overload, the ultrafine particles (about 0.1 μm) can be decomposed in vivo using a polymer. The method for producing the particles is described, for example, in Couvreur et al. , Crit Rev The Drug Carrier System. 1988; 5 (1): 1-20; Muhlen et al. , Eur J Pharm Biopham. 1998 Mar; 45 (2): 149-55; Zambaux et al. , J Controlled Release 1998 Jan 2; 50 (1-3): 31-40; oyobi U.S. Patent No. 5,145,684.
[0361]
How to treat cancer
As another aspect of the present invention, the above-mentioned drug can be used for immunotherapy of cancer, particularly prostate cancer. In this method of treatment, the agent is typically administered to a warm-blooded animal, preferably a human. The patient may or may not have cancer. That is, the use of the above-mentioned drug can prevent the occurrence of cancer or treat cancer patients. Drugs and vaccines are administered before and after surgical resection of the primary tumor and / or radiation or conventional chemotherapy. As described above, the drug may be administered by an appropriate method such as intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, intradermal, anal, vaginal, topical or oral.
[0362]
In some embodiments, the immunotherapy is an aggressive immunotherapy that relies on in vivo stimulation of the endogenous host immune system and suppresses tumors by administration of immune response modifiers (eg, polypeptides and polynucleotides). That is.
[0363]
In another embodiment, the immunotherapy administers a drug (effector cells or antibodies) with a reputed tumor immunoreactivity that mediates, directly or indirectly, antitumor effects and does not necessarily depend on the intact host immune system. This is passive immunotherapy. Examples of the effector cells include the T cells and T lymphocytes (CD8⁺Cytotoxic T lymphocytes and CD4⁺T-helper tumor infiltrating lymphocytes), killer cells (Natural Killer cells and lymphocyte activated killer cells), B cells and antigen-presenting cells expressing polypeptides (dendritic cells and macrophages).
[0364]
For adoptive immunotherapy, a T cell receptor and an antibody receptor specific for the polypeptide may be cloned, expressed, and transferred to another vector or effector cell. In passive immunotherapy, polypeptides can also be used to generate antibodies or antibodies of the anti-idiotype (see US Pat. No. 4,918,164).
[0365]
Effector cells can be obtained in sufficient amounts for adoptive immunotherapy by in vitro culture. Culture conditions for growing a single antigen-specific effector cell to billions and allowing antigen recognition in vivo are known. Such in vitro culture conditions often utilize intermittent antigen stimulation in the presence of cytokines (eg, IL-2) and undivided feeder cells. As noted above, the use of immunoreactive polypeptides allows rapid growth of antigen-specific T cell strains and the generation of cells required for immunotherapy.
[0366]
Specifically, antigen presenting cells, such as dendritic cells, macrophages, monocytes, fibroblasts and / or B cells, are pulsed with immunoreactive polypeptides by known techniques, or one or two or more. More than one kind of polynucleotide may be transfected. For example, antigen presenting cells can be transfected with a polynucleotide having a promoter suitable for promoting expression in a recombinant virus or other expression system.
[0367]
Effector cells cultured for use in therapy must be able to grow and distribute widely and survive in vivo for long periods of time. According to the research results, it is possible to grow a large number of effector cells over a long period of time by growing cultured effector cells in vivo and repeating stimulation with an antigen supplemented by IL-2 (for example, long-term effector cells). Cheever et al., Immunological Reviews 157: 177, 1997).
[0368]
A vector expressing the polypeptide can be introduced into antigen-presenting cells collected from a patient, expanded by cloning in vitro, and then transplanted into the same patient again. It can be reintroduced into the patient by known means, preferably under sterile conditions, by intravenous, intracavitary, intraperitoneal or intratumoral administration.
[0369]
The route, frequency and dose of therapeutic agents will vary from individual patient to individual and can be readily determined by standard techniques. Generally, drugs and vaccines are administered by injection (eg, intradermal, intramuscular, intravenous or subcutaneous), intranasal (eg, inhalation) or orally. Preferably, six doses are administered at monthly intervals followed by booster vaccine administration. Different protocols may be appropriate for individual patients. When administered, it can promote an anti-tumor immune response, and if at least a 10-50% level increase (compared to before treatment), it is adequate.
[0370]
The immune response can be monitored by measuring the patient's anti-tumor antibodies or by vaccine generation of cytolytic effector cells capable of killing the patient's tumor cells in vitro. Such vaccines must be capable of raising an immune response and improving clinical outcomes over patients who do not receive the vaccine. (E.g., fast recovery, complete or partial or long-term survival). Generally, for drugs and vaccines that contain one or more polypeptides, the amount of each polypeptide present in a single dose will be about 25 μg-5 kg / kg of host body weight. The appropriate amount depends on the size of the patient, but is usually about 0.1 mL to about 5 mL.
[0371]
In general, a sufficient amount of the active compound to exert a therapeutic and / or prophylactic effect must be administered in order for the dosage and treatment to be appropriate. Such effects can be monitored by improved clinical outcomes (eg, faster recovery, complete or partial, or longer survival) than patients who receive no vaccine. Existing immune responses to oncoproteins correlate with improved clinical outcome. Such an immune response can be assessed by standard proliferation, cytotoxicity, or cytokine analysis performed using samples obtained from the patient before and after treatment.
[0372]
Drugs, methods and kits for detecting and diagnosing cancer
Generally, the presence of one or more prostate tumor proteins and / or polynucleotides encoding such proteins in a biological sample (eg, blood, serum, sputum and / or tumor tissue) obtained from a patient. , The cancer of the patient can be detected. In other words, the presence or absence of cancer such as prostate cancer can be detected by using such a protein as a marker.
[0373]
Such proteins are also useful for detecting other cancers. In general, the binding agents of the invention allow detection of the level of antigen binding to the binding agent in a biological sample. By utilizing polynucleotide primers and probes, mRNA levels encoding oncoproteins can be detected, and also indicate the presence or absence of cancer. Generally, prostate tumor sequences are present at more than three times the level of normal tissue.
[0374]
Various analytical methods that use binding agents to detect polypeptide markers in a sample are known to those of skill in the art. See, for example, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, 1988. Generally, the presence or absence of cancer in a patient is determined by (a) contacting a biological sample obtained from the patient with the binding; (b) measuring the level of polypeptide in the sample that binds the binding agent; It can be determined by comparing the level with a predetermined pass value.
[0375]
In a preferred embodiment, the assay uses a binder immobilized on a solid support to which the polypeptide is bound and removed from the remainder of the sample. To detect bound polypeptide, a detection reagent that contains a reporter group and specifically binds to the binding agent / polypeptide is used. The detection reagent is, for example, a binding agent that specifically binds to the polypeptide or the antibody, or an anti-immunoglobulin, G protein, A protein, or lectin that specifically binds to the binding agent. Alternatively, a competition assay can be employed in which the polypeptide is labeled with a reporter group, and the binding agent is incubated with the sample and then bound to the immobilized binding agent. Polypeptides that can be used in this analysis include the full-length prostate tumor protein and the polypeptide portion to which the binding agent binds, as described above.
[0376]
The solid support can be any known material, as long as it can attach tumor proteins. For example, membranes such as test wells of a microtiter plate, nitrocellulose, etc. can be used. Beads or discs made of glass, fiberglass, latex, or a plastic material such as polystyrene or polyvinyl chloride may be used. Further, the magnetic particles as disclosed in US Pat. No. 5,359,681 may be fiber optic sensors. In order to fix the binder to the solid support, various known techniques described in a large number of patent documents and the like may be used.
[0377]
In the context of the present invention, "immobilization" refers to both non-covalent bonds, such as adsorption, and covalent bonds (direct linkage between the binder and the functional groups of the support or via a cross-linking agent). including. Immobilization by adsorption to wells or membranes of a microtiter plate is preferred. In this case, adsorption is obtained by contacting the binder with the solid support in a suitable buffer for a suitable period of time. The contact time also depends on the temperature, but typically ranges from about 1 hour to about 1 day. Generally, contacting the wells of a plastic microtiter (such as polystyrene or polyvinyl chloride) with about 10 ng to about 10 μg, preferably about 100 ng to about 1 μg of binder will immobilize a sufficient amount of binder. can do.
[0378]
Covalent attachment of the binder to the solid support is accomplished by reacting the support with a bifunctional reagent that reacts with both the support and the hydroxyl or amino groups of the binder. For example, the binder can be covalently attached to the support with a suitable polymer coating by using benzoquinone or by condensing the aldehyde group of the support with the active hydrogen of the binding partner (Pierce Immunotechnology Catalog). and Handbook, 1991, A12-A13).
[0379]
In some embodiments, a two-antibody sandwich assay is employed. In this assay, the polypeptide immobilized on a solid support, such as a microtiter plate, is contacted with the sample to bind the polypeptide in the sample to the immobilized antibody. Unbound sample is removed from the immobilized polypeptide-antibody complex, and a detection reagent containing a reporter group (preferably a second antibody capable of binding to a different site on the polypeptide) is added. The amount of detection reagent that remains bound to the solid support is measured using a method appropriate for the particular reporter group.
[0380]
Specifically, after the antibody is immobilized on the support as described above, the remaining protein binding sites on the support are blocked. The blocking agent may be a known one, for example, bovine serum albumin or Tween 20 (trademark) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). The immobilized antibody is then incubated with the sample, allowing the polypeptide to bind to the antibody. Prior to incubation, the sample is diluted with a suitable diluent, such as phosphate buffered saline (PBS).
[0381]
Generally, a suitable contact time (ie, incubation time) is a time sufficient to detect the presence of the polypeptide in a sample obtained from an individual with prostate cancer. Preferably, the contact time is sufficient to achieve a level of binding at which the equilibrium between bound and unbound polypeptide is at least about 95%. As will be apparent to those skilled in the art, the time required to achieve equilibrium can be readily determined by assessing the level of binding that occurs over time.
[0382]
The unbound sample is then removed, for example, by washing the solid support with a suitable buffer, such as PBS containing 0.1% Tween20 ™. A second antibody containing a reporter group is added to the solid support. The preferred reporter group is as described above.
[0383]
The detection reagent is then incubated with the immobilized antibody-polypeptide complex for a time sufficient to detect the bound polypeptide. The appropriate time for detection can be determined by assessing the level of binding that occurs over a period of time. Next, the unbound detection reagent is removed, and the bound detection reagent is detected using the reporter group. (Page 115, first line) The method of detecting a reporter group differs depending on the nature of the reporter group.
[0384]
For radioactive groups, scintillation counting or autoradiography is appropriate. For a dye, a luminescent group and a fluorescent group, spectroscopic analysis may be used. Biotin may be detected using avidin conjugated to a different reporter group (usually a radioactive or fluorescent group or enzyme). Enzyme reporter groups are usually detected by adding the substrate (over a specific period of time) and then performing spectroscopic or other analysis of the reactants.
[0385]
To determine the presence or absence of cancer, such as prostate cancer, the signal detected from the reporter group that remains attached to the solid support is compared to a signal corresponding to a predetermined pass value. In a preferred embodiment, the pass value for detecting cancer is the average signal obtained when the fixed antibody is incubated with a sample from a cancer-free patient. Samples that emit a signal 3 standard deviations above a given pass value are considered positive for cancer.
[0386]
In another preferred embodiment, Sackett et al. , Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co .; 1985, p. According to the method described in 106-7, a pass value is set using a Receiver Operator Curve. In this example, a pass value is calculated from a plot of a plurality of pairs of true positive rates (ie, sensitivity) and false positive rates (100% -specificity), each corresponding to a pass value deemed appropriate in light of the diagnostic test results. I do. The pass value may be shifted to the left along the plot to minimize the false positive rate, and may be shifted to the right to minimize the false negative rate. Generally, samples that emit a signal higher than the pass value set in this way are considered positive for cancer.
[0387]
In a related embodiment, the analysis is performed in a flow-through or strip test format and the binder is immobilized on a membrane such as nitrocellulose. In the flow-through test, as the sample passes through the membrane, the polypeptide in the sample binds to the immobilized binding agent. Next, when the solution containing the second binding agent passes through the membrane, the labeled second binding agent binds to the binding agent-polypeptide complex. The detection of the bound second binding agent is then performed as described above. In the strip test format, one end of the membrane to which the binder binds is immersed in a solution containing the sample.
[0388]
The sample moves along the membrane from the site containing the second binder toward the site of the immobilized binder. A second binder concentration at the site of the fixed metering agent indicates the presence of cancer. The concentration of the second binder at the site forms a pattern that draws visible lines. Absence of this pattern indicates a negative result. The amount of binder immobilized on the membrane is set so that it is clearly visible when the sample contains sufficient levels of polypeptide to generate a positive signal in a 2-antibody sandwich assay in the format.
[0389]
The preferred binding agents used in this analysis are antibodies and antigen-binding fragments thereof. The amount of antibody immobilized on the membrane is from about 25 ng to about 1 μg, more preferably from about 50 ng to about 500 ng. This test can be performed on very small samples.
[0390]
It goes without saying that there are various other analysis protocols that can be used in combination with the oncoprotein or the binding agent of the present invention. The above protocol is only an example. For example, the above protocol, which utilizes tumor polypeptides to detect binding to a polypeptide in a sample, can be readily modified. Detection of antibodies specific for oncoproteins correlates with the presence of cancer.
[0391]
Cancer can also be detected based on the presence of T cells in the sample that specifically react with the oncoprotein. CD4 isolated from patient⁺And / or CD8⁺A sample containing T cells is incubated with a tumor polypeptide, a polynucleotide encoding the same, and / or an APC expressing at least an immunogenic portion of the polypeptide to detect the presence or absence of specific activation of the T cells. Suitable samples include, for example, isolated T cells. T cells can be separated from patients by known techniques (eg, Ficoll / Hypaque density gradient centrifugation of peripheral blood lymphocytes).
[0392]
Incubate the T cells in vitro with the polypeptide (5-25 μg / ml) at 37 ° C. for 2-9 days. It is also desirable to incubate a T cell sample without tumor polypeptide as a control. CD4⁺For T cells, activation is preferably detected by evaluating T cell proliferation. CD8⁺It is preferable to detect activation by evaluating cytotoxic activity. A level of proliferation that is at least twice as high and / or at least 20% higher in cytotoxic activity than a disease-free patient indicates that the patient has cancer.
[0393]
As described above, cancer can also be detected based on the level of mRNA encoding a tumor protein in a sample. By using at least two oligonucleotide primers for polymerase chain reaction (PCR) based analysis, a portion of the tumor cDNA from the sample can be amplified, wherein at least one of the oligonucleotide primers is used. Is specific for (i.e., hybridizes with) a polynucleotide encoding an oncoprotein. The amplified cDNA is separated and detected by a known technique such as gel electrophoresis. Similarly, the use of an oligonucleotide that specifically hybridizes to a polynucleotide encoding an oncoprotein in a hybridization assay can detect the presence of a polynucleotide encoding an oncoprotein in a sample.
[0394]
In order to allow hybridization under the conditions of the analysis, the oligonucleotide primers and probes comprise a portion of the oncoprotein-encoding polynucleotide of the invention of a length corresponding to at least 10, preferably 20 nucleotides, at least It should contain oligonucleotide sequences having about 60%, preferably at least about 75%, more preferably about 90% identity. Preferably, the oligonucleotide primers and / or probes hybridize to the polypeptide encoding polynucleotide under the conditions described above.
[0395]
Oligonucleotide primers and / or probes used for diagnosis preferably have a length corresponding to at least 10-40 nucleotides. In this preferred embodiment, the oligonucleotide primer contains at least 10 contiguous nucleotides, more preferably at least 15 contiguous nucleotides, of a DNA molecule having the above sequence. Both PCR analysis and hybridization analysis are known (Mullis et al., Col; d Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, 1987; Errich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).
[0396]
A preferred assay utilizes RT-PCR, which combines PCR with reverse transcription. RNA is extracted from a sample, such as biological tissue, and reverse transcribed to produce a cDNA molecule. A cDNA is generated by PCR amplification using at least one specific primer, separated, and visualized using gel electrophoresis or the like. Amplification is performed on samples obtained from test patients and samples obtained from healthy subjects. The amplification reaction is performed with cDNA diluted several times in the range of two digits. As a result of diluting the test patient sample several times, the expression is more than doubled as compared with a healthy person, and the sample is determined to be positive.
[0397]
In another embodiment, the agents of the present invention can be used as markers for cancer progression. In this example, the above analysis for cancer diagnosis is performed continuously to evaluate changes in the level of a reactive polypeptide or polynucleotide. For example, the analysis is performed every 24 to 72 hours for 6 months to 1 year, and thereafter, if necessary. Cancer is often ongoing in patients with increased levels of the detected polypeptide or polynucleotide. Conversely, if the level remains constant or decreases, the cancer has not progressed.
[0398]
Biodiagnostic analysis is performed directly on the tumor. In this analysis, the tumor cells are contacted directly with the binding agent. Bound binder is detected directly or indirectly via a reporter group. Binders can also be used histologically. In this case, a polynucleotide probe can also be used.
[0399]
For increased sensitivity, multiple tumor protein markers may be analyzed within a given sample. Binding agents specific for different proteins can be combined in a single assay. Multiple primers or probes can be used simultaneously. Selection of oncoprotein markers is based on a series of experiments to ensure optimal sensitivity. Analysis of tumor proteins may be combined with other known tumor antigen assays.
[0400]
The present invention also provides a kit used for the diagnostic method. The kit contains two or more than two components required for diagnostic analysis. Components include compounds, reagents, containers and / or equipment. One container in the kit contains the monoclonal antibody or a fragment thereof. The kit also contains detection reagents that include a reporter group that detects antibody binding directly or indirectly.
[0401]
Alternatively, the kit can be configured to detect levels of mRNA encoding a tumor protein in a biological sample. Such kits often include at least one oligonucleotide probe or primer that hybridizes to a polynucleotide encoding a tumor protein, as described above. Such oligonucleotides can be used, for example, in PCR or hybridization assays. Other components present in such kits include containers that facilitate the detection of the second oligonucleotide and / or the diagnostic reagent or polynucleotide encoding the tumor protein.
The following examples are illustrative and do not limit the invention.
[0402]
An example
Example 1.Isolation and characterization of prostate-specific polypeptide
This example involves the isolation of some prostate specific polypeptides from a prostate tumor cDNA library.
Prostate tumor poly A using Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD 20897) according to the manufacturer's protocol.⁺A human prostate tumor cDNA library was constructed from the RNA. Specifically, prostate tumor tissues were homogenized with Polytron (Kinematica, Switzerland), and total RNA was extracted using Trizol reagent (BRL Life Technologies) according to the manufacturer's instructions.
[0403]
The polyA was then purified using a Qiagen oligotex spin column mRNA purification kit (Qiagen, Santa Clarita, CA 91355) according to the manufacturer's protocol.^;RNA was purified. First strand cDNA was synthesized using NotI / Oligo-dT18 primers. Double stranded cDNA was synthesized, ligated with EcoRI / BAXI adapter (Invitrogen, San Diego, CA) and digested with NotI. After size fractionation on a Chroma Spin-1000 column (Clontech, Palo Alto, CA), the cDNA was ligated to the EcoRI / NotI sites of pCDNA3.1 (Invitrogen) and electroporated by ElectroMax E.C. E. coli DH10B cells.
[0404]
Using the same method, a normal human pancreatic cDNA expression library was generated from six tissue samples (Clontech). The number of independent colonies, the percentage of colonies with inserts, the average insert size were determined, and the cDNA library was characterized by sequence analysis. Prostate tumor library is 1.64 x 10⁷Containing 70 independent colonies, 70% of the colonies had inserts, and the average insert size was 1745 base pairs. The normal pancreatic cDNA library is 3.3 × 10⁶It contained 69 colonies, 69% of the colonies had inserts, and the average insert size was 1120 base pairs. Sequence analysis of all libraries revealed that most of the clones had full-length cDNA sequences, were synthesized from mRNA, and had very low rRNA and mitochondrial DNA contamination.
[0405]
Some modifications were made to the method reported by Hara et al (Blood, 84: 189-199, 1994), and cDNA library subtraction was performed using the prostate tumor and normal pancreatic cDNA libraries described above. . Specifically, a prostate-specific subtraction cDNA library was formed as described below. A normal pancreatic cDNA library (70 μg) was digested with EcoRI, NotI, and SfuI and subjected to a filling-in reaction with a DNA polymerase Klenow fragment.
[0406]
After phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation, 100 μl of H₂Dissolved in O, heat denatured and mixed with 100 μl (100 μg) of Photoprobe biotin (Vector Laboratories, Burlingame, CA). The resulting mixture was irradiated on ice with a 270W sunlamp for 20 minutes according to the manufacturer's recommendations. Additional Photoprobe biotin (50 μl) was added and the biotinylation reaction was repeated. After 5 extractions with butanol, the DNA was precipitated with ethanol and 23 μl of H₂Dissolved in O to form driver DNA.
[0407]
For tracer DNA formation, 10 μg of the prostate tumor cDNA library was digested with BamHI and XhoI, extracted with phenol chloroform, and passed through a Chromoma spin-400 column (Clontech). After ethanol precipitation, the tracer DNA contained 5 μl of H₂Dissolved in O. The tracer DNA is mixed with 15 μl of driver DNA and 20 μl of 2 × hybridization buffer (1.5 M NaCl / 10 mM EDTA / 50 mM HEPES pH 7.5 / 0.2% sodium dodecyl sulfate) and completely heat after mineral oil overlay. Denatured.
[0408]
The samples were immediately transferred to a 68 ° C. water bath and incubated for 20 hours (long hybridization [LH]). The reaction mixture was then treated with streptavidin and extracted with phenol / chloroform. This step was repeated three more times. The subtracted DNA is precipitated and 12 μl of H₂Dissolved in O, mixed with 8 μl of driver DNA and 20 μl of 2 × hybridization buffer, and then subjected to hybridization at 68 ° C. for 2 hours (short hybridization [SH]).
[0409]
After removal of the biotinylated double-stranded DNA, the subtracted cDNA was ligated to the BamHI / XhoI site of chloramphenicol pBCSK + (Stratagene, La Jolla, CA (CA) 92037). ElectroMaxE. E. coli DH10B cells were transformed to generate a prostate tumor-specific subtraction-treated cDNA library (referred to as "prostate subtraction I").
[0410]
To analyze the subtracted cDNA library, plasmid DNA was prepared from 100 independent clones randomly picked from the subtracted prostate tumor-specific library and grouped based on the size of the insert. Representative cDNA clones were further characterized by DNA sequencing using a Perkin Elmer / Applied Biosystems automated sequencer model 373A (Foster City, CA). Was.
[0411]
Six cDNA clones, hereinafter referred to as F1-13, F1-12, F1-16, H1-1, H1-9, and H1-4, are abundant in the subtracted prostate-specific cDNA library. Indicated. The 3 'and 5' cDNA sequences determined for F1-12 are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively, and were determined for F1-13, F1-16, H1-1, H1-9 and H1-4. The 3 'cDNA sequences are shown in SEQ ID NOs: 1 and 4-7, respectively.
[0412]
The cDNA sequence of the isolated clone was compared to known sequences in the gene bank using the EMBL and GenBank databases (96 edition). Four prostate tumor cDNA clones F1-13, F1-16, H1-1 and H1-4 were found to encode the following identified proteins: prostate specific antigen (PSA), human glandular kallikrein, human Tumor expression enhancer gene and mitochondrial cytochrome C oxidase subunit II. H1-9 was found to be identical to the previously identified autonomously replicating sequence. No significant homologs were found in the cDNA sequence for F1-12.
[0413]
In the next study, the full-length cDNA sequence of F1-12 (also called P504S) was isolated. This sequence is shown in SEQ ID NO: 107, and the corresponding deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 108. P504S cDNA splice variants are set forth in SEQ ID NOs: 600-605.
[0414]
To clone fewer prostate tumor-specific genes, the three most abundant genes from the prostate tumor cDNA library in the normal pancreas cDNA library and the previous subtraction prostate tumor-specific cDNA library, namely human glandular kallikrein, , Prostate specific antigen (PSA) and mitochondrial cytochrome C oxidase subunit II genes were subtracted to perform cDNA library subtraction. Specifically, cDNA of human glandular kallikrein, PSA and mitochondrial cytochrome C oxidase subunit II contained in pCDNA3.1 were each added to 1 μg of the driver DNA, and subjected to subtraction treatment in the same manner as described above. A second subtraction-treated cDNA library called "Rally" was obtained.
[0415]
Twenty-two cDNA clones were isolated from a spike subtraction prostate tumor-specific cDNA library. Determined for clones designated J1-17, L1-12, NJ-1862, J1-13, J1-19, J1-25, J1-24, K1-58, K1-63, L1-4 and L1-14. The 3 'and 5' cDNAs are shown in SEQ ID NOs: 8-9, 10-11, 12-13, 14-15, 16-17, 18-19, 20-21, 22-23, 24-25, 26-27 and 28 −29, respectively. Determined for clones designated as J1-12, J1-16, J1-21, K1-48, K1-55, L1-2, L1-6, N1-1858, N1-1860, N1-11861, N1-1804. The assigned 3 'cDNA sequences are shown in SEQ ID NOs: 30-40, respectively.
[0416]
Comparison of these sequences with the sequences in the gene bank indicated that three of the five most abundant DNA species (J1-17, L1-12 and N1-1862; SEQ ID NOS: 8-9, 10- 11 and 12-13) showed no significant homology. One of the remaining two most abundant species (J1-12; SEQ ID NO: 30) was found to be identical to the previously identified human lung surfactant-related protein, and the other one (K1 -48; SEQ ID NO: 33) is an R. 2-arylpropionyl-CoA epimerase. It was determined to have homology with norvgicus mRNA.
[0417]
Four out of 17 low-quantity tumors isolated from the spike subtraction prostate tumor-specific cDNA library (J1-16, K1-35, L1-6 and N1-1864; SEQ ID NOs: 31, 34, and 36, respectively) And 40) were found to show homology to non-human sequences, and two (L1-2 and N1-1861; SEQ ID NOs: 35 and 39, respectively) were found to show homology to known human sequences. Was. Polypeptides J1-13, J1-19, J1-24, J1-25, K1-58, K1-63, L-4, L1-14 (SEQ ID NOS: 14-15, 16-17, 20-21, 18 respectively) -19, 22-23, 24-25, 26-27, 28-29).
[0418]
Subsequent studies have isolated the full length cDNA sequences of J1-17, L1-12 and N1-1862 (SEQ ID NOS: 109-111, respectively). The corresponding deduced amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 112-114. L1-12 is also called P501S. The cDNA splice variant of p501S is shown in SEQ ID NO: 606.
[0419]
In another experiment, four additional clones were identified by subtracting normal prostate cDNA prepared from a pool of three normal prostate poly A + RNAs from a prostate tumor cDNA library (designated "prostate subtraction 2"). . The determined cDNA sequences of these clones, hereinafter referred to as U1-3064, U1-3065, V1-3692 and 1A-3905, are shown in SEQ ID NOs: 69-72, respectively. No significant homology with U1-3065 was found from the sequence comparison between the determined sequences and the gene bank.
[0420]
The second subtraction by spikes (referred to as “prostate subtraction spike 2”) was performed using a spike having a normal prostate cDNA library from a prostate tumor-specific cDNA library, and further using PSA, J1-17, a lung surfactant-related protein, It was spiked out with mitochondrial DNA, cytochrome c oxidase subunit II, N1-1862, autonomously replicating sequences, L1-12 and tumor expression enhancing genes. Four additional clones, hereinafter referred to as V1-3686, R1-2330, 1B-3976 and V1-3679, were isolated. The cDNA sequences determined for these clones are shown in SEQ ID NOs: 73-76, respectively. Comparison of these sequences with the sequences in the gene bank revealed no significant homology with V1-3686 and R1-2330.
[0421]
Further analysis of the three types of prostate subtraction (prostate subtraction 2, spike subtraction prostate tumor-specific cDNA library, and prostate subtraction spike 2) revealed that 1G-4736, 1G-4736, 1G-4741, 1G-4744, and 1G- Sixteen additional clones, identified as 4734, 1H-4774, 1H4781, 1H-4785, 1H4796, 1H4796, 1I-4810, 1I-4811, 1J-4876, 1K-4884 and 1K-4896, were identified.
[0422]
Comparison of the sequences of these clones with the sequences of the above gene bank revealed that 1G-4741, 1G-4734, 1I-4807, IJ-4876 and 1K-4896 (SEQ ID NOs: 79, 81, 87, 90 and 92, respectively). Did not show significant homology. From further isolated clone analysis, 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1H-4774, 1H4781, 1H-4785, 1H4787, and 1H4796 shown in SEQ ID NOs: 179-188 and 191-193, respectively. The extended cDNA sequences of 1I-4807, 1J-4876, 1K-4884 and 1K-4896 were determined, and additional partial cDNA sequences for 1I-4810 and 1I-4811 shown in SEQ ID NOs: 189 and 190, respectively. Was.
[0423]
An additional study of prostate subtraction spike 2 isolated three more clones. Their sequences were determined as described above and compared to the latest GeneBank. All three clones were found to have homology to known genes, cysteine-rich proteins, LIAA0242 and KIAA0280 (SEQ ID NOs: 317, 319 and 320, respectively). Further analysis of these clones by Synteni microarray (Synteni, Palo Alto, Calif. (CA)) indicated that all three clones contained most prostate tumor and prostate BPH, and Although over-expressed in many of the normal prostate tissues tested, all other normal tissues showed low expression.
[0424]
Further subtraction was performed by subtracting a normal prostate cDNA library with normal pancreatic cDNA (designated "prostate subtraction 3"). As a result, six additional clones named 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766, 1H-4770, 1H-4771 and 1H-4722 (SEQ ID NOs: 93-98) were identified. Comparison of these sequences with the gene bank sequences showed no significant homology to 1G-4761 and 1H4711 (SEQ ID NOs: 93 and 97, respectively). Further analysis of the isolated clones determined the extended cDNA sequences for 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766 and 1H-4772 shown in SEQ ID NOs: 194-196 and 199, respectively, and SEQ ID NOs: 197 and 198, respectively. The additional partial cDNA sequences for 1H-4770 and 1H-4771 shown in Table 1 were determined.
[0425]
When a prostate tumor cDNA library prepared from a poly A + RNA pool of three prostate cancer patients was subtracted with a normal pancreatic cDNA library (prostate subtraction 4), 1D-4297, 1D-4309, 1D. Eight clones, identified as 1-4278, 1D-4288, 1D-4283, 1D-4304, 1D-4296 and 1D-4280 (SEQ ID NOs: 99-107), were identified. These sequences were compared to the sequences in the gene bank. No significant homology was found with 1D-4283 and 1D-4304 (SEQ ID NOs: 103 and 104, respectively). Further analysis of the isolated clones indicated that 1D-4309, 1D. Extended cDNA sequences for 1-4278, 1D-4288, 1D-4283, 1D-4304, 1D-4296 and 1D-4280 were determined.
[0426]
The cDNA clones isolated in prostate subtraction 1 and prostate subtraction 2 were amplified by colony PCR, and prostate tumors, normal prostates were analyzed using microarray technology (Synteni, Palo Alto, CA). And their mRNA expression levels in various other tissues were determined. Briefly, PCR amplification products were doted onto slides in an array format such that each product occupied a unique location in the array. MRNA was extracted from a tissue sample to be tested, reverse transcribed, and a fluorescence-labeled cDNA probe was prepared. Microarrays were probed with labeled cDNA probes and slides were scanned to measure fluorescence intensity.
[0427]
This intensity is proportional to the hybridization intensity. Two clones were overexpressed in prostate tumors and normal prostate and all other normal tissues tested (liver, pancreas, skin, bone marrow, brain, breast, adrenal gland, bladder, testis, salivary gland, colon, kidney, ovary , Lung, spinal cord, skeletal muscle and colon). The determined cDNA sequences for P509S and P510S are shown in SEQ ID NOs: 223 and 224, respectively. Comparison of these sequences with the sequences in the gene bank indicated homology with some ESTs identified so far.
[0428]
Further studies have performed isolation of the full length cDNA sequence of P509S. This sequence is shown in SEQ ID NO: 332, and the corresponding deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 339. The variant full-length cDNA sequences for the two P510S are shown in SEQ ID NOs: 535 and 536, and the corresponding deduced amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 537 and 538, respectively. Additional splice variants of P510S are shown in SEQ ID NOs: 598 and 599.
The determined cDNA sequences of additional prostate-specific clones isolated during characterization of the prostate-specific cDNA are shown in SEQ ID NOs: 618-689, 691-697 and 709-772. Comparison of these sequences with sequences in public databases showed no significant homology to any of those sequences.
[0429]
Example 2.Determination of tissue specificity of prostate-specific polypeptide
Using gene-specific primers, representative prostate-specific polypeptides F1-16, H1-1, J1-17 (also referred to as P502S), L1-12 (also referred to as P501S), and F1-12 (also referred to as P504S). MRNA expression levels of various normal and tumor tissues utilizing RT-PCR. Briefly, total RNA was extracted from various normal and tumor tissues using Trizol reagent as described above. First strand synthesis was performed at 42 ° C. for 1 hour with SuperScript II reverse transcriptase (BRL Life Technologies) using 1-2 μg of total RNA. Next, the cDNA was amplified by PCR using gene-specific primers. Β-actin was used as an internal control in each of the examined tissues in order to guarantee the determination of RT-PCR.
[0430]
First, a serial dilution of the first strand cDNA was prepared, and RT-PCR was performed using a β-actin-specific primer. The β-actin template was then linearly amplified and a dilution was chosen that provided sufficient sensitivity to reflect the initial copy number difference. Under these conditions, β-actin levels were determined for each reverse transcription reaction from each tissue. DNA contamination was minimized by DNase treatment and by confirming negative PCR results when using first strand cDNA prepared without the addition of reverse transcriptase.
[0431]
mRNA expression levels were measured for four types of tumor tissue (prostate tissue in two patients, breast cancer, colon cancer, lung cancer in three patients) and prostate, colon, kidney, liver, lung, ovary, pancreas, smooth muscle, skin, stomach, testis And 16 normal tissues including bone marrow and brain. F1-16 was found to be expressed at high levels in prostate tumor tissue, colon cancer and normal prostate, and at low levels in normal liver, skin and testis, and was not detected in other tissues examined further. H1-1 is at high levels in prostate tumors, lung cancer, breast cancer, normal prostate, normal colon and normal brain, at much lower levels in normal lung, pancreas, skeletal muscle, skin, small intestine, bone marrow, and in other tissues tested. It was found not to be detected.
[0432]
J1-17 (P502S) and L1-12 (P501S) appeared to be specifically overexpressed in the prostate and both genes were expressed at high levels in prostate tumor and normal prostate tissue, but were examined. Expression in any of the other tissues could not be detected at low levels. N1-1862 (P503S) was found to be overexpressed in 60% of prostate tumors and was also detectable in normal colon and kidney. That is, the results of RT-PCR indicate that F1-16, H1-1, J1-17 (P502S), N1-1862 (P503S) and L1-12 (P501S) are prostate-specific or significantly in the prostate. This indicates that it is expressed at a high level.
[0433]
Further RT-PCR studies showed that F1-12 (P504S) was overexpressed in prostate tumors and was detected in normal kidney but not in all other tissues tested. Similarly, R1-2330 was overexpressed in 40% of prostate tumors and was shown to be detectable in normal kidney and liver but not in all other tissues tested. U1-3064 was overexpressed in 60% of prostate tumors and was shown to be detectable in breast and colon cancer but not in normal tissue.
RT-PCR characterization of R1-2230, U1-3064, and 1D-4279 showed that these three antigens were overexpressed in prostate and / or prostate tumors.
[0434]
Northern analysis using four prostate tumors and two normal prostate samples, two BPH prostates and normal colon, kidney, liver, lung, pancreas, skeletal muscle, brain, stomach, testis, small intestine and bone marrow was L1 -12 (P501S) was overexpressed in prostate tumors and normal prostate, but not detectable in other normal tissues tested. J1-17 (P502S) was detected in two types of prostate tumors, but not in other tissues tested. N1-1862 (P503S) was found to be overexpressed in three prostate tumors and also expressed in normal prostate, colon and kidney, but not in other tissues tested. F1-12 (P504S) was found to be highly expressed in two prostate tumors but not detected in all other tissues tested.
[0435]
Using the microarray technology described above, expression levels of representative antigens described herein in prostate tumor, breast cancer and the following normal tissues were determined: prostate, liver, pancreas, skin, bone marrow, brain, breast, adrenal gland, bladder, Testis, salivary glands, large intestine, kidneys, ovaries, lungs, spinal cord, skeletal muscle and colon. L1-12 (P501S) was found to be overexpressed in normal prostate and prostate tumors, and that some expression was detected in normal skeletal muscle. J1-12 and F1-12 (P504S) were overexpressed in prostate tumors and were found to be lower or undetectable in all other tissues tested.
[0436]
N1-1862 (P503S) was found to be expressed at high levels in prostate tumors and normal prostate, low levels in normal colon and normal colon, and was not detected in all other tissues tested. R1-2330 was found to be overexpressed in prostate tumors and normal prostate and to be expressed at lower levels in all other tissues tested. 1D-4279 was found to be overexpressed in prostate tumors and normal prostate, was expressed at lower levels in normal spinal cord, and was undetectable in other tissues tested.
[0437]
Another microarray that specifically analyzed the extent to which P501S (SEQ ID NO: 110) was expressed in breast cancer showed that there was (2/31) mild overexpression not only in breast cancer but also in metastatic breast cancer, and that normal tissue Showed negligibly low expression. This data suggests that P501S is also overexpressed in various breast and prostate tumors.
[0438]
Vasmatzis et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 300-304, 1998) examined 32 types of ESTs (expressed sequence tags) described in various tumors and normal tissues using the above microarray technology. Two of these clones (designated P1000C and P1001C) were overexpressed in prostate tumor and normal prostate, and all other tissues tested (normal aorta, thymus, resting and activated PBMC, epithelial cells, Low to undetectable levels in the spinal cord, adrenal gland, fetal tissue, skin, salivary gland, large intestine, bone marrow, liver, lung, dendritic cells, stomach, lymph nodes, brain, heart, small intestine, skeletal muscle, colon and kidney) Was found.
[0439]
The determined cDNA sequences for P1000C and P1001C are shown in SEQ ID NOs: 384 and 472, respectively. The sequence of P1001C was found to show homology to human mRNA for the JM27 protein that had been isolated so far. Further comparison of SEQ ID NO: 384 with the sequences in the public database identified the full length cDNA sequence of p1000C encoding the 492 amino acid sequence (SEQ ID NO: 929). Amino acid sequence analysis using the PSORTII program identified a putative transmembrane domain from amino acids 84-100. The cDNA sequence of the P100C open reading frame containing the stop codon is shown in SEQ ID NO: 930, and that of the open reading frame without the stop codon is shown in SEQ ID NO: 931. The full length amino acid sequence of P1000C is shown in SEQ ID NO: 932. SEQ ID NOs: 933 and 934 show amino acids 1-100 and 100-492, respectively.
[0440]
The expression of the polypeptide encoded by the full-length cDNA of F1-12 (also called P504S; SEQ ID NO: 108) was examined by immunohistological analysis. A rabbit anti-P504S polyclonal antibody was raised against the full-length 504S protein by standard techniques. Subsequently, polyclonal antibody isolation and characterization was performed by techniques well known in the art. Immunohistological analysis showed that the P504S polypeptide was expressed in 100% of the prostate cancer samples tested (n = 5).
[0441]
Rabbit anti-P504S polyclonal antibody did not stain and stain benign prostate cells evenly in cytoplasmic granules, but rather in nuclei. Normal tissue analysis showed that the encoded polypeptide was expressed in some, but not all, of the human tissues tested. Positive cytoplasmic staining with rabbit anti-P504S polyclonal antibody was found in normal human kidney, liver, brain, colon and lung-related macrophages, while heart and bone marrow were negative.
[0442]
The data indicate that the P504S polypeptide is present in prostate cancer tissue and that there are qualitative and quantitative differences in staining between benign prostatic hyperplasia tissue and prostate cancer tissue. The selective detection of the polypeptide in prostate tumors suggests its usefulness in diagnosing prostate cancer.
[0443]
Example 3.PCR Isolation and characterization of prostate-specific polypeptide by base subtraction
CDNA containing normal prostate subtracted with 10 other normal tissue cDNAs (brain, heart, kidney, liver, lung, ovary, placenta, skeletal muscle, spleen and thymus) and then first round PCR amplified cDNA The subtraction library was purchased from Clontech. This library was subjected to a second round PCR amplification according to the manufacturer's protocol.
[0444]
The resulting cDNA fragment was subcloned into the vector pT7BlueT-vector (Novagen, Madison, Wis.) And XL-1BlueMRF'E. coli (Stratagene) was transformed. DNA was isolated from independent clones and sequenced using the Perkin Elmer / Applied Biosystems division, automated sequencer model 373A.
[0445]
Forty-nine positive clones were sequenced. When the DNA sequences of these clones were compared with the sequences in the gene bank, P5, P8, P9, P18, P20, P30, P34, P36, P38, P39, P42, P49, P50, P53, P55, No significant homology was found for the 25 clones designated P60, P64, P65, P73, P75, P76, P79 and P84. The cDNA sequences determined for these clones are shown in SEQ ID NOs: 41-45, 47-52 and 54-65, respectively. P29, P47, P68, P80 and P82 (SEQ ID NOs: 46, 53 and 66-68, respectively) were found to show some homology with previously identified DNA sequences. To the best of the inventor's knowledge, these sequences have not previously been shown to be present in the prostate.
[0446]
In another study using the sequence of SEQ ID NO: 67 as a probe in a standard full-length cloning procedure, three cDNA sequences were identified that are likely splice variants of P80 (also known as P704P). These sequences are shown in SEQ ID NOs: 699-701.
[0447]
Another study using the PCR-based technique described above further isolated 180 additional clones, of which 23 were found to have no significant homology to the known sequence. The cDNA sequences determined for these clones are shown in SEQ ID NOs: 115-123, 127, 131, 137, 145, 147-151, 153, 156-158 and 160. Twenty-three clones (SEQ ID NOs: 124-126, 128-130, 132-136, 138-144, 146, 152, 154, 155, and 159) were found to show some homology to the ESTs identified so far. Was done.
[0448]
Further, 10 clones (SEQ ID NOs: 161-170) were found to have some homology with known genes. The larger cDNA clone, including P20, is a sprite variant of the gene designated P703P. The determined DNA sequences for the variants designated DE1, DE13 and DE14 are shown in SEQ ID NOs: 171, 175 and 177, respectively, and the corresponding deduced amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 172, 176 and 178, respectively. ing. The determined cDNA sequence for the extended splice form of P703 is shown in SEQ ID NO: 225. The DNA sequences of the splice variants designated DE2 and DE6 are shown in SEQ ID NOs: 173 and 174, respectively.
[0449]
Tumor tissue (prostate (n = 5), breast (n = 2), colon and lung), normal tissue (prostate (n = 5), colon, kidney, liver, lung (n = 2), ovary (n = 2) ), Skeletal muscle, skin, stomach, small intestine and brain), and mRNA expression levels in representative clones of activated and non-activated PBMC were determined by the RT-PCR. Expression was examined for each tissue one sample at a time unless otherwise noted.
[0450]
P9 was found to be highly expressed in normal prostate and prostate tumor compared to all normal test tissues tested, except for normal colon, which showed comparable expression. P20, which is part of the P703P gene, was found to be highly expressed in normal prostate and prostate tumors compared to all 12 normal tissues tested. P20 showed some increase in breast (n = 2), colon and lung cancer when compared to all normal tissues except lung (1 of 2). Increased expression of P18 was observed in normal prostate, prostate tumor and breast cancer compared to other normal cells except lung and stomach.
[0451]
A slight increase in P5 expression was observed in normal prostate compared to many other normal tissues. However, there was some increased expression in normal lung and PBMC. Increased expression of P5 was also observed in prostate tumors (2 of 5), breast cancer and one lung cancer sample. With respect to P30, similar levels of expression were observed in normal prostate and prostate tumors as in the remaining 12 normal tissues tested and in 6 of the normal tissues.
[0452]
Increased expression was observed in breast cancer, one lung cancer sample and one colon cancer sample, and normal PBMC. P29 was overexpressed in prostate tumors (5 of 5) and normal prostate (5 of 5) when compared to most normal tissues. However, substantial expression of P29 was observed in normal colon and normal lung (2 of 2). P80 was overexpressed in prostate tumors (5 of 5) and normal prostate (5 of 5) compared to all other normal tissues tested, and increased in colon cancer.
[0453]
As a result of further studies, 10-d8, 10-h10, 11-c8, 7-g6, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3, 8-h11, 9g-12 and An additional clone, designated 9-f3, was isolated. The sequences determined for 10-d8, 10-h11, 11-c8, 8-d4, 8-d9, 8-h11, 9g-12 and 9-f3 are SEQ ID NOs: 207, 208, 209, 216, 217, 220 , 221 and 222, respectively.
[0454]
The forward and reverse DNA sequences determined for 7-g6, 8-b5, 8-b6 and 8-g3 are set forth in SEQ ID NOs: 210 and 211, 212 and 213, 214 and 215, and 218 and 219, respectively. I have. Comparison of these sequences with the gene bank sequences indicated no significant homology to the 9-f3 sequence. The clones 10-d8, 11-c8 and 8-h11 show some homology to the previously isolated ESTs, and 10-h10, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3 and 9-f12 were found to show some homology to previously identified genes.
[0455]
The mRNA expression levels of these clones were determined using the microarray technology described above. Clones 7-G6, 8-G3, 8-B5, 8-B6, 8-D4, 8-D9, 9-F3, 9-F12, 9-H3, 10-A2, 10-A4, 11-C9 and 11 -F2 was found to be overexpressed in prostate tumors and normal prostate. Increased expression of 8-F11 was seen in prostate tumors and normal prostate, bladder, skeletal muscle and colon. Increased expression of 10-H10 was found in prostate tumors and normal prostate, bladder, lung, colon, brain and colon. Increased expression of 9-B1 was found in prostate cancer, breast cancer and normal prostate, salivary gland, colon and skin, and increased expression of 11-C8 was found in prostate tumor and normal prostate and colon.
[0456]
One fragment of the additional cDNA from the above PCR-based normal prostate subtraction was found to be prostate-specific by microarray technology and RT-PCR. The determined cDNA sequence for this clone (designated 9-A11) is shown in SEQ ID NO: 226. Comparison of this sequence with the public database showed 99% identity with the known gene HOXB13.
Further studies were performed and clones 8-C6 and 8-H7 were isolated. The cDNA sequences determined for these clones are shown in SEQ ID NOs: 227 and 228, respectively. These sequences were found to show some homology to the isolated EST.
[0457]
Longer cDNA sequences for clone P20 (also referred to as P703P) were obtained using PCR and hybridization-based methods, and three additional cDNA fragments with further extended 5 'ends of the gene were obtained. The fragments called P703PDE5, P703P6.26 and P703PX-23 (SEQ ID NOs: 326, 328 and 330, the corresponding deduced amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 327, 329 and 331, respectively) are cDNA libraries (# 141-26). ) Is screened using a portion of P703P as a probe to include the additional 5 'sequence P703PDE5 recovered.
[0458]
P703P6.26 was recovered from a mixture of three prostate tumor cDNAs, and P703PX_23 was recovered from a cDNA library (# 438-48). In summary, the additional sequences include all of the putative mature serine protease along with a portion of the putative signal sequence. The full-length cDNA sequence of P703P is shown in SEQ ID NO: 524, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 525.
[0459]
Using a computer algorithm, the following regions of P703P were predicted to represent potential HLA A2-binding CTL epitopes: amino acids 164-172 of SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 866); amino acids 160 of SEQ ID NO: 525 -168 (SEQ ID NO: 867); amino acid sequence 239-247 of SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 868); amino acids 118-126 of SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 869); amino acids 112-120 of SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 870) Amino acids 155-164 of SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 871); amino acids 117-126 of SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 872); amino acids 164-173 of SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 873); amino acids 154- of SEQ ID NO: 525 163 (SEQ ID NO: 874); SEQ ID NO: 5 25 amino acids 163-172 (SEQ ID NO: 875); amino acids 58-66 of SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 876); and amino acids 59-67 of SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 877).
[0460]
P703P was found to show some homology to previously identified proteases such as thrombin. The thrombin receptor has been found to be expressed mainly in highly metastatic breast cancer cells and breast cancer biopsy samples. Introduction of a thrombin receptor antisense cDNA has been shown to inhibit invasion of cultured metastatic breast cancer cells. Antibodies to the thrombin receptor inhibit thrombin receptor activation and thrombin-induced platelet activation. In addition, peptides that assemble the tethered ligand domain of the receptor inhibit thrombin-induced platelet aggregation. P703P may play a role in prostate cancer through protease-activated receptors on cancer cells or stromal cells.
[0461]
The potential trypsin-like protease activity of P703P may activate protease-activated receptors on cancer cell membranes to promote cancer development, or may activate protease-activated receptors on adjacent cells (such as stromal cells). Activates to secrete growth factors and / or proteases (matrix metalloproteases), which may promote tumor formation, invasion and metastasis. Thus, P703P may promote cancer progression and / or metastasis through activation of protease-activated receptors. Thus, polypeptides and antibodies that block the P703P-receptor interaction could be effectively used to treat prostate cancer.
[0462]
Quantitative PCR analysis was performed on prostate tumor samples with glearson scores ranging from 5 to> 8 to determine if expression of P703P increases with increasing Gleason severity, an indicator of tumor stage. The average level of P703P expression increased with increasing Gleason score, indicating that P703P expression likely correlates with increased disease severity.
[0463]
Another study using a PCR-based subtraction library (JP: PCR subtraction) in which a pool of prostate tumors was subtracted with a pool of normal tissues isolated 13 additional clones, 7 of which were known. It did not share significant homology with the GenBank sequence. The cDNA sequences determined for these seven clones (P711P, P712P, novel23, P774P, P775P, P710P and P768P) are shown in SEQ ID NOs: 307-311, 313 and 315, respectively.
[0464]
The remaining six clones (SEQ ID NOs: 316 and 321-325) showed some homology with the known genes. Microarray analysis showed that all these 13 clones were overexpressed by 3 or more times in prostate tumor, BPH and normal prostate compared to normal non-prostate tissue. Clones P711P, P712P, novel23 and P768P showed overexpression in most of the prostate tumors and BPH tissues tested (n = 29) and many of the normal prostate tissues (n = 4), but background in all normal tissues To low levels of expression. Clones P774P, P775P and P710P showed relatively low expression, with few prostate tumor and BPH samples showing expression, with negative to low expression in normal prostate.
[0465]
Further studies have isolated an extended cDNA sequence for P712P (SEQ ID NO: 552). The amino acid sequence encoded by the 16 putative open reading frames present in the sequence of SEQ ID NO: 552 are set forth in SEQ ID NOs: 553-568.
[0466]
The full-length cDNA for P711P was obtained by screening a prostate cDNA library using the partial sequence of SEQ ID NO: 307. Specifically, a directionally cloned prostate cDNA library was prepared using standard techniques. One million colonies of this library were inoculated on LB / Amp plates. The clones were lifted using nylon membrane filters, and the cDNA picked up by these filters was denatured and cross-linked to the filters using UV light. The P711P cDNA fragment of SEQ ID NO: 307 was radiolabeled and used for hybridization of these filters. Positive clones were selected, cDNA was prepared and sequenced using an automated Perkin Elmer / Applied Biosystems sequencer. The determined full-length P711P sequence is shown in SEQ ID NO: 382, and the corresponding deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 383.
[0467]
Using cDNA and hybridization-based methods, additional cDNA sequence information was obtained from the two clones, 11-C9 and 9-F3, hereinafter referred to as P707P and P714P, respectively (SEQ ID NOs: 333 and 333). 334). Comparison with the latest GenBank revealed that P707P was a splice variant of the known gene HoxB13. In contrast, no significant homology was observed for P714P. In another study using SEQ ID NO: 334 as a probe in a standard full length cloning procedure, an extended cDNA sequence for P714P was obtained. This sequence is shown in SEQ ID NO: 698. This sequence was found to show some homology to the gene encoding the ribosomal L23A protein.
[0468]
Clones 8-B3, P-89, P98, P130 and P201 (as disclosed in US patent application Ser. No. 09 / 020,956, filed Feb. 9, 1998) correspond to P705P (SEQ ID NO: 335). Deduced amino acid sequence is found within one contiguous sequence called SEQ ID NO: 336), which has been determined to be a splice variant of the known gene NKX3.1. .
[0469]
Further studies on P775P resulted in the isolation of four additional sequences (SEQ ID NOs: 473-476), all of which are splice variants of the P775P gene. The sequence of SEQ ID NO: 474 has been found to contain two open reading frames (ORFs). The deduced amino acid sequences encoded by these ORFs are shown in SEQ ID NOs: 477 and 478. The cDNA sequence of SEQ ID NO: 475 has been found to include an ORF encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 479. The cDNA sequence of SEQ ID NO: 473 has been found to contain four ORFs. The cDNA sequences encoded by these OFRs are shown in SEQ ID NOs: 480-483. Additional P775P splice variants are set forth in SEQ ID NOs: 593-597.
[0470]
Subsequent studies identified a genomic region on chromosome 22q11.2 known as the Cat's Eye Syndrome region, which contained the five prostate genes P704P, P712P, P774P, P775P, and B305D. The relative positions of these 5 genes within this genomic region are shown in FIG. Thus, this region appears to be associated with malignancy, and other potential oncogenes may be included in this region. These studies also identified a potential open reading frame (ORF) for P775P (shown in SEQ ID NO: 533), encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 534.
[0471]
Comparison of the clone of SEQ ID NO: 325 (designated P558S) with the GenBank and GeneSeq DNA databases indicated that P558S was identical to the prostate-specific transglutaminase gene, which is known to have two forms. . The two forms of the full-length sequence are shown in SEQ ID NOs: 773 and 774, respectively, and the corresponding amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 775 and 776. The cDNA sequence of SEQ ID NO: 774 has a 15 base pair insert, resulting in a 5 amino acid insertion in the corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 776). This insertion is not present in the sequence of SEQ ID NO: 773.
[0472]
Further work on P768P (SEQ ID NO: 315) identified a putative full-length open reading frame (ORF). The cDNA sequence of the ORF with the stop codon is shown in SEQ ID NO: 907. The cDNA sequence of the OFR without the stop codon is shown in SEQ ID NO: 908, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 909. This sequence showed 80% identity with rat calcium transport protein, suggesting that P767P may be a human calcium transport protein. The location of the transmembrane domain within P768P was inferred using the PSORTII computer algorithm. Six transmembrane domains were predicted at amino acid positions 118-134, 172-188, 211-227, 230-246, 282-298 and 348-364. The amino acid sequences of SEQ ID NOs: 910-915 represent amino acids 1-134, 135-188, 189-227, 228-246, 247-298 and 299-511 of P768P, respectively.
[0473]
Example 4.Synthesis of polypeptide
The polypeptide was synthesized by FMOC chemistry using HPTU (O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) activation using a Perkin Elmer / Applied Biosystems 430A peptide synthesizer. It is synthesized using. The Gly-Cys-Gly sequence may be attached to the amino terminus of the peptide to provide a method for conjugation, binding, or peptide labeling to an immobilized surface. Peptide cleavage from the solid support is performed utilizing the following cleavage mixture: trifluoroacetic acid: ethanedithiol: thioanisole: water: phenol (40: 1: 2: 2: 3).
[0474]
After cleavage for 2 hours, the peptide is precipitated with cold methyl-t-butyl-ether. The peptide precipitate is then dissolved in water containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and lyophilized before purification by C18 reverse phase HPLC. The peptide is eluted with a 0% -60% (containing 0.1% TFA) acetonitrile gradient aqueous solution (containing 0.1% TFA). After lyophilization of the purified fraction, the peptide is characterized by electrospray or other type of mass spectrometry and by amino acid analysis.
[0475]
Example 5.PCR Further isolation and characterization of prostate-specific polypeptide using base subtraction
As described above, cDNA prepared from prostate primary tumor mRNA was subtracted with cDNA derived from normal prostate. Subtraction was performed using a PCR-based protocol (Clontech) modified to generate longer fragments.
[0476]
In this protocol, the tester and driver double-stranded cDNAs were separately digested with five restriction enzymes that recognize six nucleotide restriction sites (MluI, MscI, PvuII, SaII, and StuI). This digest resulted in a cDNA having an average size of 600 bp, rather than the average size of 300 bp generated by the RsaI digestion of the Clontech protocol. This improvement did not affect the subtraction efficiency. Next, two tester populations were created using different adapters, and the driver library was maintained without the adapter.
[0477]
Next, the tester and the driver library were hybridized with an excess of the driver cDNA. In the first hybridization step, the driver was separately hybridized to each of the two tester cDNA populations. As a result, (a) non-hybridized tester cDNA, (b) tester cDNA hybridized with other tester cDNA, (c) tester cDNA hybridized with driver cDNA, and (d) non-hybridized driver A population of cDNAs resulted.
[0478]
Next, the two separate hybridization reactions were combined and rehybridized in the presence of additional denatured driver cDNA. After the second hybridization, in addition to the populations (a) to (d), a fifth population (e) in which the tester cDNA having the second adapter was hybridized with the tester cDNA having the second adapter. As a result, in the second hybridization step, the differentially expressed sequences that could be used as templates for PCR amplification using adapter-specific primers were enriched.
[0479]
The ends were filled and PCR amplification was performed using adapter-specific primers. Only the population (e) containing the tester cDNA that did not hybridize with the driver cDNA was logarithmically amplified. Next, a second PCR amplification step was performed to reduce the background and further enrich for differentially amplified sequences.
This PCR-based subtraction technique can recover rare transcripts that are overexpressed in prostate tumor tissue to normalize the differentially expressed cDNA. Such a transcript would be difficult to recover by conventional subtraction methods.
[0480]
In addition to genes known to be overexpressed in prostate tumors, 77 additional clones were identified. The sequences of these partial cDNAs are shown in SEQ ID NOs: 29 to 305. Most of these clones did not show significant homology to the database sequence. Exceptions are JPTPN23 (SEQ ID NO: 231; similar to porcine valosin-containing protein), JPPTN30 (SEQ ID NO: 234; similar to rat mRNA for proteosomes), JPTPN30 (SEQ ID NO: 234; rat norvegicus cytoplasmic NADP-dependent isocitrate) Dehydrogenase), JPTPN46 (SEQ ID NO: 244; similar to human subclone H84d4 DNA sequence), Jp1d6 (SEQ ID NO: 265; similar to G. gallus dynein light chain-A), JP8D6 (SEQ ID NO: 288; human BAC clone) RG016J04), JP8F5 (SEQ ID NO: 289; similar to the human subclone H8 3b5 DNA sequence) and JP8E9 (SEQ ID NO: 299; similar to the human Alu sequence).
[0481]
Additional studies using a subtraction library that included subtracting the prostate tumor pool relative to the normal prostate pool based on PCR (called PT-PN PCR subtraction) yielded three additional clones. Comparison of the cDNA sequences of these clones with the latest GenBank did not show significant homology for the two clones, designated P715P and P767P (SEQ ID NOs: 312 and 314).
[0482]
Microarray analysis was used to measure mRNA expression levels in various tissues, and all three clones were found to be overexpressed in prostate tumor and BPH tissues. Specifically, clone P715P is over-expressed three-fold or more in most prostate tumors and BPH tissues, and has increased expression in many normal prostate samples and fetal tissues, but in all other normal tissues. Was negative or low. Clone 767P was overexpressed in multiple prostate tumors and BPH tissues, with mild expression levels in half of the normal prostate samples and background or low expression in all other normal tissues tested.
[0483]
Further analysis of the PT-PN PCR subtraction library and the DNA subtraction library containing prostate tumor-derived cDNAs subtracted with the pool of normal tissue cDNAs by the microarray confirmed that they were overexpressed in prostate tumors27. Clones were further isolated (SEQ ID NOs: 340-365 and 381). Clones of SEQ ID NOs: 341, 342, 345, 347, 348, 349, 351, 355-359, 361, 362 and 364 were found to be expressed in normal prostate.
[0484]
In all normal tissues, expression was found to be low or undetectable in all 26 clones, with the exception of P544S (SEQ ID NO: 336), which was found to be expressed in the small intestine. Eleven of the 26 clones (SEQ ID NOs: 340-349 and 362) were found to show some homology to previously identified sequences. No significant homology was observed for the clones of SEQ ID NOs: 350, 351, 353-361, and 363-365.
[0485]
From a comparison of SEQ ID NO: 362 with the GenBank and GeneSeq DNA databases, this clone (designated P788P) is identical to GeneSeq Accession No. X27262 and encodes a protein found in GeneSeq Accession No. Y00931. The full-length cDNA sequence of P788P is shown in FIG. 12A (SEQ ID NO: 777), and the corresponding deduced amino acids are shown in FIG. 12B (SEQ ID NO: 778). Subsequently, the P788P full-length cDNA sequence containing a polymorphism not found in the sequence of SEQ ID NO: 779 was PCR-amplified from cDNA prepared from a plurality of RNA templates derived from three individuals, and cloned multiple times. The determined cDNA sequence for this polymorphism of P788P is shown in SEQ ID NO: 779, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 780. The sequence of SEQ ID NO: 780 differed from the sequence of SEQ ID NO: 778 by six amino acid residues. The P788P protein has seven potential transmembrane domains at the C-terminal part and is predicted to be a plasma membrane protein with extracellular N-terminal senescence.
[0486]
Further work on the clone of SEQ ID NO: 352 (designated P790P) resulted in the isolation of the full-length cDNA sequence of SEQ ID NO: 526. The corresponding deduced amino acid is shown in SEQ ID NO: 527. Data from two quantitative PCR experiments show that P790P is overexpressed in 11/15 in prostate tumor samples tested, and that low levels are expressed in the spinal cord, and that expression is observed in other normal samples tested. Not shown. Additional PCR and microarray data showed that normal prostate and prostate tumors were over-expressed, and little or no expression in other tissues tested. Subsequently, P790P was found to show significant homology with previously identified G-protein coupled prostate tissue receptors.
[0487]
Further study of the clone of SEQ ID NO: 354 (designated P776P) resulted in the isolation of the extended cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 569. The cDNA sequences determined for the three additional splice variants of P776P are shown in SEQ ID NOs: 570-572. Amino acids encoded by the two putative open reading frames (ORFs) contained in SEQ ID NO: 570, one putative ORF containing the putative ORF in SEQ ID NO: 571, and the 11 putative ORFs contained in SEQ ID NO: 569 The sequences are shown in SEQ ID NOs: 573-586, respectively. Further work isolated the full length sequence for the clone SEQ ID NO: 570 (shown in SEQ ID NO: 880).
[0488]
Attempts to perform full length cloning on the clone of SEQ ID NO: 571 resulted in the isolation of two sequences (shown in SEQ ID NOs: 881 and 882), one of which was identical except for the polymorphic insertion / deletion at position 1293 Met. Specifically, the clone of SEQ ID NO: 882 (referred to as clone F1) has C at position 1293. The clone of SEQ ID NO: 881 (referred to as clone F2) has a one base pair deletion at position 1293. The deduced amino acid sequence encoded by the five open reading frames located within SEQ ID NO: 880 is SEQ ID NO: 883-887, and the deduced amino acid sequence encoded by the clones of SEQ ID NOS: 881 and 882 is SEQ ID NO: 888-893. Is shown in
[0489]
Comparison of the cDNA sequences of clones P767P (SEQ ID NO: 314) and P777P (SEQ ID NO: 350) with the GenBank human EST database showed that the two clones commonly matched many EST sequences, with P767P and P777P being identical. It was suggested to be a gene. The DNA sequence obtained from the DNA sequence alignment of P767P, P777P and multiple EST clones is shown in SEQ ID NO: 587. The amino acid sequences encoded by the three putative ORFs present in SEQ ID NO: 587 are shown in SEQ ID NOs: 588-590.
[0490]
The clone of SEQ ID NO: 342 (referred to as P789P) was found to show homology to the previously identified genes. The full length cDNA sequence and the corresponding amino acid sequence of P789P are shown in SEQ ID NOs: 735 and 736, respectively.
[0490]
Example 6.Mouse peptide priming and CTL Cell line passage
6.1This example illustrates the preparation of a CTL cell line specific for cells expressing the P502S gene.
Mice expressing the transgene for human HLA A2Kb (Dr. L. Sherman, Scripps Research Laboratories, La Jolla, Calif. (CA)) were constructed as described in Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 11993-11997, 1995, and immunized with a P2S # 12 peptide (VLGWVAEL; SEQ ID NO: 306) obtained from the P502S gene (also referred to herein as J1-17, SEQ ID NO: 8).
[0492]
Mice received 120 μg of IA from hepatitis B virus protein emulsified in 100 μg of P2S # 12 and incomplete friend adjuvant.^bImmunized with the binding peptide. Three weeks later, the mice were sacrificed, and a single cell suspension was prepared using a nylon mesh. The cells were then treated with 10% FSC, 2 mM glutamine (Gibco BRL, Gaitehrsbrug, Maryland (MD), sodium pyruvate (Gibco BRL), non-essential amino acids (Gbico BRL), 2 × 10^-5M2-Mercaptoethanol, 6x10 in complete medium containing 50 U / ml penicillin and streptomycin (RPMI-1640; Gibco BRL, Gaitehrsbrug, MD).⁶(7 μg / ml dextran sulfate and 7 μg / ml dextran sulfate, suspended in cells / ml, irradiated (3000 rads), and pulsed with P2S # 12 (5 mg /

ml P2S #

12 and 10 mg / ml β2-microglobulin). A2 transgenic spleen cells cultured for 3 days in the presence of 25 μg / ml LPS) were cultured.
[0493]
After 6 days, cells (5 × 10⁵/ Ml) 2.5 × 10⁶/ Ml peptide-pulsed irradiated (20,000 rads) EL4A2Kb cells (Sherman et al., Science 258: 815-818, 1992) and 3 × 10⁶/ Ml A2 transgenic spleen cells were restimulated with feeder cells. Cells were cultured in the presence of 20 U / ml IL-2. Cells were restimulated on a weekly basis as described for cell line cloning preparation.
[0494]
The P2S # 12 cell line is a peptide-pulsed EL4A2Kb tumor cell (1 × 10⁴Cells / well) were used as stimulators and A2 transgene spleen cells were used as feeder cells (5 × 10 5⁵Cells / well) were cloned by limiting dilution analysis grown in the presence of 30 U / ml IL-2 for 14 days and cells were restimulated as before. Clones that grew on day 21 were isolated and maintained in culture. Some of these clones showed significantly higher reactivity (lysis) on human fibroblasts (HLA A2Kb expression) transformed with P502S than on control fibroblasts. An example is shown in FIG.
This data indicates that P2S # 12 represents a naturally occurring epitope of the P502S protein expressed in association with the human HLA A2Kb molecule.
[0495]
6.2This example illustrates the preparation of a mouse CTL cell line and CTL clones specific for cells expressing the P501S gene.
This series of experiments was performed as described above. Mice were immunized with the P1S # 10 peptide (SEQ ID NO: 337) obtained from the P501S gene (also referred to herein as L1-12, SEQ ID NO: 110). The P1S # 10 peptide is a putative polypeptide analysis of P501S for a potential HLA-A2 binding sequence defined by a published HLA-A2 binding motif (Parker, KC et al., J. Immunol., 152: 163, 1994). I got more.
[0496]
P1S # 10 peptide was synthesized as described in Example 4 and tested empirically for HLA-A2 binding using a T cell based competition assay. The putative A2-binding peptide was tested for its ability to compete with HLA-A2-specific peptide presentation against the HLA-A2-binding influenza matrix peptide, HLA-A2-restricted CTL clone (D150M58), which is specific for fluM58.
[0497]
In the competition assay, 100-200 μg / ml test peptide was added to cultures of D150M58CTL to bind HLA-A2 on CTL. Thirty minutes later, CTLs cultured with test or control peptides were tested for their antigen reactivity to fluM58 peptide using a standard TNF bioassay. As shown in FIG. 3, peptide P1S # 10 competed for HLA-A2 restricted presentation of fluM58, indicating that peptide P1S # 10 binds to HLA-A2.
[0498]
A mouse expressing a transgene related to human HLA A2Kb was immunized using the method of Theobald et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1199-11997, 1995) as follows. Mice were challenged with 62.5 μg of

P1S #

10 and 120 μg of IA derived from the hepatitis B virus protein emulsified in incomplete friend adjuvant.^bImmunized with the binding peptide. Three weeks later, the mice were sacrificed, and a single cell suspension was prepared using a nylon mesh.
[0499]
The cells were then placed in complete medium (described above) at 6 × 10⁶P2S # 12 pulsed (2 μg /

ml P1S #

10 and 10 mg / ml β2-microglobulin) LPS blasts suspended in cells / ml and irradiated (3000 rads) in the presence of 7 μg / ml dextran sulfate and 25 μg / ml LPS (A2 transgenic spleen cells cultured for 3 days). After 6 days, cells (5 × 10⁵/ Ml) with the above 2.5 × 10⁶/ Ml peptide pulsed irradiated (20,000 rads) EL4A2Kb cells and 3 × 10⁶/ Ml A2 transgenic spleen cells were restimulated with feeder cells. Cells were cultured in the presence of 20 U / ml IL-2. Cells were restimulated on an additional weekly basis and prepared for cloning. After three rounds of in vitro stimulation, one cell line spore line was generated that recognizes P1S # 10 pulsed Jurkat A2Kb target cells and P501S-transformed Jurkat target cells as shown in FIG.
[0500]
The P1S # 10-specific CTL cell line was a peptide-pulsed EL4A2Kb tumor cell (1 × 10⁴Cells / well) as stimulators and transfected A2 transgenic spleen cells into feeder cells (5 × 10 5⁵(Cells / well) for 14 days and cloned by limiting dilution analysis grown in the presence of 30 U / ml IL-2. On day 21, surviving clones were isolated, cultured and maintained. As shown in FIG. 5, five of these clones exhibited specific cytolytic activity against P501S-transformed Jurkat A2Kb target cells. This data indicates that P1S # 10 represents a naturally-occurring epitope of the P501S protein expressed in association with the human HLA-A2.1 molecule.
[0501]
Example 7.Naked with prostate antigen DNA In vivo using immunity CTL PrimingThe prostate-specific antigen L1-12 is also called P501S as described above. HLA A2Kb Tg mice (Dr. L. Sherman, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) were immunized intramuscularly or transcutaneously with 100 μg of P501S in vector VR1012. Mice were immunized three times, two weeks apart. Two weeks after the final immunization, the immunized spleen cells were cultured with Jurkat A2Kb-P501S transduction stimulator cells. Two weeks after in vitro stimulation, CTL activity was examined against P501S transduced target cells. Two out of eight mice developed a strong anti-P501SCTL response. These results indicate that P501S contains at least one naturally processed HLA-A2 restricted CTL epitope.
[0502]
Example 8.Humans that recognize prostate-specific polypeptide T Cell capabilities
This example illustrates the ability of T cells specific for prostate tumor peptides to recognize human tumors.
Human CD8 + T cells were purified in vitro against P2S-12 peptide (SEQ ID NO: 306) derived from P502S (also called J1-17) using dendritic cells according to Van Tsai et al. (Critical Reviews in Immunology 18: 65-75, 1998). Primed with CD8 obtained⁺Microcultures of T cells were transfected with autologous fibroblasts or fibers transduced to express the P502S gene using the γ-interferon ELISPOT assay (see Lalvani et al., J. Exp. Med. 186: 859-8657). The blast cells were tested for their ability to recognize the P2S-12 peptide.
[0503]
Briefly, T cell titers were determined in the presence of 3 μg / ml human β2-microglobulin and 1 μg / ml P2S-12 peptide or control E75 peptide.⁴Duplicate assays were performed on fibroblasts. In addition, T cells were simultaneously assayed for autologous fibroblasts transduced with the P502S gene or for HER-2 / neu transduced fibroblasts as a control. Prior to the assay, fibroblasts were treated with 10 ng / ml of γ-interferon for 48 hours to up-regulate class I MHC expression. One of the microcultures (# 5) showed strong recognition of both peptide-pulsed and transduced fibroblasts in the gamma-interferon ELISPOT assay.
[0504]
FIG. 2A shows that as the number of T cells on fibroblasts pulsed with P2S-12 peptide increases, the number of γ-interferon spots also increases significantly (solid line) but not with control E75 peptide (dashed line). ). This indicates the ability of these T cells to specifically recognize the P2S-12 peptide.
[0505]
As shown in FIG. 2B, this microculture also produced a gamma-interferon spot with increasing numbers of T cells on transduced fibroblasts that expressed the P502S gene but not the HER-2 / neu gene. The number increased, but showed that. These results provide further evidence that the P2S-12 peptide is a naturally processed P502S protein epitope. Furthermore, this also indicates that high affinity T cells that can recognize this epitope exist in the human T cell repertoire. These T cells can also recognize human tumors that express the P502S gene.
[0506]
Example 9.Prostate antigen-specific in human blood CTL Induction of reaction
This example illustrates the ability of a prostate specific antigen to elicit a CTL response in normal human blood.
Autologous dendritic cells (DCs) grow from monocyte cultures derived from PBMCs of normal human donors in RPMI medium containing 10% human serum, 50 ng / ml GMCSF and 30 ng / ml IL-4 for 5 days To differentiate. After culturing, the DCs were overnight O. The cells were infected with a vaccinia virus expressing the recombinant P501S of I5, and 2 μg / ml of CD40 ligand was added thereto, followed by maturation for 8 hours.
[0507]
The virus was inactivated by UV irradiation, CD8 + cells were positively isolated using magnetic beads and isolated, and primary culture was started in a 24-well plate. CD8 + cells that specifically produce interferon gamma when stimulated with autologous P501S-transduced fibroblasts after 5 stimulation cycles using autologous fibroblasts transduced to express P501S and CD80 by the retrovirus The strain was identified.
[0508]
The P501S-specific activity of cell line 3A-1 could be maintained by performing additional stimulation cycles on autologous B-LCL transduced with P501S. Cytotoxicity assay (⁵¹Cell line 3A-1 transduces to express P501S as measured by Cr release) and interferon gamma production (Interferon gamma Elispot; see above and Lavani et al., J. Exp. Med. 186: 859-8865, 1997). It was shown that PGF-transduced autologous B-LCL was recognized specifically, but not PGFP-transduced autologous B-LCL. The results of these assays are shown in FIGS. 6A and 6B.
[0509]
Example 10.Prostate specific antigen P703P Natural processing included in CTL Epitope identification
The 9-mer peptide P5 (SEQ ID NO: 338) was obtained from the P703P antigen (also called P20). The p5 peptide is an immunogen in human HLA-A2 donors and is a naturally processed epitope. Antigen-specific CD8 + T cells can be primed by repeated in vitro stimulation using monocytes pulsed with p5 peptide. These CTLs specifically recognize p5-pulsed and P703P transduced target cells in ELISPOT (supra) and chromium release assays. In addition, immunization of HLA-A2Kb transgenic mice with p5 generated CTL cell lines that recognize various target cells expressing H703-A2Kb or HLA-A2 transduced P703P.
[0510]
The first studies that showed that p5 was a naturally-processed epitope were performed using HLA-A2Kb transgenic mice. HLA-A2Kb transgenic mice were immunized subcutaneously in the footpad with 100 μg of the p5 peptide together with 140 μg of the hepatitis B virus core peptide (Th peptide) incomplete adjuvant. Three weeks after immunization, spleen cells of the immunized mice were stimulated in vitro with LPL blasts that had been pulsed. CTL activity was determined by a chromium release assay 5 days after the first in vitro stimulation. Retrovirus transduced cells expressing the control antigens P703P and HLA-A2b were used as targets. A CTL cell line that specifically recognizes both p5-pulsed target cells and target cells expressing P703P has been identified.
[0511]
In vitro priming experiments in humans have shown that the p5 peptide is immunogenic in humans. Dendritic cells (DCs) were differentiated from PBMCs of normal human donors by culturing in RPMI medium containing 10% human serum, 50 ng / ml human GM-CSF and 30 ng / ml human IL-4 for 5 days. Was. After culture, DCs were pulsed with 1 μg / ml p5 peptide and co-cultured with CD8 + T cell rich PBMC. The CTL cell line was stimulated on a weekly basis with p5-pulsed monocytes. Five to six weeks after the start of CTL culture, p5-pulsed target cells showed CTL recognition. CTL was further shown to recognize human cells transduced to express P703P, indicating that p5 is a naturally processed epitope.
[0512]
In addition, a study was conducted to identify a prostate tumor-specific antigen P703P-derived peptide epitope (referred to as peptide 4) that is recognized by CD4 T cells on the cell surface in association with HLA class II molecules as follows. The amino acid sequence of peptide 4 is shown in SEQ ID NO: 781, and the corresponding cDNA sequence is shown in SEQ ID NO: 782.
[0513]
Twelve 15-mer peptides derived from the carboxy terminus of P703P, overlapping by 10 amino acids, were generated by standard procedures. Dendritic cells (DCs) were obtained from co-cultures with PBMCs of normal female donors using GM-CSF and IL-4 according to standard protocols. CD4 T cells were generated from the same donor as DC using MACS beads and negative selection. DCs were pulsed overnight with a pool of 15-mer peptides, each at a final peptide concentration of 0.25 μg / ml. The pulsed DCs are washed and 1 × 10⁴Cells were seeded at a cell / well ratio in 96-well V-bottom plates and purified CD4 T cells were plated at 1 × 10 4⁵/ Well added.
[0514]
Cultures were supplemented with 60 ng / ml IL-6 and 10 ng / ml IL-12 and incubated at 37 ° C. Cultures were restimulated on a weekly basis with generated DCs as above, pulsed with antigen presenting cells as above, and supplemented with 5 ng / ml IL-7 and 10 u / ml IL-2. After four in vitro stimulation cycles, specific growth and cytokine production against pool stimulation using a pool of irrelevant peptides from milk globin using 96 cell lines (one well corresponding to each cell line) as control Was tested.
[0515]
In response to pool # 1 of the P703P peptide, one cell line (designated 1-F9) that showed specific growth (as measured by the 3H proliferation assay) and cytokine production (as measured by the interferon gamma ELISA assay). Identified. This cell line was further tested for specific recognition of the peptide pool, specific recognition of individual peptides in the pool, and HLA mismatch analysis to identify related constrained alleles.
[0516]
Cell line 1-F9 was found to grow specifically in response to peptide pool # 1 and also peptide 4 (SEQ ID NO: 781) and to produce interferon gamma. Peptide 4 corresponds to amino acids 126-140 of SEQ ID NO: 327. Peptide titer experiments were performed to examine the sensitivity of cell line 1-F9 to specific peptides. This cell line was found to react specifically with peptide 4 at concentrations as low as 0.25 ng / ml, indicating that T cells are very sensitive and therefore have a high affinity for this epitope. That was shown.
[0517]
To determine the HLA restriction of the P703P reaction, a panel of antigen presenting cells (APCs) was generated that partially matched the donor used to generate the T cells. APCs were pulsed with peptide and used for proliferation and cytokine assays with cell line 1-F9. APCs in which the HLA-DRB0701 and HLA-DQB02 alleles coincided with the donor were able to present the peptide to T cells, suggesting that the P703P-specific reaction was restricted to one of these alleles.
[0518]
An antibody blocking assay was used to determine if the restricted allele was HLA-DR0701 or HLA-DQ02. Anti-HLA-DR blocking antibody L243 or an irrelevant isoform matched IgG2a was added to T cells and APC cultures pulsed with 250 ng / ml of the peptide RMPTVLQCVNVSVVS (SEQ ID NO: 781). Standard interferon gamma and proliferation assays were performed. Although the control antibody did not affect the ability of T cells to recognize peptide-pulsed APCs, anti-HLA-DR antibodies completely blocked T cells' ability to specifically recognize peptide-pulsed APCs in both assays. .
[0519]
To determine whether the peptide epitope RMPTVLQCVNVSVVS (SEQ ID NO: 781) is naturally processed, the ability of the 1-F9 cell line to recognize APC pulsed with the recombinant P703P protein was examined. Multiple sources of recombinant P703P were used in these experiments; P703P from E. coli, P703P from yeast (Pichia) and P703P from baculovirus. The irrelevant protein controls used were L3E from E. coli, lung-specific antigen and baculovirus-derived milk globin.
[0520]
In the interferon gamma ELISA assay, cell line IF9 was able to efficiently recognize both E. coli-type P703P and yeast-derived recombinant P703P, but not baculovirus-derived P703P. Subsequent Western blot analysis showed that the E. coli and yeast P703P protein specimens were intact, whereas the baculovirus P703P specimen was approximately 75% degraded. That is, the P703P-derived peptide RMPTVLQCVNVSVS (SEQ ID NO: 781) is a naturally processed peptide epitope derived from P703P and presented to T cells in association with HLA-DRB-0701.
[0521]
In a further study, twelve 15-mer peptides (corresponding to amino acids 27-154 of SEQ ID NO: 525) from the P703PN-terminus, overlapping by 10 amino acids, were generated by standard procedures and essentially as described above. Their ability to be recognized by CD4 cells was determined. DC were pulsed overnight with a pool of 15-mer peptides at a final concentration of each peptide of 0.25 μg / ml. Many individual CD4 T cell lines (65/480) showed significant proliferation and cytokine release (IFN-gamma) in response to the P703P peptide pool, but not the control peptide pool. CD4T cell lines that showed specific activity were restimulated with the appropriate P703P peptide pool, re-assayed for individual peptides in each pool, and assayed for peptide dose titers of the peptide pool in IFN-γ release and proliferation assays. Was.
[0522]
Sixteen immunogenic peptides were recognized by T cells from the entire set of peptide antigens tested. The amino acid sequences of these peptides are shown in SEQ ID NOs: 799-814, and the corresponding cDNA sequences are shown in SEQ ID NOs: 783-798, respectively. In some cases, the peptide reactivity of the T cell line was mapped to a single peptide, but some were mapped to more than one peptide in each pool.
[0523]
From each peptide pool having a reasonable affinity for these peptides, a CD4T cell line showing a typical recognition pattern was selected and further analyzed (I-1A, -6A; II-4C, -5E; III-). 6E, IV-4B, -3F, -9B, -10F, V-5B-4D and -10F). These CD4T cell lines were restimulated with appropriate individual peptides, truncated versions of the recombinant P703P protein produced in E. coli (amino acids 96-254 of SEQ ID NO: 525), full-length P703P produced with the baculovirus expression system, And reassayed using autologous DCs pulsed with a fusion of the influenza viruses NS1 and P703P made in E. coli.
[0524]
Of the T cell lines tested, cell line I-1A specifically recognized truncated P703P (E. coli), but did not recognize other recombinant forms of P703P. This cell line also recognized the peptide used to induce T cells. Cell line 2-4C recognized the P703P (E. coli) truncated form and the full-length form of P703P made with baculovirus, as well as the peptide. Are the rest of the T cell lines tested specific for the peptide only (II-5E, II-6F, IV-4B, IV-3F, IV-9B, IV-10F, V-5B and V-4D) Or was non-reactive with any of the antigens tested (V-10F).
[0525]
These results show that the peptide sequence RPLLANDMLLIKLDE recognized by the T cell line I-1A (corresponding to amino acids 110-124 of SEQ ID NO: 525, ie, SEQ ID NO: 525) and the peptide sequence SVSESDTIRSISIAS recognized by the T cell line II-4C (sequence No. 811; corresponding to amino acids 125-139 of SEQ ID NO: 525) and ISIASQCCPTAGNSCL (SEQ ID NO: 810; corresponding to amino acids 135-149 of SEQ ID NO: 525) are shown to be naturally occurring epitopes of the P703 protein.
[0526]
In a further study, 45 15-mer peptides overlapping by 10 amino acids and derived from the region containing amino acids 47-254 of P703P (SEQ ID NO: 525) were generated by standard techniques, and Their perceived abilities were determined substantially as described above. DCs were prepared from donor PBMCs with different HLAΔDR and DQ alleles than those used in previous experiments. DC were pulsed overnight with a pool of peptides. In this case, the final concentration of each peptide was 0.25 μg / mL, and each pool contained 10 peptides.
[0527]
Twelve cell lines showing specific proliferation and cytokine production (as measured by a gamma-interferon ELISA assay) in response to the stimulatory peptide pool were identified. These cell lines were further tested for specific recognition of the peptide pool, for individual peptides in the pool, and for recombinant P703P protein. Cell lines 3A5H and 3A9H grew specifically and produced gamma-interferon in response to the recombinant protein and one individual peptide and peptide pool.
[0528]
After restimulation against targets loaded with specific peptides, only 3A9H specifically responded to targets exposed to cell lysates of fibroblasts infected with adenovirus expressing full-length P703P. These results indicate that cell line 3A9H is able to respond to antigenic peptides derived from proteins synthesized in mammalian cells. The peptide to which the specific CD4 cell line responded corresponds to amino acids 155-170 of P703P (SEQ ID NO: 943). The DNA sequence of this peptide is shown in SEQ ID NO: 942.
[0529]
Example 11.Expression of breast cancer-derived antigen in prostate
Isolation of the antigen B305D from breast cancer by differential notation is described in US patent application Ser. No. 08 / 700,014, filed Aug. 20, 1996. Several different splice forms of the antigen have been isolated. The determined cDNA sequences for these splice types are shown in SEQ ID NOs: 366-375, and the deduced amino acid sequences corresponding to the sequences in SEQ ID NOs: 292, 298 and 301-303 are shown in SEQ ID NOs: 299-306, respectively. I have.
[0530]
Further studies have isolated a splice variant of the cDNA sequence of SEQ ID NO: 366 (SEQ ID NO: 530) which contains an additional residue of guanine at position 884 and is known to cause a frameshift within the open reading frame. . The DNA sequence determined for this OFR is shown in SEQ ID NO: 531. This frameshift results in a protein sequence containing the C-terminal domain common to the other isoforms of B305D, but with a different N-terminal region (shown in SEQ ID NO: 532).
[0531]
The expression level of B305D in various tumors and normal tissues was examined by real-time PCR and Northern analysis. The results show that B305D is highly expressed in breast cancer, prostate cancer, normal prostate and normal testis, and other tissues examined (colon cancer, lung cancer, ovarian cancer and normal bone marrow, colon, kidney, liver, lung, ovary, skin, (Small intestine, stomach) showed low or undetectable expression. Using real-time PCR on the prostate tumor panel, B305D expression in prostate tumors was shown to increase with increasing Gleason grade, and B305D expression increased as prostate cancer progressed.
[0532]
Example 12.Whole gene priming and prostate specific antigen P501S Vitro humans with stimulation by CTL Generate
Utilizing in vitro whole gene priming by P501S vaccinia-infected DCs (see, eg, Yee et al., The Journal of Immunology, 157 (9): 4079-86, 1996), P501S (L1-12) was determined by the interferon-γ ELISPOT analysis. A human CTL cell line that specifically recognizes the transduced autologous fibroblasts was also induced. Using a panel of HLA-mismatched B-LCL cell lines transduced with P501S, it was shown that these CTL cell lines appeared to be restricted to HLAB class I alleles.
[0533]
Specifically, dendritic cells (DC) contain 10% human serum, 50 ng / ml human GM-CSF and 30 ng / ml human IL-4 from monocyte cultures derived from PBMCs of normal human donors. Differentiation was achieved by growth in RPMI medium for 5 days. After culturing, DC cells were infected overnight with a recombinant P501S vaccinia virus having a multiplicity of infection (MOI) of 5 and 3 μg / ml of CD40 ligand was added thereto, followed by maturation overnight. The virus was inactivated by UV irradiation. CD8 + T cells were isolated using a magnetic bead system and primary culture was initiated using standard culture techniques.
[0534]
Cultures were restimulated every 7-10 days with autologous primary fibroblasts transduced with P501S and CD80 by retrovirus. After four restimulation cycles, a CD8 + T cell line that specifically produces interferon gamma when stimulated with autologous P501S and autologous CD80-transduced fibroblasts was identified. To base the restricted allele of the reaction, a panel of HLA mismatched B-LCL cell lines transduced with P501S was generated. Interferon-γ was measured by the ELISPOT assay and showed that the P501S-specific reaction appeared to be restricted by HLA B alleles. The results of these assays indicate that CD8 + CTL against P501S can be induced.
[0535]
To identify the epitope recognized, the cDNA encoding P501S was variously digested into fragments and subcloned into the retroviral expression vector pBIB-KS. Retroviral supernatant was generated by transfection of a helper packaging cell line, Phoenix-Ampho. The supernatant was then used to transduce Jurkat / A2Kb cells for CTL screening. CTLs were screened in the IFN-gamma ELISPOT assay for these A2Kb targets transduced with the "library" of P501S fragments.
[0536]
The first positive fragments P501S / H3 and P501S / F2 were sequenced and found to encode amino acids 106-553 and amino acids 136-547 of SEQ ID NO: 113, respectively. Cleavage of H3 was performed to encode amino acids 106-351 of SEQ ID NO: 113, which was unable to stimulate CTL, thus defining the epitope at amino acid residues 351-547. Another fragment encoding amino acids 1-472 (fragment A) and amino acids 1-351 (fragment B) was also generated. Not only fragment B, but also fragment A stimulated CTL, indicating that the epitope was at amino acid residues 351-472.
[0537]
Jurkat / A2Kb cells were pulsed and tested for CTL in an IFN-gamma assay for overlapping 20-mer and 18-mer peptides representing this region. Only peptides P501S-369 (20) and P501S-369 (18) promoted CTL. 9-mer and 10-mer peptides representing this region were synthesized and tested similarly. Peptide P501S-370 (SEQ ID NO: 539) was the smallest 9-mer showing a strong response. Peptide P501S-376 (SEQ ID NO: 540) also showed a weak response, suggesting that it was a cross-reactive epitope.
[0538]
Subsequent studies examined the ability of primary human B cells transduced with P501S to prime MHC class I restricted, P501S-specific, autologous CD8 T cells. Primary B cells were cultured in the presence of CD40 ligand and IL-4, transduced frequently with the recombinant P501S vector pBIB, and sorted with blasticidin-S to obtain homozygous HLA-A2 donors. Obtained from PBMC. For in vitro priming, purified CD8 + T cells were co-cultured with P501S-transduced B cells induced with autologous CD40 ligand + 1L-4 in a 96-well microculture format.
[0539]
These CTL microcultures were restimulated with P501S-transduced B cells before assaying for specificity. After this initial screening, microcultures that showed a significant signal above background were cloned into autologous EBV-transduced B cells (BLCL) and transduced with P501S. IFN-gamma ELISPOT was used for detection, and some of these CD8 T cell clones were found to be specific for P501S, reacting with BLCL / P501S but not with BLCL transduced with the control antigen. Not shown.
[0540]
Furthermore, the anti-P501S CD8 T cell specificity was shown to be HLA-A2 restricted. First, antibody blocking experiments using anti-HLA-AA, B, C monoclonal antibody (W6.32), anti-HLA-B, C monoclonal antibody (B1.23.2) and control monoclonal antibody Only HLA-A, B and C antibodies were shown to block recognition of P501S expressing autologous BLCL. Second, anti-P501SCTL also recognized the HLA-A2 matched, P501S-transduced heterologous BLCL, but not the corresponding EGFP-transduced control BLCL.
[0541]
The naturally processed CD501, class I restricted peptide epitope of P501S was identified as follows. Dendritic cells (DCs) were isolated on a Percol gradient and subjected to differential adherence before being in the presence of RPMI medium containing 1% human serum, 50 ng / ml GM-CSF and 30 ng / ml IL-4. For 5 days. After the culture, 2 μg / ml of CD40 ligand was added, and the DC was further cultured for 24 hours. CD8 cells were enriched from PBMC by subtracting CD4 + cells, CD14 + and CD16 + populations using magnetic beads.
[0542]
Priming cultures containing 10,000 P501S-expressing DCs and 100,000 CD8 + cells per well were incubated with 96% RPMI containing 10% human serum, 5 ng / ml IL-12 and 10 ng / ml IL-6. Prepared in a well-shaped V-bottom plate. Cultures are stimulated every 7 days with autologous fibroblasts transduced to express P501S and CD80 by retrovirus and treated with INF-gamma for 48-72 hours to upregulate MHC class I expression did. At stimulation and on

days

2 and 5 after stimulation, 10 u / ml IL-2 was added.
[0543]
After four stimulation cycles, IFN-gamma is produced in response to IFN gamma-treated autologous fibroblasts expressing P501S / CD80 in a γ-IFN Elispot assay, whereas IFN-gamma-treated P703P Reaction with autologous fibroblasts expressing / CD80 identified one P501S-specific CD8 + T cell line that did not produce it (referred to as 2A2). Cell line 2A2 was cloned into a 96-well plate at a rate of 0.5 cells / well or 2 cells / well in the presence of 75,000 PBMC / well, 10,000 B-LCL / well, 30 ng / ml OKT3 and 50 u / ml IL-2. Was Twelve clones showing strong P501S specificity in response to transduced fibroblasts were isolated.
[0544]
Fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis was performed on P501S-specific clones with CD3-, CD4 + and CD8-specific antibodies labeled with PercP, FITC and PE, respectively. Consistent with the use of CD8 T cell rich in priming cultures, the P5401S-specific clones were determined to be CD3 +, CD8 + and CD4-.
[0545]
To identify relevant P501S epitopes recognized by P501S-specific CTLs, a pool of 18-20mer or 30mer peptides covering most of the amino acid sequence of P501S was loaded on autologous B-LCL and a γ-IFN Elispot assay was performed. Tested the ability to stimulate two P501S-specific CTL clones, designated 4E5 and 4E7. One pool of five 18-20mer peptides covering amino acids 411-486 of P501S (SEQ ID NO: 113) was found to be recognized by both P501S-specific clones.
[0546]
To identify the specific 18-20mer peptides recognized by these clones, each of the 18-20mer peptides that make up the positive pool for their ability to stimulate two P501S-specific CTL clones, 4E5 and 4E7, was γ- Tested individually in the IFN Elispot assay. Both 4E5 and 4E7 specifically recognized one 20mer-peptide spanning amino acids 453-472 of P501S (SEQ ID NO: 853; cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 854).
[0547]
Since the smallest epitope recognized by CD8 + T cells is often a 9 or 10-mer peptide sequence, a 10-mer peptide differing by one amino acid was synthesized covering the entire sequence of SEQ ID NO: 853. Each of these 10-mer peptides was tested for its ability to stimulate two P501S-specific clones (designated 1D5 and 1E12). One 10-mer peptide that specifically stimulates the P501S-specific clone (SEQ ID NO: 855; cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 856). This epitope covers the amino acids 463-472 of P501S. This sequence allows for natural processing and defines the smallest 10-mer epitope from P501S that allows CTL responses to be identified in normal PBMCs. Thus, this epitope is a suitable candidate for use as a vaccine component in prostate cancer and as a therapeutic and / or diagnostic agent.
[0548]
HLA blocking analysis and mismatch analysis were performed to identify class I restriction elements for the P501S-derived sequence of SEQ ID NO: 855. In the γ-IFN Elispot assay, the specific reaction of clones 4A7 and 4E5 to P501S-transduced autologous fibroblasts was 25 ug / ml W6 / 32 (pan-class I blocking antibody) and B1.23.2 (HLA-B / C Blocking antibody). These results indicate that the SEQ ID NO: 855-specific reaction is restricted by HLA-B or HLA-C alleles.
[0549]
In the HLA mismatch analysis, autologous B-LCL (HLA-A1, A2, B8, B51, Cw1, Cw7) and heterologous B-LCL (HLA-A2, A3, B18, B51, Cw5, Cw14) sharing HLAB51 are common. Was pulsed with 20 ug / ml of the peptide of SEQ ID NO: 855 for 1 hour and tested for the ability to stimulate clones 4A7 and 4E5 using the γ-IFN Elispot assay after washing. An antibody blocking assay using B1.23.2 (HLA-B / C blocking antibody) was also performed. SEQ ID NO: 855-specific reaction was detected using both autologous (D326) and heterologous (D107) B-LCL, and the reaction was performed with 25 ug / ml B1.23.2 HLA-B / C blocking antibody. Blocked by incubation. These results indicate that the P501S-specific reaction to the peptide of SEQ ID NO: 855 is restricted to HLA-B51 class I allele. Molecular cloning and sequence analysis of the HLA-B51 allele from D3326 indicates that the HLA-B51 subtype of D326 is HLA-B51011.
[0550]
Based on the 10-mer P501S-derived epitope of SEQ ID NO: 855, two 9-mers having the sequences of SEQ ID NOs: 857 and 858 were synthesized, and the two P501S-specifics from cell line 2A2 were synthesized using Elispot assay. CTL clones were tested for their ability to stimulate. The 10-mer peptide of SEQ ID NO: 855 as well as the 9-mer peptide of SEQ ID NO: 858 were able to stimulate P501S-specific CTL to produce IFN-gamma, but not the 9-mer peptide of SEQ ID NO: 857. These results indicate that the peptide of SEQ ID NO: 858 is a 9-mer P501S-derived epitope recognized by P501S-specific CTL. The DNA sequence encoding the epitope of SEQ ID NO: 858 is set forth in SEQ ID NO: 859.
[0551]
To identify class I-restricted alleles for P501S-derived peptides in the SEQ ID NOs: 855 and 858 specific reactions, HLA B and C alleles, respectively, were cloned from donors used in in vitro priming experiments. Sequence analysis showed that the relevant alleles were HLA-B8, HLA-B51, HLA-Cw01 and HLA-Cw07. Each of these alleles was subcloned into an expression vector and co-transfected with P501S gene into BA-13 cells. The transfected VA-13 cells were then tested for the specific stimulation ability of P501S-specific CTL with an ELISPOT assay.
[0552]
VA-13 cells transfected with P501S and HLA-B51 were able to stimulate P501S-specific CTLs to secrete γ-IFN. VA-13 cells transfected with HLA-B51 alone or P501S + other HLA alleles failed to stimulate P501S-specific CTL. These results indicate that the constrained allele for the P501S-specific reaction is HLAB51 allele. Sequence analysis indicated that the related restricted allele subtype was HLA-B51011.
[0553]
To determine whether P501S-specific CTLs can recognize P501S-expressing prostate tumor cells, the P501S-positive cell lines LnCAP and CRL2422 (both expressing "moderate" amounts of P501S mRNA and protein); And PC-3 (expressing low amounts of P501S mRNA and protein), as well as the P501S-negative cell line DU-145, were cloned from a donor used to generate P501S-specific CTL using a retrovirus. Transduced with HLA-B51011 allele. HLA-B51011- or EGFO-transduced, selected tumor cells were treated with gamma interferon and androgen (up-regulating stimulatory function and P501S, respectively) and gamma interferon Elispot with P501S-specific CTL clones 4E5 and 4E7. Used for assay.
[0554]
Both 4E5 and 4E7 efficiently and specifically recognized LnCAP and CRL2422 cells transduced with the HLA-B51011 allele, but did not recognize the same cell line transduced with EGFP. Furthermore, both CTL clones specifically recognized HLA-B51011-transduced PC-3 cells, but did not recognize DU-145, a P501S-negative tumor cell line. Treatment with gamma interferon or androgen did not increase the ability of CTL to recognize tumor cells. These results indicate that the P501S-specific CTLs generated by priming all genes in vitro specifically and efficiently recognize P501S-expressing prostate tumor cell lines.
[0555]
The naturally processed CD4 epitope of P501S was identified as follows.
CD4 cells specific for P501S were prepared as described above. A series of 16 overlapping peptides spanning approximately 50% of the amino-terminal portion of the P501S gene (amino acids 1-325 of SEQ ID NO: 113) was synthesized. In preparation for priming, peptides were pooled into four peptide pools and dendritic cells (DCs) were pulsed with TNF-alpha at 4 μg / ml for 24 hours. The DCs were then washed, and the negatively sorted CD4 + T cells were mixed in a 96-well U-bottom plate.
[0556]
Cultures were stimulated weekly on fresh DCs with the addition of the peptide pool. After a total of four stimulation cycles, the cells were rested for an additional week before testing specificity for APCs pulsed with the peptide pool using a gamma-IFN ELISA and a proliferation assay. In these assays, adherent monocytes loaded with either the 4 ug / ml related peptide pool or the ug / ml irrelevant peptide were used as APCs. T cell lines that showed specific cytokine secretion or proliferation were then tested for recognition of individual peptides present in the pool. From pools A and B, T cell lines recognizing individual peptides derived from these pools could be identified.
[0557]
From pool A, cell lines AD9 and AE10 specifically recognized peptide 1 (SEQ ID NO: 862) and cell line AF5 recognized peptide 39 (SEQ ID NO: 861). In pool B, a cell line BC6 recognizing peptide 58 (SEQ ID NO: 860) could be identified. Each of these cell lines was stimulated with a specific peptide and tested for specific recognition of the peptide using titer assays and cell lysates generated by infecting HEK293 cells with adenovirus expressing P501S or an irrelevant antigen.
[0558]
In these assays, APC-adhered monocytes were pulsed with 10, 1 or 0.1 μg / ml of individual P501S peptide, and DCs were pulsed with adenovirus-infected cell lysate diluted 1: 5 overnight. . Cell lines AD9, AE10 and AF5 significantly recognized the related P501S-derived peptide even at a concentration of 0.1 mg / ml. Furthermore, cell line AD9 also showed significant (8.1-fold stimulation index) specific activity against lysates derived from adenovirus P501S infected cells. These results indicate that anti-affinity CD4 T cell lines can be generated against P501S-derived epitopes, and that at least a subset of these T cells specific for the P501S-derived sequence of SEQ ID NO: 862 are identified as epitopes that are naturally processed by human cells. It is shown to be specific. DNA sequences encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 860-862 are shown in SEQ ID NOs: 863-865, respectively.
[0559]
This cell line was cloned using anti-CD3 to further characterize the P501S-specific activity of AD9. Three clones, designated 1A1, 1A9 and 1F5, specific for the P501S-1 peptide (SEQ ID NO: 862) were identified. To determine the HLA-restricted allele for the P501S-1 specific reaction, each of these clones was tested using a Class II antibody blocking assay utilizing the proliferation and gamma interferon assays and an HLA mismatch assay.
[0560]
In the measurement of gamma interferon production using an antibody blocking assay and an ELISA assay, the peptide-pulse APC recognition ability of all three clones was specifically blocked by co-incubation with a pan-class II blocking antibody or an HLA-DR blocking antibody. It was not blocked by HLA-DQ or an irrelevant antibody. Proliferation assays performed simultaneously with the same cells also confirmed this result. These data indicate that the P501S-specific reaction of the clone is restricted by the HLA-DR allele. Another study showed that the constrained allele for the P501S-specific reaction was HLA-DRB1501.
[0561]
Example Thirteen.Identification of prostate specific antigen by microarray analysis
This example describes the isolation of certain prostate specific polypeptides from a prostate tumor cDNA library.
The human prostate tumor cDNA expression library described above was selected using microarray analysis to provide at least a 3-fold excess in prostate tumor and / or normal prostate tissue compared to non-prostate normal tissue (excluding testis). Clones showing expression were identified. 372 clones were identified and 319 clones were successfully sequenced.
[0562]
Table I provides a summary of these clones, which are shown in SEQ ID NOs: 385-400. Of these sequences, SEQ ID NOs: 386, 389, 390 and 392 are novel genes, and SEQ ID NOs: 393 and 396 are previously identified sequences. The other sequences (SEQ ID NOs: 385, 387, 388, 391, 394, 395 and 397-400) are known sequences as shown in Table I.
[0563]
[Table 2]

[0564]
CGI-82 showed 4.06-fold overexpression in prostate tissue compared to other normal tissues tested. CGI-82 was overexpressed in 43% of prostate tumors and 25% of normal prostate and was not detected in other normal tissues tested. L-iditol-2-dehydrogenase showed a 4.94-fold overexpression in prostate tissue compared to other normal tissues tested. L-iditol-2-dehydrogenase was overexpressed in 90% of prostate tumors, 100% of normal prostate and was not detected in other normal tissues tested. The Ets transcription factor PDEF was 5.55-fold overexpressed in prostate tissue compared to other normal tissues tested.
[0565]
The Ets transcription factor PDEP was overexpressed in 47% of prostate tumors, 25% of normal prostate, and was not detected in other normal tissues tested. hTGR1 showed a 9.11-fold overexpression in prostate tissue compared to other normal tissues tested. hTGR1 was overexpressed in 63% of prostate tumors and was not detected in normal tissues tested, including normal prostate. KIAA0295 showed a 5.59-fold overexpression in prostate tissue compared to other test normal tissues. KIAA0295 was overexpressed in 47% of prostate tumors, and its expression was low and could not be detected in test normal tissues including normal prostate tissue. Prostate acid phosphatase showed a 9.14-fold overexpression in prostate tissue compared to other test normal tissues.
[0566]
Prostate acid phosphatase was overexpressed in 67% of prostate tumors, 50% of normal prostate, and was not detected in other normal tissues tested. Transglutaminase was over-expressed 14.84-fold in prostate tissue compared to other normal test tissues. Transglutaminase was overexpressed in 30% of prostate tumors, overexpressed in 50% of normal prostate, and was not detected in other tested normal tissues. High density lipoprotein binding protein (HDLBP) showed a 28.06-fold overexpression in prostate tissue compared to other normal tissues.
[0567]
HDLBP was overexpressed in 97% of prostate tumors, 75% of normal prostate, and was undetectable in all other normal cells tested. CGI-69 showed 3.56 fold overexpression in prostate tissue compared to other normal test tissues. CGI-69 is a low abundant gene, detected in 90% of prostate tumors and 75% of normal prostate tissue. Expression of this gene in normal tissues was very low. KIAA0122 showed a 4.24-fold overexpression in prostate tissue compared to other test normal tissues. KIAA0122 was overexpressed in 57% of prostate tumors and was not detectable in all normal tissues, including normal prostate tissue.
[0568]
1942.2 bangur showed a 23.25-fold overexpression in prostate tissue compared to other test normal tissues. 1942.2 bangur was overexpressed in 97% of prostate tumors and 100% of normal prostate. 1942.2 bangur could not be detected in other test normal tissues. 5566.1 Wang showed a 3.31-fold overexpression in prostate tissue compared to other test normal tissues. 5566.1 Wang was overexpressed in 97% of prostate tumors and 75% of normal prostate, and was also overexpressed in normal bone marrow, pancreas and activated PBMC. The new clone 23379 (also referred to as P553S) showed a 4.86-fold overexpression in prostate tissue compared to other test normal tissues.
[0569]
Clone 23379 was detectable in 97% of prostate tumors and 75% of normal prostate, but not in all other tested normal tissues. The new clone 23399 showed 4.09-fold overexpression in prostate tissue compared to other normal test tissues. Clone 23399 was overexpressed in 27% of prostate tumors and could not be detected in all tested normal tissues, including normal prostate tissue. The new clone 23320 showed a 3.15-fold overexpression in prostate tissue compared to other normal test tissues. Clone 23320 was detectable in all prostate tumors and in 50% of normal prostate tissue. Clone 23320 was also expressed in normal colon and trachea. Other normal cells do not express this gene at high levels.
[0570]
Subsequent full-length cloning studies on P553S utilizing standard methods revealed that this clone was an incompletely spliced form of P501S. The determined cDNA sequences of the four splice variants of P553S are shown in SEQ ID NOs: 702-705. The amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 705 is shown in SEQ ID NO: 706. The cDNA sequence of SEQ ID NO: 702 was found to contain two open reading frames (ORFs). The amino sequences encoded by these two ORFs are shown in SEQ ID NOs: 707 and 708.
[0571]
Example 14.Electronic subtraction method ( electronic Subtraction ) Identification of prostate specific antigen
This example describes the identification of a prostate specific antigen using an electronic subtraction method.
A potential prostate-specific gene in the GenBank human EST database was described by an electronic subtraction method (Vasmatizis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 300-304, 1998). Method similar to that of the above). Sequences of EST clones (43,482) derived from various prostate libraries were obtained from GenBank's public human EST database. Each prostate EST sequence was used as a query sequence in a BLASTN (National Center for Biotechnology Information) search against the human EST database.
[0572]
All matches considered identical (length of matching sequence> 100 base pairs, density of identical matches in this region> 70%) were grouped (arranged) into one cluster. Clusters containing more than 200 ESTs were discarded, probably because they are highly expressed genes such as those of repetitive elements or liposome proteins. If two or more clusters share a common cluster, those clusters were combined into a "supercluster" to yield 4,345 prostate superclusters.
[0573]
Records of the 479 human cDNA library in the GenBank release were downloaded to create a database of records for these cDNA libraries. These 479 cDNA libraries were organized into the following three groups. A plus group (a library of normal prostate and prostate tumor and breast cell line libraries where expression is desired), a minus group (libraries from other normal adult tissues where expression is not desired), and other Groups (fetal tissues, infant tissues, tissues found only in women, tumors other than prostate, and libraries from cell lines other than prostate cell lines, whose expression is considered to be irrelevant). A summary of these library groups is shown in Table II.
[0574]
[Table 3]

[0575]
Each supercluster was analyzed for ESTs within that supercluster. Focusing on the tissue source of each EST clone, the super clusters were classified into the following four groups. That is, Type 1-an EST clone found only in the library of the above-mentioned plus group, and whose expression is not detected in the library of the above-mentioned minus or other group; An EST clone derived from only the EST clone, wherein no expression is detected in the minus group; EST clone derived from the library of the plus, minus, and other groups; EST clones wherein the number of ESTs derived is higher than said minus or other group; and type 4-EST clones derived from said plus, minus and other groups of libraries, wherein said plus group The number to be al induced a higher EST clones than the number derived from the negative group. This analysis identified 4,345 breast clusters (see Table III). From these clusters, 3,172 EST clones were purchased from Research Genetics, Inc. And received as frozen glycerin stock in 96-well plates.
[0576]
[Table 4]

[0577]
The insert of the EST clone was PCR amplified using amino linked PCR primers for Synteni microarray analysis. When more than one PCR product was obtained for a particular clone, the PCR products were not used for expression analysis. A total of 2,528 clones from the electronic subtraction method were analyzed by microarray analysis to identify breast subtracted clones of electronic subtraction with high levels of tumor versus normal tissue mRNA.
[0578]
Such screens use a microarray from Synteni (Palo Alto, Calif., USA), according to the manufacturer's instructions, and, in effect, Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA, 93: 10614-10619, 1996 and Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 2150-2155, 1997. In these analyses, the clones were sequenced on chips, and the chips were then probed with normal and tumor prostate cDNA and fluorescent probes made from various other normal tissues. The slide glass was scanned and the fluorescence intensity was measured.
[0579]
Clones with an expression ratio of greater than 3 (ie, clones in which the levels of prostate tumor and normal prostate mRNA were at least three times the level of other normal tissue mRNA) were identified as prostate tumor-specific sequences (Table IV). The sequences of these clones are shown in SEQ ID NOs: 401-453, and specific novel sequences are shown in SEQ ID NOs: 407, 413, 416-419, 422, 426, 427, and 450.
[0580]
[Table 5]

[0581]
[Table 6]

[0582]
The clone of SEQ ID NO: 407 (also referred to as P1020C) was further studied to isolate the extended cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 591. This extended cDNA sequence was found to contain an open reading frame encoding the predicted amino acid sequence of SEQ ID NO: 592. The P1020C cDNA and amino acid sequence was found to show some similarity to the human endogenous retrovirus HERV-K por gene and protein.
[0583]
Example Fifteen.Further identification of prostate specific antigen by microarray analysis
This example describes the isolation of additional prostate specific polypeptide from a prostate tumor cDNA library.
A human prostate tumor cDNA expression library as described above is selected using microarray analysis to at least compare prostate tumor tissue and / or normal prostate tissue with non-prostate normal tissue (without testis). Clones showing a three-fold overexpression were identified. 142 clones were identified and sequenced. Specific clones among these clones are shown in SEQ ID NOs: 454 to 467. Among these sequences, SEQ ID NOs: 459 to 460 are novel genes. Other sequences (SEQ ID NOs: 454 to 458 and 461 to 467) are known sequences.
[0584]
The determined cDNA sequence SEQ ID NO: 461 was found to be homologous to the previously identified transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2) by comparison with the sequence in the Genbank database using the BLAST program. . The full length cDNA sequence of this clone is shown in SEQ ID NO: 894, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 895. The cDNA sequence encoding the first 209 amino acids of TMPRSS2 is shown in SEQ ID NO: 896, and the first 209 amino acids is shown in SEQ ID NO: 897.
[0585]
The sequence of SEQ ID NO: 462 (designated P835P) was found to be a previously identified clone FLJ13518 (Accession No. AK023643; SEQ ID NO: 917) without an associated open reading frame (ORF). Using this clone, a Geneseq DNA database was previously searched for as a G protein-coupled receptor protein characterized by the presence of seven transmembrane domains (DNA Genseq Accession No. A09351; amino acid Geneseq Accession No. Y92365). It was consistent with the clone identified. The sequence of the fragment between these domains is shown in SEQ ID NOs: 921-928, and SEQ ID NOs: 921, 923, 925 and 927 represent the extracellular domain, and SEQ ID NOs 922, 924, 926 and 928 represent the intracellular domain Represent.
[0586]
SEQ ID NOs: 921 to 928 show amino acids 1 to 28, 53 to 61, 83 to 103, 124 to 143, 165 to 201, 226 to 238, 263 to 272, and 297 to 381 of P835P, respectively. The sequence of the full-length P835P cDNA is shown in SEQ ID NO: 916. The cDNA sequence of the P835P open reading frame, including the stop codon, is shown in SEQ ID NO: 918, and the open reading frame without the stop codon is shown in SEQ ID NO: 919, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 920. .
[0587]
Example 16.Prostate specific antigen P710P Further characterization of
This example describes full-length cloning of P710P.
The prostate cDNA library was screened with the P710P fragment. One million colonies were plated on LB / ampicillin plates. The colonies were lifted using a nylon membrane filter, and the cDNA picked up by these filters was then denatured with UV light to crosslink the filters. The P710P fragment was radioactively labeled and the fragment was used to hybridize to the filter.
[0588]
Positive cDNA clones were selected, the cDNAs were collected and sequenced by an automated Perkin Elmer / Applied Biosystems Division Sequencer. Four sequences have been obtained and are set forth in SEQ ID NOs: 468-471. These sequences appear to be different splice variants of the P710P gene. Subsequently, when the cDNA sequence of P710P was compared with the sequence of Genbank, it was revealed that the cDNA sequence was homologous to the DD3 gene (Genbank accession numbers AF103907 and AF103908). The sequence of the DD3 cDNA is shown in SEQ ID NO: 690.
[0589]
Example 17.Prostate-specific antigen protein expression
In this embodiment, E.I. The expression and purification of prostate specific antigen in E. coli, baculovirus and mammalian cells is described.
a) E. FIG. coli Within P501S Expression of
Full-length expression of PS501S was determined by M. This was achieved by first cloning P501S (amino acids 36 to 553 of SEQ ID NO: 113) having no leader sequence downstream from the first 30 amino acids (SEQ ID NO: 484) of the tuberculosis antigen Ra12. In particular, P501S DNA was used to perform PCR using primers AW025 (SEQ ID NO: 485) and AW003 (SEQ ID NO: 486). AW025 is a sense cloning primer containing a HindIII site. AW003 is an antisense cloning primer containing an EcoRI site.
[0590]
DNA amplification was performed using 5 μl 10 × Pfu buffer, 1 μl 20 mM dNTPs, 1 μl of each PCR primer at 10 μm concentration, 40 μl water, 1 μl Pfu DNA polymerase (Stratagene, La Jolle, Calif.), And 1 μl DNA at 100 ng / μl. Was. Denaturation at 95 ° C for 30 seconds, followed by 10 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes, and 20 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes. Finally, one cycle of 72 ° C. for 10 minutes was performed. This PCR product was cloned into Ra12m / pET17b using HindIII and EcoRI. The sequence of the resulting fusion construct (referred to as Ra12-P501S-F) was confirmed by DNA sequencing.
[0591]
This fusion construct was cloned into BL21 (DE3) pLysE / pLysS and CodonPlus E. coli. coli (Stratagene) and cultured overnight in LB broth containing kanamycin. The resulting culture was induced by IPTG. Proteins were transferred to PVDF membrane, blocked with 5% non-fat milk (in PBS-Tween buffer) and washed three times and incubated for 1 hour with mouse anti-His tag antibody (Clontech). The membrane was washed three times and probed with HRP-Protein A (Zymed) for 30 minutes. Finally, the membrane was washed three times and developed with ECL (Amersham). No expression was detected by Western blot. Similarly, when Ra12-P501S-F fusion was used for expression in BL21 CodonPlus by CE6 phage (Invitrogen), no expression was detected by Western blot.
[0592]
The N-terminal fragment of P501S (amino acids 36-325 of SEQ ID NO: 113) was inserted into PET17b as follows. The first 30 amino acids of the tuberculosis antigen Ra12 were cloned. PCR was performed using P501S DNA and primers AW025 (SEQ ID NO: 485) and AW027 (SEQ ID NO: 487). AW027 is an antisense cloning primer containing an EcoRI site and a stop codon. DNA amplification was performed essentially as described above. The resulting PCR product was cloned into Ra12 in pET17b at the HindIII and EcoRI sites. The fusion construct (designated Ra12-P501S-N) was confirmed by DNA sequencing.
[0593]
The Ra12-P501S-N fusion construct was used for expression in BL21 (DE3) pLysE, φLysS, and CodonPlus essentially as described previously. A protein band was observed at the expected molecular weight of 36 KDa using Western blot analysis. Some high molecular weight bands were also observed, probably due to aggregation of the recombinant protein. No expression was detected by Western blot when using the Ra12-P501S-F fusion for expression in BL21 CodonPlus by CE6 phage.
[0594]
M. A fusion construct containing the C-terminal portion of P501S (amino acids 257-553 of SEQ ID NO: 113) downstream of the first 30 amino acids of the tuberculosis antigen Ra12 (SEQ ID NO: 484) was prepared as follows. PCR was performed using P501S DNA and primers AW026 (SEQ ID NO: 488) and AW003 (SEQ ID NO: 486). AW026 is a sense cloning primer containing a HindIII site. DNA amplification was performed essentially as described above. The resulting PCR product was cloned into Ra12 in pET17b at the HindIII and EcoRI sites. The sequence for the fusion construct (designated Ra12-p501S-C) was confirmed.
[0595]
The Ra12-P501S-C fusion construct was used for expression in BL21 (DE3) pLysE, pLysS, and CodonPlus as described above. Small amounts of protein were detected by Western blot, and some molecular weight was also observed. When the Ra12-P501S-C fusion was used for expression in BL21 CodonPlus induced by CE6 phage, expression was also detected by Western blot.
[0596]
M. A fusion construct (SEQ ID NO: 848) containing a fragment of P501S (amino acids 36-298 of SEQ ID NO: 113) downstream of the tuberculosis antigen Ra12 was prepared as follows. Using P501S DNA, PCR was performed using primers AW042 (SEQ ID NO: 849) and AW053 (SEQ ID NO: 850). AW042 is an E.C. Sense cloning primer containing a coRI site. AW053 is an antisense primer having a termination site and an XhoI site. DNA amplification was performed as described above. The resulting PCR product was cloned into Ra12 in pET17b at EcoRI and XhoI sites. The resulting fusion construct (referred to as Ra12-P501S-E2) was transformed with B834 (DE3) pLysS E. coli in TB medium for 2 hours at room temperature. and expressed in E. coli host cells.
[0597]
The expressed protein was purified by washing the inclusion bodies and running on a Ni-NTA column. This purified protein remained soluble in a buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 8), 100 mM NaCl, 10 mM β-Me, and 5% glycerol. The determined cDNA and amino acid sequences for the expressed fusion protein described above are provided in SEQ ID NOs: 851 and 852, respectively.
[0598]
b) within the baculovirus P501S Expression of
To express the P501S protein in insect cells, a Bac-to-Bac baculovirus expression system (BRL Life Technologies, Inc.) was used. The full length P501S (SEQ ID NO: 113) was amplified by PCR and cloned into the XbaI site of the donor plasmid pFastBacI. Recombinant bacmid and baculovirus were prepared according to the manufacturer's instructions. This recombinant baculovirus was amplified in sf9 cells and a high titer virus stock was used to infect High Five cells (Invitrogen) to produce recombinant protein. The identity of the full-length protein was confirmed by N-terminal sequencing of the recombinant protein and by Western blot analysis (FIG. 7).
[0599]
In particular, 600,000 High Five cells in 6-well plates were infected with untreated control virus BV / ECD-PD (lane 2) or with recombinant baculovirus for P501S in different amounts or MOIs (lane). 4-8) or not infected (lane 3). Cell lysates were made on SDS-PAGE under reducing conditions and analyzed by Western blot with the anti-P501S monoclonal antibody P501S-10E3-G4D3 (prepared as described below). Lane 1 is a biotinylated protein molecular weight marker (BioLabs).
[0600]
The localization of recombinant P501S in insect cells was examined as follows. Insect cells overexpressing P501S were fractionated into nuclear, mitochondrial, membrane, and cytosolic fractions. Equal amounts of protein from each fraction were analyzed by Western blot with a monoclonal antibody against P501S. Due to the fractionation scheme, both the nuclear and mitochondrial fractions contain some plasma membrane components. However, the membrane fraction is essentially free of mitochondria and nuclei. P501S was found to be present in all fractions containing the membrane components. This suggests that P501S may be associated with the plasma membrane of insect proteins expressing the recombinant protein.
[0601]
c) In mammalian cells P501S Expression of
The full-length P501S (553 amino acids; SEQ ID NO: 113) was placed in a variety of mammalian expression vectors, including pCEP4 (Invitrogen), pVR1012 (Vicol, San Diego, CA), and pBIB, a modified form of the retroviral vector pBMN. Cloned. Transfection of P501S / pCEP4 and P501S / pVR1012 into HEK293 fibroblasts was performed using Fugene transfection reagent (Boehringer Mannheim). Briefly, 2 μl Fugene reagent was diluted in 100 μl serum-free medium and incubated at room temperature for 5-10 minutes. This mixture was added to 1 μg of P501S plasmid DNA, mixed briefly, and incubated at room temperature for 30 minutes. The Fugene / DNA mixture was added to the cells and incubated for 24-48 hours. Expression of recombinant P501S in transfected HEK293 fibroblasts was detected by Western blot using a monoclonal antibody against P501S.
[0602]
Transfection of P501S / pCEP4 into CHO-K cells (American Type Culture Collection, Rockville, MD) was performed using GenePorter transfection reagent (Gene Therapy Systems, San Diego, Calif.). Briefly, 15 μl of Gone Porter was diluted in 500 μl of serum-free medium and incubated for 10 minutes at room temperature. The Gene Porter / medium mixture was added to 2 μg of plasmid DNA, which was diluted in 500 μl of serum-free medium, mixed briefly, and incubated at room temperature for 30 minutes. The CHO-K cells are rinsed in PBS to remove plasma proteins and the Gene Porter / DNA mix is added and incubated for 5 hours. The transfected cells were then fed with an equal volume of 2x medium and incubated for 24-48 hours.
[0603]
FACS analysis of CHO-K cells transiently infected with P501S demonstrated surface expression of P501S. Expression was detected using a rabbit polyclonal antiserum to the P501S peptide as described below. Analysis by flow cytometry was performed using a FaCScan (Becton Dickinson) and the data was analyzed using the Cell Quest program.
[0604]
d) in baculovirus P703P Expression of
The full-length P703P-DE5 (SEQ ID NO: 326) cDNA with multiple adjacent restriction sites was obtained by digesting plasmid pCDNA703 with the restriction endonucleases XbaI and HindIII. The resulting restriction fragment (about 800 base pairs) was ligated into a transfer vector digested with the same restriction enzymes. The sequence of the insert was confirmed by DNA sequencing. The recombinant transfer plasmid pFBP703 was used to produce bacmid DNA and baculovirus using the Bac-To-Bac baculovirus expression system (BRL Life Technologies). High Five cells were infected with recombinant virus BVP703 to obtain recombinant P703P protein as described above.
[0605]
e) E. In coli P788P Expression of
The short N-terminal portion of P788P fused with a C-terminal 6 × His tag (residues 1 to 644 of SEQ ID NO: 777; also referred to as P788P-N) is described as follows. E. coli. The P788P cDNA was amplified using primers AW080 and AW081 (SEQ ID NOs: 815 and 816). AW080 is a sense cloning primer having an NdeI site. PCR-amplified 788P and the vector pCRX1 were digested with NdeI and XhoI. The vector and insert were ligated and transformed into Nova Blue cells. Colonies were randomly screened for inserts and then sequenced.
[0606]
P788P-N clone # 6 was confirmed to be identical to the designed construct. In the expression construct P788P-N # 6 / pCRX1, E. coli BL21 CodonPlus-RIL competent cells were transformed. After induction, most cells grew well and after 3 hours the OD600 reached 2.0 or higher. Coomassie stained SDS-PAGE showed a band overexpressed at about 75 kD. Western blot analysis using a 6 × His tag antibody confirmed that the band was P788P-N. The determined cDNA sequence for P788P-N is shown in SEQ ID NO: 817, while the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 818.
[0607]
f) E.I. In coli P510S Expression of
The P510S protein has nine potential transmembrane domains and is presumed to be located at the plasma membrane. The C-terminal domain of this protein, and the predicted third extracellular domain of P510S, are as follows: E. coli.
[0608]
The expression construct, designated Ra12-P501S-C, has a 6His tag at the N-terminus, followed by the M. tuberculosis antigen Ra12 (SEQ ID NO: 819) and the C-terminal portion of P510S (amino residues 1176-SEQ ID NO: 538). 1261). Full-length P510S was used to amplify the P510S-C fragment by PCR using primers AW056 and AW057 (SEQ ID NOs: 820 and 821, respectively). AW056 is a sense cloning vector having an EcoRI site. AW057 is an antisense primer having a stop site and an XhoI site. The amplified P501S fragment and Ra12 / pCRX1 were digested with EcoRI and XhoI and then purified. The insert and vector were ligated together and transformed into Nova Blue.
[0609]
Colonies were randomly screened for inserts and sequences. For protein expression, E. coli was used in the expression construct. E. coli BL21 (DE3) was transformed. Mini induction screening was performed to optimize expression conditions. After the induction, the cells grew well, and after 3 hours, OD600nm reached 2.0 or more. Coomassie stained SDS-PAGE showed a highly overexpressed band of approximately 30 kD. Although this is above the estimated molecular weight, Western blot analysis was positive, indicating that this band was a His-tag containing protein. The optimized culture conditions are as follows.
[0610]
Overnight culture / daytime culture (LB + kanamycin + chloramphenicol) in 2 x YT (with kanamycin and chloramphenicol) at a ratio of 25 ml culture to 1 L of 2 x YT Dilute in. Grow at 37 ° C. until OD600 = 0.6. An aliquot is taken as a sample for TO. Add 1 mM IPTG and grow at 30 ° C. for 3 hours. A T3 sample is taken, cells are spun down and stored at -80 ° C. The cDNA and amino acid sequences determined for the Ra12-P510SC construct are shown in SEQ ID NOs: 822 and 825, respectively.
[0611]
The expression construct P510S-C appears to have an initiation codon and a glycine (GGA) codon added 5 ', and then a P510S C-terminal fragment, followed by an in-frame 6 × histidine tag and a stop codon from the pET286 vector. Designed to. The cloning strategy was similar to that used for Ra12-P510S-C, except that the PCR primers used were as shown in SEQ ID NOs: 828 and 829, respectively, and NcoI / XhoI cleavage was used in pET28b. . The primer of SEQ ID NO: 828 created a 5 'NcoI site and added a start codon.
[0612]
The antisense primer of SEQ ID NO: 829 creates an XhoI site on the P510S C-terminal fragment. Clones were confirmed by sequencing. For protein expression, E. coli was used in the expression construct. E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIL competent cells were transformed. An OD600 of 2.0 or higher was obtained 30 hours after induction. Coomassie stained SDS-PAGE showed an overexpressed band of about 11 kD. Western blot analysis confirmed that the band was P510S-C when N-terminal protein sequencing was performed. The optimized culture conditions are as follows:
[0613]
Overnight culture / daytime culture (LB + kanamycin + chloramphenicol) in 2 x YT (with kanamycin and chloramphenicol) at a ratio of 25 ml culture to 1 L of 2 x YT Dilute in. Grow at 37 ° C. until OD600 = 0.6. An aliquot is taken as a sample for TO. Add 1 mM IPTG and grow at 30 ° C. for 3 hours. T3 samples are taken, cells are spun down and stored at -80 ° C until purification. The cDNA and amino acid sequence determined for the P510S-C construct are shown in SEQ ID NOs: 823 and 826, respectively.
[0614]
The putative third extracellular domain of P510S (P510S-ES; residues 328-676 of SEQ ID NO: 538) was as follows: E. coli. The P510S fragment was amplified by PCR using the primers shown in SEQ ID NOs: 830 and 831. The primer of SEQ ID NO: 830 is a sense primer having an NdeI site for use in ligation to pPDM. The primer of SEQ ID NO: 831 is an antisense primer with an XhoI site added for use in ligation to pPPM. The resulting fragment was cloned into pPDM at NdeI and XhoI sites. Clones were confirmed by sequencing. For expression of the protein, E. coli was E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIL competent cells were transformed.
[0615]
OD600nm reached 2.0 or more 3 hours after the induction. Coomassie-stained SDS-PAGE showed an overexpressed band of approximately 39 kD, and N-terminal sequencing confirmed P510S-E3. The optimized culture conditions are as follows. Overnight culture / daytime culture (LB + kanamycin + chloramphenicol) in 2 x YT (with kanamycin and chloramphenicol) at a ratio of 25 ml culture to 1 L of 2 x YT Dilute in. Grow at 37 ° C. until OD600 = 0.6. An aliquot is taken as a sample for TO. Add 1 mM IPTG and grow at 30 ° C. for 3 hours. T3 samples are taken, cells are spun down, and stored at -80 ° C until purification. The cDNA and amino acid sequence determined for the P501S-E3 construct are shown in SEQ ID NOs: 824 and 827, respectively.
[0616]
g) E. In Kori P775S Expression of
Antigen P775P contains a variety of open reading frames (ORFs). The third ORF encoding the protein of SEQ ID NO: 483 has the best emotic score. Tuberculosis antigen Ra12 (SEQ ID NO: 819) and P775P-ORF3 having an N-terminal 6 × His tag were prepared as follows. P775P-ORF3 was amplified using the sense PCR primer of SEQ ID NO: 832 and the antisense primer of SEQ ID NO: 833. PCR amplified fragments of P775P and Ra12 / pCRX1 were digested with restriction enzymes EcoRI and XhoI. The vector and insert were ligated and then transformed into NovaBlue cells.
[0617]
Colonies were randomly screened for inserts and then sequenced. A clone having the desired sequence is E. coli. E. coli BL21 (DE3) CodonPlus competent cells were transformed. Two hours after induction, the cell density reached an OD600 of about 1.8. Coomassie stained SDS-PAGE showed an overexpressed band of approximately 31 kD. Western blot using a 6 × His tag antibody confirmed that the band was Ra12-P775P-ORF3. The determined cDNA and amino acid sequences for the fusion construct are shown in SEQ ID NOs: 834 and 835, respectively.
[0618]
h) E. In coli P703P His Expression of tag fusion protein
CDNA for the coding region of P703P was prepared by PCR using primers of SEQ ID NOs: 836 and 837. The PCR product was digested with EcoRI restriction enzyme, gel purified, and cloned into a modified pET28 vector with an in-frame His tag digested with Eco72I and EcoRI restriction enzymes. The correct construct was confirmed by DNA sequence analysis, and then E. coli. E. coli BL21 (DE3) pLysS expression host cells were transformed. The amino acid and cDNA sequences determined for the expressed recombinant P703P are shown in SEQ ID NOs: 838 and 839, respectively.
[0619]
i) E. In coli P705P His Expression of tag fusion protein
CDNA for the P705P coding region was prepared by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 840 and 841. The PCR product was digested with EcoRI restriction enzyme, gel purified, and cloned into a modified pET28 vector with an in-frame His tag digested with Eco72I and EcoRI restriction enzymes. The correct construct was confirmed by DNA sequence analysis, and then E. coli. E. coli BL21 (DE3) pLysS and BL (DE3) CodonPlus expression host cells were transformed. The amino acid and cDNA sequences determined for the expressed recombinant P705P are shown in SEQ ID NOs: 842 and 843, respectively.
[0620]
j) E. In coli P711P His Expression of tag fusion protein
CDNA for the coding region of P711P was prepared by PCR using primers of SEQ ID NOs: 844 and 845. The PCR product was digested with EcoRI restriction enzyme, gel purified, and cloned into a modified pET28 vector with an in-frame His tag digested with Eco72I and EcoRI restriction enzymes. The correct construct was confirmed by DNA sequence analysis, and then E. coli. E. coli BL21 (DE3) pLysS and BL21 (DE3) CodonPlus expression host cells were transformed. The amino acid and cDNA sequences determined for the expressed recombinant P711P are shown in SEQ ID NOs: 846 and 847, respectively.
[0621]
k) E.I. Expression of P767P in E. coli
The full length coding region of P767P (amino acids 2-374 of SEQ ID NO: 590) was amplified by PCR using primers PDM-4680 and PDM-469 (SEQ ID NOs: 935 and 936, respectively). DNA amplification was performed with 10 μL of 10 × Pfu buffer, 1 μL of 10 mM dNTP, 2 μL of each 10 μM PCR primer, 83 μL of water, 1.5 μL of Pfu DNA polymerase (Stratagene, LaｌａJolla, CA), and 1 μL. DNA 100 ng / μL. Denaturation was performed at 96 ° C. for 2 minutes, followed by 40 cycles of 96 ° C. for 20 seconds, 66 ° C. for 15 seconds and 72 ° C. for 2 minutes, and finally one cycle of 72 ° C. for 4 minutes. Was.
[0622]
The PCR product was digested with XhoI and cloned into modified pET28, with a histidine tag tailed to the 5 'end digested from Eco72I and XhoI. Through sequence analysis, the construct was confirmed to be correct and transformed into E. coli BL21 pLysS and BL21 CondonPlus @ RP cells. The cDNA coding region for the recombinant B767P protein is set forth in SEQ ID NO: 938, and the corresponding amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 041. Full length P767P did not express at high enough levels for detection or purification.
[0623]
The truncated coding region of P767P (B767P-B; amino acids 47-374 of SEQ ID NO: 590) was described above for primers PDM-573 and PDM-469 (SEQ ID NOs: 937 and 936, respectively), and full length P767P. Amplified by PCR using the PCR conditions described above. The PCR product was digested with XhoI and cloned into a modified pET28 vector digested with Eco72I and Xho1. The construct was verified by sequence analysis and transformed into E. coli BL21 pLysS and BL21 CodonPlus RP cells. The protein was found to be expressed in the inclusion body pellet. The coding region of the expressed B767P-B protein is shown in SEQ ID NO: 939, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 940.
[0624]
Example 18.Preparation and characterization of antibodies to prostate-specific polypeptide
a) Preparation and characterization of polyclonal antibodies to P703P, P504S and P509S
Polyclonal antibodies to P703P, P504S and P509S were prepared as follows.
[0625]
E. FIG. Each prostate tumor antigen expressed in the E. coli recombinant expression system was grown in LB broth with the appropriate antibiotics overnight at 37 ° C. in a shaking incubator. The next morning, 10 ml of the overnight culture was added to 2 × YT with the appropriate antibiotic in a 2 L baffled Ehrenmeyer flask to 500 ml. When the optical density (at 560 nm) of the culture reached 0.4-0.6, cells were induced with IPTG (1 mM). Four hours after induction with IPTG, cells were harvested by centrifugation. The cells were washed with phosphate buffered saline and centrifuged again. The supernatant was discarded and the cells were frozen for subsequent use or processed immediately. 20 ml of lysis buffer was added to the cell pellet and vortexed.
[0626]
E. FIG. The mixture was subjected to a French press at 16,000 psi to rupture E. coli cells. The cells were centrifuged again, and the supernatant and pellet were assayed by SDS-PAGE for partitioning of the recombinant protein. For proteins localized in the cell pellet, the pellet was resuspended in 10 mM Tris pH 8.0, 1% CHAPS, and the inclusion body pellet was washed and centrifuged again. This procedure was repeated twice more. The washed inclusion bodies were solubilized with either 8 M urea or 6 M guanidine HCL containing 10 mM Tris pH 8.0 and 10 mM imidazole.
[0627]
The solubilized protein was added to 5 ml of nickel-chelate resin (Qiagen) and incubated at room temperature with continuous stirring for 45 min to 1 hour. After incubation, the resin and protein mixture was passed through a disposable column and the flow-through fraction was collected. The column was then washed with 10-20 column volumes of solubilization buffer. The antigen was then eluted from the column with 8 M urea, 10 mM Tris pH 8.0 and 300 mM imidazole and collected in 3 ml fractions. SDS-PAGE gels were run to determine which fractions were pooled for further purification.
[0628]
As a final purification step, a strong anion exchange resin, such as HiPrepQ (Biorad), was equilibrated with the appropriate buffer and the pooled fractions were loaded onto the column. Each antigen was eluted from this column using a rising salt gradient. Fractions were collected running over the column, and another SDS-PAGE gel was run to determine which fractions from this column were pooled. The pooled fraction was dialyzed against 10 mM Tris pH 8.0. The protein was then filtered through a 0.22 micron filter before filling into vials and the antigen was frozen until needed for immunization.
[0629]
400 μg prostate antigen was combined with 100 μg muramyl dipeptide (MDP). Every four weeks, rabbits were boosted with 100 μg of antigen mixed with an equal volume of incomplete Freund's adjuvant (IFA). Seven days after each boost, animals were bled. Serum was made by incubating the blood at 4 ° C. for 12-4 hours, followed by centrifugation.
[0630]
Antigen was coated by incubating a 96-well plate with 50 μl (typically 1 μg) of the recombinant protein at 4 ° C. for 20 hours. 250 μl of BSA blocking buffer was added to the wells and incubated for 2 hours at room temperature. Plates were washed 6 times with PBS / 0.01% Tween. Rabbit serum was diluted in PBS. 55 μl of diluted serum was added to each well and incubated for 30 minutes at room temperature. Plates were washed as described above, 50 μl of goat anti-rabbit horseradish peroxidase (HRP) at a dilution of 1: 10000 was added and incubated for 30 minutes at room temperature. Plates were washed again as described above and 100 μl of TMB microwell peroxidase substrate was added to each well. After 15 minutes incubation at room temperature in the dark, the colorimetric reaction was performed with 100 μl of 1N H₂SO₄And immediately measured at 450 nm. All polyclonal antibodies showed immunoreactivity to the appropriate antigen.
[0631]
b) Preparation and characterization of antibodies to P501S
A murine monoclonal antibody specific for the carboxy terminus of the prostate specific antigen P501S was prepared as follows.
A truncated fragment of P501S (amino acids 355-526 of SEQ ID NO: 113) was made and cloned into the pET28b vector (Novagen) and It was expressed as a histidine-tagged thioredoxin fusion protein in E. coli. The trx-P501S fusion protein was purified by nickel chromatography, digested with thrombin to remove the trx fragment, and further purified by an acid precipitation procedure followed by reverse phase HPLC.
[0632]
Mice were immunized with truncated P501S protein. Blood sera from mice potentially containing anti-P501S polyclonal sera were tested for P501S-specific reactivity using ELISA assays with purified P501S and trx-P501S proteins. Blood sera appearing to react specifically with P501S were then screened for P501S reactivity by Western analysis. Mice containing the P501S-specific antibody component were killed and spleen cells were used to generate anti-P501S antibody-producing hybridomas using standard techniques.
[0633]
Hybridoma supernatants were tested for P501S-specific reactivity first by ELISA and then by FACS analysis of reactivity with P501S transduced cells. Based on these results, a monoclonal hybridoma designated 10ES was selected for further subcloning. Several subclones were generated, tested for specific reactivity to P501S using ELISA, and classified for IgG isotype. The results of this analysis are shown in Table V below. Of the 16 subclones tested, the monoclonal antibody 10E3-G4-DS was selected for further study.
[0634]
[Table 7]

[0635]
The specificity of 10E3-G4-D3 for P501S was examined by FACS analysis. Specifically, cells were fixed (2% formaldehyde, 10 minutes), permeabilized (0.1% saponin, 10 minutes) and stained with 0.5-1 μg / ml 10E3-G4-D3, It was then incubated with a second FITC-conjugated goat anti-mouse Ig antibody (Pharmigen, San Diego, CA). The cells were then analyzed for FITC fluorescence using an Excalibur fluoresence activated cell sorter. B-LCL was retrovirally transduced with P501S for FACS analysis of transduced cells. For analysis of infected cells, B-LCL was infected with a vaccinia vector expressing P501S. To demonstrate specificity in these assays, B-LCL transduced with another antigen (P703P) and uninfected B-LCL vectors were utilized.
[0636]
10E3-G4-D3 was shown to bind to P501S-transduced B-LCL and also to P501S-infected B-LCL, but not to uninfected cells or P703P-transduced cells.
To examine whether the epitope recognized by 10E3-G4-D3 can be found on the surface of cells or in intracellular compartments, B-LCL was transduced with P501S or HLA-B8 as a control antigen and Fixed and permeabilized as described above or stained directly with 10E3-G4-D3 as described above and analyzed. Specific recognition of P501S by 10E3-G4-D3 was found to require permeabilization, suggesting that the epitope recognized by this antibody is intracellular.
[0637]
The reactivity of 10E3-G4-D3 with three prostate tumor cell lines, Lncap, PC-3 and DU-145, known to express high, medium and very low levels of P501S, respectively, was determined by Checked by infiltration and processing. Higher reactivity of 10E3-G4-D3 with Lncap than PC-3 was observed, and the reactivity with PC-3 was higher than with DU-145. These results are consistent with real-time PCR, and also demonstrate that this antibody specifically recognizes P501S in such tumor cell lines and that the epitope recognized in prostate tumor cell lines is intracellular .
[0638]
The specificity of 10E3-G4-D3 for P501S was also demonstrated by Western blot analysis. Lysates from HEK293 cells transiently transfected with the prostate tumor cell lines Lncap, DU-145 and PC-3, P501S and untransfected HEK293 cells were generated. Western blot analysis of these lysates with 10E3-G4-D3 showed a 46 kDa immunoreactive band in Lncap, PC-3 and P501S transfected HEK cells, but not in DU-145 cells or untransfected HEK293 cells. Not shown.
[0639]
P501S mRNA expression is consistent with these results, as semi-quantitative PCR analysis indicates that P501S mRNA is expressed in Lncap, at weaker but detectable levels in PC-3, and not at all in DU-145 cells It is because that was shown. Recombinant, bacterially expressed and purified P501S (designated P501SStr2) is 10E3-G4-like the full-length P501S transiently expressed in HEK293 cells using either the expression vector VR1012 or pCEP4. D3 (24 kDa). Although the estimated molecular weight of P501 is 60.5 kDa, both transfected P501S and "native" P501S migrated at slightly lower mobilities due to their hydrophobic nature.
[0640]
Immunohistochemical analysis was performed on prostate tumor and normal tissue section panels (prostate, adrenal gland, breast, neck, colon, duodenum, gallbladder, ileum, kidney, ovary, pancreas, parotid gland, skeletal muscle, spleen and testis) . Tissue samples were fixed in formalin solution for 24 hours and embedded in paraffin and sliced into 10 micron sections. Tissue sections were permeabilized and incubated with the 10E3-G4-D3 antibody for 1 hour. P501S immunoreactivity was visualized using HRP-labeled anti-mouse followed by incubation with DAB chromogen. P501S was found to be highly expressed in both normal prostate and prostate tumor tissues, but was not detected in the other tissues tested.
[0641]
An epitope mapping approach was pursued to identify the epitope recognized by 10E3-G4-D3. A series of 13 duplicates 20-21 mer (5 amino duplicates; SEQ ID NO: 489-501) were made across a span of the P501S fragment used to make 10E3-G4-D3. Flat bottom 96-well microtiter plates were coated with either the peptide or the P501S fragment used to immunize the mice at 1 μg / ml at 37 ° C. for 2 hours. The wells are then aspirated and blocked with phosphate buffered saline containing 1% (w / v) BSA for 2 hours at room temperature, then PBS containing 0.1% Tween 20 (PBST). Washed with. Purified antibody 10E3-G4-D3 was added in a two-fold dilution series (1000 ng to 16 ng) in PBST and incubated for 30 minutes at room temperature.
[0642]
It was then washed 6 times with PBST and incubated for 30 minutes with 1: 20,000 HRP-conjugated donkey anti-mouse IgG (H + L) Affinipure F (ab ') fragment (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). The plates were then washed and incubated in tetramethylbenzidine for 15 minutes. The reaction was stopped by the addition of 1N sulfuric acid and the plates were read at 450 nm using an ELISA plate reader. As shown in FIG. 8, reactivity was observed between the peptide of SEQ ID NO: 496 (corresponding to amino acids 439 to 459 of P501S) and the P501S fragment, but no reactivity was observed with the remaining peptides. Shows that the epitope recognized by 10E3-G4-D3 is present at amino acids 439-459 of SEQ ID NO: 113.
[0643]
To further assess the tissue specificity of P501S, a multi-array immunohistochemical analysis was performed on approximately 4700 human tissues, including all major normal organs, and neoplasms derived from these tissues. Sixty-five of these human tissue samples are of prostate origin. Tissue sections of 0.6 mm diameter were formalin fixed and embedded in paraffin. Samples were pretreated with HIER using 10 mM citrate buffer pH 6.0 and boiled for 10 minutes. Sections were stained with 10E3-G4-D3 and the P501S immunoreactivity was visualized with HRP. All 65 prostate tissue samples (5 normal, 55 untreated prostate tumors, 5 hormone refractory prostate tumors) were positive and showed different perinuclear staining. All other recognitions tested were negative for P501S expression.
[0644]
c) P503S Preparation and characterization of antibodies to
One fragment of P503S (amino acids 113-241 of SEQ ID NO: 114) was expressed and purified against P501S essentially from bacteria, as described above, to immunize both rabbits and mice. Used for Mouse monoclonal antibodies were isolated using conventional hybridoma technology, as described above. Rabbit monoclonal antibodies were isolated at the Immunogenics Pharmaceuticals (Vancouver, BC, Canada) using the Selective Lymphocyte Antibody Method (SLAM). Table VI below lists the monoclonal antibodies that have been developed against P503S.
[0645]
[Table 8]

[0646]
DNA sequences encoding the complementarity determining regions (CDRs) for rabbit monoclonal antibodies 20D4 and JA1 were determined and provided in SEQ ID NOs: 502 and 503, respectively.
To better define the respective epitope binding region of this antibody, a series of overlapping peptides was generated that span amino acids 109-213 of SEQ ID NO: 114 (span). These peptides were used in the epitope map of anti-P503S monoclonal antibody by ELISA as follows. The recombinant fragment of P503S, used as an immunogen, was used as a positive control. 96-well microtiter plates were coated with peptide or recombinant antigen at 20 ng / well at 4 ° C. overnight.
[0647]
The plate is aspirated and further blocked for 2 hours at room temperature with phosphate buffered saline containing 1% (w / v) BSA, then washed in PBS containing 0.1% Tween 20 (PBST) did. Purified rabbit monoclonal antibody, diluted in PBST, was added to the wells and incubated for 30 minutes at room temperature. This was followed by six washes with PBST and incubation for an additional 30 minutes with a 1: 2000 dilution of protein-A @ HRP conjugate. Plates were washed six times in PBST and incubated with tetramethylbenzidine (TMB) substrate for an additional 15 minutes. The reaction was stopped by the addition of 1 N sulfuric acid, and the plates were read at 450 nm using an ELISA plate reader. An ELISA using a mouse monoclonal antibody was performed using supernatants from tissue culture, but progressed appropriately in this test method.
[0648]
All of the above antibodies bound to the recombinant P503S fragment, with the exception of the negative control (negative control) SP2 supernatant. 20D4, JA1 and 1D12 bound tightly to peptide # 2101 (SEQ ID NO: 504), which corresponds to amino acids 151-169 of SEQ ID NO: 114. 1C3 bound to peptide # 2102 (SEQ ID NO: 505), which corresponds to amino acids 165-184 of SEQ ID NO: 114. 9C12 bound to peptide # 2099 (SEQ ID NO: 522), which corresponds to amino acids 120-139 of SEQ ID NO: 114. Other antibody-bound regions have not been investigated in this study.
[0649]
Following epitope mapping, the antibodies were tested by FACS analysis on one cell line stably expressing P503S, confirming that the antibodies bind to cell surface epitopes. Cells neatly transduced with the control plasmid were used as a negative control. Cells were stained live without fixative. 0.5 ug of anti-P503S monoclonal antibody was added and the cells were incubated for an additional 30 minutes on ice, washed twice with a FITC-labeled goat anti-rabbit or mouse secondary antibody, and incubated for 20 minutes. After two washes, the cells were analyzed on an Excalibur fluorescent activated cell sorter. Monoclonal antibodies 1C3, 1D12, 9C12, 20D4, and JA1 were found to bind to the cell surface epitope of P503, but 8D3 was not.
[0650]
To determine which tissues express P503S, the normal tissues (prostate, adrenal, breast, cervix, large intestine, duodenum, gallbladder, ileum, kidney, ovary, pancreas, essentially as described above) , Parotid gland, skeletal muscle, spleen, testis) were performed on the panel. HRP-labeled anti-mouse or anti-rabbit antibodies were used, followed by incubation with TMB to visualize the immunoreactivity of P503S. P503S has been found to be highly expressed in prostate tissue, with lower levels in the cervix, colon, ileum, kidney, adrenal gland, breast, duodenum, gallbladder, ovary, No expression was observed in pancreas, parotid gland, skeletal muscle, spleen, and testis.
[0651]
Western blot analysis was used to characterize the specificity of the anti-P503S monoclonal antibody. SDS-PAGE was performed on lysates (lysate) from HEK293 cells transfected with recombinant (rec) P503S expressed in bacteria and purified from bacteria, and transfected with full-length P503S. Proteins were transferred to nitrocellulose and then Western blots were performed with each anti-P503S monoclonal antibody (20D4, JA1, 1D12, 6D12, 9C12) at an antibody concentration of 1 μg / ml. Protein detection using goat anti-mouse monoclonal antibody or horse radish peroxidase (HRP) conjugated to either protein A-sepharose did. Monoclonal antibody 20D4 detected a recombinant P503S (amino acids 113-241) with a reasonable molecular weight of 14 kDa, and a 23.5 kDa species in the lysate of HEK293 cells transfected with full-length P503S. Other anti-P503S monoclonal antibodies showed similar specificity by Western blot.
[0652]
d) P703P Preparation and characterization of antibodies to
Rabbits were immunized with either the truncated (P703Ptrl; SEQ ID NO: 172) or the full-length mature form (P703Pfl; SEQ ID NO: 523) of the recombinant P703P protein, which was isolated from bacterial as described above. And isolated from bacteria. Affinity purified polyclonal antibodies were generated using the immunogen P703Pfl or P703Ptrl bound to a solid support. Rabbit monoclonal antibodies were isolated at the Immunogenics Pharmaceuticals using SLAM technology. Table VII below lists both polyclonal and monoclonal antibodies produced against P703P.
[0653]
[Table 9]

[0654]
The DNA sequences encoding the complementarity determining regions (CDRs) for rabbit monoclonal antibodies 8H2, 7H8, and 2D4 are determined and provided in SEQ ID NOs: 506-508, respectively.
Epitope mapping studies were performed as described above. Monoclonal antibodies 2D4 and 7H8 are peptides of SEQ ID NO: 509 (corresponding to amino acids 145 to 159 of SEQ ID NO: 172) and SEQ ID NO: 510 (corresponding to amino acids 11 to 25 of SEQ ID NO: 172), respectively. Was found to bind specifically. It was discovered that polyclonal antibody 9427 binds to the peptides of SEQ ID NOs: 515-517, while polyclonal antibody 2594 binds to the peptides of SEQ ID NOs: 511-514.
[0655]
The specificity of the anti-P703P antibody was determined by Western blot analysis as follows. (1) recombinant antigens expressed by bacteria; (2) lysates of HEK293 cells and Ltk-/-cells not transfected or transfected with a plasmid expressing full-length P703P And (3) SDS-PAGE was performed on supernatants isolated from these cell cultures. Proteins were transferred to nitrocellulose and then Western blots were performed using anti-P703P polyclonal antibody # 2594 at an antibody concentration of 1 ug / ml.
[0656]
Protein was detected using horseradish peroxidase (HRP) conjugated to an anti-rabbit antibody. An immunoreactive band of 35 kDa was observed for recombinant P703P. Recombinant P703P migrates at a slightly higher molecular weight because it hangs the epitope. A 30 kDa band consistent with P703P was observed in lysates and supernatants from cells transfected with full-length P703P. Lysates from HEK293 cells reliably transfected with the control plasmid were further tested to ensure specificity, but were negative for P703P expression. Other anti-P703P antibodies showed similar results.
[0657]
Immunohistochemical studies were performed as described above using an anti-P703P monoclonal antibody. P703P has been found to be expressed at high levels in normal prostate and prostate tumor tissues, but is detected in all other tissues tested (breast, lung and normal kidney). Did not.
[0658]
e) P504S Preparation and characterization of antibodies to
Full-length P504S (SEQ ID NO: 108) is expressed relative to P501S essentially in bacteria and isolated as described above, and Immunogenics Pharmaceuticals (Vancouver, BC, Canada). And used to produce rabbit monoclonal antibodies using the selective lymphocyte antibody method (SLAM). The anti-P504S monoclonal antibody 13H4 was shown by Western blot to bind to both expressed recombinant P504S and native P504S in cancer cells.
[0659]
Immunohistochemical studies using 13H4 to evaluate expression of P504S in various prostate tissues were performed as described above. A total of 104 cases, including 65 cases of radical prostatectomy with prostate cancer (PC), 26 cases of prostate biopsy, and 13 cases of benign prostatic hyperplasia (BPH), were treated with anti-P504S monoclonal antibody 13H4. Stained. P504S showed strong cytoplasmic granule staining at 64/65 (98.5%) of PC and 26/26 (100%) of prostate biopsies at prostatectomy. P504S was used for carcinomas (4+ in 91.2% of PC cases, 3+ in 5.5% cases, 2+ in 2.2% cases, 1+ in 1.1% cases) and prostatic intraepithelial neoplasia (in all cases). 4+) stained intensely and diffusely.
[0660]
The expression of P504S did not change with the Gleason score. Only 17/91 (18.7%) of NP / BPH cases around PC and 1/13 (15.4%) of BPH cases are focal (1+, 2+ to 4+ none in all cases) ) And weakly positive for P504S in the large glands. Expression of P504S has been demonstrated in small atrophic glands, postatrophic hyperplasia, basal cell hyperplasia, and transitional cell metaplasia in either biopsy or prostatectomy. , Was not found.
[0661]
P504S was therefore found to be overexpressed in all Gleason scores of prostate cancer (98.5-100% sensitivity), and in large normal prostates, In 19/104 (82.3% specificity) it was discovered that only focal positivities were shown. These findings indicate that P504S can be usefully used for the diagnosis of prostate cancer.
[0662]
Example 19.Characterization of cell surface expression and prostate specific antigen P501S Chromosome location
This example describes studies showing that the prostate-specific antigen P501S is expressed on the surface of cells, along with studies to determine the likely chromosomal location of P501S.
It is suggested that protein P501S (SEQ ID NO: 113) has 11 transmembrane domains. Based on the discovery that the epitope recognized by the anti-P501S monoclonal antibody 10E-G4-D3 (described above in Example 17) is intracellular, the following transmembrane determinants are expressed in P501S cells: Will allow the prophecy of outside domains. FIG. 9 is a schematic representation of the P501S protein showing the predicted location of the transmembrane domain and the intracellular epitopes described in Example 17.
[0663]
The underlined sequence represents the predicted transmembrane domain, the bold sequence represents the predicted extracellular domain, and the italic sequence represents the predicted intracellular domain. Sequences in both bold and underlined represent sequences used to produce polyclonal rabbit serum. The location of the transmembrane domain was predicted using HHMTOP, as described by Tusnady and Simon (Princesles Governing Amino Acid Composition of Integration Scheme. Biol 283: 489-506, 1998).
[0664]
Based on FIG. 9, it is predicted that the P501S domain flanked by transmembrane domains corresponding to amino acids 274-295 and 323-342 is extracellular. The peptide of SEQ ID NO: 518 corresponds to amino acids 306-320 of P501S and is in the predicted extracellular domain. The peptide of SEQ ID NO: 519, which comprisesAsparaginineSEQ ID NO: 518 except for the substitution of histidine and histidine, but synthesized as described above. Cys-Gly was added to the C-terminus of this peptide to facilitate coupling to the carrier protein.
[0665]
Cleavage of the peptide from the solid support was performed using the following cleavage mixture: trifluoroacetic acid: ethanediol: thioanisole: water: phenol (40: 1: 2: 2: 3). After 2 hours of cleavage, the peptide was precipitated in cold ether. Peptide granules were then dissolved in 10% (v / v) acetic acid and lyophilized before purification by C18 reverse phase hplc. The peptide was eluted using a gradient of 5-60% acetonitrile (containing 0.05% TFA) in water (containing 0.05% TFA). Peptide purity was confirmed by phlc and mass spectra and was determined to be> 95%. The purified peptide was used to generate rabbit monoclonal antibody antisera, as described above.
[0666]
The surface expression of P501S was tested by FACS analysis. Cells are stained with 10 μg / ml polyclonal anti-P501S peptide serum, washed, incubated with secondary FITC conjugate goat anti-rabbit Ig antibody (ICN), washed, and Excalibur Fluorescent Cell Analyzer Was used to analyze for FITC fluorescence. For FACS analysis of transduced cells, B-LCL was retrovirally transduced with P501S. To prove the specificity of these assays, B-LCL transduced with unrelated antigen (P703P) or untransduced was stained in parallel.
[0667]
For FACS analysis of prostate cancer cell lines, Lncap, PC-3, and DU-145 were used. Prostate cancer cell lines were separated from tissue culture dishes using a cell separation medium and stained as described above. All samples were treated with propidium iodide (PI) prior to FACS analysis, and data was obtained from PI-excluded (ie, intact and impermeable) cells. Rabbit polyclonal sera produced against the peptide of SEQ ID NO: 519 was used on the surface of cells transduced to express P501S, demonstrating that the epitope recognized by the polyclonal sera was extracellular. It showed specific recognition.
[0668]
When P501S is expressed on the cell surface, the peripheral membrane of Lncap cells was separated and subjected to Western blot analysis for biochemical measurements. Specifically, Lncap cells were placed in a 5 ml homogenization buffer (250 mM sucrose, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, pH 8.1, one complete protease inhibitor tablet (Boehringer Mannheim)) using a dounce homogenizer. Mashed. Lysate samples were centrifuged at 1000 g for 5 minutes at 4 ° C. Next, the supernatant was centrifuged at 8000 g for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant from the 8000 g centrifugation was collected and subjected to 100,000 g centrifugation at 4 ° C. for 30 minutes to collect the peripheral membrane.
[0669]
The samples were then separated by SDS-PAGE and Western blotted with the mouse monoclonal antibody 10E3-G4-D3 (described above in Example 17) using the conditions described above. HEK293 cells transduced with, and overexpressing, recombinantly purified P501S, as well as P501, were included as positive controls for P501S detection. LCL cell lysate was included as a negative control. P501S could also be detected in the Lncap whole cell lysate, in the 8000 g (inner membrane) fraction, and in the 100,000 g (plasma membrane) fraction. These results indicate that P501S is expressed in and located in the peripheral membrane.
[0670]
An ELISA analysis was performed to demonstrate that the rabbit polyclonal antiserum raised against the peptide of SEQ ID NO: 519 specifically recognizes this peptide as well as the corresponding native polypeptide of SEQ ID NO: 518. For this analysis, a flat bottom 96-well microtiter plate was prepared with the peptide of SEQ ID NO: 519, the longer polypeptide of SEQ ID NO: 520 spanning the fully predicted extracellular domain, the P501S-specific antibody 10E3-G4-D3. Coated with either the peptide of SEQ ID NO: 521 representing the recognized epitope or the P501S fragment without the immunogenic peptide sequence (corresponding to amino acids 355-526 of SEQ ID NO: 113) at 1 μg / ml for 2 hours at 37 ° C .
[0671]
Wells were aspirated, blocked with 1% (w / v) phosphate buffered saline containing BSA for 2 hours at room temperature, and subsequently washed with PBS containing 0.1% Tween 20 (PBST). Purified anti-P501S polyclonal rabbit serum was added at 2-fold dilution (1000 ng to 125 ng) in PBST and incubated for 30 minutes at room temperature. This was subsequently washed six times with PBST and incubated with HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) Affinipure F (ab ') fragment for 1:20 at 1: 20,000. The plates were then washed and incubated in tetramethylbenzidine for 15 minutes. The reaction was stopped by the addition of 1N sulfuric acid and the plates were read at 450 nm using an ELISA plate reader. As shown in FIG. 11, the anti-P501S polyclonal rabbit serum specifically recognized the peptide of SEQ ID NO: 519 used for immunization, as well as the longer peptide of SEQ ID NO: 520, but unrelated peptides and fragments from P501S. Did not recognize.
[0672]
In a further study, rabbits were immunized with a polypeptide derived from the sequence of P501S and predicted to be either extracellular or intracellular as shown in FIG. As described above, the polyclonal rabbit serum was separated and the polyclonal antibodies in the serum were purified. To determine specific reactivity with P501S, FACS analysis using either B-LCL transduced with P501S or the unrelated antigen P703P, or B-LCL injected with P501S expressing vaccinia virus was performed. used. Dead and damaged cells were excluded from the analysis as described above for surface expression. Cells were fixed and permeabilized as described above for intracellular staining. Rabbit polyclonal sera raised against the peptide of SEQ ID NO: 548 corresponding to amino acids 181 to 198 of P501S was found to recognize the P501S surface epitope.
[0673]
Since intact or permeabilized cells were recognized by this polyclonal serum in different experiments, rabbit polyclonal serum produced against the peptide of SEQ ID NO: 551 corresponding to amino acids 543-553 of P501S was extracellular or intracellular. It was found to recognize any potential epitope. Based on the same reasoning reasoning, amino acids 109-122, 539-553, 509-520, 37-54, 342-359, 295-323, 217-274, 143-160, and 75-88 amino acids of P501S, respectively. The corresponding sequences of SEQ ID NOs: 541-547, 549, and 550 can be considered to be potential surface epitopes recognized by the antibody.
[0674]
In a further study, a mouse monoclonal antibody was raised against the predicted extracellular domain of amino acids 296-322 of P501S. A / J mice were immunized with P501S / adenovirus, followed by the E. coli designated P501N, which contains 296-322 amino acids of P501S. It was boosted with E. coli recombinant protein and 296-322 peptide (SEQ ID NO: 898) conjugated to KLH. The mice were subsequently utilized for spleen B cell fusion for anti-peptide hybridoma production. The resulting three clones, designated 4F4 (IgG1, kappa), 4G5 (IgG2a, kappa), and 9B9 (IgG1, kappa), were grown for antibody production. The 4G5 mAb was purified by passing the supernatant through a Protein A-Sepharose column followed by elution with 0.2 M glycine, pH 2.3. Purified antibodies were neutralized by the addition of 1 M Tris, pH 8, and the buffer was changed to PBS.
[0675]
For ELISA analysis, 96-well plates were prepared at concentrations of 2 μg / ml, P501S peptide 296-322 (referred to as long P501S), unrelated P775 peptide, P501S-N, P501TR2, long P501S-KLH, P501S peptide. Coated with 306-319 (designated short P501) -KLH or unrelated peptide 2073-KLH and incubated at 37 ° C for 60 minutes. After coating, it was washed 5 times with PBS containing 0.1% Tween and then blocked with PBS containing 0.5% BSA, 0.4% Tween 20 for 2 hours at room temperature.
[0676]
Following addition of supernatant or purified mAb, the plate was incubated at room temperature for 60 minutes. Plates were washed as above, and donkey anti-mouse IgHRP-conjugated secondary antibody was added and incubated at room temperature for 30 minutes, followed by a final wash as above. TMB substrate was added and incubated for 15 minutes at room temperature in the dark. The reaction was performed with 1N H₂SO₄Was stopped and the absorbance was read at 450 nM. All three hybrid clones secreted the 296-322 peptide and a mAb that recognized the recombinant protein P501N.
[0677]
For FACS analysis, HEK293 cells were transiently transduced with the P501S / VR1012 expression construct using Fugene 6 reagent. After two days in culture, cells were harvested and washed, then incubated with purified 4G5 mAb for 30 minutes on water. After several washes with PBS, 0.5% BSA, 0.01% azide, goat anti-mouse Ig-FITC was added to the cells and incubated on ice for 30 minutes. Cells were washed and resuspended in wash buffer containing 1% propidium iodide and subjected to FACS analysis. FACS analysis confirmed that 296-322 amino acids of P501S are present in the extracellular domain and are expressed on the cell surface.
[0678]
The chromosomal location of P501S was determined using the Gene Bridge 4 Radiation Hybrid panel (Research Genetics). The PCR primers of SEQ ID NOs: 528 and 529 were used for PCR with the DNA pool from the hybrid panel following the manufacturer's instructions. After 38 cycles of amplification, the reaction products were separated on a 1.2% agarose gel, and the results were separated by a Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research web server (http://www-genome.wi.mit.edu/ cgi-bin / contig / rhmapper.pl) to determine promising chromosomal locations. Using this method, P501S was mapped to the long arm of chromosome 1, between q32-q42 of WI-9641. This region of chromosome 1 is associated with prostate cancer susceptibility in hereditary prostate cancer (Smith et al. Science 274: 1371-1374, 1996, and Berthon et al. Am. J. Hum. Genet. 62: 14116-1424, 1998) These results suggest that P501S plays a role in prostate cancer malignancies.
[0679]
Example 20.Prostate specific antigen P501S Regulation of expression
Steroid (androgen) hormone regulation is a common treatment modality in prostate cancer. It has previously been demonstrated that the expression of many prostate tissue-specific antigens corresponds to androgens. The response of the prostate specific antigen P501S to androgen treatment was tested with the following tissue culture system.
[0680]
1.5 × 10 5 cells from the prostate cancer cell line LNCaP⁶Cells / T75 flask (for RNA isolation) or 3 × 10⁵Cells were seeded in the wells of a 6-well plate (for FACS analysis) and cultured overnight in RPMI 1640 medium containing 10% charcoal-stripped fetal bovine serum (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD). Cell culture was continued for another 72 hours in RPMI 1640 medium containing 10% charcoal strip fetal calf serum with 1 nM of synthetic androgen methyltrienolone (R1881; New England Nuclear) added at various time points. Cells were then harvested at 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 28, and 72 hours after androgen addition for RNA isolation and FACS analysis. FACS analysis was performed using the anti-P501S antibody 10E3-G4-D3 and permeabilized cells.
[0681]
For Northern analysis, 5-10 μg of total RNA was run on a formaldehyde denaturing gel, transferred to Hybond-N nylon membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), cross-linked, and stained with methylene blue. The filter was then placed in Church's buffer (250 mM Na).₂HPO₄, 70 mM H₃PO₄, 1 mM EDTA, 1% SDS, 1% BSA, pH 7.2) at 65 ° C. for 1 hour. P501S DNA was purified using a High Prime random prime DNA labeling kit (Boehringer Mannheim).³²Labeled with P. Unincorporated label was removed using a Micro Spin S300-HR column (Amersham Pharmacia Biotech).
[0682]
Next, the RNA filter was hybridized overnight with a new Church's buffer containing labeled cDNA, and 1 × SCP (0.1 M NaCl, 0.03 M Na₂HPO₄・ 7H₂O, 0.001M Na₂(EDTA), washed with 1% sarkosyl (n-lauroyl sarcosine) and exposed to X-ray film.
Using both FACS and Northern analysis, P501S message and protein levels were found to decrease in response to androgen treatment.
[0683]
Example 21.Preparation of fusion protein of prostate specific drug
This example describes the preparation of a fusion protein of the prostate-specific antigen P703P and a truncated form of the known prostate antigen PSA. Truncated form of PSA has a deletion of 21 amino acids around the active serine site. The expression construct for the fusion protein also has a restriction site at the 3 'end, immediately before the stop codon, to aid in adding cDNA for additional antigen.
[0684]
Full length cDNA for PSA was obtained by RT-PCR from a pool of RNA from human prostate tumor tissue using the primers of SEQ ID NOs: 607 and 608 and cloned into the pCR-brand II-TOPO vector. Using the resulting cDNA as a template, two different fragments of PSA were generated by PCR using two sets of primers (SEQ ID NOs: 609 and 610 and SEQ ID NOs: 611 and 612). Truncated forms of PSA were made by PCR using the PCR product of the expected size as a template and primers of SEQ ID NOs: 611 and 613. This resulted in PSA (deltas 208-218 in amino acids). CDNA for the mature form of P703P with a 6 × histidine tag at the 5 ′ end was prepared by PCR using P703P and primers of SEQ ID NOs: 614 and 615.
[0685]
Next, cDNA for fusion of P703P with truncated PSA (referred to as FOPP) was prepared using the modified P703P cDNA and truncated PSA cDNA as templates using the primers of SEQ ID NOs: 614 and 615. Obtained. The FOPP cDNA was cloned into the NdeI and XhoI sites of the expression vector pCRX1, and confirmed by DNA sequencing. The determined cDNA sequence for the fusion construct FOPP was provided as SEQ ID NO: 616, and the amino acid sequence was provided as SEQ ID NO: 617.
[0686]
The fusion FOPP was expressed in E. coli as a single recombinant protein as follows. The expression plasmid pCRX1FOPP was transformed into E. coli strain BL21-codon plus PIL. Transformants were found to express the FOPP protein upon induction with 1 mM IPTG. A culture of the corresponding expression clone is inoculated into 25 ml of LB broth containing 50 μg / ml kanamycin and 34 μg / ml chloramphenicol, grown at 37 ° C. to an OD600 of about 1 and stored at 4 ° C. overnight. did. Cultures were diluted in 1 liter of TBLB containing 50 μg / ml kanamycin and 34 μg / ml chloramphenicol and grown at 37 ° C. to an OD600 of 0.4. IPTG was added to a final concentration of 1 mM and the culture was incubated at 30 ° C. for 3 hours.
[0687]
Cells were pelleted by centrifugation at 5,000 RPM for 8 minutes. To purify the protein, the cell pellet was suspended in 25 ml 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 2 mM PMSF (complete protease inhibitor) and 15 μg lysozyme. Cells were lysed at 4 ° C. for 30 minutes, sonicated several times, and the lysate was centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes. The precipitate containing the inclusion bodies was washed twice with 10 mM Tris-Cl pH 8.0 and 1% CHAPS. The inclusion bodies were dissolved in 40 ml of 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 100 mM sodium phosphate and 8 M urea.
[0688]
The solution was bound to 8 ml NiNTA (Qiagen) for 1 hour at room temperature. The mixture was poured into a 25 ml column and washed with 50 ml of 10 mM Tris-Cl pH 6.3, 100 mM sodium phosphate, 0.5% DOC and 8 M urea. Bound protein was eluted with 350 mM imidazole, 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 100 mM sodium phosphate and 8 M urea. The fractions containing the FOPP protein were combined, extensively dialyzed against 10 mM Tris-Cl pH 4.6, aliquoted and stored at -70 ° C.
[0689]
Example 22.Prostate-specific antigen in peripheral blood of prostate cancer patients P501S Real-time PCR Characterization
Circulating epithelial cells were isolated from fresh blood of normal individuals and metastatic prostate cancer patients, mRNA was isolated, and cDNR was prepared using a real-time PCR procedure. Real-time PCR was performed with the Taqman ™ procedure using both gene-specific primers and probes to determine gene expression levels.
Epithelial cells were enriched from blood samples using the immunomagnetic bead separation method (Dynal AS, Oslo, Norway). The isolated cells were lysed and the magnetic beads were removed. The lysate was then processed for poly A + mRNA isolation using Oligo (dT) 25 coated magnetic beads. After washing the beads in the buffer, the bead / polyA + RNA sample was suspended in 10 mM Tris HCl pH 8.0 for reverse transcription.
[0690]
The resulting cDNA was subjected to real-time PCR using gene-specific primers. Beta actin content was also measured and used for normalization. Samples with more P501S than the mean of the normal samples + 3 standard deviations were considered positive. Real-time PCR on blood samples was performed using the Taqman ™ procedure, but with up to 50 cycles using forward and reverse primers and a probe specific for P501S. Of the eight samples tested, six were positive for P501S and β-actin signals. No β-actin or P501S was detected in the remaining two samples. No P501S signal was observed in the four normal samples tested.
[0691]
Example 23.SCID Prostate-specific antigen in mouse passaged prostate tumors P703P as well as P501S Expression of
When considering the effectiveness of an antigen in treating prostate cancer, the continued presence of the antigen in tumors during androgen ablation therapy is important. The presence of prostate-specific antigens P703P and P501S in prostate tumor samples grown in SCID mice in the presence of testosterone was evaluated as follows.
[0692]
Two prostate tumors that had metastasized to the bone were removed from the patient, transplanted into SCID mice and grown in the presence of test stron. Tumors were evaluated for P703P, P501S and PSA mRNA expression using quantitative real-time PCR using the SYBR green assay. The expression of P703P and P501S in prostate tumor was used as a positive control and its absence in normal intestine and normal heart was used as a negative control. In both cases, specific mRNA was present in late passage tumors. Since bone metastases grew in the presence of testosterone, this implies that the presence of these genes would not have gone away during androgen ablation therapy.
[0693]
Example 24.Anti- P503S Monoclonal antibodies inhibit tumor growth in vivo
The ability of the anti-P503S monoclonal antibody 20D4 to suppress tumor formation in mice was examined as follows.
Ten mice were injected subcutaneously with HEK293 cells expressing P503S. Five mice received 150 μg of 20D4 intravenously on

days

0, 5, and 9 (when tumor cells were injected). Tumor size was measured for 50 days. Of the five mice that did not receive 20D4, three formed detectable tumors after about two weeks, which continued to grow throughout the study. In contrast, none of the five mice that received 20D4 formed tumors. These results indicate that anti-P503S Mab 20D4 exerts potent anti-tumor activity in vivo.
[0694]
Example 25.P501S Characterization of T cell receptor clones from specific T cell clones
T cells have a limited life span. However, the cloning and subsequent transfer of the T cell receptor (TCR) chain essentially allows endless propagation of T cell specificity. Cloning of the tumor antigen TCR chain allows its specific transfer to T cells isolated from patients sharing the TCR MHC restriction allele. Such T cells could then be developed and used in a metastatic environment of choice to introduce tumor antibody specificity to patients bearing tumors expressing the antigen. T cell receptor alpha and beta chains from a CD8 T cell clone specific for the prostate specific antigen P501S were isolated and sequenced as follows.
[0696]
2 × 10 from CTL clone 4E5 (described in Example 12 above)⁶Total mRNA from cells was isolated using Trizol reagent and cDNA was synthesized. To determine the Va and Vb sequences in this clone, a series of Va and Vb subtype-specific primers were synthesized and used in RT-PCR reactions with cDNA generated from each clone. RT-PCR reactions indicated that each clone expressed a common Vb sequence corresponding to the Vb7 subfamily. Further, using the cDNA generated from the clone, the expressed Va sequence was determined to be Va6. Primers spanning the start and stop encoding TCR nucleotides were designed to clone the full length TCR alpha and beta chains from clone 4E5.
[0696]
Primers were as follows: TCR Valpha-6 ^ 5 '(sense): GGATCC --- GCCGCCACC-ATGTCACTTTCTAGCCTGCT (SEQ ID NO: 899) BamHI site Kozak TCR alpha sequence TCR alpha 3' (antisense): GTCGAC ---- TCAGCTGGACCACAGCCGCAG (SEQ ID NO: 900) SalI site TCR alpha invariant sequence TCR Vbeta 7 5 ′ (sense): GGATCC ——— GCCGCCACC——ATGGGCTGCAGGCTGCCTCT (SEQ ID NO: 901) BamHI site Kozak TCR alpha sequence TCR alpha antisense: GTCGAC --- TCAGAAATCCTTTCTCTTGAC (SEQ ID NO: 902) SalI site TCR base Immutable array. Using the CTL clone and cDNA synthesized from the above primers, a standard 35-cycle RT-PCR reaction was established using the calibrated thermostable polymerase PWO (Roche, Natley, NJ).
[0697]
The resulting specific bands (about 850 base pairs for alpha and about 950 base pairs for beta) were ligated into a PCR blunt vector (Invitrogen) and transformed into E. coli. E. coli transformed with plasmids containing the full-length alpha and beta chains were identified, causing large-scale preparation of the corresponding plasmids. Plasmids containing the full length TCR alpha and beta chains were submitted for sequencing. The sequencing reaction demonstrated that the cloning of the full-length TCR alpha and beta chains with the determined cDNA sequences for the Vb and Va chains is shown in SEQ ID NOs: 903 and 904, respectively. The corresponding amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 905 and 906, respectively. The nucleotide sequence alignment showed that the Va sequence was 99% identical to Va6.2 (348/348) and Vb was 99% identical to Vb7 (336/338).
[0698]
Example 26.Prostate antigen P503S Of prostate-specific cells using DNA
As described above, P503S is found on the surface of prostate cells. Secondary coated microsphere beads specific for mouse IgG were ligated to purified P503S-specific monoclonal antibody 1D12. Next, the HEK cells expressing the recombinant P503S were captured using the conjugated P503S antibody. This provides a model system for prostate-specific cell capture that can be commonly used in the detection of prostate cells in blood, and thus in the detection of prostate cancer.
[0699]
HEK cells transfected with P503S were harvested and redissolved in the appropriate volume in wash buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.6% sodium citrate) to at least 5 cells per sample. Round bottom eppendorf tubes were used for all procedures using beads. Stock concentrations are as shown in Table VIII.
[0700]
[Table 10]

[0701]
Blocked immunomagnetic (immunomagnetic) beads were pre-washed as follows: all required beads were pooled and washed once with 1 mL wash buffer. The beads were resuspended in 3 volumes of wash buffer containing 1% BSA (v / v) and incubated at 4 ° C for 15 minutes with rotation. The beads were then washed three times with two volumes of wash buffer and resuspended in the original volume. The unblocked beads were pooled, washed three times with two volumes of wash buffer, and resuspended in the original volume.
[0702]
The primary antibody was incubated with the secondary beads in a fresh Eppendorf at 4 ° C. for 30 minutes with rotation. For uniform mixing of the samples, approximately 200 μL of battlefield buffer was added to increase the total volume. The antibody-bead solution was transferred to a new Eppendorf, washed twice with an equal volume of wash buffer, and resuspended in the original volume. Target cells were added to each sample and incubated with rotation at 4 ° C. for 45 minutes. The tube was transferred to a magnet, the supernatant was removed, being careful not to agitate the beads, and washed twice with 1 mL of wash buffer. Next, samples were prepared for RT-PCR using Dynabeads mRNA direct microkit (Dynal Biotech).
[0703]
The epithelial cell concentrate was placed in a magnet and the supernatant was removed. Next, the epithelial cell enriched beads were resuspended in 100 μL of cell lysis / binding buffer supplemented with Runasin (2 U / μL per sample) and frozen at −70 ° C. until use. Oligo (dT₂₅) Dynabeads were pre-washed as follows: all required beads were pooled (23 μL / sample), washed three times with an excess volume of cell lysis / binding buffer, and resuspended in the original volume . Cell lysis supernatant was separated by magnet and transferred to a new Eppendorf. 20 μL Oligo (dT25) Dynabeads was added per sample and spun at room temperature for 5 minutes. The supernatant was separated using a magnet and discarded, and the mRNA was annealed to the beads. The bead / mRNA complex was washed with buffer and resuspended in cold Tris-HCl.
[0704]
For RT-PCR, the Tris-HCl supernatant was separated and discarded using MPR. For each sample containing no more than 15 cells, add the following to a total volume of 30 μL: 1.5 μL water, 1.5 μL BSA, 6 μL first strand buffer, 0.75 mL 10 mM dNTP mixture, 3 μL Runasin, 3 μL 0.1 M dTT, and 1.5 μL Superscript II. The resulting solution was incubated at 42 ° C for 1 hour, diluted 1: 5 in water, heated at 80 ° C for 2 minutes to desorb the cDNA from the beads, and immediately placed on MPS. The supernatant containing the cDNA was transferred to a new tube and stored at -20C.
Table IX shows the percentage of capture of HEK cells transfected with P503S determined by RT-PCR.
[0705]
[Table 11]

[0706]
From the foregoing, it will be appreciated that while certain embodiments of the invention have been described by way of explanation in the specification, various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 shows the ability of T cells to kill fibroblasts expressing a representative prostate-specific polypeptide P502S as compared to control fibroblasts. The% solubility is shown as a series of effector: target ratios as indicated.
FIG. 2A
FIG. 2A shows the ability of T cells to recognize cells expressing a representative prostate-specific polypeptide p502S. In each case, the number of γ-interferon spots is indicated for a different number of responders. In FIG. 2A, data is shown for fibroblasts pulsed with P2S-12 peptide as compared to fibroblasts pulsed with control E75 peptide.
FIG. 2B
FIG. 2B shows the ability of T cells to recognize cells expressing a representative prostate-specific polypeptide p502S. In each case, the number of γ-interferon spots is indicated for a different number of responders. In FIG. 2B, data is shown for fibroblasts expressing P502S as compared to fibroblasts expressing HER-2 / neu.
FIG. 3
FIG. 3 shows a peptide competition binding assay showing that the P1S # 10 peptide from P501S binds HLA-A2. Peptide P1S # 10 inhibits Flu @ M58 peptide HLA-A2 restricted presentation for CTL cloning of D150M58 in a TNF initiation bioassay. D150M58 CTL is specific for HLA-A2 binding influenza matrix peptide Flu M58.
FIG. 4
FIG. 4 shows a P1S # 10 immunization that specifically lyses P1S # 10-pulsed Jurkat A2kb and P501S-transduced Jurkat A2kb targets compared to EGFP-transduced Jurkat A2Kb. Figure 4 shows the capacity of T cells generated from transformed mice. Percent lysis is shown as a series of effector: target ratios as indicated.
FIG. 5
FIG. 5 shows the ability of the T cell clone to recognize and specifically lyse Jurkat A2kb cells expressing the exemplary prostate-specific polypeptide P501S, whereby the P1S # 10 peptide was transformed into the p501S polypeptide. It is possible that this is a naturally processed epitope.
FIG. 6A
FIG. 6A shows CD8 against a representative prostate-specific antigen (P501S).⁺It is a graph which shows the specificity of a cell line (3A-1). FIG.⁵¹4 shows the results of a Cr release assay. The% specific lysis is shown as a series of effector: target ratios as indicated.
FIG. 6B
FIG. 6B shows CD8 against a representative prostate-specific antigen (P501S).⁺It is a graph which shows the specificity of a cell line (3A-1). FIG. 6B shows the production of interferon-γ by 3A-1 cells stimulated by autologous B-LCL transduced by P501S at various effector: target ratios as indicated.
FIG. 7
FIG. 7 is a Western blot showing expression of P501S in baculovirus.
FIG. 8
FIG. 8 shows the results of an epitope mapping study on P501S.
FIG. 9
FIG. 9 is an illustration of the P501S protein showing the location of the transmembrane domain and predicted intra- and extracellular domains.
FIG. 10
FIG. 10 is a genomic map showing the positions of prostate genes P775P, P704P, B305D, P712P, and P774P in the Cat Eye Syndrome region of chromosome 22q11.2.
FIG. 11
FIG. 11 shows the results of an ELISA assay to determine the specificity of a rabbit polyclonal antiserum raised against P501S.
FIG. 12A (1)
FIG. 12A (1) shows a part of the full-length cDNA (SEQ ID NO: 777) for clone P788P.
FIG. 12A (2)
FIG. 12A (2) shows a part of the full-length cDNA (SEQ ID NO: 777) for clone P788P.
FIG. 12A (3)
FIG. 12A (3) is a view showing a portion of a full-length cDNA (SEQ ID NO: 777) for clone P788P.
FIG. 12B
FIG. 12B shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 778) predicted from the full-length cDNA for clone P788P (SEQ ID NO: 777).

Claims

(A) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942;
(B) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and the complement of the sequence provided in 942;
(C) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and a sequence consisting of at least 20 contiguous residues of the sequences provided in 942;
(D) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942, sequences that hybridize under moderately stringent conditions;
(E) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- Sequences having at least 75% identity to the sequences of 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942;
(F) SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476. 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880- Sequences having at least 90% identity to the sequences of 882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942; and (g) SEQ ID NOs: 1-111, 115 −171, 173-175, 177, 179-305, 30 -315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593. -606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880-882, 894, 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942. A degenerate variant of the sequence to be made;
An isolated polynucleotide comprising a sequence selected from the group consisting of:

(A) SEQ ID NO: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 706-708, 775, 776, 778, 780, 781, 811, 814, 818, 826, 827, 853 855, 858, 860-862, 866-877, 879, 883-893, 895, 897, 898, 909-915, 920-928, 923-934, 940, 941 and 943;
(B) SEQ ID NOs: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 706-708, 775, 776, 778, 780, 781, 811, 814, 818, 826, 827, 853 855, 858, 860-862, 866-877, 879, 883-893, 895, 897, 898, 909-915, 920-928, 923-934, 940, 941 and 943 and at least 70% of the sequence. A sequence having identity;
(C) SEQ ID NO: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 706-708, 775, 776, 778, 780, 781, 811, 814, 818, 826, 827, 853 855, 858, 860-862, 866-877, 879, 883-893, 895, 897, 898, 909-915, 920-928, 923-934, 940, 941 and 943 and at least 90% of the sequence. A sequence having identity;
(D) a sequence encoded by the polynucleotide of claim 1;
(E) a sequence having at least 70% identity to the sequence encoded by the polynucleotide of claim 1; and (f) at least 90% to a sequence encoded by the polynucleotide of claim 1. A sequence having the identity of
An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

An expression vector comprising the polynucleotide of claim 1 operably linked to an expression control sequence.

A host cell transformed or transfected with the expression vector of claim 3.

An isolated antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 2, or an antigen-binding fragment thereof.

A method for detecting the presence of cancer in a patient, comprising:
(A) obtaining a biological sample from the patient:
(B) contacting the biological sample with a binding agent that binds to the polypeptide of claim 2;
(C) detecting the amount of the polypeptide that binds to the binding agent in the sample; and (d) comparing the amount of the polypeptide to a predetermined cut-off value, and then detecting the cancer in the patient. Determining the presence of the method.

A fusion protein comprising at least one polypeptide according to claim 2.

SEQ ID NOs: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476, 524, 526 , 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-705, 709-774, 777, 789, 817, 823, 824, 878, 880-882, 894 , 896, 907, 908, 916-919, 929-931, 938, 939 and 942, oligonucleotides that hybridize under moderate stringency conditions.

A method for stimulating and / or expanding T cells specific for an oncoprotein, comprising:
(A) the polypeptide of claim 2;
(B) at least one component selected from the group consisting of an antigen-donor cell that expresses the polypeptide according to claim 2 and a T cell; and (c) stimulation of the T cell. And / or contacting under conditions and for a time sufficient to permit expansion.

An isolated T cell population comprising T cells prepared according to the method of claim 9.

A first component selected from the group consisting of a physiologically acceptable carrier and an immunostimulant, and (a) the polypeptide of claim 2;
(B) the polynucleotide of claim 1;
(C) the antibody of claim 5;
(D) the fusion protein of claim 7;
A composition comprising (e) a T cell population according to claim 10; and (f) a second component selected from the group consisting of antigen presenting cells that express the polypeptide according to claim 2.

12. A method for stimulating an immune response in a patient, comprising administering to the patient a composition of claim 11.

12. A method of treating cancer in a patient, comprising administering to the patient a composition of claim 11.

A method for determining the presence of cancer in a patient, comprising:
(A) obtaining a biological sample from said patient;
(B) contacting the biological sample with the oligonucleotide according to claim 8;
(C) detecting the amount of polynucleotide that hybridizes to the oligonucleotide in the sample; and (d) determining the amount of polynucleotide that hybridizes to the oligonucleotide by a predetermined cut-off value. And then determining the presence of cancer in said patient.

A diagnostic kit comprising at least one oligonucleotide according to claim 8.

A diagnostic kit comprising at least one antibody according to claim 5, and a detection reagent comprising a receptor group.

A method for inhibiting the progression of cancer in a patient, comprising:
(A) (i) a polypeptide according to claim 2; (ii) a polynucleotide according to claim 1; and (iii) at least one selected from the group consisting of an antigen-donating cell expressing the polypeptide according to claim 2. Incubating CD4 ⁺ and / or CD8 ⁺ T cells isolated from the patient with one component to allow the T cells to proliferate;
(B) administering an effective amount of the expanded T cells to the patient, and thereby inhibiting the progression of cancer in the patient.