JP2004502129A - Quantitative assays for gene expression on microarrays - Google Patents

Abstract

Methods have been developed for the detection of gene expression or hybridization in microarrays (eg, combinatorial libraries with very low volumes and very densely arranged spots, which can lead to unpleasant situations). Where dense reactions can spill to adjacent spots). Thus, there is uncertainty in the accuracy of the reaction between adjacent sites. This assay uses a digoxigenin enzyme assay for detection. More were developed to increase the confidence in the analysis of DNA expression in a microarray format. It uses software analysis to normalize the spots. This process automatically quantifies large-scale array data using deformation template technology despite possible spatial disruption of the array. Each node in the deformable template represents a gene spot and repeats according to the gradient descent rule. This minimizes the energy function and merges the data mismatch energy and template deformation energy.

Description

【数３】

【数４】

鋳ばり取りポテンシャル関数、
各々のスポットで、データ不一致エネルギーは、以下に簡易化される：
ここで（円周率はｉ番目の結節の重量である、そして、ｒはサンプル・スポットのための所定の半径である。
ポテンシャル関数はローカルな領域の上のグレイ準位値の組込みである。そして、それはスムージング機能を有する。
実験結果は、小行列式摂動およびノイズにその堅固性を見せる。
（テンプレート変形エネルギー）
鋳型変形エネルギーは、原型鋳型から奇形の鋳型の偏差を測定する。
翻訳に対する鋳型変位は、メンブレンの中でそらせることのために事件が起こる。
変位の次数の量を定めるために、各々のスポットのための変形エネルギーは、その事前定義ポジションＰｊｏから奇形の制御ノードＰｊのユークリッドの遠位として定義される：
ハース、ａｉはｉ番目の結節の柔軟性である。
鋳型変形エネルギーの最小化は、結節が局在部バックグラウンドの摂動およびノイズによって引きつけられるのを防止するのを助ける、
そして、このように、提起されたアラビア記数法の堅固性を改正する。
緩和が鋳型変位およびデータ不一致エネルギーをＣｏｍｂｉｎｉｎｇして、ｌは全体的なエネルギー関数を以下として定義することができる：
【数５】

（緩和）
Ｅ＝ａＥ（＋　Ｅ２）；
あるレギュラリゼーション・パラメータ。
（４）
サンプル・スポットの局在手続きは、全体的なエネルギーの最小化と一致する。この機能の極小は、動的計画法、貪欲な検索アラビア記数法、神経回路網、その他のようなまだ過剰のコンピューティングを犠牲にして、世界的最適化手法を運用することによって獲得されることができる。
アレーの各々のスポットが事前定義ポジションで押印されるので、ジーン・スポットが規則的配列構造において起訴されると仮定される。そのために、初期位置は全てのマトリックスの遺伝子座のナンバーに従う予め定められた部位によって選ばれることができる。
また、原型アレー鋳型が入力アレーに十分に配置されたクローズでありえると仮定される。
このように、アレー・スポットは、初期の格子のまわりで極小を認定することによる局在性でありえる。
これは、決定論の傾きｄｅｓｃｅｎｔｔｅｃｈｎｉｑｕｅによって換価されることができる：
ｉ＝１，２（…）Ｎ、そして？学習は、速度である。
同位体的アレーにおいて、各々のスポットの柔軟性および重量は、同じものであるセットである。
標的センターリングの分類学的位置は、退行される（４）によって定義されるエネルギーを最小にする、それはラバーバンド上の一組の結節として翻訳されることができる；
結節の分類学的位置は、エネルギー場の極小の最下段に引きつけられる傾向がある。
結節の運動を限定して、学習速度のための最適の値を調整することを避けるために、結節は、ＡｘおよびＡｙの符号によれば、各々の繰返しの申し立てられた１つのユニットである。
平滑化している３＊３外の範囲ピクセルが濾過されて、遺伝子形質発現をアトラス相補ＤＮＡアレーの１つの関数群から抜き出すために、例えば（Ｅｋｓｔｒｏｍ（Ｍ．Ｐ．Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｉｍａｇｅ）
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、アカデミック・プレス、ロンドン、１９８４を処理する）ゴマ塩のノイズを減軽するために行使する。
メンブレンはハイブリダイゼーションおよび洗浄の手続きの間、そる。その結果、検査および所定の格子鋳型の下でメンブレン間の完全な一致を認定することは不可能である。
しかし、５つ未満の繰返しの後、変形可能な鋳型の全ての結節が安定分類学的位置に来る。そして、それは（４）によって定義される全体的なエネルギー関数を最小にする。
目視は、奇形の格子鋳型およびジーン・スポット間の良好な一致を確かめる。
【数６】

（信頼できない領域の検出）
アレー・ハイブリダイゼーションにおいて、強い若干のシグナルは、オートラジオグラフ（口語でｃａｌｌｅｄ’ｂｌｅｅｄｉｎｇ’ｓｐｏｔｓ）において観察される。
これらのｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたシグナルは、それらの近傍のそれ自身だけでなくジーンもの数量化の問題の原因となる。
配列データを分析するための大部分の商用のパッケージは、ユーザーが視覚的に出血ジーンおよびそれらの近傍を照合することを必要とするか単にこれらのスポットの存在を却下する。
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたスポットを検出する不履行は、２つの遺伝子形質発現プロファイルと比較する際の誤った結果に主任弁護人となることができる。
本願明細書において記述される方法の対物レンズは、自動的に出血領域を識別することになっていて、数量化結果のポテンシャル間違いに、ユーザーに警報を伝えることになっている。
このように、ユーザーはそれらのメンブレンの問題を含む領域の退屈で自覚的な評価から解放される。
以下のベーシック仮定は、属性のアレーのスポットについて作られた：
スポットは、相互に独占的である。
各々のスポットの範囲内の輝度の変更は、特定の範囲を有する。
各々のスポットは、限られた大きさを有する連結成分である。
したがって、ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたスポットの確認は、所定の大きさより大きいスポットをろ過するとして簡易化されることができる。
形状に基づいて、数理形態は、デジタル画像を処理する効率的な方法を規定して、線形フィルタによって解くのが困難だった画像処理問題を解決する際に広く使われていた。
適切に使われて、数学的な形態学的オペレーションは、以下によって画像データを簡易化する傾向がある：
それらの決定的な形状形質を維持すること、
そして、
不適切を削除すること。
基本的な数学的な形態学的オペレーションは、浸食および拡大である。
浸食および拡大の組成に基づいて、オープニングおよびクローズは、定義される。
バイナリイメージのケースがＡを起源のバイナリイメージおよびＢのｂｉｎａｒｙ’ｏｎ’ｐｉｘｅｌｓを表示している点集合であらせたのだから、構造化元素のｂｉｎａｒｙ’ｏｎ’ｐｉｘｅｌｓを表示している点集合である。
基本的な形態学的オペレーションは、下で定義される：
バイナリ構造化元素ＢによるバイナリイメージＡの拡大、Ａ＆ｃｏｍｍａｔ；二者のＥｒｏｓｉｏｎがＡを撮像するＢ＝｛ｂ＋ａｌｆｏｒｓｏｍｅｂＥＢａｎｄａＥＡ｝バイナリ構造化元素Ｂ（バイナリ構造化元素ＢによってバイナリイメージＡの中でＯｐｅｎｉｎｇしているＡ＆ｃｏｍｍａｔ；Ｂ＝｛ｐｌｂ＋ｐＥＡ　ｆｏｒｅｖｅｗｂＥＢ｝）Ａ＝（ＡＥ）Ｂ）Ｅ）Ｂ
バイナリ構造化元素ＢによるバイナリイメージＡのクローズ、
ｏＢ＝（Ｇ）Ｂ）＆ｃｏｍｍａｔ；Ｂ
区別するｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄした通常急送されたスポット、円板構造化元素、Ｃから見つける、大きさは研修されているアレー上のスポットの上限である、選択した。
Ｃ＝｛ｌ　Ｘ２＋ｙ２〈（Ｘ（ｙ））Ｒｕｚ｝、
そこにおいて、
Ｒは、イデアル・スポットの最大の半径である。
ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたスポットを識別する手続きが記述されることができる〈＃ｓ〉は、あとに続く：
技巧をｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇしているＢｉｎａｒｉｚｅｔｈｅｉｎｐｕｔｉｍａｇｅＦ＝｛ｆ（ｘ，ｙ）０＃ｘ〈Ｍ，０＃ｙ〈Ｎ｝ｂｙＳｔｅｐ１．世界的は、Ｏｓｔｕのような手段をｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇしている（Ｏｓｔｕ（ｓｙｓｔ．上のＮ．Ａ．ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎｓ．）
人類及びＣｙｂｅｒｎ．
８，６２−６６（１９７８の））最適の判別分析基づく：
｛ｇ（ｘ，ｙ）０＃ｘ〈Ｍ，０＃ｙ〈Ｎ｝，Ｇ＝ｇ（ｘ，ｙ）＝１もしも￣（ｘ，ｙ）〉Ｔ、ＴはＯｓｔｕの最適の限界ステップ２である。
構造化元素Ｃを有する形態学的オープニングによって、正常な大きさスポットをろ過する：
Ｇ．ｐｒｉｍｅ．＝ＧｏＣ＝｛ｇ．ｐｒｉｍｅ．（）｝（８）従って、頼みにならない領域は、セットとして表示される：
ＵＲ＝｛（ｘ，ｙ）＃　ｇ．ｐｒｉｍｅ．
（ｘ（ｙ））＝１、（ｘ（ｙ））ＥＦ｝（９）ステップ３。
（ｘｓ（ｙｊ））Ｅ　ＵＲである場合制御ノードＰｉ＝（ｘｊ（ｙｊ））をｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたスポットと確認する。
実際、数量化問題は、それらの近傍のｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたスポット、しかし、また、それらのスポットだけにおいて存在しない。
スポットの実分類学的位置の位置を決める繰返しの間、若干の制御ノードが急速に引き寄せられることｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄした低いデータ不一致エネルギー場がこれらのスポットのまわりで形成されるのでスポット。
この系において、頼みにならない様に、対応する制御ノードがその初期位置から遠く離れて申し立てる場合、遺伝子形質発現スポットはラベルをつけられる。
標的計測
マイクロアレイｓを有する定量分析の、各々のスポットから発される蛍光または放射活性の総計がそのスポットによって共同されるラベルをつけられた核酸プローブの総計の代表であると仮定すること（ＡｔｌａｓＴｍ　ＣＤＮＡ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｒｒａｙｓユーザー・マニュアル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　＆ｎｕｍ；ＰＴ３１４０−１）Ｖｅｒｓｉｏｎ　＆ｎｕｍ；ＰＲ９１２０８（ｐｐ７−９，１９９８））。
３Ｄプロットにおいて表示される各々のスポットの輝度は、サンプル・スポットのための半球状形状の仮定が数量化目的に充分でないことを示す。
以下の組込み機能は、各々のスポットの体積を確かめるために用いる：
孤立性の影像において、組込みは加法によって改任されて、体積を正規化するために円の領域を運用する：
標的結節が繰返しと一致している変形可能な鋳型から、どのＰｉ　ｉｌｓを得たか。
正規化された体積は、範囲の範囲内の実数の値である［０（ＩｍａＸ）］、
そこにおいて、
ＩｍａＸは、ピクセル値の上限である。
８ビットおよび１６ビットのグレースケール影像のために、Ｉｍａｙはそれぞれ２５５および６５５３５に等しい。
性能検定：
自動機械プロセシング対手操作
系は、２つのＣｌｏｎＴｅｃｈ濾過器から２４の副影像に基づいて訓練された。トレーニング段階は、エネルギーの定義の最適のレギュラリゼーション・パラメータの選抜を勘定に入れる。
系は１７のＣｌｏｎＴｅｃｈ濾過器から２０４のｓｕｂｉｍａｇｅｓに試験された、そして、５０のバイオ−木っ端マイクロアレイ影像はインハウスを押印した。
テスト結果は提起されたモデルが満足にスポットを抽出することができることを示す。そのとき、それらは相互に独占的である。
しかし、若干のスポツトは、ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたものによって引きつけられる、そして、このように、数量化手続きにひずみの原因となる。
系が自動的にこれらの誤ったスポットを識別することが可能であるにもかかわらず、最後の溶液は最適のプローブおよび実験的条件の設計の改良を必要とする。
テーブル１は、ＣｌｏｎＴｅｃｈによってリリースされるＡｔｌａｓＩｍａｇｅＴＭ１．０を含むアトラスＡｒｒａｙｓを分析する際の三系の中の比較の一覧を示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）ヨハネス・グーテンベルグ大学およびＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒによって開発されるＥｓｔＢｌｏｔ（Ａｄｒｙａｎ、ほか、ＢｉｏＴｅｃｈ　２６，１１７４−１１７９（１９９９））が、我々の研究室において開発した
既存の系と比較して、我々の系は、より速くいくつかの時間を執行する。
システムエラーは、１つのアレー６つの時間上の数量化手続きを反覆することによって測られる。
２つの係数は、系を鑑定する際に酌量される：
平均誤差
そして、Ｍａｘｉｍａｌ間違い
円周率およびｃｉがいずれであるか、数個の中のｉ番目のスポットを測定する際の平均値および標準逸脱は、反覆する。
テーブル２は両方のＣｌｏｎＴｅｃｈ濾過器上の２つの系の比較の一覧を示す、そして、マイクロアレイｓはインハウスを押印した、そして、本願明細書において記述される系が既存の系を上回ることは明白である。
２つのサンプルが比較されて、提起されたアレー・イメージ分析法において巻き込まれるシステムエラーの量を定めるために、そして、分析される比較手続きの以下の見方：
数量化の間違い、比率の間違いおよび正規性の間違い。
数量化の相対誤差は、ｏ−ｉ　ｌｕｉとして定義される、
そこにおいて、
ｃｉおよび円周率は、６つの独立検査の中のｉ番目のスポットの標準偏差および平均値である。
２つのサンプルの遺伝子形質発現と比較するために、我々はコンベンショナルなひだ比率の代わりに相対的なひだ比率を定義する。
サンプルＳ（ａｎｄＳ２）のための相対的なひだ比率が（Ｓ２−Ｓ１）ｉｓａｖａｌｕｅｉｎｔｈｅｒａｎｇｅ［−１として計算されること＋１］；
ｐｏｓｉｔｉｖｅＲＲＦ（Ｓ１，Ｓ２）＝，ｗｈｉｃｈ　ｍａｘ（Ｓ１，Ｓ２）値は増加機構を開示する、そして、Ｓ２にとって、負の数はＳからダウンレギュレーションを開示する。
相対的なひだ比率はコンベンショナルなもののそれに類似した意味を有する。但し、次の場合は除く−値は正規化されて、弁識するのが簡単である。
たとえば、ＲＲＩ：
＝−０．５は、二回で上または下−調節と一致する。
ジーンの豊度および比率比較の最高間違いの平均間の類縁。
正規化された豊度を有するジーンをみなす［０，０．３３］６７］、（０．６７，１］低くて、中間で高い豊度として、各々のカテゴリのための比率の最大間違いが１．８９％、４．８９％および、それぞれ、１４．５４％であること。
低い豊度ジーンの中の比率が数量化の原型鋳型の初期位置に、より影響されることは、明白である。
したがって、系はｍｅｄｉｕｍ−ａｎｄ高い豊度スポットを取扱う際により信頼できる。
テーブル３は、スポットおよび量的間違いの自動性の評価（信頼性標識）間の類縁の一覧を示す。
量的学習は、それを確かめる自動的に識別する‖『ｕｎｒｅｌｉａｂｌｅ’ｌｏｃｉは、他の２つのカテゴリより多くの間違いが欠点である。
実際に、パーセンテージｏｆ’ｕｎｒｅｌｉａｂｌｅ’ｓｐｏｔｓは、ハイブリダイゼーション手続きの品質の指示薬として運用されることができる。
ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒは、大部分の数量化および比較機能を自動化する。それは、別にアトラス相補ＤＮＡアレーの共役差積関数群を処理する、
したがって、系にアレーの全ての型を処理することに直ちに一般化されるのを可能にする。
一方、ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒは共役差積ユーザーの中の変異に強い。
スポットの数量化は、主に入力イメージ（ユーザーの自覚的な判断よりむしろ）の天性に依存する。
大部分の商用の系が結果の信頼性を鑑定するために人間オペレータに依存する一方、ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒが自動的に原因となられる間違いがｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄしたポテンシャルを識別して、スポット、そして、それらの陰影。
この系の唯一機能のうちの１つは、頼みにならない数量化を破棄して、前もって結果を誤らせることを除外することである。
配列−被支配頂ハイブリダイゼーション形質およびいかなるハイブリダイゼーション反作用の点でも固有の変異のために、アトラス・データおよび他のいかなる配列データも半定量的であるとみなされなければならないだけであることは、手形不渡証明の価値がある。
ノーザンおよび／または半定量的なＲＴ−ＰＣＲ手段を経たリボゾームリボ核酸のレベルを測定することは、常に他アッセイを有するアレー試験のいかなる面白い結果も確認するのに必要である。
気象概況において、ここで起訴されるコンピュータ・プログラムによって定義されるプロセスは、無差別のマイクロアレイ設計の点で固有のいい加減さのいくつかの問題に関係する。
ａ”ｄｉｖｉｄｅ−ａｎｄ−ｃｏｎｑｕｅｒ”ｆａｓｈｉｏｎにおいて、更なる溶液は、クラスタ・パターンのマイクロアレイが豊度のそれらの内因性のレベルに従うジーンを集めるのを予定することになっている、
そうすると、鋳型のそれらを配列する。
Ｔｈｅ”ｄｉｖｉｄｅ−ａｎｄ−ｃｏｎｑｕｅｒ”ａｐｐｒｏａｃｈも可転性を規定する。そして、集中する努力のジーンの選択されたクラスタの追跡調査を許す。
新生のレポートは、マイクロアレイ解析方法の仕事率が１８，０００〜２０，０００のジーンの鋳型の遺伝子形質発現変更を決定することを示す。
本願明細書において記述される手段は大部分の変更が発生する領域の検出を許す。
そして、他の分子状ｍｅｔｈｏｄｑｌｏｇｉｅｓ（例えばノーザンブロッティング解析および／または半定量的なＲＴ−ＰＣＲ解析）を経た徹底的な再調査再検査を許可する。
さらに、マニュアルのｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃなトレーシング対コンピュータ自動解析と比較するために、選択区域はまた、徹底的な解析のために運用されることができる。
最終的に、いかなるマイクロアレイ解析にも関係している計算の仕事は、最大の信頼性および繰返し性を有するｍｕｌｔｉｇｅｎｅ変更および最小のヒューマンエラーを文書化しなければならない。
この問題は強力な数理モデル化およびコンピュータ・プログラムによって取扱われることができる、しかし、より重要なことに、マイクロアレイｓが故意のときに、それは心に留めておかれることを必要とする。
したがって、デザイナーｂｉｏｃｈｉｐｓ”ｔｏは生物系の豊度およびデータ解析のコンピュータ化された自動性のプロセシングの使用のそれらのレベルに従うジーンを群がらせる、作業から高スループット工学の現在の人種のｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓを取り除く。
（実施例１）
Ｄｅｆｏｒｍａｂｌｅ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ．を運用している若くて古いアニマルからのデオキシリボ核酸の比較
トータル・リボゾームリボ核酸は、Ｐ．ＣｈｏｍｃｙｎｓｋｉおよびＮ．Ｓａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６（１９８７））に記載されている技巧によれば、グアニジウム／石炭酸溶液を有する均質にされた肝臓を抽出することによって凍った肝臓から単離された。
水溶
位相は、更に抜き出された（２５：
２４：
１）石炭酸：
ＣＨＣ１３：
ＩＡＡおよびグリコーゲンは、遠心によって取られた。
リボゾームリボ核酸は、エタノール沈殿によって得られて、分光学によって量を定められて、ゲル電気泳動によって権限を与えられた。
１．５ｕ。高品質Ｄｎａｓｅ−処理されたトータル・リボゾームリボ核酸のｇは、５８８の最適化されたプライマ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を用いてＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ相補ＤＮＡ合成とラベルをつけられる［ａｌｐｈａ−３２Ｐ］ｄＡＴＰにおいて運用された。
法人組識になっていない３２Ｐ−ラベルをつけられたヌクレオチドはＣｈｒｏｍａ　Ｓｐｉｎスピンずい柱（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を有するプロファイリングによって、ラベルをつけられた相補ＤＮＡプローブから取られた。そして、重量溶出を運用した。
相補ＤＮＡ／リボゾームリボ核酸プローブを包含している画分は、１ＭのＮａＯＨを有する６８のＣでの単一の足止めされる相補ＤＮＡに変換されて、１ＭのＮａＨ２ＰＯ４［ペーハー７．０］によって中和した。
プローブは、Ｃｏｔ−１つのデオキシリボ核酸がある場合には、５８８のＰＣＲジーン産物を包含して、ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄされた（３０のマイニュートのための６８のＣ）ＣｌｏｎＴｅｃｈハツカネズミマイクロアレイｓに対する６８のＣでの交雑するオーバーナイトであって、サケ精液をせん断した。そして、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を運用した。
メンブレンは、ｐｒｅ−ｗａｒｍｅｄされて２つの追加の洗流によって準拠されているｐｒｅｗａｒｍｅｄされた２Ｘ　ＳＳＣ（１％のＳＤＳ）を有するＸ４を蒸留水に通された０。
１Ｘ　ＳＳＣ（０．５％のＳＤＳ）。
メンブレンは、オートラジオグラフィおよびＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇすることためのプラスチック・ラップのそれから包まれた湿気であった。
ＣｌｏｎＴｅｃｈアトラス・ハツカネズミ相補ＤＮＡ形質発現アレーを分析する際に、典型的市販のフラットベッドスキャナ（Ｓａｐｈｉｒライノタイプ−ヘル）によって、オートラジオグラフ薄皮は、３００ＤＰＩ、８つのビット・グレースケールでスキャンされる。
獲得性の影像は高められて、ソフトウェアｐａｃａｇｅ（ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒ）によって分析される。そして、社内で開発される。
望ましくなくそらせることに関するメンブレンを取扱うために、変形可能な鋳型は、自動的に遺伝子形質発現の量を定めるために定義される。
変形可能な鋳型の各々の結節は傾き降下ルールによれば繰り返して言う。そして、それはデータ不一致エネルギーおよび鋳型変形エネルギーを結合しているエネルギー関数を最小にする。
理想的なジーン・スポットは、所定の半径を有する円として立体感を与えられる；
このように、遺伝子形質発現は面積強度によって量を定められることができる。ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒはまた、ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ”ｂｌｅｅｄｉｎｇ”ｒｅｇｉｏｎｓができる、そして、このように、数量化のポテンシャル間違いのユーザーに警報を伝える。
後の解析において、これらの領域は、慎重に照合されて、討論から締め出される。
２つのサンプルの遺伝子形質発現と比較するために、相対的なひだ比率は、コンベンショナルなひだ比率の代わりに定義された；
サンプル間の相対的なひだ比率は、ｐａｉｒｗｉｓｅ比較が培地および高い豊度ジーンにおいてより信頼できることをそれ（オペレーションのヒューマンエラーを考慮すること）に明らかにする。
テキストにおいて記述される実験結果は、各々の濾過器上の三反複の平均に基づく。
２つのサンプルを正規化する際に、Ｌａｍｂｄａデオキシリボ核酸は陰性対照として選択された、そして、ＨＰＲＴ、ＭＯＤおよびＧ３ＰＤＨは正の制御として選択された。
線形正規性手段は、行使される。
２つのＣｌｏｎＴｅｃｈアトラス・アレーＳｏｆｔｗａｒｅ　ＡｔｌａｓＩｍａｇｅＴＭ　１．０のＥｓｔＢｌｏｔ　ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒの量を定める際の三系のテーブル１つのＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
全体的なアランメント２０の最小Ｍ　１５の最小（１）Ｍ　１＊９　Ｍ　ｓｅｃ（２）
アランメント￣３０最小値Ｍ　５つの最小Ｍ　０．５＊９　Ａ　ｓｅｃを微調整する
サンプル１５の最小Ｍ　Ｎの信頼性／秒のためのＡ　２０のｓｅｃ　Ａ　Ｒｅｐｅａｔが１時間配列する
バックグラウンド１５の最小Ｍ　３つの最小Ａ　０．５のｓｅｃ　Ａ　Ｃｈｅｃｋを合わせるＭ　０　Ａ　１．５＊９　Ｍ及びＡ　ｓｅｃ
２つのアレー１５の最小値Ｍと比較する、で、レポート１０の最小（板状データ）ＭをＣｕｓｔｏｍｉｚｉｎｇしているＡ　４つの最小Ａ　Ｉ　＊６　ｓｅｃ　Ａ及びＣｕｓｔｏｍｉｚｉｎｇしているＡ　０．５の最小Ａ　０．５の最小値Ａはメーカの規定において概算したＡｔｌａｓＩｍａｇｅＴＭ　１．０の処理時間があると報告する
【表１】

（１）（グラフィックＮ／Ａ　Ｎ／Ａ　５つの最小Ｍ及びＡデータ）。
（２）ＥｓｔＢｌｏｔおよびＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒの処理時間は、４００，３８４ＭＢ　ＲＡＭ、Ｐｅｎｔｉｕｍｇに試験される。
このテーブル、手操作に対するＭ、自動機械プロセシングに対するａｎｄ’Ａ’ｒｅｆｅｒｓの。
ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒの処理時間を測定しているＯｐｅｒａｔｏｒ’＊’ｉｎは、同じ手続きの反複時間を意味する。
ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒが大衆薬のために故意であるので、
数量化Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ＥｓｔＢｌｏｔ　ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒ　ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒ（３−１０のピクセル）のシステムエラーのテーブル２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ
収容する（ＣｌｏｎＴｅｃｈ（濾過器において押印されるマイクロアレイｓ）は、濾過される））ドイツ紳士（％）１１．４９　６．９７　０．９３　Ｍｅｒｒ（％）５５．８６　３３．１０　５．０１
２つの独立作働遺伝子は、原型鋳型の初期位置（左のこまて正しい最下段コーナー）を規定することを必要とする。
【表２】

２つの独立作働遺伝子は、原型鋳型の初期位置（左のこまて正しい最下段コーナー）を規定することを必要とする。
各々の作働遺伝子は、三時間のための１つのサンプル上の同じ手続きを反覆する。
テストの間、人間オペレータが整列配置する際の３つの最高１０のピクセルから、格子鋳型の初期位置を置き換えてもよいことは、観察された。
６つの反複のために、２つの係数は、系を鑑定する際に酌量されるＮである；
平均誤差は、誤る＝Ａｖｇ（＃ｉ）、そして、
Ｎ　＃ｉ
最大の間違いＭｅｒｒ　ｉｎｗｈｉｃｈ　ｉａｎｄ＃ｉａｒｅｔｈｅａｖｅｒａｇｅｖａｌｕｅａｎｄＭａｘ（ｉ番目のスポットを測定する際のｉ＝ｌ　ｉ標準偏差）。
共役差積を有するスポットのための間違いのテーブル３つのＣｏｍｐａｒｌＳｏｎは、Ｌａｂｅｌ　Ｎｏ．（（％）Ｉｉ（ｍａｘ（ＲＤＭ）（Ｍｉｎ（ＲＤＭ）））が番号をつけるトータル・ドイツ紳士は、９８である）に０（垂直線）とラベルをつける
【表３】

実験的条件は、表３に記載の同じものである。
このテーブルは、スポットおよび量的間違いの自動性の評価（信頼性標識）間の類縁の一覧を示す。
２つの係数は、酌量される：
平均誤差／ｌｅｒｒ＝Ａｖｇ（ｉ）および比率比較の最高間違いの平均。
それはそれを見せられるｉ＝ｌ　ｉである自動的に、ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ’ｕｎｒｅｌｉａｂｌｅ’ｌｏｃｉは他の２つのカテゴリより多くの間違いが欠点である。
実際に、パーセンテージｏｆ’ｕｎｒｅｌｉａｂｌｅ』スポットは、ハイブリダイゼーション手続きの品質の指示薬として運用されることができる。
（実施例２）
義務を負わせているＥボックスのマイクロアレイ解析のためのジゴキシゲニン酵素の検出は、遺伝子形質発現を話した。
形質発現プロファイリングのための相補ＤＮＡ　マイクロアレイｓの利点および問題を換価して、新規な方法は、標的に、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）および比色であるかｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔな検出を有する反対のジゴキシゲニン抗体複合化を有する次のインキュベーションについては、ジーン−比プライマから作り出される相補ＤＮＡとラベルをつけるためにジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を役立たせることに基づいて開発された。
Ｅ−ボックス束縛元素（ＣＡＣＧＴＧ）（多数ジーンのプロモーター領域に位置する）を包含している一組のジーンは、プローブとして選択された。
おそらく、Ｅボックス−束縛ジーンのｂｅｓｔｋｎｏｗｎ代表は、ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇしている活性が細胞周期の調節で重大役割を演ずるｃ−Ｍｙｃである増殖、そして、アポトーシス（Ｅｉｌｅｒｓ（Ｍ．Ｍｏｌ．）
細胞９，１−６（１９９９）；
Ｄａｎｇ（Ｃ．Ｖ．モル）。
細胞Ｂｉｏｌ．１９（１−１１（１９９９））；
Ｆａｃｃｈｉｎｉ、そして、ペンＦＡＳＥＢジャーナル１２，６３３−６５１（１９９８））。
ｃ−Ｍｙｃ（形質発現がＥボックス−束縛被支配頂である若干の標的ジーンと同様に）のための形質発現を相互に作用しているかまたは監督しているジーンは、このマイクロアレイに含まれる。
これらのカスタムメイドの故意のマイクロアレイｓ（標識ハイブリダイゼーション・プローブに対する酵素の方法を有する混合性）は、遺伝子形質発現の比サブグループのアッセイを審査している高スループット・ジーンのための安価な、ユーザーフレンドリーな系の現像を許す。
材料および手段
ｃ−Ｍｙｃ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇのと、同程度よく、Ｅボックス−結合タンパク質をａｒｒａｖｉｎｇするためのプローブの選抜−、相互に作用することおよび標的ジーンは、共役差積データ・ベース−ＧｅｎｅＡｔｌａｓから選ばれた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｃｉｔｉ２．ｆｒ／ＧＥＮＡＴＬＡＳ）（ＧｅｎｅＣａｒｄｓ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｗｅｌｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／カード））ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｋｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ウェブ／Ｇｅｎｂａｎｋ）およびＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ）。
Ｕｎｉｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／索引。ＨＴＭＬ）、クラスタ番号および配列は、ジーンを識別して、それらの一意性を確認するために用いた。
９つのハウスキーピング遺伝子（ヒーラー細胞デオキシリボ核酸と同様に）は、正の制御として選択された；
負が規制するように、ラムダ・デオキシリボ核酸および２ｘＳＳＣ（倍速標準の塩溶液−０．３のＭ　ＮａＣＩ、３０ｍＭのＮａシトラート、ペーハー７．０）は選ばれた。
各々のジーンのための、一対のプライマがＰｒｉｍｅｒ３ソフトウェアの助けを借りて生成されたこと（ローゼンてＳｋａｌｅｔｓｋｙ（１９９８の）Ｐｒｉｍｅｒ３．
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｚｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．で利用できる暗号
ｅｄｕ／ゲノム・ソフトウェア／他／ｐｒｉｍｅｒ３．ＨＴＭＬ。）。
アンプリコンの融解温度が約８０のＣ、しかし、せいぜい８８のＣでなければならないというような方法で、プログラム・パラメタは選ばれた、または、７５Ｃ未満、アンプリコンの長さは一般に、プライマ２３のｂｐ．の約６０Ｃプライマ焼鈍温度および平均長さについては、約４５０ｂｐ（３００および７００ｂｐ間の２、３のｏｕｔｌｙｅｒｓを有する）であることになっていた。
全てのアンプリコンの配列は、所有権を主張できるソフトウェア（ＢＬＡＳＴＮ（ＦＡＳＴＡ））（反復因子および他の関連した配列を有する相同を回避して、更に同じ科からジーンの間で区別するために）を運用して、慎重に確認された。全ての選択されたジーンの全リストは、表４において表示される。
ＤＮＡ．リボゾームリボ核酸およびメッセンジャーＲＮＡ単離はリボゾームリボ核酸を合計する、そして、デオキシリボ核酸はＴｒｉｚｏｌ試薬（ギブコＢＲＬ、バーリントン、ＯＮ）を運用している新鮮血アリクォットから分離されるほぼ１０の８つのヘル細胞培養および人間の末梢のリンパ球から単離された。
それぞれ、デオキシリボ核酸およびリボゾームリボ核酸濃縮および品質は０．８または２％のアガロースゲルの分光光度的およびゲル電気泳動解析によって決定された。
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは１５０ｐｇのＯｌｉｇｏｔｅｘメッセンジャーＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、ミシソーガ、ＯＮ）を運用しているトータル・リボゾームリボ核酸から分離された。そして、メーカの規定に一致した。
トータル・リボゾームリボ核酸のプローブ１０のＪ．ｇの増幅および純化は、逆であった−メーカの規定に一致しているＭＭＬＶ（ギブコＢＲＬ、バーリントン、ＯＮ）の２００のＵを用いて４０ｎｉ反作用の写す。
ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ系９７００（ＰＥは、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ノーウォーク、ＣＴをＡｐｐｌｉｅｄした）において、プライマの各々の一対のための２つのＰＣＲ反作用は、１００ｕｌの総容積において管理された。
各々の５０ｐｌ反作用（１０ｍＭのトリス−ＨＣＩ、８．６，５０ｍＭペーハーＫＣＩ、０．１％のトリトンＸ−１００，１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ各々のｄＮＴＰ、各々のプライマの２０ｐＭ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（アマシャム・ファルマシアＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂａｉｅ　ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）および１０ｐ．ｌｏｆＲＴ反作用の１．２５のＵまたは１００ｎｇのゲノムＤＮＡの）次のようにｔｈｅｒｍａｌ−ｃｙｃｌｅｄした：
４５のｓｅｃのための９４のＣでの、１つの最小値のための６０のＣでの、そして、３０のｓｅｃのための７２のＣでの３５サイクル、５つの最小値のための９４のＣで第１の回路、プライマがジーンの３．ｐｒｉｍｅ．領域において選択されたという状態については、ＲＴ−ＰＣＲにおいて拡大されてはならない７分のＰｒｏｂｅのための７２のＣでの最後の回路は、ゲノムＤＮＡから抜き出された。
ＰＣＲ産物の大きさおよび収率は、２％のアガロースのゲル電気泳動によって決定された。
それから、ＰＣＲ産物は、溶液またはアガロースゲル・バンドから浄化された、以下の準備のアガロースゲル電気泳動（そばに、産物が決定される場合）、
ＧＦＸずい柱（アマシャム・ファルマシアＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂａｉｅ　ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）を運用すること。
純化の後、全てのプローブの濃縮は、アガロースゲル電気泳動によって概算されて、ほぼ１００ｎｇ／複数に合わせた。
倍速標準の塩溶液（ＳＳＣ）のロボットの配列しているＰｕｒｉｆｉｅｄされたＰＣＲ産物は３８４−穴プレートから三つ組の一つにおいて配列された。そして、ＣｈｉｐＭａｋｅｒ２先端（Ｔｅｌｅｃｈｅｍインターナショナル、サンホゼ、ＣＡ）を備えるＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓＴＭ　ＯｍｎｉＧｒｉｄ　マイクロアレイｅｒ（ゲノムＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、聖カルロス、ＣＡ）を役立たせた。
面間隔
４００のさくは、ドットの間にあった。
マイクロアレイｓはＨｙｂｏｎｄ−ＮかＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン・メンブレン（アマシャム・ファルマシアＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂａｉｅ　ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）に押印された。そして、テープを有する標準ガラススライドに取り付けられた。
メンブレンを有する各々の１０のスライドの前後で、定型的スライドは、プリント品質を閲覧するために挿入された。
配列した後に、メンブレンが５０ｍＪで照らされるＵＶであったこと（ＧＳジーン・リンカー（Ｂｉｏ）
ラド、ヘラクレス、ＣＡ）デオキシリボ核酸を固定する；
それから、アレー（ほぼ１つのｘ　１．５ｃｍ）を包含しているメンブレンのフラグメントは、切り離されて、５つの最小値のための沸騰水においてｄｅｎａｔｕｒａｔｅｄされて、５つの最小値のための０．１％のＳＤＳにおいてすすがれて、プレハイブリのために運用された。
ＵＶ照射段の後、メンブレンはガラススライドに取り付けられて格納されることができる。
ハイブリダイゼーションのためのＤＩＧのラベルが付いた相補ＤＮＡの製法
ジーン−比プライマ（ＧＳＰ）の初期のミックスは、作り出された。
この目的のために、プローブを調製するためにＲＴ−ＰＣＲ反作用において運用された各々のプライマの１ｎＭは、２５０ｕｌの総容積に加えられた。
ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−、ラベルをつけられた標的は、次のようにＲＴ反作用において作り出された：
ＧＳＰの１ｕｌ　４ｕ。１４の総容積のトータル・リボゾームリボ核酸およびＲＮＡｓｅ−自由水のｇ　１が、リボゾームリボ核酸の特性を奪うために１５の最小値のための６５のＣで加熱された
そうすると、アニール化されているプライマのための５つの最小値のための室温でとどまった。
代わりに２ｇのメッセンジャ−ＲＮＡ、そして、４００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）１２遅いプライマは、運用された。
８ｌの２ｕ、酵素のメーカによって供給される５ｘ第１のストランド緩衝を包含して、反作用ミックス。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ（終濃度５００ｐＭ各々）（０の４つのＩｌｌ）の１０ｍＭのミックスのｌ。
１ＭのＤＤＴ、０．７ｕｌ　ＲＮＡｇｕａｒｄ、３１のＵ／ｐｌ（アマシヤムＰｈａｒｒｎａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂａｉｅ　ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）、１９の２ｍＭのミックスの１０ｌ：
１つのｄＴＴＰ：
Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウィルス・リバーストランスクリプターゼ（ＭＭＬＶ　ＲＴ）（ギブコＢＲＬ、バーリントン、ＯＮ）のＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰ（ロシュ、ラヴァル、ＱＣ）および２１（２００のＵ／ｌ）は、加えられた。
反作用は１ｈのための３７のＣで実行された。そして、ＧｅｎｅＡｍｐ　９７００の５つの最小値のための９４０Ｃで、酵素減生が続いた。
あるいは、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔリバーストランスクリプターゼ（Ｑｉａｇｅｎ、ミシソーガ、ＯＮ）は、メーカの規定によって運用された。
ラベリング反作用は、ＧＦＸずい柱に浄化された；
この段は、法人組識になっていないヌクレオチド、プライマおよびタンパクと同じく、１００ｂｐより短い全てのラベルをつけられた産物を削除する。
純化の後、ラベリングの効能は、次のように概算された：
１の１ｕｌ：
１００，１：
１０００，１：
１００００および１：
１０００００の希釈は、我々のアッセイ（ロシュ、ラヴァル、ＱＣ）のための標準化としての周知の濃縮（１０−０．０１のｐｇ／ｌｌ）でのコントロールＤＩＧのラベルが付いたデオキシリボ核酸の希釈と共に、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎメンブレン上の点状であった；
ＵＶを有する固定化の後、メンブレンがアルカリホスファターゼ（ＡＰ）によって温置されたこと−ＤＩＧ（反対のＤＩＧ　ＡＰ）（すすがれて、メーカの規定に従うｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔな基質（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏな｛ｄｅｃａｎの１，２−ジオキセタン−３，２．ｐｒｉｍｅ．−（５．ｐｒｉｍｅ．−クロル）トリシクロ［３．３．１．１３７］｝４−イル）フェニール・リン酸塩ＣＳＰＤ（ロシュ、ラヴァル、ＱＣ））で汚される）に複合化抗体。
ハイブリダイゼーションおよびプロセシング
ハイブリダイゼーションおよびプレハイブリのためのＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ緩衝（Ｒｏｃｈｅ，ラヴァル、ＱＣ）、または、ホルムアミド緩衝が脱イオン化された５０％のホルムアミド、５ｘ　ＳＳＣ、遮断の２％の溶液（ロシュ、ラヴァル、ＱＣ）、０．１％のＮ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅを包含して、０．０２％のＳＤＳ（ｄｅｎａｔｕｒａｔｅｄされた１００のｇの／ｍｌのサケ・デオキシリボ核酸）は、運用された。
メンブレンは、予めハイブリダイゼーション乾燥器（Ａｕｔｏｂｌｏｔ、Ｂｅｌｌｃｏ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）の２ｈのための４２のＣで雑種を作った。
５ｍｌのファルコン・チューブにおいて、ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション溶液の１ｍｌの以下の４２のＣオーバーナイトで執行された。
ハイブリダイゼーション・ミックスのラベルをつけられたプローブの濃縮は、１０のｎｇ／ｍｌを構成した。
ハイブリダイゼーションの前に、プローブはハイブリダイゼーション溶液の１０の最小値のための６５のＣでｄｅｎａｔｕｒａｔｅｄされた。
その後、ハイブリダイゼーション・メンブレンは、二回１つのｘＳＳＣ（１５の最小値のための室温で、０．１％のＳＤＳ）できれいにされた（特別に掲げられない限り）
そうすると、ｐｒｅｗａｒｍｅｄされた０．１ｘＳＳＣ（６８のＣ．でのあるいは、１５の最小値のための０．１％のＳＤＳ）を有するメンブレンがよりストリンジェントの条件においてすすがれたことｉ．ｅ。２ｘＳＳＣ、３０の最小値のための６８のＣ．での０．１％のＳＤＳおよび３０分の間の６８のＣでの０．１ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの二度の二度
水洗緩衝（マレイン酸緩衝（０．１Ｍのマレイン酸、０．１５ＭのＮａＣＩ、ペーハー７．５）の０．３％のＴｗｅｅｎ　２０）の５つの最小値のための平衡化の後、メンブレンは軽度なものかき混ぜの下で遮断の１％の溶液の１．５ｈブロック化された、
そうすると、１０ｍｌのアルカリホスファターゼ−複合化ヒツジ反ジゴキシゲニン抗体（ロシュ、ラヴァル、ＱＣ）の３０の最小値のための既治療は、１を薄めた：
比色染色または１のための１０００：
ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔな検出のための１００００。
抗体インキュベーションに続いて、メンブレンは水洗緩衝の１５の最小値のためのすすがれた三時間であって、検出緩衝（０．１Ｍのトリス−ＨＣＩ、０．１５ＭのＮａＣＩ、ペーハー９．５）の２つの最小値のために釣り合って、１７５のｊｇ／ｍｌの５−Ｂｒｏｍｏ−４−クロル−３−インドリル−リン酸塩、トルイジン塩（ＢＣＩＰ）および検出緩衝の３３０のｕｇ／ｍｌのナイトロ・ブルーテトラゾリウム塩化物（ＮＢＴ）によって汚れた。
代わりに、１：
ＣＳＰＤの１００の希釈は行使された、そして、化学発光はＢｉｏＭａｘを運用しているメーカの推奨（ロシュ、ラヴァル、ＱＣ）に、ＭＲコダック薄皮を一致させて検出された。
アレーＡｒｒａｙｓの精査および評価は、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ−４つのシステム（印加ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃなＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、ユージン、ＯＲ）を備えるオリンパス顕微鏡にスキャンされた、そして、
ＣＣＤソニーを９５０のカメラに塗る。
１つのファイルへの共役差積観測視野のデータ集めおよびモンタージュは、ノーザンＥｃｌｉｐｓｅ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｍａｇｉｎｇしているＥＭＰＩＸ、Ｍｉｓｓｉｓａｕｇａ、ＯＮ）の助けを借りて果たされた。
各々のドット、バックグラウンド引算、ハウスキーピング遺伝子に対する正規性およびペアード・ハイブリダイゼーションの比較での酵素反応の輝度の量的計測は、企業内ソフトウェアプログラムによって執行される全部であった。
プローブおよびプライマの結果Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
共役差積データ・ベースの慎重な評価の後、６１のジーンは配列するために選択された。そして、９つのハウスキーピング遺伝子を勘定に入れた。
ジーンのこのセットは、Ｍｙｃ（ｃ、Ｎ、Ｌ　１およびＬ２）科、５つのｃ−Ｍｙｃ規制する係数（ＺＦＰ１６１、ｎｍ２３−Ｈ２Ｓ、ＭＢＰ−１、ＲＢＭＳ　１およびＲＢＭＳ２）、５つのｃ　Ｍｙｃ相互に作用しているジーン（ＹＹ１、ＴＦＩＩ−１、ＰＡＭ、ＭＭ−１およびαチューブリン）および４つのｃ　Ｍｙｃ標的ジーン（ｐｒｏｔｈｙｍｏｓｉｎα、ＭＲＤＢ、ＯＤＣ１およびｃｄｃ２５Ａ）と共に、ジーンを結合している３８のＥボックスを包含する。
正の制御は、形質発現（ＵＢＣ、β−アクチン、ＧＡＤＰＨ、ＨＰＲＴ１、フォスフォリパーゼ２、ＨＬＡ−Ｃ、ＰＲＳ９、アルドラーゼＣおよびＲＰＬ１３Ａ）、更にはＨｅＬａゲノムＤＮＡの共役差積レベルを有する９つのハウスキーピング遺伝子を勘定に入れる。
ラムダ・デオキシリボ核酸および２ｘＳＳＣ（倍速標準の塩溶液）（それは全てのプローブのための溶剤として運用された）は、陰性対照として選択された。
全てのジーンのためのプライマは、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアの助けを借りて選択されて、それらがＰＣＲ反作用のための同じ条件と一致すると定めて、同様融解温度の産物を作り出した。
大部分の産物は、ＨｅＬａまたはリンパ球相補ＤＮＡから作り出された。
ＰＣＲ増幅が相補ＤＮＡから故障した場合に備えて、プライマはこれらのジーンの３’ｒｅｇｉｏｎにおいて選択された、そして、アンプリコンはＨｅＬａゲノムＤＮＡから作り出された。
全てのＰＣＲ反作用が９６穴フォーマットにおいてあることができたプライマの平均焼鈍温度は、あった。
プライマの産物および焼鈍温度の大きさおよび融解温度は、表４において表示される。
配列するためのＰＣＲ産物およびそれらの融解温度の平均繊度は、４４１５８ｂｐおよび、それぞれ、８０３のＣであった。
これらのパラメータを選択することはストリンジェント条件のハイブリダイゼーションおよびポスト−ハイブリダイゼーション水洗を許した。そして、徹底的に交差反応およびバックグラウンド・レベルの可能性を減少した。
プライマの良心的な選抜は、ジーン科の非常に近い構成メンバ間の若干のケースにおいて区別するために用いてもよい（（例えばＵＳＦ１および２）ＩＤ２，３、そして、４（Ｍｙｃ科の構成メンバ）その他、あるいは、ｃ−Ｍｙｃ．の２つの共役差積転写産物との間に）
周知のように、ｃ−Ｍｙｃで異なるいくつかの転写フォームがある。そして、調節性状（ＢｏｄｅｓｃｏｔおよびＢｒｉｓｏｎジーン１７４，１１５−１２０（１９９６））を変化させることで、共役差積促進因子から写される。
第１のエキソンおよび２ｎｄ−３ｄエキソンのプライマを選択することは、ｃ−Ｍｙｃのフルサイズで先端を切った種類間の識別を許した。
おそらくナイロン・メンブレンに印刷される相補ＤＮＡマイクロアレイｓを有するハイブリダイゼーションの結果に影響するハイブリダイゼーションＳｅｖｅｒａｌパラメータに影響している条件は、慎重に試験された。
まず第一に、ジーン・プロファイリング結果は、メッセンジャーＲＮＡかトータルＨｅＬａリボゾームリボ核酸を運用して検察された。
驚くべきことに、形質発現の全部のパターンは非常に類似していた、２、３のジーン（ＵＢＣ、ＲＰＬ−１３Ａ、ＭＢＰ−１）を除いては、メッセンジャーＲＮＡからのシグナルはよりいくつかの時間であった；
最も顕著な差は、ＵＢＣで見つけられた、
そこにおいて、
それは、５−ひだに接近した。
あるいは、ＨＰＲＴ１およびホスホリパーゼＡ２のためのシグナルは、トータル・リボゾームリボ核酸によってより高かった。
メッセンジャーＲＮＡの数量が限定要因である条件において、形質発現プロファイリングの結果の有意差なしで、トータル・リボゾームリボ核酸は、その代わりに運用されることができる。
ジーン−比プライマが運用されるときに、２つの逆転写酵素、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）（ギブコＢＲＬ、バーリントン、ＯＮ）およびＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ミシソーガ、ＯＮ）（ハイブリダイゼーションのためのジゴキシゲニンのラベルが付いた標的の生産のために運用される）の比較は形質発現プロファイルのいかなる差も見せなかった；
しかし、特に染色（テーブル５）の日以後、信号の強さはＭＭＬＶを有するラベリングの後、より強かった。
オリゴ、（ｄＴ）プライマはメッセンジャーＲＮＡによって運用された。そして、いくつかのジーンの発現量の若干の有意差は検出された。
より激しいＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ生成された２−３つの時間を有するラベリングは、ＲＰ−Ｓ９、ＲＰ−Ｌ１３Ａ、ｅｎｏｌａｓｅｌ、Ｎ−ＭｙｃおよびＭＡＤ４のために信号を送る。
どの緩衝がマイクロアレイｓ、ＥａｓｙＨｙｂＴＭ（ロシュ、ラヴァル、ＱＣ）およびホルムアミドに基づく緩衝を有するハイブリダイゼーションのためによりよいか決めることは、比較された。
ＨｅＬａメッセンジャーＲＮＡの形質発現プロファイルが緩衝液組成から独立しているとわかった、しかし、ホルムアミド緩衝（テーブル５）のハイブリダイゼーションおよび遮断の２％の試薬の添加がＥａｓｙＨｙｂと比較すると還元したバックグラウンドを助成したあと、シグナルはより高かった。それによって、次の精査および画質評価を容易にした。
共役差積厳しさの水洗条件が運用される（ＭａｔｅｒｉａｌｓおよびＭｅｔｈｏｄｓを参照のこと）ときに、根本的な相違点はＨｅＬａメッセンジャーＲＮＡの形質発現プロファイルで見つけられなかった。
よりストリンジェントの水洗は均一に全てのシグナルを下げて、より鋭い縁を有するシグナルを作り出した。そして、それらがスキャンして、鑑定するのがより簡単になった。
標準の水洗条件は、おそらく相補ＤＮＡマイクロアレイｓおよびジーン−比プライマを有するハイブリダイゼーションにおいて、十分にすでにストリンジェントである；
したがって、標準水洗は優先である。−その理由は、次のことにある。それはそれほど時間がかからない。
比較の明らかに課せられた（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）中性（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｎ）を有するナイロン・メンブレンがセンシティビティの差を見せなかったこと。
この考慮を除いて、中性（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）ナイロン・メンブレンは、支持体を押印するためのそのより強い集合組織のために好ましい。
この強さは明らかに課せられたＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（それが見える印刷足型を保つとわかった）で、見つけられなかった。そして、画像分析および増加するバックグラウンドの合併症の原因となった。
表５から見られることができるように、通常１つの日に染色時間をオーバーナイトから増やすことは１０％だけシグナルの全体的な強さを増やした。
より長い染色時間は反作用のバックグラウンド・レベルを増やした。そして、それはより高いセンシティビティの可能な利点を示談にした。
ハイブリダイゼーション条件の変異は、全体的信号の強さを３０−４０％増やすことができる。
しかし、ポジの効果は相加的でない、そして、マイクロアレイｓのトータル輝度の最大差は５０％だけに近づく。
相補ＤＮＡマイクロアレイを有するＤＩＧのラベルが付いた標的のハイブリダイゼーションのための以下の条件は、最適である：
中性ナイロン・メンブレン、トータル・リボゾームリボ核酸を有する逆転写反作用、ジーン−比プライマおよびＭＭＬＶ上のプリント・プローブは、転写酵素、ホルムアミド緩衝のハイブリダイゼーションおよび条件をすすいでいる標準を取り消す。
これらの条件は、以下の段落に記載されている試験において履行された。
Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｖ、センシティビティおよびＴｏが全体を取材することは長さ（３６８−７１１のｂｐ）の中で値域を定める相補ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション（５つのジーン（ＭＲＤＢ、ＯＤＣ、ＴＦＩＩ−１、ｃｄｃ２５Ａおよびｃ−Ｍｙｃ））の特異性を鑑定するハイブリダイゼーションのｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｖは、産物を配列して、複合的なＰＣＲ反作用においてラベルをつけられて、相補ＤＮＡアレー（図６）によって交雑した。
Ａｓは予想した−アレー上の５つのサンプルだけはポジだった、コントロールとしてのＨｅＬａゲノムＤＮＡと同じく、ＨｅＬａゲノムＤＮＡが分類学的位置５１およびネガでの最も高い濃縮での点状であった遺伝子座によって、それが交雑するので、まだらのＨｅＬａゲノムＤＮＡが低い数量の中である分類学的位置１ａおよび１ｂで、ほとんど検出を興行しない。
みんなで、これらの試験は、交差反応（図４）の符号の証拠とならない。
センシティビティを概算して、相補ＤＮＡ　マイクロアレイハイブリダイゼーションのための較正曲線を誘導するために、この５−ジーンＰＣＲミックス（１０の、４，０．１および０．０４のｎｇ／ｍｌ）の共役差積濃縮は、アレーによって交雑した。
この試験の結果は、図５において起訴される。
同じ傾きｏｕｆ　４５２については、４−１０のｎｇ／ｍｌの領域の明らかなプラトーについては、半対数座標の一次従属は、全てのジーンのために観察された。
下部の検出限界は、アレーの共役差積プローブのために僅かに変化して、４０−１００と一致する
個体ジーンにつきｐｇ／ｍｌ。
これらの結果はジゴキシゲニン系（１０−３０のｐｇ／ｍｌ）の検出限界の近くにある。そして、メーカ（ロシュ、ラヴァル、ＱＣ）に一致する。
センシティビティのこのレベルは中間体豊度のメッセンジャーＲＮＡの検出を許す。そして、各々０．０４％以上のトータル細胞メッセンジャーＲＮＡを表示する。
アカウントに取得この検出レベル、中間体豊度の約７０のジーンを包含しているマイクロアレイを有するハイブリダイゼーションのために、７ｎｇのジーン−比プライマから作り出されるラベルをつけられたプローブが十分でなければならないと見積もられる。
次のハイブリダイゼーションのために、１０のｎｇ／ｍｌのラベルをつけられたプローブの濃縮は、選択された。
ジーンを有する反作用に比プライマとラベルをつけている標準逆転写の収率は、約２０である−４０ｎｇ；
したがって、１つのラベリング反作用は、２−４つの独立ハイブリダイゼーション反作用のための十分な産物を生む。
不安定な放射性のプローブとは対照的に、ＤＩＧのラベルが付いたプローブは、格納されることができて、数回再利用されることができる。
いくつかの月の間のａｔ２０　Ｃを格納した後に、ハイブリダイゼーション混合２−３つの時間を再利用することは、全く起源の人と調和した結果を与えた。
アレーは３６００ｄｐｉの解像力でスキャンされた、そして、結果は顕微鏡精査の結果と比較された。
一般に、繰り返されたドット間の多様性はスキャナの場合より高かった、そして、直線性はスキャナのソフトウェアによって影響されることができる。
スキヤナは、特にｃｈｅｍｉｌｕｍｅｎｅｓｃｅｎｃｅ検出が履行されるときに、ハイブリダイゼーション結果の原基評価のために運用されることができる。
Ｅボックス・ジーンの人間のｌｙｍｐｈｏｃｖｔｅｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎプロファイルと比較するとヘル細胞の形質発現プロファイリングは、ヒーラー細胞（図８ａ）および垂直線ヒトリンパ球（図８ｂ）を繰り返す際に決定された。
リンパ球、Ｅボックスに関連したジーンＴＣＦ４の調節の上の２−ひだより成られる最も顕著な修正、ＭＡＤ４およびＡｌｄｏｌａｓｅ　Ｃ．の
あるいは、ｃ−Ｍｙｃ規制するジーンＭＢＰ　１およびＮｍ２３−Ｈ２ＳのダウンレギュレーションおよびＮ−Ｍｙｃのｃ−Ｍｙｃおよび増加機構の小さいダウンレギュレーションは、ヒーラー細胞と比較するとリンパ球において登記された。
ｃ−Ｍｙｃ若干の相互に作用しているおよび標的ジーンの形質発現は、ｄｏｗｎ−（ＭＭ−１（ＯＤＣ　１））であるかまたはリンパ球においてｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄした（ＰＡＭ（ＭｒＤｂ））。
また、
ヒーラー細胞と比較すると、小さいｕｐ−（ＭＩＴＦ（ＩＤ２））および下の（ＴＦＥＢ）調節はリンパ球のＥボックス−束縛いくつかのジーンの形質発現に認められた。
これらの結果は、図９ａ、９ｂおよび９ｃに示される。
気象概況相補ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイｓは、遺伝子形質発現パターンを研究するためのますます強力な技巧になっている。
この場の耐性の発育にもかかわらず、技巧の若干の限界は、固執する。
主な障害のうちの１つは、大量のメッセンジャーＲＮＡのための必要条件である。
既存のマイクロアレイ系を有する他の問題は、データ鉱業である；
数万ジーンの形質発現上の情報が新規なジーンの機能を概算するために絶対に生活である間、若干のインスタンスにおいて、多数生理学的条件において、研究者はジーンのサブセットだけの形質発現プロファイルにおいて関係させられる。
何百または千において、ジーンの塊状ナンバーを有する通常のマイクロアレイｓから検出されてあることができるより、６１の中の３−６つのジーンの形質発現の有意差は、すでに非常に処理できる。
例えば、中で、
４５，０００のジーンのＳＡＧＡ解析、それがそれであるとわかった垂直線および癌性のヒト細胞の差別的に急送する。
類似した推定は、若令および古いハツカネズミの形質発現プロファイルの解析から生じた；
１．８％の約６，０００のジーンだけの形質発現は、２−ひだより変更される。ナイロン濾過器上のマイクロアレイｓを押印して、ジーン−比プライマを有する相補ＤＮＡにラベルをつけるためにジゴキシゲニンを運用することは、ハイブリダイゼーションにつき４ｐｇのトータル・リボゾームリボ核酸にわずか１の使用を許す。
これは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈプロトコルおよびそれの放射活性によって達成されることができる同じセンシティビティである通常のマイクロアレイｓより非常に知覚しうる。
そして、それは、数個ｕを必要とする。ｇ　ｏｆｍＲＮＡ、
したがって、まず第一に、１００〜１，０００マイクログラムのトータル・リボゾームリボ核酸を必要とする。
加えて、高いラベリング・センシティビティのＤＩＧのラベルが付いたプローブは、長い間格納されることができて、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙであるか放射能のようにラベルをつけられたものとは対照的に、いくつかの時間を再利用した。
そして、ラベリングのためのジゴキシゲニンを使用して、マイクロアレイの含有物のためものジーンの精選は、放射性のラベリングの他の不利な点を回避するのを助ける：
Ｅ−ボックスマイクロアレイのジーンは、豊度（中間であるか低く多量の）の同じカテゴリの全部である。
非常に多量のジーンを除外することは、強いシグナルの組み合わせの問題を削除する。
若干の環境のマージされたシグナルは、実質的に精査のプロセスを複雑にして、データ集め段の間、頼みにならない結果の原因となる。
放射性で蛍光性のプローブ方法をｓｕｐｅｒｃｅｄｉｎｇして、酵素のラベリング方法を運用する他利点は、時間節約のおよび繰返し性見方である。
一般に、ラベリング相補ＤＮＡ、ハイブリダイゼーション、水洗のために必要とされる段を含む、インキュベーションをアルカリホスファターゼで仕上げる開始からのこのプロセスは、反ジゴキシゲニン抗体を活用させた、
上下限アルカリホスファターゼの顕色のための染色、
データ集めのための精査は、最高２つの日を必要とする。
これはセーブが必要とされる最高８つのｄａｙｓ’ｅｘｐｏｓｕｒｅによって比較した相当な時３２Ｐ放射性である、または、３３Ｐはプローブにラベルをつけた。
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌａｂｅｌｅｄされたプローブの上の酵素のラベルが付いたプローブの利点は、データ評価段のコスト・セーブである、
そこにおいて、
手段は安価なルーチンの直立顕微鏡を必要とするのに、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌａｂｅｌｅｄされたプローブは高価なレーザー検出システムまたはコンフォーカル顕微鏡配列の使用を必要とする。
蛍光が精査プロセスの後、容易に漂白されることができるという悪名高い事実をプラスして、これは我々の酵素の方法を、起源の信号の強さに負けることのない安価な顕微鏡によって、繰り返しアレーをスキャンする能力のために、はるかに上部にする。
これらの結果が、次のように市販の遺伝子形質発現アレイシステムと比較してあることがありえる：
【表６】

【表４】

【表４のつづき】

【表４のつづき】

【表４のつづき】

【表５】

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａ、ポンド、１ｃ、１ｄおよび１つのｅは、マイクロアレイｓを作るための器具を興行する。
【図２】
図２ａ−ｅは、鋳型定義、繰返し、頼みにならない領域検出およびスポット・ラベリングの全ての段の証拠となる。
ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたスポット（ａｓ’＊と分類される）を区別することは、容易である』、そして、ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたスポットの陰影によってねじれたそれらは、ラベルをつけた？』。
スポットの標識は、起源の影像上の目視によって確かめられる、
そこにおいて、
矢印は、ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたものの影でスポットの分類学的位置を開示する。
図２ａは、ＣｌｏｎＴｅｃｈ相補ＤＮＡアレーの部分の生の影像である。
アレー定量化法はＣｌｏｎＴｅｃｈアトラス相補ＤＮＡ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ａｒｒａｙｓを分析することによって試験された。そして、それは正副二通作成して５８８の相補ＤＮＡ元素点状を含む。
ユーザーマニュアルに続くことはメーカによって規定されて、オートラジオグラフは放射活性ラベリング、アレー・ハイブリダイゼーションおよび水洗の手続きの後、獲得された。
デジタル画像は、グレースケールおよびガンマ補正が使用禁止にした８ビットについては、３００のＤＰＩでオートラジオグラフ直立をスキャンすることによって獲得される。
Ａ　３＊３は、ピクセル平滑フィルタがゴマ塩のノイズを減軽するために行使されたことを射程距離が長い。
初期位置は起源の影像上の格子鋳型にかぶせる。そして、それはＣｌｏｎＴｅｃｈ濾過器の１つの遮断である。
ユーザーは、グラフィカルユーザーインタフェースを経た左のこまて正しい最下段コーナーのスポットの分類学的位置を規定することを必要とする。
方程式（５）および（６）において、パラメータはセットされる；
￣ｐ；
＝１およびｒ＝５０。
図２ｂは、原型鋳型を有する初期のアランメントである。
図２ｃは、変形可能な鋳型の自動機械繰返しによる素晴らしいアランメントである。
図は、２ｄ、数理形態によって検出される頼みにならない領域（イエロー）を興行する。
構造化元素は、理想的なサンプル・スポットと同じ大きさを有する円板に選ばれる。
図２ｅは、スポットの自動機械ラベリングを興行する、頼みにならない領域対応する（『＊’ｏｖｅｒ−急送されたスポット；
『？−陰影によってゆがめられるスポット；
『ｏ．ｐｒｉｍｅ．−垂直線スポット）。
【図３】
図３ａ−３ｄは、繰返し性および信頼性の質的で量的数的表現を興行する。
ハツカネズミ相補ＤＮＡが配列するＣｌｏｎＴｅｃｈアトラスの２つの遮断（転写因子および一般のＤＮＡ結合性タンパク質）は、同じ変形可能な鋳型手段を運用して量を定められた。
画像化条件は、２ａ．、図に記載の同じものである。
２つの独立作働遺伝子は、原型鋳型（図３ａ）の初期位置（左のこまて正しい最下段コーナー）を規定することを必要とする。
各々の作働遺伝子は、１つのサンプル三時間上の同じ手続きを反覆する。
簡潔さのためにスポットの正規化された輝度の［０，０．３３］低豊度が中間の豊度として定義されて、高量−豊度として定義される［０．６７，１］ように［０．３３，０．６７］、定義されてある。
輝度対相対誤差は、低豊度スポットの量を定める際の間違いがｍｅｄｉｕｍ−ａｎｄ高い豊度スポットの量を定める際の高いとわかることを証明する。
輝度対比率の最大の間違いは、低豊度スポットの中の比率の間違いが他のスポット（図３ｂ）より高いとわかることを証明する。
望ましくない正規性の実例は、コントロール・ジーン（図３ｃ）と比較されている２つのサンプルの遺伝子形質発現と比較する。
ラインＬ１は、２つの同一のサンプルの理想的なケースである：
Ｓ１ｉ＝Ｓ２１（ｉ＝１）．．．，Ｎ；
ラインＬ２は、実試料の中心線である；
ラインＬ３は、実コントロールの中心線である。
正規性手続きは、角度Ｓｉ（Ｌ２（Ｌ３））によって、座標空間を回転させるとしてよく理解されていることがありえる。
このように、正規性の信頼性は、角度０（Ｌ１（Ｌ３））およびＢ（Ｌ２（Ｌ３））（３ｄを計算する）によって鑑定されることができる。
より大きい‖角度、より少ない頼りになるもの正規性。
このケース（０（Ｌ１（Ｌ３））＝−２９）の。
３０，
０（Ｌ２（Ｌ３））＝−１４。
５８．
望ましい正規性の実例は、見えられる
図：
０（ｌｕｉ（Ｌ３））＝−０。
９６、Ｓｉ（Ｌ２（Ｌ３））＝２。
１３．
【図４】
図４は、Ｅ−ボックス束縛に関連した遺伝子形質発現の評価のための相補ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションを興行する。
各々のジーンの略記号については、マトリックス分類学的位置は、寄託される同一の総計を有するドットの三反複の各々の遺伝子座の下に書かれる；
Ｘ−座標はナンバー１，２，３，４を記載する、そして、５つの分類学的位置およびＹ−座標はｔｈｅ”ａ”ｔｈｒｏｕｇｈ”ｏ”ｐｏｓｉｔｉｏｎｓを記載する。
各々のジーン・トリプレットのためのマトリックス所在は、それからＸ（Ｙ座標）として識別される。
例えば、５ｋはＮ−Ｍｙｃの分類学的位置を記載する、そして、３ｄはＭａｄの分類学的位置を記載する。
同じ座標は、また、表４に含まれる。
【図５】
図５ａおよびｂは、ヘル細胞のＥ−ボックス束縛に関連した遺伝子形質発現の形質発現プロファイルを興行する。
図５ａ−トータル・リボゾームリボ核酸は、ジーン比プライマを有するＲＴ反作用のジゴキシゲニンによってラベルをつけられた；
図５ｂ−メッセンジャーＲＮＡは、ＲＴ反作用のジゴキシゲニンによってラベルをつけられたオリゴ（ｄＴ）プライマ。
マトリックスの範囲内の矢印は、Ｉ−ヘル・デオキシリボ核酸（正の制御）の分類学的位置を興行する；
ＩＩ−ラムダ・デオキシリボ核酸（陰性対照）；
７７７−ＵＢＣ；
ＩＶ−ＲＰＬ−１３Ａ；
Ｖ−ＭＢＰ−１；
ＶＩ−ＨＰＲＴ１．
ドット間の遠位は、１ｍｍのバールで測定されることができる。
【図６】
図６は、５対の相補ＤＮＡマイクロアレイを有するプライマを有するマルチプレックスＰＣＲの産物のハイブリダイゼーションを興行する。
マトリックスの範囲内の矢印は、以下を示している：
Ｉ−Ｍｒｄｂ；
ＩＩ−ｃ　Ｍｙｃ　ｐ６４；
ＩＩＩ−ＴＦＩＩ−１；
ＩＶ−ＯＤＣ　１；
Ｖ−ｃｄｃ２５Ａ；
ＶＩ−ヘル・ゲノムＤＮＡ。
【図７】
図７はＭｒｄｂ、ｃ−Ｍｙｃ、ＴＦＩＩ−１、ＯＤＣ１およびｃｄｃ２５ａを含む５つのジーンの濃縮間の類縁を興行する、そして、ハイブリダイゼーションの輝度は信号を送る。
対数的近似は、示される。
ドット輝度は、Ｙ軸上の任意のユニットによって表示される；
濃縮は、Ｘ軸上のｎｇ／ｍｌとして測定される。
【図８】
図８ａおよび８ｂは、ヘル細胞（図８ａ）および垂直線ヒトリンパ球（図８ｂ）のＥボックスに関連したジーンの形質発現プロファイルを興行する。
以下の通りのマトリックス印分類学的位置の範囲内の矢印
Ｉ−Ａｌｄｏｌａｓｅ　Ｃ；
７／−Ｍａｄ４；
ＩＩＩ−ＭＢＰ−１。
【図９】
図９ａ、ｂおよびｃは、ヘル細胞およびヒトリンパ球のＥボックス遺伝子形質発現のｐａｉｒｗｉｓｅ比較を表す。
２つの独立ハイブリダイゼーションは、細胞の各々の型のために平均値になる。次元の９ａ−Ｔｈｒｅｅおよび９ｂ−ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌな図（遺伝子形質発現の差の表現）を計算する。
各々のパネルは図８ａの１つのずい柱と一致する、そして、各々のバールは個人のジーンを表示する。
【数１】

一般の利得を有するジーンまたは相対比値上の依存関係の形質発現の減失の９ｃ−Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎを計算する。
サンプルＳ　１およびＳ２間の比率が計算される相対的なひだ
ＤＡ＝？範囲の値を生む最大値（５１、５２）の［−１、＋１］。
正値はアップレギュレーションと一致する、そして、サンプルＳ２のジーンの中で、負の数はダウンレギュレーションと一致する。
相対的なひだ比率はコンベンショナルなひだ比率のそれに類似した意味を有する。但し、次の場合は除く−値は正規化されて、明白な身体的な解読については、相称である。
０．５が二つを正規化して、二倍の上または下−調節と一致する＝がサンプルをとるＲＤＭ（ＳＩ（Ｓ２））；
比較的定常的な発現量の一組のハウスキーピング遺伝子はコントロールとして選択された、そして、線形正規性は行使された。
図１は、(Background of the Invention)
The United States Government has rights in the invention under grant ROlAG09278 from Euglena Wang and from the United States Institute of Aging from the U.S. Department of Defense Advanced Research Projects Agency.
E. FIG. S.W. United States Department of Defense.
The present invention is, for example, a means for detecting qualitative as well as quantitative levels of gene expression in a microarray of combinatorial libraries.
Microarray techniques provide biologists with a phylogenetic method of identifying deoxyribonucleic acid and ribosomal ribonucleic acid mutations.
Until then, recently, the only tools available to scientists were Northern blot analysis, RNase recovery or RT-PCR to analyze differential expression.
These techniques are limited to use with a few genes at a time.
In contrast, microarray technology simultaneously defines a means of generating a huge number of global views of gene expression. And has attracted great interest, both molecular biology research, and clinical symptoms, both of which have become standard tools.
As the first step in phenotyping profiling experiments, the analysis and quantification of array images will have a significant impact on the accuracy of the following data mining and exploration.
Microarrays generally consist of discrete sites nanomolar (less than picograms) coated with Express Sequence Tags ("ESTs") (partial gene sequences) on large amounts of individual genes, complementary DNA or substrates such as nitrocellulose or silicon. Or a glass substrate was prepared by photolithography.
Microarrays containing nearly 1000 ESTs are commercially available from Affymatrix.
For half the number of Affymatrix ESTs, Clontech sells an array of nearly genespecific complementary DNA fragments. It is designed for a specific research area (eg, tumor research or broad application).
Once counterfeited, the array hybridizes to a complementary DNA probe operating a standard procedure with gene-specific primer mixing.
A nucleic acid that is analyzed-the target-is insulated (expanded and generally labeled with a fluorescent reporter group, a radiolabel or a phosphorus-labeled probe).
After the hybridization reaction is completed, the array is inserted into the scanner,
Where
The pattern of hybridization is detected.
Hybridization data is collected as light microscopy emanating from reporter groups already incorporated into the target. And it is now tied to the array probe.
Generally, probes that perfectly match the target will produce a stronger signal than those that have a mismatch.
Since the sequence and taxonomic position of each probe on the array is known, the complementarity can determine the identity of the target nucleic acid applied to the arrayed probe.
There are various signs that operate. Complementary DNA and ESTs can be detected by autoradiography or can be phosphorimaging (32p).
Fluorescent dyes are also operated and commercially available from suppliers (eg, Clontech).
The mapping and sequencing phase of the human genome analysis project is well ahead of the schedule.
So far, eukaryotic S. aureus. cerevisiae and C.I. Taking into account elegans, the complete genome sequence of 17 model organisms is over.
The complete human genome sequence will be available this year.
However, among the genes already sequenced, almost 20% of the function of only 53,000 human genes or 25% of 6,200 yeast open reading frames are known.
The next phase of the Human Genome Analysis Program deals with discriminating about the 80% remaining function of Gene.
The main way to train a new gene's function is by determining its pattern of expression-when.
Where
And how strong it is dispatched.
Techniques currently implemented to study gene expression levels include Northern blots from complementary DNA libraries (Alwine, et al., Natl Acad. Scientific USA 74, 5350-5354 (1977)), RT-PCR (Martorana, et al.). BioTechniques 27, 136-144 (1999), City of London, and other bulletins National Academy of Sciences USA 95, 334-339 (1998)), Differential Display (both and Pardee Science 257, 967-971 (1992)), Deoxyribonucleic acid sequencing Count Thing (Okubo (K. et al. NatureGenet).
2,173-179 (1992)) and tandem analysis of the gene expression-SAGE (Velculescu (VE et al. Cell 88, 243-251 (1997))).
All of these methods except SAGE can process only a few dozens or hundreds of samples at a time.
The provision in which in the near future must be received (tens of thousands of genes under conjugated product conditions and the expression pattern of conjugated product organisms), such as complementary DNA or oligonucleotide microarrays It is powerful enough to vote for this challenge, noting the huge volume of information that only high-throughput means seem to bequest.
Complementary DNA microarrays have already been successfully implemented in a number of cases,
The above accounts for:
light-and dark grown A. thaliana seedlings (Desprez (et al., Plant 14, 643-652 (1998))), heat shock and phorbol respond to serum stimulatory effects (Iyer (VR et al., Science 283, 83-87 (1999))). , Human T cells (Shena, et al., Natl Acad. Scientific USA 93, 10614-10619 (1996)), young and old mice (Lee (Science 285, 1390-1393 (1999))), and genetic characteristics of human fibroblasts. The gene for the time of expression program was sterregulated.
Many perspectives on microarray implementations have recently been reviewed in a special issue of Nature Genetics 21 (suppl.).
(1999).
Heretofore, in most cases, complementary DNA arrays were printed on glass slides.
Glass as a support has many effects;
It is a durable, non-porous material with low inherent fluorescence.
Otherwise, the loading of each dot of the microarray on the glass is low on the nylon membrane.
As a result, with microarrays on glass it is necessary to operate very high enrichment of fluorescentially labeled probes, typically 50-200, pg, each hybridization (Dagan, et al.) Nature Genetics 21, suppl., 10-14 (1999)) for total ribosome ribonucleic acid or several pg of messenger RNA per array.
Such quantities of ribosomal ribonucleic acid are usually not available, and this case regulates possible complementary DNA microarray implementations.
Another problem with complementary DNA exposing microarrays is that the complementary DNA library (Gerhold et al.) Since clone inserts can be of very different lengths (0.3-3.0 kb) and GC content. This means that the PCR product extracted from the clone insert of TIBS 24, 168-173 (1999)) is probably a negative optimal hybridization probe.
Therefore, it has a conjugated difference product melting temperature.
This means that the efficiency of hybridization of the conjugated differential product probes of the microarray s under hybridization matters, can vary considerably. Then, a trait expression profile dependent on experimental conditions is created.
Finally, if the complementary DNA target for hybridization on an array on glass is labeled fluorescently, this method is one test (Cheng, et al. Nature Genetics 21, suppl., 15-19 (1999)). The sensitivity of the fluorescent probe is less than that of the radioactive enzyme-bound probe while allowing direct comparison between the control and assay samples.
Fluorescent probes can also bleach it to make it impossible to rescan during analysis;
And last but not least, the price of laser scanners and other equipment needed to analyze the fluorescent still remains too high due to the wider implementation of complementary DNA microarrays. .
Microarrays define a simple and comprehensive way to simultaneously describe the huge number of genes.
While arranging the preparation techniques, the Nature Genet has recently reached, as reported by Cheung, et al.
21, 15-19 (1999), and Brown and Botstein Nature Genet. 21, 33-37 (1999), a technique for quantifying and analyzing sequence data is a developing stage still.
As noted above, the array has generally found a wide range of applications (eg, normal biologicals and disease processes being studied and profiling differential gene expression).
Analysis of the sequence data has therefore attracted considerable research interest.
As the first step in phenotyping profiling experiments, the analysis and quantification of array images will have a significant impact on the accuracy of the following data mining and exploration.
However, despite the high volume, it is costly in commercial packages (Bowell (Nature Genet)).
21, 25-32 (1999)), a procedure for quantifying and analyzing time-consuming and boring residues.
Some commercial packages operate on rigid template grids to extract and express gene traits and require up to one pixel precision in overlaying the template.
A single comparison between two arrays may consider some time a new user.
In addition, most commercial software packages rely on human operators to not only align the array, but also to assess the reliability of the results.
Furthermore, all currently available systems for the detection of gene phenotype have disadvantages.
Bleeding due to the presence of a specific gene or excessive expression is a problem with some commercially available filters, releasing from one spot to an adjacent spot. And obscure the results for adjacent spots.
The fluorescent label is weakened. As a result, permanent records must be manufactured by alternative techniques.
The detection sensitivity is low.
These problems were minimized by operating more specific primer mixing.
Complementary DNA probes generated by random priming disperse isotropic labels in almost all ribosomal ribonucleic acid species.
Many in which the labeled species shares or traverses only nonspecific background hybridization hybridizes to many different complementary DNA fragments.
The proportion of labels that are sequence complementary to the gene displayed in the array is minimal.
The label is an oligo (dT) primer that can be concentrated on the operating poly A + ribosome ribonucleic acid.
However, since most cells contain messenger RNA from thousands of genes at any given time, the probes will consist primarily of sequences that are not displayed in an array that can contribute to unwanted cross-reactivity.
Selection of probes that exclude consensus sequences will help.
Another approach related to these problems is to reduce the number of genes on the array.
Yet another method is to exercise multiple samples for each array. As a result, the results can be averaged, and abnormal results were immediately considered identical.
However, none of these techniques has eliminated the problem of analyzing microarrays.
The need for perceptible, accurate, reproducible means for the analysis of microarrays of genes and ESTs remains.
There is also a need for quantitative detection (not just qualitative detection).
Therefore, the object of the present invention is to:
Precise detection of microarrays of large amounts of genes, complementary DNAs or ESTs defines means and materials for gene expression.
A further object of the invention is to:
Means and materials are provided for quantified expression as well as for detection of the gene in microarrays.
Another object of the invention is to:
A nonradioactive non-fluorescent assay for gene expression is defined for microarrays, Northern blots, Southern blots or other techniques that employ deoxyribonucleic acid hybridization.
(Summary of the Invention)
Means include the detection of gene phenotypes or the detection of very closely located spots, for example, as a library of very small numbers of combinations and unpleasant situations where strong reactions can spill into adjacent spots. Developed for hybridization of microarrays
Therefore, the accuracy of the reaction of the adjacent part is unclear.
The assay operates a digoxigenin enzyme assay for detection.
Examples are evidence of the utility of enzyme detection systems.
Transcriptionally regulated profiles of E-box-related gene ratios for a given cultured cell sample were determined solely by digoxigenin (DIG) labeled complementary DNA produced from ribosomal ribonucleic acid isolated from the culture of interest. Was.
This specific enzyme labeling probe allows the final result of detecting the hybridization reaction brightness by colorimetric evaluation of the alkaline phosphatase-bound antibody to DIG.
Enzyme dumps on each locus of the E-box microarray were analyzed immediately by an upright microscope connected to a CCD camera without the long delay problem required for exposure times with radioactive probes. Or the problem of photobleaching and high background reaction was collaborated by the fluorescent probe method.
The enzymatic method provides a custom-adapted, user-friendly designer method to review the work to analyze subgroups of gene expression regulated by the same molecular modality.
The assay is very perceptible. It allows detection of as little as 0.02 nanograms.
Means for increasing the reliability of expression analysis.
Deoxyribonucleic acids in microarray format have also been developed. Then, software analysis for normalizing the spot was operated.
This process operates on deformable mold techniques to automatically size large amounts of sequence data, despite possible gap distortions in the array.
Each nodule of the deformable template displays a gene spot, and the repetition following the slope descent is determined. And it minimizes the energy function combining the data mismatch energy and the template deformation energy.
The utility of a normality tool for analysis has provided evidence in learning to identify the family of mice in the murine liver where transcript levels are revised with age.
Commercially available complementary DNA microarrays were used to analyze more live messenger RNA levels from aged C57BL / 6 male mice versus young.
Hybridization of RT-complementary DNA from young and aged mouse livers to mouse 588 genes (ClonTech Atlas Mouse Complementary DNA Expression Array) murine complementary DNA microarrays is a gene whose ratio, activity is critical for tissue function and recovery. It facilitates coordinated, age-associated changes in phenotypic expression of particular families and maintenance of normal physiological conditions.
These genes are components that account for tumor suppressors, cell cycle regulators and various stress responses and signaling pathways.
For messenger RNA levels ranging from very high to very low abundance, 32P-labeled ssRT-complementary DNA served as a probe for the microarray hybridization assay. The process described herein has been evidenced to produce upper bound results.
(Apparatus for producing microarray)
Two methodologies have been developed to increase the resolution and sensitivity of microarray analysis for gene detection.
The first is a chromophore detection assay that facilitates the determination of the sum of microarray s, Northern blots, Southern blots and other techniques for the determination of deoxyribonucleic acid hybridization;
Seconds is a reliable and reliable method for analyzing over-the-counter arrays operating a deformable template to extract expression spots of the array. And it can automatically identify unreliable phenotypes.
This automated repetition reduces human error in quantification for large extents and optimizes processing time when comparing to array 10-folds compared to existing packages.
1a-1e show an instrument for forming microarrays s of biological material. In FIG. 1 shown, and 1b, the base of the instrument is a vibration isolation table 1.
The platform 14 is mounted on the table 1 by means of a first horizontal linear guide 2.
The platform 14 is connected via a carriage (not shown) to a drive mechanism (not shown), such as the lead screw of the guide 2.
The horizontal linear guide 2 carries a computer-controlled motor 5a connected to the drive mechanism. It then carries out the movement of the platform 14 back and forth along the first linear guide 2.
The motor 5a is linked to the computer 13 via the amplification factor 15 and the bowel control panel 28.
The platform 14 is designed to detain a removable sample reservoir 11 at a predetermined taxonomic location 18.
As shown in FIG. 1b, the sample reservoir 11 is a 96-well microtiter plate.
Platform 14 also retains a series of substrates 12 that are held in place by suction. It is caused by drawing out the reduced pressure by the holes 21 on the platform below the substrate.
As shown in FIG. 1a, and 1b, on the side of the table, 1 is a vertical line riser 16, with the effect that the horizontal linear guide 3 carrying the seconds is mounted at a substantially right angle above, And straddling the platform 14 and the first alignment leads to 2.
The second horizontal linear guide 3 is for a drive mechanism (not shown) (e.g. a lead screw in a threaded engagement with a carriage (not shown) that can be asserted along the guide 3 by operation of the motor 5b). The controlled motility 5b linkage carries the computer linked to the computer 13 via the amplification factor 16 and the bowel control panel 28.
The third guide 4 is connected by a carriage to the second linear guide 3 such that the third linear guide 4 is substantially perpendicular to the first linear guide 2 and the second linear guide 3. .
By means of the computer-controlled motor 5b, the third linear guide 4 can be asserted back and forth by the carriage along the axis of the second linear guide 3.
A drive mechanism in the third linear range leads to four. e. g. / Lead screw, which is engaged by the carriage and is vertically claimed by a further computer-controlled motor 5c on the third linear guide 4, and any required longitudinal direction within the range of movement Allows to be placed in position.
The calculation control of the amplification factor 17 connected to the bowel control panel 28 is accomplished by the connection of the motor 5a.
The use of linear guide 2, linear guide 3, linear guide 4 and three carriages provides a three-dimensional bowel movement.
From the four sample locations in the sample reservoir 11, all four sample collection needles 8 include four sampling needles 8 that are linearly spaced along the manifold to occasionally allow for synchronous sample pickup. The sampling manifold 9 is connected near the lower end of the third linear guide 4 as shown in FIG. Ic.
The sampling manifold 98 can be asserted between the two taxonomic positions by the activation of an aerated cylinder 10 connected between the sampling manifold 9 and the third linear guide 4.
The sampling manifold 9 is in the "down" position for sample collection and cleaning, as shown in the solid figure Ic.
When the one-third linear guide 4 is repositioned, the sampling manifold is pivoted on the "up" position, as indicated by the refraction line.
The base of the third linear guide 4 has the effect that the inkjets 7 are mounted thereon. The sampling needle 8 is then connected to the piezoelectric inkjets 7 by a microline duct 34 (FIG. 1c).
Each sampling needle 8 is connected via a duct 34 to a micropump 35 and from there to a microvalve 36.
Each microvalve 36 is adjustable 7, or to waste, so that the fluid extracted from the active transporter 35 can be selectively claimed in the corresponding piezoelectric of the ink jet type.
As shown, there are 1b and two weight overflow storage tanks 24,25. Then, with respect to the isolation table 1, it is arranged on the opposite side of the first linear guide 2 behind the platform.
Reservoirs 24, 25 contain a cleaning liquid that can be pumped inside the appliance when required.
As shown in FIG. 1d (this type of overflow provided by the fluid inlet aperture 40 below the overflow reservoirs), which is pumped by the active transporter, the solution is: Attention is drawn from the fluid reservoir 41.
A fluid overflow aperture 42 where the liquid in the overflow reservoir returns to the fluid reservoir 41 is at the top of the overflow reservoir.
The overflow reservoir is further defined by an opening 43 on the top to allow for a basic entry of the sampling needle 8.
Also,
In the weight overflow storage tanks 24, 25, two cleaning boxes 26, 27 (calculating Ib) arranged on the surface on the opposite side of the first linear guide 2 are mounted on the vibration isolating table 1.
As shown in FIG. Ie, each box top is defined by the opening 51, 52 arbitrating the sampling needle 8 and the piezoelectric inkjets 7.
Each box 26, 27 is above the interface between the sampling needle 8 and the piezoelectric inkjets 7 and from a flushing fluid reservoir (not shown) on its inner side for delivery of flushing fluid. It is defined by the nozzle 50.
The lower portion of the box is defined by an outlet port 53 where waste flushing fluid is sucked away into the vacuum trap.
In operation, a number of substrates 12 are placed on a platform 14 and a selected sample is loaded into a sample reservoir 11.
The platform 14 mounted on the first linear guide 2 is declared in a taxonomic position so that the sampling manifold 9 is in place for sample collection.
The sampling manifold 9 is lowered by actuation of the aerated cylinder 10 and the third linear guide 4 is lowered in order to place the sampling needle 8 in the sample reservoir 11.
The quantity of sample placed in the microarray was wound up with the sampling needle 8 via micropumps 35 and delivered by duct 34 to the piezo inkjets 7 and the sampling manifold 9 was cancelled. The piezo inkjets 7 are placed through the substrate 12 and / or the substrate from which the piezo inkjets 7 removes samples and / or air on the sampling needle 8 and the interface outside the piezo inkjets 7.
The entire process can be automated.
Motion control, digital operation, sample processing and micropumping can thus be entirely regulated by the computer running the specialized computer program being designed.
Certain functions, such as fluid recirculation by weight overflow reservoirs, can be performed continuously during operation and do not require computational control.
Various liquid reagents can be dispensed using the described devices.
For example, the liquid can include deoxyribonucleic acid, ribosomal ribonucleic acid, modified nucleic acids and nucleic acid analogs, peptides, antibodies, tests, enzymes or cells.
The device can also dispense an activator or inhibitor fluid.
Activator fluids are those that make possible conjugates to the substrate or are responsible for synthetic reactions with previously deposited reagents.
The inhibitor fluid protects the area on the substrate to shield the area material from reacting.
Piezo inkjets 7 are preferably drop-on-demand printer heads capable of rapidly and accurately extracting small metered sums of liquid.
The total amount of material to be removed depends on the specific use, and may be, for example, 10 to 1000 picoliters (pl), preferably 20 to 100 pl and a plurality of the most preferred 35.
Examples of sample reservoirs include 96-well and 384-well microtiter plates and Eppendorf ™ tubes.
An example of a sample collection device counts a sample collection needle. And it may be made of stainless steel bored tubing and can include syringe tips.
The weight overflow reservoir and cleaning box can be located in any suitable taxonomic location.
micropumps 35 can be activated intermittently or continuously.
The activation of intermittent can be achieved by operating an AC-DC relay under the control of the bowel control panel.
With the provisions for the association and the use of the device, the components of the device can be defined separately for the association.
(Digoxigenin enzyme detection assay)
1a-1e show an instrument for forming microarrays s of biological material. In FIG. 1 shown, and 1b, the base of the instrument is a vibration isolation table 1.
The platform 14 is mounted on the table 1 by means of a first horizontal linear guide 2.
The platform 14 is connected via a carriage (not shown) to a drive mechanism (not shown), such as the lead screw of the guide 2.
The horizontal linear guide 2 carries a computer-controlled motor 5a connected to the drive mechanism. It then carries out the movement of the platform 14 back and forth along the first linear guide 2.
The motor 5a is linked to the computer 13 via the amplification factor 15 and the bowel control panel 28.
The platform 14 is designed to detain a removable sample reservoir 11 at a predetermined taxonomic location 18.
As shown in FIG. 1b, the sample reservoir 11 is a 96-well microtiter plate.
Platform 14 also retains a series of substrates 12 that are held in place by suction. It is caused by drawing out the reduced pressure by the holes 21 on the platform below the substrate.
As shown in FIG. 1a, and 1b, on the side of the table, 1 is a vertical line riser 6, with the effect that a horizontal linear guide 3 carrying the seconds is mounted substantially perpendicularly above, And straddling the platform 14 and the first alignment leads to 2.
The second horizontal linear guide 3 is for a drive mechanism (not shown) (e.g. a lead screw in a threaded engagement with a carriage (not shown) that can be asserted along the guide 3 by operation of the motor 5b). The controlled motility 5b linkage carries the computer linked to the computer 13 via the amplification factor 16 and the bowel control panel 28.
The third guide 4 is connected by a carriage to the second linear guide 3 such that the third linear guide 4 is substantially perpendicular to the first linear guide 2 and the second linear guide 3. .
By means of the computer-controlled motor 5b, the third linear guide 4 can be asserted back and forth by the carriage along the axis of the second linear guide 3.
A drive mechanism in the third linear range leads to four. e. g. / Lead screw, which is engaged by the carriage and is vertically claimed by a further computer-controlled motor 5c on the third linear guide 4, and any required longitudinal direction within the range of movement Allows to be placed in position.
The calculation control of the amplification factor 17 connected to the bowel control panel 28 is accomplished by the connection of the motor 5a.
The use of linear guide 2, linear guide 3, linear guide 4 and three carriages provides a three-dimensional bowel movement.
From the four sample locations in the sample reservoir 11, all four sample collection needles 8 include four sampling needles 8 that are linearly spaced along the manifold to occasionally allow for synchronous sample pickup. The sampling manifold 9 is connected near the lower end of the third linear guide 4 as shown in FIG. Ic.
The sampling manifold 98 can be asserted between the two taxonomic positions by the activation of an aerated cylinder 10 connected between the sampling manifold 9 and the third linear guide 4.
The sampling manifold 9 is in the "down" position for sample collection and cleaning, as shown in the solid figure Ic.
When the one-third linear guide 4 is repositioned, the sampling manifold is pivoted on the "up" position, as indicated by the refraction line.
The base of the third linear guide 4 has the effect that the inkjets 7 are mounted thereon. The sampling needle 8 is then connected to the piezoelectric inkjets 7 by a microline duct 34 (FIG. 1c).
Each sampling needle 8 is connected via a duct 34 to a micropump 35 and from there to a microvalve 36.
Each microvalve 36 is adjustable 7, or to waste, so that the fluid extracted from the active transporter 35 can be selectively claimed in the corresponding piezoelectric of the ink jet type.
As shown, there are 1b and two weight overflow storage tanks 24,25. Then, with respect to the isolation table 1, it is arranged on the opposite side of the first linear guide 2 behind the platform.
Reservoirs 24, 25 contain a cleaning liquid that can be pumped inside the appliance when required.
As shown in FIG. 1d (this type of overflow provided by the fluid inlet aperture 40 below the overflow reservoirs), which is pumped by the active transporter, the solution is: Attention is drawn from the fluid reservoir 41.
A fluid overflow aperture 42 where the liquid in the overflow reservoir returns to the fluid reservoir 41 is at the top of the overflow reservoir.
The overflow reservoir is further defined by an opening 43 on the top to allow for a basic entry of the sampling needle 8.
Also,
In the weight overflow storage tanks 24, 25, two cleaning boxes 26, 27 (calculating Ib) arranged on the surface on the opposite side of the first linear guide 2 are mounted on the vibration isolating table 1.
As shown in FIG. Ie, each box top is defined by the opening 51, 52 arbitrating the sampling needle 8 and the piezoelectric inkjets 7, respectively.
Each box 26, 27 is above the interface between the sampling needle 8 and the piezoelectric inkjets 7 and from a flushing fluid reservoir (not shown) on its inner side for delivery of flushing fluid. It is defined by the nozzle 50.
The lower portion of the box is defined by an outlet port 53 where waste flushing fluid is sucked away into the vacuum trap.
In operation, a number of substrates 12 are placed on a platform 14 and a selected sample is loaded into a sample reservoir 11.
The platform 14 mounted on the first linear guide 2 is declared in a taxonomic position so that the sampling manifold 9 is in place for sample collection.
The sampling manifold 9 is lowered by actuation of the aerated cylinder 10 and the third linear guide 4 is lowered in order to place the sampling needle 8 in the sample reservoir 11.
The quantity of sample placed in the microarray was wound up with the sampling needle 8 via micropumps 35 and delivered by duct 34 to the piezo inkjets 7 and the sampling manifold 9 was cancelled. The piezo inkjets 7 are placed through the substrate 12 and / or the substrate from which the piezo inkjets 7 removes samples and / or air on the sampling needle 8 and the interface outside the piezo inkjets 7.
The entire process can be automated.
Motion control, digital operation, sample processing and micropumping can thus be entirely regulated by the computer running the specialized computer program being designed.
Certain functions, such as fluid recirculation by weight overflow reservoirs, can be performed continuously during operation and do not require computational control.
Various liquid reagents can be dispensed using the described devices.
For example, the liquid can include deoxyribonucleic acid, ribosomal ribonucleic acid, modified nucleic acids and nucleic acid analogs, peptides, antibodies, tests, enzymes or cells.
The device can also dispense an activator or inhibitor fluid.
Activator fluids are those that make possible conjugates to the substrate or are responsible for synthetic reactions with previously deposited reagents.
The inhibitor fluid protects the area on the substrate to shield the area material from reacting.
Piezo inkjets 7 are preferably drop-on-demand printer heads capable of rapidly and accurately extracting small metered sums of liquid.
The total amount of material to be removed depends on the specific use, and may be, for example, 10 to 1000 picoliters (pl), preferably 20 to 100 pl and a plurality of the most preferred 35.
Examples of sample reservoirs include 96-well and 384-well microtiter plates and Eppendorf ™ tubes.
An example of a sample collection device counts a sample collection needle. And it may be made of stainless steel bored tubing and can include syringe tips.
The weight overflow reservoir and cleaning box can be located in any suitable taxonomic location.
micropumps 35 can be activated intermittently or continuously.
The activation of intermittent can be achieved by operating an AC-DC relay under the control of the bowel control panel.
With the provisions for the association and the use of the device, the components of the device can be defined separately for the association.
(Extraction of gene expression from array image)
As evidenced in Example 2, a highly perceptually accurate means for visualizing the extent of hybridization between nucleic acid molecules has been developed.
The assay is based on a nucleic acid molecule having a subsequent incubation with the opposite digoxigenin antibody complex with an enzyme (eg, alkaline phosphatase (AP) and colorimetric or chemiluminescent detection) at the target (eg, complementation generated from a gene-specific primer). Digoxigenin (DIG) serves to label DNA).
Means count the following steps:
Labeling nucleic acid molecules (generally complementary DNA)
Hybridizing labeled molecules,
Cultivate hybridized material with staining for the development of enzyme-conjugated anti-digoxigenin antibody, generally alkaline phosphatase, upper and lower bound enzymes, and wash uncrossed material with water
And
Scrutiny for data collection.
This procedure requires up to two days and is resistant and can detect samples of 4 micrograms or less.
The assay can be used to detect as little as 0.02 nanograms of nucleic acid.
This means starting material;
i. e. , Deoxyribonucleic acid or ribosomal ribonucleic acid isolated from the targeted tissue can be as little as 1-2 micrograms.
Starting materials can be labeled by digoxigen means, and the labeled nucleic acids operated for hybridization with microarrays.
The means currently operated by both Affymatrix and ClonTech require operating messenger RNA as a starting material, which is difficult to obtain. And it requires at least 100-1,000 micrograms of total ribosome ribonucleic acid.
This is in contrast to the total 1-2 micrograms ribosomal ribonucleic acid required for a nanogram of 0.02 that can be detected by the assays described herein.
The assay operates on an enzyme that is capable of cleaving a chromogen, chemiluminescent, or colorimetric substrate.
In a preferred embodiment, the enzyme is alkaline phosphatase and the substrate is Disodium 3- (4-methoxyspiro decan 1,2-dioxetane-3,2.prime .- (5.prime.-chlor) tricyclo. [3.3.1.1] {4-yl) phenyl phosphate-CSPD.
In a preferred embodiment, following antibody incubation, the reacted substrate is 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate, toluidine salt (BCIP) and nitro blue tetrazolium chloride (BC) in the detection buffer. NBT).
(Data mismatch energy)
In an ideal array image, gene expression is displayed as equally spaced spots of the same size.
However, spots can be moved from their ideal taxonomic locations due to membrane warping caused by random perturbations or unwanted temperatures in imprinting the spots.
A single grid template is not enough to extract gene expression.
To overcome the diversity of these spots, for shape-various functions, deformable molds were developed to keep information on the strain of the gene spot.
An active shape model (Cootes et al., Image Underunderstanding Computer Vision and 61, 38-59 (1995);
Ostu (N. IEEE trans. On system.)
Humanity and Cybern.
8, 62-66 (1978);
And Adryan, et al., BioTech.
26, 1174-1179 (1999)) and a deformable template {(Serra, J. Image Analysis and Mathematical Morphology, Academic Press, London, 1982; Haralick (Patt. Et al., IEEE Trans.)).
anus.
Mach.
Intel.
9, 532-550 (1987);
Ostu (N. IEEE trans. On system.)
Humanity and Cybern.
8, 62-66 (of 1978)) active'snake 'model. Developing to determine the position of twisted objects by detecting by incorporating conventional information about the shape of the object required for development
Typically, deformable template matching techniques integrate modeldriven and data-driven analysis with energy functions and a set of regularization parameters.
Two coefficients are taken into account:
Data mismatch and mold displacement.
Usually, a criterion function is defined to determine the amount of these two coefficients:
1 measures the order in which the input pattern is deformed and many of the molds that are different from others are deformed.
In matching templates or taxonomy applications, optimal matching is achieved by minimizing the weighted sum of these two criteria.
The weighting factor is called a regularization parameter. And it defines the trade-off between mold displacement and data mismatch.
(Template expression)
The raw image is scanned as described in the illustration
ClonTech complementary DNA mouse array.
Each sample spot in the three-dimensional view of the array's input image corresponds to a density level space minimum.
The following model operates to extract relevant information from it.
The array of gene samples is displayed as a set of N-circle spots of the same size.
Each spot is a circle represented by S (C (P (r)) (1)). Where C (P (r)) and, for radius r, are circles centered at Euclidean equivalent P = (x (y)).
The spot brightness is the average value I of the pixel brightness inside the circle.
The radius of the microarray spot can be determined and determined by the printing and imaging conditions and set as a constant over the entire array.
Thus, the prototype template is based on prior knowledge of the array of attributes. And it can be set as a grid of uniformly spaced circles around the array. The objective lens operating the deformable mold is to qualify the centering convenience of all spots for data mismatch and mold displacement coefficient.
(Data mismatch energy)
The data mismatch energy measures the adaptation value of the malformed template to the input pattern.
Since the input image is at the density level and the gene expression is represented by the integrated brightness of the localized area, the data mismatch energy can be defined in terms of the integrated brightness:
(Equation 2)

[Equation 3]

(Equation 4)

Casting potential function,
At each spot, the data mismatch energy is simplified to:
Where (pi is the weight of the i-th node and r is the predetermined radius for the sample spot.
The potential function is the incorporation of gray level values over a local area. And it has a smoothing function.
Experimental results show that the determinant perturbations and noise are robust.
(Template deformation energy)
The mold deformation energy measures the deviation of the deformed mold from the original mold.
An incident occurs because the template displacement relative to translation is deflected in the membrane.
In order to determine the amount of displacement order, the deformation energy for each spot is defined as its distal from the predefined position Pjo to the Euclidean of the malformed control node Pj:
Haas, ai is the flexibility of the ith node.
Minimizing mold deformation energy helps prevent nodules from being attracted by local background perturbations and noise,
It thus revises the robustness of the proposed Arabic number system.
With relaxation Combining template displacement and data mismatch energies, l can define the overall energy function as:
(Equation 5)

(Relaxation)
E = aE (+ E2);
Certain regularization parameters.
(4)
The localization procedure of the sample spot is consistent with the overall energy minimization. The minimality of this feature is gained by operating global optimization techniques at the expense of still excessive computing such as dynamic programming, greedy search Arabic notation, neural networks, and more be able to.
Since each spot in the array is imprinted at a predefined position, it is assumed that the gene spot is charged in a regular array. To that end, the initial position can be chosen by a predetermined site according to the number of the locus of all the matrices.
It is also assumed that the prototype array mold can be a well placed close to the input array.
Thus, the array spot can be localized by identifying a local minimum around the initial grid.
This can be translated by the deterministic slope descenttechnique:
i = 1,2 (...) N, and? Learning is speed.
In an isotope array, the flexibility and weight of each spot is the same set.
The taxonomic position of the target centering minimizes the energy defined by regression (4), which can be translated as a set of nodules on a rubber band;
The taxonomic location of the nodules tends to be attracted to the bottom of the energy field minimum.
To limit the movement of the nodule and avoid adjusting the optimal value for the learning speed, the nodule is, according to the signs of Ax and Ay, one unit claimed for each repetition.
The 3 * 3 outlying pixels that are smoothed out are filtered to extract the gene expression from one function group of the Atlas complementary DNA array, for example (Ekstrom (MP Digital Image)
(Techniques, Academic Press, London, 1984). Exercise to reduce sesame salt noise.
The membrane deflects during the hybridization and washing procedures. As a result, it is not possible to certify a perfect match between the membranes under inspection and a given grid mold.
However, after less than 5 repetitions, all nodules of the deformable mold are in stable taxonomic positions. And it minimizes the overall energy function defined by (4).
Visual inspection confirms a good match between the deformed grid template and the gene spot.
(Equation 6)

(Detection of unreliable area)
In array hybridization, some strong signals are observed in autoradiographs (colleded 'bleeding' spots).
These over-expressed signals cause problems with quantification of the gene as well as itself in their vicinity.
Most commercial packages for analyzing sequence data require the user to visually match bleeding genes and their vicinity, or simply dismiss the presence of these spots.
Failure to detect overexpressed spots can lead to a lawyer with false results when comparing two gene expression profiles.
The objective of the method described herein is to automatically identify the bleeding area and alert the user to potential errors in the quantification result.
In this way, the user is freed from a boring and subjective assessment of the area containing their membrane problems.
The following basic assumptions have been made for spots in the attribute array:
Spots are mutually exclusive.
The change in luminance within each spot has a specific range.
Each spot is a connected component having a limited size.
Thus, the identification of over-expressed spots can be simplified as filtering spots larger than a predetermined size.
Based on shape, mathematical forms have been widely used to define efficient ways of processing digital images and to solve image processing problems that were difficult to solve with linear filters.
Used properly, mathematical morphological operations tend to simplify image data by:
Maintaining their crucial shape traits,
And
Remove inappropriateness.
The basic mathematical morphological operations are erosion and enlargement.
Opening and closing are defined based on the composition of erosion and expansion.
Since the case of the binary image caused A to be a point set displaying the binary image of origin and the binary'on 'pixels of B, the point set displaying the binary'on' pixels of the structuring element is there.
The basic morphological operations are defined below:
Enlargement of binary image A by binary structuring element B, A &comm; B = {b + alforsomebEBandaEA} the two Erosions image A Binary structuring element B (Opening in binary image A by binary structuring element B A @ B = {plb + pEAforeevebEB}) A = (AE) B) E) B
Closing binary image A with binary structuring element B,
oB = (G) B) @ B
Differentiating over-expressed normally dispatched spots, disc structuring elements, found from C, the size is the upper limit of spots on the array being trained, selected.
C = {l X2 + y2 <(X (y)) Ruz},
Where
R is the maximum radius of the ideal spot.
The procedure for identifying the over-expressed spots can be described <#s> followed:
Binarizetheinputimage F = {f (x, y) 0 # x <M, 0 # y <N @ byStep1. The world is thresholding means such as Ostu (Ostu (NA IEEE Trans. On system.)).
Humanity and Cybern.
8, 62-66 (1978) based on optimal discriminant analysis:
{G (x, y) 0 # x <M, 0 # y <N}, G = g (x, y) = 1 If ￣ (x, y)> T, T is the optimal limit step 2 of Ostu is there.
Filter normal size spots by morphological opening with structuring element C:
G. FIG. prime. = GoC = {g. prime. ()｝ (8) Thus, the unreliable areas are displayed as a set:
UR = ｛(x, y) # g. prime.
(X (y)) = 1, (x (y)) EF｝ (9) Step 3.
In the case of (xs (yj)) E UR, the control node Pi = (xj (yj)) is identified as an over-expressed spot.
In fact, the quantification problem does not exist in the over-expressed spots in their vicinity, but also in those spots alone.
During the iteration of locating the real taxonomic position of the spots, some control nodes are rapidly attracted to the spots because an over-expressed low data mismatch energy field is formed around these spots.
In this system, gene expression spots are labeled if the corresponding control node claims far away from its initial position, so that it is unreliable.
Target measurement
Assuming that the sum of the fluorescence or radioactivity emitted from each spot of the quantitative analysis with the microarray s is representative of the sum of the labeled nucleic acid probes associated with that spot (AtlasTm CDNA Expression Arrays) User Manual (Protocol &num; PT3140-1) Version &num; PR91208 (pp7-9, 1998)).
The brightness of each spot displayed in the 3D plot indicates that the assumption of a hemispherical shape for the sample spot is not sufficient for quantification purposes.
The following built-in functions are used to determine the volume of each spot:
In isolated images, the embeddings are reassigned by addition and operate on the area of the circle to normalize the volume:
Which Pils were obtained from a deformable template whose target nodule was consistent with the repetition.
The normalized volume is a real value within the range [0 (ImaX)],
Where
ImaX is the upper limit of the pixel value.
For 8-bit and 16-bit grayscale images, Imay is equal to 255 and 65535, respectively.
Performance test:
Automatic machine processing versus manual operation
The system was trained on 24 sub-images from two ClonTech filters. The training phase accounts for the selection of the optimal regularization parameters of the definition of energy.
The system was tested on 17 ClonTech filters into 204 subimages, and 50 bio-tipped microarray images imprinted in-house.
The test results show that the proposed model can satisfactorily extract spots. Then they are mutually exclusive.
However, some spots are attracted by the over-expressed and thus cause distortion in the quantification procedure.
Despite the system being able to identify these false spots automatically, the last solution requires refinement of the design of optimal probes and experimental conditions.
Table 1 shows a list of comparisons among the three systems in analyzing Atlas Arrays including AtlasImage ™ 1.0 released by ClonTech (http://www.clontech.com), developed by Johannes Gutenberg University and ArrayAnalyzer. EstBlot (Adryan, et al., BioTech 26, 1174-1179 (1999)) developed in our laboratory.
Compared to existing systems, our system runs some time faster.
System error is measured by repeating an array of six time quantification procedures.
Two coefficients are taken into account when assessing the system:
Mean error
And Maximal mistake
Whatever the pi and ci, the average and standard deviation in measuring the i-th spot in several repeat.
Table 2 lists a comparison of the two systems on both ClonTech filters, and the microarrays imprinted in-house, and it is clear that the systems described herein outperform existing systems. It is.
The following aspects of the comparison procedure in which two samples are compared to determine the amount of system error involved in the proposed array image analysis method and are analyzed:
Incorrect quantification, incorrect ratio and incorrect normality.
The relative error of quantification is defined as o-i lui,
Where
ci and pi are the standard deviation and the mean of the i-th spot in the six independent tests.
To compare gene expression in two samples, we define a relative fold ratio instead of a conventional fold ratio.
The relative fold ratio for sample S (and S2) is (S2-S1) isavaluintherange [calculated as -1 + 1];
The positiveRRF (S1, S2) =, while max (S1, S2) values disclose an increasing mechanism, and for S2, negative numbers disclose down regulation from S.
Relative pleat ratios are conventional but have a similar meaning. However, except in the following cases, the value is normalized and is easy to discern.
For example, RRI:
= -0.5 is consistent with up or down-regulation twice.
Gene abundance and affinity between the highest error means of ratio comparison.
Assuming a gene with normalized abundance [0,0.33] 67], (0.67,1) as low, middle and high abundance, the maximum error in the ratio for each category is 1 0.89%, 4.89% and 14.54%, respectively.
It is clear that the proportion in the low abundance gene is more affected by the initial position of the quantification prototype template.
Thus, the system is more reliable in handling medium-and high abundance spots.
Table 3 shows a list of analogies between spots and the assessment of the automaticity of quantitative errors (reliability indicators).
Quantitative learning automatically identifies it to confirm it {unreliable'loci is more disadvantageous than the other two categories.
In fact, the percentage of 'unreliable' spots can be used as an indicator of the quality of the hybridization procedure.
ArrayAnalyzer automates most quantification and comparison functions. It separately processes the conjugated difference product functions of the Atlas complementary DNA array,
Thus, it allows the system to be immediately generalized to processing all types of arrays.
On the other hand, ArrayAnalyzer is robust against mutations among conjugated difference product users.
Spot quantification mainly depends on the nature of the input image (rather than the user's subjective judgment).
While most commercial systems rely on human operators to assess the reliability of the results, ArrayAnalyzer automatically identifies the potential over-expressed errors caused by over-expressed spots and their shadow.
One of the only functions of this system is to discard unreliable quantifications and rule out misleading results in advance.
Because of the unique variation in terms of sequence-dependent hybridization trait and any hybridization reactions, atlas data and any other sequence data must only be considered semi-quantitative, Worth a bill refusal proof.
Measuring the levels of ribosomal ribonucleic acid via Northern and / or semi-quantitative RT-PCR means is always necessary to confirm any interesting results of array tests with other assays.
In the weather context, the process defined by the computer program charged here involves some of the sloppy problems inherent in terms of promiscuous microarray design.
In a "divide-and-conquer" fassion, an additional solution is to schedule the microarray of cluster patterns to collect genes according to their endogenous levels of abundance,
Then, arrange them in the template.
The "divide-and-conquer" approach also defines rollability. And allow the tracking of selected clusters of Jean in a focused effort.
Newborn reports indicate that the power of the microarray analysis method determines the gene expression alteration of the gene template from 18,000 to 20,000.
The measures described herein allow detection of areas where most changes occur.
Thorough review and re-examination via other molecular methods (eg, Northern blot analysis and / or semi-quantitative RT-PCR analysis) is then allowed.
In addition, to compare with manual densitometric tracing versus computer automated analysis, the selection area can also be operated for thorough analysis.
Ultimately, the computational work involved in any microarray analysis must document the multigene changes with the greatest reliability and repeatability and the least human error.
This problem can be handled by powerful mathematical modeling and computer programs, but more importantly, when the microarray s is deliberate, it needs to be kept in mind.
Thus, designer biochips "to swarm genes that comply with their level of abundance of biological systems and the use of computerized automation of data analysis, removing the current racial bioinformatics of high-throughput engineering from work. .
(Example 1)
Deformable Template. Comparison of deoxyribonucleic acid from young and old animals operating on
Total ribosome ribonucleic acid is available from Chomcynski and N.C. According to the technique described in Sacchi (Anal Biochem. 162, 156 (1987)), it was isolated from frozen liver by extracting homogenized liver with guanidinium / carbonate solution.
Water soluble
The phase was further extracted (25:
24:
1) Carbonate:
CHC13:
IAA and glycogen were removed by centrifugation.
Ribosomal ribonucleic acid was obtained by ethanol precipitation, quantified by spectroscopy, and empowered by gel electrophoresis.
1.5u. G of high quality Dnase-treated total ribosomal ribonucleic acid runs in [alpha-32P] dATP labeled MMLV reverse transcriptase complementary DNA synthesis using 588 optimized primers (ClonTech) Was done.
Unincorporated 32P-labeled nucleotides were taken from the labeled complementary DNA probe by profiling with Chroma Spin spin columns (ClonTech). And weight elution was operated.
The fraction containing the complementary DNA / ribosomal ribonucleic acid probe was converted to a single arrested complementary DNA at 68 C with 1 M NaOH and the medium was neutralized by 1 M NaH2PO4 [pH 7.0]. Summed up.
The probe was Cot-1 in the presence of one deoxyribonucleic acid, containing 588 PCR gene products, at 68 C for prehybridized (68 C for 30 minutes) ClonTech mouse microarrays. It was a crossover night, and the salmon semen was sheared. Then, an ExpressHyb hybridization solution (ClonTech) was used.
The membrane was pre-warmed and passed through distilled water through X4 with prewarmed 2X SSC (1% SDS) followed by two additional rinses.
IX SSC (0.5% SDS).
The membrane was damp then wrapped in plastic wrap for autoradiography and Phosphorimaging.
In analyzing the ClonTech Atlas murine complementary DNA expression array, autoradiographic skins are scanned at 300 DPI, 8 bit gray scale by a typical commercial flatbed scanner (Saphir Rhinotype-Hell).
Acquired images are enhanced and analyzed by the software package (ArrayAnalyzer). And it is developed in-house.
In order to handle the membrane with regard to unwanted skew, deformable templates are defined to automatically determine the amount of gene expression.
Each nodule of the deformable mold is repeated according to the slope descent rule. And it minimizes the energy function combining the data mismatch energy and the template deformation energy.
An ideal gene spot is given a three-dimensional effect as a circle having a predetermined radius;
Thus, gene expression can be quantified by area intensity. ArrayAnalyzer also allows for identifying "bleeding" regions and thus alerts the user of quantification potential error.
In later analyses, these areas will be carefully matched and excluded from discussion.
Relative pleat ratios were defined instead of conventional pleat ratios to compare with the gene expression of the two samples;
The relative fold ratio between samples reveals that the pairwise comparison is more reliable in media and high abundance genes (taking into account human error in operation).
The experimental results described in the text are based on the average of triplicates on each filter.
In normalizing the two samples, Lambda deoxyribonucleic acid was selected as a negative control, and HPRT, MOD and G3PDH were selected as positive controls.
Linear normality measures are exercised.
Two ClonTech Atlas Arrays Software AtlasImage ™ 1.0 EstBlot ArrayAnalyzer Determines the amount of Trilogy One table One Performance
The minimum of M 15 of the overall alignment 20 (1) M 1 * 9 M sec (2)
Arrangement ￣30 Minimum value M Fine adjustment of 5 minimum M 0.5 * 9 A sec
A 20 sec A Repeat for minimum MN reliability / sec of sample 15 aligns for 1 hour
M 0 A 1.5 * 9 M and A sec to match the minimum A 3 sec A Check of the minimum M 0.5 of background 15
Compare the minimum (plate data) M of the report 10 with the four minimums A I * 6 sec A and the minimum A 0.5 with Customizing A minimum of 0.5 A reports that there is a processing time of AtlasImage ™ 1.0 estimated in the manufacturer's specifications
[Table 1]

(1) (graphic N / A N / A 5 minimum M and A data).
(2) EstBlot and ArrayAnalyzer processing times are tested on 400,384 MB RAM, Pentiumg.
This table, M for manual operation, and'A'refers for automatic machine processing.
The operator '*' in measuring the processing time of the Array Analyzer means a repetition time of the same procedure.
Since ArrayAnalyzer is intentional for over-the-counter medicine,
Table 2 System Error of Quantified Displacement EstBlot ArrayAnalyzer ArrayAnalyzer (3-10 Pixels) Comparison (ClonTech
Housing (ClonTech (microarrays imprinted in the filter) are filtered) German Gentleman (%) 11.49 6.97 0.93 Merr (%) 55.86 33.10 5.01
Two independent acting genes need to define the initial position of the prototype template (the left bottom correct correct bottom corner).
[Table 2]

Two independent acting genes need to define the initial position of the prototype template (the left bottom correct correct bottom corner).
Each agonist repeats the same procedure on one sample for three hours.
During testing, it was observed that the human operator may replace the initial position of the grid template from three up to ten pixels in alignment.
Because of the six repetitions, the two coefficients are N that are taken into account when assessing the system;
The average error is wrong = Avg (#i), and
N #i
Maximum error Merr inwhich mean #eareataveragevalueandMax (i = li standard deviation when measuring the ith spot).
Table of Mistakes for Spots with Conjugated Difference Products The three Comparsons are described in Label No. Total German gentleman ((%) Ii (max (RDM) (Min (RDM))) numbers 98) Labels 0 (vertical line)
[Table 3]

The experimental conditions are the same as described in Table 3.
This table lists the analogies between the evaluation of the automaticity of spots and quantitative errors (confidence indicators).
Two factors are taken into account:
Mean error / lerr = Avg (i) and the average of the highest error of the ratio comparison.
It is automatically i = l i to be able to show it, identifiable 'unreliable' loci is more disadvantageous than the other two categories.
In fact, the percentage of 'unreliable' spots can serve as an indicator of the quality of the hybridization procedure.
(Example 2)
Detection of the digoxigenin enzyme for microarray analysis of the obligatory E-box told gene expression.
In exchange for the advantages and problems of complementary DNA microarrays for expression profiling, the novel method involves targeting the target with alkaline phosphatase (AP) and opposing digoxigenin antibody conjugation with colorimetric or chemiluminescent detection. A subsequent incubation with was developed based on utilizing digoxigenin (DIG) to label the complementary DNA produced from the gene-specific primer.
A set of genes containing the E-box tether (CACGTG), which is located in the promoter region of multiple genes, was selected as a probe.
Presumably, the bestknow representative of the E-box-tethered gene is c-Myc, whose transactivating activity plays a critical role in cell cycle regulation, proliferation and apoptosis (Eilers (M. Mol.)
Cells 9, 1-6 (1999);
Dang (CV mole).
Cell Biol. 19 (1-11 (1999));
Facchini and Pen FASEB Journal 12, 633-651 (1998)).
Genes that interact or direct expression for c-Myc (as well as some target genes whose expression is E-box-tethered) are included in this microarray.
These custom deliberate microarrays (mixed with enzymatic methods for labeled hybridization probes) are inexpensive for high-throughput genes screening assays for specific subgroups of gene expression. Allows user-friendly system development.
Materials and means
As well as c-Myc-regulating, E-box-selection of probes to arraeving binding proteins-interacting and target genes were selected from the conjugated difference product database-GeneAtlas ( http: // www.
citi2. fr / GENATLAS) (GeneCards (http://bioinfo.welzmann.ac.il/card)) GenBank (http://www.ncbi.nkm.nih.gov/web/Genbank/pubMed/pubMed/ .Ncbi.nlm.nih.gov / PubMed).
Unigene (http: //www.ncbi.nlm.
nih. gov / UniGene / index. HTML), cluster number and sequence were used to identify the genes and confirm their uniqueness.
Nine housekeeping genes (as well as healer cell deoxyribonucleic acid) were selected as positive controls;
Lambda deoxyribonucleic acid and 2 × SSC (double-speed standard salt solution-0.3 M NaCI, 30 mM Na citrate, pH 7.0) were chosen as negative controls.
For each gene, a pair of primers was generated with the help of Primer3 software (Rozen and Skaletsky (1998) Primer3.
http: // www-zenome. wi. mit. Available ciphers for
edu / genome software / other / primer3. HTML. ).
In such a way that the melting temperature of the amplicon must be about 80 C, but no more than 88 C, the program parameters are chosen or less than 75 C, and the length of the amplicon is generally higher than that of the primer 23. Bp. For about 60C primer annealing temperature and average length was about 450 bp (with a few outlyers between 300 and 700 bp).
All amplicon sequences are proprietary software (BLASTN (FASTA)) (to avoid homology with repetitive elements and other related sequences and to further distinguish between genes from the same family). The operation was carefully confirmed. A full list of all selected genes is displayed in Table 4.
DNA. Ribosomal ribonucleic acid and messenger RNA isolation total ribosomal ribonucleic acid, and deoxyribonucleic acid is isolated from fresh blood aliquots running Trizol reagent (Gibco BRL, Burlington, ON), nearly 10 eight herocytes. It was isolated from cultured and human peripheral lymphocytes.
Deoxyribonucleic acid and ribosomal ribonucleic acid enrichment and quality, respectively, were determined by spectrophotometric and gel electrophoresis analysis of 0.8 or 2% agarose gels.
Poly (A) + RNA was isolated from total ribosome ribonucleic acid running a 150 pg Oligotex messenger RNA kit (Qiagen, Mississauga, ON). Then, it conformed to the manufacturer's regulations.
J. of total ribosomal ribonucleic acid probe 10 Amplification and purification of g was reversed-a duplicate of the 40ni reaction using 200 U of MMLV (Gibco BRL, Burlington, ON) consistent with the manufacturer's specifications.
In the GeneAmp PCR system 9700 (PE applied Biosystems, Norwalk, CT), two PCR reactions for each pair of primers were managed in a total volume of 100 ul.
Each 50 pl reaction (10 mM Tris-HCI, 8.6, 50 mM pH KCI, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM each dNTP, 20 pM of each primer, Taq DNA polymerase (Amersham-Pharmacia Biotech, Baied d'Urfe, QC) and 10 p. Loft RT reaction of 1.25 U or 100 ng of genomic DNA were thermal-cycled as follows:
35 cycles at 94 C for 45 sec, at 60 C for one minimum, and 72 C for 30 sec, 94 cycles for 5 minima 2. The first circuit in C, the primer is Gene3. prime. For the state selected in the region, the last circuit at 72 C for a 7 minute Probe that should not be expanded in RT-PCR was extracted from genomic DNA.
The size and yield of the PCR products were determined by gel electrophoresis of 2% agarose.
The PCR product was then purified from solution or agarose gel band, agarose gel electrophoresis (byside, if product is determined) in the following preparations:
Operate GFX pillars (Amersham Pharmacia Biotech, Baied d'Urfe, QC).
After purification, the enrichment of all probes was estimated by agarose gel electrophoresis and adjusted to approximately 100 ng / multiple.
Double-speed standard salt solution (SSC) robot arrayed Purified PCR products were arrayed in one of triplicate from 384-well plates. The GeneMachines ™ OmniGrid microarrayer with ChipMaker2 tips (Telechem International, San Jose, Calif.) Served (Genomic Instrumentation Services, St. Carlos, Calif.).
Surface spacing
400 heads were between the dots.
Microarrays were stamped on Hybond-N or Hybond-N + nylon membranes (Amersham Pharmacia Biotech, Baye d'Urfe, QC). It was then mounted on a standard glass slide with tape.
Before and after each of the ten slides with the membrane, a boilerplate slide was inserted to view print quality.
After alignment, the membrane was UV illuminated at 50 mJ (GS Gene Linker (Bio)
Rado, Hercules, CA) immobilizes deoxyribonucleic acid;
The fragments of the membrane containing the array (approximately one x 1.5 cm) are then cut off, denaturated in boiling water for the five minimums and 0.1% for the five minimums. % Rinsed in SDS and operated for prehybridization.
After the UV irradiation stage, the membrane can be mounted on a glass slide and stored.
Preparation of DIG-labeled complementary DNA for hybridization
An early mix of Gene-Specific Primer (GSP) was created.
To this end, 1 nM of each primer run in the RT-PCR reaction to prepare the probe was added to a total volume of 250 ul.
Digoxigenin (DIG)-a labeled target was created in an RT reaction as follows:
1ul 4u of GSP. G1 of total ribosome ribonucleic acid and RNAse-free water in a total volume of 14 was heated at 65 C for a minimum of 15 to deprive the properties of ribosome ribonucleic acid
Then, it stayed at room temperature for the five minimums for the primer being annealed.
Instead, 2 g of messenger-RNA and 400 ng of oligo (dT) 12 slow primer were operated.
Reaction mix, including 8 l of 2u, 5x first strand buffer supplied by enzyme manufacturer. l of a 10 mM mix of dATP, dCTP and dGTP (500 pM final concentration each) (4 Ills of 0).
10 l of a mixture of 1 M DDT, 0.7 ul RNAguard, 31 U / pl (Amersham Pharrncia Biotech, Baier d'Urfe, QC), 19 2 mM:
One dTTP:
Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (MMLV RT) (Gibco BRL, Burlington, ON) DIG-11-dUTP (Roche, Laval, QC) and 21 (200 U / l) were added.
The reaction was performed at 37 C for 1 h. And at 940C for the five minimums of the GeneAmp 9700, enzymatic degradation continued.
Alternatively, Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, Mississauga, ON) was operated according to the manufacturer's regulations.
The labeling reaction was purified to the GFX column;
This step removes all labeled products shorter than 100 bp, as well as unincorporated nucleotides, primers and proteins.
After purification, the labeling efficacy was estimated as follows:
1ul of 1:
100, 1:
1000, 1:
10,000 and 1:
A dilution of 100,000 was used, along with a dilution of the control DIG-labeled deoxyribonucleic acid at a known concentration (10-0.01 pg / ll) as a standardization for our assay (Roche, Laval, QC). Point-like on Hybond-N membrane;
After immobilization with UV, the membrane was incubated with alkaline phosphatase (AP)-DIG (opposite DIG AP) (rinsed, chemiluminescent substrate according to the manufacturer's specifications (Disodium 3- (4-methoxyspiro)). @ Decan's 1,2-dioxetane-3,2.prime- (5.prime.-chloro) tricyclo [3.3.1.137] {4-yl) phenyl phosphate CSPD (Roche, Laval, QC) conjugated antibody)).
Hybridization and processing
DIG Easy Hyb buffer (Roche, Laval, QC) for hybridization and prehybridization or 50% formamide with deionized formamide buffer, 5x SSC, 2% solution of blocking (Roche, Laval, QC), 0.02% SDS (100 g / ml denaturated salmon deoxyribonucleic acid) was used, including 0.1% N-lauroylsarcosine.
The membrane was previously hybridised at 42 C for 2 h in a hybridization dryer (Autoblot, Bellco, Vineland, NJ).
In a 5 ml Falcon tube, hybridization was performed with the following 42 C overnight of 1 ml of the hybridization solution.
Concentration of the labeled probe in the hybridization mix constituted 10 ng / ml.
Prior to hybridization, the probes were denaturated at 65 C for a minimum of 10 hybridization solutions.
The hybridization membrane was then cleaned twice with one xSSC (0.1% SDS at room temperature for a minimum of 15) (unless otherwise noted).
The membrane with prewarmed 0.1 × SSC (0.1% SDS at 68 C. or for a minimum of 15) was then rinsed in more stringent conditions i. e. 2xSSC, 68 C.I. for a minimum of 30. Twice twice with 0.1% SDS at 0.1% SDS at 68 C for 30 minutes and 0.1% SDS at 30 minutes
After equilibration for five minimums of water wash buffer (0.3% Tween 20 in maleic acid buffer (0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCI, pH 7.5)), the membrane is mild. 1.5 h blocked 1% solution blocked under agitation,
Thus, a previous treatment for a minimum of 30 ml of 10 ml alkaline phosphatase-conjugated sheep anti-digoxigenin antibody (Roche, Laval, QC) diluted 1:
1000 for colorimetric dyeing or 1:
10,000 for chemiluminescent detection.
Following the antibody incubation, the membrane was rinsed for 3 hours for a minimum of 15 of the wash buffer and the detection buffer (0.1 M Tris-HCI, 0.15 M NaCI, pH 9.5) was used. Balancing for the two minimums, 175 jg / ml 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate, toluidine salt (BCIP) and 330 ug / ml Nitro Blue in detection buffer. Stained with tetrazolium chloride (NBT).
Instead, 1:
A dilution of 100 of CSPD was exercised, and chemiluminescence was detected in accordance with the recommendations of the manufacturer running BioMax (Roche, Laval, QC), matching the MR Kodak skin.
Array Arrays scrutiny and evaluation were scanned on an Olympus microscope equipped with a Multiscan-4 system (Applied Scientific Instrumentation, Eugene, OR) and
Apply CCD Sony to 950 cameras.
Data collection and montage of the conjugated difference product field of view in one file was performed with the help of the Northern Eclipse Imaging System (Imaging EMPIX, Mississauga, ON).
Quantitative measurement of the intensity of the enzymatic reaction for each dot, background subtraction, normality against housekeeping genes and paired hybridization was all performed by the in-house software program.
Probe and primer results Selection
After careful evaluation of the conjugated difference product database, 61 genes were selected for alignment. Then, nine housekeeping genes were counted.
This set of genes includes the Myc (c, N, L1 and L2) family, five c-Myc regulating coefficients (ZFP161, nm23-H2S, MBP-1, RBMS 1 and RBMS2), and five c Myc 38 E boxes binding the gene, along with a working gene (YY1, TFII-1, PAM, MM-1 and α-tubulin) and four c Myc target genes (prothymosin α, MRDB, ODC1 and cdc25A) Is included.
Positive control was attributed to phenotypic expression (UBC, β-actin, GADPH, HPRT1, phospholipase 2, HLA-C, PRS9, aldolase C and RPL13A) as well as nine houses with conjugated differential product levels of HeLa genomic DNA. Take the keeping gene into account.
Lambda deoxyribonucleic acid and 2xSSC (double-speed standard salt solution), which served as a solvent for all probes, were selected as negative controls.
Primers for all genes were selected with the help of Primer3 software, producing products of similar melting temperatures, providing that they were consistent with the same conditions for PCR reactions.
Most products were made from HeLa or lymphocyte complement DNA.
Primers were selected in the 3 'region of these genes, in case the PCR amplification failed from complementary DNA, and amplicons were created from HeLa genomic DNA.
The average annealing temperature of the primers where all PCR reactions could be in a 96-well format was.
The size of the primer product and the annealing temperature and the melting temperature are indicated in Table 4.
The average fineness of the PCR products to sequence and their melting temperature was 44158 bp and C of 803, respectively.
Choosing these parameters allowed stringent conditions of hybridization and post-hybridization water washes. And drastically reduced the possibility of cross-reactivity and background levels.
Conscientious selection of primers may be used to distinguish in some cases between very close members of the family Gene (eg, USF 1 and 2) IDs 2, 3 and 4 (members of the family Myc). ) Other or between the two conjugated product transcripts of c-Myc.
As is well known, there are several transcription forms that differ in c-Myc. By changing the regulatory properties (Bodescot and Brison Gene 174, 115-120 (1996)), it is copied from the conjugated difference product promoting factor.
Choosing primers for the first exon and the 2nd-3d exon allowed discrimination between the full-sized truncated c-Myc species.
Conditions affecting hybridization Several parameters, possibly affecting hybridization results with complementary DNA microarrays printed on a nylon membrane, were carefully tested.
First of all, the gene profiling results were detected using either messenger RNA or total HeLa ribosomal ribonucleic acid.
Surprisingly, the overall pattern of expression was very similar, with the exception of a few genes (UBC, RPL-13A, MBP-1), the signal from messenger RNA was more Was time;
The most notable difference was found in UBC,
Where
It approached the 5-fold.
Alternatively, the signal for HPRT1 and phospholipase A2 was higher with total ribosomal ribonucleic acid.
In conditions where the quantity of messenger RNA is the limiting factor, total ribosomal ribonucleic acid can be used instead, without significant differences in the results of expression profiling.
When the gene-specific primer is operated, two reverse transcriptases, Moloney murine leukemia virus (MMLV) (Gibco BRL, Burlington, ON) and OmniScript (Qiagen, Mississauga, ON) (digoxigenin label for hybridization) Operated for the production of targets marked with) did not show any differences in the expression profile;
However, the signal intensity was stronger after labeling with MMLV, especially after the day of staining (Table 5).
The oligo, (dT) primer, was driven by messenger RNA. Some significant differences in the expression levels of some genes were detected.
More intense OmniScript generated labeling with 2-3 times signals for RP-S9, RP-L13A, enolasel, N-Myc and MAD4.
Determining which buffers were better for hybridization with microarrays, EasyHybTM (Roche, Laval, QC) and formamide-based buffers was compared.
The expression profile of the HeLa messenger RNA was found to be independent of buffer composition, but the addition of 2% reagents for hybridization and blocking of formamide buffer (Table 5) reduced the background as compared to EasyHyb. After subsidizing, the signal was higher. This facilitated the subsequent scrutiny and image quality evaluation.
No fundamental differences were found in the HeLa messenger RNA phenotyping profile when the conjugated differential stringency washing conditions were operated (see Materials and Methods).
A more stringent wash uniformly reduced all signals, creating a signal with sharper edges. And they became easier to scan and identify.
Standard washing conditions are already sufficiently stringent, probably in hybridizations with complementary DNA microarrays and gene-specific primers;
Therefore, standard washing is a priority. -The reasons are as follows. It doesn't take much time.
Nylon membranes with apparently imposed (Hybond-N +) neutral (Hybond N) of the comparison showed no difference in sensitivity.
Excluding this consideration, a neutral (Hybond-N) nylon membrane is preferred because of its stronger texture for imprinting the support.
This strength was not found with a clearly imposed Hybond-N + membrane, which was found to retain a visible print footprint. And it led to image analysis and increasing background complications.
As can be seen from Table 5, increasing the staining time from overnight, usually one day, increased the overall intensity of the signal by 10%.
Longer staining times increased the background level of the reaction. And it set out the possible benefits of higher sensitivity.
Variation in hybridization conditions can increase the overall signal strength by 30-40%.
However, the positive effect is not additive, and the maximum difference in the total brightness of the microarray s approaches only 50%.
The following conditions for hybridization of DIG-labeled targets with complementary DNA microarrays are optimal:
Reverse transcription reactions with neutral nylon membranes, total ribosome ribonucleic acid, gene-specific primers and print probes on MMLV cancel the transcriptase, formamide buffer hybridization and rinsing standards.
These conditions were fulfilled in the tests described in the following paragraphs.
Comprehensive DNA microarray hybridization (5 genes (MRDB, ODC, TFII-1, cdc25A and c-c), which defines a range of lengths (368-711 bp) coverage by Specificitv, sensitivity and To. Myc)) hybridization reproducibilitv to test the specificity, sequenced the products, labeled in a complex PCR reaction, and crossed by a complementary DNA array (FIG. 6).
As expected-only 5 samples on array were positive, gene where HeLa genomic DNA was punctate at taxonomic position 51 and highest enrichment at negative as well as HeLa genomic DNA as control Because the locus crosses with the locus, little detection occurs at taxonomic positions 1a and 1b where the mottled HeLa genomic DNA is among the lower numbers.
Together, these tests are not proof of the sign of cross-reactivity (FIG. 4).
The conjugation difference of this 5-gene PCR mix (10, 4, 0.1 and 0.04 ng / ml) was used to estimate the sensitivity and derive a calibration curve for complementary DNA microarray hybridization. Volume enrichment was crossed with an array.
The results of this test are prosecuted in FIG.
For the same slope off 452, for a clear plateau in the region of 4-10 ng / ml, a linear dependence of semi-logarithmic coordinates was observed for all genes.
The lower detection limit varies slightly to match 40-100 due to the conjugated difference product probe of the array.
Pg / ml per individual gene.
These results are near the limit of detection of the digoxigenin system (10-30 pg / ml). And it matches the manufacturer (Roche, Laval, QC).
This level of sensitivity allows detection of messenger RNA of intermediate abundance. Then, the total cell messenger RNA of 0.04% or more is displayed.
Get to account This level of detection, for hybridization with a microarray containing about 70 genes of intermediate abundance, if labeled probes generated from 7 ng of gene-specific primers are not sufficient It is estimated that it will not be.
Concentration of 10 ng / ml labeled probe was selected for subsequent hybridization.
The yield of the standard reverse transcription labeling reaction with gene as a specific primer is about 20, -40 ng;
Thus, one labeling reaction yields enough product for 2-4 independent hybridization reactions.
In contrast to unstable radioactive probes, probes labeled with DIG can be stored and reused several times.
After storing at20C for several months, reusing the hybridization mix 2-3 times gave results in harmony with the person of origin.
The array was scanned at a resolution of 3600 dpi, and the results were compared to the results of microscopy.
In general, the variability between repeated dots was higher than in the scanner, and the linearity could be affected by the scanner software.
Scanners can be used for primordium evaluation of hybridization results, especially when chemiluminescence detection is implemented.
When compared to the human lymphocvtes Expression profile of E-box Gene, the expression profiling of her cells was determined in repeating healer cells (FIG. 8a) and vertical line human lymphocytes (FIG. 8b).
Lymphocytes, the most prominent modifications made of 2-folds on the regulation of gene TCF4 associated with the E-box, MAD4 and Aldolase C. et al. of
Alternatively, down-regulation of c-Myc-regulating genes MBP1 and Nm23-H2S and small down-regulation of c-Myc and N-Myc of N-Myc were registered in lymphocytes as compared to HeLa cells.
c-Myc Some interacting and target gene expression was down- (MM-1 (ODC1)) or up-regulated in lymphocytes (PAM (MrDb)).
Also,
Compared to HeLa cells, small up- (MITF (ID2)) and lower (TFEB) regulation was observed in lymphocyte E-box-tethered expression of some genes.
These results are shown in FIGS. 9a, 9b and 9c.
Meteorological Overview Complementary DNA and oligonucleotide microarrays have become an increasingly powerful technique for studying gene expression patterns.
Despite the development of tolerance in this field, some limitations of craft persist.
One of the major obstacles is a requirement for large amounts of messenger RNA.
Another problem with existing microarray systems is data mining;
In some instances, in multiple physiological conditions, researchers find that in phenotypic profiles of only a subset of genes, while information on tens of thousands of gene phenotypes is absolutely life to approximate the function of new genes. Related.
Significant differences in the phenotypic expression of 3-6 genes out of 61 can already be handled much more than in hundreds or thousands, than can be detected from conventional microarrays with gene clump numbers.
For example, in
SAGA analysis of 45,000 genes, vertical lines it was found to be, and differential dispatch of cancerous human cells.
Similar estimates arose from analysis of the trait expression profiles of young and old mice;
Expression of 1.8% of only about 6,000 genes is altered by 2-folds. Using digoxigenin to imprint microarrays on a nylon filter and label complementary DNA with gene-specific primers allows only one use of 4 pg of total ribosome ribonucleic acid per hybridization. .
This is much more perceptible than ordinary microarrays, which are of the same sensitivity that can be achieved by the Clontech protocol and its radioactivity.
And it requires several u. g of mRNA,
Therefore, first of all, 100-1,000 micrograms of total ribosome ribonucleic acid is required.
In addition, probes labeled with high labeling sensitivity DIG can be stored for long periods of time, as opposed to fluorescently or radioactively labeled ones. That time was reused.
And, using digoxigenin for labeling, the selection of the gene for the contents of the microarray helps to avoid other disadvantages of radioactive labeling:
E-box microarray genes are all in the same category of abundance (medium or low abundance).
Eliminating very large amounts of genes eliminates the problem of strong signal combinations.
The merged signals of some environments substantially complicate the review process and cause unreliable results during the data collection stage.
Another advantage of operating the enzymatic labeling method by superceding the radioactive and fluorescent probe method is a time saving and repeatable view.
In general, this process from the start of finishing the incubation with alkaline phosphatase, including the steps required for labeling complementary DNA, hybridization, washing with water, took advantage of anti-digoxigenin antibodies,
Upper and lower limits for staining of alkaline phosphatase,
Scrutiny for data collection requires up to two days.
This is 32P radioactive at considerable times compared to up to eight days' exposures where a save is required, or 33P labeled probes.
The advantage of an enzyme labeled probe over a fluorescentlabelled probe is the cost savings of the data evaluation stage.
Where
Fluorescently labeled probes require the use of expensive laser detection systems or confocal microscope arrays, while the means require inexpensive routine upright microscopes.
This, in addition to the notorious fact that fluorescence can be easily bleached after the scrutiny process, repeats our enzymatic method by means of an inexpensive microscope that does not lose the signal strength of origin. For the ability to scan the array, make it much higher.
These results may be compared to a commercial gene expression array system as follows:
[Table 6]

[Table 4]

[Continuation of Table 4]

[Continuation of Table 4]

[Continuation of Table 4]

[Table 5]

[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1a, pound, 1c, 1d and one e show an instrument for making microarrays s.
FIG. 2
Figures 2a-e provide evidence for all steps of template definition, repetition, unreliable area detection and spot labeling.
It is easy to distinguish over-expressed spots (labeled as' *) '' and those twisted by the shading of the over-expressed spots labeled? ].
The sign of the spot is confirmed by visual inspection on the image of origin,
Where
The arrows disclose the taxonomic location of the spot in the shadow of the over-expressed one.
FIG. 2a is a raw image of a portion of the ClonTech complementary DNA array.
The array quantification method was tested by analyzing ClonTech Atlas complementary DNA Filter Arrays. And it contains 588 complementary DNA element punctates created in duplicate.
Following the user manual, as specified by the manufacturer, an autoradiograph was obtained after radioactive labeling, array hybridization and rinsing procedures.
Digital images are acquired by scanning the autoradiograph upright at 300 DPI for 8 bits grayscale and gamma correction disabled.
A3 * 3 has a long range that the pixel smoothing filter has been exercised to reduce sesame noise.
The initial position is overlaid on the lattice template on the image of origin. And that is one block of the ClonTech filter.
The user needs to define the taxonomic location of the right bottom corner spot right through the graphical user interface.
In equations (5) and (6), the parameters are set;
￣p;
= 1 and r = 50.
FIG. 2b is an initial alignment with a prototype template.
FIG. 2c is an excellent alignment by automatic mechanical repetition of a deformable mold.
The figure shows an unreliable area (yellow) detected by 2d, mathematical form.
The structuring element is chosen for a disk having the same size as the ideal sample spot.
FIG. 2e corresponds to an unreliable area that performs automatic mechanical labeling of the spots (“* 'over-expedited spots;
[? Spots distorted by shading;
[O. prime. -Vertical spot).
FIG. 3
Figures 3a-3d embody a qualitative and quantitative representation of repeatability and reliability.
The two blocks of the ClonTech atlas, sequenced by the murine complement DNA (transcription factors and general DNA binding proteins), were quantified using the same deformable template means.
The imaging conditions are 2a. , Are the same as those described in the figures.
The two independent acting genes need to define the initial position of the prototype template (Fig. 3a) (left bottom correct bottom corner).
Each agonist repeats the same procedure on one sample three hours.
[0,0.33] low abundance of the normalized brightness of the spot for simplicity is defined as medium abundance and defined as high amount-abundance [0.67,1]. [0.33, 0.67].
Brightness versus relative error proves that errors in defining the amount of low abundance spots are found to be high in defining the amount of medium-and high abundance spots.
The largest mistake in luminance-to-ratio proves that the wrong ratio in low abundance spots is found to be higher than the other spots (FIG. 3b).
An example of undesired normality is compared to the gene expression of two samples compared to the control gene (FIG. 3c).
Line L1 is the ideal case of two identical samples:
S1i = S21 (i = 1). . . , N;
Line L2 is the center line of the real sample;
Line L3 is the center line of the actual control.
The normality procedure can be well understood as rotating the coordinate space by the angle Si (L2 (L3)).
Thus, the reliability of normality can be assessed by the angles 0 (L1 (L3)) and B (L2 (L3)) (calculating 3d).
Greater ‖ angle, less dependable regularity.
In this case (0 (L1 (L3)) =-29).
30,
0 (L2 (L3)) =-14.
58.
Examples of desirable normality are visible
Figure:
0 (lui (L3)) =-0.
96, Si (L2 (L3)) = 2.
13.
FIG. 4
FIG. 4 demonstrates complementary DNA microarray hybridization for the evaluation of gene expression associated with E-box tethering.
For each gene abbreviation, the matrix taxonomic position is written under each locus in a triplicate of dots with the same total deposited.
The X-coordinates describe the numbers 1, 2, 3, 4 and the five taxonomic positions and the Y-coordinates describe the "a" through "o" positions.
The matrix location for each Gene triplet is then identified as X (Y coordinate).
For example, 5k describes the taxonomic position of N-Myc, and 3d describes the taxonomic position of Mad.
The same coordinates are also included in Table 4.
FIG. 5
Figures 5a and b show the expression profile of gene expression associated with E-box tethering of her cells.
FIG. 5a—Total ribosomal ribonucleic acid labeled with RT reaction digoxigenin with a gene specific primer;
Figure 5b-Messenger RNA is an oligo (dT) primer labeled with the RT reaction digoxigenin.
Arrows within the matrix indicate the taxonomic position of I-her deoxyribonucleic acid (positive control);
II-lambda deoxyribonucleic acid (negative control);
777-UBC;
IV-RPL-13A;
V-MBP-1;
VI-HPRT1.
The distance between the dots can be measured at 1 mm bar.
FIG. 6
FIG. 6 demonstrates the hybridization of the products of a multiplex PCR with primers having five pairs of complementary DNA microarrays.
Arrows within the matrix indicate:
I-Mrdb;
II-c Myc p64;
III-TFII-1;
IV-ODC 1;
V-cdc25A;
VI-Hell genomic DNA.
FIG. 7
FIG. 7 shows the analogy between the enrichment of five genes, including Mrdb, c-Myc, TFII-1, ODC1 and cdc25a, and the intensity of hybridization signals.
A logarithmic approximation is shown.
Dot brightness is displayed by any unit on the Y-axis;
Concentration is measured as ng / ml on the X-axis.
FIG. 8
Figures 8a and 8b demonstrate the gene expression profiles associated with the E-box of Hell cells (Figure 8a) and vertical line human lymphocytes (Figure 8b).
Arrows within the matrix mark taxonomic position as follows
I-Aldolase C;
7 / -Mad4;
III-MBP-1.
FIG. 9
FIGS. 9a, b and c represent a pairwise comparison of E-box gene expression in herd cells and human lymphocytes.
Two independent hybridizations will average for each type of cell. Calculate the 9a-Three and 9b-two-dimensional diagrams of dimensions (representation of differences in gene expression).
Each panel corresponds to one pillar in FIG. 8a, and each burl displays a personal gene.
(Equation 1)

Calculate the 9c-Distribution of loss of gene expression with a general gain or dependence on relative ratio values.
The relative fold at which the ratio between samples S1 and S2 is calculated
DA =? [-1, + 1] of the maximum value (51,52) that yields a value in the range.
Positive values correspond to up-regulation, and within the gene of sample S2, negative numbers correspond to down-regulation.
The relative pleat ratio has a similar meaning to that of the conventional pleat ratio. However, the following cases are excluded-the values are normalized and for explicit physical decoding, they are symmetric.
0.5 normalizes 2 and matches 2x up or down-adjustment = RDM sampling (SI (S2));
A set of housekeeping genes with relatively constant expression was selected as a control, and linear normality was exercised.
FIG.

Claims (19)

A method for detecting DNA hybridization on a microarray, Northern blot or Southern blot, comprising the following steps:
Adding a digoxigenin-labeled gene-specific primer to the target nucleic acid molecule,
Reacting the primer with the target nucleic acid molecule to produce a labeled target nucleic acid molecule;
Generating a labeled target nucleic acid molecule,
Incubating the labeled target nucleic acid molecule with an anti-digoxigenin antibody conjugated to an enzyme that cleaves the chromogenic substrate, and reacting the target nucleic acid molecule with the antibody by coloration, chromogen, Or detecting using a detection means for chemiluminescence assay,
A method comprising: 2. The method of claim 1, wherein said nucleic acid molecule is DNA. 2. The method of claim 1, wherein the target DNA is on a microarray and is present in pg. 2. The method of claim 1, wherein said target DNA is on a Northern blot. 2. The method of claim 1, wherein said target DNA is on a Southern blot. The method of claim 1, wherein the primer is reacted with the target nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule is DNA, and the target DNA is amplified in a polymerase chain reaction. The detecting means comprises a disodium 3- (4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2 ′ (5′-chloro) tricyclo [3.3.1.137] decane} -4 chemiluminescent substrate. 2. The method of claim 1, wherein -yl) phenyl phosphate-CSPD. Further comprising the step of staining with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, toluidine salt (BCIP) and nitroblue tetrazolium chloride (NBT) in the detection buffer after antibody incubation. 2. The method according to 1. A method for enhancing the resolution of a hybridization reaction between a probe and a target DNA in a microarray format, the method comprising the following steps:
Providing a test sample in the microarray in an amount of less than 200 test spots;
A method comprising: 9. The method of claim 8, wherein at least three spots are provided for each test sample. The method of claim 10, wherein the three spots are randomly arranged in the microarray. 10. The method of claim 9, wherein at least nine housekeeping genes are provided for data normalization. Further, providing a means for normalizing the size of the detection reaction for each test sample compared to the size of the other test sample and the housekeeping gene;
13. The method of claim 12, comprising: 14. The method of claim 13, wherein each test sample detection reaction is fitted into a circle of the same diameter. 15. The method of claim 14, wherein the fitting step is performed by a computer that measures and normalizes data for each test sample. 16. The method of claim 15, wherein the data is further normalized relative to a detection response for each of the housekeeping genes. A kit for use in the method of claim 1, comprising:
A kit comprising a reagent for labeling digoxigenin and a nucleic acid primer. 18. The kit of claim 17, further comprising a substrate selected from the group consisting of a chromogenic substrate, a chromogenic substrate, and a chemiluminescent substrate. An information system for use in the method of claim 9.

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