JP2004361227A - Method for identifying amyloid β-binding protein - Google Patents
Method for identifying amyloid β-binding protein Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004361227A JP2004361227A JP2003159562A JP2003159562A JP2004361227A JP 2004361227 A JP2004361227 A JP 2004361227A JP 2003159562 A JP2003159562 A JP 2003159562A JP 2003159562 A JP2003159562 A JP 2003159562A JP 2004361227 A JP2004361227 A JP 2004361227A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ncbi
- protein
- binding
- binding protein
- proteins
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 101710128242 TM2 domain-containing protein 1 Proteins 0.000 title claims description 8
- 102100032067 TM2 domain-containing protein 1 Human genes 0.000 title claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010064397 amyloid beta-protein (1-40) Proteins 0.000 claims description 18
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 51
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 51
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 51
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 13
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 12
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 10
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 8
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 8
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108010041801 2',3'-Cyclic Nucleotide 3'-Phosphodiesterase Proteins 0.000 description 6
- 102100040458 2',3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase Human genes 0.000 description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 5
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000034286 G proteins Human genes 0.000 description 4
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 4
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 4
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 3
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 3
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 3
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 3
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 3
- 108050003738 Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 102100024024 Transcription factor E2F2 Human genes 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000006933 amyloid-beta aggregation Effects 0.000 description 3
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 3
- VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=C(F)C=C1F VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 2
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 102000018361 Contactin Human genes 0.000 description 2
- 108060003955 Contactin Proteins 0.000 description 2
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010036466 E2F2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 101710170439 Glycoprotein 2a Proteins 0.000 description 2
- 101000604054 Homo sapiens Neuroplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000006541 Ionotropic Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010008812 Ionotropic Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 102100030124 N-myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 102100038434 Neuroplastin Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 101000596890 Rattus norvegicus Neurotrimin Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 102000043927 cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit Human genes 0.000 description 2
- 108700038308 cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 102000004291 ribosomal protein L6 Human genes 0.000 description 2
- 108090000892 ribosomal protein L6 Proteins 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- -1 succinimide ester Chemical class 0.000 description 2
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 2
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 2
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- MEZJQXVOMGUAMP-UHFFFAOYSA-N 1-(2-methylnaphthalen-1-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound CC1=CC=C2C=CC=CC2=C1N1C(=O)C=CC1=O MEZJQXVOMGUAMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYVHLZLQVWXBDZ-UHFFFAOYSA-N 1-[6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1CCCCCCN1C(=O)C=CC1=O PYVHLZLQVWXBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005460 3-oxoacid CoA-transferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002872 3-oxoacid CoA-transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000004672 Acetyl-CoA C-acyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010825 Actinin Human genes 0.000 description 1
- 108010063503 Actinin Proteins 0.000 description 1
- 208000006888 Agnosia Diseases 0.000 description 1
- 241001047040 Agnosia Species 0.000 description 1
- 101710196722 Alpha-glucosidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000009366 Alpha-s1 casein Human genes 0.000 description 1
- 108050000244 Alpha-s1 casein Proteins 0.000 description 1
- 102000014303 Amyloid beta-Protein Precursor Human genes 0.000 description 1
- 108010079054 Amyloid beta-Protein Precursor Proteins 0.000 description 1
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 1
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 1
- 206010003062 Apraxia Diseases 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 101710118861 Atlastin Proteins 0.000 description 1
- 102100027766 Atlastin-1 Human genes 0.000 description 1
- 230000007082 Aβ accumulation Effects 0.000 description 1
- 208000024806 Brain atrophy Diseases 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108030005456 Calcium/calmodulin-dependent protein kinases Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 108010087195 Contactin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024326 Contactin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100026992 Dermcidin Human genes 0.000 description 1
- 108010034929 Dermcidin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000016503 Dimethylarginine dimethylaminohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102000043859 Dynamin Human genes 0.000 description 1
- 108700021058 Dynamin Proteins 0.000 description 1
- 208000027534 Emotional disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000037087 Excitatory amino acid transporters Human genes 0.000 description 1
- 108091006291 Excitatory amino acid transporters Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 101600093517 Gallus gallus Neural cell adhesion molecule 1 (isoform A) Proteins 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102100027385 Hematopoietic lineage cell-specific protein Human genes 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 102100030338 Hexokinase-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710198391 Hexokinase-1 Proteins 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101001009091 Homo sapiens Hematopoietic lineage cell-specific protein Proteins 0.000 description 1
- 101000845257 Homo sapiens Protein tweety homolog 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000727472 Homo sapiens Reticulon-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000625727 Homo sapiens Tubulin beta chain Proteins 0.000 description 1
- 102100020755 Hypoxia up-regulated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710120772 Hypoxia up-regulated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 101600093473 Mus musculus Neural cell adhesion molecule 1 (isoform 1) Proteins 0.000 description 1
- 102000004390 N-Ethylmaleimide-Sensitive Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081735 N-Ethylmaleimide-Sensitive Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100035383 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710185438 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100021852 Neuronal cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 101710130688 Neuronal cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 102100036592 Neutral alpha-glucosidase AB Human genes 0.000 description 1
- 101710140639 Neutral alpha-glucosidase AB Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000002141 Plasma Membrane Calcium-Transporting ATPases Human genes 0.000 description 1
- 108010040945 Plasma Membrane Calcium-Transporting ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 101710098724 Protein alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100031076 Protein tweety homolog 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100024939 RNA-binding motif protein, X chromosome Human genes 0.000 description 1
- 101710176041 RNA-binding motif protein, X chromosome Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102100029831 Reticulon-4 Human genes 0.000 description 1
- 102000015602 Septin Human genes 0.000 description 1
- 108050004875 Septin Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100023719 Src substrate cortactin Human genes 0.000 description 1
- 101710160291 Src substrate cortactin Proteins 0.000 description 1
- 102000001435 Synapsin Human genes 0.000 description 1
- 108050009621 Synapsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 1
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 1
- 102000050389 Syntaxin Human genes 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 101710138758 Transcription factor E2F2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003672 Tropomodulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000089 Tropomodulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102100024717 Tubulin beta chain Human genes 0.000 description 1
- 102000012290 Voltage-Dependent Anion Channel 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022133 Voltage-Dependent Anion Channel 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000007791 alzheimer disease like pathology Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 201000007201 aphasia Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004781 brain capillary Anatomy 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010048054 dimethylargininase Proteins 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 208000025688 early-onset autosomal dominant Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 208000015756 familial Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N isosorbide mononitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@@H](O)CO[C@@H]21 YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- 210000005099 mouse brain capillary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000478 neocortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 102000011867 neurochondrin Human genes 0.000 description 1
- 108010075803 neurochondrin Proteins 0.000 description 1
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000010069 protein adhesion Effects 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000007507 senile plaque formation Effects 0.000 description 1
- 208000022288 senile plaque formation Diseases 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 102000003137 synaptotagmin Human genes 0.000 description 1
- 108060008004 synaptotagmin Proteins 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
【課題】安全でありかつ有効性が高い、アルツハイマー病の新たな治療方法や予防方法を開発することを目的として、それに資する技術を提供することが本発明の課題である。
【解決手段】本発明により、プロテオミクス技術を利用して、アミロイドβ蛋白質と結合する蛋白質群が包括的に与えられた。これらの蛋白質群の知見は、その蛋白質群を標的とした治療薬を開発する可能性を開くものであると共に、アルツハイマー病の原因解明に大きく寄与するものであると考えられる。
【選択図】 なしAn object of the present invention is to provide a technique contributing to the development of a new method for treating and preventing Alzheimer's disease that is safe and highly effective.
According to the present invention, a group of proteins that bind to amyloid β protein is comprehensively provided using proteomics technology. Knowledge of these proteins opens up the possibility of developing therapeutic agents targeting those proteins, and is thought to greatly contribute to elucidating the causes of Alzheimer's disease.
[Selection diagram] None
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテオミクス技術を用いて、アルツハイマー病の原因であるアミロイドβと結合する性質を有する蛋白質（アミロイドβ結合蛋白質）を包括的に同定する方法に関する。更に本発明は、そのような方法により同定された蛋白質の利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病は、初老期では４０歳代後半から５０歳代にかけ、高齢期では７０歳代後半以降に発症する疾患であり、記憶障害、意欲障害、判断障害、失語、失行、失認、人格障害、感情障害、鏡障害、クリューバー・ビューシー症候群などの症状が現れ、高度の痴呆におちいるという症状を示す。脳の病理変化としては、老人班、アルツハイマー神経原線維変化、神経細胞消失などが認められ、症状の進行とともに病変は高度となり、著名な脳萎縮をきたす。
【０００３】
アルツハイマー病の病態としては、アミロイドβ４０やアミロイドβ４２などのアミロイド蛋白質の異常かつ早期の沈着や、神経細胞内のリン酸化タウ蛋白質の貯留が認められる。また、アセチルコリンなどの神経伝達物質の異常減少が背景にあることが明らかにされている。アルツハイマー型痴呆のなかには、家族性アルツハイマー病もあり、その疾患の原因として第１４、１９、２１のそれぞれの染色体における遺伝子の異常が報告され、また、アミロイドβの前駆体蛋白質におけるアミノ酸配列の点変異の存在が証明されている。
【０００４】
上記で述べたように、アルツハイマー病に罹患した脳においては、大脳新皮質や海馬の神経細胞が脱落すると共に、老人班などの線維性蓄積物が出現する。老人班アミロイドの主要構成成分は上記のアミロイドβ蛋白質（Ａβ）であり、前駆体であるアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）の細胞外領域から膜貫通領域の途中までが２段階のプロテアーゼ作用により切り出され、分泌される。また、アルツハイマー病の初期において、アミロイド蛋白質の蓄積はタウ蛋白質のリン酸化などよりも早く起こる、最も初期に認められる現象である。このように、アルツハイマー病の発症においてアミロイド蛋白質が重要な役割を果たすと考えられており、このような考え方は「アミロイド仮説」と呼ばれている。なお、アルツハイマー病発症機序についての最新の知見については、例えば、岩坪らの総論（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ （２００２） ｖｏｌ．２０ ｎｏ．６ ｐ６２６−６２９：非特許文献１）において詳しく述べられている。
【０００５】
アミロイド蛋白質生成の第一段階においては、βセクレターゼによるβ切断が起こり、その結果としてＡβのＮ末端が形成される。β切断により生じたＡＰＰのＣ末端断片は、続いてγセクレターゼによる切断を受けるが、この切断部位には多様性がある。主要となる分子種は４０アミノ酸残基からなるＡβ４０であるが、４２アミノ酸残基からなるＡβ４２も１０％程度存在すると言われている。Ａβ４０とＡβ４２の性質にはある程度の差が見られ、アルツハイマー病の病理変化においてＡβ４２は初期から蓄積し始めるが、一方、Ａβ４０はそれより遅れて蓄積する。また、Ａβ４２はＡβ４０と比較してより高い凝集性を示すと言われている。
【０００６】
このように、近年になってアルツハイマー病の詳しい病態が明らかになってきたが、絶対的な予防方法や治療方法はなお見出されていない。現段階においては、脳代謝賦活薬、脳循環改善薬、神経伝達機能調整薬などの、脳機能改善薬を主体とした薬物療法やリハビリテーションが行われている。
【０００７】
ところで、Ａβを標的としたＡβワクチン療法が、アルツハイマー病の新たな治療方法として注目されている。その例として、ＰＤＡＰＰマウスなどのアルツハイマー病のモデル動物をＡβで免疫したところ、Ａβに対する抗体が産生され、アミロイド沈着が抑制されることなどがＳｃｈｅｎｋらにより報告されている（Ｎａｔｕｒｅ （１９９９） ｖｏｌ．４００ ｐ１７３−１７７）。このようなワクチン療法が有効であるのは、生成した抗Ａβ抗体が血液脳関門を通って脳ミクログリア内の老人班と反応し、Ｆｃレセプターを介してミクログリアの老人班が貪食されて消失するためであると推定されている。このワクチン療法は臨床実験段階までいったが、炎症反応が認められるという欠点もあるために未だ実用化はされていない。ワクチン療法については、例えば、針谷らの総説（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ （２００２） ｖｏｌ．２０ ｎｏ．６ ｐ７０６−７０７：非特許文献３）において詳しく述べられている。
【０００８】
また、血液脳関門は血中と脳内におけるＡβの濃度の平衡を調整する役割も担っているが、Ａβのワクチンを投与することにより、Ａβに対する抗体とＡβが血中で結合し、そのために血液脳関門における排出の平衡が血液側へ大きく傾くと考えられる。そのような平衡の変化により脳からのＡβの排出が促進され、脳内のＡβの量は減少すると共に血中のＡβの量は増加すると考えられる。このように、ワクチン療法において血液脳関門を介した排出が促進されるというＳｉｎｋ（流し）仮説（ＤｅＭａｔｔｏｓ ＲＢ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （２００１） ｖｏｌ．９８ ｎｏ．１５ ｐ８８５０−８８５５：非特許文献４）も提唱されており、上記のミクログリアの食作用という仮説以上に有力な考え方となっている。
【０００９】
【非特許文献１】
若林朋子、岩坪威「Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病はどこまで解明されているか」Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ （２００２） ｖｏｌ．２０ ｎｏ．６ ｐ６２６−６２９
【非特許文献２】
Ｓｃｈｅｎｋ Ｄ．ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｍｙｌｏｉｄ−β ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ＰＤＡＰＰ ｍｏｕｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９９） ｖｏｌ．４００ ｐ１７３−１７７
【非特許文献３】
針谷康夫「ワクチン療法」Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ （２００２） ｖｏｌ．２０ ｎｏ．６ ｐ７０６−７０７
【非特許文献４】
ＤｅＭａｔｔｏｓ ＲＢ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （２００１） ｖｏｌ．９８ ｎｏ．１５ ｐ８８５０−８８５５
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の課題は、ワクチン療法より有効かつ安全なアルツハイマー病の治療方法や予防方法を新たな開発することを目的として、それに資する技術を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者は、近年著しい進歩が認められたプロテオミクス技術に注目し、その技術を用いて、Ａβと結合する蛋白質群を包括的に決定した。これらの蛋白質群の知見はアルツハイマー病の原因解明に大きく寄与するものであると共に、その蛋白質群を標的とした治療薬を開発する可能性を開くものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
近年、血液脳関門（ＢＢＢ）を通じた輸送により、脳内から循環血中にＡβを排出しているという機構が提唱されている。上記アミロイド仮説を考えると、アルツハイマー病を治療・予防するためには、Ａβの沈着を防ぐことが重要であると考えられる。いくつかの蛋白質はＡβと結合することによりＡβを脳外へ排出する機構に寄与しており、よってＡβ結合蛋白質は脳内のＡβレベルの制御に関連していると考えられている。それを考えると、Ａβと結合能を有する蛋白質を標的として、Ａβ−Ａβ結合蛋白質との相互作用を阻害するというアプローチにより、Ａβの沈着を防ぐことができる可能性がある。
【００１３】
なおアルツハイマー病においては神経の変性が認められるが、Ａβの蓄積と神経変性の関連性についてはいまだ明らかになっていない。また。Ａβの沈着が起こるメカニズムについてもまだ明らかとなっていない。しかし、Ａβと結合蛋白質がこれらの現象に何らかの役割を果たしているという可能性は高いと考えられる。その観点から考えても、アルツハイマー病の治療・予防において、ＡβとＡβ結合蛋白質との相互作用を阻害することの意義は大きいと考えられる。
【００１４】
ところで近年、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析計（ＭＳ）、更にはデータ解析システムを直結して大量の蛋白質を自動的に測定する、プロテオミクスの新しい技術が開発されてきている。なおプロテオミクスとは、ゲノム情報の最終産物である蛋白質の全体（プロテオーム）を大規模に解析することを意味する。従来の手法においては、蛋白質を同定するためには、先ず目的の蛋白質を分離することが不可欠であると考えられており、そのために、例えば電気泳動法で蛋白質を分離する必要があった。
【００１５】
この様な手法は現在においても蛋白質を同定するための重要な手法であるが、ゲノム情報の蓄積とＭＳの技術革新により、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどを基盤とする、処理能力の高い蛋白質同定技術が生み出された。ＬＣとＭＳを直列に接続した装置がＬＣ−ＭＳであり、ＬＣにタンデム型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を接続した場合には、ＭＳ内での試料の破断分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が可能となる。
【００１６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたプロテオミクス技術においては、蛋白質混合物や複数の蛋白質からなる複合体の構成成分を、トリプシンなどの特異性の高いプロテアーゼで消化し、分離することなく直接同定することができる。ここで同定の基礎となるのは、消化ペプチド断片とその開裂断片の精密な質量値、使用したプロテアーゼに依存する末端のアミノ酸情報、およびそれを高速で処理するＰＣとアルゴリズム解析である。この同定法は配列タグ法と呼ばれ、ペプチドの情報をもとに特定の蛋白質を同定することが可能であり、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）などの断片的な情報を含めて既存の塩基配列情報は全て利用することができる。プロテオソーム研究において、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、配列タグ法による蛋白質同定に汎用されている。このようなプロテオミクス技術は、従来の方法と比べて処理能力（ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）が高いという特徴を有する。なおプロテオミクスによる蛋白質の大規模解析システムの技術については、例えば田岡らの総説（実験医学「細胞内機能性複合体解析のためのタンパク質大規模解析システム」Ｖｏｌ．２０ Ｎｏ１． （２００２） ｐ８−１２）などを参照にすることができる。
【００１７】
このようなプロテオミクス技術は多くの可能性を秘めるものであるが、これまで、プロテオミクス技術を用いてＡβ結合蛋白質が包括的に同定されたことはなかった。本発明において、そのような新たな手法を用いてＡβ結合蛋白質が多数同定されたが、本発明の知見はアルツハイマー病の新たな治療薬の開発や、アルツハイマー病の機構の解明に役立つものであると思われる。よって本発明においてＡβ結合蛋白質とは、Ａβとの結合能を有する蛋白質群を包括的に意味するものである。なお本願明細書において「包括的に同定する」とは、プロテオミクス技術を用いて、多数の蛋白質からなる複合物を分離することなく同定する概念を示すものであり、個々の蛋白質を分離した後に同定を行うという従来の技術と区別することを意図するものである。
【００１８】
下記の実施例において、マウスの脳毛細血管内皮細胞と大脳膜由来の蛋白質においてＡβ結合蛋白質の同定を行った。上記のサンプルから粗膜蛋白質を調製し、ビオチニル化したＡβ４０を用いて、Ａβ４０と粗膜蛋白質中のＡβ結合蛋白質とを結合させ、更にアフィニティークロス架橋を行った。架橋したサンプルを可溶化した後にストレプトアビジンビーズを添加し、ビオチニル化したＡβ４０とアビジンとの複合体を形成させた。電気泳動法により蛋白質の分離を行い、得られた各々のバンドに含まれる蛋白質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで同定した。その結果下記の実施例において、Ａβ４０と結合する蛋白質群が同定された。これらの蛋白質はＡβ４０と相互作用し、血液脳関門におけるＡβの輸送に関与する因子の候補であると考えられる。
【００１９】
下記のリストに記載した蛋白質は、本発明のＡβ結合蛋白質として好適なものである。しかしこのリストに記載された蛋白質以外にもＡβと結合する蛋白質は存在している可能性があり、それらの他の蛋白質を用いるという態様もまた、本発明において除外されるものではない。なお、下記のリストにおいて、実施例において同定されたＡβ結合蛋白質を、登録されたＮＣＢＩ番号と共に示す。
【００２０】
（１）原形質膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号６７５３１４０
（２）ＡＴＰアーゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋トランスポーターアルファ（ＡＴＰａｓｅ， Ｎａ＋／Ｋ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ， ａｌｐｈａ）：ＮＣＢＩ番号１６３０７５４１、ＮＣＢＩ番号１５４８８８６２
（３） 神経細胞接着分子１（Ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １， １８０ ｋＤａ ｉｓｏｆｏｒｍ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （Ｎ−ＣＡＭ １８０））：ＮＣＢＩ番号４００４０２
（４）コンタクチン関連蛋白質（ｃｏｎｔａｃｔｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号７９４９１００、 ＮＣＢＩ番号２０３４７９５５
（５）コンタクチン（Ｃｏｎｔａｃｔｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６６８０９５４
（６） Ｎ−マレイミド感受性融合蛋白質（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号２０３４７６５９、ＮＣＢＩ番号２０９１３３５５
（７）ニューロコンドリン（ｎｅｕｒｏｃｈｏｎｄｒｉｎ）：ＮＣＢＩ番号１６８７７７７８、ＮＣＢＩ番号４５１２２６１
（８）シナプチン（ｓｙｎａｐｓｉｎ）：ＮＣＢＩ番号７３０５５３３、ＮＣＢＩ番号１８６０６４４６
（９）熱ショック７０ＫＤ蛋白質（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０ｋＤ ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号１１６１２４８９、 ＮＣＢＩ番号２０８２６９４６
（１０）ダーミシジン（ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ）：ＮＣＢＩ番号１６７５１９２１
（１１）アルファ−Ｓ１ カゼイン前躯体（Ａｌｐｈａ−Ｓ１ ｃａｓｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）：ＮＣＢＩ番号１１５６４６
（１２） ＲＴＮ４：ＮＣＢＩ番号２３３７９８１７、ＮＣＢＩ番号２１８９８５７７
（１３）アンキリン結合細胞接着分子ニューロファスチン（ ａｎｋｙｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｎｅｕｒｏｆａｓｃｉｎ ［Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ］ ）：ＮＣＢＩ番号１８４２４２９
（１４） １５０−ｋＤａ酸素制御蛋白質（１５０−ｋＤａ ｏｘｙｇｅｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号１２８３１２２９
（１５）イオノトロピックグルタミン酸レセプター（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ）：ＮＣＢＩ番号８３９３３１３、ＮＣＢＩ番号２０８７２２６０
（１６）アクチニンアルファ（ａｃｔｉｎｉｎ ａｌｐｈａ）：ＮＣＢＩ番号１１２３０８０２、ＮＣＢＩ番号２１３０７７３２
（１７） ＡＴＰアーゼ、Ｈ＋／Ｋ＋トランスポーターアルファＡＴＰａｓｅ， Ｈ＋／Ｋ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ， ａｌｐｈａ：ＮＣＢＩ番号９０５５１７０、ＮＣＢＩ番号２０１４９７２８
（１８）ダイナミン（Ｄｙｎａｍｉｎ）：ＮＣＢＩ番号４８７８５５、ＮＣＢＩ番号２１９６１２５４
（１９）ジペプチジルアミノペプチダーゼ様蛋白質（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）： ＮＣＢＩ番号４０３８３４８、ＮＣＢＩ番号２２６５３７１５
（２０）アダプター関連蛋白質複合体（ａｄａｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）：ＮＣＢＩ番号２０３４７５７１、ＮＣＢＩ番号６６７１５６３
（２１）アルファグルコシダーゼ２（ａｌｐｈａ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ２， ａｌｐｈａ ｎｅｕｔｒａｌ）：ＮＣＢＩ番号６６７９８９１
（２２）ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８９０３０２、ＮＣＢＩ番号１６７４１６３３
（２３）アトラスティン（Ａｔｌａｓｔｉｎ）： ＮＣＢＩ番号２０９０９７８０、ＮＣＢＩ番号１９９２３４４５
（２４）カルシウム／カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼ（Ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号６６７１６６０、ＮＣＢＩ番号１８１５８４２０
（２５）チューブリンアルファ（ｔｕｂｕｌｉｎ ａｌｐｈａ）：ＮＣＢＩ番号２０８９３１７９、ＮＣＢＩ番号６７５５９０１
（２６）シナプトタグミン（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６６７８１９７
（２７）カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８５７２７８、ＮＣＢＩ番号６７５３２７２
（２８）トゥイーティーホモログ２（ｔｗｅｅｔｙ （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ） ｈｏｍｏｌｏｇ ２）：ＮＣＢＩ番号２０８４７９３４
（２９）蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０９１３９２９
（３０）アルドラーゼ（Ａｌｄｏｌａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号７５４８３２２
（３１）グアニンヌクレオチド結合蛋白質（ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６６８００３５、ＮＣＢＩ番号６７５４００８
（３２）アクチン（ａｃｔｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６７５２９５２、ＮＣＢＩ番号２０９１０７３２、ＮＣＢＩ番号２０８１８８４４
（３３）ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ触媒サブユニット（ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）：ＮＣＢＩ番号２００３６７、ＮＣＢＩ番号７１１０６９３
（３４）トロポモジュリン（Ｔｒｏｐｏｍｏｄｕｌｉｎ）：ＮＣＢＩ番号２０８９０９４８、ＮＣＢＩ番号７７１０１０２
（３５）バキュオラーＡＴＰ合成酵素（Ｖａｃｕｏｌａｒ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号１２５８５５２５
（３６）セプチン（ｓｅｐｔｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６６８５７６３、ＮＣＢＩ番号６７５４８１６
（３７）アセチルコエンザイムＡアシルトランスフェラーゼ（Ａｃｅｔｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８９６２６９、ＮＣＢＩ番号２０３４２３５０
（３８）グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８８９８４６、ＮＣＢＩ番号９０３１３
（３９）グルタミン合成酵素（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号４８３９１８、ＮＣＢＩ番号２０８２５７７２
（４０）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８９７０６１、ＮＣＢＩ番号２０８２９８８９
（４１）リボソーマル蛋白質Ｌ６（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ６）：ＮＣＢＩ番号１４２１０１０６、ＮＣＢＩ番号６７５５３５４
（４２）シナプトフィシン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）：ＮＣＢＩ番号２０９８３０１０、ＮＣＢＩ番号６６７８１９５
（４３）キャッピング蛋白質アルファ（ｃａｐｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ）：ＮＣＢＩ番号６６７１６７２、ＮＣＢＩ番号１２８４２２４８
（４４）乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号６６７８６７４
（４５）ＡＴＰアーゼ、Ｈ＋トランスポーター（ＡＴＰａｓｅ， Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ）：ＮＣＢＩ番号２０８８６３６７、ＮＣＢＩ番号１５０２９７１９
（４６）理研ｃＤＮＡ １０１０００１Ｎ１１；ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ３９ＫＤＡサブニット前躯体（ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ １０１０００１Ｎ１１；ＮＡＤＨ−ＵＢＩＱＵＩＮＯＮＥ ＯＸＩＤＯＲＥＤＵＣＴＡＳＥ ３９ ＫＤＡ ＳＵＢＵＮＩＴ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ））：ＮＣＢＩ番号２０８３２５５６、ＮＣＢＩ番号１３３８４７２０
（４７）酸性リボゾーマルリン酸化蛋白質Ｐ０（ａｃｉｄｉｃ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ＰＯ）：ＮＣＢＩ番号６６７１５６９、ＮＣＢＩ番号１３２７７９２７
（４８）理研ｃＤＮＡ ２６１００２０Ｈ１５（ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２６１００２０Ｈ１５）：ＮＣＢＩ番号２０８８３０７０
（４９）ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８７８７４５
（５０）ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋ トランスポーターミトコンドリアＦ１複合体（ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ， Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆ１ ｃｏｍｐｌｅｘ）：ＮＣＢＩ番号７９４９００３、ＮＣＢＩ番号６６８０７４８
（５１）興奮性アミノ酸トランスポーター（Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）：ＮＣＢＩ番号２０９０８４７７
（５２）チューブリンベータ（ｔｕｂｕｌｉｎ， ｂｅｔａ）：ＮＣＢＩ番号１２９６３６１５、ＮＣＢＩ番号１３３２４６７９
（５３）３−オキソ酸 ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号１８２６６６８０
（５４）異種性核リボヌクレオ蛋白質Ｇ（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）：ＮＣＢＩ番号２３２７４０３３、ＮＣＢＩ番号２０８８５３７４
（５５）クレアチンキナーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号１０９４６５７４
（５６）インターロイキンエンハンサー結合因子（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）：ＮＣＢＩ番号１３３８５８７２
（５７）Ｎ−ｍｙｃ下流（Ｎ−ｍｙｃ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）：ＮＣＢＩ番号７３０５３０５
（５８）２’，３’−サイクリック−ヌクレオチド３’−フォスフォジエステラーゼ（ ２’，３’−ｃｙｃｌｉｃ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号３０９１７８
（５９）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８８８９２９、ＮＣＢＩ番号２０８２８３５１
（６０）マレイン酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号６６７８９１６
（６１）ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋ トランスポーター（ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ， Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ）：ＮＣＢＩ番号６６８０７４８
（６２） ＡＴＰアーゼ、Ｈ＋ トランスポーター（ＡＴＰａｓｅ， Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ）：ＮＣＢＩ番号１９５２７０６４、ＮＣＢＩ番号１１８４６６１
（６３）ダーミシジン前躯体（ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）
（６４）Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼアルファ−１サブユニット （Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ ａｌｐｈａ−１ ｓｕｂｕｎｉｔ）：ＮＣＢＩ番号２０５６３２
（６５）ＡＴＰアーゼアルファ２，Ｎａ／Ｋ（ＡＴＰａｓｅ ａｌｐｈａ２，Ｎａ／Ｋ）：ＮＣＢＩ番号３５８９６０
（６６）（ＮＭ＿０２２０３０）シナプティックベヒクル糖蛋白質２ａ（（ＮＭ＿０２２０３０） ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ）：ＮＣＢＩ番号３５８９６０
（６７）（ＸＭ＿１２５６７９）ヘキソキナーゼ１類似， アイソフォームＨＫＩ−Ｒ； 脳型ヘキソキナーゼ（（ＸＭ＿１２５６７９） ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ １， ｉｓｏｆｏｒｍ ＨＫＩ−Ｒ； ｂｒａｉｎ ｆｏｒｍ ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２０８６０６７０
（６８）血管アデノシントリホスファターゼサブユニットＢ（ｖａｃｕｏｌａｒ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ）：ＮＣＢＩ番号１１８４６６１
（６９） （ＮＭ＿００７５０５） ＡＴＰ合成酵素， Ｈ＋トランスポーター， ミトコンドリアＦ１複合体， アルファサブユニットアイソフォーム１（（ＮＭ＿００７５０５） ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ， Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ， ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆ１ ｃｏｍｐｌｅｘ， ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ，ｉｓｏｆｏｒｍ １）：ＮＣＢＩ番号６６８０７４８
（７０）グルタミン酸／アスパラギン酸トランスポーター（ｇｌｕｔａｍａｔｅ／ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）：ＮＣＢＩ番号９１３７９６
（７１）２’，３’−サイクリック−ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ、ｇｉ｜２７９５４７（２’，３’−ｃｙｃｌｉｃ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ、ｇｉ｜２７９５４７）：ＮＣＢＩ番号２７９５４７
（７２）アクチン、ｇｉ｜２０８９４１０１（ａｃｔｉｎ、ｇｉ｜２０８９４１０１）：ＮＣＢＩ番号２０８９４１０
（７３）グルタミン合成酵素類似（ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ）：ＮＣＢＩ番号２０８２５７７２
（７４） ｃＡＭＰ−依存性蛋白質キナーゼ触媒サブユニット（ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）：ＮＣＢＩ番号８５６８０７９、ＮＣＢＩ番号６７５５０７６
（７５）グアニンヌクレオチド結合蛋白質（ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６７５４０１２
（７６）コンタクチン１（ｃｏｎｔａｃｔｉｎ １）：ＮＣＢＩ番号６６８０９５４
（７７） ＡＴＰ合成酵素， Ｈ＋トランスポーターミトコンドリアＦ１複合体（ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ， Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆ１ ｃｏｍｐｌｅｘ）：ＮＣＢＩ番号７９４９００３
（７８）グルコースホスフェート イソメラーゼ１ 複合体（ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ １ ｃｏｍｐｌｅｘ）：ＮＣＢＩ番号２０８２５７５３
（７９）蛋白質キナーゼ， ｃＡＭＰ依存性ＩＩ型ベータ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ， ｃＡＭＰ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ， ｔｙｐｅ ＩＩ ｂｅｔａ）：ＮＣＢＩ番号２０８４７７６８
（８０）ニューロトリミン前躯体類似（ＧＰ６５）（ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ＮＥＵＲＯＴＲＩＭＩＮ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ （ＧＰ６５））：ＮＣＢＩ番号２０８８４３１７
（８１）仮説上蛋白質ＸＰ＿１６６３５７（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＸＰ＿１６６３５７）：ＮＣＢＩ番号２０５５６２５３
（８２）アクチン（ａｃｔｉｎ）：ＮＣＢＩ番号２０８９４１０１
（８３） ２’，３’−サイクリック−ヌクレオチド３’−フォスフォジエステラーゼ（ ２’，３’−ｃｙｃｌｉｃ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）：ＮＣＢＩ番号２７９５４７
（８４）グルタミン合成酵素類似（ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ）：ＮＣＢＩ番号２０８２５７７２
（８５） Ｎａ＋／Ｋ＋−交換ＡＴＰアーゼ（ＥＣ ３．６．１．３７）ベータ−２鎖（Ｎａ＋／Ｋ＋−ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ ＡＴＰａｓｅ （ＥＣ ３．６．１．３７） ｂｅｔａ−２ ｃｈａｉｎ）：ＮＣＢＩ番号９１１２７
（８６）ＳＲＣ基質コルタクチン類似蛋白質（ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ＳＲＣ ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ ＣＯＲＴＡＣＴＩＮ）：ＮＣＢＩ番号２０８９５２５５
（８７）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ類似蛋白質（ＧＡＰＤＨ）：ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ） ：ＮＣＢＩ番号２０３４３９９３
（８８）キャッピング蛋白質アルファ２（ｃａｐｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ ２） ：ＮＣＢＩ番号１２８４２２４８
（８９） ＡＴＰ合成酵素， Ｈ＋トランスポーターミトコンドリア複合体（ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ， Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）：ＮＣＢＩ番号１１６０２９１６
（９０）リボゾーム蛋白質Ｌ６（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ６）：ＮＣＢＩ番号１１６０２９１６
（９１） 理研ｃＤＮＡ １０１０００１Ｎ１１（ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ １０１０００１Ｎ１１）：ＮＣＢＩ番号１３３８４７２０
（９２）Ｎ−エチルマレイミド融合蛋白質接着蛋白質アルファ（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ）：ＮＣＢＩ番号１３３８５３９２
（９３）電圧−依存性アニオンチャネル１（ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ １）：ＮＣＢＩ番号６７５５９６３
（９４）シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）：ＮＣＢＩ番号６９８１６００
（９５）転写因子Ｅ２Ｆ２類似蛋白質（Ｅ２Ｆ−２）（ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲ Ｅ２Ｆ２（Ｅ２Ｆ−２））：ＮＣＢＩ番号２０８４８８４１
（９６）グアニンヌクレオチド結合蛋白質（ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＣＢＩ番号１３９３７３９１
【００２１】
なお、実施例において採用した方法は、Ａβ結合蛋白質を採取する目的において好適な方法であるが、目的に応じて適宜改変を行うことによりその他のＡβ結合蛋白質を同定することもできる。例えば、架橋を行うためのクロス架橋試薬として以下の試薬を使用することができるが、クロス架橋試薬はそれらに限定されるものではない。
（１） ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ （ＤＳＳ）
（２） １，６−Ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｅ （ＢＭＨ）
（３） １−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ （ＥＤＣ）
（４） Ｎ−［ｇ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ］ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ （ＧＭＢＳ）
（５） Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ］ｂｕｔｙｒａｔｅ （ＳＭＰＢ）
（６） ｂｅｔａ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＢＭＰＡ）
（７） １，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ （ＤＦＤＮＢ）
【００２２】
本発明において、アフィニティークロス架橋は、Ａβ４０とＡβ結合蛋白質の間に生じた立体構造を固定する目的で使用しているが、各々のクロス架橋試薬により、架橋ターゲットとなる官能基や結合する官能基間の距離（スペーサー）は異なっている。それを考えると、種々のクロス架橋試薬を変えることにより、その他のＡβ結合蛋白質を同定することが可能である。
【００２３】
また、実施例においてはＡβ４０と結合する蛋白質の同定を行ったが、その多くはＡβ４２とも結合すると考えられる。しかし、［０００５］で述べたようにＡβ４０とＡβ４２にはいくらかの差異がある。よってＡβ４２を用いた場合には他のＡβ結合蛋白質を得ることが可能であり、Ａβ４２結合蛋白質もまたアルツハイマー病の予防・治療に関する有益な知見を提供するものである。よってＡβ４２と結合する蛋白質も本発明の範囲内から除外されるものではない。
【００２４】
本発明は、Ａβ結合蛋白質を用いて、ＡβとＡβ結合蛋白質との結合を阻害する医薬をスクリーニングする方法を提供するものである。上記で述べたように、アルツハイマー病では、Ａβが脳の局所に蓄積する老人班が認められる。Ａβの凝集が起こるにはコアとなる蛋白質が必要なので、得られた結合阻害剤が老人班形成阻害効果を発揮する可能性がある。このように、ＡβとＡβ結合蛋白質との結合は強く病態と相関していることから、ＡβとＡβ結合蛋白質の間の結合を通常の方法によりアッセイすることにより、老人班の形成を阻害する活性を有するアルツハイマー病の治療薬をスクリーニングすることができる。
【００２５】
既に述べた様に、アルツハイマー病においては神経の脱落が起こり、これが痴呆症のもっとも大きな原因となる。Ａβがどのようにして神経を変性させるのかについては未だ議論が続いているが、結合阻害剤を用いてＡβとＡβ結合蛋白質との間の結合を抑制してＡβの沈着を防止することにより、神経毒性を抑制できる可能性もある。
【００２６】
ＡβとＡβ結合蛋白質との結合を阻害する物質のスクリーニングは、例えば、本技術分野で汎用されている結合アッセイの方法を用いて行うことができる。具体的には、Ａβ結合蛋白質が膜蛋白質である場合には、その蛋白質をコードする遺伝子を細胞に導入してその細胞表面上に発現させて、Ａβ結合蛋白質を発現している細胞とＡβとを反応させることにより、両者の間の結合を測定することができる。なお、その際にスクリーニングする対象である化合物を反応系に添加し、Ａβを放射活性などで標識しておけば、その化合物の結合阻害能を評価することができる。
【００２７】
また、Ａβ結合蛋白質が可溶性蛋白質である場合には、インビトロの無細胞系で例えばタグ（ｔａｇ）を付けた状態で結合蛋白質を合成し、抗タグ抗体で結合蛋白質を精製することにより、タグが付加された結合蛋白質を得ることができる。その後、スクリーニングする対象である化合物と、精製された結合蛋白質とＡβを反応させる。抗タグ抗体で免疫沈降を行うことにより、結合蛋白質と共沈したＡβの量を、例えばウエスタンブロットにより測定することができる。
【００２８】
また、金の薄膜上に固定したＡβ結合蛋白質と他の分子との間の相互作用を、機械を用いて測定することもできる。具体的には、金の薄膜上にＡβ結合蛋白質を固定し、次いでＡβを添加して結合蛋白質と結合させ、スクリーニングする対象である化合物を添加する。この際のＡβ結合蛋白質からの解離を測定することにより、その化合物の結合阻害能を評価することができる。なお、表面プラズモ共鳴を利用して、金の薄膜上に固定した分子と他の分子との相互作用を測定するための装置が市販されており、この目的のために使用することができる。このような機械を用いた方法は、多検体を容易に処理することができるという利点がある。
【００２９】
また、水晶の振動によって分子同士の相互作用を測定する装置も市販されている。その装置を用いて、水晶振動子上にＡβ結合蛋白質を固定することにより、上記と同様の手法を用いて、スクリーニング対象化合物の結合阻害能を評価することができる。
【００３０】
更に、本発明のＡβ結合蛋白質の発現を促進または抑制する化合物をスクリーニングすることもできる。ワクチン療法において、Ａβに対する抗体が血中に存在すると脳内のＡβレベルが低下するのは、血液脳関門を介してＡβが排出されているからであると考えられている。この排出機構において、Ａβ結合蛋白質とＡβが結合してトランスサイトーシスによりＡβが血液側に排出されることにより、Ａβの排出が促進されている可能性がある。よって、Ａβ結合蛋白質の発現を誘導することにより、又はＡβ結合蛋白質の輸送機能を促進することにより、Ａβの抗体を用いたＡβワクチン療法と同等若しくはそれ以上のＡβ排除能を付与することができる可能性がある。この方法は免疫反応を利用したものではないために、ワクチン療法とは異なり、炎症反応などの危険性が少ない。よって本発明のＡβ結合蛋白質は、ワクチン療法に替わり得るアルツハイマー病の新たな治療法を提供する可能性がある。
【００３１】
Ａβ結合蛋白質の発現を変化させる化合物をスクリーニングするためには、ゲノムデータベースから結合蛋白質の遺伝子のゲノム配列を検索・同定し、転写開始部位周囲およそ５ｋｂｐ程にルシフェラーゼやガラクトシダーゼ等のレポーター遺伝子をつなげ、培養細胞に導入する。転写開始部位周囲には転写制御部位が存在するために、細胞内のレポーター遺伝子の発現に対する化合物の影響を計測することにより、目的とする化合物のスクリーニングを効果的に行うことができる。
【００３２】
また、本発明のＡβ結合蛋白質を含むキットを作製することもまた可能である。当該キットは一つまたは複数のＡβ結合蛋白質と、標識したＡβを含むキットであり、好ましくは塩強度とｐＨが適切に調整された緩衝液もまた含む。本キットにおいて、結合蛋白質との結合を検出するためにＡβは標識されている。標識の方法は特に限定されるものではないが、放射標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識、２、４−ジニトロフェノール標識など、本技術分野で知られている種々の技術が含まれる。そして、このキットを用いて通常の結合アッセイなどを行い、Ａβと結合蛋白質との結合を阻害する物質のスクリーニング等に利用することができる。本キットにおいて、一つのみならず多数のＡβ結合蛋白質を含むことは、本発明の好ましい態様であり、膜蛋白質と可溶性蛋白質など、性質が異なった複数の結合蛋白質を含むことは特に好ましい。
【００３３】
【実施例】
下記の実施例において本発明を更に詳しく解説するが、如何なる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００３４】
なお、本実施例において使用したアミロイドβとビオチニル化試薬は、下記のとおりである。
Ａβ４０：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ
ＭＷ＝４３１２
ビオチニル化試薬：Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチニレーションキット（ＰＩＥＲＣＥ社製）
【００３５】
（Ａβ４０のビオチニル化）
Ａβの水溶液とビオチニル化試薬の水溶液を調製し、過剰量のビオチニル化試薬をＡβに添加した。その後氷浴上で２時間または室温で３０分間放置してビオチニル化を行った。更にカラムにより未反応のビオチニル化試薬を除去し、ＨＡＢＡアッセイにより導入されたビオチン量を測定した。
【００３６】
（マウス脳毛細血管豊富画分膜タンパクサンプルの調製）
マウスを頚椎脱臼により屠殺して脳を摘出し、大脳を単離した（１匹分＝０．３ｇ）。リン酸緩衝液を加えて氷上で１０回ホモジナイズし、デキストラン溶液を加え、更にホモジナイズした。ホモジネートを４５００ｘｇで １６分間遠心し（４℃）、上層の脂肪層及び上清を除いた。ペレットに緩衝液を加えて懸濁し、ナイトロジェンキャビテーション法（８００ｐｓｉ， ３０分間， ４℃）により細胞を破砕した。懸濁液を１０，０００ｘｇで１６分間遠心し（４℃）、その上清を更に１００，０００ｘｇ （４０，２００ｒｐｍ）で６５分間遠心（４℃）した。ペレットに懸濁緩衝液を加えてピペッティングし、プロテアーゼ阻害剤を添加してサンプルを調製した。
【００３７】
（マウス大脳膜タンパクサンプルの調製）
マウスを頚椎脱臼により屠殺して脳を摘出し、大脳を単離した（１匹分＝０．３ｇ）。デンシティーグラジエント緩衝液を加え、プロテアーゼ阻害剤の存在下、氷上で１０回ホモジナイズした。ナイトロジェンキャビテーション法（８００ｐｓｉ，３０分間，４℃）により細胞を破砕し、懸濁液をチューブに入れ、１０，０００ｘｇで１６分間遠心（４℃）した。更に、上清を１００，０００ｘｇ（４０，２００ｒｐｍ）で６５分間遠心（４℃）した。ペレットに懸濁緩衝液６００ｕＬを加えてピペッティングし、プロテアーゼ阻害剤を添加してサンプルを調製した。
【００３８】
（Ａβ４０との結合）
サンプルにビオチニル化したＡβを添加し、Ａβの最終濃度を約１０ｕＭとした。全量が１．２ｍＬとなるように結合緩衝液を加えて攪拌と反転を行い、２５℃で２０から３０分間放置した。
【００３９】
（クロス架橋反応及びタンパクの可溶化）
ＤＳＳまたはＢＭＨなどのクロス架橋試薬をジメチルスルフォキシドに溶解し、２５℃で３０分間放置してＡβ４０の架橋反応を行った。１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し（４℃）、遠心ペレットに可溶化緩衝液とプロテアーゼ阻害剤を添加し、ピペッティングした後、４００ｒｐｍで一晩震盪（４℃）することにより可溶化を行った。
【００４０】
（Ａβ−蛋白質複合体の精製）
クロス架橋を行ったサンプルに、ストレプトアビジンビーズの添加を行った。４００ｒｐｍで１時間震盪（４℃）して、ビオチンとアビジンを結合させた。１５，０００ｒｐｍで３分間遠心（４℃）して上清を除く事により、生成した複合体を得た。遠心ペレットにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加え、９５℃で２ｍｉｎ加熱することにより、電気泳動用のサンプルを調製した。
【００４１】
（電気泳動）
泳動槽にアクリルアミドゲルをセットし、泳動槽に泳動バッファーを満たすことにより電気泳動（ラウリル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の準備を行った。サンプルを必要に応じて変性させて（９５℃，３分間）ゲルにアプライした。０．０４Ａの定電流の条件下（電圧は１００Ｖから２００Ｖ）でサンプルの泳動を行った。電気泳動後のゲルにつき、通常の方法で銀染色を行った。
【００４２】
（質量分析）
上記の電気泳動によって得られたバンドを切り出し、各バンドについてＬＣ−ＭＳ／ＭＳで解析することにより、Ａβと結合している分子を同定した。具体的なプロセスとしては、ＭＳ／ＭＳ測定により得られたデータを基にして、データベース検索を行うことによりＡβ結合蛋白質を同定した。多くの場合には１つのＭＳ／ＭＳデータから複数の蛋白質名が得られるが、それら複数の蛋白質のうち、分子量の最も大きなものを一つ選択した。各バンドから検出されたペプチドフラグメントと、そのフラグメントの配列から同定された蛋白質を表１に示す。
【００４３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
上記のＡβ結合蛋白質の中で、Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）は受容体と共役して細胞内情報伝達に関与する因子である。Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎがそのような役割を担っていることを考えると、受容体に結合した物質の取り込み機構に重要な役割を果たしている。よってＧ−ｐｒｏｔｅｉｎは、Ａｂの細胞内取り込みに関与している可能性が考えられる。
【００５５】
Ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ （ＳＶ２ａ）は１２回膜貫通のトランスポーター様構造をとっていることから、Ａｂの輸送に関与している可能性が考えられる。また、ＳＶ２ａのノックアウトマウスは生後すぐに重篤な痙攣を起こして死亡することから、中枢神経機能に重要な役割を果たしていると考えられる。
【００５６】
Ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ （Ｎ−ＣＡＭ１８０）については、アルツハイマー病などの痴呆疾患において、そのｍＲＮＡの発現量が低下することが報告され、アルツハイマー病との関連が示唆されている。また、Ｎ−ＣＡＭ１８０はシナプス間結合に必要な因子であり、Ａｂとの相互作用によってＮ−ＣＡＭ１８０の機能が阻害される可能性が考えられる。
【００５７】
Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＮＳＦ）， Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ （ＳＮＡＰ， ＮＡＰＡ）， およびｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ， ｓｙｎｔａｘｉｎは、小胞膜輸送の制御に関する分子である。よって、Ａｂの細胞内輸送に関与するか、もしくは、Ａｂが結合することによって細胞内輸送が阻害される可能性が考えられる。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、プロテオミクス技術を利用して、Ａβと結合する蛋白質群が包括的に与えられた。これらの蛋白質群の知見は、その蛋白質群を標的とした治療薬を開発する可能性を開くものであると共に、アルツハイマー病の原因解明に大きく寄与するものであると考えられる。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for comprehensively identifying a protein having a property of binding to amyloid β which is a cause of Alzheimer's disease (amyloid β binding protein) using proteomics technology. Furthermore, the present invention relates to a method for utilizing the protein identified by such a method.
[0002]
[Prior art]
Alzheimer's disease is a disease that starts in the late 40s and 50s in the elderly and in the late 70s and in the elderly, memory disorders, motivation disorders, impaired judgment, aphasia, apraxia, agnosia, personality Symptoms such as disability, emotional disorders, mirror disorders, and Kluber-Buchy syndrome appear, and they show symptoms of severe dementia. As pathological changes in the brain, senile plaques, Alzheimer's neurofibrillary tangles, loss of nerve cells, and the like are observed, and as the symptoms progress, the lesions become more severe, causing remarkable brain atrophy.
[0003]
The pathology of Alzheimer's disease includes abnormal and early deposition of amyloid proteins such as amyloid β40 and amyloid β42, and accumulation of phosphorylated tau protein in nerve cells. In addition, it has been revealed that the background is an abnormal decrease in neurotransmitters such as acetylcholine. Among the Alzheimer-type dementias, there is also familial Alzheimer's disease. Genetic abnormalities in the chromosomes Nos. 14, 19 and 21 have been reported as causes of the disease, and point mutations in the amino acid sequence of the amyloid β precursor protein have been reported. The existence of has been proven.
[0004]
As described above, in the brain affected by Alzheimer's disease, neurons in the cerebral neocortex and hippocampus are lost, and fibrous deposits such as senile plaques appear. A major component of senile plaque amyloid is the above-mentioned amyloid β protein (Aβ), and a part from the extracellular region of the amyloid precursor protein (APP), which is a precursor, to the middle of the transmembrane region is cut out by a two-step protease action. Is secreted. In the early stage of Alzheimer's disease, amyloid protein accumulation is the earliest phenomenon that occurs earlier than phosphorylation of tau protein. Thus, it is thought that the amyloid protein plays an important role in the development of Alzheimer's disease, and such an idea is called “amyloid hypothesis”. The latest knowledge on the Alzheimer's disease onset mechanism is described in detail in, for example, Iwatsubo et al.'S review (Clinical Neuroscience (2002) vol. 20 no. 6 p626-629: Non-Patent Document 1).
[0005]
In the first step of amyloid protein production, β-cleavage by β-secretase occurs, resulting in the formation of the N-terminus of Aβ. The C-terminal fragment of APP generated by β-cleavage is subsequently cleaved by γ-secretase, and the cleavage site is diverse. The main molecular species is Aβ40 consisting of 40 amino acid residues, but it is said that about 10% of Aβ42 consisting of 42 amino acid residues is also present. There is some difference in the properties of Aβ40 and Aβ42, and Aβ42 starts to accumulate from the beginning in pathological changes of Alzheimer's disease, while Aβ40 accumulates later. Also, Aβ42 is said to exhibit higher aggregability than Aβ40.
[0006]
Thus, in recent years, the detailed condition of Alzheimer's disease has been clarified, but no absolute preventive method or therapeutic method has yet been found. At this stage, pharmacotherapy and rehabilitation mainly based on cerebral function improving drugs such as cerebral metabolic activators, cerebral circulation improving drugs, and neurotransmitter function regulators are being performed.
[0007]
Meanwhile, Aβ vaccine therapy targeting Aβ has attracted attention as a new treatment method for Alzheimer's disease. As an example, Schenk et al. Have reported that when an animal model of Alzheimer's disease such as a PDAPP mouse was immunized with Aβ, an antibody against Aβ was produced and amyloid deposition was suppressed (Nature (1999) vol. 400 p173-177). Such vaccine therapy is effective because the generated anti-Aβ antibody reacts with the senile plaques in the brain microglia through the blood-brain barrier, and the senile plaques of the microglia are phagocytosed and disappeared via the Fc receptor. It is estimated that Although this vaccine therapy reached the stage of clinical experiment, it has not been put to practical use yet because of the disadvantage that an inflammatory reaction is observed. Vaccine therapy is described in detail in, for example, Hariya et al.'S review (Clinical Neuroscience (2002) vol. 20 no. 6 p706-707: Non-Patent Document 3).
[0008]
The blood-brain barrier also plays a role in regulating the equilibrium of Aβ concentration in the blood and in the brain. By administering an Aβ vaccine, an antibody against Aβ and Aβ bind in the blood, It is considered that the balance of excretion at the blood-brain barrier is greatly inclined to the blood side. It is thought that such a change in equilibrium promotes Aβ excretion from the brain, and decreases the amount of Aβ in the brain and increases the amount of Aβ in the blood. Thus, the sink hypothesis (DeMattos RB et al., Proc Natl Acad Sci USA (2001) vol. 98 no. 15 p8850-8855: non-sinking hypothesis that excretion via the blood-brain barrier is promoted in vaccine therapy. Patent Document 4) has also been proposed, and has a more powerful idea than the hypothesis of phagocytosis of microglia.
[0009]
[Non-patent document 1]
Tomoko Wakabayashi, Takeshi Iwatsubo, "How far has Alzheimer's disease been elucidated?", Clinical Neuroscience (2002) vol. 20 no. 6 p626-629
[Non-patent document 2]
Schenk D. et al. , Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer disease like pathology in the PDAPP mouse. Nature (1999) vol. 400 p173-177
[Non-Patent Document 3]
Yasuo Hariya, “Vaccine Therapy,” Clinical Neuroscience (2002) vol. 20 no. 6 p706-707
[Non-patent document 4]
DeMattos RB et al. , Proc Natl Acad Sci USA (2001) vol. 98 no. 15 p8850-8855
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a technique contributing to the purpose of developing a new method of treating and preventing Alzheimer's disease that is more effective and safer than vaccine therapy.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have focused on proteomics technology, which has made remarkable progress in recent years, and have comprehensively determined a group of proteins that bind to Aβ using the technology. Knowledge of these proteins will greatly contribute to elucidating the causes of Alzheimer's disease, and will also open up the possibility of developing therapeutics targeting those proteins.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In recent years, a mechanism has been proposed in which Aβ is excreted from the brain into circulating blood by transport through the blood-brain barrier (BBB). Considering the amyloid hypothesis, it is considered important to prevent the deposition of Aβ in order to treat and prevent Alzheimer's disease. Some proteins contribute to the mechanism of excreting Aβ out of the brain by binding to Aβ, and thus it is thought that Aβ-binding proteins are involved in controlling Aβ levels in the brain. Considering this, there is a possibility that Aβ deposition can be prevented by an approach of targeting a protein capable of binding to Aβ and inhibiting the interaction with an Aβ-Aβ binding protein.
[0013]
In Alzheimer's disease, neurodegeneration is observed, but the relationship between Aβ accumulation and neurodegeneration has not yet been elucidated. Also. The mechanism by which Aβ deposition occurs is not yet clear. However, it is highly likely that Aβ and the binding protein play some role in these phenomena. From this viewpoint, it is considered that inhibition of the interaction between Aβ and Aβ binding protein is significant in the treatment and prevention of Alzheimer's disease.
[0014]
By the way, in recent years, a new technique of proteomics has been developed in which a large amount of protein is automatically measured by directly connecting a liquid chromatography (LC), a mass spectrometer (MS), and a data analysis system. The term “proteomics” means that the entire protein (proteome), which is the final product of genomic information, is analyzed on a large scale. In the conventional method, it is considered that it is indispensable to first isolate the target protein in order to identify the protein, and therefore, it was necessary to separate the protein by, for example, an electrophoresis method.
[0015]
Although such a technique is still an important technique for identifying a protein at present, a protein processing technology with a high processing capability based on LC-MS / MS, etc., based on the accumulation of genomic information and technological innovation of MS. Was created. When a device in which LC and MS are connected in series is LC-MS and a tandem mass spectrometer (MS / MS) is connected to LC, break analysis of the sample in MS (LC-MS / MS) Becomes possible.
[0016]
In the proteomics technique using LC-MS / MS, a component of a protein mixture or a complex composed of a plurality of proteins can be directly identified without being separated by digestion with a highly specific protease such as trypsin. . The basis for the identification is the precise mass value of the digested peptide fragment and its cleaved fragment, terminal amino acid information depending on the protease used, and PC and algorithm analysis for processing it at high speed. This identification method is called a sequence tag method, and it is possible to identify a specific protein on the basis of information on a peptide, and the existing base sequence information including fragmentary information such as EST (expression sequence tag) can be identified. Can all be used. In proteosome research, LC-MS / MS is widely used for protein identification by the sequence tag method. Such a proteomics technology has a feature that the throughput is higher than that of the conventional method. The technique of a large-scale protein analysis system by proteomics is described in, for example, a review by Taoka et al. (Experimental Medicine “Large-scale protein analysis system for analysis of intracellular functional complex,” Vol. ) Etc. can be referred to.
[0017]
Although such proteomics technology has many potentials, hitherto no comprehensive identification of Aβ binding proteins has been made using proteomics technology. In the present invention, a large number of Aβ binding proteins have been identified using such a new technique, but the findings of the present invention are useful for developing new therapeutic agents for Alzheimer's disease and elucidating the mechanism of Alzheimer's disease. I think that the. Therefore, in the present invention, the term “Aβ binding protein” comprehensively refers to a group of proteins capable of binding to Aβ. In the specification of the present application, "comprehensive identification" refers to the concept of identifying a complex composed of a large number of proteins without separating them using proteomics technology. Is intended to be distinguished from the conventional technique of performing
[0018]
In the following examples, Aβ binding proteins were identified in proteins derived from mouse brain capillary endothelial cells and cerebral membrane. A crude membrane protein was prepared from the above sample, and Aβ40 and an Aβ-binding protein in the crude membrane protein were bound using biotinylated Aβ40, and further subjected to affinity cross-linking. After solubilizing the cross-linked sample, streptavidin beads were added to form a complex of biotinylated Aβ40 and avidin. The proteins were separated by electrophoresis, and the proteins contained in each of the obtained bands were identified by LC-MS / MS. As a result, in the following Examples, a group of proteins that bind to Aβ40 was identified. These proteins interact with Aβ40 and are thought to be candidates for factors involved in Aβ transport at the blood-brain barrier.
[0019]
The proteins described in the following list are suitable as the Aβ binding proteins of the present invention. However, proteins that bind to Aβ may exist in addition to the proteins listed in this list, and the use of such other proteins is not excluded in the present invention. In the following list, the Aβ binding proteins identified in the examples are shown together with the registered NCBI numbers.
[0020]
(1) Plasma membrane calcium ATPase (plasma membrane Ca) 2+ -ATPase): NCBI number 6753140
(2) ATPase, Na + / K + Transporter alpha (ATPase, Na + / K + (transporting, alpha): NCBI No. 16307541, NCBI No. 1548862
(3) Neuronal cell adhesion molecule 1 (Neural cell adhesion molecule 1, 180 kDa isoform precursor (N-CAM 180)): NCBI number 400402
(4) Contactin-associated protein: NCBI No. 7949100, NCBI No. 203477955
(5) Contactin: NCBI number 6680954
(6) N-maleimide sensitive fusion protein: NCBI No. 20347659, NCBI No. 20913355
(7) Neurochondrin: NCBI number 168777778, NCBI number 451261
(8) Synapsin: NCBI No. 7305533, NCBI No. 18606446
(9) Heat shock 70 kD protein: NCBI No. 11612489, NCBI No. 20826946
(10) dermicidin: NCBI number 16759211
(11) Alpha-S1 casein precursor: NCBI number 115646
(12) RTN4: NCBI number 23379817, NCBI number 21898577
(13) Ankyrin-binding cell adhesion molecule neurofastin [Rattus norvegicus]: NCBI No. 1842429
(14) 150-kDa oxygen-regulated protein: NCBI No. 12831229
(15) Ionotropic glutamate receptor (glutamate receptor, ionotropic): NCBI No. 8393313, NCBI No. 20872260
(16) actinin alpha: NCBI number 11230802, NCBI number 21307732
(17) ATPase, H + / K + Transporter Alpha ATPase, H + / K + transporting, alpha: NCBI number 9055170, NCBI number 20149728
(18) Dynamin: NCBI number 487855, NCBI number 2196254
(19) dipeptidyl aminopeptidase-like protein: NCBI No. 4038348, NCBI No. 2265715
(20) Adapter-related protein complex: NCBI No. 20347571, NCBI No. 6671563
(21) alpha glucosidase 2, alpha neutral: NCBI number 6679891
(22) Pyruvate kinase: NCBI No. 20890302, NCBI No. 1674633
(23) Atlastin: NCBI number 20909780, NCBI number 19923445
(24) Calcium / calmodulin-dependent protein kinase: NCBI number 6671660, NCBI number 18158420
(25) Tubulin alpha: NCBI No. 20893179, NCBI No. 6755901
(26) Synaptotagmin: NCBI number 6678197
(27) Catalase: NCBI No. 20857278, NCBI No. 6753272
(28) Tweety (Drosophila) homolog 2: NCBI number 20847934
(29) Protein disulfide-isomerase: NCBI No. 20913929
(30) Aldolase: NCBI No. 7548322
(31) Guanine nucleotide binding protein: NCBI No. 6680035, NCBI No. 6754008
(32) actin: NCBI number 6752952, NCBI number 20910732, NCBI number 20818844
(33) cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit: NCBI No. 200367, NCBI No. 7110693
(34) Tropomodulin: NCBI number 20890948, NCBI number 7710102
(35) Vacuolar ATP synthase: NCBI No. 12585525
(36) septin: NCBI number 6685763, NCBI number 6754816
(37) Acetyl-Coenzyme A acyltransferase: NCBI number 20896269, NCBI number 20342350
(38) Glutamate oxaloacetate transaminase: NCBI number 20889846, NCBI number 90313
(39) Glutamine synthase: NCBI No. 483918, NCBI No. 20825772
(40) glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: NCBI number 20897061, NCBI number 20829889
(41) Ribosomal protein L6: NCBI number 14210106, NCBI number 6755354
(42) Synaptophysin: NCBI No. 20983010, NCBI No. 6678195
(43) Capping protein alpha: NCBI number 6671672, NCBI number 1842248
(44) Lactate dehydrogenase: NCBI number 6678674
(45) ATPase, H + Transporter (ATPase, H + (Transporting): NCBI No. 20886367, NCBI No. 15029719
(46) RIKEN cDNA 1010001N11; NADH-ubiquinone oxidoreductase 39KDA subunit precursor (RIKEN cDNA 1010001N11; NADH-UBIQUININE OXIDOREDUCTASE 39 KDA SUBUNIT PRECURSOR): NCBI No. 20832B47C
(47) Acidic ribosomal phosphorylated protein P0 (acid ribosomal phosphoprotein PO): NCBI No. 6671569, NCBI No. 13277927
(48) RIKEN cDNA 261020H15 (RIKEN cDNA 261020H15): NCBI number 2088370
(49) Dimethylarginine dimethylaminohydrolase: NCBI No. 20878745
(50) ATP synthase, H + Transporter mitochondrial F1 complex (ATP synthase, H + (transporting mitochondrial F1 complex): NCBI number 7949003, NCBI number 6680748
(51) Excitatory amino acid transporter: NCBI No. 20908777
(52) Tubulin, beta: NCBI No. 12936615, NCBI No. 13324679
(53) 3-Oxoacid CoA transferase: NCBI No. 18266680
(54) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein G: NCBI number 23274033, NCBI number 20885374
(55) creatine kinase: NCBI number 10946574
(56) Interleukin enhancer binding factor: NCBI No. 13385872
(57) N-myc downstream (N-myc downstream): NCBI number 7305305
(58) 2 ′, 3′-cyclic-nucleotide 3′-phosphodiesterase (2 ′, 3′-cyclic-nucleotide 3′-phosphodiesterase): NCBI No. 309178
(59) Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase: NCBI No. 20888929, NCBI No. 20828351
(60) maleate dehydrogenase: NCBI No. 6678916
(61) ATP synthase, H + Transporter (ATP synthase, H + (Transporting): NCBI number 6680748
(62) ATPase, H + Transporter (ATPase, H + (Transporting): NCBI number 19527064, NCBI number 1184661
(63) Dermcidin precursor
(64) Na, K-ATPase alpha-1 subunit (Na, K-ATPase alpha-1 subunit): NCBI No. 205632
(65) ATPase alpha 2, Na / K (ATPase alpha 2, Na / K): NCBI No. 358960
(66) (NM — 022030) Synaptic vehicle glycoprotein 2a: (NCBI number 358960)
(67) (XM — 125679) hexokinase 1 analog, isoform HKI-R; brain-type hexokinase ((XM — 125679) similar to hexakinase 1, isoform HKI-R; brain form hexakinase): NC702086
(68) Vascular adenosine triphosphatase subunit B: NCBI No. 1184661
(69) (NM_007505) ATP synthase, H + Transporter, mitochondrial F1 complex, alpha subunit isoform 1 ((NM_007505) ATP synthase, H + transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit, isoform 1): NCBI number 6680748
(70) Glutamate / aspartate transporter: NCBI number 913796
(71) 2 ′, 3′-cyclic-nucleotide 3′-phosphodiesterase, gi | 27947 (2 ′, 3′-cyclic-nucleotide 3′-phosphodiesterase, gi | 27947): NCBI No. 279947
(72) actin, gi | 20894101 (actin, gi | 20894101): NCBI number 2089410
(73) Similar to glutamine synthase (similar to GLUTAMINE SYNTHEETASE): NCBI No. 20825772
(74) cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit: NCBI number 8568079, NCBI number 6755076
(75) Guanine nucleotide binding protein: NCBI No. 6754012
(76) contactin 1: NCBI number 6680954
(77) ATP synthase, H + Transporter mitochondrial F1 complex (ATP synthase, H + (transporting mitochondrial F1 complex): NCBI number 7949003
(78) Glucose phosphate isomerase 1 complex: NCBI No. 20825753
(79) protein kinase, cAMP-dependent type II beta (protein kinase, cAMP dependent regulatory, type II beta): NCBI No. 20847768
(80) Similar to Neurotrimine Precursor (GP65) (similar to NEROTRIMIN PRECURSOR (GP65)): NCBI No. 20884317
(81) Hypothetical protein XP_166357: NCBI No. 20556253
(82) actin: NCBI number 20894101
(83) 2 ', 3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (2', 3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase): NCBI number 279947
(84) Similar to glutamine synthase (similar to GLUTAMINE SYNTHEETASE): NCBI No. 20825772
(85) Na + / K + -Exchange ATPase (EC 3.6.1.37) beta-2 chain (Na + / K + -Exchanging ATPase (EC 3.6.1.37) beta-2 chain: NCBI number 91127
(86) SRC substrate cortactin-like protein (similar to SRC SUBSTRATE CORTACTIN): NCBI No. 20895255
(87) Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-like protein (GAPDH): similar to Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH): NCBI No. 20343993
(88) capping protein alpha 2: NCBI No. 1842248
(89) ATP synthase, H + Transporter mitochondrial complex (ATP synthase, H + (transporting mitochondrial complex): NCBI number 1162916
(90) Ribosomal protein L6: NCBI No. 1162916
(91) Riken cDNA 1010001N11 (RIKEN cDNA 1010001N11): NCBI No. 13384720
(92) N-ethylmaleimide fusion protein adhesion protein alpha: NCBI No. 13853852 (N-Ethylmaleimide Sensitive Fusion Protein Attachment Protein Alpha)
(93) Voltage-dependent anion channel 1: NCBI No. 6755963
(94) syntaxin: NCBI number 6981600
(95) Transcription factor E2F2-like protein (E2F-2) (similar to TRANSCRIPTION FACTOR E2F2 (E2F-2)): NCBI No. 20848841
(96) Guanine Nucleotide-Binding Protein: NCBI No. 13937391
[0021]
Although the method adopted in the examples is a method suitable for collecting Aβ binding protein, other Aβ binding proteins can be identified by appropriately modifying according to the purpose. For example, the following reagents can be used as a cross-crosslinking reagent for performing cross-linking, but the cross-linking reagent is not limited thereto.
(1) disuccinimidyl subrate (DSS)
(2) 1,6-Bismaleimidohexane (BMH)
(3) 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)
(4) N- [g-Maleimidobutyryloxy] succinimide ester (GMBS)
(5) Succinimidyl 4- [p-maleimididophenyl] butyrate (SMPB)
(6) beta-maleimididopropionic acid (BMPA)
(7) 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene (DFDNB)
[0022]
In the present invention, the affinity cross-linking is used for fixing the three-dimensional structure generated between Aβ40 and the Aβ-binding protein. The distance (spacer) between them is different. Considering that, it is possible to identify other Aβ binding proteins by changing various cross-linking reagents.
[0023]
In the examples, proteins that bind to Aβ40 were identified, but most of them are considered to also bind to Aβ42. However, there are some differences between Aβ40 and Aβ42 as described in [0005]. Therefore, when Aβ42 is used, another Aβ-binding protein can be obtained, and the Aβ42-binding protein also provides useful knowledge on the prevention and treatment of Alzheimer's disease. Therefore, proteins that bind to Aβ42 are not excluded from the scope of the present invention.
[0024]
The present invention provides a method for screening a drug that inhibits the binding between Aβ and Aβ binding protein using the Aβ binding protein. As described above, in Alzheimer's disease, senile plaques where Aβ accumulates locally in the brain are observed. Since aggregation of Aβ requires a core protein, the obtained binding inhibitor may exert an inhibitory effect on senile plaque formation. As described above, since the binding between Aβ and Aβ binding protein strongly correlates with the disease state, the activity between Aβ and Aβ binding protein is assayed by a conventional method to inhibit the formation of senile plaques. Can be screened for a therapeutic agent for Alzheimer's disease having
[0025]
As already mentioned, neurological loss occurs in Alzheimer's disease, which is the leading cause of dementia. There is still debate about how Aβ degenerates the nerve, but by using a binding inhibitor to suppress the binding between Aβ and Aβ binding protein to prevent Aβ deposition, Neurotoxicity may be suppressed.
[0026]
Screening for a substance that inhibits the binding between Aβ and an Aβ binding protein can be performed, for example, using a binding assay method widely used in the art. Specifically, when the Aβ-binding protein is a membrane protein, a gene encoding the protein is introduced into a cell and expressed on the cell surface, and the cell expressing the Aβ-binding protein and Aβ The reaction between the two can be measured. In this case, if a compound to be screened is added to the reaction system and Aβ is labeled with radioactivity or the like, the ability of the compound to inhibit binding can be evaluated.
[0027]
When the Aβ binding protein is a soluble protein, the tag is synthesized by synthesizing the binding protein in an in vitro cell-free system, for example, with a tag, and purifying the binding protein with an anti-tag antibody. An added binding protein can be obtained. Thereafter, the compound to be screened is reacted with the purified binding protein and Aβ. By performing immunoprecipitation with an anti-tag antibody, the amount of Aβ co-precipitated with the binding protein can be measured, for example, by Western blot.
[0028]
Further, the interaction between the Aβ binding protein immobilized on the gold thin film and other molecules can be measured using a machine. Specifically, an Aβ binding protein is immobilized on a gold thin film, and then Aβ is added to bind to the binding protein, and a compound to be screened is added. By measuring the dissociation from the Aβ binding protein at this time, the ability of the compound to inhibit the binding can be evaluated. An apparatus for measuring the interaction between a molecule immobilized on a gold thin film and another molecule using surface plasmo resonance is commercially available, and can be used for this purpose. The method using such a machine has an advantage that multiple samples can be easily processed.
[0029]
Further, an apparatus for measuring the interaction between molecules by vibrating quartz crystal is also commercially available. By immobilizing the Aβ binding protein on a quartz oscillator using the device, the ability to inhibit the binding of the screening target compound can be evaluated using the same method as described above.
[0030]
Furthermore, compounds that promote or suppress the expression of the Aβ binding protein of the present invention can be screened. In vaccine therapy, it is thought that the level of Aβ in the brain decreases when antibodies against Aβ are present in the blood because Aβ is excreted via the blood-brain barrier. In this excretion mechanism, Aβ excretion may be promoted by binding of Aβ binding protein to Aβ and excreting Aβ to the blood side by transcytosis. Therefore, by inducing the expression of the Aβ binding protein or by promoting the transport function of the Aβ binding protein, Aβ elimination ability equivalent to or higher than that of Aβ vaccine therapy using an Aβ antibody can be imparted. there is a possibility. Since this method does not use an immune response, unlike a vaccine therapy, there is little risk of an inflammatory response or the like. Therefore, the Aβ binding protein of the present invention may provide a new treatment for Alzheimer's disease that can replace vaccine therapy.
[0031]
To screen for a compound that alters the expression of Aβ binding protein, search and identify the genomic sequence of the gene for the binding protein from a genomic database, and connect a reporter gene such as luciferase or galactosidase to about 5 kbp around the transcription start site, Introduce into cultured cells. Since a transcription control site is present around the transcription start site, screening of a target compound can be effectively performed by measuring the effect of the compound on the expression of a reporter gene in a cell.
[0032]
It is also possible to prepare a kit containing the Aβ binding protein of the present invention. The kit is a kit containing one or more Aβ binding proteins and labeled Aβ, and preferably also contains a buffer whose salt strength and pH are appropriately adjusted. In this kit, Aβ is labeled to detect binding to a binding protein. The labeling method is not particularly limited, and includes various techniques known in the art, such as radiolabeling, fluorescent labeling, enzyme labeling, biotin labeling, and 2,4-dinitrophenol labeling. Then, a normal binding assay or the like is performed using this kit, and the kit can be used for screening for a substance that inhibits the binding between Aβ and a binding protein. It is a preferred embodiment of the present invention that the present kit contains not only one but also a large number of Aβ binding proteins, and it is particularly preferable to include a plurality of binding proteins having different properties such as a membrane protein and a soluble protein.
[0033]
【Example】
The following examples illustrate the invention in more detail, but are not intended to limit the scope of the invention in any way.
[0034]
The amyloid β and the biotinylation reagent used in this example are as follows.
Aβ40: DAEFFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV
MW = 4312
Biotinylation reagent: Sulfo-NHS-LC-biotinylation kit (PIERCE)
[0035]
(Biotinylation of Aβ40)
An aqueous solution of Aβ and an aqueous solution of a biotinylated reagent were prepared, and an excess amount of the biotinylated reagent was added to Aβ. Then, it was left on an ice bath for 2 hours or at room temperature for 30 minutes to perform biotinylation. Further, the unreacted biotinylated reagent was removed by a column, and the amount of the introduced biotin was measured by the HABA assay.
[0036]
(Preparation of mouse brain capillary rich fraction membrane protein sample)
The mouse was sacrificed by cervical dislocation and the brain was excised, and the cerebrum was isolated (0.3 g per animal). A phosphate buffer was added and the mixture was homogenized on ice 10 times, and a dextran solution was added, followed by homogenization. The homogenate was centrifuged (4 ° C.) at 4500 × g for 16 minutes to remove the upper fat layer and supernatant. The pellet was suspended by adding a buffer, and the cells were disrupted by a nitrogen cavitation method (800 psi, 30 minutes, 4 ° C.). The suspension was centrifuged at 10,000 × g for 16 minutes (4 ° C.), and the supernatant was further centrifuged at 100,000 × g (40,200 rpm) for 65 minutes (4 ° C.). A suspension buffer was added to the pellet and pipetting was performed, and a protease inhibitor was added to prepare a sample.
[0037]
(Preparation of mouse cerebral membrane protein sample)
The mouse was sacrificed by cervical dislocation, the brain was excised, and the cerebrum was isolated (0.3 g per animal). Density gradient buffer was added and homogenized on ice 10 times in the presence of a protease inhibitor. The cells were disrupted by a nitrogen cavitation method (800 psi, 30 minutes, 4 ° C.), the suspension was placed in a tube, and centrifuged at 10,000 × g for 16 minutes (4 ° C.). Further, the supernatant was centrifuged (4 ° C.) at 100,000 × g (40,200 rpm) for 65 minutes. The pellet was added with 600 uL of suspension buffer and pipetted, and a protease inhibitor was added to prepare a sample.
[0038]
(Binding to Aβ40)
Biotinylated Aβ was added to the sample to give a final Aβ concentration of about 10 uM. The binding buffer was added thereto so that the total volume was 1.2 mL, and the mixture was stirred and inverted, and left at 25 ° C. for 20 to 30 minutes.
[0039]
(Cross-crosslinking reaction and protein solubilization)
A cross-linking reagent such as DSS or BMH was dissolved in dimethyl sulfoxide, and left at 25 ° C. for 30 minutes to perform a cross-linking reaction of Aβ40. After centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes (4 ° C.), a solubilization buffer and a protease inhibitor were added to the centrifuged pellet, and pipetting was performed. .
[0040]
(Purification of Aβ-protein complex)
Streptavidin beads were added to the cross-linked sample. After shaking (4 ° C.) at 400 rpm for 1 hour, biotin and avidin were bound. The resulting complex was obtained by removing the supernatant by centrifugation (4 ° C.) at 15,000 rpm for 3 minutes. An SDS-PAGE sample buffer was added to the centrifuged pellet, and the mixture was heated at 95 ° C. for 2 minutes to prepare a sample for electrophoresis.
[0041]
(Electrophoresis)
An acrylamide gel was set in the electrophoresis tank, and electrophoresis (sodium lauryl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE) was prepared by filling the electrophoresis tank with an electrophoresis buffer. The sample was denatured as needed (95 ° C., 3 minutes) and applied to the gel. The sample was electrophoresed under the condition of a constant current of 0.04 A (voltage was from 100 V to 200 V). The gel after the electrophoresis was subjected to silver staining by a usual method.
[0042]
(Mass spectrometry)
The band obtained by the above-mentioned electrophoresis was cut out, and each band was analyzed by LC-MS / MS to identify a molecule bound to Aβ. As a specific process, an Aβ binding protein was identified by performing a database search based on data obtained by MS / MS measurement. In many cases, a plurality of protein names can be obtained from one MS / MS data, and one of the plurality of proteins having the largest molecular weight was selected. Table 1 shows the peptide fragments detected from each band and the proteins identified from the sequences of the fragments.
[0043]
[Table 1]
[Table 2]
[Table 3]
[Table 4]
[Table 5]
[Table 6]
[Table 7]
[Table 8]
[Table 9]
[Table 10]
[Table 11]
Among the above-mentioned Aβ-binding proteins, Guanine nucleotide binding protein (G-protein) is a factor involved in intracellular signal transduction in combination with a receptor. Considering that G-protein plays such a role, G-protein plays an important role in the uptake mechanism of a substance bound to a receptor. Therefore, G-protein may be involved in Ab uptake into cells.
[0055]
Synaptic vehicle glycoprotein 2a (SV2a) has a 12-transmembrane transporter-like structure, and may be involved in the transport of Ab. In addition, SV2a knockout mice die seriously shortly after birth, and are considered to play an important role in the central nervous system function.
[0056]
Regarding Neural cell adhesion molecule 1 (N-CAM180), it has been reported that the expression level of its mRNA decreases in dementia diseases such as Alzheimer's disease, suggesting a relationship with Alzheimer's disease. Further, N-CAM180 is a factor necessary for intersynaptic junction, and it is considered that the function of N-CAM180 may be inhibited by interaction with Ab.
[0057]
N-ethylmaleimide sensible fusion protein (NSF), N-ethylmaleimide sensible fusion protein attachment protein. Therefore, it is conceivable that it is involved in intracellular transport of Ab or that intracellular transport is inhibited by binding of Ab.
[0058]
【The invention's effect】
The present invention has comprehensively provided a group of proteins that bind to Aβ using proteomics technology. Knowledge of these proteins opens up the possibility of developing therapeutic agents targeting those proteins, and is thought to greatly contribute to elucidating the causes of Alzheimer's disease.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003159562A JP2004361227A (en) | 2003-06-04 | 2003-06-04 | Method for identifying amyloid β-binding protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003159562A JP2004361227A (en) | 2003-06-04 | 2003-06-04 | Method for identifying amyloid β-binding protein |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006327485A Division JP2007121309A (en) | 2006-12-04 | 2006-12-04 | Method for screening a substance that inhibits interaction between amyloid β and amyloid β-binding protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004361227A true JP2004361227A (en) | 2004-12-24 |
Family
ID=34052588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003159562A Pending JP2004361227A (en) | 2003-06-04 | 2003-06-04 | Method for identifying amyloid β-binding protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004361227A (en) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1655307A1 (en) * | 2003-07-09 | 2006-05-10 | Shionogi & Co., Ltd. | Atopic dermatitis inducer |
| JP2008530565A (en) * | 2005-02-15 | 2008-08-07 | エイディーライフ インコーポレイティッド | How to detect misfolded proteins and prions |
| EP2134365A1 (en) * | 2007-03-21 | 2009-12-23 | Effat Emamian | Compositions and methods for inhibiting tumor cell growth |
| JP2014232032A (en) * | 2013-05-29 | 2014-12-11 | 独立行政法人国立長寿医療研究センター | Chemical/physical phenomenon detection method, and device of the same |
| WO2015094001A1 (en) * | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Equigerminal Sa | Viral peptides |
| JP5925391B2 (en) * | 2013-10-16 | 2016-05-25 | 日本水産株式会社 | Peptide or acid addition salt thereof, food and drink, and composition for diabetes prevention, etc. |
| CN106771223A (en) * | 2016-11-18 | 2017-05-31 | 中国医科大学 | It is capable of achieving the kit and assay method of GLAST Identification of Fusion Protein and absolute quantitation |
| WO2019166651A1 (en) * | 2018-03-01 | 2019-09-06 | Pro Test Diagnostics Ab | Methods for the detection of autologous blood-doping |
-
2003
- 2003-06-04 JP JP2003159562A patent/JP2004361227A/en active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1655307A4 (en) * | 2003-07-09 | 2006-07-26 | Shionogi & Co | Atopic dermatitis inducer |
| EP1655307A1 (en) * | 2003-07-09 | 2006-05-10 | Shionogi & Co., Ltd. | Atopic dermatitis inducer |
| JP2008530565A (en) * | 2005-02-15 | 2008-08-07 | エイディーライフ インコーポレイティッド | How to detect misfolded proteins and prions |
| US8372593B2 (en) | 2005-02-15 | 2013-02-12 | Adlyfe, Inc. | Method for detecting misfolded proteins and prions |
| EP2134365A1 (en) * | 2007-03-21 | 2009-12-23 | Effat Emamian | Compositions and methods for inhibiting tumor cell growth |
| EP2134365B1 (en) * | 2007-03-21 | 2019-03-13 | Effat Emamian | Compositions and methods for inhibiting tumor cell growth |
| JP2014232032A (en) * | 2013-05-29 | 2014-12-11 | 独立行政法人国立長寿医療研究センター | Chemical/physical phenomenon detection method, and device of the same |
| JP5925391B2 (en) * | 2013-10-16 | 2016-05-25 | 日本水産株式会社 | Peptide or acid addition salt thereof, food and drink, and composition for diabetes prevention, etc. |
| WO2015094001A1 (en) * | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Equigerminal Sa | Viral peptides |
| GB2526222B (en) * | 2013-12-19 | 2017-03-22 | Equigerminal Sa | Viral peptides |
| GB2526222A (en) * | 2013-12-19 | 2015-11-18 | Equigerminal Sa | Viral peptides |
| CN106771223A (en) * | 2016-11-18 | 2017-05-31 | 中国医科大学 | It is capable of achieving the kit and assay method of GLAST Identification of Fusion Protein and absolute quantitation |
| WO2019166651A1 (en) * | 2018-03-01 | 2019-09-06 | Pro Test Diagnostics Ab | Methods for the detection of autologous blood-doping |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Drummond et al. | Phosphorylated tau interactome in the human Alzheimer’s disease brain | |
| Schraen-Maschke et al. | Tau as a biomarker of neurodegenerative diseases | |
| US20100169988A1 (en) | Means and methods for isolating and determining novel targets for the treatment of neurodegenerative, neurological or neuropsychiatric disorders and compositions comprising the same | |
| Haddad et al. | CLN 5 and CLN 8 protein association with ceramide synthase: B iochemical and proteomic approaches | |
| Niturad et al. | Rare GABRA3 variants are associated with epileptic seizures, encephalopathy and dysmorphic features | |
| US20220137073A1 (en) | Detection of misfolded tau protein | |
| Satoh et al. | TMEM106B expression is reduced in Alzheimer’s disease brains | |
| Sziraki et al. | A global view of aging and Alzheimer’s pathogenesis-associated cell population dynamics and molecular signatures in human and mouse brains | |
| Mettenburg et al. | Distinct Binding Sites in the Structure of α2-Macroglobulin Mediate the Interaction with β-Amyloid Peptide and Growth Factors∗ | |
| JP6826543B2 (en) | Biomolecules involved in Alzheimer's disease | |
| Smolders et al. | Contribution of rare homozygous and compound heterozygous VPS13C missense mutations to dementia with Lewy bodies and Parkinson’s disease | |
| Yoon et al. | Roles and mechanisms of ankyrin-G in neuropsychiatric disorders | |
| Mizuno et al. | MUTYH actively contributes to microglial activation and impaired neurogenesis in the pathogenesis of Alzheimer’s disease | |
| Montero-Calle et al. | The molecular misreading of APP and UBB induces a humoral immune response in Alzheimer’s disease patients with diagnostic ability | |
| JP2009537133A (en) | Procedures and methods for detecting Alzheimer's disease | |
| Johannsen et al. | A novel missense variant in the SDR domain of the WWOX gene leads to complete loss of WWOX protein with early-onset epileptic encephalopathy and severe developmental delay | |
| JP2004361227A (en) | Method for identifying amyloid β-binding protein | |
| JP2006504434A (en) | Atypical protein kinase C isoforms in nervous system diseases and cancer | |
| Keller et al. | The PSEN1 I143T mutation in a Swedish family with Alzheimer's disease: clinical report and quantification of Aβ in different brain regions | |
| CN105548561B (en) | Diagnostic agent and diagnostic method for alzheimer's disease | |
| JP2007121309A (en) | Method for screening a substance that inhibits interaction between amyloid β and amyloid β-binding protein | |
| Taylor et al. | Simple, reliable protocol for high-yield solubilization of seedless amyloid-β monomer | |
| Fuchs et al. | Genetics in dystonia: an update | |
| WO2014110628A1 (en) | Gene and mutations thereof associated with seizure disorders | |
| Nutter et al. | Choroid plexus mis-splicing and altered cerebrospinal fluid composition in myotonic dystrophy type 1 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Effective date: 20050715 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050726 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050921 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20050921 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061003 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20061204 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070821 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071011 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Effective date: 20071022 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20071022 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080527 |