JP2004344145A - Pyrroloquinoline quinone (pqq) dependent modified glucosedehydrogenase substance excellent in substrate specificity and stability - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は基質特異性及び／又は熱安定性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に関し、詳しくはピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とする改変型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）、その製造法及びグルコースセンサーに関する。
【０００２】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
【０００３】
【従来の技術及びその課題】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されるから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した（特許文献１）。ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素はグルコースオキシダーゼに比べて基質特異性、熱安定性に問題点があった。
【０００４】
本発明は、基質特異性及び／又は熱安定性が改善されたＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１１−２４３９４９号公報
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の改変型ＰＱＱＧＤＨ、その製造法、及び該ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを提供することを目的とする。
【０００７】
１． 野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも二糖類に対する作用性が低下した、及び／又は、安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【０００８】
２． 野生型のグルコースデヒドロゲナーゼよりも二糖類に対する作用性が低下したことを特徴とする１．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【０００９】
３． 二糖類がマルトースであることを特徴とする２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００１０】
４． マルトースに対する作用性がグルコースに対する作用性の９０％以下であることを特徴とする２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００１１】
５． 二糖類に対するに対するＫｍ値が大きくなったことを特徴とする２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００１２】
６． 二糖類がマルトースであることを特徴とする５．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００１３】
７． マルトースに対するＫｍ値が８ｍＭ以上であることを特徴とする５．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００１４】
８． 二糖類に対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きいことを特徴とする２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００１５】
９． 二糖類がマルトースであることを特徴とする８．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００１６】
１０． マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値の１．５倍以上であることを特徴とする８．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００１７】
１１． 配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００１８】
１２． 配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１６７位、１６８位、１６９位、３４１位、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、３００位、３４９位、１２９位、１３０位及び１３１位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００１９】
１３． アミノ酸置換が、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｎ１６７Ｅ， Ｎ１６７Ｌ， Ｎ１６７Ｇ， Ｎ１６７Ｔ， Ｎ１６７Ｓ， Ｎ１６７Ａ， Ｎ１６７Ｍ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｗ， Ｌ１６９Ｙ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｍ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｉ， Ｌ１６９Ｔ， Ｋ８９Ｅ， Ｋ３００Ｒ， Ｓ２０７Ｃ， Ｎ１８８Ｉ， Ｔ３４９Ｓ， Ｋ３００Ｔ， Ｌ１７４Ｆ， Ｋ４９Ｎ， Ｓ１８９Ｇ， Ｆ２１５Ｙ， Ｓ１８９Ｇ， Ｅ２４５Ｄ， Ａ３５１Ｔ， Ｐ６７Ｋ， Ｅ６８Ｋ， Ｐ６７Ｄ， Ｅ６８Ｔ， Ｉ６９Ｃ， Ｐ６７Ｒ， Ｅ６８Ｒ， Ｅ１２９Ｒ， Ｋ１３０Ｇ， Ｐ１３１Ｇ， Ｅ１２９Ｎ， Ｐ１３１Ｔ， Ｅ１２９Ｑ， Ｋ１３０Ｔ， Ｐ１３１Ｒ， Ｅ１２９Ａ， Ｋ１３０Ｒ， Ｐ１３１Ｋ， Ｅ３４１Ｌ， Ｍ３４２Ｐ， Ａ３４３Ｒ， Ａ３４３Ｉ， Ｅ３４１Ｐ， Ｍ３４２Ｖ， Ｅ３４１Ｓ， Ｍ３４２Ｉ， Ａ３４３Ｃ， Ｍ３４２Ｒ， Ａ３４３Ｎ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｇ及びＬ１６９Ｅからなる群から選択される１２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００２０】
１４． アミノ酸置換が、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｇ， Ｌ１６９Ｃ， （Ｋ８９Ｅ＋Ｋ３００Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｙ）， （Ｎ１６７Ｌ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ＋Ｌ１７４Ｆ＋Ｋ４９Ｎ）， （Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６８Ｎ＋Ｓ１８９Ｒ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｗ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６８Ｇ）， （Ｑ１６８Ｃ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ２０７Ｃ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｄ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ｐ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１８８Ｉ＋Ｔ３４９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｆ２１５Ｙ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｋ３００Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ａ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｍ＋Ｑ１６８Ｙ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｖ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｋ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ａ３５１Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｐ６７Ｋ＋Ｅ６８Ｋ）， （Ｐ６７Ｒ＋Ｅ６８Ｒ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｐ６７Ｄ＋Ｅ６８Ｔ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｅ１２９Ｒ＋Ｋ１３０Ｇ＋Ｐ１３１Ｇ）， （Ｅ１２９Ｑ＋Ｋ１３０Ｔ＋Ｐ１３１Ｒ）， （Ｅ１２９Ｎ＋Ｐ１３１Ｔ）， （Ｅ１２９Ａ＋Ｋ１３０Ｒ＋Ｐ１３１Ｋ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｐ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｓ＋Ｍ３４２Ｉ）， Ａ３４３Ｉ， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｃ）， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｒ＋Ａ３４３Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ）及び（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）からなる群から選択され、該アミノ酸置換により基質特異性が向上した１２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００２１】
１５． 配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、４２８位と４２９位の間にアミノ酸が挿入されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００２２】
１６． １．〜１５．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
【００２３】
１７． １６．に記載の遺伝子を含むベクター。
【００２４】
１８． １７．に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【００２５】
１９． １８．に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
【００２６】
２０． １．〜１９．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【００２７】
２１． １．〜１９．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【００２８】
２２． 野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００２９】
２３． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が４８％以上であることを特徴とする２２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００３０】
２４． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が５５％以上であることを特徴とする２２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００３１】
２５． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が７０％以上であることを特徴とする２２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００３２】
２６． 配列番号１に記載されるＰＱＱＧＤＨにおいて、２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４６位及び３００位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が置換されている、２２．に記載のＰＱＱＧＤＨ。
【００３３】
２７． アミノ酸置換が、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｋ８９Ｅ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｓ， Ｑ２４６Ｈ， Ｋ３００Ｒ， Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｋ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｙ及びＬ１６９Ｇからなる群から選択される２６．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００３４】
２８． アミノ酸置換が、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， Ｑ２４６Ｈ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ，（Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）及び（Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）からなる群から選択され、該アミノ酸置換により熱安定性が向上した２７．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【００３５】
２９． ２２．〜２８．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
【００３６】
３０． ２９．に記載の遺伝子を含むベクター。
【００３７】
３１． ３０．に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【００３８】
３２． ３１．に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
【００３９】
３３． ２２．〜３１．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【００４０】
３４． ２２．〜３１．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【００４１】
３５． ２２．〜３１．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
【００４２】
３６． 野生型酵素の活性型立体構造における活性中心から半径１５Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．に記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【００４３】
３７． 野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【００４４】
３８． 基質がグルコースで有る３７．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【００４５】
３９． 野生型酵素の活性型立体構造において基質の１位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【００４６】
４０． 基質がグルコースである３９．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【００４７】
４１． 野生型酵素の活性型立体構造において基質の２位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【００４８】
４２．基質がグルコースで有る４１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【００４９】
【発明の実施の形態】
なお、本明細書においては、アミノ酸の位置は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けする。
【００５０】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下したもの、および／または、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも熱安定性の向上したものを含む。
【００５１】
二糖類としては、マルトース、シュクロース、ラクトース、セロビオース などが例示され、特にマルトースが例示される。
【００５２】
二糖類に対する作用性とは、二糖類を脱水素する作用を意味する。
【００５３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下していれば、グルコースに対する作用性は上昇、不変、低下のいずれであっても本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに包含される。
【００５４】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース濃度の測定において二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨを用いた場合と比較して低下したものである。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、特にマルトースに対する作用性が低下したものである。マルトースに対する作用性は、好ましくは野生型ＰＱＱＧＤＨの９０％以下、より好ましくは７５％以下、さらに好ましくは６０％以下、特に４０％以下である。
【００５５】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、さらに、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対するに対するＫｍ値が大きくなってもよい。特にマルトースに対するＫｍ値が大きくなった改変型ＰＱＱＧＤＨが好ましい。マルトースに対するＫｍ値は、好ましくは８ｍＭ以上、より好ましくは１２ｍＭ以上、特に２０ｍＭ以上である。
【００５６】
あるいは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、さらに、二糖類に対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きくなってもよい。特に、マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きい改変型ＰＱＱＧＤＨが好ましい。好ましくは、マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値の１．５倍以上、より好ましくは３倍以上である。
【００５７】
ここで、マルトースに対する作用性とは、グルコースを基質としたときと二糖類、特にマルトースを基質としたときの反応速度の相対比％を意味する。
熱安定性の向上の程度は、５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が野生型ＰＱＱＧＤＨよりも高いのが好ましい。活性残存率は、好ましくは４８％以上、より好ましくは５５％以上、特に７０％以上である。
【００５８】
基質特異性の改良された本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、例えば配列番号１のアミノ酸配列において、６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１６７位、１６８位、１６９位、３４１位、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、３００位、３４９位、１２９位、１３０位及び１３１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有するＧＤＨ及び４２８位と４２９位の間にアミノ酸が挿入されているＧＤＨが例示される。」
好ましくは、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｎ１６７Ｅ， Ｎ１６７Ｌ， Ｎ１６７Ｇ， Ｎ１６７Ｔ， Ｎ１６７Ｓ， Ｎ１６７Ａ， Ｎ１６７Ｍ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｗ， Ｌ１６９Ｙ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｍ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｉ， Ｌ１６９Ｔ， Ｋ８９Ｅ， Ｋ３００Ｒ， Ｓ２０７Ｃ， Ｎ１８８Ｉ， Ｔ３４９Ｓ， Ｋ３００Ｔ， Ｌ１７４Ｆ， Ｋ４９Ｎ， Ｓ１８９Ｇ， Ｆ２１５Ｙ， Ｓ１８９Ｇ， Ｅ２４５Ｄ， Ａ３５１Ｔ， Ｐ６７Ｋ， Ｅ６８Ｋ， Ｐ６７Ｄ， Ｅ６８Ｔ， Ｉ６９Ｃ， Ｐ６７Ｒ， Ｅ６８Ｒ， Ｅ１２９Ｒ， Ｋ１３０Ｇ， Ｐ１３１Ｇ， Ｅ１２９Ｎ， Ｐ１３１Ｔ， Ｅ１２９Ｑ， Ｋ１３０Ｔ， Ｐ１３１Ｒ， Ｅ１２９Ａ， Ｋ１３０Ｒ， Ｐ１３１Ｋ， Ｅ３４１Ｌ， Ｍ３４２Ｐ， Ａ３４３Ｒ， Ａ３４３Ｉ， Ｅ３４１Ｐ， Ｍ３４２Ｖ， Ｅ３４１Ｓ， Ｍ３４２Ｉ， Ａ３４３Ｃ， Ｍ３４２Ｒ， Ａ３４３Ｎ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｇ及びＬ１６９Ｅからなる群から選ばれるアミノ酸置換を有するＧＤＨ及び４２８位と４２９位の間にＬ、ＡまたはＫが挿入されているＧＤＨである。６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１６７位、１６８位、１６９位、３４１位、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、３００位、３４９位、１２９位、１３０位及び１３１位の置換は、１ヶ所であってもよく、また複数箇所であってもよい。
【００５９】
ここで、「Ｑ７６Ｎ」は、７６位のＱ（Ｇｌｎ）をＮ（Ａｓｎ）に置換することを意味する。
【００６０】
Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｇ， Ｌ１６９Ｃ， （Ｋ８９Ｅ＋Ｋ３００Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｙ）， （Ｎ１６７Ｌ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ＋Ｌ１７４Ｆ＋Ｋ４９Ｎ）， （Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６８Ｎ＋Ｓ１８９Ｒ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｗ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６８Ｇ）， （Ｑ１６８Ｃ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ２０７Ｃ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｄ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ｐ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１８８Ｉ＋Ｔ３４９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｆ２１５Ｙ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｋ３００Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ａ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｍ＋Ｑ１６８Ｙ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｖ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｋ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ａ３５１Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｐ６７Ｋ＋Ｅ６８Ｋ）， （Ｐ６７Ｒ＋Ｅ６８Ｒ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｐ６７Ｄ＋Ｅ６８Ｔ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｅ１２９Ｒ＋Ｋ１３０Ｇ＋Ｐ１３１Ｇ）， （Ｅ１２９Ｑ＋Ｋ１３０Ｔ＋Ｐ１３１Ｒ）， （Ｅ１２９Ｎ＋Ｐ１３１Ｔ）， （Ｅ１２９Ａ＋Ｋ１３０Ｒ＋Ｐ１３１Ｋ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｐ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｓ＋Ｍ３４２Ｉ）， Ａ３４３Ｉ， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｃ）， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｒ＋Ａ３４３Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ）及び（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）の置換及び４２８位と４２９位の間へのＬ、ＡまたはＫの挿入は、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上に寄与する。ここで、基質特異性とは、グルコースを基質としたときと二糖類、特にマルトースを基質としたときの反応速度の相対比％を意味する。
熱安定性の改良された本発明のＰＱＱＧＤＨは、配列番号１のアミノ酸配列において、２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４６位及び３００位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有し、好ましくは、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｋ８９Ｅ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｓ， Ｑ２４６Ｈ， Ｋ３００Ｒ， Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｋ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｙ及びＬ１６９Ｇからなる群から選ばれるアミノ酸置換を有する。２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４６位及び３００位の置換は、１ヶ所であってもよく、複数ヶ所であってもよい。
【００６１】
ここで、「Ｋ２０Ｅ」は、２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。
【００６２】
特に、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， Ｑ２４６Ｈ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ，（Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）及び（Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）のアミノ酸置換は、ＰＱＱＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。
【００６３】
配列番号１で示される改変されるべき野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質及び配列番号２で示されるその塩基配列は、公知であり、特開平１１−２４３９４９号公報に記載されている。
【００６４】
本発明の改変タンパク質の製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００６５】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００６６】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコ−ス，シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変タンパク質が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変タンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００６７】
培養物中の改変タンパク質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変タンパク質が培養液中に存在する場合は、濾過，遠心分離などにより、改変タンパク質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変タンパク質を可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００６８】
この様にして得られた改変タンパク質含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製された改変タンパク質を得ることができる。
【００６９】
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの７６位、１６７位、１６８位及び１６９位に着目し、そのアミノ酸置換体を作成したところ、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。基質特異性に関しては、Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｓ） および （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｔ）が特に好ましい。
【００７０】
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４６位及び３００位に着目し、そのアミノ酸置換体を作成したところ、安定性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。熱安定性に関する限り、Ｋ２０Ｅ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｙ） 及びＱ２４６Ｈの置換が特に望ましい。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００７１】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００７２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１ ：ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
実施例２：変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の作製
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＮＰＧ５と配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがアスパラギンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１）を取得した。
【００７３】
ｐＮＰＧ５と配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ２）を取得した。
【００７４】
ｐＮＰＧ５と配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがスレオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ３）を取得した。
【００７５】
ｐＮＰＧ５と配列番号６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがメチオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ４）を取得した。
【００７６】
ｐＮＰＧ５と配列番号７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがグリシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ５）を取得した。
【００７７】
ｐＮＰＧ５と配列番号８記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがリジンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ６）取得した。
【００７８】
ｐＮＰＧ５と配列番号９記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがイソロイシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ７）を取得した。
【００７９】
ｐＮＰＧ５と配列番号１０記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがバリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ８）を取得した。
【００８０】
ｐＮＰＧ５と配列番号１１記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ９）を取得した。
【００８１】
ｐＮＰＧ５と配列番号２２記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の２０番目のリジンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１０）を取得した。
【００８２】
ｐＮＰＧ５と配列番号２３記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミドを取得した。更にこのプラスミドと配列番号２４記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがグルタミン酸に、３００番目のリジンがアルギニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１１）を取得した。
【００８３】
ｐＮＰＧ５と配列番号２５記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の２４６番目のグルタミンがヒスチジンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１２）を取得した。
【００８４】
ｐＮＰＧ５と配列番号２６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがセリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１３）を取得した。
【００８５】
ｐＮＰＧ５と配列番号２７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに、１６９番目のロイシンがアスパラギン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１４）を取得した。
【００８６】
ｐＮＰＧ５と配列番号６６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１５）を取得した。
【００８７】
ｐＮＰＧ５と配列番号６７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがプロリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１６）を取得した。
【００８８】
ｐＮＰＧ５と配列番号６８記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに、１６９番目のロイシンがグリシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１７）を取得した。
【００８９】
ｐＮＰＧ５、ｐＮＰＧ５Ｍ１、ｐＮＰＧ５Ｍ２、ｐＮＰＧ５Ｍ３、ｐＮＰＧ５Ｍ４、ｐＮＰＧ５Ｍ５、ｐＮＰＧ５Ｍ６、ｐＮＰＧ５Ｍ７、ｐＮＰＧ５Ｍ８、ｐＮＰＧ５Ｍ９、ｐＮＰＧ５Ｍ１０、ｐＮＰＧ５Ｍ１１、ｐＮＰＧ５Ｍ１２、ｐＮＰＧ５Ｍ１３、ｐＮＰＧ５Ｍ１４、ｐＮＰＧ５Ｍ１５、ｐＮＰＧ５Ｍ１６，ｐＮＰＧ５Ｍ１７の各組換えプラスミドで大腸菌コンピテントセル（エシェリヒア・コリーＪＭ１０９；東洋紡績製）を形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
実施例３：シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例２で得た組換えプラスミドｐＮＰＧ５Ｍ１のＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩ（東洋紡績製）で切断して、変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩで切断したｐＴＭ３３（１μｇ）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６Ｍ１と命名した。
【００９０】
ｐＮＰＧ５、ｐＮＰＧ５Ｍ２、ｐＮＰＧ５Ｍ３、ｐＮＰＧ５Ｍ４、ｐＮＰＧ５Ｍ５、ｐＮＰＧ５Ｍ６、ｐＮＰＧ５Ｍ７、ｐＮＰＧ５Ｍ８、ｐＮＰＧ５Ｍ９、ｐＮＰＧ５Ｍ１０、ｐＮＰＧ５Ｍ１１、ｐＮＰＧ５Ｍ１２、ｐＮＰＧ５Ｍ１３、ｐＮＰＧ５Ｍ１４、ｐＮＰＧ５Ｍ１５、ｐＮＰＧ５Ｍ１６，ｐＮＰＧ５Ｍ１７の各組換えプラスミドについても上記方法と同様にして発現プラスミドを取得した。得られた発現プラスミドそれぞれｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７と命名した。
実施例４：シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）をＬＢＧ培地（ＬＢ培地＋０．３％グリセロール）で３０℃、１６時間培養し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体を懸濁した。
【００９１】
該懸濁液に実施例３で得た発現プラスミドｐＮＰＧ６Ｍ１を０．５μｇ加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
ｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７の各発現プラスミドについても上記方法と同様にして、該形質転換体をそれぞれ取得した。
試験例１
ＧＤＨ活性の測定方法
（１）測定原理
（２）単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
１．遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
【表１】
２．３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分 間予備加温した。
３．０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
４．５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
【００９４】
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
【００９５】
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
ホロ型発現精製酵素の調製方法
５００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＰＹ培地で予め３０℃、２４時間培養したシュードモナス・プチダＴＥ３４９３（ｐＮＰＧ６Ｍ１）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で４０時間通気攪拌培養した。培養終了時のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約１２０Ｕ／ｍｌであった。
【００９６】
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＳＰ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで１０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後に終濃度が１ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した。最後にＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
【００９７】
ｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７によるシュードモナス・プチダＴＥ３４９３形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。
【００９８】
このようにして取得した精製酵素を用いて性能を評価した。
Ｋｍ値の測定
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースに対するＫｍ値の測定は、上記活性測定方法の基質濃度を変化させて実施した。また、マルトースに対するＫｍ値の測定は、上記活性測定方法のグルコース溶液をマルトース溶液に置き換え、グルコースに対するＫｍ値の測定同様基質濃度を変化させて実施した。結果を表２Ａ表２Ｂ、表６，表９及び表１４に示す。
基質特異性
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とマルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。マルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性に際しては、０．５Ｍのマルトース溶液を調製して活性測定に用いた。結果を表２Ａ、表２Ｂ、表４、表５、表６、表８、表９、表１１、表１３及び表１４に示す。
熱安定性の測定
各種ＰＱＱＧＤＨを酵素濃度５Ｕ／ｍｌ、緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＰＱＱを含む１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）中で保存し、５８℃で熱処理後の活性残存率を求めた。結果を表２Ａ、表２Ｂ、表６、表９及び表１４に示す。なお、熱処理を行なった時間は、表２Ｂの試験のみ３０分間、その他の試験は２０分間である。
至適ｐＨの測定
０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜８．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）中で酵素活性を測定した。結果を図１に示す。また、最も高い活性を示したｐＨを表２Ａに示す。
【００９９】
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
Ｑ７６Ｋのグルコース定量性の確認
０．４５Ｕ／ｍｌのＱ７６Ｋを含んだ下記反応試薬を調整した。
【０１０２】
結果を図２に示した。
グルコース量の測定方法
試料量３μｌに試薬３００μｌを加え、試薬添加後２分後からの１分間における吸光度変化を求め、精製水及びグルコース１００ｍｇ／ｄｌ標準液での２点検量線に基づき試料中のグルコース量を求めた。尚、測定装置は日立７１５０形自動分析装置を使用し、測定波長は、主波長４８０ｎｍのみ、測定温度は３７℃で実施した。
【０１０３】
図２より、０−６００ｍｇ／ｄｌの範囲で良好な直線性が確認された。
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認
０．４５Ｕ／ｍｌのＱ７６Ｋを含んだ下記反応試薬を調整した。
【０１０４】
【０１０５】
マルトースを含まない１００ｍｇ／ｄｌグルコース溶液と１００とし、ベースに１００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含むサンプルの測定値をそれぞれ相対評価した。同様にマルトースを含まない３００ｍｇ／ｄｌグルコース溶液と１００とし、ベースに３００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含むサンプルの測定値をそれぞれ相対評価した。結果を図３に示す。
Ｑ７６Ｅのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ｅを用いて作用性を評価した。酵素は、０．２４Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図４に示す。
Ｑ１６８Ｖのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ｖを用いて作用性を評価した。酵素は、０．３５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図５に示す。
Ｑ１６８Ａのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ａを用いて作用性を評価した。酵素は、０．６Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図６に示す。
野生型酵素のマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様に野生型酵素を用いて作用性を評価した。酵素は、０．１Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図７に示す。
【０１０６】
図３、図４、図５、図６、図７より、Ｑ７６Ｋ、Ｑ７６Ｅ、Ｑ１６８Ｖ及びＱ１６８Ａは野生型酵素に比べ、マルトースに対する作用性が低下していることが確認された。
実施例５：変異ライブラリーの構築とスクリーニング
発現プラスミドｐＮＰＧ５をテンプレートとして、ＰＣＲ法により構造遺伝子中の１６７−１６９領域にランダム変異を導入した。ＰＣＲ反応は表３に示す組成の溶液中で、９８℃２分間、次に、９８℃２０秒間、６０℃３０秒間、及び７２℃４分間を３０サイクルの条件で行った。
【０１０７】
【表３】
得られた変異ライブラリーを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、形成された各コロニーを１８０μｌ／ｗｅｌｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２６μＭのＰＱＱを含む）の分注されたマイクロタイタープレートに植菌し、３７℃、２４時間培養した。培養液各５０μｌを別のマイクロタイタープレートに移し、凍結融解の繰り返しによって培養菌体を破砕した後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を回収した。回収した上清を２枚のマイクロタイタープレートに各１０μｌ分注した。１枚のマイクロタイタープレートはグルコースを基質とした活性測定試薬を用いて活性測定し、もう一枚はマルトースを基質とした活性測定試薬を用いて活性測定し、反応性を比較した。マルトースに対する反応性の変化したクローンが多数得られた。
マルトースに対する反応性の変化したクローンをＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２６μＭのＰＱＱを含む）５ｍｌの分注された試験管で培養し、確認実験を行ったところ、マルトースに対する反応性の変化したクローンが多数得られた。
【０１０９】
結果を表４に示す。
【０１１０】
【表４】
同様にして６７−６９領域（フォワードプライマー：配列番号１４に記載、リバースプライマー：配列番号１５に記載を使用）、１２９−１３１領域（フォワードプライマー：配列番号１６に記載、リバースプライマー：配列番号１７に記載を使用）、３４１−３４３領域（フォワードプライマー：配列番号１８に記載、リバースプライマー：配列番号１９に記載を使用）にも変異導入した。また、４２８と４２９（フォワードプライマー：配列番号２０に記載、リバースプライマー：配列番号２１に記載を使用）の間に挿入を試みた。
結果を表５に示す。
【０１１２】
【表５】
これらのうち、マルトースに対する作用性が大きく低下している変異体を選抜（Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）し、これらの変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表６に示す。
【０１１４】
【表６】
実施例６：Ｑ１６８部位の変異による基質特異性への影響
実施例５に記載の方法に準じて、Ｑ１６８Ｃ、Ｑ１６８Ｄ、Ｑ１６８Ｅ，Ｑ１６８Ｆ，Ｑ１６８Ｇ，Ｑ１６８Ｈ，Ｑ１６８Ｋ，Ｑ１６８Ｌ，Ｑ１６８Ｍ，Ｑ１６８Ｎ，Ｑ１６８Ｐ、Ｑ１６８Ｒ，Ｑ１６８Ｓ，Ｑ１６８Ｔ、Ｑ１６８Ｗ、Ｑ１６８Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表７に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表８に示す。更に、各変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表９に示す。
【０１１６】
【表７】
【表８】
【表９】
実施例７：Ｌ１６９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｌ１６９Ａ，Ｌ１６９Ｖ，Ｌ１６９Ｈ、Ｌ１６９Ｙ、Ｌ１６９Ｋ，Ｌ１６９Ｄ，Ｌ１６９Ｓ，Ｌ１６９Ｎ，Ｌ１６９Ｇ，Ｌ１６９Ｃの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表１０に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表１１に示す。
【０１２０】
【表１０】
【表１１】
実施例８：Ｑ１６８Ａ変異体に対するＬ１６９部位の変異の組み合わせによる基質特異性への影響
実施例５に記載の方法に準じて、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表１２に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表１３に示す。更に、各変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表１４に示す。
【０１２３】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
本発明によれば、基質特異性及び／又は熱安定性が改善されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
【０１２７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】至適ｐＨの測定結果を示す。
【図２】グルコースの定量性の結果を示す。
【図３】Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認結果を示す。
【図４】Ｑ７６Ｅのマルトース作用性の確認結果を示す。
【図５】Ｑ１６８Ｖのマルトース作用性の確認結果を示す。
【図６】Ｑ１６８Ａのマルトース作用性の確認結果を示す。
【図７】野生型酵素のマルトース作用性の確認結果を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a modified glucose dehydrogenase (GDH) having improved substrate specificity and / or thermostability, and more particularly, to a modified PQQ-dependent glucose dehydrogenase (PQQGDH) having pyrroloquinoline quinone (PQQ) as a coenzyme, It relates to a production method and a glucose sensor.
[0002]
The modified PQQGDH of the present invention is useful for glucose quantification in clinical tests, food analysis, and the like.
[0003]
[Prior art and its problems]
PQQGDH is a glucose dehydrogenase using pyrroloquinoline quinone (PQQ) as a coenzyme. Since it catalyzes the reaction of oxidizing glucose to produce gluconolactone, it can be used for measuring blood sugar. Blood glucose concentration is a very important indicator for clinical diagnosis as an important marker of diabetes. At present, the measurement of blood glucose concentration is mainly based on a method using a biosensor using glucose oxidase, but since the reaction is affected by the dissolved oxygen concentration, an error may occur in the measurement value. . As a new enzyme replacing glucose oxidase, PQQ-dependent glucose dehydrogenase has attracted attention. Our group found that Acinetobacter baumannii NCIMB11517 strain produces PQQ-dependent glucose dehydrogenase, and constructed a gene cloning and high expression system (Patent Document 1). PQQ-dependent glucose dehydrogenase has problems in substrate specificity and thermostability compared to glucose oxidase.
[0004]
An object of the present invention is to provide PQQGDH with improved substrate specificity and / or thermal stability.
[0005]
[Patent Document 1]
JP-A-11-243949
[0006]
[Means for Solving the Problems]
An object of the present invention is to provide the following modified PQQGDH, a method for producing the same, and a glucose assay kit and a glucose sensor containing the PQQGDH.
[0007]
1. A modified PQQGDH having reduced activity on disaccharides and / or improved stability compared to wild-type pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQGDH).
[0008]
2. 1. The activity of disaccharides is lower than that of wild-type glucose dehydrogenase. 3. The modified PQQGDH according to [1].
[0009]
3. 1. The disaccharide is maltose. 3. The modified PQQGDH according to [1].
[0010]
4. 1. The activity on maltose is 90% or less of the activity on glucose. The modified PQQGDH as described.
[0011]
5. 1. The Km value for disaccharides is increased. 3. The modified PQQGDH according to [1].
[0012]
6. 4. The disaccharide is maltose. The modified PQQGDH as described.
[0013]
7. 4. The Km value for maltose is 8 mM or more. The modified PQQGDH as described.
[0014]
8. 1. The Km value for disaccharides is larger than the Km value for glucose. The modified PQQGDH as described.
[0015]
9. 7. The disaccharide is maltose. The modified PQQGDH as described.
[0016]
10. 7. The Km value for maltose is at least 1.5 times the Km value for glucose. The modified PQQGDH as described.
[0017]
11. 1. In the PQQ-dependent glucose dehydrogenase described in SEQ ID NO: 1, amino acids involved in glucose binding and / or amino acids in the vicinity thereof have been substituted. 3. The modified PQQGDH according to [1].
[0018]
12. In the PQQ-dependent glucose dehydrogenase described in SEQ ID NO: 1, positions 67, 68, 69, 76, 89, 167, 168, 169, 341, 342, 343, 351, Amino acids at at least one position selected from the group consisting of positions 49, 174, 188, 189, 207, 215, 245, 300, 349, 129, 130 and 131 are substituted Yes, 2. 3. The modified PQQGDH according to [1].
[0019]
13. Amino acid substitutions are as follows: Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G, Q76K, N167E, N167L, N167G, N167T, N167S, N167A, N167M, Q168I, Q168V, Q16A, Q16A, Q16A, Q16A, Q16A, N Q168L, Q168M, Q168N, Q168R, Q168S, Q168W, L169D, L169S, L169W, L169Y, L169A, L169N, L169M, L169V, L169F, L169F, L169H, L169H, L169H, L169H, L169H, L169H, L169H N188I, T349S K300T, L174F, K49N, S189G, F215Y, S189G, E245D, A351T, P67K, E68K, P67D, E68T, I69C, P67R, E68R, E129R, K130G, P131G, P129G, E129R, K130G, P131G, E131N 11. Selected from the group consisting of P131K, E341L, M342P, A343R, A343I, E341P, M342V, E341S, M342I, A343C, M342R, A343N, L169P, L169G and L169E. 3. The modified PQQGDH according to [1].
[0020]
14． Amino acid substitutions are as follows: Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G, Q76K, Q168I, Q168V, Q168A, Q168C, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q16K, Q16K, Q16K, Q16K, Q16K L169V, L169H, L169K, L169D, L169S, L169N, L169G, L169C, (K89E + K300R), (Q168A + L169D), (Q168S + L169S), (N167E + Q168G + L169T), (N167S + Q168N + L169R), (Q168G + L169T), (N167G + Q168S + L169Y), (N167 L + Q168S + L169G), (N167G + Q168S + L169S + L174F + K49N), (Q168N + L168N + S189R), (N167E + Q168G + L169A + S189G), (N167G + Q168R + L169A), (N167S + Q168G + L169A), (N167G + Q168V + L169S), (N167S + Q168V + L169S), (N167T + Q168I + L169G), (N167G + Q168W + L169N), (N167G + Q168S + L169N), (N167G + Q168S + L169V), (Q168R + L169C) , (N167S + Q168L + L168G), (Q168C + L169S), (N167T + Q168N + L169K), (N 67G + Q168T + L169A + S207C), (N167A + Q168A + L169P), (N167G + Q168S + L169G), (N167G + Q168G), (N167G + Q168D + L169K), (Q168P + L169G), (N167G + Q168N + L169S), (Q168S + L169G), (N188I + T349S), (N167G + Q168G + L169A + F215Y), (N167G + Q168T + L169G), (Q168G + L169V), (N167G + Q168V + L169T) , (N167E + Q168N + L169A), (Q168R + L169A), (N167G + Q168R), (N167G + Q168T), (N167G + Q168T + L169Q), (Q168I + L169G + K300T), (N167G + Q168A), (N167T + Q168L + L169K), (N167M + Q168Y + L169G), (N167E + Q168S), (N167G + Q168T + L169V + S189G), (N167G + Q168G + L169C), (N167G + Q168K + L169D), (Q168A + L169D), (Q168S + E245D), (Q168S + L169S), (A351T), (N167S + Q168S + L169S ), (Q168I + L169Q), (N167A + Q168S + L169S), (Q168S + L169E), (Q168A + L169G), (Q168S + L169P), (P67K + E68K), (P67R + E6) R + I69C), (P67D + E68T + I69C), (E129R + K130G + P131G), (E129Q + K130T + P131R), (E129N + P131T), (E129A + K130R + P131K), (E341L + M342P + A343R), (E341S + M342I), A343I, (E341P + M342V + A343C), (E341P + M342V + A343R), (E341L + M342R + A343N), (Q168A + L169A), ( (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169F), (Q168A + L169H), (Q168A + L169I), (Q168A + L169K), (Q168A + L169M), (Q168A + L 69N), (Q168A + L169P), (Q168A + L169Q), (Q168A + L169R), (Q168A + L169S), (Q168A + L169T), (Q168A + L169V), (Q168A + L169W) 12. 3. The modified PQQGDH according to [1].
[0021]
15. 1. In the PQQ-dependent glucose dehydrogenase described in SEQ ID NO: 1, an amino acid is inserted between positions 428 and 429. 3. The modified PQQGDH according to [1].
[0022]
16. 1. ~ 15. A gene encoding the modified PQQGDH according to any one of the above.
[0023]
17. 16. A vector comprising the gene according to 1.
[0024]
18. 17. A transformant transformed with the vector described in 1. above.
[0025]
19. 18. A method for producing a modified PQQGDH, which comprises culturing the transformant described in (1).
[0026]
20. 1. ~ 19. A glucose assay kit comprising the modified PQQGDH according to any one of the above.
[0027]
21. 1. ~ 19. A glucose sensor comprising the modified PQQGDH according to any one of the above.
[0028]
22. A modified PQQGDH having improved stability over wild-type pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQGDH).
[0029]
23. 22. The activity retention after heat treatment at 58 ° C. for 30 minutes is 48% or more. The modified PQQGDH as described.
[0030]
24. 22. The activity retention rate after heat treatment at 58 ° C. for 30 minutes is 55% or more. The modified PQQGDH as described.
[0031]
25. 22. The activity retention after heat treatment at 58 ° C. for 30 minutes is 70% or more. The modified PQQGDH as described.
[0032]
26. 21. PQQGDH represented by SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid at at least one position selected from the group consisting of
[0033]
27. Amino acid substitutions are K20E, Q76M, Q76G, K89E, Q168A, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q168M, Q168P, Q168W, Q168Y, Q168S, L169E, L169E, L169D, L169D, L169D, L169D, L169D 26. selected from the group consisting of Q76K, L169A, L169C, L169E, L169F, L169H, L169K, L169N, L169Q, L169R, L169T, L169Y and L169G; 3. The modified PQQGDH according to [1].
[0034]
28. Amino acid substitutions are K20E, Q76M, Q76G, (K89E + K300R), Q168A, (Q168A + L169D), (Q168S + L169S), Q246H, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q16G, Q16G, Q16G, Q168G, Q16G, Q16G, Q16G Q168S, (Q168S + L169E), (Q168S + L169P), (Q168A + L169A), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169F), (Q168A + L169,16A), (16A), (16A) (Q168A + L169R), (Q1 8A + L169T), (Q168A + L169Y) and (selected from the group consisting of Q168A + L169G), thermal stability is improved by the amino acid substitutions 27. 3. The modified PQQGDH according to [1].
[0035]
29. 22. ~ 28. A gene encoding the modified PQQGDH according to any one of the above.
[0036]
30. 29. A vector comprising the gene according to 1.
[0037]
31. 30. A transformant transformed with the vector described in 1. above.
[0038]
32. 31. A method for producing a modified PQQGDH, which comprises culturing the transformant described in (1).
[0039]
33. 22. ~ 31. A glucose assay kit comprising the modified PQQGDH according to any one of the above.
[0040]
34. 22. ~ 31. A glucose sensor comprising the modified PQQGDH according to any one of the above.
[0041]
35. 22. ~ 31. A method for measuring glucose comprising the modified PQQGDH according to any one of the above.
[0042]
36. It is obtained by mutating amino acids located within a radius of 15 ° from the active center in the active conformation of the wild-type enzyme. 3. The modified glucose dehydrogenase according to 1.).
[0043]
37. 1. Obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the substrate in the active conformation of the wild-type enzyme. The modified glucose dehydrogenase described.
[0044]
38. 37. the substrate is glucose The modified glucose dehydrogenase described.
[0045]
39. It is obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the OH group bonded to the carbon at
[0046]
40. 39. the substrate is glucose The modified glucose dehydrogenase described.
[0047]
41. It is obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the OH group bonded to the carbon at position 2 of the substrate in the active conformation of the wild-type enzyme. The modified glucose dehydrogenase described.
[0048]
42. 41. the substrate is glucose The modified glucose dehydrogenase described.
[0049]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In addition, in this specification, the position of an amino acid is numbered with 1 aspartic acid from which a signal sequence was removed.
[0050]
The modified PQQGDH of the present invention includes those having a lower activity on disaccharides than wild-type PQQGDH and / or those having improved heat stability than wild-type PQQGDH.
[0051]
Disaccharides include maltose, sucrose, lactose, cellobiose And maltose.
[0052]
The action on a disaccharide means an action of dehydrogenating the disaccharide.
[0053]
The modified PQQGDH of the present invention is encompassed in the modified PQQGDH of the present invention regardless of whether its activity on glucose is increased, unchanged, or reduced, as long as its activity on disaccharides is lower than that of wild-type PQQGDH. .
[0054]
The modified PQQGDH of the present invention has a reduced activity on disaccharides in the measurement of glucose concentration as compared with the case where wild-type PQQGDH is used. The modified PQQGDH of the present invention has reduced activity especially on maltose. The activity on maltose is preferably 90% or less, more preferably 75% or less, still more preferably 60% or less, particularly 40% or less of wild-type PQQGDH.
[0055]
The modified PQQGDH of the present invention may further have a higher Km value for disaccharides than wild-type PQQGDH. Particularly, a modified PQQGDH having a large Km value with respect to maltose is preferable. The Km value for maltose is preferably at least 8 mM, more preferably at least 12 mM, especially at least 20 mM.
[0056]
Alternatively, the modified PQQGDH of the present invention may further have a Km value for a disaccharide greater than a Km value for glucose. In particular, a modified PQQGDH in which the Km value for maltose is larger than the Km value for glucose is preferable. Preferably, the Km value for maltose is 1.5 times or more, more preferably 3 times or more, the Km value for glucose.
[0057]
Here, the action on maltose means a relative ratio% of a reaction rate when glucose is used as a substrate and when a disaccharide, particularly maltose is used as a substrate.
The degree of improvement in thermal stability is preferably such that the residual activity ratio after heat treatment at 58 ° C. for 30 minutes is higher than that of wild-type PQQGDH. The residual activity ratio is preferably at least 48%, more preferably at least 55%, especially at least 70%.
[0058]
As the modified PQQGDH of the present invention having improved substrate specificity, for example, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, positions 67, 68, 69, 76, 89, 167, 168, 169, 341 At least one of the following positions: 342, 343, 351, 49, 174, 188, 189, 207, 215, 245, 300, 349, 129, 130 and 131 GDH having an amino acid substitution at a position and GDH having an amino acid inserted between positions 428 and 429 are exemplified. "
Preferably, Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G, Q76K, N167E, N167L, N167G, N167T, N167S, N167A, N167M, Q168I, Q168V, Q168F, Q168A, Q168A, Q168A, Q168A , Q168M, Q168N, Q168R, Q168S, Q168W, L169D, L169S, L169W, L169Y, L169A, L169N, L169M, L169V, L169C, L169K, L169H, L169H, L169H, L169H, L169H , T349S, K 300T, L174F, K49N, S189G, F215Y, S189G, E245D, A351T, P67K, E68K, P67D, E68T, I69C, P67R, E68R, E129R, K130G, P131G, E129R, K130G, P131G, E129R P131K, E341L, M342P, A343R, A343I, E341P, M342V, E341S, M342I, A343C, M342R, A343N, L169P, L169G, and G29 having L between G and L169G selected from the group consisting of amino acids at positions 4 and 29 having a G substitution between L and G. , A or K inserted. 67, 68, 69, 76, 89, 167, 168, 169, 341, 342, 343, 351, 49, 174, 188, 189, 207 The substitution at positions 215, 245, 300, 349, 129, 130 and 131 may be performed at one position or at multiple positions.
[0059]
Here, “Q76N” means that Q (Gln) at position 76 is replaced with N (Asn).
[0060]
Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G, Q76K, Q168I, Q168V, Q168A, Q168C, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q168K, Q168M, Q168L, Q168N, Q168L, Q168L L169K, L169D, L169S, L169N, L169G, L169C, (K89E + K300R), (Q168A + L169D), (Q168S + L169S), (N167E + Q168G + L169T), (N167S + 16G16,816N) L169G), (N167G + Q168S + L169S + L174F + K49N), (Q168N + L168N + S189R), (N167E + Q168G + L169A + S189G), (N167G + Q168R + L169A), (N167S + Q168G + L169A), (N167G + Q168V + L169S), (N167S + Q168V + L169S), (N167T + Q168I + L169G), (N167G + Q168W + L169N), (N167G + Q168S + L169N), (N167G + Q168S + L169V), (Q168R + L169C) , (N167S + Q168L + L168G), (Q168C + L169S), (N167T + Q168N + L169K), (N167G + Q16 T + L169A + S207C), (N167A + Q168A + L169P), (N167G + Q168S + L169G), (N167G + Q168G), (N167G + Q168D + L169K), (Q168P + L169G), (N167G + Q168N + L169S), (Q168S + L169G), (N188I + T349S), (N167G + Q168G + L169A + F215Y), (N167G + Q168T + L169G), (Q168G + L169V), (N167G + Q168V + L169T) , (N167E + Q168N + L169A), (Q168R + L169A), (N167G + Q168R), (N167G + Q168T), (N167G + Q168T + L169Q), (Q168I + L 169G + K300T), (N167G + Q168A), (N167T + Q168L + L169K), (N167M + Q168Y + L169G), (N167E + Q168S), (N167G + Q168T + L169V + S189G), (N167G + Q168G + L169C), (N167G + Q168K + L169D), (Q168A + L169D), (Q168S + E245D), (Q168S + L169S), (A351T), (N167S + Q168S + L169S) , (Q168I + L169Q), (N167A + Q168S + L169S), (Q168S + L169E), (Q168A + L169G), (Q168S + L169P), (P67K + E68K), (P67R + E68R + I69C) (P67D + E68T + I69C), (E129R + K130G + P131G), (E129Q + K130T + P131R), (E129N + P131T), (E129A + K130R + P131K), (E341L + M342P + A343R), (E341S + M342I), A343I, (E341P + M342V + A343C), (E341P + M342V + A343R), (E341L + M342R + A343N), (Q168A + L169A), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169F), (Q168A + L169H), (Q168A + L169I), (Q168A + L169K), (Q168A + L169M), (Q168A + L169N), (Q 168A + L169P), (Q168A + L169Q), (Q168A + L169R), (Q168A + L169S), (Q168A + L169T), (Q168A + L169V), (Q168A + L169W) and (Q168A + L169W) , And PQQGDH. Here, the substrate specificity means a relative ratio% of a reaction rate when glucose is used as a substrate and a disaccharide, particularly, maltose is used as a substrate.
The PQQGDH of the present invention having improved thermostability has an amino acid substitution at at least one of
[0061]
Here, “K20E” means that K (Lys) at the 20th position is replaced with E (Glu).
[0062]
Particularly, K20E, Q76M, Q76G, (K89E + K300R), Q168A, (Q168A + L169D), (Q168S + L169S), Q246H, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168G, Q168G, Q168G, Q168H (Q168S + L169E), (Q168S + L169P), (Q168A + L169A), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169F), (Q168A + L169H), (Q168A + L16A, 16K, 816A + L169A) ), (Q168A + L 69T), amino acid substitution (Q168A + L169Y) and (Q168A + L169G) contributes to the improvement of the thermal stability of PQQGDH.
[0063]
The wild-type PQQGDH protein to be modified shown in SEQ ID NO: 1 and its base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are known and described in JP-A-11-243949.
[0064]
The method for producing the modified protein of the present invention is not particularly limited, but it can be produced by the following procedure. As a method for modifying an amino acid sequence constituting a protein, a commonly used technique for modifying genetic information is used. That is, a DNA having the genetic information of the modified protein is prepared by converting a specific base of the DNA having the genetic information of the protein or by inserting or deleting a specific base. As a specific method for converting bases in DNA, for example, commercially available kits (Transformer Mutagenesis Kit; manufactured by Clonetech, EXOIII / Mung Bean Deletion Kit; manufactured by Stratagene, and available from QuickChange Site Digest, a company of QuickChange Sites, etc.) The use of the chain reaction method (PCR) is mentioned.
[0065]
The prepared DNA having the genetic information of the modified protein is transferred into a host microorganism in a state of being linked to a plasmid, and becomes a transformant that produces the modified protein. As a plasmid at this time, for example, when Escherichia coli is used as a host microorganism, pBluescript, pUC18 and the like can be used. Examples of the host microorganism include Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, Escherichia coli JM109, and Escherichia coli DH5α. As a method for transferring the recombinant vector to the host microorganism, for example, when the host microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia, a method for transferring the recombinant DNA in the presence of calcium ions can be used. Electroporation may be used. Further, a commercially available competent cell (for example, competent high JM109; manufactured by Toyobo) may be used.
[0066]
The microorganism thus obtained as a transformant can stably produce a large amount of the modified protein by being cultured in a nutrient medium. The culture form of the host microorganism, which is a transformant, may be selected in consideration of the nutritional and physiological properties of the host, and is usually liquid culture in most cases. Is advantageous. As the nutrient source of the medium, those commonly used for culturing microorganisms can be widely used. The carbon source may be any carbon compound that can be assimilated, and for example, glucose, sucrose, lactose, maltose, fructose, molasses, pyruvic acid and the like are used. Any available nitrogen compound may be used as the nitrogen source, and examples thereof include peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, and soybean meal alkaline extract. In addition, phosphates, carbonates, sulfates, salts such as magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, and specific vitamins are used as needed. The culture temperature can be appropriately changed within a range in which the bacteria grow and produce the modified protein. In the case of Escherichia coli, the culture temperature is preferably about 20 to 42 ° C. The cultivation time varies somewhat depending on the conditions, but the cultivation may be terminated at an appropriate time in anticipation of the time when the modified protein reaches the maximum yield, and is usually about 6 to 48 hours. The pH of the medium can be appropriately changed within a range in which the bacteria grow and produce the modified protein, and particularly preferably, the pH is about 6.0 to 9.0.
[0067]
The culture solution containing the cells producing the modified protein in the culture can be directly collected and used. However, in general, when the modified protein is present in the culture solution according to a conventional method, filtration, centrifugation, etc. It is used after separating the modified protein-containing solution from the microbial cells. When the modified protein is present in the cells, the cells are collected from the obtained culture by means such as filtration or centrifugation, and then the cells are disrupted by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme. The modified protein is solubilized by adding a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant, if necessary, and separated and collected as an aqueous solution.
[0068]
The modified protein-containing solution thus obtained is subjected to, for example, concentration under reduced pressure, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate, or the like, or a fractional precipitation method using a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, or the like. It may be allowed to settle. Heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. A purified modified protein can be obtained by gel filtration using an adsorbent or a gel filtration agent, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, or affinity chromatography.
[0069]
In the present invention, by focusing on positions 76, 167, 168 and 169 of PQQGDH shown in SEQ ID NO: 1, and creating amino acid substitutions thereof, it is possible to obtain a modified PQQGDH with improved substrate specificity. did it. Regarding substrate specificity, Q76K, Q168A, (Q168S + L169S), (Q168A + L169D), (Q168S + E245D), (Q168S + L169E), (Q168A + L169G), (Q168S + A16L16A + L16A) ), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169K), (Q168A + L169M), (Q168A + L169N), (Q168A + L169P), (Q168A + L169) and (Q168A + L169) Particularly preferred.
[0070]
In the present invention, focusing on
Glucose assay kit
The invention also features a glucose assay kit comprising a modified PQQGDH according to the invention. The glucose assay kit of the present invention comprises the modified PQQGDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay. Typically, the kit contains, in addition to the modified PQQGDH of the present invention, buffers necessary for the assay, mediators, glucose standard solutions for preparing calibration curves, and guidelines for use. The modified PQQGDH according to the invention can be provided in various forms, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution. Preferably, the modified PQQGDH of the present invention is provided in a holo-form, but can also be provided in the form of an apoenzyme and holo-formed at the time of use.
Glucose sensor
The invention also features a glucose sensor using the modified PQQGDH according to the invention. As the electrode, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on the electrode. Examples of the immobilization method include a method using a crosslinking reagent, a method of enclosing in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, and a redox polymer. It may be fixed in a polymer together with a representative electron mediator or adsorbed and fixed on an electrode, or may be used in combination. Preferably, the modified PQQGDH of the present invention is immobilized on the electrode in a holated form, but it can also be immobilized in the form of an apoenzyme and PQQ provided as a separate layer or in solution. Typically, the modified PQQGDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
[0071]
The measurement of the glucose concentration can be performed as follows. Pour buffer into thermostatic cell, add PQQ and CaCl2, And a mediator are added and maintained at a constant temperature. As the mediator, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate and the like can be used. An electrode on which the modified PQQGDH of the present invention is immobilized is used as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in the current is measured. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared using a standard concentration glucose solution.
[0072]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
Example 1: Construction of an expression plasmid for a PQQ-dependent glucose dehydrogenase gene
The expression plasmid pNPG5 for wild-type PQQ-dependent glucose dehydrogenase contains a structural gene encoding a PQQ-dependent glucose dehydrogenase derived from Acinetobacter baumannii NCIMB11517 strain at the multiple cloning site of the vector pBluescript SK (-). It has been inserted. The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the amino acid sequence of PQQ-dependent glucose dehydrogenase deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
Example 2: Preparation of mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase
Based on the recombinant plasmid pNPG5 containing the wild-type PQQ-dependent glucose dehydrogenase gene and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 3 and a synthetic oligonucleotide complementary thereto, QuickChangeTM Using Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRATAGENE), a mutagenesis operation was performed according to the protocol, the nucleotide sequence was determined, and the glutamine at position 76 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was substituted with asparagine. A recombinant plasmid (pNPG5M1) encoding PQQ-dependent glucose dehydrogenase was obtained.
[0073]
Mutant PQQ in which glutamine at position 76 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with glutamic acid in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 4, and a synthetic oligonucleotide complementary thereto A recombinant plasmid (pNPG5M2) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
[0074]
Mutant PQQ in which glutamine at position 76 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with threonine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 5, and the synthetic oligonucleotide complementary thereto A recombinant plasmid (pNPG5M3) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
[0075]
Mutant PQQ in which glutamine at position 76 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has been substituted with methionine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 6, and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M4) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
[0076]
Mutant PQQ in which glutamine at position 76 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with glycine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 7, and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M5) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
[0077]
Mutant PQQ in which glutamine at position 76 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with lysine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 8, and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M6) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
[0078]
Mutant PQQ in which glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is replaced with isoleucine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 9, and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M7) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
[0079]
Mutant PQQ in which glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with valine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 10 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M8) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
[0080]
Mutant PQQ obtained by substituting 168th glutamine of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with alanine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 11 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M9) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
[0081]
Mutant PQQ in which lysine at
[0082]
Mutant PQQ in which lysine at position 89 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with glutamic acid in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 23, and a synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid encoding dependent glucose dehydrogenase was obtained. Further, based on this plasmid and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 24 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto, the lysine at position 89 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was replaced with glutamic acid, A recombinant plasmid (pNPG5M11) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase in which lysine was substituted with arginine was obtained.
[0083]
A mutant PQQ in which glutamine at position 246 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with histidine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 25, and a synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M12) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
[0084]
Based on pNPG5 and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 26 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto, glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was replaced by serine, and leucine at position 169 was replaced by the same method as described above. A recombinant plasmid (pNPG5M13) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase substituted with serine was obtained.
[0085]
Based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 27 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto, glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was replaced by alanine, and leucine at position 169 was replaced by the same method as described above. A recombinant plasmid (pNPG5M14) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase substituted with aspartic acid was obtained.
[0086]
Based on pNPG5 and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 66 and a synthetic oligonucleotide complementary thereto, glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was replaced with serine, and leucine at position 169 was replaced with the same method as described above. A recombinant plasmid (pNPG5M15) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase substituted with glutamic acid was obtained.
[0087]
Based on pNPG5 and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 67 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto, 168th glutamine and 169th leucine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 were used in the same manner as described above. A recombinant plasmid (pNPG5M16) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase substituted with proline was obtained.
[0088]
Based on pNPG5 and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 68 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto, glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was replaced with alanine, and leucine at position 169 was replaced with the same method as described above. A recombinant plasmid (pNPG5M17) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase substituted with glycine was obtained.
[0089]
pNPG5, pNPG5M1, pNPG5M2, pNPG5M3, pNPG5M4, pNPG5M5, pNPG5M6, pNPG5M7, pNPG5M8, pNPG5M9, pNPG5M10, pNPG5M11, pNPG5M5, pNPG5M5, pNPG5M5 ; Manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to obtain the transformants.
Example 3: Construction of an expression vector capable of replicating in Pseudomonas bacteria
5 μg of the DNA of the recombinant plasmid pNPG5M1 obtained in Example 2 was cleaved with restriction enzymes BamHI and XHoI (manufactured by Toyobo) to isolate the structural gene portion of the mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase. The isolated DNA and pTM33 (1 μg) digested with BamHI and XHoI were reacted with 1 unit of T4 DNA ligase at 16 ° C. for 16 hours to ligate the DNA. The ligated DNA was transformed using competent cells of Escherichia coli DH5α. The resulting expression plasmid was named pNPG6M1.
[0090]
pNPG5, pNPG5M2, pNPG5M3, pNPG5M4, pNPG5M5, pNPG5M6, pNPG5M7, pNPG5M8, pNPG5M9, pNPG5M10, pNPG5M11, pNPG5M12, pNPG5M13, pNPG5M14, pNPG5M15, pNPG5M16, obtain an expression plasmid in the same manner as the above-mentioned method also each recombinant plasmid pNPG5M17 did. Each resulting expression plasmid pNPG6, pNPG6M2, pNPG6M3, pNPG6M4, pNPG6M5, pNPG6M6, pNPG6M7, pNPG6M8, pNPG6M9, pNPG6M10, pNPG6M11, pNPG6M12, pNPG6M13, pNPG6M14, pNPG6M15, pNPG6M16, was named PNPG6M17.
Example 4: Preparation of transformant of Pseudomonas genus bacteria
Pseudomonas putida TE3493 (Miyakoken No. 12298) was cultured in an LBG medium (LB medium + 0.3% glycerol) at 30 ° C. for 16 hours, and cells were collected by centrifugation (12,000 rpm, 10 minutes). 8 ml of 5 mM K-phosphate buffer (pH 7.0) containing 300 mM sucrose cooled on ice was added to the cells to suspend the cells. The cells were collected again by centrifugation (12,000 rpm, 10 minutes), and 0.4 ml of an ice-cooled 5 mM K-phosphate buffer (pH 7.0) containing 300 mM sucrose was added. Suspended.
[0091]
0.5 μg of the expression plasmid pNPG6M1 obtained in Example 3 was added to the suspension, and the suspension was transformed by electroporation. The desired transformant was obtained from a colony grown on an LB agar medium containing 100 μg / ml streptomycin.
pNPG6, pNPG6M2, pNPG6M3, pNPG6M4, pNPG6M5, pNPG6M6, pNPG6M7, pNPG6M8, pNPG6M9, pNPG6M10, pNPG6M11, pNPG6M12, pNPG6M12, pNPG6M12, pNPG6M13, pNPG6M13, pNPG6M6, pNPG6M13, pNPG6M16, pNPG6M16, pNPG6M16, pNPG6M6, pNPG6M13, pNPG6M6, pNPG6M6, pNPG6M6, pNPG6M6, pNPG6M6, pNPG6M6 Were acquired respectively.
Test example 1
Method for measuring GDH activity
(1) Measurement principle
(2) Unit definition
One unit refers to the amount of PQQGDH enzyme that forms 0.5 mmol of diformazan per minute under the conditions described below.
(3) Method
reagent
A. D-glucose solution: 0.5 M (0.9 g D-glucose (molecular weight 180.16) / 10 ml H2O)
B. PIPES-NaOH buffer, pH 6.5: Dissolve 1.51 g of PIPES (molecular weight 302.36) suspended in 60 mL of water in 5N NaOH and add 2.2 ml of 10% Triton X-100. The pH was adjusted to 6.5 ± 0.05 at 25 ° C. using 5N NaOH, and water was added to make 100 ml.)
C. PMS solution: 3.0 mM (9.19 mg phenazine methosulfate (molecular weight 817.65) / 10 mlH2O)
D. NTB solution: 6.6 mM (53.96 mg of nitrotetrazolium blue (molecular weight 817.65) / 10 mlH2O)
E. FIG. Enzyme diluent: 1
procedure
1. The following reaction mixture was prepared in a light-shielded bottle and stored on ice (prepared before use)
[Table 1]
2.3.0 ml of the reaction mixture was placed in a test tube (made of plastic) and preliminarily heated at 37 ° C. for 5 minutes.
3. Add 0.1 ml of enzyme solution and mix gently by inverting.
The increase in absorbance for water at 4.570 nm was recorded on a spectrophotometer for 4-5 minutes while maintaining at 37 ° C., and the ΔOD per minute from the initial linear portion of the curve was calculated (OD test).
[0094]
At the same time, a blank (ΔOD blank) was measured by repeating the same method except that an enzyme diluent (E) was added instead of the enzyme solution.
[0095]
Immediately before the assay, the enzyme powder was dissolved in ice-cold enzyme diluent (E) and diluted to 0.1-0.8 U / ml with the same buffer (use of a plastic tube for adhesion of the enzyme). Is preferred).
Calculation
Activity is calculated using the following formula:
U / ml = {ΔOD / min (ΔOD test−ΔOD blank) × Vt × df} / (20.1 × 1.0 × Vs)
U / mg = (U / ml) × 1 / C
Vt: Total volume (3.1 ml)
Vs: sample volume (1.0 ml)
20.1: 1/2 mmol molecular extinction coefficient of diformazan
1.0: Optical path length (cm)
df: dilution factor
C: Enzyme concentration in solution (c mg / ml)
Method for preparing holo-type expression purified enzyme
500 ml of Terrific broth was dispensed into a 2 L Sakaguchi flask, autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes, allowed to cool, and then separately sterile-filtered streptomycin was added to 100 μg / ml. To this medium, 5 ml of a culture solution of Pseudomonas putida TE3493 (pNPG6M1) previously cultured at 30 ° C. for 24 hours in a PY medium containing 100 μg / ml of streptomycin was inoculated, and cultured under aeration and stirring at 30 ° C. for 40 hours. The PQQ-dependent glucose dehydrogenase activity at the end of the culture was about 120 U / ml per 1 ml of the culture in the above activity measurement.
[0096]
The cells were collected by centrifugation, suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), disrupted by sonication, and further centrifuged to obtain a supernatant as a crude enzyme solution. . The obtained crude enzyme solution was separated and purified by HiTrap-SP (Amersham-Pharmacia) ion exchange column chromatography. Then, after dialysis with a 10 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5), calcium chloride was added to a final concentration of 1 mM. Finally, it was separated and purified by HiTrap-DEAE (Amersham-Pharmacia) ion exchange column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. The sample obtained by this method showed an almost single band on SDS-PAGE.
[0097]
pNPG6, pNPG6M2, pNPG6M3, pNPG6M4, pNPG6M5, pNPG6M6, pNPG6M7, pNPG6M8, pNPG6M9, pNPG6M10, pNPG6M11, pNPG6M12, pNPG6M12, pNPG6M13, pNPG6M6, pNPG6M6, pNPG6M13, pNPG6M6, pNPG6M13, pNPG6M6 An enzyme preparation was obtained.
[0098]
The performance was evaluated using the purified enzyme thus obtained.
Measurement of Km value
The activity of PQQGDH was measured according to the above-mentioned activity measurement method. The measurement of the Km value for glucose was performed by changing the substrate concentration in the above-described activity measurement method. Further, the Km value for maltose was measured by replacing the glucose solution of the above-described activity measurement method with a maltose solution and changing the substrate concentration as in the measurement of the Km value for glucose. The results are shown in Table 2A, Table 2B, Table 6, Table 9, and Table 14.
Substrate specificity
The activity of PQQGDH was measured according to the above-mentioned activity measurement method. The dehydrogenase activity value when glucose was used as the substrate solution and the dehydrogenase activity value when maltose was used as the substrate solution were measured, and the relative value when the measured value was 100 when glucose was used as the substrate was determined. Was. For dehydrogenase activity when maltose was used as a substrate solution, a 0.5 M maltose solution was prepared and used for activity measurement. The results are shown in Table 2A, Table 2B, Table 4, Table 5, Table 6, Table 8, Table 9, Table 11, Table 13, and Table 14.
Measurement of thermal stability
Various PQQGDHs were prepared at an enzyme concentration of 5 U / ml and a buffer (1 mM CaCl 2).2After storage in 10 mM PIPES-NaOH (pH 6.5) containing 1 μM PQQ, the residual activity after heat treatment at 58 ° C. was determined. The results are shown in Tables 2A, 2B, 6, 9 and 14. The heat treatment was performed for 30 minutes in the test of Table 2B, and for 20 minutes in the other tests.
Optimal pH measurement
50 mM phosphate buffer (pH 5.0 to 8.0) containing 0.22% Triton-X100, 50 mM acetate buffer (pH 3.0 to 6.0) containing 0.22% Triton-X100, 0.22 % Enzyme activity in 50 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.0-7.0) containing 0.2% Triton-X100 and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0-9.0) containing 0.22% Triton-X100. It was measured. The results are shown in FIG. The pH showing the highest activity is shown in Table 2A.
[0099]
[Table 2A]
[Table 2B]
Confirmation of glucose quantitative property of Q76K
The following reaction reagent containing 0.45 U / ml Q76K was prepared.
[0102]
The results are shown in FIG.
How to measure glucose
300 μl of the reagent was added to 3 μl of the sample, and the change in absorbance for 1 minute from 2 minutes after the addition of the reagent was determined, and the amount of glucose in the sample was determined based on two calibration curves with purified water and
[0103]
From FIG. 2, good linearity was confirmed in the range of 0 to 600 mg / dl.
Confirmation of maltose action of Q76K
The following reaction reagent containing 0.45 U / ml Q76K was prepared.
[0104]
[0105]
A 100 mg / dl glucose solution containing no maltose was set to 100, and the measured values of the sample containing 100 mg / dl glucose in the base were relatively evaluated. Similarly, a 300 mg / dl glucose solution containing no maltose was set to 100, and the measured values of samples containing 300 mg / dl glucose in the base were relatively evaluated. The results are shown in FIG.
Confirmation of maltose action of Q76E
The action was evaluated using Q168E in the same manner as in the confirmation of the action of maltose of Q76K. Enzyme was added at a concentration of 0.24 U / ml. FIG. 4 shows the results.
Confirmation of maltose action of Q168V
The action was evaluated using Q168V in the same manner as in the confirmation of the action of maltose of Q76K. Enzyme was added at a concentration of 0.35 U / ml. FIG. 5 shows the results.
Confirmation of maltose action of Q168A
The action was evaluated using Q168A in the same manner as in the confirmation of the action of maltose of Q76K. The enzyme was added at a concentration of 0.6 U / ml. FIG. 6 shows the results.
Confirmation of maltose action of wild-type enzyme
The activity was evaluated using a wild-type enzyme in the same manner as the confirmation of the activity of Q76K for maltose. The enzyme was added at a concentration of 0.1 U / ml. FIG. 7 shows the results.
[0106]
From FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5, FIG. 6, and FIG. 7, it was confirmed that Q76K, Q76E, Q168V, and Q168A had lower action on maltose than the wild-type enzyme.
Example 5: Construction and screening of mutation library
Using the expression plasmid pNPG5 as a template, random mutation was introduced into the 167-169 region in the structural gene by PCR. The PCR reaction was performed in a solution having the composition shown in Table 3 at 98 ° C. for 2 minutes, and then at 98 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 4 minutes for 30 cycles.
[0107]
[Table 3]
The resulting mutant library was transformed into Escherichia coli DH5α, and each formed colony was inoculated on a microtiter plate in which 180 μl / well of LB medium (containing 100 μg / ml ampicillin and 26 μM PQQ) was dispensed. Then, the cells were cultured at 37 ° C for 24 hours. Each 50 μl of the culture solution was transferred to another microtiter plate, and the cultured cells were disrupted by repeated freezing and thawing, followed by centrifugation (2000 rpm, 10 minutes) to collect the supernatant. The collected supernatant was dispensed into two microtiter plates in an amount of 10 μl each. One microtiter plate was measured for activity using a reagent for measuring activity using glucose as a substrate, and the other was measured for activity using a reagent for measuring activity using maltose as a substrate, and the reactivity was compared. Numerous clones with altered reactivity to maltose were obtained.
Clones with altered reactivity to maltose were cultured in 5 ml dispensed test tubes of LB medium (containing 100 μg / ml ampicillin and 26 μM PQQ), and a confirmation experiment was performed. As a result, the reactivity to maltose was changed. Many clones were obtained.
[0109]
Table 4 shows the results.
[0110]
[Table 4]
Similarly, regions 67-69 (forward primer: described in SEQ ID NO: 14, reverse primer: used in SEQ ID NO: 15), regions 129-131 (forward primer: described in SEQ ID NO: 16, reverse primer: SEQ ID NO: 17) Mutations were also introduced into the 341-343 region (forward primer: described in SEQ ID NO: 18 and reverse primer: used in SEQ ID NO: 19). Insertion was attempted between 428 and 429 (forward primer: described in SEQ ID NO: 20, reverse primer: described in SEQ ID NO: 21).
Table 5 shows the results.
[0112]
[Table 5]
Among these, mutants having significantly reduced activity on maltose were selected (Q168S + E245D, Q168A + L169D, Q168S + L169S, Q168S + L169E, Q168A + L169G, Q168S + L169P), and plasmids were extracted from these mutants, Example 3 and Example 4. According to the method described, Pseudomonas was transformed to express a holo-type enzyme, a purified enzyme was obtained, and its properties were evaluated. Table 6 shows the results.
[0114]
[Table 6]
Example 6: Effect of mutation at Q168 site on substrate specificity
According to the method described in Example 5, Q168C, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q168K, Q168L, Q168M, Q168N, Q168P, Q168R, Q168S, Q168T, Q168W, and Q168Y were prepared. Table 7 shows the primers used for preparing each mutant. In addition, Table 8 shows the results of comparing the reactivity of maltose with the crushed liquid prepared in a test tube culture using each prepared mutant. Further, a plasmid was extracted from each mutant, and Pseudomonas was transformed according to the method described in Example 3 and Example 4 to express a holo-type enzyme, and a purified enzyme was obtained and its properties were evaluated. Table 9 shows the results.
[0116]
[Table 7]
[Table 8]
[Table 9]
Example 7: Effect of mutation at L169 site on substrate specificity
According to the method described in Example 2, mutants of L169A, L169V, L169H, L169Y, L169K, L169D, L169S, L169N, L169G, and L169C were prepared. Table 10 shows the primers used for preparing each mutant. Table 11 shows the results of comparison of the reactivity of maltose with the crushed liquid prepared in a test tube culture using each prepared mutant.
[0120]
[Table 10]
[Table 11]
Example 8: Effect of combination of mutation at L169 site on Q168A mutant on substrate specificity
According to the method described in Example 5, Preparation Q168A + L169A, Q168A + L169C, Q168A + L169E, Q168A + L169F, Q168A + L169H, Q168A + L169I, Q168A + L169K, Q168A + L169M, Q168A + L169N, Q168A + L169P, Q168A + L169Q, Q168A + L169R, Q168A + L169S, Q168A + L169T, Q168A + L169V, Q168A + L169W, each variant of Q168A + L169Y did. Table 12 shows the primers used for preparing each mutant. In addition, Table 13 shows the results of comparing the reactivity with maltose in the crushed liquid prepared in a test tube culture using each prepared mutant. Further, a plasmid was extracted from each mutant, and Pseudomonas was transformed according to the method described in Example 3 and Example 4 to express a holo-type enzyme, and a purified enzyme was obtained and its properties were evaluated. Table 14 shows the results.
[0123]
[Table 12]
[Table 13]
[Table 14]
According to the present invention, PQQGDH with improved substrate specificity and / or thermal stability can be obtained.
[0127]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of measuring the optimum pH.
FIG. 2 shows the results of glucose quantification.
FIG. 3 shows the results of confirming the maltose action of Q76K.
FIG. 4 shows the results of confirming the maltose action of Q76E.
FIG. 5 shows the results of confirming the maltose action of Q168V.
FIG. 6 shows the results of confirming the maltose action of Q168A.
FIG. 7 shows the results of confirming the maltose activity of the wild-type enzyme.
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