JP2004331633A

JP2004331633A - Monoclonal antibody and method for producing the same

Info

Publication number: JP2004331633A
Application number: JP2003152800A
Authority: JP
Inventors: Yoshinobu Nakanishi; 義信中西
Original assignee: Kanazawa Institute of Technology (KIT)
Current assignee: Kanazawa Institute of Technology (KIT)
Priority date: 2003-03-10
Filing date: 2003-05-29
Publication date: 2004-11-25

Abstract

【課題】ＳＲ−ＢＩ分子の機能の解明に必要不可欠なモノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】マウスＩｇＧ１／κサブクラスに属し、ラットのクラスＢスカベンジャー受容体タイプＩ（ＳＲ−ＢＩ）を認識するモノクローナル抗体である。ラットＳＲ−ＢＩのアミノ酸番号１１０〜１３２に相当する配列を持つ合成ペプチド、ラットＳＲ−ＢＩのアミノ酸番号１４４〜１６３に相当する配列を持つ合成ペプチド、あるいはラットＳＲ−ＢＩのアミノ酸番号１９２〜４３９部分をヒト免疫グロブリンのＦｃ領域に結合させたタンパク質を免疫原として作製される。作製されるモノクローナル抗体は、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、蛍光抗体法、フローサイトメトリー法等の抗原タンパク質の検出方法に利用可能である。
【選択図】図２The present invention provides a monoclonal antibody essential for elucidating the function of an SR-BI molecule.
The monoclonal antibody belongs to the mouse IgG1 / κ subclass and recognizes rat class B scavenger receptor type I (SR-BI). A synthetic peptide having a sequence corresponding to amino acids 110 to 132 of rat SR-BI, a synthetic peptide having a sequence corresponding to amino acids 144 to 163 of rat SR-BI, or a portion of amino acids 192 to 439 of rat SR-BI Is bound to the Fc region of a human immunoglobulin to prepare an immunogen. The prepared monoclonal antibody can be used for antigen protein detection methods such as Western blotting, immunohistochemistry, fluorescent antibody, and flow cytometry.
[Selection] Figure 2

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラットのクラスＢスカベンジャー受容体タイプＩに対するモノクローナル抗体及びその作製方法に関するものであり、さらには、このモノクローナル抗体を用いた抗原タンパク質検出方法、抗原タンパク質機能解析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
クラスＢスカベンジャー受容体タイプＩ（以下、ＳＲ−ＢＩと称する。）は、分子量約８５キロダルトンの二回膜貫通型糖タンパク質であり、脂質代謝の盛んな組織やステロイドホルモンを産生する組織、例えば肝臓、脂肪細胞、精巣、副腎、肺等に多く存在する。ＳＲ−ＢＩは、当初、酸化低密度リポタンパク質（ＯｘＬＤＬ：ｏｘｉｄｉｚｅｄｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体として同定されたが、その後の研究により、生体では高密度リポタンパク質（ＨＤＬ：ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）特異的受容体として機能することが示され、そのコレステロール代謝における役割が精力的に研究されている。
【０００３】
また、ＳＲ−ＢＩは、負電荷を持つ巨大分子や酸性リン脂質のリポソーム、さらにはアポトーシス細胞を認識することも示されており、例えば、アポトーシス細胞の貪食反応におけるＳＲ−ＢＩの関与が報告されている。アポトーシス細胞貪食反応は、４つの素過程、すなわちアポトーシス細胞周辺への食細胞の遊走、食細胞によるアポトーシス細胞の認識、食細胞によるアポトーシス細胞の取り込み、貪食されたアポトーシス細胞の食細胞内での輸送と処理、に分けることができる。これまでのこの分野の研究は、アポトーシス細胞選択認識を中心に行われてきており、アポトーシス細胞表面には貪食目印分子が出現し、食細胞はそれに対する特異的受容体で貪食すべき細胞を認識するという機構が想定されている。ここで、貪食目印分子には、糖鎖、タンパク質、リン脂質等、様々な種類の分子がその候補として挙げられているが、この中で、細胞膜リン脂質のホスファチジルセリン（ＰＳ）は、その報告例、認識する食細胞の種類、アポトーシス細胞表面への出現機構のいずれにおいても、最もよく知られた貪食目印分子である。食細胞上の貪食誘導性ＰＳ受容体として最初に同定されたのがＳＲ−ＢＩであり、これまでに精巣セルトリ細胞、卵巣ｔｈｅｃａ細胞、胸腺ｎｕｒｓｅ細胞がそれぞれの組織で生じたアポトーシス細胞を貪食する際に、ＳＲ−ＢＩの関与が報告されている。
【０００４】
さらに、本発明者らは、精子形成過程の少なくとも一部を再現できるラット精巣細胞の初代培養系を用いて、セルトリ細胞がアポトーシス精子形成細胞の貪食を行うことを明らかにした。また、このとき貪食反応がＳＲ−ＢＩの特異リガンドであるＨＤＬやＳＲ−ＢＩ特異抗体の添加により顕著に阻害されたことから、セルトリ細胞に発現するＳＲ−ＢＩがアポトーシス細胞の認識に関与することを報告している（非特許文献１参照）。
【０００５】
【非特許文献１】
白土他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，５９０１−５９０８（１９９９）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、ＳＲ−ＢＩは様々な組織に存在して脂質及びアポトーシス細胞取り込みに関わることが示されており、非マクロファージ系食細胞の主要な貪食誘導性ＰＳ受容体と位置付けされる。さらに、マクロファージも発現することから、ＳＲ−ＢＩは多くの食細胞に共通する受容体である可能性がある。したがって、ＳＲ−ＢＩ分子の機能を明らかにすることは、脂質代謝研究のみならず、生体内の有害な細胞を排除する仕組みの解明にも繋がるものと期待される。
【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みて提案されたものであり、ＳＲ−ＢＩ分子の機能の解明に必要不可欠なモノクローナル抗体及びその作製方法を提供することを目的とし、さらには、これを応用した抗原タンパク質の検出方法、機能解析方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明のモノクローナル抗体は、マウスＩｇＧ１／κサブクラスに属し、ラットのクラスＢスカベンジャー受容体タイプＩを認識することを特徴とするモノクローナル抗体である。
【０００９】
前記モノクローナル抗体は、具体的には、ラットのクラスＢスカベンジャー受容体タイプＩ（ＳＲ−ＢＩ）のアミノ酸番号１１０〜１３２に相当する配列を持つ合成ペプチド、ラットＳＲ−ＢＩのアミノ酸番号１４４〜１６３に相当する配列を持つ合成ペプチド、あるいはラットＳＲ−ＢＩのアミノ酸番号１９２〜４３９部分をヒト免疫グロブリンのＦｃ領域に結合させたタンパク質を免疫原として作製される。
【００１０】
作製に際しては、前述のようなラットＳＲ−ＢＩのアミノ酸配列の少なくとも一部を含む合成ペプチドまたはタンパク質をマウスに投与した後、抗体産生細胞（例えば脾臓細胞）を採取し、前記抗体産生細胞をミエローマ細胞（例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４）と融合させてハイブリドーマとし、クローン化したハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を分離抽出する。
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体は、抗原タンパク質の検出や、抗原タンパク質の活性の阻害から当該抗原タンパク質の機能の解析に利用することができ、ＳＲ−ＢＩ分子の機能を明らかにし、脂質代謝研究や生体内の有害な細胞を排除する仕組みを解明する上で、極めて有用である。
【００１２】
例えば、抗原タンパク質の検出には、必ずしもモノクローナル抗体を用いる必要はないが、ポリクローナル抗体は供給量が限られており、また均一な標品が常に入手可能という訳ではない。ポリクローナル抗体の場合、動物血液から抗体を採取するため、その動物の全血液量分の抗体しか存在せず、入手量に限りがある。これに対して、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマを維持する限り半永久的に供給可能であり、また、長期に亘る研究において同一品質の試薬を利用できるという利点を有する。
【００１３】
なお、本発明のモノクローナル抗体を利用可能な抗原タンパク質の検出方法としては、例えばウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、蛍光抗体法、フローサイトメトリー法等を挙げることができ、この場合、必要に応じてモノクローナル抗体に標識となる二次抗体を反応させることで、その検出を容易なものとすることができる。
【００１４】
また、本発明のモノクローナル抗体は、特定のタンパク質を認識し、特定部位に結合してその活性を阻害する性質を有することから、動物個体中でそのタンパク質（ＳＲ−ＢＩ）の働きを奪った時の影響を調べることで、当該タンパク質の機能阻害の解析に利用することができる。
【００１５】
例えばＳＲ−ＢＩは、精巣中のセルトリ細胞に存在する。そこで、セルトリ細胞におけるＳＲ−ＢＩの役割を知るために、生きたラットの精巣に抗体を注入してその影響、例えばその後精子形成が正常に行われているかどうかを調べる。ここで何らかの異常が認められれば、その現象にＳＲ−ＢＩが関与する可能性が生ずることになる。
【００１６】
通常はこのような実験には大量の抗体が必要であり、モノクローナル抗体を入手していなければ遂行することは不可能である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のモノクローナル抗体及びその作製方法、さらには、本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原タンパク質の検出方法、機能解析方法について詳述する。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体は、マウスＩｇＧ１／κサブクラスに属し、ラットのクラスＢスカベンジャー受容体タイプＩ（ＳＲ−ＢＩ）を認識する。ラットのＳＲ−ＢＩは、分子量約８５ｋＤａであり、図１に示すように、５０９個のアミノ酸残基からなる二回膜貫通型糖タンパク質である。ＳＲ−ＢＩには、細胞膜（ＣＭ）貫通領域と予想される疎水性アミノ酸に富む領域がアミノ酸の９〜３２番目、４５０〜４７５番目の２カ所に存在し、Ｎ末端、Ｃ末端に位置する細胞内領域はごく短い。
【００１９】
配列表に、ラットのＳＲ−ＢＩのアミノ酸配列を示す。なお、配列表においては、ラットセルトリ細胞、ハムスターのＳＲ−ＢＩ、マウスのＳＲ−ＢＩのアミノ酸配列も併せて示す。
【００２０】
ＳＲ−ＢＩは、脂質代謝の盛んな組織やステロイドホルモンを産生する組織、例えば肝臓、脂肪細胞、精巣、副腎、肺等に多く分布し、ＨＤＬやＡｃＬＤＬ、ＯｘＬＤＬ、酸性リポソーム、アポトーシス細胞等をリガンドとする。ＳＲ−Ｂファミリーの一つであるＳＲ−ＢＩは、ＨＤＬの取り込み及びアポトーシス細胞の認識における働きが注目されている分子である。
【００２１】
本発明のモノクローナル抗体は、前記のようなＳＲ−ＢＩ分子の機能を明らかにし、例えば脂質代謝研究や生体内の有害な細胞を排除する仕組みを解明する上で極めて有用なものである。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体を作製するには、免疫原を被免疫動物（マウス系統）に接種し、免疫する。免疫原の接種方法は、腹腔内投与、リンパ節内投与、皮内投与、脾内投与、血管内投与等、任意である。
【００２３】
免疫原としては、合成ペプチドや、ラットＳＲ−ＢＩの細胞外領域に相当するアミノ酸配列部分を結合させたタンパク質等を使用する。具体的には、先の配列表に示すラットＳＲ−ＢＩのアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１１０〜１３２に相当する配列を持つ合成ペプチド、アミノ酸番号１４４〜１６３に相当する配列を持つ合成ペプチド、あるいはアミノ酸番号１９２〜４３９部分をヒト免疫グロブリンのＦｃ領域に結合させたタンパク質である。
【００２４】
そして、得られた免疫動物から、例えば脾臓細胞やリンパ節細胞等の抗体産生細胞を分離し、抗体産生細胞を得る。得られた抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合し、増殖を半永久化する。このとき、細胞融合に使用するミエローマ細胞としては、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２）のような細胞株を挙げることができる。次いで、融合した細胞（ハイブリドーマ）を培養し、クローン化した後、抗ＳＲ−ＢＩ抗体を産生するハイブリドーマを選択し、目的とするモノクローナル抗体を分離抽出する。
【００２５】
以上により作製されるモノクローナル抗体は、抗原タンパク質の検出や、抗原タンパク質の活性の阻害から当該抗原タンパク質の機能の解析に利用することができる。適用可能な抗原タンパク質の検出方法としては、例えばウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、蛍光抗体法、フローサイトメトリー法等を挙げることができる。
【００２６】
例えば、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）は、タンパク質試料中に含まれる抗原タンパク質の分子量と含有量を決定する方法である。ウェスタンブロッティングでは、先ず、目的のタンパク質を含む試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、分子量に従って分離されたタンパク質を特殊な膜に写し取る。その膜にモノクローナル抗体を反応させ、さらにモノクローナル抗体を認識する二次抗体（例えば抗マウスＩｇＧ抗体に色素、酵素、蛍光物質、放射性物質等を結合させたもの。）を反応させる。最後に、二次抗体の標識物質を検出して最初の試料中に含まれる抗原タンパク質の分子量と含有量を決定する。
【００２７】
免疫組織化学は、動物臓器中のどの細胞に抗原タンパク質が含まれているか、あるいは細胞中のどの場所に抗原タンパク質が存在するかを決定する手法である。免疫組織化学に際しては、動物臓器については薄い（１０μｍ程度）切片を作成し、ばらばらにした細胞はそのままスライドガラスに貼り付ける。そこにモノクローナル抗体を反応させ、前記ウェスタンブロッティングの場合と同様の方法で二次抗体の標識物質を検出する。それらの試料を顕微鏡で解析して、抗原タンパク質の存在場所を決定する。
【００２８】
蛍光抗体法は、前記免疫組織化学と同じ目的で利用される実験方法であり、主にばらばらにした細胞について適用される。ばらばらにした細胞をスライドガラスに貼り付け、そこにモノクローナル抗体を反応させる。次に、蛍光物質で標識された二次抗体を添加して反応させ、最後に蛍光顕微鏡で観察する。目的の抗原タンパク質が含まれる場所が顕微鏡下に光って見える。
【００２９】
フローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）は、ばらばらにした細胞群について、目的の抗原タンパク質を持つ細胞の割合を決定する方法である。フローサイトメトリーでは、細胞試料を、先ずモノクローナル抗体と、続いて蛍光物質で標識された二次抗体と反応させる。それをフローサイトメーターで解析し、抗原を有する細胞の数および抗原量を決定する。
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体は、当該モノクローナル抗体による目的タンパク質の機能阻害から、動物個体中でそのタンパク質の働きを奪ったときに見られる影響の解析に利用できる。
【００３１】
このような抗ＳＲ−ＢＩモノクローナル抗体を用いた実験としては、例えばセルトリ細胞におけるＳＲ−ＢＩの役割を知るための実験等を挙げることができる。すなわち、ＳＲ−ＢＩは精巣中のセルトリ細胞に存在する。そこで、セルトリ細胞におけるＳＲ−ＢＩの役割を知るために、生きたラットの精巣に抗体を注入してその影響を調べる。麻酔を施したラットの精巣を露出させ、精細管内にモノクローナル抗体を含む溶液を微量注入する。精巣を腹部に戻し、切開場所を縫合して、そのラットを一定期間飼育する。その後に、精巣を取り出して、精子形成が正常に行われているかどうかを調べる。何らかの異常が認められたならば、その現象にＳＲ−ＢＩが関与する可能性が生まれる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明の具体的な実施例について、実験結果を基に説明する。
【００３３】
免疫原の調製
ラットＳＲ−ＢＩのアミノ酸番号１１０〜１３２、あるいはアミノ酸番号１４４〜１６３に相当する配列を持ち、且つアミノ末端にシステインが付加されたペプチドを合成した。なお、合成は、米国ＴＡＮＡＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社に依頼した。これらのペプチドのシステインにペプチドの抗原活性を高める役割を果たすタンパク質（Ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を結合させて免疫原とした（これをＫＬＨ−ペプチドと称する。）。また一方、ラットＳＲ−ＢＩの細胞外領域に相当するアミノ酸番号１９２〜４３９の部分をヒト免疫グロブリンのＦｃ領域（目的タンパク質の精製のし易さと安定性に寄与する。）に結合させ、これにより得られたタンパク質をヒト培養細胞で発現させて精製したものも免疫原として用いた（これをＳＲＢＩｅｃｄ−Ｆｃと称する。例えば、河崎他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２７５５９−２７５６６（２００２）を参照。）。これら合計３種類の免疫原を別々にマウスに接種して抗体生産を促した。
【００３４】
マウスへの免疫
リン酸緩衝塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）に溶かした２５μｇのＫＬＨ−ペプチド（２種類）、あるいは５０μｇのＳＲＢＩｅｃｄ−Ｆｃを、フロイント完全アジュバントとともに懸濁して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射した。その２週間後に、同量の抗原をフロイント不完全アジュバントに懸濁して、同じマウスの腹腔に注射した。これをさらに２〜４回繰り返した。
【００３５】
ハイブリドーマの作成
最後の免疫から３日後に脾臓を摘出し、そこに含まれている細胞をばらばらにした。ポリエチレングリコールを用いた方法を利用して，それらの脾臓細胞をミエローマＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞と融合させた（融合により脾臓細胞の増殖が半永久化される）。融合した細胞（ハイブリドーマと呼ぶ）のみが生き残るような薬剤を含むＨＡＴ培地で培養し，生存して増えてきた細胞をクローン化（１種類の細胞だけにする作業）した。
【００３６】
抗ＳＲ−ＢＩ抗体を生産するハイブリドーマの選択
クローン化したハイブリドーマの培養上清について、対応する免疫原を用いたＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）法を利用して各免疫原に結合する抗体の有無を検定した。その結果、ＫＬＨ−ペプチド１１０−１３２を免疫原にした場合では２８クローン、ＫＬＨ−ペプチド１４４−１６３では２クローン、そしてＳＲＢＩｅｃｄ−Ｆｃでは１クローンが抗ＳＲ−ＢＩ抗体を生産するハイブリドーマとして得られた。
【００３７】
各モノクローナル抗体の性質の検定
得られたハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体について、先ずサブクラスを調べた。その結果、全ての抗体がＩｇＧ１／κであった。
【００３８】
これらの抗体を精製して、各種免疫実験に適用できるかどうかを検定した。その結果、表１に示すように、クローンによって適用できる免疫実験が異なるが、特に、ＫＬＨ−ペプチド１４４−１６３を免疫原にした２クローン（６Ｃ７及び３Ｄ１２）、及びＳＲＢＩｅｃｄ−Ｆｃを免疫原にした１クローン（３Ｅ５）において免疫実験に適用できることがわかった。
【００３９】
【表１】

【００４０】
細胞の固定
以下、先に作製されたモノクローナル抗体を用いた免疫実験について説明するが、これらの免疫実験では、細胞が持つ抗原を検出する際に、細胞を固定するか否かの選択がある。何も処理しない細胞では細胞膜がバリアーとなって、抗体が細胞内に入ることができない。これに対して、固定した細胞では、細胞膜の物質透過性が上昇して、抗体が細胞内部に侵入できるようになる。そのため、抗体による抗原検出反応を行うと、固定しない細胞では細胞表層に存在する抗原のみが検出されるのに対して、固定した細胞では細胞表層と細胞内部の抗原がすべて検出される。そこで、実験の目的によって、いずれの方法を採用するかを決めることとする。
【００４１】
モノクローナル抗体３Ｅ５を用いたウェスタンブロッティングによるＳＲ−ＢＩの検出
ラットセルトリ細胞の抽出液中に含まれるタンパク質２０μｇをＳＤＳを含む７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、セミドライブロット装置を使ってポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移し取った後に、モノクローナル抗体３Ｅ５が結合するタンパク質を検出した。結果を図２に示す。
【００４２】
１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体３Ｅ５を反応させると単一のシグナルが検出され（図中右端部分）、これは既知のポリクローナル抗体が結合するシグナルと同じ位置に存在する（図中左端部分）。他のモノクローナル抗体ではこのようなシグナルは得られなかった。したがって、モノクローナル抗体３Ｅ５を用いることにより、ウェスタンブロッティングによってＳＲ−ＢＩを検出することが可能であることが判明した。
【００４３】
モノクローナル抗体３Ｄ１２を用いた蛍光抗体法による未固定細胞表層のＳＲ−ＢＩの検出
遺伝子導入によりＳＲ−ＢＩを発現させたハムスター卵巣由来の培養細胞（河崎他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２７５５９−２７５６６（２００２）を参照。）について、未固定条件でモノクローナル抗体３Ｄ１２を反応させ、さらに蛍光標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させた後に、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。結果を図３に示す。図３において、符号ＧがＳＲ−ＢＩの位置を示す。なお、図３において、上２枚（ａ），（ｂ）と下２枚（ｃ），（ｄ）は細胞の異なる位置の横断面を示す（上は中央寄りであり、下は上部寄りである。）。この結果は、モノクローナル抗体３Ｄ１２を用いた蛍光抗体法により未固定細胞表層のＳＲ−ＢＩの検出が可能であることを示している。
【００４４】
モノクローナル抗体３Ｄ１２を用いた蛍光抗体法による未固定細胞表層のＳＲ−ＢＩの検出
ラット黄体細胞について、未固定条件でモノクローナル抗体３Ｄ１２を反応させ、さらに蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体を反応させた後に落射蛍光顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。図４（ａ）に示す暗視野画像において、色の薄い部分がＳＲ−ＢＩの位置を示す。この結果、モノクローナル抗体３Ｄ１２を用いた免疫組織化学によって、未固定細胞表層のＳＲ−ＢＩの検出が可能であることがわかる。
【００４５】
モノクローナル抗体３Ｅ５を用いた免疫組織化学による細胞全体のＳＲ−ＢＩの検出
パラホルムアルデヒドで固定したラット黄体細胞にモノクローナル抗体３Ｅ５を反応させ、さらにペルオキシダーゼ標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、呈色反応を行った後に顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。符号ＢＲがＳＲ−ＢＩの位置を、符号ＢＬが細胞核を示す。この結果から、モノクローナル抗体３Ｅ５を用いた免疫組織化学によって、固定した細胞全体のＳＲ−ＢＩの検出が可能であることがわかる。
【００４６】
モノクローナル抗体３Ｅ５を用いた免疫組織化学による卵巣切片中のＳＲ−ＢＩの検出
パラホルムアルデヒドで固定して凍結したラット卵巣から切片を作製してモノクローナル抗体３Ｅ５を反応させ、次にペルオキシダーゼ標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、呈色反応を行った後に顕微鏡で観察した。結果を図６に示す。図６において、（ａ）は卵巣全体、（ｂ）は黄体、（ｃ）は卵胞の像を示す。また、符号ＢＲがＳＲ−ＢＩの位置を、符号ＢＬが細胞核を示す。ＳＲ−ＢＩは卵巣中の黄体と卵胞に存在する。この結果、モノクローナル抗体３Ｅ５を用いた免疫組織化学により、ラット組織切片でのＳＲ−ＢＩの検出が可能であることがわかった。
【００４７】
モノクローナル抗体３Ｄ１２を用いたフローサイトメトリーによる細胞表層のＳＲ−ＢＩの検出
未固定の細胞にモノクローナル抗体３Ｄ１２を反応させ、さらに蛍光標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させた後に、フローサイトメーターで解析した。結果を図７に示す。遺伝子導入によりＳＲ−ＢＩを発現させたハムスター卵巣由来の培養細胞（ＳＲ−ＢＩ発現株）［図７（ｂ）］は，導入前の細胞（親株）［図７（ａ）］に比べて多量の３Ｄ１２を結合させることがわかる。他のモノクローナル抗体は結合しない［図７（ｃ）］。この結果より、モノクローナル抗体３Ｄ１２を用いたフローサイトメトリーにより、細胞表層のＳＲ−ＢＩの検出が可能であることがわかる。
【００４８】
モノクローナル抗体３Ｄ１２のＨＤＬ取り込みへの影響
培養した細胞を含む培地に蛍光標識されたＨＤＬ（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で２時間加温した。その後に細胞をリン酸緩衝塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、細胞への蛍光標識ＨＤＬの取り込みをフローサイトメトリーで解析した。結果を図８に示す。遺伝子導入によりＳＲ−ＢＩを発現させたハムスター卵巣由来の培養細胞（ＳＲ−ＢＩ発現株）［図８（ｂ）］には、導入前の細胞（親株）［図８（ａ）］に比べて多量のＨＤＬが取り込まれることがわかる。この反応をモノクローナル抗体３Ｄ１２（５０μｇ／ｍｌ）の存在のもとに行わせると、図８（ｃ）に示すように、取り込み量は導入前の細胞を用いた反応とほぼ同程度まで低下した。他のモノクローナル抗体を添加しても、図８（ｄ）に示すように、ＨＤＬの取り込みは影響を受けない。したがって、モノクローナル抗体３Ｄ１２は、ＳＲ−ＢＩのＨＤＬ取り込み活性を阻害することがわかる。
【００４９】
モノクローナル抗体３Ｄ１２のアポトーシス細胞貪食への影響
モノクローナル抗体３Ｄ１２のアポトーシス細胞貪食への影響を以下のように調べた。２０日齢ラットの精巣より単離したセルトリ細胞をモノクローナル抗体３Ｄ１２または他のモノクローナル抗体と混ぜ、３２．５℃で１時間加温した。そのセルトリ細胞を同じ精巣より調製した精子形成細胞と１：１０の割合で混ぜ、上記のモノクローナル抗体を存在させた状態で３２．５℃で２時間加温後、精子形成細胞を取り込んだセルトリ細胞数を計測した。結果を図９に示す。図９には、貪食の程度を、抗体添加無しの時の貪食インデックス（総セルトリ細胞数あたりの精子形成細胞を貪食したセルトリ細胞数のパーセント）に対する相対値で示してある。図９に示されるように、セルトリ細胞による精子形成細胞の貪食は、モノクローナル抗体３Ｄ１２の添加により阻害されたが、他のモノクローナル抗体によっては影響を受けなかった。したがって、モノクローナル抗体３Ｄ１２によって機能が阻害されるＳＲ−ＢＩが、セルトリ細胞による精子形成細胞の貪食に関与していることがわかる。
【００５０】
【発明の効果】
以上の説明からも明らかなように、本発明によれば、ＳＲ−ＢＩ分子の機能の解明に必要不可欠なモノクローナル抗体を提供することが可能であり、さらには、これを応用した抗原タンパク質の検出方法、機能解析方法を提供することが可能である。特に、本発明のモノクローナル抗体は、各実験結果からも明らかなように、未固定細胞の表層に存在する抗原の検出が可能であること、抗原の機能を阻害する働きを有すること、均一な標品が大量に得られること等の特徴を有し、これまで不可能であった研究が可能になるという、極めて顕著な効果を奏するものである。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＲ−ＢＩの構造を示す模式図である。
【図２】モノクローナル抗体３Ｅ５を用いたウェスタンブロッティングによるＳＲ−ＢＩの検出結果を示す図である。
【図３】モノクローナル抗体３Ｄ１２を用いた蛍光抗体法による未固定細胞表層のＳＲ−ＢＩの検出結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図４】モノクローナル抗体３Ｄ１２を用いた蛍光抗体法による未固定細胞表層のＳＲ−ＢＩの検出結果を示す落射蛍光顕微鏡写真である。
【図５】モノクローナル抗体３Ｅ５を用いた免疫組織化学による細胞全体のＳＲ−ＢＩの検出結果を示す顕微鏡写真である。
【図６】モノクローナル抗体３Ｅ５を用いた免疫組織化学による卵巣切片中のＳＲ−ＢＩの検出結果を示す顕微鏡写真である。
【図７】モノクローナル抗体３Ｄ１２を用いたフローサイトメトリーによる細胞表層のＳＲ−ＢＩの検出結果を示す図である。
【図８】蛍光標識されたＨＤＬの細胞への取り込みをフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。
【図９】ラットセルトリ細胞による精子形成細胞の貪食反応の結果を示した図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a monoclonal antibody against rat class B scavenger receptor type I and a method for producing the same. Further, the present invention relates to a method for detecting an antigen protein and a method for analyzing an antigen protein function using the monoclonal antibody.
[0002]
[Prior art]
Class B scavenger receptor type I (hereinafter, referred to as SR-BI) is a double transmembrane glycoprotein having a molecular weight of about 85 kilodaltons, and is a tissue with active lipid metabolism and a tissue that produces steroid hormones, for example, It is abundant in the liver, adipocytes, testis, adrenal gland, lung and the like. SR-BI was originally identified as a receptor for oxidized low-density lipoprotein (OxLDL), but subsequent studies have identified specific high-density lipoprotein (HDL) in vivo. It has been shown to function as a selective receptor and its role in cholesterol metabolism has been energetically studied.
[0003]
SR-BI has also been shown to recognize negatively charged macromolecules and acidic phospholipid liposomes, as well as apoptotic cells. For example, the involvement of SR-BI in the phagocytic reaction of apoptotic cells has been reported. ing. Apoptotic cell phagocytosis involves four elementary processes: migration of phagocytic cells around apoptotic cells, recognition of apoptotic cells by phagocytes, uptake of apoptotic cells by phagocytes, and transport of phagocytic apoptotic cells into phagocytes. And processing. Until now, research in this field has focused on the recognition of apoptotic cell selection, and phagocytic marker molecules appear on the surface of apoptotic cells, and phagocytes recognize cells to be phagocytosed by specific receptors for them. A mechanism to do this is assumed. Here, various types of molecules, such as sugar chains, proteins, and phospholipids, are listed as candidates for the phagocytosis marker molecule. Among them, phosphatidylserine (PS), a cell membrane phospholipid, is reported. For example, it is the most well-known phagocytic marker molecule in both types of recognized phagocytes and appearance mechanism on the apoptotic cell surface. SR-BI was first identified as a phagocytic-inducible PS receptor on phagocytes, and so far testicular Sertoli cells, ovarian theca cells, and thymic nurse cells phagocytose apoptotic cells generated in their respective tissues. At that time, the involvement of SR-BI has been reported.
[0004]
Furthermore, the present inventors have shown that Sertoli cells phagocytose apoptotic spermatogenic cells by using a primary culture system of rat testis cells that can reproduce at least part of the spermatogenesis process. In addition, since the phagocytic reaction was significantly inhibited by the addition of HDL or SR-BI specific antibody which is a specific ligand of SR-BI, SR-BI expressed in Sertoli cells is involved in recognition of apoptotic cells. (See Non-Patent Document 1).
[0005]
[Non-patent document 1]
Shirato et al. Biol. Chem. 274, 5901-5908 (1999)
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, SR-BI has been shown to be involved in lipid and apoptotic cell uptake in various tissues, and is positioned as a major phagocytic inducible PS receptor for non-macrophage phagocytes. Furthermore, since macrophages are also expressed, SR-BI may be a receptor common to many phagocytes. Therefore, elucidating the functions of SR-BI molecules is expected to lead not only to lipid metabolism studies but also to elucidation of a mechanism for eliminating harmful cells in a living body.
[0007]
The present invention has been proposed in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody essential for elucidating the function of an SR-BI molecule and a method for producing the monoclonal antibody. It is an object of the present invention to provide a method for detecting the antigen protein and a method for analyzing the function.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody belonging to the mouse IgG1 / κ subclass and recognizing rat class B scavenger receptor type I.
[0009]
The monoclonal antibody specifically includes a synthetic peptide having a sequence corresponding to amino acids 110 to 132 of rat class B scavenger receptor type I (SR-BI), amino acids 144 to 163 of rat SR-BI. The immunogen is prepared using a synthetic peptide having a corresponding sequence or a protein in which amino acid numbers 192 to 439 of rat SR-BI are linked to the Fc region of human immunoglobulin.
[0010]
In the preparation, a synthetic peptide or protein containing at least a part of the amino acid sequence of rat SR-BI as described above is administered to a mouse, and then antibody-producing cells (for example, spleen cells) are collected. The cells are fused with cells (for example, SP2 / 0-Ag14) to form a hybridoma, and a monoclonal antibody produced from the cloned hybridoma is separated and extracted.
[0011]
The monoclonal antibody of the present invention can be used for the detection of an antigen protein or for the analysis of the function of the antigen protein from the inhibition of the activity of the antigen protein. It is extremely useful in elucidating the mechanism of eliminating harmful cells.
[0012]
For example, it is not always necessary to use a monoclonal antibody to detect an antigen protein. However, the supply amount of a polyclonal antibody is limited, and a uniform sample is not always available. In the case of a polyclonal antibody, since the antibody is collected from the blood of the animal, only the antibody corresponding to the whole blood volume of the animal exists, and the available amount is limited. In contrast, monoclonal antibodies have the advantage that they can be supplied semi-permanently as long as the hybridoma is maintained, and that reagents of the same quality can be used in long-term studies.
[0013]
In addition, examples of the method for detecting an antigen protein that can use the monoclonal antibody of the present invention include a Western blotting method, an immunohistochemical method, a fluorescent antibody method, and a flow cytometry method. By reacting the monoclonal antibody with a secondary antibody serving as a label, the detection can be facilitated.
[0014]
Further, since the monoclonal antibody of the present invention has a property of recognizing a specific protein and binding to a specific site to inhibit its activity, when the protein (SR-BI) is deprived of the function in an animal individual, By examining the effect of the protein, it can be used to analyze the function inhibition of the protein.
[0015]
For example, SR-BI is present in Sertoli cells in the testis. Therefore, in order to know the role of SR-BI in Sertoli cells, an antibody is injected into the testis of a living rat to examine its effect, for example, whether or not spermatogenesis is performed normally thereafter. Here, if any abnormality is recognized, there is a possibility that SR-BI is involved in the phenomenon.
[0016]
Usually, such experiments require a large amount of antibodies and cannot be performed without monoclonal antibodies.
[0017]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the monoclonal antibody of the present invention and a method for producing the same, and a method for detecting an antigen protein and a method for analyzing a function using the monoclonal antibody of the present invention will be described in detail.
[0018]
The monoclonal antibodies of the present invention belong to the mouse IgG1 / κ subclass and recognize rat class B scavenger receptor type I (SR-BI). Rat SR-BI is a double transmembrane glycoprotein having a molecular weight of about 85 kDa and consisting of 509 amino acid residues as shown in FIG. In SR-BI, a region rich in hydrophobic amino acids predicted to be a cell membrane (CM) penetrating region exists at two positions 9 to 32 and 450 to 475 of amino acids, and a cell located at the N-terminal or C-terminal. The inner area is very short.
[0019]
The sequence listing shows the amino acid sequence of rat SR-BI. The sequence listing also shows the amino acid sequences of rat Sertoli cells, hamster SR-BI, and mouse SR-BI.
[0020]
SR-BI is widely distributed in tissues with active lipid metabolism and tissues that produce steroid hormones, such as liver, adipocytes, testis, adrenal glands, lungs, etc. And SR-BI, a member of the SR-B family, is a molecule that has been noted for its role in HDL uptake and recognition of apoptotic cells.
[0021]
The monoclonal antibody of the present invention is extremely useful for elucidating the function of the SR-BI molecule as described above and elucidating, for example, lipid metabolism research and a mechanism for eliminating harmful cells in a living body.
[0022]
In order to prepare the monoclonal antibody of the present invention, an immunogen is inoculated into an animal to be immunized (mouse strain) and immunized. The method of inoculating the immunogen is arbitrary, such as intraperitoneal administration, intralymphatic administration, intradermal administration, intrasplenic administration, or intravascular administration.
[0023]
As the immunogen, a synthetic peptide, a protein having an amino acid sequence corresponding to the extracellular region of rat SR-BI, or the like is used. Specifically, in the amino acid sequence of rat SR-BI shown in the above sequence listing, a synthetic peptide having a sequence corresponding to amino acids 110 to 132, a synthetic peptide having a sequence corresponding to amino acids 144 to 163, or This protein has amino acids 192 to 439 linked to the Fc region of human immunoglobulin.
[0024]
Then, antibody-producing cells such as spleen cells and lymph node cells are separated from the obtained immunized animal to obtain antibody-producing cells. The obtained antibody-producing cells are fused with myeloma cells to make the proliferation semipermanent. At this time, examples of myeloma cells used for cell fusion include cell lines such as Sp2 / 0-Ag14 (SP2). Next, after culturing and cloning the fused cells (hybridoma), a hybridoma producing an anti-SR-BI antibody is selected, and a desired monoclonal antibody is separated and extracted.
[0025]
The monoclonal antibody prepared as described above can be used for detection of an antigen protein and analysis of the function of the antigen protein from inhibition of the activity of the antigen protein. Applicable methods for detecting an antigen protein include, for example, Western blotting, immunohistochemistry, fluorescent antibody, and flow cytometry.
[0026]
For example, Western blotting is a method for determining the molecular weight and content of an antigen protein contained in a protein sample. In Western blotting, first, a sample containing a target protein is subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, and the proteins separated according to the molecular weight are transferred to a special membrane. The membrane is reacted with a monoclonal antibody, and further reacted with a secondary antibody that recognizes the monoclonal antibody (for example, an anti-mouse IgG antibody to which a dye, an enzyme, a fluorescent substance, a radioactive substance, or the like is bound). Lastly, the labeling substance of the secondary antibody is detected to determine the molecular weight and content of the antigen protein contained in the first sample.
[0027]
Immunohistochemistry is a technique for determining which cells in an animal organ contain the antigen protein or where in the cell the antigen protein is present. At the time of immunohistochemistry, thin (about 10 μm) sections are prepared for animal organs, and the separated cells are directly attached to a slide glass. The monoclonal antibody is reacted therewith, and the labeling substance of the secondary antibody is detected in the same manner as in the above-mentioned Western blotting. The samples are analyzed under a microscope to determine the location of the antigen protein.
[0028]
The fluorescent antibody method is an experimental method used for the same purpose as the immunohistochemistry described above, and is mainly applied to dissociated cells. The separated cells are attached to a slide glass, and a monoclonal antibody is reacted therewith. Next, a secondary antibody labeled with a fluorescent substance is added and reacted, and finally observed with a fluorescence microscope. The location containing the target antigen protein appears shining under the microscope.
[0029]
Flow cytometry is a method of determining the proportion of cells having an antigenic protein of interest in a fragmented cell group. In flow cytometry, a cell sample is first reacted with a monoclonal antibody and then with a fluorescent-labeled secondary antibody. It is analyzed with a flow cytometer to determine the number of cells having the antigen and the amount of the antigen.
[0030]
The monoclonal antibody of the present invention can be used for analysis of the effects observed when the function of the protein is deprived in animal individuals due to the inhibition of the function of the protein of interest by the monoclonal antibody.
[0031]
An experiment using such an anti-SR-BI monoclonal antibody includes, for example, an experiment for knowing the role of SR-BI in Sertoli cells. That is, SR-BI is present in Sertoli cells in the testis. Therefore, in order to know the role of SR-BI in Sertoli cells, the effect is examined by injecting antibodies into the testes of living rats. The testis of the anesthetized rat is exposed, and a solution containing the monoclonal antibody is microinjected into the seminiferous tubule. The testes are returned to the abdomen, the incision site is sutured and the rats are housed for a period of time. Thereafter, the testes are removed to determine whether spermatogenesis is normal. If any abnormality is recognized, there is a possibility that SR-BI is involved in the phenomenon.
[0032]
【Example】
Hereinafter, specific examples of the present invention will be described based on experimental results.
[0033]
Preparation of immunogen
A peptide having a sequence corresponding to amino acid number 110 to 132 or amino acid number 144 to 163 of rat SR-BI and having cysteine added to the amino terminal was synthesized. The synthesis was requested to TANA Laboratories, USA. A protein (Keyhole limpet hemocyanin) that plays a role in enhancing the antigen activity of the peptide was bound to the cysteine of these peptides to obtain an immunogen (this is referred to as KLH-peptide). On the other hand, a portion of amino acid numbers 192 to 439 corresponding to the extracellular region of rat SR-BI is bound to the Fc region of human immunoglobulin (which contributes to the ease of purification and stability of the target protein). A protein obtained by expressing the obtained protein in human cultured cells and purified was also used as an immunogen (this is referred to as SRBIecd-Fc. For example, Kawasaki et al., J. Biol. Chem. 277, 27559-27566 (2002)). reference.). Mice were separately inoculated with these three types of immunogens separately to promote antibody production.
[0034]
Immunity to mice
25 μg of KLH-peptide (two types) or 50 μg of SRBIecd-Fc dissolved in phosphate-buffered saline were suspended in Freund's complete adjuvant and injected into the abdominal cavity of Balb / c mice. Two weeks later, the same amount of antigen was suspended in Freund's incomplete adjuvant and injected intraperitoneally in the same mouse. This was repeated two to four more times.
[0035]
Creating a hybridoma
Three days after the last immunization, the spleen was removed, and the cells contained therein were broken apart. The spleen cells were fused with myeloma SP2 / 0-Ag14 cells using a method using polyethylene glycol (the fusion makes the spleen cell proliferation semipermanent). The cells were cultured in a HAT medium containing a drug that allows only the fused cells (called hybridomas) to survive, and the cells that had survived and increased were cloned (work to reduce only one type of cells).
[0036]
Anti SR-BI Selection of hybridoma producing antibody
The culture supernatant of the cloned hybridoma was assayed for the presence or absence of an antibody that binds to each immunogen by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) using the corresponding immunogen. As a result, when KLH-peptide 110-132 was used as an immunogen, 28 clones were obtained as KLH-peptide 144-163, and 2 clones were obtained as a hybridoma producing anti-SR-BI antibody in SRBIecd-Fc. .
[0037]
Testing the properties of each monoclonal antibody
First, the subclass of the monoclonal antibody produced by the obtained hybridoma was examined. As a result, all antibodies were IgG1 / κ.
[0038]
These antibodies were purified and tested for their applicability to various immunization experiments. As a result, as shown in Table 1, the applicable immunization experiments differed depending on the clones. In particular, two clones (6C7 and 3D12) using KLH-peptide 144-163 as an immunogen and SRBIecd-Fc as an immunogen were used. One clone (3E5) was found to be applicable to immunization experiments.
[0039]
[Table 1]

[0040]
Cell fixation
Hereinafter, immunization experiments using the previously prepared monoclonal antibody will be described. In these immunization experiments, when detecting an antigen possessed by a cell, there is a choice of fixing or not fixing the cell. In cells that have not been treated, the cell membrane acts as a barrier, preventing the antibody from entering the cells. On the other hand, in fixed cells, the permeability of the cell membrane to the material is increased, so that the antibody can enter the inside of the cell. Therefore, when an antigen detection reaction is performed with an antibody, only the antigen present on the cell surface is detected in unfixed cells, whereas all antigens on the cell surface and inside the cell are detected in fixed cells. Therefore, it is determined which method is adopted depending on the purpose of the experiment.
[0041]
Detection of SR-BI by Western blotting using monoclonal antibody 3E5
20 μg of protein contained in the extract of rat Sertoli cells was separated by 7.5% polyacrylamide gel electrophoresis containing SDS, and transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane using a semi-dried lot device. The protein to which 3E5 binds was detected. FIG. 2 shows the results.
[0042]
When 10 μg / ml of the monoclonal antibody 3E5 was reacted, a single signal was detected (the rightmost part in the figure), which was present at the same position as the signal to which the known polyclonal antibody binds (the leftmost part in the figure). Such a signal was not obtained with other monoclonal antibodies. Therefore, it was found that it is possible to detect SR-BI by Western blotting by using the monoclonal antibody 3E5.
[0043]
Detection of SR-BI on Unfixed Cell Surface by Fluorescent Antibody Method Using Monoclonal Antibody 3D12
Cultured cells derived from hamster ovaries expressing SR-BI by gene transfer (see Kawasaki et al., J. Biol. Chem. 277, 27559-27566 (2002)) are reacted with monoclonal antibody 3D12 under unfixed conditions. After further reaction with a fluorescently labeled anti-mouse IgG antibody, the cells were observed with a confocal laser microscope. The results are shown in FIG. In FIG. 3, reference symbol G indicates the position of SR-BI. In FIG. 3, the upper two sheets (a) and (b) and the lower two sheets (c) and (d) show cross sections of cells at different positions (the upper part is closer to the center and the lower part is closer to the upper part). is there.). This result indicates that it is possible to detect SR-BI on the surface of unfixed cells by the fluorescent antibody method using the monoclonal antibody 3D12.
[0044]
Detection of SR-BI on Unfixed Cell Surface by Fluorescent Antibody Method Using Monoclonal Antibody 3D12
Rat luteal cells were reacted with the monoclonal antibody 3D12 under non-fixed conditions, and further reacted with a fluorescently labeled anti-mouse IgG antibody, and then observed with an epifluorescence microscope. FIG. 4 shows the results. In the dark-field image shown in FIG. 4A, a light-colored portion indicates the position of SR-BI. As a result, it can be seen that the immunohistochemistry using the monoclonal antibody 3D12 enables the detection of SR-BI on the surface of unfixed cells.
[0045]
Detection of SR-BI in whole cells by immunohistochemistry using monoclonal antibody 3E5
The rat luteal cells fixed with paraformaldehyde were reacted with the monoclonal antibody 3E5, and further reacted with a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody. After performing a color reaction, the cells were observed with a microscope. FIG. 5 shows the results. Symbol BR indicates the position of SR-BI, and symbol BL indicates the cell nucleus. These results indicate that immunohistochemistry using the monoclonal antibody 3E5 enables the detection of SR-BI in the whole fixed cells.
[0046]
Detection of SR-BI in ovarian sections by immunohistochemistry using monoclonal antibody 3E5
A section was prepared from a rat ovary fixed and fixed with paraformaldehyde, reacted with the monoclonal antibody 3E5, then reacted with a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody, and observed with a microscope after performing a color reaction. FIG. 6 shows the results. In FIG. 6, (a) shows the whole ovary, (b) shows the corpus luteum, and (c) shows the image of the follicle. The symbol BR indicates the position of SR-BI, and the symbol BL indicates the cell nucleus. SR-BI is present in the corpus luteum and follicles in the ovaries. As a result, it was found that SR-BI could be detected in rat tissue sections by immunohistochemistry using monoclonal antibody 3E5.
[0047]
Detection of SR-BI on cell surface by flow cytometry using monoclonal antibody 3D12
The unfixed cells were reacted with the monoclonal antibody 3D12, and further reacted with a fluorescently labeled anti-mouse IgG antibody, and then analyzed with a flow cytometer. FIG. 7 shows the results. The hamster ovary-derived cultured cells (SR-BI expressing strain) in which SR-BI was expressed by gene transfer (FIG. 7 (b)) had a larger amount than the cells before transfer (parent strain) [FIG. 7 (a)]. 3D12 is bound. Other monoclonal antibodies do not bind [FIG. 7 (c)]. These results indicate that SR-BI on the cell surface can be detected by flow cytometry using the monoclonal antibody 3D12.
[0048]
Effect of monoclonal antibody 3D12 on HDL uptake
Fluorescently labeled HDL (10 μg / ml) was added to the medium containing the cultured cells, and the mixture was heated at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, the cells were washed with phosphate-buffered saline, and the incorporation of fluorescently labeled HDL into the cells was analyzed by flow cytometry. FIG. 8 shows the results. Cultured cells derived from hamster ovaries (SR-BI expressing strain) in which SR-BI was expressed by gene transfer (FIG. 8 (b)) were compared with cells (parent strain) before transfer (FIG. 8 (a)). It turns out that a large amount of HDL is taken in. When this reaction was performed in the presence of monoclonal antibody 3D12 (50 μg / ml), the amount of uptake was reduced to almost the same level as in the reaction using cells before introduction, as shown in FIG. 8 (c). Addition of other monoclonal antibodies does not affect HDL uptake, as shown in FIG. Therefore, it can be seen that the monoclonal antibody 3D12 inhibits the HDL uptake activity of SR-BI.
[0049]
Effect of monoclonal antibody 3D12 on phagocytosis of apoptotic cells
The effect of monoclonal antibody 3D12 on phagocytosis of apoptotic cells was examined as follows. Sertoli cells isolated from testis of a 20-day-old rat were mixed with the monoclonal antibody 3D12 or another monoclonal antibody, and heated at 32.5 ° C. for 1 hour. The Sertoli cells were mixed with spermatogenic cells prepared from the same testis at a ratio of 1:10, and heated at 32.5 ° C. for 2 hours in the presence of the above-mentioned monoclonal antibody. The number was measured. FIG. 9 shows the results. FIG. 9 shows the degree of phagocytosis as a relative value to the phagocytosis index (the percentage of the number of Sertoli cells that phagocytosed spermatogenic cells per total number of Sertoli cells) when no antibody was added. As shown in FIG. 9, phagocytosis of spermatogenic cells by Sertoli cells was inhibited by the addition of monoclonal antibody 3D12, but was not affected by other monoclonal antibodies. Therefore, it can be seen that SR-BI, whose function is inhibited by the monoclonal antibody 3D12, is involved in phagocytosis of spermatogenic cells by Sertoli cells.
[0050]
【The invention's effect】
As is clear from the above description, according to the present invention, it is possible to provide a monoclonal antibody indispensable for elucidating the function of SR-BI molecule, and further, to detect an antigen protein using the monoclonal antibody. It is possible to provide a method and a function analysis method. In particular, the monoclonal antibody of the present invention is capable of detecting an antigen present on the surface of unfixed cells, has a function of inhibiting the function of the antigen, and has a uniform It has features such as the ability to obtain a large amount of products, and has an extremely remarkable effect that enables research that was impossible until now.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of SR-BI.
FIG. 2 shows the results of detecting SR-BI by western blotting using monoclonal antibody 3E5.
FIG. 3 is a confocal laser micrograph showing the results of detecting SR-BI on the surface of unfixed cells by a fluorescent antibody method using a monoclonal antibody 3D12.
FIG. 4 is an epifluorescence micrograph showing the results of detection of SR-BI on the surface of unfixed cells by a fluorescent antibody method using monoclonal antibody 3D12.
FIG. 5 is a photomicrograph showing results of SR-BI detection of whole cells by immunohistochemistry using monoclonal antibody 3E5.
FIG. 6 is a micrograph showing the results of detecting SR-BI in ovarian sections by immunohistochemistry using monoclonal antibody 3E5.
FIG. 7 shows the results of detecting SR-BI on the cell surface by flow cytometry using monoclonal antibody 3D12.
FIG. 8 is a diagram showing the results of analyzing the uptake of fluorescently labeled HDL into cells by flow cytometry.
FIG. 9 is a view showing the results of a phagocytic reaction of sperm-forming cells by rat Sertoli cells.

Claims

A monoclonal antibody belonging to the mouse IgG1 / κ subclass and recognizing rat class B scavenger receptor type I.

The monoclonal antibody according to claim 1, wherein a synthetic peptide having a sequence corresponding to amino acids 110 to 132 of rat class B scavenger receptor type I is used as an immunogen.

The monoclonal antibody according to claim 1, wherein a synthetic peptide having a sequence corresponding to amino acids 144 to 163 of rat class B scavenger receptor type I is used as an immunogen.

The monoclonal antibody according to claim 1, wherein a protein obtained by binding the amino acid numbers 192 to 439 of rat class B scavenger receptor type I to the Fc region of human immunoglobulin is used as an immunogen.

After administering a synthetic peptide or protein containing at least a part of the amino acid sequence of rat class B scavenger receptor type I to a mouse, collecting antibody-producing cells,
A method for producing a monoclonal antibody, comprising fusing the antibody-producing cells with myeloma cells to form a hybridoma, and isolating and extracting a monoclonal antibody produced from the cloned hybridoma.

The method for producing a monoclonal antibody according to claim 5, wherein a synthetic peptide having a sequence corresponding to amino acids 110 to 132 of rat class B scavenger receptor type I is used as the synthetic peptide.

The method for producing a monoclonal antibody according to claim 5, wherein a synthetic peptide having a sequence corresponding to amino acids 144 to 163 of rat class B scavenger receptor type I is used as the synthetic peptide.

The method for producing a monoclonal antibody according to claim 5, wherein a protein in which amino acids 192 to 439 of rat class B scavenger receptor type I are bound to the Fc region of human immunoglobulin is used as the protein.

The method for producing a monoclonal antibody according to claim 5, wherein the antibody-producing cells are spleen cells.

The method for producing a monoclonal antibody according to claim 5, wherein the myeloma cells are Sp2 / 0-Ag14.

A method for detecting an antigen protein, comprising using a monoclonal antibody belonging to the mouse IgG1 / κ subclass and recognizing rat class B scavenger receptor type I, and detecting an antigen protein that reacts with the monoclonal antibody.

12. The method for detecting an antigen protein according to claim 11, wherein the method is one selected from a Western blotting method, an immunohistochemistry method, a fluorescent antibody method, and a flow cytometry method.

The method for detecting an antigen protein according to claim 12, wherein the monoclonal antibody is reacted with a secondary antibody serving as a label.

A method for analyzing the function of an antigen protein, comprising inhibiting the activity of the antigen protein with a monoclonal antibody that belongs to the mouse IgG1 / κ subclass and recognizes rat class B scavenger receptor type I, and analyzes the function of the antigen protein.

The method according to claim 14, wherein the function is a function involved in phagocytosis of apoptotic cells.