【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。
【０００６】
一方、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定する場合、検体物質は必ずしも単一成分ではなく、例えば細胞抽出液中などのような不均一系で検体物質を測定することも要求される。その場合、種々の蛋白質、脂質などの夾雑物が検出表面に非特異的な吸着を起こすと、測定検出感度が著しく低下する。上記の検出表面では、非特異吸着が極めて起こりやすく問題があった。また、測定時のベースラインが不安定になるという問題があった。
【０００７】
この問題を解決するためにいくつかの方法が検討されている。例えば、金属表面にリンカーを介し、親水性のハイドロゲルを固定化することで、物理吸着を抑制する方法も使用されてきた（特許文献１、特許文献３及び特許文献４を参照）。しかしながら、この方法でも非特異吸着の抑制性は十分なレベルではなく、測定時のベースラインの安定性の問題も存在していた。
【０００８】
【特許文献１】
特許第２８１５１２０号
【特許文献２】
特開平９−２６４８４３号
【特許文献３】
米国特許第５４３６１６１号
【特許文献４】
特開平８−１９３９４８号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、測定時のベースラインを安定化したバイオセンサーを提供することを解決すべき課題とした。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、基板の表面を乾燥時の膜厚に対する２５℃の純水での膨潤度の比率が１以上５以下である膜でコーティングすることによって測定時のベースラインを安定化したバイオセンサーを提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明によれば、乾燥時の膜厚に対する２５℃の純水での膨潤度の比率が１以上５以下である膜でコーティングした基板から成るバイオセンサーが提供される。
【００１２】
好ましくは、乾燥時の膜厚に対する２５℃の純水での膨潤度の比率が１以上５以下である膜は有機物である。
好ましくは、乾燥時の膜厚に対する２５℃の純水での膨潤度の比率が１以上５以下である膜は、水に対する溶解度が２０重量％以下である単量体を５０重量％以上含む高分子重合体である。
好ましくは、 乾燥時の膜厚に対する２５℃の純水での膨潤度の比率が１以上５以下である膜は硬膜剤を含有する。
【００１３】
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、乾燥時の膜厚に対する２５℃の純水での膨潤度の比率が１以上５以下である膜でコーティングした金属表面あるいは金属膜から成るバイオセンサーである。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金又はアルミニウムから選ばれる自由電子金属からなる。
【００１４】
好ましくは、本発明のバイオセンサーは非電気化学的検出に使用することができ、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用することができる。
【００１５】
本発明の別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している、上記バイオセンサーが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記バイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している上記バイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定することができ、さらに好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサーは、乾燥時の膜厚に対する２５℃の純水での膨潤度の比率が１以上５以下である膜でコーティングした基板から成ることを特徴とする。
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００１８】
本発明において、膨潤度の比率は、（膨潤状態での膜厚）／（乾燥状態での膜厚）で表される。膨潤度の比率が大きいと測定中の塩濃度等の変化に対して安定化に時間がかかることになり、微量測定に支障をきたす。膨潤度の比率は、１以上５以下が好ましいが、より好ましくは１以上２以下である。
【００１９】
次に、本発明で用いることができる水に対する溶解度が２０重量％以下である単量体を５０重量％以上含む高分子重合体について説明する。
本発明に用いられる高分子重合体を形成する単量体の２５℃の水に対する溶解度は、新実験化学講座基本操作１（丸善化学、１９７５）に記載されている方法で測定することができる。この方法で測定すると上記本発明の単量体の２０℃の水に対する溶解度は、例えば２−エチルヘキシルメタクリレートで０．００重量％、スチレンで０．０３重量％、メチルメタクリレートで１．３５重量％、ブチルアクリレートで０．３２重量％、ブチルメタクリレートで０．０３重量％であった。
【００２０】
本発明で用いられる水に対する溶解度が２０重量％以下である単量体の具体例としては、スチレン、メタクリル酸メチル、メタクリル酸ヘキサフルオロプロパン、酢酸ビニル、アクリロニトリルなどが挙げられる。
【００２１】
本発明では、前述の水に対する溶解度が２０重量％以下である単量体と共に、水に対する溶解度が２０重量％以上である単量体を共重合した高分子化合物を併用しても良い。
水に対する溶解度が２０重量％以上である単量体の具体例としては、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸、アクリル酸、アリルアルコール等が挙げられる。
【００２２】
本発明の高分子重合体は、水に対する溶解度が２０重量％以下である単量体を５０重量％以上含むことが好ましい。さらに、水に対する溶解度が２０重量％以下である単量体を７５％以上含むことがより好ましい。
【００２３】
次に、本発明で用いることができる硬膜剤について説明する。
ゼラチンに代表される親水性高分子は、通常、水により大きく膨潤するが、分子内部に架橋することで膨潤を抑えることができる。本発明では、高分子に分子内架橋を形成できる化合物を硬膜剤と呼ぶ。分子内架橋反応としては、共有結合を形成する場合（例えば多価のビニルスルホン化合物、多価のエポキシ化合物、多価のメラミン化合物など）、イオン結合を形成する場合（例えばＡｌ（ＩＩＩ）イオン、Ｐｄ（ＩＩＩ）イオン、Ｃｒ（ＩＩＩ）イオン、Ｃａ（ＩＩ）イオン、Ｐｂ（ＩＩ）イオン、Ｍｇ（ＩＩ）イオン、Ｂａ（ＩＩ）イオンなど）などがあるが、本発明では特に限定されない。
【００２４】
具体的化合物としては以下のものが挙げられる。ビニルスルホン化合物としては、下記化合物が挙げられる。
ＶＳ−１
ＣＨ２＝ＣＨＳＯ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２
ＶＳ−２
ＣＨ２＝ＣＨＳＯ２ＣＨ２Ｃ（ＯＨ）ＨＣＨ２ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２
ＶＳ−３
ＣＨ２＝ＣＨＳＯ２ＣＨ２Ｃ（ＯＨ）ＨＣ（ＯＨ）ＨＣＨ２ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２
ＶＳ−４
ＣＨ２＝ＣＨＳＯ２ＣＨ２Ｃ（ＯＨ）ＨＣＨ２Ｃ（ＯＨ）ＨＣＨ２ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２
エポキシ化合物としては、デナコールＥＸ５２１（ナガセ化成工業（株）製）、メラミン化合物としては スミテックスレジンＭ−３（住友化学工業（株）製）などが挙げられる。
また、無機塩としては、Ａｌ３（ＳＯ４）２などが挙げられる。
【００２５】
上記した高分子重合体の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００２６】
膜のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。
【００２７】
本発明のバイオセンサーは、金属表面又は金属膜を膜でコーティングしたものであることが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２８】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００２９】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００３０】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００３１】
上記したような乾燥時の膜厚に対する２５℃の純水での膨潤度の比率が１以上５以下である膜でコーティングした基板から成る本発明のバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした膜中の基板から最も遠い側」という意味である。
【００３２】
好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ３ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００３３】
最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。例えば−ＣＯＯＣＨ３基を含有する高分子化合物であるポリメチルメタクリレートを金属膜上にコーティングした後、その表面をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間接触させると、最表面に−ＣＯＯＨ基が生成する。
【００３４】
上記のようにして得られたバイオセンサー用表面において、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００３５】
本発明のバイオセンサー上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００３６】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原２６、８６、５５、１１１ 、１５７ などに対する抗体等を使用することができる。
【００３７】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００３８】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００３９】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００４０】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。
【００４１】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００４２】
即ち、本発明によれば、生理活性物質が固定化された本発明のバイオセンサーを用いて、これに被験物質を接触させることにより、該バイオセンサーに固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定する方法が提供される。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
【００４３】
本発明では、バイオセンサー用表面に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００４４】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００４５】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００４６】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００４７】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００４８】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００４９】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００５０】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００５１】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００５２】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００５３】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００５４】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００５５】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００５６】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩｇＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００５７】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００５８】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００５９】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６０】
【実施例】
以下の実験は、特開２００１−３３０５６０号公報の図２２に記載の装置（以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ）、及び同公報の図２３に記載の誘電体ブロック（以下、本発明の誘電体ブロックと呼ぶ）を用いて行った。
【００６１】
実施例１：測定チップの作製
（１）比較例：デキストランで被覆処理した測定チップの作製
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ ＩＮＣ．）で３０分間処理した後、エタノール／水（８０／２０）中１１？ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールの５．０ｍＭ溶液を金属膜に接触するように添加し、２５℃で１８時間表面処理を行った。その後、エタノールで５回、エタノール／水混合溶媒で１回、水で５回洗浄を行った。
【００６２】
次に、１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールで被覆した表面を１０重量％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：０．４Ｍ水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの１：１混合溶液）に接触させ、２５℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面をエタノールで２回、水で５回洗浄した。
【００６３】
次に、２５重量％のデキストラン（Ｔ５００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）水溶液４０．５ｍｌに４．５ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で２５℃で２０時間インキュベートした。表面を５０℃の水で１０回洗浄した。
【００６４】
続いて、ブロモ酢酸３．５ｇを２７ｇの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、２８℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。このサンプルをデキストラン表面チップと呼ぶ。
【００６５】
（２）ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）膜の作成
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ ＩＮＣ．）で３０分間処理した後、１ｍｇ／ｍｌのポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液５μｌを金属膜に接触するように添加し、２５℃で１５分間静置した。
【００６６】
（３）ポリメチルメタクリレート膜をＮａＯＨで処理した測定チップの作成
前記（２）で得られたサンプルに１Ｎ ＮａＯＨ水溶液をＰＭＭＡ膜に接触するように添加し、６０℃５時間静置した後、水で３回洗浄した。このサンプルをＰＭＭＡ／ＮａＯＨ処理チップと呼ぶ。
【００６７】
（４）ポリスチレン（ＰＳ）膜の作成
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ ＩＮＣ．）で３０分間処理した後、１ｍｇ／ｍｌのポリスチレンのメチルエチルケトン溶液５μｌを金属膜に接触するように添加し、５℃で１５分間静置した。
【００６８】
（５）ポリスチレン膜をオゾン処理した測定チップの作成
前記（２）で得られたサンプルをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ ＩＮＣ．）で３０分間処理した。このサンプルをＰＳ／オゾン処理チップと呼ぶ。
【００６９】
（６）ゼラチン（Ｇｅｌ）膜の作成
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ ＩＮＣ．）で３０分間処理した後、０．１重量％のゼラチンと表１に記載の重量％の化合物Ａもしくは硫酸アルミニウムの混合物の水溶液５μｌを金属膜に接触するように添加し、２５℃で１５分間静置した。このサンプルをゼラチン膜チップと呼ぶ。
【００７０】
（７）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）膜の作成
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ ＩＮＣ．）で３０分間処理した後、０．１重量％のポリビニルアルコール（ＭＰ１０３：クラレ（株）製）と表１に記載の重量％のスミテックスレジンＭ−３（８０％水溶液：住友化学工業（株）製）の混合物の水溶液５μｌを金属膜に接触するように添加し、２５℃で１５分間静置した。このサンプルをＰＶＡ膜チップと呼ぶ。
【００７１】
化合物Ａ： ＣＨ２＝ＣＨＳＯ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣＯ−ＣＨ２ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２
【００７２】
実施例２：測定チップの性能評価：
（１）測定時のベースライン安定性の評価
特に低分子の検体化合物の結合を検出する場合、測定時のベースラインが不安定であると、その結合を検出することが極めて困難となる。
【００７３】
各チップの膜の水に対する膨潤度は、乾燥状態、及び２５℃の純水で膨潤させた状態を２５℃の環境下でＳＩＩ社ＳＰＡ４００型ＳＰＭのＡＦＭモードにて測定した。膨潤度の比率を表１に示す。
【００７４】
ベースラインの安定性は以下の方法で評価した。まず、測定チップを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、水を添加した。３０分放置後、水を抜き取り、ＨＢＳ−Ｎバッファー（ＨＥＰＥＳ０．０１ｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．４）；ＮａＣｌ０．１５ｍｏｌ／ｌ）を添加した。そのまま３０分間静置し、その間の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量を記録した。置換後５分〜１５分の間の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量（Δ５−１５）と置換後２０分〜３０分の間の共鳴シグナルの変化量（Δ２０−３０）を測定した。この共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量は各々１０ＲＵ以下であることが好ましく、５ＲＵ以下であることがさらに好ましい。また、Δ５−１５とΔ２０−３０の差は５ＲＵ以下であることが好ましい。
【００７５】
（４）結果
表１に測定時のベースラインの安定性の測定結果を示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】
表１の結果から、乾燥時の膜厚に対する２５℃の純水での膨潤度の比率が１以上５以下である膜でコーティングした基板から成る本発明のバイオセンサーを用いることにより、測定時のベースラインを安定化できることがわかる。
【００７８】
【発明の効果】
本発明により、測定時のベースラインの安定性を改善したバイオセンサー用検出表面を提供することが可能になった。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a biosensor and a method for analyzing an interaction between biomolecules using the biosensor. In particular, the present invention relates to a biosensor for use in a surface plasmon resonance biosensor and a method for analyzing an interaction between biomolecules using the biosensor.
[0002]
[Prior art]
Currently, many measurements using intermolecular interactions such as immune reactions are performed in clinical examinations, etc., but conventional methods require complicated operations and labeling substances, so measurement without the need for labeling substances Several techniques that can detect a change in the amount of a substance bound with high sensitivity are used. For example, surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, and measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles. SPR measurement technology detects adsorption and desorption near the surface by measuring the refractive index change in the vicinity of the organic functional film in contact with the metal film of the chip by measuring the peak shift of the reflected light wavelength or the change in the amount of reflected light at a fixed wavelength. It is a method to do. The QCM measurement technique is a technique capable of detecting the adsorption / desorption mass at the ng level from the change in the frequency of the oscillator due to the adsorption / desorption of a substance on the gold electrode (device) of the crystal oscillator. In addition, by functionalizing the surface of gold ultrafine particles (nm level), immobilizing a physiologically active substance on the surface, and performing a specific recognition reaction between the physiologically active substances, it is possible to obtain a living body from the sedimentation and arrangement of gold fine particles. Related substances can be detected.
[0003]
In any of the above techniques, the surface on which the physiologically active substance is immobilized is important. Hereinafter, the surface plasmon resonance (SPR) most used in this technical field will be described as an example.
[0004]
A commonly used measurement chip is composed of a transparent substrate (eg, glass), a deposited metal film, and a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance thereon, and the metal surface is interposed through the functional group. Immobilize physiologically active substances. The interaction between biomolecules is analyzed by measuring a specific binding reaction between the physiologically active substance and the analyte substance.
[0005]
As a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance, a functional group capable of binding to a metal, a linker having a chain length of 10 or more atoms, and a compound having a functional group capable of binding to a physiologically active substance, A measurement chip in which an active substance is immobilized has been reported (see Patent Document 1). In addition, a measurement chip comprising a metal film and a plasma polymerization film formed on the metal film has been reported (see Patent Document 2).
[0006]
On the other hand, when measuring a specific binding reaction between a physiologically active substance and a sample substance, the sample substance is not necessarily a single component, and for example, the sample substance may be measured in a heterogeneous system such as in a cell extract. Required. In that case, when various kinds of contaminants such as proteins and lipids cause nonspecific adsorption on the detection surface, the measurement and detection sensitivity is remarkably lowered. The above detection surface has a problem that non-specific adsorption is very likely to occur. There is also a problem that the baseline at the time of measurement becomes unstable.
[0007]
Several methods have been investigated to solve this problem. For example, a method of suppressing physical adsorption by immobilizing a hydrophilic hydrogel on a metal surface via a linker has been used (see Patent Document 1, Patent Document 3, and Patent Document 4). However, even with this method, the suppression of nonspecific adsorption was not at a sufficient level, and there was a problem of baseline stability during measurement.
[0008]
[Patent Document 1]
Patent No. 2815120 [Patent Document 2]
JP-A-9-264843 [Patent Document 3]
US Pat. No. 5,436,161 [Patent Document 4]
JP-A-8-193948 [0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made to solve the above-described problems of the prior art. That is, this invention made it the problem which should be solved to provide the biosensor which stabilized the baseline at the time of a measurement.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive investigations to solve the above problems, the present inventors have coated the surface of the substrate with a film having a ratio of the degree of swelling in pure water at 25 ° C. to the film thickness during drying of 1 to 5. As a result, the present inventors have found that a biosensor having a stable baseline at the time of measurement can be provided, and the present invention has been completed.
[0011]
That is, according to the present invention, there is provided a biosensor comprising a substrate coated with a film having a ratio of the degree of swelling in pure water at 25 ° C. to the film thickness upon drying of 1 to 5.
[0012]
Preferably, the film having a ratio of the degree of swelling in pure water at 25 ° C. to the film thickness during drying of 1 or more and 5 or less is an organic substance.
Preferably, the film having a ratio of the degree of swelling in pure water at 25 ° C. to the film thickness at the time of drying of 1 to 5 is a high film containing 50% by weight or more of a monomer having a water solubility of 20% by weight or less. It is a molecular polymer.
Preferably, the film in which the ratio of the degree of swelling in pure water at 25 ° C. to the film thickness at the time of drying is 1 or more and 5 or less contains a hardener.
[0013]
Preferably, the biosensor of the present invention is a biosensor composed of a metal surface or metal film coated with a film having a ratio of the degree of swelling in pure water at 25 ° C. to 1 to 5 with respect to the film thickness when dried.
Preferably, the metal surface or the metal film is made of a free electron metal selected from gold, silver, copper, platinum or aluminum.
[0014]
Preferably, the biosensor of the present invention can be used for non-electrochemical detection, more preferably for surface plasmon resonance analysis.
[0015]
According to another aspect of the present invention, there is provided the biosensor, wherein a physiologically active substance is covalently bonded to the surface.
According to still another aspect of the present invention, the biosensor includes a step of bringing the biosensor and the bioactive substance into contact with each other, and covalently binding the bioactive substance to the biosensor surface. A method of immobilizing is provided.
[0016]
According to still another aspect of the present invention, a substance that interacts with the physiologically active substance is detected or detected, which comprises the step of bringing the biosensor in which the physiologically active substance is covalently bonded to the surface with the test substance. A method for measuring is provided.
Preferably, the substance that interacts with the physiologically active substance can be detected or measured by a non-electrochemical method, and more preferably, the substance that interacts with the physiologically active substance is detected or measured by surface plasmon resonance analysis.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below.
The biosensor of the present invention is characterized by comprising a substrate coated with a film having a ratio of the degree of swelling in pure water of 25 ° C. to the film thickness at the time of drying of 1 to 5.
The biosensor referred to in the present invention is interpreted in the broadest sense, and means a sensor that measures and detects a target substance by converting an interaction between biomolecules into a signal such as an electrical signal. A normal biosensor is composed of a receptor site for recognizing a chemical substance to be detected and a transducer site for converting a physical change or chemical change generated therein into an electrical signal. In the living body, there are enzymes / substrates, enzymes / coenzymes, antigens / antibodies, hormones / receptors and the like as substances having affinity for each other. Biosensors use the principle that one of these substances having affinity for each other is immobilized on a substrate and used as a molecular recognition substance to selectively measure the other substance to be matched.
[0018]
In the present invention, the ratio of the degree of swelling is represented by (film thickness in the swollen state) / (film thickness in the dry state). If the ratio of the degree of swelling is large, it will take time for stabilization against changes in the salt concentration during measurement, which hinders measurement of trace amounts. The swelling ratio is preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 2 or less.
[0019]
Next, a high molecular polymer containing 50% by weight or more of a monomer having a water solubility of 20% by weight or less that can be used in the present invention will be described.
The solubility of the monomer forming the polymer used in the present invention in water at 25 ° C. can be measured by the method described in New Experimental Chemistry Course Basic Operation 1 (Maruzen Chemistry, 1975). When measured by this method, the solubility of the monomer of the present invention in water at 20 ° C. is, for example, 0.002% by weight for 2-ethylhexyl methacrylate, 0.03% by weight for styrene, 1.35% by weight for methyl methacrylate, It was 0.32% by weight for butyl acrylate and 0.03% by weight for butyl methacrylate.
[0020]
Specific examples of the monomer having a water solubility of 20% by weight or less used in the present invention include styrene, methyl methacrylate, hexafluoropropane methacrylate, vinyl acetate, acrylonitrile and the like.
[0021]
In the present invention, a polymer compound obtained by copolymerizing a monomer having a solubility in water of 20% by weight or more may be used in combination with the monomer having a solubility in water of 20% by weight or less.
Specific examples of the monomer having a solubility in water of 20% by weight or more include 2-hydroxyethyl methacrylate, methacrylic acid, acrylic acid, and allyl alcohol.
[0022]
The polymer of the present invention preferably contains 50% by weight or more of a monomer having a solubility in water of 20% by weight or less. Furthermore, it is more preferable to contain 75% or more of a monomer having a solubility in water of 20% by weight or less.
[0023]
Next, the hardener that can be used in the present invention will be described.
A hydrophilic polymer typified by gelatin usually swells greatly with water, but swelling can be suppressed by crosslinking inside the molecule. In the present invention, a compound capable of forming intramolecular crosslinks in a polymer is called a hardener. As an intramolecular crosslinking reaction, when a covalent bond is formed (for example, a polyvalent vinyl sulfone compound, a polyvalent epoxy compound, a polyvalent melamine compound, etc.), or when an ionic bond is formed (for example, an Al (III) ion, Pd (III) ion, Cr (III) ion, Ca (II) ion, Pb (II) ion, Mg (II) ion, Ba (II) ion, etc.), but are not particularly limited in the present invention.
[0024]
Specific examples of the compound include the following. Examples of the vinyl sulfone compound include the following compounds.
VS-1
CH 2 = CHSO 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOCH 2 SO 2 CH = CH 2
VS-2
CH 2 = CHSO 2 CH 2 C (OH) HCH 2 SO 2 CH = CH 2
VS-3
CH 2 = CHSO 2 CH 2 C (OH) HC (OH) HCH 2 SO 2 CH = CH 2
VS-4
CH 2 = CHSO 2 CH 2 C (OH) HCH 2 C (OH) HCH 2 SO 2 CH = CH 2
Examples of the epoxy compound include Denacol EX521 (manufactured by Nagase Kasei Kogyo Co., Ltd.), and examples of the melamine compound include Sumitex Resin M-3 (manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd.).
Examples of the inorganic salt include Al 3 (SO 4 ) 2 .
[0025]
The above-mentioned coating of the polymer can be carried out by a conventional method, for example, spin coating, air knife coating, bar coating, blade coating, slide coating, curtain coating, spray method, vapor deposition method, casting method. It can be performed by a dipping method or the like.
[0026]
The coating thickness of the film is not particularly limited, but is preferably 1 angstrom or more and 5000 angstrom or less, and particularly preferably 10 angstrom or more and 3000 angstrom or less.
[0027]
The biosensor of the present invention is preferably a metal surface or metal film coated with a film. The metal constituting the metal surface or metal film is not particularly limited as long as it can cause surface plasmon resonance, for example, in the case of a surface plasmon resonance biosensor. Preferred examples include free electron metals such as gold, silver, copper, aluminum and platinum, with gold being particularly preferred. These metals can be used alone or in combination. In consideration of adhesion to the substrate, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.
[0028]
Although the thickness of the metal film is arbitrary, for example, when considering the use for a surface plasmon resonance biosensor, it is preferably 1 angstrom or more and 5000 angstrom or less, and particularly preferably 10 angstrom or more and 2000 angstrom or less. If it exceeds 5000 angstroms, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. When an intervening layer made of chromium or the like is provided, the thickness of the intervening layer is preferably 1 angstrom or more and 100 angstrom or less.
[0029]
The metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, electroless plating, or the like.
[0030]
The metal film is preferably disposed on the substrate. Here, “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. This also includes the case where it is arranged. As a substrate that can be used in the present invention, for example, when considering use for a surface plasmon resonance biosensor, generally, optical glass such as BK7, or synthetic resin, specifically, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate A material made of a material transparent to laser light such as a cycloolefin polymer can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.
[0031]
In the biosensor of the present invention comprising a substrate coated with a film having a degree of swelling in pure water at 25 ° C. of 1 to 5 with respect to the film thickness upon drying as described above, physiological activity is applied to the outermost surface of the substrate. It preferably has a functional group capable of immobilizing a substance. The “outermost surface of the substrate” here means “the side farthest from the substrate”, and more specifically, “the side farthest from the substrate in the film coated on the substrate”.
[0032]
Preferred functional groups include —OH, —SH, —COOH, —NR 1 R 2 (wherein R 1 and R 2 independently represent a hydrogen atom or a lower alkyl group), —CHO, —NR 3 NR 1 R 2 (wherein R 1 , R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom or a lower alkyl group), —NCO, —NCS, an epoxy group, or a vinyl group can be mentioned. Here, the number of carbon atoms in the lower alkyl group is not particularly limited, but is generally about C1 to C10, preferably C1 to C6.
[0033]
As a method for introducing these functional groups on the outermost surface, a polymer containing a precursor of those functional groups is coated on a metal surface or a metal film, and then the precursor is located on the outermost surface by chemical treatment. The method of producing | generating the functional group of is mentioned. For example, after coating polymethyl methacrylate, which is a polymer compound containing —COOCH 3 groups, on a metal film, when the surface is brought into contact with an aqueous NaOH solution (1N) at 40 ° C. for 16 hours, —COOH groups are formed on the outermost surface. To do.
[0034]
On the biosensor surface obtained as described above, the physiologically active substance can be immobilized on the metal surface or metal film by covalently bonding the physiologically active substance via the functional group.
[0035]
The physiologically active substance immobilized on the biosensor of the present invention is not particularly limited as long as it interacts with the measurement target. For example, immune proteins, enzymes, microorganisms, nucleic acids, low molecular organic compounds, non-immune proteins And immunoglobulin binding proteins, sugar binding proteins, sugar chains that recognize sugars, fatty acids or fatty acid esters, polypeptides or oligopeptides having ligand binding ability, and the like.
[0036]
Examples of immunity proteins include antibodies and haptens that use the measurement target as an antigen. As the antibody, various immunoglobulins, that is, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD can be used. Specifically, when the measurement target is human serum albumin, an anti-human serum albumin antibody can be used as the antibody. In addition, when using pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, cocaine, heroin, cracks, etc. as antigens, for example, anti-atrazine antibody, anti-kanamycin antibody, anti-methamphetamine antibody, or pathogenic E. coli Among them, antibodies against O antigens 26, 86, 55, 111, 157 and the like can be used.
[0037]
The enzyme is not particularly limited as long as it exhibits activity with respect to the measurement object or a substance metabolized from the measurement object, and various enzymes such as oxidoreductase, hydrolase, and isomerase. In addition, a desorbing enzyme, a synthesizing enzyme and the like can be used. Specifically, glucose oxidase can be used when the measurement object is glucose, and cholesterol oxidase can be used when the measurement object is cholesterol. In addition, when pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, cocaine, heroin, cracks, etc. are used as measurement objects, they exhibit specific reactions with substances metabolized from them, such as acetylcholinesterase. Enzymes such as catecholamine esterase, noradrenaline esterase, and dopamine esterase can be used.
[0038]
The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used.
As the nucleic acid, one that hybridizes complementarily with the nucleic acid to be measured can be used. As the nucleic acid, either DNA (including cDNA) or RNA can be used. The type of DNA is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA prepared by gene recombination technology, or chemically synthesized DNA.
Examples of the low molecular weight organic compound include any compound that can be synthesized by an ordinary organic chemical synthesis method.
[0039]
The non-immune protein is not particularly limited, and for example, avidin (streptavidin), biotin or a receptor can be used.
As the immunoglobulin-binding protein, for example, protein A or protein G, rheumatoid factor (RF) and the like can be used.
Examples of sugar-binding proteins include lectins.
Examples of the fatty acid or fatty acid ester include stearic acid, arachidic acid, behenic acid, ethyl stearate, ethyl arachidate, and ethyl behenate.
[0040]
When the physiologically active substance is a protein or nucleic acid such as an antibody or an enzyme, the immobilization can be performed by covalently bonding to a functional group on the metal surface using the amino group, thiol group or the like of the physiologically active substance. .
[0041]
The biosensor on which a physiologically active substance is immobilized as described above can be used for detection and / or measurement of a substance that interacts with the physiologically active substance.
[0042]
That is, according to the present invention, the biosensor of the present invention on which a physiologically active substance is immobilized is brought into contact with a test substance to thereby interact with the physiologically active substance immobilized on the biosensor. A method of detecting and / or measuring a substance to be provided is provided.
As the test substance, for example, a sample containing a substance that interacts with the above physiologically active substance can be used.
[0043]
In the present invention, it is preferable to detect and / or measure the interaction between the physiologically active substance immobilized on the biosensor surface and the test substance by a non-electrochemical method. Non-electrochemical methods include surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles.
[0044]
According to a preferred aspect of the present invention, the biosensor of the present invention can be used as a surface plasmon resonance biosensor characterized by including a metal film disposed on a transparent substrate, for example.
[0045]
The surface plasmon resonance biosensor is a biosensor used in the surface plasmon resonance biosensor, and includes a part that transmits and reflects light emitted from the sensor, and a part that fixes a physiologically active substance. And may be fixed to the main body of the sensor or may be removable.
[0046]
The phenomenon of surface plasmon resonance is due to the fact that the intensity of monochromatic light reflected from the boundary between an optically transparent substance such as glass and the metal thin film layer depends on the refractive index of the sample on the metal exit side. Yes, so the sample can be analyzed by measuring the intensity of the reflected monochromatic light.
[0047]
As a surface plasmon measuring apparatus for analyzing the characteristics of a substance to be measured by utilizing a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves, an apparatus using a system called a Kretschmann arrangement can be cited (for example, Japanese Patent Laid-Open No. 6-167443). See the official gazette). A surface plasmon measuring apparatus using the above system basically includes a dielectric block formed in a prism shape, for example, and a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a substance to be measured such as a sample liquid. A light source that generates a light beam; an optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the metal film; and It comprises light detecting means for detecting the surface plasmon resonance state, that is, the state of total reflection attenuation by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
[0048]
In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be incident on the interface by changing the incident angle, or a component incident on the light beam at various angles is included. As described above, a relatively thick light beam may be incident on the interface in a convergent light state or a divergent light state. In the former case, a light beam whose reflection angle changes according to the change in the incident angle of the incident light beam is detected by a small photodetector that moves in synchronization with the change in the reflection angle, or the direction in which the reflection angle changes Can be detected by an area sensor extending along the line. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.
[0049]
In the surface plasmon measuring apparatus having the above configuration, when a light beam is incident on a metal film at a specific incident angle that is greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the measured substance in contact with the metal film. The evanescent wave excites surface plasmons at the interface between the metal film and the substance to be measured. When the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established, both are in a resonance state and the energy of the light is transferred to the surface plasmon, so that the entire energy is transferred to the interface between the dielectric block and the metal film. The intensity of the reflected light decreases sharply. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means. The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.
[0050]
If the wave number of the surface plasmon is known from the incident angle at which this total reflection attenuation (ATR) occurs, that is, the total reflection attenuation angle (θSP), the dielectric constant of the substance to be measured can be obtained. In this type of surface plasmon measurement apparatus, as shown in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-326194, in order to measure the total reflection attenuation angle (θSP) with high accuracy and a large dynamic range, It is considered to use detection means. This light detection means is provided with a plurality of light receiving elements arranged in a predetermined direction, and arranged so that different light receiving elements receive light beam components totally reflected at various reflection angles at the interface. Is.
[0051]
In that case, there is provided differential means for differentiating the light detection signals output from the light receiving elements of the arrayed light detection means with respect to the arrangement direction of the light receiving elements, and based on the differential value output by the differential means. In many cases, the total reflection attenuation angle (θSP) is specified to obtain a characteristic related to the refractive index of the substance to be measured.
[0052]
Moreover, as a similar measuring device using total reflection attenuation (ATR), for example, “Spectroscopic Research” Vol. 47, No. 1, (1998), pages 21 to 23 and pages 26 to 27 are described. Devices are also known. This leakage mode measuring device is basically a dielectric block formed in a prism shape, for example, a clad layer formed on one surface of the dielectric block, and formed on the clad layer to be in contact with the sample liquid. Optical waveguide layer to be generated, a light source for generating a light beam, and the light beam to the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the cladding layer. The optical system includes an incident optical system and light detection means for detecting the excitation state of the waveguide mode, that is, the total reflection attenuation state by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
[0053]
In the leakage mode measuring apparatus having the above-described configuration, when a light beam is incident on the cladding layer through the dielectric block at an incident angle greater than the total reflection angle, the light waveguide layer transmits a specific wave number after passing through the cladding layer. Only light having a specific incident angle having a wave length propagates in the waveguide mode. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer, resulting in total reflection attenuation in which the intensity of light totally reflected at the interface is sharply reduced. Since the wave number of guided light depends on the refractive index of the substance to be measured on the optical waveguide layer, knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs, the refractive index of the substance to be measured and the measurement object related thereto The properties of the substance can be analyzed.
[0054]
In this leakage mode measuring apparatus, the above-mentioned array-shaped light detecting means can be used to detect the position of the dark line generated in the reflected light due to the total reflection attenuation, and the above-described differentiating means is applied in conjunction therewith. Often done.
[0055]
In addition, the surface plasmon measurement device and the leakage mode measurement device described above may be used for random screening to find a specific substance that binds to a desired sensing substance in the field of drug discovery research. In this case, the thin film layer A sensing substance is fixed on the sensing substance on the sensing substance (a metal film in the case of a surface plasmon measuring apparatus, a clad layer and an optical waveguide layer in the case of a leakage mode measuring apparatus), and various analytes are placed on the sensing substance. A sample solution dissolved in a solvent is added, and the total reflection attenuation angle (θSP) is measured every time a predetermined time elapses.
[0056]
If the analyte in the sample liquid binds to the sensing substance, the refractive index of the sensing substance changes with time due to this binding. Therefore, by measuring the total reflection attenuation angle (θSP) every predetermined time and measuring whether or not the total reflection attenuation angle (θSP) has changed, the binding state of the analyte and the sensing substance is determined. It is possible to determine whether or not the analyte is a specific substance that binds to the sensing substance based on the result. Examples of the combination of the specific substance and the sensing substance include an antigen and an antibody, or an antibody and an antibody. Specifically, rabbit anti-human IgG antibody can be immobilized on the surface of the thin film layer as a sensing substance, and human IgG antibody can be used as the specific substance.
[0057]
Note that, in order to measure the binding state between the subject and the sensing substance, it is not always necessary to detect the angle of the total reflection attenuation angle (θSP) itself. For example, a sample solution can be added to the sensing substance, and the amount of change in the total reflection attenuation angle (θSP) thereafter can be measured, and the binding state can be measured based on the magnitude of the angle change. If the above-described arrayed light detecting means and differentiating means are applied to a measuring device using total reflection attenuation, the change amount of the differential value reflects the angle change amount of the total reflection attenuation angle (θSP). Therefore, the binding state between the sensing substance and the analyte can be measured based on the amount of change in the differential value (see Japanese Patent Application No. 2000-398309 by the present applicant). In such a measurement method and apparatus using total reflection attenuation, a sample liquid consisting of a solvent and an analyte is placed on a cup-shaped or petri-shaped measuring chip in which a sensing substance is fixed on a thin film layer formed in advance on the bottom surface. The amount of change in angle of the total reflection attenuation angle (θSP) described above is measured.
[0058]
Furthermore, a measuring apparatus using total reflection attenuation capable of measuring a large number of samples in a short time by sequentially measuring a plurality of measuring chips mounted on a turntable or the like is disclosed in JP-A-2001-2001. No. 330560.
[0059]
When the biosensor of the present invention is used for surface plasmon resonance analysis, it can be applied as a part of various surface plasmon measurement devices as described above.
The following examples further illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
[0060]
【Example】
The following experiment was conducted using the apparatus shown in FIG. 22 of Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-330560 (hereinafter referred to as the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention) and the dielectric block shown in FIG. (Referred to as a dielectric block of the invention).
[0061]
Example 1: Production of measurement chip (1) Comparative example: Production of measurement chip coated with dextran A dielectric block of the present invention in which 50 nm of gold was deposited as a metal film was applied to a Model-208 UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC). .) For 30 minutes and then 11 in ethanol / water (80/20). A 5.0 mM solution of hydroxy-1-undecanethiol was added so as to contact the metal film, and surface treatment was performed at 25 ° C. for 18 hours. Thereafter, washing was performed 5 times with ethanol, once with an ethanol / water mixed solvent, and 5 times with water.
[0062]
Next, the surface coated with 11-hydroxy-1-undecanethiol was brought into contact with a 10 wt% epichlorohydrin solution (solvent: 1: 1 mixed solution of 0.4 M sodium hydroxide and diethylene glycol dimethyl ether), and 25 ° C. The reaction was allowed to proceed for 4 hours in a shaking incubator. The surface was washed twice with ethanol and five times with water.
[0063]
Next, 4.5 ml of 1 M sodium hydroxide was added to 40.5 ml of a 25 wt% aqueous dextran (T500, Pharmacia) solution and the solution was contacted on the epichlorohydrin treated surface. It was then incubated for 20 hours at 25 ° C. in a shaking incubator. The surface was washed 10 times with 50 ° C. water.
[0064]
Subsequently, a mixture of 3.5 g of bromoacetic acid dissolved in 27 g of 2M sodium hydroxide solution was brought into contact with the dextran-treated surface and incubated for 16 hours in a shaking incubator at 28 ° C. The surface was washed with water and then the above procedure was repeated once. This sample is called a dextran surface chip.
[0065]
(2) Preparation of polymethylmethacrylate (PMMA) film The dielectric block of the present invention on which gold of 50 nm was deposited as a metal film was treated with Model-208UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes, and then 1 mg / mg 5 ml of polymethyl methacrylate in methyl ethyl ketone was added so as to contact the metal film, and allowed to stand at 25 ° C. for 15 minutes.
[0066]
(3) Preparation of measurement chip by treating polymethylmethacrylate film with NaOH To the sample obtained in (2) above, 1N NaOH aqueous solution was added so as to contact the PMMA film, and left at 60 ° C. for 5 hours. And washed 3 times. This sample is called a PMMA / NaOH treatment chip.
[0067]
(4) Preparation of polystyrene (PS) film A dielectric block of the present invention, in which 50 nm of gold was deposited as a metal film, was treated with Model-208UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes, and then 1 mg / ml. 5 μl of a polystyrene methylethylketone solution was added so as to come into contact with the metal film, and allowed to stand at 5 ° C. for 15 minutes.
[0068]
(5) Preparation of measurement chip in which polystyrene film was treated with ozone The sample obtained in (2) was treated with Model-208UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes. This sample is called a PS / ozone treatment chip.
[0069]
(6) Preparation of Gelatin (Gel) Film A dielectric block of the present invention on which gold of 50 nm was deposited as a metal film was treated with Model-208UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes, and then 0.1 weight 5 μl of an aqueous solution of a mixture of% gelatin and the weight% compound A or aluminum sulfate listed in Table 1 was added so as to contact the metal film, and allowed to stand at 25 ° C. for 15 minutes. This sample is called a gelatin film chip.
[0070]
(7) Preparation of Polyvinyl Alcohol (PVA) Film A dielectric block of the present invention on which gold of 50 nm was deposited as a metal film was treated with Model-208UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes, and then 0.1. 5 μl of an aqueous solution of a mixture of wt% polyvinyl alcohol (MP103: manufactured by Kuraray Co., Ltd.) and wt% Sumtex Resin M-3 (80% aqueous solution: manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd.) described in Table 1 was used as a metal film. The solution was added so as to come into contact with the solution and allowed to stand at 25 ° C for 15 minutes. This sample is called a PVA membrane chip.
[0071]
Compound A: CH 2 = CHSO 2 -CH 2 -CONH-CH 2 CH 2 -NHCO-CH 2 SO 2 -CH = CH 2
[0072]
Example 2: Performance evaluation of measurement chip:
(1) Evaluation of Baseline Stability During Measurement Particularly when detecting the binding of a low molecular weight analyte compound, if the baseline during measurement is unstable, it is extremely difficult to detect the binding.
[0073]
The degree of swelling of each chip membrane with respect to water was measured in the AFM mode of SII SPA400 type SPM in a dry state and a state swollen with pure water at 25 ° C. in an environment at 25 ° C. Table 1 shows the ratio of the degree of swelling.
[0074]
Baseline stability was evaluated by the following method. First, the measuring chip was placed in the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention, and water was added. After leaving for 30 minutes, water was extracted and HBS-N buffer (HEPES 0.01 mol / l (pH 7.4); NaCl 0.15 mol / l) was added. The mixture was allowed to stand for 30 minutes, and the amount of change in resonance signal (RU value) during that period was recorded. The amount of change in resonance signal (RU value) between 5 minutes and 15 minutes after substitution (Δ5-15) and the amount of change in resonance signal between 20 minutes and 30 minutes after substitution (Δ20-30) were measured. The amount of change in the resonance signal (RU value) is preferably 10 RU or less, and more preferably 5 RU or less. The difference between Δ5-15 and Δ20-30 is preferably 5 RU or less.
[0075]
(4) Results Table 1 shows the measurement results of the baseline stability at the time of measurement.
[0076]
[Table 1]
[0077]
From the results shown in Table 1, by using the biosensor of the present invention comprising a substrate coated with a film having a degree of swelling in pure water at 25 ° C. of 1 to 5 with respect to the film thickness at the time of drying, It can be seen that the baseline can be stabilized.
[0078]
【The invention's effect】
The present invention makes it possible to provide a detection surface for a biosensor with improved baseline stability during measurement.
