JP2004315394A

JP2004315394A - Monoclonal antibody against reston ebola virus and method for detecting reston ebola virus using the same

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Publication number: JP2004315394A
Application number: JP2003109285A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Morikawa; 茂森川; Ichiro Kurane; 一郎倉根; Masayuki Saijo; 政幸西條; Akihiko Maeda; 秋彦前田; Masahiro Niikura; トラッパーズコーヴトレイル＃３Ｂアメリカ合衆国ミシガン州４８９１０ランシング３０５５; Tetsuo Ikegami; 徹郎池上
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Infectious Diseases
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Infectious Diseases
Priority date: 2003-04-14
Filing date: 2003-04-14
Publication date: 2004-11-11

Abstract

【課題】レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体、及び該抗体を用いてレストンエボラウイルスを鑑別診断する方法を提供することを目的する。
【解決手段】レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体、就中、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体、更には、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で特定の領域の配列ＤＰＤＩＧＱＳＫの４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体を提供する。また本発明は、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を用いた抗原補足ＥＬＩＳＡ法によりレストンエボラウイルスを鑑別診断する方法を提供する。
【選択図】なしAn object of the present invention is to provide a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus, and a method for differentially diagnosing Reston Ebola virus using the antibody.
A monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus, particularly a monoclonal antibody recognizing an epitope comprising an amino acid sequence region specific to the virus among nucleoproteins possessed by Reston Ebola virus, Provided is a monoclonal antibody that recognizes an epitope consisting of a region of four or more amino acid residues of the sequence DPDIGQSK in a specific region in the amino acid sequence among nucleoproteins of a virus. The present invention also provides a method for differentially diagnosing Reston Ebola virus by an antigen supplement ELISA using a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus.
[Selection diagram] None

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レストンエボラウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を用いたレストンエボラウイルスの検出方法、該モノクローナル抗体を作製する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エボラウイルスによる感染症は、出血を伴う重篤なウイルス感染症であり、最も危険な感染症の一つである。
エボラウイルスには４つの種、ザイールエボラウイルス（ＥＢＯ−Ｚ）、スーダンエボラウイルス（ＥＢＯ−Ｓ）、コートジボアールエボラウイルス（ＥＢＯ−ＣＩ）、レストンエボラウイルス（ＥＢＯ−Ｒ）がある。エボラウイルスは一本鎖の（−）鎖ＲＮＡゲノムを有し、そのウイルス遺伝子は、核蛋白（ＮＰ）、Ｐ蛋白質（ＶＰ３５）、マトリックス蛋白質（ＶＰ４０）、糖蛋白質（ＧＰ）、ウイルスｍＲＮＡの合成に作用する核蛋白（ＶＰ３０）、膜に結合する蛋白質（ＶＰ２４）、そしてＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）をコードする。
レストンエボラウイルス（ＥＢＯ−Ｒ）はフィリピンに固有のウイルスであると考えられているが、このレストンエボラウイルスに感染したカニクイザルが米国及びイタリアに輸出されたことが報告されている。レストンエボラウイルスはヒト以外の霊長類に致死的な疾患を引き起こすが、ヒトには感染症状を引き起こさない。
【０００３】
エボラウイルスの自然宿主は特定されていないが、患者との接触によりヒトは感染する。また、エボラウイルスは輸入サルを介して国内に持ち込まれる可能性があり、全輸入サルに対する検疫も行われている。エボラ出血熱の早期の実験室診断がエボラウイルス感染の拡大を防ぐために重要であるが、前述したようにレストンエボラウイルスはヒトには感染症状を引き起こさないため、エボラウイルスの種の迅速な区別が必要である。特に、検疫などでヒト以外の霊長類由来のサンプルを試験する場合には、レストンエボラウイルスであるか否かの鑑別が重要となる。
【０００４】
エボラウイルス感染の実験室診断としては、ウイルス分離、透過型電子顕微鏡による観察、免疫組織化学的手法、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、蛍光５´ヌクレアーゼアッセイ（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ５´ ｎｕｃｌｅａｓｅａｓｓａｙ）、そして抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法が用いられている。エボラウイルス感染においては血中のウイルス量が高くなるため、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法によるエボラウイルス抗原の検出が十分可能である。一方、ウイルス分離には高度安全実験施設を使用することが必要であり、逆転写ＰＣＲ法では増幅された断片の配列確認が必要である。このため、実験室診断としては抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法が適している。
本発明者らは以前に、ザイールエボラウイルス核蛋白に対するモノクローナル抗体３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法を報告した。しかしながら、このモノクローナル抗体３−３Ｄは、ザイールエボラウイルスの核蛋白のみならず、スーダンエボラウイルス核蛋白とレストンエボラウイルス核蛋白にも反応する特異性のない抗体であった（特許文献１及び非特許文献１参照）。
従って、検疫などにおいてエボラウイルスの種を迅速に鑑別するために、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を開発する必要があった。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１４−３０６１６４号公報
【非特許文献１】
新倉その他著、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＬＩＮＩＣＡＬＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ）、２００１年、第３９巻、第９号、ｐ．３２６７−３２７１
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を提供することを目的とする。本発明はまた、該モノクローナル抗体を用いてレストンエボラウイルスを鑑別診断する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体、就中、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体、更には、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（_６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ_６４３）の４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体を見出し、本発明を完成するに至った。
また、本発明者らは、本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含む断片を用いてレストンエボラウイルスを検出する方法を開発するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明者らは、ヒスチジンタグがＮ末端に付加されたレストンエボラウイルス核蛋白（Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ）をマウスに免疫し、該マウスの脾臓細胞を用いたハイブリドーマによりモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製したところ、レストンエボラウイルスに特異的な二つのモノクローナル抗体、Ｒｅｓ２−６Ｃ８とＲｅｓ２−１Ｄ８が得られた。間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）を行うことにより、モノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８のエボラウイルスの種に対する特異性を試験したところ、これらの二つのモノクローナル抗体はレストンエボラウイルス核蛋白に反応したが、ザイールエボラウイルスの核蛋白やスーダンエボラウイルスの核蛋白には反応しないものであり（図１）、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体であった。
【０００９】
次に、レストンエボラウイルスの短縮型核蛋白に対するＩｇＧ−ＥＬＩＳＡを行うことにより、Ｒｅｓ２−６Ｃ８又はＲｅｓ２−１Ｄ８が認識する最小エピトープを決定した。この結果、Ｒｅｓ２−６Ｃ８により認識されるエピトープはレストンエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３６番目から６３９番目までの領域（４アミノ酸残基：_６３６ＤＰＤＩ_６３９）であり、Ｒｅｓ２−１Ｄ８が認識するエピトープは６３６番目から６４３番目までの領域（８アミノ酸残基：_６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ_６４３）であった（図２）。これにより以下の事実が明らかとなった。すなわち、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体を作製すれば、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を作製できる。また、８アミノ酸残基ＤＰＤＩＧＱＳＫのうち４アミノ酸残基以上を含むエピトープが、レストンエボラウイルスに特異的な抗体の選別又は精製に利用できる。
【００１０】
本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法の感度を試験したところ、感度が高くかつレストンエボラウイルスを特異的に検出できる方法であることが明らかとなった（図３）。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法と、エボラウイルスサブタイプの交叉生モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法とを併用することによって、迅速にレストンエボラウイルス感染症をザイールエボラウイルス感染症及びスーダンエボラウイルス感染症から区別して鑑別診断することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体としては、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体が好ましく、より好ましくはレストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（_６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ_６４３）の４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体が好ましい。
本発明のモノクローナル抗体は、例えばレストンエボラウイルスの核蛋白に対するモノクローナル抗体を作製することにより得ることができる。すなわち、レストンエボラウイルスの核蛋白を動物に免疫し、該動物の脾臓細胞又はリンパ球を用いてハイブリドーマを作製し、次に、得られたハイブリドーマの中からレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を産生するものを選抜する。そのスクリーニングにあたっては、例えばレストンエボラウイルスの核蛋白を用いることができ、より好ましくはレストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列からなるエピトープを用いることができ、さらに好ましくは、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（_６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ_６４３）の４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを用いることができる。
この選抜されたハイブリドーマの産生する上清を精製することにより、本発明のモノクローナル抗体を多量に作製することができる。
【００１２】
以下、本発明のモノクローナル抗体を作製する方法をより詳細に説明する。
まず、レストンエボラウイルスの核蛋白を動物に免疫し、免疫感化させて抗原に対する抗体を産生する細胞を生じさせる。ここで用いる哺乳動物としてはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリなどが挙げられるが、取り扱いが簡便なマウスにより行うことが可能である。抗原として用いるレストンエボラウイルスの核蛋白（ＮＰ）としては、天然のレストンエボラウイルス核蛋白でも、組み換え体の核蛋白でもよいが、組み換え体の核蛋白を用いれば、感染の心配が無く好ましい。組み換え体の核蛋白としては、レストンエボラウイルスの有する核蛋白の全長タンパク質でもよく、また、レストンエボラウイルスの有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列を含む部分長のタンパク質でも良い。
【００１３】
レストンエボラウイルスの組み換え核蛋白を作製する方法としては、例えば、遺伝子工学的手法を用いて、レストンエボラウイルスの核蛋白の全長あるいは部分長をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得し、次に該遺伝子を適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組み換え体ベクターを構築し、それを宿主細胞に導入することにより遺伝子を発現させて目的のタンパク質を得る方法が挙げられる。
組み換え核蛋白の作製に用いる宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればよいが、取り扱いが簡単な昆虫細胞又は大腸菌を用いることが可能である。これらの細胞を用いた組み換え蛋白の作製は、公知の方法により行うことができる。例えば、バキュロウイルスを用いた昆虫細胞での蛋白質発現系により目的の蛋白を得ることができる。
【００１４】
レストンエボラウイルスの核蛋白をコードする遺伝子（ＤＮＡ）としては、次の方法により得ることができる。例えば、レストンエボラウイルスに感染したカニクイザルの肝臓組織からＲＮＡを抽出してｃＤＡＮライブラリーを作製し、レストンエボラウイルス核蛋白に特異的な配列をもつプライマーをを用いたＰＣＲによるスクリーニングで目的のＤＮＡを得ることができる。２つ目の例として、ＧｅｎｂａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＡＢ０５０９３６に記載の配列を基に合成遺伝子を作製する方法が挙げられる。すなわち、ＧｅｎｂａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＡＢ０５０９３６に記載のアミノ酸配列を基に塩基配列を設計し、この遺伝子をいくつかの約４００ｂｐのセグメントに分け、セグメントの末端には制限酵素部位を設ける。各セグメントを３対ほどの長いプライマーでカバーできるようにプライマーを設計する。各プライマーは１０〜１２ｂｐ程度のオーバーラップを持つように設定する。これらのプライマーを用いた段階的ＰＣＲを行って各セグメントを作製する。各セグメントを制限酵素部位で連結することにより目的のＤＮＡを得ることができる。
組み換え蛋白を作製するにあたっては、蛋白の回収のためにアフィニティータグを付することができる。アフィニティータグとしてはＧＳＴタグ及びヒスチジンタグが挙げられる。
その他、レストンエボラウイルスの組み換え核蛋白を作製する方法としては、例えば、［池上その他著、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹａｎｄＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、２００２年、第４６巻、第９号、ｐ．６３３−６３８］に記載の方法に従って行うことができる。
【００１５】
レストンエボラウイルスの核蛋白を動物に免疫する方法、及び該動物の脾臓細胞又はリンパ球からハイブリドーマを作製する方法は、公知のモノクローナル抗体作製法に従って行うことができる。
例えば、動物に免疫する際に、抗原性の高いキャリアタンパク質と抗原を結合させて投与したり、適当なアジュバントと共に抗原を投与することにより抗原性を高めることができる。キャリアタンパク質としてＩＭＪＥＣＴ−ＡＬＵＭ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いることができ、アジュバントとしてはフロインドの完全アジュバンド（Ｂｅｃｔｏｎ社製）を用いることができる。抗原の投与は、１回目の投与の後、５日〜２週間の間隔で３〜１０回行うのが好ましい。
免疫した動物の脾臓細胞又はリンパ球からハイブリドーマを作製する方法としては、脾臓細胞又はリンパ球を無限に増殖可能なミエローマ細胞と融合させることにより可能である。すなわち、脾臓細胞又はリンパ球、ミエローマ細胞に、ポリエチレングリコールなどの細胞凝集性媒体を加えて培地中で懸濁することにより、細胞を融合させる。目的の融合細胞のみを選択的に得るためにはＨＡＴ選択培地を用いることができる。核酸合成系のｄｅｎｏｖｏ回路しかもたないミエローマ細胞を用いることにより、ｄｅｎｏｖｏ回路を阻害するＨＡＴ選択培地ではハイブリドーマのみが分別される。
【００１６】
ハイブリドーマの中から、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法としては、次の方法が挙げられる。例えば、ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法により、ハイブリドーマ上清のレストンエボラウイルス核蛋白に対する反応性を検定することによってハイブリドーマを選抜する方法が挙げられる。ここで用いるレストンエボラウイルス核蛋白としては、全長のレストンエボラウイルス核蛋白でもよいが、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなる部分長核蛋白を用いれば、レストンエボラウイルスの核蛋白に特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを高い確度でスクリーニングできる。好ましくは、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（_６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ_６４３）の４アミノ酸残基以上の領域を含む核蛋白を用いてＩｇＧ−ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする方法がよい。
このようなＩｇＧ−ＥＬＩＳＡに用いるレストンエボラウイルス核蛋白は、上記の組み換え核蛋白を作製する方法に従って得ることができる。若しくは、後記実施例４に記載の方法に従って行うこともできる。
【００１７】
ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法は、公知の方法に従って行うなうことができる。例えば、抗原とするレストンエボラウイルス組み換え核蛋白をプレートにコートし、ハイブリドーマ上清を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質等で標識した第一抗体の動物種に対するイムノグロブリン抗体を反応させた後に、標識物質に応じた反応を行い、抗原に特異的に反応するハイブリドーマ上清を特定する。このようにして本発明のハイブリドーマを得ることができ、本発明のモノクローナル抗体は、該ハイブリドーマの培養上清を精製することにより得ることができる。
【００１８】
上記の方法により得られたモノクローナル抗体については、例えば、後記実施例５に記載の抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法により、レストンエボラウイルス核蛋白への反応性を試験してさらに選抜することもできる。
また、後記実施例２に記載の方法に従って間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）を行うことにより、得られたモノクローナル抗体のエボラウイルスの種に対する特異性、すなわちレストンエボラウイルスの核蛋白、ザイールエボラウイルスの核蛋白、スーダンエボラウイルスの核蛋白のそれぞれに対する反応性を確認することができる。
本発明のモノクローナル抗体の認識するエピトープのマッピングは、例えば後記実施例４に記載の方法に従って行うことができる。
【００１９】
上記の記載により、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を作製する方法は明らかである。
すなわち、本発明は、次の工程（イ）〜（ハ）を含むことを特徴とするレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体の作製方法を提供する：
（イ）レストンエボラウイルスの核蛋白質を免疫した動物より脾臓細胞又はリンパ球をとりだし、ミエローマ細胞と融合さてせハイブリドーマを作製する
（ロ）レストンエボラウイルスの核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなるエピトープを用いて、（イ）のハイブリドーマのうちレストンエボラウイルスに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを選別する
（ハ）選別されたハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を精製する。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体を作製する方法のさらに具体的な方法としては、例えば後記実施例１に記載された方法に従って行うことができる。
また、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９２９１及び受託番号ＦＥＲＭＰ−１９２９２として、平成１５年４月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番１号）に寄託されている。
受託番号ＦＥＲＭＰ−１９２９１にて寄託されているハイブリドーマは、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６３９番目までの領域（_６３６ＤＰＤＩ_６３９）からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８を産生するハイブリドーマである。
受託番号ＦＥＲＭＰ−１９２９２にて寄託されているハイブリドーマは、レストンエボラウイルスの有する核蛋白のうち、アミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（_６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ_６４３）からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体Ｒｅｓ２−１Ｄ８を産生するハイブリドーマである。
【００２１】
本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体の抗原結合部位を含む断片は、例えば、レストンエボラウイルスに特異的なモノクロール抗体をパパイン又はペプシンなどの蛋白分解酵素で処理することにより得ることができる。
例えば、モノクローナル抗体のアイソタイプがＩｇＧであったとき、パパインでモノクローナル抗体を切断すると、抗原結合部位を含むＦａｂフラグメントを二つと、抗原結合部位を含まないＦｃフラグメント一つとに分解される。また、ペプシンでＩｇＧ型の抗体を切断した場合には、抗原結合部位を含むＦａｂフラグメントが２つ結合した大きな断片と、それ以外の断片とに分解される。
【００２２】
本発明は、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（_６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ_６４３）の４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを提供する。本発明のエピトープは、上記のモノクローナル抗体の作製に用いることができ、また、レストンエボラウイルスに特異性のあるポリクローナル抗体を作製する場合に用いることができる。
例えば、抗原として精製したレストンエボラウイルスの核蛋白を、動物（ウサギ、ニワトリ、ラット、マウスなど）に繰り返し注射し、免疫反応によりレストンエボラウイルス核蛋白に対する抗体を産生させる。次に、血液を採取して、これをレストンエボラウイルス核蛋白を固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、レストンエボラウイルス核蛋白に対するポリクローナル抗体を精製する。この精製されたポリクローナル抗体に対して、さらに、本発明のエピトープを固定化したカラムによりアフィニティークロマトグラフィーで精製することにより、レストンエボラウイルスに対して特異性を有するポリクローナル抗体を作製することができる。
このように作製されたレストンエボラウイルスに特異性のあるポリクローナル抗体は、本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体に代用することができる。例えば、レストンエボラウイルスに対して特異性のあるポリクローナル抗体を使用して、レストンエボラウイルスを検出することができる。
【００２３】
本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を用いてレストンエボラウイルスを検出する方法としては、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法（ＩＦＡ法など）、放射線物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法など）、ウエスタンブロッティング法、免役沈降法等を挙げることができる。
これらの方法は、本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を使用し、公知の方法に従って行うことができる。
【００２４】
本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、例えば次のような方法により行うことができる。簡潔にその方法を述べると、まず、精製した本発明のモノクローナル抗体をマイクロタイタープレートのウェルに１晩ほど吸着させ、各穴をバッファーでブロッキングする。次に、バッファーで洗浄後、サンプルをウェルにロードして１時間ほどおき、本発明のモノクローナル抗体とサンプル中のレストンエボラウイルス核蛋白を反応させる。各穴をバッファーで洗浄し、エボラウイルス核蛋白に対するポリクローナル抗体を加えて１時間ほどおき、モノクローナル抗体に捕捉されたレストンエボラウイルス核蛋白とポリクローナル抗体とを反応させる。バッファーで洗浄後、酵素で標識された抗ＩｇＧ抗体を加えて、抗原抗体複合体に抗ＩｇＧ抗体を反応させる。最後に、酵素の基質を加えて酵素反応を測定することにより、レストンエボラウイルス核蛋白を検出する。
この方法で用いるレストンエボラウイルス核蛋白に対するポリクローナル抗体は、公知の方法に従って調製できる。また、抗ＩｇＧ抗体を標識する酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（西洋わさび過酸化酵素）や、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。ホースラディッシュペルオキシダーゼの発色試薬としては２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（略名ＡＢＴＳ）や、ジアミノベンジジン（略名ＤＡＢ）を用いることができる。また、標識酵素としてアルカリフォスファターゼを用いるときには、Ｘ−リン酸（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）を基質とし、発色試薬ニトロブルーテトラゾリウムを用いることができる。
また、本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、例えば、後記実施例５に記載の方法に従って行うことができる。ここで使用されている抗ＧＳＴ−ＥＢＯ−Ｒ−ΔＮＰウサギ血清は、後記実施例３に記載の方法に従って調整することができる。
本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、後記実施例５及び図３に示されるように、レストンエボラウイルスの核蛋白を抗原希釈比１：６４０００〜１：１２８０００まで検出できる非常に感度の高い方法である。また、後記実施例５及び図３に示されるように、ザイールエボラウイルスの核蛋白を全く検出せず、レストンエボラウイルスの核蛋白のみを特異的に検出できる極めて優れた方法である。
【００２５】
レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法と、エボラウイルスの各種サブタイプの核蛋白に交叉性のあるモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法と組み合わせて測定を行えば、より高い精度でレストンエボラウイルスの鑑別診断が可能である。この方法も例えば後記実施例５に記載の方法に従って行うことができる。ここで使用するエボラウイルスの各種サブタイプの核蛋白に交叉生のあるモノクローナル抗体（３−３Ｄ）は、前記特許文献１及び非特許文献１に記載の方法に従って作製することができる。
【００２６】
本発明のレストンエボラウイルスを検出するキットは、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含む断片、及び抗原抗体反応を検出する試薬からなるものである。ここで言うモノクローナル抗体またはその断片としては、プレートに固定化された抗体や、酵素、蛍光色素などで標識された抗体であってもよい。また、抗原抗体反応を検出する試薬としては、レストンエボラウイルスを特異的に認識する抗体を一次抗体として使用した場合に抗原抗体結合反応により形成された複合体を検出するための二次抗体や、抗体の標識物質として酵素を使用する場合に酵素活性を測定するための基質、その反応停止剤などが挙げられる。その他、各種溶解剤、バッファー、洗浄剤など、免疫学的測定試薬のキットに通常使用されているものが挙げられる。
【００２７】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１：モノクローナル抗体の作製
（１）エボラウイルスの組み換え核蛋白（Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ及びＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰ）の作製
レストンエボラウイルスの組み換え核蛋白（Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ）及びザイールエボラウイルスの組み換え核蛋白（Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰ）を作製した。Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰを発現する組み換えバキュロウイルス（Ａｃ−Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ）及びＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰを発現する組み換えバキュロウイルス（Ａｃ−Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰ）を発明者らが先に報告した方法（池上その他著、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹａｎｄＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、２００２年、第４６巻、第９号、ｐ．６３３−６３８）により作製した。Ａｃ−Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ及びＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰを感染させたＴｎ５細胞を２６℃で３日間培養した後、ＰＢＳで２回洗浄した。そして、１％のＮＰ−４０を含むＰＢＳで１５分インキュベートした。一分間超音波処理をし、細胞溶解物を試験に用いた。
【００２９】
（２）マウスへの免疫
フロインドの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃｏ．，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ）とともにＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰをＢａｌｂ／ｃマウスに免疫した。そして、ＩＭＪＥＣＴ−ＡＬＵＭ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と共にＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰをマウスの皮下に抗原接種することを２週間の間隔で３回行った。
（３）ハイブリドーマの作製
最後の免疫処置から３日後に脾臓を取り出し、その脾臓細胞をポリエチレングリコール４０００（カタログＮｏ．４０３０−０３５、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いてＰ３／Ａｇ５６８と融合させた。１０％ウシ胎児血清と抗生物質（ストレプトマイシンとペニシリン；ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で、細胞培養を行った。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）添加剤（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を培地中に加え、使用説明書に従ってハイブリドーマの選抜を行った。培地の組成をＨＡＴからＲＰＭＩ１６４０へ換えたときには、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）添加剤（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を培地に加えた。
【００３０】
（４）ハイブリドーマのスクリーニング
Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰを抗原とする免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ＥＬＩＳＡ法（非特許文献１参照）により、ハイブリドーマの上清のスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡ法で陽性であったものとして大まかにスクリーニングされたハイブリドーマが得られ、これを限界希釈にてクローン化し株化した。３２種の株化されたハイブリドーマが得られ、これらの産生するモノクローナル抗体のレストンエボラウイルス核蛋白に対する反応性を、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法に従って検定した。この結果により、二つのモノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８が選ばれ、その後の試験に用いられた。ＭＡｂＴｒａｐＧＩＩａｎｔｉｂｏｄｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ，Ｕ．Ｋ．）を用い、使用説明書に従って培養上清からモノクローナル抗体を精製した。モノクローナル抗体のアイソタイプは、ＭｏｕｓｅＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＩｓｏｔｙｐｉｎｇＫｉｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて決定した。Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８のアイソタイプはそれぞれＩｇＧ２ｂとＩｇＧ１であった。
【００３１】
実施例２：間接蛍光抗体法（Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ：ＩＦＡ）による本発明のモノクローナル抗体の抗原特異性の検定
レストンエボラウイルス又はザイールエボラウイルスの全ての核蛋白を発現するＨｅＬａ細胞を用いた間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）を、発明者らが先に報告した方法（池上その他著、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹａｎｄＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、２００２年、第４６巻、第９号、ｐ．６３３−６３８）により行った。ザイールエボラウイルスに感染したＶｅｒｏＥ６細胞をガンマ線照射したものを塗布したＩＦＡスライドは、米疾患管理・予防センター（ｔｈｅＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）の好意により提供された。それぞれのモノクローナル抗体を１００ｎｇ／μｌの濃度で２０μｌスライド上のウェルにスポットし、湿潤下３７℃で１時間インキュベートした。
スライドをＰＢＳで洗浄したのち、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）血清（カタログＮｏ．６２−６５１１、ＺｙｍｙｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．，ＣＡ）と１：１００の比率で混ぜ、反応させた。スライドをＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で染色パターンを観察した。
その結果を図１に示す。レストンエボラウイルスの組み換え核蛋白を発現するＨｅＬａ細胞（Ａ〜Ｃ）、ザイールエボラウイルスの組み換え核蛋白を発現するＨｅＬａ細胞（Ｄ〜Ｆ）、スーダンエボラウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞（Ｇ〜Ｉ）に対するモノクローナル抗体の反応性、すなわちＲｅｓ２−６Ｃ８の反応性（Ａ，Ｄ，Ｇ）、同じくＲｅｓ２−１Ｄ８反応性（Ｂ，Ｅ，Ｈ）、そして３−３Ｄの反応性（Ｃ，Ｆ，Ｉ）を間接蛍光抗体法により測定した結果を示す。二つのモノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８はレストンエボラウイルス核蛋白に反応したが（図１Ａ，Ｂ）、ザイールエボラウイルスの核蛋白やスーダンエボラウイルスの核蛋白には反応しなかった（図１Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｈ）。３−３Ｄは３種のエボラウイルスの核蛋白全てに反応した。
【００３２】
実施例３：ポリクローナル抗体の調製
文献記載の方法に従って次のウサギ抗血清を調製した。すなわち、レストンエボラウイルス核蛋白のＣ末端側半分（アミノ酸配列で３６０番目から７３９番目まで）にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを付加したもの（ＧＳＴ−ＥＢＯ−Ｒ−ΔＮＰ）に対するウサギ抗血清（池上その他著、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹａｎｄＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、２００２年、第４６巻、第９号、ｐ．６３３−６３８参照）、及びＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰに対するウサギ抗血清（西條その他著、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２００１年、第３９巻、第２号、ｐ．７７６−７７８参照）を作製した。簡潔に作製方法を述べると、まず、ウサギの皮下にＧＳＴ−ＥＢＯ−Ｒ−ΔＮＰ又はＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰをＩＭＪＥＣＴ−ＡＬＵＭ（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に４回免疫し、最後の免疫処理から７日後の血清を採取した。
【００３３】
実施例４：モノクローナル抗体が認識するエピトープのマッピング
（１）レストンエボラウイルスの短縮型核蛋白の作製
Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８により認識されるエピトープを決定するするために、レストンエボラウイルスの短縮型組み換え核蛋白のセットを用意した。次の表１にこれらのペプチドを構築するために用いたプライマーを示す。
【００３４】
【表１】

【００３５】
レストンエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３１番目から７３９番目に相当する短縮型核蛋白は次のように作製した。プライマーＲＥＳ−Ｎ８Ｆ及びＲＥＳ−Ｎ８Ｒ（非特許文献１参照）を用いたＰＣＲを行い、レストンエボラウイルスのｃＤＮＡの対応する領域を増幅した。ＰＣＲ断片をｐＧＥＸ−２Ｔベクター（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，ｌｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ，ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ）にサブクローニングし、ｐＧＥＸ−ΔＮＰ６３１−７３９を構築した。この構築ベクターの挿入配列が正しいかどうかを確認した。ＧＳＴタグの付加されたレストンエボラウイルスの短縮型核蛋白を大腸菌（ＢＬ−２１）で発現させ、グルタチオンセファロース４Ｂカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。精製は使用説明書に従って行った（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）。フォワードプライマーＲ６３５ｆ，Ｒ６３６ｆ，Ｒ６３７ｆ及びＲ６３８ｆ、そしてリバースプライマーＲＥＳ−Ｎ８Ｒを用いてＰＣＲを行った。レストンエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３５番目から７３９番目、６３６番目から７３９番目、６３７番目から７３９番目、６３８番目から７３９番目に対応する短縮型核蛋白をそれぞれ発現させ、それを精製した。レストンエボラウイルス核蛋白の６３１番目から６３８番目まで、６３１番目から６３９番目まで、６３１番目から６４０番目まで、６３１番目から６４１番目まで、６３１番目から６４２番目まで、６３１番目から６４３番目までに対応する長さの各短縮型核蛋白を発現するベクターは、部位特異変異導入法によりｐＧＥＸ−ΔＮＰ６３１−７３９の対応するコドンを終始コドンに換えることにより構築した。この部位特異変異導入には、次のプライマー、Ｍｕ６３９ｆ／Ｍｕ６３９ｒ、Ｍｕ６４０ｆ／Ｍｕ６４０ｒ、Ｍｕ６４１ｆ／Ｍｕ６４１ｒ、Ｍｕ６４２ｆ／Ｍｕ６４２ｒ、Ｍｕ６４３ｆ／Ｍｕ６４３ｒ、Ｍｕ６４４ｆ／Ｍｕ６４４ｒを用い、使用説明書（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ；ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）に従って行った。前述したように、それぞれのレストンエボラウイルス短縮型核蛋白を発現させ、それを精製した。
【００３６】
（２）エピトープの決定
レストンエボラウイルスの短縮型核蛋白に対するＩｇＧ−ＥＬＩＳＡを行うことにより、Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８が認識するエピトープを決定した（図２）。
ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡは次のようにして行った。まず、精製されたＧＳＴ融合蛋白を１００ｎｇ／ウェルでＭｉｃｒｏｗｅｌｌＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＣｏ．）に吸着させ、Ｍｉｌｋ−ＰＢＳＴ（５％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳ）でブロッキング後、各モノクローナル抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ＨＲＰＯ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ）及びＡＢＴＳ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、特異反応を検出した。
Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８はレストンエボラウイルス核蛋白の６３１番目から７３９番目までのアミノ酸残基を認識することがわかった。そして、最小のエピトープを決定するためにさらに試験が行われた。
Ｒｅｓ２−６Ｃ８はレストンエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３６番目から７３９番目までに対応する短縮型核蛋白、そして６３１番目から６３９番目までに相当する短縮型核蛋白には反応したが、６３７番目から７３９番目までに相当する短縮型核蛋白と６３１番目から６３８番目までに相当する短縮型核蛋白には反応しなかった。一方、Ｒｅｓ２−１Ｄ８はレストエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３６番目から７３９番目までに相当する短縮型核蛋白及び６３１番目から６４３番目までに相当する短縮型核蛋白には反応したが、６３７番目から７３９番目までに相当する短縮型核蛋白と６３１番目から６４２番目までに相当する短縮型核蛋白には反応しなかった。これらの結果から、Ｒｅｓ２−６Ｃ８により認識されるエピトープはレストンエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３６番目から６３９番目までの領域（４アミノ酸残基：６３６ＤＰＤＩ６３９）であり、Ｒｅｓ２−１Ｄ８が認識するエピトープは６３６番目から６４３番目までの領域（８アミノ酸残基：６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）であることが示された。前記エピトープのアミノ酸配列と、１９８９年と１９９０年に単離・同定されたレストンエボラウイルス・ペンシルヴェニアが有する蛋白のアミノ酸配列、ザイールエボラウイルスが有する蛋白のアミノ酸配列、スーダンエボラウイルスが有する蛋白のアミノ酸配列とをアラインメントして比較した。アラインメントの結果を次の表２に示す。
【００３７】
【表２】

【００３８】
エピトープの８アミノ酸残基は１９８９年及び１９９０年に単離・同定されたレストンエボラウイルス・ペンシルヴェニアの有するアミノ酸配列の対応するアミノ酸残基と全く同一であった。レストンエボラウイルスのアミノ酸残基６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３に対応するザイールエボラウイルス及びスーダンエボラウイルスの核蛋白のアミノ酸残基はそれぞれ、ＮＱＤＳＤＮＴＱ、ＥＡＬＰＩＮＳＫであった（表２）。
【００３９】
実施例５：抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法
（１）臨床検体
１９９６年にフイリピンで起こったレストンエボラウイルスの流行の際、レストンエボラウイルスに感染したカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍａｃａｑｕｅｓ）から採集され凍結保存されている、肝臓の検体（番号２８８２，２８７７）、脾臓の検体（番号２８７７，２８８２，２８８５）、血清の検体（番号２８６６，２６１２）を本研究に用いた。これらの検体から、抗体３−３Ｄ（非特許文献１参照）を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法、プライマーＲＥＳ−Ｎｆ２（５´−ＴＧＡＧＣＴＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＴ−３´）及びＲＥＳ−Ｎｒ２（５´−ＡＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＴＣＣＡＡＣＴＧＡＴＴＧＣ−３´）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、エボラウイルス核蛋白抗原あるいはエボラウイルスゲノムＲＮＡが検出された。レストンエボラウイルス非感染のカニクイザル由来の肝臓５検体及び血清７９検体をネガティブコントロールとして用いた。肝臓及び脾臓の組織を、ほぼ１０％リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び５％のスキムミルクを加えた溶液（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｍｉｌｋ−ＰＢＳＴ）中で、ホモジェナイズした。１２０００ｒｐｍで１０分間遠心したのち、上澄みを試験に用いた。血清の検体は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｍｉｌｋ−ＰＢＳＴで希釈して試験に用いた。
【００４０】
（２）測定方法
抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法を以前に報告した方法（非特許文献１参照）に従って行った。簡潔に方法を述べると、まず、精製したモノクローナル抗体を、マイクロタイタープレート（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃｏ．）のウェルあたりに１００ｎｇずつ１００μｌのＰＢＳに溶かして塗布し、４℃で一晩おいた。３つのモノクローナル抗体、Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８、及び３−３Ｄをこの方法の捕捉抗体として用いた。尚、モノクローナル抗体３−３Ｄはザイールエボラウイルスの核蛋白に対する抗体として作製されたものであり、これを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法を行うことによってザイールエボラウイルス、レストンエボラウイルス、（そしておそらくスーダンエボラウイルスも）検出できることが報告されている。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回プレートを洗浄し、５％のスキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔ（Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−Ｔ）を加えてウェルをブロックし、３７℃で保温した。Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−Ｔを除去し、１００μｌのサンプルをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ここで、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−Ｔをサンプルの希釈バッファーとして用いた。ＰＢＳ−Ｔでプレートを３回洗浄した後、プレートの各ウェルに塗布されたモノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８、３−３Ｄそれぞれに対して、抗ＧＳＴ−ＥＢＯ−Ｒ−ΔＮＰウサギ血清を１：１０００の希釈比で添加し、さらに抗Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ｒＮＰウサギ血清を１：１０００の希釈比で添加した。プレートを１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。それからＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）が結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗血清（カタログＮｏ．６２−６１２０、ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．）を１：１０００の希釈比でウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄したのち、ＡＢＴＳ基質（ＡＢＴＳ錠剤とＡＢＴＳバッファー；ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をウェルに添加した。その後、プレートを室温で３０分間インキュベートし、４０５ｎｍの波長のＯＤ（光学密度）を測定し記録した。
レストンエボラウイルスに非感染のカニクイザル由来の血清７９検体について、Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８、３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡを行ったところ、ＯＤの平均値＋標準偏差×３の値はそれぞれ０．１１，０．０７，０．１１であった。また、レストンエボラウイルスに非感染のカニクイザル由来の肝臓５検体について、Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８、３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡを行ったところ、ＯＤの平均値＋標準偏差×３の値はそれぞれ０．１５，０．０８，０．１５であった。従って、このＯＤ測定のカットオフ値を０．２とした。
【００４１】
（３）ＥＬＩＳＡ法の感度の試験
本発明の抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法の感度を試験した。すなわち、図３に示されるように、レストンエボラウイルスとザイールエボラウイルスの組み換え核蛋白に対する、３つのモノクローナル抗体の反応性を抗原捕捉ＥＬＩＳＡにより測定した。図中、□はＲｅｓ２−６Ｃ８を用いた結果、△はＲｅｓ２−１Ｄ８を用いた結果、◆は３−３Ｄを用いた結果を示す。Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ（Ａ）とＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰ（Ｂ）を抗原として用いた。４回の検定の平均値±標準偏差を示す。図３Ａに示されるように、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法を行った場合、Ｒｅｓ２−６Ｃ８はＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰを希釈比１：１２８０００の濃度まで検出でき、Ｒｅｓ２−１Ｄ８はＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰを希釈比１：６４０００の濃度まで検出できた。３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法では、Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰを希釈比１：３２０００の濃度まで検出できた。予想されたように、Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法では、Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰを検出できなかった（図３Ｂ）。
【００４２】
（４）レストンエボラウイルスに感染したサル由来の検体におけるレストンエボラウイルス核蛋白の検出
レストンエボラウイルスに感染したカニクイザル由来の血清、肝臓、脾臓の検体に対し、Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８及び３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法によりレストンエボラウイルス核蛋白の検出を行った。この結果を次の表３に示す。
【００４３】
【表３】

【００４４】
Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８は、血清、肝臓及び脾臓から、抗原であるレストンエボラウイルス核蛋白を検出した。Ｒｅｓ２−６Ｃ８はすべての検体から核蛋白を検出したが、Ｒｅｓ２−１Ｄ８は７検体のうち６検体から核蛋白を検出し、３−３Ｄは７検体のうち５検体から核蛋白を検出した。３−３Ｄを用いたＥＬＩＳＡ法よりも、Ｒｅｓ２−６Ｃ８又はＲｅｓ２−１Ｄ８を用いたＥＬＩＳＡ法の方が、核蛋白を検出できる適定終点が高かった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、レストンエボラウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、レストンエボラウイルスの核蛋白にのみ反応し、ザイールエボラウイルスの核蛋白やスーダンエボラウイルスの核蛋白には反応しないため、エボラウイルスの種の鑑別診断に用いることができる。また、本発明のモノクローナル抗体を作製する方法は、非感染性の組み換え蛋白質などを抗原とすることができるため、高度安全実験施設等を使用せずに作製することができる。
本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、レストンエボラウイルスを特異的に検出することができ、かつ抗原希釈比１：６４０００〜１：１２８０００まで検出できる非常に感度の高い検出方法を提供する。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法と、エボラウイルスの各種サブタイプの核蛋白に交叉性のあるモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法とを併用することにより、レストンエボラウイルス感染症をザイールエボラウイルス感染症及びスーダンエボラウイルス感染症と区別して、迅速かつ簡便に鑑別診断することが可能となる。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、ウイルス分離法のように高度安全実験施設を使用する必要がなく、また、ＲＴ−ＰＣＲ法などのように増幅産物の配列決定を行うといった面倒な操作が不要である。このように本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、迅速、簡便かつ高感度で、レストンエボラウイルスの鑑別診断が可能であるため、輸入動物の検疫などに極めて有用である。
【００４６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、レストンエボラウイルス、ザイールエボラウイルス、スーダンエボラウイルスの核蛋白を発現する培養細胞に対する、各種モノクローナル抗体（Ｒｅｓ２−６Ｃ８，Ｒｅｓ２−１Ｄ８，３−３Ｄ）の反応性を間接蛍光抗体法により測定した結果を示す。
【図２】図２は、モノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８の、レストンエボラウイルス短縮型組み換え核蛋白に対する反応性を、ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法により検討した結果を示す。
【図３】図３は、モノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８及び３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法により、エボラウイルスの組み換え核蛋白を検出した結果示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a monoclonal antibody that specifically recognizes Reston Ebola virus, a method for detecting Reston Ebola virus using the monoclonal antibody, a method for producing the monoclonal antibody, and the like.
[0002]
[Prior art]
Ebola virus infection is a serious viral infection with bleeding and is one of the most dangerous infections.
There are four species of Ebola virus, Zaire Ebola virus (EBO-Z), Sudan Ebola virus (EBO-S), C コート te d'Ivoire Ebola virus (EBO-CI), and Reston Ebola virus (EBO-R). Ebola virus has a single-stranded (-) RNA genome, and its viral genes include nucleoprotein (NP), P protein (VP35), matrix protein (VP40), glycoprotein (GP), and synthesis of viral mRNA. Encodes a nuclear protein (VP30) that acts on DNA, a protein that binds to the membrane (VP24), and an RNA-dependent RNA polymerase (L).
Although Reston Ebola virus (EBO-R) is thought to be an endemic virus in the Philippines, it has been reported that cynomolgus monkeys infected with this Reston Ebola virus were exported to the United States and Italy. Reston Ebola virus causes lethal disease in non-human primates but does not cause infectious symptoms in humans.
[0003]
The natural host of the Ebola virus has not been identified, but humans are transmitted by contact with patients. In addition, Ebola virus may be introduced into the country via imported monkeys, and quarantine is being conducted on all imported monkeys. Early laboratory diagnosis of Ebola is important to prevent the spread of Ebola virus infection, but, as noted above, because Reston Ebola virus does not cause infection in humans, a rapid differentiation of Ebola virus species is necessary. is there. In particular, when testing a sample derived from a primate other than a human in quarantine or the like, it is important to determine whether or not it is a Reston Ebola virus.
[0004]
Laboratory diagnosis of Ebola virus infection includes virus isolation, transmission electron microscopy, immunohistochemical techniques, reverse transcription PCR (RT-PCR), fluorescent 5 'nuclease assay, and antigen A capture ELISA method has been used. In the case of Ebola virus infection, the amount of virus in the blood increases, so that the detection of Ebola virus antigen by the antigen capture ELISA method is sufficiently possible. On the other hand, virus isolation requires the use of a highly safe experimental facility, and reverse transcription PCR requires confirmation of the sequence of the amplified fragment. For this reason, antigen capture ELISA is suitable for laboratory diagnosis.
The present inventors have previously reported an antigen capture ELISA method using a monoclonal antibody 3-3D against Zaire Ebola virus nucleoprotein. However, this monoclonal antibody 3-3D is an antibody having no specificity that reacts not only with the nucleoprotein of Zaire ebola virus, but also with the nucleoproteins of Sudan ebola virus and Reston ebola virus (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). Reference 1).
Therefore, it was necessary to develop a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus in order to quickly identify the species of Ebola virus in quarantine and the like.
[0005]
[Patent Document 1]
JP-A-14-306164
[Non-patent document 1]
Niikura et al., Journal of Clinical Microbiology (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY), 2001, Vol. 39, No. 9, p. 3267-3271
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus. Another object of the present invention is to provide a method for differentially diagnosing Reston Ebola virus using the monoclonal antibody.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus, in particular, a nucleoprotein possessed by Reston Ebola virus has an amino acid sequence specific to the virus. A monoclonal antibody recognizing an epitope consisting of regions, and further, a region from amino acid sequence 636 to 643 in the nucleoprotein of Reston Ebola virus ( ₆₃₆ DPDIGQSK ₆₄₃ A) a monoclonal antibody recognizing an epitope consisting of a region of 4 or more amino acid residues was found, and the present invention was completed.
In addition, the present inventors have developed a method for detecting Reston Ebola virus using a monoclonal antibody specific to the Reston Ebola virus of the present invention or a fragment containing the antigen-binding site thereof.
[0008]
That is, the present inventors immunized a mouse with a Reston Ebola virus nucleoprotein (His-EBO-R-NP) to which a histidine tag was added at the N-terminus, and performed monoclonal antibody (hybridoma) using a spleen cell of the mouse. When MAb) was prepared, two monoclonal antibodies specific to Reston Ebola virus, Res2-6C8 and Res2-1D8, were obtained. When the specificity of the monoclonal antibodies Res2-6C8 and Res2-1D8 to Ebola virus species was tested by indirect immunofluorescence (IFA), these two monoclonal antibodies reacted with the Reston Ebola virus nucleoprotein. It did not react with the nucleoprotein of Zaire ebola virus or the nucleoprotein of Sudan ebola virus (FIG. 1), and was a monoclonal antibody specific to Reston ebola virus.
[0009]
Next, the minimum epitope recognized by Res2-6C8 or Res2-1D8 was determined by performing IgG-ELISA on the truncated nucleoprotein of Reston Ebola virus. As a result, the epitope recognized by Res2-6C8 is the region from the 636th position to the 639th position in the amino acid sequence of the Reston Ebola virus nucleoprotein (4 amino acid residues: ₆₃₆ DPDI ₆₃₉ ), And the epitope recognized by Res2-1D8 is a region from position 636 to position 643 (8 amino acid residues: ₆₃₆ DPDIGQSK ₆₄₃ ) (FIG. 2). This has clarified the following facts. That is, if a monoclonal antibody that recognizes an epitope consisting of an amino acid sequence region specific to the virus among nucleoproteins possessed by Reston Ebola virus is prepared, a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus can be prepared. In addition, an epitope containing four or more amino acid residues among the eight amino acid residues DPDIGQSK can be used for selecting or purifying an antibody specific to Reston Ebola virus.
[0010]
When the sensitivity of the antigen capture ELISA method using the monoclonal antibody of the present invention was tested, it was found that the method was highly sensitive and could specifically detect Reston Ebola virus (FIG. 3). The combination of the antigen capture ELISA using the monoclonal antibody of the present invention and the ELISA using the cross-producing monoclonal antibody of the Ebola virus subtype rapidly reduces the Reston Ebola virus infection to Zaire Ebola virus infection and Sudan. Differential diagnosis can be made from Ebola virus infection.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus of the present invention is preferably a monoclonal antibody that recognizes an epitope consisting of an amino acid sequence specific to the virus among nucleoproteins possessed by Reston Ebola virus, and more preferably Reston Ebola virus Region from amino acid sequence 636 to 643 ( ₆₃₆ DPDIGQSK ₆₄₃ A) a monoclonal antibody that recognizes an epitope consisting of a region of 4 amino acid residues or more.
The monoclonal antibody of the present invention can be obtained, for example, by preparing a monoclonal antibody against a nucleoprotein of Reston Ebola virus. That is, an animal is immunized with a nucleoprotein of Reston Ebola virus, a hybridoma is prepared using spleen cells or lymphocytes of the animal, and then a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus is obtained from the obtained hybridomas. Select what to produce. In the screening, for example, a nucleoprotein of Reston Ebola virus can be used, more preferably an epitope consisting of an amino acid sequence specific to the virus among nucleoproteins possessed by Reston Ebola virus, and further preferably And the region from amino acid sequence 636 to 643 in the nucleoprotein of Reston Ebola virus ( ₆₃₆ DPDIGQSK ₆₄₃ ) Can be used.
By purifying the supernatant produced by the selected hybridoma, a large amount of the monoclonal antibody of the present invention can be produced.
[0012]
Hereinafter, the method for producing the monoclonal antibody of the present invention will be described in more detail.
First, an animal is immunized with a nucleoprotein of Reston Ebola virus and immunized to produce cells that produce antibodies to the antigen. Examples of the mammal used here include a mouse, a rat, a hamster, a chicken, and the like, and the mammal can be easily handled. The nucleoprotein (NP) of the Reston Ebola virus used as the antigen may be a natural nucleoprotein of the Reston Ebola virus or a recombinant nucleoprotein, but the use of a recombinant nucleoprotein is preferable because there is no concern about infection. The recombinant nucleoprotein may be a full-length nucleoprotein of Reston Ebola virus, or a partial-length protein containing an amino acid sequence specific to the virus among nucleoproteins of Reston Ebola virus.
[0013]
As a method for producing a recombinant nucleoprotein of Reston Ebola virus, for example, using a genetic engineering technique, a gene (DNA) encoding the full-length or partial length of the Reston Ebola virus nucleoprotein is obtained. Is constructed by constructing a recombinant vector in which is inserted downstream of a promoter of an appropriate vector, and introducing the recombinant vector into a host cell to express a gene to obtain a target protein.
The host used for the production of the recombinant nuclear protein may be any one capable of expressing the gene of interest, such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, etc., but it is possible to use insect cells or Escherichia coli which are easy to handle. is there. The production of a recombinant protein using these cells can be performed by a known method. For example, the target protein can be obtained by a protein expression system in insect cells using baculovirus.
[0014]
The gene (DNA) encoding the nucleoprotein of Reston Ebola virus can be obtained by the following method. For example, RNA is extracted from the liver tissue of cynomolgus monkeys infected with Reston Ebola virus to prepare a cDNA library, and the target DNA is screened by PCR using primers having a sequence specific to the Reston Ebola virus nucleoprotein. Obtainable. As a second example, there is a method of producing a synthetic gene based on the sequence described in Genbank accession number AB050936. That is, a base sequence is designed based on the amino acid sequence described in Genbank accession number AB050936, this gene is divided into several segments of about 400 bp, and a restriction enzyme site is provided at the end of the segment. The primers are designed so that each segment can be covered with about three pairs of long primers. Each primer is set to have an overlap of about 10 to 12 bp. Each segment is prepared by performing stepwise PCR using these primers. The target DNA can be obtained by ligating each segment at a restriction enzyme site.
In producing a recombinant protein, an affinity tag can be added for recovery of the protein. Affinity tags include GST tags and histidine tags.
Other methods for producing a recombinant nucleoprotein of Reston Ebola virus include, for example, [Ikegami et al., Microbiology and Immunology (MICROBIOLOGY and IMMUNOLOGY), 2002, Vol. 46, No. 9, p. 633-638].
[0015]
A method for immunizing an animal with a nucleoprotein of Reston Ebola virus and a method for producing a hybridoma from spleen cells or lymphocytes of the animal can be performed according to a known monoclonal antibody producing method.
For example, when immunizing an animal, the antigenicity can be increased by administering the antigen in combination with a carrier protein having high antigenicity, or by administering the antigen together with an appropriate adjuvant. IMJECT-ALUM (Pierce) can be used as a carrier protein, and Freund's complete adjuvant (Becton) can be used as an adjuvant. The administration of the antigen is preferably performed 3 to 10 times at intervals of 5 days to 2 weeks after the first administration.
A method for producing a hybridoma from spleen cells or lymphocytes of an immunized animal can be achieved by fusing spleen cells or lymphocytes with myeloma cells capable of infinite proliferation. That is, cells are fused by adding a cell-aggregating medium such as polyethylene glycol to spleen cells, lymphocytes, or myeloma cells and suspending the cells in a medium. To selectively obtain only the desired fused cells, a HAT selection medium can be used. By using myeloma cells having only a de novo circuit of a nucleic acid synthesis system, only hybridomas can be separated in a HAT selection medium that inhibits the de novo circuit.
[0016]
As a method for screening a hybridoma that produces a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus from hybridomas, the following method can be mentioned. For example, a method for selecting hybridomas by assaying the reactivity of the supernatant of the hybridoma to the Reston Ebola virus nucleoprotein by an IgG-ELISA method may be mentioned. The Reston Ebola virus nucleoprotein used here may be a full-length Reston Ebola virus nucleoprotein, but if a partial long nucleoprotein consisting of a region of an amino acid sequence specific to the virus among the nucleoproteins of Reston Ebola virus is used. A hybridoma that produces an antibody that specifically reacts with the nucleoprotein of Reston Ebola virus can be screened with high accuracy. Preferably, the region from 636 to 643 in the amino acid sequence of the nucleoprotein of Reston Ebola virus ( ₆₃₆ DPDIGQSK ₆₄₃ )), A method of screening by an IgG-ELISA using a nucleoprotein containing a region of 4 amino acid residues or more.
Such a Reston Ebola virus nucleoprotein used for IgG-ELISA can be obtained according to the method for producing a recombinant nucleoprotein described above. Alternatively, it can be carried out according to the method described in Example 4 below.
[0017]
The IgG-ELISA method can be performed according to a known method. For example, a Reston Ebola virus recombinant nucleoprotein serving as an antigen is coated on a plate, the hybridoma supernatant is reacted as a first antibody, and the second antibody is labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, or the like. After reacting with an immunoglobulin antibody against, a reaction according to the labeling substance is performed to identify a hybridoma supernatant that specifically reacts with the antigen. Thus, the hybridoma of the present invention can be obtained, and the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by purifying the culture supernatant of the hybridoma.
[0018]
The monoclonal antibody obtained by the above method can be further selected by testing its reactivity with the Reston Ebola virus nucleoprotein by, for example, an antigen capture ELISA method described in Example 5 below.
The specificity of the obtained monoclonal antibody to the species of Ebola virus, that is, the nucleoprotein of Reston Ebola virus and the nucleus of Zaire Ebola virus were determined by performing indirect immunofluorescence (IFA) according to the method described in Example 2 below. The reactivity to each of the protein and the nucleoprotein of Sudan Ebola virus can be confirmed.
Mapping of the epitope recognized by the monoclonal antibody of the present invention can be performed, for example, according to the method described in Example 4 below.
[0019]
From the above description, a method for preparing a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus is apparent.
That is, the present invention provides a method for producing a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus, comprising the following steps (a) to (c):
(B) Spleen cells or lymphocytes are taken from an animal immunized with the nucleoprotein of Reston Ebola virus and fused with myeloma cells to produce a hybridoma.
(B) A hybridoma producing an antibody specific to a Reston Ebola virus is selected from the hybridomas (a) by using an epitope consisting of a region of an amino acid sequence specific to the virus among nucleoproteins of the Reston Ebola virus.
(C) Purify the monoclonal antibody produced by the selected hybridoma.
[0020]
A more specific method for preparing the monoclonal antibody of the present invention can be performed, for example, according to the method described in Example 1 below.
Hybridomas producing the monoclonal antibody of the present invention were identified as Accession No. FERM P-19291 and Accession No. FERM P-19292 on April 8, 2003 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Japan). It has been deposited at 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture.
The hybridoma deposited under accession number FERM P-19291 has a region from amino acid sequence 636 to 639 in the nucleoprotein of Reston Ebola virus ( ₆₃₆ DPDI ₆₃₉ ) Is a hybridoma that produces a monoclonal antibody Res2-6C8 that recognizes an epitope consisting of:
The hybridoma deposited under accession number FERM P-19292 is a region of the nucleoprotein of Reston Ebola virus from the 636th to 643th amino acid sequence ( ₆₃₆ DPDIGQSK ₆₄₃ ) Is a hybridoma that produces a monoclonal antibody Res2-1D8 that recognizes an epitope consisting of:
[0021]
The fragment containing the antigen-binding site of the monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus of the present invention can be obtained, for example, by treating a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus with a protease such as papain or pepsin. it can.
For example, when the isotype of the monoclonal antibody is IgG, when the monoclonal antibody is cleaved with papain, the Fab fragment containing the antigen-binding site is decomposed into two Fab fragments and one Fc fragment containing no antigen-binding site. When an IgG-type antibody is cleaved with pepsin, it is decomposed into a large fragment in which two Fab fragments each containing an antigen-binding site are bound, and the other fragments.
[0022]
The present invention relates to a region from amino acid sequence 636 to 643 in the nucleoprotein of Reston Ebola virus ( ₆₃₆ DPDIGQSK ₆₄₃ ) Is provided. The epitope of the present invention can be used for producing the above-mentioned monoclonal antibody, and also for producing a polyclonal antibody specific to Reston Ebola virus.
For example, animals (rabbits, chickens, rats, mice, etc.) are repeatedly injected with a purified Reston Ebola virus nucleoprotein as an antigen, and an antibody against the Reston Ebola virus nucleoprotein is produced by an immune reaction. Next, blood is collected and subjected to affinity chromatography using a column on which the Reston Ebola virus nucleoprotein is immobilized to purify a polyclonal antibody against the Reston Ebola virus nucleoprotein. The purified polyclonal antibody is further purified by affinity chromatography using a column on which the epitope of the present invention is immobilized, whereby a polyclonal antibody having specificity for Reston Ebola virus can be produced.
The polyclonal antibody specific to Reston Ebola virus thus prepared can be used in place of the monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus of the present invention. For example, a polyclonal antibody specific for Reston Ebola virus can be used to detect Reston Ebola virus.
[0023]
Methods for detecting Reston Ebola virus using the monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus of the present invention include antigen capture ELISA, fluorescent antibody (IFA), radiolabeled immunoantibody (RIA), Examples include histochemical staining (ABC method, CSA method, etc.), Western blotting, and immunoprecipitation.
These methods can be performed according to a known method using a monoclonal antibody specific to the Reston Ebola virus of the present invention.
[0024]
The antigen capture ELISA using a monoclonal antibody specific to the Reston Ebola virus of the present invention can be performed, for example, by the following method. Briefly, the method is as follows. First, a purified monoclonal antibody of the present invention is adsorbed to a well of a microtiter plate overnight, and each well is blocked with a buffer. Next, after washing with a buffer, the sample is loaded into the well and left for about 1 hour to allow the monoclonal antibody of the present invention to react with the Reston Ebola virus nucleoprotein in the sample. Each well is washed with a buffer, a polyclonal antibody against the Ebola virus nucleoprotein is added, and the mixture is left for about 1 hour to allow the Reston Ebola virus nucleoprotein captured by the monoclonal antibody to react with the polyclonal antibody. After washing with a buffer, an anti-IgG antibody labeled with an enzyme is added to react the antigen-antibody complex with the anti-IgG antibody. Finally, the Reston Ebola virus nucleoprotein is detected by adding an enzyme substrate and measuring the enzymatic reaction.
The polyclonal antibody against the Reston Ebola virus nucleoprotein used in this method can be prepared according to a known method. Examples of an enzyme for labeling an anti-IgG antibody include horseradish peroxidase (horseradish peroxidase) and alkaline phosphatase. As a coloring reagent for horseradish peroxidase, 2,2′-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (abbreviated name ABTS) and diaminobenzidine (abbreviated name DAB) can be used. When alkaline phosphatase is used as the labeling enzyme, X-phosphate (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) is used as a substrate, and a chromogenic reagent nitro blue tetrazolium can be used.
The antigen capture ELISA using a monoclonal antibody specific to the Reston Ebola virus of the present invention can be performed, for example, according to the method described in Example 5 described later. The anti-GST-EBO-R-ΔNP rabbit serum used here can be prepared according to the method described in Example 3 below.
The antigen capture ELISA method using the monoclonal antibody of the present invention has a very high sensitivity for detecting nucleoprotein of Reston Ebola virus at an antigen dilution ratio of 1: 640000 to 1: 128000, as shown in Example 5 and FIG. Is a high method. In addition, as shown in Example 5 and FIG. 3 described below, this method is an extremely excellent method capable of specifically detecting only the nucleoprotein of Reston Ebola virus without detecting the nucleoprotein of Zaire ebola virus at all.
[0025]
If the measurement is performed in combination with the antigen capture ELISA using a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus and the antigen capture ELISA using a monoclonal antibody cross-linked to nucleoproteins of various subtypes of Ebola virus, Differential diagnosis of Reston Ebola virus is possible with high accuracy. This method can also be performed, for example, according to the method described in Example 5 below. The monoclonal antibody (3-3D) having cross-reactivity with nucleoproteins of various subtypes of Ebola virus used herein can be prepared according to the methods described in Patent Document 1 and Non-patent Document 1.
[0026]
The kit for detecting Reston Ebola virus of the present invention comprises a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus or a fragment containing an antigen-binding site thereof, and a reagent for detecting an antigen-antibody reaction. The monoclonal antibody or a fragment thereof mentioned herein may be an antibody immobilized on a plate or an antibody labeled with an enzyme, a fluorescent dye, or the like. In addition, as a reagent for detecting an antigen-antibody reaction, a secondary antibody for detecting a complex formed by an antigen-antibody binding reaction when an antibody that specifically recognizes Reston Ebola virus is used as a primary antibody, When an enzyme is used as a labeling substance for an antibody, a substrate for measuring the enzyme activity, a reaction terminator and the like can be mentioned. In addition, those commonly used in kits for immunological measurement reagents, such as various lysing agents, buffers, and detergents, may be mentioned.
[0027]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0028]
Example 1: Preparation of monoclonal antibody
(1) Preparation of Ebola virus recombinant nuclear proteins (His-EBO-R-NP and His-EBO-Z-NP)
Recombinant nuclear proteins of Reston Ebola virus (His-EBO-R-NP) and recombinant nuclear proteins of Zaire Ebola virus (His-EBO-Z-NP) were prepared. Recombinant baculovirus expressing His-EBO-R-NP (Ac-His-EBO-R-NP) and recombinant baculovirus expressing His-EBO-Z-NP (Ac-His-EBO-Z-NP) It was prepared by the method reported by the inventors (Ikegami et al., Microbiology and Immunology (MICROBIOLOGY and IMMUNOLOGY), 2002, Vol. 46, No. 9, p. 633-638). Tn5 cells infected with Ac-His-EBO-R-NP and His-EBO-Z-NP were cultured at 26 ° C. for 3 days, and then washed twice with PBS. Then, the plate was incubated with PBS containing 1% NP-40 for 15 minutes. After sonication for 1 minute, the cell lysate was used for the test.
[0029]
(2) Immunization of mice
Balb / c mice were immunized with His-EBO-R-NP with Freund's complete adjuvant (Becton, Dickinson, Co., Franklin Lakes, NJ). The mice were subcutaneously inoculated with His-EBO-R-NP together with IMJECT-ALUM (Pierce, Rockford, IL) three times at two-week intervals.
(3) Preparation of hybridoma
Three days after the last immunization, the spleen was removed and the spleen cells were fused with P3 / Ag568 using polyethylene glycol 4000 (catalog No. 4030-035, Gibco BRL). Cell culture was performed in RPMI 1640 (Gibco BRL, Rockville, MD) supplemented with 10% fetal calf serum and antibiotics (streptomycin and penicillin; Gibco BRL). A hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) additive (Gibco BRL) was added to the medium, and hybridomas were selected according to the manufacturer's instructions. When the composition of the medium was changed from HAT to RPMI 1640, a hypoxanthine-thymidine (HT) additive (Gibco BRL) was added to the medium.
[0030]
(4) Hybridoma screening
Hybridoma supernatants were screened by the immunoglobulin G (IgG) ELISA method using His-EBO-R-NP as an antigen (see Non-Patent Document 1). Hybridomas roughly screened as positive by ELISA were obtained, cloned by limiting dilution and established. Thirty-two established hybridomas were obtained, and the reactivity of the monoclonal antibodies produced by them to the Reston Ebola virus nucleoprotein was assayed according to the antigen capture ELISA method. Based on this result, two monoclonal antibodies Res2-6C8 and Res2-1D8 were selected and used in subsequent tests. The monoclonal antibody was purified from the culture supernatant using MAb Trap GII antibody purification kit (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) according to the instruction manual. The isotype of the monoclonal antibody was determined using the Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Gibco BRL). The isotypes of Res2-6C8 and Res2-1D8 were IgG2b and IgG1, respectively.
[0031]
Example 2: Assay of antigen specificity of the monoclonal antibody of the present invention by indirect immunofluorescence assay (IFA)
The indirect fluorescent antibody method (IFA) using HeLa cells expressing all nucleoproteins of reston ebola virus or zeil ebola virus was described by a method previously reported by the present inventors (Ikegami et al., Microbiology and Immunology). (MICROBIOLOGY and IMMUNOLOGY), 2002, Vol. 46, No. 9, p. 633-638). IFA slides coated with gamma-irradiated Vero E6 cells infected with Zaire ebola virus were kindly provided by the Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA. Each monoclonal antibody was spotted at a concentration of 100 ng / μl in a well on a 20 μl slide and incubated for 1 hour at 37 ° C. in wet conditions.
After the slides were washed with PBS, they were mixed with a goat anti-mouse IgG (H + L) serum (catalog No. 62-6511, Zymyed Laboratories Inc., CA) conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) at a ratio of 1: 100 and reacted. I let it. The slide was washed with PBS, and the staining pattern was observed with a fluorescence microscope.
The result is shown in FIG. For HeLa cells expressing recombinant nucleoprotein of Reston Ebola virus (AC), HeLa cells expressing recombinant nuclear protein of Zaire ebola virus (DF), and Vero cells infected with Sudan ebola virus (GI) The reactivity of the monoclonal antibody, ie, Res2-6C8 reactivity (A, D, G), Res2-1D8 reactivity (B, E, H), and 3-3D reactivity (C, F, I) The result measured by the indirect fluorescent antibody method is shown. Although the two monoclonal antibodies Res2-6C8 and Res2-1D8 reacted with the Reston Ebola virus nucleoprotein (FIGS. 1A and 1B), they did not react with the nucleoprotein of Zaire ebola virus or the nucleoprotein of Sudan ebola virus (FIG. 1D). , E, G, H). 3-3D reacted with all three nucleoproteins of Ebola virus.
[0032]
Example 3: Preparation of polyclonal antibody
The following rabbit antiserum was prepared according to the method described in the literature. That is, rabbit antiserum against Glutathione S-transferase (GST) tag added to the C-terminal half of the Reston Ebola virus nucleoprotein (from amino acid sequence 360 to amino acid 739) (GST-EBO-R-ΔNP) ( Ikegami et al., Microbiology and Immunology (MICROBIOLOGY and IMMUNOLOGY), 2002, Vol. 46, No. 9, p. 633-638), and rabbit antiserum against His-EBO-Z-NP (Saijo) In addition, a journal, Clinical of Microbiology, 2001, Vol. 39, No. 2, p. 776-778 was produced. Briefly, the preparation method is described as follows. First, rabbits are immunized subcutaneously four times with GST-EBO-R-ΔNP or His-EBO-Z-NP together with IMJECT-ALUM (Pierce), and 7 days after the last immunization treatment. Serum was collected.
[0033]
Example 4: Mapping epitopes recognized by monoclonal antibodies
(1) Preparation of truncated nuclear protein of Reston Ebola virus
To determine the epitope recognized by Res2-6C8 and Res2-1D8, a set of truncated recombinant nuclear proteins of Reston Ebola virus was prepared. Table 1 below shows the primers used to construct these peptides.
[0034]
[Table 1]

[0035]
Truncated nucleoproteins corresponding to amino acids 631 to 739 in the amino acid sequence of the Reston Ebola virus nucleoprotein were prepared as follows. PCR using primers RES-N8F and RES-N8R (see Non-Patent Document 1) was performed to amplify the corresponding region of the Reston Ebola virus cDNA. The PCR fragment was subcloned into a pGEX-2T vector (Amersham Pharmacia Biotech, little Chalfont, United Kingdom) to construct pGEX-ΔNP631-739. It was confirmed whether the insertion sequence of this construction vector was correct. The GST-tagged Reston Ebola virus truncated nucleoprotein was expressed in E. coli (BL-21) and purified using glutathione Sepharose 4B column chromatography. Purification was performed according to the manufacturer's instructions (Amersham Pharmacia Biotech). PCR was performed using the forward primers R635f, R636f, R637f and R638f, and the reverse primer RES-N8R. Truncated nucleoproteins corresponding to the amino acid sequence of the nucleoprotein of Reston Ebola virus at positions 635 to 739, 636 to 739, 637 to 739, and 638 to 739 were respectively expressed and purified. It corresponds to Reston Ebola virus nucleoprotein from 631 to 638, from 631 to 639, from 631 to 640, from 631 to 641, from 631 to 642, and from 631 to 643. A vector for expressing each truncated nuclear protein having a length was constructed by replacing the corresponding codon of pGEX-ΔNP631-739 with a stop codon by site-directed mutagenesis. This site-directed mutagenesis was carried out using the following primers: Mu639f / Mu639r, Mu640f / Mu640r, Mu641f / Mu641r, Mu642f / Mu642r, Mu643f / Mu643r, Mu644f / Mu644Sr. , La Jolla, CA). As described above, each Reston Ebola virus truncated nucleoprotein was expressed and purified.
[0036]
(2) Determination of epitope
The epitope recognized by Res2-6C8 and Res2-1D8 was determined by performing IgG-ELISA on the truncated nuclear protein of Reston Ebola virus (FIG. 2).
IgG-ELISA was performed as follows. First, the purified GST fusion protein was adsorbed on a Microwell Immunoplate (Becton Dickinson Co.) at 100 ng / well, and blocked with Milk-PBST (5% skim milk, 0.05% Tween 20 and PBS). For 1 hour. After washing with PBST, a specific reaction was detected using HRPO (horseradish peroxidase) -labeled anti-mouse IgG antibody (Zymed) and ABTS (Roche Diagnostics).
Res2-6C8 and Res2-1D8 were found to recognize amino acid residues 631 to 739 of the Reston Ebola virus nucleoprotein. Further tests were performed to determine the smallest epitope.
Res2-6C8 reacted with the truncated nucleoprotein corresponding to amino acids 636 to 739 and the truncated nucleoprotein corresponding to positions 631 to 639 in the amino acid sequence of the Reston Ebola virus nucleoprotein. It did not react with the truncated nucleoprotein corresponding to the 739th position and the truncated nucleoprotein corresponding to the 631st to 638th positions. On the other hand, Res2-1D8 reacted with the truncated nucleoprotein corresponding to 636 to 739 and the truncated nucleoprotein corresponding to 631 to 643 in the amino acid sequence of Rest Ebola virus nucleoprotein, Did not react with the truncated nucleoproteins corresponding to positions 739 to 739 and the truncated nucleoproteins corresponding to positions 631 to 642. From these results, the epitope recognized by Res2-6C8 is the region from 636 to 639 in the amino acid sequence of Reston Ebola virus nucleoprotein (4 amino acid residues: 636DPDI639), and the epitope recognized by Res2-1D8 is It was shown to be a region from the 636th position to the 643th position (8 amino acid residues: 636DPDIQSK643). The amino acid sequence of the epitope, the amino acid sequence of the protein of Reston Ebola virus Pennsylvania isolated and identified in 1989 and 1990, the amino acid sequence of the protein of Zaire ebola virus, the amino acid sequence of the protein of Sudan Ebola virus The amino acid sequences were aligned and compared. The results of the alignment are shown in Table 2 below.
[0037]
[Table 2]

[0038]
The eight amino acid residues of the epitope were exactly the same as the corresponding amino acid residues in the amino acid sequence of Reston Ebola virus Pennsylvania isolated and identified in 1989 and 1990. The amino acid residues of nucleoproteins of Zaire ebola virus and Sudan ebola virus corresponding to amino acid residue 636DPDIGQSK643 of Reston ebola virus were NQDSDNTQ and EARLPINSK, respectively (Table 2).
[0039]
Example 5: Antigen capture ELISA method
(1) Clinical specimen
During the outbreak of Reston Ebola virus in the Philippines in 1996, liver specimens (No. 2882, 2877) and spleen specimens (No. 2882, 2877) collected and cryopreserved from cynomolgus monkeys (cynomolgus macaques) infected with Reston Ebola virus 2877, 2882, 2885) and serum samples (numbers 2866, 2612) were used in this study. From these samples, antigen capture ELISA using antibody 3-3D (see Non-Patent Document 1), immunohistochemistry, primer RES-Nf2 (5′-TGA GCT CCG GAA GAA GGA CGG TGT-3 ′) and Ebola virus nucleoprotein antigen or Ebola virus genomic RNA was detected by RT-PCR using RES-Nr2 (5′-ACC ATC ATG TGT CCA ACT GAT TGC-3 ′). Five liver samples and 79 serum samples from cynomolgus monkeys not infected with Reston Ebola virus were used as negative controls. Liver and spleen tissues were prepared by adding 0.05

% Tween

20, 1% Triton X-100, and 5% skim milk to almost 10% phosphate buffered saline (PBS) (Triton-Milk-PBST). ), And inside was homogenized. After centrifugation at 12000 rpm for 10 minutes, the supernatant was used for the test. The serum sample was diluted with Triton-Milk-PBST and used for the test.
[0040]
(2) Measurement method
The antigen capture ELISA was performed according to a previously reported method (see Non-Patent Document 1). Briefly, the purified monoclonal antibody was first dissolved in 100 μl of PBS per well of a microtiter plate (Becton Dickinson, Co.) in 100 μl of PBS and applied at 4 ° C. overnight. Three monoclonal antibodies, Res2-6C8, Res2-1D8, and 3-3D were used as capture antibodies in this method. The monoclonal antibody 3-3D was prepared as an antibody against the nuclear protein of Zaire Ebola virus, and was subjected to an antigen capture ELISA method using the same to obtain Zaire Ebola virus, Reston Ebola virus, and possibly Sudan Ebola virus. Also reported to be detectable. Wash the plate three times with PBS containing 0.05% Tween 20 (PBS-T), add PBS-T containing 5% skim milk (Milk-PBS-T) to block the wells, and keep at 37 ° C. did. Milk-PBS-T was removed and 100 μl of sample was added to the wells and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Here, Triton-Milk-PBS-T was used as a sample dilution buffer. After washing the plate three times with PBS-T, anti-GST-EBO-R-ΔNP rabbit serum was added to each of the monoclonal antibodies Res2-6C8, Res2-1D8, and 3-3D applied to each well of the plate. : 1000, and anti-His-EBO-Z-rNP rabbit serum was added at a dilution ratio of 1: 1000. Plates were incubated for 1 hour and washed three times with PBS-T. Goat anti-rabbit IgG (H + L) antiserum (catalog No. 62-6120, Zymed Laboratories Inc.) conjugated with HRP (horseradish peroxidase) was added to the wells at a dilution of 1: 1000 and 1 hour at 37 ° C. Incubated. After washing three times with PBS-T, ABTS substrate (ABTS tablets and ABTS buffer; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) was added to the wells. The plate was then incubated at room temperature for 30 minutes, and the OD (optical density) at a wavelength of 405 nm was measured and recorded.
The antigen capture ELISA using Res2-6C8, Res2-1D8, and 3-3D was performed on 79 samples of cynomolgus monkeys not infected with the Reston Ebola virus. The average value of OD + standard deviation × 3 was, respectively, 0.11, 0.07, 0.11. In addition, an antigen capture ELISA using Res2-6C8, Res2-1D8, and 3-3D was performed on five liver specimens derived from cynomolgus monkeys that were not infected with Reston Ebola virus. The mean value of OD + standard deviation × 3 was obtained. Were 0.15, 0.08, and 0.15, respectively. Therefore, the cutoff value of this OD measurement was set to 0.2.
[0041]
(3) Sensitivity test of ELISA method
The sensitivity of the antigen capture ELISA of the present invention was tested. That is, as shown in FIG. 3, the reactivity of the three monoclonal antibodies to the recombinant nucleoproteins of Reston Ebola virus and Zaire Ebola virus was measured by antigen capture ELISA. In the figure, □ indicates the result using Res2-6C8, Δ indicates the result using Res2-1D8, and Δ indicates the result using 3-3D. His-EBO-R-NP (A) and His-EBO-Z-NP (B) were used as antigens. The average of four tests ± standard deviation is shown. As shown in FIG. 3A, when the antigen capture ELISA method was performed, Res2-6C8 could detect His-EBO-R-NP up to a concentration of 1: 128000, and Res2-1D8 could detect His-EBO-R-NP. NP could be detected up to a dilution ratio of 1: 64000. In the antigen capture ELISA using 3-3D, His-EBO-R-NP could be detected at a dilution ratio of 1: 32000. As expected, His-EBO-Z-NP could not be detected by the antigen capture ELISA using Res2-6C8 and Res2-1D8 (FIG. 3B).
[0042]
(4) Detection of Reston Ebola virus nucleoprotein in monkey specimens infected with Reston Ebola virus
The Reston Ebola virus nucleoprotein was detected by an antigen capture ELISA method using Res2-6C8, Res2-1D8 and 3-3D for a sample of cynomolgus monkey derived from cynomolgus monkeys infected with Reston Ebola virus. The results are shown in Table 3 below.
[0043]
[Table 3]

[0044]
Res2-6C8 and Res2-1D8 detected Reston Ebola virus nucleoprotein as an antigen from serum, liver and spleen. Res2-6C8 detected nucleoprotein from all samples, while Res2-1D8 detected nucleoprotein from 6 of 7 samples, and 3-3D detected nucleoprotein from 5 of 7 samples. The fixed end point at which a nuclear protein can be detected was higher in the ELISA method using Res2-6C8 or Res2-1D8 than in the ELISA method using 3-3D.
[0045]
【The invention's effect】
The monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody that specifically recognizes Reston Ebola virus. Since the monoclonal antibody of the present invention reacts only with the nucleoprotein of Reston Ebola virus and does not react with the nucleoprotein of Zaire ebola virus or the nucleoprotein of Sudan ebola virus, it can be used for differential diagnosis of Ebola virus species. In addition, the method for producing the monoclonal antibody of the present invention can use a non-infectious recombinant protein or the like as an antigen, and thus can be produced without using a highly safe laboratory or the like.
The antigen capture ELISA method using the monoclonal antibody of the present invention provides a very sensitive detection method capable of specifically detecting Reston Ebola virus and detecting an antigen dilution ratio of 1: 640000 to 1: 128000. I do. Combining the antigen capture ELISA method using the monoclonal antibody of the present invention with the antigen capture ELISA method using a monoclonal antibody cross-linked to the nucleoproteins of various subtypes of Ebola virus can reduce the Reston Ebola virus infection. Differentiation from Zaire ebola virus infection and Sudan ebola virus infection enables rapid and simple differential diagnosis. The antigen capture ELISA method using the monoclonal antibody of the present invention does not require the use of a high-safety experimental facility as in the case of the virus isolation method, and has the trouble of determining the sequence of the amplification product as in the RT-PCR method. No special operation is required. As described above, the antigen capture ELISA method using the monoclonal antibody of the present invention is rapid, simple, and highly sensitive, and is capable of differential diagnosis of Reston Ebola virus. Therefore, it is extremely useful for quarantine of imported animals.
[0046]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the indirect reactivity of various monoclonal antibodies (Res2-6C8, Res2-1D8, 3-3D) with cultured cells expressing nucleoproteins of Reston Ebola virus, Zaire Ebola virus, and Sudan Ebola virus. The result measured by the fluorescent antibody method is shown.
FIG. 2 shows the results obtained by examining the reactivity of monoclonal antibodies Res2-6C8 and Res2-1D8 to a Reston Ebola virus truncated recombinant nucleoprotein by an IgG-ELISA method.
FIG. 3 shows the results of detecting recombinant nuclear proteins of Ebola virus by an antigen capture ELISA method using monoclonal antibodies Res2-6C8, Res2-1D8 and 3-3D.

Claims

A monoclonal antibody that specifically recognizes Reston Ebola virus.

The monoclonal antibody according to claim 1, which recognizes an epitope consisting of a region of an amino acid sequence specific to the virus among nucleoproteins possessed by Reston Ebola virus.

Is one that recognizes an epitope of four amino acid residues or regions of the area ₍₆₃₆ DPDIGQSK ₆₄₃₎ from the 636 th amino acid sequence of the nucleoprotein to 643 th Reston Ebola virus has, monoclonal according to claim 2 antibody.

The monoclonal antibody according to claim 3, which recognizes an epitope consisting of a region from position 636 to position 639 ( ₆₃₆ DPDI ₆₃₉ ) in the amino acid sequence among nucleoproteins possessed by Reston Ebola virus.

It is one that recognizes an epitope consisting of the region ₍₆₃₆ DPDIGQSK ₆₄₃₎ from the 636 th amino acid sequence up to 643 th of the nucleoprotein of Reston Ebola virus has, monoclonal antibody according to claim 3.

A fragment comprising the antigen-binding site of the monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 5.

Epitope consisting of 4 amino acid residues or regions of the area ₍₆₃₆ DPDIGQSK ₆₄₃₎ from the 636 th amino acid sequence of the nucleoprotein to 643 th Reston Ebola virus has.

A polyclonal antibody purified using the epitope according to claim 7.

A hybridoma that produces the monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 5.

A hybridoma that produces the monoclonal antibody according to claim 4.

The hybridoma according to claim 10, which has an accession number FERM P-19291.

A hybridoma that produces the monoclonal antibody according to claim 5.

The hybridoma according to claim 12, which has an accession number FERM P-19292.

A method for detecting Reston Ebola virus using the monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 5 or a fragment containing the antigen-binding site thereof.

The method according to claim 14, wherein the measurement is performed by an antigen capture ELISA method.

16. The method according to claim 15, wherein the measurement is carried out in combination with an antigen capture ELISA method using a monoclonal antibody cross-linking nucleoproteins of various subtypes of Ebola virus.

A kit for detecting Reston Ebola virus, comprising the monoclonal antibody according to claim 1 or a fragment containing the antigen-binding site thereof, and a reagent for detecting an antigen-antibody reaction.

A method for producing a monoclonal antibody specific to Reston Ebola virus, comprising the following steps:
(B) Spleen cells or lymphocytes are taken from an animal immunized with the nucleoprotein of Reston Ebola virus and fused with myeloma cells to produce a hybridoma. Using the epitope consisting of the sequence region, a hybridoma producing an antibody specific to the Reston Ebola virus is selected from the hybridomas of (a). (C) Monoclonal antibodies produced by the selected hybridomas are purified.