JP2004309303A - Analysis method of protein kinase activity - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for conveniently detecting the phosphorylation of a protein kinase substrate fixed on a chip. <P>SOLUTION: The method detects phosphorylation of peptides on an array of which is to be at least a single kind of protein kinase matrix, in which at least one peptide is fixed on a metal film of a substrate. The analysis method of protein kinase activity makes a chelate compound, especially a compound expressed by Formula 1 to act and analyzes interaction by using surface plasmon resonance (SPR), when phosphorylation is detected. The dynamic states of the various protein kinases can be very conveniently and quickly analyzed without a special technology, a marker such as a fluorescent material, a radioactive material, or the like when SPR is used. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

項５．前記ペプチドがｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーからなる群から選ばれる少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質である項１〜４のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
項６．各々が別々のプロテインキナーゼの基質である、少なくとも２種のペプチドが金属薄膜上に固定化されてなるアレイを用いる項１〜５のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
項７．少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイ上のペプチドにプロテインキナーゼを含み得る供試材料及びヌクレオシド三リン酸を作用させ、リン酸化された前記ペプチドを検出することを特徴とする項１〜６のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
項８．リン酸化されたペプチドを表面プラズモン共鳴を利用して検出することを特徴とする項１〜７のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
項９．リン酸化されたペプチドを表面プラズモン共鳴イメージング法により検出することを特徴とする項８に記載の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明における基板上のリン酸化ペプチドの検出方法としては、従来からよく知られているような放射性物質、蛍光性物質、化学発光性物質などの標識化合物を利用して行うことが可能である。しかしながら、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、楕円偏光法（以下、エリプソメトリと示す。）、和周波発生（以下、ＳＦＧと示す。）分光測定などの光学的検出方法を適用するのがより好ましい。なかでもＳＰＲは位相差を求める必要がなく、反射光強度を求めるだけで、表面のｎｍオーダーの膜厚変化を求めることができるため特に好ましい。ＳＰＲイメージング法は広い範囲の観察が可能であり、アレイフォーマットでの物質相互作用観察が可能であるためさらに好ましい。
【００１０】
ペプチドのリン酸化は、プロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸、例えばＡＴＰを本発明のアレイ上に適用して行うことができる。例えば、バッファー中にプロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸を加え、１０〜４０℃程度の温度で、好ましくは３０〜４０℃の温度で、１０分〜６時間程度、好ましくは３０〜１時間程度反応させることで、ペプチドをリン酸化することができる。必要に応じて、リン酸化の反応溶液には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ^２＋，Ｃａ^２＋などのリン酸化を補助する物質を共存させるのがよい。
【００１１】
動態のプロファイリングの対象となるプロテインキナーゼとしては、蛋白質のチロシン、セリン、トレオニン、ヒスチジンなどのアミノ酸の側鎖をリン酸化する酵素が挙げられ、例えばｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーなどが例示できる。
【００１２】
本発明において、ペプチドはプロテインキナーゼの動態を網羅的にプロファイリングすることが目的であるので、１種類のペプチドは１種類のプロテインキナーゼによってのみリン酸化され、他のプロテインキナーゼによってはリン酸化されないのが好ましい。例えばＰＫＡの基質としては配列番号１のペプチドが例示され、ＭＡＰＫの基質としては配列番号２のペプチドが例示される。また、ｃ−Ｓｒｃ系チロシンキナーゼであるｐ６０の基質としては配列番号３のペプチドが例示される。ＰＫＡ、ＭＡＰＫ、ｐ６０を含むプロテインキナーゼの基質となるペプチド配列は公知であるか、公知の配列に基づき適宜選択することが可能である。本発明のアレイがその動態の把握を必要とする複数のプロテインキナーゼの種類に対応した種類のペプチドを固定化していれば、１枚のアレイで全てのプロテインキナーゼのプロファイリングをすることができ好ましい。もちろん１つのアレイに１種のみのプロテインキナーゼに対応するペプチドを固定化し、必要な数のアレイを使用してプロテインキナーゼのプロファイリングを行ってもよい。
【００１３】
エリプソメトリは試料に光を照射し、薄膜の表面で反射した光と、薄膜の裏面で反射してきた光の干渉によって生じる偏向状態の変化から、膜厚、屈折率を測定できる。すなわち、ｐ偏光とｓ偏光の光に対する反射率の絶対値の比及び位相変化の比を評価する手段である。なかでも波長を変えながらエリプソメトリを測定する分光エリプソメトリは非常に敏感に表面の膜厚変化が検出できるため好ましい。
【００１４】
ＳＦＧは２次の非線形光学効果の一種であり、周波数の異なる２種類の入射光（周波数ω１ と周波数ω２）が媒質中で混合され、ω１＋ω２、あるいはω１−ω２の光が発生する現象である。特にω１として可視光を用い、ω２として波長可変の赤外光を用いると赤外分光に類似した振動分光を行うことができる。この手法は表面選択性が良いため単分子膜レベルの分子の振動分光が可能であり、非常に敏感な表面解析方法として有用である。
【００１５】
上述したように、特に好ましい１つの実施形態において、本発明はＳＰＲを用いて種々のプロテインキナーゼ活性を網羅的に解析することが特に好ましい。ＳＰＲは金属に照射する偏光光束によってエバネッセント波が生じて表面ににじみだし、表面波である表面プラズモンを励起し、光のエネルギーを消費して反射光強度を低下させる。反射光強度が著しく低下する共鳴角は金属の表面に形成される層の厚みによって変化する。よって、金属の表面に調べられるべき物質あるいは物質の集合体を固定化し、サンプル中の物質あるいは物質の集合体との相互作用を共鳴角の変化、あるいはある角度での反射光強度の変化で検出可能である。したがって、ＳＰＲは蛍光物質、放射性物質などによるラベルが不要であり、しかもリアルタイム評価が可能な定量法として有用である。
【００１６】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。
【００１７】
ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１においてその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００１８】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００１９】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。
【００２０】
ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００２１】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ^２に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００２２】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。
【００２３】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。
【００２４】
光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００２５】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００２６】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎ_Ｄは１．５以上であることが好ましい。
【００２７】
金属薄膜を構成する金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、これらを単独であるいは組み合わせて用いてもよいが、なかでも金を用いるのが特に好ましい。金属薄膜の形成方法は特に限定されるものではないが、公知の手法として例えば蒸着法、スパッタ法、イオンコーティング法などが挙げられる。なかでも蒸着による方法が好ましい。また、金属薄膜の厚みは１０〜３０００Å程度が好ましく、１００〜６００Å程度がより好ましい。
【００２８】
本発明の１つの特に好ましい具体例は、金属を蒸着した基板上にプロテインキナーゼの基質となるペプチドが少なくとも１種、好ましくは複数種のペプチドが固定化されてなるアレイを用い、且つ該アレイに細胞破砕液等のキナーゼを含有する溶液を作用させ、さらにキレート化合物を作用させてそれらの相互作用の様子を特にＳＰＲないしはＳＰＲイメージング法により検出することを特徴とする。本発明においてプロテインキナーゼの基質となるペプチドとは、該プロテインキナーゼによりリン酸化反応を受ける性質を有するペプチドをいうものである。
【００２９】
ペプチドの長さは特に限定されないが、一般的には１００アミノ酸残基以下のものが用いられる。好ましくは５〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１０〜２５アミノ酸残基程度からなるものが用いられる。ペプチドは公知の手法に基づく化学的な合成により得られたペプチドであってもよいし、あるいは遺伝子工学的な手法により生産されたペプチドを用いてもよい。また基板への脱着を容易にするために、上記ペプチドの片末端において、ビオチンや、チオール基を有するシステイン残基を付加させたものや、あるいはオリゴヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような一般的によく用いられるタグを付加させたものを用いるのも有用である。
【００３０】
上記ペプチドの金属薄膜への固定化の方法は、特に限定されるものではないが、金属薄膜表面に固定化しやすいような官能基を予め導入しておいて基質ペプチドを固定化処理するのがより好ましい。該官能基としては、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、アルデヒド基などが挙げられる。これらの官能基を金属薄膜表面に導入するには、一般的に用いられているアルカンチオールの誘導体を用いるのが好ましい。
【００３１】
その際に、Ｊ．Ｍ．ＢｒｏｃｋｍａｎらによりＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． 第１２１巻、第８０４４〜８０５１頁（１９９９年）において報告されているような方法に基づいて、アルカンチオール層を介して固定化し、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によりバックグラウンドを修飾する方法を用いてもよい。また、非特異的な影響をより抑えるために、ＰＥＧの末端に上述のような官能基が導入された誘導体をアルカンチオールに結合させた後に、ペプチドを固定化することも、スペーサー効果を奏する点で有用である。
【００３２】
具体的には、例えば金属薄膜にカルボキシメチルデキストランあるいはカルボキシル基で末端が修飾されたＰＥＧのような水溶性高分子を結合させて表面にカルボキシル基を導入して、ＥＤＣ（１−エチル−３，４−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）のような水溶性カルボジイミドを用いてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステルとして、活性化されたカルボキシル基にペプチドもしくは蛋白質のアミノ基を反応させる方法が挙げられる。あるいは表面をマレイミドにより修飾した後、システインのようなチオール基を含むアミノ酸残基を介して固定化してもよい。この場合のシステイン残基はペプチドの一方の末端に付加されてなるのが好ましい。非特異的な影響を低減させるためには、後者のチオール基を介した固定化方法がより好ましいが、特に限定されるものではない。
【００３３】
上述したＨｉｓ−ｔａｇやＧＳＴのようなタグを付加したペプチドを固定化する方法も非常に簡便で有用である。この場合には、上述のように金属表面にアルカンチオールを介してアミノ基やカルボキシル基を導入した後に、それぞれＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、グルタチオンを金属薄膜上に導入させておくのがよい。Ｈｉｓ−ｔａｇの場合は、ＮＴＡを導入したアレイを塩化ニッケルにより処理した後で基質を固定化する。
【００３４】
本発明においては、アレイ上における基質のリン酸化を特異的に感度よくモニターするためにキレート化合物を用いる。キレート化合物とは一般に多座配位子ないしキレート試薬が金属イオンに配位して生じた錯体をいうものを指すが、特にリン酸に選択的かつ可逆的に結合する性質を有する化合物が好ましく、ポリアミン亜鉛錯体を用いることがより好ましい。ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いることが更に好ましい。更に、二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体を用いることがより好ましい。
【００３５】
このような化合物の典型としては、式（Ｉ）に示されるような、１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ） ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし、プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛２価イオンの架橋配位子になっている）が挙げられるが、本発明は特にこの化合物に限定されるものではない。
【００３６】
【化３】

【００３７】
本発明で用いられる錯体は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能であるが、市販の化合物を原料としても合成することができる。例えば、上記式（Ｉ）で示される化合物（Ｚｎ_２Ｌ）は、市販の１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンと酢酸亜鉛を原料として次の方法により合成することができる。
１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパン４．４ｍｍｏｌのエタノール溶液（１００ｍｌ）に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４４ｍｌ）を加え、次いで酢酸亜鉛二水和物（９．７ｍｍｏｌ）を加える。溶媒を減圧留去することにより褐色のオイルを得ることができる。この残渣に水１０ｍｌを加えて溶解後、１Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（３当量）を７０℃に加温しながら滴下して加え、析出する無色の結晶を濾取し、加熱乾燥することにより式（Ｉ）の構造式で表される酢酸イオン付加体の二過塩素酸塩（Ｚｎ_２Ｌ−ＣＨ_３ＣＯＯ⁻・２ＣｌＯ_４ ⁻・Ｈ_２Ｏ）を高収率で得ることができる。この結晶は一分子の結晶水を含んでいる。
【００３８】
元素分析、核磁気共鳴分析、および赤外線分析により上記化学構造を確認することができる。下記にそのデータの事例を示す。
元素分析の理論値・・・Ｃ_２９Ｈ_３４Ｃｌ_２Ｎ_６Ｏ_１２Ｚｎ_２： Ｃ， ４０．４９； Ｈ， ３．９８； Ｎ， ９．７７
元素分析の実測値・・・Ｃ， ４０．４３； Ｈ， ３．８６； Ｎ， ９．８５
^１Ｈ ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）の結果
δ２．０４ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ １２．１ ａｎｄ １２．３ Ｈｚ， ＣＣＨＮ）， ２．５３ （３Ｈ， ｓ， ＣＨ_３）， ３．０６ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ １２．１ ａｎｄ １２．３ Ｈｚ， ＣＣＨＮ）， ３．７４ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， ＣＣＨＣ）， ４．０２ − ４．３４ （８Ｈ， ｍ， ＡｒＣＨ_２）， ７．５４ − ７．６５ （８Ｈ， ｍ， ＡｒＨ）， ８．０６ − ８．１２ （４Ｈ， ｍ， ＡｒＨ）， ８．５８ （４Ｈ， ｍ， ＡｒＨ）
^１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）の結果
δ５８．０， ６０．１， ６２．０， ６４．６， １２２．７， １２４．３， １２４．４， １２４．４， １３９．９， １４０．４， １４７．０， １４７．２， １５４．７， １５５．１
赤外線分析の結果
１６０９， １５７６， １５５６（Ｃ＝Ｏ）， １４８５， １４３９， １２６６， １１０８（ＣｌＯ_４ ⁻）， １０９０（ＣｌＯ_４ ⁻）， ７７０， ６２５ ｃｍ^−１
上記のデータは、式（Ｉ）の化合物に対して酢酸イオンが１当量と過塩素酸イオンが２当量をカウンターイオンとしてもつ物質であることを示している。
【００３９】
なお、本発明において作用されるキレート化合物の溶液濃度は特に限定されないが、通常０．００１〜１０Ｍ、特に０．０１〜１Ｍの範囲とすることが好ましい。
【００４０】
また、上記プロテインキナーゼとしては、種々のチロシンキナーゼあるいはセリン／スレオニンキナーゼが挙げられる。これらプロテインキナーゼの種類については特に限定されるものではなく、基本的にはあらゆる種類のプロテインキナーゼに対して適用することが可能である。
【００４１】
こうしたキレート化合物は上述したような方法により非常に安価に合成することができる点で有利である。また常温により保存ができる点でも使いやすい。またリン酸化されるアミノ酸残基の種類に関係なく作用をすることや、リン酸化されたアミノ酸の近傍におけるアミノ酸配列に対して反応が依存しない点において、特に抗体を用いて検出する方法と比較して大きな優位性を有している。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例を挙げることにより、本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１：ペプチドアレイの作製
まず、金を蒸着させたガラス板（大阪真空工業株式会社製ＬＡＫ−１０；サイズ：１８ｍｍ×１８ｍｍ×１ｍｍ、コート内容：１層目 クロム２０Å、２層目金４５０Å；屈折率１．７２）を、１ｍＭ濃度のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ（日本油脂製）のエタノール溶液２０ｍｌ中に２時間浸漬させた。このガラス板をエタノール、水の順で洗浄し、乾燥後、上記ガラス板の上にフォトマスクを載せて固定し、紫外線照射（ウシオ電機製Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｏｄｕｌｅｘ ＳＸ−ＵＩ５００Ｈを使用；５００ワット）を２時間行った。フォトマスクは一辺５００μｍの正方形の穴が１６個有し（４個×４個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。紫外線照射終了後エタノールによりガラス板を洗浄して、さらに１ｍＭＭＯＡＭ（８−ａｍｉｎｏ−１−ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；同仁化学製）のエタノール溶液２０ｍｌ中に１．５時間浸漬して、アレイ表面にアミノ基を導入した。
【００４４】
上記の処理を施されたガラス板上に、１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量３４００；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ製）溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌを含む）に溶解した。）２００μｌを載せて室温で２時間静置させた。このガラス板をエタノール、水の順で洗浄して乾燥後、上記ガラス板上に形成されたフォトパターン上に１０ｎｌずつスポットした。スポットに用いたペプチド溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌを含む）に溶解した。）は１００μｇ／ｍｌ濃度とした。スポッティングに際してはニチリョー製ＤＮＡ−ＧＲを用いた。基質ペプチドとしては、配列表・配列番号３（ｐ６０の基質となる。）に示されるアミノ酸配列からなる合成ペプチド及び配列番号３のアミノ酸配列中６番目のチロシン残基がリン酸化されている合成ペプチドを用いた。おのおのの基質の固定化パターンは図２に示した通りで行った。このようにペプチド溶液がスポットされたガラス板をウェットな環境下において室温で終夜静置して反応させた。こうしてキナーゼの基質ペプチドが固定化されたアレイを調製した。
【００４５】
実施例２：ＳＰＲ解析（１）
実施例１において調製したペプチドアレイを水、エタノールで洗浄して乾燥後、ＳＰＲ装置（ＧＷＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．製ＳＰＲｉｍａｇｅｒ）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーとしては、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ランニングバッファーの送液は、プランンジャーポンプ（フロム製Ｍｏｄｅｌ−０２１）を用いた。温度は３０℃に設定して行った。式（Ｉ）の化合物（以下、フォスタグと示す）を１ｍＭ濃度でランニングバッファーに溶解して、アレイに作用させた。結果は図３に示す通りである。リン酸化ｐ６０基質のスポットにおいてのみ特異的なＳＰＲシグナルが確認され、非リン酸化ｐ６０基質のスポットではシグナルはほとんど確認されなかった。
【００４６】
また、図２にＳＰＲイメージングを行った結果を示した。これは実施例２におけるＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによる画像の取り込みを５秒ごとに行い、フォスタグ反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を、画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行った結果である。リン酸化ｐ６０基質の固定化された箇所にのみスポットが認められており、フォスタグが特異的に結合していることが確認される。
【００４７】
実施例３：ＳＰＲ解析（２）
実施例１と同様にして、配列表・配列番号１（ＰＫＡの基質となる。）に示されるアミノ酸配列からなり８番目のセリン残基がリン酸化されている合成ペプチド、配列表・配列番号２（ＭＡＰＫの基質となる。）に示されるアミノ酸配列からなり１１番目のセリン残基がリン酸化されている合成ペプチド、及び配列表・配列番号３（ｐ６０の基質となる。）に示されるアミノ酸配列からなり６番目のチロシン残基がリン酸化されている合成ペプチドを固定化したアレイを調製した。おのおのの固定化のパターンは図４に示す通りである。このアレイを用いて作用させるフォスタグ濃度を０．１ｍＭとした以外は実施例２と同様にしてＳＰＲ解析及びＳＰＲイメージングを行った。ＳＰＲ解析の結果を図５に、ＳＰＲイメージングの結果を図４に示した。いずれのリン酸化基質においてもフォスタグによるＳＰＲシグナルの上昇が確認された。また、ＳＰＲイメージングにおいては、いずれのリン酸化基質においても、フォスタグの結合が確認されている。
【００４８】
【発明の効果】
上述したように、本発明の方法により、特殊な技術を要することもなく、また特にＳＰＲを用いた場合には、蛍光性物質、放射性物質等の標識を用いる必要もなく、非常に簡便で迅速に様々なプロテインキナーゼ動態の解析を行うことが可能となった。キレート化合物を用いることにより、安価で取り扱いも容易であるうえに、リン酸化アミノ酸の種類やその近傍のアミノ酸配列による影響も受けない点でも従来の方法と比べて大きな優位性がある。本発明を利用することにより、特に多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。
【００４９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において用いられる表面プラズモン共鳴イメージング装置の一例を示す図である。
【図２】実施例１においてアレイ上に基質ペプチドを固定化したパターン及び実施例２においてＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図３】実施例２において、ＳＰＲ解析を行った結果である。
【図４】実施例３において、アレイ上に基質ペプチドを固定化したパターン及びＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図５】実施例３において、ＳＰＲ解析を行った結果である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for analyzing protein kinase activity using an array in which one or a plurality of types of peptides recognizing protein kinase are immobilized on a metal substrate. The present invention relates to a method for detecting phosphorylation by acting a compound. Particularly, by using an analysis technique based on surface plasmon resonance (hereinafter sometimes referred to as SPR), rapid, efficient and simple analysis of protein kinase activity can be realized. More specifically, a novel method for analyzing protein kinase activity using surface plasmon resonance imaging (hereinafter sometimes referred to as SPR imaging) that monitors the state of interaction between substances analyzed by SPR. It is.
[0002]
[Prior art]
In recent years, research on intracellular signal transduction has progressed dramatically, not only how signals are transmitted to nuclei from cell surface receptors activated by growth factors and cytokines, but also cell cycle, adhesion, The actual state of various signal transduction pathways controlling movement, polarity, morphogenesis, differentiation, life and death, etc. has been revealed. These signaling pathways do not function independently, but cross-talk with each other and function as a system. The causes of various diseases including cancer have been described as abnormalities in these signal transduction pathways.
[0003]
It is known that various types of protein kinases play an important role in the above-mentioned signal transduction pathways in a complicatedly related manner. If we could comprehensively analyze the activity of these protein kinases and profile their intracellular dynamics at once, we would not only be able to perform basic research in cell biology and pharmacy, but also in fields such as drug development and clinical application. It is expected to make a significant contribution. However, a technique that can simultaneously and easily profile the kinetics of various protein kinases has not yet been established so far.
[0004]
As a related technique already reported, for example, it has been reported that the activity of c-Src kinase, which is a kind of tyrosine kinase, was evaluated using a peptide array (for example, see Non-Patent Document 1). In addition, for p60 tyrosine kinase, protein kinase A (hereinafter also referred to as PKA), etc., a phosphorylation detection system using a fluorescently labeled antibody using an array in which each substrate peptide is immobilized on a glass slide. (For example, see Non-Patent Documents 2 and 3) or an example of a system for detecting a kinase reaction on an array using a radioactive substance ([γ ³² P] ATP) (for example, Non-Patent Documents 4, 5 and 6). However, none of the prior arts discloses a sufficient technique as a method for simultaneously and efficiently profiling the kinetics of various protein kinases. Further, in any of the above methods, it is necessary to use a fluorescent substance or a radioactive substance, and there are significant problems in that analysis requires time and effort, handling is difficult, and special techniques and facilities are required.
[0005]
[Non-patent document 1]
Benjamin T. Houseman et al., Nature Biotechnology, Volume 20, pages 270-274 (issued March 2002).
[Non-patent document 2]
Bioorganic & Medical Chemistry Letters, Vol. 12, pp. 2085-2088 (published in 2002)
[Non-Patent Document 3]
Bioorganic & Medical Chemistry Letters, Vol. 12, pp. 2079-2083 (published in 2002)
[Non-patent document 4]
Current Opinion in Biotechnology Volume 13, pp. 315-320 (issued in 2002)
[Non-Patent Document 5]
The Journal of Biological Chemistry Volume 277, 27839-27849 (published in 2002)
[Non-Patent Document 6]
Science Vol. 289, pp. 1760-1763 (2000)
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a method for comprehensively profiling the dynamics of various protein kinases, particularly by detecting phosphorylation of a substrate peptide using an inexpensive substance by a simple method that does not require a special technique and that is rapid. Is to establish.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in view of the above circumstances, and after performing phosphorylation by protein kinase using an array in which a peptide that recognizes protein kinase is immobilized on a metal-deposited substrate, When a chelate compound is acted on, it is extremely useful to detect the interaction between substances on the array by SPR imaging, in particular, in order to rapidly and particularly comprehensively analyze various protein kinase kinetics. The inventors have found that the present invention has been achieved.
[0008]
That is, the present invention has the following configuration.
Item 1. A method for detecting phosphorylation of an at least one peptide serving as a substrate of at least one protein kinase on an array in which at least one corresponding peptide is immobilized on a metal thin film on a substrate. A method for analyzing protein kinase activity, comprising allowing a chelate compound to act.
Item 2. Item 2. The method for analyzing protein kinase activity according to Item 1, wherein a polyamine zinc complex is used as the chelate compound.
Item 3. Item 3. The method for analyzing protein kinase activity according to Item 1 or 2, wherein a binuclear zinc complex having a polyamine compound as a ligand is used as the chelate compound.
Item 4. Item 4. The method for analyzing protein kinase activity according to any one of Items 1 to 3, wherein the compound represented by the formula (I) is used as a chelate compound.
Embedded image

Item 5. The peptide is a cGMP-dependent protein kinase family, a cAMP-dependent protein kinase (PKA) family, a myosin light chain kinase family, a protein kinase C (PKC) family, a protein kinase D (PKD) family, a protein kinase B (PKB) family; Item 5. The protein according to any one of Items 1 to 4, which is a substrate of at least one kind of protein kinase selected from the group consisting of a protein kinase family belonging to a MAP kinase (MAPK) cascade, a Src tyrosine kinase family, and a receptor tyrosine kinase family. Method for analyzing kinase activity.
Item 6. Item 6. The method for analyzing protein kinase activity according to any one of Items 1 to 5, using an array in which at least two kinds of peptides each being a separate protein kinase substrate are immobilized on a metal thin film.
Item 7. A test material capable of containing protein kinase and nucleoside triphosphate are allowed to act on a peptide on an array in which at least one corresponding peptide serving as a substrate of at least one protein kinase is immobilized on a metal thin film on a substrate. Item 7. The method for analyzing protein kinase activity according to any one of Items 1 to 6, wherein the phosphorylated peptide is detected.
Item 8. Item 8. The method for analyzing protein kinase activity according to any one of Items 1 to 7, wherein the phosphorylated peptide is detected by utilizing surface plasmon resonance.
Item 9. Item 9. The method according to item 8, wherein the phosphorylated peptide is detected by surface plasmon resonance imaging.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described specifically.
The method for detecting a phosphorylated peptide on a substrate in the present invention can be performed using a labeling compound such as a radioactive substance, a fluorescent substance, and a chemiluminescent substance which are well known in the art. However, it is more preferable to apply an optical detection method such as surface plasmon resonance (SPR), ellipsometry (hereinafter, referred to as ellipsometry), and sum frequency generation (hereinafter, referred to as SFG) spectrometry. Above all, SPR is particularly preferable because it is not necessary to obtain a phase difference, and it is possible to obtain a change in film thickness on the order of nm on the surface only by obtaining reflected light intensity. The SPR imaging method is more preferable because it can observe a wide range and can observe substance interaction in an array format.
[0010]
Phosphorylation of the peptide can be performed by applying a test sample that may have protein kinase and a nucleoside triphosphate, for example, ATP, onto the array of the present invention. For example, a test sample which may have protein kinase in a buffer and a nucleoside triphosphate are added, and at a temperature of about 10 to 40 ° C, preferably at a temperature of 30 to 40 ° C, for about 10 minutes to 6 hours, preferably The peptide can be phosphorylated by reacting for about 30 to 1 hour. If necessary, a phosphorylation reaction solution may contain a substance that assists phosphorylation, such as cAMP, cGMP, Mg ²⁺ , and Ca ²⁺ .
[0011]
Kinase profiling protein kinases include enzymes that phosphorylate the side chains of amino acids such as tyrosine, serine, threonine, and histidine of proteins. For example, cGMP-dependent protein kinase family, cAMP-dependent protein kinase ( PKA) family, myosin light chain kinase family, protein kinase C (PKC) family, protein kinase D (PKD) family, protein kinase B (PKB) family, protein kinase family belonging to the MAP kinase (MAPK) cascade, Src tyrosine kinase family And the receptor tyrosine kinase family.
[0012]
In the present invention, the purpose of a peptide is to comprehensively profile the kinetics of protein kinase, so that one kind of peptide is phosphorylated only by one kind of protein kinase, and is not phosphorylated by another kind of protein kinase. preferable. For example, the PKA substrate is exemplified by the peptide of SEQ ID NO: 1, and the MAPK substrate is exemplified by the peptide of SEQ ID NO: 2. Further, the substrate of p60, which is a c-Src tyrosine kinase, is exemplified by the peptide of SEQ ID NO: 3. Peptide sequences that serve as substrates for protein kinases including PKA, MAPK, and p60 are known or can be appropriately selected based on known sequences. If the array of the present invention has immobilized peptides of a type corresponding to a plurality of types of protein kinases whose dynamics need to be grasped, profiling of all protein kinases can be performed with one array, which is preferable. Of course, a peptide corresponding to only one type of protein kinase may be immobilized on one array, and protein kinase profiling may be performed using a required number of arrays.
[0013]
Ellipsometry irradiates a sample with light, and can measure a film thickness and a refractive index from a change in a deflection state caused by interference between light reflected on the front surface of the thin film and light reflected on the back surface of the thin film. That is, it is a means for evaluating the ratio of the absolute value of the reflectance and the ratio of the phase change to the p-polarized light and the s-polarized light. Above all, spectroscopic ellipsometry, in which ellipsometry is measured while changing the wavelength, is preferable because a change in film thickness on the surface can be detected very sensitively.
[0014]
SFG is a kind of second-order nonlinear optical effect, and is a phenomenon in which two types of incident light (frequency ω1 and frequency ω2) having different frequencies are mixed in a medium to generate light of ω1 + ω2 or ω1-ω2. In particular, when visible light is used as ω1 and variable wavelength infrared light is used as ω2, vibrational spectroscopy similar to infrared spectroscopy can be performed. Since this method has good surface selectivity, vibration spectroscopy of molecules at the monomolecular film level is possible, and is useful as a very sensitive surface analysis method.
[0015]
As described above, in one particularly preferred embodiment, it is particularly preferred that the present invention comprehensively analyze various protein kinase activities using SPR. In the SPR, an evanescent wave is generated by a polarized light beam irradiated on a metal, and oozes on the surface, excites surface plasmons, which are surface waves, and consumes light energy to reduce the intensity of reflected light. The resonance angle at which the intensity of the reflected light is significantly reduced depends on the thickness of the layer formed on the surface of the metal. Therefore, the substance or substance aggregate to be examined is immobilized on the metal surface, and the interaction with the substance or substance aggregate in the sample is detected by the change in the resonance angle or the change in the reflected light intensity at a certain angle. It is possible. Therefore, SPR does not require a label with a fluorescent substance, a radioactive substance, or the like, and is useful as a quantitative method capable of real-time evaluation.
[0016]
The SPR imaging method using SPR is a method of irradiating a polarized light beam over a wide area and analyzing the reflected image to monitor the state of interaction between substances by making full use of image processing technology and the like. It is possible to screen a chip on which a plurality of substances are immobilized, and to observe the morphology of an object adsorbed on the surface with high sensitivity.
[0017]
In the SPR imaging method, a means for irradiating a chip with a polarized light beam over a wide area in order to analyze a reflected image and ensuring sufficient illuminance of the light beam is required. One example is shown in FIG. It is more preferable that the illuminance of the polarized light beam is higher because the sensitivity of the sensor increases.
[0018]
Although the type of the light source is not particularly limited, it is preferable to use light including near-infrared light whose change in the SPR resonance angle is particularly sensitive. Specifically, a white light source that can irradiate light over a wide range, such as a metal halide lamp, a mercury lamp, a xenon lamp, a halogen lamp, a fluorescent lamp, and an incandescent lamp, can be used. A halogen lamp which is sufficiently high, has a simple light power supply device and is inexpensive is particularly preferable.
[0019]
An ordinary white light source has a drawback in that light and darkness unevenness occurs in a filament portion. When the light from the light source is irradiated as it is, unevenness in brightness and darkness occurs in an image obtained by reflection, making it difficult to evaluate screening and morphological changes. Therefore, as a means for uniformly irradiating the chip with light, a method of passing light through a pinhole and then converting the light into parallel light is preferable.
[0020]
The means for passing through the pinhole is preferable as a means for obtaining a light beam having a uniform brightness, but there is a disadvantage that the illuminance is reduced if the light passes through the pinhole as it is. Therefore, as a means for securing sufficient illuminance, it is preferable to use a method in which a convex lens is provided between the pinhole and the light source, and light is collected and passed through the pinhole.
[0021]
Since the white light source is emitted light, it is necessary to use a convex lens to convert the white light into parallel light before focusing. By installing a light source near the focal length of the convex lens, parallel light can be obtained. By installing another convex lens and installing a pinhole near the focal length of the lens, it is possible to pass the condensed light through the pinhole. The light crossing and passing through the pinhole is converted into parallel light by a CCTV lens for a camera, and the cross-sectional area of the parallel light flux obtained at that time is preferably adjusted to 10 to 1000 mm ² . This method enables a wide range of screening and morphology observation.
[0022]
When monitoring the interaction, the polarized light beam is irradiated on the opposite surface of the metal thin film on which the substance or the aggregate of the substance is immobilized. The polarized light beam is applied to the opposite surface of the metal thin film on which the substance or the aggregate of the substance is immobilized, and the reflected light beam is obtained. The light beam reflected from the metal thin film passes through a near-infrared wavelength light interference filter, passes only light near a certain wavelength, and is photographed by a CCD camera.
[0023]
The center wavelength of the optical interference filter is preferably from 600 to 1000 nm, at which the sensitivity of SPR is high. The wavelength width of the wavelength at which the transmittance of the optical interference filter is half of the maximum value is called the half-value width. The smaller the half-value width is, the sharper the wavelength distribution becomes, and more specifically, the more preferable is the half-value width of 100 nm or less.
[0024]
An image captured by a CCD camera through an optical interference filter is captured by a computer, and a change in brightness of a certain portion can be evaluated in real time, and an entire image can be evaluated by image processing. In this way, it is possible to screen a chip on which a plurality of substances are immobilized, and to observe the morphology of an object adsorbed on the surface with high sensitivity.
[0025]
The SPR chip used in the present invention is preferably formed of a metal substrate having a metal thin film formed on a transparent substrate, and directly or indirectly, chemically or physically, forming a substance or substance on the metal thin film. A slide on which the aggregate is fixed is used. The material of the substrate is not particularly limited, but it is preferable to use a transparent material. Specific examples include glass and plastics such as polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, and acrylic. Among them, glass is particularly preferred.
[0026]
The thickness of the substrate is preferably about 0.1 to 20 mm, more preferably about 1 to 2 mm. In order to achieve the purpose of evaluating the reflection image from the metal thin film, the SPR resonance angle should be as small as possible, so that the captured image does not have a risk of shaking and the analysis is easy. Accordingly, the refractive index n _D of the prism in contact therewith and the transparent substrate or the transparent substrate is preferably 1.5 or more.
[0027]
Examples of the metal constituting the metal thin film include gold, silver, copper, aluminum, and platinum. These may be used alone or in combination, but among them gold is particularly preferable. The method for forming the metal thin film is not particularly limited, but known methods include, for example, an evaporation method, a sputtering method, and an ion coating method. Above all, a method by vapor deposition is preferable. Further, the thickness of the metal thin film is preferably about 10 to 3000 °, more preferably about 100 to 600 °.
[0028]
One particularly preferred embodiment of the present invention uses an array in which at least one, preferably a plurality of peptides serving as protein kinase substrates are immobilized on a metal-deposited substrate, and A solution containing a kinase such as a cell lysate is acted on, and a chelate compound is acted on to detect the state of the interaction, particularly by SPR or SPR imaging. In the present invention, a peptide serving as a substrate for a protein kinase refers to a peptide having a property of undergoing a phosphorylation reaction by the protein kinase.
[0029]
The length of the peptide is not particularly limited, but generally a peptide having 100 amino acid residues or less is used. Preferably, those having about 5 to 60 amino acid residues, more preferably about 10 to 25 amino acid residues are used. The peptide may be a peptide obtained by chemical synthesis based on a known technique, or a peptide produced by a genetic engineering technique may be used. In order to facilitate desorption to the substrate, biotin or a cysteine residue having a thiol group is added to one end of the peptide, or oligohistidine (His-tag), glutathione-S-transferase It is also useful to use a tag to which a commonly used tag such as (GST) is added.
[0030]
The method of immobilizing the peptide on the metal thin film is not particularly limited, but it is more preferable to preliminarily introduce a functional group that can be easily immobilized on the surface of the metal thin film and then immobilize the substrate peptide. preferable. Examples of the functional group include an amino group, a mercapto group, a carboxyl group, and an aldehyde group. In order to introduce these functional groups into the surface of the metal thin film, it is preferable to use a generally used alkanethiol derivative.
[0031]
At that time, J.I. M. Brockman et al. Am. Chem. Soc. Vol. 121, pp. 8044-8051 (1999), a method of immobilizing via an alkanethiol layer and modifying the background with PEG (polyethylene glycol) can also be used. Good. Further, in order to further suppress non-specific effects, immobilizing the peptide after binding a derivative having the above-described functional group introduced to the terminal of PEG to alkanethiol also has a spacer effect. Useful in
[0032]
Specifically, for example, a metal thin film is bonded to a water-soluble polymer such as carboxymethyl dextran or PEG whose terminal is modified with a carboxyl group to introduce a carboxyl group to the surface, and EDC (1-ethyl-3, As a ester of NHS (N-hydroxysuccinimide) using a water-soluble carbodiimide such as 4-dimethylaminopropylcarbodiimide), a method of reacting an activated carboxyl group with an amino group of a peptide or protein can be mentioned. Alternatively, after the surface is modified with maleimide, it may be immobilized via an amino acid residue containing a thiol group such as cysteine. In this case, the cysteine residue is preferably added to one end of the peptide. In order to reduce non-specific effects, the latter method of immobilization via a thiol group is more preferable, but is not particularly limited.
[0033]
The method of immobilizing a tagged peptide such as His-tag or GST described above is also very simple and useful. In this case, after introducing an amino group or a carboxyl group into the metal surface via the alkanethiol as described above, it is preferable to introduce NTA (nitrilotriacetic acid) and glutathione onto the metal thin film, respectively. In the case of His-tag, the array in which NTA is introduced is treated with nickel chloride, and then the substrate is immobilized.
[0034]
In the present invention, a chelate compound is used to specifically and sensitively monitor the phosphorylation of the substrate on the array. The chelate compound generally refers to a complex formed by coordination of a polydentate ligand or a chelating reagent to a metal ion, and is particularly preferably a compound having a property of selectively and reversibly binding to phosphoric acid, It is more preferable to use a polyamine zinc complex. It is more preferable to use a binuclear zinc complex having a polyamine compound as a ligand. Furthermore, it is more preferable to use a hexaamine binuclear zinc (II) complex having a binuclear zinc (II) complex as a basic structure.
[0035]
A typical example of such a compound is 1,3-bis [bis (2-pyridylmethyl) amino] -2-hydroxypropanolate (IUPAC name: 1,3-bis) as shown in the formula (I). Binuclear zinc complex having a polyamine compound having [bis (2-pyridylmethyl) amino] -2-propanolatodizinc (II) complex as a basic skeleton as a ligand (provided that a hydroxyl group of a propanol skeleton is an alcoholate and two zinc divalent compounds) But the present invention is not particularly limited to this compound.
[0036]
Embedded image

[0037]
The complex used in the present invention can be synthesized using a general chemical synthesis technique, but can also be synthesized using a commercially available compound as a raw material. For example, the compound (Zn ₂ L) represented by the above formula (I) can be obtained by the following method using commercially available 1,3-bis [bis (2-pyridylmethyl) amino] -2-hydroxypropane and zinc acetate as raw materials. Can be synthesized.
To a solution of 1,3-bis [bis (2-pyridylmethyl) amino] -2-hydroxypropane in 4.4 mmol of ethanol (100 ml) was added a 10 M aqueous sodium hydroxide solution (0.44 ml), and then zinc acetate dihydrate. (9.7 mmol) are added. By evaporating the solvent under reduced pressure, a brown oil can be obtained. After adding and dissolving 10 ml of water to the residue and adding dropwise a 1 M aqueous solution of sodium perchlorate (3 equivalents) while heating to 70 ° C., colorless crystals that precipitate are collected by filtration, and dried by heating to obtain a compound of the formula (I) two perchlorate acetate ion adduct ^{_{(Zn 2 L-CH 3 COO}} - · 2ClO 4 - · H 2 O) represented by the structural formula can be obtained in high yield. This crystal contains one molecule of water of crystallization.
[0038]
The chemical structure can be confirmed by elemental analysis, nuclear magnetic resonance analysis, and infrared analysis. An example of the data is shown below.
Theoretical value of elemental analysis: C ₂₉ H ₃₄ Cl ₂ N ₆ O ₁₂ Zn ₂ : C, 40.49; H, 3.98; N, 9.77
Actual measured value of elemental analysis: C, 40.43; H, 3.86; N, 9.85
¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) results δ 2.04 (2H, dd, J = 12.1 and 12.3 Hz, CCHN), 2.53 (3H, s, CH ₃ ), 3.06 (2H, dd, J = 12.1 and 12.3 Hz, CCNH), 3.74 (1H, t, J = 10.4 Hz, CCHC), 4.02-4.34 (8H, m, ArCH ₂ ), 7.54-7.65 (8H, m, ArH), 8.06-8.12 (4H, m, ArH), 8.58 (4H, m, ArH).
¹³ C NMR (125 MHz, DMSO-d ₆ ) results δ 58.0, 60.1, 62.0, 64.6, 122.7, 124.3, 124.4, 124.4, 139.9, 140 .4, 147.0, 147.2, 154.7, 155.1
Infrared analysis results 1609, 1576, 1556 (C = O), 1485, 1439, 1266, 1108 (ClO ₄ ⁻ ), 1090 (ClO ₄ ⁻ ), 770, 625 cm ⁻¹
The above data indicates that the compound of formula (I) is a substance having one equivalent of acetate ion and two equivalents of perchlorate ion as counter ions.
[0039]
In addition, the solution concentration of the chelate compound acted on in the present invention is not particularly limited, but is usually preferably in the range of 0.001 to 10M, particularly preferably in the range of 0.01 to 1M.
[0040]
Examples of the protein kinase include various tyrosine kinases or serine / threonine kinases. The type of these protein kinases is not particularly limited, and can be basically applied to all types of protein kinases.
[0041]
Such a chelate compound is advantageous in that it can be synthesized very inexpensively by the method described above. It is also easy to use because it can be stored at room temperature. Compared to the method using an antibody in particular, it works regardless of the type of amino acid residue to be phosphorylated, and does not depend on the amino acid sequence near the phosphorylated amino acid. Has a great advantage.
[0042]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not particularly limited to the examples.
[0043]
Example 1 Preparation of Peptide Array First, a gold-deposited glass plate (LAK-10 manufactured by Osaka Vacuum Industry Co., Ltd .; size: 18 mm × 18 mm × 1 mm, coat content: first layer of chrome 20 mm, second layer of 450 mm) ; 1.72) was immersed in a 20 mM ethanol solution of SUNBRIGHT MESH-50H (manufactured by NOF Corporation) at a concentration of 1 mM for 2 hours. This glass plate was washed with ethanol and water in that order, dried, and then fixed with a photomask placed on the glass plate, and irradiated with ultraviolet light (using an Optical Module SX-UI500H manufactured by Ushio Inc .; 500 watts) for 2 hours. went. The photomask has 16 square holes of 500 μm on a side (consisting of 4 × 4 patterns), and the pitch between the centers of the holes is designed to be 1 mm. After the irradiation with ultraviolet rays, the glass plate was washed with ethanol, and further immersed in 20 ml of an ethanol solution of 1 mM MOAM (8-amino-1-octanethiol, hydrochloride; Dojindo Chemical) for 1.5 hours to remove amino groups on the array surface. Introduced.
[0044]
The solution was dissolved in a 10 mg / ml NHS-PEG-MAL (molecular weight: 3400; manufactured by Shearwater) solution (pH 7.4, 10 mM phosphate buffer (containing 100 mM NaCl)) on the glass plate treated as described above. ) 200 μl was placed and allowed to stand at room temperature for 2 hours. The glass plate was washed with ethanol and water in that order, dried, and then spotted on the photo pattern formed on the glass plate in an amount of 10 nl. The peptide solution (dissolved in a 10 mM phosphate buffer (containing 100 mM NaCl) at pH 7.4) used for the spot had a concentration of 100 μg / ml. For spotting, DNA-GR manufactured by Nichiryo was used. As the substrate peptide, a synthetic peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (which is a substrate of p60) and a synthetic peptide having a phosphorylated tyrosine residue at position 6 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 Was used. The immobilization pattern of each substrate was as shown in FIG. The glass plate on which the peptide solution was spotted was allowed to react at room temperature overnight in a wet environment at room temperature. Thus, an array having the kinase substrate peptide immobilized thereon was prepared.
[0045]
Example 2: SPR analysis (1)
The peptide array prepared in Example 1 was washed with water and ethanol, dried and then set on an SPR device (SPRIimager manufactured by GWC Instruments Inc.) for analysis. As a running buffer, a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) was used. A running buffer was supplied using a plunger pump (Model-021 manufactured by From). The temperature was set at 30 ° C. A compound of the formula (I) (hereinafter referred to as a phosphotag) was dissolved in a running buffer at a concentration of 1 mM and allowed to act on an array. The results are as shown in FIG. A specific SPR signal was confirmed only in the phosphorylated p60 substrate spot, and almost no signal was confirmed in the non-phosphorylated p60 substrate spot.
[0046]
FIG. 2 shows the result of performing SPR imaging. In the SPR analysis in Example 2, an image was captured by a CCD camera every 5 seconds, and an image at a time before the reaction was converted from an image captured at a time after the phosphotag reaction to image operation processing software Scion. It is a result of performing a subtraction process using Image (manufactured by Scion Corp.). A spot was observed only at the position where the phosphorylated p60 substrate was immobilized, confirming that the phosphotag was specifically bound.
[0047]
Example 3: SPR analysis (2)
Synthetic peptide consisting of the amino acid sequence shown in Sequence Listing and SEQ ID NO: 1 (which serves as a substrate for PKA) in which the 8th serine residue is phosphorylated, Sequence Listing and SEQ ID NO: 2 in the same manner as in Example 1. (It becomes a substrate of MAPK.) A synthetic peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein the serine residue at position 11 is phosphorylated, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (which becomes a substrate of p60) An array was prepared in which a synthetic peptide comprising a synthetic peptide having a phosphorylation of the sixth tyrosine residue was immobilized. Each immobilization pattern is as shown in FIG. SPR analysis and SPR imaging were performed in the same manner as in Example 2 except that the concentration of the phosphotag to be acted on using this array was 0.1 mM. FIG. 5 shows the result of the SPR analysis, and FIG. 4 shows the result of the SPR imaging. In each phosphorylation substrate, an increase in the SPR signal by the phosphotag was confirmed. In addition, in SPR imaging, binding of a phosphotag was confirmed for any phosphorylated substrate.
[0048]
【The invention's effect】
As described above, according to the method of the present invention, no special technique is required, and particularly when SPR is used, there is no need to use a label such as a fluorescent substance or a radioactive substance, which is very simple and rapid. It has become possible to analyze various protein kinase dynamics. By using a chelate compound, it is inexpensive and easy to handle, and has a great advantage over conventional methods in that it is not affected by the type of phosphorylated amino acid or the amino acid sequence in the vicinity thereof. By utilizing the present invention, in particular, it is possible to comprehensively analyze various types of protein kinase signals, thereby effectively profiling protein kinase dynamics in a cell associated with introduction of a gene whose function is unknown or drug administration. be able to. This is expected to be applied to genomic drug discovery, such as functional analysis from new genes and approaches to drug discovery.
[0049]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an example of a surface plasmon resonance imaging apparatus used in the present invention.
FIG. 2 is a view showing a pattern in which a substrate peptide is immobilized on an array in Example 1 and a result of performing SPR imaging in Example 2.
FIG. 3 shows the result of performing SPR analysis in Example 2.
FIG. 4 is a diagram showing a pattern in which a substrate peptide is immobilized on an array and a result of performing SPR imaging in Example 3.
FIG. 5 shows the result of performing SPR analysis in Example 3.

Claims (9)

A method for detecting phosphorylation of an at least one peptide serving as a substrate of at least one protein kinase on an array in which at least one corresponding peptide is immobilized on a metal thin film of a substrate, the method comprising the steps of: A method for analyzing protein kinase activity, comprising allowing a chelate compound to act. The method for analyzing protein kinase activity according to claim 1, wherein a polyamine zinc complex is used as the chelate compound. The method for analyzing protein kinase activity according to claim 1 or 2, wherein a binuclear zinc complex having a polyamine compound as a ligand is used as the chelate compound. The method for analyzing protein kinase activity according to any one of claims 1 to 3, wherein the compound represented by the formula (I) is used as the chelate compound.

The peptide is a cGMP-dependent protein kinase family, a cAMP-dependent protein kinase (PKA) family, a myosin light chain kinase family, a protein kinase C (PKC) family, a protein kinase D (PKD) family, a protein kinase B (PKB) family; The substrate according to any one of claims 1 to 4, which is a substrate of at least one protein kinase selected from the group consisting of a protein kinase family belonging to a MAP kinase (MAPK) cascade, a Src tyrosine kinase family, and a receptor tyrosine kinase family. Method for analyzing protein kinase activity. The method for analyzing protein kinase activity according to any one of claims 1 to 5, wherein an array comprising at least two kinds of peptides, each of which is a separate protein kinase substrate, immobilized on a metal thin film is used. A test material and a nucleoside triphosphate, which may contain protein kinase, are allowed to act on a peptide on an array in which at least one corresponding peptide serving as a substrate of at least one protein kinase is immobilized on a metal thin film on a substrate. 7. The method for analyzing protein kinase activity according to claim 1, wherein the phosphorylated peptide is detected. The method for analyzing protein kinase activity according to any one of claims 1 to 7, wherein the phosphorylated peptide is detected using surface plasmon resonance. The method according to claim 8, wherein the phosphorylated peptide is detected by surface plasmon resonance imaging.

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