JP2004166652A

JP2004166652A - Feed for increasing the infection rate of recombinant virus to insects containing chitin synthesis inhibitor and method of inoculating recombinant virus using the feed

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Publication number: JP2004166652A
Application number: JP2002339228A
Authority: JP
Inventors: Toru Shinkawa; 徹新川; Yoji Furuta; 要二古田
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2002-11-22
Publication date: 2004-06-17

Abstract

【課題】大量の昆虫の組換えウイルスによる感染率を高める飼料の製造方法及び大量の昆虫に同時に経口的に組換えウイルスを接種させる方法を提供する。
【解決手段】昆虫用粉体人工飼料およびキチン合成阻害剤を含む、昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料。
【選択図】なしThe present invention provides a method for producing a feed for increasing the infection rate of a large amount of insects with a recombinant virus, and a method for inoculating a large amount of insects with the recombinant virus at the same time orally.
A feed for increasing the infection rate of a recombinant virus to insects, comprising a powder artificial feed for insects and a chitin synthesis inhibitor.
[Selection diagram] None

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫のウイルスに対する感染率を高める飼料の製造方法および該飼料を用いた効率的なウイルス接種方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子組換え技術を利用して、カイコで有用タンパク質を生産する技術が実用化されている。例えば、カイコ核多角体病ウイルスをベクターとして利用する方法がある（例えば、特許文献１および特許文献２を参照）。これらの方法は、カイコ核多角体病ウイルスの有する多角体遺伝子をインターフェロン等の他の有用物質をコードする遺伝子に置き換えて組換えウイルスを調製し、これを５齢カイコに接種して感染させ、４〜８日後に組換え体ウイルスが増殖の過程でカイコ細胞中で産生し、体液中に分泌した有用物質を採取、分離、精製するというものである。
【０００３】
このようなカイコを利用した遺伝子組換えの技術は、宿主となるカイコが、従来用いられている大腸菌や酵母と比べて遺伝的に人間に近いものであるため、産生有用物質の活性や抗原性の点等から好ましい。
【０００４】
この際、カイコへのウイルス接種法として（１）カイコに一頭ずつウイルスを注射する、（２）５齢カイコを低温処理してウイルスを経口接種する、および（３）カイコに蛍光増白剤を加えた飼料を食下させてウイルス感受性を高めた後にウイルスを経口接種する方法が知られている（特願２００１−３０８６０３号、国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ０２／０９８５４）。しかし、（１）の方法は作業効率が悪く大量のカイコを処理するには適さない。また、（２）の方法は低温処理設備を必要とし、大量のカイコを処理するのに適さない。さらに、（３）の方法は、カイコの発育が遅れる傾向が認められ、適用できるカイコの品種も限定される。また、蛍光増白剤の効果が長期間持続するために夾雑する病原体がカイコに感染する機会も増すので、清浄な環境を維持する手段が必要とされる。
【０００５】
また、野生型の非組換え核多角体病ウイルスのカイコに対する感染が、キチン合成阻害剤であるフルフェノクスロンおよびニッコーマイシンにより促進されるという報告はあったが（例えば、非特許文献１および非特許文献２を参照）、野生型ウイルスと組換えウイルスの感染機構は異なると考えられており、野生型ウイルスで得られた結果は組換えウイルスには適用できなかった。すなわち、核多角体病ウイルスは、感染機構の異なる２種類のウイルス粒子を作ることが知られている。一つは「経口感染型ウイルス」であり、もう一つは「組織間感染型ウイルス」である。これらは感染性が異なり、経口感染型ウイルスは経口接種した場合にはよく感染するが昆虫に注射により接種した場合は感染せず、また組織間感染型ウイルスは注射により接種した場合にはよく感染するが経口接種しても感染しないというのが、当業界での通説であった。「遺伝子組換え核多角体病ウイルス」または「バキュロウイルスベクター」という場合、「組織間感染型ウイルス」を意味する。上記報告においては、カイコ核多角体病ウイルスの「経口感染型ウイルス」を用いており、経口感染して当然であり、経口感染型ウイルスの経口感染を促進する物質が、組織間感染型ウイルスの感染を促進するとは予測できなかった。
【０００６】
さらに、カイコだけではなくクスサン、サクサン等の昆虫を用いた有用物質の産生も可能であり、これらの昆虫全般へ効率的に組換えウイルスを感染させる方法の確立が望まれている。
【０００７】
【特許文献１】
特開昭６１−９２８８号公報
【特許文献２】
特開昭６２−２０８２７６号公報
【非特許文献１】
Ｔ．ＡＲＡＫＡＷＡ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ．３７（１）、２００２、ｐ．７−１１
【非特許文献２】
Ｔ．ＡＲＡＫＡＷＡ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ．３７（３）、２００２、ｐ．３９３−３９７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、大量の昆虫へ労力を要しないで効率よく接種することができ、しかも作業者の人数を大幅に減少することができ、しかも昆虫の種類および品種を問わずウイルスを経口感染させることが可能でかつ外来病原体の夾雑を防止する手間を軽減し得る、昆虫へのウイルスの感染を促進し得る飼料、該飼料の製造方法および該飼料を用いた昆虫に組換えウイルスを感染させる方法を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討の結果、昆虫の人工飼料をキチン合成阻害剤を含んだ水と混合して攪拌磨砕し、オートクレーブで加熱した飼料を昆虫に摂食させ、次いでウイルスを混ぜた飼料を摂食させることにより、ウイルスの種類に拘わらず、手間をかけずに一度に大量の昆虫に組織間感染型ウイルスである組換えウイルスを感染させることができ、しかも外来病原体の夾雑の問題も解決し得ることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）昆虫用粉体人工飼料およびキチン合成阻害剤を含む、昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
（２）キチン合成阻害剤が、ポリオキシン、ニッコーマイシン、ウリジン２リン酸、ウリジン３リン酸、シトシン２リン酸、シトシン３リン酸、キャプタン、キャプタホール、ダイホルタン、ジクロフルアニド、１シトロネリル２メチルベンズイミダゾール、１ゲラニル２メチルベンズイミダゾール、バーバン、Ｈ−２４１０８、プラムバジン、ブプロフェジン、ジフルベンズロン、クロルフルアズロン、フルフェノクスロン、ルフェヌロン、テフルベンズロン、アロサミジンからなる群から選択される、（１）の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
【００１１】
（３）昆虫が、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（ＭａｎｄｕｃａＳｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からなる群から選択される、（１）または（２）の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
（４）昆虫が、カイコである（３）の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
【００１２】
（５）組換えウイルスが組換えバキュロウイルスである、（１）から（４）のいずれかの昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
（６）昆虫用粉体人工飼料５００ｇ当たり、チキン合成阻害剤を０．０００５〜５ｇ含む、（１）から（５）のいずれかの昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
【００１３】
（７）粉体人工飼料１０〜１０００００ｇ、キチン合成阻害剤０．００００１〜１０００ｇ、水２５〜２５００００ｍＬを混合し、攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れて、オートクレーブで加熱することからなる組換えウイルスによる昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法、
（８）昆虫が、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（ＭａｎｄｕｃａＳｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からなる群から選択される、（７）の昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法、
【００１４】
（９）昆虫が、カイコである（８）の昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法、
（１０）キチン合成阻害剤が、ポリオキシン、ニッコーマイシン、ウリジン２リン酸、ウリジン３リン酸、シトシン２リン酸、シトシン３リン酸、キャプタン、キャプタホール、ダイホルタン、ジクロフルアニド、１シトロネリル２メチルベンズイミダゾール、１ゲラニル２メチルベンズイミダゾール、バーバン、Ｈ−２４１０８、プラムバジン、ブプロフェジン、ジフルベンズロン、クロルフルアズロン、フルフェノクスロン、ルフェヌロン、テフルベンズロン、アロサミジンからなる群から選択される、（７）から（９）のいずれかの組換えウイルスによる昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法、
【００１５】
（１１）オートクレーブによる加熱が、１００〜１２１℃、１０〜３０分である（７）から（１０）のいずれかの組換えウイルスによる昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法、
（１２）飼育している大量の昆虫に組換えウイルスを同時に経口的に接種する方法であって、飼育している大量の昆虫に（１）の方法により製造した飼料を与え、２〜２４時間後に、組換えウイルス液を塗布した飼料を与えることにより組換えウイルス液塗布飼料を給餌することを含む、方法、
【００１６】
（１３）昆虫が、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（ＭａｎｄｕｃａＳｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からなる群から選択される、（１２）の飼育している大量の昆虫に組換えウイルスを同時に経口的に接種する方法、および
【００１７】
（１４）昆虫が、４齢または５齢のカイコである（１２）または（１３）の飼育している大量の昆虫に組換えウイルスを同時に経口的に接種する方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
１．本発明に用いる昆虫、ウイルスおよび昆虫用人工飼料
本発明において用いられる昆虫については特に制限はなく、いずれの昆虫も用いることができが、好ましくは、遺伝子工学の技法により有用物質の産生技術が確立している昆虫である。例えば、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（ＭａｎｄｕｃａＳｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）が好ましい昆虫として挙げられる。ここで、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ）およびヘリコベルパ・アサルタ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｓｓｕｌｔａ）は一般名タバコガに含まれる種類である。特に好ましい昆虫はカイコである。カイコは、一般に普及している品種を用いることができ、例えばＢＮＳＬ１×ＢＣＳＬ１、日１３７号×支１４６号、秋光×竜白、錦秋×鐘和、芙蓉×東海などの交雑品種が好適に用いられる。また、カイコは４齢または５齢のものが好ましい。
【００１９】
本発明のウイルスの昆虫への感染率を高める飼料のベースとなる飼料としては、市販の人工飼料を用いることができ、例えばシルクメート（登録商標、日本農産工業社製）を用いることができる。人工飼料は、粉末のものが望ましいが、ペレット状の飼料を粉砕して用いてもよい。粉末状の人工飼料を、キチン合成阻害剤と混合し、加熱殺菌することにより本発明の飼料を得ることができる。キチン合成阻害剤は、限定されないが、ポリオキシン、ニッコーマイシン、ウリジン２リン酸、ウリジン３リン酸、シトシン２リン酸、シトシン３リン酸、キャプタン、キャプタホール、ダイホルタン、ジクロフルアニド、１シトロネリル２メチルベンズイミダゾール、１ゲラニル２メチルベンズイミダゾール、バーバン、Ｈ−２４１０８、プラムバジン、ブプロフェジン、ジフルベンズロン、クロルフルアズロン、フルフェノクスロン、ルフェヌロン、テフルベンズロン、アロサミジン等が挙げられ、この中でもポリオキシン、ニッコーマイシン、キャプタン、フルフェノクスロンが好ましい。ポリオキシンとしては例えば、科研製薬株式会社製のポリオキシンＡＬ水和剤を用いることができる。
【００２０】
粉末状の人工飼料にキチン合成阻害剤を最終濃度（Ｗ／Ｗ）が０．０２５〜２．５％となるように混合し、さらに水を人工飼料５００ｇに対して１０００〜２０００ｍＬ添加し、十分に攪拌磨砕する。その後耐熱性ポリ袋に入れ、オートクレーブ等により加熱処理することにより本発明のキチン合成阻害剤を含有し、昆虫へのウイルス感染率を高める人工飼料を得ることができる。ここで用いる耐熱性ポリ袋の素材は限定されないが、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ、ＭＤＰＥ）、無延伸ポリプロピレン（ＣＰＰ）等が用いられる。加熱処理は、７０℃〜１２１℃、好ましくは１００℃〜１０５℃で１０〜３０分間行えばよい。
【００２１】
昆虫に投与するウイルス量は、使用する組換えウイルスの種類、産生させるべき有用タンパク質の種類により変わるが、組換えウイルスに感染させた昆虫の体液の遠心上清、または組換えウイルスに感染させた培養細胞の培養上清を、希釈しないでそのまま用いてもよいし、または１０万倍までのいずれかの倍率で希釈したものを用いてもよい。好ましくは、前記上清を１００倍から１０００倍に希釈したものを用いる。例えばカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）を用いる場合は、核多角体病蚕体液の遠心上清の０．１％液を飼料に塗布して、数時間食下させればよい。
【００２２】
本発明において、用いられる組換えウイルスは限定されず、外来の有用タンパク質をコードする遺伝子を有する組換えウイルスを用いることができる。組換えウイルスの例としては、カイコ核多角体病ウイルス等のバキュロウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス等が挙げられる。上述の昆虫種ごとに適したウイルスがあり、例えばオートグラファ・カリフォルニカ、イラクサギンウワバ、スポドプテラ・フルギペルダ、ヘリオシス・ビレセンス、ヘリコベルパ・ジーおよびタバコスズメガには遺伝子組換えＡｃＮＰＶが、カイコには遺伝子組換えＢｍＮＰＶが、アメリカシロヒトリには遺伝子組換えＨｙｃｕＮＰＶが、シンジュサンには遺伝子組換えＡｎｐｅＮＰＶが、サクサンにはＨｙｃｕＮＰＶおよびＡｎｐｅＮＰＶが好適に用いられる。ここに挙げたウイルスは、すべて核多角体病ウイルスの一種である。ここで、外来の遺伝子とは、組換えられるウイルスが元々有する遺伝子以外の遺伝子をいう。例えば、カイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（ＢｍＮＰＶＤＮＡ）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、目的とする有用タンパク質の遺伝子を組み込んだものが挙げられる。組換えウイルスの調製は常法にしたがって行なうことができる。例えば、カイコ核多角体病ウイルスの多角体タンパク質発現プロモーターを含むプラスミドを調製し、このプロモーターの下流に目的とする有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込み、トランスファーベクターを調製する。次いで、このトランスファーベクターと予めクローン化してあるカイコ核多角体病ウイルスとでカイコ樹立細胞をコ・トランスフェクトさせ、形質転換された組換えウイルスを同じくカイコ樹立細胞中で培養増殖し、その細胞を破壊するかまたは培養上清を採取して組換えウイルスを取得すれば良い。
【００２３】
なお、本発明で用いる組換えウイルスは、組織間感染型ウイルスであり、従来経口接種しても昆虫に感染しないと考えられており、本発明の方法によれば、組織間感染型ウイルスであっても、経口的に効率よく感染させることができる。
【００２４】
２．昆虫へのウイルス接種および飼育方法
本発明の昆虫へのウイルス接種および飼育方法によれば、効率的に一度に大量の昆虫を飼育し、ウイルス接種を行うことができる。昆虫の数は、必要に応じて増減することができるが、一度に数百頭から数百万頭程度飼育することができる。
例えば、昆虫がカイコである場合、以下の方法によりウイルス接種を行うことができ、カイコ以外の他の昆虫も同様の方法によりウイルス接種を行うことができる。
【００２５】
大量のカイコを、蚕箔（蚕座）等に載せて温度および湿度を適度に調節して飼育し、蚕箔上のカイコに上述のキチン合成阻害剤含有人工飼料を給餌する。この際、人工飼料の量は蚕が２０〜２４時間で完全に食下できる量、例えば５齢カイコ１，０００頭当たり１，４００ｇが望ましい。次いで、ウイルスを塗布した飼料をキチン合成阻害剤含有人工飼料を食下したカイコに給餌する。この際の飼料の量は、カイコが数時間、例えば６時間で食下できる量が望ましく、その量は例えば、５齢カイコ１，０００頭当たり約６００ｇである。給餌はカイコが通過可能な網の上に載せてカイコを飼育している蚕箔に網ごと載せるのが好ましい。このようにすることにより、カイコを移す手間が省け、またウイルス塗布飼料を食下したカイコが網の上に載っているので、大量のカイコを一度に網ごと移動させることができる。その後、ウイルス塗布飼料を食下したカイコを網ごと、数日分の飼料を載せた蚕箔上に載せて、飼育する。一定の飼育日数で安定した目的のタンパク質を得ることができる。例えば、組換えウイルスとしてカイコ核多角体病ウイルスを使用し、約２５℃の一定の温度で飼育した場合、感染したカイコ幼虫は投与後５日目には核多角体病（膿病）特有の病徴を呈し、有用物質の産生が進行する。
なお、上記のキチン合成阻害剤含有飼料のカイコへの投与量、食下に要する時間は一例であり、本発明はこれらの記載によっては限定されない。
【００２６】
昆虫体内で産生された目的タンパク質を回収することにより目的タンパク質を得ることができる。例えば、昆虫がカイコの場合、以下の方法により目的タンパク質の回収・分離を行うことができる。カイコ以外の昆虫も同様の方法で目的タンパク質の回収・分離を行うことができる。
【００２７】
カイコ体中で産生された目的タンパク質の回収・分離は、カイコ体中に目的タンパクが最も多く蓄積される感染後４〜６日目にカイコ体液を採取し、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の各種分離手段により有用タンパク質を取得、精製することによりできる。また、別の手段としては、カイコを摺りつぶし、ＳＤＳ水溶液、尿素水溶液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液等で抽出した後、あるいは加熱処理により夾雑タンパク質を変性除去した後に、常法処理によって有用タンパク質を分離、採取する方法が挙げられる。更に別の手段としては、摺りつぶしたカイコをリン酸バッファー等に懸濁させ、超音波処理したのち血球等の、そのタンパク質と特異的に結合する物質を加えて有用タンパク質を取得する方法を挙げることができる。
【００２８】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
〔実施例１〕カイコへのウイルスの感染率を高める飼料の製造
粉体の人工飼料（市販のシルクメート（登録商標）、日本農産工業社製）５００ｇとキチン合成阻害剤であるポリオキシンＡＬ水和剤（科研製薬株式会社製）９．４ｇ、および水１３５０ｍｌを混合し、攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れ、さらにオートクレーブで１０５℃で１５分間加熱滅菌した。加熱滅菌後成形し、使用時まで４℃で保存した。本飼料をポリオキシン飼料と称する。
【００２９】
〔実施例２〕カイコへのウイルス接種
（１）５齢起蚕（５齢１日目カイコ）へのウイルス接種
実施例１のポリオキシン飼料１４００ｇを５齢起蚕（品種は表１に示す）１０００頭に与えて２４時間食下させた。次いで薄切した普通飼料６００ｇにＢｍＮＰＶ液（核多角体病蚕体液の遠心上清の１０００倍希釈液）５０ｍＬを洗浄瓶を用いて全面に塗布したものを与えて、飼育を継続し、ウイルス感染率を測定した。ウイルス感染率は、それぞれのカイコから体液を採取し、ＢｍＮＰＶの感染の有無を調べ、感染率を算出した。なお、ポリオキシン飼料の代わりに普通飼料を与えたものを対照とした。
（２）４齢起蚕へのウイルス接種
実施例１のポリオキシン飼料３０ｇを４齢起蚕（品種は表１に示す）１００頭に与えて２４時間食下させた。次いで薄切した普通飼料６０ｇにＢｍＮＰＶ液（核多角体病蚕体液の遠心上清の１０００倍希釈液）を５ｍＬを洗浄瓶を用いて全面に塗布したものを与えて、飼育を継続し、ウイルス感染率を測定した。ウイルス感染率は、それぞれのカイコから体液を採取し、ＢｍＮＰＶの感染の有無を調べ、感染率を算出した。なお、ポリオキシン飼料の代わりに普通飼料を与えたものを対照とした。
結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】

【００３１】
表に示すように、ポリオキシン投与区のカイコでは全数がＢｍＮＰＶに感染していた。
なお、図１には、本発明のカイコへのウイルス接種の具体的な一例を示す。図１に示す方法は以下の通りである。１０００頭の５齢起蚕のカイコを蚕箔に載せ、実施例１のポリオキシン飼料一日分を蚕箔上に置きカイコに食下させた（図１ａ）。２０〜２４時間後カイコが食下した後に、ＢｍＮＰＶ液（核多角体病蚕体液を０．１％となるように蒸留水で希釈したもの）を洗浄瓶を用いて全面に塗布した普通飼料をカイコが通過可能な大きさの網目を有する網の上に置き、網ごと蚕箔上のカイコの上に載せた（図１ｂ）。カイコがＢｍＮＰＶ塗布飼料を完全に食下した６時間後、カイコは蚕箔から網の上に移っており（図１ｃ）、網ごと別の蚕箔上に置いた４日分の普通飼料の上に載せた（図１ｄ）。飼料の乾燥とカイコの這い出しを防ぐために蓋をし、４日間放置した。
【００３２】
【発明の効果】
実施例に示すように、本発明のキチン合成阻害剤を含む人工飼料を、ウイルス感染前に給餌した昆虫はウイルスに感染しやすくなっており、本発明の方法により、一度に大量の昆虫に効率的にウイルスを感染させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】キチン合成阻害剤含有飼料を用いて大量のカイコにウイルスを経口的に接種する方法を示す図である。
【図１Ｂ】キチン合成阻害剤含有飼料を用いて大量のカイコにウイルスを経口的に接種する方法を示す図である。
【図１Ｃ】キチン合成阻害剤含有飼料を用いて大量のカイコにウイルスを経口的に接種する方法を示す図である。
【図１Ｄ】キチン合成阻害剤含有飼料を用いて大量のカイコにウイルスを経口的に接種する方法を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a feed that enhances the infection rate of insects to a virus, and an efficient virus inoculation method using the feed.
[0002]
[Prior art]
In recent years, techniques for producing useful proteins in silkworms using gene recombination techniques have been put to practical use. For example, there is a method using silkworm nuclear polyhedrosis virus as a vector (for example, see Patent Documents 1 and 2). In these methods, a recombinant virus is prepared by replacing the polyhedron gene of the silkworm nucleopolyhedrovirus with a gene encoding another useful substance such as interferon, and inoculating and infecting a 5-year-old silkworm, After 4 to 8 days, the recombinant virus is produced in the silkworm cells during the growth process, and the useful substance secreted into the body fluid is collected, separated and purified.
[0003]
The technology of genetic recombination using such silkworms is based on the fact that the silkworm, which is the host, is genetically closer to humans than Escherichia coli and yeast used conventionally, so that the activity and antigenicity of useful substances produced This is preferred from the viewpoint of the above.
[0004]
At this time, as a method of inoculating the virus into the silkworm, (1) inject the virus one by one into the silkworm, (2) inoculate the virus orally by incubating the fifth-instar silkworm with a low temperature, and (3) add a fluorescent whitening agent to the silkworm. A method of inoculating a virus orally after raising the virus susceptibility by feeding the added feed is known (Japanese Patent Application No. 2001-308603, International Patent Application PCT / JP02 / 09854). However, the method (1) has poor work efficiency and is not suitable for processing a large amount of silkworms. Further, the method (2) requires low-temperature processing equipment, and is not suitable for processing a large amount of silkworms. Furthermore, in the method (3), the growth of the silkworm tends to be delayed, and the variety of the silkworm that can be applied is also limited. In addition, since the effect of the fluorescent whitening agent is maintained for a long period of time, the chances of contaminating pathogens infecting silkworms are increased, so that a means for maintaining a clean environment is required.
[0005]
In addition, there have been reports that infection of silkworms with wild-type non-recombinant nucleopolyhedrovirus is promoted by chitin synthesis inhibitors flufenoxuron and nikkomycin (for example, Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). It is thought that the infection mechanisms of the wild-type virus and the recombinant virus are different, and the results obtained with the wild-type virus were not applicable to the recombinant virus. That is, it is known that nuclear polyhedrosis virus produces two types of virus particles having different infection mechanisms. One is "orally transmitted virus" and the other is "inter-tissue transmitted virus". These are different in infectiousness. Orally transmitted virus is well transmitted when inoculated orally, but not transmitted when injected into insects, and interstitial virus is well transmitted when injected by injection. It is a common belief in the industry that it is not infected by oral inoculation. When referring to "recombinant nuclear polyhedrosis virus" or "baculovirus vector", it means "inter-infectious virus". In the above report, the "oral infectious virus" of silkworm nuclear polyhedrosis virus is used, and it is natural that oral infection occurs. It could not be predicted to promote infection.
[0006]
Furthermore, it is possible to produce useful substances using insects such as kusan and sakusan as well as silkworms, and it is desired to establish a method for efficiently infecting these insects with a recombinant virus efficiently.
[0007]
[Patent Document 1]
JP-A-61-9288
[Patent Document 2]
JP-A-62-208276
[Non-patent document 1]
T. ARAKAWA, Appl. Entomol. Zool. 37 (1), 2002, p. 7-11
[Non-patent document 2]
T. ARAKAWA, Appl. Entomol. Zool. 37 (3), 2002, p. 393-397
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can inoculate a large number of insects efficiently without requiring labor, can significantly reduce the number of workers, and can transmit a virus orally regardless of the type and variety of insects. A feed capable of promoting infection of a virus to an insect, a method of producing the feed, and a method of infecting an insect using the feed with a recombinant virus. provide.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors mixed an artificial feed for insects with water containing a chitin synthesis inhibitor, stirred and ground the mixture, fed the insects with a feed heated in an autoclave, and then mixed the virus. Feeding feed allows a large number of insects to be infected at once with a recombinant virus, which is an interstitial virus, regardless of the type of virus, regardless of the type of virus. Have been found to be able to solve the problem, and have completed the present invention.
[0010]
That is, the present invention is as follows.
(1) a feed containing an artificial powder for insects and a chitin synthesis inhibitor, which enhances the infection rate of the recombinant virus to insects;
(2) The chitin synthesis inhibitor is polyoxin, nikkomycin, uridine diphosphate, uridine triphosphate, cytosine diphosphate, cytosine triphosphate, captan, captahol, difortan, diclofluanid, 1 citronellyl 2-methyl Insects of (1) selected from the group consisting of benzimidazole, 1 geranyl 2-methylbenzimidazole, barban, H-24108, plumvazine, buprofezin, diflubenzuron, chlorfluazuron, flufenoxuron, lufenuron, teflubenzuron, allosamidine Feed that increases the infection rate of the recombinant virus,
[0011]
(3) Insects are silkworms (Bombyx mori), california japonica, saksan (Antheraea pernyi), Shinjusan (Samnia cynthia rya, Sanya cinna santa sari, Sania cinta rituala) , Shrimp glass spider (Agrius convolvuli), tobacco sparrow (Manduca Sexta), Heliothis virescens (Heliothis virensens), Helicoverpapa zea (Helikoverpa algiera, Heliacapier Heligarpiera Heligervier) overpa assulta), Trichoplusia ni (Trichoplusia ni), armyworm (Pseudaletia separata), cabbage armyworm (Mamestra brassicae), common cutworm (Spodoptera litura), Autographa californica (Autographa californica), Sekuropiasan (Hyalophora cecropia), saturniid (Antheraea yamamai ) And Spodoptera frugiperda, wherein the feed enhances the infection rate of the recombinant virus to the insects of (1) or (2), which is selected from the group consisting of Spodoptera frugiperda.
(4) a feed wherein the insects increase the infection rate of the recombinant virus to the insects of the silkworm (3),
[0012]
(5) a feed that increases the infection rate of the recombinant virus to any of the insects according to (1) to (4), wherein the recombinant virus is a recombinant baculovirus;
(6) a feed that increases the infection rate of the insect of any one of (1) to (5), wherein the feed contains 500 to 5 g of a chicken synthesis inhibitor per 500 g of artificial powdered feed for insects;
[0013]
(7) A set comprising mixing 10 to 100,000 g of artificial powdered powder, 0.00001 to 1,000 g of chitin synthesis inhibitor, and 25 to 250,000 mL of water, stirring and grinding, placing in a heat-resistant plastic bag, and heating with an autoclave. A method for producing feed that increases the infection rate of insects by the recombinant virus,
(8) Insects are silkworms (Bombyx mori), california japonica, saksan (Antheraea pernyi), Shinjusan (Samia cinthia rya, Sanya cinna santa sari, Sania cinta ritual) , Shrimp glass spider (Agrius convolvuli), tobacco sparrow (Manduca Sexta), Heliothis virescens (Heliothis virensens), Helicoverpapa zea (Helikoverpa algiera, Heliacapier Heligarpiera Heligervier) overpa assulta), Trichoplusia ni (Trichoplusia ni), armyworm (Pseudaletia separata), cabbage armyworm (Mamestra brassicae), common cutworm (Spodoptera litura), Autographa californica (Autographa californica), Sekuropiasan (Hyalophora cecropia), saturniid (Antheraea yamamai ) And Spodoptera frugiperda, the method of (7) for producing a feed that increases the infection rate of insects.
[0014]
(9) A method for producing a feed that increases the infection rate of the insect (8), wherein the insect is a silkworm,
(10) The chitin synthesis inhibitor is polyoxin, nikkomycin, uridine diphosphate, uridine triphosphate, cytosine diphosphate, cytosine triphosphate, captan, captahol, difortan, diclofluanid, 1 citronellyl 2-methyl (7) to (9) selected from the group consisting of benzimidazole, 1 geranyl 2-methylbenzimidazole, barban, H-24108, pramvazine, buprofezin, diflubenzuron, chlorfluazuron, flufenoxuron, lufenuron, teflubenzuron, allosamidine )) A method for producing a feed that increases the infection rate of insects by any of the recombinant viruses;
[0015]
(11) A method for producing a feed that increases the infection rate of insects by any of the recombinant viruses according to any one of (7) to (10), wherein heating by an autoclave is performed at 100 to 121 ° C. for 10 to 30 minutes;
(12) A method of inoculating a large amount of breeding insects orally with a recombinant virus at the same time, wherein a large amount of breeding insects are fed with the feed prepared according to the method of (1) for 2 to 24 hours. Subsequently, feeding the recombinant virus solution coated feed by providing a feed coated with the recombinant virus solution,
[0016]
(13) Insects include silkworms (Bombyx mori), Kusan (Caligura japonica), Saksan (Antheraea pernyi), Shinjusan (Samnia cynthia rythera, Samia cyntharya, Samia cinthia santia, Samia cyntharya, Samia cyntharya) ), Shrimp glass sparrows (Agrius convolvuli), tobacco spiders (Manduca Sexta), Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpaer al-Herpa ella gera ergera (Helica berger eriga eriga gerapia geravira) coverpa assulta), Trichoplusia ni (Trichoplusia ni), armyworm (Pseudaletia separata), cabbage armyworm (Mamestra brassicae), common cutworm (Spodoptera litura), Autographa californica (Autographa californica), Sekuropiasan (Hyalophora cecropia), saturniid (Antheraea yamamai ) And Spodoptera frugiperda, wherein a large amount of the breeding insects of (12) is simultaneously orally inoculated with the recombinant virus orally, and a method selected from the group consisting of Spodoptera frugiperda.
[0017]
(14) A method in which a recombinant virus is simultaneously orally inoculated into a large amount of insects raised by the insects (12) or (13), which are 4th or 5th instar silkworms.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
1. Insects, viruses and artificial feed for insects used in the present invention
The insects used in the present invention are not particularly limited, and any insects can be used. Preferably, insects for which the production technology of useful substances has been established by genetic engineering techniques. For example, silkworm (Bombyx mori), california japonica, saxan (Antheraea pernyi), sinjusan (Samia cinthia plysia), Erisan (Samia cinthia rica santia, santa cinta rica, santa cinta) Agrius convolvuli, Manduca Sexta, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa algiaver arigarpa ariga ergaro ariga ergova ariga berger ariga berg rpa assulta), Trichoplusia ni (Trichoplusia ni), armyworm (Pseudaletia separata), cabbage armyworm (Mamestra brassicae), common cutworm (Spodoptera litura), Autographa californica (Autographa californica), Sekuropiasan (Hyalophora cecropia), saturniid (Antheraea yamamai ) And Spodoptera frugiperda are preferred insects. Here, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, and Helicoverpa assulta (Helicoverpa assulta, which is a kind of tobacco commonly included in Helicoverpa armigera) and Helicoverpa armigera. A particularly preferred insect is a silkworm. As the silkworm, generally used varieties can be used. For example, hybrid varieties such as BNSL1 × BCSL1, No. 137 × No. 146, Akiko × Ryuhaku, Kinshu × Banwa, Fuyo × Tokai are suitably used. Can be The silkworm is preferably a 4th or 5th instar.
[0019]
As a feed that serves as a base of a feed that increases the infection rate of the virus of the present invention to insects, a commercially available artificial feed can be used, and for example, silkmate (registered trademark, manufactured by Nippon Agricultural Industries) can be used. The artificial feed is preferably in the form of powder, but pelletized feed may be crushed and used. The feed of the present invention can be obtained by mixing the powdery artificial feed with a chitin synthesis inhibitor and sterilizing by heating. Chitin synthesis inhibitors include, but are not limited to, polyoxin, nikkomycin, uridine diphosphate, uridine triphosphate, cytosine diphosphate, cytosine triphosphate, captan, captahol, difortan, diclofluanid, 1 citronellyl 2 Methylbenzimidazole, 1 geranyl 2-methylbenzimidazole, Barban, H-24108, plumvazine, buprofezin, diflubenzuron, chlorfluazuron, flufenoxuron, lufenuron, teflubenzuron, allosamidine, etc., among which polyoxin, nikkomycin, captan And flufenoxuron are preferred. As the polyoxin, for example, a polyoxin AL wettable powder manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. can be used.
[0020]
The chitin synthesis inhibitor is mixed with the powdered artificial feed so that the final concentration (W / W) is 0.025 to 2.5%, and 1000 to 2000 mL of water is added to 500 g of the artificial feed, and Mill with stirring. Thereafter, the mixture is placed in a heat-resistant plastic bag and heat-treated in an autoclave or the like, whereby an artificial feed containing the chitin synthesis inhibitor of the present invention and increasing the virus infection rate to insects can be obtained. The material of the heat-resistant plastic bag used here is not limited, but for example, polyethylene terephthalate (PET), high-density polyethylene (HDPE, MDPE), unstretched polypropylene (CPP) and the like are used. The heat treatment may be performed at 70 ° C. to 121 ° C., preferably 100 ° C. to 105 ° C., for 10 to 30 minutes.
[0021]
The amount of virus to be administered to insects varies depending on the type of recombinant virus to be used and the type of useful protein to be produced, but the virus was infected with the centrifugal supernatant of the body fluid of an insect infected with the recombinant virus, or with the recombinant virus. The culture supernatant of the cultured cells may be used as it is without dilution, or may be diluted at any magnification up to 100,000 times. Preferably, a supernatant obtained by diluting the supernatant 100-fold to 1000-fold is used. For example, when using the silkworm nuclear polyhedrosis virus (BmNPV), a 0.1% solution of the centrifuged supernatant of the body fluid of the silkworm nucleopolyhedrovirus may be applied to the feed and eaten for several hours.
[0022]
In the present invention, the recombinant virus to be used is not limited, and a recombinant virus having a gene encoding a foreign useful protein can be used. Examples of the recombinant virus include baculovirus such as silkworm nucleopolyhedrovirus, reovirus, poxvirus and the like. There are suitable viruses for each of the above-mentioned insect species, for example, recombinant AcNPV in Autographa californica, Iraqaginiwawa, Spodoptera frugiperda, Heliosis viresens, Helicoverpa zygium, and tobacco sponge, and genetic set in silkworm. Recombinant BmNPV, recombinant HycuNPV for American white starling, recombinant AnpeNPV for Shinjusan, and HycuNPV and AnpeNPV for saxan are preferably used. All of the viruses listed here are a type of nuclear polyhedrosis virus. Here, the foreign gene refers to a gene other than the gene originally possessed by the virus to be recombined. For example, a gene obtained by incorporating a gene of a useful protein of interest into a polyhedrin protein structural gene portion of silkworm nucleopolyhedrovirus virus DNA (BmNPV DNA). Preparation of the recombinant virus can be performed according to a conventional method. For example, a plasmid containing a polyhedron protein expression promoter of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus is prepared, and a gene encoding a useful protein of interest is inserted downstream of the promoter to prepare a transfer vector. Next, silkworm-established cells were co-transfected with the transfer vector and the silkworm nuclear polyhedrosis virus cloned in advance, and the transformed recombinant virus was cultured and propagated in the silkworm-established cells, and the cells were isolated. The recombinant virus may be obtained by disrupting or collecting the culture supernatant.
[0023]
The recombinant virus used in the present invention is an interstitial virus, which is conventionally considered not to infect insects by oral inoculation. According to the method of the present invention, the interstitial virus is not used. However, it can be efficiently transmitted orally.
[0024]
2. Virus Inoculation and Breeding Methods for Insects
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to the virus inoculation and breeding method to insects of this invention, a large amount of insects can be efficiently bred at once, and virus inoculation can be performed. The number of insects can be increased or decreased as necessary, but can be raised from several hundred to several million at a time.
For example, when the insect is a silkworm, the virus can be inoculated by the following method, and other insects other than the silkworm can also be inoculated by the same method.
[0025]
A large amount of silkworms are placed on silkworm foil (silkworm) or the like and bred while appropriately controlling the temperature and humidity, and the silkworm on the silkworm foil is fed with the above-mentioned artificial feed containing the chitin synthesis inhibitor. At this time, the amount of the artificial feed is desirably an amount capable of completely feeding the silkworm in 20 to 24 hours, for example, 1,400 g per 1,000 fifth-instar silkworms. Next, the virus-coated feed is fed to silkworms fed an artificial feed containing a chitin synthesis inhibitor. The amount of feed at this time is desirably such that the silkworm can eat under several hours, for example, six hours, and the amount is, for example, about 600 g per 1,000 fifth-instar silkworms. Feeding is preferably performed on a net through which the silkworm can pass, and the net is preferably mounted on the silkworm on which the silkworm is raised. By doing so, the trouble of transferring the silkworm can be saved, and the silkworm that has eaten the virus-coated feed is placed on the net, so that a large amount of the silkworm can be moved together with the net. Thereafter, the silkworms fed the virus-coated feed are placed on a silkworm foil on which the feed for several days is placed together with the net and raised. A stable target protein can be obtained in a certain number of breeding days. For example, when the silkworm nucleopolyhedrovirus is used as a recombinant virus and bred at a constant temperature of about 25 ° C., the infected silkworm larvae are specific to nucleopolyhedropathy (pus disease) 5 days after administration. Symptoms appear, and production of useful substances progresses.
The dose of the above-mentioned feed containing the chitin synthesis inhibitor to the silkworm and the time required under the meal are merely examples, and the present invention is not limited by these descriptions.
[0026]
The target protein can be obtained by collecting the target protein produced in the insect body. For example, when the insect is a silkworm, the target protein can be collected and separated by the following method. Insects other than silkworms can also recover and separate the target protein in the same manner.
[0027]
The recovery and isolation of the target protein produced in the silkworm body is performed by collecting the silkworm body fluid on the 4th to 6th days after infection, when the target protein is accumulated most in the silkworm body, and performing various methods such as centrifugation and column chromatography. It can be obtained by obtaining and purifying a useful protein by a separation means. As another means, after crushing the silkworm and extracting it with an SDS aqueous solution, urea aqueous solution, alkaline aqueous solution, acidic aqueous solution, or the like, or denaturing and removing contaminating proteins by heat treatment, the useful protein is separated by a conventional method. , A method of collecting. Still another method is to suspend a crushed silkworm in a phosphate buffer or the like, sonicate, and then add a substance that specifically binds to the protein, such as blood cells, to obtain a useful protein. be able to.
[0028]
【Example】
The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited by these examples.
[Example 1] Production of feed for increasing the virus infection rate to silkworm
500 g of powdered artificial feed (commercially available Silkmate (registered trademark), manufactured by Nippon Agricultural Industry Co., Ltd.), 9.4 g of polyoxin AL wettable powder (manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.), which is a chitin synthesis inhibitor, and 1350 ml of water Then, the mixture was ground by stirring, placed in a heat-resistant plastic bag, and further sterilized by heating at 105 ° C. for 15 minutes in an autoclave. After heat sterilization, it was molded and stored at 4 ° C. until use. This feed is called a polyoxin feed.
[0029]
[Example 2] Virus inoculation to silkworm
(1) Inoculation of virus to 5th instar silkworm (5th instar silkworm on day 1)
1400 g of the polyoxin feed of Example 1 was given to 1,000 5-year-old silkworms (various species are shown in Table 1) and fed for 24 hours. Then, 50 ml of BmNPV solution (1000-fold diluted solution of centrifuged supernatant of silkworm body fluid of nucleopolyhedropathy) was applied to 600 g of the sliced normal feed using a washing bottle, and the whole was fed. The rate was measured. The virus infection rate was determined by collecting body fluids from each silkworm, examining the presence or absence of BmNPV infection, and calculating the infection rate. The control was given a normal feed instead of the polyoxin feed.
(2) Virus inoculation to 4th instar silkworm
30 g of the polyoxin feed of Example 1 was given to 100 4-year-old silkworms (various species are shown in Table 1) and fed for 24 hours. Then, 60 ml of the sliced normal feed was coated with 5 mL of a BmNPV solution (a 1000-fold dilution of the centrifugal supernatant of the body fluid of the nucleopolyhedropathy) using a washing bottle, and the whole was fed. The infection rate was measured. The virus infection rate was determined by collecting body fluids from each silkworm, examining the presence or absence of BmNPV infection, and calculating the infection rate. The control was given a normal feed instead of the polyoxin feed.
Table 1 shows the results.
[0030]
[Table 1]

[0031]
As shown in the table, all the silkworms in the polyoxin administration group were infected with BmNPV.
FIG. 1 shows a specific example of virus inoculation into silkworms of the present invention. The method shown in FIG. 1 is as follows. 1000 silkworms of 5th instar silkworm were placed on the silkworm foil, and one day of the polyoxin feed of Example 1 was placed on the silkworm foil and fed to the silkworm (FIG. 1a). 20 to 24 hours later, after the silkworm ate, BmNPV solution (a solution prepared by diluting the silkworm body fluid of nuclear polyhedrosis with distilled water to 0.1%) was applied to the entire surface using a washing bottle, and the normal feed was applied. The silkworm was placed on a net having a mesh size large enough to allow the silkworm to pass through, and the net was placed on the silkworm on the silkworm foil (FIG. 1b). Six hours after the silkworm completely consumed the BmNPV-coated diet, the silkworm had moved from the silkworm foil onto the net (FIG. 1c), and the silkworm was placed on a separate silkworm foil with the net for 4 days. (FIG. 1d). The lid was kept to prevent the feed from drying and the silkworms from crawling out, and left for 4 days.
[0032]
【The invention's effect】
As shown in the Examples, insects fed an artificial feed containing the chitin synthesis inhibitor of the present invention before virus infection are susceptible to virus infection. The virus can be transmitted.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1A is a diagram showing a method of inoculating a large amount of silkworms orally with a virus using a feed containing a chitin synthesis inhibitor.
FIG. 1B is a diagram showing a method of inoculating a large amount of silkworms orally with a virus using a feed containing a chitin synthesis inhibitor.
FIG. 1C is a diagram showing a method of inoculating a large amount of silkworms orally with a virus using a feed containing a chitin synthesis inhibitor.
FIG. 1D shows a method of inoculating a large amount of silkworms orally with a virus using a feed containing a chitin synthesis inhibitor.

Claims

A feed for increasing the infection rate of a recombinant virus to insects, comprising an artificial powder for insects and a chitin synthesis inhibitor.

A chitin synthesis inhibitor comprising polyoxin, nikkomycin, uridine diphosphate, uridine triphosphate, cytosine diphosphate, cytosine triphosphate, captan, captahole, difortan, diclofluanid, 1 citronellyl 2-methylbenzimidazole, The insect set of claim 1, wherein the geranyl 2-methylbenzimidazole, barban, H-24108, plumvazine, buprofezin, diflubenzuron, chlorfluazuron, flufenoxuron, lufenuron, teflubenzuron, allosamidine. Feed that increases the transmission rate of the replacement virus.

Insects include silkworms (Bombyx mori), california japonica, saksan (Antheraea pernyi), sinjusan (Samnia cynthia ryeri, Hyasan thiasa ari santi, santa santi a ritual) (Agrius convolvuli), tobacco spruce (Manduca Sexta), Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa algiera, Helicoverpa ariga ariga armag icoverpa assulta), Trichoplusia ni (Trichoplusia ni), armyworm (Pseudaletia separata), cabbage armyworm (Mamestrabrassicae), common cutworm (Spodoptera litura), Autographa californica (Autographa californica), Sekuropiasan (Hyalophora cecropia), saturniid (Antheraea yamamai) The feed for enhancing the infection rate of a recombinant virus to insects according to claim 1 or 2, wherein the feed is selected from the group consisting of Spodoptera frugiperda and Spodoptera frugiperda.

4. The feed according to claim 3, wherein the insect is a silkworm, which enhances the infection rate of the recombinant virus to the insect.

The feed for increasing the infection rate of a recombinant virus to insects according to any one of claims 1 to 4, wherein the recombinant virus is a recombinant baculovirus.

The feed for increasing the infection rate of a recombinant virus to insects according to any one of claims 1 to 5, comprising 500 to 5 g of a chicken synthesis inhibitor per 500 g of the artificial powdered feed for insects.

10 to 100,000 g of powder artificial feed, 0.00001 to 1000 g of chitin synthesis inhibitor, 25 to 250,000 mL of water are mixed, ground and stirred, put in a heat-resistant plastic bag, and heated by an autoclave. A method for producing feed that increases the infection rate of insects.

Insects include silkworms (Bombyx mori), california japonica, saksan (Antheraea pernyi), sinjusan (Samnia cynthia ryeri, Hyasan thiasa ari santi, santa santi a ritual) (Agrius convolvuli), tobacco spruce (Manduca Sexta), Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa algiera, Helicoverpa ariga ariga armag icoverpa assulta), Trichoplusia ni (Trichoplusia ni), armyworm (Pseudaletia separata), cabbage armyworm (Mamestrabrassicae), common cutworm (Spodoptera litura), Autographa californica (Autographa californica), Sekuropiasan (Hyalophora cecropia), saturniid (Antheraea yamamai) The method for producing a feed for increasing the infection rate of insects according to claim 7, which is selected from the group consisting of Spodoptera frugiperda and Spodoptera frugiperda.

9. The method according to claim 8, wherein the insect is a silkworm.

A chitin synthesis inhibitor comprising polyoxin, nikkomycin, uridine diphosphate, uridine triphosphate, cytosine diphosphate, cytosine triphosphate, captan, captahole, difortan, diclofluanid, 1 citronellyl 2-methylbenzimidazole, 10. Any one of claims 7 to 9 selected from the group consisting of 1 geranyl 2-methylbenzimidazole, barban, H-24108, plumvazine, buprofezin, diflubenzuron, chlorfluazuron, flufenoxuron, lufenuron, teflubenzuron, allosamidine. 13. A method for producing a feed that increases the infection rate of insects by the recombinant virus according to paragraph.

The method for producing a feed that increases the infection rate of insects with the recombinant virus according to any one of claims 7 to 10, wherein the heating by the autoclave is performed at 100 to 121 ° C for 10 to 30 minutes.

A method of inoculating a large amount of breeding insects orally simultaneously with a recombinant virus, wherein a large amount of breeding insects are fed with the feed prepared according to the method of claim 1, and after 2 to 24 hours, Feeding a feed coated with the recombinant virus solution by providing a feed coated with the recombinant virus solution.

Insects include silkworms (Bombyx mori), california japonica, saksan (Antheraea pernyi), sinjusan (Samnia cynthia ryeri, Hyasan thiasa ari santi, santa santi a ritual) (Agrius convolvuli), tobacco spruce (Manduca Sexta), Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa algiera, Helicoverpa ariga ariga armag icoverpa assulta), Trichoplusia ni (Trichoplusia ni), armyworm (Pseudaletia separata), cabbage armyworm (Mamestra brassicae), common cutworm (Spodoptera litura), Autographa californica (Autographa californica), Sekuropiasan (Hyalophora cecropia), saturniid (Antheraea yamamai ) And Spodoptera frugiperda, wherein the recombinant virus is simultaneously orally inoculated into a large number of breeding insects that are bred.

14. The method according to claim 12 or 13, wherein the insect is a fourth- or fifth-year-old silkworm, and a large amount of breeding insects are orally inoculated simultaneously with the recombinant virus.