JP2004161685A

JP2004161685A - 卵黄関連蛋白およびその用途

Info

Publication number: JP2004161685A
Application number: JP2002330226A
Authority: JP
Inventors: Akihiko Hara; 彰彦原; Yasuharu Nanba; 靖治難波; Keizo Ito; 敬三伊藤
Original assignee: FRONTIER SCIENCE CO Ltd; BL KK
Current assignee: FRONTIER SCIENCE CO Ltd; BL KK
Priority date: 2002-11-14
Filing date: 2002-11-14
Publication date: 2004-06-10

Abstract

【課題】メダカ由来の新規な雌特異卵黄関連蛋白（ＹＲＰ）およびそれに対する抗体が提供することにより、ビテロジェニンを検出する従来の環境ホルモンの測定系の代替法を提供する。
【解決手段】メダカ由来の雌特異卵黄関連蛋白であって、ゲル濾過による分子量が実質的に４６０ｋＤａであり、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が実質的に１３０ｋＤａである卵黄関連蛋白、および、それに対する抗体、および、当該抗体を用いた上記卵黄関連蛋白の各種の免疫学的測定法。
【選択図】図８

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エストロジェンによって誘導される新規な蛋白質およびその用途に関し、さらに詳細には、メダカから分離された新規な蛋白質およびその用途に関する。
【従来の技術】
【０００２】
卵生脊椎動物では、卵母細胞は、卵黄蛋白前駆物質であるビテロジェニンを取り込むことによって急速に成長する（ＷａｌｌａｃｅＲＡ．１９８５．Ｉｎ：Ｂｒｏｗｄｅｒ，ｅｄｉｔｏｒ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ．Ｖｏｌ．１，ｐ１２７−１７７．）。
【０００３】
ビテロジェニン（Ｖｇ）は、エステラジオール−１７（Ｅ２）の刺激により雌動物の肝臓内で合成される糖脂質蛋白であり、雌特異蛋白として血中に分泌される。血流中のビテロジェニンは、受容体を介したエンドサイトーシスにより卵母細胞に取り込まれ、酵素により２つの主要な卵黄蛋白質、すなわち、リポビテリン（ｌｉｐｏｖｉｔｅｌｌｉｎ）とホスビチン（ｐｈｏｓｖｉｔｉｎ）に開裂する。これらの卵黄蛋白質は胚を成長させるための栄養素として役立つ。
【０００４】
複数の形態のビテロジェニンが広範囲の卵生脊椎動物において既に確認されている（ＷｉｌｅｙＨＳｅｔａｌ．１９８１．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２５６：８６２６−８６３４．；ＷａｎｇＳ−Ｙｅｔａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２：６２０６−６２１２．；ＷａｎｇＨｅｔａｌ．２０００．Ｇｅｎｅ２５６：３０３−３１０．）。硬骨魚では、ティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓａｕｒｅｕｓ）（ＬｅｅＢＨｅｔａｌ．１９９４．ＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌＢｉｏｌＩｎｔ３４：７５−８３．）、マミチョグ（Ｆｕｎｄｕｌｕｓｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｕｓ）（ＬａＦｌｅｕｒＧＪｅｔａｌ．１９９５．Ｉｎ：ＧｏｅｔｚＦ，ＴｈｏｍａｓＰ，ｅｄｉｔｏｒｓ．ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆＦｉｓｈ．Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ：ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓａｔＡｕｓｔｉｎ．ｐ３３６−３３８．）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ）（ＷａｎｇＨｅｔａｌ．２０００．Ｇｅｎｅ２５６：３０３−３１０）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｍｙｋｉｓｓ）（ＴｒｉｃｈｅｔＶｅｔａｌ．２０００．ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ２６３：８２８８３７．）およびハドック（モンツキダラＭｅｌａｎｏｇｒａｍｍｕｓａｅｇｌｅｆｉｎｕｓ）（ＲｅｉｔｈＭｅｔａｌ．２００１．ＪＥｘｐＺｏｏｌ２９１：５８−６７．）などで、ビテロジェニン遺伝子が２つ以上存在しており、このことは、多くの魚類が数種のビテロジェニン遺伝子を持つことを示唆している。
【０００５】
ニジマスにはビテロジェニンをコードする遺伝子が２０個存在する。しかし、それらの配列の９７％は同一であるため、蛋白質としては区別がつかない。したがって、複数のビテロジェニン遺伝子が発現しているとしても、蛋白質として異なる形態のビテロジェニンが複数存在することにはならない。現在のところ、翻訳蛋白として２つの異なるビテロジェニンがティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ属）（ＤｉｎｇＪＬｅｔａｌ．１９８９．ＣｏｍｐＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ９３Ｂ：３６３−３７０．；ＬｅｅＫＢＨｅｔａｌ．１９９２．ＥｘｐＺｏｏｌ２６４：１００−１０６．；ＫｉｓｈｉｄａＭｅｔａｌ．１９９３．ＦｉｓｈＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ１２：１７１−１８２．；ＢｕｅｒａｎｏＣｅｔａｌ．１９９５．ＪＥｘｐＺｏｏｌ２７３：５９−６９．）およびヒラメ（マツカワＶｅｒａｓｐｅｒｍｏｓｅｒｉ）（ＭａｔｓｕｂａｒａＴｅｔａｌ．１９９９．ＤｅｖＢｉｏｌ２１３：１８−３２．）において検出されている。
【０００６】
マツバラ他（ＭａｔｓｕｂａｒａＴｅｔａｌ．１９９９．ＤｅｖＢｉｏｌ２１３：１８−３２．）は、遠洋性卵を産むヒラメにおける２種のビテロジェニンの特徴を、Ｎ末端のアミノ酸配列と特異的抗体を用いて明らかにしている。ヒラメの２種のビテロジェニン（ＶｇＡおよびＶｇＢ）は、類似の分子量（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において１６８ｋＤａおよび１７５ｋＤａ）を有するが、卵の水和の過程において異なった役割を果たしている。
【０００７】
ＶｇＡ由来の卵黄蛋白質は、水和する際に遊離アミノ酸に分解され、浸透圧の上昇により卵に浮力を与えることがあるが、他方、ＶｇＢ由来の卵黄蛋白質は比較的大きなペプチドとして残り、栄養素として胚に使用される。
【０００８】
ヒラメとは対照的に、遠洋性卵を産まないティラピアの２種のビテロジェニン（ＶＴＧ−２００およびＶＴＧ−１３０）は異なる分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２００ｋＤａおよび１３０ｋＤａ）を有する。これらの２種のビテロジェニンは血漿から精製され、その生体内および生体外におけるエステラジオール−１７（Ｅ２）による誘導は既に研究されている（ＫｉｓｈｉｄａＭｅｔａｌ．１９９３．ＦｉｓｈＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ１２：１７１−１８２．；ＴａｋｅｍｕｒａＡｅｔａｌ．２００１．ＣｏｍｐＢｉｏｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏｌ１２９Ａ：６４１−６５１．）。しかしながら、これらの卵黄形成、排卵および発生の過程における役割は未だ全く知られていない。
【０００９】
数種の魚類では、卵膜（または漿膜）の蛋白の前駆物質が、雌特異蛋白として血流中に見出されている（ＨａｍａｚａｋｉＴｅｔａｌ．１９８５．ＪＥｘｐＺｏｏｌ２３５：２６９−２７９．；ＨｙｌｌｎｅｒＳＪｅｔａｌ．１９９１．ＪＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１３１：２２９−２３６．）。この前駆物質はコリオジェニン（Ｃｈｇ）と呼ばれ、その産生はエストロゲンによって制御される（ＭｕｒａｔａＫｅｔａｌ．１９９４．ＧｅｎＣｏｍｐＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ９５：２３２−２３９．；ＳｈｉｍｉｚｕＭｅｔａｌ．２０００．ＪＦｉｓｈＢｉｏｌ５７：１７０−１８１．）。魚の卵膜蛋白の起源は種間で様々であるが、或る魚種でビテロジェニン（Ｖｇ）とコリオジェニン（Ｃｈｇ）がどのようにエステロゲンにより制御され、卵の成熟過程に利用されるかを理解することは非常に興味深いことである。
【００１０】
メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓｌａｔｉｐｅｓ）では、ビテロジェニン（Ｖｇ）とコリオジェニン（Ｃｈｇ）の何れもが卵以外を起源としており、これらの雌特異蛋白の各種特性が研究されている（ＹａｍａｇａｍｉＫ．１９９６．ＺｏｏｌＳｃｉ１３：３３１−３４０．）。また、メダカにエストロゲンを投与すると、ビテロジェニンおよびコリオジェニンが豊富な腹水の蓄積が誘導される。かかる特徴にゆえに、メダカは、肝臓由来の雌特異蛋白による卵発生を研究するための格好のモデルとされている。
【００１１】
ハラ他（ＨａｒａＡｅｔａｌ．１９８３．ＣｏｍｐＢｉｏｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏｌ７６Ａ：１３５−１４１．）は、ＦＳ−１，２および３と称される３つの雌特異蛋白をメダカの血清中から免疫化学的に検出した。ＦＳ−２とＦＳ−３は、雌特異蛋白であり、卵黄蛋白質に対する抗血清と免疫反応し、エストロゲン投与により誘導されることから、ビテロジェニンの評価基準を満たす。
【００１２】
ハマザキ他（ＨａｍａｚａｋｉＴＳｅｔａｌ．１９８７．ＪＥｘｐＺｏｏｌ２４２：３３３−３４１．）は、エステラジオール−１７（Ｅ２）を投与されたメダカの腹水からビテロジェニンを精製し、その分子量とアミノ酸組成が他の魚のものと類似することを報告している。
【００１３】
【非特許文献１】ＷａｌｌａｃｅＲＡ．Ｉｎ：Ｂｒｏｗｄｅｒ，ｅｄｉｔｏｒ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ．１９８５．Ｖｏｌ．１，ｐ１２７−１７７．
【非特許文献２】ＷｉｌｅｙＨＳｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ１９８１．２５６：８６２６−８６３４．
【非特許文献３】ＷａｎｇＳ−Ｙｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８３．２２：６２０６−６２１２．
【非特許文献４】ＷａｎｇＨｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ２０００．２５６：３０３−３１０．
【非特許文献５】ＬｅｅＢＨｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌＢｉｏｌＩｎｔ１９９４．３４：７５−８３．
【非特許文献６】ＬａＦｌｅｕｒＧＪｅｔａｌ．Ｉｎ：ＧｏｅｔｚＦ，ＴｈｏｍａｓＰ，ｅｄｉｔｏｒｓ．ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆＦｉｓｈ．Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ：ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓａｔＡｕｓｔｉｎ．１９９５．ｐ３３６−３３８．
【非特許文献７】ＴｒｉｃｈｅｔＶｅｔａｌ．ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ２０００．２６３：８２８−８３７．
【非特許文献８】ＲｅｉｔｈＭｅｔａｌ．ＪＥｘｐＺｏｏｌ２００１．２９１：５８−６７．
【非特許文献９】ＤｉｎｇＪＬｅｔａｌ．ＣｏｍｐＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ１９８９．９３Ｂ：３６３−３７０．
【非特許文献１０】ＬｅｅＫＢＨｅｔａｌ．ＥｘｐＺｏｏｌ１９９２．２６４：１００−１０６．
【非特許文献１１】ＫｉｓｈｉｄａＭｅｔａｌ．ＦｉｓｈＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ１９９３．１２：１７１−１８２．
【非特許文献１２】ＢｕｅｒａｎｏＣｅｔａｌ．ＪＥｘｐＺｏｏｌ１９９５．２７３：５９−６９．
【非特許文献１３】ＭａｔｓｕｂａｒａＴｅｔａｌ．ＤｅｖＢｉｏｌ１９９９．２１３：１８−３２．
【非特許文献１４】ＴａｋｅｍｕｒａＡｅｔａｌ．ＣｏｍｐＢｉｏｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏｌ２００１．１２９Ａ：６４１−６５１．
【非特許文献１５】ＨａｍａｚａｋｉＴｅｔａｌ．ＪＥｘｐＺｏｏｌ１９８５．２３５：２６９−２７９．
【非特許文献１６】ＨｙｌｌｎｅｒＳＪｅｔａｌ．ＪＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１９９１．１３１：２２９−２３６．
【非特許文献１７】ＭｕｒａｔａＫｅｔａｌ．ＧｅｎＣｏｍｐＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１９９４．９５：２３２−２３９．
【非特許文献１８】ＳｈｉｍｉｚｕＭｅｔａｌ．ＪＦｉｓｈＢｉｏｌ２０００．５７：１７０−１８１．
【非特許文献１９】ＹａｍａｇａｍｉＫ．ＺｏｏｌＳｃｉ１９９６．１３：３３１−３４０．
【非特許文献２０】ＨａｒａＡｅｔａｌ．ＣｏｍｐＢｉｏｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏｌ１９８３．７６Ａ：１３５−１４１．
【非特許文献２１】ＨａｍａｚａｋｉＴＳｅｔａｌ．ＪＥｘｐＺｏｏｌ１９８７．２４２：３３３−３４１．
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
このビテロジェニンは、繁殖期におけるサイズ、相対量および外見からＦＳ−３に相当すると考えられ、ＦＳ−１およびＦＳ−２については未だ同定されていない。したがって、本発明は、メダカにおける他の雌特異蛋白を同定し、その特徴を明らかにすることを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記目的の下に鋭意研究した結果、本発明者らは、卵黄抽出物に対する抗血清と免疫反応する成分を検出した。この成分は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における分子量が１３０ｋＤａであり、抗原性および分子量の点でも以前に報告されたビテロジェニンおよびコリオジェニンと異なるものである。
【００１６】
かくして、本発明の第１局面によれば、メダカ由来の雌特異卵黄関連蛋白であって、ゲル濾過による分子量が実質的に４６０ｋＤａであり、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が実質的に１３０ｋＤａであることを特徴とする卵黄関連蛋白が提供される。
【００１７】
本発明において、ゲル濾過による分子量は、例えば、スーパーローズ６（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などを用いて０．０２Ｍのトリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．０、２％ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ_３）により３０ｍｌ／ｈｒ、フラクションサイズ０．５ｍｌの条件下に適当な分子量マーカーとの対比で測定することができ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における分子量は、例えば、７．５％ゲルを用いて適当な分子量マーカーとの対比で測定することができ、「実質的に」とは、適当な分子量マーカーとの対比で測定されたことを意味する。
【００１８】
本発明の卵黄関連蛋白は抗原性を有している。したがって、本発明の卵黄関連蛋白に対する各種の抗体は公知の方法により容易に取得できる。かくして、本発明の第二の局面によれば、本発明の卵黄関連蛋白に対する抗体が提供される。
【００１９】
当該各種抗体を用いることにより、本発明の卵黄関連蛋白を免疫学的測定法によって容易に測定できる。かくして、本発明の第三の局面によれば、上記卵黄関連蛋白に対する第一の抗体を担体に固定し、被験試料を前記担体に接触させて該被験試料中に含まれる前記卵黄関連蛋白を担体に固定された前記第一の抗体に捕捉させた後、前記卵黄関連蛋白に対する第二の抗体を適当な標識物質で標識して前記担体と接触させることにより、前記第二の抗体を担体に捕捉された前記卵黄関連蛋白に捕捉させ、担体に捕捉された第二の抗体を検出することにより前記被験試料中の卵黄関連蛋白を検出する免疫学的測定法が提供される。
【００２０】
さらに、本発明の第四の局面によれば、上記卵黄関連蛋白に対する第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記卵黄関連蛋白に対する第二の抗体と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる蛋白と第二の抗体との複合体を前記捕捉部位に捕捉させることによって前記卵黄関連蛋白を検出することを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。
【００２１】
さらに、本発明の第四の局面によれば、上記卵黄関連蛋白に対する第一の抗体と、前記卵黄関連蛋白に対する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記抗体の何れか一方は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記抗体の他方は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されてなる前記卵黄関連蛋白検出用イムノクロマト法テストストリップが提供される。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の卵黄関連蛋白（以下ＹＲＰとも言う）は、雌のメダカに特異的な蛋白であり、雌メダカの血液、腹水などの体液から分離・精製できる。ＹＲＰはエステラジオール−１７（Ｅ２）などのエストロゲンを投与することによって腹水に大量に蓄積されることから、エストロゲン投与された雌メダカの腹水から分離・精製することが好ましい。
【００２３】
体液からのＹＲＰの精製は、常法にしたがって行うことができる。例えば、腹水をリン酸緩衝食塩水などと混合して遠心分離し、さらに、透析、カラムクロマトグラフィー、限外濾過、ゲル濾過などの各種精製法を組み合わせることにより行える。透析は、各種の塩類水溶液を用いて行うことができ、塩類水溶液としてはリン酸カリ水溶液が好ましい。カラムクロマトグラフィーに用いられる充填剤としては、ヒドロキシアパタイトが好ましい。カラムクロマトグラフィーの操作条件は、カラムの充填剤の種類、充填層の系および長さ、ＹＲＰの濃度、不純物の種類および濃度などに応じて、適宜、決定される。溶出液としては、通常は、リン酸カリウム水溶液が好適に使用されるが、リン酸カリウム水溶液以外の溶出液を使用することを妨げない。なお、溶出はステップワイズ法によることが好ましい。ゲル濾過に使用されるゲルとしては、スーパーローズ６（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６）（ファルマシア、ウプサラ、スエーデンＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｒａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などが挙げらる。
【００２４】
ＹＲＰは、アプロチニンなどの適当な助剤を所望により添加し、−３５℃のような低温で凍結または凍結乾燥して保存できる。
【００２５】
ＹＲＰは、ビテロジェニンと同様に、エストロゲンによって誘導される雌特異蛋白であり、環境ホルモンに曝露された雄メダカにおいても誘導される。また、ＹＲＰは、ビテロジェニンよりも、エストロゲンおよびそれに類似の環境ホルモンに対する感受性が高いと考えられる。したがって、メダカの抗ＹＲＰ抗体を用いてメダカのＹＲＰを測定することにより、高感度の環境ホルモン免疫測定系を構築できる。免疫測定系としては、例えば、ＥＬＩＳＡ測定系やイムノクロマトグラフィー測定法が挙げられ、これらの測定法に基づく各種免疫学的測定キットを作成することにより、メダカ血中のＹＲＰの検出を容易に行うことができる。抗ＹＲＰ抗体は、公知の方法に従い、ＹＲＰを用いて動物を免疫し、その抗血清を得ることにより容易に調製できる。
【００２６】
イムノクロマトグラフィー測定法は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。一般に、イムノクロマト法テストストリップは、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の抗体と、前記抗原の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されて構成される。具体的には、例えば、図８に示されるイムノクロマト法テストストリップが挙げられる。第一および第二の抗体は何れもポリクローナル抗体（抗血清）であってもよく、また、何れか一方または両方がモノクローナル抗体であってもよい。
【００２７】
図８において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示している。図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。該膜担体３には、そのクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第一の抗体が固定され、検体の捕捉部位３１が形成される。図示の例では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位３１を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
【００２８】
含浸部材２は、第二の抗体を含浸せしめた部材からなる。当該第二の抗体は、適当な標識物質で予め標識される。図示の例では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
【００２９】
第二の抗体の標識物質としては、使用可能なものであればいかなる物質であってもよく、呈色標識物質、酵素標識物質、放射線標識物質などが挙げられる。このうち、捕捉部位３１での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便にに判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。当該含浸部材２は、標識された第二の抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
【００３０】
図８に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３のクロマト展開の開始点側（すなわち図８の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図８の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上に、含浸部材２の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して本発明のイムノクロマト法テストストリップを作成できる。さらに、必要に応じて、含浸部材２の上面に試料添加用部材５の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着してもよく、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめることもできる。
【００３１】
試料添加用部材５としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。吸収用部材４は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
【００３２】
さらに、市販品の場合、図８のイムノクロマト法テストストリップは、試料添加用部材５と捕捉部位３１の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容されて提供される。
【００３３】
かくして、適当な展開溶媒中に所定量の生体試料を混合してクロマト展開可能な混合液を被験試料として得た後、当該混合液を図８に示されるイムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材５上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材５を通過して含浸部材２において、標識された第二の抗体と混合する。その際、該混合液中に検体が存在すれば、抗原抗体反応により検体と第二の抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位３１に到達し、そこに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉される。このとき、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により発色するので、直ちに、検体の有無を判定することができる。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
なお、実施例中の実験操作は、下記に従った。
【００３５】
抗血清の調製
メダカ腹水及び卵抽出物に対する抗血清（抗腹水及び抗卵抽出物抗体）は市販の製品を用いた。
メダカのビテロジェニンとＹＲＰに対する抗血清は、１ｍｇの精製蛋白質全量をフロインド完全アジュバント（Ｉａｔｒｏｎ；Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に乳化して、ウサギに皮内注射して得た。注射は１週間間隔で４回行った。抗血清は、最後の注射の１週間後に、耳の静脈から採取した。幾らかの交差反応が、ビテロジェニンに対する抗血清はＹＲＰとの間で、ＹＰＲに対する抗血清はビテロジェニンとの間で存在したので、ビテロジェニンおよびＹＲＰに対する特異的抗血清は、それらを精製されたＹＲＰおよびビテロジェニンのそれぞれに吸収させることにより調製した。
【００３６】
電気泳動
レムリの方法（ＬａｅｍｍｌｉＵＫ．１９７０．Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５．）に従い、３％のスタッキングゲルおよび７．５％または５〜２２．５％のグラジエント分離ゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により行った。サンプルは、２％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有する等量のサンプル緩衝液（必要に応じ５％の２−メルカプトエタノールを含有）で、１００℃、１０分間処理した。５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、４００ｍＭグリシンおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で、スタッキングゲルでは１６ｍＡ、分離ゲルでは２４ｍＡにて、ブロモフェノールブルー染料先端がゲルの底に達するまで泳動を行った。ゲルは、４０％エタノール−１０％酢酸溶液中の０．１％クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブリリアントブルーＲ２５０（ＣＢＢ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により１時間染色し、２０％エタノール−５％酢酸−２．５％グリセロール溶液で、一晩、脱色した。場合により、ゲルは、市販キット（Ａｔｔｏ；Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した銀染色により可視化した。
【００３７】
分子量の測定はプレシジョンマーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｍａｒｋｅｒ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して行った。
【００３８】
リポ蛋白質、糖蛋白質およびリン蛋白質を染色する際には、３％スタッキングゲルと７．５％分離ゲルを用いたＰＡＧＥ（ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）を行った。サンプルは４０％蔗糖と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同じ操作条件で、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−４００ｍＭグリシンの溶液中で泳動させた。リポ蛋白質はスーダンブラックＢ（Ｍｅｒｃｋ；Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。糖蛋白質はＺａｃｈａｒｉｕｓおよびＺｅｌｌの方法（ＺａｃｈａｒｉｕｓＲＭ，ＺｅｌｌＴＥ．１９６９．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ３０：１４８−１５２．）に従い、過ヨウ素酸−シッフ試薬（Ｍｅｒｃｋ）で染色した。リン蛋白質はＣｕｔｔｉｎｇおよびＲｏｔｈの方法（ＣｕｔｔｉｎｇＪＡ，ＲｏｔｈＴＦ．１９７３．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ５４：３８６−３９４．）により、メチルグリーン（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ；Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で染色した。
【００３９】
ウェスターンブロット法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した蛋白質を、Ｔｏｗｂｉｎらの方法（ＴｏｗｂｉｎＨｅｔａｌ．１９７９．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７６：４３５０−４３５４．）によって、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の上に電気ブロットした。その後、膜を３０分間振盪しつつトリス（Ｔｒｉｓ）−緩衝食塩水（２０ｍＭトリスおよび５００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．５；以下「ＴＢＳ」という）中の５％スキムミルクでブロックした。次いで、この膜を、ＴＢＳで１：５００−４０００に希釈した１次抗血清とともに、室温で２時間インキュベートし、０．０５％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有するＴＢＳで５分間の洗浄を２回、ＴＢＳでの洗浄を１回行った。次いで、この膜を、２次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とともに室温で１時間インキュベートした。上記と同様に洗浄した後、抗原−抗体反応を、ＨＲＰ発色試薬（０．０６％の４−クロロ−１−ナフトールおよび０．０２％の過酸化水素を含有するＴＢＳ）により可視化した。
【００４０】
実施例１（魚とホルモンの投与）
市販のメダカ稚魚を、天然の光周期および環境温度の下に水槽に入れて数週間馴致した。魚には、１日に１回、市販飼料を与えた。魚が成熟したときに、雄および雌のそれぞれから、尾を切りマイクロヘマトクリットピペット（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ；Ｂｒｏｏｍａｌｌ，ＰＡ）で血液を採取した。これを４５００ｇ（ｇは重力の加速度。以下同様）で５分間遠心分離して血清を取得し、使用するまで−３５℃にて保存した。また、飼育中の雌から卵を採取した。
【００４１】
ホルモン投与のため、ハラ他（ＨａｒａＡｅｔａｌ．１９８３．ＣｏｍｐＢｉｏｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏｌ７６Ａ：１３５−１４１．）に記載されているように、エステラジオール−１７（Ｅ２）を含有する飼料を魚に与えた。Ｅ２投与の結果、腹水が蓄積した。この腹水をシリンジで採取し、アプロチニン（Ｔａｋａｒａ；Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を０．８４ＴＩＵ／ｍｌ添加した後、使用するまで−３５℃で保存した。
【００４２】
得られた雌と雄の血清及び腹水を電気泳動にかけ、泳動パターンを比較した。その結果を、図１に示す。図１において、「ｍａｌｅｓｅｒｕｍ」、「ｆｅｍａｌｅｓｅｒｕｍ」および「ａｓｃｉｔｅｓ」はそれぞれ、「雄の血清」、「雌の血清」および「腹水」を示す。
【００４３】
図１（ａ）は、ゲルを銀染色した結果を示し、図１（ｂ）は、ウエスタンブロット法によりゲルをニトロセルロース膜に転写し、卵抽出物に対する抗血清を用いて免疫染色した結果を示す。なお、電気泳動は、およそ０．１Ｌの血清と腹水を非還元条件のもとで７．５％のゲルを用いて行った。ウェスタンブロット法において、卵抽出物に対する抗血清は４０００倍希釈して一次抗体として使用した。矢印はビテロジェニン（Ｖｇ）と本発明の卵黄関連蛋白（ＹＲＰ）の移動位置を示し、
【００４４】
図１において、矢印Ｖｇは２２０ｋＤａのバンドを示し、矢印ＹＲＰは１３０ｋＤａのバンドを示す。これらのバンドは、雌の血清および腹水中にのみ検出され、雄の血清中には検出されなかった。２２０ｋＤａのバンドはメダカのビテロジェニン（ＨａｍａｚａｋｉＴＳｅｔａｌ．１９８７．ＪＥｘｐＺｏｏｌ２４２：３３３−３４１．）として知られている。しかし、１３０ｋＤａのバンドは、従来、確認されてない雌特異蛋白であり、それが卵抽出物に対する抗血清と免疫反応することから、卵黄関連蛋白（ＹＲＰ）と考えられる。
【００４５】
実施例２（腹水からの卵黄関連蛋白の精製）
実施例１で得られた腹水４ｍｌ（蛋白量５８ｍｇ／ｍｌ）を、等量の０．０１Ｍのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．０、０．０８４ＴＩＵのアプロチニンを含む）と混合し、４５００ｇで１０分間、遠心分離した。精製された腹水を０．０５Ｍリン酸カリウム（以下ＫＰと記すこともある）溶液（ｐＨ６．８、０．０３７５ＴＩＵ／ｍｌのアプロチニンを含む）で透析し、２．５×８ｃｍのヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に注入し、４℃にてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施した。１００ｍｌ／ｈｒの流速でステップワイズ法によりＫＰの濃度を下げることにより蛋白を溶出させた。図２（ａ）にその溶出パターンを示す。図２（ａ）において斜線領域は、それぞれ、ビテロジェニンおよびＹＲＰのフラクションを示す。
【００４６】
１．２ＭのＫＰで溶出されたビテロジェニンを含むフラクションを、透析チューブを使用した限外濾過によって濃縮し、スーパーローズ６（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にかけた。カラムからの溶出は、室温でＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、０．０２Ｍのトリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ８．０、２％ＮａＣｌ、０．１％のＮａＮ_３を含む）により通過速度３０ｍｌ／ｈｒ、フラクションサイズ０．５ｍｌで行った。図２（ｂ）にその溶出パターンを示す。ビテロジェニンは５７０ｋＤａの分子量に対応する主要なピークとして溶出された。ゲル濾過では、ビテロジェニンは５７０ｋＤａの主要なピークとして、上昇部分のショルダーで溶出された。したがってピークの山が下りきるまでの部分は分析のため、精製されたメダカビテロジェニンとして使用された。
【００４７】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより０．１ＭのＫＰで溶出されたＹＲＰを含むフラクションを、セントリコンプラスＣｅｎｔｒｉｃｏｎＰｌｕｓ−２０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、２０分間、１８００ｇで遠心分離することで濃縮した。次いで、アプロチニン０．０２ＴＩＵを添加後、ＹＲＰフラクションをスーパーローズ６を用いたゲル濾過によって分離した。ＹＲＰはメインピークとして溶出された。これを、同じカラムを使用して再クロマトグラフィーすることによりさらに精製した。図２（ｃ）にその溶出パターンを示す。精製されたＹＲＰの分子量はゲル濾過において４６０ｋＤａであった。
【００４８】
実施例３（精製されたビテロジェニンおよびＹＲＰの抗原性の比較）
実施例２で精製されたビテロジェニンおよびＹＲＰの抗原性を比較するために、腹水に対する抗血清（ａ−ＡＳ）を用い、１％アガロースゲル中でＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙの方法（ＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙＯ．１９５３．ＡｃｔａＰａｔｈＭｉｃｒｏｂｉｏｌＳｃａｎｄ３２：２３１−２４０．）に従い、二重免疫拡散法を行った。その結果を図３に示す。なお、図３において、ＡＳは実施例１で得られた腹水を示す。
【００４９】
図３から明らかなように、ビテロジェニンおよびＹＲＰは、それぞれ、抗血清（ａ−ＡＳ）に対して、単一の沈降素線を形成し、これらの線は互いに交差した。したがって、ビテロジェニンおよびＹＲＰは互いに異なる抗原性を持つことが示された。
【００５０】
実施例４（ビテロジェニン及びＹＲＰの非還元条件下および還元条件下における性状の対比）
実施例１で得られた腹水、実施例２で精製されたビテロジェニン及びＹＲＰ、並びに、卵抽出物を、非還元条件（左パネル）と還元条件（右パネル）でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて対比した。なお、サンプル（１０−１７ｇ）は７．５％ゲルによって分離し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０により染色した。その結果を図４に示す。なお、図４中、左パネルは非還元条件（２ＭＥ（−）：２−メルカプトエタノール未処理）における結果を示し、右パネルは還元条件（２ＭＥ（＋）：２−メルカプトエタノール処理）における結果を示す。矢印は精製されたビテロジェニン及びＹＲＰ、並びに、卵抽出物の分子量を示す。
【００５１】
図４から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、精製されたビテロジェニンおよびＹＲＰは、それぞれ、非還元条件下および還元条件下のいずれにおいても、２２０ｋＤａおよび１３０ｋＤａで主要なバンドを形成することがわかる。
【００５２】
実施例５（ビテロジェニン及びＹＲＰの物性の対比）
実施例２で精製されたビテロジェニンおよびＹＲＰを、７．５％ゲルを用いたＳＤＳを含まないネイティブ−ＰＡＧＥ（ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）により分離し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（蛋白検出用）、スーダンブラックＢ（脂質検出用）、過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（糖検出用）およびメチルグリーン（リン検出用）のそれぞれで染色した。結果を図５に示す。図５中、矢印Ｖｇはビテロジェニンの移動位置を示し、矢印ＹＲＰはＹＲＰの移動位置を示し、パネル「ＣＢＢ」はクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０による結果、パネル「ＳＢ」はスーダンブラックＢによる結果、パネル「Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ」は過ヨウ素酸シッフ試薬による結果、パネル「ＭＧ」はメチルグリーンによる結果を示す。
【００５３】
図５から、ビテロジェニンおよびＹＲＰの両者において、脂質、糖類およびリンが染色されたこと示され、ＹＲＰが糖脂質蛋白であることがわかる。
【００５４】
さらに、精製されたビテロジェニンおよびＹＲＰのアミノ酸組成（モル％）およびリン含有量（ｗ／ｗ％）を下記の方法で分析した。
【００５５】
アミノ酸分析
精製されたビテロジェニンとＹＲＰのそれぞれの凡そ２００ｇをアミノ酸分析のために凍結乾燥した。これを６ＮＨＣｌ中で、１１０℃で２４時間、加水分解した。そして、ビテロジェニンとＹＲＰのアミノ酸組成を、日立ＭｏｄｅｌＫＡＬ−３自動アミノ酸分析計（日立；東京、日本）で測定した。
【００５６】
リン含有量
精製されたビテロジェニンとＹＲＰのリン含有量を、サンプルの調製法を修正した以外ＧａｍｓｔおよびＴｒｙの方法（ＧａｍｓｔＯ，ＴｒｙＫ．１９８０．ＳｃａｎｄＪＣｌｉｎＬａｂＩｎｖｅｓｔ４０：４８３−４８６．）に従い測定した。すなわち、精製されたビテロジェニンとＹＲＰのそれぞれ約５００ｇを凍結乾燥した後、０．２Ｍの重炭酸アンモニウム溶液で透析し、１５０Ｌの２ＮＮａＯＨに再溶解した。これに１５０Ｌの２ＮＨＣｌを添加した後、４５００ｇで２０分間、遠心分離した。その後、上清の１００Ｌを新しいチューブに移し、リン含有量を測定した。
分析結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】

【００５８】
表１によれば、ＹＲＰにおいてセリンが比較的低い含有率であったことを除けば、ビテロジェニンとＹＲＰとの間ではアミノ酸組成は似ており、また、ＹＲＰのリン含有量はビテロジェニンのものの１／３０であることが示された。
【００５９】
実施例６（ビテロジェニン及びＹＲＰの抗原性の対比）
実施例１で得られた腹水、実施例２で精製されたビテロジェニンおよびＹＲＰ、並びに、卵抽出物を、非還元条件下で５〜２２．５％グラジエントゲルを用いて電気泳動を行うことにより分離し、ウエスタンブロット法に従い、ニトロセルロース膜へ転写し、ビテロジェニンに対する抗体の２０００倍希釈液、および、ＹＲＰに対する抗体の５００倍希釈液の夫々を用いてインキュベートし、免疫染色した。その結果を図６に示す。図６中、矢印に隣接する数字は免疫反応による染色バンドの分子量を示し、パネル「ａｎｔｉ−Ｖｇ」（左パネル）は抗ビテロジェニン抗体を用いた結果を示し、パネル「ａｎｔｉ−ＹＲＰ」（右パネル）は抗ＹＲＰ抗体を用いた結果を示し、レーン「ａｓｃｉｔｅｓ」は腹水、レーン「Ｖｇ」はビテロジェニン、レーン「ＹＲＰ」はＹＲＰ、レーン「ｅｇｇｅｘｔ．」は「卵抽出物」の結果を示す。
【００６０】
図６から、抗ビテロジェニン抗体はビテロジェニンを認識するが、腹水中のＹＲＰおよび精製されたＹＲＰを認識しなかった。また、抗ビテロジェニン抗体は卵抽出物中の分子量１２０、９６、６７および３６ｋＤａのバンドを認識した。これに反し、抗ＹＲＰ抗体は、ＹＲＰを認識したが、腹水中のビテロジェニンおよび精製されたビテロジェニンの何れも認識しなかった。また、卵抽出物中の２９ｋＤａのバンドは抗ＹＲＰ抗体と免疫反応した。以上から、ビテロジェニンおよびＹＲＰは免疫学的に互いに異なることが示された。
また、ＹＲＰはＥ２投与によるメダカの腹水からだけでなく、飼育されている雌メダカの血清にも存在することが確認された。したがって、ＹＲＰはＥ２投与による人為物ではない。その上、ウエスタンブロット法において抗−ＹＲＰ抗体は卵抽出物と交叉反応性を示した。これらを総合すると、Ｅ２投与により発現される腹水中のＹＲＰは雌特異蛋白であり、卵黄蛋白質と抗原性を共にすると考えられる。
【００６１】
実施例７（ビテロジェニンおよびＹＲＰの雌特異性の検討）
実施例１で得れらた雄血清およびメス血清のそれぞれを、非還元条件下で７．５％ゲルを用いて電気泳動を行うことにより分離し、ウエスタンブロット法に従い、ニトロセルロース膜へ転写し、ビテロジェニンに対する抗体の２０００倍希釈液、および、ＹＲＰに対する抗体の５００倍希釈液の夫々を用いてインキュベートし、免疫染色した。その結果を図７に示す。図７において、パネル「ａ−Ｖｇ」およびパネル「ａ−ＹＲＰ」は、それぞれ、「抗ビテロジェニン抗体」および「抗ＹＲＰ抗体」を用いた結果を示し、レーン「ｍａｌｅｓｅｒｕｍ」およびレーン「ｆｅｍａｌｅｓｅｒｕｍ」は、それぞれ、「雄血清」および「雌血清」の結果を示し、矢印は、ビテロジェニン（Ｖｇ）およびＹＲＰの移動位置を示す。
【００６２】
図７から、ビテロジェニンおよびＹＲＰは、雌血清中で検出されたが、雄血清中では検出されないことがわかる。したがって、ＹＰＲは雌特異蛋白であることが示された。
【００６３】
実施例８（金コロイド標識抗ＹＲＰ抗体溶液の作成）
（１）抗ＹＲＰ抗体の調製
上記の方法によって得られた抗血清を、さらに、常法によりプロテインＧ吸着体を用いたＩｇＧ精製を行い、抗ＹＲＰ抗体とした。
【００６４】
（２）金コロイド溶液の調製
加熱によって沸騰させた超純水９９ｍｌに、１％（ｖ／ｗ）塩化金酸水溶液１ｍｌを加え、さらに、その１分後に１％（ｖ／ｗ）クエン酸ナトリウム水溶液１．５ｍｌを加えて加熱し５分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に２００ｍＭ炭酸カリウム水溶液を加えてｐＨ９．０に調製し、これに超純水を加えて全量を１００ｍｌとして金コロイド溶液を得た。
【００６５】
（３）金コロイド標識抗ＹＲＰ抗体溶液の調製
上記で得られた抗ＹＲＰ抗体の蛋白換算重量１μｇ（以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単に、その精製蛋白質の重量分析による重量数値で示す）と上記の金コロイド溶液１ｍｌとを混合し、室温で２分間静置してこの抗体のことごとくを金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が１％となるように１０％ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と記す）水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのＢＳＡでブロックして、金コロイド標識抗ＹＲＰ抗体（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（５６００×Ｇ、３０分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を１０％サッカロース・１％ＢＳＡ・０．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。
【００６６】
実施例９（ＹＲＰ測定用クロマト法テストストリップの作成）
（１）ＹＲＰと金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体として用意した。
【００６７】
抗ＹＲＰ抗体２．０ｍｇ／ｍｌが含有されてなる溶液０．５μｌを、このクロマト展開用膜担体におけるクロマト展開開始点側の末端から７．５ｍｍの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、ＹＲＰと金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位とした。
【００６８】
（２）金コロイド標識抗体含浸部材
５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、実施例１で得られた金コロイド標識抗体溶液３７．５μｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材とした。
【００６９】
（４）クロマト法テストストリップの作成
上記クロマト展開用膜担体、上記標識抗体含浸部材の他に、被験試料注入部材として綿布と、吸収用部材として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図８を参照して上述したクロマト法テストストリップを作成した。
【００７０】
実施例１０（被験試料中の抗ＹＲＰ抗体の検出）
実施例２で得られた精製ＹＲＰを生理食塩水で希釈して、各濃度に調整し、被験試料とした。そして、被験試料１００μｌを実施例９で得られたテストストリップの被験試料注入部にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５〜３０分放置後、上記捕捉部位で捕捉されたＹＲＰと金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の４段階に区分して判定した。その結果を表１に示した。
【００７１】
また、同様の被験試料について、ＥＬＩＳＡ法で測定した。すなわち、抗ＹＲＰ抗体を０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）にタンパク濃度１０μｇ／ｍｌになるように溶解し、９６ウェルのポリスチレン製マイクロタイタープレートの各ウェルに５０μｌ入れ、室温で一夜静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸生理食塩緩衝液で３回洗浄した後、上記で調製された各濃度の試料を５０μｌ各ウェルに入れ、３７℃３時間静置した。３回洗浄した後、ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）標識抗ＹＲＰ抗体のタンパク濃度１ｍｇ／ｍｌ溶液を５０μｌ入れ、各ウェルを洗浄後、ペルオキシダーゼ発色キットＳＴの構成品であるＴＭＢＺ液（株式会社タウンズの製品）を１００μｌを加え２５℃で２０分反応させた後、２Ｎ硫酸を１００μｌずつ加え、反応を停止させ、各ウェルの色度をマイクロプレートリーダーで測定した。測定波長は４５０ｎｍであった。結果を表２に示す。
【００７２】
【表２】

【００７３】
表２から、クロマトストリップ捕捉部による判定結果は、ＥＬＩＳＡ法による判定結果と同等であり、したがって、本発明の測定法は、メダカのＹＲＰの検出に有用であることが示された。
【００７４】
【発明の効果】
本発明によれば、メダカ由来の新規な雌特異卵黄関連蛋白（ＹＲＰ）およびそれに対する抗体が提供される。本発明の雌特異卵黄関連蛋白（ＹＲＰ）は、ビテロジェニンと同様にエストロゲンによって誘導されるので、ビテロジェニンを検出する従来の環境ホルモンの測定系の代替法を構成するのに有用である。また、本発明の雌特異卵黄関連蛋白（ＹＲＰ）は、ビテロジェニンよりもエストロゲンに対する感受性が高いと考えられるため、従来の環境ホルモン測定系よりも感度の高い測定系を提供でき、さらには、ＥＬＩＳＡやイムノクロマトグラフィーなどの各種の免疫学的測定法に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】メダカの雄の血清（（レーン「ｍａｌｅｓｅｒｕｍ」）および雌の血清（レーン「ｆｅｍａｌｅｓｅｒｕｍ」）ならびに腹水（レーン「ａｓｃｉｔｅｓ」）の電気泳動パターンを示す写真であり、（ａ）は、ゲルを銀染色した結果を示し、（ｂ）は、ウエスタンブロット法により卵抽出物に対する抗血清を用いて免疫染色した結果を示す。
【図２】（ａ）はメダカの腹水のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる溶出パターンであり、（ｂ）は（ａ）で得られたビテロジェニンを含むフラクションのゲル濾過による溶出パターンであり、（ｃ）は（ａ）で得られたＹＲＰを含むフラクションのゲル濾過による溶出パターンである。
【図３】精製されたビテロジェニン（Ｖｇ）およびＹＲＰならびに腹水（ＡＳ：対照）の、腹水に対する抗血清（ａ−ＡＳ）を用いた二重免疫拡散法のチャート。
【図４】腹水（レーン「ａｓｃｉｔｅｓ」）、精製されたビテロジェニン（レーン「Ｖｇ」）およびＹＲＰ（レーン「ＹＲＰ」）、並びに、卵抽出物（レーン「ｅｇｇｅｘｔ．」）のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す写真であり、左パネル（２ＭＥ（−））は非還元条件における結果を示し、右パネル（２ＭＥ（＋））は還元条件における結果を示す。
【図５】精製されたビテロジェニン（レーン「Ｖｇ」）およびＹＲＰ（レーン「ＹＲＰ」）をネイティブ−ＰＡＧＥ（ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）にかけ、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０（パネル「ＣＢＢ」）、スーダンブラックＢ（パネル「ＳＢ」）、過ヨウ素酸シッフ試薬（パネル「Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ」）、メチルグリーンパターン（パネル「ＭＧ」）によって染色した結果を示す写真。
【図６】腹水（レーン「ａｓｃｉｔｅｓ」）、精製されたビテロジェニン（レーン「Ｖｇ」）およびＹＲＰ（レーン「ＹＲＰ」）、並びに、卵抽出物（レーン「ｅｇｇｅｘｔ．」）を、非還元条件下で電気泳動した写真であり、ウエスタンブロット法により、ビテロジェニンに対する抗体（左パネル「ａｎｔｉ−Ｖｇ」）、および、ＹＲＰに対する抗体（右パネル「ａｎｔｉ−ＹＲＰ」）の夫々を用いて免疫染色した結果を示す。
【図７】メダカの雄血清（レーン「ｍａｌｅｓｅｒｕｍ」）およびメス血清（レーン「ｆｅｍａｌｅｓｅｒｕｍ」）のそれぞれを、非還元条件下で電気泳動した写真であり、ウエスタンブロット法により、ビテロジェニンに対する抗体（左パネル「ａｎｔｉ−Ｖｇ」）、および、ＹＲＰに対する抗体（右パネル「ａｎｔｉ−ＹＲＰ」）の夫々を用いて免疫染色した結果を示す。
【図８】ａはイムノクロマト法テストストリップの平面図、ｂはａで示されたイムノクロマト法テストストリップの縦断面図。
【符号の説明】
１粘着シート
２含浸部材
３膜担体
３１捕捉部位
４吸収用部材
５試料添加用部材

Claims

メダカ由来の雌特異卵黄関連蛋白であって、ゲル濾過による分子量が実質的に４６０ｋＤａであり、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が実質的に１３０ｋＤａであることを特徴とする卵黄関連蛋白。
請求項１の卵黄関連蛋白に対する抗体。
請求項１の卵黄関連蛋白に対する第一の抗体を担体に固定し、被験試料を前記担体に接触させて該被験試料中に含まれる前記卵黄関連蛋白を担体に固定された前記第一の抗体に捕捉させた後、前記卵黄関連蛋白に対する第二の抗体を適当な標識物質で標識して前記担体と接触させることにより、前記第二の抗体を担体に捕捉された前記卵黄関連蛋白に捕捉させ、担体に捕捉された第二の抗体を検出することにより前記被験試料中の卵黄関連蛋白を検出する免疫学的測定法。
請求項１の卵黄関連蛋白に対する第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記卵黄関連蛋白に対する第二の抗体と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる蛋白と第二の抗体との複合体を前記捕捉部位に捕捉させることによって前記卵黄関連蛋白を検出することを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法。
前記第二の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項４に記載の測定法。
前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項４に記載の測定法。
前記第一および第二の抗体は抗血清である請求項４に記載の測定法。
請求項１の卵黄関連蛋白に対する第一の抗体と、前記卵黄関連蛋白に対する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記抗体の何れか一方は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記抗体の他方は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されてなる前記卵黄関連蛋白検出用イムノクロマト法テストストリップ。
前記標識物質が金コロイドまたはラテックスである請求項８に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項８に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
前記第一および第二の抗体は抗血清である請求項８に記載のイムノクロマト法テストストリップ。