JP2004132954A

JP2004132954A - 一個または複数個の分析物を検出するための方法および装置、ならびに装置の使用

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Publication number: JP2004132954A
Application number: JP2003181271A
Authority: JP
Inventors: Edgar Diessel; エドガー　ディーセル; Werner Hoheisel; ヴェルナー　ホーアイゼル; Udo Merker; ウド　メルカー; Jens Burmeister; イェンス　ブルマイスター; Burkhard Koehler; ブルクハルト　ケーラー
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2002-06-25
Filing date: 2003-06-25
Publication date: 2004-04-30
Also published as: DE10228260A1; AU2003204954A1; US20040157263A1; CA2432864A1; EP1376128A1

Abstract

【課題】認識反応によって分析物を検出するための測定方法。
【解決手段】分析物のための認識要素を有する生体機能的表面を有する測定電極、一個または複数個の対電極、測定電極と対電極との間の電解液を有する装置を提供し、電気的に活性の標識単位で標識化された分析物を、生体機能的表面と接触させ、その際、電気的に活性の標識単位は、生体機能的表面と分析物とを接触させる前か接触させた後に分析物と結合し、第１対電極と測定電極との間に、時間的に変動する電圧または時間的に変動する電流を供給し、第１対電極と測定電極との間の電流または電圧を測定するか、あるいは、第２対電極または他の電極と測定電極との間の電流または電圧を測定することを特徴とする方法によって解決される。
【選択図】　　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の分析物の定性的および／または定量的なインピーダンス検出のための方法、ならびにその方法を実施するための装置に関する。方法は有利には、水性媒体中での生物学的関連分子の特異的検出を含む。このようなセンサーの原理であるか、あるいはこのようなセンサーは、たとえば、環境分析、食品工業、ヒト医学および獣医学における診断、農作物保護および生化学的研究または製薬学的研究の広範囲の適用を有する。
【０００２】
【従来の技術】
このような診断的適用に関して、生体機能的表面および物理的シグナルトランスデューサーを有するバイオセンサーまたは化学センサーは公知である。
【０００３】
検出の間に、認識反応によって分析物と特異的に結合する生物学的、化学的または生化学的認識素子、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、レセプターは、生体機能的表面に結合される。
【０００４】
認識反応の例としては、リガンドと錯体との結合、イオンの封鎖、リガンドと（生物学的）レセプター、膜レセプターまたはイオンチャンネルとの結合、抗原またはハプテンと抗体との結合（イムノアッセイ）、基質と酵素との結合、ＤＮＡまたはＲＮＡと特異的タンパク質との結合、アプタマーまたは“ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ”とその標的との結合、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＰＮＡまたは他の核酸類似体のハイブリダーゼーション（ＤＮＡアッセイ）、または酵素による基質のプロセシングである。
【０００５】
検出すべき分析物の例はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、核酸類似体、酵素基質、ペプチド、タンパク質、ポテンシャル活性化剤（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ）、薬剤、細胞または細菌である。
【０００６】
検出すべき分析物と結合する認識要素の例は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、核酸類似体、アプタマー“ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ”、ペプチド、タンパク質、金属／金属イオン封鎖剤、シクロデキストリン、クラウンエーテル、抗体またはそれらのフラグメント、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、酵素、レセプター、膜レセプター、イオンチャンネル、細胞接着タンパク質、ガングリオシド、またはモノ−またはオリゴサッカリドである。
【０００７】
認識要素は、生体機能的表面に対して共有的にかまたは非共有的に結合することができる。認識要素、たとえばＤＮＡのセンサー表面上への共有的固定化は、安定性、再現性および結合特異性の点で、非共有結合よりも明らかに有利である。ＤＮＡ−被覆表面を製造するための方法の概要は、Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．，２００１，８，１２１３−１２４４に記載されている。
【０００８】
非共有結合の例は、ガラス担体上へのｃＤＮＡのスポッティングであり、この上に予めポリライシンが吸着されている。
【０００９】
種々の認識要素が、互いに空間的に独立する程度に、シグナルトランスデューサーの表面と結合する場合には、多くの認識反応が、試験すべき試料を用いて同時におこなうことができる。これは、たとえば、いわゆるＤＮＡアレイ中でおこなわれ、その際、種々のＤＮＡ配列（たとえば、オリグヌクレオチドまたはｃＤＮＡｓ）は、固体担体（たとえばガラス）上に固定化される。このようなＤＮＡアレイは、一般には、光学的方法を用いてか、あるいは二者択一的に、電気的方法を用いて読み取られ、かつこれらは、発現プロファイリング、シークエンシング、ウイルスまたは細菌の核酸の検出、遺伝子型分析において使用される。
【００１０】
バイオセンサーまたは化学センサー中での認識反応は、光学的、電気的／電気化学的、機械的および磁気的なシグナルトランスダクション法を用いて検出されてもよい。
【００１１】
最も進んだ前記光学的方法は、特に高い感受性を有してるが、これらは、一般的には制限された範囲でのみ小型化することができ、それというのも、光源、センサーおよび光検出器を含む複合構造のためである。したがって、これらは、電気的方法と比べて、製造コストの点で依然として劣る。
【００１２】
これらの理由から、電気センサーを改良に関する重要性が増している。特に、半導体技術からの微小加工技術の使用は、高い感受性を有する小型化された大きさを導く。ＤＥ４３１８５１９およびＷＯ９７／２１０９４では、２個の電極間に固定化された、未標識抗体またはＤＮＡと抗原または完全長ＤＮＡとの特異的結合をインピーダンスの測定によって検出するための、微小構造化電極装置を使用している。特に、検出すべき分子は、ＤＥ−Ａ４３１８５１９中では、可逆的に還元または酸化可能な分子で標識化されており、その結果、増幅効果が、これらのインターデジタル構造中での電気化学的再循環によって達成される。
【００１３】
電気化学的シグナルを増幅させるもう一つの方法は、ポリマーの酵素誘導による堆積を含み、この場合、これは、電子伝達抵抗を著しく増加させるものである（Ｐａｔｏｌｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｎｇｍｕｉｒ　１５，　３７０３　（１９９９））。
【００１４】
電気化学的方法は、実際の試料、たとえば体液中に存在するような電気活性物質の非特異的な検出によって折衷（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）されてもよい。
【００１５】
電解効果トランジスタは、荷電分子、または荷電分子とリガンドとの複合体を検出するために使用される（ＵＳ６２０３９８１）。
【００１６】
ナノ粒子は、二者択一的な基板材料として使用することができる。ＥＰ−Ａ１０２２５６０Ａ１では、ナノ粒子ネットワークの導電性は、リガンド吸着にによって改変されている。ＷＯ０１／１３４３２Ａ１では、単一の電子トランジスタとしての独立したナノ粒子の使用が開示されており、この電流−電圧特性は、リガンド吸着によって左右される。
【００１７】
電界効果トランジスタに基づくこれらの概念において、センサー表面上への標的化されたリガンドの吸着と荷電分子の非特異的吸着との間の干渉作用は、実際の試料、たとえば血液または尿中で生じうる。
【００１８】
分析物に対して標識単位を使用し、その際、標識単位の性質が、分析すべき試料の性質とは全く異なっている方法は、この点に関しては優れている。この目的のために、たとえば、金属ナノ粒子が標識単位として適している。
【００１９】
ＵＳ５８５８６６６では、電気的バイオセンサー技術中での標識単位としての、金属ナノ粒子の使用が開示されている。ＤＣ測定の範囲において、金属ナノ粒子を含む特定の電気的バイオセンサーは、単一分子の範囲よりも、特に高い感受性のための電位を有している。この電位は、特に自動金属組織的堆積によって促進される。このいわゆる光学顕微鏡および電子顕微鏡から公知の自動金属組織学（ａｕｔｏｍｅｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）的方法において、ナノ粒子またはコロイドは、還元剤からＡｕまたはＡｇイオンへの電子伝達のための触媒として作用し、この場合、増幅溶液は、塩の形でのＡｇまたはＡｕと一緒に還元剤、たとえばヒドロキノンを含有する。反応が生じた後に、イオンは、金属としてコロイド上に堆積する。絶縁体によって互いに分離されている電極対は、最終的に電気的シグナルトランスデューサーとして選択される。オートメタログラフィック成長（ａｕｔｏｍｅｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ　ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ）によって、ナノ粒子で標識化された分析物分子は、電極間に導電性の架橋を形成し、かつ、これは、ＤＣ抵抗測定によって検出される。これに関しての重要な特許は、ＵＳ−Ａ４７９４０８９；ＵＳ−Ａ５１３７８２７；ＵＳ−Ａ５２８４７４８である。他の開示は、ＤＥ−Ａ１９８６０５４７、ＷＯ９９／５７５５０およびＷＯ０１／００８７６で見出すことができる。ＤＣ抵抗測定による核酸の検出が示されている（Ｍｏｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｎｇｍｕｉｒ，　１７，　５４２６　（２００１））。この方法をさらに発展させることによって、点変異の識別（一本鎖ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ））が、Ｐａｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５　１５０３（２００２）によって記載されている。
【００２０】
これら２個の実施態様において、オートメタログラフィック工程後の電極間隔は、粒子よりも極めて大きい（約１００〜１０００倍）。したがって、電流の流れを可能にするために、パーコレーション経路を電極間に形成する必要がある。これは、測定方法のダイナミックレンジを著しく制限するものであり、したがって、これらの方法は一般には、閾値法（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｖａｌｕｅ）としてのみ一般的に使用される。ダイナミックレンジは、極めて精巧な自動金属組織学成長方法によってのみ助長され、この場合、これは、バイオセンサーにおける実際の使用では推奨されない。
【００２１】
【特許文献１】
ＤＥ４３１８５１９
【特許文献２】
ＷＯ９７／２１０９４
【特許文献３】
ＥＰ−Ａ１０２２５６０Ａ１
【特許文献４】
ＷＯ０１／１３４３２Ａ１
【特許文献５】
ＵＳ５８５８６６６
【特許文献６】
ＵＳ−Ａ４７９４０８９
【特許文献７】
ＵＳ−Ａ５１３７８２７
【特許文献８】
ＵＳ−Ａ５２８４７４８
【特許文献９】
ＤＥ−Ａ１９８６０５４７
【特許文献１０】
ＷＯ９９／５７５５０
【特許文献１１】
ＷＯ０１／００８７６
【非特許文献１】
Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．，２００１，８，１２１３−１２４４
【非特許文献２】
Ｐａｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５　１５０３（２００２）
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高い感受性を有する電気センサーおよび認識反応によって分析物を検出するための測定方法を開発することに関し、この場合、この方法は、高い感受性を有し、さらには、検出すべき分析物の量に対して定量化することができる。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、認識反応を用いて、一個または複数個の分析物を検出するための方法によって達成され、この場合、この方法は、
（ａ）（ｉ）生体機能的表面を有する測定電極、その際、生体機能的表面は、分析物のための認識要素を有しており、
（ｉｉ）一個または複数個の対電極、
（ｉｉｉ）測定電極と対電極との間の電解液
を有する装置を提供し、
（ｂ）電気的に活性の標識単位で標識化された分析物を、生体機能的表面と接触させ、その際、電気的に活性の標識単位は、生体機能的表面と分析物とを接触させる前に分析物と結合しているか、あるいは、分析物と生体機能的表面とを接触させた後に分析物と結合し、
（ｃ）第１対電極と測定電極との間に（ｉ）時間的に変動する電圧を印加または（ｉｉ）時間的に変動する電流を供給し、かつ、
（ｄ１）第１対電極と測定電極との間において、（ｃ）（ｉ）の場合には電流または（ｃ）（ｉｉ）の場合には電圧を測定するか、あるいは、
（ｄ２）第２対電極または他の電極と測定電極との間において、（ｃ）（ｉ）の場合には電流、または（ｃ）（ｉｉ）の場合には電圧を測定することを含む。
【００２４】
本発明によれば、分析物のための認識要素は、生体機能的表面を有する測定電極と結合する。分析物を、認識要素と一緒に認識反応中に装入する。
【００２５】
時間的に変動する電圧または時間的に変動する電流は、測定電極と対電極との間に供給される。時間的に変動する電圧は、たとえば、ＡＣ電圧またはパルス電圧であってもよく、かつ時間的に変動する電流は、たとえば、交流電流またはパルス電流であってもよい。
【００２６】
時間的に変動する電圧または時間的に変動する電流が供給される場合には、特別なインピーダンスを有するヘルムホルツ二重層が電極で形成される。このヘルムホルツ二重層のインピーダンスは、電気的に活性の標識単位で標識化された分析物が、たとえば、認識反応によって生体機能的表面と結合する場合に改変され、それというのも、測定電極の面積は、電気的に活性の標識単位によって、特に、導電性標識単位と測定電極とを電気的に接触させることによって増加するためである。
【００２７】
分析物は、たとえば、認識要素と結合させる前に電気的に活性の標識単位ですでに標識化されていてもよいか、あるいは二者択一的に、認識要素と結合させるまで標識化されず、その後に、標識単位で標識化された結合した要素は、認識要素と分子とから成る複合体と結合する。
【００２８】
本発明による方法を用いて、単一の標識単位による、すなわち一般的には単一標識化分析物によるインピーダンスの改変を検出することは可能である。それぞれの標識単位は、他の標識単位とは独立してシグナル測定に寄与する。さらに分析物分子は、複数個の標識化単位を用いて提供されてもよく、これによって、さらに方法の感受性が増加する。
【００２９】
認識要素は、当業者に公知の従来の方法によって、測定電極の表面上に固定化される。ＤＮＡ認識単位に関しては、この固定化は、たとえば、Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｃｕｒｒ，Ｍｅｄ．，２００１，８，１２１３−１２４４に記載されている。
【００３０】
電極表面上での固定化に関しては、最適な密度の認識単位を有することが好ましく、その際、高い表面密度は、認識単位の最適化された活性が確立する。
【００３１】
認識要素、たとえば抗体は、共有的にかまたは非共有的に固定化されてもよい。たとえば、アビジンまたはストレプトアビジンは、表面上で物理吸着されてよいか、表面の適した生物学的官能化の後に、共有的に固定化されてもよい。たとえば、ビオチン化抗体は、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された表面上で特異的に固定化することができる。
【００３２】
二重層のキャパシタンスは、適した等価回路図を用いて、インピーダンス測定により計算処理的に導き出すことができる。
【００３３】
インピーダンス測定の動作点（ｗｏｒｋｉｎｇ　ｐｏｉｎｔ）を調整するために、ＤＣ電圧または直流電流を、それぞれ時間的に変動する電圧または時間的に変動する電流に加えてもよい。
【００３４】
本発明による方法は、たとえば、イムノアッセイまたはＤＮＡアッセイ中で使用することができる。好ましくはＤＮＡアッセイは、ウイルス性ＤＮＡまたはＲＮＡ、または細菌の種のＤＮＡを検出するために使用され、さらには発現プロファイリング、遺伝疾病診断または薬理遺伝学（薬剤の遺伝関連活性または副作用）のため、または栄養遺伝学（食物の遺伝関連活性または副作用）のための遺伝子型分析に使用される。特に、一つのみの塩基の多様性（一本鎖ヌクレオチド多形＝ＳＮＰ）による遺伝子の改変は、遺伝子型分析において決定される。
【００３５】
さらに、分析物は、認識反応を用いて間接的に検出されてもよい。間接的検出の場合には、認識要素と結合する前に、すでに標識単位で標識化された分析物を、生体機能的表面と接触させる。同時に、未標識分析物をさらに生体機能的表面と接触させる。これら２種は、固定化された認識要素との結合において競合する。測定電極と対電極との間の電解液中に未標識分析物が存在しない場合には、その後に認識要素上のすべての結合部位は、標識化分析物によって占められ、かつインピーダンスの改変は最大になりうる。未標識分析物がゼロ濃度でない場合においては、認識要素上のいくつかの結合部位は、未標識分析物によって占められてもよく、かついくつかは本発明の濃度によれば標識化分析物によって占められてもよく、したがって、インピーダンスの改変は、未標識分析物の濃度がゼロである場合と比べて少ない。
【００３６】
本発明による方法において、分析物は、電気的に活性の標識単位で標識される。
【００３７】
電気的活性は、標識単位のために使用される材料の電気的導電性からなってもよく、この場合、この導電性は、金属の導電性の範囲であることが好ましい。
【００３８】
導電性材料、たとえばＡｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｃｕまたは炭素のナノ粒子、金属錯体および／またはクラスターは、電気的に活性の標識単位として使用されてもよい。
【００３９】
しかしながら、電気的活性は、標識単位のために使用される材料の誘電性の性質から成る。標識単位の誘電率は、有利には５〜１５０００、特に好ましくは１０〜１５００の範囲である。
【００４０】
電気的に活性の標識単位の大きさは、好ましくは、１〜１００ｎｍ、好ましくは１〜３０ｎｍの範囲であり、特に好ましくは１〜２ｎｍの範囲である。５０〜１５０原子から成るクラスターは、この場合、１〜２ｎｍの範囲の大きさを有しており、特に好ましいものである。定義された大きさは、この場合、標識単位の最も大きい直径を意味する。
【００４１】
高い誘電率を有する標識単位は、チタネート、ペロフスカイト格子の形で結晶化する材料、ＴｉＯ_２または鉛化合物から成るナノ粒子またはクラスターであってもよい。これらは、しばしば１〜１００ｎｍの範囲の大きさを有する。たとえば、ＰｂＳＯ_４は、１００ＭＨｚで誘電率１４に達し、かつ、ＢａＴｉＯ_３は１００ｋＨｚで誘電率３６００に達する。それぞれの周波数依存性は比較する場合にのみ考慮に入れるべきである。
【００４２】
カーボン“ナノチューブ”、導電性被覆を有する非導電性粒子、または金属被覆を有する非導電性粒子は、さらに、標識単位として使用されてもよい。たとえば、非導電性粒子は、ポリスチレンビーズであってもよい。導電性の性質は、カーボン“ナノチューブ”の場合には、制御された方法で調整することができる。
【００４３】
さらに標識単位は、導電性ポリマー、たとえばポリアニリン、ポリチオフェン、特にポリエチレン、ジオキシチオフェン、ポリフェニレン、ポリフェニレンビニレン、ポリチオフェンビニレンまたはポリピロールからなっていてもよい。
【００４４】
酵素、たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がさらに標識単位として使用されてもよい。ＨＲＰは、電気的に導電性のポリマー、たとえばポリアニリンのモノマー（基質）の重合を導く。
【００４５】
本発明によるＨＲＰの他の使用は、たとえば、前記に示されたすべての標識単位のナノ粒子が、直接的にかまたはビオチン−ストレプトアビジン、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎＴＭ（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ　ＴＭ，　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ：　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，　ＩＬ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）を介して間接的に結合するポリマーの堆積である。間接的な結合の場合には、ポリマーはビオチン化される。この原理は、接触的レポーター堆積法（ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＣＡＲＤ）による。
【００４６】
標識単位の適した成長は、たとえば、ＡｇまたはＡｕのような金属コロイドのオートメタログラフィック成長によって達成することができ、特に、高い感受性を達成するのに有利である。
【００４７】
分析物の検出は、電解液のような水性媒体中で実施される。体液、たとえば血液、尿、間質液および涙液は、水性媒体として好ましい。
【００４８】
さらに本発明は、認識反応を用いて、一個または複数個の分析物を検出するための装置に関し、この場合、この装置は、
（ａ）生体機能的表面を有する少なくとも一つの測定電極、その際、生体機能的表面は、分析物のための認識要素を有しており、
（ｂ）一個または複数個の対電極、
（ｃ）測定電極と対電極との間の電解液、
（ｄ）電気的に活性の標識単位で標識化され、かつ、生体機能的表面の認識要素と接触されうる分析物、
（ｅ）第１対電極と測定電極との間において、（ｉ）時間的に変動する電圧を印加するための電圧源または（ｉｉ）時間的に変動する電流を供給するための電流源、および
（ｆ）（ｉ）第１対電極と測定電極との間において（ｅ）（ｉ）の場合に電流または（ｅ）（ｉｉ）の場合に電圧を測定するか、あるいは
（ｉｉ）第２対電極または他の電極と測定電極との間において、（ｅ）（ｉ）の場合に電流または（ｅ）（ｉｉ）の場合に電圧を測定するための測定装置を含む。
【００４９】
本発明による装置において、測定電極、対電極、電解液、認識要素、分析物および電気的に活性の標識単位は、このましくは、方法に関して記載されたような性質を有する。
【００５０】
測定電極の表面は、複数個の導電性領域に分かれていてもよい。
【００５１】
本発明による電極は、平面的または非平面的な配置で配列されてもよい。
【００５２】
単一分子の範囲よりも高い感受性は、１〜２０ｘ１〜２０μｍ^２、好ましくは５〜１５ｘ５〜１５μｍ^２、特に好ましくは１０ｘ１０μｍ^２の面積を有する微小電極に基づくインピーダンス測定によって与えられ、その際、それぞれの標識単位、たとえば、オートメタログラフィック成長Ａｕコロイドは、数パーセントの大きさで電極の面積を増加させる。たとえば、１０ｘ１０μｍ^２の独立した電極面積によって、１０ｘ１０μｍ^２の大きさを有するチップ上で１０^６個の要素を取り付けることが可能である。これらの大きさの指標は本来典型的なものにすぎず、かつ、他の大きさおよび数について排除するものではない。
【００５３】
認識要素の一つの型は、それぞれの導電性領域中で固定化するか、あるいは、認識要素の同一の型は、複数個の導電性領域中で固定化されてもよい。
【００５４】
単一の電極を用いて、インピーダンス測定の２〜３オーダーの予想される定量範囲を超過したダイナミックレンジをカバーするために、種々の大きさの電極面積が使用され、この場合、これらは、検出すべき濃度範囲に対してその面積で比例して異なる。これらの場合には、数倍、好ましくは５〜１５倍、特に好ましくは９〜１１倍によってその大きさが異なる複数個の導電性領域が、それぞれの場合において、認識単位の一つの型に関して使用される。
【００５５】
平面的配置においては、一個または複数個の電極が、基板上でラテラルに互いに隣り合って存在する。分析物溶液は、マイクロチャンネルを介して、電気的センサーアレイに運搬されてもよく、この場合、これは、エッチングされストラクチャーにすることができる。二者択一的に、マイクロチャンネルによって供給された成分は、平面基板のための被覆として使用されてもよい。
【００５６】
非平面的配置の一つの例は、チャンネルがバーティカルにエッチングされた基板であり、たとえば、ドライ−エッチング法を用いてエッチングされる。これらのマイクロチャンネルの壁は、電極で覆われている。これらのミクロな液体のチャンネル中で、分析物溶液は、電極のすぐ近くに導かれてもよく、その結果、装置の応答時間は短縮され、すなわち、分析物分子の減少した拡散経路／時間によって感受性が増加する。
【００５７】
特に有利には、複数個の電極は、ラテラルに互いに隣あってか、あるいはバーティカルに積み重なって層構造の形で配列される。
【００５８】
有利には、対電極は、たとえば、２−点インピーダンス測定のための測定電極として同基板上に取り付けられてもよい。３−点インピーダンス測定のために、測定電極および対電極と同様に、付加的な基準電極がさらに基板上に取り付けられていてもよい。
【００５９】
基板はガラス、ＳｉＯ_２またはプラスチックであってもよく、好ましくはポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、またはポリスチレンであってもよい。
【００６０】
金属、たとえばＡｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｔｉ、半導体、たとえばＳｉ、金属酸化物、特に、インジウム−錫酸化物（ＩＴＯ）、または導電性ポリマー、たとえばポリアニリン、ポリチオフェン、特にポリエチレンジオキシチオフェン、ポリフェニレン、ポリフェニレンビニレン、ポリチオフェンビニレン、またはポリピロールが、電極として適している。
【００６１】
多重回路（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｃｉｒｃｕｉｔｓ）は、多重の独立した電極を作動するために使用される。
【００６２】
ＡＣ電圧または交流電流を用いておこなうインピーダンス測定によれば、本発明による溶液は、検出すべき分析物を定量化するための本質的に可能な機会（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）によって、直接的な従来技術（直流電流検出法）とは異なる。
【００６３】
またチップとして呼称されてもよい、測定電極上の機能的要素の考えられうる高い記録密度によって、本発明による装置は、ＤＮＡアッセイおよびタンパク質アレイのためのプラットホームとして適している。
【００６４】
【実施例】
本発明は、以下の制限のない例によって示すことができる。
【００６５】
例１
ＩＴＯ電極上のＤＮＡの検出のための方法および装置
認識反応のためのプラットホームとしての電子部品は、ＩＴＯ（インジウム−錫酸化物）で被覆されたガラス担持材料１に基づくものであり（Ｍｅｒｃｋ，　９Ｒ１５０７，ｏｈｍ／ｓｑｕａｒｅ：　１３，　ＩＴＯ　層厚：１２５　ｎｍ）（図１）、以下にチップとして示す。
【００６６】
標的ＤＮＡ（ｃａｐｔｕｒｅＤＮＡ）３を、以下のようにしてＩＴＯ表面２と結合した。Ｌ−リシン　２００ｇ、カプロラクタム　５０ｇ、１，６−ジアミノヘキサン　５０ｇおよびＴＰＰ　０．５ｇを、２４０℃で反応させ；水を留去した。生じるポリアミドを、ＮＭＰで８：１の比で希釈した。ポリマー　９ｇを、トリエトキシシリルプロピル　イソシアネート　０．１ｇを有するＮ_２雰囲気下で、室温で、２時間に亘ってシラン処理のために反応させ、シランは、ウレタン基を介してポリアミドのアミノ基と反応した。インジウム−錫酸化物で被覆したガラス表面を、標準的圧下でアルゴン誘導プラズマ（ａｒｇｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌａｓｍａ）を用いて３０分に亘って処理し、引き続いて、８０℃で５分に亘って加熱した。アセトン／ＤＭＦ／水（体積比７．５：２：０．５　ｖ／ｖ／ｖ）の混合物中のシラン−官能性ポリアミド−ウレタン１％濃度溶液を、室温で１５分に亘って、チップを用いてインキュベートした。官能化の後に、表面をアセトンで洗浄し、引き続いて１１０℃で４５分に亘って乾燥させた。
【００６７】
標的ＤＮＡ３
【００６８】
【外１】

【００６９】
を、リン酸緩衝液ｐＨ７．２中に溶解させ、かつ、０．１Ｍビス−スルホ−スクシンイミジルスベレート（ＢＳ３）で、室温で１０分に亘ってインキュベートした。反応を、リン酸緩衝液で希釈することによって停止させた。標的ＤＮＡをＮＡＰ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でクロマトグラフィーによって精製した。精製された標的ＤＮＡを、たとえば２５μｌ容量で、シラン処理された表面上に塗布し、かつ室温で一晩に亘ってインキュベートした。得られるＤＮＡチップを１％濃度の水酸化アンモニウムおよび水で洗浄し、引き続いて室温で乾燥させた。チップ表面上の未反応のアミノ基を、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．２中のＢＳ３　０．４ｍｇ／ｍｌで一晩に亘ってインキュベートすることによってブッロキングした。
【００７０】
ＤＮＡハイブリダイゼーション反応を、標的ＤＮＡで被覆されたチップ面上で、分析物であるＤＮＡ試料を用いることによっておこなった。配列
【００７１】
【外２】

【００７２】
との適合ＤＮＡ分析物をポジティブコントロールとして使用した。配列
【００７３】
【外３】

【００７４】
との完全な不適合分析物を、ネガティブコントロールとして使用した。トリス緩衝液ｐＨ８中の１０〜９ＭのＤＮＡｓ溶液、１Ｍ　ＮａＣｌ、０．００５％ＳＤＳをそれぞれ２５μｌの容量のチップを用いて、５６℃で０．５時間に亘ってインキュベートした。その後に洗浄をハイブリダイゼーションバッファーを用いておこない、これによって、ハイブリダイズされていないＤＮＡをチップ表面から取り除いた。ハイブリダイズされた標的ＤＮＡｓを、ストレプトアビジン−ｇｏｌｄ５（金粒子の直径１０ｎｍ、Ｓｉｇｍａ社）の溶液を用いて、室温で４時間に亘ってインキュベートした。チップを水で洗浄し、引き続いて室温で乾燥させた。金で標識された核酸を、Ｂｉｏｃｅｌｌ社からのエンハンサー溶液（Ｂｉｏｃｅｌｌ　Ｌ１５）を用いて、室温で５分間に亘って一回処理し、その後に乾燥させた。
【００７５】
ハイブリダイゼーション反応のインピーダンス測定｜Ｚ（ω）｜（複合インピーダンスの大きさ）を、ＥＧ＆Ｇ　モデル２８３　ｐｏｔｅｉｎｔｉｏｓｔａｔ／ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔを用いて、予め定められた５ｍＶのＡＣ電圧増幅度で、０．１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの周波数上で、２点−配置で測定した。この目的のために、電極面積　２ｍｍ^２を示す、１．６ｍｍ^２の内径（ｂｏｒｅ）を有するオープン−ボトムド（ｏｐｅｎ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ）テフロンポット６を、チップ１上に置いた（図２）。被覆されたＩＴＯ電極２を測定電極とし、約２５０ｃｍ^２の全表面積を有する有孔のタンタル電極７を、対電極として使用した。０．５Ｍ　ＮａＣｌを電解溶液８として使用した。
【００７６】
図３は、標的ＤＮＡとポジティブな分析物であるＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応およびコントロールハイブリダイゼーション反応に関するインピーダンススペクトルを示す。｜Ｚ（ω）｜の著しい減少が、ポジティブ反応について測定された。
【００７７】
例２
マイクロチャンネル中でバーティカルに配置された電極構造を有する、ＤＮＡを検出するための方法および装置
図４による電極構造のバーティカルな配置は、本発明による電子部品の二者択一的な実施態様である。たとえば、２０μｍの幅を有するマイクロチャンネル９は、イオン−ビームエッチングを用いての写真平板法による層構造からなる。その後の電気化学的金属堆積法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔａｌ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ）は、チャンネルの金属被覆１０を導き、したがって、測定電極としてのその十分な内部面積が可能になる。固定化およびアッセイは、例１と同様にこのマイクロチャンネルの内部でおこなう。
【００７８】
例３
バーティカルに積み重ねられた電極構造を有するＤＮＡを検出するための方法および装置
図５による電極／絶縁体層配列のバーティカルな配置は、本発明による電子部品の二者択一的な実施態様である。電極１１および絶縁層１２の交互の層は、多段階蒸着法（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏａｔｉｎｇ）またはスパッタリング法を用いて積み重なって堆積する。たとえば、２０μｍの幅を有するマイクロチャンネル１３は、イオン−ビームエッチングを用いて層構造からなる。固定化およびアッセイは、例１と同様にこのマイクロチャンネルの内部でおこなう。異なる標的ＤＮＡｓが選択的に種々の電極上に固定化される場合には、インピーダンス分析のための多重マイクロチャンネルは、この構造で製造される。
【００７９】
例４
アレイの形での平面的電極および多重測定器を有するＤＮＡを検出するための方法および装置
センサー表面は、例１または例２による独立した電子部品１４のネットワークから成り、この場合、これは、互いに非−線形要素、たとえばダイオード１５、およびコントロールライン１６〜２１を介して接続される（図６）。固定化およびアッセイは、このマイクロチャンネルの内部で、例１と同様におこなわれる。独立した部品１４を読み取るために、横行のコントロールライン１７を、縦行のコントロールライン２０に対して１−状態電圧に設定する。同時に、他の部品と接続された横行および縦行のコントロールライン対　１６／１９、１６／２０、１６／２１、１７／１９、１７／２１、１８／１９、１８／２０および１８／２１は、逆電圧またはオフ電圧に設定される。Ｎ×Ｎ部品は、２個の２×Ｎコントロールラインを介して作動させた。これらのラインの電気的作動は、標準的な多重回路によってもたらされる。
【００８０】
前記は単に、２，３の実施態様を詳細に記載したのみであって、開示された実施態様に対する多くの変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく開示にしたがっておこなわれてもよいものとする。したがって、前記は、本発明の範囲を制限するものではない。むしろ、本発明の範囲は、従属請求項およびそれと等価のものによってのみ定められるべきである。
【００８１】
【配列表】
【００８２】
【外４】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による測定電極上の認識反応を示す図
【図２】ＩＴＯ電極上でのＤＮＡ検出のための装置を示す図
【図３】ハイブリダイゼーション反応のインピーダンススペクトルを示す図
【図４】電極構造のバーティカルな配置を示す図
【図５】電極／絶縁体層配列のバーティカルな配置を示す図
【図６】アレイの形での平面的電極を示す図
【符号の説明】
１　ガラス担体（チップ）、　２　電極、　３　標的ＤＮＡ、　６　テフロンポット、　７　タンタル電極、　８　電解液、　９　マイクロチャンネル、　１０　金属被覆、　１１　電極、　１２　絶縁層、　１４　電子部品、　１５　ダイオード、　１６　コントロールライン、　１７　コントロールライン、　１８コントロールライン、　１９　コントロールライン、　２０　コントロールライン、　２１　コントロールライン

Claims

認識反応を用いて、一個または複数個の分析物を検出するための方法において、
生体機能的表面を有する測定電極、その際、生体機能的表面は分析物のための認識要素を有しており、一個または複数個の対電極、および測定電極と対電極との間の電解液を有する装置を製造し、
電気的に活性の標識単位で標識化された分析物を、生体機能的表面と接触させ、その際、電気的に活性の標識単位は、分析物と生体機能的表面とを接触させる前に分析物と結合されているか、あるいは分析物と生体機能的表面とを接触させた後に分析物と結合されており、
第１対電極と測定電極との間に、ａ）時間的に変化する電圧を印加またはｂ）時間的に変化する電流を供給し、かつ、
第１対電極と測定電極との間において、ａ）の場合には電流またはｂ）の場合には電圧を測定するか、あるいは、第２対電極または他の対電極と測定電極との間において、ａ）の場合には電流またはｂ）の場合には電圧を測定することを特徴とする、認識反応を用いて、一個または複数個の分析物を検出するための方法。
認識要素を、共有的にまたは非共有的に電子部品上で固定化する、請求項１に記載の方法。
時間的に変化する電圧が、ＡＣ電圧またはパルス電圧である、請求項１または２に記載の方法。
時間的に変化する電流が、交流電流またはパルス電流である、請求項１または２に記載の方法。
測定電極と第１対電極または他の対電極との間のインピーダンスを測定する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
測定電極と第１対電極または他の対電極との間のキャパシタンスが、適した等価回路図を用いてインピーダンス測定から導き出される、請求項５に記載の方法。
ＤＣ電圧を、時間的に変化する電圧に加える、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
直流電流を、時間的に変化する電流に加える、請求項１、２および４のいずれか１項に記載の方法。
認識反応が、イムノアッセイまたはＤＮＡアッセイ、好ましくはＳＮＰアッセイを構成する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
分析物を生体機能的表面と接触させる前に、電気的に活性の標識単位と分析物とを結合させ、さらに未標識分析物を生体機能的表面と接触させる、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
分析物分子を、複数個の電気的に活性の標識単位で標識化する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
電気的に活性の標識単位が、５〜１５０００、好ましくは１０〜１５００の誘電率を有する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
電気的に活性の標識単位が、１〜１００ｎｍ、好ましくは１〜３０ｎｍ、特に好ましくは１〜２ｎｍの大きさを有する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
電気的に活性の標識単位が、導電性材料、たとえばＡｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｃｕまたは炭素のナノ粒子、金属錯体および／またはクラスターである、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
ナノ粒子またはクラスターが、チタネート、ペロフスカイト格子で結晶化される材料、ＴｉＯ_２または鉛化合物からなる、請求項１４に記載の方法。
電気的に活性の標識単位が、カーボン“ナノチューブ”、導電性被覆を有する非導電性粒子、または金属被覆を有する非導電性粒子である、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
電気的に活性の標識単位が、導電性ポリマーである、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
導電性ポリマーが、ポリアニリン、ポリチオフェン、特にポリエチレンジオキシチオフェン、ポリフェニレン、ポリフェニレンビニレン、ポリチオフェンビニレン、ポリピロールである、請求項１７に記載の方法。
標識単位が、基質の反応によって電気性に活性の標識単位を形成する酵素、好ましくはＨＲＰである、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が、導電性ポリマー、好ましくはポリアニリンまたはポリエチレンジオキシチオフェンの重合を触媒するか、あるいはビオチン化ポリマーの付着を触媒し、そのビオチンに標識単位がアビジン、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎまたはストレプトアビジンを介して結合することができる、請求項１９に記載の方法。
電気的に活性の標識単位が、自動金属組織学的に成長する、請求項２０に記載の方法。
ＡｇまたはＡｕがオートメタログラフィック成長のために使用される、請求項２１に記載の方法。
生体機能的表面を有する少なくとも一個の測定電極、その際、生体機能的表面は、分析物のための認識要素を有しており、
一個または複数個の対電極、
測定電極と対電極との間の電解液、
電気的に活性の標識単位で標識化されており、かつ、生体機能的表面の認識要素と接触する分析物、
第１対電極と測定電極との間に、ａ）時間的に変化する電圧を印加するための電圧源、またはｂ）時間的に変動する電流を供給するための電流源、
および
第１対電極と測定電極との間で、ａ）の場合には電流またはｂ）の場合には電圧を測定するか、あるいは、第２対電極または他の対電極と測定電極との間で、ａ）の場合には電流またはｂ）の場合には電圧を測定するための測定装置を備えた、認識反応を用いて１個または複数個の分析物を検出するための装置。
測定電極、対電極、電解液、認識要素、分析物、時間的に変動する電圧、時間的に変動する電流および電気的に活性の標識単位が、請求項２から４まで、または７から２２までのいずれか１項に記載の性質を有する、請求項２３に記載の装置。
測定電極の表面が、複数個の導電性領域に分かれている、請求項２３または２４に記載の装置。
導電性領域が平面構成から成る、請求項２５に記載の装置。
導電性領域が、１〜２０×１〜２０μｍ^２、好ましくは５〜１５×５〜１５μｍ^２、特に好ましくは１０×１０μｍ^２の大きさを有する、請求項２５または２６に記載の装置。
一つの型の認識要素が、それぞれの導電性領域中に固定化されている、請求項２５から２７までのいずれか１項に記載の装置。
同一の型の認識要素が、複数個の導電性領域中に固定化されている、請求項２５から２７までのいずれか１項に記載の装置。
大きさが数倍、好ましくは５〜１５倍、特に好ましくは９〜１１倍異なる複数個の導電性領域が、それぞれの場合において認識単位の一つの型に使用される、請求項２５から２７までのいずれか１項に記載の装置。
導電性領域が、基板中にチャンネルとして配列されている、請求項２５から３０までのいずれか１項に記載の装置。
複数個の電極が、ラテラルに互いに隣り合ってかまたはバーティカルに互いに積み重なって層構造の形で配列されている、請求項２５から３０までのいずれか１項に記載の装置。
導電性領域が、基板中のマイクロチャンネルとして、導電層および絶縁層の二者択一的な層配列で、配列されている、請求項２５から３０までのいずれか１項に記載の装置。
一個または複数個の対電極および基準電極が、同じ基板上で測定電極として取り付けられている、請求項２５から３０までのいずれか１項に記載の装置。
基板が、ガラス、ＳｉＯ_２、プラスチック、好ましくはポリエチレン、テレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレンから成る、請求項３４に記載の装置。
導電性領域が、金属、好ましくはＡｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｔｉ、半導体、たとえばＳｉ、または金属酸化物、好ましくはインジウム−錫酸化物、または導電性ポリマー、たとえばポリエチレンジオキシチオフェン、ポリフェニレン、ポリフェニレンビニレン、ポリチオフェンビニレン、ポリピロールから成る、請求項２３から３５までのいずれか１項に記載の装置。
測定電極がアレイを形成する、請求項２３から３６までのいずれか１項に記載の装置。
ＤＮＡアレイまたはタンパク質アレイとしての、請求項２３から３７までのいずれか１項に記載の装置。