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JP2004093548A - Disc-like optical recording medium having microcapillary and sample analyzing apparatus using the disc-like optical recording medium - Google Patents

Disc-like optical recording medium having microcapillary and sample analyzing apparatus using the disc-like optical recording medium Download PDF

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JP2004093548A
JP2004093548A JP2003000355A JP2003000355A JP2004093548A JP 2004093548 A JP2004093548 A JP 2004093548A JP 2003000355 A JP2003000355 A JP 2003000355A JP 2003000355 A JP2003000355 A JP 2003000355A JP 2004093548 A JP2004093548 A JP 2004093548A
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sample
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disk
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藤本 正之
Kazushi Nishijima
西島 一志
Yoshinobu Baba
馬場 嘉信
Masayuki Ishiyama
石山 正之
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Taiyo Yuden Co Ltd
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a disc-like optical recording medium satisfying two requirements i.e. detection of an enormous quantity of DNA information and rapid, correct record analysis which are indispensable conditions for establishing bioinformatics, and sample analyzing apparatus using the disc-like optical recording medium. <P>SOLUTION: An optical recording area 15 and an analyzing area 14 are formed on the surface of a disc-like substrate 11. A microcapillary 23, which has a sample inlet at least at one end thereof, is formed on the analyzing area 14. By using the microcapillary 23, isolation and detection of sample components can be conducted, and the analyzed information can be stored on the optical recording area 15. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ディスク状の基板の表面に、試料成分、例えば、生化学、医科薬学に関連する生体関連高分子物質や薬剤等の分離検出に使用するマイクロキャピラリーと、その検出情報を記録するための光記録領域とを有するディスク状光記録媒体、及び該ディスク状光記録媒体を用いた試料分析装置に関する。
【0002】
【従来の技術】
生命科学の分野ではヒトを始めとする様々な生物のゲノム(全遺伝子情報)の解読が急ピッチで進んでおり、その解読結果により新しい動植物品種の品種改良が期待されている。
【0003】
また、単一生物種の中でも、その多様性を反映して個体によってそのゲノムの塩基配列がわずかに異なっていることが知られており(このような多様性はゲノム多型又は単に多型と称されている。)、例えば、ヒトにおいては、個人によって塩基配列の異なる確率は0.1%程度とされている。これは1000塩基毎に1ヶ所で多型が見られることを意味しており、ヒトゲノム全体(約30億塩基)の中で300万塩基ほどに現れることになる。
【0004】
したがって、個々のヒトの遺伝子情報を解析することによって、これまでの対症療法の域を出ない医療技術を超えた、各自の遺伝情報に基づいた最も適切な治療・投薬を施す、いわゆるテーラーメード医療の実現が可能になり、投薬や治療の無駄をなくしつつ、極めて効果的な病気予防と投薬と治療が実現できると期待されている。例えば、1塩基だけが異なる1塩基多型(SNP:Single NucleotidePolymorphism)は、遺伝子の発現量に影響を与えたり、アミノ酸変異を起こす場合があることから、膨大な塩基配列の中からSNPを検出・解析することにより、個人にあった治療や薬がわかり、テーラーメード医療の確立につながると期待されている。
【0005】
一方、ヒトゲノムのシークエンシングの技術発展の歴史は塩基解読の絶対量増大の歴史でもある。すなわち、70年代には世界中で年間100塩基以下しか解読できなかったにもかかわらず、わずか30年間に、サンガー法、キャピラリーアレイ電気泳動法等が開発され、世界中で年間ギガ(G=10)塩基のシークエンシングが可能になった。特にキャピラリー電気泳動法は、DNA解析を高速かつ高感度、高精度で行える解析法であり、しかも測定は簡便で複数の試料の同時解析が可能で自動化が容易であるという利点を有している。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、将来、ゲノム創薬からオーダーメード医療を実現していくためには、テラ(T=1012)塩基、ペタ(T=1015)塩基はおろか、地球規模のヒトDNA情報であるエクサ(E=1018)のシークエンシングすら要求されると言われており、このような膨大な量の塩基情報の記録と解析のために情報科学技術の高度な利用が必要となる。これが、近年バイオインフォマティックス(バイオ情報科学)の必要性が喧伝される理由であり、DNAシークエンサーにより得られた膨大な情報量を正確に記録し、伝送し、解析を行う情報処理のシステムが必要とされている。
【0007】
したがって、本発明の目的は、バイオインフォマティックスの確立の必須条件である膨大なDNA情報の検出と、迅速かつ正確な記録解析との二つの要件を満たすことが可能なディスク状光記録媒体、及び該ディスク状光記録媒体を用いた試料分析装置を提供することにある。
【0008】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の一つは、ディスク状の基板と、この基板表面に形成された光記録領域と、分析領域とを有し、前記分析領域には、少なくとも一端に試料注入口を有するマイクロキャピラリーが形成されていることを特徴とするマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体を提供するものである。
【0009】
上記ディスク状光記録媒体においては、前記マイクロキャピラリーは、前記基板の中心に対して放射状に形成されており、前記試料注入口が前記基板の中心側の端部に形成されていて、前記基板を回転させたときの遠心力によって試料成分を分離するものであることが好ましい。
【0010】
また、前記マイクロキャピラリーは、その経路の少なくとも2箇所に電極が形成されており、前記電極間に電圧を印加して前記試料成分を電気泳動させることによって、前記試料成分を分離するものであることが好ましい。
【0011】
更に、前記マイクロキャピラリーは、試料移送用キャピラリーと、試料分離用キャピラリーとからなり、前記試料移送用キャピラリーは、少なくともその一端に試料注入口を有し、経路の途中で前記試料分離用キャピラリーと交差して連結するか、又は他端にて前記試料分離用キャピラリーに連続するように連結されていることが好ましい。
【0012】
更にまた、前記試料分離用キャピラリーの両端には、緩衝液注入又は貯留用の穴が形成されていることが好ましい。
【0013】
更にまた、前記マイクロキャピラリーは、前記基板表面に形成された溝と、この溝の開口部を塞ぐカバーとで構成されていることが好ましい。
【0014】
更にまた、前記光記録領域及び前記分析領域が、前記ディスク状の基板の同一面に形成されていることが好ましい。
【0015】
更にまた、前記光記録領域に形成される光記録層が追記型記録層であることが好ましい。
【0016】
上記発明によれば、ディスク状の基板表面の分析領域に形成されたマイクロキャピラリーによって試料の分離・検出を行い、その分析情報を該ディスク状の基板表面に形成された光記録領域に記録保存することができるので、試料の分離・検出からその分析情報の記録までを一枚のディスクで行うことができる。
【0017】
また、本発明のもう一つは、前記マイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体と、このディスク状光記録媒体を支持して回転させるターンテーブルと、このディスク状光記録媒体にレーザ光を照射するレーザ光照射手段と、前記光記録媒体の前記光記録領域に照射されたレーザ光の反射光を受光するレーザ光受光手段と、前記光記録媒体の前記分析領域に照射されたレーザ光によって形成される画像を検出する画像検出手段とを備えていることを特徴とする試料分析装置を提供するものである。
【0018】
上記発明によれば、前記ディスク状光記録媒体上のマイクロキャピラリーで分離した試料成分の検出及びその分析情報の記録を簡便に行うことができる。
【0019】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について図面を用いて詳細に説明する。
【0020】
図1〜4には、本発明のマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体の一実施形態が示されている。図1は、マイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体の平面図、図2は該ディスク状光記録媒体の表面に形成されたマイクロキャピラリーの拡大模式図、図3は該ディスク状光記録媒体の模式断面図、図4は、光記録領域と分析領域の境界部分の拡大図を示す。
【0021】
図1に示すように、このディスク状光記録媒体1は、ディスク状の基板11の一方の表面の外周領域に光記録領域15と、該光記録領域と接する内周領域にマイクロキャピラリー23が複数個形成された分析領域14とを有しており、該分析領域の更に内周部分には、ディスクを保持するための中心穴12及びディスク保持部13が形成されている。
【0022】
分析領域14に形成されるマイクロキャピラリー23は、文献等(Chao−Xuan Zhang and Andreas Manz, “Narrow Sample Channel Injectors for Capillary Electrophoresis on Microchips”, Anal. Chem. 73 2656−2662 (2001))で公知である十字型電気泳動キャピラリーのように、短めの試料移送用キャピラリー21と長めの試料分離用キャピラリー22とからなっており、図2に示すように前記試料移送用キャピラリー21と前記試料分離用キャピラリー22は、経路の途中で所定の角度で交差して連結するように形成されている。本発明においては、マイクロキャピラリー23は、基板11を回転させたときの遠心力によって試料を移送及び/又は分離できるように、試料移送用キャピラリー21及び/又は試料分離用キャピラリー22が、基板11の中心に対して放射状に形成されていることが好ましい。なお、ここで、放射状とは、半径方向に対して傾斜した角度で外方に向かう形状や、螺旋状をなして外方に向かう形状なども含む意味である。
【0023】
この実施形態においては、試料分離用キャピラリー22が、基板11の中心から半径方向に対してやや傾斜した角度で外方に向かう形状に形成されており、ディスクの回転に伴う遠心力で試料成分を分離できるようになっている。
【0024】
また、前記試料移送用キャピラリー21の両端には、試料注入口21a、21bが形成されており、該試料注入口から試料をマイクロキャピラリー内に注入できるようになっている。一方、前記試料分離用キャピラリー22の一端には、緩衝液注入穴22a、他端には緩衝液の貯留用の穴22bが形成されており、該緩衝液注入穴から、緩衝液を注入できるようになっている。
【0025】
図3に示すように、マイクロキャピラリー23は、基板11の一方の表面(レーザ光入射面の反対側)に、所定の形状に形成された凹部31をキャピラリーカバー33で覆うことにより形成される。すなわち、図4に示すように、前記凹部31の底面のキャピラリー形成部分には、両端に試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴を有する所定長さの微細な溝32が形成されており、前記溝32の開口部をキャピラリーカバー33で覆うことにより、マイクロキャピラリーが形成されるようになっている。なお、前記キャピラリーカバー33には、前記試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴に対応するそれぞれの位置に所定の大きさの貫通穴が形成されており、該貫通穴を介して試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴は上から見て開放状態にあるが、キャピラリー形成部分はキャピラリーカバーに覆われて密閉された状態となるようになっている。
【0026】
なお、図5に示すように、キャピラリーカバー33の代替として、張り合わせ構造の記録層を持たない上面片側ディスク34(ダミー層)を利用することもできる。
【0027】
前記溝32の幅と深さは、キャピラリー全体に試料や緩衝液等を十分に吸い込み充填することができるような毛管現象を発現する幅と深さがあればよく、キャピラリー全領域にわたって均一な幅と深さを有することが好ましい。具体的には、幅:20〜300μm、深さ:10〜200μmが好ましく、幅:50〜150μm、深さ:20〜40μmがより好ましい。
【0028】
また、前記溝32の長さは、試料移送用キャピラリーを形成するものにあっては、適当量の試料を容易に移送できればよく、通常、2〜30mmが好ましく、3〜5mmがより好ましい。また、試料分離用キャピラリーを形成するものにあっては、遠心力あるいは電気泳動によって十分な分離が行える長さがあればよく、通常、10〜100mmが好ましく、15〜50mmがより好ましい。
【0029】
そして、前記溝32の両端に形成される試料注入口や緩衝液注入又は貯留用の穴の大きさ(直径)は、マイクロピペット等の注入器具によって試料や緩衝液を注入することができ、かつ液溜めの機能を有するような大きさであればよく、具体的には直径1〜5mmの大きさがあればよい。また、その深さは、前記溝32と等しい深さを有していることが好ましい。
【0030】
本発明においては、前記試料移送用キャピラリー21及び/又は前記試料分離用キャピラリー22の両端部に電極を形成することもできる。電極は、キャピラリーカバー(又は上面片側ディスク)に設けられた試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴と同じ径を持った貫通穴をとおしてキャピラリーカバーの上面に引き出される。
【0031】
例えば、試料移送用キャピラリー21の両端部に電極を形成した場合、前記電極間に電圧を印加することにより、試料注入口21a(又は21b)に注入された試料を、該試料移送用キャピラリー21と試料分離用キャピラリー22との交差点まで移送することができる。また、試料分離用キャピラリー22の両端部に電極を形成した場合、前記電極間に電圧を印加することにより、試料成分の電気泳動による分離を行うことができる。
【0032】
一方、光記録領域15には、通常のCD−RやDVD−Rと同様の情報記録部が形成されている。すなわち、図4、5に示すように、情報記録部45は、基板11のレーザ光入射面の反対側の表面に所定のピッチで刻まれた案内溝41と、その表面に積層された有機色素を含む記録層42と反射層43とから構成されており、更にその表面は保護膜44で被覆されている。
【0033】
本発明のディスク状光記録媒体を構成する基板11の材質は、通常の光記録媒体に使用されているポリカーボネート樹脂が好ましく用いられる。また、キャピラリーカバー33及び上面片側ディスク34等は、ポリカーボネートもしくはこれに相当するレーザ光を十分に透過する材料(例えば、アクリル樹脂等)であればよい。
【0034】
前記基板(ディスク)の形状は、円形に限定されず、四角形等であってもよいが、最終外形等は、基本的に日本工業規格(JIS)、コンパクトディスクデジタルオーディオシステム(S8605−1993(IEC908:1987))、DVD FLLC(Format/LogoLicensing Corporation)の規格に準拠するものであることが好ましい。
【0035】
また、図6、7には、本発明のマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体の別の実施形態が示されている。図6は、マイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体の平面図、図7は該ディスク状光記録媒体の表面に形成されたマイクロキャピラリーの拡大模式図を示す。なお、以下の実施形態の説明において、前記実施形態と実質的に同一の部分には同符号を付し、その説明を簡略又は省略するものとする。
【0036】
図6に示すように、このディスク状光記録媒体2は、基板11の一方の表面に形成される光記録領域15と分析領域14との場所が上記ディスク状光記録媒体1と逆になっている点で相違している。すなわち、ディスク状光記録媒体2においては、基板11の外周領域に分析領域14が形成されており、該分析領域14と接する内周領域に光記録領域15が形成されている。
【0037】
また、分析領域14に形成されるマイクロキャピラリー23’は、上記と同様に短めの試料移送用キャピラリー21’と長めの試料分離用キャピラリー22’とからなっている。ただし、試料分離用キャピラリー22’は、基板11の外周よりやや内側部分に、外周と同心的な円弧状をなして形成されており、試料移送用キャピラリー21’は、上記試料分離用キャピラリー22’に対して斜めに交差し、その一端が基板11の中心寄りにあって、他端が外周寄りに位置するように形成されている。その結果、試料移送用キャピラリー21’は、ディスクの回転に伴う遠心力で試料を試料分離用キャピラリー22’に移送できるようになっている。また、試料分離用キャピラリー22’の両端部には、図示しない電極が形成されており、電気泳動によって試料成分の分離を行えるようになっている。
【0038】
また、図8、9には本発明のマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体の更に別の実施形態が示されている。図8は、マイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体の平面図、図9は該ディスク状光記録媒体に形成された分析領域を拡大した図を示す。
【0039】
図8に示すように、ディスク状光記録媒体3は、ディスク状の基板11の一方の表面の外周領域に光記録領域15と、該光記録領域と接する内周領域にマイクロキャピラリー26が複数個形成された分析領域14とを有している。なお、この実施形態においては、ディスク保持部13には、識別用バーコード16が形成されている。
【0040】
分析領域14に形成されたマイクロキャピラリー26は、図9に示すように、基板11の中心側から外径方向に向けて放射状かつ螺旋状に伸びる短めの試料移送用キャピラリー24と、この試料移送用キャピラリー24の外径方向の端部に連続して該端部から半径方向外方に伸びる、長めの試料分離用キャピラリー25とで構成されている。
【0041】
そして、試料移送用キャピラリー24の内径側の端部と、試料移送用キャピラリー24と試料分離用キャピラリー25とが連結された部分の端部と、試料分離用キャピラリー25の外径側の端部とに、試料及び/又は緩衝液の注入、貯留用の穴が形成されている。因みに、試料移送用キャピラリー24の内径側の端部には、試料注入口24aが形成されている。
【0042】
また、試料移送用キャピラリー24と試料分離用キャピラリー25とが連結された部分の端部と、試料分離用キャピラリー25の外径側の端部とには、電極27、28が形成されており、前記電極27、28間に電圧を印加することにより、試料成分の電気泳動による分離を行うことができるようにもなっている。
【0043】
したがって、このマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体3によれば、試料注入口24aに注入した試料が、ディスク状光記録媒体3の回転によって生じる遠心力により、試料移送用マイクロキャピラリー24に沿って外径方向に移動し、試料分離用キャピラリー25の内径側の端部に到達する。
【0044】
そこで、電極27、28間に電圧を印加することにより、試料分離用キャピラリー25中を電気泳動によって移動させ、試料成分を分離することができる。なお、ディスク状光記録媒体3を回転させながら、上記電気泳動を行うことにより、ディスク状光記録媒体3の回転によって生じる遠心力と、上記電気泳動とを併用して、試料成分を分離することもできる。
【0045】
そして、後述する試料分析装置等を用いることにより、試料分離用キャピラリー25内で分離された試料成分を、レーザ等の光学的手段によって検出することが可能であり、分離・検出に関する情報を、逐次あるいは一括して、該ディスク状光記録媒体の光記録領域に記録することができる。
【0046】
したがって、1枚のディスク状光記録媒体で、試料成分の分離・検出から該分析情報等の記録の保存までを行うことができるので、データの管理等が非常に容易である。
【0047】
本発明においては、前記光記録領域に形成される記録層は、追記型記録層であることが好ましい。すなわち、前記記録層が、CD−RやDVD−Rと同様の有機色素を用いた記憶形態である場合は、一度記録層に書き込まれた情報を書き換えることができないので、データの改ざん等を防ぐことができる。
【0048】
なお、前記光記録領域には、試料分離用キャピラリーに充填されている試薬の情報(成分、賞味期限、使用用途等)、分析する試料の情報(成分、濃度、製造元或いは調製条件)、実験条件(試料使用量、ディスク回転数、電圧、温度、検出波長等)及びその実行のためのプログラムを、予め記録しておいてもよい。これにより、実験条件の正確な管理ができると共に操作ミス等を防止することができる。
【0049】
本発明においては、図4、5に示されるように、前記光記録領域及び前記分析領域が前記ディスク状の基板の同一面に形成されていることが好ましい。これにより、試料成分検出用の光源と、光記録領域への情報の記録/読み出し用の光源を共通化することが可能となり、一つの光源で、試料成分の検出と光記録領域へ情報の記録/読み出しができるようになる。
【0050】
なお、本発明のディスク状光記録媒体を用いて試料成分の分離を行う際には、キャピラリー内に、例えば、メチルセルロース(MC)、ハイドロキシエチルセルロース(HEC)、ハイドロキシプロピルセルロース(HPC)、ハイドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)等のセルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリアクリルアミド、アガロース、アクリルアミド誘導体のポリマー等を含む緩衝液を充填してから用いられる。緩衝液の充填は、キャピラリーの端部に形成された試料注入口や緩衝液注入又は貯留用の穴に、適量の緩衝液を滴下することにより、毛管現象によって充填することができる。
【0051】
また、試料成分としては、特に制限されないが、drug molecules、アミノ酸、ペプチド、DNA、オリゴヌクレオチド、比較的大きなタンパク質等の生化学に関連した高分子物質が好ましく例示できる。
【0052】
なお、試料成分は、CD−Rのレーザ波長である780nmやDVD−Rのレーザ波長である630nmで検出できるように、必要に応じて前記レーザ波長の付近に吸収帯を有する蛍光色素で標識される。蛍光色素は、試料成分の種類と検出に使われるレーザ波長に応じて適宜選択すればよく、例えば、CD−Rのレーザ波長である780nmで検出を行う場合は、750〜810nmに吸収帯を有する蛍光色素を用いることが好ましく、DVD−Rのレーザ波長である630nmで検出を行う場合は、600〜660nmに吸収帯を有する蛍光色素を用いることが好ましい。なお、蛍光色素による試料成分の標識は公知の方法に従って行えばよい。したがって、予め、試料成分を蛍光色素で標識してから分析に供してもよく、適当な蛍光色素を選択することにより、上記キャピラリー内に充填されるポリマー等を含む緩衝液に添加しておくことで、試料成分の分離と同時に標識が可能となる。
【0053】
例えば、試料成分としてDNAやオリゴヌクレオチドを用いる場合には、蛍光色素として、TOTO−3、IRDye41、IRDye800等を用いることができる。ちなみに、TOTO−3はDVD−Rのレーザ波長である630nm付近に吸収帯を有する蛍光色素であり、上記キャピラリー内に充填されるポリマー等を含む緩衝液に添加しておくことで、分離と同時にDNAやオリゴヌクレオチドの標識(染色)を行うことができる。したがって、別途試料成分の標識を行う必要がないので簡便である。
【0054】
一方、IRDye41、IRDye800はCD−Rのレーザ波長である780nm付近に吸収帯を有する蛍光色素である。
【0055】
次に、本発明の試料分析装置について説明する。
本発明の試料分析装置は、上記のディスク状光記録媒体を用いて分離した試料成分の検出、及び分離・検出に関する情報の記録を行うものであり、ディスク状光記録媒体を支持して回転させるターンテーブルと、このディスク状光記録媒体にレーザ光を照射するレーザ光照射手段と、前記光記録媒体の前記光記録領域に照射されたレーザ光の反射光を受光するレーザ光受光手段と、前記光記録媒体の前記分析領域に照射されたレーザ光によって形成される画像を検出する画像検出手段とを備えている。
【0056】
図10には、本発明の試料分析装置の一実施形態を示す概略構成図が示されている。
【0057】
図において、ディスク状光記録媒体1は、図示しない上記ターンテーブルによって支持され、回転動作する。このディスク状光記録媒体1に対して、半径方向に移動可能に、光検出記録手段50が設置されている。
【0058】
この光検出記録手段50は、レーザ駆動回路60によってレーザ光を出射するレーザ光源51と、このレーザ光を平行ビームとするマルチレンズ52と、レーザ出射光を通過させ、反射光を取出すためのビームスプリッタ53と、コリメータ54と、対物レンズ55と、ビームスプリッタ53で分岐された反射光を集光する集光レンズ56と、集光レンズ56で集光された反射光を受光する光検出素子57と、光検出素子57で検出された光信号を増幅させる増幅回路58と、この増幅回路を通して入力された光信号を処理するサーボ・信号処理LSI59とから構成されている。また、ディスク状光記録媒体1の上下面の所定位置を撮像するように指向されたCCD(電荷結合型)カメラ61が設置されている。
【0059】
したがって、レーザ光源51から出射されたレーザ光は、マルチレンズ52、ビームスプリッタ53、コリメータ54、及び対物レンズ55を通して、ディスク状光記録媒体11の所定位置に照射される。このレーザ光は、例えば試料分離用キャピラリー25で分離された成分を発光させたりする光源として利用され、また、分析データをディスク状光記録媒体1の光記録領域15に記録する書き込み用の光源としても利用され、更には光記録領域15に書き込まれた情報を読み出すための光源としても利用される。
【0060】
上記レーザ光を、例えば光記録領域15に書き込まれた情報を読み出すための光源等として利用する場合には、光記録領域15に照射されて反射してくるレーザ光を、ビームスプリッタ53で取出し、集光レンズ56を通して光検出素子57に照射させる。そして、光検出素子57で受光した光信号を増幅回路58で増幅させ、サーボ・信号処理LSI59で読み出すようになっている。また、サーボ・信号処理LSI59は、読み出した情報に基づいて、レーザ光源51からのレーザ光照射位置を移動させたり、レーザ光の出射タイミングを制御したりする機能も有している。
【0061】
したがって、この試料分析装置によれば、ディスク状光記録媒体1の試料分離用キャピラリー22で試料成分を分離させた後、試料分離用キャピラリー22にレーザ光を照射して、レーザ光によって発光したパターンをCCDカメラ61で撮像し、その発光パターンを図示しないコンピュータによって画像解析することによって成分の分析を行うことができる。
【0062】
また、こうして得られた分析結果を、ディスク状光記録媒体1の光記録領域15にレーザ光によって書き込むことにより、データの保存を同じディスク上で行うことができる。更に、書き込まれたデータは、レーザ光を照射し、その反射光をビームスプリッタ53で取出し、集光レンズ56を通して光検出素子57で受光し、受光した光信号を増幅回路58で増幅させ、サーボ・信号処理LSI59で読み出すことにより、データの読み出しも行うことができる。
【0063】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。なお、以下の例において、使用したディスク状光記録媒体は、予め基板の所定の領域に常法により、案内溝、記録層、反射層等が形成されたものを用い、これに機械加工によりキャピラリー等を形成して用いた。
【0064】
実施例1
図1に示す構造のディスク状光記録媒体を用いてDNA断片を分離、検出した。
【0065】
a)所定の領域に、CD−Rと同様の情報記録部が形成されたポリカーボネート製の基板11の分析領域(光記録層未形成領域)に、キャピラリーを形成するための溝32を有する凹部31を形成した。具体的には、図2に示すように、試料移送用キャピラリー21(長さ3.5mm、幅100μm、深さ30μm)と、試料分離用キャピラリー22(長さ20.5mm、幅100μm、深さ30μm)は、45度の角度で交差し、試料分離用キャピラリー22の、ディスク内径側端部に位置する緩衝液注入又は貯留用の穴22aから1.25mmの距離にあって、線幅中央50μmのところと、試料移送用キャピラリー21の、ディスク内径側端部に位置する試料注入口21aから2.25mmの距離にあって、線幅中央50μmのところとが、交差点となるように形成した。また、各溝の両端部には、直径1.5mm、深さ30μmの試料注入口(21a、21b)、緩衝液注入又は貯留用の穴(22a、22b)を形成した。
【0066】
b)そして、図3、4に示すように、上記各溝、試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴を形成した凹部31を完全に被覆するように、該凹部と同形状のポリカーボネート製のキャピラリーカバー33を紫外線硬化接着剤を用いて基板11に接着した。キャピラリーカバー33には、基板11の前記凹部に設けられた試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴に対応する位置にそれぞれ直径1.5mmの貫通穴が形成されており、該貫通穴を介して試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴は上から見て開放状態にあるが、キャピラリー形成部分はキャピラリーカバーに覆われて密閉された幅100μm、深さ30μmの管状のキャピラリーを形成している。
【0067】
c)キャピラリーカバーの貫通穴を介して上から見て開放状態にある試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴(該穴径1.5mmに相当する領域)に白金スパッタを行って電極を形成した。
【0068】
d)泳動時の緩衝液として、蛍光色素含有メチルセルロース溶液(メチルセルロース濃度0.5%)を調製した。具体的には、熱精製水80mLにメチルセルロース0.5gを加えてよく撹拌した後、一晩冷蔵庫で冷却、完全に溶解させ、その後、トリス(生化学用)及びホウ酸(試薬特級)を、最終濃度でそれぞれ50mM(pH7.5〜8.5)となるように加え、メスフラスコにて全量を100mLに調整し、最後に蛍光色素であるTOTO−3を0.1μg/mLとなるように加えた。
【0069】
そして、各試料移送用キャピラリーのディスク反回転方向の試料注入口(21b)に、適量の前記緩衝液をマイクロピペットで滴下し、毛管現象により十字状に交差したキャピラリー内部を全て緩衝液で満たした。なお、キャピラリー内への緩衝液の充填は、基本的にどこの試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴を利用しても同様の毛管現象によるキャピラリー充填効果を得ることができる。
【0070】
e)試料として、DNA標準分子量サンプル(100bp dsDNA ladder(Gensura Laboratories. Inc., 100 g/mL)は、測定時に超純水(ミリポア社)により希釈し、1μg/mLに調整した。ここで、100bp dsDNA ladderとは、10種(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000bp)の2本鎖DNA断片の混合物である(以下同じ)。
【0071】
f)上記緩衝液で満たされたキャピラリーの試料移送用キャピラリーのディスク回転方向の試料注入口(21a)に、前記DNA標準分子量サンプルをマイクロピペットで10μl滴下し、試料注入口(21b)に形成された電極をグランドに落とし、試料注入口(21a)に形成された電極に500ボルトの正電圧を印加し、電気泳動により適量が十字型のキャピラリーの交差点に到達した時点で、試料注入口(21b)の電極のグランド接触、試料注入口(21a)の電極の正電圧印加を解除して、フローティング状態とした。
【0072】
そして、上記ディスク状光記録媒体を、基本的に図10で示された構成からなる試料分析装置を用いて、試料成分の分離・検出を行った。
【0073】
具体的には、レーザ光源51及びレンズ系ユニット(52〜55)を、試料分離用キャピラリーの緩衝液貯留用の穴(22b)側の端部より2mmの位置に移動、固定して、静止状態であったディスク状光記録媒体を300rpmの回転数で回転し、遠心力によって分離、泳動されてきたDNA断片に、前記の所定の位置に固定したレーザ光源からレーザ光(波長635nm)を照射した。緩衝液中の蛍光色素により染色されているDNA断片は、レーザ光により励起されて蛍光を発するので、この蛍光をCCDカメラ61により測定し、ディスク回転からの各DNA断片の発光開始時間と発光強度とを一対の情報として一時記録メモリーであるSRAMに記録した後、SRAMに一時的に記録された各DNA断片の発光強度と泳動時間に関する情報を、試料分析装置をCD−R光記録モードに切り替えることにより、ディスク状光記録媒体の光記録領域にレーザ光(波長780nm)により焼き付け記録した。その結果を図11に示す。図11の縦軸は発光強度を表し、横軸はレーザ光源固定位置までDNA断片が到達、発光するまでの泳動時間(秒)を表す(図12〜14においても同じ。)。
【0074】
図11から、DNA標準分子量サンプルは、分子量ごとにきれいに分離、検出されており、良好な分離・検出能が得られることが分かる。
【0075】
実施例2
図6に示す構造のディスク状光記録媒体を用いてDNA断片を分離、検出した。
【0076】
a)所定の領域に、DVD−Rと同様の情報記録部(4.8GB片側記録)が形成されたポリカーボネート製の基板の分析領域(光記録層未形成領域)に、キャピラリーを形成するための溝32を形成した。具体的には、図7に示すように、試料移送用キャピラリー(長さ3.5mm、幅80μm、深さ40μm)と、試料分離用キャピラリー(長さ20.5mm、幅80μm、深さ40μm)は、45度の角度で交差し、試料分離用キャピラリーの、ディスク内径側端部から1.25mmの位置にあって、線幅中央40μmのところと、試料移送用キャピラリーのディスク回転方向(レーザ光源設置部位の上側から見て時計回り)側の端部から2.25mmの位置にあって、線幅中央40μmのところが交差点となるように形成した。また、各キャピラリーの両端部には、直径1.5mm、深さ40μmの試料注入口(21’a、21’b)、緩衝液注入又は貯留用の穴(22’a、22’b)を形成した。
【0077】
b)そして、図5に示すように、上記各溝を被覆するように、実施例1のキャピラリーカバーに相当するポリカーボネート製の上面片側ディスク34を、基板11の上記各溝、試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴が形成された面に紫外線硬化接着剤を用いて接着した。上面片側ディスク34には、基板11に設けられた試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴に対応する位置にそれぞれ直径1.5mmの貫通穴が形成されており、該貫通穴を介して試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴は上から見て開放状態にあるが、キャピラリー形成部分はキャピラリーカバーに覆われて密閉された幅80μm、深さ40μmの管状のキャピラリーを形成している。
【0078】
c)上面片側ディスクの貫通穴を介して上から見て開放状態にある試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴(該穴径1.5mmに相当する領域)に白金スパッタを行って電極を形成した。
【0079】
d)泳動時の緩衝液として、実施例1と同様にして、蛍光色素含有メチルセルロース溶液(メチルセルロース濃度0.1、0.3、0.5、0.7、1.0%)を調製した。なお、蛍光色素としてTOTO−3を0.05μg/mL添加した。
【0080】
そして、各試料移送用キャピラリーのディスク反回転方向の試料注入口(21’b)に、適量の前記緩衝液をマイクロピペットで滴下し、毛管現象により十字状に交差したキャピラリー内部を全て緩衝液で満たした。なお、キャピラリー内への緩衝液の充填は、基本的にどこの試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴を利用しても同様の毛管現象によるキャピラリー充填効果を得ることができる。
【0081】
e)試料として、DNA標準分子量サンプル(100bp dsDNA ladder(Gensura Laboratories. Inc., 100 g/mL)は、測定時に超純水(ミリポア社)により希釈し、1μg/mLに調整した。
【0082】
f)上記緩衝液で満たされたキャピラリーの試料移送用キャピラリーのディスク回転方向の試料注入口(21’a)に、前記DNA標準分子量サンプルをマイクロピペットで10μl滴下し、このディスク状光記録媒体を、基本的に図10で示された構成からなる試料分析装置を用いて試料成分の分離、検出を行った。
【0083】
具体的には、静止状態であったディスクを500rpmの回転数で回転させて、遠心力によってDNA標準分子量サンプルを十字型のキャピラリーの交差点に到達させた後、ディスクの回転を停止し、貯留用の穴(22’b)に形成された電極をグランド接触、緩衝液注入口(22’a)に形成された電極に750ボルトの正電圧を印加し、DNA断片の電気泳動分離を行った。
【0084】
なお、レーザ光源51及びレンズ系ユニット(52〜55)は、試料分離用キャピラリーの緩衝液貯留用の穴(22’b)側の端部より2mmの位置に移動、固定して、電気泳動されてきたDNA断片に、前記の所定の位置に固定したレーザ光源からレーザ光(波長635nm)を照射し、実施例1と同様に検出し、その情報をDVD−R光記録モードに切り替えることにより、ディスク状光記録媒体の光記録領域にレーザ光(波長635nm)により焼き付け記録した。
【0085】
なお、メチルセルロース濃度の異なる緩衝液を用いてそれぞれ同様の条件で、試料成分の分離、検出を行った。それらの結果を図12に示す。図12中、▲1▼はメチルセルロース濃度1.0%、▲2▼はメチルセルロース濃度0.7%、▲3▼はメチルセルロース濃度0.5%、▲4▼はメチルセルロース濃度0.3%、▲5▼はメチルセルロース濃度0.1%の緩衝液を用いた場合の結果である。
【0086】
図12から、メチルセルロース濃度によって分離能が異なるものの、良好な分離・検出能が得られることが分かる。
【0087】
実施例3
図1に示す構造のディスク状光記録媒体を用いてDNA断片を分離、検出した。
【0088】
a)所定の領域に、DVD−Rと同様の情報記録部(4.8GB片側記録)が形成されたポリカーボネート製の基板の分析領域(光記録層未形成領域)に、キャピラリーを形成するための溝32を形成した。具体的には、図2に示すように、試料移送用キャピラリー(長さ3.5mm、幅50μm、深さ50μm)と、試料分離用キャピラリー(長さ20.5mm、幅50μm、深さ50μm)は、45度の角度で交差し、試料分離用キャピラリーの、ディスク内径側端部から1.25mmの位置にあって、線幅中央25μmのところと、試料移送用キャピラリーのディスク内径側の端部より2.25mmの位置にあって、線幅中央25μmのところとが交差点となるように形成した。また、各キャピラリーの両端部には、直径1.5mm、深さ50μmの試料注入口(21a、21b)、緩衝液注入又は貯留用の穴(22a、22b)を形成した。
【0089】
b)そして、図5に示すように、上記各溝を被覆するように、実施例1のキャピラリーカバーに相当するポリカーボネート製の上面片側ディスク34を、基板11の上記各溝、試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴が形成された面に紫外線硬化接着剤を用いて接着した。上面片側ディスク34には、基板11に設けられた試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴に対応する位置にそれぞれ直径1.5mmの貫通穴が形成されており、該貫通穴を介して試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴は上から見て開放状態にあるが、キャピラリー形成部分はキャピラリーカバーに覆われて密閉された幅50μm、深さ50μmの管状のキャピラリーを形成している。
【0090】
c)上面片側ディスクの貫通穴を介して上から見て開放状態にある試料注入口、緩衝液注入又は貯留用の穴(該穴径1.5mmに相当する領域)に白金スパッタを行って電極を形成した。
【0091】
d)泳動時の緩衝液として、実施例1と同様にして蛍光色素(TOTO−3)含有0.5%メチルセルロース溶液を調製した。
【0092】
そして、各試料移送用キャピラリーのディスク反回転方向の試料注入口(21b)に、適量の前記緩衝液をマイクロピペットで滴下し、毛管現象により十字状に交差したキャピラリー内部を全て緩衝液で満たした。
【0093】
e)試料として、ファージDNAをテンプレートとして、500塩基対のフラグメントをPCR(polymerase chain reaction)法により増幅した微生物遺伝子増幅物(500bp)を用いた。PCR用のプライマーとして、配列番号1(5’側プライマー)と配列番号2(3’側プライマー)に示すものを用いた。PCR用反応液は、最終体積を50μLとし、0.5ngのテンプレートDNAに1.0μmol/Lずつの上記2種のプライマー、200mmol/Lの塩化カリウム(KCl)、15mmol/Lの塩化マグネシウム(MgCl)、0.01%(質量/体積比)ゼラチン(gelatin)を加えて調製した。PCRは、PERKIN ELMER社製装置を用いて、熱変性反応を94℃で15秒間、アニーリングと伸長反応を68℃で30秒間行い、これを25サイクル繰り返した。
「配列表フリーテキスト」
配列番号1:PCR用プライマー
配列番号2:PCR用プライマー
【0094】
f)上記緩衝液で満たされたキャピラリーの試料移送用キャピラリーのディスク回転方向の試料注入口(21a)に、前記微生物遺伝子増幅物をマイクロピペットで10μl滴下し、試料注入口(21b)に形成された電極をグランドに落とし、試料注入口(21a)に形成された電極に500ボルトの正電圧を印加し、電気泳動により適量が十字型のキャピラリーの交差点に到達した時点で、試料注入口(21b)の電極のグランド接触、試料注入口(21a)の電極の正電圧印加を解除して、フローティング状態とした。
【0095】
そして、貯留用の穴(22b)に形成された電極をグランド接触、緩衝液注入口(22a)に形成された電極に800ボルトの正電圧印加して、微生物遺伝子増幅産物の電気泳動分離を行い、実施例2と同様にして試料成分の検出、情報の記録を行った。その結果を図13に示す。
【0096】
図13から、PCRにより増幅されたDNA断片を精度よく分離・検出できることが分かる。
【0097】
実施例4
実施例1と同じディスク状光記録媒体を用いて、泳動時の緩衝液として、蛍光色素(TOTO−3)含有0.7%ハイドロキシプロピルメチルセルロース溶液を用いて、DNA標準分子量サンプル100bp dsDNA ladder(Gensura Laboratories. Inc., 100 g/mL)の分離・検出を行なった。
【0098】
具体的には、上記緩衝液で満たされたキャピラリーの試料移送用キャピラリーのディスク回転方向の試料注入口(21a)に、前記DNA標準分子量サンプルをマイクロピペットで10μl滴下し、試料注入口(21b)に形成された電極をグランドに落とし、試料注入口(21a)に形成された電極に600ボルトの正電圧を印加し、電気泳動により適量が十字型のキャピラリーの交差点に到達した時点で、試料注入口(21b)の電極のグランド接触、試料注入口(21a)の電極の正電圧印加を解除して、フローティング状態とした。
【0099】
そして、上記ディスク状光記録媒体の回転数を200rpmとした以外は、実施例1と同様にして試料成分の分離、検出を行い、その情報をディスク状光記録媒体の光記録領域に記録した。その結果を図14に示す。
【0100】
図14から、DNA標準分子量サンプルは、分子量ごとにきれいに分離、検出されており、良好な分離・検出能が得られることが分かる。
【0101】
実施例5
実施例1と同じディスク状光記録媒体を用いて、実施例1と同様の試料(DNA標準分子量サンプル100bp dsDNA ladder, Gensura Laboratories. Inc., 100g/mL)の分離泳動検出を行うにあたり、ディスク状光記録媒体の記録領域に、下記に示すような前記試料の諸項目、試料移動・泳動分離検出条件諸項目、及びその実行のためのプログラムを予め記録した。
【0102】
・試料の諸項目
1.試料の名称:標準分子量サンプル100bp dsDNA ladder, 100g/mL
2.試料の製造元:Gensura Laboratories Inc.
3.試料の超純水希釈後濃度:1μg/mL
・泳動分離検出条件諸項目
1.メチルセルロース溶液の濃度:0.5%
2.トリス及びホウ酸の最終濃度:50mM
3.蛍光色素の種類:TOTO−3
4.蛍光色素の添加量:0.1μg/ml
5.超純粋希釈後試料の試料注入孔への滴下量:10μL
6.試料注入孔電極とグランド電極との間の印加電圧:500ボルト
7.電気泳動により試料の適量が十字型のキャピラリー交差点に到達するまでの時間:150秒
8.試料適量を移動させるための印加電圧ONからOFF(フローティング状態)までの時間:150秒
9.泳動分離検出のためのディスク回転の開始:フローティング状態(印加電圧OFF)より1秒後
10.レーザ光源及びレンズ系ユニットの検出位置移動とレーザ光源ON:9のフローティング状態(印加電圧OFF)緩衝液貯留用穴の端部より2mmの位置に移動し、移動終了後レーザON
11.ディスク回転の開始:10のレーザONの1秒後
12.ディスクの回転数:300rpm
13.CCDカメラON、センシングの開始:10のレーザONと同時
14.蛍光発光センシングデータ(発光強度−時間)のSRAMへの書き込み開始:ディスク回転ON
15.レーザOFF、回転OFF、CCDカメラOFF:発光強度検知がノイズレベルと判断されてから3分後
16.SRAMに記録されたデータの焼き付け:15のレーザOFF、回転OFF、CCDカメラOFFより100ミリ秒後
【0103】
試料の分析作業の実施にあたっては、実施例1とまったく同様の試料調製、操作手順で、試料を試料注入孔へ滴下後、所定のプログラムに従った試料分析装置の自動操作を実行し、実施例1の図11とまったく同様の検出結果が当該光記録媒体に書き込まれ、当該試料分析装置により再生できることが確認された。
【0104】
なお、試料の試料注入孔への滴下前に、予め記録してある試料の諸項目、泳動分離検出条件諸項目を確認することは、図10に示された試料分析装置の光記録メディアのデータ読み取り機能により容易に確認することが可能である。
【0105】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のディスク状光記録媒体は、基板表面の分析領域に形成されたマイクロキャピラリーによって試料の分離・検出を行い、その分析情報を該ディスク状の基板表面に形成された光記録領域に記録保存することができるので、試料の分離・検出からその分析情報の記録までを一枚のディスクで行うことができる。
【0106】
また、本発明の試料分析装置を用いることにより、上記ディスク状光記録媒体上のマイクロキャピラリーで分離した試料成分の検出及びその分析情報の記録を簡便に行うことができる。
【0107】
【配列表】

Figure 2004093548
Figure 2004093548

【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施形態であるマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体の平面図である。
【図2】上記ディスク状光記録媒体の表面に形成されたマイクロキャピラリーの拡大模式図である。
【図3】上記ディスク状光記録媒体の模式断面図である。
【図4】図3における光記録領域と分析領域の境界部分の拡大図である。
【図5】キャピラリーカバーの代替として、張り合わせ構造の記録層を持たない上面片側ディスクを用いた例を示す図である。
【図6】本発明の別の実施形態であるマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体の平面図である。
【図7】上記ディスク状光記録媒体の表面に形成されたマイクロキャピラリーの拡大模式図である。
【図8】本発明の更に別の実施形態であるマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体の平面図である。
【図9】上記ディスク状光記録媒体に形成された分析領域を拡大して示す部分平面図である。
【図10】本発明の試料分析装置の一実施形態を示す概略構成図である。
【図11】実施例1において、本発明のディスク状光記録媒体及び試料分析装置を用いてDNA標準分子量サンプルを電気泳動して、検出した結果を示す図である。
【図12】実施例2において、本発明のディスク状光記録媒体及び試料分析装置を用いてDNA標準分子量サンプルを電気泳動して、検出した結果を示す図である。
【図13】実施例3において、本発明のディスク状光記録媒体及び試料分析装置を用いてPCRによる微生物遺伝子増幅産物を分離、検出した結果を示す図である。
【図14】実施例4において、本発明のディスク状光記録媒体及び試料分析装置を用いてDNA標準分子量サンプルを分離して、検出した結果を示す図である。
【符号の説明】
1、2、3.マイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体
11.基板
12.中心穴
13.ディスク保持部
14.分析領域
15.光記録領域
21、24.試料移送用キャピラリー
21a、21b、24a.試料注入口
22、25.試料分離用キャピラリー
23、26.マイクロキャピラリー
27、28.電極
31.凹部
32.溝
33.キャピラリーカバー
34.上面片側ディスク
41.案内溝
42.記録層
43.反射層
44.保護膜
51.レーザ光源
52.マルチレンズ
53.ビームスプリッタ
54.コリメータ
55.対物レンズ
56.集光レンズ
57.光検出素子
58.増幅回路
59.サーボ・信号処理LSI
60.レーザ駆動回路
61.CCDカメラ[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention, on the surface of a disk-shaped substrate, sample components, for example, biochemistry, microcapillary used for separation and detection of bio-related high-molecular substances and drugs related to medical and pharmacy, and to record the detection information The present invention relates to a disk-shaped optical recording medium having an optical recording area, and a sample analyzer using the disk-shaped optical recording medium.
[0002]
[Prior art]
In the field of life science, the genomes (all gene information) of various organisms including humans are being decoded at a rapid pace, and the results of the decoding are expected to improve new animal and plant varieties.
[0003]
Also, among single species, it is known that the nucleotide sequence of the genome is slightly different depending on individuals reflecting the diversity (such diversity is referred to as genomic polymorphism or simply polymorphism). For example, in humans, the probability that the nucleotide sequence differs between individuals is about 0.1%. This means that a polymorphism is found at one place for every 1000 bases, and appears at about 3 million bases in the entire human genome (about 3 billion bases).
[0004]
Therefore, by analyzing the genetic information of individual humans, the most appropriate medical treatments and medications based on their own genetic information, which go beyond medical techniques that have never been available for symptomatic treatment, are called tailor-made medical treatments. It is hoped that it will be possible to realize extremely effective disease prevention, medication and treatment while eliminating waste of medication and treatment. For example, a single nucleotide polymorphism (SNP: Single Nucleotide Polymorphism) that differs by only one nucleotide may affect the expression level of a gene or cause an amino acid mutation. Analyzes are expected to find treatments and drugs that are suitable for individuals, and are expected to lead to the establishment of tailor-made medicine.
[0005]
On the other hand, the history of technological development of human genome sequencing is also the history of increasing the absolute amount of base decoding. That is, despite the fact that only 100 bases or less could be decoded annually in the world in the 70's, the Sanger method, the capillary array electrophoresis method, etc. were developed in only 30 years, and the giga year (G = 10 9 ) Sequencing of bases became possible. In particular, capillary electrophoresis is an analysis method that can perform DNA analysis at high speed, with high sensitivity, and with high accuracy, and has the advantages of simple measurement, simultaneous analysis of multiple samples, and easy automation. .
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
However, in order to realize customized medicine from genomic drug discovery in the future, tera (T = 10 12 ) Base, peta (T = 10 Fifteen ) Base, let alone exa (E = 10), which is global human DNA information 18 ) Is said to be required, and the advanced use of information science and technology is required for recording and analyzing such enormous amounts of base information. This is the reason why the necessity of bioinformatics (bioinformatics) has been promoted in recent years. An information processing system that accurately records, transmits, and analyzes the enormous amount of information obtained by a DNA sequencer has been developed. is needed.
[0007]
Accordingly, an object of the present invention is to detect a huge amount of DNA information, which is an essential condition for the establishment of bioinformatics, and a disc-shaped optical recording medium capable of satisfying two requirements of quick and accurate recording analysis, And a sample analyzer using the disk-shaped optical recording medium.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, one aspect of the present invention has a disk-shaped substrate, an optical recording area formed on the surface of the substrate, and an analysis area. An object of the present invention is to provide a disk-shaped optical recording medium having a microcapillary, wherein a microcapillary having an entrance is formed.
[0009]
In the disc-shaped optical recording medium, the microcapillary is formed radially with respect to the center of the substrate, the sample inlet is formed at an end of the substrate on the center side, and the substrate is It is preferable that the sample component is separated by centrifugal force when rotated.
[0010]
Further, the microcapillary has electrodes formed at at least two places in its path, and separates the sample components by applying a voltage between the electrodes and electrophoresing the sample components. Is preferred.
[0011]
Further, the microcapillary includes a sample transfer capillary and a sample separation capillary, and the sample transfer capillary has a sample inlet at at least one end thereof, and intersects with the sample separation capillary in the middle of a path. It is preferable that the other end is connected to the sample separation capillary at the other end.
[0012]
Furthermore, it is preferable that holes for buffer solution injection or storage are formed at both ends of the sample separation capillary.
[0013]
Furthermore, it is preferable that the microcapillary is constituted by a groove formed on the surface of the substrate, and a cover closing an opening of the groove.
[0014]
Furthermore, it is preferable that the optical recording area and the analysis area are formed on the same surface of the disk-shaped substrate.
[0015]
Furthermore, it is preferable that the optical recording layer formed in the optical recording area is a write-once recording layer.
[0016]
According to the invention, the sample is separated and detected by the microcapillary formed in the analysis area on the disk-shaped substrate surface, and the analysis information is recorded and stored in the optical recording area formed on the disk-shaped substrate surface. Therefore, the process from separation and detection of the sample to recording of the analysis information can be performed on one disk.
[0017]
Another aspect of the present invention is a disc-shaped optical recording medium having the microcapillary, a turntable for supporting and rotating the disc-shaped optical recording medium, and irradiating the disc-shaped optical recording medium with laser light. A laser beam irradiating unit, a laser beam receiving unit for receiving a reflected beam of the laser beam applied to the optical recording area of the optical recording medium, and a laser beam applied to the analysis area of the optical recording medium. And an image detecting means for detecting an image.
[0018]
According to the invention, it is possible to easily detect the sample components separated by the microcapillary on the disk-shaped optical recording medium and record the analysis information thereof.
[0019]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
[0020]
1 to 4 show an embodiment of a disc-shaped optical recording medium having a microcapillary of the present invention. FIG. 1 is a plan view of a disk-shaped optical recording medium having a microcapillary, FIG. 2 is an enlarged schematic view of a microcapillary formed on the surface of the disk-shaped optical recording medium, and FIG. 3 is a schematic diagram of the disk-shaped optical recording medium. FIG. 4 is an enlarged view of a boundary portion between the optical recording area and the analysis area.
[0021]
As shown in FIG. 1, the disc-shaped optical recording medium 1 has an optical recording area 15 in an outer peripheral area on one surface of a disc-shaped substrate 11 and a plurality of microcapillaries 23 in an inner peripheral area in contact with the optical recording area. A plurality of analysis regions 14 are formed, and a center hole 12 for holding a disk and a disk holding portion 13 are formed in a further inner peripheral portion of the analysis region.
[0022]
The microcapillary 23 formed in the analysis region 14 is described in a literature or the like (Chao-Xuan Zhang and Andreas Manz, “Narrow Sample Channel Injectors for Capillary Electrolysis on Microchips. Like a cross-shaped electrophoresis capillary, the capillary comprises a short sample transfer capillary 21 and a long sample separation capillary 22, and as shown in FIG. 2, the sample transfer capillary 21 and the sample separation capillary 22 are used. Are formed so as to intersect and connect at a predetermined angle in the middle of the route. In the present invention, the sample transfer capillary 21 and / or the sample separation capillary 22 are provided on the substrate 11 so that the sample can be transferred and / or separated by centrifugal force when the substrate 11 is rotated. It is preferable to be formed radially with respect to the center. Here, the term “radial” includes a shape that goes outward at an angle inclined with respect to the radial direction, and a shape that goes outward in a spiral shape.
[0023]
In this embodiment, the sample separation capillary 22 is formed in a shape going outward from the center of the substrate 11 at a slightly inclined angle with respect to the radial direction, and the sample component is centrifugally generated by the rotation of the disk. It can be separated.
[0024]
Further, sample injection ports 21a and 21b are formed at both ends of the sample transfer capillary 21, so that a sample can be injected into the microcapillary from the sample injection ports. On the other hand, a buffer solution injection hole 22a is formed at one end of the sample separation capillary 22, and a buffer solution storage hole 22b is formed at the other end, so that the buffer solution can be injected from the buffer solution injection hole. It has become.
[0025]
As shown in FIG. 3, the microcapillary 23 is formed by covering a concave portion 31 formed in a predetermined shape with a capillary cover 33 on one surface of the substrate 11 (the side opposite to the laser beam incident surface). That is, as shown in FIG. 4, a fine groove 32 of a predetermined length having a sample injection port and a hole for buffer solution injection or storage at both ends is formed in the capillary forming portion on the bottom surface of the concave portion 31. By covering the opening of the groove 32 with a capillary cover 33, a microcapillary is formed. In the capillary cover 33, through holes of a predetermined size are formed at respective positions corresponding to the sample injection port and the hole for buffer solution injection or storage, and sample injection is performed through the through hole. The inlet and the hole for buffer solution injection or storage are open when viewed from above, but the capillary forming portion is covered with a capillary cover and is sealed.
[0026]
As shown in FIG. 5, as an alternative to the capillary cover 33, an upper surface single-sided disk 34 (dummy layer) having no laminated recording layer may be used.
[0027]
The width and depth of the groove 32 may be a width and a depth that exhibit a capillary phenomenon so that a sample or a buffer solution can be sufficiently sucked and filled in the entire capillary, and a uniform width over the entire area of the capillary. And a depth. Specifically, the width is preferably 20 to 300 μm and the depth is 10 to 200 μm, and the width is preferably 50 to 150 μm and the depth is more preferably 20 to 40 μm.
[0028]
The length of the groove 32 should be such that an appropriate amount of sample can be easily transferred in the case of forming a sample transfer capillary, and is usually preferably 2 to 30 mm, more preferably 3 to 5 mm. In addition, a capillary for forming a sample separation capillary may have a length sufficient for sufficient separation by centrifugal force or electrophoresis, and is usually preferably 10 to 100 mm, more preferably 15 to 50 mm.
[0029]
The size (diameter) of the sample injection port and the buffer solution injection or storage hole formed at both ends of the groove 32 is such that the sample or buffer solution can be injected by an injection instrument such as a micropipette, and Any size may be used as long as it has a function of a liquid reservoir, and specifically, a size having a diameter of 1 to 5 mm. Further, it is preferable that the depth is equal to the depth of the groove 32.
[0030]
In the present invention, electrodes may be formed at both ends of the sample transfer capillary 21 and / or the sample separation capillary 22. The electrode is drawn out to the upper surface of the capillary cover through a sample injection port provided in the capillary cover (or a disk on one side of the upper surface) and a through hole having the same diameter as the hole for buffer solution injection or storage.
[0031]
For example, when electrodes are formed at both ends of the sample transfer capillary 21, by applying a voltage between the electrodes, the sample injected into the sample injection port 21 a (or 21 b) is connected to the sample transfer capillary 21. It can be transported to the intersection with the capillary 22 for sample separation. When electrodes are formed at both ends of the sample separation capillary 22, separation of sample components by electrophoresis can be performed by applying a voltage between the electrodes.
[0032]
On the other hand, in the optical recording area 15, an information recording section similar to a normal CD-R or DVD-R is formed. That is, as shown in FIGS. 4 and 5, the information recording section 45 includes a guide groove 41 formed at a predetermined pitch on the surface of the substrate 11 opposite to the laser light incident surface, and an organic dye laminated on the surface. And a reflective layer 43, the surface of which is covered with a protective film 44.
[0033]
As a material of the substrate 11 constituting the disk-shaped optical recording medium of the present invention, a polycarbonate resin used for an ordinary optical recording medium is preferably used. In addition, the capillary cover 33 and the upper surface one-sided disk 34 and the like may be made of polycarbonate or a material (for example, acrylic resin or the like) sufficiently transmitting a laser beam corresponding thereto.
[0034]
The shape of the substrate (disk) is not limited to a circle but may be a square or the like, but the final outer shape or the like is basically based on Japanese Industrial Standards (JIS), a compact disk digital audio system (S8605-1993 (IEC908)). : 1987)), and preferably conforms to the standard of DVD FLLC (Format / Logo Licensing Corporation).
[0035]
6 and 7 show another embodiment of the disc-shaped optical recording medium having the microcapillary of the present invention. FIG. 6 is a plan view of a disk-shaped optical recording medium having a microcapillary, and FIG. 7 is an enlarged schematic view of a microcapillary formed on the surface of the disk-shaped optical recording medium. In the following description of the embodiment, the same reference numerals are given to substantially the same portions as those of the above embodiment, and the description thereof will be simplified or omitted.
[0036]
As shown in FIG. 6, the disc-shaped optical recording medium 2 is such that the positions of an optical recording area 15 and an analysis area 14 formed on one surface of a substrate 11 are opposite to those of the disc-shaped optical recording medium 1. Are different. That is, in the disc-shaped optical recording medium 2, the analysis area 14 is formed in the outer peripheral area of the substrate 11, and the optical recording area 15 is formed in the inner peripheral area in contact with the analysis area 14.
[0037]
The microcapillary 23 'formed in the analysis area 14 is composed of a shorter sample transfer capillary 21' and a longer sample separation capillary 22 'as described above. However, the sample separation capillary 22 ′ is formed in an arc shape concentric with the outer periphery at a portion slightly inside the outer periphery of the substrate 11, and the sample transfer capillary 21 ′ is formed as the sample separation capillary 22 ′. , Obliquely intersecting with each other, one end thereof is located near the center of the substrate 11 and the other end is located near the outer periphery. As a result, the sample transfer capillary 21 'can transfer the sample to the sample separation capillary 22' by the centrifugal force accompanying the rotation of the disk. In addition, electrodes (not shown) are formed at both ends of the sample separation capillary 22 'so that sample components can be separated by electrophoresis.
[0038]
8 and 9 show still another embodiment of the disc-shaped optical recording medium having the microcapillary of the present invention. FIG. 8 is a plan view of a disc-shaped optical recording medium having a microcapillary, and FIG. 9 is an enlarged view of an analysis area formed on the disc-shaped optical recording medium.
[0039]
As shown in FIG. 8, the disc-shaped optical recording medium 3 has an optical recording area 15 in an outer peripheral area on one surface of a disc-shaped substrate 11 and a plurality of microcapillaries 26 in an inner peripheral area in contact with the optical recording area. And the formed analysis area 14. In this embodiment, an identification barcode 16 is formed on the disk holding unit 13.
[0040]
As shown in FIG. 9, the microcapillary 26 formed in the analysis area 14 includes a short sample transfer capillary 24 radially and spirally extending from the center side of the substrate 11 toward the outer diameter direction, and a sample transfer capillary 24. The capillary 24 includes a longer sample separation capillary 25 that extends radially outward from the end of the capillary 24 continuously from the end in the outer diameter direction.
[0041]
Then, an inner end of the sample transfer capillary 24, an end of a portion where the sample transfer capillary 24 and the sample separation capillary 25 are connected, and an outer end of the sample separation capillary 25. A hole for injecting and storing a sample and / or a buffer solution is formed therein. Incidentally, a sample injection port 24a is formed at the end on the inner diameter side of the sample transfer capillary 24.
[0042]
Electrodes 27 and 28 are formed at the end of the portion where the sample transfer capillary 24 and the sample separation capillary 25 are connected, and at the outer diameter end of the sample separation capillary 25, By applying a voltage between the electrodes 27 and 28, sample components can be separated by electrophoresis.
[0043]
Therefore, according to the disk-shaped optical recording medium 3 having the microcapillary, the sample injected into the sample injection port 24a is moved along the sample transfer microcapillary 24 by the centrifugal force generated by the rotation of the disk-shaped optical recording medium 3. The sample moves in the outer diameter direction and reaches the inner end of the sample separation capillary 25.
[0044]
Then, by applying a voltage between the electrodes 27 and 28, the sample components can be moved by electrophoresis in the sample separation capillary 25 to separate the sample components. In addition, by performing the above-mentioned electrophoresis while rotating the disc-shaped optical recording medium 3, the centrifugal force generated by the rotation of the disc-shaped optical recording medium 3 and the electrophoresis are used together to separate the sample components. You can also.
[0045]
Then, by using a sample analyzer or the like described later, the sample components separated in the sample separation capillary 25 can be detected by an optical means such as a laser, and information on separation / detection is sequentially obtained. Alternatively, they can be collectively recorded in the optical recording area of the disc-shaped optical recording medium.
[0046]
Accordingly, since a single disk-shaped optical recording medium can perform from separation and detection of sample components to storage of the record of the analysis information and the like, data management and the like are very easy.
[0047]
In the present invention, the recording layer formed in the optical recording area is preferably a write-once recording layer. That is, when the recording layer is a storage mode using an organic dye similar to a CD-R or DVD-R, information once written on the recording layer cannot be rewritten, thereby preventing data falsification and the like. be able to.
[0048]
The optical recording area contains information on the reagent (component, expiration date, intended use, etc.) filled in the sample separation capillary, information on the sample to be analyzed (component, concentration, manufacturer or preparation conditions), and experimental conditions. (Sample usage, disk rotation speed, voltage, temperature, detection wavelength, etc.) and a program for executing the program may be recorded in advance. As a result, it is possible to accurately manage the experimental conditions and to prevent an operation error or the like.
[0049]
In the present invention, as shown in FIGS. 4 and 5, it is preferable that the optical recording area and the analysis area are formed on the same surface of the disk-shaped substrate. This makes it possible to share the light source for sample component detection and the light source for recording / reading information in the optical recording area, and to detect the sample component and record information in the optical recording area with one light source. / Readout becomes possible.
[0050]
When sample components are separated using the disc-shaped optical recording medium of the present invention, for example, methyl cellulose (MC), hydroxyethyl cellulose (HEC), hydroxypropyl cellulose (HPC), hydroxypropyl methyl cellulose It is used after filling a buffer solution containing a cellulose derivative such as (HPMC), a polymer of polyethylene glycol, polyethylene oxide, polyacrylamide, agarose, an acrylamide derivative, or the like. The buffer solution can be filled by capillary action by dropping an appropriate amount of buffer solution into a sample injection port formed at the end of the capillary or a hole for buffer solution injection or storage.
[0051]
The sample component is not particularly limited, but high molecular substances related to biochemistry such as drug molecules, amino acids, peptides, DNA, oligonucleotides, and relatively large proteins can be preferably exemplified.
[0052]
The sample component is labeled with a fluorescent dye having an absorption band around the laser wavelength as necessary so that it can be detected at 780 nm, which is the laser wavelength of CD-R, or 630 nm, which is the laser wavelength of DVD-R. You. The fluorescent dye may be appropriately selected depending on the type of the sample component and the laser wavelength used for detection. For example, when detection is performed at 780 nm, which is the CD-R laser wavelength, the fluorescent dye has an absorption band at 750 to 810 nm. It is preferable to use a fluorescent dye, and in the case of performing detection at 630 nm, which is the DVD-R laser wavelength, it is preferable to use a fluorescent dye having an absorption band at 600 to 660 nm. The labeling of the sample component with a fluorescent dye may be performed according to a known method. Therefore, a sample component may be labeled in advance with a fluorescent dye and then subjected to analysis, and the sample component may be added to a buffer containing a polymer or the like filled in the capillary by selecting an appropriate fluorescent dye. Thus, labeling can be performed simultaneously with separation of sample components.
[0053]
For example, when DNA or oligonucleotide is used as a sample component, TOTO-3, IRDye41, IRDye800, or the like can be used as a fluorescent dye. Incidentally, TOTO-3 is a fluorescent dye having an absorption band near 630 nm, which is the laser wavelength of DVD-R, and is added to a buffer containing a polymer or the like to be filled in the capillary, so that it can be separated at the same time as separation. Labeling (staining) of DNA and oligonucleotides can be performed. Therefore, there is no need to separately label sample components, which is convenient.
[0054]
On the other hand, IRDye41 and IRDye800 are fluorescent dyes having an absorption band around 780 nm, which is the laser wavelength of CD-R.
[0055]
Next, the sample analyzer of the present invention will be described.
The sample analyzer of the present invention detects a sample component separated by using the above-mentioned disk-shaped optical recording medium, and records information on separation / detection, and supports and rotates the disk-shaped optical recording medium. A turntable, a laser light irradiating means for irradiating the disk-shaped optical recording medium with laser light, a laser light receiving means for receiving reflected light of the laser light applied to the optical recording area of the optical recording medium, and Image detecting means for detecting an image formed by the laser light applied to the analysis area of the optical recording medium.
[0056]
FIG. 10 is a schematic configuration diagram showing one embodiment of the sample analyzer of the present invention.
[0057]
In the figure, a disk-shaped optical recording medium 1 is supported by the turntable (not shown) and rotates. A photodetection recording means 50 is provided movably in the radial direction with respect to the disc-shaped optical recording medium 1.
[0058]
The light detection recording means 50 includes a laser light source 51 for emitting laser light by a laser driving circuit 60, a multi-lens 52 for converting the laser light into a parallel beam, and a beam for passing the laser emission light and extracting reflected light. A splitter 53, a collimator 54, an objective lens 55, a condenser lens 56 for condensing the reflected light split by the beam splitter 53, and a photodetector 57 for receiving the reflected light condensed by the condenser lens 56 And an amplifying circuit 58 for amplifying the optical signal detected by the photodetector 57, and a servo / signal processing LSI 59 for processing the optical signal input through the amplifying circuit. Further, a CCD (charge-coupled type) camera 61 oriented to image predetermined positions on the upper and lower surfaces of the disc-shaped optical recording medium 1 is provided.
[0059]
Therefore, the laser light emitted from the laser light source 51 is applied to a predetermined position of the disk-shaped optical recording medium 11 through the multi-lens 52, the beam splitter 53, the collimator 54, and the objective lens 55. This laser light is used, for example, as a light source for emitting the component separated by the sample separation capillary 25, and as a writing light source for recording analysis data in the optical recording area 15 of the disc-shaped optical recording medium 1. And is also used as a light source for reading information written in the optical recording area 15.
[0060]
When the laser light is used, for example, as a light source or the like for reading information written in the optical recording area 15, the laser light irradiated to the optical recording area 15 and reflected is extracted by the beam splitter 53, The light is applied to the light detection element 57 through the condenser lens 56. Then, the optical signal received by the light detecting element 57 is amplified by the amplifier circuit 58 and read by the servo / signal processing LSI 59. Further, the servo / signal processing LSI 59 also has a function of moving the laser light irradiation position from the laser light source 51 and controlling the laser light emission timing based on the read information.
[0061]
Therefore, according to this sample analyzer, after the sample component is separated by the sample separation capillary 22 of the disk-shaped optical recording medium 1, the sample separation capillary 22 is irradiated with laser light, and the pattern emitted by the laser light is emitted. Is captured by the CCD camera 61, and the light emission pattern is image-analyzed by a computer (not shown) to analyze the components.
[0062]
Further, by writing the analysis result thus obtained in the optical recording area 15 of the disk-shaped optical recording medium 1 with a laser beam, data can be stored on the same disk. Further, the written data is irradiated with a laser beam, the reflected light is extracted by a beam splitter 53, received by a photodetector 57 through a condenser lens 56, and the received optical signal is amplified by an amplifier circuit 58. -Data can also be read by reading with the signal processing LSI 59.
[0063]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples. In the following example, the disc-shaped optical recording medium used was one in which a guide groove, a recording layer, a reflective layer, and the like were formed in a predetermined area of the substrate in a conventional manner, and a capillary was formed by machining. Were used.
[0064]
Example 1
DNA fragments were separated and detected using the disk-shaped optical recording medium having the structure shown in FIG.
[0065]
a) A concave portion 31 having a groove 32 for forming a capillary in an analysis region (a region where an optical recording layer is not formed) of a polycarbonate substrate 11 having an information recording portion similar to a CD-R formed in a predetermined region. Was formed. Specifically, as shown in FIG. 2, a sample transfer capillary 21 (3.5 mm in length, 100 μm in width and 30 μm in depth) and a sample separation capillary 22 (20.5 mm in length, 100 μm in width and 100 μm in depth) 30 μm) intersects at an angle of 45 °, is at a distance of 1.25 mm from the buffer solution injection or storage hole 22 a located at the inner diameter side end of the sample separation capillary 22, and has a line width center of 50 μm. The cross section was formed at a distance of 2.25 mm from the sample injection port 21a located on the inner diameter side end of the sample transfer capillary 21 at the center of the line width of 50 μm. At both ends of each groove, a sample injection port (21a, 21b) having a diameter of 1.5 mm and a depth of 30 μm, and a hole (22a, 22b) for buffer solution injection or storage were formed.
[0066]
b) Then, as shown in FIGS. 3 and 4, a polycarbonate resin having the same shape as the concave portion is formed so as to completely cover the concave portion 31 in which each of the grooves, the sample injection port, and the buffer solution injection or storage hole is formed. Was bonded to the substrate 11 using an ultraviolet curing adhesive. In the capillary cover 33, a through hole having a diameter of 1.5 mm is formed at a position corresponding to a sample injection port provided in the concave portion of the substrate 11 and a hole for buffer solution injection or storage, respectively. The hole for sample injection, buffer solution injection or storage is open when viewed from above, but the capillary forming part is covered with a capillary cover to form a sealed tubular capillary with a width of 100 μm and a depth of 30 μm. are doing.
[0067]
c) Platinum sputtering is performed on the sample injection port, buffer solution injection or storage hole (a region corresponding to the hole diameter of 1.5 mm) which is open through the through hole of the capillary cover when viewed from above, to form an electrode. Formed.
[0068]
d) A fluorescent dye-containing methylcellulose solution (methylcellulose concentration 0.5%) was prepared as a buffer for electrophoresis. Specifically, 0.5 g of methylcellulose was added to 80 mL of hot purified water, stirred well, cooled in a refrigerator overnight to completely dissolve, and then tris (for biochemistry) and boric acid (special reagent grade) were added. The final concentration was adjusted to 50 mM (pH 7.5 to 8.5), and the total volume was adjusted to 100 mL with a volumetric flask. Finally, the fluorescent dye TOTO-3 was adjusted to 0.1 μg / mL. added.
[0069]
Then, an appropriate amount of the buffer solution was dropped by a micropipette into the sample inlet (21b) of the sample transfer capillary in the direction opposite to the disk, and the inside of the capillaries crossed in a cross shape by capillary action was completely filled with the buffer solution. . The capillary can be filled with the same capillary effect by capillary action regardless of where the sample injection port, buffer solution injection or storage hole is used.
[0070]
e) As a sample, a DNA standard molecular weight sample (100 bp dsDNA ladder (Gensura Laboratories. Inc., 100 g / mL)) was diluted with ultrapure water (Millipore) at the time of measurement and adjusted to 1 μg / mL. The 100 bp dsDNA ladder is a mixture of 10 (100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 bp) double-stranded DNA fragments (the same applies hereinafter).
[0071]
f) 10 μl of the DNA standard molecular weight sample is dropped by a micropipette into the sample inlet (21a) in the disk rotation direction of the capillary for transferring the sample of the capillary filled with the buffer solution, and is formed in the sample inlet (21b). The ground electrode is dropped to the ground, a positive voltage of 500 volts is applied to the electrode formed in the sample inlet (21a), and when an appropriate amount reaches the intersection of the cross-shaped capillary by electrophoresis, the sample inlet (21b ), The ground contact of the electrodes and the application of the positive voltage to the electrodes of the sample inlet (21a) were released to bring them into a floating state.
[0072]
Then, the disc-shaped optical recording medium was separated and detected using a sample analyzer basically having the configuration shown in FIG.
[0073]
Specifically, the laser light source 51 and the lens system unit (52 to 55) are moved and fixed to a position 2 mm from the end of the capillary for sample separation on the side of the buffer solution storage hole (22b), and are stationary. The disk-shaped optical recording medium was rotated at a rotation speed of 300 rpm, and the DNA fragments separated and electrophoresed by centrifugal force were irradiated with laser light (wavelength 635 nm) from the laser light source fixed at the predetermined position. . The DNA fragment stained with the fluorescent dye in the buffer emits fluorescence when excited by the laser beam. The fluorescence is measured by the CCD camera 61, and the luminescence start time and the luminescence intensity of each DNA fragment from the rotation of the disk are measured. Are recorded as a pair of information in the SRAM which is a temporary recording memory, and the information on the emission intensity and the migration time of each DNA fragment temporarily recorded in the SRAM is switched to the CD-R light recording mode of the sample analyzer. As a result, printing was performed on the optical recording area of the disk-shaped optical recording medium by laser light (wavelength 780 nm). The result is shown in FIG. The vertical axis in FIG. 11 represents the emission intensity, and the horizontal axis represents the migration time (seconds) until the DNA fragment reaches the laser light source fixed position and emits light (the same applies to FIGS. 12 to 14).
[0074]
From FIG. 11, it can be seen that the DNA standard molecular weight sample is clearly separated and detected for each molecular weight, and good separation and detection ability can be obtained.
[0075]
Example 2
DNA fragments were separated and detected using the disk-shaped optical recording medium having the structure shown in FIG.
[0076]
a) For forming a capillary in an analysis area (an optical recording layer-free area) of a polycarbonate substrate having an information recording section (4.8 GB single-sided recording) similar to that of a DVD-R formed in a predetermined area. A groove 32 was formed. Specifically, as shown in FIG. 7, a sample transfer capillary (length 3.5 mm, width 80 μm, depth 40 μm) and a sample separation capillary (length 20.5 mm, width 80 μm, depth 40 μm) Intersect at an angle of 45 degrees, at a position 1.25 mm from the inner end of the disk for sample separation, at a line width center of 40 μm, and in the disk rotation direction of the sample transfer capillary (laser light source). It was formed at a position 2.25 mm from the end on the clockwise side (as viewed from above the installation site) and at the center of the line width of 40 μm as an intersection. At both ends of each capillary, sample injection ports (21′a, 21′b) having a diameter of 1.5 mm and a depth of 40 μm, and holes (22′a, 22′b) for buffer injection or storage are provided. Formed.
[0077]
b) Then, as shown in FIG. 5, the upper surface single-sided disk 34 made of polycarbonate corresponding to the capillary cover of the first embodiment is covered with the above-mentioned grooves, the sample injection port, and the buffer so as to cover the above-mentioned grooves. It adhered to the surface in which the hole for liquid injection or storage was formed using an ultraviolet curing adhesive. On the upper surface one-sided disk 34, through holes having a diameter of 1.5 mm are formed at positions corresponding to the sample injection port provided on the substrate 11 and the hole for buffer solution injection or storage, respectively. The sample inlet, buffer solution injection or storage hole is open when viewed from above, but the capillary forming part is covered with a capillary cover to form a sealed 80 μm wide, 40 μm deep tubular capillary. I have.
[0078]
c) Platinum sputtering is performed on the sample injection port, buffer solution injection or storage hole (a region corresponding to the hole diameter of 1.5 mm) which is open when viewed from above through the through hole of the upper surface one-sided disk, and the electrode is formed. Was formed.
[0079]
d) A fluorescent dye-containing methylcellulose solution (methylcellulose concentration: 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0%) was prepared as in Example 1 as a buffer for electrophoresis. In addition, 0.05 μg / mL of TOTO-3 was added as a fluorescent dye.
[0080]
Then, an appropriate amount of the buffer solution is dropped by a micropipette into the sample inlet (21'b) of the sample transfer capillary in the direction opposite to the disk, and the inside of the capillaries crossed in a cross shape by capillary action is entirely filled with the buffer solution. Filled. The capillary can be filled with the same capillary effect by capillary action regardless of where the sample injection port, buffer solution injection or storage hole is used.
[0081]
e) As a sample, a DNA standard molecular weight sample (100 bp dsDNA ladder (Gensura Laboratories. Inc., 100 g / mL)) was diluted with ultrapure water (Millipore) at the time of measurement and adjusted to 1 μg / mL.
[0082]
f) 10 μl of the DNA standard molecular weight sample was dropped by a micropipette onto the sample inlet (21′a) in the disk rotation direction of the capillary for transferring the sample of the capillary filled with the buffer solution, and the disk-shaped optical recording medium was removed. The sample components were separated and detected using a sample analyzer basically having the configuration shown in FIG.
[0083]
Specifically, the stationary disk was rotated at a rotation speed of 500 rpm, and the DNA standard molecular weight sample was allowed to reach the intersection of the cross-shaped capillary by centrifugal force. The electrode formed in the hole (22'b) was grounded, and a positive voltage of 750 volts was applied to the electrode formed in the buffer solution inlet (22'a) to perform electrophoretic separation of DNA fragments.
[0084]
The laser light source 51 and the lens system unit (52 to 55) are moved and fixed at a position 2 mm from the buffer solution storage hole (22'b) side end of the sample separation capillary, and are electrophoresed. The irradiated DNA fragment is irradiated with laser light (wavelength 635 nm) from the laser light source fixed at the above-mentioned predetermined position, detected in the same manner as in Example 1, and the information is switched to the DVD-R optical recording mode. Burning recording was performed on the optical recording area of the disk-shaped optical recording medium using a laser beam (wavelength: 635 nm).
[0085]
Separation and detection of sample components were carried out under the same conditions using buffers having different methylcellulose concentrations. The results are shown in FIG. In FIG. 12, (1) is a methylcellulose concentration of 1.0%, (2) is a methylcellulose concentration of 0.7%, (3) is a methylcellulose concentration of 0.5%, (4) is a methylcellulose concentration of 0.3%, and (5). ▼ shows the results when a buffer having a methylcellulose concentration of 0.1% was used.
[0086]
From FIG. 12, it can be seen that good separation / detection ability can be obtained although the separation ability varies depending on the methylcellulose concentration.
[0087]
Example 3
DNA fragments were separated and detected using the disk-shaped optical recording medium having the structure shown in FIG.
[0088]
a) For forming a capillary in an analysis area (an optical recording layer-free area) of a polycarbonate substrate having an information recording section (4.8 GB single-sided recording) similar to that of a DVD-R formed in a predetermined area. A groove 32 was formed. Specifically, as shown in FIG. 2, a sample transfer capillary (length 3.5 mm, width 50 μm, depth 50 μm) and a sample separation capillary (length 20.5 mm, width 50 μm, depth 50 μm) Crosses at an angle of 45 degrees, is at a position 1.25 mm from the inner end of the disk for sample separation, at the center of the line width of 25 μm, and the end of the capillary for sample transfer on the inner diameter of the disk. It was formed so as to be located at a position of 2.25 mm from the center and a point of intersection of 25 μm at the center of the line width. At both ends of each capillary, a sample inlet (21a, 21b) having a diameter of 1.5 mm and a depth of 50 μm, and a hole (22a, 22b) for buffer solution injection or storage were formed.
[0089]
b) Then, as shown in FIG. 5, the upper surface single-sided disk 34 made of polycarbonate corresponding to the capillary cover of the first embodiment is covered with the above-mentioned grooves, the sample injection port, and the buffer so as to cover the above-mentioned grooves. It adhered to the surface in which the hole for liquid injection or storage was formed using an ultraviolet curing adhesive. On the upper surface one-sided disk 34, through holes having a diameter of 1.5 mm are formed at positions corresponding to the sample injection port provided on the substrate 11 and the hole for buffer solution injection or storage, respectively. The sample inlet, buffer injection or storage hole is open when viewed from above, but the capillary forming part is covered with a capillary cover to form a sealed 50 μm wide, 50 μm deep tubular capillary. I have.
[0090]
c) Platinum sputtering is performed on the sample injection port, buffer solution injection or storage hole (a region corresponding to the hole diameter of 1.5 mm) which is open when viewed from above through the through hole of the upper surface one-sided disk, and the electrode is formed. Was formed.
[0091]
d) A 0.5% methylcellulose solution containing a fluorescent dye (TOTO-3) was prepared in the same manner as in Example 1 as a buffer for electrophoresis.
[0092]
Then, an appropriate amount of the buffer solution was dropped by a micropipette into the sample inlet (21b) of the sample transfer capillary in the direction opposite to the disk, and the inside of the capillaries crossed in a cross shape by capillary action was completely filled with the buffer solution. .
[0093]
e) A microbial gene amplified product (500 bp) obtained by amplifying a 500 bp fragment by PCR (polymerase chain reaction) using phage DNA as a template was used as a sample. As primers for PCR, those shown in SEQ ID NO: 1 (primer on the 5 ′ side) and SEQ ID NO: 2 (primer on the 3 ′ side) were used. The PCR reaction solution had a final volume of 50 μL, and 0.5 ng of template DNA was added to each of the two primers at 1.0 μmol / L, 200 mmol / L potassium chloride (KCl), and 15 mmol / L magnesium chloride (MgCl). 2 ) And 0.01% (mass / volume ratio) gelatin. In the PCR, using a device manufactured by PERKIN ELMER, a thermal denaturation reaction was performed at 94 ° C. for 15 seconds, and an annealing and extension reaction was performed at 68 ° C. for 30 seconds, and this was repeated 25 cycles.
"Sequence List Free Text"
SEQ ID NO: 1: PCR primer
SEQ ID NO: 2: Primer for PCR
[0094]
f) The microbial gene amplification product is dropped by 10 μl to the sample inlet (21a) in the disk rotation direction of the capillary for transferring the sample of the capillary filled with the buffer solution, and formed into the sample inlet (21b). The ground electrode is dropped to the ground, a positive voltage of 500 volts is applied to the electrode formed in the sample inlet (21a), and when an appropriate amount reaches the intersection of the cross-shaped capillary by electrophoresis, the sample inlet (21b ), The ground contact of the electrodes and the application of the positive voltage to the electrodes of the sample inlet (21a) were released to bring them into a floating state.
[0095]
Then, the electrode formed in the storage hole (22b) is brought into ground contact, and a positive voltage of 800 volts is applied to the electrode formed in the buffer inlet (22a) to perform electrophoretic separation of the microorganism gene amplification product. In the same manner as in Example 2, detection of sample components and recording of information were performed. The result is shown in FIG.
[0096]
FIG. 13 shows that the DNA fragment amplified by PCR can be accurately separated and detected.
[0097]
Example 4
Using the same disk-shaped optical recording medium as in Example 1, using a 0.7% hydroxypropylmethylcellulose solution containing a fluorescent dye (TOTO-3) as a buffer during electrophoresis, a DNA standard molecular weight sample 100 bp dsDNA ladder (Gensura) Laboratories, Inc., 100 g / mL).
[0098]
Specifically, 10 μl of the DNA standard molecular weight sample was dropped with a micropipette onto the sample inlet (21a) in the disk rotation direction of the capillary for transferring the sample of the capillary filled with the buffer solution, and the sample inlet (21b) Is grounded, a positive voltage of 600 volts is applied to the electrode formed at the sample inlet (21a), and when an appropriate amount reaches the crossing point of the cross-shaped capillary by electrophoresis, the sample is injected. The ground contact of the electrode at the inlet (21b) and the application of the positive voltage to the electrode at the sample inlet (21a) were released to bring the electrode into a floating state.
[0099]
Then, the sample components were separated and detected in the same manner as in Example 1 except that the rotation speed of the disc-shaped optical recording medium was set to 200 rpm, and the information was recorded in the optical recording area of the disc-shaped optical recording medium. FIG. 14 shows the result.
[0100]
From FIG. 14, it can be seen that the DNA standard molecular weight sample is clearly separated and detected for each molecular weight, and good separation and detection ability can be obtained.
[0101]
Example 5
When the same disk-shaped optical recording medium as in Example 1 was used to perform the separation and migration detection of the same sample (DNA standard molecular weight sample 100 bp dsDNA ladder, Gensura Laboratories. Inc., 100 g / mL) in the same manner as in Example 1 In the recording area of the optical recording medium, the following items of the sample, various items of the sample movement / migration separation detection conditions, and a program for executing the same were recorded in advance.
[0102]
・ Sample items
1. Sample name: standard molecular weight sample 100 bp dsDNA ladder, 100 g / mL
2. Sample manufacturer: Gensura Laboratories Inc.
3. Sample concentration after dilution with ultrapure water: 1 μg / mL
・ Electrophoretic separation detection conditions
1. Concentration of methylcellulose solution: 0.5%
2. Final concentration of Tris and boric acid: 50 mM
3. Type of fluorescent dye: TOTO-3
4. Addition amount of fluorescent dye: 0.1 μg / ml
5. Drop volume of sample after ultra-pure dilution into sample injection hole: 10 μL
6. Applied voltage between sample injection hole electrode and ground electrode: 500 volts
7. Time required for the appropriate amount of sample to reach the cross-shaped capillary intersection by electrophoresis: 150 seconds
8. Time from application voltage ON to OFF (floating state) for moving an appropriate amount of sample: 150 seconds
9. Start of disk rotation for electrophoretic separation detection: 1 second after floating state (applied voltage OFF)
10. Movement of detection position of laser light source and lens system unit and laser light source ON: Floating state of 9 (applied voltage OFF) Move to position 2 mm from end of buffer solution storage hole, and turn on laser after movement
11. Start of disk rotation: 1 second after 10 lasers ON
12. Disk rotation speed: 300 rpm
13. CCD camera ON, sensing start: Simultaneous with 10 laser ON
14. Start writing fluorescence emission sensing data (emission intensity-time) to SRAM: disk rotation ON
15. Laser OFF, rotation OFF, CCD camera OFF: 3 minutes after the emission intensity detection is judged to be the noise level
16. Burning of data recorded in SRAM: 15 milliseconds after laser off, rotation off, CCD camera off
[0103]
In carrying out the sample analysis work, the sample preparation and operating procedure were exactly the same as in Example 1, and after the sample was dropped into the sample injection hole, the sample analyzer was automatically operated according to a predetermined program. 1 was written to the optical recording medium, and it was confirmed that the result could be reproduced by the sample analyzer.
[0104]
Before dropping the sample into the sample injection hole, confirming the prerecorded items of the sample and the various items of the electrophoretic separation detection conditions are based on the data of the optical recording medium of the sample analyzer shown in FIG. It can be easily confirmed by the reading function.
[0105]
【The invention's effect】
As described above, the disc-shaped optical recording medium of the present invention performs the separation and detection of the sample by the microcapillary formed in the analysis region on the substrate surface, and the analysis information is formed on the disc-shaped substrate surface. Since the data can be recorded and stored in the optical recording area, the process from separation and detection of the sample to recording of the analysis information can be performed on one disk.
[0106]
Further, by using the sample analyzer of the present invention, it is possible to easily detect the sample components separated by the microcapillary on the disk-shaped optical recording medium and record the analysis information thereof.
[0107]
[Sequence list]
Figure 2004093548
Figure 2004093548

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a plan view of a disk-shaped optical recording medium having a microcapillary according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is an enlarged schematic view of a microcapillary formed on the surface of the disk-shaped optical recording medium.
FIG. 3 is a schematic sectional view of the disk-shaped optical recording medium.
4 is an enlarged view of a boundary portion between an optical recording area and an analysis area in FIG.
FIG. 5 is a diagram showing an example in which an upper surface single-sided disk having no laminated recording layer is used as a substitute for the capillary cover.
FIG. 6 is a plan view of a disc-shaped optical recording medium having a microcapillary according to another embodiment of the present invention.
FIG. 7 is an enlarged schematic view of a microcapillary formed on the surface of the disk-shaped optical recording medium.
FIG. 8 is a plan view of a disc-shaped optical recording medium having a microcapillary according to still another embodiment of the present invention.
FIG. 9 is an enlarged partial plan view showing an analysis area formed on the disc-shaped optical recording medium.
FIG. 10 is a schematic configuration diagram showing one embodiment of a sample analyzer of the present invention.
FIG. 11 is a diagram showing the results of detection by electrophoresis of a DNA standard molecular weight sample using the disk-shaped optical recording medium and the sample analyzer of the present invention in Example 1.
FIG. 12 is a diagram showing the results of detection by electrophoresis of a DNA standard molecular weight sample using the disk-shaped optical recording medium and the sample analyzer of the present invention in Example 2.
FIG. 13 is a diagram showing the results of separating and detecting microbial gene amplification products by PCR using the disk-shaped optical recording medium and the sample analyzer of the present invention in Example 3.
FIG. 14 is a diagram showing the results of separation and detection of a DNA standard molecular weight sample using the disk-shaped optical recording medium and the sample analyzer of the present invention in Example 4.
[Explanation of symbols]
1, 2, 3,. Disc-shaped optical recording medium having microcapillaries
11. substrate
12. Center hole
13. Disk holder
14. Analysis area
15. Optical recording area
21, 24. Capillary for sample transfer
21a, 21b, 24a. Sample inlet
22, 25. Capillary for sample separation
23, 26. Microcapillary
27, 28. electrode
31. Recess
32. groove
33. Capillary cover
34. Top one side disk
41. Guide groove
42. Recording layer
43. Reflective layer
44. Protective film
51. Laser light source
52. Multi lens
53. Beam splitter
54. Collimator
55. Objective lens
56. Condenser lens
57. Photodetector
58. Amplifier circuit
59. Servo / signal processing LSI
60. Laser drive circuit
61. CCD camera

Claims (9)

ディスク状の基板と、この基板表面に形成された光記録領域と、分析領域とを有し、前記分析領域には、少なくとも一端に試料注入口を有するマイクロキャピラリーが形成されていることを特徴とするマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体。A disk-shaped substrate, an optical recording area formed on the surface of the substrate, and an analysis area, wherein the analysis area is formed with a microcapillary having a sample injection port at least at one end. Disc-shaped optical recording medium having a micro-capillary to be formed. 前記マイクロキャピラリーは、前記基板の中心に対して放射状に形成されており、前記試料注入口が前記基板の中心側の端部に形成されていて、前記基板を回転させたときの遠心力によって試料成分を分離するものである請求項1記載のマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体。The microcapillary is formed radially with respect to the center of the substrate, the sample injection port is formed at an end on the center side of the substrate, and the sample is injected by centrifugal force when the substrate is rotated. The disk-shaped optical recording medium having a microcapillary according to claim 1, which separates components. 前記マイクロキャピラリーは、その経路の少なくとも2箇所に電極が形成されており、前記電極間に電圧を印加して前記試料成分を電気泳動させることによって、前記試料成分を分離するものである請求項1又は2記載のマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体。2. The microcapillary has electrodes formed at least at two points in a path of the microcapillary, and separates the sample components by applying a voltage between the electrodes to cause electrophoresis of the sample components. Or a disk-shaped optical recording medium having the microcapillary according to 2. 前記マイクロキャピラリーは、試料移送用キャピラリーと、試料分離用キャピラリーとからなり、前記試料移送用キャピラリーは、少なくともその一端に試料注入口を有し、経路の途中で前記試料分離用キャピラリーと交差して連結するか、又は他端にて前記試料分離用キャピラリーに連続するように連結されている請求項1〜3のいずれか1つに記載のマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体。The microcapillary comprises a sample transfer capillary and a sample separation capillary, and the sample transfer capillary has a sample inlet at least at one end thereof, and intersects with the sample separation capillary in the middle of a path. The disk-shaped optical recording medium having a microcapillary according to any one of claims 1 to 3, which is connected to the sample separation capillary at the other end thereof. 前記試料分離用キャピラリーの両端には、緩衝液注入又は貯留用の穴が形成されている請求項4に記載のディスク状光記録媒体。5. The disk-shaped optical recording medium according to claim 4, wherein holes for buffer solution injection or storage are formed at both ends of the sample separation capillary. 前記マイクロキャピラリーは、前記基板表面に形成された溝と、この溝の開口部を塞ぐカバーとで構成されている請求項1〜5のいずれか1つに記載のマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体。The disk-shaped optical recording device having a microcapillary according to claim 1, wherein the microcapillary includes a groove formed on the surface of the substrate and a cover closing an opening of the groove. Medium. 前記光記録領域及び前記分析領域が、前記ディスク状の基板の同一面に形成されている、請求項1〜6のいずれか一つに記載のマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体。The disk-shaped optical recording medium having a microcapillary according to claim 1, wherein the optical recording region and the analysis region are formed on the same surface of the disk-shaped substrate. 前記光記録領域に形成される光記録層が追記型記録層である、請求項1〜7のいずれか一つに記載のマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体。The disk-shaped optical recording medium having a microcapillary according to claim 1, wherein the optical recording layer formed in the optical recording area is a write-once recording layer. 請求項1〜8のいずれか1つに記載のマイクロキャピラリーを有するディスク状光記録媒体と、このディスク状光記録媒体を支持して回転させるターンテーブルと、このディスク状光記録媒体にレーザ光を照射するレーザ光照射手段と、前記光記録媒体の前記光記録領域に照射されたレーザ光の反射光を受光するレーザ光受光手段と、前記光記録媒体の前記分析領域に照射されたレーザ光によって形成される画像を検出する画像検出手段とを備えていることを特徴とする試料分析装置。A disc-shaped optical recording medium having the microcapillary according to any one of claims 1 to 8, a turntable for supporting and rotating the disc-shaped optical recording medium, and applying a laser beam to the disc-shaped optical recording medium. A laser beam irradiating unit for irradiating, a laser beam receiving unit for receiving a reflected light of the laser beam radiated to the optical recording region of the optical recording medium, and A sample analyzer, comprising: image detection means for detecting an image to be formed.
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