【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高精度な基質の定量を可能にするバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
スクロース、グルコースなど糖類の定量分析法として、施光度計法、比色法、還元滴定法および各種クロマトグラフィーを用いた方法等が開発されている。しかし、これらの方法はいずれも糖類に対する特異性があまり高くないので精度が悪い。これらの方法のうち施光度計法によれば、操作は簡便ではあるが、操作時の温度の影響を大きく受ける。従って、施光度計法は、一般の人々が家庭などで簡易に糖類を定量する方法としては適切でない。
【０００３】
ところで、近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した種々のタイプのバイオセンサが開発されている。
以下に、試料液中の基質の定量法の一例としてグルコースの定量法について説明する。電気化学的なグルコースの定量法としては、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４：以下ＧＯＤと略す）と酸素電極または過酸化水素電極とを使用して行う方法が一般に知られている（例えば、鈴木周一編「バイオセンサー」講談社）。
ＧＯＤは、酸素を電子伝達体として、基質であるβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化する。酸素の存在下で、ＧＯＤによる酸化反応過程において、酸素が過酸化水素に還元される。酸素電極によって、この酸素の減少量を計測するか、または過酸化水素電極によって過酸化水素の増加量を計る。酸素の減少量および過酸化水素の増加量は、試料液中のグルコースの含有量に比例するので、酸素の減少量または過酸化水素の増加量からグルコースの定量が行われる。
【０００４】
上記方法では、その反応過程からも推測できるように、測定結果は試料液に含まれる酸素濃度の影響を大きく受ける欠点があり、試料液に酸素が存在しない場合は測定が不可能となる。
そこで、酸素を電子伝達体として用いず、フェリシアン化カリウム、あるいはフェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体を電子伝達体として用いる新しいタイプのグルコースセンサが開発されてきた。このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子伝達体の還元体を電極上で酸化することにより、その酸化電流量から試料液中に含まれるグルコース濃度が求められる。このような有機化合物や金属錯体を酸素の代わりに電子伝達体として用いることで、既知量のＧＯＤとそれらの電子伝達体を安定な状態で正確に電極上に担持させて試薬層を形成することが可能となる。この場合、試薬層を乾燥状態に近い状態で電極系と一体化させることもできるので、この技術に基づいた使い捨て型のグルコースセンサが近年多くの注目を集めている。その代表的な例が、特許第２５１７１５３号公報に示されるバイオセンサである。使い捨て型のグルコースセンサにおいては、測定器に着脱可能に接続されたセンサに試料液を導入するだけで容易にグルコース濃度を測定器で測定することができる。このような手法は、グルコースの定量だけに限らず、試料液中に含まれる他の基質の定量にも応用可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記の様な電気化学式グルコースセンサでは、電極系の簡略化によるコスト削減の観点から、作用極と対極から構成される二電極式での測定に基づくものが多い。この二電極式測定では、対極が参照極としての役割も兼ねることとなる。よって、作用極への電位印加の際に基準となる対極電位が、作用極での酸化還元反応に伴い変動し、それが測定結果に誤差を与える場合があった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために本発明のバイオセンサは、作用極、対極、および少なくとも酵素および電子伝達体を包含する試薬層を具備し、前記対極の実効電極面積が前記作用極の実効電極面積の１０２〜１０４倍の大きさであることを特徴とする。
前記対極は、電析により形成された金属を主成分とすることが好ましい。その金属は、貴金属類であることが好ましい。前記貴金属類は、白金、金、またはパラジウムであることが好ましい。
【０００７】
また、前記対極は、金属および前記金属以外の導電性物質を主成分とする複合体から、前記金属を除去することで作製されたものであることが好ましい。前記の導電性物質は、カーボンであることが好ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明によるバイオセンサは、前記のように、対極の実効電極面積が、作用極の実効電極面積の１０２〜１０４倍の大きさを有する。これにより、電極反応時における対極電位（基準電位）の変動が抑制され、二電極式測定においても、より正確な電位を作用極に印加することができる。例えば、作用極面積が１ｍｍ２、対極面積が５００ｍｍ２の電極系に１μＡの電流が流れたと仮定する。この時の両極の電流密度は、作用極で１μＡ／ｍｍ２、対極で０．００２μＡ／ｍｍ２であり、対極面積が作用極面積と同じである場合に比べて、その電流密度が１／５００であることがわかる。すなわち、作用極面積に対して対極面積を大きくすることで、単位対極面積あたりでの電極反応量を大幅に抑制することができる。これによって、対極電位を支配する、対極界面における濃度比（酸化体）／（還元体）の変化を、より小さくすることができる。
【０００９】
このように、作用極への電位印加の際の基準となる対極電位の変動を、電極反応時であっても抑制することができるので、本発明に基づくバイオセンサを用いることで、二電極式であっても、より高精度な基質の定量が可能となる。
【００１０】
対極の材料としては、電析により微細構造を形成するような金属が適しており、白金、金、あるいはパラジウム等の貴金属類が好適である。また対極を、金属およびこの金属以外の導電性物質を主成分とする複合体から、前記金属を除去することにより作製してもよい。導電性物質としては、カーボン等が好適である。
【００１１】
試薬層に含有される酸化還元酵素は、試料液に含まれる基質によって適宜選択することができる。酸化還元酵素としては、例えば、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等を用いることができる。
電子伝達体としては、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセン誘導体等が挙げられる。また、酸素を電子伝達体とした場合にも電流応答が得られる。電子伝達体は、これらの一種または二種以上を使用することができる。
試薬層を作用極に固定化することによって、酵素あるいは電子伝達体を不溶化させてもよい。固定化する場合は、架橋固定法あるいは吸着法が好ましい。また、電極材料中に混合させてもよい。
【００１２】
作用極の材料としては、電子伝達体を酸化する際にそれ自身が酸化されない導電性物質であれば使用できる。また、電極系の作製法としては、スクリーン印刷法、スパッタリング法、蒸着法等が好適である。
【００１３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明する。
《実施例１》
バイオセンサの一例として、グルコースセンサについて説明する。グルコースセンサに用いた電極系として、図１に示すものを使用した。図１は、グルコースセンサの平面図である。
上記グルコースセンサを、以下のようにして作製した。
ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板１上に、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷し、リード２および３をそれぞれ形成した。次に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを基板１上に印刷して作用極４を形成した。作用極４は上記リード２と接触している。
【００１４】
次に、その基板１上に、絶縁性ペーストを印刷して絶縁層５を形成した。絶縁層５は、上記作用極４の外周部を覆っており、これによって作用極４の露出部分の面積は一定に保たれる。絶縁層５は、リード２および３の一部を覆っている。次に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストをリード３と接触するように基板１上に印刷して、電析により対極を作製するための、下地電極６を形成した。
【００１５】
次に、下地電極６上に白金を電析させた。３重量％の塩化白金酸および０．０３重量％の酢酸鉛を含む水溶液を電解浴とした。基板１の下地電極６側の部分を白金電極とともに前記の電解浴に浸漬し、下地電極６を陰極、白金電極を陽極として電解した。この際、下地電極６の電位は０Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌとした。この操作により下地電極６上に白金微粒子（白金黒）が電析された。前記の白金微粒子を電析させて得た対極６ａの実効電極面積は、下地電極６の約２０００倍になった。白金電析のための印加電位は上の例に限定されず、−０．１５Ｖ〜０．４Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ程度であればよい。
【００１６】
次に、作用極４および対極６ａからなる電極系上に、カルボキシメチルセルロース（以下ＣＭＣと略称する）の水溶液を滴下し、乾燥させることでＣＭＣ層を形成した。更に、前記ＣＭＣ層上に、酵素ＧＯＤおよび電子受容体フェリシアン化カリウムを含有する水溶液を滴下し、乾燥させることで試薬層を形成した。こうしてグルコースセンサを作製した。
【００１７】
このグルコースセンサを測定器に装着し、センサの試薬層上に、グルコース濃度定量に十分な量のグルコース水溶液（３６０ｍｇ／ｄｌ）を滴下した。所定時間経過後、対極６ａを基準にして作用極４に＋５００ｍＶを印加し、５秒後の電流値を測定した。液中のフェリシアン化イオン、グルコース、およびＧＯＤが反応し、グルコースがグルコノラクトンに酸化され、フェリシアン化イオンがフェロシアン化イオンに還元される。このフェロシアン化イオンを酸化することで応答電流が得られる。この応答電流値は、試料液中のグルコース濃度に依存する。
【００１８】
応答電流の測定と共に、対極６ａの電極電位を同時に測定した。電圧印加直前の電極電位は約２５０ｍＶｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌであり、５００ｍＶの電圧印加直後においても、その電極電位の変化は殆ど見られなかった。一方、白金黒を電析していない下地電極６を対極として同様の測定を行った場合、電圧印加直前の電極電位はほぼ同等の約２５０ｍＶｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌであったにもかかわらず、５００ｍＶの電圧印加直後には０ｍＶｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ程度まで減少した。
【００１９】
この結果から、白金黒を電析して対極面積を顕著に大きくすることで、対極電位の変動が抑制されることがわかる。また、白金黒を電析することで、電析しない場合に比較して、応答電流のばらつきが抑制された。白金黒の代わりに、金黒やパラジウム黒を電析した対極６ａを用いた場合においても、上記と同様の効果が得られた。
【００２０】
《実施例２》
樹脂バインダー、導電性銅粉およびカーボン粉からなるペーストを用いて下地電極６を形成した他は、実施例１と同様にして電極系を作製した。
次に、上記下地電極６から電解酸化により銅を除去した。すなわち、一般的な電解液として０．２ＭのＮａＣｌ水溶液中で、下地電極６を陽極、別途用意した白金電極を陰極として電解した。この際、下地電極６の電位は０．２Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌとした。この操作により下地電極６中に含有される銅が電解酸化により溶出した。こうして得られた対極６ａは、銅の溶出により、多数の微細空隙を有するカーボンのマトリックスで形成され、これが大面積を有する対極６ａとして機能する。
【００２１】
このようにした作製した電極系（作用極４および対極６ａ）上に、実施例１と同様に試薬層を形成することで、グルコースセンサを作製した。
実施例１と同様の測定を行った結果、上記のような手法に基づいて対極６ａを形成することで、対極電位の変動を抑制すると同時に、応答電流のばらつきも抑制することが明らかになった。
【００２２】
上記の実施例では、応答電流を得るための電極系への印加電圧を５００ｍＶとしたが、これに限定されることはない。電気的信号の変化が観察される電圧、更に電子伝達体が酸化される電圧であればよい。
また、実施例では、電極系、リード／端子の一例を示したが、それらの形状、配置等はこれらに限定されるものではない。また、カバー／スペーサ部材等を組み合わせ、電極系上に試料供給路を形成したセンサを用いることもできる。
【００２３】
【発明の効果】
以上のように本発明は、より高精度な基質の定量を可能にするバイオセンサを提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例に用いたバイオセンサの平面図である。
【符号の説明】
１ 絶縁性の基板
２、３ リ−ド
４ 作用極
５ 絶縁層
６ 下地電極
６ａ 対極[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a biosensor that enables highly accurate quantification of a substrate.
[0002]
[Prior art]
As a quantitative analysis method for saccharides such as sucrose and glucose, a photometer method, a colorimetric method, a reductive titration method, a method using various types of chromatography, and the like have been developed. However, none of these methods has a very high specificity for saccharides, so that the accuracy is low. According to the photometer method among these methods, the operation is simple, but is greatly affected by the temperature during the operation. Therefore, the photometer method is not suitable as a method for ordinary people to easily determine saccharides at home or the like.
[0003]
In recent years, various types of biosensors utilizing specific catalytic action of enzymes have been developed.
Hereinafter, a method for quantifying glucose will be described as an example of a method for quantifying a substrate in a sample solution. As a method for electrochemically quantifying glucose, a method using glucose oxidase (EC 1.1.3.4; hereinafter abbreviated as GOD) and an oxygen electrode or a hydrogen peroxide electrode is generally known (for example, , Shuichi Suzuki, "Biosensor" Kodansha).
GOD selectively oxidizes substrate β-D-glucose to D-glucono-δ-lactone using oxygen as an electron carrier. In the presence of oxygen, oxygen is reduced to hydrogen peroxide during the oxidation reaction process by GOD. The oxygen electrode measures the decrease in oxygen, or the hydrogen peroxide electrode measures the increase in hydrogen peroxide. Since the amount of decrease in oxygen and the amount of increase in hydrogen peroxide are proportional to the content of glucose in the sample solution, glucose is quantified from the amount of decrease in oxygen or the amount of increase in hydrogen peroxide.
[0004]
The above method has a drawback that the measurement result is greatly affected by the concentration of oxygen contained in the sample solution, as can be inferred from the reaction process. If oxygen is not present in the sample solution, the measurement becomes impossible.
Therefore, a new type of glucose sensor using an organic compound such as potassium ferricyanide or a ferrocene derivative or a quinone derivative or a metal complex as an electron carrier without using oxygen as an electron carrier has been developed. In this type of sensor, the concentration of glucose contained in the sample solution is determined from the amount of oxidation current by oxidizing the reduced form of the electron carrier generated as a result of the enzyme reaction on the electrode. By using such an organic compound or metal complex as an electron carrier instead of oxygen, it is possible to form a reagent layer by accurately supporting a known amount of GOD and the electron carrier in a stable state on an electrode. Becomes possible. In this case, since the reagent layer can be integrated with the electrode system in a state close to a dry state, a disposable glucose sensor based on this technology has been receiving much attention in recent years. A typical example is a biosensor disclosed in Japanese Patent No. 2517153. In a disposable glucose sensor, the glucose concentration can be easily measured by the measuring device simply by introducing the sample liquid into the sensor detachably connected to the measuring device. Such a technique is applicable not only to the determination of glucose but also to the determination of other substrates contained in a sample solution.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Many electrochemical glucose sensors as described above are based on two-electrode measurement composed of a working electrode and a counter electrode from the viewpoint of cost reduction by simplifying the electrode system. In this two-electrode measurement, the counter electrode also serves as a reference electrode. Therefore, the counter electrode potential, which is a reference when applying a potential to the working electrode, fluctuates with the oxidation-reduction reaction at the working electrode, which may give an error to the measurement result.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the biosensor of the present invention includes a working electrode, a counter electrode, and a reagent layer containing at least an enzyme and an electron carrier, and the effective electrode area of the counter electrode is the effective electrode area of the working electrode. Characterized in that the size is 10 2 to 10 4 times as large as
It is preferable that the counter electrode mainly contains a metal formed by electrodeposition. The metal is preferably a noble metal. Preferably, the noble metals are platinum, gold, or palladium.
[0007]
Preferably, the counter electrode is formed by removing the metal from a composite mainly composed of a metal and a conductive substance other than the metal. Preferably, the conductive material is carbon.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Biosensor according to the present invention, as described above, the effective electrode area of the counter electrode has a 10 2 to 10 4 times the size of the effective electrode area of the working electrode. Thereby, the fluctuation of the counter electrode potential (reference potential) during the electrode reaction is suppressed, and a more accurate potential can be applied to the working electrode even in the two-electrode measurement. For example, assume that a current of 1 μA flows through an electrode system having a working electrode area of 1 mm 2 and a counter electrode area of 500 mm 2 . Current density bipolar At this time, 1 .mu.A / mm 2 at the working electrode, a 0.002μA / mm 2 in the counter electrode, as compared with the case the counter electrode area is the same as the working electrode area, the current density is 1/500 It can be seen that it is. That is, by increasing the counter electrode area with respect to the working electrode area, the amount of electrode reaction per unit counter electrode area can be significantly suppressed. As a result, the change in the concentration ratio (oxidant) / (reductant) at the counter electrode interface, which governs the counter electrode potential, can be further reduced.
[0009]
As described above, since the fluctuation of the counter electrode potential, which is the reference when applying the potential to the working electrode, can be suppressed even during the electrode reaction, by using the biosensor based on the present invention, the two-electrode type Even in this case, it is possible to quantify the substrate with higher accuracy.
[0010]
As a material for the counter electrode, a metal that forms a fine structure by electrodeposition is suitable, and noble metals such as platinum, gold, and palladium are suitable. Further, the counter electrode may be manufactured by removing the metal from a composite mainly composed of a metal and a conductive substance other than the metal. As the conductive substance, carbon or the like is preferable.
[0011]
The oxidoreductase contained in the reagent layer can be appropriately selected depending on the substrate contained in the sample solution. As the oxidoreductase, for example, fructose dehydrogenase, glucose oxidase, alcohol oxidase, lactate oxidase, cholesterol oxidase, xanthine oxidase, amino acid oxidase and the like can be used.
Examples of the electron carrier include potassium ferricyanide, p-benzoquinone, phenazine methosulfate, methylene blue, and a ferrocene derivative. Also, a current response can be obtained when oxygen is used as the electron carrier. One or more of these electron carriers can be used.
The enzyme or the electron carrier may be insolubilized by immobilizing the reagent layer on the working electrode. In the case of immobilization, a cross-linking immobilization method or an adsorption method is preferred. Further, it may be mixed in the electrode material.
[0012]
As a material for the working electrode, any conductive substance that does not oxidize itself when oxidizing the electron carrier can be used. As a method for forming the electrode system, a screen printing method, a sputtering method, an evaporation method, or the like is preferable.
[0013]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples.
<< Example 1 >>
A glucose sensor will be described as an example of a biosensor. The electrode system shown in FIG. 1 was used as the electrode system used for the glucose sensor. FIG. 1 is a plan view of the glucose sensor.
The glucose sensor was manufactured as follows.
Silver paste was printed on the insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate by screen printing to form leads 2 and 3, respectively. Next, the working electrode 4 was formed by printing a conductive carbon paste containing a resin binder on the substrate 1. The working electrode 4 is in contact with the lead 2.
[0014]
Next, an insulating paste was printed on the substrate 1 to form an insulating layer 5. The insulating layer 5 covers the outer peripheral portion of the working electrode 4 so that the area of the exposed portion of the working electrode 4 is kept constant. The insulating layer 5 covers a part of the leads 2 and 3. Next, a conductive carbon paste containing a resin binder was printed on the substrate 1 so as to be in contact with the leads 3, and a base electrode 6 for forming a counter electrode by electrodeposition was formed.
[0015]
Next, platinum was deposited on the base electrode 6. An aqueous solution containing 3% by weight of chloroplatinic acid and 0.03% by weight of lead acetate was used as an electrolytic bath. The portion of the substrate 1 on the side of the base electrode 6 was immersed in the electrolytic bath together with the platinum electrode, and electrolysis was performed using the base electrode 6 as a cathode and the platinum electrode as an anode. At this time, the potential of the base electrode 6 is 0 V vs. Ag / AgCl. By this operation, platinum fine particles (platinum black) were electrodeposited on the base electrode 6. The effective electrode area of the counter electrode 6a obtained by electrodepositing the platinum fine particles was about 2000 times that of the base electrode 6. The applied potential for the platinum electrodeposition is not limited to the above example, and may be -0.15V to 0.4Vvs. It may be about Ag / AgCl.
[0016]
Next, an aqueous solution of carboxymethylcellulose (hereinafter abbreviated as CMC) was dropped on an electrode system composed of the working electrode 4 and the counter electrode 6a, and dried to form a CMC layer. Further, an aqueous solution containing the enzyme GOD and the electron acceptor potassium ferricyanide was dropped on the CMC layer, and dried to form a reagent layer. Thus, a glucose sensor was manufactured.
[0017]
The glucose sensor was mounted on a measuring instrument, and a sufficient amount of an aqueous glucose solution (360 mg / dl) for quantifying glucose concentration was dropped on the reagent layer of the sensor. After a lapse of a predetermined time, +500 mV was applied to the working electrode 4 with reference to the counter electrode 6a, and a current value after 5 seconds was measured. The ferricyanide ion, glucose, and GOD in the liquid react, glucose is oxidized to gluconolactone, and the ferricyanide ion is reduced to ferrocyanide ion. A response current can be obtained by oxidizing the ferrocyanide ion. This response current value depends on the glucose concentration in the sample solution.
[0018]
The electrode potential of the counter electrode 6a was measured simultaneously with the measurement of the response current. The electrode potential immediately before the voltage is applied is about 250 mV vs. 250 mV. Ag / AgCl, and almost no change in the electrode potential was observed immediately after the application of a voltage of 500 mV. On the other hand, when the same measurement was performed using the base electrode 6 on which platinum black was not electrodeposited as a counter electrode, the electrode potential immediately before the application of the voltage was approximately equal to about 250 mVvs. Despite being Ag / AgCl, immediately after application of a voltage of 500 mV, 0 mV vs. It decreased to about Ag / AgCl.
[0019]
From this result, it can be seen that by depositing platinum black to significantly increase the counter electrode area, the fluctuation of the counter electrode potential is suppressed. Further, by depositing platinum black, variation in response current was suppressed as compared with the case where electrodeposition was not performed. The same effect as described above was obtained when the counter electrode 6a on which gold black or palladium black was electrodeposited was used instead of platinum black.
[0020]
<< Example 2 >>
An electrode system was produced in the same manner as in Example 1, except that the base electrode 6 was formed using a paste composed of a resin binder, conductive copper powder and carbon powder.
Next, copper was removed from the base electrode 6 by electrolytic oxidation. That is, in a 0.2 M NaCl aqueous solution as a general electrolytic solution, electrolysis was performed using the base electrode 6 as an anode and a separately prepared platinum electrode as a cathode. At this time, the potential of the base electrode 6 is set to 0.2 Vvs. Ag / AgCl. By this operation, copper contained in base electrode 6 was eluted by electrolytic oxidation. The counter electrode 6a thus obtained is formed of a carbon matrix having a large number of fine voids due to the elution of copper, and functions as the counter electrode 6a having a large area.
[0021]
A glucose sensor was manufactured by forming a reagent layer on the electrode system (working electrode 4 and counter electrode 6a) thus manufactured in the same manner as in Example 1.
As a result of performing the same measurement as in Example 1, it was found that by forming the counter electrode 6a based on the above-described method, the fluctuation of the counter electrode potential was suppressed and the variation of the response current was also suppressed. .
[0022]
In the above embodiment, the voltage applied to the electrode system for obtaining the response current is set to 500 mV, but the present invention is not limited to this. Any voltage may be used as long as the voltage at which a change in the electric signal is observed and further the voltage at which the electron carrier is oxidized.
Further, in the embodiment, an example of the electrode system and the lead / terminal has been described, but their shape, arrangement, and the like are not limited thereto. Further, a sensor in which a sample supply path is formed on an electrode system by combining a cover / spacer member and the like can be used.
[0023]
【The invention's effect】
As described above, the present invention provides a biosensor that enables more accurate quantification of a substrate.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a plan view of a biosensor used in one embodiment of the present invention.
[Explanation of symbols]
REFERENCE SIGNS LIST 1 insulating substrate 2, 3 lead 4 working electrode 5 insulating layer 6 base electrode 6 a counter electrode
