【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターフェロンβ複合体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
過去に、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーを結合した生体分子が臨床的に有用な特性を持っていることが示されている（Ｉｎａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏａｃｔａｎｄ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ５， ３４３ （１９９０）， Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９， ２４９ （１９９２） ； Ｋａｔｒｅ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０， ９１ （１９９３）参照）。その中には、より優れた物理的及び熱安定性、酵素分解の受けにくさに対する保護、溶解度の増加、インビボの循環半減期の延長、クリアランス値の減少、及び増強された効力が示されている。
【０００３】
天然型あるいは天然型と同一の一次構造を持つインターフェロンβに水溶性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合するのに各種の方法が用いられ得る。一般的には、スクシンイミドエステル反応ＰＥＧ化試薬によりタンパク質のアミノ基に、マレイミド反応やピリジルジスルフィド反応ＰＥＧ化試薬によりタンパク質のチオール基に結合する方法などが用いられる。これらの試薬は反応溶液のｐＨが他の多くの蛋白質にとって安定な中性条件で高効率に結合反応が進行するために好都合である。
【０００４】
しかしながら、インターフェロンβにおいては中性溶液条件下では凝集等が原因で失活することが知られており、殊に糖鎖を欠いた組み換え型タンパクにおいては顕著である。この特殊性から、他の多くのタンパク質とは異なり、インターフェロンβを一般的なアミノ基およびチオール基結合ＰＥＧ化試薬を用いて高効率かつ活性を維持してＰＥＧと結合させることは困難であった。例えば、Ｋａｔｒｅらは米国特許４，７６６，１０６および米国特許４，９１７，８８８において、大過剰のメトキシ−ポリエチレングリコールＮ−サクシニミジルグルタレートおよびメトキシ−ポリエチレングリコールＮ−サクシニミジルスクシネートによるインターフェロンβのＰＥＧ化を記載している。この実験において使用されたインターフェロンβは市販製品Ｂｅｔａｓｅｒｏｎであり、微生物宿主細胞中で生産されたことによるグリコシレーションの不在はその水溶液中での溶解性を低下させた。ポリエチレングリコール結合反応を高ｐＨで行った結果得られた複合体に関しては溶解性をもたらしたが、主要な問題は活性および収量のレベルの低下であった。また、エル・タイヤー，ナビルらはＷＯ９９／５５３７７において、モノメトキシーポリエチレングリコール−ＯＰＳＳ（オルトピリジルジスルフィド誘導体）によるインターフェロンβのＣｙｓ１７を介したＰＥＧ化について記載している。しかし、この結合反応もインターフェロンβが安定な酸性ｐＨで実施されており、インターフェロンβ複合体の収率は５０％を超えることはない。
【０００５】
１９９７年１月２８日に公開された日本国特許第３１７７４４９号「水溶性ポリマーで修飾したコンセンサスインターフェロン」には還元的アルキル化方法を用いてコンセンサスインターフェロンのＮ末端に選択的にポリエチレングリコールを結合させる方法について述べられている。アミノ基１つ以上を有するタンパク部分を水溶性ポリマー部分と還元的アルキル化条件下、上記タンパク部分のアミノ末端でαアミノ基を選択的に活性化させるのに適するｐＨで反応させることにより、水溶性ポリマーをαアミノ酸に選択的に結合するという原理によるが、この方法によりインターフェロンβのＰＥＧ化を実施すると、モノＰＥＧ 化は実際には起こらず、いずれかのリシン残基またはＮ末端に非選択的に結合し、そのため不均一な混合物が生成し、さらに同混合物は、十分な抗ウイルス活性および細胞増殖抑制活性を持たなかった。すなわちリシン残基またはＮ末端のアミノ基などのアミノ基を用いたモノＰＥＧ 化をインターフェロンβに対して行うことはできず、また生物活性を維持したＰＥＧ化インターフェロンβを得ることもできない。
【０００６】
このようなアミノ基を用いる方法とは別に、タンパク質のシステイン残基に水溶性ポリマーを結合させる手段がある。ＰＣＴ出願ＷＯ９９／５５３７７にはｍＰＥＧ−ＯＰＳＳを用いてインターフェロンβのＣｙｓ１７を介したモノＰＥＧ化について記載されている。インターフェロンβは５つのシステイン残基を持ち、そのうちＣｙｓ１７以外の４つは分子内でジスルフィド結合しているため、原理的には上の方法でモノＰＥＧ化が可能であるが、上述したように同方法によるとＰＥＧ化効率が著しく低く実用的ではない。低効率の原因は反応溶液のｐＨに止まらず、結合させようとするポリマーの分子量が高くなると、標的とするＣｙｓ１７に立体的に接近し得ないことにも問題があると考えられる。インビボの循環半減期の延長、クリアランス値の減少などの効果を明確に得るためには結合するＰＥＧの分子量が限定される。腎臓のクリアランスを免れるためにはＰＥＧ化インターフェロンβの分子量は６０ｋＤａ以上であることが望ましいが、上の方法によると、実施例に示された通り５ｋＤａ程度のＰＥＧを結合できるにすぎず、ＰＥＧ化インターフェロンβの分子量は６０ｋＤａに達することがない。同出願においては、より大きなＰＥＧ部分の結合のために、ステップワイズによるＰＥＧ化という煩雑な方法を提示している。さらに、ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳを用いたＰＥＧ化はＰＥＧとインターフェロンβとの結合部分であるジスルフィド結合が生体内で著しく不安定であり、ＰＥＧ化による恩恵を受けることができない。
【０００７】
このようにインターフェロンβの物性が障壁となって、産業化に必要となる高効率で活性を維持したインターフェロンβ複合体を製造することはできなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、インターフェロンβの生物活性を損なうことなく、インターフェロンβと水溶性ポリマーとを結合することができる、インターフェロンβ複合体の簡便かつ高効率な製造方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、特定の糖類等を反応溶液に添加することによりアミノ基あるいはチオール基反応性の水溶性ポリマーを中性で高効率かつインターフェロン活性を低下させることなくインターフェロンβに結合させることができることを見い出し本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、インターフェロン活性低下抑制剤の存在下、ｐＨ６．５ないし８．５において、インターフェロンβと水溶性ポリマーとを結合させることを含む、インターフェロンβ複合体の製造方法を提供する。また、本発明は、インターフェロンβのアミノ基の一部を化学修飾により保護した状態で水溶性ポリマーをインターフェロンβのアミノ基に結合させることを含む、インターフェロンβ複合体の製造方法を提供する。さらに、本発明は、インターフェロンβの中和抗体又はその抗原結合性断片とインターフェロンβとを結合させた状態で、水溶性ポリマーとインターフェロンβを結合させることを含むインターフェロンβ複合体の製造方法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の方法では、インターフェロン活性低下抑制剤の存在下、ｐＨ６．５ないし８．５において、インターフェロンβと水溶性ポリマーとを結合させる。
【００１２】
ここで、インターフェロン活性低下抑制剤とは、これを添加することにより、インターフェロンβをｐＨ６．５〜８．５の環境に置くことに起因するインターフェロンβの抗ウイルス活性の低下が、非添加の場合に比較して抑制される物質を意味する。なお、インターフェロンβの抗ウイルス活性は、下記実施例に記載するような公知の方法（例えば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ３７，７５５（１９８１）； Ｂｏｒｄｅｎ ｅｔ． Ａｌ．， Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４２， ４９４８ （１９８２）等）により容易に測定することができる。インターフェロン活性低下抑制剤の例として、糖類、とりわけ、糖単位の数が５以下の少糖類及び単糖類並びにこれらの糖アルコール、炭素数２〜６の多価アルコール等を挙げることができる。これらのうち、グルコース、マンニトール、ソルビトール、シュクロース又はトレハロースのような、二糖類及び単糖類並びにこれらの糖アルコール並びにエチレングリコールやグリセロールのような、炭素数２又は３の多価アルコールが好ましく、特に二糖類及び単糖類並びにこれらの糖アルコールが好ましい。これらのインターフェロン活性低下抑制剤は、単独でも２種以上組み合わせても用いることができる。
【００１３】
水溶性ポリマーは、人体に無害で、インターフェロンβの生理活性を利用する目的で生体にインターフェロンβと該水溶性ポリマーとの複合体を投与した際に、該複合体が血液に溶解するのに必要なレベルの水溶性を有するものである。上述のように、生理活性物質に水溶性ポリマーを結合することにより、生体内での該生理活性物質の物理的及び熱安定性、酵素分解の受けにくさに対する保護、溶解度の増加、インビボの循環半減期の延長、クリアランス値の減少を図ることが従来から行われているが、本発明においても、このような目的で従来から使用されている水溶性ポリマーを好ましく用いることができる。このような水溶性ポリマーの好ましい例として、ポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコールを挙げることができる。
【００１４】
インターフェロンβ中のチオール基に水溶性ポリマーを結合する場合には、末端にオルトピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、マレイミド又はヨードアセトアミド構造のようなチオール基反応性の構造を有するもの、好ましくはマレイミド構造を有する水溶性ポリマーを用いることができる。また、インターフェロンβ中のアミノ基に水溶性ポリマーを結合する場合には、末端にヒドロキシスクシンイミドエステル又はニトロベンゼンスルホネートエステル構造のような、アミノ基反応性の構造を有する水溶性ポリマーを用いることができる。末端にこれらの構造を有する水溶性ポリマーは、従来よりアミノ基やチオール基との結合のために広く用いられており、この分野において周知であり、周知の合成方法により容易に製造することもできるし、このような末端活性化ＰＥＧは、市販されてもいる。本発明では、このような市販品も好ましく用いることができる。
【００１５】
水溶性ポリマーの平均分子量は、特に限定されないが、生体内でのインターフェロンβの物理的及び熱安定性、酵素分解の受けにくさに対する保護、溶解度の増加、インビボの循環半減期の延長、クリアランス値の減少を図る観点から、平均分子量は約４４００〜８００００ダルトンが好ましく、さらに好ましくは、約２００００〜６００００ダルトンである。
【００１６】
本発明の方法に供されるインターフェロンβは、天然タンパク質、天然タンパク質の糖鎖を天然のものから改変したもの、もしくは組換えタンパク質、組み替えタンパク質で天然タンパク質と異なる糖鎖を有するもしくは糖鎖を有しないものを挙げることができ、組織、タンパク質合成、天然細胞又は組換え細胞のような、いかなる通常のソースからも得られる。特にインターフェロンβのチオール基への水溶性ポリマーの結合には天然型インターフェロンβの糖鎖より分子量の小さい糖鎖をもつインターフェロンβが好ましく、糖鎖を持たないインターフェロンβを用いることが更に好ましい。このような糖鎖の異なるインターフェロンβは天然型のインターフェロンβに糖転移酵素、糖分解酵素など各種の酵素を作用させることによって得られ、また、天然タンパク質と異なる糖鎖を有するもしくは糖鎖を有しないインターフェロンβは、各種組換え細胞における通常の方法での生産もしくは糖転移酵素、糖分解酵素を強制発現する組換え細胞における生産によって得られる。遺伝子工学的に生産された、糖鎖を持たないインターフェロンβは市販されており、本発明の方法では、このような市販のインターフェロンβも好ましく用いることができる。
【００１７】
また、一般に、生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を構成するアミノ酸のうち、少数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、又は少数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されてもその生理活性が維持される場合があることは当業者に広く知られている。インターフェロンβ（アミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す）のアミノ酸配列と相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ、インターフェロンβ活性を有するタンパク質、さらに好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１個ないし数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、又は１個ないし数個のアミノ酸が挿入され、付加されたタンパク質であってインターフェロンβ活性を有するタンパク質も、本発明において、「インターフェロンβ」として用いることができる。もっとも、天然のインターフェロンβと同じアミノ酸配列を有するインターフェロンβが最も好ましい。
【００１８】
インターフェロンβと水溶性ポリマーとの結合反応は、ｐＨ６．５ないし８．５、好ましくはｐＨ７．５〜８．５において、上記インターフェロン活性低下抑制剤の存在下、水系媒体中、好ましくは緩衝液中で、インターフェロンβと水溶性ポリマーとを反応させることにより容易に行うことができる。インターフェロン活性低下抑制剤の濃度は、特に限定されず、反応混合物全体の重量に対し、約１〜９０％が好ましく（複数種類のインターフェロン活性低下抑制剤を用いる場合には合計量、以下同じ）、さらに好ましくは約１〜５０％、さらに好ましくは約１０〜３０％程度である。インターフェロンβと水溶性ポリマーとの混合比率（インターフェロンβ：水溶性ポリマー）は、特に限定されないが、通常、モル比で、約１：１〜１：１００程度であり、特に、マレイミド活性化水溶性ポリマーでは約１：３ないし１：２０が好ましく、スクシンイミジルエステル活性化水溶性ポリマーでは約１：４ないし１：７０が好ましい。反応温度は通常４〜４０℃、好ましくは４〜２５℃である。反応時間は、反応温度等に応じて適宜選択できるが、通常、約１時間〜２４時間程度が適当である。結合反応後、例えばイオン交換、ゲル濾過、疎水又は親和性担体を用いたクロマトグラム等の周知の方法により、未反応のインターフェロンβや水溶性ポリマーを除去して所望のインターフェロンβと水溶性ポリマーとの複合体を精製することができる。
【００１９】
上記した本発明の方法の好ましい１つの態様では、インターフェロンβのアミノ基の一部を、アミノ基反応性低分子化合物と反応させて化学修飾することにより保護した後、水溶性ポリマーをインターフェロンβのアミノ基に結合させる。ここで、アミノ基反応性低分子化合物としては、水溶性ポリマー結合後に脱保護反応が可能なものが望ましく、ＤＭＭＡ（ジメチルマレイン酸無水物、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ２９０，３６８−３７２，１９９９）等のアルキルマレイン酸無水物や、Ｂｏｃ（ｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。アミノ基反応性低分子化合物の分子量は、特に限定されないが、１００〜５００程度が好ましい。このようなアミノ基反応性低分子化合物は、インターフェロンβに対してモル比で好ましくは約２倍〜１００倍、さらに好ましくは約５倍〜５０倍添加することが好ましい。このアミノ基の保護反応の反応温度は、特に限定されないが、０ｏＣ〜２５ｏＣ程度が適当であり、また、反応時間は、反応温度等に応じて適宜選択できるが、通常、約１０分間〜２時間程度が適当である。反応溶媒や、反応混合物中のインターフェロンβの濃度の好ましい範囲等の条件は、水溶性ポリマーとの結合反応における好ましい条件と同様でよい。下記実施例において具体的に示されるように、このようなアミノ基反応性低分子化合物をインターフェロンβと反応させた後、前記のようにインターフェロンβを水溶性ポリマーと結合させることにより、アミノ基を保護しない場合に比べて、インターフェロンβの生理活性が高くなる。これは、アミノ基反応性低分子化合物自体は、どのアミノ基と反応するかを選択することはできないものの、反応性の高いアミノ基がインターフェロンβの活性部位に存在するので、アミノ基の一部を保護すれば、それによって活性部位のアミノ基が保護される確率が高く、水溶性ポリマーは、インターフェロンβの活性部位以外に位置するアミノ基に結合する確率が高くなるので、インターフェロンβの活性低下が抑制されるものと考えられる。水溶性ポリマーを結合した後、保護したアミノ基を脱保護することが好ましく、脱保護反応は、用いるアミノ基反応性低分子化合物に応じた公知の方法により行うことができる。例えば、アミノ基反応性低分子化合物としてＤＭＭＡを用いる場合には、酢酸等の酸によりｐＨを５．０にすることにより容易に行うことができる。
【００２０】
なお、このようにアミノ基の一部を化学修飾した状態で水溶性ポリマーを結合することにより、アミノ基を保護しない場合に比べて、インターフェロンβの生理活性が高くなるという知見は、本願発明により初めて見出された知見であり、この方法を用いる場合は、インターフェロン活性低下抑制剤を用いるか否かに関わらず、本発明の範囲に含まれる。もっとも、インターフェロン活性低下抑制剤を用いる上記本発明の一態様として、アミノ基の一部を化学修飾した状態で水溶性ポリマーを結合する方法を採用することが好ましい。
【００２１】
本発明のもう１つの好ましい態様では、インターフェロンβの中和抗体とインターフェロンβとを反応させて結合した後、水溶性ポリマーをインターフェロンβに結合させる。このようにすると、インターフェロンβの活性中心は中和抗体により保護された状態で水溶性ポリマーが結合されるので、水溶性ポリマーを結合することに起因するインターフェロンβの活性低下を抑制することができる。中和抗体に代えて、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂなどの抗原結合性断片を好ましく用いることもできる。抗体としては、モノクローナル抗体が好ましい。インターフェロンβの中和モノクローナル抗体は公知であり、このような公知のモノクローナル抗体を用いることもできるし、また、周知の方法により中和抗体を作製することもできる。すなわち、モノクローナル抗体を作製する常法であるケーラーとミルシュタインの方法によりモノクローナル抗体を種々作製し、インターフェロンβと反応させて抗原抗体複合物を形成し、この抗原抗体複合物の抗ウイルス活性を調べ、抗ウイルス活性が消失するものをスクリーニングすることにより作製することができる。インターフェロンβと抗体又はその抗原結合性断片との反応は、通常の免疫反応の条件で反応させることができ、４ｏＣ〜３７ｏＣで反応を行うことができる。反応時間は、反応温度等により適宜選択されるが、４ｏＣの場合には一夜、２５ｏＣの場合には３０分間〜２時間程度が適当である。免疫反応後、酸処理（例えば塩酸や硫酸のような無機酸）のような周知の処理によりインターフェロンβと抗体又はその断片とを解離させることにより、所望のインターフェロンβと水溶性ポリマーとの複合体が得られる。
【００２２】
上記免疫反応は、上記抗体又はその抗原結合性断片を担体、好ましくはタンパク質を固相化できる高分子、例えばＮＨＳやＢｒＣＮ活性化アガロースやセファロース（商品名）に固相化した担体を用いることで、インターフェロンβを結合後、水溶性ポリマーと反応を行い、その後に固相化担体を適当な溶液、例えば水溶性ポリマーを含まない反応液などの、抗体とインターフェロンβの結合を解離する作用をもたない緩衝液で洗浄することにより容易に未反応の水溶性ポリマーから分離精製することに用いることが可能である。また、未反応の水溶性ポリマーを除いた後の固相化抗体からのインターフェロンβ複合体の溶出は低イオン強度の酸、例えば１０ｍＭ塩酸などを用いることが出来、溶出後に次の精製工程に適した溶液組成になるように添加物を加えることも容易である。また、上記のような担体を用いることにより、水溶性ポリマーとの結合反応後の、不要となった抗体又はその断片の除去が容易になるばかりでなく、インターフェロンβと水溶性ポリマーとの反応後の不要物の除去精製工程を同一担体で連続して行うことも可能になる。反応液中の未反応の水溶性ポリマーや塩は、目的のインターフェロンβ複合体から未反応のインターフェロンβを除去するための精製操作、例えばイオン交換、ゲル濾過、疎水、親和性担体を用いたクロマトグラムの効率を低下させるため、通常限外濾過や余分なカラム操作などの前工程が行われる、これを省くことによって収率の向上と操作の簡便化の効果が得られる。なお、担体に固相化した抗インターフェロンβ抗体の断片とインターフェロンβとを反応させた後、ＰＥＧを結合し、得られたインターフェロンβ複合体を精製した実施例が下記実施例４に詳細に記載されている。
【００２３】
なお、インターフェロンβの活性部分を、中和抗体又はその抗原結合性断片により保護した状態で、水溶性ポリマーを結合するという方法は、本願発明により初めて提供された新手法であり、この方法を用いる場合は、インターフェロン活性低下抑制剤を用いるか否かに関わらず、本発明の範囲に含まれる。もっとも、インターフェロン活性低下抑制剤を用いる上記本発明の一態様として、インターフェロンβの活性部分を、中和抗体又はその抗原結合性断片により保護した状態で、水溶性ポリマーを結合する方法を採用することが好ましい。
【００２４】
なお、上記した、アミノ基反応性化合物による保護脱保護反応や抗体との結合反応の多くは中性溶液中で進行するため、水溶性ポリマーとの結合反応に用いる上述のインターフェロン活性低下抑制剤を用いることが非常に好ましく、この反応条件が見い出される以前においては、これらの方法のインターフェロンβへの適用されたことは無かった。
【００２５】
さらに、上記した通り、インターフェロンβ中のフリーのシステインのチオール基に水溶性ポリマーを結合する場合、特に望ましい分子量である２００００〜６００００ダルトンの水溶性ポリマーをインターフェロンβのシステイン残基に結合させるには、インターフェロンβの糖鎖が天然型より小さいこと、もしくは糖鎖が除去されているあるいは糖鎖をもとから持っていないことが好ましい。このようなインターフェロンβを用いることにより、一段階の反応で、還元解裂することのない結合反応を高効率で進行させることができる。なお、この結合反応に用いる水溶性ポリマーや好ましい反応条件は上記した通りである。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
【００２７】
実施例１
ｐＨ７での組換え型インターフェロンβへのポリエチレングリコール結合反応における添加剤の効果
０．５Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に保存した組換え型ヒトインターフェロンβ（最終濃度２００μｇ／ｍｌ、Ｇｏｅｄｄｅｌらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．８，４０５７−４０７４（１９８０））に従って組み換え大腸菌により発現精製を行った）に各々、グルコース（最終濃度１４．３％）又はエチレングリコール（最終濃度２４．５％）を添加した後、非添加コントロールと共に１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．０に調節した。マレイミド活性化ポリエチレングリコール（平均分子量２００００、日本油脂より購入）をインターフェロンβに対して約１０倍モル混合し、４℃で一晩結合反応をさせた。同時にマレイミド活性化ポリエチレングリコールを添加していない反応液を各々調製してインターフェロン活性の変化を測定した。インターフェロンβとポリエチレングリコールの結合効率はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、クマシーブリリアントブルー染色を施した際のバンドの呈色度にて（図１）、また、反応前後のインターフェロン活性は一般に培養細胞の抗ウイルス活性に基づく生物活性測定法（Ｂｉｏａｓｓａｙ法）（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ３７，７５５（１９８１）； Ｂｏｒｄｅｎ ｅｔ． Ａｌ．， Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４２， ４９４８ （１９８２）参照）もしくはこれと同等の結果が得られる酵素抗体法により測定した。具体的には、インターフェロンβの抗ウイルス活性は次のようにして測定した。セミコンフルエントのＦＬ細胞を１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシン液で剥離後、細胞播種用培地を加えた。血球計算盤を用いて、細胞懸濁液の細胞数を計測し、３〜４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞播種用培地で希釈調製した。調製した細胞懸濁液を攪拌しながらマルチチャンネルピペットを用いてマイクロプレート全ｗｅｌｌに加え、１０〜１５分静置し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で一晩培養した。
【００２８】
冷却下で、ＩＦＮ希釈用培地を用いて、ヒトＩＦＮβ標準品を１５０ＩＵ／ｍｌ前後に、また測定サンプルは標準品と類似した活性となるように希釈した。
【００２９】
トランスファープレート台に左側がＨ列となるようにトランスファープレートを載せ、マルチチャンネルピペットを用いてＩＦＮ希釈用培地を全ｗｅｌｌに５０μｌ加えた。２Ｈ〜１１Ｈの各ｗｅｌｌにマイクロピペットを用いて前希釈した標準品および測定サンプルを５０μｌ加えた。マルチチャンネルピペットを用いて２Ｈ〜１１Ｈ各ｗｅｌｌ中の培地とＩＦＮ液を泡立てないように静かに吸排を繰り返して攪拌し、５０μｌをＧ列に移した。Ｇ列〜Ａ列に向けて、同様の操作で攪拌し２倍段階希釈を行った。Ａ列の希釈が終えたところで液５０μｌを捨てた。トランスファープレートを静かに持ち上げ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した細胞の上に乗せた
【００３０】
ウイルス希釈用培地に凍結融解したウイルスを加えた。培養したプレートの上清をステ、マルチチャンネルピペットを用いて、洗浄用培地を１００μｌを加え、さらに同洗浄培地を捨てた。１Ａ〜Ｄおよび１２Ａ〜Ｄを除く全てのｗｅｌｌに上で、調製したウイルス希釈液を１００μｌ加え、３７℃インキュベータ内で１晩培養した。
【００３１】
顕微鏡でＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）の状態を観察した。さらに、プレートの上清を棄て、クリスタルバイオレット染色液で１０〜１５分染色した後、染色液を棄て、乾燥させた。ＯＤ５９０ｎｍを測定し、各プレートの１Ａ〜Ｄあるいは１２Ａ〜Ｄの平均ＯＤを１００％とし、１Ｅ〜Ｈあるいは１２Ｅ〜Ｈの平均値を０％とし、各ｗｅｌｌのＯＤ％を算出した。ＯＤ５０％の希釈倍率の逆数を実測値ＩＦＮ活性とした。各プレートの標準品実測値から、サンプル活性を換算した。
【００３２】
結果を表１に示す。ｐＨ７におけるインターフェロン活性の低下抑制効果は、エチレングリコール又はグルコースを用いた場合がコントロールよりも明らかに高かった（表１．マレイミドＰＥＧなしカラム参照）。ポリエチレングリコールの結合効率は、グルコースが最も高く、最も効率良く複合体が得られた（図１参照）。複合体の残存活性も、グルコース又はエチレングリコール添加によって得られたものが、未反応のｐＨ５．０におけるインターフェロンβの活性に対する比で８０％前後もあり、高かった（表１．マレイミドＰＥＧ反応物カラム参照）。
【００３３】
【表１】
表１
【００３４】
実施例２
活性化ポリエチレングリコールのインターフェロンβ結合反応における反応溶液ｐＨの影響
０．５Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に保存した組換え型ヒトインターフェロンβ（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）にグルコース（最終濃度１７．０％）を添加した後、非添加コントロールと共に１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを４．９、５．５、６．２、６．８、７．５に調節した。マレイミド活性化ポリエチレングリコール（平均分子量２００００、日本油脂より購入）をインターフェロンβに対して約１０倍モル混合し、室温で３時間結合反応を行った。インターフェロンβとポリエチレングリコールの結合効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、クマシーブリリアントブルー染色を施した際のバンドの呈色度にて解析した（図２）。その結果、試験した上記ｐＨの中では、ｐＨ６．８以上にした場合に、殆ど全てのインターフェロンβがポリエチレングリコールと結合する高効率が得られることが判った。
【００３５】
実施例３
ｐＨによる脱保護可能なアミノ基保護剤を用いたインターフェロンβ複合体の作製０．５Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に保存した組換え型ヒトインターフェロンβ（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）にグルコース（最終濃度１７．０％）を添加した後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを８．０に調節した。ＤＭＭＡ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社より購入）をインターフェロンβに対して０、３、１０、３０、１００倍モル混合し、氷中で３０分反応させた。更にスクシンイミジルエステル活性化ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ、平均分子量２００００、日本油脂より購入）をインターフェロンβの５０倍添加して１時間結合反応を行った。次に、４Ｍ酢酸を用いて反応液をｐＨ５．０に戻した後に３７℃で１５分間脱保護を行った。反応効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果、ＤＭＭＡによるインターフェロンβ複合体形成の大きな低下は見られなかった。一方、反応前後のインターフェロン活性を上記のように測定した結果（表２）、ＤＭＭＡを１０倍モル以上反応させてアミノ基を保護することで活性低下に繋がる部位へのポリエチレングリコールが抑制されることが判った。
【００３６】
【表２】
表２．ＤＭＭＡによるアミノ基保護でのＮＨＳ−ＰＥＧ結合ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性
【００３７】
実施例４
抗インターフェロンβ抗体を用いたＮＨＳ−ＰＥＧの結合反応とインターフェロンβ複合体の精製
ヒトインターフェロンβに対して中和活性を有する公知のモノクローナル抗体であるＹＳＢ−１（Ｓｕｇｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，ｖｏｌ．６，３１３−３２０，１９８７）をパパインでＦａｂに分解、精製した。これをＮＨＳ活性化セファロース（アマシャムファルマシア社より購入）に固相化した。固相化の具体的な方法は次の通りであった。６カラム体積の１ｍＭ塩酸でＮＨＳ活性化セファロースを洗浄した後、０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３，０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）に溶解した上記Ｆａｂを室温で３０分間反応させた。未反応のＮＨＳを６カラム体積の０．５Ｍエタノールアミンで不活化した。その後０．１Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）、１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
【００３８】
０．５Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に保存した組換え型ヒトインターフェロンβ（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）にグルコース（最終濃度１７．０％）を添加した後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．５に調節し、ＹＳＢ−１固相化担体（最終濃度３０％Ｖ／Ｖ）を懸濁した。室温で１時間反応させたのち、スクシンイミジルエステル活性化ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ、平均分子量２００００、日本油脂より購入）をインターフェロンβの４０倍添加して３０分間結合反応を行った。１７％グルコースを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で担体を洗浄した後、１０ｍＭ塩酸でインターフェロンβ複合体を溶出した。溶出液に含まれていた未反応のインターフェロンβを分離するため、酢酸緩衝液を加えてｐＨ５．０に調整した後、ゲル濾過カラムに供した。得られたインターフェロンβ複合体のインターフェロン活性を上記のように測定した結果、未修飾インターフェロンβ活性の８０％を維持していた。
【００３９】
実施例５
インターフェロンβのＣｙｓ１７のチオール基へのポリエチレングリコール結合反応における糖鎖サイズの効果検討
０．５Ｍ塩化ナトリウム、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に保存した組換え型ヒトインターフェロンβ（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）、又は天然型ヒトインターフェロンβ（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）にグルコース（最終濃度１７．０％）を添加した後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．５に調節した。マレイミド活性化ポリエチレングリコール（平均分子量２００００、４００００、日本油脂より購入）をインターフェロンβに対して約１０倍モル混合し、室温で３時間結合反応を行った。インターフェロンβとポリエチレングリコールの結合効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、クマシーブリリアントブルー染色を施した際のバンドの呈色度にて解析した結果、天然型インターフェロンβのシステイン残基への結合効率は５％以下と著しく低く、これに対し大腸菌組換え型インターフェロンβには実施例２同様８０％以上の高効率でポリエチレングリコールが導入された。このことから、ヒトインターフェロンβのＣｙｓ１７のチオール基に分子量２００００以上の高分子のポリエチレングリコールを高効率で結合させるためには、インターフェロンβの糖鎖が障害にならにいよう欠失した組換え型もしくは低分子量の組換え型か天然型を低分子量に処理した改変型を用いることが好ましいことが見い出された。このような糖鎖欠失もしくは低分子型のインターフェロンβでは１段階の反応で直接高分子量のポリエチレングリコールを結合させることが可能であることも産業利用上有利である。なお、インターフェロンβにおける糖鎖は水溶性に寄与しており、この欠失もしくは改変型は特に中性溶液での失活、凝集特性を増して高効率なポリエチレングリコール結合反応進行の妨げとなるため、実施例１に示したように糖などの失活、凝集抑制物質の共存が必要である。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、インターフェロンβの生物活性を損なうことなく、インターフェロンβと水溶性ポリマーとを結合することができる、インターフェロンβ複合体の簡便かつ高効率な製造方法が提供された。本発明の方法によれば、水溶性ポリマーとの結合反応に好適な中性域において、インターフェロンβの活性が低下することを抑制できるので、従来法に比較して、水溶性ポリマー結合後のインターフェロンβの活性が有意に高い。また、化学修飾又は抗インターフェロンβ中和抗体との反応により、アミノ基を部分的に保護した状態で水溶性ポリマーを結合することにより、水溶性ポリマーの結合によるインターフェロンβの活性低下をより一層防止することができる。さらに、本発明の方法により、インターフェロンβのＣｙｓ１７のチオール基に、高分子量の水溶性ポリマーを一段階の反応で結合させることが可能になった。
【００４１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】インターフェロン活性低下抑制剤存在下、ｐＨ７でのＰＥＧ化インターフェロンβのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す図である。
【図２】グルコース存在下、ｐＨ４．９〜７．５でのＰＥＧ化インターフェロンβのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing an interferon β complex.
[0002]
[Prior art]
In the past, biomolecules conjugated with water-soluble polymers such as polyethylene glycol have been shown to have clinically useful properties (Inada et al., J. Bioactand Compatible Polymers 5, 343 (1990), Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, 249 (1992); Katre, Advanced Drug Delivery Systems 93 (93), 91; Among them have been shown better physical and thermal stability, protection from susceptibility to enzymatic degradation, increased solubility, increased circulating half-life in vivo, reduced clearance values, and enhanced potency. I have.
[0003]
Various methods can be used to attach a water-soluble polymer, polyethylene glycol (PEG), to interferon β having the same primary structure as the natural type or the natural type. In general, a method is used in which a succinimide ester reaction PEGylation reagent binds to an amino group of a protein, and a maleimide reaction or a pyridyl disulfide reaction PEGylation reagent binds to a protein thiol group. These reagents are advantageous because the binding reaction proceeds efficiently under neutral conditions in which the pH of the reaction solution is stable for many other proteins.
[0004]
However, it is known that interferon β is inactivated under neutral solution conditions due to aggregation or the like, and is particularly remarkable in a recombinant protein lacking a sugar chain. Due to this specialty, unlike many other proteins, it was difficult to bind interferon β to PEG with high efficiency and maintaining activity using a general amino- and thiol-group-conjugated PEGylation reagent. . For example, Katre et al. In U.S. Pat. Nos. 4,766,106 and 4,917,888 disclose interferon with a large excess of methoxy-polyethylene glycol N-succinimidyl glutarate and methoxy-polyethylene glycol N-succinimidyl succinate. PEGylation of β is described. The interferon beta used in this experiment was the commercial product Betaseron, and the absence of glycosylation due to its production in microbial host cells reduced its solubility in aqueous solution. Performing the polyethylene glycol conjugation reaction at high pH resulted in solubility for the conjugate, but the major problem was reduced levels of activity and yield. In addition, L. Tire and Nabil et al. In WO 99/55377 describe the PEGylation of interferon β via Cys17 with monomethoxy-polyethylene glycol-OPSS (orthopyridyl disulfide derivative). However, this binding reaction is also performed at an acidic pH at which interferon β is stable, and the yield of the interferon β complex does not exceed 50%.
[0005]
Japanese Patent No. 3,177,449, "Consensus Interferon Modified with Water-Soluble Polymer", published on January 28, 1997, has polyethylene glycol selectively bonded to the N-terminus of consensus interferon using a reductive alkylation method. The method is described. By reacting a protein moiety having one or more amino groups with a water-soluble polymer moiety under reductive alkylation conditions at a pH suitable to selectively activate an α-amino group at the amino terminus of the protein moiety, However, when PEGylation of interferon β is carried out by this method, mono-PEGylation does not actually occur, and non-selection occurs at any lysine residue or N-terminus. , Resulting in a heterogeneous mixture, which did not have sufficient antiviral and cytostatic activity. That is, monoPEGylation using an amino group such as a lysine residue or an N-terminal amino group cannot be performed on interferon β, and it is not possible to obtain PEGylated interferon β that maintains biological activity.
[0006]
Apart from such a method using an amino group, there is a means for bonding a water-soluble polymer to a cysteine residue of a protein. PCT application WO 99/55377 describes monoPEGylation of interferon beta via Cys17 using mPEG-OPSS. Interferon β has five cysteine residues, of which four, other than Cys17, are disulfide-bonded in the molecule. Therefore, in principle, mono-PEGylation is possible by the above method. According to the method, the PEGylation efficiency is extremely low and is not practical. It is thought that the cause of the low efficiency is not limited to the pH of the reaction solution, and if the molecular weight of the polymer to be bound is high, there is also a problem that the polymer cannot be sterically approached to target Cys17. In order to clearly obtain effects such as prolongation of circulating half-life and reduction of clearance value in vivo, the molecular weight of PEG to be bound is limited. In order to avoid kidney clearance, it is desirable that the molecular weight of PEGylated interferon β is 60 kDa or more. However, according to the above method, only PEG of about 5 kDa can be bound as shown in the Examples. The molecular weight of interferon β never reaches 60 kDa. In this application, a complicated method of stepwise PEGylation is presented for coupling a larger PEG moiety. Furthermore, in the PEGylation using mPEG-OPSS, the disulfide bond which is the binding portion between PEG and interferon β is extremely unstable in a living body, and cannot benefit from PEGylation.
[0007]
As described above, the physical properties of interferon β act as a barrier, and it has not been possible to produce an interferon β complex which is required for industrialization with high efficiency and maintains activity.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a simple and highly efficient method for producing an interferon β complex that can bind interferon β and a water-soluble polymer without impairing the biological activity of interferon β. .
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted various studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, by adding a specific saccharide or the like to a reaction solution, a water-soluble polymer reactive with an amino group or a thiol group can be neutralized with high efficiency and interferon activity. Have been found to be able to bind to interferon-beta without reducing the expression of the present invention.
[0010]
That is, the present invention provides a method for producing an interferon β complex, which comprises binding interferon β to a water-soluble polymer at pH 6.5 to 8.5 in the presence of an interferon activity reduction inhibitor. Further, the present invention provides a method for producing an interferon β complex, which comprises binding a water-soluble polymer to an amino group of interferon β with a part of the amino group of interferon β protected by chemical modification. Furthermore, the present invention provides a method for producing an interferon β complex, which comprises binding a water-soluble polymer to interferon β in a state in which a neutralizing antibody of interferon β or an antigen-binding fragment thereof is bound to interferon β. I do.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As described above, in the method of the present invention, interferon β and the water-soluble polymer are bound at a pH of 6.5 to 8.5 in the presence of an interferon activity reduction inhibitor.
[0012]
Here, the interferon activity lowering inhibitor means that by adding the same, the decrease in the antiviral activity of interferon β caused by placing interferon β in an environment of pH 6.5 to 8.5 is not added. Means a substance that is suppressed as compared to The antiviral activity of interferon β can be determined by a known method as described in the following Examples (for example, Rubinstein et al., J. Virol. 37, 755 (1981); Borden et. Al., Canc. Res. 42, 4948 (1982)). Examples of the interferon activity reduction inhibitor include saccharides, especially oligosaccharides and monosaccharides having 5 or less saccharide units, sugar alcohols thereof, and polyhydric alcohols having 2 to 6 carbon atoms. Among them, glucose, mannitol, sorbitol, sucrose or trehalose, such as disaccharides and monosaccharides and sugar alcohols thereof, and polyhydric alcohols having 2 or 3 carbon atoms such as ethylene glycol and glycerol are particularly preferable. Disaccharides and monosaccharides and their sugar alcohols are preferred. These interferon activity reduction inhibitors can be used alone or in combination of two or more.
[0013]
The water-soluble polymer is harmless to the human body and is necessary for dissolving the complex in blood when administering the complex of interferon β and the water-soluble polymer to a living body for the purpose of utilizing the physiological activity of interferon β. It has a high level of water solubility. As described above, by binding a water-soluble polymer to a physiologically active substance, the physical and thermal stability of the physiologically active substance in a living body, protection from insensitivity to enzymatic degradation, increase in solubility, and circulation in vivo It has been conventionally attempted to extend the half-life and decrease the clearance value. In the present invention, however, water-soluble polymers conventionally used for such a purpose can be preferably used. Preferred examples of such water-soluble polymers include polyalkylene glycols, especially polyethylene glycol.
[0014]
When a water-soluble polymer is bonded to the thiol group in interferon β, one having a thiol group-reactive structure such as orthopyridyl disulfide, vinyl sulfone, maleimide or iodoacetamide at the terminal, preferably having a maleimide structure Water-soluble polymers can be used. When a water-soluble polymer is bonded to an amino group in interferon β, a water-soluble polymer having an amino group-reactive structure such as a hydroxysuccinimide ester or nitrobenzenesulfonate ester structure at a terminal can be used. Water-soluble polymers having these structures at the terminals have been widely used for bonding to amino groups and thiol groups, are well known in the art, and can be easily produced by well-known synthetic methods. However, such terminally activated PEGs are also commercially available. In the present invention, such commercially available products can also be preferably used.
[0015]
The average molecular weight of the water-soluble polymer is not particularly limited, but the physical and thermal stability of interferon β in vivo, protection against susceptibility to enzymatic degradation, increased solubility, extended circulating half-life in vivo, clearance value In light of reducing the average molecular weight, the average molecular weight is preferably about 4400 to 80,000 daltons, and more preferably about 20,000 to 60,000 daltons.
[0016]
The interferon β used in the method of the present invention is a natural protein, a natural protein obtained by modifying a sugar chain of a natural protein, or a recombinant protein or a recombinant protein having a sugar chain different from the natural protein or having a sugar chain. None can be obtained and can be obtained from any conventional source, such as tissue, protein synthesis, natural or recombinant cells. In particular, for the binding of the water-soluble polymer to the thiol group of interferon β, interferon β having a sugar chain whose molecular weight is smaller than that of natural interferon β is preferable, and interferon β having no sugar chain is more preferably used. Such interferon β having a different sugar chain can be obtained by allowing various types of enzymes such as glycosyltransferase and glycolytic enzyme to act on natural interferon β, and having or having a sugar chain different from that of the natural protein. Non-interferon β can be obtained by production in a variety of recombinant cells by a conventional method or by production in a recombinant cell in which a glycosyltransferase or glycolytic enzyme is forcibly expressed. Interferon β having no sugar chain produced by genetic engineering is commercially available, and such a commercially available interferon β can be preferably used in the method of the present invention.
[0017]
In general, when the amino acid constituting the amino acid sequence of a protein having a biological activity has a small number of amino acids substituted or deleted, or the biological activity is maintained even when a small number of amino acids are inserted or added. It is widely known to those skilled in the art. A protein having an amino acid sequence of 80% or more, preferably 90% or more homology with the amino acid sequence of interferon β (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), and further having interferon β activity, more preferably A protein in which one or several amino acids have been substituted or deleted, or one or several amino acids have been inserted and added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and which has an interferon β activity Proteins can also be used as “interferon β” in the present invention. However, interferon β having the same amino acid sequence as natural interferon β is most preferred.
[0018]
The binding reaction between interferon β and the water-soluble polymer is carried out at pH 6.5 to 8.5, preferably pH 7.5 to 8.5, in an aqueous medium, preferably in a buffer, in the presence of the interferon activity reduction inhibitor. The reaction can be easily carried out by reacting interferon β with a water-soluble polymer. The concentration of the interferon activity decrease inhibitor is not particularly limited, and is preferably about 1 to 90% with respect to the weight of the whole reaction mixture (when a plurality of types of interferon activity decrease inhibitors are used, the total amount is the same hereinafter), It is more preferably about 1 to 50%, more preferably about 10 to 30%. The mixing ratio of interferon β and the water-soluble polymer (interferon β: water-soluble polymer) is not particularly limited, but is usually about 1: 1 to 1: 100 in molar ratio, and particularly, maleimide-activated water-soluble About 1: 3 to 1: 20 is preferred for polymers, and about 1: 4 to 1: 70 is preferred for succinimidyl ester activated water soluble polymers. The reaction temperature is usually 4 to 40 ° C, preferably 4 to 25 ° C. The reaction time can be appropriately selected according to the reaction temperature and the like, but usually about 1 hour to 24 hours is appropriate. After the binding reaction, for example, ion exchange, gel filtration, chromatograms using a hydrophobic or affinity carrier, and other known methods, remove unreacted interferon β and water-soluble polymer to remove the desired interferon β and water-soluble polymer. Can be purified.
[0019]
In a preferred embodiment of the above-described method of the present invention, after a part of the amino group of interferon β is protected by reacting with an amino group-reactive low molecular weight compound and chemically modifying the water-soluble polymer, Attached to an amino group. Here, as the amino group-reactive low molecular weight compound, a compound capable of deprotection reaction after bonding to a water-soluble polymer is desirable, and DMMA (dimethyl maleic anhydride, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol 290, 368-372, Examples thereof include alkyl maleic anhydride such as (1999) and Boc (t-butoxycarbonyl group), but are not limited thereto. The molecular weight of the amino group-reactive low molecular weight compound is not particularly limited, but is preferably about 100 to 500. Such an amino group-reactive low molecular weight compound is preferably added in a molar ratio of about 2 to 100 times, more preferably about 5 to 50 times, with respect to interferon β. The reaction temperature of this amino group protection reaction is not particularly limited, o C ~ 25 o C is appropriate, and the reaction time can be appropriately selected according to the reaction temperature and the like, but usually about 10 minutes to 2 hours is appropriate. Conditions such as the reaction solvent and the preferable range of the concentration of interferon β in the reaction mixture may be the same as the preferable conditions in the binding reaction with the water-soluble polymer. As specifically shown in the examples below, after reacting such an amino group-reactive low molecular weight compound with interferon β, the amino group is reacted with interferon β as described above to form an amino group. The bioactivity of interferon β is higher than in the case without protection. This is because although the amino group-reactive low molecular weight compound itself cannot select which amino group to react with, since a highly reactive amino group is present in the active site of interferon β, a part of the amino group is , The probability that the amino group in the active site is protected is high, and the water-soluble polymer has a high probability of binding to an amino group located outside the active site of interferon β, so that the activity of interferon β is reduced. Is considered to be suppressed. After binding the water-soluble polymer, the protected amino group is preferably deprotected, and the deprotection reaction can be performed by a known method depending on the amino group-reactive low-molecular compound used. For example, when DMMA is used as the amino group-reactive low molecular weight compound, it can be easily performed by adjusting the pH to 5.0 with an acid such as acetic acid.
[0020]
It should be noted that, by binding the water-soluble polymer in a state where a part of the amino group is chemically modified, the physiological activity of interferon β is increased as compared with the case where the amino group is not protected, according to the present invention. This is the first finding, and the use of this method is included in the scope of the present invention regardless of whether or not an interferon activity reduction inhibitor is used. However, as one embodiment of the present invention using an interferon activity reduction inhibitor, it is preferable to employ a method of bonding a water-soluble polymer in a state where a part of amino groups is chemically modified.
[0021]
In another preferred embodiment of the present invention, after the neutralizing antibody of interferon β is reacted with and bound to interferon β, the water-soluble polymer is bound to interferon β. In this manner, the water-soluble polymer is bound while the active center of interferon β is protected by the neutralizing antibody, so that the decrease in the activity of interferon β due to the binding of the water-soluble polymer can be suppressed. . F (ab ') instead of neutralizing antibody 2 , Fab and the like can also be preferably used. As the antibody, a monoclonal antibody is preferable. A neutralizing monoclonal antibody for interferon β is known, and such a known monoclonal antibody can be used, or a neutralizing antibody can be prepared by a known method. That is, various monoclonal antibodies are produced by the usual method of producing monoclonal antibodies by Koehler and Milstein's method, reacted with interferon β to form an antigen-antibody complex, and the antiviral activity of this antigen-antibody complex is examined. Can be prepared by screening those in which the antiviral activity is lost. The reaction between interferon β and the antibody or the antigen-binding fragment thereof can be carried out under the conditions of a normal immune reaction. o C-37 o The reaction can be carried out at C. The reaction time is appropriately selected depending on the reaction temperature and the like. o 25 nights for C o In the case of C, about 30 minutes to 2 hours is appropriate. After the immune reaction, the complex of desired interferon β and a water-soluble polymer is obtained by dissociating interferon β from the antibody or a fragment thereof by a known treatment such as an acid treatment (for example, an inorganic acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid). Is obtained.
[0022]
The above-mentioned immune reaction is carried out by using the above-mentioned antibody or an antigen-binding fragment thereof as a carrier, preferably a polymer which can immobilize a protein, such as NHS or BrCN-activated agarose or Sepharose (trade name). After the binding of interferon β, it reacts with the water-soluble polymer, and then the solid-phased carrier has a function of dissociating the bond between the antibody and interferon β, such as a reaction solution containing no water-soluble polymer. By washing with an unreacted buffer, it can be easily used for separation and purification from unreacted water-soluble polymer. The elution of the interferon β complex from the solid-phased antibody after removing the unreacted water-soluble polymer can be performed using a low ionic strength acid such as 10 mM hydrochloric acid, which is suitable for the next purification step after elution. It is also easy to add additives so as to obtain a solution composition. Further, by using the carrier as described above, after the binding reaction with the water-soluble polymer, not only the removal of the unnecessary antibody or the fragment thereof becomes easy, but also after the reaction between the interferon β and the water-soluble polymer. It is also possible to continuously perform the step of removing and purifying unnecessary substances using the same carrier. The unreacted water-soluble polymer or salt in the reaction solution is subjected to a purification operation for removing unreacted interferon β from the target interferon β complex, for example, ion exchange, gel filtration, chromatography using a hydrophobic, affinity carrier. Preliminary steps such as ultrafiltration and extra column operation are usually performed to reduce the efficiency of gram. By omitting this step, the effects of improving the yield and simplifying the operation can be obtained. An example of reacting a fragment of an anti-interferon β antibody immobilized on a carrier with interferon β, binding PEG, and purifying the obtained interferon β complex is described in detail in Example 4 below. Have been.
[0023]
The method of binding a water-soluble polymer while protecting the active portion of interferon β with a neutralizing antibody or an antigen-binding fragment thereof is a new method provided for the first time by the present invention, and uses this method. Such cases are included in the scope of the present invention regardless of whether or not an interferon activity reduction inhibitor is used. However, as one embodiment of the present invention using an interferon activity reduction inhibitor, a method of binding a water-soluble polymer while protecting the active portion of interferon β with a neutralizing antibody or an antigen-binding fragment thereof is employed. Is preferred.
[0024]
In addition, since many of the above-described protective deprotection reactions with amino group-reactive compounds and binding reactions with antibodies proceed in a neutral solution, the above-mentioned interferon activity reduction inhibitor used in the binding reaction with a water-soluble polymer is used. It is highly preferred that these methods have not been applied to interferon beta before this reaction condition was found.
[0025]
Furthermore, as described above, when a water-soluble polymer is bonded to the thiol group of free cysteine in interferon β, a particularly desirable molecular weight of 20,000 to 60,000 daltons is bonded to a cysteine residue of interferon β. Preferably, the sugar chain of interferon β is smaller than the natural type, or the sugar chain has been removed or has no sugar chain. By using such interferon β, a binding reaction without reductive cleavage can proceed with high efficiency in a one-step reaction. The water-soluble polymer used for the binding reaction and the preferable reaction conditions are as described above.
[0026]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples.
[0027]
Example 1
Effect of additives on polyethylene glycol binding reaction to recombinant interferon β at pH 7
Recombinant human interferon β (final concentration 200 μg / ml, stored in 0.5 M sodium chloride, 100 mM acetate buffer (pH 5.0), using the method of Goeddel et al. (Nucleic Acid. Res. Vol. 8, 4057-4074 (1980)). )), Glucose (final concentration 14.3%) or ethylene glycol (final concentration 24.5%) was added to each, and then 1M disodium hydrogen phosphate was added together with a non-supplemented control. The pH was adjusted to 7.0 using the solution. Maleimide-activated polyethylene glycol (average molecular weight: 20,000, purchased from NOF) was mixed about 10-fold mol with respect to interferon β, and the binding reaction was allowed to proceed at 4 ° C. overnight. At the same time, reaction solutions to which maleimide-activated polyethylene glycol had not been added were prepared, and changes in interferon activity were measured. The binding efficiency between interferon β and polyethylene glycol is determined by the coloration of the band when Coomassie brilliant blue staining is performed after separation by SDS-PAGE (FIG. 1). Bioassay method based on viral activity (Bioassay method) (see Rubinstein et al., J. Virol. 37, 755 (1981); Borden et. Al., Canc. Res. 42, 4948 (1982)) The measurement was performed by the enzyme antibody method which gives equivalent results. Specifically, the antiviral activity of interferon β was measured as follows. After the semi-confluent FL cells were detached with a 0.25% trypsin solution containing 1 mM-EDTA, a cell seeding medium was added. The number of cells in the cell suspension was counted using a hemocytometer, and 3 to 4 × 10 5 The cells were diluted with a cell seeding medium so as to be cells / ml. The prepared cell suspension was added to all the wells of the microplate using a multi-channel pipette with stirring, left standing for 10 to 15 minutes, and cultured overnight at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
[0028]
Under cooling, a human IFNβ standard was diluted to about 150 IU / ml using an IFN dilution medium, and the measurement sample was diluted to have an activity similar to that of the standard.
[0029]
The transfer plate was placed on the transfer plate table so that the left side was row H, and 50 μl of IFN dilution medium was added to all the wells using a multichannel pipette. To each well of 2H to 11H, 50 μl of a standard product and a measurement sample pre-diluted using a micropipette were added. Using a multi-channel pipette, the medium in each well of 2H to 11H and the IFN solution were stirred gently by repeatedly sucking and discharging so as not to foam, and 50 μl was transferred to row G. The mixture was stirred in the same manner as in the rows G to A to perform a two-fold serial dilution. When the dilution of row A was completed, 50 μl of the liquid was discarded. The transfer plate was gently lifted and placed on the cells cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
[0030]
The freeze-thawed virus was added to the virus dilution medium. Using a multichannel pipette, 100 μl of a washing medium was added to the supernatant of the cultured plate, and the washing medium was discarded. 100 μl of the prepared virus diluent was added to all wells except 1A to D and 12A to D, and cultured in a 37 ° C. incubator overnight.
[0031]
The state of CPE (cytopathic effect) was observed with a microscope. Further, the supernatant of the plate was discarded, and the plate was stained with crystal violet staining solution for 10 to 15 minutes, and then the staining solution was discarded and dried. The OD was measured at 590 nm, and the average OD of 1A to D or 12A to D of each plate was set to 100%, and the average value of 1E to H or 12E to H was set to 0%, and the OD% of each well was calculated. The reciprocal of the dilution ratio at an OD of 50% was defined as the measured IFN activity. The sample activity was converted from the measured value of the standard product of each plate.
[0032]
Table 1 shows the results. The effect of suppressing the decrease in interferon activity at pH 7 was clearly higher when ethylene glycol or glucose was used than the control (see Table 1. Column without maleimide PEG). The binding efficiency of polyethylene glycol was highest for glucose, and the complex was most efficiently obtained (see FIG. 1). The residual activity of the conjugate obtained by adding glucose or ethylene glycol was as high as about 80% as compared to the activity of interferon β at unreacted pH 5.0 (Table 1. Maleimide PEG reaction product column). reference).
[0033]
[Table 1]
Table 1
[0034]
Example 2
Effect of Reaction Solution pH on Interferon β Binding Reaction of Activated Polyethylene Glycol
Glucose (17.0% final concentration) was added to recombinant human interferon β (final concentration 200 μg / ml) stored in 0.5 M sodium chloride, 100 mM acetate buffer (pH 5.0), and then together with a non-added control. The pH was adjusted to 4.9, 5.5, 6.2, 6.8, 7.5 using 1 M disodium hydrogen phosphate solution. Maleimide-activated polyethylene glycol (average molecular weight: 20,000, purchased from NOF) was mixed about 10-fold mol with respect to interferon β, and the binding reaction was performed at room temperature for 3 hours. The binding efficiency between interferon β and polyethylene glycol was analyzed by SDS-PAGE, and then analyzed by the coloration of the band when subjected to Coomassie brilliant blue staining (FIG. 2). As a result, it was found that, when the pH was adjusted to 6.8 or higher, high efficiency in which almost all of the interferon β was bound to polyethylene glycol was obtained.
[0035]
Example 3
Preparation of Interferon β Complex Using Amino Group Protecting Agent Deprotectable by pH Recombinant human interferon β (final concentration 200 μg / ml) stored in 0.5 M sodium chloride, 100 mM acetate buffer (pH 5.0) After addition of glucose (final concentration 17.0%), the pH was adjusted to 8.0 using 1M disodium hydrogen phosphate solution. DMMA (purchased from Acros Organics) was mixed with interferon β in a molar ratio of 0, 3, 10, 30, 100 times, and reacted on ice for 30 minutes. Further, succinimidyl ester-activated polyethylene glycol (NHS-PEG, average molecular weight: 20,000, purchased from NOF) was added 50 times the amount of interferon β, and the binding reaction was performed for 1 hour. Next, the reaction solution was returned to pH 5.0 using 4M acetic acid, and then deprotected at 37 ° C. for 15 minutes. As a result of analyzing the reaction efficiency by SDS-PAGE, no significant decrease in the formation of the interferon β complex by DMMA was observed. On the other hand, as a result of measuring the interferon activity before and after the reaction as described above (Table 2), it was found that by reacting DMMA at least 10-fold mol and protecting the amino group, polyethylene glycol at the site leading to a decrease in activity was suppressed. I understood.
[0036]
[Table 2]
Table 2. Antiviral activity of NHS-PEG conjugated IFN-β in protection of amino group by DMMA
[0037]
Example 4
Conjugation reaction of NHS-PEG using anti-interferon β antibody and purification of interferon β complex
YSB-1 (Sugi, M. et al., Hybridoma, vol. 6, 313-320, 1987), a known monoclonal antibody having a neutralizing activity against human interferon β, was decomposed into Fab with papain and purified. . This was immobilized on NHS-activated Sepharose (purchased from Amersham Pharmacia). The specific method of immobilization was as follows. After washing NHS-activated Sepharose with 6 column volumes of 1 mM hydrochloric acid, the Fab dissolved in 0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl (pH 8.3) was reacted at room temperature for 30 minutes. Unreacted NHS was inactivated with 6 column volumes of 0.5 M ethanolamine. Thereafter, the plate was washed with 0.1 M acetic acid, 0.5 M NaCl (pH 4.0), and 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5).
[0038]
Glucose (17.0% final concentration) was added to recombinant human interferon β (200 μg / ml final concentration) stored in 0.5 M sodium chloride, 100 mM acetate buffer (pH 5.0), and then 1 M hydrogen phosphate The pH was adjusted to 7.5 using a disodium solution, and the YSB-1 solid support (final concentration 30% V / V) was suspended. After reacting at room temperature for 1 hour, succinimidyl ester-activated polyethylene glycol (NHS-PEG, average molecular weight: 20,000, purchased from NOF) was added 40 times the amount of interferon β, and the binding reaction was performed for 30 minutes. After washing the carrier with a phosphate buffer (pH 7.0) containing 17% glucose, the interferon β complex was eluted with 10 mM hydrochloric acid. In order to separate unreacted interferon β contained in the eluate, the pH was adjusted to 5.0 by adding an acetate buffer, and then applied to a gel filtration column. As a result of measuring the interferon activity of the obtained interferon β complex as described above, 80% of the unmodified interferon β activity was maintained.
[0039]
Example 5
Effect of sugar chain size on polyethylene glycol binding reaction of interferon β to thiol group of Cys17
Recombinant human interferon β (final concentration 200 μg / ml) or natural human interferon β (final concentration 200 μg / ml) stored in 0.5 M sodium chloride, 100 mM acetate buffer (pH 5.0) was added to glucose (final concentration). (17.0%), and the pH was adjusted to 7.5 using a 1 M disodium hydrogen phosphate solution. Maleimide-activated polyethylene glycol (average molecular weight: 20,000, 40000, purchased from NOF) was mixed about 10-fold mol with respect to interferon β, and the binding reaction was performed at room temperature for 3 hours. As a result of analyzing the binding efficiency of interferon β and polyethylene glycol by SDS-PAGE and analyzing the coloration of the band when Coomassie brilliant blue staining was performed, the binding efficiency of natural interferon β to cysteine residues was 5%. % Or less, whereas polyethylene glycol was introduced into Escherichia coli recombinant interferon β with high efficiency of 80% or more as in Example 2. From this, in order to bind a high molecular weight polyethylene glycol having a molecular weight of 20,000 or more to the thiol group of Cys17 of human interferon β with high efficiency, a recombinant type in which the sugar chain of interferon β was deleted so as not to be a hindrance. Alternatively, it has been found that it is preferable to use a low molecular weight recombinant type or a modified type obtained by treating a natural type to a low molecular weight. It is also advantageous for industrial use that such a sugar chain-deleted or low-molecular-weight interferon β can directly bind high-molecular-weight polyethylene glycol in a one-step reaction. In addition, the sugar chain in interferon β contributes to water solubility, and this deletion or modified form increases inactivation and aggregation properties, particularly in neutral solutions, and hinders the progress of the highly efficient polyethylene glycol binding reaction. As shown in Example 1, it is necessary to inactivate sugar and the like, and to coexist with an aggregation inhibitor.
[0040]
【The invention's effect】
According to the present invention, a simple and highly efficient method for producing an interferon β complex that can bind interferon β to a water-soluble polymer without impairing the biological activity of interferon β has been provided. According to the method of the present invention, in a neutral region suitable for a binding reaction with a water-soluble polymer, a decrease in the activity of interferon β can be suppressed. β activity is significantly higher. In addition, by chemically modifying or reacting with an anti-interferon β neutralizing antibody, the water-soluble polymer is bound while partially protecting the amino group, thereby further preventing the decrease in the activity of interferon β due to the binding of the water-soluble polymer. can do. Furthermore, the method of the present invention has made it possible to bind a high molecular weight water-soluble polymer to the thiol group of Cys17 of interferon β in a one-step reaction.
[0041]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing an SDS-PAGE image of PEGylated interferon β at pH 7 in the presence of an interferon activity reduction inhibitor.
FIG. 2 is a view showing an SDS-PAGE image of PEGylated interferon β at pH 4.9 to 7.5 in the presence of glucose.
