【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、急性肝炎や劇症肝炎のような肝疾患の治療に有用な、肝疾患治療又は予防薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝臓は体内最大の代謝器官であり、生命維持に必須の臓器である。ウイルス感染やアルコール摂取、薬剤中毒などにより発症する急性肝炎は、しばしば急速に悪化し、劇症肝炎となる。劇症肝炎は、肝細胞の急激な大量壊死による高熱、激しい腹痛，全身性黄疸の後、肝性脳症により死亡率約７０％にもおよぶ。現在のところ、治療としては、（１）抗炎症、または肝細胞壊死の阻止を目的としたステロイド剤やシクロスポリン等の免疫抑制剤、（２）肝再生促進を目的としたグルカゴン・インスリン療法，（３）抗ウイルスを目的としたインターフェロン療法、（４）血漿交換、交換輸血、人工肝補助装置など、が行われているが、いずれも十分な効果は得られておらず、新たな作用機序の急性肝不全、劇症肝炎の治療薬の開発が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、急性肝炎や劇症肝炎等の肝疾患の治療に優れた効果を発揮する新規な肝疾患治療又は予防薬を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、オンコスタチンＭを投与することにより、優れた肝疾患治療効果が得られることを見出し本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、オンコスタチンＭ受容体アゴニストを有効成分として含有する肝疾患治療又は予防薬を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）は、インターロイキン−６ （ＩＬ−６）ファミリーに属するサイトカインであり、ＯＳＭのアミノ酸配列は公知であり、ＯＳＭをコードする遺伝子も公知であり、遺伝子工学的に生産された組換えＯＳＭが市販されている。ＯＳＭのアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｄ３１９４２に記載されており、下記配列番号１にも記載されている。ＯＳＭは、受容体に結合することによりその生理活性を発揮することが知られており、該受容体は、ＯＳＭ特異的なＯＳＭＲβとＩＬ−６ファミリーに共通なｇｐ１３０からなるヘテロ２量体である１。
【０００７】
下記実施例に具体的に記載されるように、本願発明者らは、ＯＳＭが、四塩化炭素投与により引き起こされる急性肝障害の軽減に優れた効果を発揮すること、従って、急性肝炎や劇症肝炎のような肝疾患の治療に有効であることを見出した。上記の通り、ＯＳＭの生理作用は、ＯＳＭが、ＯＳＭ受容体（ＯＳＭＲ）（より詳細にはＯＳＭＲβサブユニット）に結合し、ＯＳＭ受容体を介して発揮することが知られている。従って、ＯＳＭ以外の他のＯＳＭＲアゴニストも本発明の肝疾患治療又は予防薬の有効成分として用いることができる。
【０００８】
また、一般に、生理活性を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に少数のアミノ酸が挿入され又は付加された場合であってもその生理活性を維持する場合があることは当業者に広く知られているところである。本発明の肝疾患治療又は予防薬においては、このような修飾ＯＳＭも有効成分として用いることができる。ヒトＯＳＭのアミノ酸配列は、上記の通り、配列番号１に示されているが、この配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するヒトＯＳＭの他にも、該アミノ酸配列と好ましくは７０％以上の相同性を有し、かつ、肝疾患治療効果を発揮するアミノ酸配列を有する修飾ヒトオンコスタチンＭも本発明の肝疾患治療又は予防薬として用いることができる。なお、上記相同性は、７０％以上が好ましく、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算出することができ、このようなソフトはインターネットによっても利用に供されている。なお、肝疾患治療効果を発揮するか否かは、下記実施例に記載されているように、四塩化炭素を投与して作製した急性肝疾患モデルや、臨床試験において患者に投与し、血中アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（グルタミンオキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）活性又は血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性（グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＴＰ））活性が有意に減少するか否かを調べることにより知ることができる。
【０００９】
本発明の肝疾患治療又は予防薬の有効成分として好ましく用いられるＯＳＭは、精製された天然物であっても、遺伝子工学的に生産された組換えＯＳＭのいずれでもよい。上記の通り、組換えＯＳＭは市販されているので、このような市販の組換えＯＳＭを好ましく用いることができる。また、上記した修飾ＯＳＭは、既にクローニングされているＯＳＭ遺伝子に周知の部位特異的変異法を適用して修飾した遺伝子を周知の方法で発現させることにより容易に調製することができる。
【００１０】
下記実施例において具体的に記載されるように、本発明の肝疾患治療又は予防薬は、肝細胞壊死の軽減、肝臓の組織破壊の軽減及び血清肝障害マーカーの低減等、肝臓障害の軽減に種々の点から有効であり、急性肝炎や劇症肝炎のような、肝細胞壊死又は肝臓の組織破壊を伴う種々の肝疾患の治療に有効である。また、治療対象となる動物種は特に限定されず、ヒトをはじめ、肝細胞壊死又は肝臓の組織破壊を伴う肝疾患を患う他の動物にも適用することができる。なお、投与するＯＳＭは、その動物種由来のＯＳＭと同一のアミノ酸配列を有することが最も好ましいが、上記の通り、修飾ＯＳＭをも用いることができるので、肝疾患治療に効果がある限り、異種動物由来のＯＳＭも用いることができる。
【００１１】
本発明の肝疾患治療又は予防薬の投与量は、疾患の種類や程度、患者の体重や状態に応じて適宜設定されるが、有効成分がヒトＯＳＭの場合、通常、成人１日当たり０．１ｍｇ〜１００ ｍｇ程度、好ましくは２ ｍｇ〜６０ ｍｇ程度を、１回又は数回に分けて投与することができる。また、投与経路は、非経口投与が好ましく、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与等を好ましく採用することができる。また、製剤化は、製薬分野において周知のいずれの方法によっても行うことができ、上記有効成分以外に各種賦形剤、希釈剤、溶剤その他の添加剤を添加することができる。具体的な製剤例としては、例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中にＯＳＭを０．０１ ｇ／Ｌ〜１ ｇ／Ｌ程度の量で含むものを例示することができる。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１３】
１． 材料と方法
（１） 四塩化炭素による急性肝障害
実験には１２週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスの雄を使用した。１０％ 四塩化炭素溶液（オリーブオイルで希釈）を２００μＬ腹腔内投与し，投与後４８時間後にネンブタール麻酔下、腹部大静脈より採血した後、頚椎脱きゅうにて屠殺した。次いで肝臓を摘出し組織化学、免疫組織化学、遺伝子発現、ザイモグラフィー解析に使用した。
【００１４】
（２） ＯＳＭの投与
マウス組換えＯＳＭ（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社より市販）をＰＢＳで１ ｇ／Ｌの濃度に希釈し、体重１ ｋｇあたり１ ｍｇの投与量で、四塩化炭素投与２０分前、投与後８， １６， ２４時間後に皮下注射した。コントロールとしてはＰＢＳを用いた。
【００１５】
（３） 血清肝障害マーカーの測定
血清ＡＳＴ （ＧＯＴ）活性およびＡＬＴ （ＧＴＰ）活性の測定は、ＧＯＴ−ＵＶテストワコー、ＧＰＴ−ＵＶテストワコー（共に和光純薬工業より市販）を用い、キット添付のプロトコルに従い測定した。
【００１６】
（４） 組織化学および、免疫組織化学
クリオスタットを用いて、７ μｍの肝臓凍結切片を作製し、４ ％パラホルムアルデヒドで固定した。組織化学はヘマトキシリン・エオジン染色を行い、アポトーシス細胞の検出はＴｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ （ＴＵＮＥＬ） 染色により行った。ＴＵＮＥＬ陽性肝細胞の数は、２０倍の対物レンズで検鏡下、対照群とＯＳＭ投与群について、それぞれ１６視野について計測した。
【００１７】
（５） ノザンブロットによる遺伝子発現解析
採取した肝臓からＴｒｉｚｏｌ試薬（ニッポンジーン社より市販）を用いてＲＮＡを抽出した。１レーンあたり１０マイクログラムの全ＲＮＡを、ホルムアルデヒド変性ゲルにて電気泳動し、ナイロン膜に転写した後、ＤＩＧラベルしたＴＩＭＰ−１遺伝子のｃＤＮＡプローブ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＸＭ＿１３５７８８）を用いてハイブリダイズを行った。プローブの検出は、ＣＤＰ−ｓｔａｒを基質とした化学発光により行った。
【００１８】
（６） ゼラチンザイモグラフィー解析
１レーン当たり８０マイクログラムの肝臓抽出液を、非還元化、０．１％ゼラチンを含む８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ゲルを２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で洗浄し（３０分Ｘ ２）、反応液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）／１５０ ｍＭ ＮａＣｌ／１０ ｍＭ ＣａＣｌ２）中で、３７℃で２４時間反応させた後、ＣＢＢ染色を行い、次いで脱色処理をおこなった（メタノール３０／酢酸１０／水 ６０）。Ｉｎ ｓｉｔｕ ゼラチンザイモグラフィーはゼラチン膜をコートしたポリエステルフィルム（富士フィルム）上に肝臓新鮮凍結切片を張り付け、３７℃で３時間反応させた後、ビーブリッヒ・スカーセット染色を行った。
【００１９】
（７） 血清ＴＮＦ−α濃度の測定
血清ＴＮＦ−αの濃度は、Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＠Ｍ Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ−α Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ （カタログ Ｎｏ． ＭＴＡ００） を用い、キット添付のプロトコルに従い測定した。
【００２０】
（８） 統計処理
統計処理は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行った。
【００２１】
２． 結果
（１） ＯＳＭ投与による中心性壊死、血清肝障害マーカーの減少
四塩化炭素を単回投与すると急性肝障害が引き起こされるが、これは肝のチトクロームＰ−４５０によって四塩化炭素からフリーラジカルが生じ、これによって肝小葉中心部の肝細胞が障害されて、まず肝細胞の細胞膜透過性が増大し、ＧＰＴやＧＯＴといった肝特異的酵素の血中への漏えいが起き、それに続きいわゆる中心性壊死が引き起こされる２。また、この四塩化炭素による急性肝障害は抗ＴＮＦ−α抗体の投与によって軽減されることから３ 、ＴＮＦ−αによる肝障害の悪化が関与していると考えられる。ＯＳＭの投与によって四塩化炭素による急性肝障害が軽減できるか検討したところ、ＯＳＭ投与群 （３例）では、四塩化炭素投与４８時間後における中心静脈の周りに観察される壊死巣が、対照群 （３ 例）と比べていずれも劇的に改善されており、血清肝障害マーカーの値も対照群と比べて、ＡＬＴで２５．２ ＋ ３．７ ％，
ＡＳＴで３１．８ ＋ ８．８ ％ に抑えられていた （Ｎ ＝３， ｐ ＜ ０．０５） （図１）。
【００２２】
（２） ＯＳＭ投与による肝細胞アポトーシスの抑制
四塩化炭素投与によって誘導される肝細胞死は、壊死と同時にアポトーシスも誘導されることが報告されている５。アポトーシスを起こした肝細胞をＴＵＮＥＬ 法を用いて解析したところ、ＯＳＭ投与群では、ＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス肝細胞の数がいずれの個体においても対照群と比べて有意に減少しており（対照群：１７．９ ＋ ６．４ ｃｅｌｌ ， ＯＳＭ群：４．４ ＋ １．９８ ｃｅｌｌ， 各１６視野）、ＯＳＭの投与によって、肝細胞のアポトーシスも有意に抑制できることが明らかとなった（図２）。
【００２３】
（３） ＯＳＭ投与による血清ＴＮＦ−α産生の抑制
ＴＮＦ−αはエンドトキシン血症や薬物性肝障害によって、主に肝臓におけるクッパー細胞から産生される炎症性サイトカインで、肝細胞死（壊死、アポトーシス）やマトリクス分解酵素の産生促進による組織破壊を引き起こす５， ６， ７。四塩化炭素による急性肝障害もＴＮＦ−αに対する中和抗体の投与により、その症状が軽減化されることから、ＴＮＦ−αの関与が明らかである。四塩化炭素投与４８時間後の血清ＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法を用いて測定したところ、対照群では１２２ ＋ ９４ ｐｇ／ｍＬ （ｎ＝６）であるのに対し、ＯＳＭ投与群では２７．３ ＋ ２９．１ ｐｇ／ｍＬ （Ｎ＝６）と約２０ ％にまで有意に抑えられていた（ｐ ＜ ０．０１）（図３）。
【００２４】
（４） ＯＳＭ投与による細胞外マトリクス分解の抑制
細胞外マトリクスの分解は亜鉛とカルシウム依存性のマトリクスメタロプロテアーゼ （ＭＭＰ）と呼ばれる酵素群により調節されており、ＭＭＰの活性は、様々な組織構築、組織再構築に重要な役割を担っているばかりでなく、癌細胞の転移や、リウマチなどの病態にも深く関与していることが知られている８。肝臓においても、肝障害にともないＭＭＰの産生、活性化が起こり、細胞外マトリクスの分解が起こる。マウスにおける劇症肝炎モデルの１つであるＴＮＦ−α／ ガラクトサミンモデルにおいては、過度のＭＭＰ（特にＭＭＰ−２とＭＭＰ−９）の産生、活性化が引き起こされており， ＭＭＰ阻害剤であるＢＢ−９４の投与によって、劇症肝炎が軽減化されることが報告されている９。ゼラチンザイモグラフィーによって、四塩化炭素投与４８時間後の肝組織におけるＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の産生および活性を、対照群とＯＳＭ投与群で比較したところ、ＯＳＭ投与群では、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性が顕著に抑制されており、ｉｎ ｓｉｔｕ ザイモグラフィーによる肝臓切片におけるゼラチナーゼ活性も、ＯＳＭ投与群では対照群と比較して顕著に抑制されていた。この結果からＯＳＭ投与によって、四塩化炭素による急性肝障害における組織破壊が軽減化されることが示された。
【００２５】
（５） ＯＳＭ投与によるＴＩＭＰ−１遺伝子の発現誘導
生体組織においてＭＭＰの活性は、その内因性阻害分子であるＴｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ （ＴＩＭＰ）により厳密に制御されている。肝障害時においては、ＭＭＰ遺伝子の発現の後に、ＴＩＭＰ遺伝子の発現が誘導され、細胞外マトリクスの再構築を制御していることが知られている８。一方、ＯＳＭは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいてＴＩＭＰ−１遺伝子の発現を誘導することが報告されている１０， １１。ＯＳＭ投与群の肝臓におけるＴＩＭＰ−１遺伝子の発現をノーザンブロットで調べたところ、全ての個体においてＴＩＭＰ−１遺伝子の発現が対照群と比べて、著しく増強されていた。
【００２６】
３． 考察
ウイルス感染やアルコール摂取、薬剤中毒などにより発症する急性肝炎は、時折急速に悪化し、劇症肝炎となるが、現在のところ有効な治療法は確立されておらず、死亡率も非常に高い。延命率を上げる新しい治療法、治療薬の開発が望まれている。マウスに四塩化炭素を単回投与すると急性肝障害が引き起こされるが、これは肝のチトクロームＰ−４５０によって四塩化炭素からフリーラジカルが生じ、これによって肝小葉中心部の肝細胞が障害されて、まず肝細胞の細胞膜透過性が増大し、ＡＬＴやＡＳＴといった肝特異的酵素の血中への漏えいが起き、それに続きいわゆる中心性壊死が引き起こされる。同時に肝細胞のアポトーシスも引き起こされることが知られている。四塩化炭素誘導性の急性肝障害は、抗ＴＮＦ−α抗体の投与によって軽減されることから， 肝障害によって産生されるＴＮＦ−αによって障害が悪化すると考えられる。ＴＮＦ−αは肝細胞の壊死、アポトーシスを誘導するばかりでなく、ＭＭＰの産生、および活性化を促進し、組織破壊を引き起こす。また急性肝障害の劇症化にも中心的に関わっていると考えられている。
【００２７】
上記実施例によって、ＯＳＭは急性肝炎治療薬として有効であることが示された。ＯＳＭを投与すると、急性肝炎における肝細胞の壊死、アポトーシス、血清肝障害マーカーは、いずれも対照群の約２０〜３０％レベルにまで改善され、組織破壊も軽度であった。急性肝炎の劇症化にも深く関与すると思われる血清ＴＮＦ−α濃度も、ＯＳＭ投与群では、対照群の約２２ ％のレベルに抑えられていた。組織破壊に深く関与するＭＭＰに対する内因性阻害分子であるＴＩＭＰ−１の遺伝子発現もＯＳＭ投与群では著しく増強されていた。以上の結果より、ＯＳＭの投与は、急性肝炎の治癒に有効であり、その抗肝炎活性は、血清ＴＮＦ−αの産生を抑える事とＴＩＭＰ−１発現誘導による組織破壊の軽減化によるものと示唆された。急性肝炎の劇症化を促進すると考えられているＴＮＦ−α濃度とＭＭＰ活性に対して抑制効果を示したＯＳＭは、劇症肝炎に対しても有効な効果を示すことが予想される。また、ＯＳＭの構造を模倣した低分子物質、いわゆるＯＳＭＲβのアゴニストや、ＯＳＭによって発現が誘導される遺伝子は新規の急性肝炎、劇症肝炎の治療、予防薬となると考えられる。
【００２８】
参考文献
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２． Ｄａｂｅｖａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５６： ２０１７−２０３１
３． Ｃｚａｊａ， Ｍ． Ｊ． Ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０８： １８４９−１８５４４． Ｓｈｉ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５３： ５１５−５２５５． Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｍａｎｏ， Ｒ． ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９： ８４１−８４８６． Ｂｉｒｄ， Ｇ．Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ （１９９０） Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ．１１２： ９１７−９２０７． Ｍｕｔｏ， Ｙ． ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｌａｎｃｅｔ ８６０２： ７２−７４ ８． Ｋｎｉｔｔｅｌ， Ｔ． ｅｔ ａｌ （２０００） Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１３： ４４３−４５３９． Ｗｉｅｌｏｃｋｘ， Ｂ． ｅｔ ａｌ （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ７：１２０２−１２０８１０． Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｃ． Ｄ． ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： ２４３１−２４３７１１． Ｋｅｒｒ ， Ｃ． ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ． １９：１１９５−１２０５
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、急性肝炎や劇症肝炎等の肝疾患の治療に優れた効果を発揮する新規な肝疾患治療又は予防薬が提供された。上記実施例から明らかなように、本発明の肝疾患治療又は予防薬は、肝細胞壊死の軽減、肝臓の組織破壊の軽減及び血清肝障害マーカーの低減等、肝臓障害の軽減に種々の点から有効であり、急性肝炎や劇症肝炎のような、肝細胞壊死又は肝臓の組織破壊を伴う種々の肝疾患の治療及び予防に有効である。
【００３０】
【配列表】
【００３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】四塩化炭素投与４８時間の血清ＡＬＴ値 （左）と血清ＡＳＴ値（右）を示す図である。
【図２】ＰＢＳ 投与群とＯＳＭ投与群について、２０倍の対物レンズで検鏡下、それぞれ１６視野についてアポートーシスを起こした肝細胞をカウントしグラフ化した図である。＊Ｐ ＜ ０．０１ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定
【図３】四塩化炭素投与４８時間後の血清ＴＮＦ−αの濃度をＰＢＳ投与群とＯＳＭ投与群で比較した図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a therapeutic or preventive agent for liver disease useful for treating liver disease such as acute hepatitis and fulminant hepatitis.
[0002]
[Prior art]
The liver is the largest metabolic organ in the body and an essential organ for life support. Acute hepatitis that develops due to viral infection, alcohol consumption, drug poisoning, etc. often worsens rapidly and becomes fulminant hepatitis. Fulminant hepatitis has a high fever due to sudden massive necrosis of hepatocytes, severe abdominal pain, generalized jaundice, and a death rate of about 70% due to hepatic encephalopathy. At present, treatments include (1) anti-inflammatory drugs or immunosuppressive drugs such as cyclosporine for preventing hepatocellular necrosis, (2) glucagon-insulin therapy for promoting liver regeneration, ( 3) Interferon therapy for the purpose of antivirus, (4) plasma exchange, exchange transfusion, artificial liver assist device, etc. are performed, but all of them have not obtained sufficient effects and a new mechanism of action There is a demand for the development of a remedy for acute liver failure and fulminant hepatitis.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a novel therapeutic or preventive drug for liver disease that exhibits excellent effects in treating liver diseases such as acute hepatitis and fulminant hepatitis.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the inventors of the present application have found that administration of Oncostatin M can provide an excellent therapeutic effect on liver disease, and completed the present invention.
[0005]
That is, the present invention provides a therapeutic or preventive drug for liver disease, comprising an oncostatin M receptor agonist as an active ingredient.
[0006]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Oncostatin M (OSM) is a cytokine belonging to the interleukin-6 (IL-6) family, the amino acid sequence of OSM is known, and the gene encoding OSM is also known, and is produced by genetic engineering. Recombinant OSM is commercially available. The amino acid sequence of OSM is, for example, GenBank Accession No. D31942, and also in SEQ ID NO: 1 below. OSM is known to exert its physiological activity by binding to a receptor, which is a heterodimer consisting of OSM-specific OSMRβ and gp130 common to the IL-6 family. 1 .
[0007]
As specifically described in the Examples below, the present inventors have shown that OSM exerts an excellent effect in reducing acute liver injury caused by carbon tetrachloride administration, and therefore, acute hepatitis and fulminant It has been found that it is effective for treating liver diseases such as hepatitis. As described above, it is known that OSM binds to OSM receptor (OSMR) (more specifically, OSMRβ subunit) and exerts physiological effects of OSM via OSM receptor. Therefore, other OSMR agonists other than OSM can be used as an active ingredient of the therapeutic or preventive agent for liver disease of the present invention.
[0008]
In general, a protein having a physiological activity has a physiological activity even when a small number of amino acids in the amino acid sequence are substituted or deleted, or a small number of amino acids are inserted or added to the amino acid sequence. Is well known to those skilled in the art. In the therapeutic or prophylactic agent for liver disease of the present invention, such a modified OSM can also be used as an active ingredient. As described above, the amino acid sequence of human OSM is shown in SEQ ID NO: 1. In addition to the human OSM having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence preferably has a homology of 70% or more with the amino acid sequence. Modified human oncostatin M having an amino acid sequence that has the property of exhibiting a therapeutic effect on liver disease can also be used as a therapeutic or preventive agent for liver disease of the present invention. The homology is preferably 70% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more. The homology of the amino acid sequence can be easily calculated using well-known computer software such as FASTA, and such software is also available on the Internet. In addition, whether or not to exert a therapeutic effect on liver disease, as described in the following examples, acute liver disease model prepared by administering carbon tetrachloride, administered to patients in clinical trials, blood It can be known by examining whether or not aspartate aminotransferase (AST) (glutamine oxaloacetate transaminase (GOT) activity or blood alanine aminotransferase (ALT) activity (glutamyltranspeptidase (GTP)) activity is significantly reduced. it can.
[0009]
The OSM preferably used as an active ingredient of the therapeutic or preventive drug for liver disease of the present invention may be a purified natural product or a recombinant OSM produced by genetic engineering. As described above, since recombinant OSM is commercially available, such commercially available recombinant OSM can be preferably used. The above-mentioned modified OSM can be easily prepared by applying a well-known site-directed mutagenesis method to the already cloned OSM gene and expressing the modified gene by a well-known method.
[0010]
As specifically described in the Examples below, the therapeutic or prophylactic agent for liver disease of the present invention is useful for reducing liver damage, such as reduction of hepatocellular necrosis, reduction of liver tissue destruction, and reduction of serum liver damage markers. It is effective in various respects, and is effective in treating various liver diseases such as acute hepatitis and fulminant hepatitis accompanied by hepatocellular necrosis or tissue destruction of the liver. In addition, the animal species to be treated is not particularly limited, and the present invention can be applied to other animals suffering from liver diseases including hepatocellular necrosis or liver tissue destruction, including humans. The OSM to be administered most preferably has the same amino acid sequence as that of the OSM derived from the animal species. However, as described above, a modified OSM can also be used. OSM from animals can also be used.
[0011]
The dose of the therapeutic or prophylactic agent for liver disease of the present invention is appropriately set according to the type and degree of the disease, the weight and condition of the patient. When the active ingredient is human OSM, it is usually 0.1 mg per adult per day. About 100 mg, preferably about 2 mg to 60 mg, can be administered once or in several divided doses. The administration route is preferably parenteral administration, and intravenous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration and the like can be preferably employed. Formulation can be carried out by any method known in the pharmaceutical field, and various excipients, diluents, solvents and other additives can be added in addition to the above-mentioned active ingredients. As a specific formulation example, for example, a formulation containing OSM in a phosphate buffer solution (PBS) in an amount of about 0.01 g / L to 1 g / L can be exemplified.
[0012]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0013]
1. Materials and Methods (1) For an acute liver injury test using carbon tetrachloride, 12-week-old male C57 / BL6 mice were used. 200 μL of a 10% carbon tetrachloride solution (diluted with olive oil) was intraperitoneally administered, and 48 hours after administration, blood was collected from the abdominal vena cava under Nembutal anesthesia, and then sacrificed by cervical spine prolapse. The liver was then removed and used for histochemistry, immunohistochemistry, gene expression, and zymography analysis.
[0014]
(2) Administration of OSM Mouse recombinant OSM (commercially available from R & D systems) was diluted with PBS to a concentration of 1 g / L and administered at a dose of 1 mg / kg body weight 20 minutes before carbon tetrachloride administration. It was injected subcutaneously 8, 16, and 24 hours after administration. PBS was used as a control.
[0015]
(3) Measurement of serum hepatic injury marker Serum AST (GOT) activity and ALT (GTP) activity were measured using GOT-UV Test Wako and GPT-UV Test Wako (both commercially available from Wako Pure Chemical Industries) and included in the kit. Was measured according to the protocol described in
[0016]
(4) Histochemistry and immunohistochemistry Using a cryostat, a 7 μm frozen section of the liver was prepared and fixed with 4% paraformaldehyde. Histochemistry was performed by hematoxylin-eosin staining, and apoptotic cells were detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-measured dUTP nickel labeling (TUNEL) staining. The number of TUNEL-positive hepatocytes was counted in a control group and an OSM-administered group for each of 16 fields under a microscope with a 20 × objective lens.
[0017]
(5) Gene Expression Analysis by Northern Blot RNA was extracted from the collected liver using Trizol reagent (commercially available from Nippon Gene). 10 micrograms of total RNA per lane was electrophoresed on a formaldehyde denaturing gel, transferred to a nylon membrane, and then hybridized using a DIG-labeled TIMP-1 gene cDNA probe (GenBank Accession No .: XM_135788). Was done. Probe detection was performed by chemiluminescence using CDP-star as a substrate.
[0018]
(6) Gelatin zymography analysis 80 micrograms of the liver extract per lane was separated by non-reduced, 8% SDS-PAGE containing 0.1% gelatin, and the gel was separated by 2.5% Triton X-100. (30 minutes X2), and reacted at 37 ° C. for 24 hours in a reaction solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 150 mM NaCl / 10 mM CaCl 2 ), followed by CBB staining. Then, a decolorizing treatment was performed (methanol 30 / acetic acid 10 / water 60). In the in situ gelatin zymography, a liver fresh frozen section was stuck on a polyester film (Fuji film) coated with a gelatin film, reacted at 37 ° C. for 3 hours, and stained with Biebrich Scarset.
[0019]
(7) the measured concentration of serum TNF-α of serum TNF-α concentrations, using the Quantikine of R & D systems @ M Mouse TNF -α Immunoassay ( Catalog No. MTA00), was measured in accordance with the kit protocol.
[0020]
(8) Statistical processing Statistical processing was performed by Student's t-test.
[0021]
2. Results (1) Central necrosis due to OSM administration, decrease in serum liver injury markers A single administration of carbon tetrachloride causes acute liver injury, which is caused by the generation of free radicals from carbon tetrachloride by liver cytochrome P-450. This causes damage to hepatocytes in the center of the hepatic lobule, first increasing the cell membrane permeability of hepatocytes, causing leakage of liver-specific enzymes such as GPT and GOT into the blood, followed by so-called central necrosis. Triggered 2 . Moreover, acute liver failure due to the carbon tetrachloride is considered to worsening of 3, TNF-alpha by liver damage from being reduced by the administration of anti-TNF-alpha antibodies is involved. It was examined whether administration of OSM can reduce acute liver injury caused by carbon tetrachloride. In the OSM administration group (3 cases), necrotic lesions observed around the central vein 48 hours after carbon tetrachloride administration were found to be in the control group (3 cases) were all dramatically improved, and the value of serum liver injury marker was 25.2 + 3.7% in ALT,
In AST, it was suppressed to 31.8 + 8.8% (N = 3, p <0.05) (FIG. 1).
[0022]
(2) hepatocyte death induced by inhibition of carbon tetrachloride administration of hepatocyte apoptosis by OSM administration, and necrosis have been simultaneously reported that apoptosis induced 5. When the apoptotic hepatocytes were analyzed using the TUNEL method, the number of TUNEL-positive apoptotic hepatocytes in the OSM-administered group was significantly reduced in all individuals compared to the control group (control group: 17.9 + 6.4 cells, OSM group: 4.4 + 1.98 cells, 16 visual fields each), it was revealed that administration of OSM can also significantly suppress apoptosis of hepatocytes (FIG. 2).
[0023]
(3) Inhibition of serum TNF-α production by OSM administration TNF-α is an inflammatory cytokine produced mainly by Kupffer cells in the liver due to endotoxemia or drug-induced liver injury, and hepatocyte death (necrosis, apoptosis) 5, 6, 7 causing tissue destruction by promoting the production of matrix-degrading enzymes. The acute liver injury caused by carbon tetrachloride is alleviated by administration of a neutralizing antibody against TNF-α, and thus the involvement of TNF-α is apparent. The serum TNF-α 48 hours after the administration of carbon tetrachloride was measured by an ELISA method. The result was 122 + 94 pg / mL (n = 6) in the control group, whereas it was 27.3+ in the OSM administration group. It was 29.1 pg / mL (N = 6), which was significantly suppressed to about 20% (p <0.01) (FIG. 3).
[0024]
(4) Suppression of extracellular matrix degradation by OSM administration The degradation of extracellular matrix is regulated by a group of enzymes called zinc and calcium-dependent matrix metalloproteases (MMPs). It is known not only to play an important role in tissue remodeling, but also to be deeply involved in the metastasis of cancer cells and pathological conditions such as rheumatism 8 . Production and activation of MMPs also occur in the liver due to liver damage, and extracellular matrix is degraded. In the TNF-α / galactosamine model, which is one of the fulminant hepatitis models in mice, excessive production and activation of MMPs (particularly MMP-2 and MMP-9) are caused, and the MMP inhibitor BB It has been reported that administration of -94 reduces fulminant hepatitis 9 . By gelatin zymography, the production and activity of MMP-2 and MMP-9 in liver tissue 48 hours after carbon tetrachloride administration were compared between the control group and the OSM administration group. -9 activity was remarkably suppressed, and gelatinase activity in liver sections by in situ zymography was also remarkably suppressed in the OSM administration group as compared with the control group. These results indicate that OSM administration reduces tissue destruction in acute liver injury caused by carbon tetrachloride.
[0025]
(5) Induction of TIMP-1 Gene Expression by OSM Administration The activity of MMP in living tissues is strictly controlled by Tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP), which is an endogenous inhibitory molecule thereof. It is known that during liver injury, the expression of the TIMP gene is induced after the expression of the MMP gene, thereby controlling the reconstruction of the extracellular matrix 8 . Meanwhile, OSM has been reported to induce the expression of TIMP-1 gene in vitro and vivo 10, 11. When the expression of the TIMP-1 gene in the liver of the OSM-administered group was examined by Northern blot, the expression of the TIMP-1 gene was significantly enhanced in all individuals as compared with the control group.
[0026]
3. Acute hepatitis caused by viral infection, alcohol consumption, drug intoxication, etc. sometimes worsens rapidly and becomes fulminant hepatitis, but no effective treatment has been established at present and the mortality rate is extremely high. . There is a demand for the development of new treatments and therapeutics that increase the survival rate. A single administration of carbon tetrachloride to mice causes acute liver injury, which is caused by the formation of free radicals from carbon tetrachloride by hepatic cytochrome P-450, which damages hepatocytes in the central hepatic lobule, First, the cell membrane permeability of hepatocytes increases, and liver-specific enzymes such as ALT and AST leak into the blood, followed by so-called central necrosis. It is known that hepatocyte apoptosis is also caused at the same time. Acute liver injury induced by carbon tetrachloride is alleviated by administration of an anti-TNF-α antibody, and thus it is considered that TNF-α produced by liver injury worsens the injury. TNF-α not only induces hepatocyte necrosis and apoptosis, but also promotes MMP production and activation, causing tissue destruction. It is also thought to be centrally involved in fulminant acute liver injury.
[0027]
The above examples showed that OSM is effective as a therapeutic agent for acute hepatitis. When OSM was administered, hepatocyte necrosis, apoptosis, and serum liver injury markers in acute hepatitis were all improved to about 20 to 30% of the control group, and tissue destruction was mild. The serum TNF-α concentration, which is thought to be deeply involved in fulminant acute hepatitis, was also suppressed to about 22% in the OSM-administered group compared to the control group. Gene expression of TIMP-1, an endogenous inhibitory molecule for MMP, which is deeply involved in tissue destruction, was also significantly enhanced in the OSM administration group. The above results suggest that administration of OSM is effective for the cure of acute hepatitis, and that its anti-hepatitis activity is due to the suppression of serum TNF-α production and the reduction of tissue destruction by induction of TIMP-1 expression. Was done. OSM, which is believed to promote fulminant transformation of acute hepatitis, has an inhibitory effect on TNF-α concentration and MMP activity, and is expected to exhibit an effective effect on fulminant hepatitis. In addition, a low-molecular substance that mimics the structure of OSM, an agonist of so-called OSMRβ, and a gene whose expression is induced by OSM are considered to be novel therapeutic and preventive drugs for acute hepatitis and fulminant hepatitis.
[0028]
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[0029]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a novel therapeutic or preventive agent for liver disease which exhibits excellent effects in treating liver diseases such as acute hepatitis and fulminant hepatitis. As is clear from the above examples, the therapeutic or prophylactic agent for liver disease of the present invention can reduce hepatocellular necrosis, reduce tissue destruction of the liver, reduce serum liver injury markers, etc. It is effective for the treatment and prevention of various liver diseases such as acute hepatitis and fulminant hepatitis, which are accompanied by hepatocellular necrosis or liver tissue destruction.
[0030]
[Sequence list]
[0031]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing serum ALT values (left) and serum AST values (right) 48 hours after carbon tetrachloride administration.
FIG. 2 is a graph showing, in a PBS administration group and an OSM administration group, hepatocytes that have undergone apoptosis in 16 fields of view under a microscope with a 20 × objective lens, and graphed. * P <0.01 Student's t-test FIG. 3 is a graph comparing serum TNF-α concentrations 48 hours after carbon tetrachloride administration between the PBS administration group and the OSM administration group.
