JP2003536073A - プロテオミクス分析を実施するためのマイクロアレイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペプチド模倣タンパク質結合アレイ、それらの製造、使用、および適用が、提供される。本発明のタンパク質結合アレイエレメントは、安定なアンカーを介して固体支持体に連結されたペプチド模倣セグメントを含む。本発明は、ペプチド模倣アレイエレメントライブラリー合成、分配、およびアレイエレメントの平面状の固体支持体へのスポッティング、複合体タンパク質混合物の標識化、およびアレイへの示差的タンパク質結合の分析を考慮する。本発明はまた、富化または精製、およびアレイスクリーンによって、示差的であると同定されるタンパク質のその後の配列決定または構造分析を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 本発明は、細胞産物分析および物質に関する。１つの実施形態では、本発明は
、プロテオミクスマイクロアレイおよびプロテオミクス分析を行なうためにこれ
らを使用する方法に関する。

【０００２】 近年、マイクロアレイ技術は、専門化した亜分野から、分子生物学、微生物学
、製剤学、農学、および多数の他の生物工学における基礎および応用研究のため
の重要な手段へと発達してきた。ＤＮＡマイクロアレイ技術は、生物のゲノムま
たは細胞を、発現した表現型またはタンパク質機能に結びつけようと試みる。

【０００３】 マイクロアレイ技術に関する大量の出版物および特許文献は、ガラススライド
（しばしば、「チップ」といわれる）などの固体表面に陳列されるＤＮＡ（また
は他の核酸形態（例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ））のアレイを記載する。アレ
イ化ＤＮＡは、代表的には、短いオリゴヌクレオチド（例えば、約８〜２５塩基
）の形態であるかまたはより長いクローンであるかまたはＰＣＲ産物である（約
５００〜２０００塩基）。前者は、代表的には、固体支持体上で合成されるが、
後者は、アレイ型式中の固体支持体上に自動的に「スポットされる」。

【０００４】 固体表面上のペプチドおよびタンパク質アレイの報告は存在するが、これらは
、ＤＮＡアレイと比較してあまり注目を受けてこなかった。これは、界面におい
て複雑な生物学的マトリックスの存在下でのこれらの物質に固有の不安定性に起
因するようである。例えば、多数のタンパク質は、固体表面との接触の際に変成
することが周知である。ペプチドおよびタンパク質はまた、分析される生物学的
サンプルに存在し得る任意のプロテアーゼによる加水分解に供される。さらに、
ペプチドアレイは、代表的には、フォトリソグラフ法を使用して固体支持体上で
インサイチュで合成される。これらの技術は、それぞれのチップについて設計お
よび製造されなければらない高価なあつらえのマスクの使用を必要とする。さら
に、表面合成のペプチドの化学的特徴付けは、産生されるペプチドが極めて少量
なことに起因して、実施することがほぼ不可能である。

【０００５】 現在、生物学的サンプルのプロテオームを分析する最も一般的な方法は、２次
元（「２−Ｄ」）ゲル電気泳動を使用する。この結果は、実験プロトコル（例え
ば、ゲルおよび他のパラメーターの展開時間）に非常に敏感であるため、この方
法は問題がある。従って、２−Ｄゲルから再現性のあるデータを得ることは非常
に難しい。また、これらのゲルで使用される銀染色の感度は制限されており、そ
して、マイクロアレイ技術で使用される蛍光標識の感度より小さい。

【０００６】 従って、タンパク質コンテクストにおいて有用な効果的なマイクロアレイ技術
を開発する非常に大きい必要性が存在する。多くの場合では、機能的経路は、特
定の遺伝子に直接関連し得ない。タンパク質は、しばしば、最終的に機能を決定
する種々の翻訳後の修飾、相互作用、または分解を受ける。見かけ上単純なタン
パク質の豊富さの評価でさえ、対応するＲＮＡのレベルと直接相関し得ない。唯
一の解決法は、タンパク質レベルで、細胞、組織または生物の状態を評価するこ
とである。従って、細胞、組織、血清などの複合体混合物におけるタンパク質の
迅速な差示的表示を可能にする高処理能様式は、ＤＮＡマイクロアレイ技術に対
する強力な対応物および相補物を提供する。

【０００７】 （発明の要旨） 上述のことを達成するために、本発明は、ペプチド模倣タンパク質結合アレイ
、これらの製造、使用、および適用を提供する。本発明のタンパク質結合アレイ
エレメントは、ペプチド模倣セグメント、アンカーセグメントならびにペプチド
模倣セグメントおよびアンカーセグメントを接続するリンカーセグメントを含む
。本発明は、ペプチド模倣セグメントアレイエレメントライブラリーの合成、分
配、および固体平面基板上にアレイエレメントをスポットすること、複合体タン
パク質混合物の標識、およびアレイに対する差示的タンパク質結合の分析を意図
する。本発明はまた、アレイスクリーニングにより差示的であると同定されるタ
ンパク質の富化または精製、および引き続く配列決定または構造分析を可能にす
る。本発明に従うプロテオミクスマイクロアレイを含むキットもまた提供される
。

【０００８】 １つの局面では、本発明は、固体支持体の表面に安定に付着したタンパク質結
合剤のアレイに関する。そのアレイは、実質的に平面の表面を有する固体基板お
よび基板に結合された多数の異なったタンパク質結合剤を含む。タンパク質結合
剤のそれぞれは、基板表面に安定して結合したアンカーセグメント、ペプチド模
倣タンパク質結合セグメント、およびアンカーおよびペプチド模倣セグメントを
接続しそして分離するリンカーセグメントを含む。

【０００９】 別の局面では、本発明は、固体支持体の表面と安定に連結する多数の異なった
タンパク質結合剤を含むアレイを作製する方法に関する。この方法は、実質的に
平面の表面を有する固体基板を結合するために調製する工程、およびこのタンパ
ク質結合剤が基板表面に結合されるのに十分な条件下で、多数の異なったタンパ
ク質結合剤をこの基板と接触させる工程を包含する。タンパク質結合剤のそれぞ
れは、基板表面に安定して結合されるアンカーセグメント、ペプチド模倣タンパ
ク質結合セグメント、およびアンカーおよびペプチド模倣セグメントを接続しそ
して分離するリンカーセグメントを含む。

【００１０】 別の局面では、本発明は、固体支持体の表面と安定に連結する多数の異なった
タンパク質結合剤を含むアレイを作製する方法に関する。この方法は、この結合
剤のそれぞれが、基板表面に安定に結合されるアンカーセグメント、ペプチド模
倣タンパク質結合セグメント、ならびに、アンカーおよびペプチド模倣セグメン
トを接続しそして分離するリンカーセグメントを含む、タンパク質結合剤のライ
ブラリーを生成する工程を包含する。このタンパク質結合剤は、それぞれの異な
ったタンパク質結合剤について、ライブラリーから個々の貯蔵レセプタクルへ分
配され、多数の異なったタンパク質結合剤は、固体基板への結合のために調製さ
れ、多数の異なったタンパク質結合剤と結合するための実質的に平面の表面を有
する固体支持体が調製され、そして、アレイが、本明細書中に記載されるように
調製される。

【００１１】 本発明のさらなる局面は、差示的結合アッセイを実施する方法に関する。この
方法は、タンパク質を含む生物学的サンプル溶液中のタンパク質を標識する工程
、標識されたタンパク質含有生物学的サンプルのアリコートを、本明細書中に記
載されるアレイと接触させる工程、およびこのアレイのタンパク質結合剤へのサ
ンプル中のタンパク質の差示的結合を決定するためにアレイを分析する工程を包
含する。

【００１２】 本発明の別の局面は、本明細書中に記載されるような差示的結合アッセイを実
施する際の使用のためのキットに関する。このキットは、基板に結合する複数の
異なったタンパク質結合剤を有する実質的に平面の表面を有する固体基板を有す
るアレイを含む。このタンパク質結合剤の各々は、この基板表面に安定に結合し
たアンカーセグメント、ペプチド模倣タンパク質結合セグメント、およびアンカ
ーおよび模倣セグメントを接続しそして分離するリンカーを含む。

【００１３】 本発明のさらなる局面は、固体支持体の表面に安定に付着したタンパク質結合
剤の混合アレイに関する。このアレイは、実質的に平面の表面を有する固体基板
、および基板に結合された多数の異なったタンパク質結合剤を含む。タンパク質
結合剤のそれぞれは、基板表面に安定に結合されるアンカーセグメント、ペプチ
ド模倣タンパク質結合セグメント、ならびに、アンカーおよびペプチド模倣セグ
メントを接続しそして分離するリンカーセグメントを含む。このアレイは、さら
に、基板に結合する複数の異なった抗体を含む。

【００１４】 本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、本発明の以下の明細書および本
発明の原理を例示の目的で示す添付の図面において、さらに詳細に示される。

【００１５】 （発明の特定の実施形態の説明） 本発明の材料および関連技術および装置は、ここで、いくつかの実施形態を参
照して記載される。記載される実施形態の重要な特性および特徴は、本文中およ
び添付の図面中の構造で例示される。本発明は、これらの実施形態と組み合わせ
て記載されるが、本発明が、これらの実施形態に制限されることは意図されない
ことが理解されるべきである。対照的に、本発明の精神および範囲内に含まれ得
るような代替、改変、および同等物をカバーすることが意図される。以下の説明
では、多数の特定の詳細が、本発明の完全な理解を提供するために示される。本
発明は、これらの特定の詳細のいくつかまたは全てがなくとも、実行され得る。
別の例では、周知のプロセス操作は、本発明を不必要に不明瞭にしないように、
記載されていない。

【００１６】 この明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」お
よび「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数の参照を含む。他に定
義されなければ、本明細書中に使用されるすべての技術用語および科学用語は、
本発明が所属する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

【００１７】 （導入） 本発明は、ペプチド模倣タンパク質結合アレイを提供し、さらに、これらの製
造方法、使用、および適用を提供する。本発明のこのタンパク質結合アレイエレ
メントは、安定なアンカーを使用して固体支持体に連結されるペプチド模倣セグ
メント（その例は、ペプトイドである）を含む。１つの実施形態では、本発明は
、ペプチド模倣アレイエレメントライブラリー合成、分配、および平面状の固体
基板上にアレイエレメントをスポットすること、複合体タンパク質混合物の標識
、ならびに標識された純粋なタンパク質または複合体タンパク質混合物をペプチ
ド模倣アレイに接触させることによる単一タンパク質結合または差示的タンパク
質結合の分析を提供する。このような分析は、癌、ＨＩＶまたは糖尿病などの疾
患に関する新規の治療標法の同定を導き得る。次いで、これらの新規の標的は、
新しい薬物候補を検出するための高処理能スクリーニングアッセイにおいて使用
され得る。本発明はまた、アレイスクリーニングによって差示的であると同定さ
れるタンパク質の富化または精製、および引き続く配列決定または構造分析を可
能にする。これらのアレイはまた、目的のタンパク質に対する新しい合成リガン
ド（タンパク質精製または高処理能アッセイの開発のための）または目的の抗体
についての合成抗体を同定するために使用され得る。これらはまた、新しい酵素
インヒビターもしくは薬物標的のための他の高親和性リガンドを見い出すために
、または新しい治療法のための最初の骨格として使用され得る。本発明に従うプ
ロテオミクスマイクロアレイを含むキットもまた提供される。

【００１８】 （１．タンパク質結合剤アレイ） 本発明に従うペプチド模倣アレイは、固体支持体の表面に付着されるタンパク
質結合剤を含む多数の異なったアレイエレメントから構成される。異なったタン
パク質結合剤アレイエレメントはそれぞれ、基板表面に付着したアンカーセグメ
ント、ペプチド模倣タンパク質結合セグメント、およびアンカーおよびペプチド
模倣セグメントを接続しそして分離するリンカーセグメントを含む。本明細書中
で使用されるように、「ペプチド模倣物」とは、アッセイ条件下で、タンパク質
−タンパク質またはタンパク質−ペプチドの物理的および／または化学的相互作
用と類似した様式で、タンパク質またはレセプターと検出可能に相互作用する非
ペプチド合成ポリマーまたはオリゴマーについていう。アンカーセグメントは、
例えば、本明細書中に記載されるようなマイクロアレイの正常な操作条件下で、
マイクロアレイが供されるプロセシングの間、アンカー基と固体表面との間の関
係、従って、基板表面上のタンパク質結合剤の濃度と密度との間との関係が維持
されるように、代表的には、基板表面に付着される。さらに以下に記載されるよ
うに、アレイの表面に存在するタンパク質結合剤の化学的に異なる種類の数は、
少なくとも２、または少なくとも１０、または少なくとも１００であり、そして
、はるかに大きくあり得、一般的には、少なくとも約１，０００、または少なく
とも約５，０００〜約５０，０００、例えば、約５，０００と約１０，０００と
の間であり得る。

【００１９】 図１Ａおよび１Ｂは、本発明に従う１つのこのようなアレイエレメントおよび
アレイを示す。図１Ａでは、タンパク質結合アレイエレメント１００は、３つの
セグメントを含む：ペプチド模倣セグメント１０２、アンカーセグメント１０４
、およびリンカーセグメント１０６。このアレイエレメントは、そのアンカーセ
グメント１０４と基板表面１１０との間の結合によって、固体支持体または基板
１０８に付着される。いくつかの場合では、この基板は、積層物を形成する複数
の層１１２ａ、１１２ｂ、１２２ｃから構成され得る。図１Ｂにおいて、タンパ
ク質結合アレイは、平面基板１０８に付着される複数の異なったアレイエレメン
ト１００（例えば、図１Ａに例示されるような）を含む。このアレイのこれらの
成分のそれぞれは、以下に別々に非常に詳細に記載される。

【００２０】 （Ａ．基板） 本発明に従うアレイで使用される固体支持体（図１Ａおよび１Ｂ、エレメント
１０８）は、生産される産物の意図された使用に大いに依存して変化し得る。こ
の固体支持体は、このアレイが使用される任意の分析方法とまた適合するタンパ
ク質結合剤と結合するための任意の適切な材料であり得る。適合性は、表面また
は物質化学分野の当業者に公知の方法および材料を使用して決定され得る。１つ
の実施形態において、この固体支持体は、不浸透性の剛性の材料を包含する。適
切な材料としては、プラスチック（例えば、ポリマー（例えば、ポリ塩化ビニル
、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリカルボネートおよびそ
れらのコポリマー（例えば、塩化ビニル／プロピレンポリマー、塩化ビニル／酢
酸ビニルポリマー、スチレンコポリマー）））などが挙げられる。適切な材料と
してはまた、ガラス（例えば、石英から形成されるような）またはケイ素；およ
び金属（合金を含む）（例えば、金、白金、銀、銅、アルミニウム、チタン、ク
ロムなど）が挙げられる。

【００２１】 上記のように、目的とする多くの実施形態において、支持体または基板１０８
は、２以上の異なる材料層から構成される。ここで、この組成は、例えば、図１
Ａでエレメント１１２ａによって示されるような、少なくとも１つの基材、なら
びに図１Ａでエレメント１１２ｂおよび１１２ｃによって示されるような、１以
上の表面コーティング材料を含む。例えば、目的とする１つの実施形態は、基材
１１２ａ（例えば、ガラス）を含み、この基材１１２ａは、金属層１１２ｂ（例
えば、二酸化ケイ素でオーバーコーティングされた金もしくはアルミニウム、ま
たは二酸化ケイ素でオーバーコーティングされたチタン）、および官能化有機（
例えば、アミノ改変チオールまたはアミノ改変シラン）層１１２ｃでコーティン
グされる。平面固体支持体は、例えば、標準的な３’’×１’’顕微鏡スライド
の寸法、または３’’もしくは５’’の直径の円形ウェーハの形状であり得る。
他の外形は、界面化学または材料化学の分野の当業者に明らかである。

【００２２】 固体支持体材料または基板は、意図される材料用途に依存して、種々の異なる
外形を有し得る。従って、最も広い意味で、支持体または基材は、板、シート、
円錐体、管、ウェル、ビーズ、ナノ粒子（例えば、約５〜１００ｎｍ）、ウェー
ハなどの形状であり得る。いくつかの実施形態では、基礎の支持体材料は、例え
ば、板、スライド、シート、円板などにおいて見出されるような、少なくとも１
つの実質的な平面を有するものである。これらの実施形態では、全体的にスライ
ドまたは板の外形（例えば、長方形または円板の外形）を有する支持体が使用さ
れる。

【００２３】 上記スライドの平面長方形の実施形態では、支持体の長さは一般的に、少なく
とも約１ｃｍであり、そして約４０ｃｍ以上程度に長くなり得るが、通常は、約
３０ｃｍ以下、そしてしばしば、約２０ｃｍ以下であり得る。支持体の幅は、一
般的に、少なくとも約１ｃｍであり、そして約４０ｃｍ程度に長くなり得るが、
通常は、約３０ｃｍ以下、そしてしばしば、約２０ｃｍ以下である。支持体の高
さは、約０．０１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲であり、これは、剛性基板が作製され
た材料および必要な剛性を提供するために必要とされる材料の厚さに、少なくと
も部分的に依存する。多くの実施形態において特に興味深いのは、標準的な顕微
鏡スライドの寸法を有する支持体である。１つの代表的な基板サイズは、約２．
５４ｃｍ×７．６２ｃｍ、かつ約１〜２ｍｍ厚である。しかし、任意の適切な寸
法が使用され得る。

【００２４】 支持体がビーズ、ナノ粒子またはマイクロ粒子である場合、支持体の直径は代
表的に、約５ｎｍ〜約１０００μ、特に、約１０ｎｍ〜約５００μの範囲である
。

【００２５】 タンパク質結合剤は、層１１２ａまたは１１２ｂの無機固体表面（以下で、図
４Ａを参照してより詳細に例示および記載される）に直接結合されるか、または
、１１２ｃの官能化有機層（以下で、図４Ｂを参照してより詳細に例示および記
載される）を使用して付着されるかのいずれかであり得る。後者の場合、層中の
有機分子の非基板結合末端が、反応基で官能化され、この反応基が、その後に結
合したタンパク質結合剤のアンカー基（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）に付
着され得る。適切な末端反応基は、アンカーの官能基に依存して、例えば、マレ
イミド、ヒドラジド、アミノオキシ、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド）、無水物、アルデヒド、ジスルフィド、チオール、アジド、ホ
スフィン、またはアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン（ｎｅｕｔ
ｒａｖｉｄｉｎ）、またはビオチンに結合するタンパク質アビジンの他の改変形
態であり得る。

【００２６】 基礎の支持体材料（例えば、ガラス）の表面が、金属（例えば、アルミニウム
、金、またはチタン）の薄層でコーティングされるような実施形態では、この金
属層の厚さは、一般的に、約３００Å〜約１０，０００Å、より詳細には、約７
５０Å〜約２，０００Å、そしてさらにより詳細には、約１，０００Å〜約１，
５００Åの範囲である。金属層は、任意の適切なプロトコルを使用して基板表面
に沈着され得、これには、当業者に公知のような、電子線蒸着（ｅ−ｂｅａｍ
ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、蒸着、スパッタリングなどが挙げられる。接着金属層
は、金属層と基板との間に存在し得る。ここで、目的とする接着層には、チタン
、クロムなどが挙げられる。現在では、接着層は、代表的に、約５Åと約１００
Åとの間、通常は、約２５Åと約７５Åとの間の範囲であり、そして多くの実施
形態では、約５０Åである。いくつかの実施形態では、上記の接着層は、分子接
着層であり得る。本発明に従う分子接着層を形成するために適切な材料の例とし
ては、当該分野において公知のような、メルカプトプロピルトリエチルオキシシ
ラン、および他のメルカプトアルコキシシラン（例えば、メルカプトプロピルト
リメトキシシラン、メルカプトプロピルトリクロロシラン、または他の鎖長（例
えば、メルカプトヘキシルトリエトキシシランおよび他のメルカプトヘキシルア
ルコキシシラン））が挙げられる。接着層が分子接着層である場合、接着層の厚
さは代表的に、約５Å〜約５０Åの範囲である。

【００２７】 タンパク質結合剤のアンカー基を使用して、このタンパク質結合基を無機（例
えば、金属またはガラス）基板表面に直接結合し得る。例えば、チオールアンカ
ー基を使用して、官能化層（例えば、マレイミド／アミン／チオール）を介在さ
せることなく、金属（例えば、金、銀、銅または白金）に直接結合し得る。また
は、アンカー基が活性化シラン（すなわち、他の有機種と反応性であるように改
変された、例えば、加水分解性シラン、またはヒドロキシルもしくは他のシラン
と縮合してシロキサン結合を形成し得る改変シラン）である場合（例えば、クロ
ロシランまたはアルコキシシラン）、タンパク質結合剤は、ガラスまたは他の酸
化物表面（例えば、酸化チタン、酸化ケイ素（ｓｉｌｉｃｏｎ ｏｘｉｄｅ）、
または酸化アルミニウム）に直接結合し得る。この目的の他の活性化シランとし
ては、トリエトキシシラン、トリクロロシラン、トリメトキシシラン、または他
のトリアルコキシシランが挙げられる。各クラスにおいて、鎖長は、例えば、３
個の原子から約１８個までであり得る。

【００２８】 以下でより詳細に記載されるように、基板の無機表面への直接的なタンパク質
結合剤の結合の場合、タンパク質結合剤の連結セグメント（ペプチド模倣物とア
ンカーとの間）は、表面が、ペプチド模倣物で（その後に）生じるタンパク質結
合を阻害しないのに十分に、硬性基板表面から離してペプチド模倣物を維持する
に十分な長さであるべきである。この長さは、例えば、約２個の原子〜約２００
個の原子、または約２Å〜約３００Åであり得る。代表的な連結セグメントは、
約２個の原子〜約３０個の原子、好ましくは約６個の原子〜約１２個の原子の間
の骨格を有し得る。連結セグメントは、例えば、適切に誘導体化された脂肪族鎖
（例えば、アミノアルカン酸（例えば、アミノヘキサン酸））、エチレンオキシ
ド（例えば、図１Ｃに示されるような）、スルホキシド、もしくは「非結合」（
直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ））の短いペプトイドまたはペプチドエレメント
（これらは、アレイの各エレメントについて一定を保つ（例えば、グリシンヘプ
タマー））、またはこれらの成分のいくつかの組合せから構成され得る。

【００２９】 上記のように、タンパク質結合剤はまた、アミノ改変チオール（アミノチオー
ル）（いくつかの金属基板表面での使用のため）またはアミノ改変シラン（アミ
ノシラン）（ガラス、金属性または他の酸化物基板表面での使用のため）のよう
な、官能化有機層（図１Ａ、エレメント１１２ｃ）を使用して、付着され得る。
このような有機層が使用される場合、層の有機分子の末端が反応基で官能化され
、この反応基が、末端で基板表面に安定に付着され得、そして別の末端で、本発
明に従ってその後に結合されるタンパク質結合剤のアンカーセグメントに安定に
付着され得る。適切な末端基としては、例えば、アンカーで提示されるチオール
との反応において共有結合を形成し得るマレイミドが挙げられる。このような合
成アンカー系のさらなる利点は、長期の有効期間を付与するその安定性である。
基板における他の可能な末端基としては、ヒドラジド（これは、アンカーのアル
デヒド部分またはケトン部分と共有結合を形成するように反応し得る）；アミノ
オキシ（これは、アンカーのケトン部分と共有結合を形成するように反応し得る
）、アルデヒド、ジスルフィド、チオール、アジド、ホスフィンが挙げられる。

【００３０】 別の実施においては、アビジン、ストレプトアビジン、または他の類似体のよ
うなタンパク質が、固体支持体のコーティングとして使用され得る。この場合、
ビオチンが、タンパク質結合剤のアンカー部分として使用されて、表面上のアビ
ジンと安定な非共有結合複合体を形成する。作用に関して如何なる特定の理論に
も束縛されることは望まないが、この様式は、提示される分子とその隣接物との
間で所望される距離、および提示される分子と固体表面との間で所望される距離
で、特定の生体適合性環境にあるタンパク質結合剤を提示すると考えられる。他
のタンパク質コーティングもまた、それらが小さな分子のアンカー基を十分に結
合するという条件において使用され得る。これらとしては、抗ジゴキシゲニン／
ジゴキシゲニン、抗ジニトロフェノール／ジニトロフェノール、または当該分野
において公知の他の多くのタンパク質／小さな分子の対が挙げられ得る。アビジ
ン／ビオチンは、その極めて安定な結合相互作用が理由で、特に価値がある。さ
らに、実質的なシグナルの増加が、本発明に従う他の適切な固定技術と比較して
、ビオチン／アビジン固定について観察されている（例えば、チオール／マレイ
ミドよりも１０００倍高い）。適切な合成高分子もまた、このようなタンパク質
スペーサーの模倣物として使用され得る。これらとしては、高分子量ポリマー（
例えば、ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリアクリル酸、ポリリジンなど
）が挙げられ得る。

【００３１】 当然のことながら、この特徴（すなわち、上記のような、マイクロアレイが、
その通常の操作条件下で供される処理の間に結合を維持するに十分に安定である
こと）の他の適切な結合の組合せもまた可能である。さらに、界面化学の分野の
当業者は、ペプトイドにおける上記に列挙したアンカー基が、表面における反応
基として機能し得ること、そしてこの反応性表面基がまた、ペプチド模倣物アン
カー基として機能し得ることを理解する。

【００３２】 本発明の１つの実施形態では、アルミニウムスライドを、約５００Å〜約２，
０００Åの間の厚さを有する二酸化ケイ素または一酸化ケイ素（ｓｉｌｉｃｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ）の層でコーティングし得る。厚さを、放射または励起光の
波長の１／４に、おおよそ対応するように選択する。アミノアルキルトリアルコ
キシシラン（例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、トリクロ
ロシラン、トリメトキシシラン、および任意の他のトリアルコキシシラン）の層
が、酸化物の表面でコーティングされる。さらに、他のアミノシランもまた使用
され得る（例えば、界面化学分野の当業者によって理解されるような、より順序
付けられたシラン層を形成し得る、より長いアルキル基（例えば、オクチル、デ
シル、ヘキサデシルなど）を有する化合物）。このシラン層の厚さは、約３Å〜
約１００Å、より好ましくは約５Å〜約５０Å、さらにより好ましくは、約７Å
〜約２０Åであり得る。他の適切な例は、約７Å厚であるＡＰＳ層である。アミ
ノ改変Ａ１表面は、タンパク質結合剤におけるアンカー官能基に結合する反応基
で官能化され得る。１つの実施形態では、官能基はマレイミドであり得る。別の
実施形態では、官能基は、タンパク質全体（例えば、アビジン）であり得る。ア
ビジン提示基板の実施が、以下の実施例３において、図７Ａおよび７Ｂを参照し
て記載される。

【００３３】 別の実施形態では、金表面仕上げ基板スライド（または、金属−チオール結合
を形成し得る任意の金属（例えば、Ａｇ、Ｐｔ、またはＣｕ）で表面仕上げされ
たスライド）は、タンパク質結合剤におけるアンカー官能基（例えば、マレイミ
ド）に結合する基で官能化されるアミノチオール層でコーティングされ得る。し
かし、アンカー官能基および表面結合反応基は、直交反応性（ｏｒｔｈｏｇｏｎ
ａｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ）を有するように選択されるべきである。上記のように
、これらのアンカーおよび基板結合基は、当業者に容易に理解されるように、交
換され得る。

【００３４】 一般的に、官能化有機層１１２ｃは、実質的に均一な親水性表面を有するとい
う点で特徴付けられる。均一とは、層の表面が、実質的に不整（例えば、ギャッ
プ、ピンホールなど）を全く含まないことを意味する。層１１２ｃの厚さは、か
なり変動し得る。ここでこの厚さは、約５，０００Å未満、通常は、約２，００
０Å未満であり得るが、はるかに低く、特に約５Å〜約１００Å、または約２０
Å〜約５０Åの間であり得る。

【００３５】 少なくとも以下のような実施形態：支持体材料が、官能化有機層の下に金属層
を含む場合、例えば、支持体材料が、上記のような金コーティングされた顕微鏡
スライド上のアミノ改変チオール層である場合では、有機層の厚さは、層１１２
ｃが、有意なシグナル消光（すなわち、意味の有るシグナル検出を効率的に防止
するに十分な大きさでのシグナル消光）が生じないように、基板表面上の金属層
から十分離れた距離で表面に存在し得る任意の蛍光標識部分を分離させるに少な
くとも十分な厚さであるように選択される。これらの実施形態では、官能化有機
層は、少なくとも約３０Å、通常は少なくとも約５０Å、そしてより通常には、
少なくとも約１００Åの厚さを有し得る。あるいは、消光が生じる場合には、ス
ライドは、高塩溶液（例えば、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．０８５Ｍクエン
酸ナトリウム）で処理され得る（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／０１１４２
を参照のこと）。

【００３６】 以下でより詳細に記載されるような、蛍光標識された標的と共にアレイが使用
される実施形態では、官能化アミノ改変チオール層の厚さは、放射および反射さ
れるシグナルの最大増幅を与えるように選択され得る。例えば、米国特許第５，
０５５，２６５号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照の
こと。このような実施形態では、有機層の厚さは、標識から放射される光の波長
の約１／４である。有機層の正確な厚さは、共に使用される特定の標識に依存し
て変動するが、厚さは、一般的に、約５０Å〜約３００Å、通常は、約１００Å
〜約２００Å、そしてより通常には、約１２５Å〜約１５０Åの範囲である。

【００３７】 １つの実施形態では、官能化アミノ改変チオール層１１２ｃは、少なくとも１
つの自己集合化した単層（ＳＡＭ）を含む。そういうものとして、この層が１よ
り多い自己集合化した単層を含む場合、官能化有機層は、互いに対して順次融合
された、１以上の異なる自己集合化された単層を含み得る（例えば、ＰＣＴ公開
番号ＷＯ０１／０１１４２を参照のこと）。

【００３８】 （Ｂ．タンパク質結合剤） 上記のように、本発明のタンパク質結合剤は、以下の３つのセグメントから構
成される：ペプチド模倣物、アンカー、およびこのペプチド模倣物とこのアンカ
ーとを接続するリンカー。

【００３９】 「ペプチド模倣物」は、本明細書中で使用される場合、アッセイ条件下におい
て、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−ペプチドの物理化学的相互作用
と類似の様式で、タンパク質またはレセプターと検出可能に相互作用する、非ペ
プチド合成ポリマーまたはオリゴマーをいう。ペプチド模倣物は、一般的にプロ
テアーゼ耐性であり、そして例えば、以下が挙げられる：オリゴマー種、例えば
、ペプトイド、β−ペプチド、ならびに、Ａ．Ｅ．ＢａｒｒｏｎおよびＲ．Ｎ．
Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍａｔ
ｅｒｉａｌｓ：ｉｎ−ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｔ
ｉｃｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １９９９，３（６）：６８
１−７、ならびにＫ Ｋｉｒｃｈｅｎｂａｕｍ，Ｒ．Ｎ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ
およびＫ．Ａ．Ｄｉｌｌ，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｔｈｅ ｍ
ｉｍｉｃ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ
ｌ １９９９ ９（４）：５３０−５（この各々は、すべての目的のためにその
全体において、本明細書中で参考として援用される）に記載されるような他のも
の、ならびに拘束された環状分子（例えば、環状ペプチドおよび複素環）。いく
つかの場合では、ペプチド模倣物はまた、天然のタンパク質の折り畳みを模倣し
得る。本発明に従うペプチド模倣物は、一般的に、約５００マー以下、より詳細
には、約１００マー以下、代表的には約５０マー以下、そして通常は約１０マー
〜約２０マー、より詳細には、約１２マー〜約１６マーを含む。本明細書中に提
供されたパラメーターを考慮することによって、当業者は、所定の適用について
、過度な実験を伴なうことなく、適切なペプチド模倣物の長さを選択し得る。

【００４０】 ペプチド模倣物ライブラリー、ならびにその設計および合成の例は、以下にお
いて見出され得る：Ｆａｈａｄ Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉら，Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎ
ｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８，９：２０５−２２３；Ｖｉｃｔｏｒ
Ｊ．Ｈｒｕｂｙら，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ
ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐ
ｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １９９７，１：１１４−１１９；およびＡｍｙ Ｓ
．Ｒｉｐｋａら，Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃｕｒｒ Ｏ
ｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １９９８，２：４４１−４５２（すべての目的の
ために、それらの全体において、本明細書中で参考として援用される）。

【００４１】 本発明の好ましい実施形態では、タンパク質結合剤のペプチド模倣物セグメン
トは、ペプトイドである。用語「ペプトイド」は、本明細書中で使用される場合
、以下に記載されるようなＮ^α−置換アミドを含むポリマーをいう：米国特許第
５，８３１，００５号、同第５，８７７，２７８号、同第５，９７７，３０１号
、同第５，８７１，３８７号、同第５，９８６，６９５号、および同第５，７１
９，０４９号；ならびに、同時係属中の米国特許出願番号第０８／３４０，０７
３号、同第０８／８３６，１６７号、同第０８／９２０，２０５号、同第０８／
１２６，５３９号、同第０８／２７７，２２８号、同第０８／４５４，５１１号
、同第０８／４８５，１０６号、同第０９／１３２，８２８号、同第０８／４８
４，９２３号、同第０９／７０４，４２２号；ならびに、ＰＣＴ公開番号９６／
１５１４３および同９３／０９１１７（これらの各々が、すべての目的のために
それらの全体において、本明細書中で参考として援用される）。

【００４２】 アンカーセグメントは、固体表面へのアレイエレメントの安定な付着を提供す
る。この官能基は、固体表面において提示される相補基（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
ａｒｙ ｇｒｏｕｐ）に対して反応性であるように、そしてリガンド中に存在す
る側鎖に対して直交（すなわち、実質的に非反応性）であるように選択される。
アンカー基の重要な特徴は、表面に対するその反応が十分に容易であり、その結
果、それは、表面上へのロボットでのアレイスポッターによって沈着される液滴
の平均寿命の完全に範囲内になる。例えば、表面がマレイミドを提示する場合、
適切なアンカー基はチオールであり、そして約６０％湿度で約１５〜２０分間が
、約１０ｎＬ液滴の蒸発の前に結合反応を完了するために必要とされる。当然の
ことながら、液滴の寿命は、温度、湿度および他の条件に応じて変動し、これは
、より多いかまたはより少ない反応時間が行われることを可能にする。上記のよ
うに、他の表面提示／アンカーの組合せが可能であり、これには、アルデヒドま
たはケトンのアンカー基とのヒドラジド表面基が含まれる。あるいは、アンカー
基はまた、ビオチン分子であり得、これは、アビジンタンパク質を提示する表面
に対して（非共有結合性であるが）強力に付着する。

【００４３】 アンカー基は、いずれかの末端（ペプトイドの場合、Ｃ末端またはＮ末端のい
ずれか）で、ペプチド模倣物に付着し得る。これは、サブモノマー（例えば、置
換アミン）としてか、または合成後にペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）側
鎖の改変体としてのいずれかで付着され得る。あるいは、別の例では、アンカー
基が、ビーズ状固体支持体（この支持体から、合成される）にペプトイドを接続
するリンカーとして提示され得る。このリンカーは、このペプトイドに沿って樹
脂から切断されて、容易に利用可能なアンカー基を提供し得る。いくつかの例が
、２００１年４月６日付けで出願された、Ｐｅｐｔｏｉｄｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ
と表題付けられた同時係属中の米国特許出願番号第 （代理人整理番号
１６７０８．００１）（これは、その全体において、そしてすべての目的のため
に、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。

【００４４】 タンパク質結合剤分子の連結セグメントは、例えば、基板表面とペプチド模倣
物との間での分離を提供することによって、ペプチド模倣物と分析物溶液（マイ
クロアレイが接触される溶液）の成分との間の相互作用を容易にするに十分な、
固体表面とペプチド模倣物セグメントとの間の分離を提供するように選択される
。その結果、この表面は、表面で提示されるペプチド模倣物リガンドに対するタ
ンパク質結合部位に対して、特に、深い結合ポケットを有するタンパク質に対す
るペプチド模倣物の接近で（その後に）生じるタンパク質結合を阻害しない。リ
ンカーはまた、表面上で互いからペプチド模倣物を分離させるように供され得、
それによって、リガンドとタンパク質結合ポケットとの間で可能性がある立体障
害を緩和する。代表的な連結セグメントは、約２個〜約２００個の間、好ましく
は、約６個〜約３０個の間の原子の骨格を有し得る。連結セグメントは、例えば
、脂肪族鎖（例えば、アミノアルカン酸（例えば、アミノヘキサン酸））、エチ
レンオキシド、スルホキシド、もしくは「非結合」（直交性）の短いペプトイド
またはペプチドエレメント（これらは、アレイの各エレメントについて一定を保
つ）、またはこれらの成分のいくつかの組合せから構成され得る。１つの実施形
態では、２−炭素リンカーが使用され得る。別の実施形態では、３個のエチレン
オキシドが使用され得る。非結合性の短いペプトイドの例は、２マー〜１２マー
、例えば、４マーのメトキシエチル側鎖（これは、各タンパク質結合剤について
一定を保つ）であるが、ペプチド模倣物セグメントは変動可能である。適切な直
交性ペプチドリンカーは、２マー〜１２マー、例えば、５マーのグリシンである
。

【００４５】 いくつかの実施形態において、有機層が基板表面に存在する場合、スペーサー
の官能基が有機層中に構築され得る。このような場合、基板表面層中のスペーサ
ーおよびタンパク質結合剤中のリンカーが集合的に寄与して、堅い基板表面から
ペプチド模倣物を所望の間隔にする。さらに、立体障害の緩和はまた、アビジン
タンパク質（タンパク質結合剤上にビオチンアンカー基でカップリングされた）
のような特に生体適合性の形式を示す表面コーティングの選択によって達成され
得る。

【００４６】 図３は、アレイエレメント３００の小セットの例を図示する。ここで、ペプチ
ド模倣タンパク質結合セグメント３０２は、１２マーのペプチドであり、リンカ
ー３０４は、短い、脂肪族鎖であり、そしてアンカー基３０６はチオールである
。図３に示されるペプチド模倣セグメントは、本発明の実施形態に従った、ペプ
チド模倣セグメントとしてペプトイドを用いて獲得可能な親和性特性の範囲のサ
ブセットを例示する。

【００４７】 上記のように、アレイの表面上に存在する異なるタイプの結合剤の数は、少な
くとも２である。「異なる」とは、２つの異なるタンパク質結合剤の２つの異な
るペプチド模倣物の間の単量体単位の配列が同じでないことを意味する。アレイ
の表面上に存在する異なる種のタンパク質結合剤の数は、少なくとも２、少なく
とも約１０、少なくとも約５０、または少なくとも約１００であるが、これは代
表的にはより多く、一般には少なくとも１，０００、通常少なくとも約５，００
０そしてより通常には少なくとも約１０，０００である。この数は、５００，０
００程度かまたはより多いかもしないが、代表的には、約１００，０００を超え
ず、そして通常、約５０，０００を超えない。

【００４８】 タンパク質結合アレイエレメントの周囲の表面領域は、タンパク質のバックグ
ラウンドの非特異的結合を最小にするように改変され得、複合体サンプル（例え
ば、溶解液、または血清）が、単一工程において試験されることを可能にする。
この表面は、親水性末端（例えば、アルコール、炭水化物、アミノ酸、スルホキ
シド、アクリルアミド、またはエーテル）で化学的にブロックされ得る。アルコ
ール末端基の例は、マレイミド処理表面の場合、例えば、メルカプトエタノール
、メルカプトヘキサノール、メルカプト−オクタノールである。これらは、表面
上で、未処理のマレイミドをブロックする。この表面はまた、１％〜１０％のウ
シ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）もしくはヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）（
リン酸緩衝化生理食塩水中に含有）、あるいは１％〜１０％脱脂粉乳、または１
％〜１０％カゼイン、ゼラチン、または他の適切なブロッキングタンパク質の溶
液のようなタンパク質を用いてブロックされ得る。ある場合には、ブロッキング
タンパク質溶液への界面活性剤の添加が、有利である。例えば、０．０１％〜０
．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（詳細には、０．０
５％）、０．１〜２％ ＳＤＳの添加は、アッセイ開発または表面化学分野にお
いて周知である。

【００４９】 （Ｃ．アレイの一般的特徴） 代表的に、このアレイは、固体基板上に複数のタンパク質結合剤スポットを有
することにより特徴付けられる。ここで各スポットは、１つ以上の、通常複数の
、支持体表面に結合した同一の結合剤によって特徴付けられる。アレイの表面上
の異なるスポットの数は、このアレイ上の異なるタンパク質結合剤の数と同じで
あっても、そうでなくても良い。例えば、同じタンパク質結合剤が、このアレイ
表面上の２つ以上のスポットにおいて存在してもよい。いくつかの実施形態にお
いて、各タンパク質結合剤は、アレイ中で二連で存在する。結合剤の性質に依存
して、支持体表面のサイズ、製造の方法、およびこのアレイの意図された使用、
このアレイ表面上の異なるスポットの数は、大きく変化し得る。支持体表面が、
標準的な顕微鏡スライドの寸法（約３”×１”）である場合、この支持体表面上
のスポットの数は、代表的に少なくとも約３，０００、通常少なくとも約６，０
００、そしてより通常には、少なくとも約１０，０００〜５０，０００である。
この数は、１０００，０００程度か、それ以上であるが、代表的には、約７５，
０００を超えず、そして通常、約５０，０００を超えない。

【００５０】 各スポットの直径は、代表的に、約１００μｍ〜約３００μｍ、通常約２００
μｍ〜約３００μｍの範囲である。任意の２つの所定のスポットの間の間隔は、
一般に、約１μｍと約５０μｍとの間である。スポットの密度は一般に、約１〜
約５，０００スポット／ｃｍ²、通常約１００〜２，０００スポット／ｃｍ²の範
囲である。代表的に、スポットは、あるパターンの形態で、スペーサー層の表面
にわたって整列される。このパターンは、組織化された列（ｒｏｗ）およびスポ
ットの列（ｃｏｌｕｍｎ）の形態であり得る。例えば、基板表面にわたるスポッ
トの格子、基板表面にわたる一連の曲線の列（ｒｏｗ）、例えば、一連の同心の
円または半円のスポット、など。密度をさらに増大するため、このスポットはま
た六角形に整列され得る。スポットの他の整列はなお、本発明の範囲内である。

【００５１】 （２．本発明のタンパク質結合剤アレイを作製する方法） 本発明のアレイは、任意の都合の良いプロトコルを用いて調製され得る。目的
のプロトコルの１つは、以下：１）タンパク質結合剤の結合のために活性化され
た表面を有する固体支持体の獲得；および２）タンパク質結合剤が支持体表面に
安定に会合するような条件下で、支持体表面と２つ以上の異なるタンパク質結合
剤とを接触させる工程を含む。

【００５２】 （Ａ．固体支持体製造） 固体支持体は、従来の任意の方法論を用いて製造され得る。この方法論は、固
体支持体の特定の性質に依存して変化する。本発明の１つの実施形態に従って、
ガラス支持体を金属（例えば、アルミニウムまたは金）の層で被覆する。ガラス
の固体支持体を金属層で被覆するため、ガラスの表面を、薄層の金属（例えば、
金、銀、白金、銅、チタン、またはアルミニウムなど）で上記のような厚みで、
被覆する。任意の都合の良いプロトコルを用いて、基板表面に金属層を蒸着し得
る。ここで適切なプロトコルは、電子線蒸着、蒸着、スパッタリングなどを含み
、そして当業者に公知である。例えば、Ｍｏｔｅｓｈａｒｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１３２８〜１３３６；Ｂａｉｎら、Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８９）１１１：７１５５〜７１６４；Ｌｅｅら、
Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９８）１４：６４１９〜６４２３；Ｆｏｌｋｅｒｓら、
Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９２）８：１３３０〜１３４１を参照のこと。接着金属
層が、金属層と基板との間に存在し得る場合、目的の接着金属としては、上記に
ような厚みで蒸着された、チタン、クロムなどが挙げられる。さらに、二酸化ケ
イ素または一酸化ケイ素のような酸化物オーバーレイヤーが、金属層の表面への
電子線またはスパッタリングによって蒸着され得る。

【００５３】 １例としては、金基板の準備後、タンパク質結合剤のアンカー基が、チオール
であり、そして連結基が、（上記に説明したように）十分長い場合、本発明によ
るアレイは、剥き出しのクリーンな金の上に、チオール提示タンパク質結合剤を
スポットすることによって形成され得る。基板の金表面は、クロム酸清浄溶液（
例えば、酸化クロムまたは二クロム酸ナトリウム含有硫酸、例えば、Ｎｏｃｈｒ
ｏｍｉｘ（Ｆｉｓｈｅｒから入手可能）（５０〜８０％二クロム酸ナトリウム含
有１２Ｎ硫酸））を用いて浄化され得、そしてＨＰＬＣ等級の水でリンスされ得
る。これは、表面に官能基を付与する工程の数を減じる利点を有する。

【００５４】 別の実施形態において、タンパク質結合剤のアンカー基が官能化修飾シラン（
例えば、一官能性シラン、二官能性シラン、三官能性シラン（例えば、クロロシ
ラン、アルコキシシラン、ジクロロシランもしくはジアルコキシシラン、または
トリクロロシランもしくはトリアルコキシシラン））である場合、アンカー基は
、酸素含有表面（例えば、ガラス、酸化チタン、または酸化アルミニウム）に直
節結合され得る。本発明のこれらの実施形態によるアレイは、酸化基板表面上に
活性なシラン提示タンパク質結合剤をスポットすることによって形成され得る。
ガラス基板は、この結合のために利用可能な表面ヒドロキシル基を有する。金属
基板表面は、例えば、熱処理または化学処理によって、酸化され得る。例えば、
アルミニウムは、当該分野で周知のように、電気化学的に、熱的に、または化学
的に（例えば、Ｈ₂Ｏ₂を用いて）酸化され得る。さらに、二酸化ケイ素または酸
化チタンの層は、アルミニウム上に蒸着され得る。酸化物はまた、アルミニウム
またはシリコンで生じるように、ネイティブな薄層として存在し得る。次いで、
このネイティブな酸化物は、アミノ−シランによって誘導体化され得る。

【００５５】 本発明のなお別の実施形態において、金属（例えば、金またはアルミニウム）
基板表面は、まず、整列した単層を形成する官能化された有機分子で官能化され
る。有機分子の末端は、タンパク質結合剤の適切なアンカー基に結合し得る反応
基で官能化される。適切な末端基は、アンカーの官能基に依存して、例えば、マ
レイミド、ヒドラジド、アミノオキシ、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド、無水物、アルデヒド、ジスルフィド、チオール、アジド、ホ
スフィンまたはアビジン）であり得る。

【００５６】 １つの実施形態において、官能化有機分子は、アミノ修飾チオール分子である
。チオール分子を用いて金属表面を官能化するために、金属表面を有する基板を
アミノ改変チオールの溶液に浸し得る；次いで、アミノ修飾チオール溶液を、こ
の基板の表面上に蒸着させ得る。他の都合の良いプロトコルを使用し得る。代表
的に、アミノ修飾チオール分子が基板表面上の単層にアセンブルされるのに十分
な条件および時間の下で、金基板をアミノ修飾チオール溶液に浸す。接触が実行
される温度は、代表的には、約１０℃〜約１００℃、通常、約１５℃〜約８０℃
の範囲である。自己集合化した単層が金表面上に形成するのに十分な時間、接触
を維持する。ここで、接触を、代表的には、少なくとも約２０分間、通常、少な
くとも約４時間、そしてより通常には少なくとも約１６時間、維持する。

【００５７】 あるいは、アミノチオールはまた、バキュームオーブン中でか、またはスピン
コーティングによる蒸着により蒸着され得る。例えば、１〜１０％（例えば、５
％）溶液のチオール含有揮発性溶液（例えば、イソプロパノール、メタノール、
ＴＨＦ）が調製され得る。スライドを１０００〜８０００ｒｐｍ（例えば、５，
０００ｒｐｍ）でスピンして、チオールの蒸着さえ提供し得る。次いで、異種二
官能性分子（例えば、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはＬＣ（長鎖）−ＳＭＣＣ）
（これは、一端では活性化エステルであり、他方ではマレイミドである）を、ア
ミノ基と接触させて、マレイミド終端表面を作製する。他の異種二官能性架橋は
また、一端でのＮＨＳエステルと他方の端でのマレイミドとの間の、異なる長さ
のスペーサー（例えば、長エチレンオキシドスペーサー（例えば、２〜４単位）
）とともに用いられ得る。上記のように、基板上のスペーサーは、タンパク質結
合剤中の「リンカー」として、これと同じ目的で働く。

【００５８】 別の実施形態において、アルミニウムスライドを用い得る。アルミニウム金属
は、クリーンなガラス基板上に、電子線蒸着によって蒸着され得る。次いで、ア
ルミニウムを、発光または励起光の１／４の波長と同じか、それより薄い厚みで
、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）または一酸化ケイ素によりさらに上から被覆（オー
バーコート）する。約６００〜１０００オングストロームの酸化物の厚みを用い
て、結合実験を実施する前に、酸化物を薄くする必要性を排除する。アルミニウ
ム／酸化物表面を、アミノ改変シランで処理し得る。例えば、８００〜１，４０
０オングストローム層の二酸化ケイ素で新鮮に被覆したアルミニウムスライドを
、直ちに、３％〜４０％のアミノプロピルトリエトキシシラン含有イソプロパノ
ール（これは、０．２μＭフィルター膜を通して以前に濾過されている）の槽中
に浸し得、そして１時間までシラン処理し、続いてリンスおよび乾燥し得る。あ
るいは、シランで被覆したアルミニウムスライド（ＡＰＳ）は、Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄから入手する（そ
して、国際特許出願番号ＷＯ ９８／５３３０４に記載されいる）。いくつかの
場合、このような市販のスライドは、信号対雑音比を改善するための結合実験を
実施する前に、約２００Åと約１，０００Åとの間、より詳細には、約９００Å
と約１，０００Åとの間に酸化物層を薄くすることが必要であり得る。最後のア
ミノ修飾Ａ１表面は、ＳＭＣＣで官能化され得、マレイミド官能基を提示する表
面を提供する。ここで、再度、シランはまた、上記のように、蒸着されるか、ま
たはスピン被覆され得る。例えば、１〜１０％（例えば５％）溶液のシランを含
有する揮発性溶媒（例えば、イソプロパノール、メタノール、ＴＨＦ）が調製さ
れ得る。このスライドを、１０００〜８０００ｒｐｍ（例えば、５，０００ｒｐ
ｍ）でスピンして、シランの蒸着さえ提供し得る。次いで、異種二官能性分子（
例えば、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１
−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはＬＣ（長鎖）−ＳＭＣＣ）（これは、一
端では活性化エステルであり、そして他方ではマレイミドである）を、アミノ基
と接触させて、マレイミド終端表面を作製する。他の異種二官能性架橋はまた、
一端でのＮＨＳエステルと他方の端でのビオチンまたはマレイミドとの間の、異
なる長さのスペーサー（例えば、長エチレンオキシドスペーサー（例えば、２〜
４単位））とともに用いられ得る。上記のように、基板上のスペーサーは、タン
パク質結合剤中の「リンカー」として、これと同じ目的で働く。

【００５９】 さらに、この実施形態に従って、本発明によるマイクロアレイで実行したアッ
セイにおいて用いられた蛍光シグナルの増幅は、市販の官能化されたそしてスポ
ットされたアルミニウムスライド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をエッチングすることに
より増強され、酸化物層の厚みを約２００Å〜約９００Å、好ましくは約５００
Åに減少させ得る。例えば、約０．１〜０．２％ＳＤＳ／５×ＳＳＣ（０．７５
Ｍ ＮａＣｌ／０．０８５Ｍクエン酸ナトリウム）および必要に応じて５ｍＭ
ＥＤＴＡのエッチング溶液を、約５０〜８０℃、好ましくは約６０℃で、約２〜
４時間適用し得る。上記のように、二酸化ケイ素層の適切な厚みの手動による蒸
着は、スライドを薄くすることの必要性を排除し得る。

【００６０】 上記のように、基板表面が、有機の自己集合化した単層を有する場合、最初の
単層の自己集合化後、１つ以上のさらなる単層を最初の単層上に移植し得る。こ
こでさらなる層を分子（例えば、アルキル基）から作製する。この分子は、最初
に蒸着された単層の表面官能基（例えば、アミノ官能基）に共有結合を提供する
官能基を有する。ここで最初に蒸着された単層は、カルボキシ官能基の存在によ
って特徴付けられる。あるいは、複数成分のスペーサーが、表面への結合の前に
構築され得る。

【００６１】 （Ｂ．タンパク質結合剤の合成） 上記のように、本発明によるタンパク質結合剤は、以下の３つのセグメントか
ら構成される：ペプチド模倣物、アンカー、ならびにペプチド模倣物とアンカー
とを接続するリンカー。

【００６２】 ペプチド模倣物は、それが天然のペプチドの生物学的効果を模倣し得る限り、
種々の非ペプチドポリマー構造および特徴を有し得る。ペプチド模倣物構造に対
する言及は、上記に与えられている。本発明の１つの実施形態において、タンパ
ク質結合剤のペプチド模倣物セグメントは、ペプトイドである。

【００６３】 ペプトイドのライブラリーは、カリフォルニア州、エメリービルのＣｈｉｒｏ
ｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが開発したような、自動的な（ｒｏｂｏｔｉｃ）固
相合成技術を用いて合成され得る。このライブラリーの密度は、上記に援用され
た米国特許文書に記載のように、ペプチド合成において用いられるアミンサブモ
ノマー（ブロム酢酸および置換アミン）の性質および配列によって制御され得る
。図２に例示されるように、ライブラリーは、ミックス合成およびスプリット合
成２０２、またはパラレル合成を用いるプロセス２００に従って調製され得、そ
の結果、合成されたペプトイドには多重性が存在するが、所定のビーズ上のペプ
トイドは１種しか存在しない（すなわち、各ビーズは、何度も反復される、１つ
の特有の化合物を有する）。１ビーズあたりの化合物の量は、約１〜１００ナノ
モルにわたり、最も代表的には２０〜４０ナノモルである。１ビーズあたり、約
４０ナノモルが通常得られる。このプロセスはさらに、米国特許出願第０９／３
０６，７００号に記載されており、この開示は、全体としてそして全ての目的の
ために、本明細書において参考として援用される。次いで、合成されたペプトイ
ド（依然としてレジンに結合した）を、例えば、ここで参照したばかりの米国特
許出願に記載のビーズピッキング（ｂｅａｄ ｐｉｃｋｉｎｇ）技術を用いて、
９６ウェルプレート（または他の複数ウェルプレート（例えば、３８４ウェルプ
レートまたは１０２４ウェルプレート））２０４に分配し得る。「大ビーズ（ｂ
ｉｇ ｂｅａｄ）」樹脂（約５００μの直径を有する）の使用により、１ウェル
あたり１ビーズの分配が可能になる。

【００６４】 次いで、このペプトイドを乾燥し、（例えば、約２０〜９５％ＴＦＡ含有ジク
ロロメタン；代表的には９５％である）を用いて）樹脂から切り離し、アセトニ
トリル／水に再溶解し、濾過または遠心分離し、乾燥して、５０％ＤＭＳＯ／５
０％緩衝液に再溶解し得る。他の溶媒／緩衝液システムはまた、ＰＢＳ、ＴＢＳ
、ボラート、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどである残留物を有する、例えば、５０％ＤＭ
Ｆ、または５０％ＮＭＰを用い得る。ある場合には、ｔｒｉｓ−カルボキシエチ
ルホスフィン（ＴＣＥＰ）のような還元剤をまた、スポッティングプレートのウ
ェルに添加して、ペプトイド上のチオールの酸化を阻害し、その結果ペプトイド
は、基板表面上のマレイミドに対する反応性を保持する。ＴＣＥＰがウェルに添
加される場合、ＰＢＳのようなリン酸緩衝液は、回避されることになり、そして
ＴＢＳのような緩衝液が好ましい。この最終溶液はスポッティングが容易である
。

【００６５】 本発明の１つの実施形態において、スポッテイングプレートのウェル中のペプ
トイドの濃度は、約０．５〜２ｍＭの範囲でなければならず、ここで２ｍＭが好
ましい。調製した平坦な固体支持体２０６上にスポットするために、以下にさら
に詳細に記載されるように、このペプトイドを濾過するかまたは遠心分離し、乾
燥し、そして再懸濁する。スライド上にスポットされた物質が、マイクロアレイ
に適用されるべき溶液中のプローブの量に対して過剰に存在することが有用であ
る。これは、飽和蛍光シグナルを与える量であり、その結果シグナル強度の変化
は実質的にタンパク質レベルに依存する。

【００６６】 アンカー基およびリンカー基は、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかでペプトイド
に結合し得る。これらは、参考として援用される特許文書に上記されるようにペ
プトイド合成の間、サブモノマー（例えば、米国特許第５，８７７，２７８号お
よび上記に参考された同時係属米国特許出願番号＿＿＿（弁理士整理番号１６７
０８．００１）に記載のように）として、または当業者に公知の手順に従って、
合成後のペプトイドの改変体として、インサイチュ活性化アミノ酸カップリング
工程を用いるかのいずれかで結合され得る。

【００６７】 Ｎ末端結合のために、ペプトイドを樹脂上で合成し得、次いでこのリンカーお
よびアンカー基を、分子全体が切断される前に、付加し得る。例えば、ペプトイ
ドは、本明細書において参考として以前に援用された同時係属出願番号０９／７
０４，４２２号に例示および記載されるように、Ｒｉｎｋアミドポリスチレン樹
脂上に調製され得る。この合成手順はまた、Ｆｉｇｌｉｏｚｚｉ，Ｇ．Ｍ．Ｇｏ
ｌｄｓｍｉｔｈ，Ｒ，Ｎｇ，Ｓ．Ｃ．，Ｂａｎｖｉｌｌｅ，Ｓ．Ｃ．，Ｚｕｃｋ
ｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９６，２６７：
４３７〜４４７（この開示は、本明細書において参考として、全ての目的のため
に援用されている）に報告されている。また、切断前に、１つ以上の（例えば、
２〜４、好ましくは４）のサブモノマー親水性リンカー基（例えば、メトキシエ
チルアミン）が、ペプトイドＮ末端に付加され得る。次いで、トリチル保護シス
テアミンを付加し、チオールアンカー基を提供する。次いで、結合したリンカー
およびアンカー基を有するペプトイドは、例えば、９５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）含有
ジクロロメタン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）を用いて、樹脂から切り離され得る。その結果、
得られた溶液は、本発明によるマイクロアレイスライド上に適用（スポット）す
るのが容易である。

【００６８】 別の実施形態において、ＦＭＯＣ保護βアラニンを、ペプトイド合成の当業者
に公知であるように、ＨｏｂｔおよびＤＩＣを用いたインサイチュ活性化により
ペプトイドのＮ末端に結合する。βアラニンは、ペプトイドとペプトイドリンカ
ーとの間のアダプター分子として、機能する。βアラニンの結合後、ペプトイド
（例えば、グリコール）リンカー上のＦＭＯＣ保護アミノ酸は、例えば、βアラ
ニンのＮ末端に結合される。最終的に、ビオチンは、ペプチドカップリングによ
りＮ末端に付加される。

【００６９】 チオールまたはビオチンのアンカー基はまた、Ｃ末端のペプトイドの末端に付
着され得る。例えば、４−（ジフェニルヒドロキシメチル）安息香酸（Ｆｌｕｋ
ａから入手可能）を、酸触媒の存在下でシスタミン塩酸塩を用いて処理する。次
いで、得られたアミンを、Ｎ−（９−フルレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−Ｆ
ＭＯＣ）誘導体として保護し、そして得られたＦＭＯＣ−ＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｓ
−Ｔｒ−ＣＯＯＨを、アミノメチル−Ｂｉｇ-ビーズ（４００−５００ミクロン
、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ）にカップリングする。ペプトイドを、上記のよう
に脱保護したアミン上で合成し、そしてＴＦＡを用いた処理は、樹脂からのチオ
ール−改変ペプトイドの切断を生じる一方で、樹脂上のトリチル保護基を残す。
このような手順は、上で参照される同時係属出願である米国特許出願番号＿＿＿
＿（代理人番号ＰＰ１６７０８．００１）に記載される。

【００７０】 （Ｃ．固体支持体とタンパク質結合剤との接触） 基板およびタンパク質結合剤の調製の後、上記のように、表面に結合されて、
アレイを生じる目的の２つ以上の異なるタンパク質結合剤を官能化した基板表面
、または他の方法で調製した（洗浄した、酸化したなど）基板表面と接触させる
。接触とは、結合剤を表面近くに導き、その結果これらを、基板層の表面に対し
て実質的に安定に付着または結合させること意味する。

【００７１】 結合剤と基板表面との接触において、上記のような結合剤スポットの所望のパ
ターンを生じる表面と結合剤と表面との接触についての任意の簡便な手段が、例
えば、スポッティングによって用いられ得る。上記のように、本明細書中で用い
られる用語「接触」は、支持表面の近くに近接して結合剤を導く任意の方法をい
う。一般に、結合剤の水溶液（例えば、水、水／有機溶媒（例えば、５０／５０ 水／ＤＭＳＯなど））を、接触の間に用いる。ここで、この溶媒は、水および
結合剤に加えて、１つ以上の成分（例えば、緩衝剤、塩など）を含み得る。他の
系は、５０／５０ ＮＭＰ／ＴＢＳ、ＤＭＦ／ＴＢＳ、ＮＭＰ／ＰＢＳ、ＤＭＦ
／ＰＢＳ、または水を伴う全てのこれらの溶媒を含む。５０／５０混合液もまた
調製され得る。例えば、より高い割合のこの水溶液を用いる場合、液滴サイズは
、この溶液のより高い表面張力に起因してより小さくなる。液滴サイズ（従って
密度）をある程度までこの様式で調整し得る。代表的には、接触を、支持体表面
の別々の位置に異なる結合剤の溶液を沈着さることにより達成し、その結果、結
合剤の各々の異なる型を、基板表面上のそれ自身の固有の位置に沈着させる。

【００７２】 結合剤を、任意の簡便な手段を用いて（例えば、ピペッティングにより）支持
体表面上に沈着させ得る。多数のデバイスおよびプロトコルが、支持体表面の正
確な位置上に水溶液を沈着させるために開発されており、そして本発明の方法に
おいて用いられ得る。このようなデバイスとしては、「インクジェット」印刷デ
バイス、機械式沈着デバイス、またはピペッティングデバイスなど（例えば、米
国特許第４，８７７，７４５号；同第５，３３８，６８８号；同第５，４７４，
７９６号；５，４４９，７５４号；同第５，６５８，８０２号；同第５，７００
，６３７号；および同第５，８０７，５５２号、を参照のこと、これらの開示は
本明細書中で参考として援用される）が挙げられる。支持体の別々の位置上に水
性容積を正確に沈着させるための自動デバイス（すなわち、アレイ）はまた、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ
ｃｓ；Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；およびＢｉｏＲｏ
ｂｏｔｉｃｓを含む多数の販売元から市販されている。あるいは、Ｏｋａｍｏｔ
ｏ、ＳｕｚｕｋｉおよびＹａｍａｍｏｔｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、第１８巻（２０００年４月）、４８３により最近記載されているバブ
ルジェット（登録商標）技術が、用いられ得る。

【００７３】 上記のように、本発明に従うプロセスの重要な特徴は、タンパク質結合剤上の
アンカー基と基板表面との間の反応が十分容易であり、その結果、表面上の自動
アレイスポッターにより沈着させた液滴の平均寿命内で完了されることである。
例えば、この表面を官能化し、そしてマレイミドを提示する場合、適切なアンカ
ー基はチオール基であり、そして約６０％の湿度にて約１５−２０分が結合反応
の完了に必要とされる。上記のように、他の表面提示／アンカーの組合せが可能
である（これらは、安定で、さらに電子対を共有しない結合を形成する組合せ（
例えば、アビジンおよびビオチン）を含む）。

【００７４】 （Ｄ．チップのブロッキング） アレイ基板（チップ）上へのペプトイドライブラリーのスポッティングの後、
残留するチップの未コートの表面を、親水性末端を提示する分子で官能化し得る
。これらの親水性末端は、複合体混合物のタンパク質の非特異的結合を減少また
は排除することが予想される。この親水性タンパク質は、アルコール、糖質、ア
ミノ酸、スルホキシド、アクリルアミド、およびエーテル、または他の低タンパ
ク質結合基のような親水性末端を有する、アルコール、スルホキシド、糖質、ア
クリルアミドから構成され得る。親水性提示分子を、既にスポットされているペ
プトイドと同じ様式でチップに係留する。例えば、ペプトイドライブラリーを用
いてスポッティングしたチップは、システイン、メルカプトエタノール、または
他の安定な親水性チオールを用いてブロッキングされ得る。このチップをまた、
２％ＢＳＡ／ＰＢＳ、１０％脱脂粉乳またはカゼインのようなタンパク質を用い
て、少なくとも１時間ブロックして、水でリンスし、そして乾燥し得る。他の可
能なブロッキング剤は、上で述べられている。このブロッキング剤を、チップに
当業者に周知の方法（例えば、チップをブロッキング剤の溶液中に浸漬すること
によるか、チップの表面をブロッキング剤溶液でペイントすることによるか、ま
たはスピンコーティングすることによる）で適用し得る。

【００７５】 （Ｅ．要旨） 図４Ａおよび図４Ｂは、上記の手中に従う本発明のいくつかの実施形態のため
のタンパク質結合剤アレイを作製するためのプロセスを簡単に示す。図４Ａにお
いて、タンパク質結合剤が、露出した平面状の基板の無機表面に直接結合される
アレイを作製するプロセス（４００）を示す。金表面またはアルミニウム表面を
有する平面状の基板４１２を提供する（４１０）。この表面を上記のように結合
（洗浄）するために調製する。チオールアンカー基４３４を有するタンパク質結
合剤４２２を、基板４１２上にスポットする（４２０）。一旦、タンパク質結合
剤の結合が完了すると、ブロッキング剤４３２、すなわち、アルコールのような
親水基、またはタンパク質が、基板４１２の表面に適用される。ここで、タンパ
ク質結合剤４２２は結合されない（４３０）。

【００７６】 図４Ｂにおいて、タンパク質結合剤が有機層を介して平面状の基板の表面に結
合するアレイを作製するためのプロセス（４５０）を示す。金表面またはアルミ
ニウム表面を有する平面状の基板４６２を提供する（４６０）。この表面を上記
のように官能化したアミノ改変チオールまたはアミノ改変シラン層４６４を適用
することによる結合のために調製する。この層４６４は、基板４６２の金表面ま
たはアルミニウム表面に結合するチオールまたはシラン官能基４６６、および引
き続いてタンパク質結合剤を結合するための結合官能基４６８（例えば、マレイ
ミド）を含む。基板表面層結合官能基４６８に相補的なアンカー官能基４７４を
有するタンパク質結合剤４７２を、基板上にスポットする（４７０）。一旦、タ
ンパク質結合剤の結合が完了すると、ブロッキング剤４８２、すなわちアルコー
ルのような親水基、またはタンパク質が、基板表面に適用される。ここで、タン
パク質結合剤４７２は結合されない（４８０）。

【００７７】 （３．本発明のタンパク質結合剤アレイの使用の方法） 本発明のアレイは、アレイの表面結合剤と試験サンプルにおける目的の分析物
との間の結合事象が検出される、種々の異なる適用における用途を見出す。換言
すれば、本発明のアレイは結合アッセイにおける用途を見出す。このような適用
では、支持体結合剤は、一般に、試験サンプルにおける分析物「プローブ」につ
いての「標的」として作用する。分析物プローブは、代表的には、標識される。
例えば、ここで、標識は、直接的に検出可能な標識（例えば、放射性同位体、蛍
光標識、化学発光標識など）、または間接的に検出可能な標識（例えば、標識抗
体についてのリガンドのようなシグナル生成系のメンバー、ここで、この標識は
、基質を色素源産物へと転換するなど酵素的であり得、ここで、この標識抗体は
二次標識抗体であり得る）であり得、その結果、結合事象は、容易に検出され得
る。

【００７８】 特に、本発明のアレイに従って、複合体タンパク質サンプルのプロテオミクス
分析を行う際に有用である。本明細書中で用いられる場合、プロテオミクスとは
、サンプル中の１つ以上のタンパク質の分離および／または定量および／または
同定である。サンプルは、細胞（例えば、細胞の細胞質ゾル、膜、または細胞外
タンパク質）、組織（例えば、解剖またはレザー顕微解剖した）、体液（尿、血
液、脊髄液）、あるいはタンパク質を含む任意の他のサンプル由来である。この
ような分離／定量／同定の結果、薬物スクリーニングのための新規のタンパク質
標的、診断のためのタンパク質、またはアッセイもしくはタンパク質精製のため
の新規の合成リガンドを生成し得る。このアレイは、異なるタンパク質結合アッ
セイにおいて非常に有効に用いられ得る。例えば、複合体タンパク質混合物の２
（以上）−色素蛍光標識、および蛍光イメージングによるアレイに結合する異な
るタンパク質の分析を行い得る。下記のように、このアレイを他の技術と組み合
わせて用いて、配列を同定し、そして目的の示差的に発現されたタンパク質また
はペプチドを構造的に同定し得る。このアレイをＤＮＡアレイと並行して実行し
、かつ異なる結合結果比較して、遺伝子活性とタンパク質発現との間の相関関係
を同定し得る。また、混合アレイ（ここでアレイを作る分子は抗体などを含む）
を調製し、そして結合アッセイを行うために用い得る。

【００７９】 種々の技術を用いて、本発明に従うアレイ（プロテオミクスアレイ）を用いる
異なる結合アレイを行い得る。本発明の実施形態において用いられる場合のこれ
らの技術のいくつかを、以下に記載する： （Ａ．タンパク質標識） 複合体タンパク質サンプルを標準的な技術を用いて標識する。これらの技術の
多くは、タンパク質混合物の２−Ｄゲル分析のための開発されている。例えば、
サンプルＡは、アミン反応性シアニン３色素（「Ｃｙ３」）（λ_ex＝５５０ｎｍ
／λ_em＝５７０ｎｍ）で標識され、そしてサンプルＢは、アミン反応性シアニン
５色素（Ｃｙ５）（λ_ex＝６５０ｎｍ／λ_em＝６７０ｎｍ）で標識される（色素
試薬はＡｍｅｒｓｈａｍ-Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。サンプルＡおよ
びＢは、例えば、正常または罹患した、処置または未処置などの、組織または細
胞株にそれぞれ由来する。未反応色素を、標準的な方法（例えば、ゲル濾過、透
析など）を用いて標識タンパク質から分離し得る。勿論、上記のように、テトラ
メチルローダミン−イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセイン−イソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびこれらのスクシジミジルエステル誘導体、
またはアミノ酸側鎖（例えば、アミノ側鎖（リシン）、チオール側鎖（システイ
ン）、または他の安定な官能基を介してタンパク質に反応し得る他の色素分子を
含むがこれらに限定されない、種々の異なる標識は、当業者に公知である。

【００８０】 （Ｂ．結合アッセイおよびチップ読み出し） 標識タンパク質サンプルは、プロテオミクスマイクロアレイチップと共に、ア
レイの要素に対する種々のタンパク質のアフィニティーを調節すると予想される
、時間、かつ種々のｐＨ、塩含有量、および温度の条件下でインキュベートされ
る。一般に、サンプルは、アレイ表面上の適切な容量の液体サンプルの導入によ
りマイクロアレイと接触される、ここで、導入とは、サンプルと表面の充満、表
面上のサンプルの沈着（例えば、ピペットを用いる）、サンプル中のアレイ全体
の浸漬などである。多くの実施形態では、溶液は表面上に沈着され、次いでスラ
イドガラスの下、またはシールされたチャンバ中に挟まれる。

【００８１】 例えば、各プローブ溶液の２５μＬ−１００μＬ（代表的には、５０μＬ）の
アリコートを代表的な顕微鏡スライドサイズのチップの表面に適用し得、そして
洗浄したカバーガラスを上部に配置し、チップ表面上のプローブ溶液のサンドイ
ッチを形成する。次いで、このタンパク質溶液を、チップと共に少なくとも１時
間、または一晩同時インキュベートする。インキュベーションの後、カバーガラ
スを取り出し、そしてチップを、例えば、１Ｘ ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ
または界面活性剤を含む他の適切な緩衝液の中で洗浄する。このチップをストリ
ンジェンシーを減少または増加する種々の条件を用いて洗浄し得る。これらの条
件を再びカスタマイズして、例えば、最も強結合したタンパク質のみの保持を可
能にする。あるいは、保証される場合、より低いストリンジェンシーの洗浄を用
いて、比較的弱い結合タンパク質の可視化を可能にし得る。この選択は、チップ
およびタンパク質混合物の特性に提示される、ペプチド模倣物（ペプトイド）ア
レイの複雑性および多様性により決定されるようである。次いで、洗浄したチッ
プを、例えば、アルゴンまたは窒素の気流下で乾燥する。

【００８２】 適切な洗浄の後、チップを、当業者に周知であるようなアレイスキャナーで読
み取る。各スポットについてのＣｙ３対Ｃｙ５の割合を、市販のソフトウェアを
用いて決定する。あるスポットよりも、かなり高いまたは低い割合を示すスポッ
トを観察し、そして「示差的」であると考えた。

【００８３】 図５は、上記の手順に従う本発明の１つの実施形態についてのタンパク質結合
剤アレイを用いる異なるプロテオミクス結合アレイを行うためのプロセスを簡単
に示す。図５において、プロセス（５００）は、比較のために２つの生体サンプ
ル（例えば、「未処理」細胞株５０２ａおよび「処理」細胞株５０２ｂ）の獲得
で開始する。細胞溶解物５０４ａ、ｂを細胞株サンプルから単離する。この溶解
物を標識する。例えば、「未処理」細胞溶解物５０４ａを、蛍光緑色色素で標識
し、一方「処理」細胞溶解物５０４ｂを蛍光赤色色素で標識する。次いで、標識
サンプル５０６ａ、ｂを、本発明に従うタンパク質結合アレイチップ５０８（例
えば、ペプトイドのアレイ）上で同時インキュベートする。サンプル中のタンパ
ク質は、変性またはネイティブのいずれかであり得る。１−２％ＳＤＳの添加を
伴う例は、サンプル中のタンパク質を変性させ得、そしてクラスターまたは疎水
性相互作用を最小化または排除し得る。あるいは、このクラスター（これはタン
パク質間結合経路において重要であり得る）およびタンパク質は、ネイティブ状
態および研究した結果を維持し得る。次いで、このチップをアレイスキャナーで
読み取る。

【００８４】 （Ｃ．ライブラリー配列決定） 示差的に発現されるタンパク質を結合するペプチド模倣物の配列、ライブラリ
ー配列決定技術により決定し得る。これを、アミド骨格に沿うペプトイドのフラ
グメント化を可能にする、例えば、ＭＳ／ＭＳ法により達成し得る。これらの方
法は、同時係属の米国特許出願番号０９／５８０，３８０において記載される（
この開示は、本明細書中で参考として援用される）（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／
７２００４もまた参照のこと）。フラグメント化生成物の質量から、単離したペ
プトイドの構造および配列を決定し得る。

【００８５】 （Ｄ．アレイ処理後：タンパク質の単離、精製、および同定） 一旦、タンパク質またはタンパク質のセットをサンプルＡとＢとの間で異なる
ことを決定すると、チップ上で同定される同じペプチド模倣物（例えば、ペプト
イド）から構成されるクロマトグラフィー支持体調製することにより単離し得る
。ペプトイドベースのクロマトグラフィー支持体（これらの調製およびこれらの
使用は米国特許出願番号０９／７０４，４２２に記載される）は、既に本明細書
中で参考として援用されている。

【００８６】 本開示の１つの実施形態に従って、チップ上の差異を生じるペプトイド配列を
、ペプトイド合成の間、疎水性「マスク」される親水性樹脂上で合成し得る。合
成の後、「非マスク」における樹脂は、生物学的溶液と適合性の親水基を示す。
このような樹脂は、タンパク質結合／単離実験に即座に利用可能である。

【００８７】 一旦、タンパク質が単離されると、その配列は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分析
またはトリプシン消化のような標準的な技術を用いて決定され得る。

【００８８】 図６は、上記および下記の手順に従うアレイ処理後の局面を簡単に示す。図６
において、プロセス（６００）は、本発明に従うプロテオミクスマイクロアレイ
を用いて行ったプロテオミクス示差的結合アッセイにおける目的物として同定さ
れる、ペプチド模倣物剤６０１（例えば、ペプトイド）を用いるクロマトグラフ
ィー分離カラム６０２の調製で開始する。次いで、マイクロアレイ上で本来実行
される複合体サンプルのアリコートを、カラムを介して実行する。目的のタンパ
ク質は、カラムに優先的に結合し、そしてそれによって、サンプルの他の成分か
ら分離される。結合タンパク質を溶出し、そして次いで、さらなる分析６０４（
例えば、タンパク質配列決定、三次構造決定など）に用いる。さらに、タンパク
質の同定に関するデータを、さらなる研究についてのバイオインフォマティクス
データベースに入力する。

【００８９】 あるいは、示差的に発現されるタンパク質を結合する同じペプトイドを、チッ
プ上に繰り返しスポットし得、そして同じ溶解物のアリコートと共にインキュベ
ートし得る。同じタンパク質は、アレイ（しかし、本来のチップ上の１つのスポ
ットよりもはるかに大きい面積）に結合すべきである。次いで、レーザー脱離質
量分析を用いて、チップから直接タンパク質を配列決定し得る。

【００９０】 （Ｅ．他の適用） 本発明に従うプロテオミクスマイクロアレイの予想される用途は、広範である
。一般に、この適用は、別の複合体の混合物に対してある複合体の混合物におい
て、過剰発現または過少発現される（または診断タンパク質の場合のように、存
在／非存在する）タンパク質またはタンパク質のセットの同定に共通点を有する
。当業者は、本発明の実施形態が、サンドイッチアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ
）を含む広範な種々のアッセイ形式と適合性であることを認識する。

【００９１】 上記のように、プロテオミクスマイクロアレイを用いて、比較されるべき２つ
以上のタンパク質溶液を二者択一的に標識する（例えば、あるサンプルについて
Ｃｙ３および別のサンプルについてＣｙ５）ことにより、複合体溶液におけるタ
ンパク質の示差的発現を測定し得る。このチップを用いて、より遅い高処理能ス
クリーニングアッセイにつてい新規のタンパク質を見出し得る。別の特に強力な
適用において、この方法論は、特定の宿主（例えば、酵母またはバキュロウイル
ス）において過剰発現される組換えタンパク質を精製するために用いられ得る。
発現したタンパク質を含むサンプルを、チップ上に二者択一的標識サンプルを同
時に結合させ、そして差異を探すことにより、発現したタンパク質を含まないサ
ンプルと比較する。この手順は、発現したタンパク質に対して都合のよいアフィ
ニティーおよび特異性で結合するアレイ上のペプトイドを同定する。次いで、こ
れらのサンプルペプトイドは、目的の組換えタンパク質の単離および精製のため
のクロマトグラフィー樹脂を作製するために用いられる。

【００９２】 類似の様式で、プロテオミクスマイクロアレイチップは使用され得、癌、ＨＩ
Ｖまたは糖尿病のような特定の疾患状態を診断し得る、血漿または血清中にタン
パク質マーカーを見出し得るか、または薬物スクリーニングのための新規の標的
を見出し得る。また、一旦、特定の群のタンパク質についてのリガンドのセット
が同定されると、これらのタンパク質の発現レベルのモニタリングが可能になり
、薬物の作用機構を解明する。この点において、新しいリガンドは、抗体がタン
パク質の存在量を決定するために、現在使用される方法と同じように、タンパク
質の存在量のプローブとして使用され得る。さらに、細菌またはウイルスのビル
レント株および非ビルレント株由来のタンパク質を試験することによって、感染
性疾患を生じる独特のビルレンス因子を決定し得る。一旦、これらのビルレンス
因子が同定されると、これらのタンパク質は、新規の抗菌薬剤または抗ウイルス
薬剤をスクリーニングするための標的として同定され得る。あるいは、本発明に
よって提供されるチップはまた、種々のペプチド、抗原、またはタンパク質模倣
物を見出すために使用され得る。例えば、クロマトグラフィー支持体として使用
され得る新規の模倣細胞性接着分子、模倣薬剤候補物、またはタンパク質模倣物
。さらに、チップにスポットされた物質は、それ自体で潜在的な薬剤候補物であ
る得るか、または新規の薬剤候補物を設計するための初めの骨格として機能し得
る。このような実施形態において、潜在的な治療因子を同定するための高処理能
アッセイは、チップ上で直接行われ得る。

【００９３】 １つの実施形態において、本発明のプロテオミクスマイクロアレイは、ＤＮＡ
アレイと平行してなされ、そして各々に由来する示差的な結合結果は、遺伝子活
性およびタンパク質発現における相関関係を同定するために比較される。例えば
、示差的結合アッセイは、複雑な生物学的サンプルについて、プロテオミクスア
レイおよびＤＮＡアレイの両方で行われる。サンプル由来の別のアリコートを標
識し、そして本発明によるプロテオミクスマイクロアレイおよび当該分野で周知
のＤＮＡマイクロアレイと接触させる。プロテオミクスアレイ上の結合結果によ
って証明された示差的なタンパク質発現は、ＤＮＡアレイについての結合結果と
比較された場合、発現するために活性化が必要である、タンパク質発現および遺
伝子ファミリーとの間の関係を解明し得る。

【００９４】 本発明の別の実施形態において、本発明の「混合アッセイ」チップを提供する
。チップ表面に付着されたペプトイドまたは他のペプチド模倣物の結合エレメン
トは、抗体またはタンパク質結合エレメントと混合され得、両方の型の結合エレ
メントは、同じチップ上に存在する。抗体は、ポジティブコントロールとして機
能し得るか、または分析される混合物中の特定のタンパク質のレベルのモニタリ
ング手段として機能し得る。ペプトイドは、未知のタンパク質における差のデー
タを提供するが、チップ上の抗体スポットは、既知のタンパク質の差レベルのデ
ータを提供する。例えば、細胞が特定の薬剤で処置された場合、タンパク質レベ
ルは、上昇するか減少し得る。これらのタンパク質が、既知の抗体を有する場合
、抗体の差を用いたこれらの変化のモニタリングが可能になり、同時に、ペプト
イドの差を用いた未知のタンパク質における変化を検索することが可能になる。

【００９５】 この技術の１つの実施例において、抗体溶液は、ペプトイド溶液と同じマイク
ロタイタープレート（しかし、異なるウェル）に調製される。ペプトイドは、す
でにチオールアンカー基で官能化されている。抗体は、還元剤と反応し、抗体の
ヒンジおよびＦｃ領域におけるジスルフィド結合を減少し、従って、抗体にチオ
ールを産生する（例えば、Ｌｅｖｉｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ら（１９６９），Ｅｘｐｅ
ｒｅｎｔｉａ，第２５巻、１２６〜１２７およびＢｌａｕｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．
ら（１９９５）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．，第２２巻、６９０〜
６９８に記載されるように）。このことは、同じスポッティングセッションにお
いて、ペプトイドおよび抗体の両方のスポッティングを可能にし、それによって
「混合」チップを作製する。あるいは、抗体は、チップ表面上の固定化プロテイ
ンＡまたはプロテインＧに結合し得るが、ペプトイドは、アビジンまたはストレ
プトマイシンに付着され、ディスプレイのための混合表面を提示する。あるいは
、抗体は単に、ビオチン化され得、ビオチン化ペプトイドまたはペプチドと一緒
に、アビジンでコーティングされたチップ上にスポットされる。

【００９６】 本発明のプロテオミクスマイクロアレイ技術と組合わされ得る別の技術は、Ｍ
Ｓ／ＭＳ高分子構造分析技術であり、上記参照された米国特許出願番号第０９／
５８０、３８０に記載され、本明細書中に以前に参考として援用される。この方
法において、技術の組合せは、目的のタンパク質を同定するため、それを濃縮お
よび単離するため、そのタンパク質を配列決定するため、そしてその４次タンパ
ク質構造の側面を解明するために使用され得る。

【００９７】 目的のタンパク質の同定およびポストアレイプロセシングに関するデータはま
た、バイオインフォマテックスデータベースに入力され得る。このデータは、さ
らなる研究のために、その中の他の生物学的データと対応され得る。

【００９８】 （４．キット） 本発明によって提供されるのはまた、対象のアレイを使用するプロテオミクス
結合アッセイを行うためのキットである。本発明によるこのようなキットは、本
発明に従うアレイを少なくとも含む。このキットは、分析または診断目的のため
に構成され得、そして、さらに、アレイが意図される方法において使用される１
以上のさらなる試薬を備える。例えば、キットは、プロテオミクス結合アッセイ
を行うのに必要な種々の容器、標識、緩衝溶液、ツールおよび任意の他の物質を
含み得る。本発明によるキットはまた、分析のためのサンプルを受けるために構
成され得、その後、さらなるユーザーの操作なしで、本発明に従う結合アッセイ
に必要な工程を行う。

【００９９】 （実施例） 以下の実施例は、本発明に従うプロテオミクスアレイの合成および特性、それ
らの成分、および適用に関する詳細を提供する。以下は代表のみあり、そして本
発明は、これらの実施例に示される詳細に限定されないことが、理解されるべき
である。

【０１００】 （実施例１：ウエルあたり１つの化合物を含むマイクロタイタープレートの調
製） １：１ＤＭＳＯ／ＰＢＳ溶液中の９６の単独の化合物（０．８ｍＭ）を含む１
つの（１）９６ウェルプレートの調製：シリコン処理したバイアル（８ｍｌ、２
ドラム）を、Ｒｉｎｋポリスチレンマクロビーズ固体支持体上で合成された、合
計１２１の可能な化合物を含む、１化合物／ビーズライブラリーでロードした（
６６ｍｇ、約１３２０ビーズ、４０ナノモル／ビーズ、０．７５ｍｍｏｌ／ｇ、
４２５−５００ｕｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。ビーズを
、ジクロロエタン（ＤＣＥ、４ｍｌ）中で、２４時間膨潤させ、そしてステンレ
ス鋼メッシュ（６００ｕｍ）で篩にかけた。得られたジクロロエタンビーズスラ
リーを使用して、９６ビーズを個別に選択し、そしてポリプロピレン９６ウェル
プレート（２００μＬ、円錐形の底）に再配置し、９６ウェルについて、ウェル
あたり１ビーズを得た。生じた９６ウェルプレート（「グランドマザー」プレー
ト）を、９６ウェルキャリアローターを備えたスピードバックエバポレーターＳ
ａｖａｎｔ ＡＥＳ２００に移し、そして残りのＤＣＥをプレートから除去した
。次いで、切断カクテル（ＴＦＡ／ＴＥＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＣＥ、４６：２：２：５
０、７５μＬ）をプレート内の各ビーズ含有ウェルに添加した。１時間後、プレ
ートを、スピードバックエバポレーターに移し、ほとんどの揮発性物質をプレー
トから除去した。各ウェルを、アセトニトリル（ＣＨ₃ＣＮ、１０μＬ）で処理
し、マイクロタイタープレート振盪機を使用して、１０分間攪拌した。プレート
をスピードバックエバポレーターに移し、そして残りの揮発性物質を１０分間プ
レートから除去した。各ウェル内の各々の単独の化合物を、ジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ、２５μＬ）に溶解し、そして、ポリプロピレン膜（０．４５μｍ
）を備えた、ポリスチレン製の９６ウェルフィルタープレートに再配置した。そ
の９６ウェルフィルタープレートを、ポリプロピレン９６ウェルプレート（２０
０μＬ、円錐形の底）に積み重ね、そしてアセンブリを、１５°で３０００ＲＰ
Ｍ（約２０００Ｇ）で５分間のプログラムを組み込まれたＢｅｃｋｍａｎ ＧＳ
−６Ｒ遠心分離機に移した。

【０１０１】 この手順は、９６ウェルにおける１化合物の濾過された９６ＤＭＳＯ溶液（１
．６ｍＭ）からなる「マザー」プレートを提供する。「ドータープレート」（ス
ポッティングに使用される）を形成するために、各ＤＭＳＯ溶液（５μＬ）のア
リコートを、ポリプロピレン９６ウェルプレート（２００μＬ、円錐形の底）に
移した。次いで、ドータープレートの各ウェルを、脱気溶液ＰＢＳ（５μＬ）を
用いて混合し、そして−２０℃に保存した。あるいは、各ウェルにおける各化合
物を、２０μＬの５０％ＤＭＳＯ／水に溶解し得た。円錐形の底を有するプレー
トの場合、プレートを、１，８００ｒｐｍで５分間遠心分離し得、ビーズを円錐
形のウェルの底に固定し、続いて１０μＬの清澄な上清をスポッティングの準備
が出来ているドータープレートに移す。

【０１０２】 同じことが、３８４ウェルプレート内の３８４のビーズ、または１０２４ウェ
ルプレート内の１０２４ビーズなど、について行われ得る。スポッティングにつ
いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＩＩ（
９６ウェルについて）またはＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＩＩＩ（３８４ウェル）ｓ
ｐｏｔｔｅｒｓのような任意の適切なスポッティング装置が使用され得る。

【０１０３】 （実施例２：スポッティングのための固体支持体の機能付加） 金またはアルミニウム反射顕微鏡スライドを、ペプトイドのライブラリーのス
ポッティングのための基板として使用した。１つの実施例において、ペプトイド
は、チオール末端基で官能化され、そしてその表面は、マレイミドで官能化され
る。スポッティングの際、ペプトイドのチオールは、表面のマレイミドと反応し
、共有結合性のチオエーテル付着を形成する。マレイミドで活性化された金表面
を、以下のように調製した：１）金でコーティングした顕微鏡スライド（１２０
０オングストロームＡｕ、３０〜５０オングストロームＴｉまたはＣｒ）を、ク
ロム酸洗浄溶液で、１５分間洗浄し、そしてＨＰＬＣグレードの水でリンスした
。２）金スライドを、１〜５ｍＭのアミノ改変チオール（１−メルカプトウンデ
シルジエトキシアミン；１つのＣ−１１アルキル、２つのエチレンオキシド、お
よび１つのアミン；あるいは、Ｃ−２〜Ｃ−２０アルキル基および／またはエト
キシまたはトリエトキシ基は、このような化合物中で使用され得る）に、１〜２
４時間、室温または４５あるいは６０℃で浸した。スライドを、無水エタノール
で４回リンスし、そして窒素気流下で乾燥した。３）アミノ改変金スライドを、
スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（ＳＭＣＣ）の溶液（５０〜１００μＭ）に浸し、マレイミド官能基
を提示する表面を溶かした。

【０１０４】 酸化ケイ素の１０００〜１４００オングストロームの層およびアミノプロピル
シラン（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｓｉｌａｎｅ）（ＡＰＳ）の層でコーティングさ
れた、アルミニウムスライドを作製するか、またはＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａから購入した。アミノ改変Ａｌ表面を、ＳＭＣＣで、上記のように官
能化する。

【０１０５】 いくつかの場合、ペプトイドライブラリーのスポッティング後、アルミニウム
スライドを、０．１％ＳＤＳ／５×ＳＳＣの溶液中で６０℃で２時間、エッチン
グした。エッチングされたスライドは、酸化物層の厚さの減少（２００〜９００
オングストローム）を示し、Ｃｙ５およびＣｙ３の両方のシグナルの増幅を可能
にする。

【０１０６】 （実施例３：アビジンを用いたアルミニウム／ＳｉＯ₂表面の誘導体化） アミノシランでコーティングされたアルミニウムスライドを、図７Ａに示され
るＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（「ＬＣ」は６−アミノヘキサノイルをいい、
そして「ＮＨＳ」はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルをいう）（Ｐｉｅｒｃｅよ
り市販）の溶液（ＰＢＳ緩衝液中で、０．３９ｍＭ）に浸した。このスライドを
、８０ｒｐｍで振盪しながら、１．５時間コーティングした。ビオチンの付着後
、このスライドを水で洗浄し、次いで、ＰＢＳ緩衝液中の１ｕｇ／ｍｌ〜１ｍｇ
／ｍｌアビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンの溶液に２時間
７０ｒｐｍで攪拌しながら浸した。このスライドを水で洗浄し、そしてビオチン
化ペプチドまたはペプトイドのスポッティングの準備をした。図７ｂは、本発明
の１つの実施形態による、ビオチン化タンパク質結合剤でスポットされたアビジ
ン誘導体化アルミニウムスライドの提示を示す。

【０１０７】 種々の表面改変工程が、厚さの変化に注意するために偏光解析法を使用して続
く。４０〜４５オングストロームの厚さ変化の増加を、表面層へのアビジンの添
加後に、再現可能に記録した。

【０１０８】 （実施例４：タンパク質標識） タンパク質溶液を、ｐＨ９．３の０．１Ｍ炭酸ナトリウム中で、１ｍｇ／ｍＬ
の濃度かつ０．１〜３ｍＬの容量にまで調製し、そして二官能性または一官能性
のアミノ反応シアニン色素（Ｃｙ３またはＣｙ５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）と混合した。タンパク質を、未反応の色素から、１ｍＬの充填、０
．５ｍＬ画分および３．５の希釈因子を有する５ｃｍ長、１．７ｃｍ直径のカラ
ムのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５充填を使用するサイズ排除クロマトグラフィー
によって精製した。

【０１０９】 図８は、成分のサイズ排除クロマトグラフィーが、未反応の色素から標識され
たタンパク質を効果的に分離することを示す結果のグラフを提供する。グラフは
、タンパク質（ＢＳＡ標準）および色素分子の異なる溶出プロフィールを示す。

【０１１０】 （実施例５：チップ結合実験） いくつかの場合、ペプトイドライブラリーをスポットされたチップは、システ
イン、メルカプトエタノールまたは他の適切な親水性チオールで化学的にブロッ
クされる。チップは、タンパク質（例えば、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ、１０％脱脂粉
乳または１％カゼイン）で少なくとも１時間ブロックされ、水で洗浄され、そし
て乾燥される。標識されたタンパク質プローブ溶液を、ブロッキング溶液で希釈
する（代表的には２０〜１０００ｎｇの総タンパク質まで）（エッチングされた
Ａｌスライドについて、数ピコグラムの検出限界が、観察された）。プローブ溶
液の３０〜１００μＬのアリコートを、チップ表面に適用し、そして頂部にきれ
いなカバーガラスを配置し、チップ表面上でのプローブ溶液のサンドウィッチを
形成する。タンパク質溶液を、少なくとも１時間チップでインキュベートする。
カバーガラスを、１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎまたは界面活性剤を含む他
の適切な緩衝液中に取り出す。次いでチップを、１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎまたは他の適切な緩衝液／界面活性剤系で洗浄する。チップをさらに水で洗
浄し、アルゴンまたは窒素気流下で乾燥し、そしてスキャンする。

【０１１１】 （実施例６：サンプルチップ） １，０００ペプトイドベースのタンパク質結合剤のライブラリーを保有するマ
イクロアレイチップを、本発明に従って調製した。ストレプトアビジンを、ｗｎ
ｔ経路でタンパク質を発現するように誘導された細胞、およびコントロール細胞
溶解物にスパイクし、そして全体の混合物を、Ｃｙ３（コントロール）またはＣ
ｙ５（ｗｎｔ）で標識した。次いで混合物を、上部左隅にビオチン提示ペプトイ
ドを有する、チップでインキュベートした（６．３ｎｇの合計タンパク質／チッ
プ；３１ｐｇストレプトアビジン／チップ）。図９Ａおよび９Ｂは、インキュベ
ートされたチップの１／６を示す。示されるように、ビオチンペプトイドスポッ
トに加え、多くの他のペプトイドスポットは、溶解物中のタンパク質に結合して
いる。Ｃｙ５およびＣｙ３チャネルからの相対シグナルを比較することによって
、差を同定し得る。図９Ｃは、ストレプトアビジン単独のコントロールチップの
１／２を示す（３１ｐｇストレプトアビジン／チップ）。ビオチンペプトイドス
ポットは、上部左隅で可視である。

【０１１２】 （実施例７：デモンストレーションチップ） 図１０に示されるように、「抗ｇｌｕ」抗体に対して異なり、そして既知の親
和性の６量体ペプチドを、ビオチンアンカー基および７量体グリシルリンカーを
用いて合成した。本発明の概念を提供するために、ビオチン化ペプチドを、本発
明に記載されるように、アビジン処理スライドにスポットした。このスライドを
、カゼインでブロックし、そしてＣｙ５−標識抗ｇｌｕ抗原でプローブした。シ
グナル強度におけるグラデーションは、ペプチドとそれらの同族抗体プローブと
の間の親和性における既知の差（例えば、直接ＥＬＩＳＡによって測定される差
）と相関した。

【０１１３】 （実施例８：表面付着系の比較） 図１１は、基質へのタンパク質結合剤の表面付着の型に対するシグナル強度の
依存を示す。この実施例において、１０００倍のシグナルの増加は、チオール／
マレイミドに比較したビオチン／アビジンの固定化について観察される（シグナ
ルは、示された上記の表面付着の記述および分子構造を生じる）。

【０１１４】 （実施例９：抗体ディスプレイのためのタンパク質コーティングスライド表面
の調製） プロテインＡ−またはプロテインＧ−改変スライド表面を調製するために、ア
ビジンでコーティングされたスライド（上記のように調製された）を、ビオチン
化プロテインＡまたはプロテインＧの溶液（ＰＢＳ緩衝液中で０．５〜１ｍｇ／
ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅより購入、製品番号２９９８９ｚｚおよび２９９８８ｚｚ）
中に、２時間室温で浸した。次いで、このスライドを、脱イオン化蒸留水で洗浄
し、そして窒素またはアルゴンを用いて、風乾した。

【０１１５】 （結論） 先の発明は、明白な理解のためにいくつかを詳細に記載したが、特定の変化お
よび改変が本発明の範囲内で行われ得ることは、明らかある。例えば、本発明の
開示は、タンパク質結合アレイエレメントのペプチド模倣セグメントとしてのペ
プトイドの使用を強調するが、本発明の範囲が、それに限定されないこと、およ
び本明細書中で記載される適切な特性および機能を有する他の分子がまた使用さ
れ得ることが理解されるべきである。本発明のプロセスおよび装置の両方を行う
、多くの代替方法が存在することもまた注意されるべきである。従って、本発明
の実施形態は、限定ではなく、例として考えられるべきであり、そして本発明は
、本明細書中に示される詳細に限定されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、本発明の１つの実施形態に従って、それぞれ、タンパク質結合剤ア
レイエレメントおよびアレイ部分の構造を概略的に示す。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、本発明の１つの実施形態に従って、それぞれ、タンパク質結合剤ア
レイエレメントおよびアレイ部分の構造を概略的に示す。

【図１Ｃ】 図１Ｃは、本発明の１つの実施形態に従う、エチレンオキシドから構成される
タンパク質結合剤連結セグメントの分子構造を示す。

【図２】 図２は、本発明の１つの実施形態に従って、固体支持体の表面と安定に連結し
た多数の異なったタンパク質結合剤を有するアレイを作製するプロセスを概略的
に示す。

【図３】 図３は、本発明の１つの実施形態に従って、６つの１２マーペプトイドアレイ
エレメントの分子構造を概略的に示す。

【図４Ａ】 図４Ａは、本発明の１つの実施形態に従って、タンパク質結合剤を固体支持体
に結合する代替的な様式を概略的に示す。

【図４Ｂ】 図４Ｂは、本発明の１つの実施形態に従って、タンパク質結合剤を固体支持体
に結合する代替的な様式を概略的に示す。

【図５】 図５は、本発明の１つの実施形態に従って、差次的なタンパク質結合アッセイ
を行なうためのプロセスを概略的に示す。

【図６】 図６は、本発明の実施形態に従って同定されたタンパク質を同定し、そして特
徴付けるための種々のプロセスを概略的に示す。

【図７Ａ】 図７Ａは、本発明の１つの実施形態に従って、基板として使用されるアルミニ
ウムスライドを被覆するために溶液中で使用されるＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチ
ンについての化学式を示す。

【図７Ｂ】 図７Ｂは、本発明の１つの実施形態に従って、ビオチン化タンパク質結合剤を
使用してスポットされたアビジン誘導体アルミニウムスライドを示す。

【図８】 図８は、本発明の実施形態に従って、標識されたタンパク質サンプルを、マイ
クロアレイに適用する前に、未反応の色素から標識されたタンパク質を分離する
ために行なわれたサイズ除外クロマトグラフィーの結果のグラフを示す。

【図９】 図９Ａ〜９Ｃは、本発明の概念を証明するために使用された１，０００ペプト
イドベースのタンパク質結合剤のライブラリーを保有するマイクロアレイチップ
の走査を示す。

【図１０】 図１０は、ビオチン化ペプチドを、アビジン処理したスライドにスポットし、
カゼインでブロックし、そしてＣｙ５標識の抗Ｇｌｕ抗体でプローブした場合に
得られた、ビオチン化６量体ペプチド（ＡからＥ）および対応するシグナル強度
を示す。

【図１１】 図１１は、本発明に従って、表面付着の２モデルについてのペプチドの表面付
着の様式に対するシグナル強度の依存性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ツッカーマン， ロナルド エヌ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94530， エル セリト， コントラ コスタ ド ライブ 1116 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 AA20 CA04 CA09 CA12 HA13 HA14 HA20 4B063 QA01 QQ43 QQ53 QQ79 QR32 QR35 QR38 QR48 QR56 QR84 QS32 QS34 QS39 QX02

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 固体支持体の表面に安定に付着したタンパク質結合剤のアレ
   イであって、該アレイは、以下： 実質的に平面状の表面を有する固体基板； 該基板に結合した複数の異なるタンパク質結合剤であって、該タンパク質結合
   剤の各々は、以下： 該基板表面に安定に結合したアンカーセグメント、 ペプチド模倣タンパク質結合剤、および 該アンカーセグメントおよび該ペプチド模倣セグメントを接続し、そして分離
   するリンカーセグメント、 を含む、タンパク質結合剤、 を含む、アレイ。
2. 【請求項２】 前記基板が、前記アンカーセグメントの下の前記平面状の表
   面上に金属を備える、請求項１に記載のアレイ。
3. 【請求項３】 前記基板が、ガラス、プラスティックまたは金属のうちの１
   つである、請求項２に記載のアレイ。
4. 【請求項４】 前記金属が、アルミニウム、金またはチタンのうちの１つで
   ある、請求項２に記載のアレイ。
5. 【請求項５】 前記ペプチド模倣セグメントが、ペプチドである、請求項２
   に記載のアレイ。
6. 【請求項６】 前記リンカーセグメントが、Ｃ２−Ｃ１００脂肪族鎖、ポリ
   エチレンオキシド、および直交性のペプチド模倣オリゴマーまたはペプチドオリ
   ゴマーからなる群から選択される、請求項２に記載のアレイ。
7. 【請求項７】 前記アンカーセグメントが、チオールである、請求項２に記
   載のアレイ。
8. 【請求項８】 前記アンカーセグメントが、ビオチンである、請求項２に記
   載のアレイ。
9. 【請求項９】 前記金属基板表面が、さらに、前記アンカーセグメントの下
   のアミノ改変されたチオールおよびシロキサンのうちの官能化された１つで被覆
   される、請求項２に記載のアレイ。
10. 【請求項１０】 前記アミノチオールまたはアミノシランが、マレイミドで
    官能化されている、請求項９に記載のアレイ。
11. 【請求項１１】 前記アンカーセグメントが、チオールである、請求項１０
    に記載のアレイ。
12. 【請求項１２】 前記アミノチオールまたはアミノシランが、ヒドラジド、
    アミノオキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、無水物、アルデヒド、ジスルヒ
    ド、チオール、アジドおよびホスフィンのうちの１つで官能化される、請求項９
    に記載のアレイ。
13. 【請求項１３】 前記金属基板表面が、さらに、前記アンカーセグメントの
    下のアビジンタンパク質で被覆されている、請求項９に記載のアレイ。
14. 【請求項１４】 前記アビジンタンパク質が、アビジン、ストレプトアビジ
    ン、ニュートラビジンおよび類似体からなる群から選択される、請求項１３に記
    載のアレイ。
15. 【請求項１５】 前記アンカー基が、ビオチンである、請求項１３に記載の
    アレイ。
16. 【請求項１６】 前記アビジンタンパク質が、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチ
    ン部分を介して前記金属基板表面に付着される、請求項１３に記載のアレイ。
17. 【請求項１７】 固体支持体の表面に安定に結合されたタンパク質結合剤の
    アレイであって、該アレイは、以下： 固体支持体であって、該固体支持体は、マレイミド官能化アミノチオールまた
    はアミノシランで被覆された実質的に平面状のアルミニウム表面を有する、固体
    支持体； 該基板に結合した複数の異なるタンパク質結合剤であって、該タンパク質結合
    剤の各々が、以下： マレイミド提示基板表面に安定に結合したチオール基板アンカーセグメント、 ペプトイドタンパク質結合セグメント、ならびに 該アンカーおよびペプチド模倣セグメントを接続しそして分離する脂肪族リン
    カーセグメント、 を含む、複数の異なるタンパク質結合剤、 を含む、アレイ。
18. 【請求項１８】 前記マレイミド官能化アミノチオールまたはアミノシラン
    が、スペーサーを含む、請求項１７に記載のアレイ。
19. 【請求項１９】 固体支持体の表面に安定に会合したタンパク質結合剤のア
    レイであって、該アレイは、以下： 固体支持体であって、該固体支持体は、アビジン官能化アミノシランまたはア
    ミノチオールで被覆された実質的に平面状のアルミニウム表面を有する、固体支
    持体； 該基板に結合した複数の異なるタンパク質結合剤であって、該タンパク質結合
    剤の各々が、以下： アビジン提示基板表面に安定に結合したビオチン基板アンカーセグメント、 ペプトイドタンパク質結合セグメント、および 該アンカーおよびペプチド模倣セグメントを接続しそして分離する直交ペプチ
    ドリンカーセグメント、 を含む、複数の異なるタンパク質結合剤、 を含む、アレイ。
20. 【請求項２０】 前記アビジン官能化アミノシランまたはアミノチオールが
    、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン部分を含む、請求項１７に記載のアレイ。
21. 【請求項２１】 固体支持体の表面に安定に会合した複数の異なるタンパク
    質結合剤を含むアレイを作製する方法であって、該方法は、以下： 実質的に平面状の表面を有する固体基板を結合するために準備する工程； 複数のタンパク質結合剤が該基板表面に結合するのに十分な条件下で、該複数
    の異なるタンパク質結合剤を該基板と接触させる工程であって、該タンパク質結
    合剤の各々が、以下： 基板アンカーセグメント、 ペプチド模倣タンパク質結合セグメント、および 該アンカーおよびペプチド模倣セグメントを接続しそして分離するリンカーセ
    グメント、 を含む、工程、を包含し、それによって該アレイが生成される、方法。
22. 【請求項２２】 前記接触させる工程が、前記タンパク質結合剤の前記基板
    表面への結合が、液滴が蒸発する前に完了されるような条件下で、該基板表面上
    の異なる位置に、該タンパク質結合剤の各々の液滴をスポットする工程を包含す
    る、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記基板表面が金被覆を含み、そして結合のために準備す
    る工程が、該金被覆を洗浄する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記アンカーセグメントがチオールである、請求項２３に
    記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記基板表面が金およびアルミニウムから選択される金属
    被覆を含み、そして結合のために準備する工程が、官能化アミノチオールまたは
    アミノシランを用いて該金属被覆を洗浄およびコーティングする工程を含む、請
    求項２２に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記アミノチオールまたはアミノシランが、アミノプロピ
    ルシランである、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記アミノプロピルシランが、マレイミドで官能化されて
    いる、請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記基板アンカーセグメントが、チオールである、請求項
    ２７に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記アンカーセグメントが、ビオチンである、請求項２５
    に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記アミノチオールまたはアミノシランが、ヒドラジド、
    アミノオキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、無水物、アルデヒド、ジスルヒ
    ド、チオール、アジドおよびホスフィンのうちの１つで官能化される、請求項２
    ５に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記金属基板表面が、さらに、前記アンカーセグメントの
    下のアビジンタンパク質で被覆されている、請求項２５に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記アビジンタンパク質が、アビジン、ストレプトアビジ
    ン、ニュートラビジンおよびアナログからなる群から選択される、請求項３１に
    記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記アンカーセグメントが、ビオチンである、請求項３１
    に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記アビジンタンパク質が、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチ
    ン部分を介して前記金属基板表面に付着される、請求項３１に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記ペプチド模倣セグメントが、ペプチドである、請求項
    ２１に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記リンカーセグメントが、Ｃ２−Ｃ１００脂肪族鎖、ポ
    リエチレンオキシド、および直交性のペプチド模倣オリゴマーまたはペプチドオ
    リゴマーからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
37. 【請求項３７】 固体支持体の表面に安定に会合した複数の異なるタンパク
    質結合剤を含むアレイを作製する方法であって、該方法は、以下： タンパク質結合剤にライブラリーを生成する工程であって、該タンパク質結合
    剤が、 基板アンカーセグメント、 ペプチド模倣セグメント、および 該アンカーおよびペプチド模倣セグメントを接続しそして分離するリンカーセ
    グメントを含む、工程； タンパク質結合剤を、該ライブラリーから、各々異なるタンパク質結合剤のた
    めの個々の貯蔵レセプタクルに分配させる工程； 固体基板への結合のために、複数の該異なるタンパク質結合剤を調製する工程
    ； 複数の該異なるタンパク質結合剤との結合のために実質的に平面状の表面を有
    する固体基板を調製する工程、 を包含し、それによって、該アレイが生成される、方法。
38. 【請求項３８】 前記基板表面が金およびアルミニウムから選択される金属
    被覆を含み、そして結合のために準備する工程が、官能化アミノチオールまたは
    アミノシランを用いて該金属被覆を洗浄およびコーティングする工程を含む、請
    求項３７に記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記アミノチオールまたはアミノシランが、マレイミドで
    官能化されている、請求項３８に記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記基板アンカーセグメントが、チオールである、請求項
    ３９に記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記金属基板表面が、さらに、前記アンカーセグメントの
    下のアビジンタンパク質で被覆されている、請求項３８に記載の方法。
42. 【請求項４２】 前記アンカーセグメントが、ビオチンである、請求項４１
    に記載の方法。
43. 【請求項４３】 示差的結合アッセイを行う方法であって、該方法は、以下
    ： タンパク質含有生物学的サンプル溶液内のタンパク質を標識する工程： 該標識されたタンパク質含有生物学的サンプル溶液のアリコートを、請求項１
    に記載のアレイと接触させる工程； 該アレイのタンパク質結合剤への、該サンプル中のタンパク質の示差的結合を
    決定するために、該アレイを分析する工程、 を包含する、方法。
44. 【請求項４４】 前記ペプチド模倣セグメントが、ペプチドである、請求項
    ４３に記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記異なるタンパク質結合剤の各々が、その薬剤を含む異
    なる供給源レセプタクルに対応する、請求項４４に記載の方法。
46. 【請求項４６】 前記示差的結合アッセイの結果に基づいて、目的のタンパ
    ク質結合剤を選択する工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
47. 【請求項４７】 前記選択されたタンパク質結合剤の前記ペプチド模倣セグ
    メントを配列決定する工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
48. 【請求項４８】 前記選択されたタンパク質結合剤の前記ペプチド模倣セグ
    メントを、質量分析法による構造分析に供する工程をさらに含む、請求項４６に
    記載の方法。
49. 【請求項４９】 請求項４６に記載の方法であって、前記タンパク質含有生
    物学的サンプル溶液をタンパク質を用いて富化させる工程をさらに包含し、ここ
    で、該タンパク質は、好ましくは、該タンパク質含有生物学的サンプル溶液の第
    二のアリコートを分離カラムに適用することによって、前記選択されたタンパク
    質結合剤に結合し、該分離カラムが、該選択されたタンパク質結合剤を表示する
    クロマトグラフィー支持体を含む、方法。
50. 【請求項５０】 前記富化されたタンパク質を配列決定する工程をさらに包
    含する、請求項４９に記載の方法。
51. 【請求項５１】 前記富化されたタンパク質を質量分析法による構造分析に
    供する工程をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。
52. 【請求項５２】 請求項４３に記載の方法であって、さらに、標識されたｃ
    ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを含む前記生物学的サンプル溶液のアリコー
    トを、ＤＮＡアレイと接触させる工程、該サンプル中の核酸のＤＮＡアレイのエ
    レメントへの示差的結合を決定するために該ＤＮＡアレイを分析する工程、そし
    て遺伝子活性とタンパク質発現における相関を同定するために、２つのアレイの
    該示差的結合の結果を比較する工程を、包含する、方法。
53. 【請求項５３】 請求項４３に記載の示差的結合アッセイを行う際の使用の
    ためのキットであって、該キットは、以下： 実質的に平面状の表面を有する固体基板； 該基板に結合した複数の異なるタンパク質結合剤であって、該タンパク質結合
    剤の各々が、以下： 該基板表面に安定に結合したアンカーセグメント、 ペプチド模倣タンパク質結合セグメント、および 該アンカーおよびペプチド模倣セグメントを接続しそして分離するリンカーセ
    グメント を含む、タンパク質結合剤を含む、 アレイを含む、キット。
54. 【請求項５４】 固体支持体の表面に安定に付着されたタンパク質結合剤の
    混合アレイであって、該アレイは、以下： 実質的に平面状の表面を有する固体基板； 該基板に結合した複数の異なるタンパク質結合剤であって、該タンパク質結合
    剤の各々が、以下： 該基板表面に安定に結合したアンカーセグメント、 ペプチド模倣タンパク質結合セグメント、および 該アンカーおよびペプチド模倣セグメントを接続しそして分離するリンカーセ
    グメント、を含むタンパク質結合剤；ならびに 該基板に結合した複数の異なる抗体、 を備える、混合アレイ。