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JP2003530568A - 試料の蛍光を検出するための方法および装置 - Google Patents

試料の蛍光を検出するための方法および装置

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Publication number
JP2003530568A
JP2003530568A JP2001574858A JP2001574858A JP2003530568A JP 2003530568 A JP2003530568 A JP 2003530568A JP 2001574858 A JP2001574858 A JP 2001574858A JP 2001574858 A JP2001574858 A JP 2001574858A JP 2003530568 A JP2003530568 A JP 2003530568A
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JP
Japan
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sample
light
filter
detection
light source
Prior art date
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Pending
Application number
JP2001574858A
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English (en)
Inventor
フランス・アイナー・ラヴン・ハンセン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chemometec AS
Original Assignee
Chemometec AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chemometec AS filed Critical Chemometec AS
Publication of JP2003530568A publication Critical patent/JP2003530568A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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    • G—PHYSICS
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、試料の蛍光を検出するための装置および方法に関し、ここに該装置は検出手段と同じ試料の側に位置する励起光源を含む。該装置は、１面型ならびに２面型のシステムとして構成し得、ここに２面型システムは２面型励起システムおよび／または２面型検出システムを含む。２面型システムは蛍光システムおよび従来の顕微鏡の組合せともし得る。該装置は、種々の生物試料、液体ならびに固体材料、および蛍光研究を通して分析するのに好適な種々の他のタイプの材料の分析に使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、試料の蛍光を検出するための装置および方法に関する。
【０００２】 発明の背景 顕微鏡における試料の照明は、主として２の異なるクラスに類別し得る： ・透過型顕微鏡：この顕微鏡では、光源が試料の１の側に位置し、該試料を透過
した光を検出するためのセンサーまたは検出器が試料のもう１の側に位置する。 ・反射型顕微鏡：この顕微鏡では、試料から反射された光を検出するためのセン
サーまたは検出器と同じ試料の側に光源が位置する。光源からの光は、ビーム・
スプリッター、例えばダイクロイックミラーのごとき部分的に透過および偏向す
る表面によって偏向されて試料を照らす。試料から反射した光は、検出手段に向
けて該表面を透過することができる。
【０００３】 蛍光顕微鏡においては、光源は単なる照明の代りに励起光を供する。検出され
る蛍光シグナルは励起光の強度と比較して強度が低いため、いずれの励起光も検
出器に直接的に透過することや濾過されないことが重要である。
【０００４】 米国特許第5,805,342号（Gravely）には、透過型および反射型の蛍光システム
が示されており、これらでは、光源は試料面の試料を通るかまたは走査する。励
起光は、試料の反対側に位置するか、または光が部分的に透過および偏向する表
面によって偏向されるように位置する。
【０００５】 より多くの機能を有するよりコンパクトな蛍光顕微鏡を作製するため、本発明
者らは、以前知られていたよりもよりコンパクトな様式に組み立てることができ
、したがってポータブルな蛍光顕微鏡として使用し得る蛍光顕微鏡を発明した。
【０００６】 発明の概要 本発明は、 −少なくとも第１の光源を含む第１の励起光手段、ここに該励起光は主光路を
有し、 −該試料を設置するための試料面、 −試料からの光蛍光シグナルを検出するための少なくとも第１の検出器を含む
検出手段、ここに該検出手段と試料面との間の軸は検出−試料軸であり、 −検出器（群）からのデータを受けるために結合したプロセッサー、 −シグナルを検出手段に焦点合わせするための焦点合わせ手段、ここに該焦点
合わせ手段は収集角を有する、を含み ここに、第１の光源の励起主光路と検出−試料軸との間の角度が、収集角／２
〜９０°の範囲であることを特徴とする試料の蛍光を検出するための装置に関す
る。
【０００７】 さらに、本発明は、 −試料を試料面に配置し、 −試料の第１の表面を、少なくとも第１の光源を有する第１の光手段からの励
起光で直接的に露光し、 −焦点合わせ手段を用いることによって、試料の第１の表面からの蛍光シグナ
ルを少なくとも第１の検出器を含む第１の検出手段上で検出し、 −検出したシグナルをプロセシングしてシグナルデータを得、 −シグナルデータを評価すべきパラメータに相関させ、ついで −パラメータを評価する ことを含む試料のパラメータを評価する方法に関する。
【０００８】 定義 以後の用語は、下記の意味を有する： 収集角：その従来の意味で用いる。すなわち、それにつき焦点合わせ手段が検
出手段によって検出されるべきシグナルを収集し得る角度を意味する。 収集角／２：収集角の半分を意味する。 検出面積：１の検出によって検出される試料の表面の面積を意味する。 検出器−試料軸：検出器から試料への軸を意味する。 直接的に露光する：主光路と検出−試料軸との間の角度が収集角／２〜９０°
であることを意味する。 焦点深度：対象物がその像を歪めることなく、焦点合わせシステムの軸に沿っ
て対象物が運動し得る距離を意味し、かかる歪みは、焦点が合っている場合には
単一の検出エレメントを照明する像が、歪んだ場合には１または２の方向で２の
検出エレメントに伸長する面積を照らすと定義される。分析の前に２またはそれ
を超える検出エレメントが結合した場合、結合した検出エレメントは焦点深度の
定義とみなす。
【０００９】 入射角：主光路と検出−試料軸との間の角度 光手段：試料の１の側を露光するための全ての光源を含む光システム 光面：２またはそれを超える光源を通る面 主光路：発光ダイオードの中心によって例示される、光線の中心から試料面へ
の路 試料面：検出器−試料軸に対して垂直であって、その上に試料を配置する面
【００１０】 本発明による装置は、静置型蛍光顕微鏡またはポータブル型蛍光顕微鏡となり
得る。好ましい具体例において、該装置はフィールドで試料の蛍光を検出するた
めにポータブル型である。
【００１１】 光源は、試料に最大の光エネルギーを供給するように試料に対して配置する。
光は検出手段と同じ試料の側に設置された光源から伝送されるため、透過型蛍光
顕微鏡において実際に適用可能なものを超えて励起光の強度を増大させることが
可能である。なぜなら、第１の光源からの光は検出−試料軸に直接的に伝送され
ないからである。
【００１２】 コスト的に有効なように発光ダイオードのごとき発散する励起光を使用して、
試料の可能な限り大きな面積を励起光に露光することが好ましい。光源は発光ダ
イオード、レーザーダイオード、レーザー、発熱光源（ハロゲンランプのごとき
）およびガス放出ランプ（キセノンランプのごとき）から選択し得る。
【００１３】 例えば２またはそれを超える発光ダイオードを用いることによって、試料への
光束を増大させる目的で１を超える光源を使用することが好ましい場合もある。
幾つかの光源が異なる電磁気特性を有する１を超える光源を用いることも可能で
ある。
【００１４】 励起光手段は、好ましくは少なくとも１の発光ダイオード（ＬＥＤ）を含むが
、少なくとも２のＬＥＤが配されているのが好ましく、少なくとも４のＬＥＤが
配されているのがより好ましい。１を超えるＬＥＤを用いる場合、該ＬＥＤは好
ましくは互いに同じ距離で離す。それらは、光の作用が効果的に利用される限り
、円形パターンまたは検出−試料軸のまわりの方形パターンのごとき、検出−試
料軸のまわりにいずれの対称パターンでも配置し得る。励起光は好ましくは光面
、すなわち光源を通る面に配置される。光面は好ましくは試料面に平行である。
【００１５】 幾つかのＬＥＤを使用することによって、試料の実質的に最適な励起に通じる
幾つかの角度からの励起光に試料が露光され、光源は好ましくは全部が実質的に
同時に伝送するように作動する。使用するＬＥＤの数に上限はないが、２０を超
えるＬＥＤのごとき３０もの多いＬＥＤを配することもある。
【００１６】 しかしながら、第１の光源が第２の光源とは異なる波長帯を有するところの少
なくとも第１の光源および第２の光源を第１の励起光手段に配置するある適用に
ついては、これらの光源は交互で伝送し得る。２の異なる光源を使用することに
よって、試料から２の異なる蛍光シグナルを得ることが可能である。そのことに
より、少なくとも２の異なる種類の情報を得ることが可能である。なぜなら、１
の波長の光源を伝送する場合には１のタイプのシグナルが検出器に伝送され、も
う１の波長の光源を伝送する場合にはもう１のタイプのシグナルが検出器に伝送
されるからである。
【００１７】 より低く発散する光源を用いる場合には、発散する光学手段を励起光路に配置
して励起光を適当に発散させ得る。光源（群）をどの程度発散させるかとは独立
して、試料の適当な励起を保証し、かつ、検出手段に励起光が直接的に伝送され
る危険性を軽減させるために、光はその光路から偏向することなく試料に指向し
て発せられることが好ましい。
【００１８】 励起光としてレーザーダイオードを用いる場合、所望により発散する手段と共
に配されていてもよい、少なくとも４のレーザーダイオードの配置によって、適
当な発散を達成し得る。
【００１９】 光源は、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００または２００〜４
００ｎｍの範囲のごとき２００〜９８０ｎｍの範囲のごときいずれかの好適な波
長の光を供し得る。
【００２０】 もう１の具体例において、光源は試料光面に平行な第１の光面に配置され、該
第１の光面は検出器の背後の試料面から一定の距離に位置する。この構造により
、光は直接的に試料面に向けて光源から発せられるか、または検出器手段の周り
を通る。もう１の具体例において、光は最初に、光線を試料面に向かって反射す
る反射器に向けて反対方向で指向し、検出器手段のまわりを通る。励起光の位置
決定とは独立して、励起主光路と検出−試料軸との間の角度は前記に定義のごと
く存在することは保証されなければならない。反射器は、凹面鏡のごときいずれ
の好適な反射手段であってもよい。
【００２１】 光源を検出手段の背後に設置する場合、光源は好ましくはハウジング中に配置
する。この場合においては、ハウジングは開口部と共に配されて、試料から発せ
られたシグナルを検出器に到達させる。
【００２２】 本発明の１の具体例において、光源は、第１の励起光手段が試料面に平行な第
１の光面に位置するように配置し、ここに該第１の面は試料面と第１の検出手段
との間に存在する。第１の励起光手段の少なくとも第１の光源の入射角は、収集
角／２と９０°との間に存在する。好ましくは全ての光源がこの範囲内の入射角
を有し、より好ましくは全ての光源が実質的に同じ入射角を有する。 このことによって、励起光路と発せられたシグナルが干渉せず、検出するシグ
ナルにエラーが生じないことが保証される。
【００２３】 入射角は、好ましくは３０°〜９０°、５０°〜８５°のごとき、５０°〜７
５°のごとき、５０°〜６０°のごとき、より好ましくは４５°〜８５°の範囲
であって、試料の好適な励起を供する。
【００２４】 励起光は直接的に、すなわちビームスプリッターによって偏向されることなく
、そらせ板などによって機械的に試料に伝送され、それによって装置をよりコン
パクトかつより少ないパーツを有して構成することができる。なぜなら、いずれ
の偏向手段も光路に取込ませる必要がないからである。
【００２５】 さらにシグナルエラーを回避するためには、光源を閉じ込めるか、さもなけれ
ば遮蔽して、いずれの励起光も検出手段に直接的に伝送されないことを保証する
。
【００２６】 試料面は試料の表面によって構成される。装置の１の具体例において、試料を
試料面に位置決定させるための手段を配置する。例えば、凹部を有するプレート
を、評価する試料を受けるための試料面に設置し得る。特に液体試料については
、試料面は、少なくとも検出の間に試料を閉じ込めておくための試料コンパート
メントを含み得る。試料コンパートメントは、静置型コンパートメント、または
試料面に嵌合するように成形されたカセットのごとき置換え可能なコンパートメ
ントとし得る。
【００２７】 分析する試料を含む試料コンパートメントは、好ましくは、検出エレメントの
アレイに露光され得、したがって同時に試料の大面積の分析が可能なように、可
能な限り大きな試料体積を配置する。このことを達成する１の方法は、検出エレ
メントの面に平行ではない方向で試料コンパートメントの厚さを画定し、したが
って検出エレメントに露光される試料コンパートメントの面積当たりの有効体積
を増大させることである。最適な厚さは、焦点合せシステムのいずれかの有効焦
点深度によって決ることもある。
【００２８】 かかる場合においては、試料コンパートメントが、検出エレメントのアレイの
面に実質的に平行でない方向で、試料の寸法を少なくとも２０μｍ以下の厚さに
、好ましくは２０μｍを超える厚さに、より好ましくは４０μｍを超える厚さに
、より好ましくは６０μｍを超える厚さに、より好ましくは８０μｍを超える厚
さに、より好ましくは１００μｍを超える厚さに、より好ましくは１４０μｍを
超える厚さに、より好ましくは１８０μｍを超える厚さに、より好ましくは２５
０μｍを超える厚さに、より好ましくは５００μｍを超える厚さに、より好まし
くは１０００μｍを超える厚さに制限する。
【００２９】 同様に、試料コンパートメントの検出面積を検出エレメントのアレイに平行な
向きに拡大し、検出エレメントのアレイに露光される試料の有効面積を増大させ
ることが有利である。これらの適用の幾つかについては、寸法の長さは１ｍｍ以
上、好ましくは２ｍｍ以上、より好ましくは４ｍｍ以上、より好ましくは１０ｍ
ｍ以上、より好ましくは２０ｍｍ以上、より好ましくは４０ｍｍ以上、より好ま
しくは１００ｍｍ以上、より好ましくは２００ｍｍ以上、より好ましくは４００
ｍｍ以上である。
【００３０】 幾つかの適用については、管状の試料コンパートメントを使用し、それによっ
て、かかる管状の試料コンパートメントの半径を増大させることによって同時に
分析する試料の面積を増大させることも可能である。かかる試料コンパートメン
トの最適半径は、焦点深度のごときシステムの種々のコンポーネントの構造によ
って決る場合もある。該管は、これらの状況で、０.０１ｍｍを超える、好まし
くは０.０２ｍｍ以上の、より好ましくは０.０４ｍｍ以上の、より好ましくは０
.１ｍｍ以上の、より好ましくは０.２ｍｍ以上の、より好ましくは０.４ｍｍ以
上の、より好ましくは１ｍｍ以上の、より好ましくは２ｍｍ以上の、より好まし
くは４ｍｍ以上の、より好ましくは１０ｍｍ以上の内側半径を有する。
【００３１】 試料コンパートメントは、出典明示して本明細書の一部とみなすPCT／DK99／0
0605号に記載されているディスポーザブル型サンプリングデバイスとし得る。
【００３２】 本発明による装置により、広範な種々の体積の試料の評価が許容される。そこ
からシグナルがアレイに露光される試料の体積は、通常０.０１〜１０μｌの範
囲のごとき、０.０１〜４μｌの範囲のごとき、０.０２〜１０μｌの範囲のごと
き、好ましくは０.０４〜２μｌの範囲のごとき、０.０５〜２μｌの範囲のごと
き、０.０１〜１,５０μｌの範囲のごとき、０.０１〜２０μｌの範囲である。
【００３３】 システムの焦点深度は試料コンパートメントの最適寸法の決定に重要となるこ
とがある。寸法が焦点深度の１倍よりも大きく１.５倍よりも小さい、より好ま
しくは焦点深度の１.５倍に等しいかまたはそれよりも大きく２倍よりも小さい
、より好ましくは焦点深度の２倍に等しいかまたはそれよりも大きく３倍よりも
小さい、より好ましくは焦点深度の３倍に等しいかまたはそれよりも大きく４倍
よりも小さい、より好ましくは焦点深度の４倍に等しいかまたはそれよりも大き
く６倍よりも小さい、より好ましくは焦点深度の６倍に等しいかまたはそれより
も大きい場合の伸長でさえ、焦点合わせシステムの焦点深度を超えた寸法を用い
ることが可能であることが判明している。
【００３４】 試料は、好ましくは露光の間になおその位置に留まり、検出手段に対する静止
状態を得る。
【００３５】 フィルター 検出に必要な蛍光シグナルを得るために、フィルターを光源と試料との間の光
路に挿入する。フィルターは、励起光／発光に好適ないずれのフィルターともし
得る。フィルターは、干渉フィルター、着色フィルターおよび偏光フィルターか
ら選択し得る。好ましくは、各光源に対して別々のフィルターを準備する。これ
らのフィルターは実質的に同じものであってもよいが、ある試料に対しては異な
るフィルターを用いることが簡便となり得る。
【００３６】 例えば、これらの波長成分のうちの１または幾つかが同時に１または同時に１
を超えてのいずれかで試料に伝送される前に、好ましくは１を超える波長成分が
同時に試料に伝送され、したがって試料中の粒子についての質的ならびに量的な
情報を得る機会が得られる場合に、単色性のデバイスを用いて電磁線を１または
それを超える波長成分に分離し得る。このことは、試料が異なる波長成分に対し
て異なって応答する粒子を含む場合に特に興味深い。
【００３７】 励起光手段中の個々の光源用のフィルターは結合する、例えば連続する支持材
料上に配置する。それによって、顕微鏡の構造が促進される。なぜなら、結合し
たフィルターは１の手動操作で装置に位置し得るからである。
【００３８】 支持材料は、励起光に対して非−透明であるかまたは用いるフィルターに対応
するフィルター機能を有するいずれの好適な材料ともし得る。 支持材料の形状は、好ましくは、半円形、円形、方形、三角形、四角形のごと
き光源配置のパターンに対応する。光を検出試料軸のまわりに配置する場合、試
料から発せられたシグナルを検出手段に通させることが重要である。
【００３９】 好ましい具体例において、フィルターは円形の“孔”を有する円形であり、該
“孔”の直径は好ましくはシグナル線の直径に対応するかまたはそれよりも大き
い。
【００４０】 種々の波長成分を試料に伝送し得るように、フィルターは交換可能とし得るこ
とが本発明によって想定される。この具体例においては、フィルター（群）をそ
のまま交換し得、あるいはフィルターおよび光源を交換し得る。後者の状況にお
いては、フィルター（群）および光源は好ましくは置換え可能なフィルター−光
ユニットとして結合する。
【００４１】 試料に伝送される光は、１またはそれを超えるレンズを含む焦点合わせシステ
ムによって焦点合わせし得る。かかる焦点合わせシステムの効果は、光源の有効
効率を増大させることである場合もある。
【００４２】 さらに、単色性デバイスを用いて、試料から発せられたかまたはそれを通過し
た電磁シグナルを、１の波長が同時に測定されるかまたは１を超える波長成分が
同時に測定されるように、検出エレメントによってかかる電磁シグナルが検出さ
える前に、１またはそれを超える波長成分に分離し得る。このことは、異なる波
長成分に対して異なって応答する粒子を試料が含む場合、例えば粒子が当該粒子
の性質に依存して異なる特性のフォトルミネセンスを発し得る場合に、特に興味
深い。この効果は、好ましくは単色性デバイスと組み合わせて、異なる波長特性
を有する１を超えるタイプの光源を用いることによっても創生し得る。
【００４３】 特に、試料から発せられたかまたはそれを通過したスペクトルに富む電磁線は
、試料の実質的に同一の画分からの情報を測定する、検出エレメントのアレイ中
の各検出エレメントが実質的に異なる波長成分に露光されるように、複数の波長
成分に空間的に分離し得る。
【００４４】 このことは、限定されるものではないが、以下のもののうちの１または幾つか
を用いることによって達成し得る：干渉フィルター、着色フィルター、光学格子
、プリズム、光学的に活性な結晶。
【００４５】 さらに、励起光または蛍光シグナルは、光学的に活性な結晶または干渉計のご
ときによって、好ましくはマイケルソン干渉計を用いることによって、より好ま
しくは少なくとも１の反射表面を運動し得る干渉計を用いるごときによって、強
度変調させ得る。
【００４６】 試料中の粒子の数または粒子のいずれかの形状特性を評価するために、二次元
フィルタリングまたは画像認識のごとき人工(art)画像処理技術の１または幾つ
かの状態を用いることが好ましい場合もある。
【００４７】 検出手段は、試料から発せられた蛍光シグナルを感知または検出し得るいずれ
かの検出器を含み得る。
【００４８】 好ましい具体例において、検出手段は電荷結合素子（ＣＣＤ）のごとき検出デ
バイスまたは検出エレメントのアレイである検出器を含み、ＣＣＤは、ＣＭＯＳ
のごとき、フルフレームＣＣＤ、フレームトランスファーＣＣＤ、インターライ
ントランスファーＣＣＤ、ライン走査ＣＣＤ、ｅｇ波長増幅型ＣＣＤアレイ、フ
ォーカルプレーンアレイ、フォトダイオードアレイまたはフォトディテクターア
レイとし得る。ＣＭＯＳは、好ましくはオン−チップ集積シグナルコンディショ
ンおよび／またはシグナルプロセシングを有するＣＭＯＳイメージセンサーであ
る。上記の検出デバイスのいずれを選択するかとは関係なく、検出手段はさらに
白／黒またはカラーＣＣＤまたはカラーＣＭＯＳを含み得る。
【００４９】 検出エレメントのサイズは、ある程度その感度を決定する。したがって、幾つ
かの適用において、約１μｍ２以下のサイズの検出エレメントを有することに興
味がある。ある種の状況においては、検出エレメントのアレイ中の検出エレメン
トのサイズは２０μｍ２未満、好ましくは１０μｍ２未満、より好ましくは５μ
ｍ２未満、より好ましくは２μｍ２未満、より好ましくは１μｍ２以下である。
他の状況においては、検出エレメントのアレイ中の検出エレメントのサイズは、
５０００μｍ２以上、２０００μｍ２以上のごとき、より好ましくは１０００μ
ｍ２以上、５００μｍ２以上のごとき、または２００μｍ２以上でさえ、より好
ましくは１００μｍ２以上であって２００μｍ２未満、より好ましくは５０μｍ２ 以上であって１００μｍ２未満、より好ましくは２０μｍ２以上であって５０
μｍ２未満である。
【００５０】 検出エレメントのアレイは、好ましくは以下の領域の１または幾つかの波長の
電磁線に対して感度を有する：１００〜２００ｎｍ、２００〜６００ｎｍ、３０
０〜７００ｎｍ、４００〜８００ｎｍ、６００ｎｍ〜１μｍ、８００ｎｍ〜２μ
ｍ、２〜１０μｍ、５〜１０μｍ、１０〜２０μｍ、２０〜４０μｍ。
【００５１】 収集角（その中でシグナルが検出される全平面角度と定義される）を最大化す
るように検出エレメントに試料からのシグナルを焦点合わせするための焦点合わ
せシステムを含めることは、多くの状況において、評価に改善された状態を付与
することが判明している。予期せぬことに、かかる広い収集角を、焦点合わせに
用いた対物レンズが検出エレメントが設置されている面を異なって横切るいずれ
かの粒子の像の縦横比を歪ませるか、または分析する試料を横切る焦点合わせに
変動を生じる程度まででさえ、例えば試料中の粒子の数の評価に用い得ることが
判明した。
【００５２】 検出エレメントの縦横比は、粒子を評価するためのシグナルの収集において重
要となり得る。約１／１の比がしばしば好ましいが、ある条件下では１／１とは
異なる比を用いるのが好ましいこともあり得る。特に、このことが大きな体積の
いずれかの試料からのシグナルの検出を促進する場合、したがって、例えばより
多くの粒子の同時の評価が許容される。これらの環境下で、検出エレメントのア
レイ中の検出エレメントのより長い高さまたは幅に対するより短い高さまたは幅
の比は、実質的に１以下であり、好ましくは１／２未満であり、より好ましくは
１／４未満であり、より好ましくは１／１０であり、より好ましくは１／５０未
満であり、より好ましくは１／１００未満であり、より好ましくは１／２００未
満である。
【００５３】 好ましくはアレイ上に像を形成すべき比を表す別の方法は、検出エレメント上
の試料の個々の粒子の像化を考慮することである。個々の粒子は、せいぜい１０
０の検出エレメント、せいぜい８１の検出エレメントのごとき、せいぜい６４の
検出エレメントのごとき、せいぜい４９の検出エレメントのごとき、せいぜい３
６の検出エレメントのごとき、せいぜい２５の検出エレメントのごとき、特にせ
いぜい１６の検出エレメントおよびより好ましくはせいぜい９の検出エレメント
の上に像化するのが好ましい場合がある。そのパラメータまたはパラメータ群を
評価する個々の粒子はせいぜい５の検出エレメントまたはせいぜい１の検出エレ
メントの上でさえ像化するのがなおより好ましい。粒子当たりのエレメントの数
が大きければ大きい程、個々の粒子により多い情報が提供されるが、粒子当たり
のエレメントの数が少なければ少ない程、１の検出露光において生成し得る合計
カウントは増加するであろう。
【００５４】 試料の少なくとも一部分からのシグナルは、焦点合わせ手段を使用することに
よって、好ましくは１のレンズを使用することによって検出エレメントのアレイ
上に焦点合わせされるが、２のレンズ、または２を超えるレンズを使用すること
も可能である。焦点合わせシステムに使用するレンズの数は、いずれかの測定シ
ステムの複雑性に影響を及ぼし得る。
【００５５】 試料からのシグナルのいずれかの検出器上への焦点合わせは、いずれかの検出
器に対する試料の位置に依存する。測定システムの構造が試料およびいずれかの
検出器の相対位置を変化し得るような場合、システムの焦点合わせを調節するこ
とができる利点がある。このことは、しばしば、最初に試料からのいずれかのシ
グナルの少なくとも１の測定をとり、ついでこれに基づいてシステムの焦点合わ
せを調節することによって達成し得る。この手順は許容し得る焦点合わせを得る
ために多数回反復し得る。同様に、好ましくは調節の広がりが試料からのシグナ
ルの少なくとも１の測定によって決定する場合、試料または試料材料からのシグ
ナルの焦点合わせを調節する。
【００５６】 使用した焦点合わせ構造の収集角は、検出エレメントのアレイ上に収集される
いずれかのシグナルの強度に影響を及ぼし得る。したがって、高感度が必要であ
る場合には、収集角を増大させることが実際的である。収集角の好ましいサイズ
は、焦点深度のごときシステムに対して作成される他の要件によっても決定し得
る。これらの状況では、焦点合わせ手段の収集角は、好ましくは少なくとも２°
、好ましくは５°を超える、より好ましくは１５°を超える、より好ましくは２
０°を超える、より好ましくは５０°を超える、より好ましくは１２０°を超え
る、より好ましくは１５０°を超える。
【００５７】 検出されるシグナルは、実質的に以下のもののうちの１または幾つかによって
生じる：１０−６秒以下の状態の寿命を有するフォトルミネセンス、１０−６を
超える励起状態の寿命を有するフォトルミネセンス、化学ルミネセンス、レイリ
ー散乱、ラマン散乱、電磁線の減衰、電磁線の吸収、電磁線の散乱。
【００５８】 好ましくは検出エレメントの該アレイ中の１またはそれを超える検出エレメン
トについての各測定されたシグナルが１またはそれを超える所定の値（群）を有
する場合、より好ましくは各所定値が１またはそれを超えるいずれかの以前の測
定に基づいて決定される場合、１またはそれを超える検出エレメントから測定し
たシグナルは、計算手段を使用することによって体系的または変化するバイアス
について補正し得、バイアス補正は１またはそれを超える所定の値（群）を使用
することによって行う。
【００５９】 ある状況、例えば、アナログ−デジタル変換においては、出力チャネルまたは
その組み合せが実質的に異なるレベルを有する場合のその同定を該シグナルの強
度に相関させる場合、１または好ましくは１を超える出力チャネルが他の出力チ
ャネルとは実質的に異なるレベルを有するように２、好ましくは３、より好まし
くは４、より好ましくは５、より好ましくは６、より好ましくは７、より好まし
くは８、より好ましくは８を超えるレベルの別々の出力チャネルを調整すること
も興味深いものとなり得る。
【００６０】 いずれかの測定したシグナルの分析については、いずれかのシグナルの得られ
た強度がデジタル表示に変換されるようにシグナルをデジタル化することが必要
な場合がある。このことは、これらのチャネルのいずれが他のチャネルとは異な
るシグナルを有するかについての情報である一連のチャネルを有することによっ
て、あるいは、好ましくは二重表示と同様に、組み合わせを形成する１を超える
このチャネルを有することによってさえ行い得る。
【００６１】 検出手段によって検出されたシグナルの情報は、プロセシング、ディスプレイ
および所望により情報を保存するためにプロセッサーに入力する。 シグナル情報はプロセッサーに接続したディスプレイ上に表示し得、および／
または印刷し得る。表示された情報は、粒子の数、サイズ分布、形状もしくは分
類、励起波長、発光波長、倍率のごとき測定されたシグナルおよび／または使用
したシステムに関するいずれの種類の情報であってもよい。
【００６２】 例えば、検出エレメントからの測定されたシグナルについての情報を保存する
ために使用する保存容量は、製造コストにかなりの影響を及ぼすコンポーネント
の１である。したがって、検出エレメントのアレイ中の検出エレメントから測定
したシグナルを保存するために使用する実質的にいずれの保存容量手段を使用す
ることなく、パラメータの評価を行い得ることは興味深い。
【００６３】 一方、いずれの保存容量を使用しても評価を行うことが困難な場合、好ましく
は情報の画分のみしか保存できない場合があるが、好ましくはかかる保存容量の
量はすべての測定検出エレメントからの情報を保存することが必要とされるもの
よりも大きいべきである。
【００６４】 幾つかの状況においては、検出エレメントのアレイ中の検出エレメントからの
測定シグナルを保存容量によって保存し、保存容量は検出エレメントのアレイ中
の検出エレメントの数以下、好ましくは検出エレメントの数の１／２未満の、よ
り好ましくは検出エレメントの数の１／４未満の、より好ましくは検出エレメン
トの数の１／８未満の、より好ましくは検出エレメントの数の１／１６未満の、
より好ましくは検出エレメントの数の１／３２未満の、より好ましくは検出エレ
メントの数の１／６４未満の、より好ましくは検出エレメントの数の１／１２８
未満の、より好ましくは検出エレメントの数の１／２５６未満の、より好ましく
は検出エレメントの数の１／５１２未満の、より好ましくは検出エレメントの数
の１／１０２４未満の数の測定を保存することができる。
【００６５】 他のある種の状況においては、検出エレメントのアレイ中の検出エレメントか
らの測定シグナルは保存容量によって保存するのが有利であり、保存容量は検出
エレメントのアレイ中の検出エレメントの数よりも多い、好ましくは検出エレメ
ントの数の２倍以上の、より好ましくは検出エレメントの数の４倍以上の、より
好ましくは検出エレメントの数の８倍以上の、より好ましくは検出エレメントの
数の１６倍以上の、より好ましくは検出エレメントの数の３２倍以上の、より好
ましくは検出エレメントの数の６４倍以上の、より好ましくは検出エレメントの
数の１２８倍以上の、より好ましくは検出エレメントの数の２５６倍以上の、よ
り好ましくは検出エレメントの数の５１２倍以上の、より好ましくは検出エレメ
ントの数の１０２４倍以上の多数の測定を保存することができる。
【００６６】 その他、パラメータの評価のより複雑な局面では、かなりの量の保存容量を使
用することが要求される。したがって、この態様においては、使用する検出エレ
メントの１の測定で収集されるよりも多くの情報を保存し得る保存容量を有する
ことが必要となり得る。
【００６７】 計算手段、好ましくは検出エレメントの合計数の小画分に実質的に等しい量の
情報のみを保存し得る保存容量を備えたAnalogue Devices社から市販されている
デジタル・コンピュータ（ADSP2101）を使用し、ついで好ましくは各検出エレメ
ントからの測定した情報または検出エレメントのラインもしくは検出エレメント
の２またはそれを超えるラインが、測定された情報を保存することによって生じ
るものの他の遅延のごとき実質的にいずれの遅延もなく、データの実質的にリア
ルタイムのプロセシングに基づいて多数の対象物を評価することによって試料の
パラメータの相関および評価を作成することが可能である。
【００６８】 しかしながら、第２の計算手段、好ましくはデジタル・コンピュータによって
情報をプロセシングする前に第１の計算手段、好ましくはデジタル・コンピュー
タを使用することによって実質的にすべての測定した情報を保存し、したがって
、それが得られるのと実質的に同一速度であるがいずれかの情報と同一の情報の
プロセシングとの間に実質的な時間の遅延を有して測定した情報がプロセシング
されることが好ましい場合もあり；好ましくは、これは、１の測定手段のみ、好
ましくはタスクを実行するのに十分なリソースを備えたデジタル・コンピュータ
のみを使用することによって行う。
【００６９】 装置は低倍率または低拡大率で試料のパラメータを評価するのに特に有用であ
る。それによって、大面積の試料に関する情報を達成することが可能である。
【００７０】 倍率は焦点合わせ手段によって供され得る。かかる焦点合わせの倍率は、シス
テムの他のコンポーネントの構成、または粒子もしくは試料物質に依存して１／
１とは異なり得る。例えば、粒子の形状特性を評価する場合には拡大を行い得る
。
【００７１】 粒子が比較的小さい状況では、検出エレメントのアレイ上の生物粒子の像のサ
イズに対する生物粒子のサイズの比を１／１以下、好ましくは１／１未満であっ
て１／１００よりも高い、および１／１未満であって１／４０よりも高い、ある
いは他の好ましい状況では１／１未満であって１／１０よりも高いものとし得、
なおある状況においては該比は１／１未満であって１／４よりも高い、より好ま
しくは１／１未満であって１／２よりも高いものとするのが好ましい。
【００７２】 問題の粒子が検出エレメントのサイズに匹敵する寸法を有する場合には、約１
／１の倍率を有するのが好ましい場合があり、したがって、いずれかの粒子の像
はいずれか１または数個のみの検出エレメント上に焦点合わせされる。これは、
ある条件下では、いずれかのシグナルの好ましい検出を供する。
【００７３】 これらの状況下では、検出エレメント上の生物粒子の像のサイズに対する生物
粒子のサイズの比は、５／１０〜２０／１０の区間、好ましくは６／１０〜１８
／１０の区間、より好ましくは７／１０〜１６／１０の区間、より好ましくは８
／１０〜１４／１０の区間、より好ましくは９／１０〜１２／１０の区間であり
、より好ましくは１０／１０に実質的に等しい。
【００７４】 したがって、検出エレメントのアレイに露光される空間表示は、露光ドメイン
における元の線形寸法に対する検出エレメントのアレイ上の線形寸法の像の比が
４０：１よりも小さい、通常せいぜい２０：１、好ましくは１０：１よりも小さ
い、および多くの場合においてはせいぜい６：１または４：１よりも小さいこと
もある比の線形拡大に付すことが好ましい場合がある。
【００７５】 拡大は、好適には決定すべきパラメータ、特にそれに対してパラメータを評価
する粒子のサイズに相関させる。粒子のサイズは、粒子を球形粒子に近似させる
ことによって得られ、ここで下記に言及するサイズは粒子の直径に関係する。好
ましくは、粒子を球形粒子に近似させる場合、粒子の最小の寸法を直径として用
いる。したがって、例えば、サイズが１／３μｍないし３μｍのごとき０.１μ
ｍないし５μｍの場合、前記した比は、１０：１〜１：１０の範囲のごとき、好
ましくは４０：１〜１：１０の範囲、より好ましくは２０：１〜１：１０の範囲
である。実際に最良の結果を与えることが証明された大部分の具体例において、
比は６：１〜２：１の範囲である。
【００７６】 サイズが５μｍ〜１００μｍのごとき、３μｍ〜１００μｍのごとき１μｍ〜
１００μｍである場合、前記した比は通常３：１〜１：１００の範囲、好ましく
は２：１〜１：１００の範囲である。多くの実際の具体例においては、比は２：
１〜１：２の範囲であろう。特に小さい高精度の検出エレメントでは、１.４：
１〜１：１００の範囲のごとき非常に小さい比、例えば１：１〜１：１００の範
囲で作動することは興味深いこととなり得る。
【００７７】 予期せぬことには、像の縦横比が、粒子の評価に顕著なマイナスの影響を有す
ることなく、検出エレメントのアレイ上でかなり歪められ得ることが判明した。
かかる状況では、検出エレメントのアレイ上の生物粒子の像の２の寸法の長い方
に対する短い方の比は、生物粒子の対応する寸法の比に対して、実質的に１以下
、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／４以下、より好ましくは１／１０
以下、より好ましくは１／５０以下、より好ましくは１／１００以下、より好ま
しくは１／２００以下である。かかる状況では、検出エレメントのアレイ上の生
物粒子の像の２の寸法の長い方に対する短い方の比は、ある種の環境では、検出
エレメントのアレイによって広がる面積内で実質的に同一ではない。
【００７８】 本発明による装置は、１面型装置、すなわち、それに対して試料から発せられ
たシグナルを検出する側と同一の試料の側面から試料に対して励起光を指向する
装置として使用し得る。
【００７９】 この装置によって、従来の蛍光顕微鏡と比較して種々の利点が達成されている
。まず第１に、評価すべき試料を検出器と励起光との間の試料面にスライドさせ
る代わりに、試料面で直接評価すべくそれを配置することが可能である。さらに
、透明でない試料の表面蛍光を検出することが可能となった。
【００８０】 前記に言及したごとく、検出器を傷付けることなく励起光の強度を増加させる
ことも可能である。 また、それによって通常は顕微鏡に試料を配置することが可能でない性質を有
する試料も、顕微鏡を試料上に直接的に置き、それによって試料の表面が単純に
試料面を構成し得る点において、本発明のシステムを使用することによって評価
し得る。
【００８１】 最後に、励起光手段が検出器と同じ試料面の側に配置され、したがって従来の
装置と比較して少なくとも２５％、装置の軸が短くなる点において、よりコンパ
クトな、それによってより簡単に取り扱える装置を製造することが可能である。
【００８２】 本発明により、現在までフローサイトメトリー装置でしか信頼して評価されて
いなかった試料のパラメータを評価することが可能である。１の露光で大きな試
料のパラメータを評価することができ、したがって露光当たりにその部分のみを
評価することによって大きな試料を評価する場合に通常カウントされていた統計
学的誤差を減少することが可能である。
【００８３】 さらに、１の露光で試料から１を超える蛍光シグナルを得て、それによってそ
れらの異なる蛍光シグナルに起因して試料の粒子の分類を容易にすることが可能
である。
【００８４】 したがって、本発明による１面型装置は、種々の組合せで構成し得、これらは
すべて本発明の範囲内に入る。特に、以下に論じる主たる組合せを考える。
【００８５】 装置は光源と励起光フィルターが同一である単一蛍光装置として構成し得る。
【００８６】 少なくとも２の異なる蛍光シグナルを供する装置のごとき多重蛍光装置は、以
下のもののうちの少なくとも１によって提供し得る： ・第１および第２の光源、該光源は異なる波長の光を発する ・第１および第２のフィルターが異なり、それによって少なくとも２の異なる波
長の励起光が試料に露光される ・デュアルバンド・フィルターのごとき第１および第２の発光フィルターが異な
り、それによって少なくとも２の異なる蛍光シグナルが検出器（群）に発せられ
る。
【００８７】 しかしながら、本発明装置は二面型装置として構成し得、それによって励起光
を試料の両面から指向し得、あるいは試料の両面からシグナルを検出するために
検出手段を配置し得、あるいはその両方の組合せとし得ることもさらなる利点で
ある。
【００８８】 したがって、二面型装置とは、さらに： −第２の光面に位置する第２の励起光手段、該第２の光面は試料面と平行であ
って第１の光面とは反対の試料面のもう１の側に位置する −試料が第１の検出手段と第２の検出手段との間に位置するように配置された
第２の検出手段。それにより、１の露光検出によって試料からのシグナルに関す
る異なる情報を評価することが可能である。例えば、第１の検出手段は試料の粒
子の数を記録するように適合し得る一方、第２の検出手段は試料中の粒子の形状
を記録するように適合し得る と共に提供される本発明による装置を意味する。
【００８９】 好ましい具体例において、２面型装置には、２面型励起システムおよび２面型
検出システムの両方が含まれる。
【００９０】 第２の励起光手段は、第１の光手段に関連して論じたいずれかの光手段とし得
る。蛍光顕微鏡の目的に依存して、これらの光手段は異なるまたは同一とし得る
。
【００９１】 さらに、励起光は異なる波長帯を構成し、それによって異なる波長を有する発
光が達成される。第２の検出手段は、第１の検出手段に関連して論じたいずれの
検出手段ともし得る。
【００９２】 以下の表１は、本発明によるシステム構造の組み合わせの非−網羅的なリスト
を示す。
【００９３】
【表１】
【００９４】 Ｘは、各々、１のタイプの検出器、発光フィルター、励起源および励起フィル
ターを示し、Ｙは、各々、もう１のタイプの検出器、発光フィルター、励起源お
よび励起フィルターを示す。
【００９５】 配置番号１および２は、１面型システムに対応し、ここで配置２においては２
の異なる励起光源および／またはフィルターが利用されている。
【００９６】 配置番号３および４は、励起光の量を増加させるため（配置３）または異なる
タイプの励起光を加えるため（配置４）の２面型システムに対応する。 配置番号５および６は２面型検出システムであり、ここでは２の検出器は例え
ば異なる倍率を有するように異なる。配置番号６もさらに２重の励起を使用して
いる。
【００９７】 配置番号７は、励起ならびに検出に関する２面型システムである。全てのパラ
メータ、すなわち検出器、発光フィルター、励起源、および励起フィルターは２
面に対して異なり、試料からの広範な種々の情報を得る可能性を提供する。
【００９８】 配置番号８も、励起ならびに検出に関する２面型システムである。配置番号７
とは反対に、検出器および発行フィルターのみが２面に対して異なり、ここでも
、試料からの広範な種々の情報を得る可能性を提供する。
【００９９】 配置番号９および１０は、両方とも第２の検出器として顕微鏡を利用する。配
置番号１０においては、システムは励起源に関して２面型である。顕微鏡は、従
来の顕微鏡のごときいずれの種類の顕微鏡であってもよい。
【０１００】 上記に示したごとく、光源、フィルター、倍率および検出器のいずれの好適な
組合せをも本発明によって考えられ、組合せは本願において表して示すものに限
られない。下記に、２面型システムの好ましい具体例を論じる。
【０１０１】 装置は単一蛍光システムとし得、そこでは実質的に同一波長の励起光が２の側
から試料に露光される。それによって、励起光を強化し得る。
【０１０２】 ２面型励起光装置においては、第１の励起光手段は試料の１の側から１の波長
を試料に露光し、第２の励起光は試料のもう１の側から試料を露光する。もちろ
ん、第１の励起光および第２の励起光が、各々、異なる光源および／またはフィ
ルターを含み、それによって前記に論じたなおより多くの波長で試料を照射し得
ることは理解される。
【０１０３】 ２面型励起光装置は１の検出器を含み得、それによって該装置は部分的透過シ
ステムとして機能する。
【０１０４】 もう１の具体例において、２面式励起光装置は２の検出手段を含む。それによ
って、多量の情報を試料から得ることができる。１の態様において、２の検出手
段は鏡像であるが（２の検出手段の像は互いに鏡像である）、情報の確認を提供
する試料に関する等しい情報を得ることができる。
【０１０５】 本発明による装置は、１面型励起光手段を用いる２面型検出装置ともし得る。
それによって、１の検出器が試料を透過したシグナルを検出する。
【０１０６】 励起光の配置とは関係なく、２面型検出システムは、受けた情報の量を増加さ
せることができる。例えば、２の検出器によって異なる波長を受けることができ
、および／または異なる感度を有する異なる検出器を使用し得る。さらに、例え
ば２の検出器について異なる倍率を用いることによって、試料に関する情報を増
加させ得る。システムの１の側は、例えば低倍率によって試料の大面積中の粒子
の数を評価し得、システムのもう１の側は、より大きな倍率を用いることによっ
て粒子の形状を評価し得る。倍率の組合せは、例えば１：１および１：４、１：
１および１：１０、１：２および１：４、１：２および１：１０とし得る。２の
検出器から送られたシグナル情報は、好ましくは同じプロセッサーに移され、そ
れによって情報を別々に表示し得、ならびに組合せて表示し得、例えば特定の粒
子に関する特異的な形状情報およびもう１の検出器によって検出されたその数を
提供し得る。
【０１０７】 本発明による装置を２面型装置として使用することも可能であり、そこではも
う１の側は従来の光学顕微鏡またはいずれかのタイプの顕微鏡である。システム
のもう１の側を非−蛍光顕微鏡として用いる場合、顕微鏡用の照明光は顕微鏡に
対して試料のいずれの側にも好適に配置し得る。１の側に従来の顕微鏡を含む２
面型装置は、システムの蛍光部用の１面型または２面型励起光システムを含み得
る。
【０１０８】 ２面型検出システムを用いる場合、第１の検出手段は、そのうえ、装置を単純
化するために第２の検出手段かシグナルデータを受けることができる。しかしな
がら、各検出手段にるいて別々のプロセッサーを取り付けることが可能である。
【０１０９】 装置への電力の供給源は、−１５０ないし１５０ボルトの交流電圧、または−
２５０ないし３５０ボルトの交流電圧、または−３５０ないし３５０ボルトを有
する交流電源を実質的に直流電圧に変換し得る変圧器とし得る。
【０１１０】 さらに、本発明は、試料からの蛍光シグナルを評価する方法に関し、ここでは
、前記に論じたごとく試料を装置の試料面に配置する。 該発明によれば、試料の第１の表面が少なくとも１第1の光源を有する第１の
光手段からの励起光に直接露光され、第１の表面からの蛍光シグナルが焦点合わ
せ手段の使用によって検出器（群）上に焦点合わせされ、検出器（群）によって
検出される。検出されたシグナルはプロセシングされ、それによってシグナルデ
ータが得られる。ついで、これらのシグナルデータは、評価すべきパラメータに
関連付けられ、最終的に試料のパラメータが評価される。
【０１１１】 試料は、それから蛍光シグナル（群）を検出するこに好適であるいずれの試料
であってもよい。多くの適用において、試料は液体試料であり、その内容物を評
価する。蛍光シグナルは、試料中の粒子の数および／または試料中の粒子の形状
のごとき試料中の粒子のパラメータに関連付ける場合もある。特に、この場合に
は、本発明による２面型装置に該方法を適合させるのが有利であり、それによっ
て、各々を個々の検出手段によって、両方のパラメータを同時に評価し得る。
【０１１２】 それによって、該発明は下記のもののごとき広範な種々の適用に適用し得る： 本発明により、前記した種々のタイプの生物粒子を分析し得、したがって本発
明は下記の適用における液体試料材料中の粒子の数の評価に特に好適である： 特に、乳製品目的のミルクのごときミルク試料の分析に関して本発明は好適で
ある。ミルクでは、本発明を適用して、ミルク中の体細胞のサイズおよび／また
は数のごとき体細胞を分析し得る。さらに、分析をミルク中の細菌に関して行い
得る。
【０１１３】 ミルクはミルクの処理のいずれの時点においても分析し得るが、本発明はミル
クを搾乳の間に分析するオン−ラインまたはアット−ライン分析に特に好適であ
る。デバイスに取込まれた種々の操作により、研究室技術の分野に熟練していな
い人でも有効な結果を行い得る。
【０１１４】 血液分析に関しては、装置は種々の血液細胞のタイプの数、形状および型の評
価のごとき血液粒子に対する全ての評価に好適である。
【０１１５】 本発明は研究室または細胞カウントおよび差カウントの一般的な実施に用い得
る。さらに、本発明は、例えば癌治療のごとき治療に関連する全細胞カウントを
制御する場合に、患者によって用い得る。
【０１１６】 本発明により、例えば合計細胞カウントの評価が尿管感染症と関連して必要な
場合に、細菌について尿試料を分析し得る。
【０１１７】 また、本発明は、細菌タイプのごとき尿管感染症の特異的な症例を診断する場
合に使用し得る。
【０１１８】 さらに、本発明の装置で精液を評価し得る、例えば精子のカウント、生存精子
および／または死滅精子の合計カウントならびにカウントを行い得る。また、精
子の形状を本発明の装置によって 調べ得る。
【０１１９】 飲料水の制御、水精製プラントからの廃水または水の制御のごとき、水中の粒
子の評価を本発明によって行い得る。すべての適用において、制御は細菌カウン
トのごとき合計粒子カウントに関連付け得、あるいはそれは特に病原性細菌のご
とき特異的な細菌に対するモニタープロセスに関連し得る。
【０１２０】 細菌の評価に関して、本発明は食品または飼料飼料ならびに石油化学試料（例
えば、航空機燃料用のもの）と結合しても使用し得る。
【０１２１】 さらに、醗酵制御、すなわち醗酵槽中の細胞増殖および生存細胞の制御を本発
明により行い得る。これは、ペプチドまたはタンパク質組成物を製造する医薬産
業のごとき醗酵を用いる全技術分野に関連する。
【０１２２】 液体のパラメータを評価する場合、前記した評価の間に液体を封入するための
試料コンパートメントと共に装置を準備するのが好ましい。
【０１２３】 本発明の方法によって、動物組織または細胞凝集物の一部、植物材料などのご
とき固形材料のパラメータを評価することも可能である。固形材料を評価する場
合、該材料の一部は試料面に配置し得る。しかしながら、本発明による装置を、
動物または植物の大きな部分上に直接配置して、検出エリアで励起可能な動物ま
たは植物の部分を評価することが可能である。
【０１２４】 例えば、個人の皮膚の色素斑を調べる場合、あるいは細菌または菌類の増殖を
例えば動物またはヒトでイン・サイチュで検出する場合に、該発明を適用し得る
。
【０１２５】 また、該発明は、犯罪分野における技術的検査のツールとしてノートを含む書
類の確認のごとき非−有機材料、または金属構造のごとき種々の構造における欠
陥を検出する場合、微細な欠陥を発見するのが困難な場合などにも適用し得る。
【０１２６】 下記に本発明を図面に参照してより詳細に論じる。 図１中では、本発明による装置１を概略様式で示す。試料は試料面の試料コン
パートメントに配置する。励起光手段３の光源４ａ、４ｂからの励起光は、主光
路５ａ、５ｂを通って試料に露光される。
【０１２７】 試料からの蛍光シグナルは少なくとも１の検出器７を含む検出手段６に発光さ
れる。発光されたシグナルの通路は、試料と検出器との間の軸、すなわち検出−
試料軸８にたどっている。
【０１２８】 シグナルデータは、検出手段６に結合したプロセッサー（図示せず）に伝送さ
れる。試料からの蛍光シグナルは薄幸フィルター１４によって濾過され、フォー
カシングレンズ１０によって検出手段９に焦点合わせされる。
【０１２９】 光源４ａ、４ｂは光ハウジング１１中に配置され、それによって検出手段への
励起光の直接的な伝送が回避される。さらに、励起光フィルター１２ａ、１２ｂ
が励起光線に位置する。
【０１３０】 図２は励起光フィルターの円形支持材料１３の断面図を示し、ここでは光源の
位置が破線の円によって示されている。
【０１３１】 図３においては、光路およびシグナル路をより詳細に示している。光路では主
光路を５として示している。さらに、検出−試料軸を破線８によって示している
。システムの収集角は２の矢印の間で示すＣで図示し、主光路と検出−試料軸の
間の角度をＥで図示する。
【０１３２】 図４においては、２面型励起／検出システム１を示し、ここでは試料の各側の
システムは同一であって、図１の１面型システムについて記載したのと同様であ
る。
【０１３３】 図５は、２面型励起システムを示し、ここでは第１の励起光手段３ａ中の光源
４ａ、４ｂからの励起光および第２の励起光手段３ｂ中の光源４ａ、４ｂからの
励起光は試料２の両側から試料２に露光される。前記に論じたごとく、光源は評
価すべき情報に依存して同一であっても異なっていてもよい。さらに、各光源に
用いるフィルターも異なっていても同一であってもよい。
【０１３４】 蛍光シグナルは、励起光の配置に起因して試料を透過および反射し、検出手段
６に発せられる。発光されたシグナルの路は、試料と検出器との間の軸、すなわ
ち検出−試料軸８をたどる。
【０１３５】 シグナルデータは前記したごとく検出手段に結合したプロセッサーに伝送され
る。
【０１３６】 図６は、１面型励起システムを用いた２面型検出システムを示し、ここでは試
料２から反射した蛍光シグナルが検出器７ａを含む検出手段６ａによって検出さ
れる。反射した蛍光シグナルはフィルター１４ａを介して伝送され、レンズ１０
ａによって焦点合わせされる。
【０１３７】 さらに、試料２から伝送された蛍光シグナルは、検出器７ｂを含む検出手段６
ｂによって検出される。反射した蛍光シグナルはフィルター１４を通過し、レン
ズ１０ｂによって焦点合わせされる。
【０１３８】 フィルター１４ａは好ましくはフィルター１４ｂとは異なり、それによって、
少なくとも２の異なる蛍光シグナルに関する情報を得ることができる。
【０１３９】 また、２の検出システムにおける倍率は、例えばレンズ１０ａの倍率がレンズ
１０ｂとは異なるように、異なっていてもよい。
【０１４０】 実施例 本発明による得られた細胞の像 ミルク中の体細胞の数の評価は、図１および図２に示すシステム構造中の試料
コンパートメント中に存在する細胞核内のＤＮＡに結合した蛍光色素を起源とす
る蛍光シグナルを検出することによって行う。試料コンパートメントは、透過性
の材料の２の実質的に平行な面によって画定され、したがって約６×８×０.０
７ｍｍ（高さ、幅、深さ）の寸法を有するコンパートメントを形成する。本実施
例においては、試料コンパートメントはディスポーザブル・カセットの一体化さ
れた一部分である。
【０１４１】 蛍光は、試料コンパートメントに高エネルギーの光（波長５５０ｎｍ未満の励
起光）を通過させることによって生成させる。励起光の源は、図２に図示するご
とく配置された８の発光ダイオードを含む、図１に図示するごとき本発明による
光源である。発光ダイオードはタイプＮＳＰＧ−５００Ｓ（日亜化学工業株式会
社、日本）である。
【０１４２】 試料コンポーネントに到達する約５５０ｎｍよりも長い波長を有する励起光か
らいずれの成分も実質的に除去するために、光学フィルターが光路に挿入されて
いる。この光学フィルターは光源に一体化され、いずれの試料コンパートメント
から発せられた光も通過できる中部に円形孔を有する円形ディスクとして備えら
れている（さらなる説明については図２を参照されたい）。このフィルターはFe
rroperm ＳＷＰ５５０型であり、これは赤外線を吸収する２ｍｍ基体（Hoya, Ｃ
Ｍ-５００）上の２面型の干渉フィルターである。
【０１４３】 試料コンパートメントから発せられた光は、レンズを使用することによって検
出モジュールのセンサー上に焦点合わせされる。このレンズは開口数０.１０を
有する標準×４の顕微鏡対物レンズである（１の供給者はG. J. Carl Hansens R
ftf., Denmark）である。レンズは、元の対象とほぼ同じサイズを有する検出モ
ジュールのセンサー上の試料コンパートメントに対象の像が得られるように（ほ
ぼ×１の倍率）配置される。
【０１４４】 検出モジュールに到達することから、約５７５ｎｍ以下の波長を有する試料コ
ンパートメントから発せられた光から実質的にいずれの成分をも除去するために
、光学フィルターが光路に挿入されている。このフィルターはSchott ＯＧ５９
０型（厚さ３ｍｍ）のものである。
【０１４５】 試料コンパートメントからの濾過された光は、ＩＣ×０５４ＢＬ-６型の電荷
結合素子（ＣＣＤ）（Sonyによって供給されている）によって検出する。
【０１４６】 ＣＣＤからの電気情報は増幅され、アナログ−デジタル変換モジュール（ＡＤ
Ｃ）によって測定する。この情報を整えて記録情報の像表示を得ることができる
。１のかかる像を図７に示す。
【０１４７】 図７の像は、本発明による光源からの光で励起した場合の、約１％のTriton
Ｘ−１００およびＤＮＡ染色用色素として約３０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウ
ム（CAS−25535−16−4）を含有するミルク溶液竜の体細胞の試料から記録され
た発光結果である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明による装置の概略図である。
【図２】 図２は励起光フィルターの円形支持材料１３の断面図を示す。
【図３】 図３は光路およびシグナル路を示す。
【図４】 図４は２面側型励起／検出システムを示す。
【図５】 図５は２面型励起システムを示す。
【図６】 図６は１面型励起システムを用いた２面型検出システムを示す。
【図７】 ミルク溶液中の体細胞の試料から記録された発光結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA01 BA16 CA04 EA01 EA03 FA02 FA06 GA02 HA01 HA07 JA02 JA03 LA03 2G045 AA02 AA24 AA25 AA28 CA25 CB01 CB03 CB17 CB20 CB21 DA12 DA13 FA12 FA16 FB12 GA01 GC15 GC22 JA01 JA07

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 −少なくとも第１の光源を含む第１の励起光手段、ここに該
    第１の光源は主光路を有し、 −該試料を設置するための試料面、 −試料からの蛍光シグナルを検出するための少なくとも第１の検出器を含む検
    出手段、ここに該検出手段と試料面との間の軸は検出−試料軸であり、 −検出器（群）からのデータを受けるために結合したプロセッサー、 −シグナルを検出手段に焦点合わせするための焦点合わせ手段、ここに該焦点
    合わせ手段は収集角を有する、を含み ここに、第１の光源の励起主光路と検出−試料軸との間の角度が、収集角／２
    ないし９０°の範囲であることを特徴とする試料の蛍光を検出するための装置。
  2. 【請求項２】 少なくとも第１の光手段が試料面に平行な第１の光面に設置
    され、ここに該第１の光面が試料面と第１の検出手段との間に存在する請求項１
    記載の装置。
  3. 【請求項３】 光源が発光ダイオード、レーザーダイオード、レーザー、発
    熱光源およびガス放出ランプよりなる群から選択される請求項１または２記載の
    装置。
  4. 【請求項４】 励起光フィルターが少なくとも１の光源からの励起光路に挿
    入された請求項１〜３いずれか１項記載の装置。
  5. 【請求項５】 励起光が少なくとも２の光源と同様に配置されている請求項
    ４記載の装置。
  6. 【請求項６】 実質的に同一のフィルターを全ての光源に用いる請求項１〜
    ５いずれか１項記載の装置。
  7. 【請求項７】 各光源用の励起光フィルター（群）が支持材料上で互いに連
    結されている請求項５または６記載の装置。
  8. 【請求項８】 支持材料が円形、方形、四角形、半円形から選択される形状
    を有する請求項６または７記載の装置。
  9. 【請求項９】 第１の光源が第１のフィルターを通して濾過され、第２の光
    源が第２のフィルターを通して濾過され、ここに該第１のフィルターおよび該第
    ２のフィルターが異なっている請求項１〜８いずれか１項記載の装置。
  10. 【請求項１０】 第２の励起光手段が第２の光面に位置し、ここに該面が試
    料面と平行であって第１の光面よりも試料面のもう１の側に位置して試料が２の
    側からの励起光を受けることができる請求項１〜９いずれか１項記載の装置。
  11. 【請求項１１】 第２の光手段からの光路に挿入されたフィルターが、第１
    の光手段の光路に挿入されたフィルターと異なる請求項１０記載の装置。
  12. 【請求項１２】 第２の検出手段が、試料面が第１の検出手段と第２の検出
    手段との間に位置するように配置された請求項１〜１１いずれか１項記載の装置
    。
  13. 【請求項１３】 第１の検出手段が検出デバイスのアレイである請求項１〜
    １２いずれか１項記載の装置。
  14. 【請求項１４】 第１の検出手段が電荷結合素子のアレイである請求項１３
    記載の装置。
  15. 【請求項１５】 第１の検出手段が第２の検出手段と同一である請求項１２
    〜１４いずれか１項記載の装置。
  16. 【請求項１６】 発光フィルターが少なくとも第１の検出器への発光路に挿
    入された請求項１〜１５いずれか１項記載の装置。
  17. 【請求項１７】 発光フィルターが干渉フィルター、着色フィルターおよび
    偏光フィルターよりなる群から選択される請求項１６記載の装置。
  18. 【請求項１８】 焦点合わせ手段がレンズである請求項１〜１７いずれか１
    項記載の装置。
  19. 【請求項１９】 試料の検出面積が少なくとも０.１ｍｍ２、好ましくは少
    なくとも０.５ｍｍ２、より好ましくは少なくとも１ｍｍ２である請求項１〜１
    ８いずれか１項記載の装置。
  20. 【請求項２０】 励起主光路と検出−試料との間の角度が３５ないし９０°
    、好ましくは４５ないし８５°、より好ましいは５０ないし８０°の範囲である
    請求項１〜１９いずれか１項記載の装置。
  21. 【請求項２１】 少なくとも第１の光手段が試料面に平行である第１の光面
    に設置され、ここに該第１の光面が検出器の背後の試料面から一定の距離に位置
    する請求項１および３〜２０いずれか１項記載の装置。
  22. 【請求項２２】 検出器が試料に向かう開口部を有するハウジング中に位置
    する請求項２１記載の装置。
  23. 【請求項２３】 焦点合わせ手段が２／１〜１／１０の範囲、好ましくは２
    ／１〜１／４の範囲、より好ましくは２／１〜１／２の範囲の倍率を供する請求
    項１〜２２いずれか１項記載の装置。
  24. 【請求項２４】 −試料を試料面に配置し、 −試料の第１の表面を少なくとも第１の光源を有する第１の光手段からの励起
    光で直接的に露光し、 −焦点合わせ手段を用いることによって、試料の第１の表面からの蛍光シグナ
    ルを少なくとも第１の検出器を含む第１の検出手段上で検出し、 −検出したシグナルをプロセシングしてシグナルデータを得、 −シグナルデータを評価すべきパラメータに相関させ、ついで −パラメータを評価する ことを含む試料のパラメータを評価する方法。
  25. 【請求項２５】 少なくとも第１の光手段が試料面に平行である第１の光面
    に設置され、ここに該第１の光面が試料面と第１の検出手段との間に存在する請
    求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 光源が発光ダイオードである請求項２４または２５記載の
    方法。
  27. 【請求項２７】 励起光フィルターが少なくとも１の光源からの励起光路に
    挿入された請求項２４〜２６いずれか１項記載の方法。
  28. 【請求項２８】 励起光が支持材料上に光源として配置された請求項２５記
    載の方法。
  29. 【請求項２９】 実質的に同一のフィルターを全ての光源に用いる請求項２
    ４〜２８いずれか１項記載の方法。
  30. 【請求項３０】 第１の光源が第１のフィルターを通して濾過され、第２の
    光源が第２のフィルターを通して濾過され、ここに該第１のフィルターおよび該
    第２のフィルターが異なる請求項２４〜２８いずれか１項記載の方法。
  31. 【請求項３１】 さらに、試料の第２の表面を少なくとも１の光源を有する
    第２の光手段からの励起光で直接的に露光することを含む請求項２４〜３０いず
    れか１項記載の方法。
  32. 【請求項３２】 第２の励起光手段が第２の光面に位置し、ここに該面が試
    料面と平行であって第１の光面よりも試料面のもう１の側に位置して試料が２の
    側の表面で露光される請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 第２の光手段からの光路に挿入されたフィルターが、第１
    の光手段の光路に挿入されたフィルターと異なる請求項３１または３２記載の方
    法。
  34. 【請求項３４】 第２の検出手段が、試料コンパートメントが第１の検出手
    段と第２の検出手段との間に位置するように配置された請求項２４〜３３いずれ
    か１項記載の方法。
  35. 【請求項３５】 第１の検出手段が検出デバイスのアレイである請求項２４
    〜３４いずれか１項記載の方法。
  36. 【請求項３６】 第１の検出手段が電荷結合素子のアレイである請求項３３
    記載の方法。
  37. 【請求項３７】 第１の検出手段が第２の検出手段と同一である請求項３４
    〜３６いずれか１項記載の方法。
  38. 【請求項３８】 発光フィルターが少なくとも第１の検出器への発光路に挿
    入された請求項２４〜３７いずれか１項記載の方法。
  39. 【請求項３９】 コリメーターレンズが発光路に配置された請求項２４〜３
    ８いずれか１項記載の方法。
  40. 【請求項４０】 試料面が検出面積と共に配された請求項２４〜３９いずれ
    か１項記載の方法。
  41. 【請求項４１】 該検出面積が少なくとも０.１ｍｍ２、好ましくは少なく
    とも０.５ｍｍ２、より好ましくは少なくとも１ｍｍ２である請求項４０記載の
    方法。
  42. 【請求項４２】 試料コンパートメントが、試料を収容するための試料面に
    配置された請求項２４〜４１いずれか１項記載の方法。
  43. 【請求項４３】 励起主光路と検出−試料軸との間の角度が３５ないし９０
    °、好ましくは４５ないし８５°、より好ましいは５０ないし８５°の範囲であ
    る請求項２４〜４２いずれか１項記載の方法。
  44. 【請求項４４】 少なくとも第１の光手段が試料面に平行である第１の光面
    に設置され、ここに該第１の光面が検出器の背後の試料面から一定の距離に位置
    する請求項２４記載の方法。
  45. 【請求項４５】 検出器が開口部を有するハウジング中に位置して発せられ
    たシグナルを検出器（群）に到達させる請求項４４記載の方法。
  46. 【請求項４６】 試料が液体試料である請求項２４〜４５いずれか１項記載
    の方法。
  47. 【請求項４７】 蛍光シグナルを試料中の粒子のパラメータに関係付ける請
    求項４６記載の方法。
  48. 【請求項４８】 粒子の数を評価する請求項４６または４７記載の方法。
  49. 【請求項４９】 粒子の形状を評価する請求項４６〜４８いずれか１項記載
    の方法。
  50. 【請求項５０】 粒子の数を第１の検出手段によって評価し、粒子の形状を
    第２の検出手段によって評価する請求項４９記載の方法。
  51. 【請求項５１】 試料が蛍光シグナルを発することができる固形材料の一部
    分である請求項２４〜４６いずれか１項記載の方法。
  52. 【請求項５２】 試料が組織、部分および／または細胞凝集物である請求項
    ５１記載の方法。
  53. 【請求項５３】 試料が書類またはノートである請求項５１記載の方法。
  54. 【請求項５４】 試料が金属からの欠陥シグナルを検出するための金属構造
    の一部分である請求項５０記載の方法。
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