JP2003530082A6 - Compositions and methods for treating immune related diseases - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規なタンパク質を含有する組成物、及びその組成物を使用する免疫関連疾患の診断又は治療のための方法に関する。The present invention relates to compositions containing novel proteins, and methods for diagnosing or treating immune-related diseases using the compositions.
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は免疫関連疾患の診断と治療に有用な組成物と方法に関する。
（発明の背景）
免疫関連及び炎症疾患は、正常な生理においては、侵襲又は傷害に反応し、侵襲又は傷害からの修復を開始し、異物性生物体に対する生得的及び後天性防御を備えるために重要である、かなり複雑で、しばしば複数の相互に関連した生物的経路の現れ又は結果である。疾患又は病状は、これらの正常な生理学的経路が、反応の強度に直接関連したものとして、異常な調節又は過度な刺激の結果として、自己に対する反応として、又はこれらの組合せとして、さらなる侵襲又は傷害を引き起こす場合に生じる。
これらの疾患の発生は、多くの場合、多段階経路を含み、しばしば複数の異なる生物学的システム／経路を含むが、一又は複数のこれらの経路の重要な点での介入は改善又は治療効果を有し得る。治療的介入は、有害なプロセス／経路の拮抗か、又は有益なプロセス／経路の刺激のいずれかにより生じ得る。
【０００２】
多くの免疫関連疾患が知られており、広範囲にわたって研究されている。このような疾患には、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、免疫欠損症、異常増殖等が含まれる。
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は哺乳動物の免疫反応の重要な成分である。Ｔ細胞は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）内の遺伝子によりコードされる自己分子と結合している抗原を認識する。抗原は抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片等々の表面にＭＨＣ分子と共に表示され得る。Ｔ細胞系は宿主哺乳動物の健康を脅かすこれらの改変細胞を除去する。Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞と細胞障害性Ｔ細胞を含む。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞上の抗原−ＭＨＣ複合体の認識に続いて広範囲に増殖する。またヘルパーＴ細胞は種々のサイトカイン、すなわちリンホカインを分泌し、これが、Ｂ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、及び免疫反応に寄与する種々の他の細胞の活性化において中心的な役割を担う。
体液性及び細胞媒介性免疫反応の双方においての中心的事象は、ヘルパーＴ細胞の活性化とクローン性増殖である。ヘルパーＴ細胞の活性化は、抗原提示細胞の表面上の抗原−ＭＨＣとのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体の相互作用により開始させられる。この相互作用は休止ヘルパーＴ細胞を誘発して細胞周期（Ｇ０からＧ１転移）へ入らせる生化学的事象カスケードを媒介し、その結果、ＩＬ−２と、時にはＩＬ−４に対する高親和性レセプターを発現させる。活性化されたＴ細胞は周期を通じて進展し、増殖しメモリー細胞又はエフェクター細胞に分化する。
ＴＣＲによって媒介されたシグナルに加えて、Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞によって放出されるサイトカインにより、又は抗原提示細胞とＴ細胞上の膜結合性分子との相互作用により誘発されるさらなる同時刺激に関与している。サイトカインＩＬ−１及びＩＬ−６は同時刺激シグナルを提供することが示されている。また、抗原提示細胞の表面に発現したＢ７分子とＴ細胞表面に発現したＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４分子との相互作用によりＴ細胞の活性化がなされる。活性化したＴ細胞は増加した数の細胞接着分子、例えばＩＣＡＭ−１、インテグリン、ＶＬＡ−４、ＬＦＡ−１、ＣＤ５６等を発現する。
【０００３】
混合リンパ球培養又は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞の増殖は、化合物が免疫系を刺激する能力の確立された指標である。多くの免疫反応において、炎症細胞は傷害又は感染部位に浸潤する。移動細胞は、患部組織の組織学的検査により定量可能な好中球、好酸球、単球又はリンパ球でありうる。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編，１９９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．。
免疫関連疾患は免疫反応を抑制することにより治療することができる。免疫刺激活性を有する分子を阻害する中和抗体を使用することは、免疫媒介及び炎症疾患の治療に有用である。免疫反応を阻害する分子は免疫反応の阻害に用いることができ（タンパク質を直接、又は抗体アゴニストの使用を介して）、よって免疫関連疾患を改善する。
【０００４】
（発明の概要）
Ａ．実施態様
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における免疫関連疾患の診断と治療に有用な組成物と方法に関する。本発明は、哺乳動物における免疫反応を刺激又は阻害するタンパク質（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）の同定に基づいている。免疫関連疾患は免疫反応を抑制又は増強することで治療することができる。免疫反応を増強する分子は、抗原に対する免疫反応を刺激又は強化する。免疫反応の増強が有益である場合には、免疫反応を刺激する分子が治療に使用可能である。あるいは、免疫反応の鎮静が有用である場合（例えば炎症）には、抗原に対する免疫反応を鎮静又は低減するといった、免疫反応を抑制する分子（例えば中和抗体）を治療的に使用することができる。従って、ＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト及びアンタゴニストは、免疫関連及び炎症疾患の治療のための医薬及び薬物の調製に有用である。特定の態様では、このような医薬及び薬物は、製薬的に許容可能な担体と共に、治療的有効量のＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する。好ましくは、混合物は滅菌される。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含んでなる、ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。好ましくは、ＰＲＯポリペプチドは天然配列ＰＲＯポリペプチドである。特定の態様では、ＰＲＯアゴニスト又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ抗体である。
【０００５】
他の実施態様では、本発明は、担体又は賦形剤と混合されてＰＲＯポリペプチド又は該ポリペプチドと結合するアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を含んでなる組成物に関する。一態様では、組成物は治療に有効な量のポリペプチド又は抗体を含む。他の態様では、組成物が免疫刺激分子を含むとき、組成物は、（ａ）その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を増大させ、（ｂ）その必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は増強し、（ｃ）抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるＴ−リンパ球の増殖を増加させ、（ｄ）Ｔ−リンパ球の活性を刺激し、又は（ｅ）血管透過性を増加させるのに有用である。さらなる態様では、組成物が免疫阻害分子を含むとき、組成物は、（ａ）その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を減少させ、（ｂ）その必要とする哺乳動物における免疫反応を阻害又は低減させ、（ｃ）Ｔ−リンパ球の活性を低減し、又は（ｄ）抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるＴ−リンパ球の増殖を減少させるのに有用である。他の態様では、組成物は、例えばさらなる抗体又は細胞障害又は化学療法剤であり得るさらなる活性成分を含有する。好ましくは、組成物は滅菌されている。
【０００６】
他の実施態様では、本発明は有効量のＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はそのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む、その必要とする哺乳動物における免疫関連疾患を治療する方法に関する。好ましい態様では、免疫関連疾患は、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、骨関節症、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症ミオパシー、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少、甲状腺炎、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患からなる群から選択される。
【０００７】
他の実施態様では、本発明は上述の又は下記のポリペプチドの何れかに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、該抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は単鎖抗体である。一態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。他の態様では、抗体はＰＲＯポリペプチドの活性を模倣し（アゴニスト抗体）、又は逆に抗体がＰＲＯポリペプチドの活性を阻害又は中和する（アンタゴニスト抗体）。他の態様では、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）残基を有する。抗体は標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよい。さらなる態様では、抗体は抗体断片、モノクローナル抗体、単鎖抗体、又は抗イディオタイプ抗体である。さらなる他の実施態様では、本発明は製薬的に許容可能な担体と混合して、抗ＰＲＯ抗体を含有する組成物を提供する。一態様においては、該組成物は製薬的有効量の抗体を含む。好ましくは該組成物は滅菌されている。組成物は、貯蔵時の安定性の延長が達成されるように保存できる、液状製薬用製剤の形態で投与されてもよい。あるいは、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体、又は単鎖抗体である。
【０００８】
さらなる実施態様では、本発明は：
（ａ）ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する組成物；
（ｂ）該組成物を収容する容器；及び
（ｃ）免疫関連疾患の治療における該ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの使用に言及した、該容器に添付されたラベル又は該容器に含められた包装挿入物を具備する製造品を提供する。該組成物は、治療的有効量のＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含んでいてもよい。
【０００９】
さらなる他の実施態様では、本発明は、（ａ）哺乳動物から得た組織細胞の試験試料における、及び（ｂ）同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における、ＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含む、哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法に関し、ここで、対照試料と比較して試験試料の発現レベルが高い又は低いと、試験組織細胞を得た哺乳動物に免疫関連疾患が存在することを示す。
他の実施態様では、本発明は（ａ）抗ＰＲＯ抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料に接触させ、（ｂ）試験試料中における、ＰＲＯポリペプチドと抗体との複合体形成を検出することを含む哺乳動物における免疫疾患の診断方法に関し、ここで、該複合体の形成は、該疾患の有無を示す。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における複合体形成をモニターして比較することで実施してもよい。試験試料中に生成される多量の複合体は、試験組織細胞が得られた哺乳動物における免疫疾患の有無を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を有する。複合体生成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光測定、又は他のこの分野で知られた技術によりモニターすることができる。通常、試験試料は、免疫システムに欠陥又は異常があると疑われる個体から採取される。
【００１０】
他の実施態様では、本発明はＰＲＯポリペプチドを含有すると思われる細胞の試験試料を抗ＰＲＯ抗体に暴露し、該細胞試料に対する該抗体の結合性を測定することを含んでなる、試料中におけるＰＲＯポリペプチドの有無を決定する方法を提供する。特定の態様では、試料は、ＰＲＯポリペプチドを含有すると思われる細胞と、細胞に結合する抗体を含む。抗体は、好ましくは検出可能に標識化され、及び／又は固体支持体に結合される。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージ中に抗ＰＲＯ抗体と担体を含んでなる免疫関連疾患の診断キットに関する。キットは好ましくはＰＲＯポリペプチドの有無を検出するために抗体を使用するための説明書を含む。好ましくは、担体は製薬的に許容可能なものである。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージに抗ＰＲＯ抗体を含んでなる診断キットに関する。好ましくはキットはＰＲＯポリペプチドを検出するための抗体を使用するための説明書を含む。
【００１１】
他の実施態様では、本発明は哺乳動物から得た組織細胞の試験試料におけるＰＲＯポリペプチドの有無を検出することを含む、哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法を提供し、ここで、該試験試料におけるＰＲＯポリペプチドの有無が該哺乳動物に免疫関連疾患が存在することを示す。
他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供し、それは：
（ａ）細胞とスクリーニングされる試験化合物とを、ＰＲＯポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ；
（ｂ）前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、前記細胞性反応の誘発が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。
【００１２】
他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに候補化合物を、これら２つの成分を互いに作用させるのに十分な時間と条件の下で接触させ、ＰＲＯポリペプチドの活性が阻害されているかどうかを決定することを含んでなる、ＰＲＯポリペプチドの活性を阻害可能な化合物を同定する方法に関する。特定の態様では、候補化合物又はＰＲＯポリペプチドのどちらかは固体支持体上に固定される。他の態様では、非固定成分は検出可能な標識を保有する。好ましい態様では、この方法は、
（ａ）細胞とスクリーニングされる試験化合物とを、ＰＲＯポリペプチドが存在し、ＰＲＯポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ；
（ｂ）前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアンタゴニストであるか否かを決定する過程を含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、通常はＰＲＯポリペプチドを発現する細胞におけるＰＲＯポリペプチドの発現を阻害する化合物の同定方法を提供し、該方法は、細胞と試験化合物とを接触させ、ＰＲＯポリペプチドの発現が阻害されるか否かを測定することを含む。好ましい態様では、この方法は：
（ａ）細胞とスクリーニングされる試験化合物とをＰＲＯポリペプチドを発現させるのに適した条件下で接触させ；
（ｂ）前記ポリペプチドの発現の阻害を測定する過程を含んでなる。
【００１３】
さらなる実施態様において、本発明は免疫関連疾患を患っている哺乳動物の該疾患の治療方法に関し、それは、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストのいずれかをコードする核酸分子を哺乳動物に投与することを含んでなり、ここで前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ抗体であってよい。好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。他の好ましい実施態様では、核酸はエキソビボでの遺伝子療法を介して投与される。さらなる好ましい実施態様では、核酸はベクター、より好ましくはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス又はレトロウイルスベクター内に包含される。
また、他の態様において、本発明は、プロモータ、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるウイルスベクターを含有する組換えウイルス粒子を提供し、ここでウイルスベクターはウイルス構造タンパク質に付随している。好ましくは、シグナル配列は哺乳動物、例えば天然ＰＲＯポリペプチドからのものである。
また、さらなる実施態様では、本発明は、レトロウイルス構造タンパク質を発現する核酸構築物を含有し、またプロモータ、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターをさらに含むエキソビボ産生細胞に関し、ここで該産生細胞は、組換えレトロウイルス粒子を生産させるための構造タンパク質に関連するレトロウイルスベクターを包含している。
【００１４】
さらなる実施態様では、本発明は、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物組織への脈管構造からの炎症細胞の浸潤を増加させる方法を提供し、ここで哺乳動物において脈管組織からの炎症細胞の浸潤が増加する。
またさらなる実施態様では、本発明は、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物組織への脈管構造からの炎症細胞の浸潤を減少させる方法を提供し、ここで哺乳動物において脈管構造からの炎症細胞の浸潤が減少する。
またさらなる実施態様では、本発明は、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＴ−リンパ球の活性を増加させる方法を提供し、ここで哺乳動物におけるＴ−リンパ球の活性が増加する。
またさらなる実施態様では、本発明は、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＴ−リンパ球の活性を低減させる方法を提供し、ここで哺乳動物におけるＴ−リンパ球の活性が低減する。
またさらなる実施態様では、本発明は、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＴ−リンパ球の増殖を増加させる方法を提供し、ここで哺乳動物におけるＴ−リンパ球の増殖が増加する。
またさらなる実施態様では、本発明は、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＴ−リンパ球の増殖を低減させる方法を提供し、ここで哺乳動物におけるＴ−リンパ球の増殖が低減する。
【００１５】
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１０８１、ＰＲＯ１２７４、又はＰＲＯ１０２７２ポリペプチド又はそのアゴニストとＴ−細胞を接触させることを含んでなる、Ｔ−細胞の増殖を刺激する方法を提供し、ここで、該Ｔ−細胞の増殖が刺激される。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１５５６、ＰＲＯ４４０１、又はＰＲＯ１０２６８ポリペプチド又はそのアゴニストと前記Ｔ−リンパ球を接触させることを含んでなる、Ｔ−リンパ球の増殖を阻害させる方法を提供し、ここで、該Ｔ−リンパ球の増殖が阻害される。
またさらなる実施態様では、本発明は、単核球細胞、好酸球又は多形核好中球（ＰＭＮ）の哺乳類動物細胞への浸潤を増強する方法であって、ＰＲＯ１７５４又はＰＲＯ９９１２ポリペプチド又はそのアゴニストと核組織を接触させることを含んでなる該方法を提供し、ここで、該浸潤が増強される。
【００１６】
Ｂ．さらなる実施態様
本発明の他の態様では、本発明はここに記載したポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。また、そのようなベクターの任意のものを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であってよい。ここに記載したポリペプチドの任意のものの製造方法がさらに提供され、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養物から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載したポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。
他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は単鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブを単離するのに有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
【００１７】
他の実施態様では、本発明はＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の他に特別に定められた任意の断片を有するＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１８】
他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチドのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列、又はここに開示された全長アミノ酸配列の他に特別に定められた任意の断片のコード配列を含むＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）ここに開示されたＡＴＴＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【００２０】
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されているか膜貫通ドメインが不活性化されているＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的であるものを含んでなる単離された核酸分子を提供し、ここでそのようなポリペプチドの膜貫通ドメインがここに開示される。従って、ここに記載されたＰＲＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチドコード配列の断片、又はその相補鎖に関し、それらは、例えば、場合によっては抗ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするＰＲＯポリペプチドの断片をコードする、ハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。そのような核酸断片は通常少なくとも約２０のヌクレオチド長、又は少なくとも約３０のヌクレオチド長、又は少なくとも約４０のヌクレオチド長、又は少なくとも約５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約６０のヌクレオチド長、又は少なくとも約７０のヌクレオチド長、又は少なくとも約８０のヌクレオチド長、又は少なくとも約９０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１００のヌクレオチド長、又は少なくとも約１１０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１２０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１３０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１４０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１６０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１７０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１８０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１９０のヌクレオチド長、又は少なくとも約２００のヌクレオチド長、又は少なくとも約２５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約３００のヌクレオチド長、又は少なくとも約３５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約４００のヌクレオチド長、又は少なくとも約４５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約５００のヌクレオチド長、又は少なくとも約６００のヌクレオチド長、又は少なくとも約７００のヌクレオチド長、又は少なくとも約８００のヌクレオチド長、又は少なくとも約９００のヌクレオチド長、又は少なくとも約１０００のヌクレオチド長であり、ここで、「約」という用語は、その参照している長さのプラス又はマイナス１０％の参照ヌクレオチド配列長を意味する。ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くのよく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用して、ＰＲＯポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片（類）が新規であるかを決定することにより常套的な形で決定することができることに留意される。そのようなＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコードされるＰＲＯポリペプチド断片、好ましくは抗ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含んでなるそれらのＰＲＯポリペプチド断片である。
【００２１】
他の実施態様では、本発明は、上記で同定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
ある態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するＰＲＯポリペプチドに対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、ここに開示されたＡＴＴＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００２３】
特定の態様では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たない単離されたＰＲＯポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養物からＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の態様では、本発明は、膜貫通ドメインが欠失されたか膜貫通ドメインが不活性化された単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養物からＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなる。
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで定められる天然ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、ＰＲＯポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含む。好ましくは、ＰＲＯポリペプチドは天然ＰＲＯポリペプチドである。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はここに記載するＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗ＰＲＯ抗体を、担体と組み合わせて含有する物質の組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
本発明の他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗ＰＲＯ抗体の、ＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗ＰＲＯ抗体に起因する病状の治療に有用な医薬の調製のための使用に関する。
【００２４】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値標記がある場合、種々のポリペプチドを指し、完全な符号（すなわち、ＰＲＯ／番号）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を指す。「ＰＲＯ／番号ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／番号」であって、「番号」がここで使用される実際の数値標記として与えられる用語は、天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体（ここでさらに定義する）を含む。ここに記載されるＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成法によって調製してもよい。「ＰＲＯポリペプチド」なる用語は、ここで記載する個々のＰＲＯ／番号ポリペプチドをそれぞれ指す。「ＰＲＯポリペプチド」を意味するこの明細書における全開示は、ポリペプチドのそれぞれを個々に、また一緒に併せて意味する。例えば、それに対する抗体の調製、精製、誘導、形成、その投与、それを含む組成物、それを用いた病気の治療等々の記載は、本発明の各ポリペプチドにそれぞれ関与している。また「ＰＲＯポリペプチド」なる用語には、ここに開示されるＰＲＯ／番号ポリペプチドの変異体も含まれる。
【００２５】
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、天然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここで記載の天然配列ＰＲＯポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字及び下線で示す。しかし、添付の図面に開示したＰＲＯポリペプチドは、図面におけるアミノ酸位置１としてここに命名されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をＰＲＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を称する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、ここで最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えないと思われる。よって、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン／細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約５又はそれ未満のアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、そのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
【００２６】
ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」のおおよその位置は、本明細書及び／又は添付の図面に示す。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ−末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ−末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸を越えないと思われ、シグナルペプチドのＣ−末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに当該技術にいて日常的に使用される基準に従って同定され得る（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ等，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）及びｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに同定されるシグナルペプチドのＣ−末端境界のいずれかの側の約５アミノ酸を越えない範囲内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【００２７】
「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わないＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する上記又は下記の活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ−又はＣ−末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示された全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わないＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチド配列の任意の他の特に定められた断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、又は少なくとも約２０アミノ酸長、又は少なくとも約３０アミノ酸長、又は少なくとも約４０アミノ酸長、又は少なくとも約５０アミノ酸長、又は少なくとも約６０アミノ酸長、又は少なくとも約７０アミノ酸長、又は少なくとも約８０アミノ酸長、又は少なくとも約９０アミノ酸長、又は少なくとも約１００アミノ酸長、又は少なくとも約１５０アミノ酸長、又は少なくとも約２００アミノ酸長、又は少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００２８】
ここで同定されているＰＲＯポリペプチド配列に対して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、特定のＰＲＯポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが以下の表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、以下の表１に示したソースコードは米国著作権庁，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であり、また以下の表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００２９】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは認識されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２と３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「ＰＲＯ」とは対象の仮のＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」とは対象の「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されているポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」はそれぞれ異なった仮想のアミノ酸配列を表す。
【００３０】
特に断らない限り、ここで用いられる全ての％アミノ酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６））を用いて得ることもできる。殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を用いた場合、％アミノ酸配列同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定されるように、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象のＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象の比較アミノ酸配列（即ち、対象のＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象のＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数で割った商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含むポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象の比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象のＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００３１】
また、パーセントアミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５： ３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードしてもよく、別にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから得てもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
【００３２】
「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子を意味し、ここに開示された全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わないＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ポリペプチド配列の任意の他の断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯポリペプチド変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示された全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナル配列を伴うか伴わないＰＲＯポリペプチド配列の細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０のヌクレオチド長、又は少なくとも約６０のヌクレオチド長、又は少なくとも約９０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１２０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１８０のヌクレオチド長、又は少なくとも約２１０のヌクレオチド長、又は少なくとも約２４０のヌクレオチド長、又は少なくとも約２７０のヌクレオチド長、又は少なくとも約３００のヌクレオチド長、又は少なくとも約４５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約６００のヌクレオチド長、又は少なくとも約９００のヌクレオチド長、又はそれよりも長い。
【００３３】
ここで同定されるＰＲＯコード化核酸配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、対象のＰＲＯ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが以下の表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、以下の表１に示したソースコードは米国著作権庁，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公に入手可能であり、また以下の表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００３４】
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表４と５は、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「ＰＲＯ−ＤＮＡ」は、対象の仮のＰＲＯ−コード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は対象の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」はそれぞれ異なった仮想のヌクレオチドを表す。
【００３５】
特に断らない限り、ここで用いられる全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２６６： ４６０−４８０（１９９６））を用いて得ることもできる。殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を用いた場合、％核酸配列同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定されるように（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象のＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象の比較核酸分子（すなわち、対象のＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子が比較される変異ＰＲＯポリヌクレオチドであってもよい配列）との間の、一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）対象のＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂと少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含む単離された核酸分子」という記載において、核酸配列Ａは対象の比較核酸分子であり、核酸配列Ｂは対象のＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【００３６】
また、パーセント核酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５： ３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードしてもよく、別にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから得てもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチド数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
【００３７】
他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、活性ＰＲＯポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成可能な核酸分子である。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の夾雑成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一となるまで精製される。単離されたポリペプチドには、自然環境におけるＰＲＯポリペプチドの少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」ＰＲＯポリペプチドコード化核酸又は他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、ポリペプチドコード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたポリペプチドコード化核酸は、天然の細胞中に存在する特定のポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるものを含む。
【００３８】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３９】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗ＰＲＯモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、多エピトープ特異性を持つ抗ＰＲＯ抗体組成物、単鎖抗ＰＲＯ抗体、及び抗ＰＲＯ抗体の断片を特にカバーしている（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定され得る。
「中程度の緊縮性条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件の例は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄などである。当業者は、プローブ長等の因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００４０】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは、融合するＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基）を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００４１】
ここでの目的において「活性な」又は「活性」とは、天然又は自然に生じるＰＲＯの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持しているポリペプチドの形態を意味し、ここで「生物学的」活性とは、天然又は自然に生じるＰＲＯによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は自然に生じるＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを称し、「免疫学的」活性とは、天然又は自然に生じるＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体の生成を誘発する能力を称する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様に「アゴニスト」なる用語も最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子等を含む。ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＰＲＯポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニスト分子と接触させ、ＰＲＯポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含みうる。
【００４２】
「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又は疾患を防止又は低下（減少）させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを称する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、及び動物園、スポーツ用、又はペット用動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む哺乳動物に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００４３】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭを含む。
【００４４】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、６つのＣＤＲｓが抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ’断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、通常はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主たるクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらのいくつかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分割される。
【００４５】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；国際公開第９３／１１１６１号；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０： ６４４４−６４４８（１９９３）により十分に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の夾雑成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法で測定した場合９５重量％を越える、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００４６】
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドのエピトープに「特異的に結合する」又はこれに「特異的な」抗体とは、任意の他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合しないで、その特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドのエピトープに結合するものである。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に結合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【００４７】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語に含まれるものは、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、免疫欠損症、異常増殖等が含まれる。
「Ｔ細胞媒介疾患」という用語は、Ｔ細胞が直接的又は間接的に哺乳動物の病的状態を媒介するか又は寄与等する疾患を意味する。Ｔ細胞媒介疾患は細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等に、また例えばＴ細胞により分泌されるリンホカインによりＢ細胞が刺激されるならばＢ細胞に関連した効果にさえも関連している。
本発明により治療可能で、そのいくつかは免疫又はＴ細胞媒介性である免疫関連及び炎症疾患の例には、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少（特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少）、甲状腺炎（グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱随性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性（ｎｏｎｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス）、自己免疫慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎；クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。ウイルス性疾患、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染）、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型肝炎、ヘルペス等、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染等の感染症も含まれる。
【００４８】
「有効量」という用語は、特に記載した目的の達成をもたらすＰＲＯポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの濃度又は量のことである。ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの「有効量」は経験的に決定することができる。さらに「治療有効量」は、記載した治療効果の達成に有効なＰＲＯポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの濃度又は量のことである。この量もまた経験的に決定することができる。
【００４９】
ここで用いられる「細胞障害薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び／又は細胞破壊を生ずる物質を称する。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド類、例えばパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）及びドキセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）、タキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を称する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ期でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）ブロックする薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−Ｃである。さらなる情報は、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ，編，Ｃｈａｐｔｅｒ １，表題「ＣｅＩｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｒａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」，Ｍｕｒａｋａｍｉ等，（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ： Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、特にｐ１３に見出すことができる。
【００５０】
「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を含み、天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここで用いられる「炎症性の細胞」なる用語は、単核球、好酸球、マクロファージ、及び多形核好中球（ＰＭＮ）などの炎症反応を増強する細胞を指す。
【００５１】
ＩＩ．本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＰＲＯポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯポリペプチドと称されるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に開示するように、種々のＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は任意の与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ／番号」として呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの事実上のヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【００５４】
Ｂ．ＰＲＯポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯの翻訳後プロセスを変えうると認識するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ又はここに記載したＰＲＯの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての技術及び指針の任意のものを用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯと比較してＰＲＯのアミノ酸配列が変化するＰＲＯをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然タンパク質によって提示された活性について試験することにより決定される。
【００５５】
ＰＲＯポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ−末端又はＣ−末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【００５６】
特別の実施態様では、対象の保存的置換を、好ましい置換と題して表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と示した又は以下に参照としてアミノ酸分類でさらに記載するように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
（１）疎水性：ノルロイシン，ｍｅｔ，ａｌａ，ｖａｌ，ｌｅｕ，ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ，ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ，ｇｌｎ，ｈｉｓ，ｌｙｓ，ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ，ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ，ｔｙｒ，ｐｈｅ。
【００５７】
非保存的置換とは、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするものである。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、もしくは好ましくは残りの（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等，Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限的選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に頻繁に見られることが多い［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
【００５８】
Ｃ．ＰＲＯの修飾
ＰＲＯの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯの選択された側鎖又はＮ−又はＣ−末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗ＰＲＯ抗体の精製方法、及びその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダート等の薬剤を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００５９】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。ここでの目的に対し、「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列ＰＲＯに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失（潜在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味することが意図される。さらに、この語句は、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含み、それには、存在する種々の糖質部分の性質及び特性の変化を含む。
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ（Ｏ−結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ＰＲＯポリペプチド上に糖質部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
ＰＲＯポリペプチド上に存在する糖質部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）により、及びＥｄｇｅ等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ等，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）に記載されているように、種々のエンド−及びエキソ−グリコシダーゼを用いることにより達成される。
【００６０】
ＰＲＯの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリペプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号又は同第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のＰＲＯポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯを含むキメラ分子を形成する方法で修飾されてもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Ｈｏｐｐ等，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）］を含む。
【００６１】
それに代わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ１分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【００６２】
Ｄ．ＰＲＯの調製
以下の記述は、主として、ＰＲＯ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ等，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯの種々の部分は別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯを生産してもよい。
【００６３】
１．ＰＲＯをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯをコードするＤＮＡは、ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＰＲＯコード化遺伝子は、ゲノムライブラリー、オリゴヌクレオチド合成、又は他の既知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリーは、対象の遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えば、ＰＲＯに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド）によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＰＲＯをコードする遺伝子を単離する他の手段はＰＣＲ法を使用するものである［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，上掲；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ等，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）］。
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に与えられている。
【００６４】
このようなライブラリーースクリーニング法において同定された配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ等の公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の他の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の定められた領域内又は全長配列に渡っての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。
【００６５】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変更された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋ等，上掲に見出すことができる。 真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは、通常、当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗ等，Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ国際公開第８９／０５８５９号に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）及びＨｓｉａｏ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３８２９（１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いられる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）及びＭａｎｓｏｕｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照のこと。
【００６６】
ここのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の適切な原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバシリリチェニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異に影響を与えるように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｒｔ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【００６７】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；１９８５年５月２日発行のＥＰ １３９，３８３）；クルベロミセスホスツ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｈｏｓｔｓ）（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））、例えばケーラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（２）：７３７−７４２［１９８３］）、ケーフラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、ケーブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、ケーウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、ケーワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、ケードロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、ケーテモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びケーマルキシアナス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ ４０２，２２６）；ピッチャパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ等，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２８：２６５−２７８［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマレーシア（ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｃａｓｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３［１９７９］）；シュワニオマイセス（ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日発行のＥＰ ３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日公開の国際公開第９１／００３５７号）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ｂａｌｌａｎｃｅ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎ等，Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４［１９８４］）及びクロカビ（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．，４：４７５−４７９［１９８５］）が含まれる。ここではメチロトロピック（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母が適切であり、これらに限られないが、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見出される。
【００６８】
グリコシル化ＰＲＯの発現に適切な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より特定の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児性腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ等，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；及びマウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＴＣ ＣＣＬ５１）を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術範囲内にあると考えられる。
【００６９】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯコード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母菌の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行のＥＰ ３６２，１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現において、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーの等の哺乳動物シグナル配列は、タンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００７０】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は種々の細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に対する耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯコード化核酸を取り込むことのできる細胞の同定を可能にするものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ等による，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）の記載により調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｍａｎ等，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン存在下で増殖能を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）］。
【００７１】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯコード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成に指向するプロモーターを含む。種々の潜在的な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ等，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ ３６，７７６］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
酵母宿主での使用に対して好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０）］又は他の糖分解酵素［Ｈｅｓｓ等，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースを利用する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌による発現における使用に適する用ベクターとプロモータはＥＰ７３，６５７に更に記載されている。
【００７２】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ ２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノム、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
高等真核生物によるＰＲＯをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動性因子である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期ＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期ポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞（酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
さらに、組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉ等，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ １１７，０６０；及びＥＰ１１７，０５８に記載されている。
【００７３】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりの、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、サザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００７４】
５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン−Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯの発現に用いられた細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。次の手順が適切な精製手順の例である：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような夾雑物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載された種々のタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯの性質に依存する。
【００７５】
Ｅ．組織分布
ＰＲＯを発現させる組織の位置は、種々のヒト組織におけるｍＲＮＡ発現を測定することにより特定可能である。このような遺伝子の位置により、ＰＲＯポリペプチドの刺激及び阻害活性の影響を最も受けていると思われる組織の情報が提供される。また、特定の組織における遺伝子の位置により、以下で検討される活性阻止アッセイのための試料組織も提供される。
上記したように、種々の組織における遺伝子発現は、従来のサザンブロット、ｍＲＮＡの転写の定量化のためのノーザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５［１９８０］）、ドットブロット（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリッド形成により、ここに提供する配列に基づいて適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識可能な抗体を用いてもよい。
あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片の免疫組織学的染色、及び細胞培養物又は体液のアッセイ等の免疫学的方法によっても測定できる。免疫組織学的染色及び／又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。簡便には、抗体は天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、又はＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。抗体を生成する一般的技術、及びノーザンブロット及びインサイツハイブリッド形成の特定のプロトコールは以下に提供する。
【００７６】
Ｆ．抗体結合性の研究
ＰＲＯポリペプチドの活性は、抗体結合性の研究によって更に証明することが可能で、この場合、組織細胞上でＰＲＯポリペプチドの効果を各々阻害する抗ＰＲＯ抗体の能力がテストされる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロ結合体抗体を含み、その調製は以下に記載する。
抗体結合性の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。
競合的結合アッセイは、限られた量の抗体との結合について、標識標準物が試験分析物と競合する能力に基づく。試験試料中の標的タンパク質の量は、抗体に結合する標準物の量に逆比例する。結合する標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に不溶化し、抗体に結合した標準物及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。
サンドウィッチアッセイは２つの抗体の使用を含み、各々、検出されるタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第１の抗体に結合し、その後第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３成分複合体が形成される。例えば米国特許第４，３７６，１１０号参照。第２の抗体は検出可能成分で標識され（直接サンドウィッチアッセイ）、あるいは検出可能成分で標識された抗−免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドウィッチアッセイ）。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合の検出可能成分は酵素である。
免疫組織化学のために、組織試料はフレッシュなものでも凍結されたものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
【００７７】
Ｇ．細胞ベースアッセイ
細胞ベースアッセイ及び免疫関連疾患の動物モデルは、ここで同定された遺伝子とポリペプチドとの関係、及び免疫関連疾患の進行及び病理との関係をさらに理解するために使用することができる。
異なる方法では、特定の免疫関連疾患に含まれることが知られている細胞型の細胞をここに記載のｃＤＮＡで形質移入し、これらのｃＤＮＡが免疫機能を刺激又は阻害する能力を分析する。適当な細胞は所望の遺伝子で形質移入され、免疫機能活性がモニターされる。このような形質移入株化細胞は、次いで、例えばＴ細胞増殖又は炎症細胞の侵入を調節するといった、免疫機能を刺激又は阻害するポリー又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験するのに使用できる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、さらに、免疫関連疾患治療用の候補薬の同定に使用できる。
さらに、（下記のような）トランスジェニック動物から誘導された初代培養は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な株化細胞が好ましい。トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術はこの分野で良く知られている（Ｓｍａｌｌ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，６４２−６４８［１９８５］参照）。
一つの適切な細胞ベースアッセイは混合リンパ球反応（ＭＬＲ）である。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｕｎｉｔ３．１２；Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，国立衛生研究所，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．から出版。このアッセイでは、試験化合物が活性化したＴ細胞の増殖を刺激又は阻害する能力をアッセイする。レスポンダーＴ細胞の懸濁液を同種刺激細胞と共に培養し、トリチウム化チミジンの取込によりＴ細胞の増殖能を測定する。このアッセイはＴ細胞反応性の一般的な測定法である。多くのＴ細胞が応答し、活性化してＩＬ−２が産出されるため、このアッセイにおける応答性の差異は、応答細胞によるＩＬ−２生成の差異を部分的に反映する。ＭＬＲの結果は、標準的なリンホカイン（ＩＬ−２）検出アッセイにより確認することができる。上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３．１５．６．３．を参照。
ＭＬＲアッセイにおける増殖性Ｔ細胞応答は、アッセイされる分子の直接的な分裂促進特性又は外的抗原が誘発した活性化による。ＰＲＯポリペプチドのＴ細胞刺激活性のさらなる証明は、同時刺激アッセイにより得ることができる。Ｔ細胞活性化には、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を通して媒介される抗原特異的シグナル、及び第２のリガンド結合相互作用、例えばＢ７（ＣＤ８０、ＣＤ８６）／ＣＤ２８結合相互作用を通して媒介される同時刺激シグナルが必要である。ＣＤ２８の架橋により、活性化Ｔ細胞によるリンホカインの分泌が増加する。Ｔ細胞活性化はネガティブな又はポジティブな効果を有するリガンドの結合を通してネガティブとポジティブの双方のコントロールを有する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４はＢ７に結合するＩｇスーパーファミリーの関連糖タンパク質である。Ｂ７に結合するＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化のポジティブな同時刺激効果を有し；逆にＢ７に結合するＣＴＬＡ−４はネガティブなＴ細胞脱活性化効果を有する。Ｃｈａｍｂｅｒｓ．Ｃ．Ａ．ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ．Ｊ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）９：３９６。Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．，Ｃｅｌｌ（１９９２）７１：１０６５；Ｌｉｎｓｅｙ，Ｐ．Ｓ．ａｎｄ Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ．Ｊ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１１：１９１；Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．等Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ（１９９４）１５：３２１；Ｊｅｎｋｉｎｓ．Ｍ．Ｋ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：４０５。同時刺激アッセイでは、ＰＲＯポリペプチドはＴ細胞同時刺激又は阻害活性についてアッセイされる。
【００７８】
ＰＲＯポリペプチド、並びに本発明の他の化合物は、Ｔ細胞の増殖の刺激因子（同時刺激因子）及びアゴニスト、例えばＭＬＲ及び同時刺激アッセイで決定されるアゴニスト抗体であるが、例えば、減弱な、最適下限の又は不十分な免疫機能に特徴付けられる免疫関連疾患を治療するのに有用である。これらの疾患はＴ細胞の増殖及び活性化（及びＴ細胞媒介免疫性）を刺激し、刺激化合物、例えば刺激性ＰＲＯポリペプチドの投与により哺乳動物における免疫反応を増強することにより治療される。刺激性ポリペプチドは、例えばＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト抗体であり得る。
本発明におけるような刺激化合物の直接の使用は、４−１ＢＢ糖タンパク質、すなわちプライムＴ細胞上で発現されるリガンド（４−１ＢＢＬ）に結合しＴ細胞の活性化と成長をシグナル伝達する腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーを用いる実験において実証された。Ａｌｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２２１９。
また、アゴニスト刺激化合物の使用も実験的に実証されている。アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体を用いた治療による４−１ＢＢの活性化は腫瘍の根絶化を亢進する。Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ．Ｉ．及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｅ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１８：１。以下により詳細に記載する腫瘍治療のための免疫アジュバント治療は、本発明の刺激化合物の使用の他の例である。
また、免疫刺激又は増強効果はＭＬＲアッセイにおいて阻害性であることが見出されたＰＲＯの活性に拮抗又はこれを阻害することにより達成することができる。化合物の阻害活性を無効にすることで、正味の刺激効果が生じる。適切なアンタゴニスト／阻害化合物は、阻害タンパク質を認識し、これに結合する抗体又はその断片であり、それにより該タンパク質とそのレセプターとの効果的な相互作用がブロックされ、レセプターを通してのシグナル伝達が阻害される。この効果は、おそらくＣＴＬＡ−４結合により引き起こされる阻害シグナルの除去により、Ｔ細胞増殖を亢進する抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用する実験で実証されている。Ｗａｌｕｎａｓ，Ｔ．Ｌ．等，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：４０５。
【００７９】
別法として、免疫刺激又は増強効果は、血管透過性増強特性を有するＰＲＯの投与により達成することもできる。増強された血管透過性は炎症と免疫細胞（例えば単球、好酸球、ＰＭＮ）の局部的浸潤により緩和可能な疾患に有益であろう。
他方、ＰＲＯポリペプチド並びに本発明の他の化合物は、Ｔ細胞増殖／活性化、リンホカイン分泌、及び／又は血管透過性の直接の阻害剤であるが、免疫反応を抑制するために直接使用することができる。これらの化合物は、免疫反応の程度を低減し、過剰活性、超最適（ｓｕｐｅｒｏｐｔｉｍａｌ）又は自己免疫反応により特徴付けられる免疫関連疾患の治療に有用である。本発明の化合物のこの用途は、レセプターＢ７に結合するＣＴＬＡ−４がＴ細胞を脱活性化する上述の実験により実証されている。本発明の直接の阻害化合物は類似した形で機能する。血管浸透過性を抑制する化合物の使用は炎症を低減することが予想される。このような使用は過度の炎症を伴う病状の治療に有益である。
あるいは、刺激ＰＲＯポリペプチドに結合し、これらの分子の刺激効果をブロックする化合物、例えば抗体により、正味の阻害効果がつくりだされ、Ｔ細胞の増殖／活性化及び／又はリンホカイン分泌を阻害することにより、Ｔ細胞媒介免疫反応を抑制するために使用することができる。ポリペプチドの刺激効果をブロックすることにより、哺乳動物の免疫反応が抑制される。この用途は抗ＩＬ２抗体を使用する実験において実証されている。これらの実験において、抗体はＩＬ２に結合し、そのレセプターへのＩＬ２の結合を阻害し、これによりＴ細胞阻害効果が達成される。
【００８０】
Ｈ．動物モデル
さらに、インビトロにおける細胞ベースアッセイの結果は、インビボ動物モデル及びＴ細胞機能アッセイにより証明することができる。免疫関連疾患の進行及び病因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アンタゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、ヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作成される。
移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制され又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は宿主抗原を認識しそれに反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度のケースまで多様である。移植片対宿主疾患モデルはＭＨＣ抗原及び少量の移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は上記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｕｎｉｔ４．３．に詳細に記載されている。 皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、Ｔ細胞がインビボで組織の破壊を媒介する能力を試験する手段であり、移植拒絶におけるそれらの役割の指標である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾の皮膚の移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がＴ細胞、ヘルパーＴ細胞及びキラー−エフェクターＴ細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが分かった。Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ，Ｈ．Ｊｒ．及びＳａｃｈｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９，８８９−９９２。適切な手順は上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＩｍｍｕｎｏＩｏｇｙ，ｕｎｉｔ４．４．に詳細に記載されている。本発明の化合物の試験に使用可能な他の移植拒絶モデルは、Ｔａｎａｂｅ，Ｍ．等，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９４）５８：２３及びＴｉｎｕｂｕ，Ｓ．Ａ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）４３３０−４３３８により記載されている同種心臓移植片モデルである。
【００８１】
遅発型過敏症の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイをまた提供する。遅発型過敏反応は、抗原投与後の経過した時間まで、ピークに達しない炎症により特徴付けられるＴ細胞媒介インビボ免疫反応である。これらの反応はまた組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）及び実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ、ＭＳ用のモデル）で生じる。適切な手順は上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｕｎｉｔ４．５．に詳細に記載されている。
ＥＡＥは、Ｔ細胞及び単核細胞の炎症と、続いての中枢神経系における軸索の脱髄により特徴付けられるＴ細胞媒介自己免疫疾患である。ＥＡＥは、一般的にヒトにおけるＭＳの関連動物モデルであると考えられている。Ｂｏｌｔｏｎ．Ｃ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（１９９５）１：１４３。急性及び再発性弛緩モデルの双方が開発されている。本発明の化合物は上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｕｎｉｔ１５．１及び１５．２．に記載されているプロトコールを使用して、免疫媒介脱髄疾患に対するＴ細胞刺激又は阻害活性を試験することができる。また、Ｄｕｎｃａｎ．Ｉ．Ｄ．等，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ（１９９７）５５４−５６１に記載されているようにして、オリゴデンドロサイト又はシュワン細胞が中枢神経系に移植されたミエリン疾患のモデルも参照されたい。
接触性過敏症は、細胞媒介免疫機能の単純な遅発型過敏インビボアッセイである。この手順において、遅発型過敏反応を生じさせる外因性ハプテンに皮膚を暴露し、反応を測定して定量する。接触過敏症は最初の感作段階に顕在化段階が続く。顕在化段階はＴリンパ球が過去に接触したことのある抗原に遭遇したときに生じる。腫れと炎症が生じ、ヒトアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルが作成される。適切な手順は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，及びＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ｕｎｉｔ４．２に詳細に記載されている。また、Ｇｒａｂｂｅ，Ｓ．及びＳｃｈｗａｒｚ，Ｔ．Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ １９（１）：３７−４４（１９９８）も参照のこと。
【００８２】
関節炎の動物モデルは、コラーゲン−誘発関節炎である。このモデルはヒト自己免疫慢性関節リウマチの臨床的、組織的及び免疫学的特徴を共有し、ヒト自己免疫関節炎の許容可能なモデルである。マウス及びラットモデルは滑膜炎、軟骨の腐食及び軟骨下（ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ）骨により特徴付けられる。本発明の化合物は上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｕｎｉｔ１５．５．に記載されているプロトコールを使用し、自己免疫関節炎に対する活性を試験することができる。また、Ｉｓｓｅｋｕｔｚ，Ａ．Ｃ．等，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６）８８：５６９に記載されているＣＤ１８及びＶＬＡ−４インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用するモデルも参照のこと。
抗原誘発性気道反応亢進、肺好酸球増加症及び炎症が卵白アルブミンで動物を感作させ、エアゾールにより送達される同様のタンパク質に動物を暴露することで誘発される喘息モデルが記載されている。いくつかの動物モデル（モルモット、ラット、非ヒト霊長類）では、エアゾール抗原への暴露時にヒトのアトピー性喘息に類似した徴候が示された。マウスモデルはヒト喘息の多くの特徴を有している。喘息治療における活性と有効性について本発明の化合物を試験するのに適した手順は、Ｗｏｌｙｎｉｅｃ，Ｗ．Ｗ．等，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）１８：７７７とそこに引用されている文献に記載されている。
さらに、本発明の化合物は乾癬用疾患の動物モデルにおいて試験することができる。ある証拠によりＴ細胞が乾癬の病原であることを示唆されている。本発明の化合物は、Ｓｃｈｏｎ．Ｍ．Ｐ．等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９７）３：１８３により記載されているｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスモデルにおいて試験することができ、そのモデルではマウスは乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示す。他の適切なモデルはＮｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．（１９９５）１４６：５８０に記載されているようにして調製されたヒトｓｋｉｎ／ｓｃｉｄマウスキメラである。
【００８３】
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここで同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象の動物ゲノムに導入することにより設計することができる。遺伝子組換え操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非−ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、前核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ及びＷａｎｇｅｒ，米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，６１４８−６１５［１９８５］）；胚性肝細胞での遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，Ｃｅｌｌ ５６，３１３−３２１［１９８９］）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４［１９８３］）；精子媒介遺伝子転移（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等，Ｃｅｌｌ ５７，７１７−７３［１９８９］）を含む。概説のためには、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Ｌａｓｋｏ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，６２３２−６３６（１９９２）の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によってモニターできる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学等の技術を用いて分析できる。
【００８４】
動物は、さらに、特定の組織中への免疫細胞の湿潤を測定するために例えば組織学的検査により、免疫疾患の病原の徴候を検査してもよい。またトランスジェニック動物を本発明の化合物で処理して、化合物のＴ細胞増殖刺激又は阻害の度合いを測定するブロック実験も実施することができる。これらの実験では、上述のようにして調製したＰＲＯポリペプチドに結合するブロック抗体が動物に投与され、免疫機能に対する効果が測定される。
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、その同じポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えの結果、ここに同定するポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って当該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みをモニターするために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは変更が加えられていないフランキングＤＮＡ（５’と３’末端の両方）数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターの記述についてはＴｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に（例えばエレクトロポレーションによって）導入され、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Ｌｉ等，Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ポリペプチドが存在しないことによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【００８５】
Ｉ．免疫アジュバント治療
一実施態様では、本発明の免疫刺激化合物は腫瘍（癌）治療における免疫アジュバント治療に使用することができる。Ｔ細胞がヒト腫瘍特異的抗原を認識することは十分に確立されている。遺伝子のＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーによりコードされる腫瘍抗原の一グループは全ての成人の正常組織においてサイレントであるが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺腫瘍、頭部及び頸部の腫瘍、膀胱癌においては有意の量で発現している。ＤｅＳｍｅｔ．Ｃ．等，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：７１４９。Ｔ細胞の同時刺激により、インビトロ及びインビボの双方において、腫瘍の退行及び抗腫瘍反応が誘発されることが示されている。Ｍｅｌｅｒｏ．Ｉ．等，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）３：６８２；Ｋｗｏｎ．Ｅ．Ｄ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４：８０９９；Ｌｙｎｃｈ．Ｄ．Ｈ．等，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）３：６２５；Ｆｉｎｎ．Ｏ．Ｊ．及びＬｏｔｚｅ．Ｍ．Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）２１：１１４。本発明の刺激化合物はアジュバントとして単独で又は成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤と共に投与することができ、Ｔ細胞増殖／活性化及び腫瘍抗原に対する抗腫瘍反応を刺激する。成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤は既知の投与方法で使用されている従来からの量で投与することができる。本発明の化合物による免疫刺激活性により、成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤の量を減らすことができ、よって、潜在的に患者に対する毒性を低下させることができる。
【００８６】
Ｊ．候補薬についてのスクリーニングアッセイ
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされるポリペプチド、又はその生物学的に活性な断片と結合又は複合体を形成する化合物、あるいはコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。考慮される小分子とは、合成有機又は無機化合物を含み、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド−免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチド、即ち候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【００８７】
候補化合物がここで同定される遺伝子にコードされる特定のタンパク質と相互作用するが結合しない場合、そのタンパク質との相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、共免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ及びＮａｔｈａｎｓ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，５７８９−５７９３（１９９１）に開示されているようにして、Ｆｉｅｌｄｓ及び共同研究者等［Ｆｉｅｌｓ及びＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４０，２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，９５７８−９５８２（１９９１）］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることによりモニターすることができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。既刊の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２−ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２−ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商品名））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入可能である。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定される遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物を見出すために、通常、反応混合物は、２つの生成物の相互作用及び結合を可能ならしめる条件及び時間の下、遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含むように調製される。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物有り又は無しで実施する。さらに、第３の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は外成分との結合（複合体形成）は上記のようにモニターする。対照反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物では形成されないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【００８８】
Ｋ． 免疫関連疾患の治療のための組成物及び方法
免疫関連疾患の治療に有用な組成物は、限定するものではないが、例えば、Ｔ細胞の増殖／活性化、リンホカインの放出、又は免疫細胞の浸潤等の免疫機能を阻害又は刺激するタンパク質、抗体、有機小分子、ペプチド、リン酸化ペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重鎖ヘリックス分子等々を含む。
例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接的に阻止するように作用する。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列のおよそ−１０から＋１０位置の間から取り出されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４： ４６９−４７１（１９９４）及びＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照のこと。
転写阻害に用いられる三重鎖ヘリックス形成における核酸分子は単鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重鎖ヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１，上掲を参照のこと。
これらの分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組合せにより、及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【００８９】
Ｌ．抗ＰＲＯ抗体
本発明はさらに抗ＰＲＯ抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ結合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
抗ＰＲＯ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで産生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００９０】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗ＰＲＯ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培養培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００９１】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現をサポートし、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ等，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイによって測定される。このような技術及びアッセイは、当該分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Ｇｏｄｉｎｇ，上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００９２】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に組込むことができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等，上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【００９３】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の断片、特にＦａｂ断片を生成するための抗体の消化は、当該分野において知られている定法的技術を使用して達成できる。
【００９４】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗ＰＲＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Ｊｏｎｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者［Ｊｏｎｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００９５】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９２）；Ｍａｒｋｓ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Ｃｏｌｅ等及びＢｏｅｒｎｅｒ等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる（Ｃｏｌｅ等，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ．ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化してマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Ｍａｒｋｓ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３（１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇ等，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５−９３（１９９５）に記載されている。
また、抗体は上述した既知の選択及び／又は突然変異誘発法を使用し、親和成熟させてもよい。好ましい親和成熟抗体は、成熟抗体が調製された（一般的にマウス、ヒト化又はヒトの）出発抗体のものよりも、５倍、より好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０又は３０倍の親和性を有する。
【００９６】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースにおいて、結合特異性の一方はＰＲＯに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づく［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行われる。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【００９７】
ＷＯ ９６／２７０１１に記載された他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖が小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えられた第２の抗体分子の界面に作り出される。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再転換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ’断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【００９８】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。ＴｕｔｔらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＰＲＯポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗ＰＲＯポリペプチドアームは、特定のＰＲＯポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＰＲＯポリペプチドを発現する細胞に細胞障害薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＰＲＯ−結合アーム及び細胞障害薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。対象の他の二重特異性抗体はＰＲＯポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【００９９】
５．ヘテロ結合体抗体
ヘテロ結合抗体も本発明の範囲内に入る。ヘテロ結合抗体は２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／２００３７３；ＥＰ ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
【０１００】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌の治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成されたホモダイマー抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Ｃａｒｏｎ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６： １１９１−１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８： ２９１８−２９２２（１９９２）参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体は、Ｗｏｌｆｆ等，Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ２５６０−２５６５（１９９３）に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３： ２１９−２３０（１９８９）参照。
【０１０１】
７．免疫結合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性結合）に結合された抗体を含む免疫複合体にも関する。このような免疫結合体の生成に有用な化学療法剤は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性断片、（緑膿菌からの）エクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性結合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９ＯＹ及び１８６Ｒｅを含む。
抗体及び細胞障害薬の結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８： １０９８（１９８７）に記載されたように調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のためのキレート剤の例である。ＷＯ ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に結合されてもよく、抗体−レセプター結合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合結合体を循環から除去し、次に細胞障害薬（放射性ヌクレオチド等）に結合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１０２】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示するタンパク質、抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ等，Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７： ４０３０（１９８０）；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、定められた孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７： ２８６−２８８（１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合され得る。化学療法剤（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Ｇａｂｉｚｏｎ等，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）参照。
【０１０３】
Ｍ．製薬組成物
本発明の活性ＰＲＯ分子（例えばＰＲＯポリペプチド、抗ＰＲＯ抗体、及び／又はその変異体）、並びに上述のスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、免疫関連疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
本発明の活性ＰＲＯ分子、好ましくはポリペプチド又は抗体の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性分子を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロイド；ヘキサメトニウムクロイド；ベンズアルコニウムクロイド；ベンズエトニウムクロイド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又は又はトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（商品名）、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１０４】
ここで開示されたスクリーニングアッセイで同定された化合物は、同様の方式でこの分野で知られた標準技術を用いて製剤することができる。
リポフェクション又はリポソームもＰＲＯ分子を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，７８８９−７８９３［１９９３］を参照のこと）。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性ＰＲＯ分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１０５】
徐放性製剤又はＰＲＯ分子を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリー（Ｄ）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１０６】
Ｎ．治療方法
本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性物質は、組織への炎症細胞の浸潤、Ｔ細胞の増殖の刺激、Ｔ細胞の増殖の阻害、血管透過性の増加又は低減又はその阻害によって特徴付けられるものを含む、Ｔ細胞媒介疾患等の種々の免疫関連疾患及び病状を治療するために使用できると考えられる。
本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物で治療される病状又は疾患の例には、限定するものではないが、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、骨関節症、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少（特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少）、甲状腺炎（グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、例えば多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱随性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性ウィルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎；クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
全身性紅斑性狼瘡では、疾患の中心的な媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産生と、続いての免疫媒介炎症の発生である。抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。Ｔリンパ球は組織損傷に直接的には関与していることは示されていないが、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発育に必要である。よって、疾患の発生はＴリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的に冒される。
【０１０７】
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、主に複数の関節の滑膜に関連する慢性全身性自己免疫炎症疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に付随し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体を生成する。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発し；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば、関節空間／液でもしかりである。冒されている組織は、多くの場合対称的なパターンで、主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患もまた生じる。一形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の典型的病巣、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発生である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、これは、ＲＡ疾患過程の末期、時には関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う複数の器官において血管炎が付随する。多くの場合、患者には、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；その小結節は、末期には混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡにおいて生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６歳未満で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子が陽性である患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は３つの主要なカテゴリー：小関節（ｐａｕａｒｔｉｃｕｌａｒ）、多関節及び全身性に細分類される。関節炎は重度で典型的には破壊的であり、関節強直症及び遅延成長に至る。他の徴候には慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【０１０８】
脊椎関節症は、いくつかの共通した臨床的特徴とＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子産物の発現との共通の関連性を持つ疾患のグループである。該疾患には：Ｂｅｃｈｔｅｒｅｗ氏病（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｙｌｉｔｉｓ）、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。顕著な特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；炎症非対称性関節炎；ＨＬＡ−Ｂ２７（クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ−Ｂ座位にある血清学的に定義された対立遺伝子）との関連；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導に対する鍵として最も関わっている細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球で、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ２７に対して反応する。ＨＬＡ−Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応を誘発すると仮定されている。
全身性硬化症（強皮症）は病因がよく知られていない。疾患の顕著な特徴は皮膚の硬結であり；これは活性な炎症プロセスにより誘発されると思われる。強皮症は局部的又は全身性であり：血管病巣が共通しており、微小血管系における内皮細胞傷害が全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準は、皮膚病巣における単核細胞浸潤の存在と、多くの患者において抗細胞核抗体の存在によって導かれる。多くの場合、ＩＣＡＭ−１が皮膚病巣の線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレーションされ、これらの細胞とのＴ細胞の相互作用が疾患の病因においてある役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：結果的に異常なぜん動／運動性となる平滑筋萎縮症及び線維症：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【０１０９】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対照的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症と、涙腺及び唾液腺の続く機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患に関連するか又はそれに伴なう場合がある。この疾患は、双方とも小さいＲＮＡ−タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する自己抗体産生に関連している。病巣は乾性角結膜炎、口内乾燥症で、胆汁性硬変、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病を含む他の徴候又は関連を伴うものに至る。
全身性血管炎症は一次病巣が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として冒された脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、いくつかのケースでは最終的な末端器官機能障害になるといった疾患である。また、血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ）は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の生成に関連した疾患等の続発症として又は二次病変として生じる場合がある。原発性全身性血管炎症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。その他の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳ又は川崎病）、隔離されたＣＮＳ血管炎、ベヘット（Ｂｅｈｅｔ’ｓ）病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）及び皮膚壊死性細静脈炎（ｖｅｎｕｌｉｔｉｓ）が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の発病メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内のほとんど全ての組織中における類上皮細胞肉芽腫の存在により特徴づけられる病因がよく知られていない病状であり；肺の関与が最も一般的である。病因は疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞型より放出される局部的又は全身的活性産物の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、及び発作性夜間血色素尿を含む自己免疫溶性血性貧血は、赤血球（いくつかの場合においては血小板もまた含む他の血液細胞）表面で発現した抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ−レセプター−媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
【０１１０】
他の臨床的環境における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、血小板破壊／除去が、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ−レセプター−媒介メカニズムにより除去される結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に存在し多くの場合甲状腺に特異的なタンパク質と反応する抗体の産生を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。自然のモデル：ラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びチキン（肥満チキン種）；誘導性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）のいずれかでの動物の免疫化を含む実験用モデルが存在する。
Ｉ型真性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は膵臓ランゲルハンス島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリン様レセプターに対する抗体は、インスリン−非反応性の表現型をつくりだすことができる。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産生される結果として直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応性である、腎臓中の抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果として間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の生成をもたらす他の免疫媒介疾患により、間接的続発症として免疫媒介腎疾患も誘発しうる。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として、器官機能が損なわれ、いくつかの場合では腎臓機能不全に進行する、病巣発達を腎組織に生じさせ／誘発する炎症反応が生じる。体液及び細胞免疫メカニズムの双方が障害の発病に関与しうる。
多発性硬化症；特発性脱随性多発神経障害又はギラン−バレー症候群；及び慢性炎症脱随性多発神経障害を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患は、自己免疫に原因を有し、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に引き起こされる損傷の結果として神経脱髄が生じると考えられている。ＭＳにおいては、疾患の誘発及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。病巣は優勢なＴ細胞媒介小膠細胞の湿潤と、浸潤しているマイクロファージを含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病巣における優勢な細胞型である。オリゴデンドロサイトの細胞死と続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球により推進されていると思われる。
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。その反応の阻害は治療的に有益であろう。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発病はＴリンパ球依存性である。
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。病巣にはＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
【０１１１】
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴリンパ球依存性である。これらの疾患はＴリンパ球誘発性炎症、ＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染（限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及びヘルペス）、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染（ＭＬＲを刺激する分子（又は誘導体／アゴニスト）を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる）を含む感染疾患、ＭＬＲを刺激し、治療に利用し、遺伝子し、獲得し、感染誘発された（例えばＨＩＶ感染）状態に対する免疫反応を増強するために治療上用いることが可能な免疫欠損疾患（分子／誘導体／アゴニスト）又は医原性（即ち、化学療法からのもの）免疫欠損、及び異常増殖である。
ヒト癌患者の中には、異常増殖細胞上の抗原に反応する抗体及び／又はＴリンパ球を発生させるものもいることが証明されている。また、異常増殖のある動物モデルにおいても、免疫反応を増強することで、特定の異常増殖が拒絶又は退行する結果になることも示されている。ＭＬＲにおけるＴリンパ球反応を増強する分子は、異常増殖に対する免疫反応を増強するインビボでの利用性を有している。ＭＬＲにおけるＴリンパ球増殖反応を増強する分子（又は拮抗的に同じレセプターに影響を及ぼした小分子アゴニスト又は抗体）は、癌の治療に治療的に使用することができる。また、ＭＬＲにおいてリンパ球反応を阻害する分子は、異常増殖中に、新生物に対する免疫反応を抑制するように、インビボで機能し；このような分子は新生物細胞自体により発現されうるか、又はその発現は他の細胞中の新生物により誘発されうる。このような阻害分子（抗体、小分子アンタゴニスト又は他の手段による）の拮抗作用により免疫媒介腫瘍拒絶が増強される。
さらに、炎症誘発性特性を有する分子を阻害することは、再灌流傷害；脳卒中；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化；急性肺傷害；出血性ショック；火傷；敗血症／敗血症ショック；急性尿細管壊死；子宮内膜症；変性関節疾患及び膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｓ）の治療に有益である。
【０１１２】
本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入（鼻孔内、肺内）経路などにより投与される。ポリペプチド及び抗体の静脈内又は吸入投与が好ましい。
免疫アジュバント治療において、抗癌剤の投与などの他の投薬計画は、本発明のタンパク質、抗体又は化合物の投与と組み合わされてもよい。例えば、本発明の免疫アジュバントで治療される患者は、抗癌剤（化学療法剤）又は放射線治療を受けてもよい。このような化学療法剤の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｅｄ．Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）にも記載されている。化学療法剤は、免疫アジュバントの投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。加えて、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（ＥＰ ６１６８１２参照）を、それらの分子について知られた用量で付与してもよい。
【０１１３】
また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、ＰＲＯポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いてＰＲＯポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とＰＲＯポリペプチドとの組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチド又は抗体が、例えば、一又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０１１４】
Ｏ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質（例えばＰＲＯ分子を含有するもの）を含む製造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は通常、本発明のポリペプチド又は抗体である。容器上又は添付される使用説明書又はラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１１５】
Ｐ．免疫関連疾患の診断及び予知
ある種の免疫関連疾患で過剰発現されるタンパク質等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は疾患治療の優れた標的である。同じタンパク質は免疫関連疾患で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに、これらの疾患の診断及び予知における付加的な用途が見出される。例えば、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、又は他の免疫関連疾患で増幅された遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は診断又は予知として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅又は過剰発現された遺伝子にコードされるタンパク質（「マーカー遺伝子産物」）の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によってモニターできる。これらの技術は、過剰発現した遺伝子が細胞表面タンパク質をコードする場合に特に適切である。このような結合アッセイは、本質的に上述したように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を重層することにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１１６】
（実施例）
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して同定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡである。
実施例１：新規なポリペプチド及びそれをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同スクリーニング
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（存在すれば、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ、ＧｅｎＢａｎｋ）及び企業のデータベース（例えば、ＬＩＦＥＳＥＱＴＭ、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含む。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０（１９９６））を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用い、ｐｈｒａｐを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を、しばしば（常にではない）ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ−２及びｐｈｒａｐの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより対象の配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及びＰＲＯポリペプチドの全長コード配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。ある場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリーを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象の遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３： １２７８−１２８０（１９９１）参照）に、ユニークなＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
【０１１７】
実施例２：特定のデータベースクエリー（Ｄａｔａｂａｓｅ Ｑｕｅｒｙ）を使用するｃＤＮＡクローンの単離ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を、公的（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）及び／又は私的（ＬＩＦＥＳＥＱＲ，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）データベースにおいて、特定の遺伝子の相同性を検索するために、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ及又はＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｈｕｌ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６））を用いて同定した。この場合、研究者は疑問配列として、予め同定されている一つの遺伝子を使用し、関連した相同性を検索した。相同性の有意性は各遺伝子に基づきケースバイケースで決定される。有意な相同性が見出された場合、これにより、検査され配列決定される全長クローンに対応するか、又は次に天然配列ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するための種々の組織ライブラリーーをスクリーニングするために使用されるクローニングオリゴヌクレオチドの創製のためのテンプレートとなる、さらなるＥＳＴ配列が同定される結果となる。
【０１１８】
実施例３：シグナルアルゴリズム分析を使用するｃＤＮＡクローンの単離
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ｉｎｃ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）によって開発された独自のシグナル配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）及び／又は私的（ＬＩＦＥＳＥＱＲ，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）データベースからのＥＳＴ並びに集団化及び構築されたＥＳＴ断片に適用して、種々のポリペプチドコード核酸配列を同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５’−末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムを使用すると、多数のポリペプチドコード化核酸配列の同定がなされる。
【０１１９】
実施例４：ゲノムＤＮＡに対してＥＣＤ相同性を使用するｃＤＮＡクローンの単離
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（存在すれば、分泌シグナル配列を含む）を、配列データベースの検索に使用した。データベースは、公的データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）を含む。この場合、ＧｅｎＢａｎｋからのゲノムＤＮＡ配列は、スタンフォード大学よりライセンスされた遺伝子予想プログラム、ＧＥＮＳＣＡＮを用いて分析した。ＧＥＮＳＣＡＮ分析は遺伝子のコード領域を予測し、ＥＣＤ検索の対象となり得る配列を作成する。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ−２［Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０（１９９６）］を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。必要ならば、既知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドが：１）ＰＣＲにより対象の配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するために、２）全長コード化配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、合成された。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。ある場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリーを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象の遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
様々な組織由来の５０種の異なるヒトｃＤＮＡライブラリーのプールがクローニングに使用された。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３： １２７８−１２８０（１９９１）参照）に、ユニークなＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
上述のように単離されたクローンのＤＮＡ配列は、全長ポリペプチドに対する全長ＤＮＡ配列を与えた。
【０１２０】
実施例５：ゲノムＤＮＡ対してシグナルアルゴリズム検索を使用するｃＤＮＡクローンの単離
潜在的な対象遺伝子は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）によって開発された独自のシグナル配列検出アルゴリズムを、公的なデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）からＧＥＮＳＣＡＮ（スタンフォード大学よりライセンス）によりプロセスされたゲノム配列に対し適用することにより同定された。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５’−末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムを使用すると、多数のポリペプチドコード化核酸配列の同定がなされる。
上記のシグナル配列アルゴリズムの使用により、ゲノム配列の同定が可能となる。その後、当該ゲノム配列は相同性の存在を同定するために種々のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）と比較された。相同性検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０（１９９６））を用いて行われた。必要ならば、既知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上となるこれらの比較物は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドが：１）ＰＣＲにより対象の配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するために、２）全長コード化配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、合成された。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。ある場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリーを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象の遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
様々な組織由来の５０種の異なるヒトｃＤＮＡライブラリーのプールがクローニングに使用された。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３： １２７８−１２８０（１９９１）参照）に、ユニークなＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
上述のように単離されたクローンのＤＮＡ配列は、全長ポリペプチドに対する全長ＤＮＡ配列を与えた。
【０１２１】
実施例６：ヒトＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述した実施例１ないし５に記載の技術を使用し、ここで開示されたＰＲＯポリペプチドをコードする多数の全長ｃＤＮＡクローンを同定した。次に、これらのｃＤＮＡを、次の表７に示すように、ブダペスト条約に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，１０８０１ ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、ＶＡ２０１１０−２２０９米国（ＡＴＣＣ）に寄託した。
実施例７：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における刺激活性アッセイ（番号２４）
この実施例は、本発明のポリペプチドが刺激されたＴリンパ球の増殖刺激剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫反応の増強が好ましい治療において有用である。治療薬は本発明のＰＲＯポリペプチドのアンタゴニスト、例えばＴリンパ球増殖の阻害が期待されるポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体の形態をとりうる。
このアッセイの基本的プロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｕｎｉｔ３．１２；Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，国立衛生研究所，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃから出版のものに記載されている。
より特別には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を哺乳動物個体、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する（一人のドナーには刺激物ＰＢＭＣを供給し、他のドナーにはレスポンダーＰＢＭＣを供給する）。所望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びＤＭＳＯ中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地（３７℃、５％ＣＯ２）で一晩解凍し、ついで洗浄し、３ｘ１０６細胞／ｍｌのアッセイ用培地（ＲＰＭＩ；１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸塩）に再懸濁させる。
【０１２３】
刺激物ＰＢＭＣは細胞を照射（約３０００ラド）することにより調製される。このアッセイは混合物：１００：１の１％又は０．１％に希釈された試験試料、５０：１の光にさらされた刺激物細胞、及び５０：１のレスポンダーＰＢＭＣ細胞を三重ウェルに蒔くことにより調製される。１００マイクロリッターの細胞培養培地又は１００マイクロリッターのＣＤ４−ＩｇＧをコントロールとして使用する。ついで、ウェルを３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートする。５日目、各ウェルにトリチウム化チミジン（１．０ｍＣ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ）でパルス処理する。６時間後、細胞を３回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、ＰＢＭＣをＢａｌｂ／ｃマウス及びＣ５７Ｂ６マウスの脾臓から単離する。アッセイ用培地（ＲＰＭＩ；１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸塩）において新たに回収された脾臓から細胞を、顕微鏡検査用に細かく切断し、リンホライト（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ）Ｍ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりＰＭＢＣを単離し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に１ｘ１０７細胞／ｍｌになるように細胞を再懸濁させる。ついで、アッセイは上記のように行われる。本発明の化合物におけるこのアッセイの結果を次の表８に示す。コントロールより正に増加しているとポジティブであると考えられ、１８０％以上の増加が好ましい。しかしながら、コントロールより多い値は全て、試験用タンパク質についての刺激効果を示す。
実施例８：皮膚血管透過性アッセイ（番号６４）
本アッセイは、特定のＰＲＯポリペプチドが哺乳動物の注入部位において、単核細胞、好酸球及びＰＭＮ浸潤を誘発することにより免疫反応を促進及び炎症反応を誘発することを示すものである。当該皮膚血管透過性アッセイは次のように実施される。体重が３５０グラム又はそれ以上の無毛のモルモットがケタミン（７５−８０ｍｇ／Ｋｇ）及び５ｍｇ／Ｋｇキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）筋肉注射（ＩＭ）で麻酔される。精製されたＰＲＯポリペプチドのサンプル又は条件培地試験サンプルが、注入部位あたり１００μｌで試験動物の背中に皮内注入される。動物あたり約１０−３０、好ましくは約１６−２４箇所の部位に注入が可能である。エバンスブルー色素（１％に生理的食塩水で緩衝）の１ｍｌが心臓内に注入される。ついで注入部位における斑点が注入後１時間、６時間及び２４時間で測定（直径ｍｍ）される。動物は注入後、適当な時間の後屠殺される。それぞれの皮膚注入部位は生体組織検査され、パラホルムアルデヒドで固定される。次に、皮膚は組織病理学検査のために準備される。各部位は皮膚への炎症細胞浸潤を検査される。可視的な炎症細胞の炎症を有する部位はポジティブとして記録される。炎症細胞は好中球、好酸球、単球、リンパ球であり得る。
少なくとも注入部位での最小血管周囲の浸潤は陽性として記録され、注入部位で浸潤のなかった場合にはネガティブとして記録される。結果は表９中に示される。
実施例９：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における阻害活性アッセイ（番号６７）
本実施例は、一又は複数のＰＲＯポリペプチドが刺激されたＴリンパ球の増殖阻害剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を阻害する化合物は、免疫反応の抑制が好ましい治療において有用である。
このアッセイの基本的プロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ３．１２；Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，国立衛生研究所，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃから出版のものに記載されている。
より特別には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を哺乳動物個体、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する（一人のドナーには刺激物ＰＢＭＣを供給し、他のドナーにはレスポンダーＰＢＭＣを供給する）。所望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びＤＭＳＯ中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地（３７℃、５％ＣＯ２）で一晩解凍し、ついで洗浄し、３ｘ１０６細胞／ｍｌのアッセイ用培地（ＲＰＭＩ；１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸、１％ピルバート）に再懸濁させる。刺激物ＰＢＭＣは細胞を照射（約３０００ラド）することにより調製される。
このアッセイは：
１００：１の１％又は０．１％に希釈された試験試料、
５０：１の照射された刺激物細胞、及び
５０：１のレスポンダーＰＢＭＣ細胞、
の混合物を三重ウェルに蒔くことにより調製される。１００マイクロリッターの細胞培養培地又は１００マイクロリッターのＣＤ４−ＩｇＧをコントロールとして使用する。ついで、ウェルを３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートする。５日目、各ウェルにトリチウム化チミジン（１．０ｍＣ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ）でパルス処理する。６時間後、細胞を３回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の改良法では、ＰＢＭＣをＢａｌｂ／ｃマウス及びＣ５７Ｂ６マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地（ＲＰＭＩ；１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸塩）において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンホライトＭ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりＰＢＭＣを単離し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に１ｘ１０７細胞／ｍｌになるように細胞を再懸濁させる。ついで、アッセイは上記のように行われる。
コントロール以下に減少していると阻害化合物としてポジティブであると考えられ、８０％以下の減少が好ましい。しかしながら、コントロールより少ない値は全て、試験用タンパク質の阻害効果を示す。結果を表１０に示す。
実施例１０：インサイツハイブリッド形成
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び位置測定のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と位置測定、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Ｌｕ及びＧｉｌｌｅｔｔ，Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １： １６９−１７６（１９９４）のプロトコールの最適化バージョンに従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ−標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のＬｕ及びＧｉｌｌｅｔｔに記載されたようにインサイツハイブリッド形成する。［３３Ｐ］ＵＴＰ−標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
【０１２７】
３３Ｐ−リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢＦ １００２，ＳＡ＜２０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をスピード真空乾燥させた。乾燥３ ３Ｐ−ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加した：２．０μｌの５ｘ転写バッファー；１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）；２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ： 各１０μｌの１０ｍＭ ＧＴＰ，ＣＴＰ及びＡＴＰ＋１０μｌのＨ２Ｏ）；１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）；１．０μｌのＲｎａｓｉｎ；１．０μｌのＤＮＡテンプレート（１μｇ）；１．０μｌのＨ２Ｏ。
管を３７℃で１時間インキュベートし、１．０μｌのＲＱ１ ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１紙にピペットした。残りの溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに充填し、プログラム１０を用いてスピンさせた（６分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（３分間）。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢＩＯＦＬＵＯＲ ＩＩで数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で泳動した。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡＭｒｋＩＩＩを３μｌのローディングバッファーに添加した。９５℃の加熱ブロック上で３分間加熱した後、速やかにゲルを氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を充填し、１８０−２５０ボルトで４５分間泳動した。ゲルをサランラップでラップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から一晩露出した。
【０１２８】
３３Ｐ−ハイブリッド形成
凍結切片の前処理 スライドを冷凍庫から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において氷上の４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（２５ｍｌ ２０ｘＳＳＣ＋９７５ｍｌ ＳＱＨ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（２５０ｍｌの予備加熱ＲＮａｓｅフリーＲＮａｓｅバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌストック１２．５μｌ）、切片を０．５ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中、各２分間脱水した。
パラフィン包埋切片の前処理 スライドを脱パラフィンし、ＳＱＨ２Ｏ中に配置し、２ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅフリーＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅバッファー中１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く０．５ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
プレハイブリッド化 スライドをＢｏｘバッファー（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を５０μｌのハイブリッド形成バッファー（３．７５ｇデキストラン硫酸＋６ｍｌＳＱ Ｈ２Ｏ）で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、１８．７５ｍｌのホルムアミド、３．７５ｍｌの２０ｘＳＳＣ及び９ｍｌのＳＱ Ｈ２Ｏを添加し、組織を良くボルテックスし、４２℃で１−４時間インキュベートした。
ハイブリッド形成 スライド当たり１．０ｘ１０６ｃｐ．のプローブ及び１．０μｌのＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μｌのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、５０μｌの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド５０μｌに添加した。スライドを５５℃で一晩インキュベートした。
洗浄 洗浄は、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで２ｘ１０分間、室温で実施し（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（２５０ｍｌＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
【０１２９】
あるいは、種々のヒト組織からのポリＡ＋ＲＮＡ（レーン当り２μｇ）を含有するマルチ−組織ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。ＤＮＡプローブをランダムプライムＤＮＡラベルビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰでラベルした。ハイブリッド形成はＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、６８℃で１時間行った。ついで、ブロットを２ｘＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳ溶液を用い、室温で４０分間洗浄し、次に新鮮な溶液に変えて、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液を用い、５５℃で４０分間洗浄した。ブロットをホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）にさらした。
この方法は、遺伝子発現を定量し、転写の組織分布を分析し、特定の病気に罹ったヒト個体から単離された発病組織における本発明の遺伝子／ＤＮＡ及びタンパク質の特定のｍＲＮＡ合成の変化を追うために使用された。これらの結果は、本発明の遺伝子が発現した発病組織においてより特異的に示され、本発明の阻害又は刺激化合物（及びそのアゴニスト又はアンタゴニスト）の病気に対する治療効果の特定の局在化をより予測している。ハイブリッド形成は、一又は複数の次の組織及び細胞試料を使用し、上述の方法に従い実施される：
（ａ）リンパ球及び抗原提示細胞（樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ及び単球、ＮＫ細胞）；
（ｂ）リンパ組織：正常及び反応性リンパ節、胸腺、気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）；
（ｃ）ヒト疾患組織：
・関節炎及び変性関節疾患を患っている患者の滑膜及び関節；
・潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性大腸疾患を患っている患者の結腸；
・乾癬及び他の形態の皮膚炎由来の皮膚病巣；
・慢性及び急性気管支炎、肺炎、間質性肺炎、胸膜炎由来のＢＡＬＴ及びリンパ節組織を含む肺組織；
・喘息由来のリンパ節組織及びＢＡＬＴを含む肺組織；
・鼻炎又は副鼻孔炎を患っている患者の鼻又は洞組織；
・多発性硬化症、アルツハイマー病及び脳卒中由来の脳及び脊髄；
・腎炎、糸球体腎炎及び全身性エリテマドーデス由来の腎臓；
・感染性及び非感染性肝炎及びアセトアミノフェン誘導性肝硬変由来の肝臓；
・新生物／癌由来の組織。
細胞又は組織試料に関連する疾患における本発明の化合物（及びそのアゴニスト又はアンタゴニスト）の治療効果の局在化を示す発現が一又は複数の細胞又は組織試料において観察される。
【０１３０】
結果
ＤＮＡ５４２２９−１３６６
５’ＵＴＲプローブを用いたマウスＤＮＡ５４２２９−１３６６発現の特異的パターン
正常な成体の大腸：粘膜の陰窩細胞中に強い分節状の発現が見られる。；この発現は陰窩細胞にのみ存在し、絨毛のおよそ上半分に伸展する。絨毛の端の上皮細胞は、シグナルを示さない。パターンは、分裂可能な粘膜上皮細胞の密度に相関する。このパターンが分節状、即ちシグナルを示さない大腸のある領域が存在するという事実は興味深い。
炎症を起こした成体マウス（ＩＬ１０ Ｒ ＫＯ（ノックアウト）マウス）の大腸：発現のパターン及び強度は正常な大腸に関して上述したことと類似するようである。
正常な成体の小腸：粘膜の陰窩細胞中に発現する分節状の領域が僅かに存在する。；発現は、大腸での発現に比べて非常に弱く、小腸管の僅かな部分にのみ見られる；小腸及び大腸の更なる評価により保証される。
正常及び炎症を起こした成体マウス肺：シグナル無し。
５’ＵＴＲプローブをマウス組織中で用いたＤＮＡ５４２２９−１３６６の特異的発現パターン
結果：ＤＮＡ５４２２９−１３６６の発現分布は、正常マウス組織の広範囲に及ぶスクリーニングにおいてさらに評価された。既に、インサイツハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡ５４２２９−１３６６の発現が結腸上皮に限定されることを報告した。
概要：ＤＮＡ５４２２９−１３６６の発現は、盲腸上皮中に最小限の伸展を伴い結腸上皮に特異的に限定された。発現はこれら上皮細胞中で強く、散在していた。回腸、空腸、十二指腸基部、又は胃には発現は見られなかった。以下の正常マウス組織では、発現は見られなかった：肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、肺、膵臓、胃、十二指腸基部、空腸、回腸、脳、皮膚、精巣、又は乳腺。結腸上皮に限定された発現は、珍しい分布パターンであるため、興味深い。
ＤＮＡ５４２２９−１３６６のインサイツハイブリダイゼーションに用いられたプライマー
５４２２９．ｐ１
５’’ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＣ ＣＣＣ ＴＧＡ ＧＣＴＴＴＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＧＴＧ３’’（配列番号１９）
５４２２９．ｐ２
５’’ＣＴＡ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＣＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＡＡＧ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＡＧＡＴＣ ＧＴＣ ＴＴＡ ＧＧＣ３’’（配列番号２０）
【０１３１】
ＤＮＡ６４８８９−１５４１
さらなる新規血管形成組織に対する血管形成組織スクリーニングによるＤＮＡ６４８８９−１５４１の発現：肺血管炎、血管筋脂肪腫、浸潤性子宮内膜腺癌、糖尿病眼症、関節リウマチ。
結果：１４．５週の胎児表皮、肺上皮及び間質、食道上皮、及び骨格筋において、中程度から弱い発現が見られる。正常成体の組織には検出可能な発現は見られない；子宮内膜癌腫上皮は弱い発現を示す。２つのヒト臍帯静脈血管内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞ペレットの一方は弱い発現を示す。
ＤＮＡ６４８８９−１５４１のインサイツハイブリッド形成に用いられたプライマー
６４８８９．ｐ１
５’’ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＣ ＧＧＣ ＣＣＣ ＣＡＴＧＡＣ ＴＣＣ ＴＴＡ ＣＣＴ３’’（配列番号２１）
６４８８９．ｐ２
５’’ＣＴＡ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＣＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＴＣ ＡＧＣＡＣＡ ＣＧＣ ＡＴＣ ＴＣ３’’（配列番号２２）
【０１３２】
ＤＮＡ６５３５１−１３６６
ＳＰＤＩスクリーニング組織、乳癌腫及び結腸腺癌における５’ＵＴＲプローブを用いたマウスＤＮＡ６５３５１−１３６６発現の特異的パターン
ヒト胎児性組織：
胎児性の肝臓、肺、骨格筋、骨、脊髄、血管、心臓、腸、生殖腺、副腎、脊椎傍神経節には発現は見られない。胎児性肢：長骨の骨髄腔中でクラスター化している造血細胞における弱いシグナル。
アカゲザル及びチンパンジーの組織
脳：シグナル無
舌：シグナル無
胃：腺性粘膜中に弱い矛盾するシグナル
甲状腺／副甲状腺：シグナル無
胸腺：シグナル無
神経：シグナル無
ヒト正常及び疾患組織：シグナル無：胸腺、脳、肺、副腎、脾臓、腎臓（正常及び変性）、皮膚、臍帯、肝臓（正常及び炎症性）、乳癌腫、結腸腺癌、腸間膜脂肪組織、乳脂肪組織。
眼：内部神経節眼層において弱いシグナル。
６５３５１．ｐ１
５’’ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＣ ＣＧＡ ＧＡＧ ＧＣＧＣＣＴ ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＧＡ３’’（配列番号２３）
６５３５１．ｐ２
５’’ＣＴＡ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＣＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＡＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣＣＣＣ ＧＣＡ ＡＣＣ Ｃ３’’（配列番号２４）
【０１３３】
実施例１１：ハイブリッド形成プローブとしてのＰＲＯの使用
以下の方法は、ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
全長又は成熟ＰＲＯのコード配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける同種ＤＮＡ類（ＰＲＯの自然に生じる変異体をコードするものなど）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識ＰＲＯ−誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハート液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
次いで、全長天然配列ＰＲＯをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０１３４】
実施例１２：大腸菌におけるＰＲＯの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現によるＰＲＯの非グリコシル化形態の調製を例示する。
ＰＲＯをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Ｂｏｌｉｖａｒ等，Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７）を参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯコード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載された方法を用いて選択した大腸菌株の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培養は、続いて大規模培養の播種に用いられる。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離して採集することができる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化ＰＲＯタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製することができる。
【０１３５】
以下の手法を用いて、大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態でＰＲＯを発現させてもよい。ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ−Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ） ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用する。形質転換体は、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させる。ついで培養をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させる。試料を取り出してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により発現を確認し、バルク培養を遠心分離して細胞をペレット化する。細胞ペレットを精製及びリフォールディングまで凍結させる。
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させる。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌する。この工程により、亜硫酸化によりブロックされた全てのシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされる。溶液をＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で４０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化する。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに充填する。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄する。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸収により見積もる。
【０１３６】
試料を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製したリフォールディングバッファー中でゆっくりと希釈することによりタンパク質をリフォールディングさせる。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択する。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌する。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させる。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％になるまで添加する。リフォールディングされたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかける。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同なリフォールディングされたタンパク質を含有する画分をプールする。一般的に、殆どのタンパク質の正しくリフォールディングされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたＰＲＯポリペプチドタンパク質を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去する。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に処方した。
上述したように、ここに開示された多くのＰＲＯポリペプチドが成功裏に発現した。
【０１３７】
実施例１３：哺乳動物細胞でのＰＲＯの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のＰＲＯの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開のＥＰ３０７，２４７参照）を用いる。場合によっては、ＰＲＯＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＰＲＯＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、例えばｐＲＫ５−ＰＲＯと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞である。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化する。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯＤＮＡを約１μｇのＶＡＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ等，Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９８２））］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、 ０．２２７ＭＣａＣｌ２に溶解させる。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間沈殿物を形成させる。沈殿物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間安定させる。培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加する。２９３細胞を、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートする。
形質移入の約２４時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換する。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに充填する。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらす。形質移入した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
【０１３８】
これに換わる技術において、ＰＲＯは、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５μｇ／ｍｌウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。次いで発現されたＰＲＯを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製する。
他の実施態様では、ＰＲＯをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの既知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯポリペプチドの存在を決定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
また、エピトープタグポリペプチドは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯはｐＲＫ５ベクター外でサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ−ｈｉｓタグポリペプチド挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクター／エンハンサーにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をベクターを含むＳＶ４０プロモータ／エンハンサーで（上記のように）形質移入することができる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ−ｈｉｓタグＰＲＯを含む培地を次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された任意の方法により精製できる。
またＰＲＯは、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、又は他の安定な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
【０１３９】
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質はそれぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）、及び／又はポリ−ｈｉｓタグ形態として発現する。
ＰＣＲ増幅に続いて、それぞれのＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ ３．１６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターは、対象のＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ＣＨＯ細胞における発現に使用されたベクターは、Ｌｕｃａｓ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ ｒｅｓ．２４： ９，１７７４−１７７９（１９９６）に記載されたようなものであり、対象のｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬ＳｕｐｅｒｆｅｃｔＲ（Ｑｕｉａｇｅｎ），ＤｏｓｐｅｒＲ又はＦｕｇｅｎｅＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用し約一千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上掲のＬｕｃａｓ等に記載されているように成長させる。約３ｘ１０−７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させる。 プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合する。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．２μｍ透析濾過ウシ胎児血清）中に懸濁させる。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍｌスピナーに分ける。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地を満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０５細胞／ｍＬで播種する。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させる。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載された生産培地を使用した。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで播種する。０日目に、細胞数とｐＨを測定する。１日目に、スピナーをサンプル化し、濾過空気での散布を実施する。２日目に、スピナーをサンプル化し、温度を３３℃に変え、５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）の３０ｍＬとする。生産を通して、ｐＨを７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μｍフィルターを通して濾過する。濾過物を、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填する。
【０１４０】
ポリ−Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加する。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製する。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に汲み上げる。充填後、１００ｍＭのクエン酸，ｐＨ３．５で溶離する前に、カラムを平衡バッファーで十分洗浄する。溶離したタンパク質を、１ｍｌの画分を２７５μｌの１Ｍトリスバッファー，ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中和する。高度に精製されたタンパク質を、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩する。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定により評価する。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０１４１】
実施例１４：酵母菌でのＰＲＯの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然配列ＰＲＯシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯ発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌を、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清を、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示されるＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０１４２】
実施例１５：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯの組換え発現を記載する。
ＰＲＯをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯをコードする配列又はＰＲＯのコード配列の所望部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、側方に位置する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）中にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ等，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）に記載されているように実施する。
【０１４３】
次に、発現されたポリ−ｈｉｓタグＰＲＯは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製することができる。抽出は、Ｒｕｐｅｒｔ等，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：１７５−１７９（１９９３）に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を充填バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの充填バッファーで平衡させる。濾過した細胞抽出物を、毎分０．５ｍＬでカラムに充填する。カラムを分画回収が始まる点であるＡ２ ８０のベースラインまで充填バッファーで洗浄する。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄する。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開する。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）に結合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析する。溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯを含む画分をプールして充填バッファーで透析する。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示されるＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０１４４】
実施例１６：ＰＲＯに結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術はこの分野で知られており、例えば、上掲のＧｏｄｉｎｇに記載されている。用いられ得る免疫原は、本発明の精製ＰＲＯ、ＰＲＯを含む融合タンパク質、及び細胞表面にＰＲＯを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムの量で注入したＰＲＯ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）に乳化し、動物の後足蹠に注入する。免疫化したマウスを、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＰＲＯ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。 適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＰＲＯの最後の静脈内注射を注入することができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
ハイブリドーマ細胞を、ＰＲＯに対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングする。ＰＲＯに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＰＲＯモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１４５】
実施例１７：特異的抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ−ＰＲＯポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ−ＰＲＯポリペプチドは、対象のＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＰＲＯポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化セファロースＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨ、又は高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、ＰＲＯポリペプチドが回収される。
【０１４６】
実施例１８：薬物スクリーニング
本発明は、ＰＲＯポリペプチド又はその結合断片を任意の種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯポリペプチド又は断片は、溶液中の遊離状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＰＲＯポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ＰＲＯポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。
従って、本発明は、ＰＲＯポリペプチド関連疾患又は疾病に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＰＲＯポリペプチド又は断片に接触させ、（ｉ）試薬とＰＲＯポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は（ｉｉ）ＰＲＯポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、当該技術でよく知られた方法でアッセイすることを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なＰＲＯポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯポリペプチドに結合する又はＰＲＯポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開されたＷＯ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＰＲＯポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合可能な中和抗体がＰＲＯポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイに使用されることも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯポリペプチドで一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１４７】
実施例１９：合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象の生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＰＲＯポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯポリペプチドの機能を向上又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９： １９−２１（１９９１））。
１つの方法において、ＰＲＯポリペプチド、又はＰＲＯポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造が、Ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Ｂｒａｘｔｏｎ及びＷｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１： ７７９６−７８０１（１９９２）に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はＡｔｈａｕｄａ等，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３： ７４２−７４６（１９９３）に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。このアプローチは、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生成する。機能的で薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体（抗−ｉｄｓ）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗−ｉｄｓの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗−ｉｄは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のＰＲＯポリペプチドがＸ線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる指針を提供する。
【０１４８】
上記の文書による明細書は、当業者が本発明を実施するためには十分であると考えられる。寄託された実施例は、本発明のある側面の一つの例証としてのものであり、あらゆる機能的に等価な構築物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された構築物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明のあらゆる側面の実施を可能にするには不十分であることを認めるものではなく、それが表す特定の例証に請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、天然配列ＰＲＯ１０８１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す図であり、配列番号：１はここで「ＤＮＡ５４２２９−１３６６」と称されるクローンである。
【図２】図２は、図１に示す配列番号：１のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【図３】図３は、天然配列ＰＲＯ１２７４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す図であり、配列番号：３はここで「ＤＮＡ６４８８９−１５４１」称されるクローンである。
【図４】図４は、図３に示す配列番号：３のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図である。
【図５】図５は、天然配列ＰＲＯ１１９９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す図であり、配列番号：５はここで「ＤＮＡ６５３５１−１３６６」と称されるクローンである。
【図６】図６は、図５に示す配列番号：５のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６）を示す図である。
【図７】図７は、天然配列ＰＲＯ１７５４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７）を示す図であり、配列番号：７はここで「ＤＮＡ７６３８５−１６９２」と称されるクローンである。
【図８】図８は、図７に示す配列番号：７のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８）を示す図である。
【図９】図９は、天然配列ＰＲＯ１５５６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９）を示す図であり、配列番号：９はここで「ＤＮＡ７６５２９−１６６６」と称されるクローンである。
【図１０】図１０は、図９に示す配列番号：９のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す図である。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｂは、天然配列ＰＲＯ４４０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す図であり、配列番号：１１はここで「ＤＮＡ８４９１２−２６１０」と称されるクローンである。
【図１２】図１２は、図１１Ａ−１１Ｂに示す配列番号：１１のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す図である。
【図１３】図１３は、天然配列ＰＲＯ９９１２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３）を示す図であり、配列番号：１３はここで「ＤＮＡ１０８７００−２８０２」と称されるクローンである。
【図１４】図１４は、図１３に示す配列番号：１３のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す図である。
【図１５】図１５は、天然配列ＰＲＯ１０２６８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５）を示す図であり、配列番号：１５はここで「ＤＮＡ１４５５８３−２８２０」と称されるクローンである。
【図１６】図１６は、図１６に示す配列番号：１６のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す図である。
【図１７】図１７は、天然配列ＰＲＯ１０２７２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７）を示す図であり、配列番号：１７はここで「ＤＮＡ１４７５３１−２８２１」と称されるクローンである。
【図１８】図１８は、図１７に示す配列番号：１７のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す図である。[0001]
(Field of the Invention)
The present invention relates to compositions and methods useful for diagnosing and treating immune-related diseases.
(Background of the Invention)
Immune-related and inflammatory diseases are critical in normal physiology to respond to invasion or injury, initiate repair from invasion or injury, and provide innate and acquired defenses against foreign organisms. It is the manifestation or consequence of complex, often multiple, interconnected biological pathways. A disease or condition is a condition in which these normal physiological pathways are directly related to the intensity of the response, as a result of abnormal regulation or overstimulation, as a response to self, or as a combination thereof, as a further invasion or injury. Occurs when causing.
Although the occurrence of these diseases often involves multi-step pathways and often involves multiple different biological systems / pathways, intervention at one or more key points in these pathways will result in an improved or therapeutic effect. May be provided. Therapeutic intervention may result from either antagonizing a detrimental process / pathway or stimulating a beneficial process / pathway.
[0002]
Many immune-related diseases are known and have been extensively studied. Such diseases include immune-mediated inflammatory diseases, non-immune-mediated inflammatory diseases, infectious diseases, immunodeficiencies, abnormal growth and the like.
T lymphocytes (T cells) are an important component of a mammalian immune response. T cells recognize antigens that are associated with self molecules encoded by genes in the major histocompatibility complex (MHC). The antigen may be displayed with MHC molecules on the surface of antigen presenting cells, virus infected cells, cancer cells, grafts, and the like. T cell lines eliminate these modified cells that threaten the health of the host mammal. T cells include helper T cells and cytotoxic T cells. Helper T cells proliferate extensively following recognition of the antigen-MHC complex on antigen presenting cells. Helper T cells also secrete various cytokines, the lymphokines, which play a central role in the activation of B cells, cytotoxic T cells, and various other cells that contribute to the immune response.
Central events in both humoral and cell-mediated immune responses are helper T cell activation and clonal expansion. Activation of helper T cells is initiated by the interaction of the T cell receptor (TCR) -CD3 complex with antigen-MHC on the surface of antigen presenting cells. This interaction mediates a cascade of biochemical events that induce resting helper T cells to enter the cell cycle (G0 to G1 transition), thereby causing high affinity receptors for IL-2 and sometimes IL-4. To be expressed. Activated T cells evolve throughout the cycle, proliferate and differentiate into memory cells or effector cells.
In addition to the signal mediated by the TCR, activation of T cells may be triggered by additional cytokines released by antigen presenting cells or by the interaction of antigen presenting cells with membrane-bound molecules on T cells. Involved in stimulation. The cytokines IL-1 and IL-6 have been shown to provide costimulatory signals. Further, T cells are activated by the interaction between the B7 molecule expressed on the surface of the antigen-presenting cell and the CD28 and CTLA-4 molecules expressed on the T cell surface. Activated T cells express an increased number of cell adhesion molecules, such as ICAM-1, integrin, VLA-4, LFA-1, CD56, and the like.
[0003]
Proliferation of T cells in a mixed lymphocyte culture or mixed lymphocyte reaction (MLR) is an established indicator of the ability of a compound to stimulate the immune system. In many immune responses, inflammatory cells infiltrate the site of injury or infection. The migrating cells can be neutrophils, eosinophils, monocytes or lymphocytes that can be quantified by histological examination of the affected tissue. Current Protocols in Immunology, John. E. FIG. Colligan, Ed., 1994, John Wiley & Sons, Inc. .
Immune related diseases can be treated by suppressing the immune response. The use of neutralizing antibodies that inhibit molecules with immunostimulatory activity is useful for treating immune-mediated and inflammatory diseases. Molecules that inhibit the immune response can be used to inhibit the immune response (either directly through the protein or through the use of antibody agonists), thus ameliorating immune-related diseases.
[0004]
(Summary of the Invention)
A. Embodiment
The present invention relates to compositions and methods useful for diagnosing and treating immune-related diseases in mammals, including humans. The present invention is based on the identification of proteins (including agonist and antagonist antibodies) that stimulate or inhibit an immune response in a mammal. Immune related diseases can be treated by suppressing or enhancing the immune response. Molecules that enhance the immune response stimulate or enhance the immune response to the antigen. Where enhancing an immune response is beneficial, molecules that stimulate the immune response can be used therapeutically. Alternatively, if sedation of the immune response is useful (e.g., inflammation), molecules that suppress the immune response (e.g., neutralizing antibodies), such as sedating or reducing the immune response to the antigen, can be used therapeutically. . Accordingly, PRO polypeptides, agonists and antagonists thereof, are useful in preparing medicaments and medicaments for the treatment of immune-related and inflammatory diseases. In certain aspects, such medicaments and drugs comprise a therapeutically effective amount of a PRO polypeptide, agonist or antagonist thereof, together with a pharmaceutically acceptable carrier. Preferably, the mixture is sterilized.
In a further embodiment, the present invention provides a method of identifying an agonist or antagonist of a PRO polypeptide comprising contacting the PRO polypeptide with a candidate molecule and monitoring a biological activity mediated by said PRO polypeptide. About. Preferably, the PRO polypeptide is a native sequence PRO polypeptide. In certain aspects, the PRO agonist or antagonist is an anti-PRO antibody.
[0005]
In another embodiment, the invention is directed to a composition comprising a PRO polypeptide or an agonist or antagonist antibody that binds to the polypeptide when mixed with a carrier or excipient. In one aspect, the composition comprises a therapeutically effective amount of the polypeptide or antibody. In another aspect, when the composition comprises an immunostimulatory molecule, the composition (a) increases infiltration of inflammatory cells into tissues of the mammal in need thereof; Stimulating or enhancing an immune response, (c) increasing the proliferation of T-lymphocytes in a mammal in need thereof in response to the antigen, (d) stimulating the activity of T-lymphocytes, or (e) Useful for increasing vascular permeability. In a further aspect, when the composition comprises an immunosuppressive molecule, the composition (a) reduces infiltration of inflammatory cells into tissues of the mammal in need thereof, and (b) reduces immunity in the mammal in need thereof. Useful for inhibiting or reducing a response, (c) reducing the activity of T-lymphocytes, or (d) reducing the proliferation of T-lymphocytes in a mammal in need thereof in response to an antigen. . In other aspects, the composition contains an additional active ingredient, which can be, for example, an additional antibody or cytotoxic or chemotherapeutic agent. Preferably, the composition is sterile.
[0006]
In another embodiment, the present invention is directed to a method of treating an immune-related disease in a mammal in need thereof, comprising administering to the mammal an effective amount of a PRO polypeptide, agonist or antagonist thereof. In a preferred embodiment, the immune-related disease is systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, juvenile chronic arthritis, spondyloarthritis, systemic sclerosis, idiopathic inflammatory myopathy, Sjogren's syndrome, systemic vasculitis, Sarcoidosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenia, thyroiditis, diabetes mellitus, immune-mediated renal disease, central and peripheral nervous system demyelinating diseases such as multiple sclerosis, idiopathic demyelinating polyneuropathy Or Guillain-Barré syndrome, and chronic inflammation-related paraneoplastic polyneuropathy, hepatobiliary diseases, such as infectious, autoimmune chronic active hepatitis, primary biliary cirrhosis, granulomatous hepatitis, and sclerosing cholangitis, Autoimmune or immune-mediated skin diseases including inflammatory bowel disease, gluten-sensitive bowel disease, and Whipple disease, bullous skin disease, erythema multiforme and contact dermatitis, psoriasis, allergy Diseases, such as asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, food sensitization and urticaria, pulmonary immune diseases, such as eosinophilic pneumonia, idiopathic pulmonary fibrosis and irritable pneumonia, rejection and graft versus host disease Selected from the group consisting of transplantation-related diseases.
[0007]
In another embodiment, the invention provides an antibody that specifically binds to any of the above or below described polypeptides. In some cases, the antibody is a monoclonal antibody, a humanized antibody, an antibody fragment, or a single chain antibody. In one aspect, the invention is directed to an isolated antibody that binds a PRO polypeptide. In other embodiments, the antibody mimics the activity of the PRO polypeptide (agonist antibody), or conversely, the antibody inhibits or neutralizes the activity of the PRO polypeptide (antagonist antibody). In another aspect, the antibody is a monoclonal antibody, preferably having non-human complementarity determining region (CDR) residues and human framework region (FR) residues. The antibody may be labeled or immobilized on a solid support. In a further aspect, the antibody is an antibody fragment, a monoclonal antibody, a single-chain antibody, or an anti-idiotype antibody. In yet another embodiment, the invention provides a composition comprising an anti-PRO antibody in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. In one aspect, the composition comprises a pharmaceutically effective amount of the antibody. Preferably, the composition is sterile. The compositions may be administered in the form of a liquid pharmaceutical formulation that can be preserved to achieve extended stability upon storage. Alternatively, the antibodies are monoclonal antibodies, antibody fragments, humanized antibodies, or single-chain antibodies.
[0008]
In a further embodiment, the present invention provides:
(A) a composition comprising a PRO polypeptide or an agonist or antagonist thereof;
(B) a container containing the composition; and
(C) providing an article of manufacture comprising a label affixed to the container or a package insert included in the container, which refers to the use of the PRO polypeptide or agonist or antagonist thereof in the treatment of an immune-related disease. The composition may include a therapeutically effective amount of the PRO polypeptide or an agonist or antagonist thereof.
[0009]
In yet another embodiment, the invention encodes a PRO polypeptide (a) in a test sample of tissue cells obtained from a mammal and (b) in a control sample of known normal tissue cells of the same cell type. A method for diagnosing an immune-related disease in a mammal, comprising detecting the expression level of a gene, wherein the expression level of the test sample is higher or lower than the control sample, and the mammal obtained the test tissue cell. Shows that an immune-related disease exists.
In another embodiment, the invention provides (a) contacting an anti-PRO antibody with a test sample of tissue cells obtained from a mammal, and (b) detecting complex formation between the PRO polypeptide and the antibody in the test sample. A method of diagnosing an immune disease in a mammal, wherein the formation of the complex indicates the presence or absence of the disease. Detection may be qualitative or quantitative, and may be performed by monitoring and comparing complex formation in control samples of known normal tissue cells of the same cell type. The large amount of complex formed in the test sample indicates the presence or absence of an immune disease in the mammal from which the test tissue cells were obtained. The antibody preferably has a detectable label. Complex formation can be monitored, for example, by light microscopy, flow cytometry, fluorimetry, or other techniques known in the art. Usually, test samples are taken from individuals suspected of having a defective or abnormal immune system.
[0010]
In another embodiment, the invention comprises exposing a test sample of cells suspected of containing the PRO polypeptide to an anti-PRO antibody and measuring the binding of the antibody to the cell sample. Methods are provided for determining the presence or absence of a PRO polypeptide. In certain aspects, the sample comprises cells suspected of containing the PRO polypeptide and antibodies that bind to the cells. The antibodies are preferably detectably labeled and / or bound to a solid support.
In another embodiment, the present invention relates to a kit for diagnosing an immune-related disease comprising an anti-PRO antibody and a carrier in a suitable package. The kit preferably includes instructions for using the antibody to detect the presence or absence of the PRO polypeptide. Preferably, the carrier is pharmaceutically acceptable.
In another embodiment, the invention is directed to a diagnostic kit comprising the anti-PRO antibody in a suitable package. Preferably, the kit includes instructions for using the antibody to detect the PRO polypeptide.
[0011]
In another embodiment, the present invention provides a method of diagnosing an immune-related disease in a mammal, comprising detecting the presence or absence of the PRO polypeptide in a test sample of tissue cells obtained from the mammal, wherein the test comprises The presence or absence of the PRO polypeptide in the sample indicates that an immune-related disease is present in the mammal.
In another embodiment, the present invention provides a method of identifying an agonist of a PRO polypeptide, comprising:
(A) contacting the cells with the test compound to be screened under conditions suitable for inducing a cellular response normally elicited by the PRO polypeptide;
(B) measuring the induction of the cellular response to determine whether the test compound is an effective agonist, wherein the induction of the cellular response is an effective agonist of the test compound. It indicates that.
[0012]
In another embodiment, the present invention provides that the PRO polypeptide is contacted with a candidate compound for a time and under conditions sufficient for the two components to interact with each other to determine whether the activity of the PRO polypeptide is inhibited. And identifying a compound capable of inhibiting the activity of a PRO polypeptide. In certain embodiments, either the candidate compound or the PRO polypeptide is immobilized on a solid support. In another aspect, the non-immobilized component carries a detectable label. In a preferred embodiment, the method comprises:
(A) contacting the cells with the test compound to be screened under conditions suitable for the induction of a cellular response in which the PRO polypeptide is present and normally induced by the PRO polypeptide;
(B) measuring the induction of said cellular response to determine whether the test compound is an effective antagonist.
In another embodiment, the present invention provides a method of identifying a compound that inhibits expression of a PRO polypeptide in a cell that normally expresses the PRO polypeptide, the method comprising contacting a cell with a test compound, Determining whether expression of the polypeptide is inhibited. In a preferred embodiment, the method comprises:
(A) contacting the cells with the test compound to be screened under conditions suitable for expressing the PRO polypeptide;
(B) measuring the inhibition of the expression of the polypeptide.
[0013]
In a further embodiment, the present invention relates to a method of treating a disease in a mammal suffering from an immune-related disease, comprising: (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of the PRO polypeptide, or (c) a PRO polypeptide. Administering to a mammal a nucleic acid molecule encoding any of the above antagonists, wherein said agonist or antagonist may be an anti-PRO antibody. In a preferred embodiment, the mammal is a human. In another preferred embodiment, the nucleic acid is administered via ex vivo gene therapy. In a further preferred embodiment, the nucleic acid is contained in a vector, more preferably an adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus or retroviral vector.
In another aspect, the present invention provides a nucleic acid encoding a promoter, (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist polypeptide of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist polypeptide of a PRO polypeptide, and a polypeptide. Recombinant virus particles comprising a viral vector consisting essentially of a signal sequence for cell secretion of the virus, wherein the viral vector is associated with a viral structural protein. Preferably, the signal sequence is from a mammal, eg, a native PRO polypeptide.
In yet a further embodiment, the invention comprises a nucleic acid construct that expresses a retroviral structural protein and comprises a promoter, (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist polypeptide of the PRO polypeptide, or (c) PRO. An ex vivo producing cell further comprising a retroviral vector consisting essentially of a nucleic acid encoding an antagonist polypeptide of the polypeptide and a signal sequence for cellular secretion of the polypeptide, wherein the producing cell is a recombinant retroviral particle Retrovirus vectors related to the structural proteins for producing E. coli.
[0014]
In a further embodiment, the present invention provides a method for administering to a mammalian tissue comprising administering to a mammal (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist of a PRO polypeptide. For increasing the infiltration of inflammatory cells from the vasculature of a mammal, wherein the infiltration of inflammatory cells from vascular tissue is increased in a mammal.
In yet a further embodiment, the invention provides a mammalian tissue comprising administering (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist of a PRO polypeptide to a mammal. A method of reducing the infiltration of inflammatory cells from the vasculature into a mammal, wherein the infiltration of inflammatory cells from the vasculature is reduced in a mammal.
In yet a further embodiment, the present invention provides a method of treating a mammal, comprising administering (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist of a PRO polypeptide to a mammal. A method of increasing T-lymphocyte activity is provided, wherein T-lymphocyte activity in a mammal is increased.
In yet a further embodiment, the present invention provides a method of treating a mammal, comprising administering (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist of a PRO polypeptide to a mammal. A method for reducing the activity of T-lymphocytes is provided, wherein the activity of T-lymphocytes in a mammal is reduced.
In yet a further embodiment, the present invention provides a method of treating a mammal, comprising administering (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist of a PRO polypeptide to a mammal. A method of increasing T-lymphocyte proliferation is provided, wherein T-lymphocyte proliferation in a mammal is increased.
In yet a further embodiment, the present invention provides a method of treating a mammal, comprising administering (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist of a PRO polypeptide to a mammal. A method of reducing T-lymphocyte proliferation is provided, wherein T-lymphocyte proliferation in a mammal is reduced.
[0015]
In a further embodiment, the invention provides a method of stimulating T-cell proliferation, comprising contacting the T-cell with a PRO1081, PRO1274, or PRO10272 polypeptide or agonist thereof, wherein the method comprises stimulating T-cell proliferation. Stimulation of T-cell proliferation.
In yet a further embodiment, the invention provides a method of inhibiting the proliferation of T-lymphocytes, comprising contacting said T-lymphocytes with a PRO1199, PRO1556, PRO4401, or PRO10268 polypeptide or agonist thereof. Here, the proliferation of the T-lymphocytes is inhibited.
In yet a further embodiment, the invention is a method of enhancing infiltration of a mononuclear cell, eosinophil or polymorphonuclear neutrophil (PMN) into a mammalian cell, comprising a PRO1754 or PRO9912 polypeptide or a PRO9912 polypeptide or a polypeptide thereof. Providing the method comprising contacting nuclear tissue with an agonist, wherein the invasion is enhanced.
[0016]
B. Further embodiments
In another aspect of the invention, the invention provides a vector comprising DNA encoding any of the polypeptides described herein. Also provided is a host cell comprising any of such vectors. By way of example, the host cell may be a CHO cell, E. coli, or yeast. Further provided is a method of producing any of the polypeptides described herein, comprising culturing host cells under conditions suitable for expression of the desired polypeptide and recovering the desired polypeptide from the cell culture. Including.
In another embodiment, the invention provides a chimeric molecule comprising any of the polypeptides described herein fused to a heterologous polypeptide or amino acid sequence. Examples of such chimeric molecules include any of the polypeptides described herein fused to an epitope tag sequence or the Fc region of an immunoglobulin.
In another embodiment, the invention provides an antibody that specifically binds to any of the above or below described polypeptides. In some cases, the antibody is a monoclonal antibody, a humanized antibody, an antibody fragment, or a single chain antibody.
In yet another embodiment, the invention provides oligonucleotide probes useful for isolating genomic and cDNA nucleotide sequences or antisense probes, wherein the probes are derived from any of the above or below nucleotide sequences. Can be induced.
[0017]
In another embodiment, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide.
In one aspect, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) a full-length amino acid sequence disclosed herein, an amino acid sequence lacking a signal peptide disclosed herein, a transmembrane with or without a signal peptide disclosed herein. A DNA molecule encoding a PRO polypeptide having the extracellular domain of the protein, or any specially defined fragment in addition to the full length amino acid sequence disclosed herein, or the complement of the DNA molecule of (b) (a) At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity, or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence identity, or at least about 8 % Nucleic acid sequence identity, or at least about 88% nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity Or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% Or a nucleotide sequence having at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, or at least about 99% nucleic acid sequence identity.
[0018]
In other aspects, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) a coding sequence for a full-length PRO polypeptide disclosed herein, a coding sequence for a PRO polypeptide lacking a signal peptide disclosed herein, disclosed herein. A DNA molecule comprising the coding sequence of the extracellular domain of the transmembrane PRO polypeptide with or without a signal peptide, or the coding sequence of any specially defined fragment in addition to the full-length amino acid sequence disclosed herein; or (B) at least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about the complementary strand of the DNA molecule of (a). About 83% nucleic acid sequence identity, or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least About 86% nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence Identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, or at least about 99% nucleic acid sequence identity Comprising a nucleotide sequence having the property
[0019]
In a further aspect, the invention relates to (a) a DNA molecule encoding the same mature polypeptide encoded by any of the human protein cDNAs deposited with the ATTC disclosed herein; or (b) the DNA molecule of (a) At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity to the complementary strand of a DNA molecule. Or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% % Nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity, or at least about 9%. % Nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity Or nucleotides having at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, or at least about 99% nucleic acid sequence identity Isolated nucleic acid molecule comprising the sequence.
[0020]
Another aspect of the invention is a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide wherein the transmembrane domain has been deleted or the transmembrane domain has been inactivated, or which is complementary to such an encoded nucleotide sequence. There is provided an isolated nucleic acid molecule comprising a transmembrane domain of such a polypeptide disclosed herein. Accordingly, the soluble extracellular domains of the PRO polypeptides described herein are contemplated.
Other embodiments relate to fragments of the PRO polypeptide coding sequence, or a complement thereof, which encode, for example, a fragment of the PRO polypeptide that optionally encodes a polypeptide that includes a binding site for an anti-PRO antibody. It finds use as a hybridization probe or as an antisense oligonucleotide probe. Such nucleic acid fragments are usually at least about 20 nucleotides in length, or at least about 30 nucleotides in length, or at least about 40 nucleotides in length, or at least about 50 nucleotides in length, or at least about 60 nucleotides in length, or at least about 70 nucleotides in length. Or at least about 80 nucleotides, or at least about 90 nucleotides, or at least about 100 nucleotides, or at least about 110 nucleotides, or at least about 120 nucleotides, or at least about 130 nucleotides. Length, or at least about 140 nucleotides in length, or at least about 150 nucleotides in length, or at least about 160 nucleotides in length, or at least about 170 nucleotides in length, or at least about 180 nucleotides in length. Nucleotides in length, or at least about 190 nucleotides in length, or at least about 200 nucleotides in length, or at least about 250 nucleotides in length, or at least about 300 nucleotides in length, or at least about 350 nucleotides in length, or at least about 400 nucleotides in length. Or at least about 450 nucleotides in length, or at least about 500 nucleotides in length, or at least about 600 nucleotides in length, or at least about 700 nucleotides in length, or at least about 800 nucleotides in length, or at least about 900 nucleotides in length, or It is at least about 1000 nucleotides in length, where the term "about" means a reference nucleotide sequence length that is plus or minus 10% of its referenced length. Novel fragments of a PRO polypeptide encoding nucleotide sequence can be prepared by aligning the PRO polypeptide encoding nucleotide sequence with other known nucleotide sequences using any of a number of well-known sequence alignment programs. It is noted that polypeptide encoding nucleotide sequence fragment (s) can be determined in a conventional manner by determining whether it is novel. All such PRO polypeptide encoding nucleotide sequences are contemplated herein. Also contemplated are the PRO polypeptide fragments encoded by these nucleotide molecule fragments, preferably those PRO polypeptide fragments that comprise a binding site for an anti-PRO antibody.
[0021]
In another embodiment, the invention provides an isolated PRO polypeptide encoded by any of the isolated nucleic acid sequences identified above.
In certain aspects, the present invention relates to a full-length amino acid sequence disclosed herein, an amino acid sequence lacking a signal peptide disclosed herein, an extracellular domain of a transmembrane protein with or without a signal peptide disclosed herein, or At least about 80% amino acid sequence identity, or at least about 81% amino acid sequence identity, or at least about 81% amino acid sequence identity to a PRO polypeptide having any other specifically defined fragment of the full length amino acid sequences disclosed herein. About 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or at least about 86% amino acid sequence Identity, or at least about 87% amino acid sequence identity, or at least about 88% Amino acid sequence identity, or at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% amino acid sequence identity, or at least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92% amino acid sequence identity, Or at least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity, or at least about 97% An isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence having amino acid sequence identity, or at least about 98% amino acid sequence identity, or at least about 99% amino acid sequence identity.
[0022]
In a further aspect, the invention provides an amino acid sequence identity of at least about 80%, or at least about 81%, to the amino acid sequence encoded by any of the human protein cDNAs deposited with the ATTC disclosed herein. Amino acid sequence identity, or at least about 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, Or at least about 86% amino acid sequence identity, or at least about 87% amino acid sequence identity, or at least about 88% amino acid sequence identity, or at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% Amino acid sequence identity, or at least about 91% amino acid sequence identity, or At least about 92% amino acid sequence identity, or at least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% Amino acid sequence identity, or isolation comprising an amino acid sequence having at least about 97% amino acid sequence identity, or at least about 98% amino acid sequence identity, or at least about 99% amino acid sequence identity PRO polypeptides.
[0023]
In certain aspects, the invention provides an isolated PRO polypeptide without an N-terminal signal sequence and / or an initiating methionine, which is encoded by a nucleotide sequence that encodes such an amino acid sequence described above. Methods for producing it are also described herein, wherein these methods comprise culturing a host cell comprising a vector comprising a suitable encoding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, Recovering the PRO polypeptide from the culture.
In another aspect, the invention provides an isolated PRO polypeptide wherein the transmembrane domain has been deleted or the transmembrane domain has been inactivated. Methods for producing it are also described herein, wherein these methods comprise culturing a host cell comprising a vector comprising a suitable encoding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, Recovering the PRO polypeptide from the culture.
In yet another embodiment, the invention relates to agonists and antagonists of the native PRO polypeptides defined herein. In certain embodiments, the agonist or antagonist is an anti-PRO antibody or small molecule.
In a further embodiment, the present invention relates to a method of identifying an agonist or antagonist of a PRO polypeptide, comprising contacting the PRO polypeptide with a candidate molecule and monitoring a biological activity mediated by said PRO polypeptide. including. Preferably, the PRO polypeptide is a native PRO polypeptide.
In yet a further embodiment, the invention relates to a composition of matter comprising a PRO polypeptide, or an agonist or antagonist of a PRO polypeptide described herein, or an anti-PRO antibody in combination with a carrier. In some cases, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.
Another embodiment of the present invention is useful for treating PRO polypeptides, or agonists or antagonists thereof, or anti-PRO antibodies as described above, for conditions resulting from PRO polypeptides, agonists or antagonists thereof, or anti-PRO antibodies. It relates to the use for the preparation of a medicament.
[0024]
(Detailed description of preferred embodiments)
I. Definition
The terms "PRO polypeptide" and "PRO" as used herein, when immediately followed by a numerical designation, refer to the various polypeptides, and the full code (ie, PRO / number) is provided herein. Refer to a particular polypeptide sequence. The terms “PRO / number polypeptide” and “PRO / number”, where “number” is used as the actual numerical designation as used herein, include native sequence polypeptides and polypeptide variants (further defined herein). To). The PRO polypeptides described herein may be isolated from a variety of sources, such as human tissue types or other sources, and may be prepared by recombinant or synthetic methods. The term “PRO polypeptide” refers to each individual PRO / number polypeptide described herein. The full disclosure herein of "PRO polypeptide" means each of the polypeptides individually and together. For example, the description of preparation, purification, induction, formation, administration of the antibody thereto, compositions containing the same, treatment of diseases using the same, etc., is involved in each polypeptide of the present invention. The term “PRO polypeptide” also includes variants of the PRO / number polypeptides disclosed herein.
[0025]
"Native sequence PRO polypeptides" include polypeptides having the same amino acid sequence as the corresponding PRO polypeptide from nature. Such native sequence PRO polypeptides can be isolated from nature or can be produced by recombinant or synthetic means. The term “native sequence PRO polypeptide” specifically refers to naturally occurring truncated or secreted forms (eg, extracellular domain sequences), naturally occurring mutant forms (eg, alternatively spliced) of a particular PRO polypeptide. Forms) and naturally occurring allelic variants of the polypeptide. In various embodiments of the invention, the native sequence PRO polypeptides described herein are mature or full-length native sequence polypeptides comprising the full-length amino acid sequence shown in the accompanying figures. Start and stop codons are shown in bold and underlined in the figure. However, the PRO polypeptide disclosed in the accompanying drawings is shown to begin with a methionine residue, designated herein as
[0026]
The approximate location of the "signal peptide" of the various PRO polypeptides disclosed herein is provided herein and / or in the accompanying drawings. However, as noted, the C-terminal boundary of the signal peptide may vary, but will not exceed about 5 amino acids on either side of the signal peptide C-terminal boundary, as initially defined herein, The C-terminal boundary of the signal peptide can be identified according to criteria routinely used in the art to identify such types of amino acid sequence components (eg, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1). -6 (1997) and von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986). In addition, it is also noted that in some cases, cleavage of the signal peptide from the secreted polypeptide is not completely uniform, resulting in one or more secreted species. These mature polypeptides, in which the signal peptide is cleaved within no more than about 5 amino acids on either side of the C-terminal boundary of the signal peptide identified herein, and the polynucleotides encoding them, are described in the present invention. To be considered.
[0027]
"PRO polypeptide variant" refers to a full-length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, a PRO polypeptide sequence lacking the signal peptide disclosed herein, PRO with or without the signal peptide disclosed herein. An active PRO polypeptide as described above or below having at least about 80% amino acid sequence identity with the extracellular domain of the polypeptide or other fragments of the full length PRO polypeptide sequences disclosed herein. Such PRO polypeptide variants include, for example, PRO polypeptides in which one or more amino acid residues have been added or deleted at the N- or C-terminus of the full length native amino acid sequence. Generally, a PRO polypeptide variant comprises a full length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, a PRO polypeptide sequence lacking a signal peptide disclosed herein, a PRO polypeptide sequence with or without a signal peptide disclosed herein. At least about 80% amino acid sequence identity, or at least about 81% amino acid sequence identity, with the extracellular domain of the peptide or any other specifically defined fragment of the full length PRO polypeptide sequences disclosed herein, or At least about 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or at least about 86% amino acid Sequence identity, or at least about 87% amino acid sequence identity, or At least about 88% amino acid sequence identity, or at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% amino acid sequence identity, or at least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92% amino acids Sequence identity, or at least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity, or at least Have about 97% amino acid sequence identity, or at least about 98% amino acid sequence identity, and / or at least about 99% amino acid sequence identity. Typically, the PRO variant polypeptide is at least about 10 amino acids in length, or at least about 20 amino acids in length, or at least about 30 amino acids in length, or at least about 40 amino acids in length, or at least about 50 amino acids in length, or at least about 60 amino acids in length. Or at least about 70 amino acids in length, or at least about 80 amino acids in length, or at least about 90 amino acids in length, or at least about 100 amino acids in length, or at least about 150 amino acids in length, or at least about 200 amino acids in length, or at least about 300 amino acids in length, Or more.
[0028]
"Percent (%) amino acid sequence identity" with respect to the PRO polypeptide sequences identified herein refers to sequence alignment, introducing gaps if necessary to obtain maximum percent sequence identity, and any conservation. A substitution is also defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to amino acid residues in a particular PRO polypeptide sequence, not considered as part of the sequence identity. Alignments for the purpose of determining percent amino acid sequence identity can be obtained by various methods within the skill of the art, eg, publicly available such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megaalign (DNASTAR) software. This can be achieved by using computer software. One of skill in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximum alignment over the entire length of the sequences being compared. However, for purposes herein,% amino acid sequence identity values were obtained using the sequence comparison computer program ALIGN-2, the complete source code for which is provided in Table 1 below. Can be The ALIGN-2 sequence comparison computer program is available from Genentech, Inc. The source code, as shown in Table 1 below, was created by the United States Copyright Office, Washington D.C. C. , 20559, along with user documentation and is registered under U.S. Copyright No. TXU510087. The ALIGN-2 program is available from Genentech, Inc. , South San Francisco, California, and may be compiled from the source code provided in Table 1 below. The ALIGN-2 program is compiled for use with a UNIX® operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
[0029]
In situations where ALIGN-2 is used for amino acid sequence comparisons, the given amino acid sequence A, the given amino acid sequence B, or the% amino acid sequence identity thereto (with or with the given amino acid sequence B) A given amino acid sequence A with or including some% amino acid sequence identity) can also be calculated as follows:
100 times the fraction X / Y
Here, X is the number of amino acid residues having a score that is the same as the score according to the alignment of A and B of the sequence alignment program ALIGN-2, and Y is the total number of amino acid residues of B. It will be appreciated that if the length of amino acid sequence A differs from the length of amino acid sequence B, the percent amino acid sequence identity of A to B will be different from the percent amino acid sequence identity of B to A. As an example of the calculation of% amino acid sequence identity using this method, Tables 2 and 3 show the calculation of% amino acid sequence identity for an amino acid sequence referred to as a "comparative protein" to an amino acid sequence referred to as "PRO". A method wherein the "PRO" represents the amino acid sequence of the subject tentative PRO polypeptide, the "comparative protein" represents the amino acid sequence of the polypeptide to which the subject "PRO" polypeptide is being compared, “X”, “Y” and “Z” represent different virtual amino acid sequences, respectively.
[0030]
Unless otherwise specified, all% amino acid sequence identity values used herein are obtained using the ALIGN-2 computer program as described in the immediately preceding paragraph. However,% amino acid sequence identity values can also be obtained using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)), as described below. Most WU-BLAST-2 search parameters are set to initial values. The parameters that are not set to the initial values, i.e. the adjustable parameters are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. When using WU-BLAST-2, the% amino acid sequence identity value is determined by (a) the PRO polypeptide of interest having a sequence derived from the native PRO polypeptide, as determined by WU-BLAST-2. The number of identical identical amino acid residues between the amino acid sequence and the comparative amino acid sequence of interest (ie, the sequence to which the PRO polypeptide of interest may be the PRO polypeptide variant to be compared) is determined by (b 2.) Determined by the quotient divided by the total number of amino acid residues in the PRO polypeptide of interest. For example, in the expression "polypeptide containing amino acid sequence A having or having at least 80% amino acid sequence identity to amino acid sequence B", amino acid sequence A is the comparative amino acid sequence to be targeted, and amino acid sequence B is the target amino acid sequence. 3 is the amino acid sequence of the PRO polypeptide of FIG.
[0031]
Percent amino acid sequence identity may also be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program is available at http: // www. ncbi. nlm. nih. gov, or separately from National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to initial values, for example, unmask = OK, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low complex length = 15/5 , Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
In situations in which NCBI-BLAST2 is used for amino acid sequence comparison, the percent amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A to or to a given amino acid sequence B (with or to a given amino acid sequence B) (A given amino acid sequence A with or including some% amino acid sequence identity) can be calculated as follows:
100 times the fraction X / Y
Here, X is the number of amino acid residues having a score consistent with being identical by the alignment of A and B of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Y is the total number of amino acid residues of B. Where the length of amino acid sequence A differs from the length of amino acid sequence B, it will be appreciated that the percent amino acid sequence identity of A to B is different from the percent amino acid sequence identity of B to A.
[0032]
“PRO variant polynucleotide” or “PRO variant nucleic acid sequence” means a nucleic acid molecule encoding an active PRO polypeptide, as defined below, and includes the full length native sequence PRO polypeptide disclosed herein. Sequence, the full length native sequence PRO polypeptide sequence lacking the signal peptide disclosed herein, the extracellular domain of the PRO polypeptide with or without the signal peptide disclosed herein or any of the full length polypeptide sequence disclosed herein. Has at least 80% nucleic acid sequence identity with the nucleotide sequence encoding the other fragment. Typically, a PRO polypeptide variant polynucleotide comprises a full-length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, a full-length native sequence PRO polypeptide sequence lacking a signal peptide disclosed herein, a signal sequence disclosed herein. At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81, to a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of the PRO polypeptide sequence or without, or any other fragment of the full-length PRO polypeptide sequences disclosed herein. % Nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity, or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity Or at least about 86% nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or At least about 88% nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% Nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, or At least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, or at least about 99% nucleic acid sequence identity. A variant does not include a native nucleotide sequence.
Typically, the PRO variant polynucleotide is at least about 30 nucleotides in length, or at least about 60 nucleotides in length, or at least about 90 nucleotides in length, or at least about 120 nucleotides in length, or at least about 150 nucleotides in length, or At least about 180 nucleotides, or at least about 210 nucleotides, or at least about 240 nucleotides, or at least about 270 nucleotides, or at least about 300 nucleotides, or at least about 450 nucleotides, or at least about 600 nucleotides in length, or at least about 900 nucleotides in length, or longer.
[0033]
"Percent (%) nucleic acid sequence identity" to a PRO encoding nucleic acid sequence identified herein refers to the alignment of sequences, introducing gaps if necessary to obtain maximum percent sequence identity, to the PRO nucleic acid of interest. Defined as the percentage of nucleotides in the candidate sequence that are identical to the nucleotides in the sequence. Alignments for the purpose of determining percent nucleic acid sequence identity can be obtained by various methods within the purview of those skilled in the art, for example, publicly available computers such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megaalign (DNASTAR) software. This can be achieved by using software. However, for the purposes herein,% nucleic acid sequence identity values were obtained using the sequence comparison computer program ALIGN-2, the complete source code for which is provided in Table 1 below. Can be The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, Inc. and the source code shown in Table 1 below was obtained from the United States Copyright Office, Washington D.C. C. , 20559, along with user documentation and is registered under U.S. Copyright No. TXU510087. The ALIGN-2 program is publicly available from Genentech, South San Francisco, California, and may be compiled from the source code provided in Table 1 below. The ALIGN-2 program is compiled for use with a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
[0034]
In situations in which ALIGN-2 is used for nucleic acid sequence comparison, the given nucleic acid sequence C, the given nucleic acid sequence D, or the% nucleic acid sequence identity thereto (with or with the given nucleic acid sequence D) A given nucleic acid sequence C, which has or includes some% nucleic acid sequence identity) can be calculated as follows:
100 times the fraction W / Z
Here, W is the number of nucleotides having a score consistent with the alignment by C and D alignment of the sequence alignment program ALIGN-2, and Z is the total number of nucleotides of D. Where the length of the nucleic acid sequence C differs from the length of the nucleic acid sequence D, it will be appreciated that the% nucleic acid sequence identity of D to D is different from the% nucleic acid sequence identity of D to C. As an example of the calculation of% nucleic acid sequence identity, Tables 4 and 5 show how to calculate the% nucleic acid sequence identity of a nucleic acid sequence designated as "Comparative DNA" to a nucleic acid sequence designated as "PRO-DNA". Wherein "PRO-DNA" represents the provisional PRO-encoding nucleic acid sequence of interest, "comparative DNA" represents the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule with which the subject "PRO-DNA" nucleic acid molecule is being compared, "N", "L" and "V" each represent a different hypothetical nucleotide.
[0035]
Unless otherwise specified, all% nucleic acid sequence identity values used herein are obtained using the ALIGN-2 computer program as described in the immediately preceding paragraph. However,% nucleic acid sequence identity values can also be obtained using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)), as described below. Most WU-BLAST-2 search parameters are set to initial values. The parameters that are not set to the initial values, i.e. the adjustable parameters are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. When using WU-BLAST-2, the% nucleic acid sequence identity value is determined by determining whether (a) the subject PRO having a sequence derived from a native sequence PRO polypeptide encoding nucleic acid as determined by WU-BLAST-2. A match between the nucleic acid sequence of the polypeptide-encoding nucleic acid molecule and the reference nucleic acid molecule of interest (ie, the sequence to which the PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule of interest can be a mutated PRO polynucleotide). The number of identical nucleotides is determined by (b) the quotient divided by the total number of nucleotides of the PRO polypeptide encoding nucleic acid sequence of interest. For example, in the description "an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence A having or having at least 80% nucleic acid sequence identity to a nucleic acid sequence B", the nucleic acid sequence A is a comparative nucleic acid molecule of interest; Sequence B is the nucleic acid sequence of a PRO polypeptide encoding nucleic acid molecule of interest.
[0036]
Percent nucleic acid sequence identity may also be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program is available at http: // www. ncbi. nlm. nih. gov, or separately from National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to initial values, for example, unmask = OK, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low complex length = 15/5 , Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
In situations where NCBI-BLAST2 is used for sequence comparison, the% nucleic acid sequence identity of a given nucleic acid sequence C to or to a given nucleic acid sequence D (to or against a given nucleic acid sequence D) (A given nucleic acid sequence C with or including some degree of nucleic acid sequence identity) can be calculated as follows:
100 times the fraction W / Z
Here, W is the number of nucleotides having a score that is the same as the score according to the alignment of C and D of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Z is the total number of nucleotides of D. Where the length of the nucleic acid sequence C differs from the length of the nucleic acid sequence D, it will be appreciated that the% nucleic acid sequence identity of D to D is different from the% nucleic acid sequence identity of D to C.
[0037]
In another embodiment, the PRO variant polynucleotide encodes an active PRO polypeptide and is capable of hybridizing to a nucleotide sequence encoding a full-length PRO polypeptide disclosed herein, preferably under stringent hybridization and washing conditions. Nucleic acid molecule. The PRO variant polypeptide may be one that is encoded by a PRO variant polynucleotide.
"Isolated," as used to describe the various polypeptides disclosed herein, means a polypeptide that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminant components of the natural environment are substances that typically interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, including enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the polypeptide is (1) sufficient to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues by using a spinning cup sequenator, or (2) Coomassie blue or Preferably, it is purified to homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using silver staining. Isolated polypeptide includes polypeptide in situ within recombinant cells, since at least one component of the PRO polypeptide will not be present in its natural environment. However, usually, an isolated polypeptide is prepared by at least one purification step.
An "isolated" PRO polypeptide-encoding nucleic acid or other polypeptide-encoding nucleic acid is a nucleic acid that has been identified and separated from at least one contaminating nucleic acid molecule normally associated with the natural source of the polypeptide-encoding nucleic acid. Is a molecule. An isolated polypeptide-encoding nucleic acid molecule is other than in the form or setting in which it is found in nature. Thus, an isolated polypeptide-encoding nucleic acid is distinguished from a particular polypeptide-encoding nucleic acid molecule present in natural cells. However, isolated polypeptide-encoding nucleic acid molecules include, for example, those contained in cells that normally express the polypeptide at a chromosomal location different from that of the natural cell.
[0038]
The term "control sequence" refers to a DNA sequence necessary to express an operably linked coding sequence in a particular host organism. For example, control sequences suitable for prokaryotes include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to utilize promoters, polyadenylation signals and enhancers.
A nucleic acid is “operably linked” when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, the DNA of a presequence or secretory leader is operably linked to the DNA of a polypeptide if it is expressed as a preprotein that contributes to the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is responsible for transcription of the sequence. If so, it is operably linked to the coding sequence; or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it is in a position that facilitates translation. Generally, "operably linked" means that the DNA sequences being linked are contiguous, and, in the case of a secretory leader, contiguous and in reading phase. However, enhancers need not be in close proximity. Binding is achieved by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional techniques.
[0039]
The term "antibody" is used in the broadest sense and includes, for example, a single anti-PRO monoclonal antibody (including agonists, antagonists and neutralizing antibodies), an anti-PRO antibody composition with multiepitope specificity, a single-chain antibody. It specifically covers PRO antibodies and fragments of anti-PRO antibodies (see below). The term "monoclonal antibody" as used herein refers to a substantially homogeneous population of antibodies, i.e., the individual antibodies contained in the population are identical except for naturally occurring mutations that may be present in small amounts. Refers to antibodies obtained from a population.
The "stringency" of a hybridization reaction is usually readily determined by one of ordinary skill in the art, and is generally an empirical calculation dependent upon probe length, washing temperature, and salt concentration. In general, the longer the probe, the higher the temperature needs to be for proper annealing, and the shorter the probe, the lower the temperature. Hybridization generally depends on the ability of denatured DNA to reanneal when the complementary strand is present in an environment below its melting point. The higher the degree of desired homology between the probe and the hybridizable sequence, the higher the relative temperature that can be used. As a result, higher relative temperatures make the reaction conditions more stringent, while lower temperatures reduce stringency. For further details and explanation of the stringency of the hybridization reaction, see Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
As defined herein, "stringent conditions" or "high stringent conditions" means (1) low ionic strength and high temperature for washing, for example, 0.015M sodium chloride / 0.0015M at 50 ° C. Using sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate; (2) denaturing agents such as formamide during hybridization, eg, 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin at 42 ° C. /0.1% Ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM pH 6.5 sodium phosphate buffer and 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate; or (3) 50% formamide at 42 ° C. 5xSSC (0.75M NaCl, 0.075M sodium citrate), 50mM phosphorous Sodium (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5 × Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (50 μg / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran sulfate, and 0% at 42 ° C. Washing in 0.2 × SSC (sodium chloride / sodium citrate) and 50% formamide at 55 ° C. followed by a high stringency wash consisting of 0.1 × SSC with EDTA at 55 ° C.
"Medium stringency conditions" are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Identified as described in Cold Spring Harbor Press, 1989, and includes the use of less stringent washing solutions and hybridization conditions (eg, temperature, ionic strength and% SDS) as described above. Examples of moderate stringency conditions include 20% formamide, 5xSSC (150mM NaCl, 15mM trisodium citrate), 50mM sodium phosphate (pH 7.6), 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20mg / d Incubation overnight at 37 ° C. in a solution containing mL of denatured sheared salmon sperm DNA, followed by washing the filters in 1 × SSC at 37-50 ° C. One skilled in the art will recognize how to adjust temperature, ionic strength, etc. as necessary to accommodate factors such as probe length.
[0040]
The term "epitope tag," as used herein, refers to a chimeric polypeptide comprising a PRO polypeptide fused to a "tag polypeptide." The tag polypeptide has a sufficient number of residues to provide an epitope from which the antibody can be produced, but is short enough so as not to inhibit the activity of the fused PRO polypeptide. Also, the tag polypeptide is preferably quite unique so that the antibody does not substantially cross-react with other epitopes. Suitable tag polypeptides generally have at least 6 amino acid residues, usually about 8 to about 50 amino acid residues (preferably, about 10 to about 20 amino acid residues).
The term "immunoadhesin" as used herein refers to an antibody-like molecule that combines the binding specificity of a heterologous protein ("adhesin") with the effector functions of immunoglobulin constant domains. Structurally, immunoadhesins comprise a fusion of an amino acid sequence with the desired binding specificity, other than the antigen recognition and binding site of an antibody (ie, "heterologous"), and an immunoglobulin constant domain sequence. . The adhesin portion of an immunoadhesin molecule is typically a contiguous amino acid sequence that includes at least the receptor or ligand binding site. The immunoglobulin constant domain sequence of the immunoadhesin may be any of the following: IgG-1, IgG-2, IgG-3 or IgG-4 subtype, IgA (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM. From immunoglobulins.
[0041]
By "active" or "activity" for the purposes herein is meant a form of the polypeptide that retains the biological and / or immunological activity of PRO, either natural or naturally occurring, and wherein "biological" "Enzymatic" activity is a biological function (inhibiting or stimulating) caused by a natural or naturally occurring PRO that is capable of generating antibodies against an antigenic epitope possessed by the natural or naturally occurring PRO. And "immunological" activity refers to the ability of natural or naturally occurring PRO to induce the production of antibodies against antigenic epitopes possessed by PRO.
The term "antagonist" is used in the broadest sense and includes any molecule that partially or completely blocks, inhibits, or neutralizes a biological activity of a native PRO polypeptide disclosed herein. Similarly, the term "agonist" is used in the broadest sense and includes any molecule that mimics the biological activity of a native PRO polypeptide disclosed herein. Suitable agonist or antagonist molecules include, in particular, agonist or antagonist antibodies or antibody fragments, fragments or amino acid sequence variants of native PRO polypeptides, peptides, antisense oligonucleotides, small organic molecules and the like. A method of identifying an agonist or antagonist of a PRO polypeptide comprises contacting the PRO polypeptide with a candidate antagonist or agonist molecule and measuring a detectable change in one or more biological activities normally associated with the PRO polypeptide. May be included.
[0042]
“Treatment” refers to both therapeutic treatment, prophylactic and preventative measures, wherein a patient is prevented or reduced (reduced) from the targeted pathological condition or disease. Those in need of treatment include those already with the disorder as well as those prone to have the disorder or those in which the disorder is prevented.
"Chronic" administration refers to administering the drug in a continuous manner, unlike the acute manner, and maintaining the initial therapeutic effect (activity) over a long period of time. "Intermittent" administration is treatment that is not consecutively done without interruption, but rather is cyclic in nature.
"Mammal" for therapeutic purposes includes human, domestic and agricultural animals, and zoo, sport, or pet animals, such as dogs, cats, cows, horses, sheep, pigs, goats, rabbits, and the like. Refers to any animal classified as a mammal. Preferably, the mammal is a human.
Administration “in combination with” one or more therapeutic agents includes simultaneous (concurrent) and consecutive administration in any order.
[0043]
As used herein, "carrier" includes a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or stabilizer, and is non-toxic to cells or mammals exposed to them at the dosages and concentrations employed. . Physiologically acceptable carriers are often aqueous pH buffered solutions. Examples of physiologically acceptable carriers include phosphate, citrate, and other organic acid salts buffers; antioxidants, including ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; For example, serum albumin, gelatin, or immunoglobulin; hydrophobic polymers, such as polyvinylpyrrolidone; amino acids, such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides, including glucose, mannose or dextrin, and other carbohydrates; Chelating agents such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; and / or nonionic surfactants such as TWEENTM, Polyethylene glycol (PEG), and PLURONICSTMincluding.
[0044]
"Antibody fragments" comprise a portion of an intact antibody, preferably the antigen binding or variable region of the intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab')2Diabodies; linear antibodies (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); single-chain antibody molecules; and multispecificity formed from antibody fragments. Including antibodies.
Papain digestion of antibodies produces two identical antibody-binding fragments, called "Fab" fragments, each of which has a single antigen-binding site, and the rest reflect "Fc", reflecting their ability to crystallize easily. Named fragment. Pepsin treatment is F (ab ')2Generates a fragment that has two antigen binding sites and is capable of cross-linking antigen.
"Fv" is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy and one light chain variable region in tight, non-covalent association. In this configuration, the three CDRs of each variable domain interact to form VH-VLThe antigen binding site is determined on the surface of the dimer. Rather, the six CDRs confer antigen binding specificity for the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) has a lower affinity than the entire binding site, but has the ability to recognize and bind the antigen .
The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab fragments differ from Fab 'fragments by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Here, Fab'-SH represents Fab 'in which the cysteine residue of the constant domain has a free thiol group. F (ab ')2Antibody fragments are usually produced as pairs of Fab 'fragments, which have hinge cysteines between them. Other chemical linkages of antibody fragments are known.
The "light chains" of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species are assigned one of two distinct types, called kappa and lambda, based on the amino acid sequence of their constant domains.
Depending on the amino acid sequence of the constant domain of the heavy chain, immunoglobulins can be assigned to different classes. There are five main classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, some of which are further subdivided into subclasses (isotypes) such as IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, IgA and IgA2.
[0045]
"Single-chain Fv" or "sFv" antibody fragments are derived from the VHAnd VLDomains, which are present in a single polypeptide chain. Preferably, the Fv polypeptide is VHAnd VLIt further comprises a polypeptide linker between the domains, which allows the sFv to form the structure desired for antigen binding. For a review of sFv, see The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 113-131. 269-315 (1994), Pluckthun.
The term "diabodies" refers to small antibody fragments that have two antigen-binding sites, wherein the fragments are of the same polypeptide chain (VH-VL) Within the light chain variable domain (VLHeavy chain variable domain (VH)including. By using a linker that is too short to pair between the two domains of the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains of the other chain and create two antigen-binding sites. Diabodies are described, for example, in EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA, 90: 6444-6448 (1993).
An "isolated" antibody is one that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminant components of the natural environment are substances that interfere with the diagnostic or therapeutic use of the antibody and include enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the antibody has at least 15 residues by (1) using a spinning cup sequenator, to more than 95% by weight, most preferably to more than 99% by weight, as determined by the Lowry method. Or (3) SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using Coomassie Blue or preferably silver staining until homogeneity is achieved. . Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells since at least one component of the antibody's natural environment will not be present. However, usually, an isolated antibody is prepared by at least one purification step.
[0046]
An antibody that “specifically binds” or “specifically” to a particular polypeptide or epitope of a particular polypeptide is an antibody that does not substantially bind to any other polypeptide or polypeptide epitope. It binds to a specific polypeptide or an epitope of a specific polypeptide.
The term "label" as used herein refers to a detectable compound or composition that binds directly or indirectly to the antibody to produce a "labeled" antibody. The label may itself be detectable (eg, a radioactive or fluorescent label), or, in the case of an enzymatic label, may catalyze a chemical transformation of a detectable substrate compound or composition.
By "solid phase" is meant a non-aqueous matrix to which the antibodies of the invention can be attached. Examples of solid phases contemplated herein include those formed in part or in whole from glass (eg, controlled pore glass), polysaccharides (eg, agarose), polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol, and silicone. In certain embodiments, depending on the context, the solid phase can constitute a well of an assay plate; in others, it can be a purification column (eg, an affinity chromatography column). The term also encompasses a discrete solid phase of discrete particles, as described in US Pat. No. 4,275,149.
"Liposomes" are small vesicles composed of various types of lipids, phospholipids and / or surfactants, and are useful for transporting drugs (such as PRO polypeptides or antibodies thereof) to mammals. The components of the liposome are usually arranged in a bilayer format similar to the lipid arrangement of biological membranes.
"Small molecule" is defined herein as having a molecular weight of less than about 500 daltons.
[0047]
The term "immune-related disease" refers to a disease in which a component of the mammalian immune system is responsible for, mediates, or contributes to a pathological condition in a mammal. Also included are diseases in which an improved effect is imparted to the progress of the disease by stimulating or mediating an immune response. Included in this term are immune mediated inflammatory diseases, non-immune mediated inflammatory diseases, infectious diseases, immunodeficiencies, overgrowth and the like.
The term "T cell mediated disease" refers to a disease in which T cells directly or indirectly mediate or contribute to a mammalian pathological condition. T cell mediated diseases are associated with cell mediated effects, lymphokine mediated effects, etc., and even B cell related effects if, for example, B cells are stimulated by lymphokines secreted by T cells.
Examples of immune-related and inflammatory diseases that can be treated by the present invention, some of which are immune or T cell mediated, include systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, juvenile chronic arthritis, spondyloarthritis, systemic Sclerosis (scleroderma), idiopathic inflammatory myopathy (dermatomyositis, polymyositis), Sjogren's syndrome, systemic vasculitis, sarcoidosis, autoimmune hemolytic anemia (aplastic anemia, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) , Autoimmune thrombocytopenia (idiopathic thrombocytopenic purpura, immune-mediated thrombocytopenia), thyroiditis (Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, juvenile lymphocytic thyroiditis, atrophic thyroiditis), diabetes mellitus, immune-mediated Renal diseases (glomerulonephritis, tubulointerstitial nephritis), demyelinating diseases of the central and peripheral nervous system, such as multiple sclerosis, idiopathic paralytic polyneuropathy, or Guillain-Barre syndrome; Chronic inflammatory paraneoplastic polyneuropathy, hepatobiliary disease, such as infectious hepatitis (type A, B, C, D, E, and other nonhepatotropic viruses), chronic autoimmunity Active hepatitis, primary biliary cirrhosis, granulomatous hepatitis, and sclerosing cholangitis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis; Crohn's disease), gluten-sensitive bowel disease, and Whipple disease, bullous skin disease, Autoimmune or immune-mediated skin diseases including erythema multiforme and contact dermatitis, psoriasis, allergic diseases such as asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, food sensitivity and urticaria, lung immune diseases, e.g. Includes transplant-related diseases including eosinophilic pneumonia, idiopathic pulmonary fibrosis and irritable pneumonia, rejection and graft-versus-host disease. Also included are viral diseases such as AIDS (HIV infection), hepatitis A, B, C, D and E, herpes, bacterial infections, fungal infections, protozoan infections and parasitic infections. .
[0048]
The term "effective amount" refers to the concentration or amount of a PRO polypeptide and / or agonist / antagonist that achieves the specifically stated purpose. An "effective amount" of a PRO polypeptide or agonist or antagonist thereof can be determined empirically. Further, “therapeutically effective amount” refers to the concentration or amount of PRO polypeptide and / or agonist / antagonist effective to achieve the stated therapeutic effect. This amount can also be determined empirically.
[0049]
The term "cytotoxic agent" as used herein refers to a substance that inhibits or suppresses the function of cells and / or causes cell destruction. The term refers to radioisotopes (eg, I131, I125, Y90And Re186), Chemotherapeutic agents, and toxins such as enzymatically active toxins from bacteria, fungi, plants or animals, or fragments thereof.
“Chemotherapeutic agents” are chemical compounds useful for treating cancer. Examples of chemotherapeutic agents include adriamycin, doxorubicin, epirubicin, 5-fluorouracil, cytosine arabinoside ("Ara-C"), cyclophosphamide, thiotepa, busulfan, cytoxins, taxoids such as paclitaxel (Taxol, Bristol) -Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) and doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France), taxotere, methotrexate, cisplatin, melphalan, vinblastitomycin, blematomycin, bleblastom, vinblastine, poliomycin. Vinorelbine, carboplatin, teniposide, daunomycin, kalmi Including clarithromycin, aminopterin, dactinomycin, mitomycin, (see US Patent No. 4,675,187) esperamicin, melphalan, and other related nitrogen mustards. Also included in this definition are hormone-like agents that act to modulate or inhibit hormonal effects on tumors, such as tamoxifen and onapristone.
As used herein, “growth inhibitor” refers to a compound or composition that inhibits the growth of cells, especially cancer cells that overexpress any of the genes identified herein, in vitro or in vivo. That is, growth inhibitors significantly reduce the percentage of cells that overexpress such genes in S phase. Examples of growth inhibitors include agents that block cell cycle progression (at a position other than S phase), for example, agents that induce G1 or M phase arrest. Classical M phase blockers include vincas (vincristine and vinblastine), taxol, and topo II inhibitors such as doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposide, and bleomycin. These agents that cause G1 arrest also overflow S phase arrest, for example, DNA alkylating agents such as tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechlorethamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil, and ara-C. Further information can be found in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds.,
[0050]
The term "cytokine" is a general term for proteins released from one cell population and acting on other cells as intercellular mediators. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, and traditional polypeptide hormones. Included in cytokines are growth hormones such as human growth hormone, N-methionyl human growth hormone, and bovine growth hormone; parathyroid hormone; thyroxine; insulin; proinsulin; relaxin; prorelaxin; glycoprotein hormones such as follicle stimulating hormone ( FSH), thyroid stimulating hormone (TSH), and luteinizing hormone (LH); liver growth factor; fibroblast growth factor; prolactin; placental lactogen; tumor necrosis factors -α and -β; Mueller inhibitor; Peptide; Inhibin; Activin; Vascular endothelial growth factor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nerve growth factor such as NGF-β; Platelet growth factor; Transforming growth factor (TGF) such as TGF-α and TGF-β; -Like growth factors-I and II; erythropoietin (EPO); osteogenic factors; interferons such as interferon-α, -β, and -γ; colony-stimulating factors (CSFs), such as macrophage-CSF (M-CSF); -Macrophage-CSF (GM-CSF); and granulocyte-CSF (G-CSF); interleukins (ILs) such as IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; tumor necrosis factors such as TNF-α and TNF-β; and others including LIF and kit ligand (KL) Is a polypeptide factor. As used herein, the term cytokine includes proteins from natural sources or from recombinant cell culture and is the biologically active equivalent of a native sequence cytokine.
The term "immunoadhesin" as used herein refers to an antibody-like molecule that combines the binding specificity of a heterologous protein ("adhesin") with the effector functions of immunoglobulin constant domains. Structurally, immunoadhesins comprise a fusion of an amino acid sequence with the desired binding specificity, other than the antigen recognition and binding site of an antibody (ie, "heterologous"), and an immunoglobulin constant domain sequence. . The adhesin portion of an immunoadhesin molecule is typically a contiguous amino acid sequence that includes at least the receptor or ligand binding site. The immunoglobulin constant domain sequence of the immunoadhesin may be any of the following: IgG-1, IgG-2, IgG-3 or IgG-4 subtype, IgA (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM. From immunoglobulins.
The term "inflammatory cells" as used herein refers to cells that enhance the inflammatory response, such as monocytes, eosinophils, macrophages, and polymorphonuclear neutrophils (PMN).
[0051]
II. Compositions and Methods of the Invention
A. Full length PRO polypeptide
The present invention provides newly identified and isolated nucleic acid sequences encoding polypeptides referred to in the present application as PRO polypeptides. In particular, as disclosed in further detail in the Examples below, cDNAs encoding various PRO polypeptides have been identified and isolated. It should be noted that although proteins generated in separate rounds of expression are given different PRO numbers, the UNQ number is unique to any given DNA and encoded protein and does not change. However, for the sake of simplicity, the proteins encoded by the full-length natural nucleic acid molecules disclosed herein, as well as additional natural homologs and variants included in the above definition of PRO, will be described in their origin or format of preparation. Regardless of this, it is referred to as “PRO / number”.
Various cDNA clones have been deposited with the ATCC, as disclosed in the Examples below. The actual nucleotide sequence of these clones can be readily determined by sequencing the deposited clones using methods routine in the art. The predicted amino acid sequence can be determined from the nucleotide sequence using conventional techniques. For the PRO polypeptides and encoding nucleic acids described herein, Applicants have identified what is believed to be the reading frame best matching the sequence information currently available.
[0054]
B. PRO polypeptide variants
It is contemplated that PRO variants may be prepared in addition to the full-length native sequence PRO polypeptides described herein. PRO variants can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into PRO DNA, and / or by synthesizing the desired PRO polypeptide. One skilled in the art will recognize that amino acid changes, such as changes in the number or position of glycosylation sites or changes in membrane anchoring properties, can alter the post-translational process of PRO.
Mutations in the native full-length sequence PRO or various domains of PRO described herein can be, for example, any of the techniques and guidelines for conservative and non-conservative mutations described in US Pat. No. 5,364,934. This can be done using The mutation may be a substitution, deletion or insertion of one or more codons encoding PRO that results in a change in the amino acid sequence of PRO as compared to native sequence PRO. In some instances, the mutation is a substitution of at least one amino acid for one or more domains of PRO by any other amino acid. Guidance as to which amino acid residues are inserted, substituted or deleted without adversely affecting the desired activity can be determined by comparing the sequence of the PRO to the sequence of a protein molecule of known homology, It is found by minimizing the number of amino acid sequence changes made within a region. Amino acid substitutions can be the result of substitution of one amino acid for another amino acid having similar structural and / or chemical properties, for example, substitution of leucine for serine, ie, a conservative amino acid substitution. Insertions or deletions can optionally be in the range of 1 to 5 amino acids. The mutations tolerated are determined by systematically making amino acid insertions, deletions or substitutions in the sequence and testing the resulting variants for the activity displayed by the full-length or mature native protein.
[0055]
PRO polypeptide fragments are provided herein. Such fragments may be truncated at the N-terminus or C-terminus, for example, as compared to the full length native protein, or may lack internal residues. Certain fragments lack amino acid residues that are not essential for a desired biological activity of the PRO polypeptide.
PRO fragments may be prepared by any of a number of conventional techniques. The desired peptide fragment may be chemically synthesized. Alternative methods include enzymatic digestion, for example, by treating the protein with an enzyme known to cleave the protein at a site determined by a particular amino acid residue, or by digesting the DNA with appropriate restriction enzymes. Including the generation of a PRO fragment by isolating the desired fragment. Yet another suitable technique involves isolating and amplifying a DNA fragment encoding the desired polypeptide fragment by the polymerase chain reaction (PCR). Oligonucleotides that determine the desired termini of the DNA fragment are used in the 5 'and 3' primers of the PCR. Preferably, a PRO polypeptide fragment shares at least one biological and / or immunological activity with a native PRO polypeptide disclosed herein.
[0056]
In particular embodiments, conservative substitutions of interest are shown in Table 6, entitled preferred substitutions. If such a substitution results in a change in biological activity, a more substantial change may be introduced and the product screened as indicated in Table 6 as exemplary substitutions or as further described in the amino acid taxonomy by reference below. Is done.
(1) hydrophobicity: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophilicity: cys, ser, thr;
(3) acidic: asp, glu;
(4) basic: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Residues affecting chain orientation: gly, pro; and
(6) Aromatic: trp, tyr, phe.
[0057]
Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another. Also, such substituted residues may be introduced at conservative substitution sites, or preferably at the remaining (non-conserved) sites.
Mutations can be made using methods known in the art, such as oligonucleotide-mediated (site-directed) mutagenesis, alanine scanning, and PCR mutagenesis. Site-directed mutagenesis [Carter et al., Nucl. Acids Res. , 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. , 10: 6487 (1987)], cassette mutagenesis [Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)], restricted selection mutagenesis [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)], or other known techniques can be performed on cloned DNA to produce PRO mutant DNA.
Also, scanning amino acid analysis can be used to identify one or more amino acids along a flanking sequence. Preferred scanning amino acids are relatively small, neutral amino acids. Such amino acids include alanine, glycine, serine, and cysteine. Alanine is a typically preferred scanning amino acid within this group because it eliminates side chains beyond the beta carbon and is less likely to alter the backbone structure of the mutant [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1108]. (1989)]. Alanine is also typically preferred because it is the most common amino acid. In addition, it is often found in both buried and exposed locations [Creighton, The Proteins, (WH Freeman & Co., NY); Chothia, J. et al. Mol. Biol. , 150: 1 (1976)]. If alanine substitution does not yield a sufficient amount of variant, isoteric amino acids can be used.
[0058]
C. Modification of PRO
Covalent modifications of PRO are included within the scope of the invention. One type of covalent modification involves reacting the targeted amino acid residue of the PRO polypeptide with an organic derivatizing reagent that can react with selected side chains of the PRO or N- or C-terminal residues. . Derivatization with a bifunctional reagent is useful, for example, for cross-linking PRO to a water-insoluble support matrix or surface for use in purifying anti-PRO antibodies and vice versa. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester such as 4-azidosalicylic acid, 3,3′-dithiobis (succinimidyl) Homobifunctional imide esters, including disuccinimidyl esters such as propionate), bifunctional maleimides such as bis-N-maleimido-1,8-octane, and methyl-3-[(p-azidophenyl)- [Dithio] propioimidate.
Other modifications include deamination of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of the hydroxyl group of seryl or threonyl residues, lysine, arginine, and histidine, respectively. Methylation of α-amino group of side chain [T. E. FIG. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.C. H. Freeman & Co. , San Francisco, pp. 147-64. 79-86 (1983)], acetylation of the N-terminal amine, and amidation of any C-terminal carboxyl groups.
[0059]
Another type of covalent modification of the PRO polypeptide included within the scope of the present invention involves altering the native glycosylation pattern of the polypeptide. For the purposes herein, "alteration of the native glycosylation pattern" refers to the deletion of one or more carbohydrate moieties found in the native sequence PRO (removal of potential glycosylation sites or chemical and / or enzymatic means). And / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the native sequence PRO. In addition, the phrase includes qualitative changes in the glycosylation of the native protein, including changes in the nature and properties of the various carbohydrate moieties present.
Addition of a glycosylation site to a PRO polypeptide may involve altering the amino acid sequence. The alteration may be made, for example, by the addition or substitution of one or more serine or threonine residues to the native sequence PRO (O-linked glycosylation site). The PRO amino acid sequence is optionally altered through alterations at the DNA level, particularly by mutating the DNA encoding the PRO polypeptide at preselected bases to produce codons that are translated into the desired amino acid. Is also good.
Another means of increasing the number of carbohydrate moieties on a PRO polypeptide is by chemical or enzymatic attachment of glycosides to the polypeptide. Such methods are described in the art, for example, in WO 87/05330 published Sep. 11, 1987, and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev .. Biochem. Pp. 259-306 (1981).
Removal of carbohydrate moieties present on the PRO polypeptides can be accomplished chemically or enzymatically, or by mutational substitution of codons encoding amino acid residues presented as targets for glucosylation. Chemical deglycosylation techniques are known in the art and are described, for example, in Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. , 259: 52 (1987), and Edge et al., Anal. Biochem. , 118: 131 (1981). Enzymatic cleavage of carbohydrate moieties on polypeptides is described by Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987), by using various endo- and exo-glycosidases.
[0060]
Another type of covalent modification of PRO is U.S. Pat. No. 4,640 to PRO polypeptide, which is one of a variety of non-proteinaceous polymers, such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, or polyoxyalkylene. No. 4,835,689; No. 4,301,144; No. 4,670,417; No. 4,791,192 or No. 4,179,337. Including binding in the manner described.
Also, the PRO polypeptides of the present invention may be modified in a manner to form a chimeric molecule comprising PRO fused to another heterologous polypeptide or amino acid sequence.
In one embodiment, such a chimeric molecule comprises a fusion of PRO with a tag polypeptide that provides an epitope to which an anti-tag antibody can selectively bind. Epitope tags are generally located at the amino or carboxyl terminus of the PRO. The presence of such an epitope-tagged form of PRO can be detected using an antibody against the tag polypeptide. Also, provision of the epitope tag allows the PRO to be readily purified by affinity purification using an anti-tag antibody or other type of affinity matrix that binds to the epitope tag. Various tag polypeptides and their respective antibodies are well known in the art. Examples include poly-histidine (poly-his) or poly-histidine-glycine (poly-his-gly) tag; flu HA tag polypeptide and its antibody 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. , 8: 2159-2165 (1988)]; c-myc tag and 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 and 9E10 antibodies thereto [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; Herpes simplex virus glycoprotein D (gD) tag and its antibody [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Other tag polypeptides include the flag peptide [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; the KT3 epitope peptide [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; the α-tubulin epitope peptide [Skinner et al. Biol. Chem. 266: 15163-15166 (1991)]; and a T7 gene 10 protein peptide tag [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].
[0061]
In an alternative embodiment, the chimeric molecule may comprise a fusion of the PRO with an immunoglobulin or a particular region of an immunoglobulin. For a bivalent form of the chimeric molecule (also called an "immunoadhesin"), such a fusion could be the Fc region of an IgG1 molecule. Ig fusions preferably comprise a solubilized (transmembrane domain deleted or inactivated) form of the PRO polypeptide in place of at least one variable region within an Ig molecule. In a particularly preferred embodiment, the immunoglobulin fusion comprises the hinge, CH2 and CH3, or the hinge, CH1, CH2 and CH3 regions of an IgG1 molecule. See U.S. Patent No. 5,428,130 issued June 27, 1995 for the production of immunoglobulin fusions.
[0062]
D. Preparation of PRO
The following description relates primarily to a method for producing PRO by culturing cells transformed or transfected with a vector containing the PRO nucleic acid. Of course, it is contemplated that PRO can be prepared using other methods well known in the art. For example, a PRO sequence, or a portion thereof, may be produced by direct peptide synthesis using solid-phase techniques [see, eg, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. et al. H. Freeman Co. , San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. et al. Am. Chem. Soc. , 85: 2149-2154 (1963)]. In vitro protein synthesis may be performed by manual techniques or by automation. Automated synthesis may be performed, for example, using an Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) according to the manufacturer's instructions. The various portions of the PRO are chemically synthesized separately and may be combined using chemical or enzymatic methods to produce full-length PRO.
[0063]
1. Isolation of DNA encoding PRO
DNA encoding PRO can be obtained from a cDNA library prepared from a tissue that carries the mRNA and will express it at detectable levels. Thus, human PRODNA can be conveniently obtained from a cDNA library prepared from human tissue, as described in the Examples. PRO-encoding genes can also be obtained by genomic libraries, oligonucleotide synthesis, or other known synthetic methods (eg, automated nucleic acid synthesis).
Libraries can be screened with probes (eg, antibodies to PRO or oligonucleotides of at least about 20-80 bases) designed to identify the gene of interest or the protein encoded thereby. Screening of the cDNA or genomic library with the selected probe is performed using standard procedures described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). can do. Another means of isolating the PRO-encoding gene uses the PCR method [Sambrook et al., Supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
The following example describes a technique for screening a cDNA library. The oligonucleotide sequence selected as a probe must be of sufficient length and sufficiently distinct to minimize false positives. Preferably, the oligonucleotide is labeled so as to be detectable upon hybridization with DNA in the library being screened. Labeling methods are well known in the art,32Includes the use of radiolabels, such as P-labeled ATP, biotinylation or enzyme labels. Hybridization conditions, including moderate and high stringency, are given in Sambrook et al., Supra.
[0064]
Sequences identified in such library screening methods can be compared and aligned with other well-known sequences that have been deposited in public databases, such as Genbank, or other personal sequence databases and made available to the public. . Sequence identity (at either the amino acid or nucleotide level) within a defined region of the molecule or over the entire length of the sequence can be determined using methods known in the art and described herein. it can.
Nucleic acids with protein-encoding sequences may use, for the first time, the deduced amino acid sequences disclosed herein, and if necessary, detect Sambrook et al. And by screening a selected cDNA or genomic library using conventional primer extension methods as described in US Pat.
[0065]
2. Selection and transformation of host cells
Host cells are transfected or transformed with the expression or cloning vectors for PRO production described herein to induce a promoter, select transformants, or amplify a gene encoding the desired sequence. Culture in a suitably modified conventional nutrient medium. Culture conditions, such as medium, temperature, pH, etc., can be selected by those skilled in the art without undue experimentation. Generally, principles, protocols, and practical techniques for maximizing cell culture productivity are described in Mammarian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.D. Butler eds. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., Supra. Methods for Eukaryotic Cell Transfection and Prokaryotic Cell Transformation, eg, CaCl 22, CaPO4Liposome-mediated and electroporation are generally known to those skilled in the art. Transformation is accomplished using standard techniques appropriate to the host cell used. Calcium treatment using calcium chloride or electroporation as described in Sambrook et al., Supra, is commonly used for prokaryotes. Infection by Agrobacterium tumefaciens has been described by certain species as described in Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) and WO 89/05859, published June 29, 1989. Used for transformation of plant cells. For mammalian cells without such cell walls, the calcium phosphate precipitation method of Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) can be used. General aspects of mammalian cell host system transformations are described in U.S. Pat. No. 4,399,216. Transformation into yeast is typically performed by Van Solingen et al. Bact. , 130: 946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3829 (1979). However, other methods of introducing DNA into cells, such as nuclear microinjection, electroporation, intact cells, or bacterial protoplast fusion using polycations, such as polybrene, polyornithine, etc., are also used. For various techniques for transforming mammalian cells, see Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).
[0066]
Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors herein are prokaryote, yeast, or higher eukaryote cells. Suitable prokaryotes include, but are not limited to, eubacteria, eg, Gram-negative or Gram-positive organisms, eg, Enterobacteriaceae such as E. coli. Various E. coli strains are publicly available, for example, E. coli K12 strain MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli strains W3110 (ATCC 27,325) and K5772 (ATCC 53,635). Other suitable prokaryotic host cells are E. coli, for example, E. coli. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, such as Salmonella typhimurium, Serratia, such as Serratia marcescans, and Shigella, such as B. bacillus, such as Bacillus bacillus, such as B. bacillus. P. subtilis) and B. licheniformis (eg, Vasiliricheniformis 41P described in DD266,710 published April 12, 1989), Pseudomonas, such as Pseudomonas and Streptomyces. Including the Enterobacteriaceae family. These examples are illustrative rather than limiting. Strain W3110 is one particularly preferred host or parent host because it is a common host strain for recombinant DNA production and issuance. Preferably, the host cells secrete minimal amounts of proteolytic enzymes. For example, strain W3110 may be modified to affect a genetic mutation in a gene encoding a protein foreign to the host, such as E. coli W3110 strain 1A2 having the complete genotype tonA. Escherichia coli W3110 strain 9E4 with complete genotype tonA ptr3; complete genotype tonA prt3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan;rEscherichia coli W3110 strain 27C7 (ATCC 55,244) having the full genotype tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ommpT rbs7 ilvG kanrEscherichia coli W3110 strain 37D6 having a non-kanamycin resistance degP deletion mutation; Escherichia coli W3110 strain 40B4, which is a 37D6 strain having a non-kanamycin-resistant degP deletion mutation; Includes E. coli strains with proteases. Alternatively, in vitro methods of cloning, such as PCR or other nucleic acid polymerase polymerase reactions, are preferred.
[0067]
In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for PRO-encoding vectors. Saccharomyces cerevisiae is a commonly used lower eukaryotic host microorganism. Other examples include Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 published May 2, 1985); Kluyveromyces hosts (U.S. Patent No. 4). , 943, 529; Fleer et al., Bio / Technology, 9: 968-975 (1991)), for example, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (2). : 737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wikeramii (K. wi). keramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), Kedrosophilalum (AT. 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology, 8: 135 (90) )), K. thermotolerans and K. marxianus; yarowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al.). Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichodel reesia (EP 244, 234). Neurospora crassa (Case et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]); EP 394,538); and filamentous fungi, for example, Neurospora, Penicillium, Polypocladium (WO 91/00357, published January 10, 1991); Nest fungus (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and black mold (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Methylotropic yeasts are suitable here, but are not limited to Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, and Rhodotorla or Rhodoro. Or a yeast capable of growing in methanol selected from the genus consisting of A list of specific species that is illustrative of this yeast taxonomy can be found in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
[0068]
Suitable host cells for the expression of glycosylated PRO are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 and plant cells. Examples of useful mammalian host cell lines include Chinese Hamster Ovary (CHO) and COS cells. More specific examples are the monkey kidney CV1 strain transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); the human embryonic kidney strain (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture) J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); Mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human hepatocytes (Hep G2, HB8065); and mouse breast tumors Cells (MMT 060562, ATTC C Including the L51). Selection of the appropriate host cell is deemed to be within the skill of the art.
[0069]
3. Selection and use of replicable vectors
The nucleic acid (eg, cDNA or genomic DNA) encoding PRO is inserted into a replicable vector for cloning (amplification of the DNA) or expression. Various vectors are publicly available. The vector can be, for example, in the form of a plasmid, cosmid, virus particle or phage. The appropriate nucleic acid sequence is inserted into the vector by various techniques. Generally, DNA is inserted into an appropriate restriction endonuclease site using techniques well known in the art. Vector components generally include, but are not limited to, one or more signal sequences, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Construction of suitable vectors containing one or more of these components employs standard ligation techniques known to those of skill in the art.
PRO is not only produced directly by recombinant techniques, but also as a fusion peptide with a heterologous polypeptide which is a signal sequence or other polypeptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the polypeptide. Is also produced. Generally, the signal sequence is a component of the vector or is part of the PRO-encoding DNA that is inserted into the vector. The signal sequence may be, for example, a prokaryotic signal sequence selected from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, 1 pp or a thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, signal sequences include, for example, yeast invertase leader, alpha factor leader (Saccharomyces) and Kluyveromyces alpha factor leader, the latter of US Pat. No. 5,010,182. Or an acid phosphatase leader, a C. albicans glucoamylase leader (EP 362,179 published April 4, 1990), or published on November 15, 1990. It may be the signal described in WO 90/13646. In mammalian cell expression, signal sequences from secreted polypeptides of the same or related species, as well as mammalian signal sequences such as viral secretion leaders, may be used for direct secretion of the protein.
[0070]
Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. Such sequences are well known for various bacteria, yeasts and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, the 2μ plasmid origin is suitable for yeast, and various viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are mammalian. Useful for cloning vectors in animal cells.
Expression and cloning vectors typically contain a selection gene, also termed a selectable marker. Typical selection genes include (a) that confer resistance to antibiotics or other toxins such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) compensate for auxotrophic deficiencies, or (c) encode the gene code for, for example, Basili. Encodes a protein that supplies important nutrients not available from complex media, such as D-alanine racemase.
Examples of suitable selectable markers for mammalian cells are those that allow for the identification of cells that can take up the PRO-encoding nucleic acid, such as DHFR or thymidine kinase. Suitable host cells when using wild-type DHFR are described in Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980). CHO cell line deficient in DHFR activity prepared and grown. A suitable selection gene for use in yeast is the trp1 gene present in the yeast plasmid YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemer et al. Gene, 10: 157 (1980)]. The trp1 gene provides a selection marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in the presence of tryptophan, for example, ATCC No. 44076 or PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
[0071]
Expression and cloning vectors usually contain a promoter operably linked to the PRO-encoding nucleic acid sequence and directing mRNA synthesis. Promoters recognized by a variety of potential host cells are known. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include the β-lactamase and lactose promoter systems [Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)], alkaline phosphatase, tryptophan (trp). ) Promoter system [Goeddel, Nucleic Acids Res. , 8: 4057 (1980); EP 36,776], and hybrid promoters such as the tac promoter [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]. Promoters for use in bacterial systems also will contain a Shine-Dalgarno (SD) sequence operably linked to the DNA encoding PRO.
Examples of suitable promoter sequences for use in yeast hosts include 3-phosphoglycerate kinase [Hitzeman et al. Biol. Chem. , 255: 2073 (1980)] or other glycolytic enzymes [Hess et al., J. Am. Adv. Enzyme Reg. Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)], for example, enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate. Includes acid isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triosephosphate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase.
Other yeast promoters include inducible promoters that have the additional effect of regulating transcription by growth conditions, such as alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degradative enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein, and glycerol. There are promoter regions for aldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and enzymes that utilize maltose and galactose. Suitable vectors and promoters suitable for use in yeast expression are further described in EP 73,657.
[0072]
PRO transcription from vectors in mammalian host cells is described, for example, by polyomavirus, infectious epithelioma virus (UK 2,211,504 published July 5, 1989), adenovirus (eg, adenovirus 2), bovine nipple Genomes of viruses such as oncovirus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and simian virus 40 (SV40), heterologous mammalian promoters such as actin or immunoglobulin promoters, and heat shock promoters Is controlled as long as such a promoter is compatible with the host cell system.
Transcription of the DNA encoding PRO by higher eukaryotes can be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about 10 to 300 base pairs, that act on a promoter to enhance its transcription. Many enhancer sequences from mammalian genes are currently known (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus. Examples include the late SV40 enhancer of the replication origin (100-270 base pairs), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the late polyoma enhancer of the replication origin and the adenovirus enhancer. The enhancer may be spliced into the vector at a position 5 'or 3' to the PRO coding sequence, but is preferably located 5 'from the promoter.
Expression vectors used in eukaryotic host cells (nucleated cells derived from yeast, fungi, insects, plants, animals, humans, or other multicellular organisms) also need to terminate transcription and stabilize mRNA. Includes arrays. Such sequences can be obtained from the usually 5 ', and sometimes 3' untranslated regions of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions contain nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding PRO.
In addition, other methods, vectors and host cells suitable for adapting to the synthesis of PRO in recombinant vertebrate cell culture are described in Geting et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; and EP 117,058.
[0073]
4. Gene amplification / expression detection
Gene amplification and / or expression may be performed using appropriately labeled probes based on the sequences provided herein, for example, by conventional Northern blotting to quantitate mRNA transcription [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], Southern blotting, dot blotting (DNA analysis), or in situ hybridization. Alternatively, an antibody capable of recognizing a specific duplex, including a DNA duplex, an RNA duplex, and a DNA-RNA hybrid duplex or a DNA-protein duplex, can also be used. The antibody can then be labeled and the assay performed, wherein the duplex is bound to the surface, so that upon formation of the duplex at the surface, the antibody bound to the duplex Presence can be detected.
Alternatively, gene expression can be measured by immunological methods that directly quantify gene product expression, such as immunohistochemical staining of cells or tissue sections and cell culture or body fluid assays. Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or assay of a sample solution may be monoclonal or polyclonal, and may be prepared in any mammal. Conveniently, the antibody is directed against the native sequence PRO polypeptide or to a synthetic peptide based on the DNA sequences provided herein, or to an exogenous sequence fused to the PRO DNA and encoding a specific antibody epitope. Can be prepared for
[0074]
5. Purification of polypeptide
PRO forms can be recovered from the culture medium or from lysates of the host cells. If membrane-bound, they can be detached from the membrane using a suitable washing solution (eg, Triton-X100) or enzymatic cleavage. Cells used for expression of PRO can be disrupted by various chemical or physical means, such as freeze-thaw cycles, sonication, mechanical disruption, or cell lysing agents.
It is desirable to purify PRO from recombinant cell proteins or polypeptides. The following procedure is an example of a suitable purification procedure: fractionation on an ion exchange column; ethanol precipitation; reverse phase HPLC; chromatography on silica or a cation exchange resin, such as DEAE; chromatofocusing; SDS-PAGE; Precipitation; gel filtration using, for example, Sephadex G-75; a protein A Sepharose column to remove contaminants such as IgG; and a metal chelation column that binds the epitope-tagged form of PRO. It is known in the art and described in, for example, Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, and various methods described in Proteins in New York (1982). it can. The purification process chosen will depend, for example, on the production method used and in particular on the nature of the particular PRO being produced.
[0075]
E. FIG. Tissue distribution
The location of the tissue that expresses PRO can be determined by measuring mRNA expression in various human tissues. The location of such genes provides information about the tissues most likely to be affected by the stimulatory and inhibitory activities of the PRO polypeptide. The location of the gene in a particular tissue also provides a sample tissue for the activity inhibition assay discussed below.
As described above, gene expression in various tissues can be determined by conventional Southern blot, Northern blot for quantification of mRNA transcription (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]. ), Dot blot (DNA analysis), or in situ hybridization can be measured using appropriate labeled probes based on the sequences provided herein. Alternatively, an antibody capable of recognizing a specific duplex including a DNA duplex, an RNA duplex, and a DNA-RNA hybrid duplex or a DNA-protein duplex may be used.
Alternatively, gene expression in various tissues can be measured by immunohistological staining of tissue sections and immunological methods such as cell culture or body fluid assays to directly quantify gene products. Antibodies useful for immunohistological staining and / or assay of sample solutions, which may be monoclonal or polyclonal, are prepared from any animal. Conveniently, the antibody encodes a specific antibody epitope fused to a native sequence PRO polypeptide, or to a synthetic peptide based on a DNA sequence encoding the PRO polypeptide, or to DNA encoding the PRO polypeptide. It can be prepared for an exogenous sequence. General techniques for generating antibodies, and specific protocols for Northern blot and in situ hybridization are provided below.
[0076]
F. Antibody binding studies
The activity of a PRO polypeptide can be further demonstrated by antibody binding studies, where the ability of the anti-PRO antibody to inhibit the effect of each of the PRO polypeptides on tissue cells is tested. Exemplary antibodies include polyclonal, monoclonal, humanized, bispecific, and heteroconjugate antibodies, the preparation of which is described below.
Antibody binding studies may be performed with known assays, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technologies, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).
Competitive binding assays are based on the ability of a labeled standard to compete with a test analyte for binding to a limited amount of antibody. The amount of target protein in a test sample is inversely proportional to the amount of standard that binds to the antibody. To facilitate determination of the amount of standard bound, the antibody is preferably insolubilized before or after competition, so that standards and analytes bound to the antibody can be readily separated from unbound standards and analytes. Be able to separate.
The sandwich assay involves the use of two antibodies, each of which can bind to a different immunogenic portion, or epitope, of the protein to be detected. In a sandwich assay, the test sample analyte binds to a first antibody immobilized on a solid support, after which a second antibody binds to the analyte, thus forming an insoluble ternary complex. See, for example, U.S. Patent No. 4,376,110. The second antibody may be labeled with a detectable component (direct sandwich assay) or measured using an anti-immunoglobulin antibody labeled with a detectable component (indirect sandwich assay). For example, one form of the sandwich assay is an ELISA assay, wherein the detectable component is an enzyme.
For immunohistochemistry, the tissue sample may be fresh or frozen, embedded in paraffin, and fixed with a preservative such as formalin.
[0077]
G. FIG. Cell-based assays
Cell-based assays and animal models of immune-related diseases can be used to further understand the relationship between the genes identified herein and polypeptides, and the progression and pathology of immune-related diseases.
In a different method, cells of a cell type known to be involved in a particular immune-related disease are transfected with the cDNAs described herein and analyzed for the ability of these cDNAs to stimulate or inhibit immune function. Appropriate cells are transfected with the desired gene and immune function activity is monitored. Such transfected cell lines can then be used to test the ability of the poly or monoclonal antibody or antibody composition to stimulate or inhibit immune function, for example, to regulate T cell proliferation or inflammatory cell invasion. . Cells transfected with the coding sequences of the genes identified herein can be further used to identify drug candidates for the treatment of immune-related diseases.
In addition, primary cultures derived from transgenic animals (as described below) can be used for the cell-based assays herein, but stable cell lines are preferred. Techniques for deriving continuous cell lines from transgenic animals are well known in the art (see Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [1985]).
One suitable cell-based assay is the mixed lymphocyte reaction (MLR). Current Protocols in Immunology, unit 3.12; E. FIG. Coligan, A .; M. Kruisbeek, D .; H. Marglies, E .; M. Shevach, W.C. Strober, National Institutes of Health, John Wiley & Sons, Inc. Published from. In this assay, the ability of a test compound to stimulate or inhibit the proliferation of activated T cells is assayed. A suspension of responder T cells is cultured with allogeneic stimulator cells, and the proliferative capacity of the T cells is measured by incorporation of tritiated thymidine. This assay is a general measure of T cell reactivity. As many T cells respond and activate to produce IL-2, differences in responsiveness in this assay partially reflect differences in IL-2 production by responding cells. MLR results can be confirmed by a standard lymphokine (IL-2) detection assay. Current Protocols in Immunology, supra, 3.15.6.3. See
The proliferative T cell response in the MLR assay is due to the direct mitogenic properties of the molecule being assayed or to external antigen-induced activation. Further evidence of the T cell stimulatory activity of a PRO polypeptide can be obtained by a costimulation assay. T cell activation involves antigen-specific signals mediated through the T cell receptor (TCR) and costimulatory signals mediated through a second ligand binding interaction, such as a B7 (CD80, CD86) / CD28 binding interaction. is necessary. Cross-linking of CD28 increases the secretion of lymphokines by activated T cells. T cell activation has both negative and positive controls through binding of a ligand with a negative or positive effect. CD28 and CTLA-4 are related glycoproteins of the Ig superfamily that bind to B7. CD28 binding to B7 has a positive costimulatory effect on T cell activation; conversely, CTLA-4 binding to B7 has a negative T cell deactivating effect. Chambers. C. A. and Allison. J. P. , Curr. Opin. Immunol. (1997) 9: 396. Schwartz, R .; H. , Cell (1992) 71: 1065; Linsey, P .; S. and Ledbetter. J. A. Annu. Rev .. Immunol. (1993) 11: 191; H. Immunol. Today (1994) 15: 321; Jenkins. M. K. , Immunity (1994) 1: 405. In costimulation assays, PRO polypeptides are assayed for T cell costimulatory or inhibitory activity.
[0078]
PRO polypeptides, as well as other compounds of the invention, are stimulators (co-stimulators) and agonists of T cell proliferation, such as MLR and agonist antibodies as determined by costimulation assays, but are, for example, attenuated, optimal It is useful for treating immune-related diseases characterized by lower or insufficient immune function. These diseases are treated by stimulating T cell proliferation and activation (and T cell mediated immunity) and enhancing the immune response in the mammal by administration of a stimulatory compound, eg, a stimulatory PRO polypeptide. The stimulatory polypeptide can be, for example, a PRO polypeptide or an agonistic antibody thereof.
Direct use of a stimulatory compound as in the present invention involves tumor necrosis that binds to the 4-1BB glycoprotein, a ligand expressed on primed T cells (4-1BBL), and signals T cell activation and growth. Demonstrated in experiments using members of the factor receptor family. Alderson, M .; E. FIG. J. et al. Immunol. (1994) 24: 2219.
The use of agonist stimulating compounds has also been demonstrated experimentally. Activation of 4-1BB by treatment with an agonist anti-4-1BB antibody enhances tumor eradication. Hallstrom. I. And Hallstrom, K .; E. FIG. , Crit. Rev .. Immunol. (1998) 18: 1. Immunoadjuvant therapy for treating tumors, described in more detail below, is another example of the use of stimulatory compounds of the invention.
Alternatively, an immunostimulatory or potentiating effect can be achieved by antagonizing or inhibiting the activity of PRO found to be inhibitory in an MLR assay. Reversing the inhibitory activity of the compound produces a net stimulating effect. Suitable antagonists / inhibitor compounds are antibodies or fragments thereof that recognize and bind to the inhibitory protein, thereby blocking the effective interaction of the protein with its receptor and inhibiting signaling through the receptor Is done. This effect has been demonstrated in experiments using anti-CTLA-4 antibodies that enhance T cell proliferation, presumably by eliminating inhibitory signals caused by CTLA-4 binding. Walunas, T.W. L. Et al., Immunity (1994) 1: 405.
[0079]
Alternatively, an immunostimulatory or potentiating effect can be achieved by administration of a PRO having vascular permeability enhancing properties. Enhanced vascular permeability may be beneficial for diseases that can be alleviated by inflammation and local infiltration of immune cells (eg, monocytes, eosinophils, PMNs).
On the other hand, PRO polypeptides and other compounds of the invention are direct inhibitors of T cell proliferation / activation, lymphokine secretion, and / or vascular permeability, but may be used directly to suppress immune responses. Can be. These compounds reduce the extent of the immune response and are useful in the treatment of immune-related diseases characterized by hyperactivity, superoptimal or autoimmune responses. This use of the compounds of the invention has been demonstrated by the experiments described above in which CTLA-4 binding to receptor B7 deactivates T cells. The direct inhibitory compounds of the present invention function in a similar manner. The use of compounds that inhibit vascular hyperpermeability is expected to reduce inflammation. Such use is beneficial in treating conditions involving excessive inflammation.
Alternatively, compounds that bind to stimulatory PRO polypeptides and block the stimulatory effects of these molecules, such as antibodies, produce a net inhibitory effect that inhibits T cell proliferation / activation and / or lymphokine secretion. Can be used to suppress T cell-mediated immune responses. By blocking the stimulatory effect of the polypeptide, the immune response of the mammal is suppressed. This use has been demonstrated in experiments using anti-IL2 antibodies. In these experiments, the antibody binds to IL2 and inhibits binding of IL2 to its receptor, thereby achieving a T cell inhibitory effect.
[0080]
H. Animal model
In addition, the results of in vitro cell-based assays can be demonstrated by in vivo animal models and T cell function assays. To further understand the role of the genes identified herein in the progression and pathogenesis of immune-related diseases, and to test the efficacy of candidate therapeutics, including antibodies and other agonists of natural polypeptides, including small molecule antagonists For this purpose, various well-known animal models can be used. The in vivo nature of these models can predict response in human patients. Animal models for immune-related diseases include both non-recombinant and recombinant (transgenic) animals. Non-recombinant animal models include, for example, rodent, eg, mouse models. Such models are created by introducing cells into syngeneic mice by standard techniques, for example, subcutaneous injection, tail vein injection, spleen transplant, intraperitoneal transplant, subrenal transplant, and the like.
Graft-versus-host disease occurs when immunocompetent cells are transplanted into immunosuppressed or resistant patients. Donor cells recognize and respond to host antigens. Responses range from severe, life-threatening inflammation to mild cases such as diarrhea and weight loss. The graft-versus-host disease model provides a means to assess T cell reactivity to MHC antigens and small amounts of transplant antigen. A suitable procedure is described in Current Protocols in Immunology, unit 4.3, above. In more detail. Animal models for skin allograft rejection are a means of testing the ability of T cells to mediate tissue destruction in vivo and are indicative of their role in transplant rejection. The most common and accepted model uses a graft of mouse tail skin. Repeat experiments have shown that skin allograft rejection is mediated by T cells, helper T cells and killer-effector T cells, but not antibodies. Auchincloth, H .; Jr. And Sachs, D .; H. , Fundamental Immunology, 2nd ed. , W.S. E. FIG. Paul ed. , Raven Press, NY, 1989, 889-992. A suitable procedure is described in Current Protocols in Immunolology, supra, unit 4.4. In more detail. Other transplant rejection models that can be used to test compounds of the present invention are described in Tanabe, M .; Et al., Transplantation (1994) 58:23 and Tinubu, S .; A. J. et al. Immunol. (1994) 4330-4338.
[0081]
Animal models of late-onset hypersensitivity also provide assays for cell-mediated immune function. A delayed type hypersensitivity reaction is a T cell-mediated in vivo immune response characterized by non-peaking inflammation until a certain time after antigen administration. These reactions also occur in tissue-specific autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, a model for MS). A suitable procedure is described in Current Protocols in Immunology, supra, unit 4.5. In more detail.
EAE is a T-cell mediated autoimmune disease characterized by inflammation of T cells and mononuclear cells, followed by axonal demyelination in the central nervous system. EAE is generally considered to be a relevant animal model for MS in humans. Bolton. C. , Multiple Scrollosis (1995) 1: 143. Both acute and recurrent relaxation models have been developed. The compounds of the present invention can be obtained from the above-mentioned Current Protocols in Immunology, unit 15.1 and 15.2. Can be used to test for T cell stimulatory or inhibitory activity against immune-mediated demyelination disease. Also, Duncan. I. D. Et al., Molec. Med. See also models of myelin disease in which oligodendrocytes or Schwann cells have been transplanted into the central nervous system, as described in Today (1997) 554-561.
Contact hypersensitivity is a simple delayed hypersensitivity in vivo assay of cell-mediated immune function. In this procedure, the skin is exposed to an exogenous hapten that produces a delayed type hypersensitivity reaction, and the response is measured and quantified. Contact hypersensitivity is followed by an initial sensitization phase followed by a manifestation phase. The manifestation phase occurs when T lymphocytes encounter an antigen that they have contacted in the past. Swelling and inflammation occur, creating an excellent model of human allergic contact dermatitis. A suitable procedure is described in Current Protocols in Immunology, J. Mol. E. FIG. Coligan, A .; M. Kruisbeek, D .; H. Marglies, E .; M. Shevach, and W.C. Strober, John Wiley & Sons, Inc, unit 4.2. Also, Grabbe, S.A. And Schwarz, T .; Immun. See also Today 19 (1): 37-44 (1998).
[0082]
An animal model for arthritis is collagen-induced arthritis. This model shares the clinical, histological and immunological characteristics of human autoimmune rheumatoid arthritis and is an acceptable model for human autoimmune arthritis. The mouse and rat models are characterized by synovitis, cartilage erosion and subchondral bone. The compounds of the present invention are described in Current Protocols in Immunology, unit 15.5. Can be tested for activity against autoimmune arthritis. Also, Issekutz, A. et al. C. See also the model using monoclonal antibodies to CD18 and VLA-4 integrin described in Immunology (1996) 88: 569.
Antigen-induced airway hyperreactivity, pulmonary eosinophilia and inflammation sensitize animals to ovalbumin and describe an asthma model induced by exposing animals to similar proteins delivered by aerosol . Several animal models (guinea pigs, rats, non-human primates) showed signs similar to human atopic asthma upon exposure to aerosol antigens. The mouse model has many features of human asthma. Suitable procedures for testing compounds of the invention for activity and efficacy in treating asthma are described in Wolyniec, W .; W. Et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1998) 18: 777 and the references cited therein.
In addition, the compounds of the present invention can be tested in animal models for psoriasis diseases. Some evidence suggests that T cells are pathogenic for psoriasis. The compounds of the present invention are described in Schon. M. P. Et al., Nat. Med. (1997) 3: 183, can be tested in the scid / scid mouse model, in which mice exhibit histopathological skin lesions similar to psoriasis. Other suitable models are described by Nickoloff, B .; J. Et al., Am. J. Path. (1995) 146: 580, a human skin / scid mouse chimera prepared as described.
[0083]
Recombinant (transgenic) animal models can be designed by introducing the coding portions of the genes identified herein into the subject's animal genome using standard techniques for producing transgenic animals. Animals that can serve as targets for genetic engineering operations include, but are not limited to, mice, rats, rabbits, guinea pigs, sheep, goats, pigs, and non-human primates, such as baboons, chimpanzees and monkeys. Techniques known in the art for introducing transgenes into these animals include pronuclear microinjection (Hoppe and Wanger, US Pat. No. 4,873,191); retrovirus-mediated gene transfer into the germline ( For example, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]); Gene targeting in embryonic hepatocytes (Thompson et al., Cell 56, 313-321 [1989]); Embryo electroporation (Lo, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814 [1983]); sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 [1989]). See, for example, US Pat. No. 4,736,866 for a review.
For the purposes of the present invention, transgenic animals include those having a transgene in only some of their cells ("mosaic animals"). The transgene may be incorporated as a single transgene or as a concatamer, eg, head-to-head or head-to-tail tandem. Selective introduction of a transgene into a particular cell type is also described, for example, in Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992).
Transgene expression in the transgenic animal can be monitored by standard techniques. For example, Southern blot analysis or PCR amplification is used to confirm integration of the transgene. The level of mRNA expression can then be analyzed using techniques such as in situ hybridization, Northern blot analysis, PCR, or immunohistochemistry.
[0084]
The animals may also be tested for signs of pathogenesis of the immune disease, for example by histological examination, to determine the infiltration of immune cells into specific tissues. Block experiments can also be performed in which transgenic animals are treated with a compound of the present invention and the degree of T cell proliferation stimulation or inhibition of the compound is determined. In these experiments, a blocking antibody that binds to the PRO polypeptide prepared as described above is administered to animals and the effect on immune function is measured.
Alternatively, the polypeptide identified herein may be encoded as a result of homologous recombination between an altered genomic DNA encoding a polypeptide introduced into an embryonic cell of the animal and an endogenous gene encoding the same polypeptide. "Knock-out" animals can be created that have defective or altered genes. For example, a cDNA encoding a particular polypeptide can be used for cloning genomic DNA encoding the polypeptide according to established techniques. A portion of the genomic DNA encoding a particular polypeptide can be deleted or replaced with another gene, such as a gene encoding a selectable marker used to monitor integration. Typically, the vector contains a few kilobases of flanked DNA (both at the 5 'and 3' ends) unchanged (eg, for a description of homologous recombination vectors, Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987)]. The vector is introduced into embryonic stem cells (eg, by electroporation) and selects for cells in which the introduced DNA has been homologously recombined with the endogenous DNA [eg, Li et al., Cell, 69: 915 (1992). reference]. The selected cells are then injected into the blastocyst of an animal (eg, a mouse or rat) to form an assembling chimera [eg, Bradley, Teratocarcinomamasand Embronic Stem Cells: A Practical Approach, E. et al. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987); 113-152]. The chimeric embryo is then implanted into a suitable pseudopregnant female nanny and is said to produce a "knock-out" animal. Progeny that have DNA homologously recombined in embryonic cells are identified by standard techniques and can be used to propagate animals in which all cells of the animal contain homologously recombined DNA. . Knockout animals are characterized by their ability to defend against certain pathological conditions and the development of pathological conditions due to the absence of the polypeptide.
[0085]
I. Immunoadjuvant treatment
In one embodiment, the immunostimulatory compounds of the invention can be used for immunoadjuvant treatment in tumor (cancer) treatment. It is well established that T cells recognize human tumor-specific antigens. One group of tumor antigens encoded by the MAGE, BAGE and GAGE families of genes is silent in all adult normal tissues, but in tumors such as melanoma, lung tumors, head and neck tumors, and bladder cancers. It is expressed in a significant amount. DeSmet. C. Et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 7149. It has been shown that costimulation of T cells induces tumor regression and an antitumor response both in vitro and in vivo. Melero. I. Et al., Nature Medicine (1997) 3: 682; Kwon. E. FIG. D. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 8099; Lynch. D. H. Et al., Nature Medicine (1997) 3: 625; Finn. O. J. And Lotze. M. T. , J. et al. Immunol. (1998) 21: 114. The stimulatory compounds of the invention can be administered alone or as an adjuvant, or together with growth regulators, cytotoxics or chemotherapeutics, to stimulate T cell proliferation / activation and antitumor response to tumor antigens. The growth regulator, cytotoxic agent or chemotherapeutic agent can be administered in conventional amounts used in known modes of administration. The immunostimulatory activity of the compounds of the present invention can reduce the amount of growth regulators, cytotoxics or chemotherapeutics, and thus potentially reduce toxicity to the patient.
[0086]
J. Screening assays for drug candidates
Candidate drug screening assays may involve compounds that bind or complex with the polypeptide encoded by the gene identified herein, or a biologically active fragment thereof, or the encoded polypeptide and other cellular proteins. Designed to identify compounds that inhibit the interaction with. Such screening assays include those according to high-throughput screening of chemical libraries, which makes them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates. Small molecules to be considered include synthetic organic or inorganic compounds, which are peptides, preferably soluble peptides, (poly) peptide-immunoglobulin fusions, especially but not limited to poly- and monoclonal antibodies and antibody fragments. , Single chain antibodies, anti-idiotype antibodies, and chimeric or humanized forms of those antibodies or fragments, as well as antibodies, including human antibodies and antibody fragments. Assays can be performed in a variety of formats, including protein-protein binding assays, biochemical screening assays, immunoassays and cell-based assays that are well characterized in the art. All assays require that the candidate drug be contacted with the polypeptide encoded by the nucleic acid identified herein under conditions and for a time sufficient for these two components to interact. Common.
In a binding assay, the interaction is binding and the complex formed is isolated or detected in the reaction mixture. In a particular embodiment, the polypeptide encoded by the gene identified herein, ie, the drug candidate, is immobilized on a solid phase, eg, a microtiter plate, by covalent or non-covalent attachments. Non-covalent attachment is generally achieved by coating the solid surface with a solution of the polypeptide and drying. Alternatively, it can be used to immobilize an immobilized antibody specific to the polypeptide to be immobilized, eg, a monoclonal antibody, on a solid surface. The assay is performed by adding a non-immobilized component, which may be labeled with a detectable label, to the immobilized component, eg, the coated surface containing the anchored component. When the reaction is completed, unreacted components are removed, for example, by washing, and the complex fixed on the solid surface is detected. If the first non-immobilized component has a detectable label, detection of the label immobilized on the surface indicates that complex formation has occurred. If the initial non-immobilized component has no label, complex formation can be detected, for example, by a labeled antibody that specifically binds to the immobilized complex.
[0087]
If the candidate compound interacts with, but does not bind to, the particular protein encoded by the gene identified herein, the interaction with that protein is assayed by well-known methods to detect protein-protein interactions. can do. Such assays include traditional techniques such as cross-linking, co-immunoprecipitation, and co-purification through a gradient or chromatography column. In addition, protein-protein interactions are described in Chevray and Nathans Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991), as described in Fields and co-workers [Fields and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)]. Many transcriptional activators, such as yeast GAL4, consist of two physically distinct modular domains, one acting as a DNA binding domain and the other as a transcription activation domain. The yeast expression system described in published literature (generally referred to as the "2-hybrid system") takes advantage of this property and uses two hybrid proteins, while the target protein is the DNA-binding domain of GAL4. And, on the other hand, the candidate activation protein is fused to the activation domain. Expression of the GAL1-lacZ reporter gene under the control of the GAL4 activating promoter depends on the reconstitution of GAL4 activity through protein-protein interactions. Colonies containing interacting polypeptides are detected with a chromogenic substance for β-galactosidase. A complete kit for identifying protein-protein interactions between two specific proteins using the two-hybrid technique (MATCHMARKER ™) is commercially available from Clontech. The system can also be extended to mapping protein domains involved in a particular protein interaction, as well as identifying amino acid residues that are important for this interaction.
To find compounds that inhibit the interaction of the genes identified herein with other intracellular or extracellular components, usually the reaction mixture is subjected to conditions and times that allow the interaction and binding of the two products. The product is prepared to contain the product of the gene and intracellular or extracellular components. To test the ability of a test compound to inhibit binding, reactions are performed with or without the test compound. In addition, a placebo may be added to the third reaction mixture to serve as a positive control. Binding (complex formation) between the test compound and the intracellular or extraneous components present in the mixture is monitored as described above. Complex formation in the control reaction and not in the reaction mixture containing the test compound indicates that the test compound interferes with the interaction of the test compound with its reaction partner.
[0088]
K. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
Compositions useful for the treatment of immune-related diseases include, but are not limited to, proteins, antibodies that inhibit or stimulate immune functions such as, for example, T cell proliferation / activation, lymphokine release, or immune cell infiltration. , Small organic molecules, peptides, phosphorylated peptides, antisense and ribozyme molecules, triple helix molecules and the like.
For example, antisense RNA and RNA molecules act to directly block mRNA translation by hybridizing to the target mRNA and interfering with protein translation. When antisense DNA is used, oligodeoxyribonucleotides derived from the translation initiation site, eg, between about −10 and +10 positions of the target gene nucleotide sequence, are preferred.
Ribozymes are enzymatic RNA molecules that can catalyze the specific cleavage of RNA. Ribozymes act by sequence-specific hybridization to complementary target RNA, followed by nucleotide-strand cleavage. Specific ribozyme cleavage sites within potential RNA targets can be identified by known techniques. For further details, see, for example, Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994) and PCT Publication No. WO 97/33551 (published September 18, 1997).
The nucleic acid molecule in triplex helix formation used for transcription inhibition is single-stranded and consists of deoxynucleotides. The basic composition of these oligonucleotides is designed to promote triple helix formation via Hoogsteen base pairing rules, which generally requires a resizable extension of a purine or pyrimidine on one strand of the duplex. I do. For further details see, for example, PCT Publication No. WO 97/33551, supra.
These molecules can be identified by any or any combination of the screening assays discussed above, and / or by any other screening techniques well known to those skilled in the art.
[0089]
L. Anti-PRO antibody
The present invention further provides anti-PRO antibodies. Exemplary antibodies include polyclonal, monoclonal, humanized, bispecific and heteroconjugate antibodies.
1. Polyclonal antibody
Anti-PRO antibodies include polyclonal antibodies. Methods for preparing polyclonal antibodies are known to those skilled in the art. In mammals, polyclonal antibodies can be produced, for example, by one or more injections of an immunizing agent and, if desired, an adjuvant. Typically, the immunizing agent and / or adjuvant will be injected into the mammal by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections. The immunizing agent can include the PRO polypeptide or a fusion protein thereof. It is useful to couple the immunizing agent to a protein known to be immunogenic in the immunized mammal. Examples of such immunogenic proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor. Examples of adjuvants that can be used include Freund's complete adjuvant and MPL-TDM adjuvant (monophosphoryl lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate). The immunization protocol will be selected by one of skill in the art without undue experimentation.
[0090]
2. Monoclonal antibody
Alternatively, the anti-PRO antibody may be a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method as described in Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In the hybridoma method, a mouse, hamster, or other suitable host animal is typically immunized with an immunizing agent to produce antibodies that specifically bind to the immunizing agent or to generate lymphocytes capable of producing the antibody. Trigger. Lymphocytes can also be immunized in vitro.
Immunizing agents typically include a PRO polypeptide or a fusion protein thereof. Generally, peripheral blood lymphocytes ("PBL") are used if cells of human origin are desired, or spleen cells or lymph node cells if a non-human mammalian source is desired. Next, the lymphocytes are fused with the immortalized cell line using a suitable fusion agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 146-64). 59-103]. Immortalized cell lines are usually transformed mammalian cells, particularly myeloma cells of rodent, bovine, and human origin. Usually, rat or mouse myeloma cell lines are used. The hybridoma cells are preferably cultured in a suitable culture medium containing one or more substances that inhibit the survival or growth of the unfused, immortalized cells. For example, if the parent cell lacks the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the culture medium of the hybridoma will typically contain hypoxatin, aminoptilin and thymidine ("HAT medium"). ) This substance blocks the growth of HGPRT deficient cells.
[0091]
Preferred immortalized cell lines are those that fuse efficiently, support stable high level expression of antibody by the selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. A more preferred immortalized cell line is a murine myeloma line, which is available, for example, from the Salk Institute Cell Distributor Center in San Diego, California and the American Type Culture Collection in Manassas, Virginia. Human myeloma and mouse-human xenomyeloma cell lines for producing human monoclonal antibodies have also been described [Kozbor, J. et al. Immunol. , 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Technologies and Applications, Marcel Dekker, Inc .; , New York, (1987) pp. 51-63].
The culture medium in which the hybridoma cells are cultured is then assayed for the presence of a monoclonal antibody to PRO. Preferably, the binding specificity of the monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by an in vitro binding assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Such techniques and assays are known in the art. The binding affinity of the monoclonal antibody can be determined, for example, by the method of Munson and Pollard, Anal. Biochem. , 107: 220 (1980).
After the desired hybridoma cells have been identified, clones can be subcloned by limiting dilution and grown by standard methods [Goding, supra]. Suitable media for this purpose include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium and RPMI-1640 medium. Alternatively, the hybridoma cells can be grown as ascites in vivo in a mammal.
Monoclonal antibodies secreted by the subclones can be isolated from the culture medium or ascites fluid by conventional immunoglobulin purification methods, such as, for example, protein A-sepharose, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography. Separated or purified.
[0092]
Further, the monoclonal antibody can be prepared by a recombinant DNA method, for example, a method described in US Pat. No. 4,816,567. The DNA encoding the monoclonal antibody of the present invention can be readily prepared using conventional methods (eg, using oligonucleotide probes that can specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of the mouse antibody). Can be isolated and sequenced. The hybridoma cells of the present invention are a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be integrated into an expression vector, which is transfected into host cells, such as monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not produce immunoglobulin proteins. Alternatively, monoclonal antibodies can be synthesized in recombinant host cells. DNA can also be obtained by substituting human heavy and light chain constant domain coding sequences, eg, for homologous mouse sequences [US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Supra], or immunoglobulin coding The sequence can be modified by covalently attaching part or all of the coding sequence for a non-immunoglobulin polypeptide. Such non-immunoglobulin polypeptides can be substituted for the constant domains of the antibodies of the invention, or for the variable domains of one of the antigen binding sites of the antibodies of the invention, to produce chimeric bivalent antibodies.
[0093]
The antibody may be a monovalent antibody. Methods for preparing monovalent antibodies are well known in the art. For example, one method involves the recombinant expression of an immunoglobulin light chain and a modified heavy chain. The heavy chain is truncated generally at any point in the Fc region to prevent heavy chain crosslinking. Alternatively, the relevant cysteine residues are replaced or deleted with other amino acid residues to prevent crosslinking.
In vitro methods are also suitable for preparing monovalent antibodies. Digestion of an antibody to produce a fragment thereof, particularly a Fab fragment, can be accomplished using routine techniques known in the art.
[0094]
3. Human and humanized antibodies
The anti-PRO antibody of the present invention further includes a humanized antibody or a human antibody. A humanized form of a non-human (e.g., mouse) antibody refers to a chimeric immunoglobulin, an immunoglobulin chain or a fragment thereof (e.g., Fv, Fab, Fab ', F (ab')).2Or another antigen-binding subsequence of an antibody), which comprises a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin. Humanized antibodies are those in which the residues of the complementarity-determining regions (CDRs) of the recipient are the residues of the CDRs of a non-human species (donor antibody) having the desired specificity, affinity and potency, such as mouse, rat or rabbit. Human immunoglobulins (recipient antibodies) replaced by In some cases, Fv framework residues of the human immunoglobulin have been replaced by corresponding non-human residues. Also, a humanized antibody may contain residues that are not found in the recipient antibody, nor in the imported CDR or framework sequences. In general, a humanized antibody will have at least one, typically at least one, typically all of the CDR regions correspond to those of a non-human immunoglobulin and all or almost all of the FR regions are of a human immunoglobulin consensus sequence. Contains substantially all of the two variable domains. The humanized antibody optimally comprises at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op Struct. Biol. , 2: 593-596 (1992)].
Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, one or more non-human amino acid residues are introduced into a humanized antibody. These non-human amino acid residues are often referred to as "import" residues, which are typically taken from an "import" variable domain. Humanization is essentially by replacing the relevant sequence of a human antibody with a rodent CDR or CDR sequence [see Winters and co-workers [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature. , 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1544-1536 (1988)]. Thus, such "humanized" antibodies are chimeric antibodies (U.S. Pat. No. 4,816,567) in which substantially less than an intact human variable domain has been replaced by the corresponding sequence from a non-human species. is there. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues have been replaced by residues from analogous sites in rodent antibodies.
[0095]
In addition, a human antibody was prepared using a phage display library [Hoogenboom and Winter, J. et al. Mol. Biol. 227: 381 (1992); Marks et al. Mol. Biol. , 222: 581 (1991)], and various methods known in the art. Techniques such as Cole et al. And Boerner can also be used to prepare human monoclonal antibodies (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Lis. P. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol. , 147 (1): 86-95 (1991)] Similarly, human antibodies transduce human immunoglobulin loci into transgenic animals, such as endogenous immunoglobulin genes, which are partially or completely inactivated and introduced into mice. Upon administration, one observes the production of human antibodies that are very similar to those found in humans in all aspects including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. Is a US patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661. No. 016, and the following scientific literature: Marks et al., Bio / Technology 10,779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al. , Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995). It has been.
Antibodies may also be affinity-matured using known selection and / or mutagenesis methods described above. Preferred affinity matured antibodies are 5-fold, more preferably 10-fold, even more preferably 20 or 30-fold more affinity than that of the starting antibody (typically mouse, humanized or human) from which the mature antibody was prepared. Having.
[0096]
4. Bispecific antibodies
Bispecific antibodies are monoclonal, preferably human or humanized, antibodies that have binding specificities for at least two different antigens. In this case, one of the binding specificities is for PRO and the other is for any other antigen, preferably a cell surface protein or receptor or receptor subunit.
Methods for making bispecific antibodies are well known in the art. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy / light chain pairs in which the two heavy chains have different specificities [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Due to the random assortment of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of ten different antibody molecules, only one of which has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule is usually achieved by an affinity chromatography step. Similar procedures are described in WO 93/08829, published May 13, 1993, and in Traunecker et al., EMBO J. Clin. , 10: 3655-3659 (1991).
Antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) can be fused to immunoglobulin constant domain sequences. The fusion preferably is with an immunoglobulin heavy chain constant domain, comprising at least part of the hinge, CH2, and CH3 regions. Preferably, at least one of the fusions has a first heavy chain constant region (CH1) containing the site necessary for light chain binding. The DNA encoding the immunoglobulin heavy chain fusion and, if desired, the immunoglobulin light chain, are inserted into separate expression vectors and co-transfected into a suitable host organism. For further details on generating bispecific antibodies see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
[0097]
According to another approach described in WO 96/27011, the interface between a pair of antibody molecules can be manipulated to maximize the percentage of heterodimers recovered from recombinant cell culture. Preferred interfaces include at least a portion of the CH3 region of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (eg, tyrosine or tryptophan). Complementary "cavities" of the same or similar size as the large side chains are created at the interface of the second antibody molecule, where the large amino acid side chains have been replaced by smaller ones (eg, alanine or threonine). This provides a mechanism to increase the yield of heterodimers over other unwanted end products such as homodimers.
Bispecific antibodies are full-length antibodies or antibody fragments (e.g., F (ab ')2Bispecific antibodies). Techniques for producing bispecific antibodies from antibody fragments have also been described in the literature. For example, bispecific antibodies can be prepared using chemical linkage. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) proteolytically cleave intact antibodies to F (ab ').2Describes a procedure for producing fragments. These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. The Fab 'fragment produced is then converted to a thionitrobenzoate (TNB) derivative. One of the Fab'-TNB derivatives is then reconverted to Fab'-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of another Fab'-TNB derivative to form a bispecific antibody. The produced bispecific antibody can be used as an agent for selective immobilization of an enzyme.
Fab 'fragments can be recovered directly from E. coli, which can be chemically coupled to form bispecific antibodies. Shalaby et al. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992) are fully humanized bispecific antibodies F (ab ').2Describes the production of the molecule. Each Fab 'fragment is separately secreted from E. coli and undergoes directed chemical coupling in vitro to form bispecific antibodies. The bispecific antibody thus formed is capable of binding ErbB2 receptor overexpressing cells and normal human T cells, triggering the cytolytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast tumor targets. Become.
[0098]
Various techniques for making and isolating bispecific antibody fragments directly from recombinant cell culture have also been described. For example, bispecific antibodies have been produced using leucine zippers. Kostelny et al. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Leucine zipper peptides from the Fos and Jun proteins are linked to the Fab 'portions of two different antibodies by gene fusion. The antibody homodimer is reduced at the hinge region to form monomers and then re-oxidized to form the antibody heterodimer. This method can also be used for the production of antibody homodimers. See Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) provided an alternative mechanism for making bispecific antibody fragments. The fragments are joined by a light chain variable domain (V) with a linker that is short enough to allow pairing between the two domains on the same chain.L) Has a heavy chain variable domain (VH). Therefore, the V of one fragmentHAnd VLThe domain is the complementary V of other fragmentsLAnd VHIt is forced to pair with a domain, forming two antigen-binding sites. Other strategies for making bispecific antibody fragments by the use of single-chain Fv (sFv) dimers have also been reported. Gruber et al. Immunol. 152: 5368 (1994). Antibodies with more than two valencies are also contemplated. For example, trispecific antibodies can be prepared. Tutt et al. Immunol. 147: 60 (1991).
Exemplary bispecific antibodies can bind to two different epitopes of a PRO polypeptide provided herein. Alternatively, the anti-PRO polypeptide arm may be a trigger molecule on leukocytes, such as a T cell receptor molecule (eg, CD2, CD3, CD28, or B7) or an FcγRI, such that the cytoprotective mechanism is focused on a particular PRO polypeptide expressing cell. (CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16) can bind to the Fc receptor for IgG (FcγR). Bispecific antibodies can also be used to localize cytotoxic drugs to cells that express a particular PRO polypeptide. These antibodies have a PRO-binding arm and an arm that binds a cytotoxic agent or a radiochelator, such as EOTUBE, DPTA, DOTA, or TETA. Other bispecific antibodies of interest bind the PRO polypeptide and further bind tissue factor (TF).
[0099]
5. Heteroconjugate antibody
Heteroconjugate antibodies also fall within the scope of the present invention. Heteroconjugate antibodies consist of two covalently linked antibodies. Such antibodies can be used, for example, to target immune system cells to unwanted cells [US Pat. No. 4,676,980] and to treat HIV infection [WO 91/00360; WO 92/200373]. EP 03089] has been proposed. It is contemplated that the antibodies can be prepared in vitro using known methods in synthetic protein chemistry, including those involving crosslinking agents. For example, immunotoxins can be made using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate, and, for example, those disclosed in U.S. Patent No. 4,676,980.
[0100]
6. Processing effector functions
It is desirable to modify the antibody of the invention for effector function, for example, to improve the effectiveness of the antibody in treating cancer. For example, a cysteine residue may be introduced into the Fc region, thereby forming an interchain disulfide bond in this region. The homodimeric antibodies so generated may have improved internalization capacity and / or increased complement-mediated cell killing and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). J. Caron et al. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. et al. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Homodimer antibodies with improved antitumor activity can also be prepared using heterobifunctional crosslinks as described in Wolff et al., Cancer research 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, the antibody can be engineered to have two Fc regions, thereby improving complement lysis and ADCC capabilities. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
[0101]
7. Immunoconjugate
The present invention is also conjugated to chemotherapeutic agents, cytotoxic drugs such as toxins (eg, enzymatically active toxins from bacteria, fungi, plants or animals, or fragments thereof), or radioisotopes (ie, radioactive bonds). It also relates to an immune complex comprising the antibody. Chemotherapeutic agents useful for generating such immunoconjugates are described above. Enzymatically active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, a non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modecin A chain, alpha- Sarsin, S. aragiri protein, dianthin protein, pokeweed protein (PAPI, PAPII, and PAP-S), crane inhibitor, cursin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelin, gelinin , Restrictocin, phenomycin, enomycin, and tricothecene Including the ne). A variety of radionucleotides are available for generating radioactively linked antibodies. As an example,212Bi,131I,131In,9OY and186Including Re.
The conjugate of the antibody and the cytotoxic agent can be a variety of bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), imidoester bifunctionality. Derivatives (such as dimethyl adipimidate HCL), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azide compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium Using derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (such as triene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) Can be created. For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an example of a chelating agent for conjugation of radionucleotides to antibodies. See WO 94/11026.
In another embodiment, the antibody may be conjugated to a "receptor" (such as streptavidin) for use in pre-targeting a tumor, and the antibody-receptor conjugate is administered to a patient, and then a clarifying agent is added. Unbound conjugate is used to remove from the circulation and then administered a "ligand" (such as avidin) conjugated to a cytotoxic drug (such as a radionucleotide).
[0102]
8. Immunoliposome
Further, the proteins and antibodies disclosed herein may be prepared as immunoliposomes. Liposomes containing antibodies are described in Epstein et al., Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); and U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545. Liposomes with improved circulation times are disclosed in US Pat. No. 5,013,556.
Particularly useful liposomes are produced by reverse phase evaporation with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derived phosphatidylethanolamine (PEG-PE). The liposomes are extruded through a defined pore size filter to produce liposomes having the desired diameter. Fab 'fragments of the antibodies of the present invention are described in Martin et al. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982), and can be attached to liposomes via a disulfide exchange reaction. A chemotherapeutic agent (such as doxorubicin) is optionally contained within the liposome. Gabizon et al. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).
[0103]
M. Pharmaceutical composition
Active PRO molecules of the invention (eg, PRO polypeptides, anti-PRO antibodies, and / or variants thereof), and other molecules identified in the above-described screening assays, may be used in pharmaceutical compositions for the treatment of immune-related diseases. Can be administered.
Therapeutic formulations of the active PRO molecules, preferably polypeptides or antibodies, of the present invention can be used to convert active molecules with the desired degree of purity into any pharmaceutically acceptable carrier, in the form of a lipophilic formulation or an aqueous solution, Prepared and stored by mixing with excipients or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]). Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers such as phosphates, citrates, and other organic acids; ascorbic acid and methionine Preservatives (octadecyldimethylbenzylammonium cloid; hexamethonium cloid; benzalkonium cloid; benzethonium cloid; phenol; butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; Low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulin; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; glycine, glutamine Amino acids such as asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates containing glucose, mannose or dextrin; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; sodium and the like. Metal complex (eg, Zn-protein complex); and / or non-ionic such as TWEEN (trade name), PLURONICS (trade name), and polyethylene glycol (PEG) Contains surfactant.
[0104]
Compounds identified in the screening assays disclosed herein can be formulated in a similar manner using standard techniques known in the art.
Lipofections or liposomes can also be used to introduce PRO molecules into cells. When antibody fragments are used, minimal inhibitory fragments that specifically bind to the binding domain of the target protein are preferred. For example, a peptide molecule that retains the ability to bind to a target protein sequence can be designed based on the variable region sequence of the antibody. Such peptides can be chemically synthesized and / or produced by recombinant DNA technology. (See, e.g., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]).
The formulations herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. Alternatively, or in addition, the composition may include a cytotoxic agent, cytokine or growth inhibitor. These molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.
The active PRO molecule may also be used in colloidal drug delivery systems (e.g., in microcapsules prepared, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin microcapsules and poly (methyl methacrylate) microcapsules, respectively) (Eg, liposomes, albumin spherules, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in microemulsions. These techniques are described in Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A .; Ed. (1980).
Formulations used for in vivo administration must be sterile. This is easily achieved by filtration through a sterile filtration membrane.
[0105]
Sustained-release preparations or PRO molecules may be prepared. Suitable examples of sustained release formulations include a semipermeable matrix of a solid hydrophobic polymer containing the antibody, which matrix is in the form of a shaped article, eg, a film, or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactides (U.S. Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid and γ- Ethyl-L-glutamate copolymer, non-degradable ethylene-vinyl acetate, LUPRON DEPOTTM(Injectable microspheres consisting of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate), including poly (D) -3-hydroxybutyric acid. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid enable release of molecules for over 100 days, certain hydrogels release proteins more quickly. When encapsulated antibodies remain in the body for extended periods of time, they denature or aggregate by exposure to 37 ° C. water, resulting in reduced biological activity and possible changes in immunogenicity. . Rational strategies can be devised for stabilization depending on the mechanism involved. For example, if the aggregation mechanism is found to be intermolecular SS bond formation through thio-disulfide exchange, stabilization may include modification of sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, control of water content, appropriate And the development of specific polymer matrix compositions.
[0106]
N. Method of treatment
The polypeptides, antibodies and other active agents of the invention are characterized by infiltration of inflammatory cells into tissues, stimulation of T cell proliferation, inhibition of T cell proliferation, increased or reduced vascular permeability or inhibition thereof. It is believed that it can be used to treat a variety of immune-related diseases and conditions, including those that are T-cell mediated.
Examples of medical conditions or diseases treated with the polypeptides, antibodies and other compounds of the present invention include, but are not limited to, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, juvenile chronic arthritis, osteoarthritis, spine Arthropathy, systemic sclerosis (scleroderma), idiopathic inflammatory myopathy (dermatomyositis, polymyositis), Sjogren's syndrome, systemic vasculitis, sarcoidosis, autoimmune hemolytic anemia (aplastic anemia, seizures) Nocturnal hemoglobinuria), autoimmune thrombocytopenia (idiopathic thrombocytopenic purpura, immune-mediated thrombocytopenia), thyroiditis (Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, juvenile lymphocytic thyroiditis, atrophic thyroiditis), Diabetes mellitus, immune-mediated renal disease (glomerulonephritis, tubulointerstitial nephritis), demyelinating diseases of the central and peripheral nervous system such as multiple sclerosis, idiopathic paralytic polyneuropathy, or N-Barré syndrome and chronic inflammation-associated paraneoplastic polyneuropathy, hepatobiliary disease, such as infectious hepatitis (type A, B, C, D, E, and other non-hepatotrophic viruses), autologous Chronic immune active hepatitis, primary biliary cirrhosis, granulomatous hepatitis, and sclerosing cholangitis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis; Crohn's disease), gluten-sensitive bowel disease, and Whipple's disease, bullous Skin diseases, autoimmune or immune-mediated skin diseases including erythema multiforme and contact dermatitis, psoriasis, allergic diseases such as asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, food sensitivity and urticaria, lung immunity Diseases include transplant-related diseases including, e.g., eosinophilic pneumonia, idiopathic pulmonary fibrosis and irritable pneumonia, rejection and graft-versus-host disease.
In systemic lupus erythematosus, the central mediator of the disease is the production of autoreactive antibodies to self proteins / tissues, followed by the development of immune-mediated inflammation. Antibodies directly or indirectly mediate tissue damage. Although T lymphocytes have not been shown to be directly involved in tissue damage, T lymphocytes are required for the development of autoreactive antibodies. Thus, disease development is dependent on T lymphocytes. Multiple organs and systems are clinically affected, including the kidney, lung, musculoskeletal, mucocutaneous, ocular, central nervous system, cardiovascular system, gastrointestinal tract, bone marrow and blood.
[0107]
Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic systemic autoimmune inflammatory disease primarily involving the synovium of multiple joints, resulting in damage to articular cartilage. The pathogenesis is T lymphocyte dependent and is associated with the production of rheumatoid factors, autoantibodies to self IgG, resulting in the production of immune complexes that reach high levels in synovial fluid and blood. These complexes in the joints induce significant lymphocyte and monocyte infiltration into the synovium, followed by significant synovial changes; infiltration of similar cells by the addition of multiple neutrophils If done, it's the joint space / fluid. The affected tissues are mostly joints, often in a symmetrical pattern. However, two main forms of extra-articular disease also occur. One form is the development of extra-articular disorders with ongoing progressive joint disease and typical lesions of pulmonary fibrosis, vasculitis, and skin ulcers. A second form of extra-articular disease is the so-called Feltie syndrome, which occurs late in the RA disease process, sometimes after the joint disease has subsided, and involves the presence of neutropenia, thrombocytopenia and splenic hypertrophy. This is accompanied by vasculitis in multiple organs with the formation of infarcts, skin ulcers and gangrene. Often, patients develop a rheumatoid nodule in the subcutaneous tissue over the diseased joint; the nodule has a necrotic center surrounded by mixed inflammatory cell infiltration at the end. Other signs that may occur in RA include: pericarditis, pleurisy, coronary arthritis, interstitial pneumonia with pulmonary fibrosis, keratoconjunctivitis sicca, and rheumatoid nodules.
Juvenile chronic arthritis is a chronic idiopathic inflammatory disease that often occurs before the age of 16 years. Its phenotype has some similarities to RA; some patients who are rheumatoid factor positive are classified as juvenile rheumatoid arthritis. The disease is subdivided into three major categories: pauarticular, polyarticular, and systemic. Arthritis is severe and typically destructive, leading to joint ankylosis and delayed growth. Other signs include chronic anterior uveitis and systemic amyloidosis.
[0108]
Spondyloarthropathies are a group of diseases that have a common association between some common clinical features and expression of the HLA-B27 gene product. The diseases include: Bechterew's disease (ankylosing sponylitis), Reiter's syndrome (reactive arthritis), arthritis associated with inflammatory bowel disease, spondylitis associated with psoriasis, juvenile spondyloarthritis and undifferentiated spondyloarthritis It is. Prominent features include sacroiliitis with or without spondylitis; inflammatory asymmetric arthritis; association with HLA-B27 (a serologically defined allele at the HLA-B locus of class I MHC); Includes ocular inflammation and the absence of autoantibodies associated with other rheumatic diseases. The cells most involved as key to disease induction are CD8 + T lymphocytes, cells that target antigens presented by class I MHC molecules. CD8 + T cells respond to the class I MHC allele HLA-B27 as if they were foreign peptides expressed by MHC class I molecules. It has been postulated that the epitope of HLA-B27 mimics an antigenic epitope of a bacterial or other microorganism and thus elicits a CD8 + cell response.
The etiology of systemic sclerosis (scleroderma) is not well known. A prominent feature of the disease is induration of the skin; it appears to be triggered by an active inflammatory process. Scleroderma is local or systemic: common vascular lesions, endothelial cell injury in the microvasculature is an early key event in the development of systemic sclerosis; vascular injury can be immune-mediated . Immunological criteria are guided by the presence of mononuclear cell infiltrates in skin lesions and the presence of anti-nuclear antibodies in many patients. In many cases, ICAM-1 is up-regulated on the cell surface of skin lesion fibroblasts, suggesting that T cell interactions with these cells play a role in the pathogenesis of the disease. Other organs of interest include: the gastrointestinal tract: smooth muscle atrophy and fibrosis that result in abnormal peristalsis / motility: the kidneys: affecting the arcuate and interlobular arteries, resulting in renal cortical blood flow Concentric subendothelial intimal hyperplasia resulting in decreased proteinuria, hypernitrogenhematuria and hypertension: skeletal muscle: atrophy, interstitial fibrosis: inflammation: lung: interstitial pneumonia and interstitial fibrosis: and heart : Includes contraction band necrosis, scar / fibrosis.
[0109]
Idiopathic inflammatory myopathy, including dermatomyositis, polymyositis and others, is a chronic muscular inflammatory disease of unknown etiology, leading to muscle weakness. Muscle damage / inflammation is often contrasting and progressive. Autoantibodies are associated with many forms. These myositis-specific autoantibodies are produced against the components, proteins and RNAs involved in protein synthesis and inhibit their function.
Sjogren's syndrome is due to immune-mediated inflammation and subsequent disruption of the lacrimal and salivary glands. The disease may be associated with or associated with inflammatory connective tissue disease. The disease is associated with the production of autoantibodies to Ro and La antigens, both small RNA-protein complexes. Lesions are keratoconjunctivitis sicca, xerostomia, with other signs or associations including biliary cirrhosis, peripheral or sensory neuropathy, and overt purpura.
Systemic vascular inflammation is where the primary lesion is inflamed, followed by damage to the blood vessels, resulting in ischemia / necrosis / degeneration in the tissue supplied by the affected vessels, and in some cases, the ultimate terminal disease. It is a disease that causes organ dysfunction. Vasculitides may also occur as a sequela or as a secondary lesion in other immune inflammatory mediated diseases, such as rheumatoid arthritis, systemic sclerosis, etc., especially those associated with immune complex formation. . Diseases of the primary systemic vasculitis group include: systemic necrotizing vasculitis: polyarteritis nodosa, allergic vasculitis and granulomatosis, polyangitis: Wegener's granulomatosis; lymphomatous granulation Tumors: and giant cell arteritis. Other vasculitis include: mucocutaneous lymph node syndrome (MLNS or Kawasaki disease), isolated CNS vasculitis, Behett's disease, obstructive thrombotic vasculitis (Berger disease) and cutaneous necrotic venules Venulitis. The pathogenesis mechanism of most types of vasculitis listed is thought to be mainly due to the attachment of immunoglobulin complexes to the vessel wall, followed by the induction of an inflammatory response via ADCC, complement activity, or both. ing.
Sarcoidosis is a condition of unknown etiology characterized by the presence of epithelioid granuloma in almost every tissue in the body; pulmonary involvement is most common. Etiology is associated with the retention of active macrophages and lymphocytes at the site of the disease, followed by the release of local or systemic active products released from these cell types resulting in chronic sequelae.
Autoimmune hemolytic anemia, including autoimmune hemolytic anemia, aplastic anemia, and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, are antigens expressed on the surface of red blood cells (and in some cases, other blood cells that also contain platelets). The result is the production of antibodies that react with and are reflected in the removal of the antibody-coated cells via complement-mediated lysis and / or ADCC / Fc-receptor-mediated mechanisms.
[0110]
In autoimmune thrombocytopenia, including thrombocytopenic purpura and immune-mediated thrombocytopenia in other clinical settings, platelet destruction / removal involves antibody or complement binding to platelets followed by complement lysis, ADCC or Fc -Results in removal by a receptor-mediated mechanism.
Thyroiditis, including Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, juvenile lymphocytic thyroiditis, and atrophic thyroiditis, involves the production of antibodies that are present in the thyroid gland and often react with thyroid-specific proteins. This is due to the result of an autoimmune reaction to the antigen. Natural models: Rats (BUF and BB rats) and chickens (obese chicken species); Inducible models: There are experimental models involving immunization of animals with either thyroglobulin, thyroid microsomal antigen (thyroid peroxidase).
Type I diabetes mellitus or insulin-dependent diabetes mellitus is the autoimmune destruction of pancreatic islet β-cells; this destruction is mediated by autoantibodies and autoreactive T cells. Also, antibodies to insulin or an insulin-like receptor can create an insulin-non-reactive phenotype.
Immune-mediated renal diseases, including glomerulonephritis and tubulointerstitial nephritis, are directly or as a result of the production of autoreactive antibodies or T cells against renal antigens, or reactive with other non-renal antigens. Certain depositions of antibodies and / or immune complexes in the kidney are indirectly due to antibody or T cell mediated damage to renal tissue. Thus, other immune-mediated diseases that result in the formation of immune complexes may also trigger immune-mediated renal disease as an indirect sequelae. Both direct and indirect immunity mechanisms result in an inflammatory response that results in / induces focal development in renal tissue, which compromises organ function and in some cases progresses to renal dysfunction. Both humoral and cellular immune mechanisms may be involved in the pathogenesis of the disorder.
Demyelinating diseases of the central and peripheral nervous system, including multiple sclerosis; idiopathic paralytic polyneuropathy or Guillain-Barre syndrome; and chronic inflammatory paralytic polyneuropathy, are due to autoimmunity, It is believed that nerve demyelination results from damage caused directly by dendrocytes or myelin. In MS, there is evidence to suggest that disease induction and progression is dependent on T lymphocytes. Multiple sclerosis is a T-lymphocyte-dependent, demyelinating disease that has either a relapsing flaccid pathway or a chronic progressive pathway. The etiology is unknown, but viral infection, genetic predisposition, environment and autoimmunity all contribute. Lesions contain predominant T cell-mediated microglial infiltration and infiltrating microphages; CD4 + T lymphocytes are the predominant cell type in the lesion. The mechanism of oligodendrocyte cell death and subsequent demyelination is unknown, but appears to be driven by T lymphocytes.
Uncontrolled immuno-inflammatory responses are associated with inflammatory and fibrotic lung diseases, including eosinophilic pneumonia; idiopathic pulmonary fibrosis and irritable pneumonia. Inhibition of that response would be therapeutically beneficial.
Autoimmune or immune-mediated skin diseases, including bullous skin disease, erythema multiforme, and contact dermatitis, are mediated by autoantibodies, the pathogenesis of which is T lymphocyte dependent.
Psoriasis is a T lymphocyte-mediated inflammatory disease. Lesions include infiltration of T lymphocytes, macrophages and antigen processing cells and certain neutrophils.
[0111]
Allergic diseases including asthma; allergic rhinitis; atopic dermatitis; food sensitivity and urticaria are T lymphocyte dependent. These diseases are primarily mediated by T lymphocyte-induced inflammation, IgE-mediated inflammation, or a combination of both.
Transplant-related diseases, including rejection and graft-versus-host disease (GVHD), are T lymphocyte dependent; they are ameliorated by inhibiting T lymphocyte function.
Other diseases in which intervention in the immune and / or inflammatory response may be beneficial include, but are not limited to, viral infections (including but not limited to AIDS, A, B, C, D, E, Hepatitis and herpes), bacterial infections, fungal infections, protozoan infections, and parasite infections (Molecules (or derivatives / agonists) that stimulate the MLR can be used in therapy to enhance immune responsiveness to infectious agents) Infectious diseases, including immune deficiency diseases (molecules) that can be used therapeutically to stimulate, utilize, generatively acquire, acquire, and enhance an immune response to an induced (eg, HIV infection) condition, including MLR / Derivative / agonist) or iatrogenic (ie, from chemotherapy) immunodeficiency, and hyperplasia.
It has been demonstrated that some human cancer patients develop antibodies and / or T lymphocytes that respond to antigens on abnormally growing cells. It has also been shown that in animal models with overgrowth, enhancing the immune response can result in the rejection or regression of certain overgrowth. Molecules that enhance the T lymphocyte response in the MLR have in vivo utility to enhance the immune response to abnormal growth. Molecules that enhance the T lymphocyte proliferative response in the MLR (or small molecule agonists or antibodies that antagonistically affected the same receptor) can be used therapeutically to treat cancer. Also, molecules that inhibit the lymphocyte response in the MLR function in vivo to suppress the immune response to neoplasms during abnormal growth; such molecules can be expressed by the neoplastic cells themselves, or Expression can be induced by neoplasms in other cells. Antagonism of such inhibitory molecules (by antibodies, small molecule antagonists or other means) enhances immune-mediated tumor rejection.
In addition, inhibiting a molecule having proinflammatory properties may include reperfusion injury; stroke; myocardial infarction; atherosclerosis; acute lung injury; hemorrhagic shock; burn; sepsis / sepsis shock; acute tubular necrosis; Beneficial in the treatment of endometriosis; degenerative joint disease and pancreatitis.
[0112]
The compounds of the invention, e.g., polypeptides or antibodies, can be administered to mammals, preferably humans, in a well-known manner, e.g., intravenously as a bolus or by continuous infusion over a period of time, intramuscularly, intraperitoneally, intracerebrospinally, It is administered by subcutaneous, interarticular, intrasynovial, intrathecal, oral, topical, or inhalation (intranasal, intrapulmonary) routes. Intravenous or inhaled administration of polypeptides and antibodies is preferred.
In immunoadjuvant therapy, other regimens, such as administration of anti-cancer agents, may be combined with administration of a protein, antibody or compound of the invention. For example, a patient to be treated with the immunoadjuvant of the present invention may receive anticancer (chemotherapeutic) or radiation therapy. Preparation and dosage schedules for such chemotherapeutic agents are used according to the manufacturer's instructions or are determined empirically by the skilled practitioner. Preparations and dosing schedules for such chemotherapy are also described in Chemotherapy Service Ed. M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). The chemotherapeutic agent may be administered prior to or subsequent to the administration of the immunoadjuvant, or may be administered simultaneously therewith. In addition, anti-estrogen compounds such as tamoxifen or anti-progesterone such as onapristone (see EP 616812) may be given at doses known for those molecules.
[0113]
It is also possible to administer antibodies to antigens associated with other immune diseases or with tumors, such as antibodies that bind to CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, or vascular endothelial factor (VEGF). preferable. Alternatively or additionally, two or more antibodies that bind to the same antigen or two or more different antigens disclosed herein may be co-administered to the patient. Often, it is also beneficial to administer one or more cytokines to the patient. In one embodiment, the PRO polypeptide is co-administered with a growth inhibitor. For example, a growth inhibitor is administered first, followed by a PRO polypeptide. However, simultaneous administration or administration first is also conceivable. Suitable doses for growth inhibitors are those currently used, but may be reduced by the combined (synergistic) effect of the growth inhibitor and the PRO polypeptide.
For the treatment or reduction of a severe immune-related disease, an appropriate dose of a compound of the invention will be determined by the type of disease to be treated, the severity and course of the disease, as defined above, for the purpose of preventing or treating. Whether or not the drug is administered will depend on previous treatments, the patient's clinical history and response to the compound, and the discretion of the attending physician. The compound is suitably administered to the patient at one time or over a series of treatments.
For example, depending on the type and severity of the disease, about 1 μg / kg to 15 mg / kg (eg, 0.1-20 mg / kg) of the polypeptide or antibody can be administered, for example, in one or more separate doses or In any case, by continuous infusion, it is the first candidate dose to administer to the patient. A typical daily dosage might range from about 1 μg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the factors mentioned above. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is continued until the desired suppression of disease symptoms occurs. However, other dosage regimens may be useful. The progress of this therapy is easily monitored by conventional techniques and assays.
[0114]
O. Products
In another embodiment of the present invention, there is provided an article of manufacture comprising a substance (eg, containing a PRO molecule) useful for diagnosing or treating the above diseases. The article of manufacture comprises a container and instructions for use. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, and test tubes. The container may be formed from various materials such as glass or plastic. The container may contain a composition effective to diagnose and treat the condition and may have a sterile access port (eg, the container may be an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle. May be). The active agent in the composition will usually be a polypeptide or antibody of the invention. The instructions or labels on or associated with the container indicate that the composition is used for diagnosing or treating the condition of choice. The article of manufacture may further comprise a second container containing a pharmaceutically acceptable buffer, such as phosphate buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. In addition, it may contain other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes, and package inserts with usage instructions.
[0115]
P. Diagnosis and prediction of immune-related diseases
Cell surface proteins, such as proteins that are overexpressed in certain immune-related diseases, are excellent targets for candidate drugs or disease treatment. The same proteins find additional use in the diagnosis and prognosis of these diseases, as well as secreted proteins encoded by genes amplified in immune-related diseases. For example, antibodies against the protein product of the gene amplified in multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, or other immune-related diseases can be used as a diagnostic or prognostic.
For example, antibodies including antibody fragments can be used for qualitative or quantitative detection of expression of a protein encoded by the amplified or overexpressed gene ("marker gene product"). The antibody is preferably provided with a detectable, eg, fluorescent, label and binding can be monitored by light microscopy, flow cytometry, fluorometry, or other techniques known in the art. These techniques are particularly appropriate where the overexpressed gene encodes a cell surface protein. Such a binding assay is performed essentially as described above.
In situ detection of antibodies that bind to the marker gene product can be performed, for example, by immunofluorescence or immunoelectron microscopy. For this purpose, a histological sample is removed from the patient and a labeled antibody is applied to it, preferably by overlaying the antibody on a biological sample. This approach also allows the distribution of the marker gene product in the tissue being tested to be determined. It will be apparent to those skilled in the art that a wide variety of histological methods are readily available for in situ detection.
The following examples are provided for illustrative purposes only, and are not intended to limit the scope of the invention in any way.
The entirety of all patents and references cited herein are hereby incorporated by reference.
[0116]
(Example)
Commercial reagents referred to in the examples were used according to manufacturer's instructions unless otherwise indicated. The source of cells identified by the ATCC accession number in the following examples and throughout the specification is the American Type Culture Collection, Manassas, VA.
Example 1: Extracellular domain homology screen to identify novel polypeptides and cDNAs encoding them
Extracellular domain (ECD) sequences (including secretion signal sequences, if present) from about 950 known secreted proteins from the Swiss-Prot public database were used to search the EST database. EST databases include public databases (eg, Dayhoff, GenBank) and corporate databases (eg, LIFESEQ).TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). The search was performed using the computer program BLAST or BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) as a comparison with the six frame translation of the EST sequence of the ECD protein sequence. Comparatives that do not encode a known protein and have a BLAST score of 70 (sometimes 90) or higher can be clustered with the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA) and consensus DNA sequence Built.
Using this extracellular domain homology screen, a consensus DNA sequence was constructed using phrap against other identified EST sequences. In addition, the resulting consensus DNA sequence is often (but not always) extended using repeated cycles of BLAST or BLAST-2 and prap, and the consensus sequence is made as far as possible using the sources of EST sequences discussed above. Extended.
Based on the consensus sequence obtained as described above, a probe is then synthesized to identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR and to isolate a clone of the full length coding sequence of the PRO polypeptide Used to be used as Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000 bp in length. Probe sequences are typically 40-55 bp in length. In some cases, additional oligonucleotides are synthesized when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. To screen some libraries for full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR with a PCR primer pair according to Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. The positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs.
The cDNA library used to isolate the cDNA clones was created by standard methods using commercially available reagents such as those from Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with oligo dT containing a NotI site, ligated to the SalI hemikinase adapter with blunt ends, cut with NotI, appropriately sized by gel electrophoresis, and a suitable cloning vector (such as pRKB or pRKD; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; it was cloned into Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) at unique XhoI and NotI sites in a predetermined orientation.
[0117]
Example 2: Isolated Polypeptide-encoding Nucleotide Sequences of cDNA Clones Using Specific Database Queries can be publicly (eg, GenBank) and / or private (LIFESEQ)R, Incyte Pharmaceuticals, Inc. (Palo Alto, Calif.) In order to search for homology of a specific gene using the computer programs BLAST and BLAST2 (Altshul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). In this case, researchers used a previously identified gene as the interrogative sequence to search for related homologies. The significance of homology is determined on a case-by-case basis based on each gene. If significant homology is found, this may result in a variety of tissue libraries corresponding to the full-length clone to be examined and sequenced, or to subsequently isolate DNA encoding the native sequence PRO polypeptide. This results in the identification of additional EST sequences that serve as templates for the creation of cloning oligonucleotides used to screen for ESTs.
[0118]
Example 3: Isolation of cDNA clones using signal algorithm analysis
A proprietary signal sequence discovery algorithm developed by Genentech Inc (South San Francisco, CA) can be used for public (eg, GenBank) and / or private (LIFESEQ)R, Incyte Pharmaceuticals, Inc. (Palo Alto, Calif.) Database and applied to assembled and assembled EST fragments to identify various polypeptide-encoding nucleic acid sequences. The signal sequence algorithm calculates a secretion signal score based on the letters of the DNA nucleotides surrounding the first and possibly second methionine codon (ATG) at the 5'-end of the sequence or sequence fragment under consideration. The nucleotide following the first ATG must encode at least 35 non-obvious amino acids without a stop codon. If the first ATG has the required amino acids, the second is not tested. If none of the requirements were met, no candidate sequence was scored. To determine whether the EST sequence contains a genuine signal sequence, the DNA surrounding the ATG codon and the corresponding amino acid sequence were analyzed using a set of seven sensors (evaluation parameters) known to be associated with secretion signals. Scored. Using this algorithm, a large number of polypeptide-encoding nucleic acid sequences are identified.
[0119]
Example 4: Isolation of cDNA clones using ECD homology to genomic DNA
Extracellular domain (ECD) sequences (including secretion signal sequences, if present) from about 950 known secreted proteins from the Swiss-Prot public database were used to search the sequence database. Databases include public databases (eg, GenBank). In this case, the genomic DNA sequence from GenBank was analyzed using the gene prediction program, GENSCAN, licensed from Stanford University. GENSCAN analysis predicts the coding region of a gene and creates a sequence that can be the subject of an ECD search. The search was performed using the computer program BLAST or BLAST-2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)] as a comparison with the six frame translation of the EST sequence of the ECD protein sequence. If necessary, comparisons that do not encode a known protein and have a BLAST score of 70 (sometimes 90) or higher may be clustered with the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA). To a consensus DNA sequence. Based on the consensus sequence, the oligonucleotides can be used as: 1) to identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR; 2) for use as probes to isolate clones of the full-length coding sequence; Synthesized. Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000 bp in length. Probe sequences are typically 40-55 bp in length. In some cases, additional oligonucleotides are synthesized when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. To screen some libraries for full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR with a PCR primer pair according to Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. The positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs.
Pools of 50 different human cDNA libraries from various tissues were used for cloning. The cDNA library used to isolate the cDNA clones was created by standard methods using commercially available reagents such as those from Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with oligo dT containing a NotI site, ligated to the SalI hemikinase adapter with blunt ends, cut with NotI, appropriately sized by gel electrophoresis, and a suitable cloning vector (such as pRKB or pRKD; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; it was cloned into Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) at unique XhoI and NotI sites in a predetermined orientation.
The DNA sequence of the clone isolated as described above gave the full-length DNA sequence for the full-length polypeptide.
[0120]
Example 5: Isolation of cDNA clones using signal algorithm search on genomic DNA
Potential genes of interest are described in Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) by applying a proprietary signal sequence detection algorithm to genomic sequences processed by GENSCAN (licensed from Stanford University) from public databases (eg, GenBank). Was. The signal sequence algorithm calculates a secretion signal score based on the letters of the DNA nucleotides surrounding the first and possibly second methionine codon (ATG) at the 5'-end of the sequence or sequence fragment under consideration. The nucleotide following the first ATG must encode at least 35 non-obvious amino acids without a stop codon. If the first ATG has the required amino acids, the second is not tested. If none of the requirements were met, no candidate sequence was scored. To determine whether the EST sequence contains a genuine signal sequence, the DNA surrounding the ATG codon and the corresponding amino acid sequence were analyzed using a set of seven sensors (evaluation parameters) known to be associated with secretion signals. Scored. Using this algorithm, a large number of polypeptide-encoding nucleic acid sequences are identified.
Use of the above signal sequence algorithms allows for the identification of genomic sequences. The genomic sequence was then compared to various databases (eg, GenBank) to identify the presence of homology. Homology searches were performed using the computer program BLAST or BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). If necessary, these comparisons, which do not encode a known protein and have a BLAST score of 70 (sometimes 90) or higher, can be obtained with the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA). The population was assembled into a consensus DNA sequence.
Based on the consensus sequence, the oligonucleotides can be used as: 1) to identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR; 2) for use as probes to isolate clones of the full-length coding sequence; Synthesized. Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000 bp in length. Probe sequences are typically 40-55 bp in length. In some cases, additional oligonucleotides are synthesized when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. To screen some libraries for full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR with a PCR primer pair according to Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. The positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs.
Pools of 50 different human cDNA libraries from various tissues were used for cloning. The cDNA library used to isolate the cDNA clones was created by standard methods using commercially available reagents such as those from Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with oligo dT containing a NotI site, ligated to the SalI hemikinase adapter with blunt ends, cut with NotI, appropriately sized by gel electrophoresis, and a suitable cloning vector (such as pRKB or pRKD; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; it was cloned into Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) at unique XhoI and NotI sites in a predetermined orientation.
The DNA sequence of the clone isolated as described above gave the full-length DNA sequence for the full-length polypeptide.
[0121]
Example 6: Isolation of a cDNA clone encoding a human PRO polypeptide
Using the techniques described in Examples 1-5 above, a number of full-length cDNA clones encoding the PRO polypeptides disclosed herein were identified. These cDNAs were then deposited with the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 USA (ATCC) according to the Budapest Treaty, as shown in Table 7 below.
Example 7: Stimulatory activity assay in mixed lymphocyte reaction (MLR) (# 24)
This example shows that the polypeptides of the present invention are active as stimulators of stimulated T lymphocyte proliferation. Compounds that stimulate lymphocyte proliferation are useful in treatments where an enhanced immune response is preferred. Therapeutic agents can be in the form of antagonists of the PRO polypeptides of the invention, for example, a mouse-human chimera, humanized or human antibody to a polypeptide expected to inhibit T lymphocyte proliferation.
The basic protocol for this assay is described in Current Protocols in Immunology, unit 3.12; E. FIG. Coligan, A .; M. Kruisbeek, D .; H. Marglies, E .; M. Shevach, W.C. Strober, National Institutes of Health, published by John Wiley & Sons, Inc.
More specifically, in one variation of this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are isolated by leukopheresis from a mammalian individual, eg, a human volunteer (one donor is supplied with the stimulator PBMC). , Other responders are supplied with responder PBMC). After isolation, if desired, the cells are frozen in fetal calf serum and DMSO. Frozen cells are placed in an assay medium (37 ° C., 5% CO 2).2) Overnight, then wash and wash 3x106Resuspend cells / ml in assay medium (RPMI; 10% fetal calf serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% glutamine, 1% HEPES, 1% non-essential amino acids, 1% pyruvate).
[0123]
The stimulus PBMC is prepared by irradiating the cells (about 3000 rads). The assay consists of seeding a mixture: test sample diluted 100: 1 in 1% or 0.1%, stimulator cells exposed to 50: 1 light, and 50: 1 responder PBMC cells in triplicate wells. Prepared by 100 microliters of cell culture medium or 100 microliters of CD4-IgG are used as controls. The wells were then placed at 37 ° C, 5% CO2And incubate for 4 days. On day 5, each well is pulsed with tritiated thymidine (1.0 mC / well; Amersham). After 6 hours, the cells are washed three times and then assessed for label uptake.
In another variation of this assay, PBMCs are isolated from spleens of Balb / c and C57B6 mice. Cells from freshly harvested spleens in assay medium (RPMI; 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% glutamine, 1% HEPES, 1% non-essential amino acids, 1% pyruvate) were microscopically analyzed. The PMBCs were isolated by mincing for inspection and overlaying these cells on Lympholyte M (Organon Teknika), centrifuging at 2000 rpm for 20 minutes, collecting and collecting the mononuclear cell layer in the assay medium. Wash and add 1x107Resuspend cells to cells / ml. The assay is then performed as described above. The results of this assay for compounds of the invention are shown in Table 8 below. A positive increase over the control is considered positive and an increase of 180% or more is preferred. However, all values above the control indicate a stimulatory effect on the test protein.
Example 8: Skin vascular permeability assay (# 64)
This assay demonstrates that certain PRO polypeptides promote immune and inflammatory responses by inducing mononuclear cells, eosinophils and PMN infiltration at the site of injection in mammals. The cutaneous vascular permeability assay is performed as follows. Hairless guinea pigs weighing 350 grams or more are anesthetized with ketamine (75-80 mg / Kg) and 5 mg / Kg xylazine intramuscular injection (IM). A sample of purified PRO polypeptide or a conditioned media test sample is injected intradermally into the back of the test animal at 100 μl per injection site. Injections can be made at about 10-30, preferably about 16-24 sites per animal. One ml of Evans blue dye (1% buffered with saline) is injected into the heart. Spots at the injection site are then measured (diameter mm) at 1 hour, 6 hours and 24 hours after injection. Animals are sacrificed after the appropriate time after injection. Each skin injection site is biopsied and fixed with paraformaldehyde. Next, the skin is prepared for histopathological examination. Each site is examined for inflammatory cell infiltration into the skin. Sites with visible inflammatory cell inflammation are scored as positive. Inflammatory cells can be neutrophils, eosinophils, monocytes, lymphocytes.
At least the minimal perivascular invasion at the injection site is scored as positive and negative if no infiltration at the injection site. The results are shown in Table 9.
Example 9: Inhibitory activity assay in mixed lymphocyte reaction (MLR) (No. 67)
This example shows that one or more PRO polypeptides are active as inhibitors of stimulated T lymphocyte proliferation. Compounds that inhibit lymphocyte proliferation are useful in treatments where suppression of the immune response is preferred.
The basic protocol for this assay is described in Current Protocols in Immunology, Unit 3.12; E. FIG. Coligan, A .; M. Kruisbeek, D .; H. Marglies, E .; M. Shevach, W.C. Strober, National Institutes of Health, published by John Wiley & Sons, Inc.
More specifically, in one variation of this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are isolated by leukopheresis from a mammalian individual, eg, a human volunteer (one donor is supplied with the stimulator PBMC). , Other responders are supplied with responder PBMC). After isolation, if desired, the cells are frozen in fetal calf serum and DMSO. Frozen cells are placed in an assay medium (37 ° C., 5% CO 2).2) Overnight, then wash and wash 3x106Resuspend cells / ml in assay medium (RPMI; 10% fetal calf serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% glutamine, 1% HEPES, 1% non-essential amino acids, 1% pyruvate). The stimulus PBMC is prepared by irradiating the cells (about 3000 rads).
This assay:
A test sample diluted 100% to 1% or 0.1%,
50: 1 irradiated stimulator cells, and
50: 1 responder PBMC cells,
Is prepared by plating the mixture in a triple well. 100 microliters of cell culture medium or 100 microliters of CD4-IgG are used as controls. The wells were then placed at 37 ° C, 5% CO2And incubate for 4 days. On day 5, each well is pulsed with tritiated thymidine (1.0 mC / well; Amersham). After 6 hours, the cells are washed three times and then assessed for label uptake.
In another refinement of this assay, PBMCs are isolated from spleens of Balb / c and C57B6 mice. Cells were microscopically collected from freshly harvested spleens in assay medium (RPMI; 10% fetal calf serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% glutamine, 1% HEPES, 1% non-essential amino acids, 1% pyruvate). PBMCs were isolated by mincing for inspection and overlaying these cells on Lympholite M (Organon Teknika), centrifuging at 2000 rpm for 20 minutes, collecting, washing the mononuclear cell layer in the assay medium, 1x10 in assay medium7Resuspend cells to cells / ml. The assay is then performed as described above.
A decrease below the control is considered to be positive as an inhibitory compound, with a decrease of 80% or less being preferred. However, all values below the control indicate an inhibitory effect of the test protein. Table 10 shows the results.
Example 10: In-situ hybrid formation
In situ hybridization is a powerful and versatile technique for the detection and localization of nucleic acid sequences in cell or tissue preparations. It is useful, for example, for identifying sites of gene expression, analyzing tissue distribution of transcripts, identifying and locating viral infections, tracking changes in specific mRNA synthesis, and assisting in chromosome mapping.
In situ hybridization was performed by PCR generation according to an optimized version of the protocol of Lu and Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994).33Performed using a P-labeled riboprobe. Briefly, formalin-fixed, paraffin-embedded human tissue was sectioned, deparaffinized, deproteinized with proteinase K (20 mg / ml) for 15 minutes at 37 ° C., and further described as described in Lu and Gillett, supra. Hybridize in situ. [33[P] UTP-labeled antisense riboprobe is generated from the PCR product and hybridized at 55 ° C overnight. Slides are immersed in Kodak NTB2 nuclear track emulsion and exposed for 4 weeks.
[0127]
33P-riboprobe synthesis
6.0 μl (125 mCi)33P-UTP (Amersham BF 1002, SA <2000 Ci / mmol) was vacuum dried in speed. Dry3 3The following components were added to each tube containing P-UTP: 2.0 μl 5 × transfer buffer; 1.0 μl DTT (100 mM); 2.0 μl NTP mixture (2.5 mM: 10 μl each 10 mM GTP, CTP And ATP + 10 μl H2O); 1.0 μl UTP (50 μM); 1.0 μl Rnasin; 1.0 μl DNA template (1 μg); 1.0 μl H2O.
The tubes were incubated at 37 ° C. for 1 hour, 1.0 μl of RQ1 DNase was added, and then incubated at 37 ° C. for 15 minutes. 90 μl of TE (10 mM Tris pH 7.6 / 1 mM EDTA pH 8.0) was added and the mixture was pipetted on DE81 paper. The remaining solution was loaded into a Microcon-50 ultrafiltration unit and spun using program 10 (6 minutes). The filtration unit was converted to a second tube and spun using program 2 (3 minutes). After the final recovery spin, 100 μl of TE was added. 1 μl of the final product was pipetted on DE81 paper and counted with 6 ml of Biofluor II.
Probes were run on a TBE / urea gel. 1-3 μl of probe or 5 μl of RNAMrkIII was added to 3 μl of loading buffer. After heating on a 95 ° C. heating block for 3 minutes, the gel was immediately placed on ice. The wells of the gel were flushed, filled with samples, and run at 180-250 volts for 45 minutes. The gel was wrapped in Saran wrap and exposed to XAR film with a reinforcing screen for 1 hour to overnight in a -70 ° C freezer.
[0128]
33P-hybrid formation
Pretreatment of frozen sections Slides were removed from the freezer, placed on an aluminum tray and thawed at room temperature for 5 minutes. The tray was placed in a 55 ° C. incubator for 5 minutes to reduce setting. Slides were fixed in 4% paraformaldehyde on ice for 10 minutes in a steam hood and washed with 0.5 × SSC for 5 minutes at room temperature (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQH)2O). After 10 minutes of deproteinization in 0.5 μg / ml proteinase at 37 ° C. (12.5 μl of a 10 mg / ml stock in 250 ml of preheated RNase-free RNase buffer), the sections are washed with 0.5 × SSC for 10 minutes at room temperature did. Sections were dehydrated in 70%, 95%, 100% ethanol for 2 minutes each.
Pretreatment of paraffin-embedded sections Deparaffinize slides and use SQH2O and rinsed twice with 2 × SSC at room temperature for 5 minutes each. Sections were prepared with 20 μg / ml proteinase K (500 μl of 10 mg / ml in 250 ml RNase-free RNase buffer; 37 ° C., 15 minutes) —Human embryo or 8 × proteinase K (100 μl in 250 ml RNase buffer, 37 ° C., 30 minutes) — Deproteinized in formalin tissue. Subsequent rinsing with 0.5 × SSC and dehydration were performed as described above.
Prehybridization Slides were placed in a plastic box lined with Box buffer (4xSSC, 50% formamide) -saturated filter paper. Tissue is washed with 50 μl of hybridization buffer (3.75 g dextran sulfate + 6 ml SQ H2O), vortexed, uncapped and heated in the microwave for 2 minutes. After cooling on ice, 18.75 ml of formamide, 3.75 ml of 20 × SSC and 9 ml of SQ H2O was added, the tissue was vortexed well and incubated at 42 ° C for 1-4 hours.
Hybridization 1.0x10 per slide6cp. Of the probe and 1.0 μl of RNA (50 mg / ml stock) were heated at 95 ° C. for 3 minutes. The slides were cooled on ice and 48 μl of hybridization buffer was added per slide. After vortexing, 50 μl33The P mixture was added to 50 μl of prehybrid on the slide. Slides were incubated overnight at 55 ° C.
Washing Washing was performed with 2 × SSC, EDTA for 2 × 10 minutes at room temperature (400 ml of 20 × SSC + 16 ml of 0.25 M EDTA, Vf= 4 L), followed by RNase A treatment at 37 ° C for 30 minutes (500 μl of 10 mg / ml in 250 ml RNase buffer = 20 μg / ml). Slides were washed 2x10 minutes with 2xSSC, EDTA at room temperature. Stringent wash conditions were as follows: 55 ° C. for 2 hours, 0.1 × SSC, EDTA (20 ml 20 × SSC + 16 ml EDTA, Vf= 4L).
[0129]
Alternatively, poly A from various human tissues+Multi-tissue blots containing RNA (2 μg per lane) were purchased from Clontech (Palo alto, CA). DNA probes were labeled with [α-α-DNA] using random primed DNA labeled beads (Pharmacia Biotech).32P] -dCTP. Hybridization was performed at 68 ° C. for 1 hour using Expresshyb (Clontech). The blot is then washed with 2 × SSC / 0.05% SDS solution at room temperature for 40 minutes, and then replaced with a fresh solution and washed with 0.1 × SSC / 0.1% SDS solution at 55 ° C. for 40 minutes. did. The blot was exposed to a phosphorimager.
This method quantifies gene expression, analyzes the tissue distribution of transcripts, and identifies changes in specific mRNA synthesis of the genes / DNAs and proteins of the invention in diseased tissues isolated from human individuals with a particular disease. Used to chase. These results are more specific in diseased tissues in which the gene of the invention has been expressed, and more predict the specific localization of the therapeutic effect of the inhibitory or stimulatory compound of the invention (and its agonists or antagonists) on disease. are doing. Hybridization is performed according to the method described above, using one or more of the following tissue and cell samples:
(A) lymphocytes and antigen presenting cells (dendritic cells, Langerhans cells, macrophages and monocytes, NK cells);
(B) lymphoid tissue: normal and reactive lymph nodes, thymus, bronchial associated lymphoid tissue (BALT), mucosal associated lymphoid tissue (MALT);
(C) Human disease tissue:
Synovium and joints in patients suffering from arthritis and degenerative joint disease;
The colon of a patient suffering from inflammatory bowel disease, including ulcerative colitis and Crohn's disease;
Skin lesions from psoriasis and other forms of dermatitis;
Pulmonary tissue including BALT and lymph node tissue from chronic and acute bronchitis, pneumonia, interstitial pneumonia, pleurisy;
-Lung tissue including lymph node tissue and BALT from asthma;
Nasal or sinus tissue of patients suffering from rhinitis or sinusitis;
Brain and spinal cord from multiple sclerosis, Alzheimer's disease and stroke;
Kidneys from nephritis, glomerulonephritis and systemic lupus erythematosus;
Liver from infectious and non-infectious hepatitis and acetaminophen-induced cirrhosis;
-Tissue from neoplasm / cancer.
Expression indicative of a localized therapeutic effect of a compound of the present invention (and agonists or antagonists thereof) in a disease associated with a cell or tissue sample is observed in one or more cell or tissue samples.
[0130]
result
DNA54229-1366
Specific pattern of mouse DNA 54229-1366 expression using 5'UTR probe
Normal adult colon: Strong segmental expression in mucosal crypt cells. This expression is present only in crypt cells and extends to approximately the upper half of the villi. Epithelial cells at the ends of the villi show no signal. The pattern correlates with the density of dividing mucosal epithelial cells. Interesting is the fact that this pattern is segmental, that is, there are certain areas of the large intestine that show no signal.
Intestine in inflamed adult mice (IL10R KO (knockout) mice): Pattern and intensity of expression appear to be similar to those described above for normal colon.
Normal adult small intestine: There are few segmented areas that are expressed in mucosal crypt cells. Expression is very weak compared to expression in the large intestine and is found only in a small part of the small intestinal tract; further evaluation of the small and large intestine is warranted.
Normal and inflamed adult mouse lungs: no signal.
Specific expression pattern of DNA54229-1366 using 5'UTR probe in mouse tissues
Results: The expression distribution of DNA54229-1366 was further evaluated in an extensive screening of normal mouse tissues. It has already been reported that the expression of DNA54229-1366 is restricted to colon epithelium by in situ hybridization.
Summary: Expression of DNA54229-1366 was specifically restricted to the colon epithelium with minimal extension into the cecal epithelium. Expression was strong and scattered in these epithelial cells. No expression was seen in the ileum, jejunum, duodenal base, or stomach. No expression was seen in the following normal mouse tissues: liver, kidney, spleen, bone marrow, lung, pancreas, stomach, duodenal base, jejunum, ileum, brain, skin, testis, or mammary gland. Expression restricted to the colon epithelium is interesting because of its uncommon distribution pattern.
Primers used for in situ hybridization of DNA54229-1366
54229. p1
5 "GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CCC TGA GCTTTC TGG AGA GTG 3" (SEQ ID NO: 19)
54229. p2
5 "CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GTG CAG GAGATC GTC TTA GGC 3" (SEQ ID NO: 20)
[0131]
DNA64889-1541
Expression of DNA64889-1541 by angiogenic tissue screening against additional new angiogenic tissue: pulmonary vasculitis, angiomyolipoma, invasive endometrial adenocarcinoma, diabetic ophthalmopathy, rheumatoid arthritis.
Results: Moderate to weak expression is seen in fetal epidermis, lung epithelium and stroma, esophageal epithelium, and skeletal muscle at 14.5 weeks. There is no detectable expression in normal adult tissues; endometrial carcinoma epithelium shows weak expression. One of the two human umbilical vein vascular endothelial (HUVEC) cell pellets shows weak expression.
Primers used for in situ hybridization of DNA64889-1541
64889. p1
5 "GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGC CCC CATGAC TCC TTA CCT 3" (SEQ ID NO: 21)
64889. p2
5 "CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCC ATC AGCACA CGC ATC TC3" (SEQ ID NO: 22)
[0132]
DNA65351-1366
Specific pattern of mouse DNA65351-1366 expression using 5'UTR probe in SPDI screening tissues, breast carcinoma and colon adenocarcinoma
Human fetal tissue:
No expression is found in fetal liver, lung, skeletal muscle, bone, spinal cord, blood vessels, heart, intestine, gonads, adrenal glands, and paravertebral ganglia. Fetal limb: weak signal in hematopoietic cells clustering in the medullary cavity of the long bone.
Rhesus monkey and chimpanzee tissues
Brain: no signal
Tongue: no signal
Stomach: weak and contradictory signals in glandular mucosa
Thyroid / parathyroid: no signal
Thymus: no signal
Nervous: no signal
Human normal and diseased tissues: no signal: thymus, brain, lung, adrenal gland, spleen, kidney (normal and degenerated), skin, umbilical cord, liver (normal and inflammatory), breast carcinoma, colon adenocarcinoma, mesenteric adipose tissue , Milk fat tissue.
Eye: weak signal in the inner ganglion eye layer.
65351. p1
5 ″ GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CGA GAG GCCGCT GCA GGA TGA 3 ″ (SEQ ID NO: 23)
65351. p2
5 "CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCC AGC TCCCCC GCA ACC C3" (SEQ ID NO: 24)
[0133]
Example 11: Use of PRO as a hybridization probe
The following method describes the use of a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide as a hybridization probe.
DNA containing the full-length or mature PRO coding sequence can be used as a probe for screening homologous DNAs (such as those encoding naturally occurring variants of PRO) in human tissue cDNA libraries or human tissue genomic libraries. .
Hybridization and washing of filters containing any of the library DNAs was performed under the following high stringency conditions. Hybridization of the radiolabeled PRO-derived probe to the filter was performed using 50% formamide, 5 × SSC, 0.1% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate, 50 mM sodium phosphate, pH 6.8, 2 × Denhardt's solution, and 10%. Performed in a solution of dextran sulfate at 42 ° C. for 20 hours. Washing of the filter was performed at 42 ° C. in an aqueous solution of 0.1 × SSC and 0.1% SDS.
DNA having the desired sequence identity with the DNA encoding the full-length native sequence PRO can then be identified using standard methods known in the art.
[0134]
Example 12: Expression of PRO in E. coli
This example illustrates the preparation of a non-glycosylated form of PRO by recombinant expression in E. coli.
The DNA sequence encoding PRO is first amplified using selected PCR primers. The primer must have a restriction enzyme site corresponding to the restriction enzyme site of the selected expression vector. Various expression vectors can be used. An example of a suitable vector is pBR322 (derived from E. coli; see Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)), which contains genes for ampicillin and tetracycline resistance. The vector is digested with restriction enzymes and dephosphorylated. The PCR amplified sequence is then ligated into a vector. The vector preferably comprises an antibiotic resistance gene, a trp promoter, a polyhis leader (including the first six STII codons, a polyhis sequence, and an enterokinase cleavage site), a PRO coding region, a lambda transcription terminator, and the argU gene. .
The ligation mixture is then used to transform an E. coli strain selected using the methods described in Sambrook et al., Supra. Transformants are identified by their ability to grow on LB plates, and antibiotic resistant clones are then selected. Plasmid DNA is isolated and confirmed by restriction analysis and DNA sequence analysis.
Selected clones can be grown overnight in a liquid medium such as LB broth supplemented with antibiotics. Overnight culture is subsequently used for seeding large-scale cultures. The cells are then grown to an optimal optical density, during which the expression promoter is turned on.
After culturing for several more hours, the cells can be harvested by centrifugation. The cell pellet obtained by centrifugation is solubilized using various reagents known in the art, and the solubilized PRO protein is then purified using a metal chelation column under conditions that tightly bind the protein. be able to.
[0135]
PRO may be expressed in Escherichia coli in the form of a poly-His tag using the following technique. The DNA encoding PRO is first amplified using the selected PCR primers. Primers provide restriction sites corresponding to those of the selected expression vector, and efficient and reliable translation initiation, rapid purification on metal chelating columns, and proteolytic removal with enterokinase Contains other useful sequences. The PCR-amplified poly-His tag sequence is then ligated into an expression vector, which is used to transform an E. coli host based on strain 52 (W3110 fuhA (tonA) long galErpoHts (httpRts) clpP (lacIq)). Transformants were initially grown in LB containing 50 mg / ml carbenicillin at 30 ° C. with shaking at 3-5 O.C. D. Grow to reach 600. The culture was then grown in CRAP medium (3.57 g of (NH4)2SO4, 0.71 g sodium citrate 2H2O, 1.07 g KCl, 5.36 g Difco yeast extract, 5.36 g Sheffield hycase SF in 500 mL water, and 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (W / v) glucose and 7 mM MgSO4And then grow for about 20-30 hours with shaking at 30 ° C. A sample is removed to confirm expression by SDS-PAGE analysis and the bulk culture is centrifuged to pellet the cells. The cell pellet is frozen until purification and refolding.
The E. coli paste from a 0.5 to 1 L fermentation (6-10 g pellet) is resuspended at 10 volumes (w / v) in 7 M guanidine, 20 mM Tris, pH 8 buffer. Add solid sodium sulfate and sodium tetrathionate to final concentrations of 0.1 M and 0.02 M, respectively, and stir the solution at 4 ° C. overnight. This step results in a denatured protein with all cysteine residues blocked by sulfitation. The solution is centrifuged at 40,000 rpm for 30 minutes in a Beckman Ultracentrifuge. The supernatant is diluted with 3-5 volumes of metal chelate column buffer (6M guanidine, 20 mM Tris, pH 7.4) and clarified by filtration through a 0.22 micron filter. The clarified extract is loaded onto a 5 ml Qiagen Ni-NTA metal chelate column equilibrated with a metal chelate column buffer. The column is washed with loading buffer containing 50 mM imidazole (Calbiochem, Utrol grade), pH 7.4. The protein is eluted with a buffer containing 250 mM imidazole. Fractions containing the desired protein are pooled and stored at 4 ° C. Protein concentration is estimated by its absorption at 280 nm using the extinction coefficient calculated based on its amino acid sequence.
[0136]
Slowly dilute the sample in a freshly prepared refolding buffer consisting of 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M urea, 5 mM cysteine, 20 mM glycine and 1 mM EDTA. To refold the protein. The refolding volume is chosen such that the final protein concentration is between 50 and 100 micrograms / ml. The refolding solution is slowly stirred at 4 ° C. for 12-36 hours. The refolding reaction is stopped by adding TFA at a final concentration of 0.4% (pH about 3). Before further purification of the protein, the solution is filtered through a 0.22 micron filter and acetonitrile is added to a final concentration of 2-10%. The refolded protein is chromatographed on a Poros R1 / H reverse phase column using elution with a 0.1% TFA transfer buffer and a 10-80% acetonitrile gradient. Aliquots of fractions with A280 absorbance are analyzed on SDS polyacrylamide gels and fractions containing homologous refolded proteins are pooled. In general, the correctly refolded species of most proteins elute at the lowest concentration of acetonitrile because these species are the most compact and their hydrophobic inner surfaces are shielded from interaction with reversed-phase resins. Is done. Aggregated species are usually eluted at higher acetonitrile concentrations. In addition to removing misfolded forms of the protein from the desired form, the reverse phase step also removes endotoxin from the sample.
Fractions containing the desired folded PRO polypeptide protein are pooled and acetonitrile is removed using a gentle stream of nitrogen directed at the solution. The protein was formulated into 20 mM Hepes, pH 6.8, containing 0.14 M sodium chloride and 4% mannitol by dialysis or gel filtration on G25 Superfine (Pharmacia) resin equilibrated with preparation buffer and sterile filtration.
As mentioned above, many of the PRO polypeptides disclosed herein have been successfully expressed.
[0137]
Example 13: Expression of PRO in mammalian cells
This example illustrates the preparation of a potentially glycosylated form of PRO by recombinant expression in mammalian cells.
The vector pRK5 (see EP 307,247 published March 15, 1989) is used as an expression vector. In some cases, the PRODNA is bound to pRK5 having the selected restriction enzyme, and the PRODNA is inserted using a ligation method described in Sambrook et al., Supra. The resulting vector is called, for example, pRK5-PRO.
In one embodiment, the selected host cells are 293 cells. Human 293 cells (ATCC CCL 1573) are grown to confluence in tissue culture plates in a medium such as DMEM supplemented with fetal calf serum and optionally nutrients and / or antibiotics. About 10 μg of pRK5-PRO DNA was mixed with about 1 μg of VARNA gene-encoding DNA [Thymmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)], and 500 μl of 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 MCaCl.2To dissolve. To this mixture was added dropwise, 500 μl of 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4Is added and a precipitate is formed at 25 ° C. for 10 minutes. The precipitate is suspended and added to 293 cells and stabilized at 37 ° C. for about 4 hours. The medium is aspirated and 2 ml of 20% glycerol in PBS is added for 30 seconds. The 293 cells are then washed with serum-free medium, fresh medium is added, and the cells are incubated for about 5 days.
About 24 hours after transfection, the medium was removed and medium (only) or 200 μCi / ml35S-cysteine and 200 μCi / ml35Replace with medium containing S-methionine. After a 12 hour incubation, the conditioned media is collected, concentrated on a spin filter, and loaded onto a 15% SDS gel. The treated gel is dried and exposed to the film for a selected period of time to reveal the presence of the PRO polypeptide. The medium containing the transfected cells is subjected to further incubation (with serum-free medium) and the medium is tested in the selected bioassay.
[0138]
In an alternative technology, PRO is disclosed in Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 12: 7575 (1981) using the dextran sulfate method. 293 cells are grown to maximum density in a spinner flask and 700 μg of pRK5-PRO is added. The cells are first concentrated from the spinner flask by centrifugation and washed with PBS. The DNA-dextran precipitate is incubated on the cell pellet for 4 hours. The cells are treated with 20% glycerol for 90 seconds, washed with tissue medium and re-introduced into a spinner flask containing tissue medium, 5 μg / ml bovine insulin and 0.1 μg / ml bovine transferrin. After about 4 days, the conditioned medium is centrifuged and filtered to remove cells and cell debris. The sample containing the expressed PRO is then concentrated and purified by a selected method such as dialysis and / or column chromatography.
In another embodiment, PRO can be expressed in CHO cells. pRK5-PRO is CaPO4Alternatively, CHO cells can be transfected using known reagents such as DEAE-dextran. As described above, incubate the cell culture medium and culture the culture medium (only) or35The medium can be replaced with a medium containing a radiolabel such as S-methionine. After determining the presence of the PRO polypeptide, the medium may be replaced with a serum-free medium. Preferably, the medium is incubated for about 6 days, and then the conditioned medium is collected. The medium containing the expressed PRO can then be concentrated and purified by any selected method.
Also, the epitope tag polypeptide may be expressed in host CHO cells. PRO may be subcloned outside of the pRK5 vector. The subclone insert can be subjected to PCR to fuse in frame with a selected epitope tag, such as a poly-his tag, in a baculovirus expression vector. The poly-his tag polypeptide insert can then be subcloned into an SV40 derived vector / enhancer containing a selectable marker such as DHFR for selection of stable clones. Finally, the CHO cells can be transfected (as described above) with the SV40 promoter / enhancer containing the vector. Labeling may be performed as described above to confirm expression. The medium containing the expressed poly-his tag PRO is then concentrated and Ni2+-Can be purified by any selected method such as chelate affinity chromatography.
PRO may also be expressed in CHO and / or COS cells by a transient expression method or in CHO cells by another stable expression method.
[0139]
Stable expression in CHO cells was performed using the following method. The protein may be an IgG construct (immunoadhesin) in which the coding sequence (eg, extracellular domain) of a soluble form of each protein is fused to an IgG1 constant region sequence that includes the hinge, CH2 and CH2 domains, and / or poly-his. Expressed as a tag form.
Following PCR amplification, each DNA is subcloned into a CHO expression vector using standard techniques as described in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). . CHO expression vectors have restriction sites compatible with the 5 'and 3' of the DNA of interest and are constructed to allow convenient shuttleing of the cDNA. Vectors used for expression in CHO cells are described in Lucas et al., Nucl. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996), using the SV40 early promoter / enhancer to control expression of the cDNA of interest and dihydrofolate reductase (DHFR). DHFR expression allows selection for stable maintenance of the plasmid following transfection.
Twelve micrograms of the desired plasmid DNA was prepared using the commercially available transfection reagent Superfect.R(Quiagen), DosperROr FugeneR(Boehringer Mannheim) into about 10 million CHO cells. Cells are grown as described in Lucas et al., Supra. About 3x10-7Cells are frozen in ampoules for further growth and production as described below. An ampoule containing the plasmid DNA is placed in a water bath, thawed, and mixed by vortexing. The contents were pipetted into a centrifuge tube containing 10 mL of medium and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant is aspirated and the cells are suspended in 10 mL of selection medium (0.2 μm filtered PS20, 5% 0.2 μm diafiltered fetal bovine serum). The cells are then split into 100 ml spinners containing 90 ml of selective medium. After 1-2 days, transfer the cells to a 250 mL spinner filled with 150 mL of selection medium and incubate at 37 ° C. After another 2-3 days, 250 mL, 500 mL and 2000 mL spinners were added to 3 × 105Seed at cells / mL. The cell culture medium is replaced by fresh medium by centrifugation and resuspended in production medium. Although any suitable CHO medium may be used, the production medium described in US Pat. No. 5,122,469, issued Jun. 16, 1992, was used in practice. 1.2x10 3L production spinner6Seed at cells / mL. On day 0, cell number and pH are measured. On
[0140]
For the poly-His tag construct, the protein is purified using a Ni-NTA column (Qiagen). Prior to purification, imidazole is added to the conditioned medium to a concentration of 5 mM. The conditioned medium was pumped at 4 ° C. at a flow rate of 4-5 ml / min onto a 6 ml Ni-NTA column equilibrated with 20 mM Hepes, pH 7.4 buffer containing 0.3 M NaCl and 5 mM imidazole. After loading, the column is further washed with equilibration buffer and the protein is eluted with equilibration buffer containing 0.25 M imidazole. The highly purified protein was subsequently desalted using 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) in a storage buffer containing 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl and 4% mannitol and stored at -80 ° C. .
The immunoadhesin (containing Fc) construct is purified from the conditioned medium as follows. The conditioned medium is pumped onto a 5 ml Protein A column (Pharmacia) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8. After loading, the column is washed thoroughly with equilibration buffer before eluting with 100 mM citric acid, pH 3.5. The eluted protein is immediately neutralized by collecting 1 ml fractions into tubes containing 275 μl of 1 M Tris buffer, pH 9. The highly purified protein is subsequently desalted in a storage buffer as described above for the poly-His tag protein. Homogeneity is assessed by SDS polyacrylamide gel and N-terminal amino acid sequencing by Edman degradation.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein have been successfully expressed as described above.
[0141]
Example 14: Expression of PRO in yeast
The following method describes the recombinant expression of PRO in yeast.
First, a yeast expression vector is created for the intracellular production or secretion of PRO from the ADH2 / GAPDH promoter. The DNA encoding PRO and the promoter are inserted into the appropriate restriction sites of the selected plasmid to direct intracellular expression of PRO. For secretion, the plasmid encoding the DNA encoding PRO may be added to a DNA encoding the ADH2 / GAPDH promoter, a native sequence PRO signal peptide or other mammalian signal peptide, or, for example, a yeast alpha factor or invertase secretion signal / It can be cloned with a leader sequence, and (if necessary) a linker sequence for PRO expression.
A yeast, such as yeast strain AB110, can then be transformed with the expression plasmid described above and cultured in a selected fermentation medium. The transformed yeast supernatant can be analyzed by precipitation with 10% trichloroacetic acid and separation by SDS-PAGE, followed by staining the gel with Coomassie blue staining.
The recombinant PRO can then be isolated and purified by removing the yeast cells from the fermentation medium by centrifugation and then concentrating the medium using a selected cartridge filter. The concentrate containing PRO may be further purified using a selected column chromatography resin.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein have been successfully expressed as described above.
[0142]
Example 15: Expression of PRO in insect cells infected with baculovirus
The following method describes the recombinant expression of PRO in baculovirus infected insect cells.
The sequence encoding PRO is fused upstream of an epitope tag contained in a baculovirus expression vector. Such epitope tags include poly-his tags and immunoglobulin tags (such as the Fc region of an IgG). A variety of plasmids can be used, including those derived from commercially available plasmids such as pVL1393 (Novagen). Briefly, the sequence encoding PRO or a desired portion of the coding sequence of PRO, such as the sequence encoding the extracellular domain of a transmembrane protein or the sequence encoding a mature protein when the protein is extracellular, is 5 ′ and Amplified by PCR with primers complementary to the 3 'region. The 5 'primer may include a flanking (selected) restriction enzyme site. The product is then digested with the selected restriction enzymes and subcloned into an expression vector.
Recombinant baculovirus was obtained from the above plasmid and BaculoGoldTMIt is created by co-transfecting viral DNA (Pharmingen) into Spodoptera frugiperda ("Sf9") cells (ATCC CRL 1711) using lipofectin (commercially available from GIBCO-BRL). After incubation at 28 ° C. for 4-5 days, the released virus is recovered and used for further amplification. Viral infection and protein expression are performed as described in O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
[0143]
Next, the expressed poly-his tag PRO is, for example, Ni2+-It can be purified by chelate affinity chromatography as follows. Extractions are prepared from virus-infected recombinant Sf9 cells as described in Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Briefly, Sf9 cells were washed and sonicated in buffer (25 mL Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl 2).20.1 mM EDTA; 10% glycerol; 0.1% NP-40; 0.4M KCl) and sonicated twice on ice for 20 seconds. The sonicate is clarified by centrifugation, and the supernatant is diluted 50-fold with loading buffer (50 mM phosphate, 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.8) and filtered through a 0.45 μm filter. Ni2+-Prepare a NTA agarose column (commercially available from Qiagen) in a total volume of 5 mL, wash with 25 mL of water and equilibrate with 25 mL of loading buffer. Load the filtered cell extract into the column at 0.5 mL per minute. Column A is the point where fraction collection starts.2 80Wash with filling buffer to baseline. Next, the column is washed with a secondary wash buffer (50 mM phosphate; 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 6.0), which elutes the bound protein non-specifically. A280After reaching the baseline again, the column is developed with a 0 to 500 mM imidazole gradient in the secondary wash buffer. One mL fractions were collected and analyzed by SDS-PAGE and silver staining or Ni bound to alkaline phosphatase (Qiagen).2+-Analyze by Western blot with NTA. His eluted10-Pool the fractions containing the tag PRO and dialyze against the loading buffer.
Alternatively, purification of the IgG-tag (or Fc-tag) PRO can be performed using known chromatography techniques, including, for example, protein A or protein G column chromatography.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein have been successfully expressed as described above.
[0144]
Example 16: Preparation of antibodies that bind to PRO
This example illustrates the preparation of a monoclonal antibody that can specifically bind to PRO.
Techniques for the production of monoclonal antibodies are known in the art and are described, for example, in Goding, supra. Immunogens that can be used include purified PRO of the present invention, fusion proteins containing PRO, and cells that express PRO on the cell surface. The selection of an immunogen can be made by one skilled in the art without undue experimentation.
Mice, such as Balb / c, are immunized with PRO immunogen emulsified in complete Freund's adjuvant and injected subcutaneously or intraperitoneally in amounts of 1-100 micrograms. Alternatively, the immunogen is emulsified in MPL-TDM adjuvant (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) and injected into the animal's hind footpad. The immunized mice are then boosted 10 to 12 days later with an additional immunogen emulsified in the selected adjuvant. The mice are then boosted with additional immunization injections for several weeks. Serum samples from retro-orbital bleeds may be periodically collected from mice for testing in an ELISA assay for detection of anti-PRO antibodies. After a suitable antibody titer has been detected, animals that are "positive" for the antibody can be injected with the last intravenous injection of PRO. Three to four days later, the mice are sacrificed and spleen cells are removed. The spleen cells were then purified (using 35% polyethylene glycol) from P3X63AgU. Fused to one or more selected mouse myeloma cell lines. The fusion produces hybridoma cells, which are then plated in 96-well tissue culture plates containing HAT (hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) medium to inhibit the growth of unfused cells, myeloma hybrids, and spleen cell hybrids.
Hybridoma cells are screened by ELISA for reactivity to PRO. Determination of “positive” hybridoma cells secreting the desired monoclonal antibody to PRO is within the skill of the art.
Positive hybridoma cells are injected intraperitoneally into syngeneic Balb / c mice to generate ascites containing anti-PRO monoclonal antibodies. Alternatively, the hybridoma cells can be grown in tissue culture flasks or roller bottles. Purification of the monoclonal antibodies produced in ascites can be performed using ammonium sulfate precipitation, followed by gel exclusion chromatography. Alternatively, affinity chromatography based on the binding of the antibody to protein A or protein G can be used.
[0145]
Example 17: Purification of PRO polypeptide using specific antibodies
Native or recombinant PRO polypeptides can be purified by various standard protein purification methods in the art. For example, a pro-PRO, mature, or pre-PRO polypeptide is purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for the PRO polypeptide of interest. Generally, immunoaffinity columns are made by covalently attaching an anti-PRO polypeptide antibody to an activated chromatography resin.
Polyclonal immunoglobulins are prepared from immune sera either by precipitation with ammonium sulfate or by purification on immobilized Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Similarly, monoclonal antibodies are prepared from mouse ascites fluid by ammonium sulfate precipitation or chromatography on immobilized Protein A. The partially purified immunoglobulin is CnBr-activated SepharoseTM(Pharmacia LKB Biotechnology) or the like. The antibody is bound to the resin, the resin is blocked, and the derivative resin is washed according to the manufacturer's instructions.
Such immunoaffinity columns are utilized in the purification of PRO polypeptide by preparing fractions from cells containing the soluble form of the PRO polypeptide. This preparation is induced by the addition of detergent or solubilization of the whole cell or cell component fraction obtained via differential centrifugation by methods known in the art. Alternatively, the solubilized PRO polypeptide containing the signal sequence is secreted in useful amounts into the medium in which the cells are growing.
The solubilized PRO polypeptide-containing preparation is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow for favorable adsorption of the PRO polypeptide (eg, a high ionic strength buffer in the presence of a detergent). The column is then eluted under conditions that disrupt antibody / PRO polypeptide binding (eg, low pH, such as about 2-3, or high concentrations of chaotropes such as urea or thiocyanate ions), and the PRO polypeptide is recovered. You.
[0146]
Example 18: Drug screening
The invention is particularly useful for screening compounds by using the PRO polypeptides or binding fragments thereof in any of a variety of drug screening techniques. The PRO polypeptide or fragment used in such a test may be free in solution, immobilized on a solid support, carried on the cell surface, or located intracellularly. One method of drug screening utilizes eukaryotic or prokaryotic host cells that are stably transfected with a recombinant nucleic acid expressing a PRO polypeptide or fragment. Agents are screened against such transfected cells in a competitive binding assay. Such cells, either in viable or immobilized form, can be used for standard binding assays. For example, the formation of a complex between the PRO polypeptide or fragment and the reagent being tested may be measured. Alternatively, the reduction in complex formation between the PRO polypeptide and its target cell or target receptor caused by the reagent being tested can be tested.
Accordingly, the present invention provides a method of screening for a drug or any other reagent that can affect a PRO polypeptide-related disease or condition. These methods include contacting the reagent with a PRO polypeptide or fragment, (i) for the presence of a complex between the reagent and the PRO polypeptide or fragment, or (ii) reacting the PRO polypeptide or fragment with a cell. Assaying for the presence of the complex between them in a manner well known in the art. In these competitive binding assays, the PRO polypeptide or fragment is typically labeled. After appropriate incubation, the free PRO polypeptide or fragment is separated from that in bound form, and the amount of free or unconjugated label is determined by the amount of the particular reagent bound to the PRO polypeptide or the PRO polypeptide / cell complex Is a measure of the ability to inhibit
Other techniques for drug screening provide high-throughput screening for compounds with appropriate binding affinity for the polypeptide and are described in detail in WO 84/03564 published September 13, 1984. ing. Briefly, a number of different small peptide test compounds are synthesized on a solid support such as a plastic pin or some other surface. When applied to a PRO polypeptide, the peptide test compound reacts with the PRO polypeptide and is washed. Bound PRO polypeptide is detected by methods well known in the art. Purified PRO polypeptide can also be coated directly on a plate for use in the drug screening techniques described above. In addition, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.
The invention also contemplates that neutralizing antibodies capable of binding the PRO polypeptide be used in competitive drug screening assays in which the test compound specifically competes with the test compound for the PRO polypeptide or a fragment thereof. In this method, the antibodies can be used to detect the presence of any peptide having one or more antigenic determinants on the PRO polypeptide.
[0147]
Example 19: Rational drug design
The purpose of rational drug design is to produce structurally analogous biologically active polypeptides of interest (eg, PRO polypeptides) or small molecules with which they interact, eg, agonists, antagonists, or inhibitors. . Any of these examples can be used to create more active and stable forms of the PRO polypeptide or drugs that enhance or inhibit the function of the PRO polypeptide in vivo (see Hodgson, Bio / Technology, 9:19). -21 (1991)).
In one method, the three-dimensional structure of a PRO polypeptide or PRO polypeptide-inhibitor complex is determined by X-ray crystallography, by computer modeling, and most typically by a combination of the two methods. In order to elucidate the structure of the molecule and determine the active site, both the shape and charge of the PRO polypeptide must be ascertained. To a lesser extent, useful information about the structure of the PRO polypeptide may be gained by modeling based on the structure of homologous proteins. In both cases, the relevant structural information is used to design analogous PRO polypeptide-like molecules or to identify effective inhibitors. Useful examples of rational drug design include molecules with enhanced activity or stability, as set forth in Braxton and Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992), or Athauda et al. Biochem. , 113: 742-746 (1993), including molecules that act as inhibitors, agonists, or antagonists of the natural peptide.
It is also possible to isolate the target-specific antibody selected by the functional assay as described above and to elucidate its crystal structure. This approach, in principle, produces a pharmacore upon which subsequent drug design can be based. By generating anti-idiotypic antibodies (anti-ids) to functional, pharmacologically active antibodies, protein crystallography can be bypassed. As a mirror image of the mirror image, the binding site of the anti-ids can be expected to be an analog of the original receptor. Anti-ids can then be used to identify and isolate peptides from banks of chemically or biologically produced peptides. The isolated peptide will function as a pharmacore.
In accordance with the present invention, sufficient quantities of the PRO polypeptide are available to perform analytical experiments such as X-ray crystallography. In addition, knowledge of the PRO polypeptide amino acid sequence provided herein provides guidance for use in computer modeling techniques that replaces or adds to X-ray crystallography.
[0148]
The written description above is considered sufficient for those skilled in the art to practice the invention. The deposited examples are by way of illustration of one aspect of the invention, and because any functionally equivalent construct is within the scope of the invention, the deposited construct will limit the scope of the invention. It is not limited. The deposit of material herein is not an admission that the written description contained herein is not sufficient to enable practice of any aspect of the invention, including its best mode, as it represents. It is not to be construed as limiting the claim to any particular illustration. Indeed, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and fall within the scope of the appended claims.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the native sequence PRO1081 cDNA, SEQ ID NO: 1 is a clone referred to herein as “DNA54229-1366”.
FIG. 2 is a diagram showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG.
FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1274 cDNA (SEQ ID NO: 3), which is a clone referred to herein as “DNA64889-1541”.
FIG. 4 is a view showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 3 shown in FIG.
FIG. 5 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1199 cDNA (SEQ ID NO: 5), which is a clone referred to herein as “DNA65351-1366”.
FIG. 6 is a diagram showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 5 shown in FIG.
FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1754 cDNA (SEQ ID NO: 7), which is a clone designated herein as "DNA76385-1692".
FIG. 8 is a view showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 7 shown in FIG.
FIG. 9 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1556 cDNA (SEQ ID NO: 9), which is a clone designated herein as “DNA76529-1666”.
FIG. 10 is a view showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 9 shown in FIG. 9;
FIGS. 11A-11B show the nucleotide sequence of native sequence PRO4401 cDNA (SEQ ID NO: 11), which is a clone designated herein as "DNA84912-2610".
FIG. 12 is a diagram showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 11 shown in FIGS. 11A-11B.
FIG. 13 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9912 cDNA (SEQ ID NO: 13), which is a clone designated herein as “DNA108700-2802”.
FIG. 14 is a view showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 13 shown in FIG.
FIG. 15 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO10268 cDNA (SEQ ID NO: 15), which is a clone referred to herein as “DNA145583-2820”.
FIG. 16 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 16 shown in FIG.
FIG. 17 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO10272 cDNA (SEQ ID NO: 17), which is a clone designated herein as “DNA147531-2821”.
FIG. 18 is a view showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 17 shown in FIG.
Claims (36)
（ｂ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）又は図１８（配列番号：１８）に示すポリペプチドをコードし、その関連シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列；
（ｃ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）又は図１８（配列番号：１８）に示すポリペプチドの細胞外ドメインをコードし、その関連シグナルペプチドを伴うヌクレオチド配列；又は
（ｄ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）又は図１８（配列番号：１８）に示すポリペプチドの細胞外ドメインをコードし、その関連シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列；
に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。(A) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. (SEQ ID NO: 12), a nucleotide sequence encoding the polypeptide shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16) or FIG. 18 (SEQ ID NO: 18);
(B) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. (SEQ ID NO: 12), a nucleotide sequence encoding the polypeptide shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16) or FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), and lacking its associated signal peptide;
(C) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. (SEQ ID NO: 12), the extracellular domain of the polypeptide shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16) or FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), and its associated signal peptide (D) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10) encoding the extracellular domain of the polypeptide shown in FIG. 12 (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16) or FIG. 18 (SEQ ID NO: 18); A nucleotide sequence lacking its associated signal peptide;
An isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to a nucleic acid.
（ｂ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）又は図１８（配列番号：１８）に示すポリペプチドのアミノ酸配列で、その関連シグナルペプチドを欠くアミノ酸配列；
（ｃ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）又は図１８（配列番号：１８）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列で、その関連シグナルペプチドを伴うアミノ酸配列；又は
（ｄ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）又は図１８（配列番号：１８）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列で、その関連シグナルペプチドを欠くアミノ酸配列；
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。(A) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. (SEQ ID NO: 12), the amino acid sequence of the polypeptide shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16) or FIG. 18 (SEQ ID NO: 18);
(B) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. (SEQ ID NO: 12), the amino acid sequence of the polypeptide shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16) or FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), which lacks the relevant signal peptide ;
(C) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. (SEQ ID NO: 12), the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16) or FIG. (D) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. : 10), the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in Fig. 12 (SEQ ID NO: 12), Fig. 14 (SEQ ID NO: 14), Fig. 16 (SEQ ID NO: 16) or Fig. 18 (SEQ ID NO: 18). An amino acid sequence lacking its associated signal peptide;
An isolated polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to a polypeptide.
前記容器上のラベル；及び
前記容器に収容される（ａ）請求項１０に記載のポリペプチド、（ｂ）該ポリペプチドのアゴニスト、（ｃ）該ポリペプチドのアンタゴニスト、又は（ｄ）該ポリペプチドに結合する抗体を含有する組成物と、を含んでなる製造品であって、前記容器上のラベルが、前記組成物が免疫関連疾患の治療に使用できることを示している製造品。container;
A label on the container; and (a) the polypeptide of claim 10, (b) an agonist of the polypeptide, (c) an antagonist of the polypeptide, or (d) the polypeptide contained in the container. An article of manufacture comprising an antibody that binds to an antibody, wherein the label on the container indicates that the composition can be used to treat an immune-related disease.
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