JP2003529349A

JP2003529349A - 骨障害の治療

Info

Publication number: JP2003529349A
Application number: JP2001560355A
Authority: JP
Inventors: ヒューエス．キーピング; ジョナサンエス．ライヒナー
Original assignee: ロードアイランドホスピタル，アライフスパンパートナー
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2003-10-07
Also published as: AU2001236849A1; CA2399705A1; WO2001060983A2; US20040126364A1; WO2001060983A3; EP1263933A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、骨組織を構成（または再構成）するための組成物、および例えば組換えヒトインターロイキン-4（rhIL-4）などの抗炎症性組成物を送達する方法を提供する。該組成物は、生骨芽前駆細胞（OPC）または歯前駆細胞から生成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は、骨損失障害に関する。破局的骨損失、すなわち骨溶解は、リウマチ
様関節炎、骨転移、無菌性人工関節弛緩および歯周炎を含む、一連の疾患状態の
衰弱性病理学的結果である。リウマチ様関節炎（RA）は、長期の能力障害および
死亡率上昇を引き起こすことの多い、慢性炎症性疾患である。

【０００２】発明の概要本発明は、骨組織を形成（または再形成）するための組成物、および抗炎症性
組成物、例えば組換えヒトインターロイキン-4（rhIL-4）を送達する方法を提供
する。組成物は、生骨芽前駆細胞（OPC）または歯前駆細胞から生成される。細
胞は、骨分解を阻害するために、骨の移植の特異的部位での抗炎症性ポリペプチ
ドの発現を指示する、調節可能で誘導可能な骨芽細胞特異的プロモーターを含む
、遺伝子改変されたウイルスまたは非ウイルスプラスミドベクターを含む。例え
ば、骨間質細胞は自己または同種歯周靭帯から単離し、エキソビボで操作を行っ
てから、レシピエント患者に移植する。間質細胞は、細胞外マトリクス（ECM）
成分の存在下で培養して、歯前駆細胞に分化させる。例えばECMは、BMP-6などの
骨形成タンパク質（BMP）を含む。前駆細胞への分化の誘導は、細胞の遺伝子操
作の前または後に実施する。

【０００３】好ましくは、細胞が移入または形質導入される核酸は、抗炎症性サイトカイン
またはサイトカインの抗炎症性断片をコードする。例えば、サイトカインはイン
ターロイキン-4（IL-4）である。核酸は、配列番号：1のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードし、例えば核酸は、配列番号：2の塩基配列のコード領域を
含む。

【０００４】

【表１】ヒトIL-4アミノ酸配列

【０００５】

【表２】ヒトIL-4塩基配列

【０００６】または、細胞は、IL-4断片、作用物質または突然変異体をコードする核酸を含
む。断片、作用物質または突然変異体は、抗炎症活性を有する。例えば、突然変
異体は、IL-2Rγへの結合内に含まれるIL-4の領域内に突然変異を含む。例えばA
rg21はGlu残基に変化する。配列番号：2のコード配列とは異なる配列は、ストリ
ンジェントな条件下で参照配列の全部または一部とハイブリダイズし、抗炎症性
ペプチドをコードする。プロモーターまたは参照配列とは異なる転写調節領域は
、ストリンジェントな条件下で、参照配列を持つ核酸にハイブリダイズして、参
照配列の、例えば細胞特異性などの転写調節機能を保持する。例えば核酸は、参
照配列について1つまたはそれ以上の改変を含むことがある。そのような改変は
、参照配列と比べて、1つまたはそれ以上のヌクレオチドの突然変異、欠失およ
び／または付加によって得られる。改変は、調節配列の活性を変化させるために
、例えばプロモーター活性を向上させるために、転写阻害領域を抑制するために
、プロモーターを構成的または調節可能に、またはその逆にするために導入され
る。改変は、制限部位を導入して、次のクローニング工程を行いやすくするため
に、または転写活性には必須ではない配列を除去するためにも行われる。好まし
くは、改変配列は少なくとも70％（より好ましくは少なくとも80％、さらに好ま
しくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少
なくとも99％）が参照配列と同一である。改変は、参照配列に関連するポリペプ
チドの生物機能または転写プロモーター機能の細胞特異性を実質的に変化させな
い。

【０００７】ヌクレオチドおよびアミノ酸の比較は、レーザージーン（Lasergene）ソフト
ウェアパッケージ（DNASTAR, Inc、Madison、WI）を用いて実施した。使用した
メガライン（MegAlign）モジュールは、クラスタル（Clustal）V法（Higginsら
、1989、CABIOS 5（2）、151〜153）であった。使用したパラメータは、ギャッ
プペナルティ10、ギャップ長ペナルティ10であった。

【０００８】または、所与の参照配列とは異なる核酸は高いストリンジェンシーで、参照配
列を有するDNA鎖、またはその相補鎖にハイブリダイズする。ハイブリダイゼー
ションは、アウスベル（Ausubel）ら（「最新の分子生物学プロトコール（Curre
nt Protocols in Molecular Biology）」、John Wiely ＆ Sons、1989）に述べ
られているような標準方法を用いて実施する。「高いストリンジェンシー」とは
、高温および低塩濃度を特徴とする核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件
を指す。すなわち42℃および50％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション、
65℃での2×SSCおよび1％SDSによる1回目の洗浄、それに続く65℃での0.2％×SS
C、0.190SDSによる洗浄を指す。参照遺伝子または配列に対して約50％の配列同
一性を有するDNA配列を検出するのに適した、さらに低いストリンジェンシー条
件は、ホルムアミドなしの42℃でのハイブリダイゼーション、6×SSCおよび1％S
DS中での42℃における1回目の洗浄、それに続く6×SSCおよび1％SDS中での50℃
における2回目の洗浄によって検出される。

【０００９】ポリペプチド（例えばIL-4）をコードする異種核酸は、オステオカルシンプロ
モーター配列（例えば配列番号：3の塩基配列を含む核酸）または骨シアロタン
パク質プロモーター配列（配列番号：4のヌクレオチド1〜2472位）または象牙質
シアロタンパク質プロモーター配列（配列番号：6および／または7）などの、骨
芽細胞特異的プロモーターに機能的に連結されている。

【００１０】

【表３】ヒトオステオカルシン制御領域

【００１１】

【表４】マウス骨シアロタンパク質プロモーター領域およびcDNA

【００１２】

【表５】ラット骨シアロタンパク質プロモーター領域

【００１３】

【表６】マウス象牙質シアロタンパク質遺伝子制御領域（5'からエキソン1）

【００１４】

【表７】マウス象牙質シアロタンパク質遺伝子制御領域（エキソン1とエキソ
ン2の間のイントロン）

【００１５】核酸の発現は好ましくは、誘導可能である。骨芽細胞または象牙芽細胞転写制
御DNAを用いて、IL-4または他の抗炎症性ポリペプチドの発現を転写単位で制御
する。例えば配列番号：3、4、5、6または7の一部を含み、歯前駆細胞またはOPC
（他の細胞種に比較して）における転写を優先的に指示するよう機能する、その
ようなプロモーターの切断断片が使用できる。制御配列、例えばシス作用細胞特
異的転写制御領域は、転写単位で、異種核酸配列に対して5'に配置される。参照
配列で特定化された1個の核酸配列の全部または一部、その相補鎖またはその変
異体を用いて、異種核酸配列の転写を指示することができる。核酸断片は、参照
塩基配列の1つまたはその相補配列と同じ長さの一部と同一の、少なくとも20個
の連続ヌクレオチドの一部である。

【００１６】異種ポリペプチドコード配列の発現は、本発明の細胞を、テトラサイクリンま
たはテトラサイクリン類似体（例えばミノサイクリンまたはドキシサイクリン）
などの抗生物質化合物と接触させることによって制御される。例えば、テトラサ
イクリンは、例えば歯周手術の少なくとも2日前、本発明の細胞の移植時、およ
び／または手術後および／または移植後の少なくとも2日間に全身投与する。細
胞による異種ポリペプチドは、抗生物質が組織に存在する間に、すなわち細胞移
植レシピエントに投与されている間に発現する。組換え抗炎症性ポリペプチドの
発現は、抗生物質投与の中止後に低下および停止する。通常、抗生物質は、手術
前の8〜12日間と手術後の8〜12日間に投与する。同様に、抗生物質は整形外科手
術、例えば関節からの軟骨除去手術、転移性骨癌の除去手術（その際に患部組織
またはその隣接部位に細胞が移植される）の前後に投与される。細胞は、歯整形
補綴移植の、前、最中または後に移植してもよい。進行性の歯周疾患を治療する
ためには、顎の下顎部内の歯周靭帯に細胞を局所的に投与する。骨損失、例えば
歯槽骨損失につながる可能性のある進行性の歯周病または他の骨障害に苦しむ、
またはその危険に瀕している哺乳類、例えばヒト患者の骨溶解を阻害するために
細胞を使用することによって、臨床上の利点が与えられる。

【００１７】本明細書で述べる方法は、例えばイヌ、ネコ、ウマを治療するための獣医学用
途にも適用できる。

【００１８】本発明は、抗炎症性ポリペプチドをコードする核酸を含むように遺伝子改変さ
れたOPCを含む。OPCは骨髄間質細胞に由来し、ECMの存在下にてエキソビボで分
化されている。上述したように、OPCは好ましくは、骨芽細胞に分化された細胞
内でそれが優先的に連結される核酸の転写を指示するプロモーターに機能的に連
結された、IL-4などのサイトカインまたはその作用物質をコードする核酸を含む
。

【００１９】骨障害の治療では、細胞はレシピエント哺乳類の骨髄中、または哺乳類の関節
中に移植される。例えば、細胞は脛骨内または大腿骨内投与される。細胞は、例
えば骨損失部位または、例えば骨髄中などのそのような部位の隣接部位に局所的
に移植され、組換えポリペプチドの細胞による発現は、ミノサイクリンまたはド
キシサイクリンなどの抗生物質を全身投与することによって制御される。細胞を
哺乳類の骨髄に移植する方法は、米国特許第4,188,486号で述べられているよう
に、当技術分野で周知である。投与する細胞の用量は、移植の位置に適した量中
に1×10⁵細胞〜1×10¹⁰細胞の範囲である（例えば大腿骨骨髄への移植と比べて
、下顎組織または歯周靭帯への移植に使用される量は少ない）。そのような移植
手順の臨床プロトコールは当技術分野で周知である。大腿骨骨髄には、例えば体
重1kgあたり1×10⁸細胞の用量が投与される。リウマチ様関節炎などの長期疾患
の場合には、反復移植が必要なことがある。

【００２０】シクロオキシゲナーゼII（COX-2）阻害剤または腫瘍壊死因子-α（TNFα）が
選択的に投与される。COX阻害剤には、アスピリン、イブプロフェンおよびイン
ドメタシンはもちろんのこと、ビスアリールCOX-2阻害化合物（例えば、米国特
許第5,994,379号に記載されているような）および（メチルスルホニル）フェニ
ル-2-(5H)-フラノン（例えば、米国特許第6,020,343号に記載されているような
）が含まれる。

【００２１】単離された遺伝子改変OPCを用いて、リウマチ様関節炎、骨粗鬆症、先端周囲
または軟骨性骨損失などの進行性骨損失障害、人工関節粒子誘導性骨溶解、骨折
または欠損、原発性または続発性副甲状腺機能亢進症、転移性骨疾患、溶骨性骨
疾患、形成後手術、補綴連結後手術で苦しんでいる、またはその危機に瀕してい
る患者を治療する。

【００２２】「骨芽前駆体」という語は、骨間質細胞に由来する、分化した骨前駆細胞を意
味する。「歯前駆体」という語は、歯周靭帯に由来する、分化した骨前駆細胞を
意味する。骨髄間質細胞または靭帯由来細胞の分化状態は、ECMの存在下での培
養によって誘導される。細胞は好ましくは、BMP-2、4または6などのBMPの存在下
で培養される。分化した前駆細胞は、未分化の間質細胞と比較して、骨組織を生
成する能力が向上している。OPCすなわち歯前駆細胞は、アルカリホスファター
ゼの生成、オステオカルシンの発現、および骨シアロタンパク質の発現（歯前駆
体の場合の象牙質シアロタンパク質に加えて）によって、骨間質細胞（脂肪、筋
肉または軟骨細胞もしくは組織と同様に）と区別される。

【００２３】本発明のエキソビボ細胞による治療方法は、標準の遺伝子治療プロトコールに
勝る利点がいくつかある。例えば、組換え抗炎症性ポリペプチドを発現する細胞
は、望ましい表現型を持たない細胞から単離、すなわち精製される。単離された
OPCすなわち歯前駆細胞の個体群はそれぞれ、少なくとも75％、より好ましくは8
5％、さらに好ましくは90％、さらに好ましくは95％、さらに好ましくは98％、
より好ましくは99％または100％のOPCすなわち歯前駆細胞である。

【００２４】 DNAは単離細胞にエキソビボで導入されるため、DNAが体内の非標的細胞に摂取
される可能性は避けられるか、最小限となる。安全性の別の手段は、転写制御領
域および単離細胞種のみでの転写を指示するプロモーターを使用することによっ
て付与される。インビボの組換えポリペプチドの発現は、抗生物質または抗生物
質類似体の全身投与によってさらに制御される。

【００２５】 OPCは骨髄吸引液からの間質細胞から単離および増殖され、自己骨髄間質細胞
が増殖される。細胞は選択的に凍結され、液体窒素中で長期間、分化および形質
導入されるまで保管される。これらの「保存された」自己細胞によって、長期間
にわたって複数回の接種が可能となり、RAは何年も持続するため、このことは有
利である。

【００２６】本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から
明らかになると思われる。

【００２７】詳細な説明溶骨性病変部位へのrhIL-4の細胞による送達によって、例えばマクロファージ
などの炎症効果細胞と、例えば溶骨細胞前駆細胞などの溶骨効果細胞が位置して
いる炎症部位付近で、rhIL-4を濃縮することができる。胸腺細胞およびT細胞機
能に対するrhIL-4の副作用は、全身的に送達された場合に体全体で機能するのに
対して、サイトカインが局所的に作用するため、大きく減少する。

【００２８】本明細書で述べる細胞は、骨芽細胞系統に関係づけられる。分化は、骨形態形
成タンパク質の存在下で、細胞をマトリゲル（Matrigel)（Becton Dickenson）
などの細胞外マトリクスまたは他の市販のマトリクス調製物に曝露させることで
分化する、骨髄間質細胞を刺激することによって誘導された。本工程は通常、1
つまたはそれ以上の治療用タンパク質をコードする遺伝子を含むレトロウイルス
発現ベクターを用いて、分化細胞に形質導入する前に実施する。これは、形質導
入細胞が一度インビボで移植されると、軟骨、筋肉または脂肪細胞に分化できな
いという点で有利である。これに対して、骨芽細胞前の多能性骨髄間質細胞はな
お分化する可能性を保持している。

【００２９】ウイルスプロモーターを使用する、先行技術で用いられたレトロウイルスベク
ターとは異なり、OPC内のレトロウイルス発現ベクターは、逆トランス活性化因
子のテトラサイクリン活性因子（rtTA）遺伝子の転写を開始する骨芽細胞特異的
プロモーターを使用するように構築されている。テトラサイクリン活性因子は次
に、rhIL-4治療用タンパク質の生成を制御する。この手法によって、骨芽細胞プ
ロモーターがOPC内で（間質細胞などの他の細胞種と比較して）さらに効果的に
転写を指示し、ウイルスプロモーターよりもインビボではるかに不活性化されに
くいため、安全性の向上という利点をもたらす。例えば、ウイルスベクターは、
インターロイキン-4コード配列の発現を制御するドキシサイクリン誘導系を含む
。

【００３０】本明細書で述べるOPCは、α-5インテグリン受容体の発現を向上させるように
改変された。この改変によって、細胞はインビボに移植された場合に骨マトリク
スタンパク質に付着できるようになり、このことにより、OPCを例えば多孔性リ
ン酸カルシウムセラミックキューブまたは他の種類のカプセル化デバイスなどに
事前にカプセル化せずに、溶骨部位に直接挿入できるという、さらなる利点がも
たらされる。

【００３１】細胞は自己または同種間細胞移植に用いられ、部位特異的の、制御された方法
で、組換えヒトインターロイキン-4（rhIL-4）タンパク質を送達する、細胞によ
るプラットフォームとして作用する。RhIL-4は、OPCが溶骨性骨病変部位に移植
されると、規定された細胞種に作用する。rhIL-4を生成するように遺伝子改変さ
れたOPCは、i）抗癌剤とともに使用した場合に腫瘍縮小を促進する、ii）骨を再
吸収する溶骨細胞の形成を阻害する、およびiii）新しい骨の成長を刺激するた
めに使用する。本方法により、臨床結果が改善される。rhIL-4を分泌するよう改
変されたOPCは、移植誘導性骨溶解の発生により人工関節交換の修正を受けてい
る患者はもちろんのこと、リウマチ様関節炎による骨損失に苦しむ患者や、重篤
な歯周疾患による口腔に移植してもよい。

【００３２】IL-4およびその作用物質 IL-4、すなわち主としてTh2細胞およびマクロファージによって生成される抗
炎症性サイトカインは、抗炎症および免疫抑制特性を示す。例えば分化した骨芽
前駆細胞または歯前駆細胞などの骨由来細胞は、組換えヒトインターロイキン-4
（rhIL-4）を生成するよう遺伝子改変され、患部骨組織に投与される。本発明は
、細胞特異的プロモーターを含むウイルスプラスミド発現系によって、部分に分
化している骨髄間質細胞を標的とすることによって、rhIL-4を炎症関節に局所的
に送達する遺伝子治療法を提供する。高い局所または全身濃度によるrhIL-4の潜
在的に危険な影響を防止するために、rhIL-4の生成は抗生物質類似体の経口投与
によって制御する。リウマチ様関節炎に関連する、関節軟骨分解および骨再吸収
は、組織損傷部位付近でのIL-4の局所的な制御放出によって著しく減少する。軟
骨分解および骨損失が減少する機構は、IL-4が血管形成を減少させる能力ととも
に、IL-4がTNF-α、IL-1およびPGE2の生成を阻害する能力に基づいている。IL-4
の制御された局所放出によって、インビボでの軟骨および骨破壊が減少する。IL
-4は、移植細胞が（自己ではなく）同種間である場合には、免疫抑制特性も持っ
ており、移植細胞によって生成されるIL-4によって、組織拒絶に打ち勝つ全身性
免疫抑制剤を投与する必要がなくなる場合がある。

【００３３】実施例1 C3H10T1/2細胞に由来する骨誘導性細胞外マトリクスを含むBMP-6上で
のウサギ骨髄間質細胞の分化米国では毎年、185,000件を超える脊髄関節固定が実施され、最も一般的に実
施される手順、後外側腰部横突間突起融合では、35％という高い非癒合率が報告
された。自己腸骨稜骨は、最も基本的な移植材料であるが、量が限られており、
収集物の罹患率は低くはない。本明細書で述べるデータは、BMPが骨髄からの多
分化能間質細胞のウサギ骨芽細胞系統への分化を誘導することを示している。骨
芽細胞系統間質細胞は、構成的にBMP-6のmRNAを発現または過剰発現する形質移
入マウス細胞系が分泌したECMに曝露される。

【００３４】 C3H10T1/2マウス繊維芽細胞系由来の細胞は、rhBMP-6遺伝子を含むLXSNベクタ
ーまたは遺伝子を含まない同一のベクターのどちらかを用いて形質導入した。細
胞は、100単位/ml PCN、100μg/mlストレプトマイシンおよび10％FBS（Hyclone
、Logan、UT）を補充したDMEM（Gibco、Gaithersburg、MD）中で標準条件下で培
養した。集密状態到達の4日後、細胞を水と0.1％Triton X-100によって連続して
溶解させた。プレートはリン酸緩衝生理的食塩水（PBS）によって静かに洗浄し
、細胞外マトリクスとプラスチック皿に付着したBMP-6を残した。

【００３５】骨髄は2匹のニュージーランドシロウサギの大腿骨から吸引し、100u ヘパリン
/ccを含むDMEM中で懸濁させた。細胞懸濁液はPBS、2％BSA、0.6％クエン酸ナト
リウム、1％ペニシリン／ストレプトマイシンで希釈した。次に懸濁液をフィコ
ール・パーク（Ficoll-Paque)（Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ
）勾配上に重ねて、600×gで20分間、遠心分離を行った。界面にある細胞を単離
、洗浄し、500×gで2回、再度遠心分離を行った。次にそれらを、T-75フラスコ
内にて、12.5％FBS、0.2mM I-イノシトール、20nMギ酸、0.1mM βメルカプトエ
タノール、1％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、L-グルタミン2mMを
含み、ヌクレオシドを含まないa-MEM中で、標準条件下で集密状態まで培養した
。細胞は、未切断細胞、LXSN形質導入細胞またはLXSN-BMP6形質導入細胞によっ
て作成したECM、またはプラスチック上に3通り再播種し、21日間培養した。

【００３６】アルカリホスファターゼ（ALP）活性は、間質細胞をECMに播種した後、1日目
と21日目に測定した。プレートはこすり落とし、pH10.5の0.5M CAPSですすいで
、超音波処理を行った。超音波処理物にはそれぞれ、0.5mlの0.5％リン酸p-ニト
ロフェニルを加えて、37℃にて30分間インキュベートした。0.2M NaOHを加えて
反応を停止させ、生成されたp-ニトロフェノールの量を分光測光法により405nm
にて決定した。ALP活性は、μmol p-ニトロフェノール/分/mgタンパク質として
表した。タンパク質含有量は、ブラッドフォード（Bradford）タンパク質アッセ
イ法（Bio-Rad、Hercules、CA）によって決定した。追加の対照として、C3H10T1
/3細胞系それぞれによって生成されたECMは、1日目と、21日間培地に曝露した後
に、ALP活性についても評価した。

【００３７】 ECMのみでのALP活性は、1日目と21日目では無視できた。ECM曝露骨髄細胞それ
ぞれによる活性は、プラスチック上の細胞による活性と同じく、1日目では同様
に無視できた。しかし21日目では、著しく異なっていた（図1）。プラスチック
上に播種した骨髄細胞によって生じたALPレベルは不変であった。未形質導入ま
たはLXSN細胞による、ECM上に播種した骨髄細胞のALPレベルはそれぞれ400％上
昇したが、BMP-6形質移入細胞による、ECM上に播種した骨髄細胞のALPレベルは7
00％上昇した。

【００３８】新生マウス頭頂骨細胞によって生成されたECM結合BMP-2および4は、マウス骨
髄細胞のALP活性を刺激した。BMP-6がない場合に間質細胞をEMCに曝露すると、
おそらくマトリクス内にコラーゲン型が存在するために、ALP生成が増加した。B
MP曝露細胞によってALP生成がさらに増加するのは、間質細胞の骨芽細胞分化が
増加するためである。

【００３９】これらの結果は、ECM結合BMPへの曝露により、間質細胞が骨芽細胞系統に沿っ
て分化することを示している。例えばOPCまたは歯前駆細胞などの骨芽細胞系統
の細胞は、アルカリホスファターゼ、オステオカルシンおよび骨シアロタンパク
質（歯前駆細胞の場合は象牙質シアロタンパク質に加えて）などのマーカー遺伝
子を発現することによって、同定および精製される。マーカー遺伝子を検出する
プローブは当技術分野で既知である（例えば、Guoら、2000、「石灰質化組織イ
ンターナショナル（Calcified Tissue International）」66、212〜216）。マー
カー遺伝子の発現は、遺伝子の転写（例えばインサイチューアッセイ法で標識核
酸プローブを使用して）の測定によって、または遺伝子産物に結合する抗体を検
出する免疫組織化学によって検出する。上述のアッセイ法は、OPCによる間質細
胞と歯前駆細胞を区別するために使用する。

【００４０】実施例2 細胞由来IL-4による歯槽骨損失の阻害溶骨細胞は、進行性歯周病の間の過剰な骨再吸収の仲介を行う。IL-4は溶骨細
胞の分化と機能を阻害する。自己細胞は、IL-4を発現するよう改変され、下顎骨
、患部歯に隣接する柔組織、または歯周靭帯に、当技術分野で既知の方法を用い
て炎症部位に永久に移植される。

【００４１】当技術分野で認識された歯周疾患のモデルである、臨床関連微生物ポルフィロ
モナスギンギバリス（Porphyromonas gingivalis）に由来するLPSの反復注射
によって、C3Hマウスに歯周疾患を誘発させる。歯周疾患のあるマウスは、制御
可能な方法でIL-4を生成するよう遺伝子改変されたC3H10T1/2細胞を用いて治療
する。インターロイキン-4の生成は、抗生物質を例えば飲料水に入れて経口投与
することによって制御する。細胞は骨吸収部位に局所的に移植するため、生物活
性分子を全身投与したり、反復して局所注射する必要はなくなる。抗生物質は選
択的に、歯周疾患の細胞移植後に、歯周ポケット内に配置される。インターロイ
キン4の局所送達のためのこの細胞による手法は、歯槽骨の再吸収を阻害するよ
う改変した組織を利用する。

【００４２】本明細書で使用するマウスモロニーレトロウイルスベクターは、明確に特徴付
けられており、ヒトまたはマウスでは非免疫原性である。

【００４３】標準インサイチューハイブリダイゼーション（ISH）を用いて、IL-4生成を検
出するのはもちろんのこと、下顎骨または細胞移植レシピエントの他の骨組織を
有する細胞における骨溶解表現型を特徴付ける。

【００４４】実施例3 遺伝子治療ベクターテトラサイクリン類似体制御発現系を用いて、組換え抗炎症性組成物の作成を
指示する。以下の理由で、デュアル「テット・オン（tet-on）」レトロウイルス
システムを用いる；i）ベクターは市販品であり、パッケージング細胞は高いレ
トロウイルス力価を生成すること、ii）マウスモロニーレトロウイルスベクター
は明確に付けられており、非免疫原性であり、ヒトには安全に使用されているこ
と、およびiii）「テット・オン」モードで2つのレトロウイルスベクターを使用
すると、「漏れ」が防止される、すなわち、抗生物質がない場合には、組換えポ
リペプチド発現が非常に低いか、発現がないこと。

【００４５】「テット・オフ（tet-off）」および「テット・オン」システムは、抗生物質
のテトラサイクリンまたは各種類似体を用いて発現を制御する。VP16ウイルスト
ランス活性因子融合タンパク質（tTA）の毒性は観測されず、「逆」（rtTA、テ
ット・オン）またはrTA、「テット・オフ」トランス活性因子に対する抗体は生
成されなかった。テトラサイクリン類似体のドキシサイクリンは、「テット・オ
ン」システムに好ましい抗生物質誘導物質であり、皮下ペレット移植によってと
同様に、例えばミフェプリストンおよびラパマイシンに関して述べられた既知の
方法によって、経口または腹腔内投与によって投与する。ドキシサイクリンおよ
び／またはミノサイクリンは経口投与する。ミノサイクリンは、骨および軟骨の
分解に関与するマトリクスメタロプロテイナーゼ（MMP）の作用を阻害する。炎
症関節でのミノサイクリン活性化部位特異的IL-4生成は、相乗的方法で炎症と血
管形成を阻害するよう作用する。これらの2つの薬剤は、ともに作用して、RAに
罹患した患者の恩恵を増大させる。「テット・オン」システムのミノサイクリン
を除去することによる、局所IL-4生成の遮断能力は、リウマチ関節においてなど
の、炎症部位での持続的IL-生成の有害な影響を阻止するのに有利である。

【００４６】アデノウイルスおよびレトロウイルスプラスミドベクターで使用される一部の
ウイルスプロモーター／エンハンサーは、インターフェロン-γおよび腫瘍壊死
因子-αによってインビボで不活性化される。これらにはラウス肉腫ウイルス（R
SV）、シミアンウイルス40（SV40）およびサイトメガロウイルス（CMV）プロモ
ーターが含まれる。IFNおよびTNFのレベルがRAおよびOA患者で上昇するため、こ
れらの標準ウイルスベクターの使用は、特に持続生成が必要な場合に、組換えポ
リペプチド発現を制限できる。長期のインビボ使用の場合、ウイルスプロモータ
ーのこのような制限を考えると、本発明では、2つのレトロウイルスプラスミド
ベクターのうちの1つでrtTAトランス活性因子の発現を制御するために、CMVプロ
モーターの代わりに構成的細胞プロモーターを利用する。ヒトオステオカルシン
プロモーター配列（例えば配列番号：3）は、OPCをエキソビボで形質導入する場
合に「テット・オン」レトロウイルスベクターを改変するために用いる。

【００４７】骨髄間質細胞から得た後期ウサギ骨芽前駆細胞を単離し、マーカー遺伝子検出
を用いて特徴付けた。ウサギOPCは、組換えヒト骨形態形成タンパク質-6（rhuBM
P-6）を発現するレトロウイルスベクターによって形質導入されたC3H10T1/2細胞
に由来する、骨誘導性マトリクス上で部分分化を受けた。

【００４８】骨髄間質細胞は、治療の8〜12週間前に、ヒト患者などの個体から得る。細胞
は膨張させ、分化させ、抗炎症性ポリペプチドをエキソビボでコードする組換え
DNAを用いて形質導入する。OPCは、例えば、歯周疾患の場合には下顎もしくは歯
周靭帯内の、または遠位の大腿骨および近位の脛骨の骨髄内の、すなわち炎症膝
関節に並んでいる、患部または損傷部位に隣接する骨髄骨に移植する。本手法に
よって、rhuIL-4形質導入OPCが骨再吸収溶骨細胞および関節のパンヌス／骨界面
に極めて接近する。移植OPCを骨髄内で正しく配置することは、以下の理由で重
要である；i）IL-4による骨再吸収の阻害は、侵入パンヌスおよび周囲の骨芽細
胞の滑膜線維芽細胞に、OPCを極めて接近させることによって最適化されること
、ii）局所生成されるIL-4は、リウマチ滑膜繊維芽細胞の存在下で、分化滑膜骨
髄由来のマクロファージによる溶骨細胞の生成を阻害すること、およびiii）OPC
生成IL-4は、炎症関節の新血管形成を阻害すること。

【００４９】骨芽細胞系統に部分的に分化された骨髄間質細胞を使用する別の利点は、局所
的に存在する多数の骨芽細胞による、所与の細胞個体群でのrhuIL-4の高レベル
の発現を含む。さらに、分化した間質細胞の純粋な個体群は、骨芽細胞のオステ
オカルシンプロモーターの特異性が高いために不要である。脂肪細胞、筋肉およ
び軟骨前駆細胞は、これらの細胞種が組換え抗炎症性ポリペプチドコードDNAを
吸収した場合でも、rhuIL-4を発現しない。これらの特徴は、形質導入骨芽細胞
が骨髄に接種される場合に、サイトカイン放出のためのより安全で制御された環
境をもたらす。

【００５０】実施例4 rhIL-4「テット・オン」デュアルレトロウイルス発現ベクターの構築 pRevTet-OnおよびpRev-TREレトロウイルス発現ベクターは、クロンテックラ
ボラトリー（Clontech Laboratories, Inc.)（Palo Alto、CA）より公に入手で
きる。どちらのベクターも、レトロパック（Retropak）TM（Clontech Inc.）PT6
7パッケージング細胞系において、高い力価のウイルスを生成可能なレトロウイ
ルスである、pLNCXに由来している。各プラスミドの主要なマウスモロニー白血
病ウイルスベクターは、伸張されたレトロウイルスパッケージングシグナルを操
作するプロモーター（L）を含む、5'長末端反復（LTR）からなる。残りのDNAは
、細菌選択のための細菌およびアンピシリン耐性遺伝子内での複製を可能にする
pBR322によるプラスミド配列からなる。すべてのプラスミドおよびレトロウイル
ス発現ベクターは、塩化セシウム／臭化エチジウム超遠心分離勾配によって精製
し、アガロースゲル上で純度を確認し、制限酵素マッピングおよびDNA配列解析
によって配向を解析した。

【００５１】pRev-Tet-On-huOCプラスミド構築物 pRev-Tet-Onベクターもネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、次い
で逆テトラサイクリン調節領域（rtTA）を操作する内部の最小即時初期サイトメ
ガロウイルス（CMV）プロモーターを含んでいた。1339kb BamHI/EcoRI cDNAは、
ヒトオステオカルシンプロモーターのcDNAを含むpGoscasベクターから切除した
。制御DNAは、BamHI/ClaIによって消化されたpRev-Tet-Onに連結され、これがCM
VプロモーターおよびベクターのrtTA部分を除去する。rtTAへの1.05kb DNAは次
に、pRev-Tet-OnのClaI部位に連結させ、次に平滑末端連結を行った。これによ
り、pRev-Tet-Onレトロウイルスベクター内の骨芽細胞特異的ヒトオステオカル
シンプロモーターのための、ウイルスCMVプロモーター／エンハンサの置換が行
われた。

【００５２】pRev-TRE-rhuIL-4プラスミド構築物 pRev-TREベクター（Clontech）は、伸張したレトロウイルスパッケージングシ
グナルを操作するプロモーターを含む5'長末端反復（LTR）を含んでいる。トラ
ンス活性因子反応領域（TRE）は、最小CMVプロモーターの上流にtetOオペレータ
ー配列の7個の直接反復を含み、これはtTAおよびrtTAトランス活性因子によって
結合可能である。rhuIL-4-pCDプラスミドは、米国菌培養収集所（ATCC（＃57593
））から得た。0.86kb BamHI hIL-4挿入断片は単離して、pRev-TREベクター内の
マルチクローニング部位のBamHI部位内への次のサブクローニングに使用した。r
huIL-4 cDNA挿入断片の配向が正しいことを確認するために、制限酵素マッピン
グを実施した。pRev-TRE-rhuIL-4ベクターは次に、ハイグロマイシンBによって
選択したPT67パッケージング細胞系（Clontech）に形質移入させ、NIH3T3細胞の
感染およびハイグロB選択の前に、ウイルス上清の連続希釈を用いて高い力価の
クローンを評価した。pRev-TRE-rhuIL-4ベクターを含むPT67パッケージング細胞
を用いて、pRevTet-On-huOCベクターとともにウサギ骨芽前駆細胞を連続して感
染させた。形質導入細胞は、G418およびハイグロマイシンBによる選択を行い、
テトラサイクリン類似体処理に反応してrhuIL-4を生成するクローンを単離する
。形質導入細胞におけるrhuIL-4生成誘導に最適なドキシサイクリンおよびミノ
サイクリン濃度は、標準方法を用いて作成した。

【００５３】実施例5 ウサギ骨髄間質細胞の単離および骨形成分化骨髄吸引液（約1〜2cc）は、麻酔したニュージーランドシロウサギの大腿骨の
より大きなトロキュラー（trocular）領域より得て、100uヘパリン/ccを含むDME
M中で懸濁させた。細胞懸濁液は、PBS、2％BSA、0.6％クエン酸ナトリウム、1％
ペニシリン／ストレプトマイシンによって希釈した。懸濁液は次に、フィコール
・パーク（Ficoll-Paque)（Amersham Pharmacia Biotech； Piscataway、NJ）勾
配上に重ね、600×gで20分間遠心分離を行った。界面にある細胞を単離、洗浄し
、500×gで2回、再度遠心分離を行った。次にそれらを、37℃、5％CO₂中で、T-7
5フラスコ内にて、12.5％ウマ血清（Sigma； St Louis、MO）、12.5％FBS、0.2m
M I-イノシトール、20nMギ酸、0.1mM βメルカプトエタノール、1％ペニシリン
／ストレプトマイシンを補充した、L-グルタミン2mMを含み、ヌクレオシドまた
はグルココルチコイドを含まない、α-MEM中で、集密状態まで2〜3週間培養した
。次に細胞はDPBS/EDTA/パンクレアチン中で収集し、凍結培地中の液体窒素中で
保存した。BMSCのアリコートは次に解凍し、プラスチック皿、または未形質導入
細胞、LXSN形質導入細胞またはrhuBMP6形質導入細胞によって生成されたECMでコ
ーティングした皿に3通り再度播種し、1および21日間培養した。位相差顕微鏡に
よる解凍細胞の検査によって、組織培養プラスチック上で21日間培養したBMSCは
、図3Aに示すようにその繊維が細胞の円錐形状形態を維持していることがわかっ
た。これに対して、21日間、BMP-6含有ECM上に播種したBMSCは、見た目はさらに
丸石形状となり（図3B）、骨芽細胞に似ていた。

【００５４】アルカリホスファターゼ（ALP）活性は、ECM上に間質細胞を播種した後に、1
日目と21日目に決定した。代表的な結果を図1に示す。これらのデータは、間質
細胞がエキソビボでさらなる分化を受ける前に、単離、膨張および凍結保存され
たことを示している。データは、アルカリホスファターゼ誘導に関するBMP反応
性によって、BMSCが部分分化を受けて後期骨芽前駆細胞になったことが証明され
ることも示している。

【００５５】実施例6 ウサギ後期骨芽前駆細胞へのrhuIL-4の影響後期ウサギOPCによるPGE2生成に対するrhuIL-4の影響を解析した。OPCはBMP-6
/ECMコーティングされた皿からトリプシン処理によって収集し、カウントし、次
に6ウェル皿に再度播種し、1％FBSおよび10〜5Mアラキドン酸を含むα-MEM中で2
4時間培養した。細胞は次に、IL-4（25、50および100ng/ml）存在下、または非
存在下で、rhuIL-1（2ng/ml）を用いてさらに24時間インキュベートした。PGE2
レベルは、細胞条件培地中で酵素免疫測定法（BioTrak RPN222、Amersham Phar
macia Biotech, Inc.、Piscataway、NJ）によって測定した。図4に示すように、
ウサギOPCによるIL-1刺激PGE2放出の阻害に対するIL-4の用量関連効果があった
。

【００５６】これらの結果は、rhuIL-4が、溶骨細胞が仲介する骨再吸収における重要な中
間段階である、骨芽前駆細胞におけるPGE2生成誘導に対するIL-1-αの影響を阻
害することと、RAに関連する炎症を減少させるにはIL-4が有益であること（PGE2
がリウマチ性滑膜炎に関連する痛みと浮腫の強力な媒介物質であるため）を示し
ている。

【００５７】他の態様は特許請求の範囲に含まれている。

【図面の簡単な説明】

【図１】 BMP-6を用いて、および用いずに未形質導入C3H10t1/2細胞、また
はC3H10T1/2細胞によって作成されたECMに、またはプラスチックのみに接種した
ウサギ骨髄間質細胞のアルカリホスファターゼ活性を示す棒グラフである。活性
は、1日目および21日目の生成されたp-ニトロフェノールμmol/分/mgタンパク質
×10^-1で表されている。

【図２Ａ】歯周靭帯生検の図である。

【図２Ｂ】象牙芽細胞前駆細胞を骨誘導性マトリクス上で分化させ、制御
可能な治療用遺伝子を用いた細胞を形質導入する方法の図である。

【図２Ｃ】治療的介入が必要な場合に、歯に隣接して細胞を移植するため
の器具の図である。

【図３】図3Aは、組織培養プラスチック上に播種後、21日間培養したウサ
ギ骨髄間質細胞の顕微鏡写真である。倍率100倍。図3BはrhuBMP-6によって形質
導入されたC3H10T1/2細胞系による、ECMコート皿に播種後、21日間培養したウサ
ギ骨髄間質細胞の顕微鏡写真である。倍率100倍。

【図４】ウサギ骨芽前駆細胞によるrhuIL-1α導入PGE2に対するrhuIL-4の
影響を示す棒グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ 19/08 43/00 １２１ 29/00 １０１Ｃ１２Ｎ 5/00 ＺＮＡＢ 43/00 １２１Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 CA04 DA03 EA04 FA02 GA11 4B065 AA93X AA93Y AB01 BA01 CA44 4C084 AA02 AA13 CA56 DA01 DA16 MA57 MA66 MA67 NA13 NA14 ZA67 ZA96 ZB15 4C086 AA01 AA02 DA29 MA02 NA20 ZC75

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗炎症性ポリペプチドをコードする核酸を含む、単離された
歯前駆細胞。
【請求項２】細胞が歯周靭帯に由来する、請求項1記載の細胞。
【請求項３】ポリペプチドがサイトカインである、請求項1記載の細胞。
【請求項４】サイトカインがインターロイキン-4（IL-4）である、請求項
3記載の細胞。
【請求項５】核酸が骨芽細胞特異的プロモーターに機能的に連結されてい
る、請求項1記載の細胞。
【請求項６】骨芽細胞特異的プロモーターがオステオカルシンプロモータ
ーである、請求項5記載の細胞。
【請求項７】骨芽細胞特異的プロモーターが骨シアロタンパク質プロモー
ターである、請求項5記載の細胞。
【請求項８】核酸の発現が誘導可能である、請求項1記載の細胞。
【請求項９】核酸の発現が抗生物質化合物によって制御される、請求項1
記載の細胞。
【請求項１０】抗生物質化合物がテトラサイクリンまたはテトラサイクリ
ン類似体である、請求項9記載の細胞。
【請求項１１】テトラサイクリン類似体がミノサイクリンまたはドキシサ
イクリンである、請求項10記載の細胞。
【請求項１２】哺乳類の骨溶解を阻害する方法であって、哺乳類に、抗炎
症性ポリペプチドをコードする核酸を含む、単離した歯前駆細胞を導入すること
を含む方法。
【請求項１３】哺乳類が進行性歯周病に罹患しているか、その危機に瀕し
ている、請求項12記載の方法。
【請求項１４】哺乳類が歯周疾患による進行性歯槽骨損失に罹患している
か、その危機に瀕している、請求項12記載の方法。
【請求項１５】細胞が顎の下顎部の歯周靭帯に投与される、請求項12記載
の方法。
【請求項１６】抗炎症性ポリペプチドをコードする核酸を含む、単離され
た骨芽前駆細胞。
【請求項１７】ポリペプチドがサイトカインである、請求項16記載の細胞
。
【請求項１８】サイトカインがインターロイキン-4（IL-4）である、請求
項17記載の細胞。
【請求項１９】核酸が骨芽細胞特異的プロモーターに機能的に連結されて
いる、請求項16記載の細胞。
【請求項２０】骨芽細胞特異的プロモーターがオステオカルシンプロモー
ターである、請求項19記載の細胞。
【請求項２１】骨芽細胞特異的プロモーターが骨シアロタンパク質プロモ
ーターである、請求項19記載の細胞。
【請求項２２】核酸の発現が誘導可能である、請求項16記載の細胞。
【請求項２３】核酸の発現が抗生物質化合物によって制御される、請求項
16記載の細胞。
【請求項２４】抗生物質化合物がテトラサイクリンまたはテトラサイクリ
ン類似体である、請求項23記載の細胞。
【請求項２５】テトラサイクリン類似体がミノサイクリンまたはドキシサ
イクリンである、請求項24記載の細胞。
【請求項２６】哺乳類の骨溶解を阻害する方法であって、哺乳類に、抗炎
症性ポリペプチドをコードする核酸を含む、単離した骨芽前駆細胞を導入するこ
とを含む方法。
【請求項２７】細胞が哺乳類の関節に移植される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】細胞が脛骨内投与される、請求項26記載の方法。
【請求項２９】細胞が大腿骨内投与される、請求項26記載の方法。
【請求項３０】ポリペプチドの発現が抗生物質化合物によって制御される
、請求項26記載の方法。
【請求項３１】抗生物質化合物がテトラサイクリンまたはテトラサイクリ
ン類似体である、請求項26記載の方法。
【請求項３２】ミノサイクリンを哺乳類に投与することをさらに含む、請
求項31記載の方法。
【請求項３３】前記抗生物質化合物が全身的に投与される、請求項30記載
の方法。
【請求項３４】シクロオキシゲナーゼII（COX-2）の阻害剤を投与するこ
とをさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項３５】腫瘍壊死因子-α（TNFα）の阻害剤を投与することをさら
に含む、請求項26記載の方法。
【請求項３６】哺乳類が進行性リウマチ様関節炎に罹患しているか、その
危機に瀕している、請求項26記載の方法。
【請求項３７】哺乳類が進行性先端周囲骨または軟骨損失、人工関節粒子
誘導性骨溶解、または骨溶解骨転移に罹患しているか、その危機に瀕している、
請求項26記載の方法。
【請求項３８】細胞を骨髄形態タンパク質-6に接触させることを含む、骨
髄間質細胞の分化を誘導する方法。