JP2003527599A - 埋め込み型アナライトセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本埋め込み型アナライトセンサーは基板、該基板上にある電極、および該電極上にあるメンブレンを含んでなる。該メンブレンは元素状シリコンから構成される。該センサーは、 in vivoで、１日当り20％より少ないシグナルドリフトを示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】背景技術 本発明は埋め込み型のアナライトセンサーに関する。

【０００２】 これまで様々な埋め込み型グルコースセンサーが開発されてきた。例として、
米国特許第5,387,327号；同第5,411,647号；および同第5,476,776号に記載され
たもの；ならびにPCT国際公開WO 91/15993；WO 94/20602；WO 96/06947；および
WO 97/19344に記載されたものがある。これら埋め込み型グルコースセンサーは
、通常ポリマー製基板を含み、その基板の表面に金属電極が印刷されている。そ
の電極を生体適合性のメンブレン（膜）が覆い、グルコースが電極に到達するこ
とを可能にしており、一方ではタンパク質のような他の分子を排除している。た
いていは電極につけられている酵素の助けを借りて、電気化学的手法を用いるこ
とにより存在するグルコースの量を測定する。グルコースセンサーを患者の体内
に埋め込む場合は、ワイヤーを介して電極を取り付けることができる。このワイ
ヤーは、患者の身体から出て、電極を制御しまたグルコース濃度を測定、記録す
る外部回路につながる。あるいは、この外部回路の全部または一部を小型化して
、埋め込み型グルコースセンサーの中に収容することもできる。WO 97/19344に
記載されているようなトランスミッターさえも、埋め込み型グルコースセンサー
の中に収容することができ、こうすることにより患者の身体から出るリード線の
必要性を完全になくすことができる。

【０００３】 電流測定式グルコースセンサーに伴う問題は、シグナルが不安定なことである
。これは、タンパク質との相互作用からくる酵素の分解、酵素の漏出、および／
または電極の汚損の結果起こるものと考えられる。これを克服するための通常の
対策は、上述の生体適合性メンブレン、つまりコーティングを用いることである
。しかしながら、これらのメンブレンにもいくつかの問題がある。例えば、ナフ
ィオン(Nafion)系のバイオセンサーメンブレンは、ひび割れ、剥離、タンパク質
付着、カルシウム沈着などが見られる。生物学的環境下では、ポリマー系のメン
ブレンには石灰沈着が起こり、亀裂や、透過性に変化が生じる。ポリマーメンブ
レンと関係する、はっきりしない多孔度もまた、in vivoでのメンブレンの安定
性および石灰沈着に大いに絡むものであることが示されている。材料中にある細
孔や間隙に侵入する生物学的成分は、イオンおよびカルシウムの蓄積場所である
代謝の陰となる場所を生じさせる。ミネラルの沈着はポリマー製メンブレンの表
面破壊を広げることが知られているという事実と合わせると、この状況は埋め込
み型グルコースセンサーに対し潜在的に深刻な問題を提起する。

【０００４】 ポリマーメンブレンでは、その孔径分布は通常ある種の確率分布（例えばガウ
ス分布）に従うが、これは、サイズの大きなタンパク質がいずれそのメンブレン
を通り抜けて移動するという有限の可能性を残すことになる。この漏れまたは不
適切な拡散特性により、また、例えば生物付着やタンパク質吸着、線維性増殖組
織による被包、および時間の経過とともに起こる装置材料の劣化のような身体−
センサー境界面における諸々の事象により、ドリフトが引き起こされる可能性が
ある。

【０００５】 現在、 20 nmと非常に小さい公称孔径のメンブレンが入手可能である。そうは
言うものの、これらの孔径での濾過は、完全なものからは程遠いものである。最
も一般的なフィルターは、溶液流延法で形成されるポリマーメンブレンであるが
、この方法で得られるものは孔径分布が偏差30％と大きい。メンブレン（例えば
MILLPORE ISOPORE）を形成させるのにイオン飛跡エッチング（ion-track etchin
g）を用いると、もっと狭まった孔径分布（±10％）のものが作れる。しかしな
がら、このメンブレンは細孔率が低く（＜10⁹ 孔/cm²）、孔径にも限度があり、
そして孔が表面に対しランダムに分布している。均一な孔のものを得るために多
孔質アルミナ（例えばWHATMAN）が用いられたこともある。アルミナは通常高い
孔数密度（＞10¹⁰/cm²）を有しているが、特定の孔径（典型的には大体20ナノメ
ーターより大）しか得られず、孔の形状と配置をコントロールするのは難しい。

【０００６】発明の概要 ひとつの態様では、本発明は埋め込み型アナライトセンサーであり、基板、該
基板上にある電極、および該電極上にあるメンブレンを含んでなる。該メンブレ
ンは元素状シリコンから構成される。

【０００７】 もうひとつの態様では、本発明は埋め込み型アナライトセンサーの製作方法に
関し、電極をメンブレンで覆うことを含んでなる。該電極は基板上にあり、該メ
ンブレンは元素状シリコンから構成される。

【０００８】 本発明はまた、 in vivoで1日当り20％より少ないシグナルドリフトを示す埋
め込み型アナライトセンサーにも関する。

【０００９】図面の簡単な説明 以下の図面は本明細書の一部をなし、本発明の特定の態様をさらに図説するた
めに含めてある。本明細書中に提供される具体的な実施形態の詳細な説明と組み
合わせて、これらの図面の１枚あるいは複数枚を参照することにより、本発明を
よりよく理解することができる。

【００１０】 図１〜９は、本発明の実施形態で使用するメンブレンの製作方法を図示する。

【００１１】 図１０は、埋め込み型アナライトセンサーの断面図を示す。

【００１２】 図１１は、埋め込み型アナライトセンサーの分解組立図を示す。

【００１３】 図１２は、埋め込み型アナライトセンサーの断面図を示す。

【００１４】詳細な説明 図１０に本発明の１つの実施形態の断面図を示す。図中、埋め込み型アナライ
トセンサー2は基板6を含み、その上に電極8と8がある。電極はメンブレン4で覆
われている。リード線12と12がこの埋め込み型アナライトセンサーを外部回路（
図示されていない）に電気的に接続することを可能にしている。埋め込み型アナ
ライトセンサーはまた、外部コート層16および内部コート層14を含む。

【００１５】 図１１は本発明の１つの実施形態の分解組立図を示す。分かりやすくするため
に内部および外部コート層は図では除かれている。図に示されるように、埋め込
み型アナライトセンサー2は、基板6の表面上に電極8と8を含み、この電極はマイ
クロエレクトロニクス回路10に電気的に接続されている。このマイクロエレクト
ロニクス回路はリード線12と12に電気的に接続されていて、このリード線は埋め
込み型アナライトセンサーを外部回路（図示されていない）に電気的に接続する
ことを可能にする。電極はメンブレン4で覆われている。

【００１６】 図１２は、図１０に示されているものと類似の、本発明の実施形態の断面図を
示すものであるが、第3番目の電極8と第3番目のリード線12がついている。この
ように図示されてはいるが、電極の数とリード線の数は異なっていてよい。

【００１７】 メンブレンは、微細機械加工された硬質材料で構成される。好ましくは、メン
ブレンは元素状シリコンから構成されるが、微細機械加工できる他の生体適合性
の硬質材料も考えられ、例えば金属（例えばチタン）、セラミックス（例えば、
シリカや窒化ケイ素）、およびポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレン
、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、シリコーン樹脂など）がある。微
細機械加工はフォトリソグラフィーを含む方法であって、例えば半導体産業で用
いられるようなもので、基板から物質を除去したり、基板に物質を添加したりす
る。これらの方法はよく知られており、Encyclopedia of Chemical Technology,
Kirk-Othmer, Volume 14, pp. 677-709 (1995)；Semiconductor Device Fundam
entals, Robert F. Pierret, Addison-Wesley, 1996；およびMicrochip Fabrica
tion 第3版、Peter Van Zant, McGraw-Hill, 1997に記載されている。元素状シ
リコンから構成されるメンブレンの製作方法の詳細は、1999年春学期に提出され
た、カリフォルニア大学バークレー校大学院のDerek James Hansfordの博士論文
に記載されている（この博士論文は、マテリアルサイエンス・ミネラル工学専攻
の工学博士号（Doctor of Philosophy in Engineering-Materials Science and
Mineral Engineering）の取得要件の一部を満たすものとして提出されたもので
ある）。

【００１８】 このメンブレンの特性は孔径が規定されていることであり、標準的なメンブレ
ンの孔径分布に比較して狭い孔径分布を有している。この製作方法は許容差がわ
ずかであるため、孔径を正確な直径範囲に制御することができ、例えば1〜50 nm
、または5〜20 nm、あるいは5〜15 nmにさえも（例えば12 nm、18 nm、あるいは
25 nmにさえも）制御でき、その時の偏差は+/- 0.01〜20％、+/- 0.1〜10％%、
あるいは+/- 1〜5％にさえある。従ってこのサイズより上の分子はほぼ確実に排
除することができる。というのは、孔径分布が、釣鐘曲線というよりも山高帽の
形をしているからであり、従って、例えば12 nm、18 nm、25 nm、あるいは50 nm
より上のサイズの孔は存在しない。これらのメンブレンは、例えばタンパク質の
ような妨害分子を排除することができる。この妨害分子というのは、センサーを
体内に埋め込んだ場合、さもなければセンサーに大きなドリフトの問題を引き起
こすものである。シグナルドリフトというのは、アナライト濃度の変化に無関係
の、センサーからのシグナルの大きさの変化である。シグナルドリフトの量は、
ドリフト（変動）する前のシグナルの大きさを基準にする。好ましくは、本発明
の埋め込み型アナライトセンサーは、in vivoで1日当たり20％より少ないシグナ
ルドリフトを示すもの、さらに好ましくはin vivoで1日当たり10％より少ない、
最も好ましくはin vivoで1日当たり5％より少ないシグナルドリフトを示すもの
である。

【００１９】 本発明で用いるメンブレンは、グルコース拡散実験およびアルブミン拡散実験
により特性評価することができる。これらの実験はあとの方で説明する。好まし
くは、メンブレンは、グルコース拡散実験結果が、330分で少なくとも1 mg/dl、
さらに好ましくは330分で少なくとも10 mg/dl、これよりもさらに好ましくは330
分で少なくとも30 mg/dl、そして最も好ましくは330分で少なくとも60 mg/dlで
あるものである。好ましくは、メンブレンは、アルブミン拡散実験結果が、420
分で多くとも0.1 g/dlであり、さらに好ましくは420分で多くとも0.05 g/dlであ
り、これよりもさらに好ましくは420分で多くとも0.01 g/dlであり、そして最も
好ましくは420分で多くとも0.001 g/dlであるものである。

【００２０】 このメンブレンの製作方法は、小型で埋め込み型アナライトセンサーの簡単で
、経済的な製造を可能にするものである。例えば、最初にメンブレンを製作し、
その後基板上にセンサー用電極および電気コネクターを形成させることができる
。好ましくは、基板はシリコンであるが、他の材料も可能で、例えばセラミック
スやポリマーがある。必要ならば、例えばアンプ、フィルター、トランスミッタ
ー、および／またはシグナル予備調整部品のような電子部品を、この層の中に容
易に組み込むことができる。特に、基板が元素状シリコンから構成される場合は
、よく知られている集積回路技術を用いて、シングルチップの上に小型化された
形で全ての回路を配置することができる。

【００２１】 試薬がセンサーに含まれる場合、基板とメンブレンをくっつけるのに２つの方
法が可能である： １．試薬を電極上に付着させる前に基板とメンブレンを熱的に接合させる。こ
の場合、１つの開口部を、好ましくはメンブレン中に設ける（これは微細機械加
工法で製作するので、開口部はこの加工法の１つの工程の中で簡単に作ることが
できる）。複数のメンブレンが１つのピースとして形成される場合、および／ま
たは複数の基板が１つのピースとして形成される場合は、熱接合の後、さらにエ
ッチング工程を用いて個々のメンブレン／基板の単位に分けることができる。試
薬を個々の開口部から付着させ、開口部を、例えばポリマーシーラントを用いて
密封する。その後個々のセンサーを分離して、例えばシリコンゴムのようなフレ
キシブルな内部コート層の中に組み入れ、その後例えば生体適合性の層のような
外部コート層で個別にコーティングする。

【００２２】 ２．メンブレンと基板をくっつける前に試薬を電極上に付着させる。この場合
、試薬中の酵素が破壊される可能性があるので熱的な接合はできない。メンブレ
ンおよび基板を最初に個々に分けておき、例えばシアノアクリレートのような適
当な接着剤を用いて１つのメンブレンを１つの基板に接着することにより個々の
センサーを組み立てる。最終の工程としては、個々のセンサーを、例えばシリコ
ンゴムのようなフレキシブルな内部コート層の中に組み入れ、その後例えば生体
適合性の層のような外部コート層で個別にコーティングする。センサーは、ニー
ドルアプリケーター（needle applicator）を用いて皮膚の中に挿入できる。制
御装置は通常身体の外に残し、電線（リード線）を通してセンサー素子に接続す
ることができる。

【００２３】 電極を基板の表面上に形成させる。電極は、十分公知の半導体加工技術により
、純金属または合金のような導電性材料あるいは金属導電体である他の材料から
形成させることができる。例としては、アルミニウム、カーボン（例えばグラフ
ァイト）、コバルト、銅、ガリウム、金、インジウム、イリジウム、鉄、マグネ
シウム、水銀（アマルガムとして）、ニッケル、ニオビウム、オスミウム、パラ
ジウム、白金、レニウム、ロジウム、セレニウム、シリコン（例えば高度にドー
プされた多結晶シリコン）、銀、タンタル、錫、チタン、タングステン、ウラニ
ウム、バナジウム、亜鉛、ジルコニウム、これらの混合物、およびこれら元素の
合金または金属化合物がある。好ましくは、電極は金、白金、パラジウム、イリ
ジウム、あるいはこれら金属の合金を含有していることであり、その理由は、こ
のような貴金属およびそれらの合金は生体系では不活性であるからである。電極
はどのような厚さでもよいが、好ましくは10 nm〜1 mm、さらに好ましくは20nm
〜100μm、あるいはもっと好ましくは25 nm〜1μmである。

【００２４】 少なくとも2本の電極がなくてはならない。電極の数は2〜1000本、または3〜2
00本、あるいは3〜99本であってもよい。個々の電極セット（2本または3本の電
極）を、個々のチャンバーの中に分けて入れ、それぞれを前記のメンブレンで覆
うことができる。さらに、個々の電極セット（2本または3本の電極）にそれぞれ
異なる試薬を付着させてもよく、こうすることにより少なくとも2種（例えば3〜
100種、あるいは4〜20種）の異なるアナライトを測定することのできる埋め込み
型アナライトセンサーが可能である。

【００２５】 埋め込み型アナライトセンサーの残りの個々の部分は当業者には周知であり、
例えば米国特許第5,387,327号；同第5,411,647号；および同第5,476,776号；な
らびにPCT国際公開WO 91/15993；同WO 94/20602；同WO 96/06947；およびWO 97/
19344に記載されている。

【００２６】 リード線およびマイクロエレクトロニクス回路の両方が付いて図示されている
が、これらの部品は任意であり必要なら付ける。マイクロエレクトロニクス回路
は、例えばマイクロプロセッサー、アンプ、あるいは電源のような、普通は埋め
込み型アナライトセンサーの外にくる電気部品の一部あるいは全部を含んでいて
よい。またマイクロエレクトロニクス回路がトランスミッター、あるいは例えば
レーザー（これは皮膚を通して光を発する）のような、ワイヤレスで情報を送信
する他の装置も含んでいる場合は、リード線を含む必要はない。これに対して、
マイクロエレクトロニクス回路はなくてもよく、この場合は、リード線が電極と
外部電気部品とを直接電気的に接続する。

【００２７】 必要ならば、１つあるいは複数の内部コート層があってもよい。内部コート層
は拡散を調節する機能を果たすと考えられる。内部コート層の例として、酢酸セ
ルロース、ポリウレタン、ポリアリルアミン（PAL）、ポリアジリジン（PAZ）、
およびシリコン含有ポリマーを挙げることができる。いくつかの具体的な例がPC
T公開WO 98/17995、同WO 98/13685および同WO 96/06947、ならびに米国特許第4,
650,547号および同第5,165,407号に記載されている。

【００２８】 必要ならば、１つあるいは複数の外部コート層があってもよい。本発明の埋め
込み型アナライトセンサーは、 in vivo で、好ましくは、ヒト、イヌ、あるい
はマウスのような哺乳動物の皮下で使用することを目的としている。外部コート
層は、埋め込み型アナライトセンサーの生体適合性を改善する機能を果たす。外
部コート層の例を挙げると、ナフィオン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエ
チレン（PTFE）、ポリ（エチレンオキサイド）（PEO）、および2-メタクリロイ
ルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸n-ブチルとの共重合体（MPC）
の各膜（メンブレン）がある。いくつかの具体的な例がPCT公開WO 96/06947、お
よびMedical Progress through Technology、Nishidaら、21: 91-103 (1995)に
記載されている。

【００２９】 電極を試薬でコーティングしてもよい。試薬は任意であり、特定のアナライト
用の電気化学プローブとするために用いる。試薬は、例えばグルコース検出用の
グルコースオキシダーゼあるいはグルコースヒドロゲナーゼのように、単一酵素
のような単純なものでありうる。酵素は、PCT公開WO 96/06947に記載されている
ように、固定化または「捕捉（wired）」されていてよい。試薬には、センサー
の感度を上げるため、必要ならメディエーターを含有させてもよい。出発試薬は
試薬の各反応体あるいは各成分であり、そしてたいていは電極につける前に液体
形態で一緒に混ぜ合わされる。液体はその後蒸発し、試薬が固体の形態で残る。
具体的な試薬の選択は、その具体的なアナライトあるいは測定すべきアナライト
により決まり、当業者にはよく知られている。例えば、グルコース測定用試薬の
一例として、試薬1グラムあたり、62.2mgのポリエチレンオキサイド（平均分子
量100〜900キロダルトン）、3.3mgのNATROSOL 250M、41.5mgのAVICEL RC-591 F
、89.4mgの一塩基性燐酸カリウム、157.9mgの二塩基性燐酸カリウム、437.3mgの
フェリシアン化カリウム、46.0mgのコハク酸ナトリウム、148.0mgのトレハロー
ス、2.6mgのTRITON X-100界面活性剤、および2,000〜9,000単位の酵素活性を含
むものを挙げることができる。この酵素は、12.5mgの補酵素PQQと121万単位のキ
ノタンパク質グルコースデヒドロゲナーゼのアポ酵素とから酵素溶液として調製
され、キノタンパク質グルコースデヒドロゲナーゼ溶液を作る。この試薬はWO 9
9/30152の7〜10頁に記載されている（この文献は参照により本明細書中に組み入
れるものとする）。

【００３０】 限定するものではないが、本発明で特定のアナライトを測定するのに用いるこ
とができるその外の酵素および追加のメディエーターの例を以下の表１に掲載す
る。

【００３１】

【表１】

【００３２】 表１に示されているいくつかの例では、少なくとも１つの追加の酵素が反応触
媒として使用される。また、表１に示されているいくつかの例では付加的なメデ
ィエーターを用いてもよく、これは酸化型のメディエーターへの電子移動を促進
する。付加的メディエーターは、酸化型メディエーターよりも少ない量で試薬に
加える。上記のアッセイについて説明するが、本発明の開示に従い、色々な電気
化学的アッセイを行うことができることが理解されよう。

【００３３】メンブレンの形成 以下に本発明で用いるメンブレンの作り方を記すが、これは、1999年の春学期
に提出された、カリフォルニア大学バークレー校大学院のDerek James Hansford
の博士論文（この博士論文は、マテリアルサイエンス・ミネラル工学専攻の工学
博士号の取得要件の一部を満たすものとして提出されたものである）にある記述
に基づくものである。

【００３４】 他の材料から作られる他のメンブレンを使うこともできる。この独特の方法は
、埋設された窒化膜のエッチング停止層を頼りとするものである。

【００３５】 埋設窒化膜エッチング停止層は、ナノメータースケールの孔を形成させる際に
エッチング液止めとしての働きをする。埋設窒化膜エッチング停止層は孔構造の
３次元制御を容易にし、50ナノメーターより小さい直径の孔を形成するのを容易
にする。その上、これらの孔を、ウエハー全面に亘って均一に形成させることが
できる。

【００３６】 好ましくは、この製作プロトコルの第１工程は、支持用隆起構造を基板にエッ
チングで形成させることである。この隆起は、その後形成されるメンブレン構造
に機械的剛性を与える。

【００３７】 その後、低圧化学蒸着法（LPCVD）を用いて、エッチング停止層として働く低
ストレスシリコン窒化膜（LSNまたは窒化膜）を基板上に蒸着させる。１つの実
施形態では、0.4μmの窒化膜を用いた。この結果得られた構造を図１に示す。図
１には、基板20とその上に形成された窒化膜エッチング停止層22が図示されてい
る。

【００３８】 ストップ層22の上に、メンブレンのベース構造層（ベース層）を蒸着させる。
エッチング停止層22は薄いので、構造層を、基板20の中に形成された支持用隆起
のところまで蒸着させる。１つの実施形態では、ベース層として5μmのポリシリ
コンを用いた。図２にエッチング停止層22の上に配置されたベース層24を図示す
る。低ストレスシリコン窒化膜をベース層としても用いることもできるが、この
場合それはそれ自身のエッチング停止層として働く。

【００３９】 次の加工工程は、孔の形状を画定するために、ベース層24に穴をエッチングで
空けることである。孔を画定するために、従来の半導体加工で用いられるような
マスクを用いることができる。例えば、マスクとして熱的に成長させた酸化物層
を用い、塩素プラズマによりポリシリコンの中に穴をエッチングで空けることが
できる。この工程では、エッチングがベース層24を完全に貫いていることを確認
することが重要で、従って10〜15％の過剰エッチングを行なうことが好ましい。
埋設窒化膜エッチング停止層22が、シリコンベース層24のプラズマエッチングに
対してエッチング停止として働くことに注目することは価値がある。さもなくば
、もしプラズマが窒化膜を貫いて穴を空けるのであれば、プラグ層の下にある窒
化膜が完全に除去されるのを防ぐために（最終のKOHによるエッチングで除去さ
れるのを防ぐために）、エッチング工程のもっと厳密な制御を行なう必要がある
と考えられる。図３にこの加工法による結果を図示する。特に、この図は、ベー
ス層24の中に形成されているが窒化膜エッチング停止層22の中で終わっている穴
26を図示するものである。

【００４０】 次にベース層24上に孔犠牲酸化物を成長させる。図４に、ベース層24上に配置
された犠牲酸化物28を図示する。

【００４１】 この犠牲酸化物の厚みが最終メンブレンの孔径を決定する。それゆえこの工程
の制御は再現性のあるメンブレンにとって極めて重要である。これは、ベース層
24の熱酸化（例えば、成長温度850〜950℃で約1時間とアニール10分）により達
成される。当然、制御された厚みの犠牲層を形成させるのには色々な方法を用い
ることができる。例えば、熱的に蒸発されるタングステンフィルムをポリマー製
メンブレンの犠牲層として用いてもよく、これは過酸化水素で選択的に除去する
ことができる。犠牲層の基本的必須要件は、ウエハー全面に亘って高精度でその
厚みを制御する能力である。ポリシリコンおよび窒化膜の両方の熱酸化が、ウエ
ハー全面に亘って5％未満での犠牲層の厚み制御を可能とする。この制御の限界
は、例えば天然酸化物の初期厚み（特にポリシリコンについて）、結晶粒度また
は密度、および不純物濃度のような、ベース層中の局所的不均質性から来る。

【００４２】 ベース層24をプラグ層（層間に孔スペーシングを維持するために必要）と機械
的に接続させるために、犠牲酸化物層28中にアンカー点を定めた。本設計では、
これは、対角線方向に1μmだけ孔穴からずらした同一のマスクを用いることによ
り達成される。これは各孔穴の１つまたは２つのコーナーにアンカーをもたらし
、これが可能な限り大きな孔面積を開けながら構造体の層間に所望の機械的接続
を与えた。図５に、この方法で形成されたアンカー30を図示する。

【００４３】 次にプラグ構造層を付着させて穴26を埋める。この工程は1.5μmのポリシリコ
ンを付着させることにより行った。その結果得られるプラグ層32を図６に示す。

【００４４】 表面に孔を開けるために、プラグ層32をベース層のところまで平坦化し、図７
に示すように、プラグ層が孔穴開口部分にだけある最終構造体を残す。

【００４５】 平坦化の方法は、プラグ材料として使用される材料によって決まる。硬い微細
加工用材料（ポリシリコンおよび窒化膜）に対しては、平坦化には化学機械研摩
（chemical mechanical polishing）を用いた。検討したその他の材料では、プ
ラズマエッチング法を、急速湿式化学平滑化法（quick wet chemical smoothing
）と共に用いて粗く平坦化した。この方法は、用いたプラズマではベース層はエ
ッチングされないと仮定して、ベース層は影響を受けないという利点があるが、
プラグそのものを完全にエッチングしてしまうのを避けるためエッチングのタイ
ミングの制御を行う必要があるという欠点がある。

【００４６】 この時点で、メンブレンはリリースの準備ができた状態なので、保護層34をウ
エハー上に蒸着する（ウエハーの両面を完全に覆う）。保護層34の必須要件は、
保護層がシリコンのエッチング（これらの実験ではKOH）に影響されないことと
、保護層をプラグ32またはベース24の構造層を取り除くことなく除去できること
である。ポリシリコンおよび窒化膜構造層の場合には、保護層として薄い窒化膜
層を用いる（窒化膜はKOHには全くエッチングされず、HFにゆっくり溶ける）。
ポリマー製構造材料の場合には、窒化膜の蒸着に必要な加工温度（835℃）の点
から、保護層としてシリコンを用いる。

【００４７】 裏面エッチングウインドーを保護層にエッチングにより設けた。所望の範囲に
シリコンを露出させ、その後構造体全体を80℃のKOH浴に入れ、シリコンウエハ
ー基板20を（平滑な埋設エッチング停止層で明示されるように）メンブレンのベ
ース層24のところまでエッチングした。図８に、基板20に形成された、この結果
得られるアパーチャー（開口）36を図示する。

【００４８】 この時点で、埋設窒化膜層22、犠牲酸化物層34、およびプラグ層32をHFまたは
SF₆/酸素プラズマ中でのエッチングにより除去する。結果として得られるナノメ
ータースケールの孔を有するメンブレン4を図９に示す。

【００４９】メンブレンの特性評価 メンブレンの目的は、測定対象アナライト（たとえばグルコース）をメンブレ
ンに通して拡散させると同時に大きな分子（例えばタンパク質）を排除すること
である。それゆえ、メンブレンの２つの重要な特性はグルコース拡散とアルブミ
ン拡散である。全ての実験は室温（25℃）で行う。

【００５０】 以下はグルコースの拡散実験である： メンブレンの周りをぐるっと囲んで組み立てられたミニ拡散チャンバーを使っ
てグルコースの拡散を測定する。アクリル樹脂から作製されたこの拡散チャンバ
ーは、2mLの一定容積をもつ２つのコンパートメントＡおよびＢで構成され、こ
れらコンパートメントは目的とするメンブレンで分離されており、Ｏリングでシ
ールされ、そしてネジのように回して螺合されている。

【００５１】 この拡散チャンバーを使って、酵素的定量アッセイ（TRINDER（商標）、SIGMA
）および分光光度計による比色測定により、メンブレンの両方の側でグルコース
を測定する。全ての実験の出発グルコース濃度は、チャンバーＡとＢで、それぞ
れ6,666 mg/dlと0.0 mg/dlであった。サンプル0.1 mlを拡散チャンバーから採り
、そのうちの10 μlをキュベット中の3 mlのグルコース試薬に添加し、転回する
ことにより穏やかに混合した。各試験管を室温で18分インキュベートし、波長50
5nmで測定を行う。試薬は750 mg/dlまで直線的である。拡散チャンバーそのもの
は、境界層効果（液／メンブレンの境界面における拡散抵抗）を最小限にするこ
とを目的として攪拌するためにモーターに取り付ける。孔を確実に湿らせるため
に、最初に受容側セルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で15分間満たしてから、
供与側セルを満たす。供与側セルは、種々の濃度の、PBS中のグルコース溶液で
満たす。

【００５２】 以下はアルブミンの拡散実験である： グルコースの拡散実験と同様に、同じ拡散チャンバーを使用して、メンブレン
ンの両方の側でアルブミンも測定する。Albumin BCP (ブロモクレゾールパープ
ル、SIGMA)を用いて、アルブミン拡散および／または排除を最初に測定し、定量
化する。全ての実験の出発アルブミン濃度は、チャンバーＡおよびＢでそれぞれ
4 g/dlおよび0.0 mg/dlとする。時間ゼロおよび拡散期間の終点（時間＝330分）
で0.1 mlのサンプルを採る。その後、300μLのアリコートを3 mLの試薬に添加し
、600 nmで吸光度を測定する。ブランクとして試薬に脱イオン水を加えたものを
用いる。BCPアッセイは6 g/dlまでは直線的であったが、1 g/dlより下では正確
ではなかった。チャンバーＡに存在する可能性のある低い濃度のアルブミンに対
しては、Bradford Method（MICRO PROTEIN KIT, SIGMA）を用いてチャンバーＢ
中のタンパク質の存在を測定した。この方法は、クーマシーブリリアントブルー
（Coomassie brilliant blue）の未知タンパク質との結合を定量化し、この結合
量を、種々の量の標準タンパク質との結合量と比較する。アルブミンを標準タン
パク質として使用する。この方法は、タンパク質10 mg/dlもしくは0.1 g/dlにま
で至る感度で、検量線を用いて、1〜100マイクログラムのタンパク質を定量化す
る。吸光度は595 nmで測定する。

【００５３】メンブレンの分析 グルコースの拡散を３つのタイプのメンブレンについて測定した：シリコン微
細機械加工メンブレン（平均孔径＝0.0245ミクロン）、WHATMAN ANODISCメンブ
レン（平均孔径＝0.02ミクロン）、およびMF-MILLIPORE酢酸硝酸混合セルロース
メンブレン（平均孔径＝0.025ミクロン）。

【００５４】 アルブミン実験の結果を以下の表に示す。

【００５５】

【００５６】 アルブミンの存在は、グルコースのメンブレン通過を妨げるとは考えられない
し、グルコースの輸送を遅くするとも考えられない。微細機械加工のメンブレン
を通して拡散するアルブミンの量は検出できない。しかしながら、同じメンブレ
ンがグルコースの拡散は示す。微細機械加工メンブレンは、グルコースの拡散を
許す一方で、アルブミンの完全排除（検出限界の範囲内まで）を達成することが
できる。拡散速度を市販のメンブレンのそれと比較すると、微細機械加工のメン
ブレンは、同じような孔径を有するMILLIPOREメンブレンおよびアルミナWHATMAN
メンブレンに匹敵するグルコース拡散特性を有する。

【００５７】 微細機械加工メンブレンを通るアルブミンの通過を、チャンバーＡおよびチャ
ンバーＢ中のアルブミン濃度の変化を経時的に見ることにより測定する。BCPア
ッセイを用いたが、チャンバーＢには検出可能なアルブミンの痕跡はない。しか
しながら、チャンバーＢ中のアルブミンの量が、このアッセイシステムの検出限
界より下である可能性がある。それで、ブラッドフォード法も採用した。このマ
イクロアッセイを用いたところ、微細機械加工メンブレンでは、再び、チャンバ
ーＢには検出可能な量のアルブミンは見出されなかったが、MILLIPOREまたはWHA
TMANメンブレンを使った場合は、両者ともチャンバーＢに少量のタンパク質が見
出された。420分後にチャンバーＢ中で検出されたアルブミンの量は、MILLIPORE
およびWHATMANメンブレンについてはそれぞれ約0.25 g/dLおよび0.20 g/dLであ
った。

【００５８】 グルコースは、勿論、市販のメンブレンと同じような速度で微細機械加工メン
ブレンを通って拡散する。同時に、アルブミンの通過は排除される。グルコース
とアルブミンンの混合溶液では、グルコースだけが微細機械加工メンブレンを通
って拡散する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施形態で使用するメンブレンの製作方法を示す図である。

【図２】 本発明の実施形態で使用するメンブレンの製作方法を示す図である。

【図３】 本発明の実施形態で使用するメンブレンの製作方法を示す図である。

【図４】 本発明の実施形態で使用するメンブレンの製作方法を示す図である。

【図５】 本発明の実施形態で使用するメンブレンの製作方法を示す図である。

【図６】 本発明の実施形態で使用するメンブレンの製作方法を示す図である。

【図７】 本発明の実施形態で使用するメンブレンの製作方法を示す図である。

【図８】 本発明の実施形態で使用するメンブレンの製作方法を示す図である。

【図９】 本発明の実施形態で使用するメンブレンの製作方法を示す図である。

【図１０】 埋め込み型アナライトセンサーの断面図である。

【図１１】 埋め込み型アナライトセンサーの分解組立図である。

【図１２】 埋め込み型アナライトセンサーの断面図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年２月２２日（２００１．２．２２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１５】 前記埋め込み型アナライトセンサーがグルコースセンサー
である、請求項１１に記載の方法。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１０月１７日（２００２．１０．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）基板、 （ｂ）該基板上にある電極、および （ｃ）該電極上にあるメンブレン、 を含んでなり、該メンブレンが元素状シリコンから構成されることを特徴とする
   埋め込み型アナライトセンサー。
2. 【請求項２】 （ｄ）前記電極に電気的に接続されたマイクロエレクトロニ
   クス回路、をさらに含んでなる、請求項１に記載の埋め込み型アナライトセンサ
   ー。
3. 【請求項３】 （ｅ）前記電極に電気的に接続されたリード線、をさらに含
   んでなる、請求項１に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
4. 【請求項４】 （ｅ）前記電極に電気的に接続されたリード線、をさらに含
   んでなり、該リード線が、前記マイクロエレクトロニクス回路を経て該電極に電
   気的に接続されている、請求項２に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
5. 【請求項５】 前記マイクロエレクトロニクス回路がトランスミッターおよ
   び電源を含む、請求項２に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
6. 【請求項６】 （ｆ）前記基板および前記メンブレンを取り囲むコート層、
   をさらに含んでなる、請求項１に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
7. 【請求項７】 前記コート層が内部コート層および外部コート層を含む、請
   求項６に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
8. 【請求項８】 前記基板が元素状シリコンから構成される、請求項１に記載
   の埋め込み型アナライトセンサー。
9. 【請求項９】 前記メンブレンが微細機械加工により製作される、請求項１
   に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
10. 【請求項１０】 前記埋め込み型アナライトセンサーがグルコースセンサー
    である、請求項１に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
11. 【請求項１１】 電極をメンブレンで覆うことを含んでなる埋め込み型アナ
    ライトセンサーの製作方法であって、 該電極が基板上にあり、かつ、該メンブレンが元素状シリコンから構成される
    ことを特徴とする、上記方法。
12. 【請求項１２】 前記メンブレンを、元素状シリコンを微細機械加工するこ
    とにより形成することをさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記メンブレンおよび前記基板をコート層で取り囲むこと
    をさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記メンブレンを微細機械加工により製作する、請求項１
    １に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記埋め込み型アナライトセンサーがグルコースセンサー
    である、請求項１１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 基板上にある電極および該電極を覆うメンブレンを含む埋
    め込み型アナライトセンサーにおいて、その改良点は、該メンブレンが元素状シ
    リコンから構成されることからなる、上記埋め込み型アナライトセンサー。
17. 【請求項１７】 （１）電気化学的にアナライトを測定する手段、および （２）該手段上にあるメンブレン、 を含んでなり、該メンブレンが元素状シリコンから構成されることを特徴とする
    埋め込み型アナライトセンサー。
18. 【請求項１８】 （ａ）基板、 （ｂ）該基板上にある電極、および （ｃ）該電極上にあるメンブレン、 を含んでなり、該メンブレンが微細機械加工により製作されることを特徴とする
    埋め込み型アナライトセンサー。
19. 【請求項１９】 （ａ）基板、 （ｂ）該基板上にある電極、および （ｃ）該電極上にあるメンブレン、 を含んでなり、in vivoで1日当り20％より少ないシグナルドリフトを示すことを
    特徴とする埋め込み型アナライトセンサー。
20. 【請求項２０】 前記センサーが、 in vivoで1日当り10％より少ないシグ
    ナルドリフトを示す、請求項１９に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
21. 【請求項２１】 前記センサーが、 in vivoで1日当り5％より少ないシグナ
    ルドリフトを示す、請求項１９に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
22. 【請求項２２】 （ｄ）前記電極に電気的に接続されたマイクロエレクトロ
    ニクス回路、をさらに含んでなる、請求項１９に記載の埋め込み型アナライトセ
    ンサー。
23. 【請求項２３】 （ｅ）前記電極に電気的に接続されたリード線、をさらに
    含んでなる、請求項１９に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
24. 【請求項２４】 （ｅ）前記電極に電気的に接続されたリード線、をさらに
    含んでなり、該リード線が、前記マイクロエレクトロニクス回路を経て該電極に
    電気的に接続されている、請求項２２に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
25. 【請求項２５】 前記マイクロエレクトロニクス回路がトランスミッターお
    よび電源を含む、請求項２２に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
26. 【請求項２６】 （ｆ）前記基板および前記メンブレンを取り囲むコート層
    、をさらに含んでなる、請求項１９に記載の埋め込み型アナライトセンサー。
27. 【請求項２７】 前記コート層が内部コート層および外部コート層を含む、
    請求項２６に記載の埋め込み型アナライトセンサー。