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JP2003523943A - Ｉｌ−１ｌ１遺伝子およびポリペプチド生成物 - Google Patents

Ｉｌ−１ｌ１遺伝子およびポリペプチド生成物

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JP2003523943A
JP2003523943A JP2001511187A JP2001511187A JP2003523943A JP 2003523943 A JP2003523943 A JP 2003523943A JP 2001511187 A JP2001511187 A JP 2001511187A JP 2001511187 A JP2001511187 A JP 2001511187A JP 2003523943 A JP2003523943 A JP 2003523943A
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JP
Japan
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gene
sequence
protein
polypeptide
nucleic acid
Prior art date
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Abandoned
Application number
JP2001511187A
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Inventor
ニックリン，マーティン
バートン，ジェニー
Original Assignee
インターリューキン ジェネティックス インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by インターリューキン ジェネティックス インコーポレイテッド filed Critical インターリューキン ジェネティックス インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、インターロイキン−１遺伝子座によってコードされている新規な遺伝子IL-1L1 遺伝子の発見に関する。該遺伝子は、IL-1 βをコードしている遺伝子とIL-1 レセプターアンタゴニストをコードしている遺伝子との間に存在しており、IL-1 アゴニストタンパク質およびIL-1 アンタゴニストタンパク質と相同なポリペプチドをコードしている。これらの分子を利用した治療法、診断法およびスクリーニングアッセイについても開示している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 １．発明の背景 インターロイキン−１（IL-1）遺伝子クラスターは、炎症反応を制御する多数
の関連ポリペプチドをコードしている。IL-1 遺伝子クラスターは、ヒトの２番
染色体（2q13）の長腕に存在しており、430kbの領域内にIL-1 α（IL-1A によっ
てコードされている）、IL-1β（IL-1B によってコードされている）および IL-
1レセプターアンタゴニスト（IL-1ra 、IL-1RN によってコードされている）を
含む少なくとも３種類のインターロイキン−１シグナル伝達リガンド（signalin
g ligand）に対する遺伝子を有する（ニックリン（Nicklin）ら、(1994) Genomi
cs 19:382-4）。アゴニスト分子であるIL-1 αおよびIL-1βは、強力な前炎症
活性を有しており、多様な炎症カスケードを引き起こす。例えば、IL-1 αおよ
びIL-1βサイトカインは、IL-6 およびIL-8 などの他のサイトカイン類の産生を
刺激し、そのことが白血球の活性化および損傷組織への集結、ならびに血管作用
物質の局所産生の引き金になっている。IL-1 アゴニスト活性の発揮が不適切で
あることが、自己免疫性疾患ならびに変型関節炎、炎症性腸疾患および乾癬を含
む炎症性疾患の病態において中心的な役割を果たしていると考えられる。これと
は対照的に、IL-1 レセプターアンタゴニスト（IL-1ra）は、炎症カスケードを
誘起することなく、ある種のIL-1 レセプターに競合的に結合することにより、I
L-1 アゴニストのシグナル導入を阻止する。従って、IL-1 レセプターアンタゴ
ニスト活性の不足によっても自己免疫性疾患および炎症性疾患の病態が進行する
可能性があり、そのようなIL-1 レセプターアンタゴニストはこのような疾患お
よび状態の治療用として有用な物質を提供することができると考えられる。
【０００２】 IL-1 アゴニストは、少なくとも２種類のレセプターを介して作用する。Ｉ型
のIL-1 レセプター（IL-1RI）は細胞の内部にシグナルを伝達するが、II型のレ
セプター（IL-1RII）はシグナルを伝達しないことから、「おとり」レセプター
として知られている。細胞のIL-1 に対する反応性は、IL-1RI レセプターとIL-1
RII レセプターとの比に影響され、このことは、IL-1RI をIL-1 依存的に活性化
させるIL-1 レセプターアクセサリータンパク質（IL-1 receptor accessory pro
tein ：IL-1RAcP）と呼ばれる第三の膜タンパク質との相互作用に競合するよう
に見受けられる（ラング（Lang）ら、(1998) J. Immunol. 161:6871-7）。IL-1
のＩ型レセプターは、Ｔ細胞、繊維芽細胞および上皮細胞上に発現される（シム
ス（Sims）ら、(1988) Science 241:585-9）が、IL-1 のII型レセプターは、Ｂ
細胞、好中球およびマクロファージ上に発現される（ボムツィック（Bomsztyk）
ら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8034-8）。IL-1a およびIL-1b の
リガンドはどちらもＩ型およびII型のIL-1 レセプターに結合し、サイトカイン
としてのそれらの生物学的活性は類似しているが、IL-1a の見かけの親和性はIL
-1RI に対して高く、一方、IL-1b の見かけの親和性はIL-1RII に対して高い。
【０００３】 IL-1 レセプターアンタゴニストは、構造的にはIL-1a およびIL-1b と相同で
あり、IL- 1 のＩ型レセプターに結合するが、生物学的には不活性であることか
ら、IL-1 の競合阻害剤として作用する。ある種の細胞型においては、IL-1 レセ
プターアンタゴニストのmRNA は選択的にスプライスされ、２つの異なる第一エ
クソンに組み込まれる。選択的にスプライスされたもののうちのひとつは分泌さ
れるが、もうひとつは細胞質内にとどまっており、この細胞内貯留型のIL-1 レ
セプターアンタゴニストの機能についてはわかっていない。急性タンパク質とし
ての前炎症性サイトカインに応答して、肝細胞（hepatocytes）は細胞質貯留型
ではなく分泌型のIL-1ra を産生する（ガベイ（Gabay）ら、(1997) J. Clin. In
vest. 99:2930-40）。IL-1 レセプターアンタゴニストの用途については、多数
の炎症性疾患および状態の治療への使用が考えられている（米国特許）。
【０００４】 IL-1RN 遺伝子の遺伝的多様性は、ある種の炎症性疾患および状態の病因に関
与しているものと考えられる。ヒトIL-1RN 遺伝子の２番目のイントロンは、86b
pからなる配列の可変数縦列反復配列（variable number of tandem repeats:VNT
R）によって引き起こされる多形性を包含している（ターロウ（Tarlow）ら、(19
93) Hum. Genet. 91:403-4）。ヒトにおいては、この多形性に関して少なくと
も５個の対立遺伝子が存在しており、このIL-1RN VNTR 多形性のうちの特定の対
立遺伝子（すなわち、IL-1RN VNTR 対立遺伝子２）は、炎症性症状を有する数種
の疾患において、より深刻な臨床症状に関連しており、そのような疾患としては
、歯根膜疾患（米国特許第5,686,246号）、骨粗鬆症（米国特許第5,698,399号）
、紅斑性狼瘡（ブラケモア（Blakemore）ら、(1994) Arthritis Rheum. 37:1380
-5）、潰瘍性大腸炎（マンスフィールド（Mansfield）ら、(1994) Gastroentero
logy 106:637-42）および円形脱毛症（ターロウ（Tarlow）ら、(1993) Hum. Ge
net. 91:403-4）、ならびに糖尿病性腎臓病（WO 98/15653 、ブラケモア（Blake
more）ら、(1996) Hum. Genet. 97:369-74を参照）などが挙げられる。IL-1RN(V
NTR)に結合しているIL-1のその他の多形対立遺伝子も慢性閉鎖性気道疾患（WO 9
9/24615）および冠状動脈疾患（WO 98/40517）などのような様々な炎症性疾患ま
たは症状に関連していることが見出されている。様々な感染性疾患、自己免疫性
疾患および外傷を有する患者においては、インターロイキン−1ra の血中レベル
が上昇している。さらに、炎症性疾患のリスク上昇に関連があるヒトのIL-1 遺
伝子座のハプロタイプについての特徴が明らかにされている（WO 98/54359）。
【０００５】 ２．発明の概要 本発明は、一部においては、インターロイキン−1レセプターアンタゴニスト
タンパク質（IL-1ra）およびインターロイキン−1（IL-1）と配列相同性を有す
る新規なタンパク質をコードしているヒトおよびマウスの新規な遺伝子の発見に
基づく。本明細書に記載している新規に同定されたタンパク質および核酸は「IL
-1L1 群」と称され、本明細書中には本遺伝子のヒトおよびマウスの相同遺伝子
（ホモログ）を用いて例示している。ヒトIL-1L1遺伝子（本明細書においてはhI
L-1L1と称する）転写体は図１に示しており、2562個のヌクレオチドからなる共
通配列（配列番号１）、ならびに39個のヌクレオチドからなる５’配列（配列番
号２）および42ヌクレオチドからなる５’配列（配列番号３）の２種の５’配列
を含む。hIL-1L1遺伝子転写体は、５’および３’非翻訳領域、ならびに図３の
（A）に示す155個のアミノ酸から構成されるhIL-1L1ポリペプチドをコードして
いる465個のヌクレオチドからなるオープンリーディングフレーム（配列番号４
）を含む。hIL-1L1 遺伝子は胎盤において多量に発現され、胸腺組織においても
若干発現されている（図７）。hIL-1L1タンパク質の全長をコードしているcDNA
を含む核酸は、1999年×月×日 にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）（バージニア州マナサス、ユニバー
シティー通り1801番地、郵便番号20110-2209；電話番号＋01(703) 365-2700）に
寄託されており、ATCC 受け入れ番号は×××××である。hIL-1L1遺伝子転写体
は特に長い約２kbの３’非翻訳領域（UTR）を有する。
【０００６】 hIL-1L1のマウスの相同遺伝子も単離されており、本明細書においてはmIL-1L1
と称する。1284個のヌクレオチドからなるmIL-1L1遺伝子転写体は図２（配列番
号４）に示しており、５’および３’非翻訳領域、ならびに図３の(B)（配列番
号６）に示す155個のアミノ酸から構成されるmIL-1L1ポリペプチドをコードして
いる465個のヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを含む。mIL-1
L1ポリペプチド配列はhIL-1L1のそれと90％の同一性を示し（図４）、このこと
は、コードされているIL-1L1生成物が進化の過程を通して高度に保存されている
ことを示唆している。マウスのIL-1L1ポリペプチドをコードしている cDNA を含
む核酸は、1999年×月×日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
American Type Culture Collection）（メリーランド州ロックヴィル、パークロ
ーン通り12301番地）に寄託されており、ATCC 受け入れ番号は×××××である
。mIL-1L1遺伝子転写体は約0.7kbの３’UTR を有する。mIL-1L1の３’UTR はhIL
-1L1の３’UTR とは部分的に相同性を有するのみである。５’−ACAATNAAAANCCC
NGATNCTTGGTCTCTANTCNCATNAAAA−３’（配列番号12）に相当する41個のヌクレオ
チドからなる保存性の共通配列は、配列番号１（hIL-1L1）においてはヌクレオ
チド番号1137から始まり、配列番号４（mIL-1L1）においてはヌクレオチド番号1
146から始まることが確認されている。
【０００７】 BLAST プログラム（アルツシュル（Altschul）ら、(1990) J. Mol. Biol. 215
:403 ）を用いたアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の解析から、新規に同定
されたヒトおよびマウスのIL-1L1タンパク質および核酸中の一部のアミノ酸配列
および核酸配列は、他のIL-1 遺伝子およびそれらによってコードされているポ
リペプチドとある程度の配列類似性を有することが明らかになった。特に、本発
明のIL-1L1ポリペプチドは、IL1 ドメイン、カゼインキナーゼII ホスホリル化
部位、ミリスチル化（myristylation）配列、膜貫通セグメント、ならびにIL-1
アゴニストおよびアンタゴニストと同種のセグメントのうちのひとつまたはそれ
以上によって確認されるヒトおよびマウスのIL-1L1ポリペプチド配列を含む。
【０００８】 ４．発明の詳細な説明 ４．１一般的事項 本発明は、一部においては、IL−1レセプターアンタゴニスト（IL-1ra）およ
び IL-1 βポリペプチドと相同なタンパク質をコードしているIL-1 遺伝子クラ
スター遺伝子座内に存在する遺伝子の発見に基づく。従って、IL-1L1タンパク質
は、前炎症性サイトカイン（IL-1 β）ならびに炎症性サイトカイン（IL-1ra）
と関連がある。IL-1L1遺伝子という名は、この遺伝子がIL-1 β（IL-1 Beta）を
コードしている遺伝子とIL-1 レセプターアンタゴニスト（IL-1 Receptor antag
onist ）をコードしている遺伝子との間（Interval）に存在するという事実に由
来している。従って、本明細書に開示している遺伝子およびタンパク質をIL-1L1
遺伝子およびIL-1L1タンパク質と称する。
【０００９】 IL-1L1 遺伝子は、IL-1 クラスターを含む680kbのCEPH 酵母人工染色体（YAC
）クローン766E12（ノスワン（Nothwang）ら、(1997)）を用いて単離した。YAC
クローン766E12 は、パルスフィールド電気泳動を行うことによってクローンを
生成している酵母株から単離し、得られたDNAは、IL-1 がコードされている伝達
暗号を選択する際のドライバーとして使用した（モーガン（Morgan）ら、(1992)
Nucleic. Acids Res. 20:5173-79）。cDNA は、10 ng/ml のホルボールミリス
テートアセテートおよび100 ng/ml の大腸菌（E. coli）リポ多糖類の存在下で
６時間培養したヒト末梢血単核細胞から得た。
【００１０】 選択したcDNA を増幅させ、増幅したcDNA フラグメントは、２サイクルのアフ
ィニティー選択を行い、さらに増幅させた後、pNEB193 にクローニングした。得
られたクローンの中からランダムに選択した100個のサンプルについて、すべて
シークエンスを行った。IL-1L1発現配列タグ（EST）は、約530bpからなる連続配
列を構成している３個の重複cDNA フラグメント由来の重複配列のうちのひとつ
に対応していた。この配列は、374bpからなるヒトの胎盤由来のcDNA（ジェンバ
ンク（GenBank）受入れ番号R70041）および348bpからなるヒトの胎盤のcDNA（ジ
ェンバンク（GenBank）受入れ番号R70089）と相同であることが見出された。試
験を行ったところ、該配列は、ジングリッチ（Gingrich）ヒトPAC ライブラリー
由来のP1人工染色体131J6と特異的にハイブリダイズすることが見出されたこと
から、ICRF ヒトP1ライブラリー（ノスワン（Nothwang）ら、(1996) Genomics 4
1:370-8）に由来し、ICRF 700G1305 に隣接するIL1B 遺伝子とIL1RN 遺伝子との
間に位置づけられた。この後者のクローンは、IL-1ra 遺伝子（IL1RN）を含む。
データベースのEST 配列内にもこれらの新規なEST 配列内にもオープンリーディ
ングフレームは存在しておらず、さらに分析をおこなったところ、これらの配列
は、遺伝子伝達暗号の３’非翻訳領域（UTR）内に含まれていることが明らかに
なった。
【００１１】 ５．実施例 ５．１ヒトおよびマウスのIL-1L1のクローニングおよび分析 ヒトの炎症反応に関与している可能性があるインターロイキン−１遺伝子クラ
スター（ニックリン（Nicklin）ら、(1996)）内に存在する新規な遺伝子を発見
することを目的として、発明者らは、IL-1 クラスターを含む680kbのCEPH 酵母
人工染色体（YAC）クローン766E12 を産生する酵母（ノスワン（Nothwang）ら、
(1996)）を入手し、パルスフィールド電気泳動を行うことによって染色体を単離
した。モーガン（Morgan）らの記載(1992)に従い、cDNA 選択法におけるドライ
バーとして該染色体を使用した。cDNA は、10 ng/ml のホルボールミリステート
アセテートおよび100 ng/ml の大腸菌（E. coli）リポ多糖類の存在下で６時間
培養したヒト末梢血単核細胞から得た。cDNA は記載に従って増幅させ、cDNA フ
ラグメントは、２サイクルのアフィニティー選択を行い、さらに増幅させた後、
pNEB193 にクローニングした。ランダムに選択した100個のサンプルについて、
すべてシークエンスを行った。配列を重複ユニット内に集めた。IL-1L1発現配列
タグ（EST）は、約530bpからなる連続配列を構成している３個の重複フラグメン
ト（発明者らの記録ではe031 およびe049）由来の重複配列のうちのひとつに対
応していた。この配列は、既に報告されている２つのEST クローンR70041および
R70089とも重複していることが見出された。試験を行ったところ、該配列は、ジ
ングリッチ（Gingrich）ヒトPAC ライブラリー由来のP1人工染色体131J6と特異
的にハイブリダイズすることが見出されたことから、ICRF ヒトP1ライブラリー
（ノスワン（Nothwang）ら、(1996) Genomics 41:370-8）に由来し、ICRF 700G1
305 に隣接するIL1B 遺伝子とIL1RN 遺伝子との間に位置づけられた。この後者
のクローンは、IL-1ra 遺伝子（IL1RN）を含む。データベースのEST 配列内にも
発明者らの新規なEST 配列内にもオープンリーディングフレームは存在していな
かった。
【００１２】 EST DNA をプローブとして使用し、HGMP 由来のH9 胎盤cDNA プラスミドライ
ブラリーからcDNA を単離した。このクローンの長さは1.6kbしかなかったが、ポ
リアデニル化されていたにもかかわらず、コード配列を含んではいなかった。全
クローンのシークエンスを行い、５’末端配列を用いることにより、胎盤由来の
IL-1L1 cDNA の５’末端のプライマー依存性増幅（primer dependent amplifica
tion）を行った。生成物の長さは約1.1kbであり、cDNA クローンの配列と重複し
ていた。増幅反応のために多数のの５’プライマーのセットを使用することによ
り、２つの異なる非コード５’末端を含むと思われる５個以上の別異の単離体（
各５’末端につき少なくとも２個の単離体）を得ており、それらは図１に示して
いる。mRNA の推定総全長は2.6kbと計算された。コード配列には最初の600個ま
でのヌクレオチドが含まれていた。予測されるクローニングエラーを排除すると
、すべてのcDNA 配列（発明者らが全体をシークエンスしたのは３個）は同一の
タンパク質をコードしており、このことから、リーダー配列は存在しないと考え
られた。確かに、発明者らが本明細書において報告している配列と同一のヒトの
cDNA が既に報告されている（ムレロ（Mulero）ら、(1999) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 263:702-6；スミス（Smith）ら、(2000) J. Biol. Chem. 275:116
9-75；バスフィールド（Busfield）ら、(2000) Genomics 66:213-6）。
【００１３】 IL-1L1 のゲノムのシークエンスおよびマッピング：PAC 131J6 のサブクロー
ンはXba I およびEcoR-I で切断したDNA から作出し、プライマーウォーキング
によってシークエンスを行った。両鎖から少なくとも一回は良好な解析結果が得
られた。IL-1L1 遺伝子は6072個のヌクレオチドからなり、これは図１１に示し
ている。イントロン−エクソン境界の位置は図１０のｂに示しており、これは、
既にIL-1 構造ファミリーの他の遺伝子群について記載されているように、IL-1R
N のイントロン−エクソン境界の位置と非常に類似している。PAC 131J6 由来の
シークエンス済みの全セグメント（6540個のヌクレオチドからなる、受入番号AJ
271338）は、エクソン１の450ヌクレオチド上流からポリアデニル化部位の18ヌ
クレオチド下流までの中に６個のエクソンを含む。最近、PAC RP11-339F22 のハ
イスループットゲノム配列（受入番号AC016724）もEMBL データベースに寄託さ
れた。相違を調べるために初期のデータを再確認したところ、発明者らのゲノム
配列は、データベースの配列と44の位置（0.67％）において異なっていた。PAC
RP11-339F22 は195kbのゲノム性挿入体（インサート）を含んでいるが、現時点
ではこの挿入体に12個の非重複フラグメントが確認されている。既知のマーカー
の位置（ヒルダーブラント（Hilderbrandt）ら、(1996) Cytogenet. Cell Genet
. 73:235-239）を利用する目的で12個のフラグメントのうちの11個を配置し、さ
らに、IL-1RN 遺伝子座のうちの位置が定まっている配列を配置した。制限酵素
地図ならびにIL-1L1 由来の５’および３’プローブを用いたハイブリダイゼー
ションにより、残りのフラグメントの位置を定め、他のフラグメントの方向を定
めることができた。故に、IL-1L1 はSTSマーカーの10H8S と131P6S との間に配
置され、131P6S 方向に転写される。IL-1RN 内の３個のギャップから示唆される
ように、AC016724 から排除される配列は小さいと考えられることから、IL-1L1
のポリアデニル化シグナルはIL-1RN の第一エクソンの５’側約53kbの位置に存
在しており、２個の遺伝子は同方向を向いていると結論づけた。発明者らのこれ
までのマッピングから、このことは、IL-1L1 とIL-1B との間に約270kbの隔たり
があることを意味している。
【００１４】 ヒトとマウスのIL-1Lクラスター間に断絶が生じたことから（ザヘディ（Zahed
i）ら、(1991) J. Immunol. 146:4228-33）、種間におけるIL-1L1 転写体の相違
は、マウスIL-1L1 のエクソン６内に存在する分裂によるものであるか否かを考
察した。マウスIL-1L1 cDNA プローブを用いて129/Sv RPCI21 ライブラリー（イ
オアノー（Ioannou）ら、(1996)、ドラコポリ（Dracopoli）ら編、「ヒト遺伝子
に関する最新プロトコール（Current Protocols in Human Genetics）」より、5
.15.1−5.15.24、ウィレー（Wiley）社、ニューヨーク）由来のマウスPAC クロ
ーンについてスクリーニングを行い、３個のプラスミドを得たが、このうちの２
個がIl1rn をも含んでおり、これらのことから、Il1l1 およびIl1rn が隣接して
存在しており、また、相同領域の断絶はIl1l1 とIl1rn との間よりもむしろIl1b
とIl1l1 との間において生じるという明らかな証拠が得られた。ズーブロット
（クロンテック（Clontech）社）のストリンジェンシーの低いハイブリダイゼー
ションにより、真獣類のすべての種にIL-1L1 遺伝子が存在することが明らかに
なった（図８）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ２種の５’末端を有する２つのヒトIL-1L1のcDNA の核酸配列
【図２】 マウスIL-1L1のcDNA 配列の核酸配列
【図３】 ヒトIL-1L1およびマウスIL-1L1によってコードされている推定ポリペプチド配
列
【図４】 ヒトおよびマウスのIL-1L1のポリペプチド配列の比較
【図５】 ヒトIL-1L1のポリペプチド配列およびヒトのプロ−IL-1ra ポリペプチド配列
の比較
【図６】 IL-1L1遺伝子生成物の３種の組換え体のポリペプチド配列
【図７】 ヒトIL-1L1の伝達暗号の組織分布を示すノーザンブロット
【図８】 哺乳類中のIL-1L1遺伝子配列の保存性を示すズーブロット
【図９】 ヒトの２番染色体におけるIL-1遺伝子座内のIL-1L1遺伝子の染色体位置、なら
びにIL-1L1遺伝子のイントロン／エクソン構造
【図１０】 IL-1L1転写体のスプライシングの詳細
【図１１】 IL-1L1遺伝子の全ゲノム配列
【図１２】 JEG-3 細胞由来の天然型IL-1L1タンパク質の免疫沈降
【図１３】 ヒトおよびマウスのIL-1L1遺伝子とヒトにおけるその他のIL-1 様遺伝子ファ
ミリーとの並記
【手続補正書】
【提出日】平成１４年８月１４日（２００２．８．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 IL-1L1遺伝子およびポリペプチド生成物
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 １．発明の背景 インターロイキン−１（IL-1）遺伝子クラスターは、炎症反応を制御する多数
の関連ポリペプチドをコードしている。IL-1 遺伝子クラスターは、ヒトの２番
染色体（2q13）の長腕に存在しており、430kbの領域内にIL-1 α（IL-1A によっ
てコードされている）、IL-1β（IL-1B によってコードされている）および IL-
1レセプターアンタゴニスト（IL-1ra 、IL-1RN によってコードされている）を
含む少なくとも３種類のインターロイキン−１シグナル伝達リガンド（signalin
g ligand）に対する遺伝子を有する（ニックリン（Nicklin）ら、(1994) Genomi
cs 19:382-4）。アゴニスト分子であるIL-1 αおよびIL-1βは、強力な前炎症
活性を有しており、多様な炎症カスケードを引き起こす。例えば、IL-1 αおよ
びIL-1βサイトカインは、IL-6 およびIL-8 などの他のサイトカイン類の産生を
刺激し、そのことが白血球の活性化および損傷組織への集結、ならびに血管作用
物質の局所産生の引き金になっている。IL-1 アゴニスト活性の発揮が不適切で
あることが、自己免疫性疾患ならびに変型関節炎、炎症性腸疾患および乾癬を含
む炎症性疾患の病態において中心的な役割を果たしていると考えられる。これと
は対照的に、IL-1 レセプターアンタゴニスト（IL-1ra）は、炎症カスケードを
誘起することなく、ある種のIL-1 レセプターに競合的に結合することにより、I
L-1 アゴニストのシグナル導入を阻止する。従って、IL-1 レセプターアンタゴ
ニスト活性の不足によっても自己免疫性疾患および炎症性疾患の病態が進行する
可能性があり、そのようなIL-1 レセプターアンタゴニストはこのような疾患お
よび状態の治療用として有用な物質を提供することができると考えられる。
【０００２】 IL-1 アゴニストは、少なくとも２種類のレセプターを介して作用する。Ｉ型
のIL-1 レセプター（IL-1RI）は細胞の内部にシグナルを伝達するが、II型のレ
セプター（IL-1RII）はシグナルを伝達しないことから、「おとり」レセプター
として知られている。細胞のIL-1 に対する反応性は、IL-1RI レセプターとIL-1
RII レセプターとの比に影響され、このことは、IL-1RI をIL-1 依存的に活性化
させるIL-1 レセプターアクセサリータンパク質（IL-1 receptor accessory pro
tein ：IL-1RAcP）と呼ばれる第三の膜タンパク質との相互作用に競合するよう
に見受けられる（ラング（Lang）ら、(1998) J. Immunol. 161:6871-7）。IL-1
のＩ型レセプターは、Ｔ細胞、繊維芽細胞および上皮細胞上に発現される（シム
ス（Sims）ら、(1988) Science 241:585-9）が、IL-1 のII型レセプターは、Ｂ
細胞、好中球およびマクロファージ上に発現される（ボムツィック（Bomsztyk）
ら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8034-8）。IL-1αおよびIL-1βの
リガンドはどちらもＩ型およびII型のIL-1 レセプターに結合し、サイトカイン
としてのそれらの生物学的活性は類似しているが、IL-1αの見かけの親和性はIL
-1RI に対して高く、一方、IL-1βの見かけの親和性はIL-1RII に対して高い。
【０００３】 IL-1 レセプターアンタゴニストは、構造的にはIL-1αおよびIL-1βと相同で
あり、IL- 1 のＩ型レセプターに結合するが、生物学的には不活性であることか
ら、IL-1 の競合阻害剤として作用する。ある種の細胞型においては、IL-1レセ
プターアンタゴニストのmRNA は選択的にスプライスされ、２つの異なる第一エ
クソンに組み込まれる。選択的にスプライスされたもののうちのひとつは分泌さ
れるが、もうひとつは細胞質内にとどまっており、この細胞内貯留型のIL-1 レ
セプターアンタゴニストの機能についてはわかっていない。急性タンパク質とし
ての前炎症性サイトカインに応答して、肝細胞（hepatocytes）は細胞質貯留型
ではなく分泌型のIL-1ra を産生する（ガベイ（Gabay）ら、(1997) J. Clin. In
vest. 99:2930-40）。IL-1 レセプターアンタゴニストの用途については、多数
の炎症性疾患および状態の治療への使用が考えられている（米国特許）。
【０００４】 IL-1RN 遺伝子の遺伝的多様性は、ある種の炎症性疾患および状態の病因に関
与しているものと考えられる。ヒトIL-1RN 遺伝子の２番目のイントロンは、86b
pからなる配列の可変数縦列反復配列（variable number of tandem repeats:VNT
R）によって引き起こされる多型性を包含している（ターロウ（Tarlow）ら、(19
93) Hum. Genet. 91:403-4）。ヒトにおいては、この多型性に関して少なくと
も５個の対立遺伝子が存在しており、このIL-1RN VNTR 多型性のうちの特定の対
立遺伝子（すなわち、IL-1RN VNTR 対立遺伝子２）は、炎症性症状を有する数種
の疾患において、より深刻な臨床症状に関連しており、そのような疾患としては
、歯根膜疾患（米国特許第5,686,246号）、骨粗鬆症（米国特許第5,698,399号）
、紅斑性狼瘡（ブラケモア（Blakemore）ら、(1994) Arthritis Rheum. 37:1380
-5）、潰瘍性大腸炎（マンスフィールド（Mansfield）ら、(1994) Gastroentero
logy 106:637-42）および円形脱毛症（ターロウ（Tarlow）ら、(1993) Hum. Ge
net. 91:403-4）、ならびに糖尿病性腎臓病（WO 98/15653 、ブラケモア（Blake
more）ら、(1996) Hum. Genet. 97:369-74を参照）などが挙げられる。IL-1RN(V
NTR)に結合しているIL-1のその他の多型対立遺伝子も慢性閉鎖性気道疾患（WO 9
9/24615）および冠状動脈疾患（WO 98/40517）などのような様々な炎症性疾患ま
たは症状に関連していることが見出されている。様々な感染性疾患、自己免疫性
疾患および外傷を有する患者においては、インターロイキン−1ra の血中レベル
が上昇している。さらに、炎症性疾患のリスク上昇に関連があるヒトのIL-1 遺
伝子座のハプロタイプについての特徴が明らかにされている（WO 98/54359）。
【０００５】 IL-1α、IL-1β、IL-1raおよびIL-18は、IL-1様サイトカイン類であり、それ
らの活性については既に報告されている。いずれの型のIL-1（IL-1αおよびIL-1
β、それぞれ、ヒト遺伝子IL-1AおよびIL-1Bによってコードされている）も単一
ドメインタンパク質であり、I型IL-1レセプター（IL-1RAcP）との相互作用を介
して炎症性サイトカインとして作用する。
【０００６】 IL - 1 レセプターアンタゴニスト（IL-1ra 、ヒト遺伝子IL-1RN によってコ
ードされている）のIL-1βに対する同一性は28％であるが、アンタゴニストとし
て作用し、IL-1R1 との結合に関して、IL - 1 と競合することによってIL-1 の
シグナル伝達を阻止する。IL - 1R1 とIL - 1ra とのコンプレックスはIL-1RAcP
を補強しないため、シグナル伝達を活性化することができなかった（グリーン
フェダー（ Greenfeder ）ら、J . Biol . Chem . 270 : 13757 - 13765(1995)
）。IL-18 もIL-1 の相同遺伝子（ホモログ）であるが、別異のレセプター対で
あるIL-18R およびAcPL と特異的に相互作用する（トリゴエ（Torigoe）ら、J.
Biol. Chem. 27:25737-25742 (1997)；ボーン（Born）ら、J. Biol. Chem. 273:
29445-29446(1998) ）。IL-18 レセプターを構成する２つの構成要素は 、IL-1R
1と同様なドメイン構造を有しており、シグナルはトール（Toll）様ドメインを
通過する。同様な細胞内において発現された場合、IL-1 レセプターおよびIL-18
レセプターの下流のシグナル伝達カスケードは類似している（トマセン（ Thom
assen ）ら、J. Interferon Cytokine Res. 18:1077-1088 (1998)）。その他の
３つのIL-1R1 様レセプターであるT1 / ST2（ IL-1RL1 ）（バーガース（Berger
s）ら、EMBO J. 13:1176-1188(1994) ）、IL1R-rp2 （IL-1RL2）（ラヴェンバー
グ（Lovenberg）ら、Neuroimmunol. 70:113-122 (1996)） およびIL1RAPL （キ
ャリー（Carrie）ら、Nat. Genet. 23:25-31(1999) ）はシグナル誘起リガンド
ではないことがわかっているが、ST2の細胞質ドメインは、トランスフェクト細
胞内においてIL-1R1 様シグナルを伝達することが示されている（レイカースト
ーファー（Reikerstorfer）ら、J. Biol. Chem. 28:17645-17648(1995) ）。発
明者らはこれまでに、ヒトの染色体2q13（IL-1α 、IL-1β およびIL-1ra を含
む）から約430kbのゲノム性フラグメント（IL-1クラスター）を単離している（
レイカーストーファー（Reikerstorfer）ら、J. Biol. Chem. 28:17645- 17648(
1995)）。IL-18 は別の染色体上に存在している（ノラン（Nolan）ら、Genomics
51:161-163 (1998)）。
【０００７】 ２．発明の概要 本発明は、一部においては、インターロイキン−1レセプターアンタゴニスト
タンパク質（IL-1ra）およびインターロイキン−1（IL-1）と配列相同性を有す
る新規なタンパク質をコードしているヒトおよびマウスの新規な遺伝子の発見に
基づく。本明細書に記載している新規に同定されたタンパク質および核酸は「IL
-1L1 群」と称され、本明細書中には本遺伝子のヒトおよびマウスの相同遺伝子
（ホモログ）を用いて例示している。ヒトIL-1L1遺伝子（本明細書においてはhI
L-1L1と称する）転写体は図１に示しており、2562個のヌクレオチドからなる共
通配列（配列番号１）、ならびに39個のヌクレオチドからなる５’配列（配列番
号２）および42ヌクレオチドからなる５’配列（配列番号３）の２種の５’配列
を含む。hIL-1L1遺伝子転写体は、５’および３’非翻訳領域、ならびに図３の
（A）に示す155個のアミノ酸から構成されるhIL-1L1ポリペプチドをコードして
いる465個のヌクレオチドからなるオープンリーディングフレーム（配列番号４
）を含む。hIL-1L1 遺伝子は胎盤において多量に発現され、胸腺組織においても
若干発現されている（図７）。hIL-1L1タンパク質の全長をコードしているcDNA
を含む核酸は、1999年×月×日 にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）（バージニア州マナサス、ユニバー
シティー通り1801番地、郵便番号20110-2209；電話番号＋01(703) 365-2700）に
寄託されており、ATCC 受理（Designation）番号は×××××である。hIL-1L1
遺伝子転写体は特に長い約２kbの３’非翻訳領域（UTR）を有する。
【０００８】 hIL-1L1のマウスの相同遺伝子も単離されており、本明細書においてはmIL-1L1
と称する。1284個のヌクレオチドからなるmIL-1L1遺伝子転写体は図２（配列番
号４）に示しており、５’および３’非翻訳領域、ならびに図３の(B)（配列番
号６）に示す155個のアミノ酸から構成されるmIL-1L1ポリペプチドをコードして
いる465個のヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを含む。mIL-1
L1ポリペプチド配列はhIL-1L1のそれと90％の同一性を示し（図４）、このこと
は、コードされているIL-1L1生成物が進化の過程を通して高度に保存されている
ことを示唆している。マウスのIL-1L1ポリペプチドをコードしている cDNA を含
む核酸は、1999年×月×日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
American Type Culture Collection）（メリーランド州ロックヴィル、パークロ
ーン通り12301番地）に寄託されており、ATCC 受理番号は×××××である。mI
L-1L1遺伝子転写体は約0.7kbの３’UTR を有する。mIL-1L1の３’UTR はhIL-1L1
の３’UTR とは部分的に相同性を有するのみである。５’−ACAATNAAAANCCCNGAT
NCTGGTCTCTANTCNCATNAAAA−３’（配列番号12）に相当する41個のヌクレオチド
からなる保存性の共通配列は、配列番号１（hIL-1L1）においてはヌクレオチド
番号1137から始まり、配列番号４（mIL-1L1）においてはヌクレオチド番号1146
から始まることが見出されている。
【０００９】 BLAST プログラム（アルツシュル（Altschul）ら、J. Mol. Biol. 215:403(19
90)）を用いたアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の解析から、新規に同定さ
れたヒトおよびマウスのIL-1L1タンパク質および核酸中の一部のアミノ酸配列お
よび核酸配列は、他のIL-1 遺伝子およびそれらによってコードされているポリ
ペプチドとある程度の配列類似性を有することが明らかになった。特に、本発明
のIL-1L1ポリペプチドは、IL1 ドメイン、カゼインキナーゼII ホスホリル化部
位、ミリスチル化（myristylation）配列、膜貫通セグメント、ならびにIL-1 ア
ゴニストおよびアンタゴニストと同種のセグメントのうちのひとつまたはそれ以
上によって特徴づけられるヒトおよびマウスのIL-1L1ポリペプチド配列を含む。
【００１０】 ひとつの側面から見ると、本発明は、単離されたIL-1L1 核酸分子に関する。
ひとつの実施態様においては、IL-1L1 核酸分子は脊椎動物由来である。好まし
い実施態様においては、IL-1L1 核酸分子は、ヒトなどの哺乳類由来である。さ
らに好ましい実施態様においては、核酸は、配列番号１に示されている核酸配列
もしくはそれらの一部、または、配列番号２もしくは３に示されている２種の選
択的５’末端（alternative 5'ends）のうちのひとつを含む核酸配列を有する。
本発明の別の実施態様においては、核酸は本来マウス由来であり、配列番号４に
示されている核酸配列またはそれらの一部を有する。開示されている分子は、非
コード配列（例えば、プローブ、アンチセンスまたはリボザイム分子など）であ
る場合も、まは機能性IL-1L1 ポリペプチド（例えば、ヒトIL-1L1 ポリペプチド
の生物活性の少なくともひとつに対するアゴニストまたはアンタゴニストとして
作用することによって生物学的活性を特異的に調節するポリペプチドなど）をコ
ードしている場合もある。ひとつの実施態様においては、核酸分子はATCC 受理
番号×××××（hIL-1L1）または×××××（mIL-1L1）に含まれているIL-1L1
遺伝子にハイブリダイズすることができる。別の実施態様においては、本発明
の核酸は、脊椎動物のIL-1L1 遺伝子、または脊椎動物のIL-1L1 遺伝子と相補的
な遺伝子にハイブリダイズすることができる。さらに別の実施態様においては、
本発明の核酸は、図１（配列番号１、２または３）に示す核酸配列またはそれら
と相補的な配列とハイブリダイズすることができる。また別の実施態様において
は、本発明の核酸は、図２（配列番号４）に示す核酸配列またはそれらと相補的
な配列とハイブリダイズすることができる。好ましい実施態様においては、緩和
なストリンジェント条件下、またはストリンジェント条件下においてハイブリダ
イゼーションを行う。
【００１１】 さらに好ましい実施態様においては、核酸分子は、配列番号１、２、３もしく
は４に示す核酸、または、配列番号１、２、３もしくは４に示す核酸の相補配列
との相同性が少なくとも約70％、好ましくは約80％、より好ましくは約85％、さ
らにより好ましくは少なくとも約90％、または95％であるIL-1L1 核酸である。
さらなる実施態様においては、核酸分子は、ATCC 受理番号×××××または×
××××に含まれるIL-1L1 核酸に対する配列類似性が少なくとも約70％、好ま
しくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、さらにより好まし
くは少なくとも約90％または95％であるIL-1L1 核酸である。
【００１２】 また本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび
プライマーを提供するが、このとき該ヌクレオチドは、配列番号１、２もしくは
３に示す配列のうちの少なくとも約６個、少なくとも約10個、少なくとも約15個
、少なくとも約20個、または少なくとも約25個の連続したヌクレオチド、または
配列番号４、あるいはそれらと相補的な配列にハイブリダイズするヌクレオチド
配列の領域に対応しており、好ましい実施態様においては、配列番号10もしくは
11に示す配列、または、天然に存在するそれらの突然変異体もしくは対立遺伝子
変異体にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域に対応している。好ましい
実施態様においては、プローブ／プライマーは、それらに結合している検出可能
なラベル基を追有する。
【００１３】 発現させるためには、例えば、転写プロモーターの少なくともひとつ（例えば
、構造発現用または誘導発現用など）または転写エンハンサー配列などのような
転写制御配列に目的の核酸を機能発揮できるように結合することができる。IL-1
L1 遺伝子転写制御配列は、本発明のIL-1L1 ポリペプチドならびに異種のポリペ
プチドをコードしている配列を制御する特異的な方法を提供する。例えば、IL-1
遺伝子座がコードしている遺伝子は、活性化（IL-1RAcP およびIL-1RI）におい
ても抑制（IL - 1RII）においてもリポ多糖類（LPS）誘起に反応することが示さ
れている（ペントン−ロル（Penton-Rol）J. Immunol. 162:2931-2938(1999)）
。そのような制御配列は、IL-1L1 核酸分子と組み合わせることにより、遺伝子
発現に有用なベクターを提供することができる。さらに本発明は、そのような発
現ベクターを用いてトランスフェクトした原核性または真核性の宿主細胞、なら
びに、そのような発現ベクターを用いてIL-1L1 タンパク質を産生するイン・ビ
トロ（in vitro）（例えば、細胞培養など）法およびイン・ビボ（in vivo）（
例えば、トランスジェニックなど）法について記載している。
【００１４】 別の面から見ると、本発明は、単離されたポリペプチド、好ましくは実質的に
純粋な調製物（例えば、プラズマから精製したポリペプチド、または組換えによ
り生成したポリペプチドなど）に関する。IL-1L1 ポリペプチドは、タンパク質
の全長を含む場合、あるいは、アミノ酸の長さが少なくとも約６個、10個、25個
、50個、75個、100個、125個、130個、135個、140個、145個、150個もしくは155
個である特定のモチーフ／ドメインまたはフラグメントのうちのひとつまたはそ
れ以上に対応する小さなフラグメントを含む場合がある。特に好ましい実施態様
においては、そのようなポリペプチドはIL - 1L1 の生物活性を有しており、例
えば、レセプター、特にインターロイキン−１レセプター（IL-1R）ファミリー
もしくはインターロイキン−１レセプターアクセサリータンパク質（IL-1RAcP）
コレセプターなどに結合することができ、および／または、レセプターの活性を
変化させることができる。
【００１５】 ひとつの実施態様においては、ポリペプチドは、配列番号１、２、３または４
に示されている核酸配列とハイブリダイズする核酸によってコードされている。
好ましい実施態様においては、ポリペプチドは、配列番号10または11に示されて
いるようなIL-1L1遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）に由来する核
酸配列とハイブリダイズする核酸によってコードされている。さらに好ましい実
施態様においては、IL-1L1 ポリペプチドは、配列番号５または配列番号６に示
されているアミノ酸配列を含む。このIL-1L1 タンパク質は、変形されたタンパ
ク質をも包含しており、それらは例えば、変形部位（例えば、チロシン残基、ス
レオニン残基、セリン残基またはアスパラギン残基など）が変化する突然変異、
またはタンパク質のグリコシル化が阻止される突然変異、あるいはシグナル伝達
に関与する細胞内タンパク質とのタンパク質の相互作用が阻止される突然変異な
どによる翻訳後修飾に抵抗性を有するタンパク質などである。
【００１６】 本発明のIL-1L1 ポリペプチドは、グリコシル化することができ、または逆に
、発現系を選択することにより、もしくはグリコシル化を妨げるようにタンパク
質配列を変形することにより、還元型の炭水化物を有するアナログを提供するこ
ともできる。グリコシル化型は、グリコサミノグリカン鎖を誘導体化することに
よっても得ることができる。さらに、内因性のシグナル配列（これは、タンパク
質の前駆体型として存在していても、一般的には解裂されてしまうが）を欠いた
IL-1L1 ポリペプチドを生成することもできる。
【００１７】 さらに別の好ましい実施態様においては、本発明は、野生型のIL-1L1 タンパ
ク質の活性を模倣する、または活性に拮抗するなどの調節能を有する精製された
ポリペプチドまたは組換えポリペプチドに関する。好ましくは、そのようなポリ
ペプチドは、配列番号５または配列番号６に示されている配列と同一または相同
なアミノ酸配列を含む。
【００１８】 本発明を別の面から見ると、IL-1L1 タンパク質を含むキメラ分子（例えば、
融合タンパク質など）に関する。例えば、IL-1L1 ポリペプチドとは無関係な（
異種の）アミノ酸配列を有する第二のポリペプチドなどのような第二のポリペプ
チド部分を含む組換え融合タンパク質としてIL-1L1 ポリペプチドを生成するこ
とができる。好ましいIL-1L1 融合タンパク質としては、免疫グロブリンの定常
領域がIL-1L1 ポリペプチドに融合した免疫グロブリン−IL-1L1 融合タンパク質
が挙げられる。
【００１９】 本発明をさらに別の面から見ると、免疫原性調製物中にIL-1L1 ポリペプチド
を含む免疫原に関し、ここで、免疫原とは、IL-1L1 ポリペプチドに対する特異
的免疫応答（例えば、体液性応答、抗体応答および／または細胞性応答など）を
誘起することができるものである。好ましい実施態様においては、免疫原は、配
列番号１もしくは４に示されている核酸によってコードされているタンパク質、
または配列番号５もしくは６に示されているようなポリペプチド配列の特定の決
定基などのような抗原性決定基を有する。
【００２０】 本発明をさらに別の面から見ると、IL-1L1 タンパク質のエピトープと特異的
に反応する抗体および抗体の調製物に関する。
【００２１】 さらに本発明は、本明細書に記載しているIL-1L1 遺伝子の異種型を含み（さ
らに好ましくは発現し）、または、内因性IL-1L1 遺伝子を誤発現する（例えば
、目的とするIL-1L1 タンパク質のひとつまたはそれ以上の発現が破壊されてい
る）非ヒトトランスジェニック動物に関する。そのようなトランスジェニック動
物は、突然変異を起こしているIL-1L1 対立遺伝子もしくは誤発現するIL-1L1 対
立遺伝子を含む細胞性および／または組織疾患の研究、あるいは薬剤スクリーニ
ングににおける動物モデルとして用いることができる。別の用途としては、その
ようなトランスジェニック動物は組換えIL-1L1 ポリペプチドの発現に用いるこ
とができる。
【００２２】 さらに本発明は、個体中のIL-1L1 遺伝子および／もしくはタンパク質が不完
全または欠失がある（例えば、活性および／またはレベルに関してなど）か否か
を判断するため、ならびに／または、IL-1L1 対立遺伝子の識別を行うためのア
ッセイおよびキットに関する。ひとつの実施態様においては、そのような方法は
、IL-1L1 タンパク質のレベル、IL-1L1 mRNAのレベルおよび／またはIL-1L1 遺
伝子の転写速度を測定する段階を含む。別の実施態様においては、そのような方
法は、対象個体の組織中における遺伝子改変の存否を検出することを含み、ここ
で、遺伝子改変とは、次のうちの少なくともひとつによって特徴づけられる：遺
伝子からの１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、遺伝子への１個またはそ
れ以上のヌクレオチドの付加、遺伝子の１個またはそれ以上のヌクレオチドの置
換、染色体上の遺伝子の大規模な再配列、遺伝子のメッセンジャーRNA 転写体の
レベルの変化、遺伝子のメッセンジャーRNA 転写体における野生型とは異なるス
プライシングパターンの存在、および／または、野生型とは異なるIL-1L1 タン
パク質レベル。
【００２３】 例えば、遺伝子変化または特異的な多型領域の存在を検出するためには次のよ
うな段階が含まれる：（i）IL-1L1 遺伝子もしくは天然に存在するそれらの突然
変異体のセンス配列もしくはアンチセンス配列にハイブリダイズするオリゴヌク
レオチド配列、または、本質的にIL-1L1 遺伝子に関連を有する５’もしくは３
’フランク配列（隣接配列）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含
むプローブ／プライマーを提供し；（ii）サンプルを含む適切な核酸と該プロー
ブ／プライマーを接触させ；さらに、（iii）プローブ／プライマーを核酸にハ
イブリダイゼーションすることにより、遺伝子変化の存否を検出する。特に好ま
しい実施態様においては、次のような段階が含まれる：１）IL-1L1 遺伝子の少
なくとも一部をシークエンスし、２）一本鎖立体配座多型（SSCP）解析を行って
突然変異体の核酸と野生型の核酸との電気泳動移動度の差異を検出し；さらに、
３）野生型または突然変異型IL- 11 タンパク質と特異的に免疫反応を起こす抗
体を用い、イムノアッセイにおいてIL-1L1 タンパク質レベルを検出または定量
する。
【００２４】 本明細書に記載している診断アッセイを用いて得られた情報（単独で、または
同じ疾病に関与している他の遺伝的欠陥に関する情報とあわせて）から、症状を
有する被験対象は、例えば、IL-1L1 遺伝子内に、またはIL-1L1 遺伝子の発現を
制御する遺伝子内に特定の疾病または疾患の原因となる、または関与を有する遺
伝的欠陥を有するという診断を下す、または確認することに役立つ。別の方法と
しては、そのような情報（単独で、または同じ疾病に関与している他の遺伝的欠
陥に関する情報とあわせて）を用い、症状を呈していない被験対象が、IL-1L1
活性もしくはタンパク質レベルの異常が原因である、または関与している疾病ま
たは疾患を発病するおそれがあるか否かを予測することができる。特に、本アッ
セイを行うことにより、IL-1L1 内の突然変異が原因である、または関与してい
る症状を引き起こす個人的確率を確認することができるが、ここでの突然変異と
は一ヌクレオチド多型（single nucleotide polymorphism:SNP）である。予後の
情報に基づき、医師は各個人に特定の疾病または症状の発症を阻止する、または
遅延させるために有用な養生法（例えば、食事や運動など）または治療法を推奨
することができる。
【００２５】 さらに、個人のIL-1L1 遺伝子またはタンパク質の欠損または欠乏による特定
の変化に関する知識は、単独で、または同じ疾病に関与しているその他の遺伝的
欠陥に関する情報（特定の疾患に関する遺伝子プロファイル）とあわせて考察す
ることにより、各個人の遺伝子プロファイルに特有の疾患に対する治療および薬
物遺伝子学的（pharmacogenomics）目標を設定することができる。例えば、各個
人のIL-1L1 遺伝子プロファイル、あるいは、IL-1L1 遺伝子の変化が原因となっ
ている、もしくは関与している疾病または症状に関する遺伝子プロファイルを医
師が入手した場合には、１）疾病または症状を分子レベルで特定するような薬剤
をより有効に処方することができ、さらに、２）特定の薬剤についてより適切な
投与量を決定することができる。例えば、疾病のあらゆる段階において、多数の
患者についてIL - 1L1 タンパク質の発現レベルを単独、または同じ疾患に関与
していることが既知であるその他の遺伝子の発現レベルとあわせて測定すること
により、疾病の転写または発現プロファイルを作成することができる。
【００２６】 次に、個々の患者の発現パターンを疾病の発現プロファイルと比較することに
より、その患者に投与する適切な薬剤および投与量を決定することができる。
【００２７】 IL-1L1 または疾病の遺伝子プロファイルに基づき、最も高い臨床効果を上げ
ることが予測される集団に照準を合わせることができる場合には、１）効果が得
られなかった市販薬剤を別の市販薬剤に代替えする、２）安全性または効果が一
部の患者群に限定的であったために臨床開発が中断されている候補薬剤を救済す
る、さらに、３）候補薬剤の開発の加速およびコスト削減、ならびにより最適な
薬物ラベリングを行う（例えば、IL-1L1 をマーカーとして用いることは、有効
投与量の最適化に有用であるなど）ことができる。
【００２８】 別の面から見ると、本発明は、IL-1L1 活性（例えば、IL-1L1 ポリペプチドと
標的ペプチドとの相互作用など）を調節する化合物を同定する方法を提供する。
好ましい実施態様においては、その方法は次のような段階を含む：（a）（i）IL
-1L1 ポリペプチド、（ii）IL-1L1 の結合相手（例えば、IL-1L1 レセプターま
たは硫酸ヘパリンプロテオグリカンなど）、および（iii）被験化合物を含む反
応混合物を調製し；さらに、（b）IL-1L1 ポリペプチドとIL-1L1 結合タンパク
質との相互作用を検出する。被験化合物不含の場合と比較して、被験化合物の存
在下においてはIL-1L1 ポリペプチドとIL-1L1 結合タンパク質との相互作用が統
計的に有為に変化（強化または阻害）したことから、被験化合物がIL-1L1 の生
物活性に対するアゴニスト（ミメチックもしくは増強剤）またはアンタゴニスト
（阻害剤）であることを示唆している。反応混合物としては、セルフリータンパ
ク質調製物（例えば、再構成したタンパク質混合物もしくは細胞溶解物など）、
または、組換えによりIL-1L1 の結合相手を発現する異種核酸を含む組換え細胞
を用いることができる。
【００２９】 好ましい実施態様においては、IL-1L1 とIL-1L1 の結合相手との相互作用を検
出する段階は、競合結合アッセイを用いる。別の好ましい実施態様においては、
IL-1L1 とIL-1L1 の結合相手のうちの少なくともひとつが検出可能なラベルを有
しており、さらに、コンプレックス内のラベルを検出することにより、IL-1L1
とIL - 1L1 の結合相手との相互作用を定量する。検出可能なラベルとしては例
えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素の補因子などを用いること
ができる。別の実施態様においては、免疫アッセイによってコンプレックスを検
出する。
【００３０】 さらに別の実施態様においては、被験化合物をスクリーニングするアッセイを
提供し、細胞において産生されるIL-1L1 の量を調節する物質を同定する。ひと
つの実施態様においては、そのようなスクリーニングアッセイは、IL-1L1 プロ
モーターに機能発揮できるように連結されたレポーター遺伝子をトランスフェク
トした細胞を被験化合物と接触させ、レポーター遺伝子の発現レベルを測定する
ことを含む。レポーター遺伝子は、例えば、検出可能な信号（色素、蛍光、発光
、細胞生育性、細胞の栄養要求性の緩和、細胞増殖および薬剤耐性など）を発す
る遺伝子産物などをコードすることができる。例えば、レポーター遺伝子は、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラク
トシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む群から選択される遺伝子産物を
コードすることができる。
【００３１】 また、本発明の範ちゅうには、IL-1L1 レベルもしくは活性の異常が関与して
いる、または、IL-1L1 レベルもしくは活性を調節することによって効果が得ら
れる疾病または疾患を治療する方法も含まれる。そのような方法は、例えば、患
者の局所または全身にIL-1L1 治療剤を含む組成物の薬剤学的に有効量を投与す
ることを含む。治療を受ける患者の状態に応じて、治療剤はIL-1L1 アゴニスト
またはIL-1L1 アンタゴニストを用いることができる。
【００３２】 本発明のその他の特徴および利点については以下の詳細な記述および請求項か
ら明らかである。
【００３３】 ３． 図面の簡単な説明 図１は、２種の５’末端を有する２つのヒトIL-1L1のcDNA の核酸配列を示す
。IL-1L1 の遺伝子転写体は、３’がポリアデニル化され、かつ、２種の異なる
５’末端は39個のヌクレオチドおよび42個のヌクレオチドからなる（それぞれ、
配列番号２および３）、2562個のヌクレオチドからなる共通配列（配列番号１）
を含む。ヒトIL-1L1 のオープンリーディングフレーム（ ORF ）（配列番号10）
には下線を引いている。
【００３４】 図２は、マウスIL-1L1 のcDNA の核酸配列（配列番号４）を示す。マウスのの
オープンリーディングフレーム（ORF）（配列番号11）には下線を引いている。
【００３５】 図３は、ヒトIL-1L1 （パネルA ；配列番号５）およびマウスIL-1L1 （パネル
Ｂ；配列番号６）によってコードされている推定ポリペプチド配列を示す。
【００３６】 図４は、保存性の置換（＋）をしめし、また、コンセンサスポリペプチド配列
（配列番号７）を示すヒトおよびマウスのIL-1L1のポリペプチド配列を比較した
ものである。
【００３７】 図５は、保存性の置換（＋）をしめし、また、コンセンサスポリペプチド（配
列（配列番号９）を示す ヒトIL-1L1のポリペプチド配列およびヒトのプロ−IL
-1ra ポリペプチド配列（配列番号８）を比較したものである。
【００３８】 図６は、アミノ末端アミノ酸配列が異なっているIL-1L1 遺伝子生成物の３種
の組換え体のポリペプチド配列を示す。
【００３９】 図７は、ヒトIL-1L1 の伝達暗号の組織分布を示すノーザンブロットである。
【００４０】 図８は、哺乳類中のIL-1L1 遺伝子配列の保存性を示すズーブロットである。
【００４１】 図９は、ヒトの２番染色体におけるIL - 1 遺伝子座内のIL-1L1 遺伝子の染色
体位置、ならびにIL-1L1 遺伝子のイントロン／エクソン構造を示す。
【００４２】 図１０は、IL-1L1 転写体のスプライシングの詳細を示す。
【００４３】 図１１は、IL-1L1 遺伝子の全ゲノム配列を示す。
【００４４】 図１２は、JEG-3 細胞由来の天然型IL-1L1 タンパク質の免疫沈降を示す。
【００４５】 図１３は、ヒトおよびマウスのIL-1L1 遺伝子とヒトにおけるその他のIL-1 様
遺伝子ファミリーとの並記である。保存性残基は四角く囲んであり、折り畳まれ
たタンパク質のβ−シート二次構造を示している ４．発明の詳細な説明 ４．１ 一般的事項 本発明は、一部においては、IL−1レセプターアンタゴニスト（IL-1ra）およ
び IL-1 βポリペプチドと相同なタンパク質をコードしているIL-1 遺伝子クラ
スター遺伝子座内に存在する遺伝子の発見に基づく。従って、IL-1L1タンパク質
は、前炎症性サイトカイン（IL-1 β）ならびに炎症性サイトカイン（IL-1ra）
と関連がある。IL-1L1遺伝子という名は、この遺伝子がIL-1 β（IL-1 Beta）を
コードしている遺伝子とIL-1 レセプターアンタゴニスト（IL-1 Receptor antag
onist ）をコードしている遺伝子との間（Interval）に存在するという事実に由
来している。従って、本明細書に開示している遺伝子およびタンパク質をIL-1L1
遺伝子およびIL-1L1タンパク質と称する。
【００４６】 IL-1L1 遺伝子は、IL-1 クラスターを含む680kbのCEPH 酵母人工染色体（YAC
）クローン766E12（ノスワン（Nothwang）ら、(1997)）を用いて単離した。YAC
クローン766E12 は、パルスフィールド電気泳動を行うことによってクローンを
生成している酵母株から単離し、得られたDNAは、IL-1 がコードされている伝達
暗号を選択する際のドライバーとして使用した（モーガン（Morgan）ら、(1992)
Nucleic. Acids Res. 20:5173-79）。cDNA は、10 ng/ml のホルボールミリス
テートアセテートおよび100 ng/ml の大腸菌（E. coli）リポ多糖類の存在下で
６時間培養したヒト末梢血単核細胞から得た。
【００４７】 選択したcDNA を増幅させ、増幅したcDNA フラグメントは、２回のアフィニテ
ィー選択を行い、さらに増幅させた後、pNEB193 にクローニングした。得られた
クローンの中からランダムに選択した100個のサンプルについて、全体のシーク
エンスを行った。IL-1L1発現配列タグ（EST）は、約530bpからなる連続配列を構
成している３個の重複cDNA フラグメント由来の重複配列のうちのひとつに対応
していた。この配列は、374bpからなるヒトの胎盤由来のcDNA（ジェンバンク（G
enBank）アクセッション（Accession）番号R70041）および348bpからなるヒトの
胎盤のcDNA（ジェンバンク（GenBank）アクセッション番号R70089）と相同であ
ることが見出された。試験を行ったところ、この配列は、ジングリッチ（Gingri
ch）ヒトPAC ライブラリー由来のP1人工染色体131J6と特異的にハイブリダイズ
することが見出されたことから、ICRF ヒトP1ライブラリー（ノスワン（Nothwan
g）ら、Genomics 41:370-378(1990)）に由来し、ICRF 700G1305 に隣接するIL1B
遺伝子とIL1RN 遺伝子との間に位置づけられた。この後者のクローンは、IL-1r
a 遺伝子（IL1RN）を含む。データベースのEST 配列内にもこれらの新規なEST
配列内にもオープンリーディングフレームは存在しておらず、さらに分析をおこ
なったところ、これらの配列は、遺伝子伝達暗号の３’非翻訳領域（UTR）内に
含まれていることが明らかになった。
【００４８】 プローブとしてこの３’フラグメントを用いたノーザンブロット分析から、ヒ
トの胎盤内に約2.6kbの転写体（図７）が存在することが明らかになった。最初
にプローブとしてこの３’フラグメントを用いることによってcDNA の全長を得
、次に、HGMP（ Human Genome Mapping Project：ヒトゲノムマッピングプロジ
ェクト）から入手したH9 胎盤cDNA プラスミドライブラリーから1.6kbのIL-1L1
cDNA フラグメントを単離した。この1.6kbのクローンはポリアデニル化されてい
たが、明らかなオープンリーディングフレームを含んではいなかった。次に、こ
のクローンの５’末端を用いて、ヒトの胎盤由来のcDNAから得られるIL-1L1 転
写体の全長の５’末端を増幅させるためのプライマーを調製した。得られた生成
物は長さが約1.1kbであり、1.6kbのクローンの配列と重複していた。続いて行っ
た分析から、IL-1L1遺伝子は５’非コード領域がわずかに異なる２種の転写体を
コードしていることが明らかになった（図１）。つなぎ合わせた転写体の全長は
約2.6kbであり、ノーザン分析によって検出された胎盤mRNAと一致していた。同
様な大きさの転写体は、IL-1L1コード配列を含むプローブを用いた分析により、
ヒトの胸腺においても検出された（図７）。ヒトの完全cDNAは、ジェンバンク（
GenBank）データベース内の以下に挙げるEST cDNAフラグメントと相同であるこ
とがわかった：ジェンバンク（GenBank）アクセッション番号AI040890（485bpか
らなるヒトの副甲状腺腫瘍由来のEST：図１に示すヒトの一般的な転写体配列内
のヌクレオチド番号955から1278に存在するIL-1L1のアンチセンス鎖の３’UTRと
相同）；ジェンバンク（GenBank）アクセッション番号AI469873（442bpからなる
ヒトのEST：ヌクレオチド番号2133から2561に存在するIL-1L1 ３’UTRアンチセ
ンス鎖と相同）；ジェンバンク（GenBank）受入番号AA722902（414bpからなるヒ
トの胎児の心臓由来のEST：ヌクレオチド番号2141から2555に存在するIL-1L1 ３
’UTRアンチセンス鎖と相同）；ジェンバンク（GenBank）アクセッション番号AI
67887（410bpからなるヒトの副甲状腺由来のEST：ヌクレオチド番号871から1278
に存在するIL-1L1 ３’UTRアンチセンス鎖と相同）；ジェンバンク（GenBank）
アクセッション番号R70041（317bpからなるヒトの胎盤由来のEST：ヌクレオチド
番号2191から2552に存在するIL-1L1 ３’UTRアンチセンス鎖と相同、）；ジェン
バンク（GenBank）アクセッション番号R70089（348bpからなるヒトの胎盤由来の
EST：ヌクレオチド番号1828から2144に存在するIL-1L1 ３’UTRセンス鎖と相同
）；およびジェンバンク（GenBank）受入番号W08205（382bpからなるマウス由来
のEST：ヌクレオチド番号５から308に存在するIL-1L1 ５’リーダー配列および
コード配列のセンス鎖と相同）。
【００４９】 ヒトのIL-1L1転写体は、155個のアミノ酸から構成されるポリペプチドをコー
ドしており（図３のA）、コード領域（図１の下線部分）は、転写体内の約２kb
の大きな３’非翻訳領域を除いた最初の600個までのヌクレオチドを占めている
。ヒトのIL-1L1ポリペプチド配列は、ヒトのIL-1ra（スイスプロット（SwissPro
t:SP）アクセッション番号P18510、155個のアミノ酸中73個が同一、または全体
的な同一性は47％、図５参照）と相同であり、さらに、IL-1raをコードしている
遺伝子のマウス相同体（SPアクセッション番号P25085）、ラット相同体（SPアク
セッション番号P25086）およびウサギ相同体（SPアクセッション番号P26890）と
相同である。ヒトのIL-1L1ポリペプチド配列は、ヒトのIL-1βポリペプチド（ス
イスプロット（SwissProt:SP）アクセッション番号P01584、155個のアミノ酸中4
2個が同一、または全体的な同一性は27％）と相同であり、さらに、アカシカのI
L-1βポリペプチド（SPアクセッション番号P51754）、ヒツジのIL-1βポリペプ
チド（SPアクセッション番号P21621）、ウシのIL-1βポリペプチド（SPアクセッ
ション番号P09428）、マウスのIL-1βポリペプチド（SPアクセッション番号P107
49）、ラットのIL-1βポリペプチド（SPアクセッション番号Q63264）およびその
他のIL-1βタンパク質相同体と相同である。
【００５０】 1.2kbのマウスIL-1L1 cDNA も得られており、シークエンスがなされている（
図２参照）。この伝達暗号は155個のアミノ酸から構成されるポリペプチドをコ
ードしているものと推定され、図４に示すヒトIL-1L1のそれとの同一性は90％で
ある（155個のアミノ酸配列のうち141個以上が同一であった）。1.2kbのマウスI
L-1L1 cDNAのコード領域の核酸配列は、2.6kbのヒトIL-1L1 cDNAのコード領域の
配列と非常に相同性が高かった（ヌクレオチド番号７から500までの間における
ヒトIL-1L1 配列との同一性は84％であった）。1.2kbのマウスIL-1L1クローンは
ポリアデニル化されており、その３’非翻訳領域はヒトIL-1L1の３’UTRと相同
な短い領域を有する。83％の配列同一性を示すこの領域は、一般的なヒトIL-1L1
転写体配列のヌクレオチド番号1137から1177に存在し、マウスIL-1L1配列のヌク
レオチド番号1146から1186に存在する。41bpからなる保存性コンセンサス配列：
５’−ACAATNAAAANCCCNGATNCTGGTCTCTANTCNCATNAAAA−３’（配列番号12）は、
ヒトおよびマウスのIL-1L1３’UTRに見出されており、GATA-1およびGATA-2結合
部位（メリカ（Merika）およびオルキン（Orkin）Mol. Cell Biol. 13:3999-401
0(1993)）、イカロス（Ikaros）結合部位（モルナー（Molnar）およびゲオルゴ
ポウロス（Georgopoulos）Mol. Cell Biol. 14:8292-8303(1994)）ならびにレト
ロウイルス性ポリA下流エレメントを含む多数の核酸配列モチーフを有する。そ
のような保存性の下流ヌクレオチド配列は、RNAポリメラーゼの開始および／も
しくは終結、mRNAのポリアデニル化、mRNAの安定性、またはIL-1L1の翻訳の開始
もしくは終結を制御する作用を有するものと考えられる。
【００５１】 ヒト、アカゲザル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリおよび酵
母由来のゲノム性DNA切断物を含む写し取った試料について、ヒトIL-1L1プロー
ブを用い、ストリンジェンシーの低い条件でサザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンを行った。このズーブロット（Zoo-blot）ハイブリダイゼーションから、試
験を行ったすべての哺乳類において、ひとつの相同なバンドが存在することが明
らかになった。故に、哺乳類の進化の過程においてIL-1L1遺伝子は保存されてい
たと考えられる。
【００５２】 組換えヒトIL-1レセプターアンタゴニストおよびIL-1L1ポリペプチドを作出し
、ニッケルキレートクロマトグラフィーを用いて精製し、続いてイミダゾールを
用いて溶出させ、トロンビンを用いて処理することにより、図６に示すポリペプ
チド配列を得た。N15 およびC13 で二重にラベルしたIL-1L1タンパク質について
核磁気共鳴実験を行ったところ、IL-1L1タンパク質はβ−シート構造のように大
きく折り畳まれていることが示唆され、これは、ヒトIL-1raの構造と一致する。
【００５３】 組換えIL-1raをウサギに投与することにより、ポリクローナル抗体が産生され
ることも明らかになった。絨毛膜癌細胞系JEG-3は、本質的にIL-1L1 mRNAを産生
することが示されている。この細胞系に由来するタンパク質を代謝ラベルしたも
のは、抗IL-1L1ウサギポリクローナル抗血清と免疫沈降した。これらの結果から
、IL-1L1の推定分子量と一致する17kDaの大きさのタンパク質は免疫沈降するこ
とが示唆された。
【００５４】 ４．２ 定義 簡便のため、本明細書、実施例および請求項において使用している特定の語句
の意味を以下に示す。
【００５５】 「異常な活性」とは、IL-1L1などのようなポリペプチドの活性に対して用いる
場合には、野生型もしくは天然のポリペプチドの活性とは異なる、または健常な
個体中のポリペプチドの活性とは異なる活性をさす。あるポリペプチドの活性が
天然型の同類のポリペプチドの活性よりも強い場合には、異常となり得る。これ
とは別に、あるポリペプチドの活性が天然型の同類のポリペプチドの活性よりも
弱い、または消失している場合には、異常となり得る。異常な活性は、活性を変
化させることもある。例えば、異常ポリペプチドは別異の標的ペプチドと相互作
用することができる。IL-1L1をコードしている遺伝子の過剰発現または少量発現
により、細胞は異常なIL-1L1活性を有することになる。
【００５６】 本明細書において使用している「アゴニスト」とは、IL-1L1の生物活性を模倣
する、または上方調節する（例えば、強化するまたは補充するなど）物質をさす
。IL-1L1アゴニストとは、野生型のIL-1L1タンパク質または野生型IL-1L1の生物
活性（例えば、IL-1Bレセプター結合活性など）のうちの少なくともひとつを有
するそれらの誘導体が挙げられる。IL-1L1治療剤としては、IL-1L1遺伝子の発現
を増加させる、またはIL-1L1タンパク質の生物活性のうちの少なくともひとつを
増強する化合物を用いることもできる。アゴニストとしては、IL-1L1ポリペプチ
ドとその他の分子（例えば、IL-1のI型またはII型レセプター）との相互作用を
強化する化合物も用いることができる。そのようなアゴニストは、例えば、IL-1
I型レセプターへのIL-1L1の結合を強化することができ、それによってIL-1αお
よびIL-1βによる炎症性シグナル伝達に対するIL-1L1依存的阻止を促進する。別
の方法としては、IL-1L1アゴニストは、IL-1 II 型レセプターまたは「おとりレ
セプター」へのIL-1L1の結合を強化することができる。IL-1 II 型レセプターは
Ｂ細胞上に存在し、IL-1α／IL-1β依存性の炎症性シグナル伝達を減弱させる作
用を有する。従って、IL-1L1アゴニストは、IL-1αおよびIL-1βによる炎症性シ
グナル伝達を間接的に促進することができる。
【００５７】 「対立遺伝子」とは、本明細書中においては「対立遺伝子変異体」と相互に読
み替えることができ、遺伝子またはそれらの一部のもうひとつの型をさす。対立
遺伝子は、相同染色体上の同一の遺伝子座または位置を占めている。ある個体が
、ある遺伝子について２個の同一の対立遺伝子を有する場合、その個体はその遺
伝子または対立遺伝子についてホモ接合性であるという。ある個体が、ある遺伝
子について２個の異なる対立遺伝子を有する場合、その個体はその遺伝子につい
てヘテロ接合性であるという。特定の遺伝子についての対立遺伝子は、ヌクレオ
チドが１個または数個異なっている場合があり、また、ヌクレオチドの置換、欠
失および挿入を含む場合がある。頻繁に生じる配列の変化としては、トランジシ
ョン突然変異（すなわち、プリンからプリンへの置換およびピリミジンからピリ
ミジンへの置換、例えば、AからGへの置換、またはCからTへの置換など）、トラ
ンスバージョン突然変異（すなわち、プリンからピリミジンへの置換およびピリ
ミジンからプリンへの置換、例えば、AからTへの置換、またはCからGへの置換な
ど）および反復DNA配列内の変化（例えば、トリヌクレオチド反復配列およびそ
の他の縦列反復配列の伸長および収縮など）などが挙げられる。ある遺伝子の対
立遺伝子は、突然変異を含む遺伝子を形成することもできる。「IL-1L1遺伝子の
多型領域に関する対立遺伝子変異体」とは、他の個体中のIL-1L1遺伝子のある領
域に見出される１個または数個のヌクレオチド配列を有するIL-1L1遺伝子の当該
領域をさす。
【００５８】 本明細書において使用している「アンタゴニスト」とは、IL-1L1の生物活性の
うちの少なくともひとつを下方調節する（例えば、抑制するまたは阻害するなど
）物質をさす。IL-1L1アンタゴニストとしては、IL-1L1タンパク質と他の分子（
例えば、IL-1Lレセプター（IL - 1R）などのレセプターなど）との相互作用を阻
害する、または減弱させる化合物を用いることができる。従って、好ましいアン
タゴニストとは、IL-B1レセプターへの結合を減弱させ、それによって、IL-1Bレ
セプターの活性化を阻止する化合物である。アンタゴニストとしては、IL-1L1遺
伝子の発現を下方調節する、またはIL-1L1タンパク質の存在量を減少させる化合
物を用いることもできる。IL-1L1アンタゴニストとしては、IL-1L1ポリペプチド
の最も強力なネガティブ型を用いることができ、例えば、IL-1 I型レセプターな
どの標的ペプチドと相互作用することができるが、レセプターを活性化すること
ができないIL-1L1ポリペプチドのひとつの型などが挙げられる。IL-1L1アンタゴ
ニストとしては、IL-1L1ポリペプチドの強力なネガティブ型をコードしている核
酸、IL-1L1アンチセンス核酸、またはIL-1L1 RNAと特異的に相互作用することが
できるリボザイムを用いることもできる。さらにその他のIL-1L1アンタゴニスト
としては、IL-1L1ポリペプチドに結合し、その活性を阻害する分子を用いること
ができる。そのような分子としては、ある型のIL-1L1標的ペプチドなどのペプチ
ドが挙げられるが、そのようなペプチドは、生物学的活性を持たず、IL-1L1標的
分子（IL-1L1レセプターなど、好ましくはIL-1 I型レセプター）への結合を阻害
する。別の作用としては、IL-1L1アンタゴニストはIL-1 II型レセプターを阻害
する活性を有する。IL-1 II型レセプターは、「おとり」レセプターと呼ばれ、
Ｂ細胞上に存在し、IL-1αおよびIL-1βに結合して、両者とIL-1 I型レセプター
との相互作用を妨げ、それによってIL-1 I型レセプターが媒介する活性に拮抗す
る。ある種のIL-1L1ポリペプチドはIL-1 II型おとりレセプターに結合、拮抗し
、それによってIL-1αおよびIL-1βの炎症性シグナル伝達を促進することができ
る。従って、ある種のIL-1L1アンタゴニストは、発生時からこの状況を阻止する
ように作用することができ、それによってIL-1αおよびIL-1βの炎症性シグナル
伝達を減弱させることができる。そのようなIL-1L1アンタゴニストポリペプチド
は、IL-1L1の活性部位に結合し、IL-1L1と標的ペプチド（例えば、IL-1 I型およ
びII型レセプターなど）との相互作用を妨げる。別の好ましい実施態様において
は、IL-1L1アンタゴニストは、IL-1L1ポリペプチドと標的であるIL-1L1Rとの相
互作用を阻害することができるような低分子である。別の方法としては、低分子
は、IL-1L1R結合部位以外の部位（ヘパリン硫酸プロテオグリカン結合部位など
）と相互作用することによって拮抗することができる。
【００５９】 本明細書において使用している「抗体」とは、任意のアイソタイプ（例えば、
IgG、IgA、IgM、IgEなど）を含むすべての抗体をさし、脊椎動物（例えば、哺乳
類など）のタンパク質と特異的に反応するそれらのフラグメントを含む。従来か
ら使用されている技術を用いて抗体をフラグメントに分けることができ、さらに
、抗体全体に関して記載されている方法と同様な方法を用い、用途に応じてフラ
グメントをスクリーニングすることができる。従って、「抗体」という語には、
ある種のタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子に対して蛋白質分
解することによって得た部分のセグメント、または組換えによって調整した部分
のセグメントを含む。そのようなタンパク質分解フラグメントおよび／または組
換えフラグメントとしては、Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、ならびにペプチドリンカ
ーによって結合しているV[L]ドメインおよび／もしくはV[H]ドメインを含む一本
鎖抗体（scFv）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。scFvは共有
結合または非共有結合をすることにより、２つまたはそれ以上の結合部位を有す
る抗体を形成する。本発明においては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体もしくはその他の精製された抗体、ならびに組換え抗体を含む。
【００６０】 核酸の異常発現「が関与している」または「によって特徴づけられる」疾病、
疾患または症状とは、核酸の発現レベルの異常による、が関係している、または
原因となっている被験対象内の疾病、疾患または症状をさす。
【００６１】 本明細書において使用している「IL-1L1ポリペプチドの生物活性フラグメント
」とは、IL-1L1ポリペプチドの全長フラグメントをさし、このとき、そのような
フラグメントは野生型のIL-1L1ポリペプチドの活性を特異的に模倣または拮抗し
ている。好ましくは、生物活性フラグメントとは、インターロイキンI型またはI
I型レセプターと相互作用することができるフラグメントである。
【００６２】 「生物学的活性」または「生物活性」または「活性」または「生物学的作用」
は、相互に読み替えて用いることができ、本明細書においては、IL-1L1ポリペプ
チド（天然型であっても立体構造が変性していてもよい）またはそれらの任意の
部分配列によって直接または間接的に発揮されるエフェクター作用または抗原性
作用をさす。生物学的活性としては、例えば、IL-1レセプター（IL-1R）、好ま
しくはIL-1 I型レセプターなどの標的ペプチドに結合することが挙げられる。別
の表現をすれば、IL-1L1の生物活性は、例えば、IL-1L1遺伝子の発現を調節する
などのように、IL-1L1ポリペプチドのレベルを調節することによって調節するこ
とができる。
【００６３】 「生物マーカー」とは、核酸、ペプチド、ホルモンなどの生物学的分子をさし
、それらの存在または濃度は検出可能であり、また、疾病などの既知の状態と関
連がある。
【００６４】 「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書においては相
互に読み替えて用いることができる。これらの語句は特定の被験細胞をさすだけ
でなく、そのような細胞の後裔または後裔となり得る細胞をもさす。突然変異ま
たは環境の影響を受けて細胞継代中にある種の変化が生じる可能性があることか
ら、そのような後裔細胞は親細胞と同一であるとは限らないが、本明細書におい
て使用しているように、そのような細胞も語句の範ちゅうに含む。
【００６５】 「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」とは、IL-1L1ポリペプチ
ドのうちのひとつをコードしている第一のアミノ酸配列とIL-1L1ポリペプチドの
任意のドメインとは異種であり、実質的に同種ではないドメイン（例えば、ポリ
ペプチドの一部分など）を規定している第二のアミノ酸配列との融合体をさす。
キメラポリペプチドは、別異のポリペプチドであるにもかかわらず、第一のポリ
ペプチドをも発現する器官内において見出される異種ドメインとして存在するこ
とができ、あるいは、別異の種類の器官によって発現されるポリペプチド構造の
「種間」融合体、「遺伝子間」融合体などでもあり得る。一般的に、融合ポリペ
プチドは一般式X-IL-1L1-Yで表すことができ、ここで、IL-1L1は、IL-1L1ポリペ
プチドに由来するポリペプチドの一部分を表し、XおよびYはそれぞれ別異に空位
であるかまたは、器官内のIL-1L1配列とは無関係のアミノ酸配列（天然に存在す
る突然変異体を含む）を表す。
【００６６】 「輸送コンプレックス」とは、標的化法（例えば、標的細胞表面に対して遺伝
子、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを強固にアフィニティー結合さ
せる分子、ならびに／または標的細胞による細胞または核の取り込みが促進され
る分子など）を意味する。標的化法の例としては、ステロール類（例えば、コレ
ステロールなど）、リピド類（例えば、陽イオン性リピド、ビロソーム（viroso
me）またはリポソームなど）、ウイルス類（例えば、アデノウイルス、アデノ関
連ウイルスおよびレトロウイルスなど）または標的細胞に特異的に結合する物質
（例えば、標的細胞に特異的なレセプターによって認識されるリガンドなど）な
どが挙げられる。好ましいコンプレックスは、イン・ビボ（in vivo）において
十分に安定であり、標的細胞によるインターナリゼーションに先立ち、顕著に脱
カップリングを阻止する。しかしながら、細胞内の適切な条件下においてはコン
プレックスは解裂可能であり、それによって機能発揮型の遺伝子、タンパク質、
ポリペプチドまたはペプチドが放出される。
【００６７】 周知のように、遺伝子は、個々のゲノム内に１コピー、または複数のコピーが
存在する。そのような重複遺伝子は同一であるか、またはヌクレオチドの置換、
付加もしくは欠失を含むある種の変形があるものの、それらはすべて実質的に同
一の活性を有するポリペプチドをコードしている。従って、「IL-1L1をコードし
ているDNA配列」とは、特定の個体内に存在する１個またはそれ以上の遺伝子を
さす。さらに、ヌクレオチド配列内のある種の差異は個々の器官の間にも存在し
ており、対立遺伝子と呼ばれている。そのような対立遺伝子の差異は、同一の生
物学的活性を有するポリペプチドがコードされているにもかかわらず、コードさ
れているポリペプチドのアミノ酸配列に差異が生じることに起因するものである
と考えられるが、そうではないかもしれない。
【００６８】 「等価」とは、作用が同等なポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列
を含む。等価ヌクレオチド配列には、１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換
、付加もしくは欠失によって異なっている配列（対立遺伝子変異体など）、なら
びに遺伝子コードの縮重によって核酸のヌクレオチド配列が異なっている配列（
例えば、配列番号１および４など）を含む。
【００６９】 本明細書において使用している「ハプロタイプ」とは、統計的に有為なレベル
（p corr ＜0.05）でグループとして継承している（disequilIL-1L1ium）一組の
対立遺伝子をさす。本明細書において使用しているように、「IL-1ハプロタイプ
」という語句は、IL-1遺伝子座におけるハプロタイプをさし、IL-1L1遺伝子配列
の多型変異体を含む。
【００７０】 「相同性」、「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間または２つ
の核酸分子間の配列類似性をさす。相同性は、比較のために並記した各配列内の
ある位置について比較することによって決定することができる。比較した配列内
のある位置に同一の塩基またはアミノ酸が存在する場合には、２つの分子はその
位置において同一である。核酸配列間の相同性または類似性または同一性の割合
は、核酸配列によって占有されている位置における同一または一致ヌクレオチド
数の関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性の割合は、アミノ酸配列に
よって占有されている位置における（すなわち、構造的に関連がある）アミノ酸
数の関数である。本発明のIL-1L1配列のうちのひとつと「無関係な」または「非
相同な」配列との同一性は40％以下であるが、好ましくは25％以下である。
【００７１】 本発明において使用している「IL-1L1」とは、本明細書中に記載しているイン
ターロイキン１様遺伝子をさし、IL-1L1タンパク質をコードしている。本発明に
おいて使用しているIL-1L1は、「IBR」遺伝子またはタンパク質と相互に読み替
えることができ、IBRとは、該遺伝子がIL-1遺伝子座内に存在している（IL-1L1
遺伝子はIL-1β（IL-1Beta）とIL-1レセプターアンタゴニスト（IL-1 Receptor
Antagonist）をコードしている遺伝子との間（Interval）に存在している）こと
に基づくIL-1L1の別名である。さらに、本明細書において使用しているIL-1L1遺
伝子はIL1L1遺伝子とも呼ぶ。
【００７２】 「IL-1L1核酸」とは、IL-1L1タンパク質をコードしている核酸をさし、それら
は例えば、配列番号10もしくは11を有する核酸またはそれらのフラグメント、そ
れらと相補的な核酸、ならびにそれらの誘導体などである。
【００７３】 「IL-1L1ポリペプチド」および「IL-1L1タンパク質」とは、配列番号５または
６に示すアミノ酸配列もしくはそれらのフラグメント、ならびにそれらの相同体
を含むポリペプチドを包含し、さらに、アゴニストポリペプチドおよびアンタゴ
ニストポリペプチドを含む。
【００７４】 「IL-1L1レセプター」または「IL-1L1R」とは、IL-1L1に結合することができ
る、および／またはIL-1L1からのシグナルを伝達することができる多様な膜結合
タンパク質レセプターをさし、それらは例えば、IL-1 I型レセプターおよびIL-1
II型レセプターなどである。「IL-1L1レセプター」または「IL-1L1R」とは、IL
-1関連リガンド（例えば、IL-1α、IL-1βおよびIL-1ra（レセプターアンタゴニ
スト）など）のうちの任意のものまたはすべてに結合することができる、および
／またはそれらからのシグナルを伝達することができる多様な膜結合タンパク質
レセプターをさす。そのようなレセプターとしては、Ｔ細胞、繊維芽細胞および
結合組織に存在するIL-1 I型レセプター、およびＢ細胞に存在するIL-1 II型レ
セプターなどが挙げられる。本明細書において使用しているIL-1L1R とは、さら
に、IL-1Rアクセサリータンパク質（IL-1R AcP）をさしており、これは、細胞外
ドメイン内に存在するIgスーパーファミリーに相同であることから関連を有して
おり、また、L-1 I型レセプターおよびIL-1 II型レセプターと部分的に相同であ
ることから関連を有する。IL-1R AcPはIL-1 I型レセプターとコンプレックスを
形成すると考えられていることから、IL-1αまたはIL-1βからの前炎症性シグナ
ルをいずれも伝達する。本明細書において使用しているIL-1L1レセプター（IL-1
L1R）は、さらに、ST2/T1およびIL-1rrp2などのオーファンレセプターなどのよ
うなIL-1レセプター関連遺伝子をもさす。本明細書において使用しているIL-1L1
Rの範ちゅうに含まれるその他のIL-1レセプター関連遺伝子としては、MyD88およ
びrsc786などが挙げられる。
【００７５】 「IL-1L1治療剤」とは、多様な形態のIL-1L1ポリペプチド、ならびに、天然に
存在するIL-1L1ポリペプチドの効果を模倣する、強化する（共働する）または阻
害する（拮抗する）ことによってIL-1L1ポリペプチドの活性（例えば、IL-1L1レ
セプターおよび／またはIL-1L1コレセプターとの相互作用など）のうちの少なく
ともひとつを調節することができるペプチドミメチック、核酸または低分子など
をさす。野生型IL-1L1ポリペプチドの活性を模倣するまたは強化するIL-1L1治療
剤は「IL-1L1アゴニスト」である。逆に、野生型IL-1L1ポリペプチドの活性を阻
害するIL-1L1治療剤は「IL-1L1アンタゴニスト」である。
【００７６】 本明細書において使用している「IL-1遺伝子クラスター」および「IL-1遺伝子
座」とは、２番染色体の2q13領域またはその近傍に存在するすべての核酸を含み
、それらの中には少なくともIL-1L1遺伝子、IL-1A遺伝子、IL-1B遺伝子およびIL
-1RN遺伝子ならびにその他の連結している遺伝子が含まれる（ニックリン（Nick
lin）ら、Genomics 19:382-384(1994)）。本明細書において使用している「IL-1
A」、「IL-1B」および「IL-1RN」とは、それぞれ、IL-1、IL-1およびIL-1アンタ
ゴニストをコードしている遺伝子をさす。IL-1A、IL-1BおよびIL-1RNの遺伝子ア
クセッション番号はそれぞれ、X03833、X04500およびX64532である。
【００７７】 「IL-1の作用の突然変異」とは、別異の表現型を生じる（すなわち、IL-1遺伝
子またはタンパク質の作用に影響を与える）IL-1遺伝子クラスター内の突然変異
をさす。そのような例としては、IL-1A（+4845）対立遺伝子２、IL-1B（+3954）
対立遺伝子２、IL-1B（+6912）対立遺伝子２，およびIL-1RN（+2018）対立遺伝
子２などが挙げられる。
【００７８】 「IL-1X(Z)対立遺伝子Y」とは、遺伝子X内のIL-1遺伝子座多型部位において生
じるYで表される特定の対立遺伝子型をさし、ここで、Xは、IL-1遺伝子座内に存
在するIL-1A、IL-1BもしくはIL-1RNまたはその他の遺伝子であって、ヌクレオチ
ドZの位置または近傍に存在しており、ヌクレオチドZは、IL-1の特定の遺伝子X
の主要転写開始部位（この位置をヌクレオチド番号＋１とする）に基づく番号で
表す。さらに、本明細書において使用している「IL-1X対立遺伝子（Z）」とは、
ヌクレオチドZの位置または近傍に存在する遺伝子X内のIL-1多型部位に関するす
べての対立遺伝子をさす。例えば、「IL-1RN（+2018）対立遺伝子」とは、2018
番の位置におけるIL-1RN遺伝子の別異の型をさす。「IL-1RN（+2018）対立遺伝
子１」とは、センス鎖の2018番の位置にシトシン（Ｃ）を有するIL-1RN遺伝子の
型をさす。クレイ（Clay）ら、Hum. Genet. 97:723-726(1996)。「IL-1RN（+201
8）対立遺伝子２」とは、プラス鎖の2018番の位置にチミン（Ｔ）を有するIL-1R
N遺伝子の型をさす。ある個体が同一のIL-1RN対立遺伝子を２個有する場合には
、その個体はホモ接合体である、またはホモ接合状態であると称する。ある個体
が２つの異なるIL-1RN対立遺伝子を有する場合には、その個体はヘテロ接合体で
ある、またはヘテロ接合状態であると称する。「IL-1RN（+2018）対立遺伝子２
，２」とは、IL-1RN（+2018）対立遺伝子２がホモ接合状態であることをさす。
逆に、「IL-1RN（+2018）対立遺伝子１，１」とは、IL-1RN（+2018）対立遺伝子
１がホモ接合状態であることをさす。「IL-1RN（+2018）対立遺伝子１，２」と
は、対立遺伝子１および２がヘテロ接合状態であることをさす。
【００７９】 本明細書において使用している「IL-1に関連する」とは、ヒトの２番染色体（
2q12−14）上のヒトIL-1遺伝子座に関連があるすべての遺伝子を含むことを意味
する。これらには、ヒトの２番染色体（2q13−14）上のヒトIL-1遺伝子クラスタ
ーに存在するIL-1遺伝子が含まれ、例えば、IL-1L1遺伝子、インターロイキン−
１αをコードしているIL-1A遺伝子、インターロイキン−１βをコードしているI
L-1B遺伝子、およびインターロイキン−１レセプターアンタゴニストをコードし
ているIL-1RN（またはIL-1ra）遺伝子などが挙げられる。さらに、これらのIL-1
関連遺伝子には、ヒトの２番染色体（2q12）上に存在するヒトIL-1レセプターの
I型およびII型、ならびにマウスの１番染色体の19.5cMの位置に存在するマウス
相同体も含まれる。インターロイキン−１α、インターロイキン−１βおよびイ
ンターロイキン−１RNは密接に関連していることから、これらはすべてIL-1 I
型レセプターに結合するが、インターロイキン−１αおよびインターロイキン−
１βはIL-1 I 型レセプターを活性化するアゴニストリガンドであり、インター
ロイキン−１RNは天然に存在するアンタゴニストリガンドである。ここで、「IL
-1」とは、遺伝子産物またはポリペプチドに関して使用しており、すなわち、ヒ
トの２番染色体（2q12−14）上のインターロイキン−１遺伝子座によってコード
されている遺伝子生成物のすべて、ならびに他の種由来の対応する相同体もしく
はそれらの機能性変異体をさす。従って、IL-1とは、炎症性反応を促進する分泌
ポリペプチド（IL-1αおよびIL-1βなど）、ならびに炎症性反応と拮抗する分泌
ポリペプチド（IL-1レセプターアンタゴニストおよびIL-1 II型（おとり）レセ
プターなど）を包含する。
【００８０】 「IL-1レセプター」または「IL-1R」とは、IL-1遺伝子座においてコードされ
ているリガンド（IL-1α、IL-1β、IL-1raもしくはIL-1L1など）に結合すること
ができる、および／またはそのようなリガンドからのシグナルを伝達することが
できる多様な細胞膜結合性タンパク質レセプターをさす。この語は、インターロ
イキン−１（IL-1）分子に結合することができる任意のタンパク質について用い
ることができ、哺乳類のプラズマ膜タンパク質としてのそれらの天然型の立体構
造が、IL-1から発せられるシグナルを細胞へ伝達する際に役立っていると考えら
れる。本明細書において使用しているように、この語には、IL-1結合活性または
シグナル伝達活性を有する天然に存在するタンパク質のアナログを含む。そのよ
うなものの例としてはヒトおよびマウスのIL-1レセプターが挙げられ、例えば、
Ｔ細胞、繊維芽細胞および上皮細胞において発現され、IL-1 I型レセプターと称
される80kDaのポリペプチド（IL-1R I型；シムス（Sims）ら、Science 214:585-
589(1988)）、ならびに、Ｂ細胞、好中球、およびマクロファージにおいて発現
され、IL-1 II型レセプターと称される68kDaのポリペプチド（IL-1R II型；ボム
ツィック（Bomsztyk）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:8034-8038(1989)
）などが含まれ、両者はタンパク質のイムノグロブリン（Ig）スーパーファミリ
ーと構造的関連を有する。本発明のIL-1レセプターは、米国特許第4,968,607号
、第5,081,228号および第5,350,683号に記載されているものを包含する。「IL-1
核酸」とは、IL-1タンパク質をコードしている核酸をさす。
【００８１】 「IL-1ポリペプチド」および「IL-1タンパク質」とは、IL-1のゲノム性DNAに
よってコードされているアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはそれらのフラ
グメント、ならびにそれらの相同体を包含し、さらに、アゴニストポリペプチド
およびアンタゴニストポリペプチドを含む。このようなIL-1タンパク質としては
、IL-1L1、IL-1α、IL-1βおよびIL-1raなどが挙げられる。
【００８２】 「リスクが増している」とは、特定の多型対立遺伝子を持たない集団における
疾病または症状の発現頻度と比較して、特定の多型対立遺伝子を持っている個体
が疾病または症状を発現する頻度が統計的に有為に高いことをさす。
【００８３】 本明細書において使用している「相互作用」とは、分子間における検出可能な
関連または関係を意味し（例えば、生化学的相互作用など）、分子間としては、
タンパク質−タンパク質間、タンパク質−核酸間、核酸−核酸間、ならびにタン
パク質−天然に存在する低分子間、もしくは核酸−天然に存在する低分子間の相
互作用などが挙げられる。
【００８４】 DNAまたはRNAなどの核酸に関して、本明細書において使用している「単離され
た」とは、巨大分子から構成される天然の材料内に存在する他のDNAまたはRNAか
ら分離された分子をさす。例えば、目的のIL-1L1ポリペプチドのうちのひとつを
コードしている単離された核酸は、好ましくは、ゲノム性DNA内のIL-1L1遺伝子
のすぐ横に元来隣接している核酸配列の長さが10kb以下であり、より好ましくは
、そのようにすぐ横に元来隣接している核酸配列の長さが５kb以下であり、最も
好ましくは、そのようにすぐ横に元来隣接している核酸配列の長さが1.5kb以下
である。本明細書において使用している単離された、とは、組換えDNA技術によ
って産生された場合に、細胞性材料、ウイルス性材料もしくは培養培地を実質的
に含まない、または、化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくはその他
の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドをもさす。さらに、「単離さ
れた核酸」とは、天然にはフラグメントとして存在せず、また、天然においては
見出されない核酸フラグメントをも包含する。本明細書において使用している「
単離された」とは、他の細胞性タンパク質から単離されたポリペプチドをもさし
、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドを含む意味である。
【００８５】 「ノックイン」トランスジェニック動物とは、ゲノム内に導入された修飾遺伝
子を保有する動物をさし、そのような修飾遺伝子は外因性または内因性である。
【００８６】 「ノックアウト」トランスジェニック動物とは、内因性の遺伝子の発現が部分
的または完全に抑制されている（例えば、遺伝子の少なくとも一部分の欠失、遺
伝子の少なくとも一部分が別の配列と置換、停止コドンの導入、重要なアミノ酸
をコードしている塩基の突然変異、またはイントロン結合の除去などによる）動
物をさす。好ましい実施態様においては、内因性修飾遺伝子に対応する「ノック
アウト」遺伝子座は機能的に活性なポリペプチドをもはやコードしておらず、「
ヌル」対立遺伝子と呼ばれる。従って、本発明のノックアウトトランスジェニッ
ク動物は、IL-1遺伝子について１個のヌル突然変異を有する動物（例えば、IL-1
L1ヌル対立遺伝子ヘテロ接合体動物など）、およびIL-1遺伝子について２個のヌ
ル突然変異を有する動物（IL-1L1ヌル対立遺伝子ホモ接合体動物など）を含む。
【００８７】 「ノックアウト構築体」とは、細胞内の内因性DNA配列によってコードされて
いるタンパク質の発現を減少させるまたは抑制することを目的として用いること
ができる核酸配列をさす。単純な実施例においては、ノックアウト構築体は、IL
-1RNなどの遺伝子の重要部分が欠失している遺伝子を含んでおり、それによって
活性タンパク質は発現することができない。別の例としては、天然に存在する遺
伝子に多数の停止コドンを付加してタンパク質合成の早期停止を起こさせること
ができ、またはイントロン結合を不活化することができる。代表的なノックアウ
ト構築体においては、遺伝子のいくつかの部分が選択的マーカー（ネオ遺伝子な
ど）によって置換されており、そのような遺伝子は次のように表すことができる
：IL-1RN5'/neo/IL-1RN3'。ここで、IL-1RN5'およびIL-1RN3'は、IL-1RN遺伝子
のある位置の上流および下流にそれぞれ存在するゲノム性配列またはcDNA配列を
さし、neoはネオマイシン耐性遺伝子をさす。別のノックアウト構築体において
は、フランク部位に第二の選択的マーカーを付加することにより、次のように表
すことができる：IL-1RN/neo/IL-1RN/TK。ここで、TKはチミジンキナーゼ遺伝子
であり、これは、先に得られた構築体のIL-1RN5'配列またはIL-1RN3'配列のどち
らにも付加することができ、適切な培地においてさらに選択を行うことができる
（すなわち、TKが負の選択マーカーであるため）。このツーマーカー構築体（tw
o-marker construct）により、一般的にTK配列を保持している非同種組換え事象
から、フランキングTKマーカーが除去されている同種組換え事象の選択が可能に
なる。遺伝子の欠失ならびに／または置換は、エクソン、イントロン（特にイン
トロン結合）および／もしくはプロモーターなどの制御領域において生じ得る。
【００８８】 「結合の脱平衡」とは、ある集団内の各対立遺伝子において発生が予測される
分離頻度よりも、２つの対立遺伝子の共遺伝の頻度が高いことをさす。独立して
遺伝する２つの対立遺伝子の予測出現頻度は、第一の対立遺伝子の出現頻度に第
二の対立遺伝子の出現頻度をかけたものである。予測された頻度で共出現する対
立遺伝子を「結合平衡」にあるという。結合の脱平衡の原因は不明であることが
多い。ある種の対立遺伝子の組み合わせに対する選択によるものであるか、また
は、遺伝的に異種の集団の混合において最近生じたものである可能性がある。さ
らに、疾病遺伝子に強固に結合しているマーカーの場合には、対立遺伝子（また
は結合している対立遺伝子群）と疾病遺伝子との関連性が考えられ、疾病に関す
る突然変異の発生がごく最近である場合には、特定の染色体領域内における組換
え事象によって平衡に達するまでに至っていないことがある。ひとつ以上の対立
遺伝子を含む対立遺伝子パターンについては、第一の対立遺伝子パターンを有す
るすべての対立遺伝子が、第二の対立遺伝子パターンの対立遺伝子のうちの少な
くともひとつと結合脱平衡状態である場合には、該第一の対立遺伝子パターンは
第二の対立遺伝子パターンと結合の脱平衡状態にあるという。結合の脱平衡の例
としては、IL-1RN（+2018）およびIL-1RN（VNTR）多型部位における対立遺伝子
間に生じているものが挙げられる。IL-1RN（+2018）に存在する２つの対立遺伝
子は、IL-1RN（VNTR）に最も多く存在する２つの対立遺伝子（対立遺伝子１およ
び対立遺伝子２）と100％結合脱平衡である。
【００８９】 「マーカー」とは、個体間で異なっていることが既知であるゲノム内の配列を
さす。例えば、IL-1RN遺伝子は可変数縦列反復配列（VNTR）を含むマーカーであ
る。
【００９０】 本明細書において使用している「調節」とは、促進制御（すなわち、活性化ま
たは刺激（例えば、共働もしくは強化などによる））、ならびに抑制制御（すな
わち、阻害または抑制（例えば、拮抗、減少または阻害などによる））をさす。
【００９１】 「突然変異を受けた遺伝子」とは、遺伝子の対立遺伝子型をさし、突然変異を
受けた遺伝子を持っていない個体と比較して、突然変異を受けた遺伝子を持って
いる個体の表現型を変えることができる。表現型を変えるためにはこの突然変異
に関してホモ接合体でなければならない場合、そのような突然変異は劣性である
という。遺伝子型の変化には突然変異を受けた遺伝子のコピーが１個あれば十分
である場合、そのような突然変異は優性であるという。突然変異を受けた遺伝子
のコピーを１個有し、表現型は該遺伝子のホモ接合体とヘテロ接合体との中間を
示す場合、そのような突然変異は共優性（co-dominant）であるという。
【００９２】 本発明の「非ヒト動物」には、齧歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウ
シなどの哺乳類、ならびにニワトリ、両生類、爬虫類などが含まれる。好ましい
非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含む齧歯類から選択され、最も好ましくは
マウスであるが、アフリカツメガエル属などのトランスジェニック両生類、およ
びトランスジェニックニワトリも胚形成および組織形成などに影響を与えること
ができる物質を理解し、確認するための重要な材料となり得る。本明細書におい
て使用している「キメラ動物」とは、組換え遺伝子が見出される、または動物体
内のすべてではないがいくつかの細胞内において組換え遺伝子が発現される動物
をさす。「組織特異的キメラ動物」とは、ある組織において組換えIL-1L1遺伝子
が存在するおよび／もしくは発現される、または分断されているが、他の組織に
おいてはそのようになっていないことをさす。
【００９３】 本明細書において使用している「核酸」とは、デオキシリボ核酸（DNA）およ
びリボ核酸（RNA）などのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをさす。
この語には、等価物として、ヌクレオチドアナログから調製されるRNAもしくはD
NAのアナログ、ならびに記載されている実施態様に応じて単鎖（センス鎖または
アンチセンス鎖）および二本鎖のポリヌクレオチドも含まれる。
【００９４】 「配列番号×に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列」とは、配
列番号×を有する核酸の相補鎖のヌクレオチド配列をさす。本明細書において使
用している「相補鎖」とは、「コンプレメント（complement）」と相互に読み替
えて用いることができる。核酸鎖のコンプレメントとは、コード鎖のコンプレメ
ントまたは非コード鎖のコンプレメントである。二本鎖の核酸の場合、配列番号
×を有する核酸のコンプレメントとは、配列番号×を有する鎖の相補鎖、または
配列番号×の相補鎖のヌクレオチド配列を有する任意の核酸をさす。配列番号×
を有する一本鎖核酸の場合、この核酸のコンプレメントとは、配列番号×のヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸である。ヌクレオチド配
列およびそれらに相補的な配列は、常に５’から３’の方向に記載される。
【００９５】 「同一性パーセント」とは、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド
配列間の配列の同一性をさす。同一性は、比較を目的として並記した各配列のあ
る位置において比較することによって決定することができる。比較した配列内の
同じ位置に同じ塩基またはアミノ酸が存在している場合、それらの分子はその位
置において同一であり、同じ位置に同一または類似のアミノ酸残基（例えば、立
体的性質および／または電気的性質が類似しているなど）が存在している場合、
それらの分子はその位置において相同（類似）であるという。相同性、類似性ま
たは同一性のパーセント表示は、比較した配列内において同一または類似のアミ
ノ酸が存在している位置数の関数で表される。FASTA、BLASTまたはENTREZなどを
含む多様な配列ならびアルゴリズムおよび／またはプログラムを用いることがで
きる。FASTAおよびBLASTは、GCG配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウ
ィスコンシン州マディソン）の一部として利用可能であり、さらに、デフォルト
設定（default setting）なども合わせて利用することができる。ENTREZは、国
立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biothchnology Info
rmation）、国立医学図書館（National Library of Medicine）、国立衛生研究
所（National Institute of Health：メリーランド州ベゼスダ）から入手可能
である。ひとつの実施態様においては、２つの配列間の同一性パーセントは、ギ
ャップウェイトを１とし、GCGプログラムを用いることによって決定することが
でき、例えば、２つの配列間において、単一のアミノ酸またはヌクレオチドがミ
スマッチであるかのように各アミノ酸ギャップにウェイトをかける。
【００９６】 その他の並記技術については、「酵素学における方法 第266巻：巨大分子の
配列解析に関するコンピューターを利用した方法（Methods in Enzymology, vol
.266 : Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis）」（（1996
年）、ドゥーリトル（Doolittle）編、アカデミック・プレス（Academic Press
）社、ハーコート・ブレース（Harcourt Brace）社の一部門、アメリカ合衆国カ
リフォルニア州サンディエゴ）に記載されている。好ましくは、配列内にギャッ
プが存在することを許容する並記プログラムを用いて配列を並べる。スミス−ウ
ォーターマン（Smith-Waterman）は配列ならびにギャップが存在することを許容
するアルゴリズムのうちのひとつである。Meth. Mol. Biol. 70: 173-187(1997)
を参照のこと。さらに、ニードルマン（Needleman）およびワンシュ（Wunsch）
の並記法を用いたGAPプログラムを用いて配列を並べることもできる。別の方法
としては、MASPARコンピューター上で作動するMPSRCHソフトウェアを用いた走査
法がある。MPSRCHは、スミス−ウォーターマン（Smith-Waterman）アルゴリズム
を用い、大型のパラレルコンピューター上で配列を評価する。この方法によって
離れた位置に存在する関連性を拾い上げる能力が向上し、また、この方法は小さ
なギャップおよびヌクレオチド配列エラーに対して特に寛容である。核酸によっ
てコードされているアミノ酸配列を用いることにより、タンパク質およびDNAの
データベースを走査することができる。
【００９７】 個々の配列に関するデータベースは、「酵素学における方法 （Methods in E
nzymology, vol.266）」（ドゥーリトル（Doolittle）編、同上）に記載されて
いる。データベースとしては、ジェンバンク（GenBank）、EMBLおよび日本のDNA
データベース（DDBJ）が挙げられる。
【００９８】 配列番号１〜850のうちのひとつに示す配列の核酸配列との同一性が少なくと
も70％である核酸が好ましく、より好ましくは同一性が80％であり、さらに好ま
しくは90％であり、さらにより好ましくは少なくとも95％である。配列番号１〜
４のうちのひとつに示す核酸配列との同一性が少なくとも90％、より好ましくは
95％、最も好ましくは約98〜99％である核酸配列も本発明の範ちゅうに含まれる
ことは自明である。好ましい実施態様においは、核酸は哺乳類のものである。新
規な核酸を既知の配列と比較する場合には、数種の並記ツールを利用することが
できる。そのようなツールの例としてはパイルアップ（PileUp）が挙げられるが
、これは、複数の配列並びを創出するものであり、フェン（Feng）らによって記
載されている（J. Mol. Evol. 25:351-360(1987)）。別の方法であるGAPは、ニ
ードルマン（Needleman）らの並記法（J. Mol. Biol. 48:443-453(1970)）を利
用している。包括的な配列並記にはGAPが最も適している。第三の方法としては
ベストフィット（BestFit）が挙げられるが、これは、スミス−ウォーターマン
（Smith-Waterman）の局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482-489(1
981)）を用い、ギャップを挿入することによって一致数を最大化するものである
。
【００９９】 「多型」とは、ある遺伝子またはそれらの一部（例えば、対立遺伝子変異体な
ど）についてひとつ以上の型が共存していることをさす。少なくとも２つの異な
る型（すなわち、２つの異なるヌクレオチド配列）が存在する遺伝子の一部分は
、「遺伝子の多型領域」と称される。多型領域は単一のヌクレオチドである場合
もあり、その同一性は対立遺伝子によって異なる。多型性領域のヌクレオチド長
は数個である場合もある。
【０１００】 「多型性遺伝子」とは、少なくともひとつの多型領域を有する遺伝子をさす。
本明細書において使用している「プロモーター」とは、機能発揮できるようにそ
のプロモーターに連結されている選択されたあるDNA配列の発現を制御し、選択
された該DNA配列を細胞内において効率的に発現させるDNA配列を意味する。この
語は、「組織特異的」プロモーター、すなわち、選択された細胞内（例えば、特
定の組織の細胞内など）においてのみ選択された DNA配列を効率的に発現させる
プロモーターを包含する。またこの語は、「リーキー」プロモーター、すなわち
、基本的にはひとつの組織内において選択されたDNAの発現を制御するが、他の
組織内においても発現を行わせるプロモーターも包含する。さらにこの語は、非
組織特異的プロモーター、ならびに構成的発現または誘導的発現（すなわち、発
現レベルが制御可能である）を行うプロモーターをも包含する。
【０１０１】 「疾病の傾向がある」、ならびに「疾病の素因がある」もしくは「疾病にかか
りやすい」とは、本発明において、あるIL-1遺伝子座多型性対立遺伝子が特定の
疾病と関連があることが発見された、または予測されたことを意味する。従って
、健康な個体と比較した場合、疾病に罹患している個体においては該対立遺伝子
の発現頻度が高い。従って、これらの対立遺伝子を用いることにより、発症前ま
たは発病前の個体においても疾病を予測することができる。
【０１０２】 本明細書においては、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」
という語は相互に読み替えて用いられている。
【０１０３】 「組換えタンパク質」とは、組換えDNA技術によって産生された本発明のポリ
ペプチドをさすが、このとき、一般的には、IL-1L1ポリペプチドをコードしてい
るDNAを適切な発現ベクターに挿入し、次に、このベクターを宿主細胞に形質転
換して異種タンパク質を産生させる。さらに、組換えIL-1L1遺伝子に関して「由
来する」とは、「組換えタンパク質」、すなわち、天然型のIL-1L1ポリペプチド
のアミノ酸配列を有する、または、天然型のポリペプチドに対して置換もしく欠
失（切断を含む）を含む突然変異を起こさせることによって産生されたアミノ酸
配列と類似のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むことを意味する。
【０１０４】 本明細書において使用している「低分子」とは、分子量が約５kDa以下であり
、最も好ましくは約４kDa以下である組成物をさす。低分子としては、核酸、ペ
プチド、ポリペプチド、ペプチドミメチック、炭水化物、脂質、またははその他
の有機性（炭素含有）分子もしくは無機性分子が挙げられる。多くの製薬企業が
化学的混合物および／または生物学的混合物（菌類、バクテリア類または藻類の
抽出物であることが多い）についての膨大なライブラリーを所有しており、本発
明の任意のアッセイを用いてそれらをスクリーニングすることにより、IL-1L1の
生物活性を調節する化合物を同定することができる。
【０１０５】 本明細書において使用している「特異的にハイブリダイゼーションする」また
は「特異的に検出する」とは、脊椎動物、好ましくはIL-1L1遺伝子の連続する少
なくとも約６個、約12個、約20個、約30個、約50個、約100個、約150個、約200
個、約300個、約350個、約400個、または約425個のヌクレオチドとハイブリダイ
ズする本発明の核酸分子の能力をさす。
【０１０６】 「転写制御配列」とは、本明細書において使用している一般的用語であり、開
始シグナル、エンハンサーおよびプロモーターなどのDNA配列をさし、これらは
、機能発揮できるように連結されており、タンパク質をコードしている配列の転
写を誘導または制御する。好ましい実施態様においては、IL-1L1遺伝子のうちの
ひとつの転写は、発現が企図されている細胞内において、組換え遺伝子の発現を
制御するプロモーター配列（またはその他の転写制御配列）の制御下にある。組
換え遺伝子は、天然に存在する型のIL-1L1ポリペプチドの転写を制御している転
写制御配列と同じかまたは異なる転写制御配列の制御下にあることも理解できる
であろう。
【０１０７】 本明細書において使用している「トランスフェクション」とは、核酸を介した
遺伝子輸送により、発現ベクターを介するなどして受容細胞内に核酸を導入する
ことをさす。本明細書において使用している「形質転換」とは、外来性のDNAま
たはRNAを細胞内に取り込むことによって細胞の遺伝子型が変化する過程をさし
、例えば、形質転換細胞はIL-1L1ポリペプチドの組換え型を発現し、あるいは導
入された遺伝子のアンチセンス発現の場合には、天然型のIL-1L1ポリペプチドの
発現が中断される。
【０１０８】 本明細書において使用している「導入遺伝子」とは、細胞内に導入された核酸
配列（IL-1L1ポリペプチドのうちのひとつなどをコードしている配列、またはそ
れらのアンチセンス転写体をコードしている配列など）をさす。導入遺伝子は、
導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞に対して部分的または全体的に
異種、すなわち外来性のものを用いることができ、あるいは、導入されるトラン
スジェニック動物もしくは細胞の内因性遺伝子と同種であるが、導入される細胞
のゲノムを変化させるような方法で動物のゲノム内に導入されるよう設計される
、もしくは導入される（例えば、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に導入する
、または遺伝子の導入によってノックアウトが得られる位置に導入するなど）。
導入遺伝子はエピソームとして細胞内に存在することができる。導入遺伝子は、
１個またはそれ以上の転写制御配列およびイントロンなどのその他の核酸を含む
場合があるが、これらは、選択された核酸の至適発現に必要であると考えられる
。
【０１０９】 「トランスジェニック動物」とは、動物体内の１個またはそれ以上の細胞内に
人為的介入（例えば、当該分野において既知であるトランスジェニック技術など
）によって導入された異種核酸を有する任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳類、
鳥類もしくは両生類をさす。核酸は、マイクロインジェクションまたは組換えウ
イルスを用いたインフェクションなどのような計画的な遺伝子操作法を用い、細
胞の前駆体に導入することにより、直接的または間接的に細胞内に導入される。
遺伝子操作という語は、古典的な交配またはイン・ビトロ（in vitro）受精の意
味は含まず、組換えDNA分子の導入をさすものである。この分子は、染色体内に
組み込まれるかまたは、染色体外でDNAを複製する。本明細書に記載している一
般的なトランスジェニック動物においては、導入遺伝子は、IL-1L1ポリペプチド
（例えば、アゴニスト型またはアンタゴニスト型など）のうちのひとつについて
の組換え型を細胞に発現させる。しかしながら、組換えIL-1L1遺伝子がサイレン
トであるトランスジェニック動物を企図することもあり、これらには例えば、以
下に記載しているようなFLPまたはCREリコンビナーゼ依存性構築体などが挙げら
れる。さらに、「トランスジェニック動物」には、人為的介入（組換えおよびア
ンチセンス法を含む）により、１個またはそれ以上のIL-1L1遺伝子において遺伝
子の分裂が生じている組換え動物も含む。
【０１１０】 本明細書において使用している「治療する」とは、病態または疾病の症状の少
なくともひとつが治癒および軽減することを含む。
【０１１１】 「ベクター」とは、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を
さす。好ましいベクターのひとつの型としては、エピソーム、すなわち、染色体
外複製をすることができる核酸が挙げられる。好ましいベクターとは、それらに
連結されている核酸が自動複製および／または発現することができるものである
。本明細書においては、機能発揮できるように遺伝子に連結し、その遺伝子を発
現させることができるベクターを「発現ベクター」と称する。一般的には、組換
えDNA技術における発現ベクターの使用は、「プラスミド」の形で行われること
が多く、ここでプラスミドとは、一般的に環状二本鎖DNAループをさし、ベクタ
ー型においては染色体に結合していない。プラスミドは最も広範に用いられてい
るベクターの様式であることから、本定義においては、「プラスミド」と「ベク
ター」を相互に読み替えて用いることができる。しかしながら、本発明は、同等
の機能を発揮し、本明細書に続いて当該分野において既知となるその他の発現ベ
クターをも包含する。
【０１１２】 「野生型対立遺伝子」とは、個体内に存在する２個のコピーが、野生型表現型
を示す場合の対立遺伝子をさす。遺伝子内のある種のヌクレオチドの変化は、ヌ
クレオチドが変化している遺伝子のコピーを２個有する個体表現型には影響を与
えないことから、特定の遺伝子に関して数種の異なる野生型対立遺伝子が存在す
る可能性がある。
【０１１３】 ４．３ 本発明の核酸 本発明は、IL-1L1核酸、それらの相同体、およびそれらの一部分を提供する。
好ましい核酸は、IL-1L1遺伝子のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１、２、
３もしくは４、またはそれらと相補的な配列のうちのひとつ、あるいはATCC受理
番号がXXXXXもしくはXXXXXであるIL-1L1核酸のうちのひとつなど）との相同性が
少なくとも約60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％であり、
より好ましくは約85％であり、さらに好ましくは約90％であり、さらに好ましく
は約95％であり、またさらに好ましくは約99％である。配列番号１、２、３もし
くは４、またはそれらと相補的な配列のうちのひとつとの同一性が少なくとも90
％、より好ましくは95％、最も好ましくは約98〜99％である核酸も本発明の範ち
ゅうに含まれることは自明である。好ましい実施態様においては、核酸は哺乳類
由来であり、特に好ましい実施態様においては、配列番号10または11に記載して
いる核酸などのコード領域に対応するヌクレオチド配列のすべてまたは一部分を
含むが、このとき、該コード領域は、配列番号１または４のIL-1L1 cDNA配列内
にそれぞれ含まれているヒトおよびマウスのIL-1L1 ORF配列に対応している。
【０１１４】 さらに本発明は、IL-1L1遺伝子のヒトおよびマウスの相同体によってコードさ
れているIL-1L1転写体の３’UTR（非翻訳領域）に存在し、進化の過程を通じて
保存されている核酸配列を提供する。この保存領域に対応する41個のヌクレオチ
ドからなる共通配列は、５’−ACAATNAAAANCCCGATNCTGGTCTCTANTCNCATNAAAA−３
’（配列番号12）であり、配列番号１（hIL-1L1）のヌクレオチド番号1137およ
び配列番号４（mIL-1L1）のヌクレオチド番号1146からはじまっている。一般的
には、３’および５’UTR配列は進化の過程を通してそれほどよく保存されてい
はいないが、これは、それらの配列が生体レベルにおいて淘汰圧の対象となるよ
うな機能性ポリペプチド遺伝子産物をコードしていないからである。しかしなが
ら、そのような非コード保存性配列のうちのあるものは、mRNAプロセッシング（
例えば、スプライシング、停止、またはポリアデニル化など）、mRNA安定性また
はポリペプチド翻訳開始などにおいて重要な役割を果たすことがある。別の場合
には、そのような保存性配列は、エクソン配列に結合し、上流の転写開始部位に
影響を与える転写制御タンパク質（転写アクチベーターおよびリプレッサーなど
）の結合部位を表していることがある。この制御配列は、異種発現系に挿入する
ことにより、組換え遺伝子発現などの発現レベルまたは制御に影響を及ぼすこと
ができる。別の方法としては、新規に同定された本配列は、IL-1L1遺伝子発現の
レベルおよび／またはパターンを変化させることを目的として、IL-1L1遺伝子の
組換え型から除去することができる。
【０１１５】 本発明は、IL-1L1ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離
された核酸、そのような核酸の変異体および／または等価物も包含する。等価物
とは、機能的に等価なIL-1L1ポリペプチド、または本明細書に記載しているよう
なIL-1L1タンパク質の活性を有する機能的に等価なペプチドをコードしているヌ
クレオチド配列を含むことは明らかである。等価ヌクレオチド配列には、１個ま
たはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失によって異なっている配列
（対立遺伝子変異体など）を含み、さらに、遺伝子コードの縮重により、配列番
号１、２、３または４に示すIL-1L1遺伝子のヌクレオチド配列とは異なっている
配列も含む。
【０１１６】 好ましい核酸は脊椎動物のIL-1L1核酸である。特に好ましい脊椎動物IL-1L1核
酸とは哺乳類のものである。種とは関係なく、好ましいIL-1L1核酸は、脊椎動物
IL-1L1タンパク質のアミノ酸配列との類似性または同一性が少なくとも約60％、
65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％または95％であるポリペプチ
ドをコードしている。ひとつの実施態様においては、核酸は、IL-1L1ポリペプチ
ドの生物活性のうちの少なくともひとつを有するポリペプチドをコードしている
cDNAである。好ましくは、核酸は、配列番号１、２、３または４の核酸に対応す
るヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む。
【０１１７】 本発明のさらに別の好ましい核酸は、少なくとも２個、５個、10個、25個、50
個、100個、150個または200個のアミノ酸残基から構成されるIL-1L1ポリペプチ
ドをコードしている。例えば、そのような核酸は、約50、60、70、80、90または
100塩基対で構成することができる。本発明の範ちゅうには、プローブ／プライ
マーまたはアンチセンス分子（すなわち、非コード核酸分子）として使用され、
長さが少なくとも約６、12、20、30、50、60、70、80、90または100塩基対であ
る核酸分子も含まれる。
【０１１８】 本発明を別の面からみると、ストリンジェント条件下において、配列番号１、
２、３もしくは４で表される核酸、またはそれらと相補的な核酸、あるいはATCC
受理番号がXXXXXもしくはXXXXXである核酸とハイブリダイズする核酸を提供する
。DNAハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件とは、
例えば、約45℃において6.0×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）で処
理し、続いて50℃において2.0×SSCで洗浄するなどであるが、そのような条件は
当業者において既知であり、または「分子生物学における最新プロトコール（Cu
rrent Protocols in Molecular Biology）」（ジョン・ウィレー＆サンズ（John
Wiley & Sons）社、ニューヨーク、1989年、6.3.1〜6.3.6）もしくは「分子ク
ローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning : A Laboratory Manual）
」（コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、
1989年）に記載されている。例えば、洗浄段階の塩濃度は、50℃において約2.0
×SSCを用いるストリンジェンシーの低い条件から50℃において約0.2×SSCを用
いるストリンジェンシーの高い条件までの中から選択することができる。さらに
、洗浄段階の温度は、約22℃の室温で行うストリンジェンシーの低い条件から約
65℃で行うストリンジェンシーの高い条件まで上昇させることができる。温度と
塩濃度とを変化させることが可能であり、または、温度と塩濃度を一定に保ちな
がら他の条件を変化させることもできる。好ましい実施態様においては、本発明
のIL-1L1核酸は、中程度のストリンジェンシー条件下（例えば、約2.0×SSCを用
い、温度は約40℃）において、配列番号１、２、３もしくは４、またはそれらと
相補的な配列のうちのひとつと結合する。特に好ましい実施態様においては、本
発明のIL-1L1核酸は、ストリンジェンシーが高い条件下において、配列番号１、
２、３もしくは４、またはそれらと相補的な配列のうちのひとつと結合する。別
の特に好ましい実施態様においては、本発明のIL-1L1核酸配列は、ストリンジェ
ンシーが高い条件下において、IL-1L1 ORF核酸配列に対応している配列番号10ま
たは11のうちのひとつと結合する。
【０１１９】 遺伝子コードの縮重により、配列番号１もしくは４、または10もしくは11のう
ちのひとつに示されているヌクレオチド配列、あるいはそれらと相補的なヌクレ
オチド配列と異なる配列を有する核酸も本発明の範ちゅうに含まれる。そのよう
な核酸は、機能的に等価なペプチド（すなわち、IL-1L1ポリペプチドの生物学的
活性を有するペプチド）をコードしてはいるが、遺伝子コードの縮重によって配
列リストに記載されている配列とは配列が異なっている。例えば、１組以上の三
つ組みコドンによって定義されているアミノ酸が多数存在する。同じアミノ酸を
特定しているコドン、すなわち、同義コドン（例えば、CAUおよびCACはいずれも
ヒスチジンをコードしている）は、IL-1L1ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を
与えない「サイレント」突然変異となる。しかしながら、IL-1L1ポリペプチドの
アミノ酸配列に変化をもたらすDNA配列多型が哺乳類の間に存在すると考えられ
ている。当業者であれば、ある種の個体間においては、天然の対立遺伝子変化に
より、IL-1L1ポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードしている核酸中
のヌクレオチドが１個またはそれ以上（例えば、ヌクレオチドの約３〜５％まで
）変化している可能性があることを察知できるであろう。
【０１２０】 ４．３．１ プローブおよびプライマー 哺乳類の組織から得たIL-1L1遺伝子のクローニングによって決定されたヌクレ
オチド配列により、他の細胞型（例えば、他の組織由来など）のIL-1L1相同体お
よび他の哺乳類の組織由来のIL-1L1相同体の同定および／またはクローニングに
使用することを目的として設計されたプローブおよびプライマーの作出が可能に
なる。例えば、本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプロー
ブ／プライマーも提供し、このとき、該オリゴヌクレオチドは、ストリンジェン
ト条件下において、配列番号１、２、３、４、10もしくは11、または天然に存在
するそれらの突然変異体を含む群から選択されるセンスまたはアンチセンス配列
中の少なくとも約12個、好ましくは25個、より好ましくは40個、50個または75個
の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
例えば、配列番号10または11に示されている核酸配列に基づくプライマーをPCR
反応に使用し、IL-1L1ポリペプチドをコードしている遺伝子をクローニングする
ことができる。
【０１２１】 好ましい実施態様においては、IL-1L1プライマーは、特異性を最適化し、プラ
イミング効率に影響を及ぼす二次構造を避けるように設計する。本発明の至適プ
ライマーは、「上流」および「下流」プライマーの融点がほぼ等しくなるように
設計されており、このとき、融点は次のような式を用いて求めることができる：
T m ＝81.5℃−16.6（log 10 [Na+ ]）＋0.41（％G＋C）−0.63（ホルムアミド
％）−（600／長さ）またはT m（℃）＝２（A/T）＋４（G/C）。至適IL-1L1プラ
イマーは、バイオメディカル研究のためのホワイトヘッド研究所（Whitehead In
stitute for Biomedical Research : http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/
primer/primer3.cgi）によって提供されている「プライマー３（Primer3）」な
どのような多様なプログラムを用いて設計することも可能である。
【０１２２】 好ましい実施態様においては、IL-1L1プローブおよびプライマーを用い、IL-1
L1遺伝子配列の内部および周辺に生じるヒトIL-1遺伝子座多型を検出することが
できる。IL-1遺伝子座内の遺伝的変異は、炎症性疾患および自己免疫性疾患など
のようなヒトにおいて発症する多くの疾病および病態の進行に関連性があると考
えられており、そのような状況においては、IL-1によってコードされているポリ
ペプチドが重要な病因となっている。従って、本発明は、ヒトおよびマウスのIL
-1L1遺伝子が関与している多型を含むIL-1遺伝子座多型に対するプローブおよび
プライマーを提供する。本発明のPCRプライマーは、IL-1L1のヒト多型に隣接し
、ゲノムのこの領域を増幅させ、解析することができるものを含む。多型対立遺
伝子の同一性の分析は、例えば、直接シークエンスによって、または対立遺伝子
特異的捕捉プローブを用いて、もしくは分子標識プローブを用いて行うことがで
きる。別の方法としては、PCR産物内に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を作出
するまたは削除することによって多型対立遺伝子を直接検出することが可能であ
り、または、プライマーの配列が改変されるように少なくとも１個のプライマー
に適切な配列の変形を施し、そのような配列が特定のIL-1多型対立遺伝子の増殖
によって得られたPCR産物に組み込まれた場合に、少なくとも１組の対立遺伝子
と組み合わせるが、該多型の別の少なくとも１組の対立遺伝子とは組み合わせな
いことによって特異的な制限部位を作出する。可変数縦列反復配列（VNTR）多型
に対応するIL-1多型は、電気泳動移動度によって検出することが可能であり、従
って、VNTRに隣接しているプライマーを用いてPCR産物の分子量が求められる。
制限断片長多型（RFLP）に対応するその他のIL-1多型についても、適切なIL-1遺
伝子座プローブ、ならびにヒトもしくは非ヒト動物などの適切なサンプル組織か
ら得たゲノム性DNAもしくはcDNAを用いたサザンブロット上のバンドの移動度か
ら直接検出することができる。
【０１２３】 同様に、IL-1L1配列に基づくプローブを用い、同一または同種のタンパク質を
コードしている転写体またはゲノム性配列を検出することができ、これらは、例
えば、予後アッセイまたは診断アッセイに利用することができる（詳細について
は以下に記載）。本発明は、交互にスプライスされたIL-1L1転写体の変異体に共
通なプローブを提供し、それらは例えば、配列番号１、４、10または11のうちの
いずれかにおいて見出される配列と相補的である少なくとも12個の連続したヌク
レオチドに対応している。さらに、本発明は、IL-1L1転写体の交互スプライス型
に特異的にハイブリダイズするプローブを提供する。例えば、配列番号２または
３のいずれかにおいて見出される配列と相補的な少なくとも12個の連続したヌク
レオチドからなるプローブを用い、選択的５’末端が番号１または番号２である
転写体の型に対応するヒトIL-1L1遺伝子転写体の選択的スプライス型を検出する
ことができる。好ましい実施態様においては、プローブはさらに、それらに結合
し、検出可能となるようなラベル基を有しており、そのようなラベル基としては
、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、および酵素補因子などを含む群か
ら選択される。
【０１２４】 核酸のその他の型について本明細書で既に記載しているように、プローブおよ
びプライマーを調製し、変形することができる。
【０１２５】 ４．３．２ アンチセンス、リボザイムおよびトリプレックス技術 本発明を別の側面からみると、「アンチセンス」治療において単離された核酸
を使用することに関する。本明細書において使用しているように、「アンチセン
ス」治療とは、細胞性条件下において、１個またはそれ以上のIL-1L1タンパク質
をコードしている細胞性mRNAおよび／またはゲノム性DNAと特異的にハイブリダ
イズする（例えば、結合するなど）オリゴヌクレオチド分子またはそれらの誘導
体を投与する、またはイン・サイチュー（in situ）で生成させることにより、
該タンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害するこ
となどによって）ことをさす。結合は、従来型の塩基対相補性により、または例
えば、DNA二本鎖への結合の場合には、二重らせんの主要な溝における特異的相
互作用を介して行われると考えられる。一般的には、「アンチセンス」治療とは
、当該分野において一般的に用いられる技術の範囲をさし、オリゴヌクレオチド
配列の特異的結合に、基づく任意の治療を含む。
【０１２６】 本発明のアンチセンス構築体は、例えば、発現プラスミドとして輸送すること
ができ、該プラスミドが細胞内で転写された場合には、IL-1L1タンパク質をコー
ドしている細胞性mRNAの特異的部分に対しては少なくとも相補的であるRNAを産
生する。別の方法としては、アンチセンス構築体はオリゴヌクレオチドプローブ
であるが、これは、イクス・ビボ（ex vivo）において産生され、細胞内に導入
された場合には、mRNAおよび／またはIL-1L1遺伝子のゲノム性配列とハイブリダ
イズすることにより、発現阻害を起こす。好ましくは、そのようなオリゴヌクレ
オチドは、内在性のエンドヌクレアーゼ（例えば、エクソヌクレアーゼおよび／
またはエンドヌクレアーゼなど）に対して抵抗性であり、また、それ故にイン・
ビボ（in vivo）で安定である変形オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオ
リゴヌクレオチドとして使用される核酸分子の例としては、ホスホルアミデート
（phosphoramidate）、ホスホチオエートおよびDNAのメチルホスホネートアナロ
グなどが挙げられる（米国特許第5,176,996号、5,264,564号および5,256,775号
も参照のこと）。さらに、アンチセンス治療に有用なオリゴマーを構築するため
の一般的な方法については総説が著されており、例えば、ヴァン・デル・クロー
ル（Van der Krol）ら、Bio Techniques 6 : 958-976(1988)およびステイン（St
ein）ら、Cancer Res. 48 : 2659-2668(1988)などが挙げられる。アンチセンスD
NAに関しては、翻訳開始部位（例えば、目的とするIL-1L1ヌクレオチド配列の−
10〜＋10の間の領域など）由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１２７】 アンチセンス法には、IL-1L1 mRNAに相補的なオリゴヌクレオチド（DNAまたは
RNA）を設計することを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、IL-1L1 mRNA
転写体に結合し、翻訳を阻止する。完全に相補的であることが好ましいが、必ず
しも必要というわけではない。二本鎖アンチセンス核酸の場合には、二本のDNA
のうちの一本について試験を行うか、または、三本鎖の形成についてアッセイを
行う。ハイブリダイズ能は、相補性の度合いおよびアンチセンス核酸の長さによ
って定まる。一般的には、ハイブリダイズする核酸の長さが長いほどRNAに含ま
れるミスマッチ塩基数が増えるが、安定な二本鎖（場合によっては三本鎖）を形
成する。当業者であれば、ハイブリダイズしたコンプレックスの融点を測定する
という標準的な方法を用いることにより、ミスマッチの許容範囲を確認すること
ができる。
【０１２８】 mRNAの５’末端（例えば、AUG開始コドンを含む５’非翻訳領域までなど）に
相補的な配列は、翻訳の阻止に対して最も効果的に作用するはずである。しかし
ながら、最近、mRNAの３’非翻訳配列に相補的な配列もmRNAの翻訳の阻止に対し
て作用を発揮することが示された（ワーグナー（Wagner）,R.ら、Nature 372 :
333(1994)）。故に、IL-1L1遺伝子の５’または３’非翻訳、非コード領域に相
補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンス法に使用し、内在性のIL-1L1 mRNAの
翻訳を阻止することができる。mRNAの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオ
チドは、AUG開始コドンに相補的なコドンを含んでいなければならない。mRNAの
コード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳阻止効果は低い
が、本発明に従って用いることもできる。IL-1L1 mRNAの５’、３’またはコー
ド領域のいずれかにハイブリダイズするように設計するためには、アンチセンス
核酸は、少なくとも６個のヌクレオチドから構成されている必要があり、好まし
くは、約100個以下、より好ましくはヌクレオチド数が約50個、25個、17個また
は10個以下である。
【０１２９】 標的配列の選択に関係なく、はじめにイン・ビボ（in vivo）実験を行ってア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を阻害する能力を評価することが好
ましい。これらの実験においては、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチ
ドの非特異的生物学的効果とを区別する対照を用いることが好ましい。さらに、
これらの実験においては、標的RNAまたはタンパク質のレベルを内部対照RNAまた
はタンパク質のそれと比較することが好ましい。加えて、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドを用いて得られた結果を対照オリゴヌクレオチドを用いていられたそ
れらと比較することも含まれる。対照オリゴヌクレオチドは被験オリゴヌクレオ
チドとほぼ同じ長さであることが好ましく、また、標的細胞への特異的ハイブリ
ダイゼーションを避ける必要性からオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列はア
ンチセンス配列と差異がないことが好ましい。
【０１３０】 オリゴヌクレオチドとしては、DNAもしくはRNAまたはそれらのキメラ混合物あ
るいはそれらの誘導体もしくは変形体を用いることができ、一本鎖のものも二本
鎖のものも用いることができる。オリゴヌクレオチドは、分子の安定性、ハイブ
リダイゼーションなどを向上させることなどを目的として、塩基部位、糖部位ま
たはリン酸骨格を変形することができる。オリゴヌクレオチドはその他の付加基
を有する場合があり、それらには例えば、ペプチド（例えば、宿主細胞レセプタ
ーを標的とする目的で用いる）、細胞膜を通過させる物質（例えば、レシンガー
（Letsinger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 : 6553-6556(1989)；
レマイトレ（Lemaitre）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 : 648-652(1
987)；1988年12月15日発行のPCT公開公報第WO88/09810などを参照）もしくは脳
血管関門を通過させる物質（例えば、1988年４月25日発行のPCT公開公報第WO89/
10134などを参照）、ハイブリダイゼーションによって活性化する解裂剤（例え
ば、クロール（Krol）ら、Bio Techniques 6 : 958-976(1988)などを参照）、ま
たはインターカレート剤（例えば、ゾン（Zon）ら、Pharm. Res. 5 : 539-549(1
988)などを参照）などが挙げられる。最後に、オリゴヌクレオチドにその他の分
子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって活性化する架橋剤、輸
送剤、ハイブリダイゼーションによって活性化する解裂剤などをコンジュゲート
させることもできる。
【０１３１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の変形塩基部位を含む場
合があり、そのような部位は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５
−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−ア
セチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウラシル、５−カルボキ
シメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル
ウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、
N6−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，
２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル
シトシン、５−メチルシトシン、N6−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチ
ルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−
Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボメチルウラシル、５−メト
キシウラシル、２−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−
オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、キ
ューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラ
シル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチ
ルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル
、３−（３−アミノ−３−N−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（acp３）ｗ
、および２，６−ジアミノプリンからなる群から選択されるが、これらに限定さ
れるわけではない。
【０１３２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の変形糖部位を含む場合
があり、そのような部位は、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシル
ロースおよびヘキソースからなる群から選択されるが、これらに限定されるわけ
ではない。
【０１３３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、中性のペプチド様骨格を有する場合もあ
る。そのような分子はペプチド核酸（PNA）−オリゴマーと称され、ペリー−オ
キーフ（Perry-O'Keefe）ら（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93 : 14670(19
96)）およびエグロム（Eglom）ら（Nature 365 : 566(1993)）によって記載され
ている。PNAオリゴマーのひとつの長所は、DNAの骨格が中性であるため、培地の
イオン強度とは基本的に関係なく、相補的DNAに結合することができることであ
る。さらに別の実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少な
くとも１個の変形リン酸骨格を含む場合があり、そのような骨格は、ホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデ
ート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステ
ル、およびホルムアセタールならびにそれらのアナログからなる群から選択され
る。
【０１３４】 さらに別の実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的RN
Aと特異的に二本鎖ハイブリッドを形成するが、このとき、相補的RNAは、通常の
βユニットとは対称的に、鎖が互いに平行に組合わさっている（ガウティエ（Ga
utier）ら、Nucl. Acids Res. 15 : 6625-6641(1987)）。オリゴヌクレオチドは
２’−O−メチルリボヌクレオチド（イノウエ（Inoue）ら、Nucl. Acids Res. 1
5 : 6131-6148(1987)）またはキメラRNA-DNAアナログ（イノウエ（Inoue）ら、F
EBS Lett. 215 : 327-330(1987)）である。
【０１３５】 本発明のオリゴヌクレオチドは、自動DNA合成機（バイオサーチ（Biosearch）
社、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社などから購入可能
）の使用などのような当該分野において既知である標準的な方法によって合成す
ることができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはステイン（
Stein）らの方法（Nucl. Acids Res. 16 : 3209(1988)）に従って合成すること
ができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは孔調整ガラスポリマー支持体
を用いて調製することができる（サリン（Sarin）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 85 : 7448-7451(1988)）。
【０１３６】 IL-1L1コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを用いることがで
きるが、転写された非翻訳領域および開始メチオニンを含む領域に相補的なアン
チセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０１３７】 アンチセンス分子は、イン・ビボ（in vivo）においてIL-1L1を発現する細胞
に輸送することができる。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に輸送する方法に関
しては、様々な方法が開発されており、それらは例えば、アンチセンス分子を組
織部位に直接注入することができ、または、所望する細胞を標的とするように設
計した変形アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面において発現されたレセプ
ターまたは抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結したアンチセンス
など）を全身投与することができる。
【０１３８】 しかしながら、ある場合においては、アンチセンスの細胞内濃度が内在性のmR
NAの翻訳を抑制するのに十分な濃度に達することが困難な場合がある。従って、
好ましい方法においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なpol IIIま
たはpol IIプロモーターの制御下におかれている組換えDNA構築体を用いる。そ
のような構築体を用いて患者の標的細胞にトランスフェクトすることにより、内
在性のIL-1L1転写体に相補的な塩基対を形成すると、一本鎖RNAの転写が十分量
行われ、され、それによってIL-1L1 mRNAの翻訳が阻止される。例えば、ベクタ
ーが細胞によって取り込まれ、アンチセンスRNAの転写を標的とするようにベク
ターを導入することができる。そのようなベクターは、転写されて所望するアン
チセンスRNAを産生することができる限りは、エピソーム性を保持しているか、
または染色体に取り込まれることができる。そのようなベクターは、当該分野に
おいて標準的な組換えDNA法によって構築することができる。ベクターとしては
、プラスミド、ウイルスまたは当該分野において既知であるその他のものが挙げ
られ、これらを用いて哺乳類細胞内において複製および発現を行わせることがで
きる。アンチセンスRNAをコードしている配列の発現は、哺乳類細胞内、好まし
くはヒトの細胞内で作用することが確認されている任意のプロモーターを用いて
行うことができる。そのようなプロモーターは、誘導的または構成的であり、例
えば、SV40初期プロモーター領域（バーノイスト（Bernoist）およびシャンボン
（Chambon）、Nature 290 : 304-310(1981)）、ルイス肉腫（Rous sarcoma）ウ
イルスの長い３’末端反復配列内に存在するプロモーター（ヤマモト（Yamamoto
）ら、Cell 22 : 787-797(1980)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（
ワーグナー（Wagner）,R.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 : 1441-144
5(1981)）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（ブリンスター（Brinster）ら
、Nature 296 : 39-42(1982)）などが挙げられるが、これらに限定されるわけで
はない。任意の型のプラスミド、コスミド、YACまたはウイルスベクターを用い
ることにより、組織部位に直接導入することができる組換えDNA構築体を調製す
ることができる。別の方法としては、所望する組織に選択的に感染するウイルス
ベクターを用いることができ、その場合には、別の投与経路（例えば、全身投与
など）によって投与を行うことができる。
【０１３９】 酵素を用いてIL-1L1 mRNA転写体を酵素解裂させるように設計されたリボザイ
ム分子を使用してIL-1L1 mRNAの翻訳およびIL-1L1の発現を阻止することもでき
る（例えば、1990年10月４日に発行されたPCT国際公開公報第WO90/11364；サー
ヴァー（Saver）ら、Science 247 : 1222-1225(1990)および米国特許第5,093,24
6号などを参照）。部位特異的認識配列においてmRNAを解裂させるリボザイムを
用いてIL-1L1 mRNAを破壊することはできるが、ハンマーヘッド型リボザイムの
使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形
成する隣接領域（フランキング領域）によって検出された位置においてmRNAを解
裂する。唯一必要なことは、標的mRNAが二塩基からなる次のような配列：５’−
UG −３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生
は当該分野において既知であり、ハセロフ（Haseloff）およびガーラック（Gerl
ach）によって詳細に記載されている（Nature 334 : 585-591(1988)）。ヒトIL-
1L1 cDNA（図１）およびマウスIL-1L1cDNA（図２）のヌクレオチド配列内には、
ハンマーヘッド型リボザイム解裂部位になり得る部位が多数存在している。好ま
しくは、解裂認識部位がIL-1L1 mRNAの５’末端付近に位置するように、すなわ
ち、効率を上げ、かつ、非機能的mRNA転写体の細胞内蓄積を最小限にするために
、リボザイムを操作する。
【０１４０】 本発明のリボザイムは、RNAエンドリボヌクレオチドアーゼ（本明細書におい
ては、以後「セック型リボザイム（Cech-type ribozyme）」と称する）も含むが
、そのような例としては、テトラヒメナ・サーモフィラ（Tetrahymena thermoph
ila）中に天然に存在するもの（IVSまたはL-19IVS RNAとして知られている）お
よびトーマス・セック（Thomas Cech）と共同研究者らによって詳細に記載され
ているもの（ザウ（Zaug）ら、Science 224 : 574-578(1984);ザウ（Zaug）およ
びセック（Cech）、Science 231 : 470-475(1986)；ザウ（Zaug）ら、Nature 32
4: 429-433(1986)；ユニバーシティ・パテント（University Patents）社による
公開国際特許公報第WO88/04300；ビーン（Been）およびセック（Cech）、Cell 4
7 : 207-216(1986)）などが挙げられる。セック型リボザイムは、標的RNA配列に
ハイブリダイズし、標的RNAの解裂後、それに取って代わる８塩基対から構成さ
れる活性部位を有する。本発明は、IL-1L1遺伝子内に存在する８塩基対活性部位
配列を標的とする上記のようなセック型リボザイムを含む。
【０１４１】 アンチセンス法と同様に、リボザイムは変形オリゴヌクレオチド（例えば、安
定性、標的の正確性などを向上させる目的として）から構成することができ、イ
ン・ビボ（in vivo）においてIL-1L1遺伝子を発現する細胞に輸送されなければ
ならない。好ましい輸送方法としては、強力な構成性プロモーターであるpol II
Iまたはpol IIの制御下においてリボザイムを「コードしている」DNA構築体を用
いることが挙げられるが、これは、内在性IL-1L1遺伝情報を破壊し、翻訳を阻害
するのに十分な量のリボザイムを感染した細胞内において産生させるためである
。リボザイムはアンチセンス分子とは異なり、触媒性であることから、効率を上
げるためには細胞内濃度が低いことが必要である。
【０１４２】 内在性IL-1L1遺伝子の発現は、標的同種組換え（targeted homorogous recomb
ination ）を用い、IL-1L1遺伝子またはそのプロモーターを不活化または「ノッ
クアウト」することによっても減少させることができる（例えば、スミシーズ（
Smithies）ら、Nature 317 : 230-234(1985)；トーマス（Thomas）およびカペッ
チ（Capecchi）、Cell 51 : 503-512(1987)；トンプソン（Thompson）ら、Cell
5 : 313-321(1989)などを参照。これらの各文献を参照として全体的に本明細書
中に取り入れておく）。例えば、内在性IL-1L1遺伝子（IL-1L1遺伝子のコード領
域または制御領域）と同種のDNAが隣接している突然変異型非機能性IL-1L1（ま
たは全く無関係のDNA配列）に選択的マーカーおよび／または負の選択的マーカ
ーを付加して、または付加せずに用い、イン・ビボ（in vivo）においてIL-1L1
を発現する細胞にトランスフェクトすることができる。標的同種組換え体を介し
たDNA構築体の挿入により、IL-1L1遺伝子が不活化した。そのような方法は、農
業分野において特に好ましく、ES（胚性幹）細胞を用いて不活化IL-1L1を有する
動物の子を得ることができる。（トーマス（Thomas）およびカペッチ（Capecchi
）、(1987) 同上、ならびにトンプソン（Thompson）ら、(1989)同上などを参照
）。しかしながら、この方法はヒトに対しても適用することができ、組換えDNA
構築体を直接投与するか、または、適切なウイルスベクターを用いてイン・ビボ
（in vivo）の要求部位に送達する。
【０１４３】 別の方法としては、IL-1L1遺伝子の制御領域（すなわち、IL-1L1プロモーター
および／またはエンハンサー）に相補的な標的化デオキシリボヌクレオチド配列
（targeting deoxyribonucleotide sequence）を用い、体内の標的細胞内のIL-1
L1遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成することによって、内在性IL-1
L1遺伝子の発現を減少させることができる（一般的なものとしては、ヘレン（He
lene）, C. Anticancer Drug Res. 6(6) : 569-584(1991)；ヘレン（Helene）,
C. Ann. N. Y. Acad. Sci. 660 : 27-36(1992)；マハー（Maher）, L. J. Bioas
says 14(12) : 807-815(1992)を参照）。
【０１４４】 転写を阻害するための三重らせん形成に用いられる核酸分子は、一本鎖であり
、デオキシリボヌクレオチドによって構成されていることが好ましい。これらの
オリゴヌクレオチドの塩基組成物は、二本鎖のうちの一本に存在するプリンまた
はピリミジンのどちらかが一般的にかなり大きく広がる必要があるというフーグ
スティーン塩基対則に従って三重らせんの形成を促進する。ヌクレオチド配列は
ピリミジンが基準になっている場合が多いことから、得られた三重らせんの３本
の鎖はTATおよびCGCの三つ組で交叉することになる。ピリミジンに富んだ分子は
、二本鎖のうちのプリンに富んだ領域に相補的な塩基をその鎖と平行方向で提供
する。さらに、核酸分子としては、G残基の広がりを有するなどのプリンに富ん
だ核酸が選択される。これらの分子はGC対に富んだDNA二本鎖と共に三本鎖を形
成するが、このとき、プリン残基の大部分は標的二本鎖の中の一本に存在してお
り、三重らせんの三本の鎖の間にはCGCの三つ組が交叉している。
【０１４５】 別の方法としては、三重らせん形成のための標的化となり得る配列は、いわゆ
る「スイッチバック」核酸分子を調製することによって増やすことができる。ス
イッチバック分子は、二重らせんのうちの一本に存在するプリンまたはピリミジ
ンのかなり大きな広がりの必要性を排除しながら、はじめに一本の鎖に対して塩
基対を形成していき、次にもう一本の鎖に対し塩基対を形成するという交互５’
−３’、３’−５’様式で合成する。
【０１４６】 本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、ならびに三重らせん分子は
、DNAおよびRNA分子の合成に用いる当該分野において既知の任意の方法によって
調製することができる。このような技術には、当該分野において既知であるオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドの化学的合成が挙げ
られ、例えば、固相ホスホルアミジート化学合成などがある。別の方法としては
、アンチセンスRNA分子をコードしているDNA配列のイン・ビトロ（in vitro）お
よびイン・ビボ（in vivo）転写によってRNA分子を調製することができる。その
ようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリ
メラーゼプロモーターを有する広範な種類のベクターに組み込むことができる。
別の方法としては、使用するプロモーターに応じて構成的または誘導的にアンチ
センスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築体を細胞系に安定的に導入すること
ができる。
【０１４７】 さらに、細胞内の安定性の促進および半減期延長の手段として、核酸分子に対
して既知の多様な変形を導入することができる。可能な変形としては次のような
ものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：分子の５’および／ま
たは３’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列を
付加すること、オリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内においてホスホジエステ
ル結合よりもホスホロチオエートまたは２’O−メチルを用いること。
【０１４８】 ４．３．３．IL-1L1タンパク質をコードしているベクターおよびIL-1L1を発現 する細胞 さらに、本発明は、IL-1L1タンパク質をコードしているプラスミドおよびベク
ターを提供し、これらを用いて宿主細胞内でIL-1L1タンパク質を産生することが
できる。宿主細胞としては、任意の原核細胞または真核細胞を用いることができ
る。従って、哺乳類のIL-1L1タンパク質のクローニングに由来し、タンパク質の
全長または選択された一部分をコードしているヌクレオチド配列を用い、微生物
細胞または真核細胞を利用する過程を経て、組換え型IL-1L1ポリペプチドを産生
することができる。発現ベクターなどの遺伝子構築体内にポリヌクレオチド配列
を連結し、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳類）または原核細胞（バクテ
リア）を宿主として、そのような宿主を形質転換するかまたは宿主にトランスフ
ェクトすることは、当該分野において既知の標準的な方法である。
【０１４９】 細胞内において核酸に発現を行わせるベクターを発現ベクターと称する。一般
的には、IL-1L1タンパク質の発現に用いられる発現ベクターは、IL-1L1ポリペプ
チドをコードしており、少なくとも１個の転写制御配列に機能発揮できるように
連結している核酸を含む。制御配列は当該分野において既知であり、目的とする
IL-1L1タンパク質を直接発現するように選択される。転写制御配列については、
ゲデル（Goeddel）著、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Gene Expressi
on Technology : Methods in Enzymology）185」（アカデミック・プレス（Acad
emic Press）社、カリフォルニア州サンディエゴ(1990年)）に記載されている。
ひとつの実施態様においては、発現ベクターには、IL-1L1ポリペプチドに対する
アゴニスト活性を有するペプチドをコードしている組換え遺伝子、また逆に、IL
-1L1タンパク質に対するアンタゴニスト型ペプチドをコードしている組換え遺伝
子を含む。
【０１５０】 IL-1L1ポリペプチドの産生に適したベクターとしては、大腸菌（E.coli）など
の原核細胞内での発現用のpBR322由来のプラスミド、pEMBL由来のプラスミド、p
EX由来のプラスミド、pBTac由来のプラスミド、およびpUC由来のプラスミドなど
が挙げられる。
【０１５１】 酵母内での組換えタンパク質発現用ベクターは多数存在する。例えば、YEP24
、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2およびYRP17は、麦酒酵母菌（S.cerevisiae）への
遺伝子構築体導入に有用なクローニングおよび発現ビヒクル（vehicles）である
（例えば、ブローチ（Broach）ら、(1983年)「遺伝子発現の実験的操作（Experi
mental Manipulation of Gene Expression）」（M. イノウエ（Inouye）編、ア
カデミック・プレス（Academic Press）社、83ページなどを参照。参考として本
明細書中に取り入れておく）。これらのベクターは、pBR322 oriが存在すること
から大腸菌（ E . coli ）内において複製することができ、また、酵母２ミクロ
ンプラスミドの複製決定因子が存在することから、麦酒酵母菌（S.cerevisiae）
内で複製することができる。さらに、アンピシリンなどの薬物の対する耐性マー
カーを用いることができる。ひとつの実施態様においては、配列番号１または４
に示されているIL-1L1遺伝子のうちのひとつをコードしている配列をサブクロー
ニングすることによって作成した発現ベクターを用い、組換えによってIL-1L1ポ
リペプチドを産生する。
【０１５２】 好ましい哺乳類発現ベクターは、バクテリア内でベクターが増幅することがで
きるための原核細胞性配列、ならびに真核細胞内で発現される１個またはそれ以
上の真核細胞性転写ユニットを有する。真核細胞のトランスフェクトに適した哺
乳類発現ベクターの例としては、pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、
pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neoおよびpHygなどが
挙げられる。これらのベクターのうちのいくつかは、pBR322などのバクテリア性
プラスミド由来の配列を用いて変形され、原核細胞および真核細胞において複製
でき、また、薬剤耐性選択が行えるようになっている。これらとは別に、ウシパ
ピローマウイルス（BPV-1）またはエプスタイン−バー（Epstein-Barr）ウイル
ス（pHEBo、pREP由来およびp205）などのウイルスの誘導体を用い、真核細胞内
においてタンパク質を一過性に発現させることができる。当該分野においては、
プラスミドの調製および宿主生物の形質転換に関する多数の方法が既知である。
原核細胞および真核細胞の両者に適したその他の発現系に関しては、一般的な組
換え手法と共に、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning
: A Laboratory Manual）第２版」（サンブルック（Sambrook）、フリッシュ（F
ritsch）およびマニアティス（Maniatis）編、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、（1989
年））第16章および17章を参照のこと。
【０１５３】 いくつかの実施例においては、バキュウロウイルス発現系を用いて組換えIL-1
L1ポリペプチドを発現させることが望ましい。そのようなバキュウロウイルス発
現系の例としては、pVL由来のベクター（pVL1392、pVL1393およびpVL941など）
、pAcUW由来のベクター（pAcUW1など）およびpBlueBac由来のベクター（β-gal
を有するpBlueBac IIIなど）が挙げられる。
【０１５４】 N末端を欠いた型などのようなIL-1L1タンパク質の一部分のみ、すなわち、シ
グナルペプチドを欠いた切断突然変異を発現させることを所望する場合には、発
現を所望する配列を含むオリゴヌクレオチドフラグメントに開始コドン（ATG）
を付加する必要がある。N末端位置のメチオニンは、メチオニンアミノペプチダ
ーゼ（MAP）という酵素を用いることによって解裂できることは既知である。MAP
は、大腸菌（E . coli）（ベン−バサー（Ben-Bassat）ら、J. Bacteriol. 169
: 751-757(1987)）およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）からクロ
ーニングされており、組換えタンパク質に対するイン・ビトロ（in vitro）活性
が確認されている（ミラー（Miller）ら、PNAS 84 : 2718-2722(1987)）。故に
、所望するならば、N末端メチオニンの除去は、MAPを産生する宿主（例えば、大
腸菌（E . coli）またはCM89または麦酒酵母菌（S.cerevisiae）など）内におい
てIL-1L1由来のポリペプチドを発現させることによってイン・ビボ（in vivo）
において、または精製 MAPを用いてイン・ビトロ（in vitro）において行うこと
ができる（例えば、ミラー（Miller）ら、同上、の方法など）。
【０１５５】 さらに、本発明の遺伝子構築体を遺伝子治療プロトコールの一部として用い、
IL-1L1タンパク質のひとつに対するアゴニスト型またはアンタゴニスト型をコー
ドしている核酸を輸送することができる。従って、本発明を別の側面からみると
、組織内におけるIL-1L1の機能を再構築すること、あるいは、阻害することを目
的とする、特定の細胞型におけるIL-1L1ポリペプチドのイン・ビボ（in vivo）
またはイン・ビトロ（in vitro）トランスフェクション用ならびに発現用のベク
ターに関する。例えば、天然に存在する型のタンパク質が誤発現される、または
天然型のタンパク質が突然変異を受け、活性が低下している場合には、このよう
な操作が所望される。
【０１５６】 ウイルスによる輸送法に加えて、ウイルスによらない輸送法を用いて動物の組
織内でIL-1L1ポリペプチドの発現を起こさせることもできる。ウイルスによらな
い遺伝子輸送法として最もよく用いられているのは、哺乳類細胞が巨大分子の取
り込みおよび細胞内輸送のために行う正常なメカニズムに基づくものである。好
ましい実施態様においては、ウイルスによらない本発明の標的化法は、標的細胞
によるIL-1L1ポリペプチド遺伝子の取り込みに関するエンドサイトーシス経路に
基づくものである。このような様式の標的化法の例としては、リポソーム由来の
系、ポリリジンコンジュゲートおよび人工ウイルスエンベロープなどが挙げられ
る。
【０１５７】 別の実施態様においては、以下に詳細に記載しているトランスジェニック動物
を用いて組換えタンパク質を産生することができる。
【０１５８】 ４．４． 本発明のポリペプチド 本発明により、細胞由来の他のタンパク質から単離された、または実質的に他
のタンパク質を含まない、単離されたIL-1L1ポリペプチドを入手することが可能
になった。「実質的に細胞由来の他のタンパク質を含まない」（本明細書におい
ては「混在タンパク質」とも称する）、または「実質的に純粋、もしくは精製さ
れた調製物」とは、混在タンパク質が約20％（乾燥重量）以下である、好ましく
は混在タンパク質が約５％以下であるIL-1L1ポリペプチドの調製物を包含するも
のである。本明細書に記載しているクローニングされた遺伝子を用いることによ
り、目的とする機能型のポリペプチドが精製された調製物として初めて調製され
た。
【０１５９】 本発明の好ましいIL-1L1タンパク質は、配列番号５または６に示されているア
ミノ酸配列との同一性または相同性が少なくとも約60％、65％、66％、67％、68
％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80
％、85％、90％または95％である。より好ましいIL-1L1タンパク質は、少なくと
も10個、20個、30個または50個のアミノ酸残基から構成される配列であって、こ
のとき該配列は、配列番号５または６に示されているアミノ酸配列との同一性ま
たは相同性が少なくとも約70％、80％、90％、95％、97％、98％または99％であ
る。そのようなタンパク質としては組換えタンパク質が挙げられ、例えば、配列
番号１、４、10もしくは11に示すヌクレオチド配列またはそれらと相同な配列を
含む核酸からイン・ビトロ（in vitro）において産生することができる。例えば
、本発明に従う好ましい組換えポリペプチドは、配列番号１、４、10もしくは11
に示すヌクレオチド配列との相同性が少なくとも85％、より好ましくは90％、最
も好ましくは95％である核酸によってコードされている。配列番号１、４、10も
しくは11に示す配列との相同性が少なくとも約98〜99％である核酸によってコー
ドされているポリペプチドも本発明の範ちゅうに含まれる。
【０１６０】 好ましい実施態様においては、本発明のIL-1L1タンパク質は哺乳類のIL-1L1タ
ンパク質である。特に好ましい実施態様においては、IL-1L1タンパク質は、配列
番号５または配列番号６に示すものである。特に好ましい実施態様においては、
IL-1L1タンパク質はIL-1L1生物活性を有する。ある種の翻訳後修飾（例えば、リ
ン酸化など）によってIL-1L1タンパク質の見かけの分子量が未修飾のポリペプチ
ド鎖に比べて増加する場合があることは明らかであろう。
【０１６１】 本発明は、スプライシングを受けた本発明の変異体によってコードされている
タンパク質のイソ型にも関する。そのようなイソ型は、配列番号５または６によ
って特定されるIL-1L1タンパク質が有する生物学的活性と同一または異なる生物
学的活性を有する。例えば、そのようなイソ型は、IL-1L1遺伝子転写体の１個ま
たはそれ以上において異なる部位でスプライシングを行うことによって生じる。
【０１６２】 IL-1L1ポリペプチドは、添付の配列リストに記載されている野生型（「真正の
」）IL-1L1タンパク質が有する生物学的活性のうちの少なくともひとつに対する
アゴニストまたはアンタゴニストとして機能することが好ましい。IL-1L1タンパ
ク質のアミノ酸配列に関して「進化上関連がある」とは、天然に生じたアミノ酸
配列を有するポリペプチド、およびコンビナトリアル突然変異誘発などによって
派生したヒトIL-1L1ポリペプチドの突然変異体をさす。
【０１６３】 タンパク質の全長、あるいは１個またはそれ以上の特定のモチーフおよび／も
しくはドメインまたは任意の大きさ（例えば、少なくともアミノ酸配列の長さが
少なくとも５個、10個、20個、25個、50個、75個および100個など）に相当するフ
ラグメントは本発明の範ちゅうに含まれる。
【０１６４】 例えば、単離されたIL-1L1ポリペプチドは、配列番号１、４、10もしくは11の
いずれかに示される核酸配列のすべてまたは一部分によってコードされている。
IL-1L1タンパク質のペプチジル部分は、そのようなペプチドをコードしている核
酸のフラグメントから組換えによって産生されたペプチドをスクリーニングする
ことによって得られる。さらに、従来型のメリフィールド（Merrifield）固相f-
Mocまたはt-Boc化学などの当該分野において既知の技術を用い、フラグメントを
化学的に合成することができる。例えば、本発明のIL-1L1ポリペプチドは、所望
する長さの重複のないフラグメントに任意に分割することができ、または、好ま
しくは、所望する長さの重複フラグメントに分割することができる。フラグメン
トは組換えまたは化学合成によって産生することができ、さらに、試験を行うこ
とにより、野生型（「真正の」）IL-1L1タンパク質のアゴニストまたはアンタゴ
ニストとして機能することができるペプチジルフラグメントを同定することがで
きる。
【０１６５】 IL-1L1ポリペプチドは、膜結合型または可溶型をとることができる。好ましい
可溶型IL-1L1ポリペプチドは、疎水性シグナル配列鎖を含まないポリペプチドで
ある。そのようなタンパク質は、当該分野において既知の方法を用い、遺伝子工
学によって作出することができる。組換えポリペプチドの溶解性は、野生型タン
パク質の疎水性ドメイン（膜透過ドメインと予想されるドメインなど）の消失に
よって増加すると考えられる。例えば、SMART（Simple Modular Architecture R
esearch Tool, v.3.0 ; シュルツ（Schultz）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S
. A. 95 : 5857-5864(1988)）によれば、アミノ酸番号53〜73に存在するhuIL-1L
1ポリペプチド配列は、LSPVILGVQGGSQCLSCGVGという配列を有する膜透過セグメ
ントをコードしていることが予測された。従って、可溶性IL-1L1タンパク質は配
列番号５または６のアミノ酸番号74〜155付近のアミノ酸配列を有する可能性が
ある。第二のIL-1L1膜透過セグメントは、アミノ酸番号105〜125に存在するGLTS
SFESAAYPGWFLCTVPという配列であると予測されている。従って、組換えIL-1L1の
ある種の可溶型は、このドメインが欠如している場合があり、例えば、配列番号
５または６のアミノ酸番号１〜105のアミノ酸を含むIL-1L1ポリペプチドなどが
挙げられる。別の方法としては、予測される２つの膜透過領域を削除する、およ
び／またはこれらのドメインから離れた配列を再度組み合わせて組換え型にする
ことができる。例えば、配列番号５または６のアミノ酸番号１〜52、74〜104お
よび126〜155を含む組換え可溶性IL-1L1ポリペプチドを作出する。天然のシグナ
ル配列を欠いたリーダーレス組換えインターロイキン（IL-1）レセプターアンタ
ゴニストは、大腸菌（E . coli）において組換え発現した場合に、浸透圧感受性
細胞性領域内に蓄積される（トステンソン（Thostenson）ら、J. Bacteriol 179
: 5333-5339(1997)）。従って、可溶性の天然型ポリペプチドを回収するために
最適化したIL-1L1ポリペプチドのアナログ性組換え型も本発明の範ちゅうに含ま
れる。
【０１６６】 一般的には、本発明に記載しているIL-1L1タンパク質の活性（例えば、「生物
活性」など）を有するポリペプチドは、配列番号１、４、10または11のうちのい
ずれかひとつに示す核酸配列の全長または一部分によってコードされているアミ
ノ酸配列を含み、さらに、天然に存在するIL-1L1タンパク質の生物学的／生化学
的活性のすべてもしくは一部分を擬態する、またはアンタゴナイズするポリペプ
チドをさす。そのような生物学的活性の例としては、IL1ドメインと称される保
存された構造領域（ディナレロ（Dinarello）、Cytokine Growth Factor Rev. 8
: 253-265(1997)；パタルカ（Patarca）ら、Crit. Rev. Oncol. 8: 142-188(199
7)；クルツロック（Kurzrock）ら、Cytokines Mol. Ther. 1: 177-184(1995)）
などが挙げられ、これは、配列番号５または６のアミノ酸番号４〜152の範囲に
存在する。このドメインは、IL-1L1アゴニストコンセンサス配列を含むIL-1アゴ
ニストであるIL-1βとの相同性が特に高い領域を含んでおり、そのようなコンセ
ンサス配列としては、配列番号５および６のアミノ酸番号16〜21に存在するLKXL
XL、配列番号５および６のアミノ酸番号111〜114に存在するFESA、配列番号５お
よび６のアミノ酸番号146〜152に存在するITDFXXQが挙げられる。さらに、本発
明のIL-1L1ポリペプチドは、IL-1アンタゴニストであるIL-1raポリペプチド内に
存在する保存性配列を含む。例えば、保存性IL-1アンタゴニストポリペプチドは
、IL-1L1／IL-1raコンセンサス配列である次の配列を含む；配列番号５または６
のアミノ酸番号20〜31に存在するYLXNNQLXAGXL、配列番号５または６のアミノ酸
番号80〜88に存在するLEXVNIXXLおよび配列番号５または６のアミノ酸番号108〜
131に存在するTXSFESAAXPGWFLCTXXEADQPV。IL-1L1、アゴニストであるIL-1βお
よびアンタゴニストであるIL-1raの構造比較を行ったところ、ヒトインターロイ
キン−１β前駆体（ジェンバンク（GenBank）アクセッション番号P01584）のア
ミノ酸番号１〜140に存在する長大なアミノ酸末端ドメインの存在が明らかにな
り、このドメインはIL-1raポリペプチドおよび配列番号５もしくは６のIL-1L1ポ
リペプチドには存在していない。故に、このIL-1アゴニストドメインの不在はIL
-1アンタゴニストポリペプチドと関連がある。本発明の組換えIL-1L1ポリペプチ
ドは、配列番号５または６のIL-1L1ポリペプチドの１個またはそれ以上のセグメ
ントを有するIL-1L1ポリペプチド配列に融合したヒトインターロイキン−１β前
駆体（ジェンバンク（GenBank）アクセッション番号P01584）のアミノ酸番号１
〜140から構成される配列を含む。
【０１６７】 IL-1L1ポリペプチドのその他の構造的特徴としては、グリコシル化コンセンサ
ス配列を含むことであり、例えば、次のようなミリスチル化配列などが挙げられ
る；配列番号５のアミノ酸番号29〜34に存在するGGLHAG、配列番号５のアミノ酸
番号30〜35に存在するGLHAGK、配列番号５のアミノ酸番号60〜65に存在するGVQG
GS、配列番号５のアミノ酸番号63〜68に存在するGGSQCL、配列番号５のアミノ酸
番号73〜78に存在するGQEPTL、配列番号５のアミノ酸番号91〜96に存在するGAKE
SK、配列番号５のアミノ酸番号106〜111に存在するGLTSSF。さらに、本発明のIL
-1L1ポリペプチドは、次の２個のカゼインキナーゼ２リン酸化部位を有する；配
列番号５のアミノ酸番号109〜112に存在するSSFE、配列番号５のアミノ酸番号12
3〜126に存在するTVPE。
【０１６８】 IL-1L1タンパク質のその他の生物学的活性については当業者においては理論的
に明らかである。本発明に従えば、あるポリペプチドがIL-1L1タンパク質の天然
型に対する特異的アゴニストまたはアンタゴニストであるならば、そのポリペプ
チドは生物学的活性を有する。
【０１６９】 ある化合物（例えば、IL-1L1タンパク質またはそれらの変異体などのタンパク
質など）が上述の生物学的活性のうちのひとつまたはそれ以上を有しているか否
かを決定するためのアッセイとしては、IL-1アゴニスト活性およびIL-1アンタゴ
ニスト活性を評価するために用いられる当業者において既知のアッセイが挙げら
れる。例えば、組換えIL-1L1ポリペプチドがヒトの皮膚の繊維芽細胞内において
インターロイキン−６遺伝子の発現を活性化する能力は、IL-1β様IL-1アゴニス
ト活性の指標である。逆に、IL-1αまたはIL-1βによって誘導されたインターロ
イキン−６の遺伝子発現を組換えIL-1L1ポリペプチドが干渉する能力は、IL-1α
様IL-1アンタゴニスト活性の指標である。IL-1L1遺伝子はヒトの胎盤において多
量に発現されることが知られており、従ってIL-1L1特異的レセプターはそのよう
な組織内に存在すると考えられることから、そのようなアッセイは、基本的には
ヒトの臍帯静脈内皮細胞において行うことが望ましい。
【０１７０】 その他の好ましい本発明のタンパク質としては、本発明の核酸に関連する項目
に記載されている核酸によってコードされているものが挙げられる。特に、本発
明は、IL-1L1−免疫グロブリン融合タンパク質などの融合タンパク質を提供する
。そのような融合タンパク質は、例えば、IL-1L1タンパク質の安定性および溶解
性などを向上させることができ、従って治療に使用することができるものと考え
られる。融合タンパク質を用いてIL-1L1タンパク質の免疫原性フラグメントを産
生することもできる。例えば、ロタウイルスのVP6キャプシドタンパク質は、IL-
1L1ポリペプチドの一部分に対する免疫原性担体タンパク質として、モノマー型
またはウイルス粒子型で用いることができる。抗体を誘起させようとしているIL
-1L1タンパク質の一部分に対応する核酸配列を後期ワクシニアウイルス構造タン
パク質をコードしている配列を含む融合遺伝子構築体内に組み込み、ビリオンの
一部としてIL-1L1エピトープを含む融合タンパク質を発現する一組の組換えウイ
ルスを産生することができる。組換えB型肝炎ビリオンも同様の利用ができるこ
とは、B型肝炎表面抗原融合タンパク質を用いた免疫原性融合タンパク質を利用
することによって示されている。同様に、IL-1L1タンパク質の一部分およびポリ
オウイルスキャプシドタンパク質を含む融合タンパク質をコードしているキメラ
構築体を作出し、一連のポリペプチド抗原の免疫原性を高めることもできる（例
えば、EP公開公報第0259149号、エヴァンス（Evans）ら、Nature 339: 385(1989
)、ハン（Huang）ら、J. Virol. 62: 3855(1988)、シュリエンガー（Schlienger
）ら、J. Virol. 66: 2(1992)などを参照）。
【０１７１】 ペプチドに基づく免疫法に関する多抗原ペプチド法を用いて免疫原を作出する
こともでき、このとき、IL-1L1ポリペプチドの所望する部分は、オリゴマー性分
岐鎖リジンコア上におけるペプチドの有機化学合成によって直接得ることもでき
る（例えば、ポスネット（Posnett）ら、JBC 263: 1719(1988)、ナーデリ（Nard
elli）ら、J. Immunol. 148: 914(1992)などを参照）。IL-1L1タンパク質の抗原
性決定基もバクテリア細胞によって発現され、呈示される。
【０１７２】 融合タンパク質を用いて免疫原性を増強することに加え、融合タンパク質を用
いてタンパク質を発現させることができ、従って本発明のIL-1L1ポリペプチドの
発現に利用できることは広く認識されている。例えば、IL-1L1ポリペプチドはグ
ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST−融合）タンパク質として産生する
ことができる。そのようなGST−融合タンパク質は、例えば、グルタチオン誘導
体化マトリックスを用いることなどによって容易にIL-1L1ポリペプチドを精製す
ることができる（例えば、「分子生物学に関する最新プロトコール（Current Pr
otocols in Molecular Biology）」、アウスベル（Ausubel）ら編、ジョン・ウ
ィレー＆サンズ（ John Wiley & Sons ）社（ニューヨーク）、1991年などを参
照）。さらに、IL-1L1ポリペプチドを小さなエピトープタグ（例えば、FLAGまた
は赤血球凝集素のタグ配列など）に融合させたものを用いることにより、得られ
た組換えポリペプチドの免疫学的精製を簡便化することができ、または、細胞も
しくは組織サンプル中の免疫学的検出を行うことができる。さらに、当該分野に
おいて既知であり、市販されているグリーン蛍光タンパク質およびそれらの組換
え体に融合させることにより、生細胞および組織内にIL-1L1ポリペプチドを局在
させることもできる。
【０１７３】 さらに、本発明は、目的とするIL-1L1ポリペプチドを産生する方法に関する。
例えば、目的のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現させる核
酸ベクターを用いてトランスフェクトした宿主細胞を適切な条件下で培養し、ペ
プチドの産生を行わせることができる。細胞培養に適した培地は当該分野におい
て既知である。当該分野において既知のタンパク質精製技術（例えば、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動およ
びペプチドに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティー精製など）を用いるこ
とにより、培養培地、宿主細胞またはそれらの両方から組換えIL-1L1ポリペプチ
ドを単離することができる。好ましい実施態様においては、組換えIL-1L1ポリペ
プチドは、精製に役立つGST融合タンパク質などのドメインを含む融合タンパク
質である。
【０１７４】 加えて、一般的には、ある状況下においては、天然型のタンパク質の生物学的
活性の一部分のみを促進または阻害することを目的として、IL-1L1アゴニスト（
ミメチック）またはIL-1L1アンタゴニストのいずれか一方に機能を限定したIL-1
L1ポリペプチドのうちのひとつに対する相同体を提供することができる。従って
、機能を限定された相同体を用いて処理することにより、特定の生物学的効果を
誘起することができ、天然型のIL-1L1タンパク質のすべての生物学的活性に対す
るアゴニストまたはアンタゴニストを用いて処理する場合に比べて副作用が減少
する。
【０１７５】 各IL-1L1タンパク質に対する相同体は、点突然変異などの突然変異誘発または
切断などによって作出することができる。例えば、元になったIL-1L1ポリペプチ
ドの生物学的活性と実質的に同じ活性、またはそれらの一部を保持している相同
体を突然変異によって作出することができる。別の方法としては、IL-1L1レセプ
ターに競合結合することなどによって天然型のタンパク質の機能を阻害すること
ができるアンタゴニスト型のタンパク質を作出することができる。
【０１７６】 本発明の組換えIL-1L1ポリペプチドは、野生型IL-1L1タンパク質の相同体も含
み、例えば、ユビキチン化または該タンパク質に関連するその他の酵素標的が変
化する突然変異により、タンパク質解裂に対する抵抗性を獲得したタンパク質な
どが挙げられる。
【０１７７】 IL-1L1ポリペプチドを化学的に変形し、グリコシル基、脂質、リン酸基、アセ
チル基などの化学的部位と共有コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートを形成
することによってIL-1L1誘導体を作出することもできる。IL-1L1タンパク質の共
有誘導体は、タンパク質のアミノ酸側鎖上またはポリペプチドのN末端もしくはC
末端の官能基に化学的部位を連結することによって調製することができる。
【０１７８】 IL-1L1ポリペプチドの構造の変形は、治療もしくは予防効果の向上、安定性（
例えば、イクス・ビボ（ex vivo）貯蔵期間および蛋白質分解に対する抵抗性な
ど）の向上または翻訳後修飾（例えば、タンパク質のリン酸化パターンを変更す
るなど）を目的として行うことができる。そのような変形ペプチドは、天然型タ
ンパク質の活性のうちの少なくともひとつを保持している、またはそれらに対す
る特異的アンタゴニストを産生するように設計されている場合には、本発明に従
うIL-1L1ポリペプチドと機能的に等価であるとみなす。そのような変形ペプチド
は、例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加などによって調製することができ
る。置換による変異体においては、保存性のアミノ酸または非保存性のアミノ酸
が置換されている。
【０１７９】 例えば、単離された置換体のうち、ロイシンがイソロイシンもしくはバリンに
、アスパラギン酸がグルタミン酸に、スレオニンがセリンに置換したもの、また
は同様に、あるアミノ酸が構造的に関連のあるアミノ酸に置換したもの（例えば
、等立体配置および／または等電性突然変異など）については、得られた分子の
生物学的活性に対して大きな影響を与えないことが予測されるのは当然である。
アミノ酸のファミリー内で生じる保存性の置換は側鎖と関連がある。一般的に、
コードされているアミノ酸は４つのファミリーに分けることができる：（１）酸
性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒス
チジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン
、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電荷極性＝
グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロ
シン。同様に、アミノ酸集団は次のように分けることができる：（１）酸性＝ア
スパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン
；（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリ
ン、スレオニン、ここで、セリンとスレオニンは脂肪族水酸基を有する群にさら
に分けられる；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；
（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；および（６）硫黄含有＝システイン
、メチオニン（例えば、「生化学（Biochemistry）第二版」、L.ストライヤー（
Stryer）編（WH フリーマン（Freeman）社）、1981年などを参照）。ペプチド
内のアミノ酸配列の変化によって機能性のIL-1L1相同体（例えば、得られたペプ
チドが野生型を模倣するまたはアンタゴナイズするという意味においての機能な
ど）が得られたか否かについては、変異体ペプチドが野生型タンパク質と同様の
様式で細胞内において応答する能力、またはそのような応答を競合阻害する能力
を評価することによって容易に判断することができる。１個またはそれ以上の置
換が生じているポリペプチドについても同様に調べることができる。
【０１８０】 さらに本発明は、IL-1L1タンパク質の一連のコンビナトリアル突然変異体およ
び切断突然変異体を作出する方法に関し、また、本発明は変異体配列（例えば、
相同体など）である可能性のある配列の同定に特に有用である。そのようなコン
ビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストも
しくはアンタゴニストとして作用することができる、またはこれらとは別に、新
規な活性を併せ持つ新規なIL-1L1相同体を作出することである。従って、コンビ
ナトリアル由来の相同体は天然型タンパク質に比べて活性を増強させることがで
きる。
【０１８１】 ひとつの実施態様においては、IL-1L1変異体の中の変化に富んだIL-1L1aryは
、核酸レベルにおけるコンビナトリアル突然変異によって作出され、変化に富ん
だ遺伝子である１IL-1L1aryによってコードされている。例えば、IL-1L1配列候
補の変性セットが独立したポリペプチドとして発現できるように、またはIL-1L1
配列のセットを含む大きな融合タンパク質（例えば、ファージディスプレーなど
）のセットとして発現できるように、酵素を用いて合成オリゴヌクレオチドの混
合物を遺伝子配列内に連結することができる。
【０１８２】 変性オリゴヌクレオチド配列からそのようなIL-1L1相同体候補のライブラリー
を作出する方法は多数ある。変性遺伝子配列の化学的合成は自動DNA合成機内で
行うことができ、次に、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結する。遺伝子
の変性セットを用いる目的は、IL-1L1配列候補の所望するセットをコードしてい
るすべての配列を一回の混合で提供するためである。変性オリゴヌクレオチドの
合成は当該分野において既知である（例えば、ナラン（Narang）, SA、Tetrahed
ron 39: 3(1984)；イタクラ（Itakura）ら、「組換えDNA、第３回マクロ分子に
関するクリーブランドシンポジウム要旨集（Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleve
land Sympos. Macromolecules）」（AG ウォルトン（Walton）ら編、アムステル
ダム、エルセヴィール（Elsevier）社、pp.273-89）（1981年）；イタクラ（Ita
kura）ら、Annu. Rev. Biochem. 53: 323(1984)；イタクラ（Itakura）ら、Scie
nce 198: 1056(1984)；イケ（Ike）ら、Nucleic Acids Res. 11: 477(1983)など
を参照）。そのような技術は、その他のタンパク質に選択的変化を起こさせる場
合に用いられている（例えば、スコット（Scott）ら、Science 249: 386-390(19
90)；ロバーツ（Roberts）ら、PNAS 89: 2429-2433(1992)；デヴリン（Devlin）
ら、Science 249: 404-406(1990)；クヴィルラ（Cwirla）ら、PNAS 87: 6378-63
82(1990)；ならびに米国特許第5,223,409号、5,198,346号および5,096,815号な
どを参照）。
【０１８３】 同様に、生物活性フラグメントのスクリーニングおよび選択用のIL-1L1フラグ
メントの多様な集団を作出することを目的として、IL-1L1クローン用のコード配
列フラグメントのライブラリーを提供することができる。そのようなライブラリ
ーの作出にあたっては、化学合成を含む様々な技術が当該分野において既知であ
る。ひとつの実施態様においては、コード配列フラグメントのライブラリーは次
のようにして作出することができる：（i）ニックが１分子につき１回しか発生
しないような条件下において、IL-1L1コード配列の二本鎖PCRフラグメントをヌ
クレアーゼで処理し、（ii）二本鎖DNAの変性を行い、（iii）DNAを元の状態に
戻し、別異のニック生成物由来のセンス／アンチセンス対を含む二本鎖DNAを生
成し、（iv）S1ヌクレアーゼを用いて処理することにより、再生成した二本鎖か
ら一本鎖部分を除去し、さらに（v）得られたフラグメントライブラリーを発現
ベクター内に連結する。本実施態様に従えば、N末端、C末端および様々な大きさ
の内部フラグメントをコードしている発現ライブラリーを得ることができる。
【０１８４】 点突然変異または切断によって作出されたコンビナトリアルライブラリーの遺
伝子生成物のスクリーニング、ならびにある種の特性を有する遺伝子産物に関す
るcDNAライブラリーのスクリーニングについては、当該分野において広範な技術
が既知である。一般的に、そのような技術は、IL-1L1相同体のコンビナトリアル
突然変異によって作出された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに応用す
ることができる。大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングにおいて最も広く
用いられている技術とは、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター内にク
ローニングし、得られたベクターのライブリラリーを用いて適切な細胞の形質転
換を行い、さらに、生成物が検出されている遺伝子をコードしているベクターに
関して、所望する活性の検出を行うことによってベクターの単離が比較的容易に
なるような条件下において該コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。
以下に記載している各アッセイは、コンビナトリアル突然変異法によって作出さ
れた多数の変性IL-1L1配列をスクリーニングするために必要なハイスループット
分析に利用することができる。コンビナトリアル突然変異は、突然変異タンパク
質の非常に大きなライブラリー（例えば、1026 個程度）を作出することができ
る。この大きさのコンビナトリアルライブラリーは、ハイスループットスクリー
ニングアッセイを用いても技術的に困難である。この問題を解決することを目的
として、新規な技術であるリクルーシブ・アンサンブル突然変異誘発（recrusiv
e ensemble mutagenesis : REM）が開発されたが、これは、ランダムライブラリ
ー中に存在する大多数の非機能性タンパク質を排除し、機能性タンパク質の頻度
のみを増大させ、故に、配列スペースの有効なサンプリングを行うために必要と
される複雑性の低下が生じる。REMは、適切な選択法またはスクリーニング法を
用いた場合に、ライブラリー内の機能性突然変異体の頻度を高めるアルゴリズム
である（アーキン（Arkin）およびユルヴァン（Yourvan）、PNAS USA 89: 7811-
7815(1992)；ユルヴァン（Yourvan）ら、「自然界における平行問題の解析 ２
（Parallel Problem Solving from Nature 2）」、マナー（Maenner）およびマ
ンデリック（Manderick）編、エルセヴィール（Elsevier）社（アムステルダム
）、pp.401-410（1992年）；デルグレーヴ（Delgrave）ら、Protein Engineerin
g 6(3): 327-331(1993）。
【０１８５】 本発明は、IL-1L1タンパク質を還元し、本発明のIL-1L1ポリペプチドが標的ペ
プチドなどの分子に結合することを妨害することができる小分子などのミメチッ
ク（例えば、ペプチドまたは非ペプチド剤など）を産生することにも関する。従
って、以上に記載しているそのような突然変異誘発技術は、例えば、IL-1L1ポリ
ペプチドと標的ペプチドとの結合などに関係しているタンパク質−タンパク質相
互作用に関与しているIL-1L1タンパク質の決定因子のマッピングにも有用である
。例えば、レセプターの分子認識に関連があるIL-1L1ポリペプチドの重要な残基
を確認することができ、また、これを用いてIL-1L1由来のペプチドミメチック、
または真正のIL-1L1タンパク質とその部位との結合を競合的に阻害する小分子を
作出することができる。例えば、走査突然変異誘発（scanning mutagenesis）を
利用し、他のタンパク質との結合に関与しているIL-1L1タンパク質のアミノ酸残
基をマッピングすることにより、相互作用を可能にしているIL-1L1タンパク質の
そのような残基を模倣しているペプチドミメチック化合物を作出することができ
る。そのようなミメチックを用いることにより、IL-1L1タンパク質の正常機能を
干渉することができる。例えば、そのような残基に対する非加水分解性ペプチド
アナログは、ベンゾジアゼピン（例えば、フライディンガー（Freidinger）ら、
「ペプチド：化学および生物学（Peptides : Chemistry and Biology）」、G.R.
マーシャル（Marshall）編、ESCOM出版社（ESCOM Publisher）（オランダ、ラ
イデン）、1988年などを参照）、アゼピン（例えば、ハフマン（Huffman）ら、
「ペプチド：化学および生物学（Peptides : Chemistry and Biology）」、G.R.
マーシャル（Marshall）編、ESCOM出版社（ESCOM Publisher）（オランダ、ラ
イデン）、1988年などを参照）、置換γ−ラクタム環類（ガーヴェイ（Garvey）
ら、「ペプチド：化学および生物学（Peptides : Chemistry and Biology）」、
G.R. マーシャル（Marshall）編、ESCOM出版社（ESCOM Publisher）（オランダ
、ライデン）、1988年）、ケトメチレンプソイドペプチド類（エヴェンソン（Ew
enson）ら、(1986) J. Med. Chem. 29 : 295；エヴェンソン（Ewenson）ら、「
ペプチド：構造および機能（Peptides : Structure and Function）」、第９回
アメリカペプチドシンポジウム（9th American Peptide Symposium）要旨集、ピ
アス化学（Pierce Chemical）社（イリノイ州ロックランド）、1985年）、β−タ
ーンジペプチドコア類（ナガイ（Nagai）ら、Tetrahedron Lett. 26: 647(1985)
；サト（Sato）ら、J. Chem. Soc. Perkin Trans 1: 1231(1986)）、およびβ−
アミノアルコール類（ゴードン（Gordon）ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.
126: 419(1985)；ダン（Dann）ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 134: 71(
1986)）を用いて作出することができる。
【０１８６】 ４．５ 抗IL-1L1抗体およびそれらの用途 本発明を別の側面からみると、哺乳類のIL-1L1タンパク質（例えば、野生型ま
たは突然変異型IL-1L1タンパク質など）と特異的に反応する抗体に関する。例え
ば、IL-1L1タンパク質由来の免疫原（例えば、cDNA配列に基づくものなど）を用
いることにより、標準的なプロトコールに従い、抗タンパク質／抗ペプチド抗血
清またはモノクローナル抗体を産生することができる（例えば、「抗体：実験室
マニュアル（Antibodies : A Laboratory Manual）」、ハーロウ（Harlow）およ
びレーン（Lane）編、コールドスプリングハーバープレス（Cold Spring Harbor
Press）社、1988年などを参照）。哺乳類IL-1L1ポリペプチドもしくは抗体応答
を誘起することができる抗原性フラグメント、または上述の融合タンパク質など
の免疫原型のペプチドを用い、マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳類を
免疫することができる。タンパク質またはペプチドに対して免疫原性を付与する
技術としては、キャリヤーへのコンジュゲーションまたは当該分野において既知
であるその他の技術が挙げられる。IL-1L1タンパク質の免疫原性部分は、アジュ
バントの存在下において投与することができる。免疫化の進行は、プラズマまた
は血清中の抗体タイターの検出によってモニターすることができる。抗原を免疫
原として標準的なELISAまたはその他のイムノアッセイを行うことにより、抗体
のレベルを評価することができる。好ましい実施態様においては、目的とする抗
体は、哺乳類のIL-1L1タンパク質の抗原決定基、例えば、配列番号５もしくは６
に記載されているタンパク質、またはそれらと非常に関連がある相同体（例えば
、相同性が少なくとも90％であり、好ましくは相同性が少なくとも94％であるな
ど）の抗原決定基などに対して免疫特異的である。
【０１８７】 IL-1L1ポリペプチドの抗原性調製物を用いて行った動物の免疫化に続いて、抗
IL-1L1抗血清が得られ、さらに、所望するならば、血清からポリクローナル抗IL
-1L1抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を作成することを目的と
して、免疫を行った動物から抗体産生細胞（リンパ球）を回収し、標準的な体細
胞融合法を用いてミエローマ細胞などの不朽化細胞と融合させることにより、ハ
イブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技術は当該分野において既知
であり、例えば、コーラー（Kohler）およびミルステイン（Milstein）によって
最初に開発されたハイブリドーマ技術（Nature 256: 495-497(1975)）、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術（コツバー（Kozbar）ら、Immunology Today 4: 72(198
3)）、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV −ハイブリドーマ
技術（コール（Cole）ら、「モノクローナル抗体および癌治療（Monoclonal Ant
ibodies and Cancer Therapy）」、アラン・R.リス（Alan R. Liss）社、pp.77-
96、1985年）などが挙げられる。本発明の哺乳類のIL-1L1ポリペプチドと特異的
に反応する抗体、およびそのようなハイブリドーマ細胞を含む培地から単離され
たモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスク
リーニングすることができる。ひとつの実施態様においは、抗ヒトIL-1L1抗体は
、配列番号１、４、10もしくは11の配列を有する核酸によってコードされている
タンパク質と特異的に反応する。
【０１８８】 本明細書において使用している抗体とは、哺乳類のIL-1L1ポリペプチドのうち
のひとつとも特異的に反応するフラグメントを含む。従来法によって抗体をフラ
グメント化することができ、抗体全体について上述した方法と同様の方法を用い
てフラグメントをスクリーニングすることができる。例えば、ペプシンを用いて
抗体を処理することによってF(ab)2 フラグメントを調製することができる。得
られたF(ab)2 フラグメントを処理することにより、ジスルフィド結合を還元し
、Fabフラグメントを得ることができる。本発明の抗体は、二重特異性、単鎖、
ならびに抗体の少なくともひとつのCDR領域によって付与されたIL-1L1タンパク
質に対する親和性を有するキメラ型およびヒト型分子をも包含する。好ましい実
施態様においては、抗体は、それらに結合され、検出可能なラベルを含み、その
ようなラベルとしては、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補
因子などを用いることができる。
【０１８９】 抗IL-1L1抗体を用いることにより、個体がIL-1L1タンパク質レベルの異常が関
与する疾病または症状を有するか否かなどを判断したり、そのような疾患に罹患
している個人に対して行われている治療法の効果を判断することを目的として、
個体内のIL-1L1タンパク質レベルをモニターすることなどが可能になる。IL-1L1
ポリペプチドのレベルは、血液サンプルなどの体液内の細胞から測定することが
できる。
【０１９０】 本発明の抗IL-1L1抗体のその他の用途としては、λgt11、λgt18〜23、λZAP
およびλORF18などの発現ベクター内に構築されたcDNAライブリーの免疫学的ス
クリーニングが挙げられる。正しい読み枠（リーディングフレーム）内および方
向に挿入されたコード配列を有するこの型のメッセンジャーライブラリーは、融
合タンパク質を産生することができる。例えば、λgt11は、アミノ末端にβ−ガ
ラクトシダーゼアミノ酸配列を含み、カルボキシ末端に外来性ポリペプチドを含
む融合タンパク質を産生する。IL-1L1タンパク質の抗原性エピトープ（例えば、
特定のIL-1L1タンパク質のその他のオーソログまたは同種由来のその他のパラロ
グなど）は、例えば、感染プレートから抗IL-1L1抗体を用いてリフトした反応性
ニトロセルロースフィルターなどのような抗体を用いて検出することができる。
次に、このアッセイによって検出された陽性ファージを感染プレートから単離す
ることができる。従って、IL-1L1相同体の存在を検出することができ、また、ヒ
ト由来のイソ型（スプライシング変異体を含む）に交換することができるように
、他の動物からクローニングすることができる。
【０１９１】 ４．６ トランスジェニック動物 さらに本発明は、IL-1L1治療剤を同定するためなどのような多様な目的に利用
することができるトランスジェニック動物を提供する。本発明のトランスジェニ
ック動物とは、IL-1L1プロモーターの制御下もしくは異型プロモーターの制御下
にある異型IL-1L1遺伝子もしくはそれらのフラグメントを有する非ヒト動物を含
む。従って、本発明のトランスジェニック動物としては、野生型IL-1L1タンパク
質もしくはそれらのフラグメント、またはそれらの突然変異体および多型変異体
を含む変異体をコードしている導入遺伝子を発現する動物を用いることができる
。そのような動物を用いることにより、配列番号５または６に記載されている配
列由来のIL-1L1タンパク質のアミノ酸配列内の差異（多型による差異など）によ
る影響を評価することができる。このような動物を用いることにより、特定の部
位におけるIL-1L1タンパク質の発現の影響を確認すること、または、IL-1L1治療
剤の同定認もしくはそれらのイン・ビボ（in vivo）における活性の確認を行う
こともできる。
【０１９２】 ひとつの側面からみると、本発明は、イン・ビボ（in vivo）スクリーニング
に用いるトランスジェニック非ヒト動物および細胞系、ならびに炎症性疾患の治
療に有用な薬剤およびその他の治療法の評価を提供する。ひとつの実施態様にお
いては、本発明は、インターロイキン−１遺伝子が選択的破壊を受けたトランス
ジェニック動物に関する。特に、その遺伝子はIL-1L1遺伝子である。動物は、破
壊された遺伝子についてキメラ、ヘテロ接合性またはホモ接合性である。ホモ接
合性ノックアウトIL-1L1哺乳類は、変形関節炎、炎症性腸疾患、I型糖尿病、乾
癬、骨粗鬆症、真正糖尿病における腎炎、円形脱毛症、グレーヴス病、全身性紅
斑性狼瘡、硬皮性苔癬、潰瘍性大腸炎、冠状動脈疾患、動脈炎、糖尿病性網膜炎
、低出生体重、妊娠併発症、重篤な歯根膜疾患、乾癬およびインシュリン依存性
糖尿病などの炎症性状態を研究するためのモデルを提供するが、特に動脈性損傷
によって特徴づけられる。選択的破壊は遺伝子内の任意の場所で行うことができ
るが、破壊された遺伝子が機能的IL-1L1タンパク質の産生を阻害することのみが
必要条件である。好ましい実施態様においては、破壊により、配列番号11に記載
しているようなIL-1L1をコードしている全配列が除去される。トランスジェニッ
ク動物としては、ヒト以外の任意の種を用いることができるが、好ましくは哺乳
類である。好ましい実施態様においては、選択的に破壊されたIL-1L1遺伝子を有
する非ヒト動物の炎症に対する応答が変化していることを特徴とするが、ここで
、選択的破壊によって野生型IL-1L1ポリペプチドの産生が阻害されることから、
非ヒト哺乳類の表現型は該選択的破壊に対してホモ接合性である。
【０１９３】 別の側面から見ると、本発明は、選択的に破壊されたIL-1L1遺伝子を有する細
胞または細胞系に関する。好ましい実施態様においては、細胞または細胞系は未
分化細胞、例えば、幹細胞、胚性幹細胞、卵母細胞または胚性細胞などである。
【０１９４】 さらに別の側面から見ると、本発明は、インターロイキン−１遺伝子が選択的
に破壊されている非ヒト哺乳類を産生する方法に関する。例えば、IL-1L1ノック
アウト構築体は、該IL-1L1遺伝子の内部の一部分がマーカーに置き換えられてい
るIL-1L1遺伝子の一部分を有するように調製することができる。次に、ノックア
ウト構築体を胚性幹（ES）細胞集団にトランスフェクトする。マーカーの発現に
従ってトランスフェクトした細胞を選択することができる。次に、トランスフェ
クトしたES細胞を当該哺乳類の祖先の胚に導入する。生殖細胞系列にノックアウ
ト構築体を有するキメラ哺乳類が誕生するまで胚を成長させる。そのようなキメ
ラ哺乳類を繁殖させることにより、IL-1L1遺伝子が選択的に破壊されたヘテロ接
合性哺乳類が誕生することになる。ヘテロ接合体を交配させることにより、ホモ
接合体を誕生させることができる。
【０１９５】 別の側面からみると、本発明は、上述の動物の作出に用いることができるIL-1
L1ノックアウト構築体に関する。ひとつの実施態様においては、IL-1L1構築体は
IL-1L1遺伝子の一部分を含んでおり、ここで、該IL-1L1遺伝子内の一部分を選択
的マーカーに置き換えることができる。好ましくは、マーカーはneo遺伝子であ
り、IL-1L1遺伝子の一部は、長さが少なくとも2.5kb〜7.0または9.5kb（置換部
分および任意のIL-1L1フランキング配列を含む）である。内部遺伝子は、少なく
ともエクソンの一部分を含むことが好ましく、ある実施態様においては、IL-1L1
ポリペプチドをコードしているエクソンのすべてを含む。
【０１９６】 さらに別の側面から見ると、本発明は、炎症状態を治療するおよび／または阻
止する効果に関して物質を試験する方法に関する。ひとつの実施態様においては
、この方法には上述のトランスジェニック動物または細胞系を用いることができ
る。例えば、被験物質をトランスジェニック動物に投与し、その物質が炎症性状
態を軽減する能力について、該炎症性状態に対する効果として評価することがで
きる。これらの動物を用いてIL-1が関与する任意の炎症性状態について試験を行
うことができるが、特に、動脈性損傷によって特徴づけられる状態について研究
が行われている。この方法は、IL-1炎症性タンパク質およびそれらの下流組成物
に対して有効な被験物質についても適用することができる。
【０１９７】 トランスジェニック動物とは、IL-1L1プロモーターまたはそれらのフラグメン
トの支配下にある導入遺伝子（例えば、レポーター遺伝子など）を含むことがで
きる。これらの動物は、例えば、IL-1L1遺伝子の発現を調節するなどによってIL
-1L1の産生を調節するIL-1L1薬剤を同定するためなどに有用である。IL-1L1遺伝
子プロモーターは、IL-1L1 cDNAフラグメントを用いてゲノムライブラリーをス
クリーニングし、当該分野において既知の方法に従って性質を明らかにすること
などによって単離することができる。本発明の好ましい実施態様においては、そ
のようなIL-1L1レポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物を用い、IL-1
L1発現調節能に関して、ステロイドホルモンとして知られている生物活性分子の
集団をスクリーニングする。本発明のさらに好ましい実施態様においては、IL-1
L1発現調節活性についてスクリーニングされたステロイドホルモンは、アンドロ
ゲンとして知られるグループに属する。本発明のさらに好ましい実施態様におい
ては、ステロイドホルモンはテストステロンまたはテストステロンのアナログで
ある。本発明の範ちゅうに含まれるその他の非ヒト動物としては、内在性のIL-1
L1遺伝子の発現が減弱されている、または「ノックアウト」されているものが挙
げられる。「ノックアウト」動物とは、特定の遺伝子または遺伝子群の欠失をホ
モ接合状態たはヘテロ接合状態で有する動物である。これらの動物は、IL-1L1の
不在が特定の表現型を発現するか否か、特に、このようなマウスが特定の疾病（
心疾患または癌に対する感受性が高いなど）を発症するか、または発症する傾向
にあるか否かを判断するのに有用である。さらに、これらの動物は、以下に記載
しているようなIL-1L1遺伝子の突然変異によって生じた疾病状態を軽減する、ま
たは弱める薬剤に関するスクリーニングに有用である。これらの動物は、IL-1L1
遺伝子内の特定のアミノ酸の相違または対立遺伝子変異の影響を判断するのにも
有用である。すなわち、IL-1L1ノックアウト動物は、IL-1L1の突然変異型または
対立遺伝子変異体を発現するトランスジェニック動物と交配することができ、そ
れによって野生型IL-1L1タンパク質ではなく突然変異型タンパク質のみを発現す
る動物を得ることができる。
【０１９８】 本発明のこの側面についての好ましい実施態様においては、IL-1L1発現を消失
したことによって生じた症状に対するトランスジェニック治療または薬物治療に
関するモデル系として、染色体の一方または両方に突然変異型IL-1L1遺伝子座を
有するトランスジェニックIL-1L1ノックアウトマウスを用いる。
【０１９９】 トランスジェニックおよびノックアウト非ヒト動物を得る方法は当該分野にお
いて既知である。ノックアウトマウスは、ノックアウトを受ける遺伝子をコード
しているマウス胚性幹細胞染色体内に「ノックアウト」構築体をホモ組み込みす
ることによって得ることができる。ひとつの実施態様においては、ホモ性組換え
を行って動物のゲノムを変形する方法である遺伝子ターゲッティングを用いるこ
とにより、培養胚性幹細胞に変化を導入することができる。ES細胞内の目的のIL
-1L1遺伝子を標的にすることにより、これらの変化を動物の生殖細胞系に導入し
てキメラを作出することができる。遺伝子ターゲッティング法は、標的IL-1L1遺
伝子座と相同なセグメントを含み、IL-1L1ゲノム配列に対して予期された配列変
化（例えば、挿入、欠失、点突然変異など）を有するDNAターゲッティング構築
体を組織培養細胞内に導入することによって実施することができる。次に、ター
ゲッティングの正確さに関して処理細胞をスクリーニングすることにより、正確
にターゲッティングが行われた細胞を同定、単離する。
【０２００】 胚性幹細胞における遺伝子ターゲッティングは、１個またはそれ以上のIL-1L1
ゲノム性配列と相同性組換えを行うように設計されたターゲッティング導入遺伝
子構築体を用いることにより、IL-1L1遺伝子機能を妨げる手段として、本発明に
よって企図された方法である。ターゲッティング構築体は、IL-1L1遺伝子の構成
要素と組換えすることによって、陽性選択マーカーが遺伝子のコード配列内に挿
入される（または置き換えられる）ように計画することができる。挿入された配
列は機能的にIL-1L1遺伝子を阻害し、一方で陽性の選択特性を示す。IL-1L1ター
ゲッティング構築体の例については以下に詳細に記載している。
【０２０１】 一般的に、ノックアウト動物の産生に用いされる胚性幹細胞（ES細胞）は、産
生されるノックアウト動物と同一種の細胞である。したがって、例えば、マウス
の胚性幹細胞は、通常、ノックアウトマウスの産生に用いられる。
【０２０２】 胚性幹細胞は、ドエッチュマン（Doetschman）らによって記載（J. Embryol.
Exp. MoIL-1L1hol. 87: 27-45(1985)）されているような、当業者において既知
である方法を用いて産生、維持される。任意の細胞系のES細胞を用いることがで
きるが、ノックアウト構築体の生殖細胞系列が遺伝してゆくためには、細胞が発
達中胚の生殖細胞系列に組み込まれ、その一部となる能力について、選択された
細胞系を特に選別する。従って、この能力を有すると考えられている任意のES細
胞系を本明細書に記載している用途に用いることができる。一般的にES細胞の産
生に用いられているマウスの系統は129Jである。もうひとつのES細胞系はマウス
の細胞系D3（アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（American Type Cu
lture Collection）、カタログ番号CKL 1934）である。さらに別の好ましいES細
胞系はWW6細胞系（イオッフェ（Ioffe）ら、PNAS 92: 7357-7361(1995)）である
。細胞を培養し、当業者において既知である次のような方法を用いてノックアウ
ト構築体挿入の準備を行う：ロバートソン（Robertson）、「奇形腫細胞および
胚性幹細胞：実験的手法（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells : A Pr
actical Approach）」、E. J. ロバートソン（Robertson）編、IRLプレス（IRL
Press）社、（ワシントンDC）、1987年；ブラッドレー（Bradley）ら、Current
Topics in Devel. Biol. 20: 357-371(1986)；ホーガン（Hogan）ら、「マウス
胚の操作：実験室マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory
Manual）」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring H
arbor Laboratory Press）社、（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、
1986年）。
【０２０３】 ノックアウト構築体とは、幹細胞系に導入され、突然変異を受ける遺伝子の染
色体遺伝子座においてゲノムと再結合することができる特別に形成された核酸フ
ラグメントをさす。従って、与えられたノックアウト構築体は破壊の標的とされ
ている与えられた遺伝子に特異的である。にもかかわらず、これらの構築体内に
は多数の共通エレメントが存在しており、これらのエレメントは当該分野におい
て既知である。一般的なノックアウト構築体は、突然変異を受ける遺伝子をコー
ドしているゲノムの遺伝子座の５’および３’末端に由来する約0.5kb以上約10.
0kb以下の核酸フラグメントを有する。これらの２個のフラグメントは、ネオマ
イシン耐性遺伝子（neoR ）などのような陽性選択的マーカーをコードしている
核酸の介在フラグメントによって隔離されている。得られた核酸フラグメントは
、陽性選択的マーカーをコードしている核酸に連結したゲノムの遺伝子座の５’
最末端に由来する核酸を含み、さらに該マーカーがゲノムの遺伝子座の３’最末
端に由来する核酸に連結しており、IL-1L1のコード配列またはノックアウトを受
けるその他の遺伝子の大部分が脱落している。染色体の該遺伝子座において得ら
れた構築体をホモ接合的に組換えた場合には、構造遺伝子になるはずであった脱
落したコード配列がゲノムの遺伝子座から消失する。そのような稀少なホモ接合
性組換えを起こす幹細胞は、陽性選択的マーカーをコードしている遺伝子の核酸
のゲノム内への安定的な組み込み、さらに、適切な薬剤（本実施例においてはネ
オマイシン）の存在下においてこのマーカー遺伝子を発現する細胞に対する選択
性という長所によって選出することができる。
【０２０４】 この基本的な技術に関する変形も存在しており、当該分野において既知である
。例えば、「ノックイン」構築体は、陽性選択的マーカーをコードしている核酸
に連結したゲノムの遺伝子座の５’最末端に由来する核酸を含み、該マーカーの
もう一方が３’ゲノム遺伝子座フラグメントをコードしている核酸に連結してい
るという基本的な配置は同一であるが、コード配列が脱落していない点が異なっ
ており、従って、用いられている５’および３’ゲノム性フラグメントは連続し
ており、陽性選択的マーカーをコードしている核酸を導入することによって分断
された。遺伝子のゲノム性遺伝子座の限られた領域（例えば、１個のエクソンな
ど）のみに突然変異を起こさせる場合には、この「ノックイン」型構築体は突然
変異トランスジェニック動物の構築に非常に有用であり、クローニングおよび遺
伝子増幅に用いることができる。別の方法としては、「ノックイン」構築体を用
いて選択した遺伝子の１個の機能性ドメインを特異的に削除することができ、そ
の結果、コードされているポリペプチドドメインのひとつの機能が破壊され、そ
の他の機能は保持されているような遺伝子のポリペプチドを発現するトランスジ
ェニック動物を得ることができる。この型の「ノックイン」突然変異体は、いわ
ゆる「ドミナントネガティブ」突然変異体と呼ばれる特性を持つことが多いが、
これは、特にホモマルチメライズ（homomultimerize）するタンパク質の場合に
は、由来元である野生型遺伝子のポリペプチド生成物の活性を特異的に阻止する
（または「毒性」である）ことができるからである。「ノックイン」技術の変形
においては、マーカー遺伝子の発現が選択された遺伝子の転写制御因子の制御下
におかれるように、目的のゲノム性遺伝子座にマーカー遺伝子を組み込む。マー
カー遺伝子とは、活性を検出することができる酵素（例えば、β−ガラクトシダ
ーゼなど）をコードしている遺伝子であり、適切な条件下において細胞に酵素基
質を加え、酵素活性を分析することができる。当業者であれば、その他の有用な
マーカーおよび与えられた細胞内においてそれらの存在を検出する方法について
既知である。そのようなマーカーはすべて本発明の範ちゅうに含まれる。
【０２０５】 上述したように、上記の「ノックアウト」または「ノックイン」構築体の相同
的組換えは非常に頻度が低く、そのような構築体はゲノムのランダム領域に非相
同的に挿入される頻度が高く、その場合、欠失の標的である遺伝子に全く影響を
与えず、また改変を望んでいない別の遺伝子を妨害するように組換えを起こす可
能性がある。そのような非相同的組換え事象は、上記のノックアウトまたはノッ
クイン構築体のいずれか一方の端が陰性選択的マーカー（特に、チミジンキナー
ゼ遺伝子の２個の対立遺伝子変異体を用いることにより、当該分野において既知
の適切な組織培養培地（すなわち、５−ブロモデオキシウリジンなどの薬物を含
む培地）内で発現を起こす細胞系について、そのポリペプチド産物に関して選択
することができる）に隣接するように変形することによって選択することができ
る。従って、本発明の「ノックアウト」または「ノックイン」構築体の好ましい
実施態様においては、陽性選択的マーカーの核酸に連結しているゲノム性遺伝子
座の５’末端をコードしている核酸に連結している陰性選択的マーカーをコード
している核酸を含み、このとき、該陽性選択的マーカーのもう一方の端は同上の
ゲノム性遺伝子座の３’末端をコードしている遺伝子座に連結しており、３’末
端のもう一方の端は陰性選択的マーカーをコードしている第二の核酸に連結して
いる。得られたノックアウト構築体とゲノムとの非相同的組換えにより、これら
の陰性選択的マーカー遺伝子のうちの１個または両方が安定的に組み込まれ、従
って、非相同的組換えを起こした細胞は適切な選択培地（例えば、５−ブロモデ
オキシウリジンなどの薬物を含む培地）中で増殖させることによって選択するこ
とができる。陽性選択的マーカーおよび陰性選択的マーカーに関して同時に選択
を行うことにより、突然変異の発生を企図している遺伝子の遺伝子座においてノ
ックアウト構築体が相同的組換えを起こしているクローンの数が大幅に増加する
。得られたノックアウト幹細胞系内の選択された遺伝子座において染色体の変化
が予測通りに生じていることは、当業者において既知であるサザンブロット分析
を行うことによって確認することができる。別の方法としては、PCRを用いるこ
とができる。
【０２０６】 細胞内に挿入された各ノックアウト構築体は、最初は直鎖でなければならない
。故に、ノックアウト構築体がベクター内に挿入された場合には（以下に記載）
、ベクター配列内のみを切断し、ノックアウト構築体配列内を切断しないように
選択された適切な制限エンドヌクレアーゼを用いてDNAを切断することによって
直鎖化を行う。
【０２０７】 挿入に関しては、当業者において既知である挿入法に適した条件下において、
ノックアウト構築体をES細胞に加えることによって行う。例えば、ES細胞に対し
てエレクトロポレーションを行う場合には、エレクトロポレーション装置を用い
、メーカーの使用ガイドラインに従ってES細胞およびノックアウト構築体DNAに
電気パルスを照射する。通常、エレクトロポレーションを行った後は適切なイン
キュベーション条件下においてES細胞を快復させる。次に、既に説明しているよ
うに、ノックアウト構築体の存在について細胞のスクリーニングを行う。１個以
上のノックアウト構築体をES細胞に導入する場合には、各ノックアウト構築体は
同時に、または一度に１個ずつ導入することができる。
【０２０８】 既に概説した選択技術により、正しい位置にノックアウト構築体を有する適切
なES細胞を確認した後、細胞を胚に挿入する。挿入は、当業者において既知であ
る多様な方法を用いて行うことができるが、好ましい方法はマイクロインジェク
ション（微量注入）である。マイクロインジェクションの実施にあたっては、マ
イクロピペットに約10〜30個の細胞を集め、適切な発達段階にある胚の中に注入
して、ノックアウト構築体を有する外来性のES細胞を発達中の胚に組み込ませる
。例えば、形質転換したES細胞を未分化胚芽細胞にマイクロインジェクトするこ
とができる。ES細胞の挿入に用いられる胚の適切な発達段階は種によって異なる
が、マウスに関しては、約3.5日齢の胚である。妊娠している雌の子宮を灌流す
ることによって胚を得る。胚を得るための適切な方法は当業者において既知であ
り、例えば、ブラッドレー（Bradley）ら（同上）などによって記載されている
。
【０２０９】 適切な発達段階にある任意の胚を用いることができるが、好ましい胚は雄であ
る。マウスにおいては、好ましい胚は、ES細胞遺伝子によってコードされている
毛色と異なる毛色をコードしている遺伝子をも有する。このようにすれば、モザ
イク毛色（発達中の胚にES細胞が組み込まれたことを示す）を探すことによって
、産まれた子におけるノックアウト構築体の存在を容易にスクリーニングするこ
とができる。従って、例えば、ES細胞系が白毛の遺伝子を有する場合には、黒毛
または茶毛の遺伝子を有する胚を選択する。
【０２１０】 ES細胞が胚内に導入された後、妊娠のために、偽妊娠させた養母の子宮内に胚
を着床させる。任意の養母を用いることができるが、一般的には、出産、繁殖能
の良さ、および保育能に基づいて選択する。そのような養母は、精管切断した同
種の雄と交配することによって得られる。養母の偽妊娠の時期は着床の成功に重
要であり、種によって異なる。マウスにおいては、この時期は偽妊娠約２〜３日
目である。
【０２１１】 毛色選択法（上述、および以下の実施例を参照）を用いた場合には、養母から
生まれた子のスクリーニングは、まず、モザイク毛色に関して行う。さらに、ま
た別の方法としては、子の尾の組織のDNAについて、上述のようにサザンブロッ
トおよび／またはPCRを用いてノックアウト構築体の存在をスクリーニングする
ことができる。ホモ接合性ノックアウト動物を作出することを目的として、モザ
イク毛色を示す子が生殖系にノックアウト構築体を有すると考えられる場合には
、それらを互いに交配する。ホモ接合体は、この交配によって生まれたマウス、
ならびにヘテロ接合体であることが既知であるマウスおよび野生型マウス由来の
ゲノム性DNAを等量用いてサザンブロットを行うことによって確認することがで
きる。
【０２１２】 ノックアウト子の確認および特性の判断にはその他の方法を用いることができ
る。例えば、ノーザンブロットを用い、ノックアウトされている遺伝子、マーカ
ー遺伝子またはそれらの両方をコードしている転写体の存否を確認するためにmR
NAを精査することができる。さらに、ウェスタンブロットを用い、子の様々な組
織内におけるノックアウトされたIL-1L1遺伝子の発現レベルを評価することがで
き、このとき、特定のIL-1L1タンパク質に対する抗体、またはこの遺伝子が発現
している場合には、マーカー遺伝子産物に対する抗体を用いてウェスタンブロッ
トを精査する。最後に、ノックアウト構築体遺伝子産物の存否の確認に適した抗
体を用い、子から採取した様々な細胞についてイン・サイチュー（in situ）分
析（細胞を固定する、抗体でラベルするなど）および／またはFACS（蛍光活性化
セルソーター）分析を行うことができる。
【０２１３】 ノックアウトまたは破壊トランスジェニック動物の作出に関するその他の方法
も一般的に既知である。例えば、「マウス胚の操作（Manipulating the Mouse E
mbryo）」（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Har
bor Laboratory Press）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年
）などを参照のこと）。相同的組換えによって標的配列に挿入を行うなどして組
換え酵素に関するノックアウト動物を作出することもでき、そのような個体にお
いては、組換え酵素配列により、IL-1LI遺伝子不活化の組織特異的および／また
は一時的制御を実施することができる（上述参照）。
【０２１４】 １個以上のノックアウト構築体および／または１個以上の導入遺伝子発現構築
体を有する動物は任意の方法で作出する。好ましい作出方法は、各個体が所望す
るトランスジェニック表現型のうちのひとつを有するような一連の哺乳類群を作
出することである。そのような動物について一連の交配、戻し交配および選択を
行い、所望するすべてのノックアウト構築体を含み、および／または構築体を発
現する単一の動物を最終的に作出するが、このとき該動物は、ノックアウト構築
体および／または導入遺伝子が存在すること以外は野生型とコンジェニック（遺
伝子的に同一）である。
【０２１５】 すべてのIL-1LI導入遺伝子は、タンパク質の野生型をコードしており、または
、アゴニストおよびアンタゴニストならびにアンチセンス構築体を含むそれらの
相同体をコードしている。好ましい実施態様においては、導入遺伝子の発現は特
定の細胞集団、組織または使用する発達段階によって制限されており、例えば、
所望する様式が得られるように発現を制御するシス活性（cis-acting）配列など
が挙げられる。本発明においては、IL-1LIタンパク質のそのようなモザイク発現
が様々な形態の系統解析に必須であり、さらに、正常胚内の組織の小片において
発達が大きく変化したことによるIL-1LI発現の欠如などといった影響を評価する
方法を提供することができる。これらのこと、ならびに組織特異的制御配列およ
び条件制御配列を用いて、ある位置パターンにおける導入遺伝子の発現を制御す
ることができる。さらに、条件組換え系または原核細胞性転写制御配列などによ
り、一時的な発現パターンを得ることもできる。
【０２１６】 イン・ビボ（in vivo）における部位特異的遺伝子操作によって制御を行うこ
とができる導入遺伝子を発現させる遺伝子操作技術は当業者に既知である。例え
ば、標的配列の遺伝子組換えを触媒する組換え酵素の発現の制御を行うことがで
きる遺伝子系が利用可能である。本明細書において使用している「標的配列」と
は、組換え酵素によって遺伝子組換えが行われたヌクレオチド配列をさす。標的
配列は、組換え酵素認識配列に隣接しており、また、一般的には、組換え酵素活
性を発現する細胞内において削除されているかまたは逆向きになっている。組換
え酵素によって触媒される組換え事象は、標的配列の組換えによって目的とする
IL-1LIタンパク質のうちのひとつの発現が活性化されるかまたは抑制されるよう
に企図することができる。例えば、組換えIL-1LI遺伝子の発現を干渉する標的配
列（アンタゴニスト相同体またはアンチセンス転写体をコードしている標的配列
など）の削除を企図することにより、該遺伝子の発現を活性化することができる
。タンパク質の発現を伴うこのような干渉は、IL-1LI遺伝子がプロモーター因子
または内部停止コドンから位置的に離れているなどの多様なメカニズムによって
生じるものである。さらに、遺伝子のコード配列が組換え酵素認識配列に隣接し
、かつ、細胞内においてプロモーター因子に対してまず３’→５’方向にトラン
スフェクトされるように導入遺伝子を調製することができる。そのような実施例
においては、標的配列が逆向きになっている場合、プロモーター制御による転写
活性化を行うことができるプロモーター因子に対してコード配列の５’末端に配
置することによって目的の遺伝子を再配置する。
【０２１７】 本発明のトランスジェニック動物はすべて、本発明の導入遺伝子を大多数の細
胞内に有しており、導入遺伝子によって細胞の増殖、死および／または分化の制
御に関する「宿主細胞」の表現型が改変されている。本明細書に記載している導
入遺伝子構築体を１個またはそれ以上用いて本発明の導入遺伝子微生物を産生す
ることができるため、一般的に外来遺伝子材料を使用してトランスジェニック微
生物を産生する一般的な記述をしておく。この一般的な記述は、以下の方法およ
び材料を用いて特定の導入遺伝子配列を微生物内に組み込むことを目的として、
当業者によって変更することが可能である。
【０２１８】 ひとつの実施態様においては、バクテリオファージP1のcre/loxP組換え酵素系
（ラクソ（Lakso）ら、PNAS 89: 6232-6236(1992)；オーバン（Orban）ら、PNAS
89: 6861-6865(1992)）または麦酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）のFLP
組換え酵素系（オゴーマン（O'Gorman）ら、Science 251: 1352-1355(1991)；PC
T公報 WO 92/15694）を用い、イン・ビボ（in vivo）部位特異的遺伝子組換え系
を調製することができる。Cre組換え酵素は、loxP配列間に存在する介在標的配
列の部位特異的組換えを触媒する。loxP配列は、34塩基対のヌクレオチド反復配
列であって、これにCre組換え酵素が結合しており、Cre組換え酵素が媒介する遺
伝子組換えに必要である。loxP配列の方向は、Cre組換え酵素の存在下において
、介在標的配列を切除するのかまたは逆方向にするのかによって決定され（アブ
レムスキ（Abremski）ら、J. Biol. Chem. 259: 1509-1514(1984)）、loxP配列
が直列反復に向いている場合には標的配列の切除を触媒し、loxP配列が逆方向反
復に向いている場合には標的配列の逆向きを触媒する。
【０２１９】 従って、標的配列の遺伝子組換えはCre組換え酵素の発現に左右される。組換
え酵素の発現は、外部から添加した物質による誘導または抑制が可能な調節制御
（例えば、組織特異的制御、発達段階特異的制御など）に関するプロモーター因
子によって調節することができる。この調節制御により、組換え酵素の発現にプ
ロモーター因子が介在している細胞内においてのみ標的配列の遺伝子組換えが生
じる。従って、組換えIL-1LIタンパク質の発現活性化は、組換え酵素の発現の制
御を介して調節することができる。
【０２２０】 cre/loxP組換え酵素系を用いて組換えIL-1LIタンパク質の発現を調節するため
には、Cre組換え酵素および目的とするタンパク質をコードしている導入遺伝子
を有するトランスジェニック動物を作出する必要がある。Cre組換え酵素および
組換えIL-1LI遺伝子を有する動物は、「二重」トランスジェニック動物を構築す
ることによって得られる。そのような動物を作出するための簡便な方法は、１個
の導入遺伝子（例えば、IL-1LI遺伝子および組換え酵素遺伝子など）を有するト
ランスジェニック動物を交配することである。
【０２２１】 組換え酵素介在型の発現様式においてIL-1LI導入遺伝子を有するトランスジェ
ニック動物を最初に構築することによるひとつの利点は、目的とするタンパク質
がアゴニスト性またはアンタゴニスト性のいずれであっても、トランスジェニッ
ク動物の体内で発現すると有害である可能性があることである。そのような場合
には、目的とする導入遺伝子がすべての組織内でサイレントである創始者集団を
繁殖させ、維持することができる。この創始者集団内の個々の個体を、例えば、
１つもしくはそれ以上の組織内、ならびに／または所望する一時的なパターンに
おいて組換え酵素を発現する個体と交配させることができる。従って、例えば、
アンタゴニスト性IL-1LI導入遺伝子がサイレントである創始者集団を作出するこ
とにより、特定の組織においてIL-1LIが介在する誘導が破壊されている、または
ある発達段階において例えば死に至るなどの表現型を呈する創始者集団由来の子
孫を研究することができる。
【０２２２】 IL-1LI導入遺伝子を発現させることを目的として、原核細胞性タンパク質が同
時に発現することを必要とする原核細胞性プロモーター配列を用い、同様な条件
導入遺伝子を調製することができる。プロモーターおよび対応するトランス活性
化原核細胞性タンパク質の例については米国特許第4,833,080に記載されている
。
【０２２３】 さらに、条件導入遺伝子の発現は、遺伝子治療に類似した方法によって誘導す
ることができ、このとき、トランス活性化タンパク質（例えば、組換え酵素また
は原核細胞性タンパク質など）の遺伝子は、細胞型特異的様式と同様に、組織に
輸送され、発現する。この方法に従えば、IL-1LIA導入遺伝子は、トランス活性
化因子が導入されて発現スイッチが入れられるまでは、サイレント状態で成熟に
至る。
【０２２４】 ひとつの実施態様においては、本発明の「非ヒトトランスジェニック動物」は
、非ヒト動物の生殖細胞系に導入遺伝子を導入することによって作出する。発達
段階の異なる標的胚性細胞を用いて導入遺伝子を導入する。標的胚性細胞の発達
段階に応じて異なる導入方法を採用する。本発明の実施に用いる任意の動物の特
定の系統は、健康状態良好、胚収率の高さ、胚内の前核の可視性および生殖適合
性良好に関して選択する。さらに、ハプロタイプも重要な要素である。例えば、
トランスジェニックマウスを作出する場合、C57BL/6系またはFVB系などをよく用
いる（ジャクソン・ラボラトリー（Jackson Laboratory）、メイン州バーハーバ
ー）。好ましい系統としては、H-2 b 、H-2 d またはH-2 q ハプロタイプを有す
るC57BL/6系またはDBA/1系などである。本発明の実施に用いる系統は、それら自
身がトランスジェニックおよび／またはノックアウトである（すなわち、部分的
にまたは完全に抑制された１個以上の遺伝子を有する動物から得られた個体であ
る）。
【０２２５】 ひとつの実施態様においては、導入遺伝子構築体を単一の発生段階にある胚に
導入する。マイクロインジェクションに最も適した標的は接合子である。マウス
においては、直径約20μｍの大きさに成長した雄の前核を用い、１〜２plのDNA
溶液を注入して再生を行わせることができる。遺伝子導入の標的として接合子を
用いることの重要な利点は、ほとんどの場合において、初回分裂が起こる前に、
注入されたDNAが宿主遺伝子内に組み込まれることである（ブリンスター（Brins
ter）ら、PNAS 82: 4438-4442(1985)）。その結果として、トランスジェニック
動物のすべての細胞が組み込まれた導入遺伝子を有することになる。生殖細胞の
50％が導入遺伝子を保持していることから、一般的に、上記の結果は、導入遺伝
子が創始個体から子孫へ効率的に伝達されていることにおいても反映されている
。
【０２２６】 通常、受精胚は、前核が現れてくるまで適切な培地内でインキュベートする。
この時期になると、以下の記載に従い、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を雌
または雄の前核に導入する。マウスなどのいくつかの種においては、雄の前核が
好ましい。最も好ましくは、接合子の雄のDNA補体が卵核または接合子の雌の前
核によって処理される前に、外来性の遺伝子材料を添加する。卵核または雌の前
核は雄のDNA補体に影響を与える分子を放出すると考えられているが、これはお
そらく、雄のDNAのプロタミンがヒストンに置換されることにより、雌と雄のDNA
補体の結合が生じ、二倍体接合子が形成されるためと考えられる。
【０２２７】 従って、好ましくは、雄のDNA補体が雌の前核による影響を受ける前に、雄のD
NA補体またはその他の任意のDNA補体に外来性の遺伝子材料を添加する。例えば
、雄の前核が形成された直後にできる限り速やかに、初期の雄の前核に外来性の
遺伝子材料を添加するが、この時期は、雄と雌の前核が十分離れており、両者と
も細胞壁近辺に存在している。別の方法としては、脱縮合（decondensation）を
行った後に精子の核に外来性の遺伝子材料を添加することができる。次に、外来
性の遺伝子材料を含む精子を卵に加えることができ、または、導入遺伝子構築体
を卵に添加後、できる限り速やかに脱縮合精子を加えることができる。
【０２２８】 胚への導入遺伝子ヌクレオチド配列の導入は、マイクロインジェクション、エ
レクトロポレーション、またはリポフェクションなどのような当該分野において
既知の任意の方法を用いて行うことができる。胚への導入遺伝子ヌクレオチド配
列の導入に続き、イン・ビトロ（in vitro）で様々な期間にわたって胚をインキ
ュベートする、もしくは代理宿主に再移植する、またはそれらの両方を行うこと
ができる。イン・ビトロ（in vitro）でインキュベーションを行って成熟させる
方法は本発明の範囲に含まれる。イン・ビトロ（in vitro）での胚のインキュベ
ーションに関するひとつの一般的な方法は、種によって異なるが約１〜７日間で
あり、次にそれらを代理親に再移植する。
【０２２９】 本発明の目的を達成するためには、接合子は、該細胞は完全な生物に発達する
ことができる二倍体細胞を形成する必要がある。一般的に、接合子は、配偶子由
来の２個のハプロイド（一倍体）核の融合によって自然にまたは人工的に形成し
た核を有する卵を含む。従って、配偶子核は、生来適合性である、すなわち、分
化、発達を行って機能性の生物に至ることができる生物学的に活性な接合子であ
る必要がある。一般的には、正倍数接合子が好ましい。異数性接合子が得られた
場合には、その染色体数は、配偶子を得た生物の染色体の正倍数に対して１個以
上異なっていてはならない。
【０２３０】 同様な生物学的考慮に加えて、接合子の核または接合子の核の一部を形成する
遺伝子材料に添加することができる外来性の遺伝子材料の量（例えば、容量など
）は物理的考慮にも左右される。遺伝子材料を全く除去しない場合には、添加す
ることができる外来性遺伝子材料の量は、物理的に崩壊することなく吸収される
と予測される量に限られる。一般的には、挿入される外来性遺伝子材料の容量は
、約10pl未満である。添加による物理的影響は、接合子の生物活性を物理的に破
壊するほど大きくてはいけない。DNA配列の数および多様性に関する生物学的制
限は、特定の接合子および外来性遺伝子材料の機能に応じて異なるが、得られた
接合子の外来性遺伝子材料を含む遺伝子材料は、接合子が分化および発達を開始
、継続して機能性の生物に至ることが生物学的に可能でなければならないため、
当業者においては自明である。
【０２３１】 接合子に添加される導入遺伝子構築体のコピー数は、添加される外来性遺伝子
材料の総量に従って決まり、遺伝子の形質転換が起こり得る量である。理論的に
は必要なコピーは１個であるが、一般的には、１個のコピーが確実に機能するこ
とを目的として、導入遺伝子構築体の多数のコピー（例えば、1000〜20000コピ
ー）を用いる。本発明に従えば、挿入されたそれぞれの外来性DNA配列に対して
１個以上の機能性コピーを用いて外来性DNA 配列の表現型発現を促進することが
有利である。
【０２３２】 細胞、核膜またはその他の細胞構造もしくは遺伝子構造を破壊しない限り、任
意の技術を用いて核の遺伝子材料内に外来性遺伝子材料を添加することができる
。外来性遺伝子材料は、マイクロインジェクションによって核の遺伝子材料内に
挿入することが好ましい。細胞および細胞構造へのマイクロインジェクションは
当該分野において既知であり、使用されている。
【０２３３】 再移植は標準的な方法を用いて行う。通常、代理親に麻酔をかけ、卵管内に胚
を挿入する。特定の親に移植する胚の数は種によって異なるが、通常は、その種
が自然に宿す子の数と同程度である。
【０２３４】 代理親から生まれたトランスジェニック子については、任意の適切な方法を用
いて導入遺伝子の存在および／または発現に関してスクリーニングを行う。スク
リーニングは、導入遺伝子の少なくとも一部に相補的であるプローブを用い、サ
ザンブロット分析またはノーザンブロット分析によって行う場合が多い。導入遺
伝子産物の存在をスクリーニングするための別のまたは追加の方法としては、導
入遺伝子によってコードされているタンパク質に対する抗体を用いるウェスタン
ブロット分析がある。一般的には、DNAは尾の組織から調製し、導入遺伝子に対
するサザン分析またはPCRによって分析する。別の方法としては、最高レベルで
導入遺伝子を発現していると考えられる組織または細胞について、サザン分析ま
たはPCRによって導入遺伝子の存在および発現を調べるが、この場合には任意の
組織または細胞型を用いることができる。
【０２３５】 導入遺伝子の存在を調べるための別のまたは追加の方法としては、酵素および
／もしくは免疫学的アッセイ、特定のマーカーもしくは酵素活性に対する組織学
的染色、フローサイトメトリー分析などの適切な生化学的アッセイが挙げられる
が、これらに限定されるわけではない。血液の分析も血中の導入遺伝子産物の存
在の検出、ならびに多様な型の血液細胞およびその他の血液成分に対する導入遺
伝子の影響の評価に有用である。
【０２３６】 トランスジェニック動物の子孫は、トランスジェニック動物を適切な相手と交
配することによって、またはトランスジェニック動物から得た卵子および／もし
くは精子をイン・ビトロ（in vitro）受精させることによって得ることができる
。交配を行う場合には、交配相手はトランスジェニックおよび／またはノックア
ウトであるものもそうでないものも用いることができ、トランスジェニックの場
合には、同一もしくは異なる導入遺伝子を有する、またはそれらの両方を有する
個体を用いることができる。別の方法としては、交配相手として親系統を用いる
ことができる。イン・ビトロ（in vitro）受精を行う場合には、受精胚を代理親
内に移植する、もしくはイン・ビトロ（in vitro）でインキュベートする、また
はそれらの両方を行う。いずれの方法を用いた場合にも、上述の方法またはその
他の適切な方法を用い、導入遺伝子の存在に関して子孫の評価を行う。
【０２３７】 本発明に従って産生されたトランスジェニック動物は外来性遺伝子材料を有す
る。上述したように、ある実施態様においては、外来性遺伝子材料は、IL-1LIタ
ンパク質（アゴニスト性またはアンタゴニスト性のもの）、ならびにアンチセン
ス転写体またはIL-1LI突然変異体を産生するDNA配列である。さらに、そのよう
な実施態様においては、該配列はプロモーターなどの転写制御因子に結合してお
り、そのような因子は、特定の型の細胞内において導入遺伝子産物を発現させる
。
【０２３８】 レトロウイルス感染を用いて、非ヒト動物に導入遺伝子を導入することもでき
る。発達中の非ヒト胚をイン・ビトロ（in vitro）で培養し、胚盤胞段階に至ら
しめる。この間、割球分割細胞をレトロウイルス感染の標的とすることができる
（ジェニッヒ（Jaenich）,R.、PNAS 73 : 1260-1264(1976)）。酵素処理を行っ
て透明帯を除去することにより、割球分割細胞を効率的に感染させることができ
る（「マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）」、ホーガン（Hogan
）編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor L
aboratory Press）（コールドスプリングハーバー）、1986年）。一般的には、
導入遺伝子の導入に用いるウイルスベクター系は、導入遺伝子を有する複製欠損
性レトロウイルスである（ヤーナー（Jahner）ら、PNAS 82: 6927-6931(1985)；
ヴァン・デル・パッテン（Van der Putten）ら、PNAS 82: 6148-6152(1985)）。
単層のウイルス産生細胞上で割球分割細胞を培養することにより、トランスフェ
クションが容易かつ効率的に起こる（ヴァン・デル・パッテン（Van der Putten
）ら、同上；スチュワート（Stewart）ら、EMBO J. 6: 383-388(1987)）。別の
方法としては、より後期の段階で感染を行うことができる。割腔胞胚腔内にウイ
ルスまたはウイルス産生細胞を注入することができる（ヤーナー（Jahner）ら、
Nature 298: 623-628(1982)）。トランスジェニック非ヒト動物を構成している
細胞の一部分においてのみ取り込みが生じるため、創始個体のほとんどが導入遺
伝子に関してモザイク状である。さらに、創始個体は、一般的に子孫において形
質分離する可能性があるゲノム内の別異の位置に導入遺伝子の多様なレトロウイ
ルス性挿入部を有する場合がある。加えて、妊娠中期の胚を子宮内でレトロウイ
ルス感染させることによって生殖系に導入遺伝子を導入することも可能である（
ヤーナー（Jahner）ら、同上）。
【０２３９】 導入遺伝子導入における標的細胞の第三のタイプは胚性幹細胞（ES）である。
ES細胞は、イン・ビトロ（in vitro）で培養し、胚と融合させた移植前の胚から
得られる（エヴァンス（Evans）ら、Nature 292: 154-156(1981)；ブラッドレー
（Bradley）ら、Nature 309: 255-258(1984)；ゴスラー（Gossler）ら、PNAS 83
: 9065-9069(1986)；ロバートソン（Robertson）ら、Nature 322: 445-448(1986
)）。DNAトランスフェクションまたはレトロウイルスを介した形質導入によって
導入遺伝子を効率的にES細胞に導入することができる。次に、そのような形質転
換されたES細胞を非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わせることができる。その後
、ES細胞は胚に定着し、得られるキメラ動物の生殖系に寄与する。ジェニッシュ
（Jaenisch）, R.の文献（Science 240: 1468-1474(1988)）を参照のこと。
【０２４０】４．７ IL-1LI治療剤に関するスクリーニングアッセイ さらに、本発明は、IL-1LI治療剤を判定するためのスクリーニング法を提供す
るが、そのような治療剤としては、例えば、IL-1LI活性の異常が原因であるもし
くは関与している、またはIL-1LI活性もしくはIL-1L1タンパク質レベルを調節す
ることによって効果が得られる疾病または症状に対する治療および／または進行
の阻止などを目的としたものが挙げられる。そのような疾病、症状または疾患の
例としては、例えば、変形関節炎、炎症性腸疾患、I型糖尿病、乾癬、骨粗鬆症
、真正糖尿病における腎炎、円形脱毛症、グレーヴス（Graves）病、全身性紅斑
性狼瘡、硬化性苔癬、潰瘍性大腸炎、冠状動脈疾患、動脈疾患、糖尿病性網膜症
、低体重出生、妊娠併発症、重篤な歯根膜疾およびインシュリン依存性糖尿病な
どが挙げられるが、これらに限定されるわけではなく、特に、動脈損傷、ステロ
イドホルモン応答性腫瘍の増殖を伴うような癌（例えば、乳癌、前立腺癌または
精巣癌など）、血管疾病もしくは障害（例えば、血栓性発作、虚血性発作、なら
びにアテローマ性動脈硬化および血栓形成から進行した末梢血管疾患など）、心
疾患（例えば、心筋梗塞、うっ血性心不全、不安定狭心症および虚血性心疾患な
ど）、ならびに心血管系疾患および障害（例えば、高血圧、低血圧、心筋細胞肥
大症およびうっ血性心不全などによるもの）、あるいは、IL-1LI依存性過程の異
常もしくは変化によるその他の疾病状態もしくは障害によって特徴づけられる。
【０２４１】 IL-1L1治療剤としては、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメチック、低分子
および核酸を含む任意の型の化合物を用いるができる。核酸としては、例えば、
遺伝子、アンチセンス核酸、リボザイムまたは三つ組分子などを用いることがで
きる。本発明に従うIL-1L1治療剤はアゴニスト性またはアンタゴニスト性である
。好ましいIL-1L1アゴニストとしては、IL-1L1の活性（例えば、繊維芽細胞増殖
因子レセプター結合活性またはヘパリン硫酸結合活性など）のうちの少なくとも
ひとつを模倣しているIL-1L1タンパク質またはそれらの誘導体が挙げられる。そ
の他の好ましいアゴニストとしては、細胞内におけるIL-1L1タンパク質の産生を
増加させることができる化合物（例えば、IL-1L1遺伝子の発現を促進制御するこ
とができる化合物など）、ならびに、IL-1L1活性および／またはIL-1L1タンパク
質と標的ペプチドなどの他の分子との相互作用を促進することができる化合物が
挙げられる。好ましいIL-1L1アンタゴニストとしては、例えば、繊維芽細胞増殖
因子レセプターには結合できるがヘパリン硫酸には結合できないなどの性質を有
するドミナントネガティブタンパク質であるIL-1L1タンパク質が挙げられる。そ
の他の好ましいアンタゴニストとしては、細胞内でのIL-1L1タンパク質の産生を
低下させるもしくは阻害する化合物、IL-1L1遺伝子の発現を抑制制御することが
できる化合物、ならびに、IL-1L1活性および／もしくはIL-1L1タンパク質とその
他の分子との相互作用を抑制制御することができる化合物が挙げられる。別の好
ましい実施態様においては、IL-1L1アンタゴニストは標的ペプチドの変形型であ
り、IL-1L1タンパク質のFGFR結合ドメインと相互作用することはできるが、生物
学的活性を有しない（例えば、それ自身は細胞表面レセプターではないなど）も
のである。
【０２４２】 また、本発明は、IL-1L1タンパク質（例えば、野生型IL-1L1タンパク質または
IL-1L1タンパク質の突然変異型など）に結合することができ、それによってIL-1
L1の増殖因子活性を調節し、もしくはIL-1L1の分解を起こすIL-1L1治療剤を同定
するためのスクリーニング法を提供する。例えば、そのようなIL-1L1治療剤とし
ては、IL-1L1タンパク質（野生型または突然変異型）と特異的に相互作用する抗
体またはそれらの誘導体を用いることができる。
【０２４３】 従って、本発明は、IL-1L1のアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物を
同定する方法を提供し、そのような方法には、IL-1L1タンパク質もしくはIL-1L1
タンパク質と相互作用することができる分子（例えば、FGFレセプターおよび／
またはヘパリン硫酸など）と相互作用することができる化合物、ならびに／また
は、IL-1L1タンパク質と他の分子（例えば、レセプターおよび／またはヘパリン
硫酸など）との相互作用を調節することができる化合物を選択することを含む。
一般的には、IL-1L1タンパク質と相互作用することができる分子を「IL-1L1結合
パートナー」と称する。
【０２４４】 本発明の化合物は、所望する化合物の型および活性に応じ、多様なアッセイを
用いて確認することができる。さらに、本明細書に記載しているように、被験化
合物についてさらに動物モデルを用いて試験することができる。以下に記載して
いるのはIL-1L1治療剤同定に用いることができるいくつかのアッセイを例示した
ものである。IL-1L1治療剤同定のために追加のアッセイを組むことは当業者の技
量の範囲内である。
【０２４５】４．７．１ セルフリーアッセイ セルフリーアッセイを用いることにより、IL-1L1タンパク質または結合パート
ナーと相互作用することができる化合物を同定し、それによってIL-1L1タンパク
質または結合パートナーの活性を変化させることができる。そのような化合物は
例えば、IL-1L1タンパク質または結合パートナーの構造を変化させることによっ
てその活性に影響を及ぼすことができる。セルフリーアッセイを用いて、IL-1L1
タンパク質とIL-1L1結合パートナー（標的ペプチドなど）との相互作用を調節す
る化合物を同定することもできる。好ましい実施態様においては、本質的に、そ
のような化合物を同定するためのセルフリーアッセイは、結合パートナーの存在
下または不在下において、IL-1L1タンパク質ならびに被験化合物もしくは被験化
合物ライブラリーを含む反応混合物を用いる。被験化合物としては、例えば、IL
-1L1結合パートナー（生物学的に不活性な標的ペプチドなど）または低分子など
を用いることができる。
【０２４６】 従って、本発明のスクリーニングアッセイのひとつの例としては、IL-1L1タン
パク質もしくはそれらの機能性フラグメントまたはIL-1L1結合パートナーと被験
化合物もしくは被験化合物ライブラリーとを接触させ、コンプレックスの形成を
検出する段階を含む。検出を行うためには、分子を特別なマーカーでラベルする
ことができ、さらに、被験化合物もしくは被験化合物ライブラリーを別異のマー
カーでラベルすることができる。次に、被験化合物とIL-1L1タンパク質もしくは
それらのフラグメントもしくはIL-1L1結合パートナーとの相互作用は、インキュ
ベーション段階および洗浄段階の後に、２つのラベルのレベルを測定することに
よって検出することができる。洗浄段階後に２種のラベルが存在することは、相
互作用が生じていることを示している。
【０２４７】 分子間の相互作用は、リアルタイムBIA（Biomolecular Interaction Analysis
：生体分子相互作用分析）（ファルマシア・バイオセンサー（ Pharmacia Biose
nsor）社、AB）を用いて確認することもできるが、これは、光学現象である表面
プラズモン共鳴（SPR）を検出するものである。検出は、生体特異的インターフ
ェースにおける巨大分子の質量濃度の変化よって行われ、相互作用をする物質に
対するラベルは必要ない。ひとつの実施態様においては、被験化合物ライブラリ
ーをセンサー表面に固定し、例えば、マイクロフローセルから構成される一枚の
壁を形成する。次に、IL-1L1タンパク質、それらの機能性フラグメント、IL-1L1
アナログもしくはIL-1L1結合パートナーを含む溶液を連続的にセンサーの表面に
流す。シグナル記録に現れた共鳴角度の変化によって相互作用が生じていること
が示される。この技術については、例えば、ファルマシア（ Pharmacia ）社か
ら出版されている「BIAテクノロジー ハンドブック（BIAtechnology Handbook
）」にさらに詳細に記載されている。
【０２４８】 本発明のスクリーニングアッセイに関する別の実施態様においては、(a)(i)IL
-1L1ポリペプチド、(ii)IL-1L1結合パートナーおよび(iii)被験化合物を含む反
応混合物を調製し；(b)IL-1L1とIL-1L1結合パートナーとの相互作用を検出する
段階を含む。本明細書に記載しているように、IL-1L1ポリペプチドおよびIL-1L1
結合パートナーは、組換え、プラズマなどの材料からの精製、または化学的合成
により調製することができる。被験化合物の存在下におけるIL-1L1とIL-1L1結合
タンパク質との相互作用の変化が、被験化合物不在下における相互作用の変化と
比較して統計学的に有為差（強化または阻害）を示した場合に、被験化合物はIL
-1L1生物活性に対する強力なアゴニスト（ミメチックまたは強化剤）またはアン
タゴニスト（阻害剤）であることが示唆される。本アッセイの化合物は同時に接
触させることができる。別の方法としては、はじめにIL-1L1タンパク質を被験化
合物と適切な時間接触させ、次に、反応混合物にIL-1L1結合パートナーを添加す
る。化合物の影響力は、様々な濃度の被験化合物を用いて得られたデータから容
量依存性曲線を作成することによって評価することができる。さらに、対照アッ
セイを行って比較用ベースラインを作成することができる。対照アッセイにおい
ては、IL-1L1結合パートナーまたはIL-1L1ポリペプチドを含む組成物に単離精製
したIL-1L1ポリペプチドまたは結合パートナーを添加し、被験化合物不在下にお
けるコンプレックスの形成を定量する。
【０２４９】 IL-1L1タンパク質とIL-1L1結合パートナーとのコンプレックスの形成は様々な
技術によって検出することができる。コンプレックス形成の変化は、例えば、検
出可能なラベルしたタンパク質（例えば、放射ラベルした、蛍光ラベルした、も
しくは酵素ラベルしたIL-1L1タンパク質またはIL-1L1結合パートナーなど）を用
い、イムノアッセイまたはクロマトグラフ検出によって定量することができる。
【０２５０】 一般的には、IL-1L1またはその結合パートナーのいずれかを固定することが望
ましく、このことにより、コンプレックス非形成型のタンパク質の一方もしくは
両方からコンプレックスを分離させ、また、アッセイの自動化を図ることができ
る。IL-1L1のIL-1L1結合パートナーへの結合は、反応物を接触させるのに適した
任意の容器内で行うことができる。そのような容器の例としては、マイクロタイ
タープレート、試験管および微量遠心管などが挙げられる。ひとつの実施態様に
おいては、タンパク質をマトリックスに結合させることができるドメインを付加
した融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ／IL-1L1（GST/IL-1L1）融合タンパク質は、グルタチオンセファ
ロースビーズ（シグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社、ミズーリ州セントルイ
ス）またはグルタチオン誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着させる
ことができ、次に、IL-1L1結合パートナー（例えば、35ＳでラベルしたIL-1L1結
合パートナーなど）および被験化合物と混合し、コンプレックスを形成するよう
な条件下（よりストリンジェントな条件が望ましいかもしれないが、例えば、塩
やpHに関する物理的条件など）において、この混合物をインキュベートする。イ
ンキュベーション後、ビーズを洗浄して非結合のラベルをすべて除去し、マトリ
ックスを固定化し、放射ラベルを直接測定する（例えば、ビーズを発光体中に置
くなど）かまたは、コンプレックスを解離した後の上清を測定する。別の方法と
しては、コンプレックスをマトリックスから解離させ、SDS-PAGEで分離し、以下
の実施例に記載しているような標準的な電気泳動技術を用いて、ビーズフラクシ
ョン中のIL-1L1タンパク質またはIL-1L1結合パートナーのレベルをゲルから定量
することができる。
【０２５１】 マトリックス上にタンパク質を固定化するためのその他の技術を本アッセイに
用いることもできる。例えば、ビオチンとストレプトアビジとのコンジュゲーシ
ョンを利用することにより、IL-1L1またはそれに固有の結合パートナーを固定化
することができる。例えば、ビオチン化したIL-1L1分子は、当該分野において既
知の技術を用い、ビオチン−NHS（N−ヒドロキシスクシンイミド）から調製する
ことができ（例えば、ビオチンキット（ピアス（Pierce Chemicals）社、イリノ
イ州ロックフォード）など）、ストレプトアビジンで被覆した96ウェルプレート
（ピアス（Pierce Chemicals）社）のウェル内に固定化することができる。別の
方法としては、IL-1L1反応性の抗体をプレートのウェルに固定し、抗体コンジュ
ゲーションによってウェル内にIL-1L1を捕獲することができる。上述したように
、IL-1L1を入れたウェル内において、IL-1L1結合タンパク質および被験化合物と
からなる調製物インキュベートし、ウェルに捕獲されたコンプレックスの量を定
量することができる。そのようなコンプレックスを検出するための方法の例とし
ては、GST固定化コンプレックスについて記載した上述の方法に加え、IL-1L1結
合パートナーと反応する抗体、もしくはIL-1L1タンパク質と反応し、結合パート
ナーと競合する抗体を用いることによって行うコンプレックスの免疫検出、なら
びに結合パートナーが関与する内因性または外因性の酵素活性の検出に基づく酵
素結合アッセイが挙げられる。後者の例としては、酵素をIL-1L1結合パートナー
と化学的にコンジュゲートするかまたは融合タンパク質として供することができ
る。具体的には、IL-1L1結合パートナーは、ホースラディッシュパーオキシダー
ゼと化学的に架橋結合させるまたは遺伝子融合させることができ、酵素の色素基
質（例えば、３，３’−ジアミノ−ベンザジン−テトラヒドロクロリドまたは４
−クロロ−１−ナフトールなど）を用いてコンプレックス内に捕獲されたポリペ
プチドの量を測定することができる。同様に、ポリペプチドとグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼとからなる融合タンパク質を調製することができ、１−ク
ロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてGST活性を検出することにより、コン
プレックスの形成を定量することができる（ハビッグ（Habig）ら、J. Biol. Ch
em. 249: 7130(1974)）。
【０２５２】 コンプレックス内に捕獲されたタンパク質のうちのひとつを定量することを目
的とする免疫検出に基づく方法においては、抗IL-1L1抗体などのようなタンパク
質に対する抗体を用いることができる。別の方法としては、コンプレックス内に
存在する検出すべきタンパク質は、融合タンパク質の形で「エピトープタグを付
ける（epitope tagged）」ことができ、このとき、融合タンパク質にはIL-1L1配
列に加えて、抗体が入手可能な（市販されている）第二のペプチドを含む。例え
ば、上述のGST融合タンパク質は、GST部位に対する抗体を用いることにより、結
合の定量にも使用することができる。その他の有用なエピトープタグとしてはmy
c−エピトープ（例えば、エリソン（Ellison）ら、J. Biol. Chem. 266: 21150-
21157(1991)などを参照）が挙げられるが、これは、c-myc由来の10個の残基から
なる配列ならびにpFLAG系（インターナショナル・バイオテクノロジーズ（Inter
national Biotechnologies）社）もしくはpEZZタンパク質A系（ファルマシア（
Pharmacia ）社、ニュージャージー州）を有する。
【０２５３】 セルフリーアッセイを用いることにより、IL-1L1タンパク質と相互作用し、IL
-1L1タンパク質の活性を制御する化合物を同定することができる。従って、ひと
つの実施態様においては、IL-1L1タンパク質を被験化合物と接触させ、IL-1L1の
触媒活性をモニターする。ひとつの実施態様においては、IL-1L1が標的分子に結
合する能力を測定する。標的分子に対するIL-1L1の結合親和性は、当該分野にお
いて既知の方法に従って測定することができる。
【０２５４】４．７．２ 細胞に基づくアッセイ 上述したようなセルフリーアッセイに加えて、本発明によって提供されるIL-1
L1タンパク質は、低分子アゴニストまたはアンタゴニストを同定するためなどの
細胞に基づくアッセイに用いることができる。ひとつの実施態様においては、被
験化合物のみの存在下または被験化合物およびIL-1L1タンパク質の存在下におい
て、細胞膜の外表面にIL-1L1レセプタータンパク質を発現する細胞をインキュベ
ートし、例えば、マイクロフィジオメーター（マコーネル（McConnell）ら、Sci
ence 257: 1906(1992)）などを用い、被験化合物−IL-1L1レセプタータンパク質
間またはIL-1L1タンパク質（好ましくはタグを付けたIL-1L1タンパク質）−IL-1
L1レセプタータンパク質間の相互作用を検出する。IL-1L1レセプタータンパク質
−被験化合物間もしくはIL-1L1タンパク質間の相互作用は、培地の酸性化の変化
としてマイクロフィジオメーターによって検出する。故に、このアッセイ系は、
IL-1L1−IL-1L1レセプター間の相互作用を干渉するなどの作用をする分子アンタ
ゴニスト、ならびにIL-1L1レセプターを活性化するなどの作用をする分子アゴニ
ストを同定する手段を提供する。
【０２５５】 細胞に基づくアッセイを用いることにより、IL-1L1遺伝子の発現を調節する、
IL-1L1 mRNAの翻訳を調節する、または、IL-1L1 mRNAもしくはIL-1L1タンパク質
の安定性を調節する化合物を同定することもできる。従って、ひとつの実施態様
においては、IL-1L1を産生することができる細胞（例えば、JEG-3などの絨毛上
皮腫細胞系など）を被験化合物と共にインキュベートし、細胞培地中に産生され
たIL-1L1の量を測定し、被験化合物と接触させていない細胞からのIL-1L1産生量
と比較する。１個またはそれ以上の対照遺伝子の発現を測定するなどの多様な対
照分析を行うことにより、化合物とIL-1L1との間の特異性を確認する。被験化合
物としては、低分子、タンパク質および核酸が挙げられる。特に、本アッセイは
、IL-1L1アンチセンス分子またはリボザイムの有効性確認に利用することができ
る。
【０２５６】 別の実施態様においては、IL-1L1遺伝子のプロモーターの少なくとも一部分に
機能発揮できるように連結しているレポーター遺伝子を用い、トランスフェクシ
ョン実験を行うことによってIL-1L1遺伝子の転写に対する被験化合物の効果を確
認する。遺伝子のプロモーター領域は、当該分野において既知の方法に従ってゲ
ノム性ライブラリーなどから単離することができる。レポーター遺伝子としては
、定量可能なタンパク質をコードしている任意の遺伝子（例えば、ルシフェラー
ゼまたはCAT遺伝子など）を用いることができる。そのようなレポーター遺伝子
は当該分野において既知である。
【０２５７】 好ましい実施態様においては、本発明は、絨毛上皮腫細胞系JEG-3を用いた細
胞に基づくアッセイを提供する。この細胞系の分析から、ウサギ抗IL-1L1ポリク
ローナル抗血清と免疫沈降する17kDaのIL-1L1ポリペプチドを産生することが示
されている。従って、この細胞系は、IL-1L1遺伝子の発現を促進制御もしくは抑
制制御する、または、IL-1L1ポリペプチドの定常状態レベルに影響を与える物質
に関するスクリーニングアッセイ、あるいは、IL-1L1ポリペプチドの翻訳後活性
（例えば、IL-1L1蛋白質分解過程、IL-1L1グリコシル化、IL-1L1リン酸化または
IL-1L1分泌など）に影響を与える物質に関するスクリーニングアッセイに用いる
ことができる。
【０２５８】 別の好ましい実施態様においては、インターロイキン−１アゴニストおよびア
ンタゴニスト活性に関するアッセイを用いることができる。例えば、ヒト皮膚繊
維芽細胞は、IL-1αおよびIL-1βなどのIL-1様アクチベーターに応答してインタ
ーロイキン−６を発現する。従って、この細胞系をIL-1アゴニスト活性のアッセ
イに用いることができる。さらに、この細胞系を用いることにより、インターロ
イキン−６遺伝子のIL-1αもしくはIL-1βによる活性化を阻害するまたは減弱す
る化合物をスクリーニングすることによるIL-1アンタゴニストのアッセイが提供
される。またさらに、この細胞系をIL-1レセプターアンタゴニストポリペプチド
と共に用いることにより、IL-1L1ポリペプチドならびにIL-1レセプターアンタゴ
ニスト活性（例えば、インターロイキン−６遺伝子のIL-1β依存性活性を阻止す
るIL-1raの能力など）に影響を与えるIL-1L1ポリペプチドアゴニストおよびアン
タゴニストを同定することができる。
【０２５９】 本発明の方法に用いることができる細胞に基づくその他のスクリーニングアッ
セイは、当業者に既知であるか明白である。例えば、IL-1アゴニストおよびアン
タゴニストは、下流で生じるNF-κBのIL-1依存性活性化に対する影響力によって
確認することができる（レディ（Reddy）ら、Mol. Cell Biol. 19: 4798-4805(1
997)）。IL-1依存性の活性化は、IκBキナーゼの特にβサブユニットの活性化（
リ（Li）ら、J. Exp. Med. 189: 1839-1845(1999)）を含む複数のメカニズムに
よって起こるが、ここで、IκBキナーゼβサブユニットの活性化は、NF-κBのI
κBインヒビターのリン酸化、およびそれに続いてプロテオソームによる蛋白質
分解を起こし、または、NF-κBの転写アクチベーターに対する核の局在化を阻害
する。IL-1L1は、ホスファチジルイノシトール３キナーゼの活性化を介してNF-
κBを活性化させることもできるが、ここで、ホスファチジルイノシトール３キ
ナーゼは、p65/RelAサブユニットのリン酸化によって発するシグナルを伝達し、
それによって下流遺伝子のNF-κB依存性転写活性化を行う（例えば、シゼモア（
Sizemore）ら、Mol. Cell Biol. 19: 4798-4805(1997）。従って、IL-1誘導性の
炎症性応答遺伝子レポーターを用い、本発明の方法に従ってIL-1アゴニスト活性
およびアンタゴニスト活性をアッセイすることができる。
【０２６０】 さらに、IL-1βは、心筋細胞においてNOシンターゼ（iNos）遺伝子およびシク
ロオキシゲナーゼ−２遺伝子を誘導することが知られている（ラポインテ（LaPo
inte）ら、Hypertension 33: 276-282(1999)）。またさらに、ヒトの胎盤におけ
るIL-1L1遺伝子の発現に関して特に顕著なことは、ヒトの臍動脈内皮細胞（HUAE
C）では、インターロイキン−１によって多数の遺伝子が誘導されていることで
ある（コ（Ko）ら、Mol. Cell. Probes 13: 203-211(1999)）。そのような遺伝
子としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）遺伝子および血管内皮増殖因子
（VEGF）遺伝子などが挙げられ、これらは、血管新生を制御し、アテローマ性動
脈硬化症の進行に関与しているが、さらに、造血における重要な増殖因子エフェ
クターである顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）遺伝子、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子（GM-CSF）遺伝子および幹細胞因子（SCF）遺伝子が挙げられ
る。特定の遺伝子の活性化または抑制に対するIL-1のその他の作用を利用して、
IL-1L1ならびにIL-1L1のアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性に関する細胞
に基づくアッセイの開発をすることができる（例えば、ローン（Rohn）ら、J. I
mmunol. 162: 886-896(1999)（MHC クラスIIの発現のIL-1による抑制）；ペラカ
ーニ（Pellacani）ら、J. Biol. Chem. 274: 1525-1532(1999)（非ヒストン染色
体高移動群（HMG）遺伝子発現のIL-1による活性化）；ボーゲイ（Borghaei）ら
、Biochem. Biophys. Res. Commun. 251: 334-338(1998)（マイトジェン誘導性
核オーファンレセプター（MINoR）遺伝子発現のIL-1による誘導）などを参照）
。
【０２６１】 さらに本発明は、上述のスクリーニングアッセイによって同定された新規物質
および本明細書に記載している治療のためのそれらの使用法を包含する。
【０２６２】４．８ 候補薬剤 さらに本発明は、被験対象内において、コードされたIL-1L1タンパク質の発現
レベルおよび／または作用に影響を及ぼす新規なIL-1L1遺伝子および遺伝子内の
変形、ならびに関連経路遺伝子に少なくとも部分的には基づく候補薬剤に関する
。
【０２６３】 例えば、本明細書に記載されている診断アッセイを用いて得られた情報は（単
独でまたは、同様の疾病に関連があるその他の遺伝子欠損に関する情報と併せて
）、症状を呈している対象（例えば、炎症性変形関節炎の症状を呈している対象
など）の診断または確認に有用であり、そのような対象は、遺伝子（例えば、IL
-1L1遺伝子内またはIL-1L1遺伝子の発現を制御する遺伝子内など）に欠損を有し
ており、そのことが特定の疾病または疾患の原因となっているか、または関与し
ている。別の観点からみると、情報を単独でまたは、同様の疾病に関連があるそ
の他の遺伝子欠損に関する情報と併せて利用することにより、症状を呈していな
い対象が、対象内のIL-1L1活性の異常またはIL-1L1タンパク質レベルの異常が原
因となっているか、もしくは関与している疾病または疾患を発現するか否かを予
測することができる。予測情報に基づき、医師は、特定の疾病または疾患の発症
を予防するまたは遅延させるために有効な養生法（例えば、食事や運動など）ま
たは治療プロトコールを推奨することができる。
【０２６４】 さらに、対象内のIL-1L1遺伝子またはタンパク質の欠損もしくは欠失（IL-1L1
遺伝子プロファイル）によって生じる特定の変化に関する知識を（単独でまたは
、同様の疾病に関連があるその他の遺伝子欠損に関する情報（特定の疾患に関す
る遺伝子プロファイル）と併せて）有することにより、対象の遺伝子プロファイ
ルに特有の疾病に対する個別注文治療を行うことができ、このことが「薬物遺伝
子学（pharmacogenomics）」の最終目標である。例えば、個人のIL-1L1遺伝子プ
ロファイル、あるいはL-1L1遺伝子の変化が原因となっている、もしくは関与し
ている疾病または症状に対する遺伝子プロファイルを入手することにより、医師
にとっては、１）疾病または症状に対して分子レベルで作用する薬剤をより効果
的に処方することが可能になり、また、２）特定の薬剤の適量がより決定しやく
すなる。例えば、疾病の様々な段階にある多数の患者において、IL-1L1タンパク
質の発現レベルを単独でまたは、同様の疾病に関連があることが既知であるその
他の遺伝子の発現レベルと併せて測定することにより、疾病の転写プロファイル
または発現プロファイルを得ることができる。次に、個々の患者における発現パ
ターンを疾病の発現パターンと比較することにより、患者に投与する適切な薬剤
および投与量を決定することができる。
【０２６５】 IL-1L1または疾病の遺伝子プロファイルに基づき、最も高い臨床効果を示すこ
とが予測される集団を標的にすることにより、１）販売不振の市販薬を一掃し、
２）患者亜集団に特異的な安全性または効果に関する制限から臨床開発が中断さ
れた薬剤候補を救済し、さらに３）薬剤候補に対する開発の加速およびより安価
な開発の実施、ならびにより適切な薬剤ラベルの作成（例えば、IL-1L1をマーカ
ーとして使用することは、有効投与量の最適化に有用である）を行うことができ
る。
【０２６６】 これらおよびその他の方法については、以下に詳細に記載している。
【０２６７】４．８．１ 予断および診断アッセイ 本方法は、対象が、IL-1L1タンパク質レベルの異常またはIL-1L1生物活性の異
常などのようなIL-1L1活性の異常が関与する疾病、症状または疾患を発現してい
る（診断）または発現するリスクを有する（予断）か否かを判断する方法を提供
する。そのような疾病、症状または疾患の例としては次のようなものが挙げられ
るが、これらに限定されるわけではない。変形関節炎、炎症性腸疾患、乾癬、紅
斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎および円形脱毛症ならびに糖尿病性腎炎などの炎症性疾
患、増殖因子サイトカインまたはステロイドホルモン応答性腫瘍（例えば、乳癌
、前立腺癌または精巣癌など）を含む癌、血管疾病または疾患（例えば、血栓性
発作、虚血性発作、ならびにアテローム性動脈硬化および血栓の形成によって生
じる末梢血管疾病など）、心疾患（例えば、心筋梗塞、不安定狭心症および虚血
性心疾患など）、心血管系疾病および疾患（高血圧、低血圧、心筋肥大および鬱
血性心不全などに由来するものなど）、外傷治癒、肢再生、神経損傷または疾病
（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、AIDS関連疾患または脳性麻痺に
関係するものなど）、あるいは、IL-1L1依存性の過程の異常もしくは変化によっ
て生じるその他の疾病、症状もしくは疾患、例えば、心血管の側副増殖および再
造形、脈管形成、オートクリン機構もしくはパラクリン機構を介して生じる細胞
形質転換、細胞（例えば、内皮など）の走化性刺激、神経前駆細胞（例えば、PC
12 クロム親和性細胞腫など）の神経突起の成長、成熟ニューロンの神経生理の
維持、胚性間葉および肢芽前駆組織の増殖、中胚葉誘導およびその他の発達過程
、コラゲナーゼおよびプラスミノーゲンアクチベーターの分泌刺激、腫瘍血管化
、ならびに腫瘍浸潤および転移など。
【０２６８】 従って、本発明は、IL-1L1レベルの異常またはIL-1L1生物活性の異常が原因で
ある、または関与している疾病、症状または疾患を発現しているか、または発現
する可能性があるか否かを判断する方法を提供し、そのような方法は例えば、IL
-1L1遺伝子もしくはIL-1L1タンパク質、IL-1L1の生物活性のレベルを測定し、な
らびに／またはIL-1L1遺伝子内の突然変異もしくは特定の多型変異体の存在を判
断することを含む。
【０２６９】 ひとつの実施態様においては、この方法は、ノーザンブロット分析、逆転写ポ
リメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、イン・サイチュー（in situ）ハイブリダイゼ
ーション、免疫沈降、ウェスタンブロットハイブリダイゼーション、または免疫
組織化学などの技術により、対象が異常mRNAを有している、および／またはIL-1
L1タンパク質レベルが異常であるか否かを判断することを含む。本方法に従えば
、対象から細胞を得、IL-1L1タンパク質またはmRNAのレベルを測定し、健康な対
象におけるIL-1L1タンパク質またはmRNAのレベルと比較する。IL-1L1ポリペプチ
ドまたはmRNAのレベルの異常は、IL-1L1活性の異常を示唆している。
【０２７０】 別の実施態様においては、本方法は、IL-1L1活性のうちの少なくともひとつを
測定することを含む。例えば、本明細書に記載しているように、ヘパリンに対す
るIL-1L1の親和性を測定することができる。同様に、結合パートナー（例えば、
IL-1 I型またはII型レセプターなど）に対する対象由来のIL-1L1タンパク質の
親和性定数を求めることができる。得られた結果を健康な対象由来のIL-1L1タン
パク質に関して行った同様の分析結果と比較することにより、対象のIL-1L1活性
が異常であるか否かが示される。
【０２７１】 好ましい実施態様においては、IL-1L1活性の異常が原因である、または関与し
ている疾病を発現しているか、または発現する可能性があるか否かを判断する方
法は、対象由来の細胞サンプル中において、（i）IL-1L1ポリペプチドをコード
している遺伝子の統合性に影響を及ぼす変化、または（ii）IL-1L1遺伝子の誤発
現のうちの少なくともひとつによって特徴づけられる遺伝子変化の有無を検出す
ることを特徴とする。例えば、そのような遺伝子変化は、（i）IL-1L1遺伝子か
らの１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、（ii）IL-1L1遺伝子への１個ま
たはそれ以上のヌクレオチドの付加、（iii）IL-1L1遺伝子の１個またはそれ以
上のヌクレオチドの置換、（iv）IL-1L1遺伝子の大規模な染色体再配列、（v）I
L-1L1遺伝子のメッセンジャーRNA転写体レベルの大幅な変化、（vi）IL-1L1遺伝
子の異常変形（ゲノム性DNAのメチル化パターンの異常変形など）、（vii）IL-1
L1遺伝子のメッセンジャーRNA転写体の非野生型スプライシングパターン、（vii
i）IL-1L1ポリペプチドの非野生型レベル、（ix）IL-1L1遺伝子の対立遺伝子消
失、ならびに／または（x）IL-1L1ポリペプチドの不適切な翻訳後修飾、などの
うちの少なくともひとつの存在を確認することによって検出することができる。
以下に記載しているように、本発明は、IL-1L1遺伝子内に生じた変化を検出する
ための多数のアッセイ技術を提供する。これらの方法としては、シークエンス解
析、サザンブロットハイブリダイゼーション、制限酵素部位マッピングを含む方
法、ならびに解析を行う核酸とプローブとの間のヌクレオチド対の不在を検出す
ることを含む方法などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これ
らおよびその他の方法については以下に詳細に記載している。
【０２７２】 遺伝子疾病または疾患などの特定の疾病および疾患は、突然変異型タンパク質
をコードする必要がないある種の遺伝子の多型領域に対する特定の対立遺伝子変
異体が関与している。従って、対象が遺伝子の多型領域に対する特定の対立遺伝
子変異体（例えば、単一ヌクレオチド多型（SNP）など）を有する場合には、特
定の疾病または疾患を発現しやすいと判断することができる。IL-1L1遺伝子など
の遺伝子内に存在する多型領域は、個体群における遺伝子のヌクレオチド配列を
確認することによって同定することができる。SNPなどの多型領域が同定された
場合には、特定の個体群（例えば、鬱血性心不全、高血圧、低血圧、または癌（
例えば、ステロイド応答性の腫瘍の増殖を含む癌など）などの特定の疾患に罹患
している患者の集団など）に関して研究することにより、特定の疾病との関連を
判断することができる。多型領域は遺伝子内の任意の領域、例えば、エクソン、
エクソンのコード領域および非コード領域、イントロン、およびプロモーター領
域などに存在している。
【０２７３】 IL-1L1遺伝子は、多型領域、すなわち、特定の疾病もしくは疾患に関与してい
る、またはそのような疾病もしくは疾患を発現する可能性を高めることに関与し
ている特異的対立遺伝子を有すると考えられる。従って、本発明は、対象内に存
在するIL-1L1遺伝子の多型領域の対立遺伝子または対立遺伝子変異体の性質を明
らかにする方法を提供し、それにより、対象が多型領域に存在する特異的対立遺
伝子変異体が関与している疾病または疾患を発現しているか、または発現するリ
スクを有するか否かを判断する。
【０２７４】 ある実施態様においては、IL-1L1遺伝子もしくは天然に存在するそれらの突然
変異体に対するセンス配列またはアンチセンス配列、あるいは、IL-1L1遺伝子も
しくは天然に存在するそれらの突然変異体と本来関連している５’もしくは３’
フランキング配列またはイントロン性配列とハイブリダズすることができるヌク
レオチド配列領域を含む核酸プローブを有する核酸組成物を提供する。細胞の核
酸は、ハイブリダイゼーションを受け入れることができ、プローブをサンプルの
核酸と接触させ、サンプル核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを検出す
る。そのような技術を用いることにより、ゲノムレベルまたはmRNAレベルにおい
て、欠失、置換などを含む変化または対立遺伝子変異体を検出することができ、
また、mRNA転写体レベルを確認することができる。
【０２７５】 好ましい検出方法としては、突然変異部位もしくは多型部位に重複しており、
かつ、突然変異領域もしくは多型領域の周辺に約５、10、20、25もしくは30個の
ヌクレオチドを有するプローブを用いる対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーショ
ンが挙げられる。本発明の好ましい実施態様においては、対立遺伝子変異体（例
えば、単一ヌクレオチド多型体など）に特異的にハイブリダイズすることができ
る数個のプローブを「チップ（chip）」などの固相支持体に結合させる。オリゴ
ヌクレオチドは、リトグラフィーを含む多様な方法によって固相支持体に結合さ
せることができる。例えば、チップに最高250,000個のオリゴヌクレオチドを結
合させることができる。オリゴヌクレオチドを結合させたこのようなチップ（「
DNAプローブアレイ（DNA probe arrays）」とも呼ばれる）を用いて行う突然変
異検出分析については、例えば、クローニン（Cronin）ら、Human Mutation 7:
244(1996)に記載されている。ひとつの実施態様においは、チップは、ある遺伝
子の少なくともひとつの多型領域に対する対立遺伝子変異体をすべて含む。次に
、固相支持体に被験核酸を接触させ、特定のプローブに対するハイブリダイゼー
ションを検出する。従って、簡便なハイブリダイゼーション実験により、１個ま
たはそれ以上の遺伝子に対する多数の対立遺伝子変異体の性質を確認することが
できる。
【０２７６】 ある実施態様においては、変化の検出は、アンカーPCRもしくはRACE PCRなど
のようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、米国特許第4,683,195号および
4,683,202号などを参照）において、また別の方法としては、リガーゼ連鎖反応
（LCR）（例えば、ランデグラン（Landegran）ら、Science 241: 1077-1080(198
8)；ナカザワ（Nakazawa）ら、PNAS 91:360-364(1994)を参照）において、プロ
ーブ／プライマーを用いることを含むが、IL-1L1遺伝子の点突然変異の検出には
LCRが特に有用である（アブラヴァヤ（Abravaya）ら、Nuc. Acid Res. 23: 675-
682(1995)を参照）。ひとつの具体的な実施例においては、その方法は次のよう
な段階を含む：（i）患者から細胞のサンプルを採取し、（ii）サンプルの細胞
から核酸（例えば、ゲノム性核酸もしくはmRNAまたは両者など）を単離し、（ii
i）IL-1L1遺伝子が（もし存在していれば）ハイブリダイゼーションし、および
増幅するような条件下において、IL-1L1遺伝子に特異的にハイブリダイズする１
個またはそれ以上のプライマーと核酸サンプルを接触させ、（iv）増幅生成物の
存否を検出し、または、増幅生成物の大きさを検出して対照サンプルの長さと比
較する。PCRおよび／またはLCRは、本明細書に記載している突然変異の検出に用
いる任意の技術と組み合わせることにより、予備増幅段階としての利用に適して
いると考えられる。
【０２７７】 別の増幅方法としては、自己持続性配列複製（self sustained sequence repl
ication）（グアテリ（Guatelli）, J.C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
1874-1878(1990）、転写増幅系（クウォー（Kwoh）, D.Y.ら、Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 86: 1173-1177(1989)）、Q−βレプリカーゼ（リザルディ（Lizardi
）, P.M.ら、Bio/Technology 6: 1197(1988)）、またはその他の任意の核酸増幅
法が挙げられ、増幅後、当業者において既知の技術を用いて増幅された分子を検
出する。これらの検出手順は、核酸分子の存在数が非常に少ない場合の検出に特
に有用である。
【０２７８】 本アッセイの好ましい実施態様においては、サンプル細胞から得たIL-1L1遺伝
子の突然変異または対立遺伝子変異体は、制限酵素解裂パターンの変化によって
同定することができる。例えば、サンプルDNAおよび対照DNAを単離し、必要であ
れば増殖させ、１個またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、
ゲル電気泳動によってフラグメントの大きさを測定する。さらに、配列特異的リ
ボザイム（例えば、米国特許第5,498,531号などを参照）を用いることにより、
リボザイム解裂部位の発生もしくは消失に基づいて特異的突然変異の存在を評価
することができる。
【０２７９】 さらに別の実施態様においては、当該分野において既知である多様なシークエ
ンシング反応のうちの任意のものを用いて、IL-1L1遺伝子を直接解析し、サンプ
ルIL-1L1の配列を対応する野生型（対照）配列と比較することによって突然変異
を検出することができる。そのようなシークエンシング反応の例としては、マク
サム（Maxim）およびギルバート（Gilbert）によって開発された技術（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 74: 560(1977)）、ならびにサンガー（Sanger）によって開
発された技術（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463(1977)）に基づくものが
挙げられる。本アッセイを行う場合には、マススペクトロメトリーによるシーク
エンシング（例えば、PCT公開公報WO 94/16101；コーエン（Cohen）ら、Adv. Ch
romatogr 36: 127-162(1996)；グリフィン（Griffin）ら、Appl. Biochem. Biot
echnol. 38: 147-159(1993)などを参照）を含む自動化された各種のシークエン
シング法のうちの任意のものを用いることも包含している（Biotechniques 19:
448(1995)）。ある実施態様においては、シークエンシング反応において確認が
必要な塩基は、わずかに１個、２個または３個の核酸であることは、当業者にお
いて自明である。例えば、わずか１個の核酸を検出するA−トラックなどを行う
ことができる。
【０２８０】 さらに別の実施態様においては、解裂剤に対する保護を用いて（ヌクレアーゼ
、ヒドロキシルアミンまたは四塩化オスミウムを使用し、さらにピペリジンを使
用するなど）、RNA/RNA、RNA/DNAまたはDNA/DNAのヘテロ二本鎖内のミスマッチ
塩基を検出することができる（マイヤーズ（Myers）ら、Science 230: 1242(198
5)）。一般的には、「ミスマッチ解裂」は、野生型IL-1L1配列を含むラベルした
RNAもしくはDNAを組織サンプルから得た突然変異の可能性を有するRNAもしくはD
NAとハイブリダイズすることによって形成されるヘテロ二本鎖を提供することに
よって開始する。二本鎖相補結合は、相補結合の一本鎖領域を解裂する物質を用
いて処理するが、そのような一本鎖領域は、対照鎖とサンプル鎖との間の塩基対
ミスマッチなどによって生じる。たとえば、RNA/DNA相補結合は、RNaseを用いて
処理することができ、DNA/DNAハイブリッドはS1ヌクレアーゼを用いて処理し、
ミスマッチ領域を酵素切断することができる。別の実施態様においては、ミスマ
ッチ領域を切断することを目的として、DNA/DNA相補結合またはRNA/DNA相補結合
をヒドロキシルアミンまたは四塩化オスミウムで処理し、さらにピペリジンを用
いて処理する。ミスマッチ領域の切断後、得られた材料を分子量に従って変性ポ
リアクリルアミドゲル上で分離し、突然変異部位を確認する。例えば、コットン
（Cotton）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397(1988)；サレーバ（Salee
ba）ら、Methods Enzymol. 217: 286-295(1992)などを参照のこと。好ましい実
施態様においては、検出のために対照DNAまたはRNAをラベルすることができる。
【０２８１】 また別の実施態様においては、細胞サンプルから得たIL-1L1 cDNA内の点突然
変異を検出およびマッピングするために確立された系において、二本鎖DNA内の
ミスマッチ塩基対を認識する１個またはそれ以上のタンパク質（いわゆる「DNA
ミスマッチ修復」酵素）をミスマッチ解裂反応に使用する。例えば、大腸菌（E
. coli）のmutY酵素は、G/AミスマッチにおいてAを解裂し、HeLa細胞由来のチミ
ジンDNAグリコシラーゼは、G/TミスマッチにおいてTを解裂する（ス（Hsu）ら、
Carcinogenesis 15: 1657-1662(1994)）。ある実施態様に従えば、IL-1L1配列（
例えば、野生型IL-1L1配列など）に基づくプローブを被験細胞由来のcDNAまたは
その他のDNA生成物にハイブリダイズさせる。DNAミスマッチ修復酵素を用いて相
補結合鎖を処理し、解裂生成物が得られた場合には、電気泳動法などによって検
出することができる。例えば、米国特許第5,459,039号を参照。
【０２８２】 別の実施態様においては、電気泳動移動度の変化を利用してIL-1L1遺伝子内の
突然変異の検出する、または、多型領域の対立遺伝子変異体を検出する。例えば
、一本鎖コンホメーション多型（SSCP）を用いて、突然変異核酸と野生型核酸と
の間の電気泳動移動度の差異を検出することができる（オリータ（Orita）ら、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766(1989)；コットン（ Cotton）ら、Mutat.
Res. 285: 125-144(1993)；ハヤシ（Hayashi）ら、Genet. Anal. Tech. Appl. 9
:73-79)(1992)）。サンプルおよび対照のIL-1L1核酸の一本鎖DNAフラグメントを
変性し、放置して元に戻した。一本鎖核酸の二次構造は配列によって異なるが、
電気泳動移動度において現れた変化により、わずか１個の塩基の変化でも検出可
能である。DNAフラグメントはラベルすることができ、ラベルしたプローブを用
いて検出することができる。このアッセイの感度は、DNAよりもむしろRNAを用い
ることによって増強することができるが、これは、二次構造が配列の変化により
影響を受けやすいためである。好ましい実施態様においては、本方法をヘテロ二
本鎖分析に用いることにより、電気泳動移動度における塩基の変化に基づいてヘ
テロ二本鎖分子を分離することができる（キーン（Keen）ら、Trends Genet 7:5
(1991)）。
【０２８３】 さらに別の実施態様においは、変性グラジエントゲル電気泳動（DGGE）を用い
、変性段階の異なる変性体を加えたポリアクリルアミドゲル内での変異体フラグ
メントまたは野生型フラグメントの移動度をアッセイする（マイヤーズ（Myers
）ら、Nature 313: 495(1985)）。分析方法としてDGGEを用いた場合には、DNAが
完全に変性していないことを確認するためにDNAを変形する。例えば、PCRにより
、融解温度が高いGCに富んだDNAの約40bpから構成されるGCクランプを付加する
ことなどが挙げられる。さらなる実施態様においては、変性剤の濃度勾配の代わ
りに温度勾配を用い、対照DNAおよびサンプルDNAの移動度の差異を確認する（ロ
ーゼンバウム（Rosenbaum）およびレイスナー（Reissner）、Biophys. Chem. 26
5: 12753(1987）。
【０２８４】 点突然変異の検出または多型領域の対立遺伝子変異体の確認に使用するその他
の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択
的増幅、または選択的プライマー伸長などが挙げられるが、これらに限定される
わけではない。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の突然変異また
はヌクレオチドの相違（例えば、対立遺伝子変異体内などにおける）を中央とし
て調製し、次に、完全に一致した場合にのみハイブリダイゼーションを行わせる
ような条件下において標的DNAにハイブリダイズさせる（サイキ（Saiki）ら、Na
ture 324: 163(1986)；サイキ（Saiki）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6
230(1989)）。そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーション技術を用いることにより、オリゴヌクレオチドがPCR増幅した標的DNAに
ハイブリダイズする場合には１回の反応につき１個の突然変異もしくは多型領域
を検出し、または、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に結合し、ラベルし
た標的DNAとハイブリダイズする場合には、多数の別異の突然変異もしくは多型
領域を検出することができる。
【０２８５】 別の方法としては、選択的PCR増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発
明と組み合わせて用いることができる。特異的増幅においてプライマーとして使
用するオリゴヌクレオチドは、ディファレンシャルハイブリダイゼーションに基
づく増幅を行うことができるように、分子の中央に突然変異もしくは多型領域を
有している（ギブス（Gibbs）ら、Nucleic Acids Res. 17: 2437-2448(1989)）
か、または、ミスマッチを防ぐ、もしくはポリメラーゼの伸長を抑制する適切な
条件下において、プライマーの３’最末端に突然変異もしくは多型領域を有して
いる（プロスナー（Prosnner）、Tibtech. 11:238(1993)）。さらに、突然変異
領域に新規な制限酵素部位を導入し、解裂に基づく検出部位を作出することが望
ましい（ガスパリーニ（Gasparini）ら、Mol. Cell Probes. 6: 1(1992）。ある
実施態様においては、増幅用のTaqリガーゼを用いて増幅を行うこともできると
考えられる（バラニー（Barany）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189(1991)
）。そのような場合には、５’配列の３’末端が完全に一致した場合にのみ核酸
連結反応が起こることから、増幅の有無を検索することによって特異的部位にお
ける既知の突然変異の存在を検出することが可能になる。
【０２８６】 別の実施態様においては、対立遺伝子変異体の確認は、オリゴヌクレオチド連
結反応アッセイ（OLA）を用いて行うことができ、例えば、米国特許第4,998,617
号およびランデグレン（Landegren）, Uら、Science 241: 1077-1080(1988)に記
載されている。OLAプロトコールにおいては、標的の一本の鎖の隣接する配列に
ハイブリダイズすることができるように設計された２個のオリゴヌクレオチドを
用いる。オリゴヌクレオチドのうちのひとつは別異のマーカー、例えば、ビオチ
ニル化マーカーなどに連結し、もうひとつは検出可能なラベルを付ける。標的分
子内に相補的であることが予測される配列が見出された場合には、オリゴヌクレ
オチドは、末端が隣接し、連結反応基質を作出するようにハイブリダイズする。
アビジンまたはその他のビオチンリガンドを用い、連結反応によってラベルした
オリゴヌクレオチドを回収することができる。ニッカーソン（Nickerson）, D.
A.らは、PCRおよびOLAの特質を組み合わせた核酸検出アッセイについて記載して
いる（ニッカーソン（Nickerson）, D. A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
8923-8927(1990)）。この方法においては、PCRを用いて標的DNAの指数関数的増
幅を行い、次に、OLAを用いて検出を行う。
【０２８７】 このOLA法に基づくいくつかの方法が開発されており、これらの方法を用いる
ことにより、IL-1L1遺伝子の多型領域の特異的対立遺伝子変異体を検出すること
ができる。例えば、米国特許第5,593,826号は、３’−アミノ基を有するオリゴ
ヌクレオチドおよび５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを用いるOLAにより、ホ
スホルアミデート結合を有するコンジュゲートを形成することを開示している。
OLAについての別の変形法についてはトーベ（Tobe）らが記載しており（Nucleic
Acids Res 24: 3728(1996)）、この方法によれば、OLAをPCRと組み合わせるこ
とによって、１個のマイクロタイターウェル内で２個の対立遺伝子の鑑別をする
ことができる。固有のハプテン（すなわち、ジゴキシゲニンおよびフルオレセイ
ンなど）を用いて対立遺伝子特異的プライマーにそれぞれ印を付けることにより
、別異の酵素レポーター、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュパ
ーオキシダーゼを用いてラベルしたハプテン特異的抗体を用いることによって各
OLA反応を検出することができる。この系では、２色の異なる色を発色するハイ
スループット様式を用いて２つの対立遺伝子の検出を行うことができる。
【０２８８】 さらに本発明は、IL-1L1遺伝子内の単一ヌクレオチド多型の検出法を提供する
。単一ヌクレオチド多型は、不変配列領域に接している変形部位を構成している
ため、分析においては、変形部位に存在する１個のヌクレオチドの同定をするだ
けで十分であり、各患者に対して完全な遺伝子配列の決定を行うことは不要であ
る。そのような単一ヌクレオチド多型の分析を行うためのいくつかの方法が開発
されている。
【０２８９】 ひとつの実施態様においては、例えば、マンディ（Mundy）, C. R.によって開
示されているように（米国特許第4,656,127号）、特異化されたエキソヌクレア
ーゼ抵抗性ヌクレオチドを用いて単一ヌクレオチド多型を検出することができる
。この方法に従えば、３’側が多型部位に隣接している対立遺伝子配列に相補的
なプライマーを特定の動物またはヒトから得た標的分子にハイブリダイズさせる
。標的分子上の多型部位が、特異化されたエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチ
ド誘導体に相補的なヌクレオチドを有する場合には、ハイブリダイズしたプライ
マーの末端にその誘導体を組み込む。そのような組み込みにより、プライマーは
エキソヌクレアーゼに対して耐性になり、検出可能になる。サンプルのエキソヌ
クレアーゼ抵抗性誘導体の性質は既知であるため、プライマーがエキソヌクレア
ーゼに対して抵抗性を獲得したという知見から、標的分子の多型部位に存在する
ヌクレオチドは、反応に用いたヌクレオチド誘導体のそれに相補的であることが
明らかになる。本方法は、大量の余分なシークエンスデータ解析を必要としない
点で有用である。
【０２９０】 本発明の別の実施態様においては、溶液法を用いて多型部位のヌクレオチドの
性質を決定する（コーエン（Cohen）,D.ら、フランス特許第2,650,840号；PCT出
願番号WO 91/02087）。米国特許第4,656,127号のマンディ（Mundy）法と同様に
、３’側が多型部位に隣接している対立遺伝子配列に相補的なプライマーを用い
る。この方法は、ラベルしたジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて多型部位の
ヌクレオチドの性質を決定するが、このとき、該誘導体が多型部位のヌクレオチ
ドに相補的である場合には、プライマーの末端に組み込む。
【０２９１】 別の方法としては、遺伝子ビット分析（Genetic Bit Analysis）またはGBATM
として知られている方法がゲレット（Goelet）, P.らによって記載されている（
PCT出願番号92/15712）。ゲレット（Goelet）, P.らの方法は、ラベルしたター
ミネーターおよび３’側が多型部位に隣接している配列に相補的なプライマーの
混合物を用いる。ラベルしたターミネーターは組み込まれ、解析を行っている標
的分子の多型部位内に存在するヌクレオチドによって判定され、かつ、そのよう
なヌクレオチドに相補的である。コーエン（Cohen）,D.らの方法（フランス特許
第2,650,840号；PCT出願番号WO 91/02087）とは対称的に、ゲレット（Goelet）,
P.らの方法は、好ましくは不均質相アッセイであり、プライマーまたは標的分
子を固相に固定化する。
【０２９２】 最近、DNAの多型部位をアッセイするためのプライマー制御ヌクレオチド取り
込み法（primer-guided nucleotide incorporation procedure）についていくつ
かの文献が発表されている（コマー（Komher）, J. S.ら、Nucl. Acids Res. 17
: 7779-7784(1989)；ソコロフ（Sokolov）, B. P.、Nucl. Acids Res. 18: 3671
(1990)；シヴァネン（Syvanen）, A. -C.ら、Genomics 8: 684-692(1990)；クプ
スワミー（Kuppuswamy）, M. N.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1143-114
7(1991)；プレザント（Prezant）, T. R.ら、Hum. Mutat. 1: 159-164(1992)；
ウゴソーリ（Ugozzoli）, L.ら、GATA 9: 107-112(1992)；ニレン（Nyren）, P.
ら、Anal. Biochem. 208: 171-175(1993)）。これらの方法は、ラベルしたデオ
キシヌクレオチドを取り込んで多型部位の塩基を区別するという点においてGBAT M とは異なる方法である。そのような様式においては、シグナルは取り込まれた
デオキシヌクレオチドの数に比例することから、同一ヌクレオチドの転写におい
て生じた多型は、転写の長さに比例したシグナルを発生する（シヴァネン（Syva
nen）, A. -C.ら、Amer. J. Hum. Genet. 52: 46-59(1993)）。
【０２９３】 タンパク質翻訳の未熟終結を引き起こす突然変異に関しては、タンパク質切断
試験（protein truncation test: PTT）によって効率的に診断を実施することが
できる（レスト（Roest）ら、Hum. Mol. Genet. 2: 1719-21(1993)；ヴァン・デ
ル・ルート（Van der Luijt）ら、Genomics 20: 1-4(1994)）。PTTに関しては、
はじめに、入手可能な組織からRNAを単離して逆転写し、PCRによって目的のセグ
メントを増幅する。次に、逆転写PCR産物をネストPCR増幅（nested PCR amplifi
cation）の鋳型として用い、このとき、RNAポリメラーゼプロモーターおよび真
核性翻訳を開始するための配列を含むプライマーを使用した。目的の領域を増幅
した後、プライマーに組み込まれた特異的なモチーフにより、PCR産物のイン・
ビトロ（in vitro）転写および翻訳が順次行われる。翻訳産物のドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動においては、切断ポリペプチドの動
向は、翻訳の未熟終結を引き起こす突然変異の存在を示している。この方法の変
形としては、目的の標的領域が１個のエクソンに由来するものである場合には、
PCR鋳型としてDNA（RNAと対照するものとして）を用いる。
【０２９４】 本発明に記載している方法は、例えば、少なくとも１個のプローブ核酸、プラ
イマーセット、および／または本明細書に記載している抗体反応試薬を含む予め
パッケージ詰めされた診断キットを用いて行うことができ、例えば、臨床の場に
おいて、IL-1L1ポリペプチドが関与している症状を呈している患者、またはIL-1
L1ポリペプチドが関与している疾病または病気に関する家族歴について診断を行
う場合に簡便に利用することができる。
【０２９５】 以下に記載している診断においては、任意の細胞型または組織を用いることが
できる。好ましい実施態様においては、対象から血液などの体液を採取し、IL-1
L1遺伝子の多型領域における突然変異の存在、または対立遺伝子変異体の特性を
明らかにする。血液などの体液は、静脈穿刺などの既知の技術によって採取する
ことができる。別の方法としては、毛髪や皮膚などの乾燥サンプル上において核
酸試験を行うことができる。出生前診断においては、ビアンチ（Bianchi）らの
国際特許出願WO 91/07660号の記載に従い、胎児の核酸サンプルは母体の血液か
ら採取することができる。別の方法としては、出生前診断を行うために、羊水穿
刺または絨毛穿刺を行ってサンプルを採取することができる。
【０２９６】 RNAまたはタンパク質を用いてIL-1L1遺伝子の多型領域に関する突然変異また
は特異的対立遺伝子変異体の存在を検出する場合には、使用する細胞または組織
がIL-1L1遺伝子を発現していなければならない。これらの方法に用いる好ましい
細胞としては心細胞が挙げられる（実施例の項を参照のこと）。その他の細胞ま
たは組織を用いた場合には、例えば、ノーザンブロット分析などによって対象内
の特異的IL-1L1遺伝子の発現パターンを決定することによって判断することがで
きる。
【０２９７】 診断法は、核酸精製を行わなくてもよいように、生体穿刺または切除によって
得た患者の組織切片（固定または冷凍したもの）についてイン・サイチュー（in
situ）で直接行うこともできる。そのようなイン・サイチュー（in situ）法に
おいては、核酸反応試薬をプローブおよび／またはプライマーとして使用するこ
とができる（例えば、ヌオヴォ（Nuovo）, G. J.、「PCRイン・サイチュー（in
situ）ハイブリダイゼーション：プロトコールおよび応用（PCR in situ hybrid
ization: protocols and applications）」、ラーヴェン・プレス（Raven Press
）社、ニューヨーク、1992年などを参照）。」 基本的にひとつの核酸配列の検出に焦点を絞った方法に加えて、そのような検
出法においてプロファイルを予測することもできる。例えば、ノーザンブロット
分析および／またはRT-PCRなどの示差表示法を用いることにより、フィンガープ
リントプロファイルを作成することができる。
【０２９８】 疾病の診断および予後に関しては、上述したようなIL-1L1ポリペプチドの野生
型もしくは突然変異体またはそれらの対立遺伝子変異体に対する抗体を用いるこ
ともできる。そのような診断法を用いることにより、IL-1L1ポリペプチドの発現
レベルの異常、あるいはIL-1L1ポリペプチドの構造異常、ならびに／または組織
、細胞もしくは細胞成分における分布異常を検出することができる。構造異常と
しては、例えば、正常なIL-1L1ポリペプチドと比較した場合の突然変異型IL-1L1
ポリペプチドの大きさ、電気陰性度または抗原性の差異などが挙げられる。分析
を行う組織または細胞系由来のタンパク質は、ウェスタンブロットなどの当業者
において既知の技術を用いて容易に検出または単離することができる。ウェスタ
ンブロット分析を実施するための詳細な説明については、サンブルック（Sambro
ok）ら（同上、1989年）の第18章を参照のこと。本明細書において使用したタン
パク質の検出および単離法については、ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane
）によって記載されたもの（ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）、「抗体
：ラボラトリーマニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、コールド
スプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s）社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1988年））などもあり、
この記載を参照として本明細書中に取り入れておく。
【０２９９】 例えば、この方法は、蛍光ラベルした抗体（以下を参照）を光学顕微鏡検出、
フローサイトメトリー検出もしくは蛍光光度検出と組み合わせた免疫蛍光法によ
って行うことができる。さらに、本発明において有用な抗体（またはそれらのフ
ラグメント）は、IL-1L1ポリペプチドのイン・サイチュー（in situ）検出のた
めの免疫蛍光法もしくは免疫電子顕微鏡において、組織学的に用いることができ
る。イン・サイチュー（in situ）検出は、患者から組織試料を採取し、その試
料に本発明のラベルした抗体を加えることによって実施することができる。抗体
（またはフラグメント）は、生物学的サンプルを被覆するようにラベル抗体（ま
たはフラグメント）を加えることが好ましい。そのような方法を用いることによ
り、IL-1L1ポリペプチドの存在のみならず、被験組織内におけるIL-1L1ポリペプ
チドの分布をも確認することができる。本方法を用いることにより、通常の技術
を有する当業者であれば、このようなイン・サイチュー（in situ）検出を行う
ために、多様な組織学的方法（例えば、染色法など）のうちの任意のものを変形
することができることは容易に理解できる。
【０３００】 抗原または抗体を結合させることができる支持体としては、固相支持体または
キャリヤーを用いることが多い。既知の支持体またはキャリヤーとしては、ガラ
ス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、
アミラーゼ類、天然もしくは変形セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロス（
gabbros）およびマグネタイトなどが挙げられる。キャリヤーの性質としては、
本発明の目的のためにある程度可溶性であっても不溶性であってもよい。支持体
は、連結している分子が抗原または抗体に結合することができる限りは、事実上
任意の立体構造をとることができる。従って、支持体の立体構造は、ビーズのよ
うな球状、または、試験管内表面もしくは棒の外表面のような円柱状にすること
ができる。別の構造としては、シートや試験片などのような平面にすることがで
きる。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者であ
れば、抗体を結合させるのに適したその他多くのキャリヤーを知っており、日常
的な実験を行うことによって、それらのキャリヤーが同等であることを確認する
ことができる。
【０３０１】 抗IL-1L1ポリペプチド特異的抗体にラベルを付ける方法のひとつは、酵素への
結合を介したものであり、酵素免疫アッセイ（EIA）に使用する（ヴォラー（Vol
ler）、「酵素標識免疫吸着測定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay: ELIS
A）」、Diagnostic Horizons 2: 1-7(1978)、微生物学会季刊誌（Microbiologic
al Associaties Quarterly Publication）、メリーランド州ウォーカーズヴィル
；ヴォラー（Voller）ら、J. Clin. Pathol. 31: 507-520(1978)；バトラー（Bu
tler）、Meth. Enzymol. 73: 482-523(1981)；マッジオ（Maggio）編、「酵素免
疫アッセイ（Enzyme Immunoassay）」、CRCプレス（CRC Press）社、フロリダ州
ボカ・ラトン、1980年；イシカワ（Ishikawa）ら編、「酵素免疫アッセイ（Enzy
me Immunoassay）」、工学書院、東京、1981年）。抗体に結合する酵素は、適切
な基質、好ましくは色素性基質と反応し、例えば、分光光度計、蛍光計または目
視などによって検出可能な化学的部位を産生するような方法で反応する。抗体に
検出可能なラベルを付けるために用いることができる酵素としては次のようなも
のが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：リンゴ酸デヒドロゲナー
ゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母
アルコールデビドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、
トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエス
テラーゼ。酵素に色素基質を使用する色素法によって検出を行うことができる。
検出は、基質の酵素反応量を同様に調整した対照と目視比較することにより、視
覚的に行うこともできる。
【０３０２】 検出は、その他の多様な免疫アッセイのうちの任意のものを用いて行うことも
できる。例えば、放射活性ラベルした抗体または抗体フラグメントを用い、ラジ
オイムノアッセイ（RIA）を行うことによって、フィンガープリント遺伝子野生
型または突然変異ペプチドを検出することができる（例えば、ウェイントラウブ
（Weintraub）,B.、「ラジオイムノアッセイの原理：第７回放射リガンドアッセ
イ技術に関するトレーニングコース（Principles Radioimmunoassays: Seventh
Training Course on Radioligand Assay Techniques）」、エンドクライン協会
（The Endocrine Sciety）、1986年３月などを参照、参考として本明細書に取り
入れておく）。放射活性同位体は、γ−カウンターもしくはシンチレーションカ
ウンター、またはオートラジオグラフィーなどを用いる方法によって検出するこ
とができる。
【０３０３】 蛍光化合物を用いて抗体をラベルすることも可能である。蛍光ラベルした抗体
に適切な波長の光を照射すると、蛍光を発することによって抗体の存在を検出す
ることができる。最も一般的に使用される蛍光ラベル化合物としては、フルオレ
セインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、
アロフィコシアニン、Q−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンなどが挙げ
られる。
【０３０４】 蛍光を発する金属（例えば、152 Euまたはその他のランタノイド類金属など）
を用いて、抗体に検出可能なラベルをすることもできる。これらの金属は、ジエ
チレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などの
金属キレート基を用いることにより、抗体に結合させることができる。
【０３０５】 抗体を化学発光化合物に結合させることによって検出可能なラベルを付けるこ
ともできる。化学反応進行中に発生する光を検出することにより、化学発光タグ
を付けた抗体の存在を確認することができる。特に有用な化学発光ラベル化合物
の例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエス
テル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルなどが挙げ
られる。
【０３０６】 同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体をラベルすることができる。生
物発光は生体系において見出される化学発光のひとつの様式であり、触媒性タン
パク質が化学発光反応の効率を増強する。生物発光タンパク質の存在は、光を検
出することによって確認する。ラベルとして重要な生物発光化合物としては、ル
シフェリン、ルシフェラーゼおよびアクオリンなどが挙げられる。
【０３０７】 さらに、遺伝子もしくは遺伝子産物の変化、または多型変異体検出用の上記の
方法はいずれも、処置または治療の経過をモニターすることにも利用できること
は自明である。
【０３０８】４．８．２ 薬物遺伝子学 個人においてIL-1L1遺伝子もしくはタンパク質の欠損または欠失の結果として
生じる特定の変化に関する知識（IL-1L1遺伝子プロファイル）は、単独で、また
は同様の疾病に関与しているその他の遺伝子欠損に関する情報（特定の疾患に関
する遺伝子プロファイル）と組み合わせて用いることにより、「薬物遺伝子学（
Pharmacogenomics）」の目標である、個人の遺伝子プロファイルに特有の疾病に
対する治療の確立を行うことができる。例えば、IL-1L1遺伝子の特定の対立遺伝
子を有する対象は、特定の疾病の症状を示すもしくは示さないと考えられ、また
は、特定の疾病の症状を呈しやすいもしくは呈しやすくないと考えられる。さら
に、対照が症状を呈していて、IL-1L1治療に有効なある種の薬物に応答する、ま
たは応答しない場合において、別の薬物に応答する可能性がある。従って、IL-1
L1遺伝子および／またはタンパク質の欠損および／または欠失が原因となってい
る、またはこれらが関与している疾病または症状を呈している患者集団から、IL
-1L1遺伝子プロファイル（例えば、特定の疾病の進行に関連を有するIL-1L1遺伝
子の変化を分類するなど）を作成し（IL-1L1遺伝子集団プロファイル）、個々人
のIL-1L1プロファイルを集団のプロファイルと比較することにより、特定の患者
もしくは患者集団（すなわち、同様な遺伝子変化を有する患者群）に安全かつ有
効であると考えられる薬物を選択または設計することが可能になる。
【０３０９】 例えば、IL-1L1集団プロファイルは、IL-1L1遺伝子の欠損または欠失が原因と
なっている、またはこれらが関与している疾病を有している患者集団内において
、IL-1L1遺伝子の同一性などのIL-1L1プロファイルを判断することによって得ら
れる。さらに、IL-1L1集団プロファイルは、任意の多様な方法を用いて得られた
、IL-1L1治療に対する集団の応答に関する情報をも含み、そのような方法として
は、１）IL-1L1関連疾病による症状の重篤度、２）IL-1L1遺伝子発現レベル、３
）IL-1L1 mRNAレベル、および／または４）IL-1L1タンパク質レベルをモニター
する方法、さらに、特定の遺伝子変化またはIL-1L1遺伝子もしくはIL-1L1経路遺
伝子（IL-1L1 pathway gene）内に存在する変化に基づいて集団を区別または分
類する方法などが挙げられる。さらに、IL-1L1遺伝子集団プロファイルによって
、特定の治療に対して応答性または非応答性である患者における特定の変化を示
唆することもできる。この情報または集団プロファイルは、個人のIL-1L1プロフ
ァイルに基づき、特定の薬物に対して応答することを予測するのに有効である。
【０３１０】 好ましい実施態様においては、IL-1L1プロファイルは、転写または発現レベル
プロファイルであり、第一段階は、IL-1L1タンパク質の発現レベルを単独で、ま
たは同様の疾病に関与していることがわかっているその他の遺伝子の発現レベル
と併せて測定することを含む。IL-1L1プロファイルは、疾病の様々な段階にある
多数の患者から測定可能である。
【０３１１】 薬物遺伝子学の研究は、トランスジェニック動物を用いて行うこともできる。
例えば、本明細書に記載しているようなIL-1L1遺伝子の特異的対立遺伝子変異体
を有するトランスジェニックマウスを作出することができる。このようなマウス
は、例えば、野生型IL-1L1遺伝子をヒトのIL-1L1遺伝子の対立遺伝子と置換する
ことによって作出することができる。特定のIL-1L1治療に対するこのようなマウ
スの応答を判断することができる。
【０３１２】４．８．３ 臨床試験におけるIL-1L1治療剤の効果のモニタリング IL-1L1または疾病遺伝子プロファイルに基づき、最も高い臨床効果を示すこと
が期待される標的集団により、１）販売不振の結果、市販薬の棚の位置を変更し
；２）一部の患者集団において安全性または有効性が制限された結果、臨床開発
が中断されている薬物候補を救済し；３）薬物候補の開発促進および低コスト開
発、ならびにより適切な薬剤ラベルを作成する（例えば、マーカーとしてIL-1L1
を使用することは、最適有効投与量の決定に有用である）ことが可能になる。
【０３１３】 IL-1L1治療剤を用いた治療は、IL-1L1タンパク質レベルもしくは活性、IL-1L1
mRNAレベル、ならびに／またはIL-1L1転写レベルなどのIL-1L1の特性を測定す
ることによってモニターすることができる。この測定は、治療が有効であるか、
または調整もしくは最適化すべきであるかの指標になる。従って、IL-1L1は、臨
床試験期間の有効性のマーカーとして用いることができる。
【０３１４】 好ましい実施態様においては、本発明は、物質（例えば、アゴニスト、アンタ
ゴニスト、ペプチドミメチック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または
本明細書に記載しているスクリーニングアッセイによって確認されたその他の薬
物候補など）を用いて行う治療の効果をモニターする方法を提供し、その方法に
は、i）物質の投与に先だって、対象から投与前サンプルを採取し；ii）投与前
サンプル中のIL-1L1タンパク質、mRNAまたはゲノム性DNAの発現レベルを検出し
；iii）対象から１個またはそれ以上の投与後サンプルを採取し；iv）投与後サ
ンプル中のIL-1L1タンパク質、mRNAまたはゲノム性DNAの発現または活性レベル
を測定し；v）投与前サンプル中のIL-1L1タンパク質、mRNAまたはゲノム性DNAの
発現または活性レベルを投与後サンプル中のIL-1L1タンパク質、mRNAまたはゲノ
ム性DNAのそれらと比較し；さらに、vi）対象に応じて物質の投与量を変更する
段階を含む。例えば、検出されたレベルよりもIL-1L1の発現または活性レベルを
上昇させたい、すなわち、物質の効果を増強させたい場合には、物質の投与量を
増やすことが望ましい。逆に、検出されたレベルよりもIL-1L1の発現または活性
レベルを低下させたい、すなわち、物質の効果を減弱させたい場合には、物質の
投与量を減らすことが望ましい。
【０３１５】 IL-1L1治療剤の投与前および後に対象から細胞を採取してIL-1L1以外の遺伝子
の発現レベルを検出し、IL-1L1治療剤が有害な遺伝子の発現を増強または減少さ
せていないことを確認することもできる。これは例えば、転写プロファイル法な
どを用いることによって実施することができる。従って、イン・ビボ（in vivo
）においてIL-1L1治療剤に接触させた細胞由来のmRNA、および同種の細胞でIL-1
L1治療に接触させていないものに由来するmRNAを逆転写させ、さらに多数の遺伝
子から得たDNAを含むチップにハイブリダイズさせることにより、IL-1L1治療剤
処理細胞内の遺伝子の発現と非処理細胞内の遺伝子の発現とを比較することがで
きる。例えば、ある対象においてIL-1L1治療剤が癌原遺伝子の発現のスイッチを
入れる場合には、この特異的IL-1L1治療剤の使用は望ましくない。
【０３１６】４．９ IL-1L1治療剤および治療法 本発明は、インターロイキン−１の異常発現または異常活性（例えば、炎症性
疾患または自己免疫性疾患など）が関与している疾患を呈している、または発症
する可能性がある対象に対する予防および治療法を提供する。サイトカイン類で
あるインターロイキン−１（IL-1）および腫瘍壊死因子（TNF）は、炎症応答に
関する重要な指標であり、多くの慢性炎症性疾病の発生機序において中心的な役
割を担っていると考えられている。イン・ビボ（in vivo）におけるそれらの生
物学的活性は、白血球を組織に引き寄せ、活性化すること、ならびにそれらの分
泌が他の好リンパ球サイトカイン類および代謝酵素の分泌を刺激することによっ
て生じる局所炎症およびマトリックス代謝を再燃させるのに十分であることに関
しては多数の報告がなされている。これらのサイトカイン類の産生量が多いこと
は、感染に対する応答とも関連があり、局所においてIL-1およびTNFが誘導され
ることにより、微生物の侵入が誘起される。しかしながら、古典的な研究におい
ては、ある感染性状態においては、単球サイトカイン類の産生レベルが非常に高
く、このことにより、付随する一連の事象（例えば、組織代謝、血管の反応性、
宿主が受けた損傷による過度の凝固など）の発生が活性化されることが報告され
ている。
【０３１７】 例えば、サイトカイン類は発達期間を通して作用し、特に、ヒトの胎盤の発達
および機能においては重要な役割を果たしている（ジョヒ（Jokhi）ら、Cytokin
e 9: 126-137(1997)）。胎盤−子宮界面においては多様なサイトカイン類が見出
されているが、着床部位の組織局所構造が複雑であるため、それらの産生に関す
る正確な細胞内起源は確認されていない。サイトカイン類のうち、EGF、インタ
ーロイキン−１β（IL-1β）、IL-2、IL-3、インターフェロン−α（IFN-α）、
IFN-γ、腫瘍壊死因子−α（TNF-α）およびトランスフォーミング成長因子−β
１（TGF-β１）の発現については、胎盤および脱落膜から単離した細胞において
アッセイされている。さらに、サイトカインレセプター類であるIGF-1r、PDGF-r
α／β、IL-1rII、IL-6r、IL-7r、IFN-γr、TNF-rp80、ならびに胎盤細胞および
子宮細胞由来のエンドグリンは、免疫組織学的方法およびフローサイトメトリー
法によってアッセイされている。これらの研究から、ヒトの胎盤−子宮界面にお
けるサイトカインの複雑で多様な活性が明らかになった。
【０３１８】 プロ炎症性サイトカイン類であるIL-1、IL-6および腫瘍壊死因子−α（TNF-α
）は、出生前子宮内感染（IUI）および新生児の脳損傷との関連に作用している
と考えられる。さらに、母体性IUIによって満期前出産のリスクが増し、これは
すなわち、脳室内出血、新生児白質損傷およびその後に起こる脳性麻痺のリスク
が増すことに関連している（ダマン（Dammann）ら、Pediatr. Res. 42: 1-8(199
7)）。IL-1、IL-6および腫瘍壊死因子−α（TNF-α）は、IUI、満期前出産、新
生児感染症および新生児の脳損傷と関連していることが見出されている。そのよ
うなサイトカイン類が３つの関連する母体／胎児部位（子宮、胎児循環および胎
児脳）に存在すること、ならびにサイトカイン類がこれらの部位の界面（胎盤お
よび脳血管関門）を通過する能力から、出生前母胎感染による脳室内出血、新生
児白質損傷の発生におけるサイトカイン類の役割が示唆される。故に、IL-1によ
って媒介されるプロ炎症性サイトカインカスケードを阻害することにより、妊娠
中期の終わり頃に出生する子に生じる障害を阻止することができると考えられる
。
【０３１９】 インターロイキン−１β（IL-1β）は、正常な羊水内に存在しており、ヒトの
胎盤マクロファージによって産生される。妊娠中期の羊水内で検出されるIL-1β
の量は、陣痛の開始時期に比べて３倍である。IL-1βは、脱落膜および羊膜によ
るプロスタグランジン類合成の強力な刺激剤である。プロスタグランジン類のう
ちPGE2 およびPGF 2αが羊水中で高レベルを示すことは、満期前分娩および羊膜
内感染の可能性を示唆している。このことは、満期前分娩をし、組織的絨毛羊膜
炎に罹患している女性から得た羊膜が、胎盤に炎症のない女性から得た羊膜より
も多量のPGE2 を産生するという事実によって説明することができる。そのよう
なPGE2 レベルの上昇は、たとえ臨床的または準臨床的に性尿管感染がなくても
、未熟児低体重症（PLBW）と関連があり、事実、PLBW出産の大部分は起源が未知
の感染によってによって起こると考えられている。IL-1は、感染をしている場合
の陣痛の開始に最初に関与するサイトカインである。IL-1は、バクテリアの生成
物に応答し、イン・ビトロ（in vitro）においてヒトの脱落膜によって産生され
る。満期前に分娩し、羊膜腔内にバクテリアが存在している患者においては、羊
水内のIL-1の生物活性および濃度が上昇している。妊娠12日目のラットに組換え
ヒトIL-1βを注射すると、胎盤の壊死および胎児の吸収が起こった。さらに、対
照に比べて、分娩中の羊水中のIL-1βの濃度および生物活性が上昇した。またさ
らに、IL-1βは、イン・ビトロ（in vitro）において、羊膜および脱落膜による
プロスタグランジンの産生を刺激することが知られている。
【０３２０】 従って、本発明に従うIL-1L1治療剤としては、脳室内出血、新生児白質損傷お
よびその後に起こる脳性麻痺、ならびに未熟児低体重出生を含むヒト胎盤におけ
るインターロイキン−１依存性の疾患に拮抗する物質が挙げられる。
【０３２１】４．９．１ 予防法 ひとつの側面から見ると、本発明は、IL-1L1の発現もしくはIL-1L1のうちの活
性の少なくともひとつを制御する物質を対象に投与することにより、IL-1L1の発
現もしくは活性の異常が関与している疾病または状態を予防する方法を提供する
。そのような疾病のリスクを有する対象は、本明細書に記載しているような診断
または予後アッセイを用いて確認することができる。IL-1L1の異常を特徴とする
疾病または疾患から防御する、または進行を遅延させるため、予防剤の投与は、
症状を発現する前に行うことができる。IL-1L1異常の様式に応じて、例えば、IL
-1L1アゴニストまたはIL-1L1アンタゴニストを用いて予防措置を施すことができ
る。予防法は本発明の治療法と同様であり、さらに次の項でより詳しく説明して
いる。
【０３２２】４．９．２ 治療法 一般的には、本発明は、IL-1L1の活性異常が原因となっている、または関与し
ている疾病または症状を治療する方法を提供し、そのような方法は、IL-1L1活性
を制御することができる化合物の有効量を対象に投与することを含む。IL-1L1活
性の異常を含む疾病症状を緩和するために用いる方法としては、例えば、アンチ
センス、リボザイム、および上述した三重らせん分子が挙げられる。適切な化合
物の例としては、本明細書に詳述しているアンタゴニスト、アゴニストまたはホ
モログが挙げられる。
【０３２３】４．９．３ 有効投与量 そのような化合物の毒性および治療効果については、細胞培養または実験動物
などにおいて、標準的な薬物学的方法によって判断することができ、例えば、Ld 50 （集団の50％が死亡する投与量）およびEd50 （集団の50％に治療効果が認め
られた投与量）を定めることなどが挙げられる。毒性と治療効果との投与量比が
治療指数であり、LD50 /ED50 として表すことができる。治療指数が大きい化合
物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いる場合には、未感染細胞に対し
て予測される損傷を最小限に抑えるため、そのような化合物が感染組織部位に向
かうように輸送系を設計することが必要であり、それによって副作用を軽減する
ことができる。
【０３２４】 細胞培養アッセイおよび動物実験によって得られたデータをヒトに使用する投
与剤の調製に用いることができる。そのような化合物の投与量は、毒性をほとん
どまたは全く示さずにED50 を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。投
与量は、投与剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変化する。本発明にお
いて使用する任意の化合物について、まず、細胞培養アッセイを行って治療有効
投与量を確立することができる。動物モデルにおいて製剤化を行い、細胞培養に
おいて決定したIC50 （すなわち、半数において症状の阻害を起こす被験化合物
濃度）を含む範囲の循環プラズマ濃度に到達させることができる。そのような情
報を利用することにより、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定すること
ができる。例えば、高速液体クロマトグラフィーなどによってプラズマ中のレベ
ルを測定することができる。
【０３２５】４．９．４ 製剤化および使用法 本発明に従う薬剤学的組成物は、物理学的に許容される１種類またはそれ以上
のキャリヤーまたは賦形剤を用い、従来法に従って製剤化することができる。従
って、注射、吸入もしくは吸送（口または鼻から）、経口、口腔内、非経口もし
くは直腸投与などのような投与法に応じて化合物ならびに物理学的に許容される
塩および溶媒化合物を製剤化することができる。
【０３２６】 そのような治療に対しては、全身投与ならびに局所もしくは局在化投与を含む
多様な投与法に応じて、本発明の化合物を製剤化することができる。技術および
製剤化に関する一般的な事項については、レミントン（Remmington）著「薬剤学
（Pharmaceutical Sciences）」（ミード出版（Meade Publishing）社、ペンシ
ルバニア州イーストン）に記載されている。全身投与の場合は、筋肉内、静脈内
、腹腔内および皮下を含む注射が好ましい。注射用としては、本発明の化合物は
液体溶液、好ましくは、ハンクス液またはリンゲル液などのような物理的に適合
性の緩衝液を用いた溶液として製剤することができる。さらに、化合物を固形状
に製剤化し、使用直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥製剤も含
まれる。
【０３２７】 経口投与用としては、薬剤学的組成物は、例えば、薬剤学的に許容される賦形
剤を用い、従来法に従って製剤化した錠剤またはカプセル剤などの剤形にするこ
とができ、そのような賦形剤としては、結合剤（ゼラチン化する前のトウモロコ
シでんぷん、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース
など）、充填剤（例えば、ラクトース、微晶性セルロースまたは水素化リン酸カ
ルシウムなど）、光沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシ
リカなど）、崩壊防止剤（例えば、ジャガイモでんぷんまたはでんぷんグリコー
ル酸ナトリウム（sodium starch glycolate）など）、湿潤剤（例えば、ラウリ
ル硫酸ナトリウムなど）などが挙げられる。錠剤は、当該分野において既知の方
法によってコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤としては、例
えば、溶液、シロップ、懸濁液、または使用時に水もしくはその他の適切なビヒ
クルで溶解する乾燥製品などの剤形にすることができる。そのような液体製剤は
、薬剤学的に許容される添加剤を用い、従来法に従って製剤化することができ、
そのような添加剤としては、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロー
ス誘導体または食用硬化油など）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴ
ムなど）、非水性基剤（例えば、アチオンドオイル（Ationd oil）、油性エステ
ル類、エチルアルコールまたは分画植物油など）、ならびに保存剤（例えば、メ
チルもしくはプロピルヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸など）が挙げられる
。製剤には、適切な緩衝塩、香料、色素および甘味料を加えることもできる。
【０３２８】 経口投与用の製剤は、活性化合物が放出制御されるように製剤化することが好
ましい。口腔内投与の場合には、組成物は、従来法に従って製剤化した錠剤また
は舌下錠にすることができる。吸入による投与の場合、本発明に従って組成物を
使用するにあたっては、適切な噴出剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、ト
リクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはそ
の他の適切なガスなど）を用いた加圧パックまたはネブライザーからエアロゾル
スプレーとして簡便に導出することができる。加圧エアロゾルの場合には、投与
単位は、一定量を送達するように作成されたバルブによって定めることができる
。吸入器または空気吸入器において使用するゼラチンなどのカプセルおよびカー
トリッジは、組成物、ならびにラクトースもしくはでんぷんなどの適切な粉末基
剤から構成される粉末混合物を含む製剤にすることができる。
【０３２９】 組成物は、ボーラス注射または連続注入などの注射による非経口投与に用いる
ことができるように製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加し、
アンプルまたは複数回投与容器などの単位投与型にすることができる。組成物は
、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性ビヒクル中におけるエマルションなど
の状態にすることができ、さらに、懸濁剤、安定化剤および／もしくは分散剤な
どの製剤補助剤を用いることができる。別の方法としては、活性材料を粉末にし
、滅菌発熱物質不含水などの適切なビヒクルを用いて用時溶解することができる
。
【０３３０】 組成物は、坐薬または浣腸固定剤などの直腸組成物として製剤化することがで
き、そのような組成物は、カカオ脂、またはその他のグリセリド類などの従来か
ら用いられている坐薬基剤を含む。
【０３３１】 これまでに記載されている製剤に加えて、本組成物は、デポー製剤として製剤
化することもできる。そのような長時間作用製剤は、埋め込み（例えば、皮下や
筋肉内など）、または筋肉内注射によって投与することができる。従って、例え
ば、適切なポリマー性材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中エマル
ションなどとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体（例
えば、難溶性塩など）として化合物を製剤化することができる。その他の適切な
デリバリーシステムとしては、非常に長時間にわたって薬物を局所に非侵襲性送
達することができるマイクロスフェアーが挙げられる。この技術には、炎症また
は鬱血を起こすことなく心臓などの選択した任意の臓器に冠状カテーテルを介し
て注入することができる前毛細血管大のマイクロスフェアーを用いる。投与され
た治療剤はこれらのマイクロスフェアーから徐々に放出され、周囲の組織細胞（
例えば、内皮細胞など）に取り込まれる。
【０３３２】 全身性投与は、経粘膜法または経皮法によっても行うことができる。経粘膜ま
たは経皮投与用には、透過しなければならないバリアーに適した浸透剤を製剤化
の際に使用する。そのような浸透剤は一般的に当該分野において既知であり、例
えば、経粘膜投与用には胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を用いる。さらに、透
過させるために界面活性剤を用いることがある。経粘膜投与は鼻腔スプレーまた
は坐薬を用いて行うことができる。局所投与用には、本発明のオリゴマーを当該
分野において一般的に知られている軟膏、蝋膏、ゲルまたはクリームとして製剤
化する。洗浄溶液を局所に用いて傷や炎症の処置を行うことにより、回復を促進
させることができる。
【０３３３】 臨床の場においては、多数の方法の中の任意の方法（これらの方法は当該分野
においては既知である）により、IL-1L1遺伝子治療のための遺伝子デリバリーシ
ステムを患者に適用することができる。例えば、遺伝子デリバリーシステムの薬
剤学的製剤は、静脈内注射などによって全身に導入することができ、トランスフ
ェクションの特異性により、標的細胞におけるタンパク質の特異的誘導が優先的
に生じるが、このとき、トランスフェクションの特異性は、遺伝子送達ビヒクル
、レセプター遺伝子の発現を制御する転写制御配列の作用による細胞型もしくは
組織型発現、またはそれらの組み合わせによってもたらされる。別の実施態様に
おいては、組換え遺伝子の初期送達は、動物への導入が極めて局所的であること
から、より限定的なものである。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、カテーテル（
米国特許第5,328,470号を参照）または定位注入（チェン（Chen）ら、PNAS 91:
3054-3057(1994)を参照）によって導入することができる。配列番号１もしくは
４、または配列番号３もしくは３によって表されるIL-1L1のもうひとつの５’末
端、あるいはそれらに相同な配列を含む群で表される配列のうちのひとつなどの
ようなIL-1L1遺伝子は、例えば、デヴ（Dev）らによって記載（Cancer Treat Re
v 20: 105-115(1994)）された技術を用いるエレクトロポレーションによって遺
伝子治療構築体内に送達することができる。
【０３３４】 本発明の遺伝子治療構築体または化合物の薬剤学的製剤は、基本的に、許容さ
れる希釈剤中に遺伝子デリバリーシステムを有しており、または、徐放性マトリ
ックスを含んでおり、このマトリックス内に遺伝子送達ビヒクルもしくは化合物
が包埋されている。別の方法としては、レトロウイルスベクターなどの組換え細
胞から全遺伝子デリバリーシステムが完全な状態で産生される場合には、薬剤学
的製剤は、遺伝子デリバリーシステムを産生する１個またはそれ以上の細胞を含
む。
【０３３５】 所望する場合には、組成物は、活性成分を含有する１回またはそれ以上の投与
単位を含むパックまたはディスペンサー装置に充填することができる。例えば、
パックは、ブリスターパックなどのような金属もしくはプラスチックの薄層で作
成することができる。パックまたはディスペンサー装置には、投与指示を添付す
ることができる。
【０３３６】４．10 キット さらに本発明は、IL-1L1タンパク質異常関与している疾病もしくは症状の診断
もしくは予後に使用する、または、治療を行うためのキットを提供する。本発明
は、IL-1L1治療剤を対象に投与すべきか否かを判断するためのキットをも提供す
る。本発明には、生物学的サンプル中のIL-1L1 mRNAもしくはタンパク質の存在
を検出する、または、突然変異の存在、もしくはIL-1L1遺伝子内の多型領域の性
質の確認ためのキットを包含する。たとえば、そのようなキットは、生物学的サ
ンプル内のIL-1L1タンパク質またはmRNAを検出することができるラベルした化合
物または物質、サンプル内のIL-1L1量を測定する手段、ならびにサンプル内のIL
-1L1量を標準のそれと比較する手段を含む。キットには、キットを用いてIL-1L1
mRNAもしくはタンパク質を検出するための説明を含む場合もある。
【０３３７】 ひとつの実施態様においては、そのようなキットは、有効量のIL-1L1アンタゴ
ニスト治療剤を含有する薬剤学的組成物、ならびに高血圧の治療もしくは予防に
おける使用説明を含む。別の実施態様においては、そのようなキットは、有効量
のIL-1L1アゴニスト治療剤を含有する薬剤学的組成物、および虫さされの治療に
おける使用説明を含む。一般的には、キットは、有効量のIL-1L1アゴニストもし
くはアンタゴニスト治療剤を含有する薬剤学的組成物、および鎮痛剤としての使
用説明を含む。例えば、キットは、有効量のIL-1LIアゴニスト治療剤を含有する
薬剤学的組成物および鎮痛剤としての治療説明を含む。
【０３３８】 また別のキットを用い、対象がIL-1L1活性の異常が関与している疾病もしくは
症状を発現している、または発現しそうであるかを判断することができる。その
ようなキットは、例えば、IL-1L1遺伝子もしくはそれらの対立遺伝子変異体、ま
たはそれらの突然変異体の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズすることが
できる１個またはそれ以上の核酸プローブを含んでいる。
【０３３９】４．11 IL-1L1タンパク質および核酸のその他の使用法 本発明のIL-1L1核酸は、さらに、次のようなアッセイに使用することができる
。ひとつの実施態様においては、配列番号１もしくはそれらの一部を有するヒト
IL-1L1核酸、またはそれらにハイブリダイズする核酸を用い、IL-1遺伝子座内に
おけるIL-1L1遺伝子の正確な染色体局在性を確認することができる。さらに、IL
-1L1遺伝子は、IL-1L1以外の遺伝子を含む遺伝子連結に関する研究における染色
体マーカーとして用いることができる。
【０３４０】 遺伝子の染色体局在は、当該分野において既知のいくつかの方法によって示す
ことができる。例えば、サザンブロット分析または体細胞ハイブリッドのPCRマ
ッピングを用いることにより、どの染色体または染色体フラグメントに特定の遺
伝子が局在しているかを判断することができる。染色体または染色体領域におけ
る遺伝子の所在確認に関して同様に用いられるその他のマッピング法としては、
イン・サイチュー（in situ）ハイブリダイゼーション、ラベルしたフローソー
ト染色体を用いたプレスクリーニング、ならびに染色体特異的cDNAライブラリー
構築を目的とするハイブリダイゼーションによる事前選択などが挙げられる。
【０３４１】 さらに、核分裂中期の染色体に対する核酸（例えばIL-1L1核酸など）の蛍光イ
ン・サイチュー（in situ）ハイブリダイゼーション（FISH）は、一段階法によ
って行うことができ、これによって、染色体上における核酸の正確な位置が明ら
かになる。この技術は、500〜600塩基長の短い核酸に対して用いることができる
が、2000塩基対以上のより大きなクローンは、簡易検出用に十分な強度のシグナ
ルを発して染色体の特異的位置に結合する可能性が高い。そのような技術につい
ては、例えば、ヴェルマ（Verma）ら、「ヒト染色体：基本技術に関するマニュ
アル（Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques）」（ペルガモン・
プレス（Pergamon Press）社、ニューヨーク、1988年）などに記載されている。
そのような技術を用いることにより、約50〜約500個の遺伝子を含む染色体領域
における遺伝子の位置を確認することができる。
【０３４２】 IL-1L1遺伝子が特定の疾病を区別する、すなわち関連している染色体領域内に
存在していることが示された場合には、影響を受けた個体と受けていない個体と
の間のcDNAまたはゲノム配列における差異を確認する。影響をうけた個体のうち
のいくつかまたはすべてにおいて突然変異が存在しているものの、正常な個体に
おいては全く存在していない場合には、その突然変異が疾病の原因である、また
は関与している可能性が示唆される。
【０３４３】 さらに本発明は以下の実施例によって具体的に説明されるが、これらは、本発
明を限定するためのものではない。参照として引用したすべての参考文献（文献
、交付された特許、公開された特許出願を含む）の内容を本明細書中に取り入れ
ておく。
【０３４４】 本発明の実施においては、特に記載していない限り、当業者において既知であ
る細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、
組換えDNAおよび免疫学に関して従来から用いられている技術を利用する。その
ような技術に関しては、文献に十分な説明がなされている。例えば、サンブルッ
ク（Sambrook）、フリッシュ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis）編、
「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Lanoratory Ma
nual）第２版」（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press）社、1989年）；D. N. グローヴァー（Glover）編
、「DNAクローニング（DNA Cloning）」第１巻および第２巻（1985年）；M. J.
ガイト（Gait）編、「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）
」（1984年）；ムリス（Mullis）ら、米国特許第4,683,195号；B. D. ハーメス
（Hmes）およびS. J. ヒギンズ（Higgins）編、「核酸ハイブリダイゼーション
（Nucleic acid Hybridization）（1984年）；「転写および翻訳（Transcriptio
n And Translation）」（1984年）；R. I. フレッシュニー（Freshney）、「動
物細胞の培養（Culture Of Animal Cells）」（アラン・R・リス（Alan R. Liss
）社、1987年）；「不動化細胞および酵素（Immobilized Cells And Enzymes）
」（IRLプレス（IRL Press）社、1986年）；B. パーバル（Perbal）、「分子ク
ローニングに関する実験指針（A Practical Guide To Molecular Cloning）」(1
984年)；文献「酵素学における方法（Methods In Enzymology）」（アカデミッ
ク・プレス（Academic Press）社、ニューヨーク）；J. H. ミラー（Miller）お
よびM. P. カロス（Calos）編、「哺乳類細胞に対する遺伝子移入ベクター（Gen
e Transfer Vectors For Mammalian Cells）」（コールドスプリングハーバーラ
ボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、1987年）；ウ
ー（Wu）ら編、「酵素学における方法（Methods In Enzymology）」第154巻およ
び155巻；メイヤー（Mayer）およびウォーカー（Walker）編、「細胞におよび分
子生物学おける免疫化学的方法（Immunochemical Methods In Cell And Molecul
ar Biology）」（アカデミック・プレス（Academic Press）社、ロンドン、1987
年）；D. M. ウェイア（Weir）およびC. C. ブラックウェル（Blackwell）編、
「実験免疫学ハンドブック（Handbook Of Experimental Immunology）」第I巻〜
第IV巻(1986年）；「マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）」（コ
ールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laborator
y Press）社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年）などを参
照のこと。
【０３４５】 ５．実施例 ５．１ ヒトおよびマウスのIL-1L1のクローニングおよび分析 ヒトの炎症反応に関与している可能性があるインターロイキン−１遺伝子クラ
スター（ニックリン（Nicklin）ら、(1996)）内に存在する新規な遺伝子を発見
することを目的として、発明者らは、IL-1 クラスターを含む680kbのCEPH 酵母
人工染色体（YAC）クローン766E12 を産生する酵母（ノスワン（Nothwang）ら、
(1996)）を入手し、パルスフィールド電気泳動を行うことによって染色体を単離
した。モーガン（Morgan）らの記載(1992)に従い、cDNA 選択法におけるドライ
バーとして該染色体を使用した。cDNA は、10 ng/ml のホルボールミリステート
アセテートおよび100 ng/ml の大腸菌（E. coli）リポ多糖類の存在下で６時間
培養したヒト末梢血単核細胞から得た。cDNA は記載に従って増幅させ、次に、
２サイクルのアフィニティー選択を行い、さらに増幅させた後、cDNA フラグメ
ントをpNEB193 にクローニングした。ランダムに選択した100個のサンプルにつ
いて、すべてシークエンスを行った。配列を重複ユニット内に集めた。IL-1L1発
現配列タグ（EST）は、約530bpからなる連続配列を構成している３個の重複フラ
グメント（発明者らの記録ではe031 およびe049）由来の重複配列のうちのひと
つに対応していた。この配列は、既に報告されている２つのEST クローンR70089
およびR00741とも重複していることが見出された。試験を行ったところ、該配列
は、ジングリッチ（Gingrich）ヒトPAC ライブラリー由来のP1人工染色体131J6
と特異的にハイブリダイズすることが見出されたことから、ICRF ヒトP1ライブ
ラリー（ノスワン（Nothwang）ら、Genomics 41:370-378(1996)）に由来し、ICR
F 700G1305 に隣接するIL1B 遺伝子とIL1RN 遺伝子との間に位置づけられた。こ
の後者のクローンは、IL-1ra 遺伝子（IL1RN）を含む。データベースのEST 配列
内にも発明者らの新規なEST 配列内にもオープンリーディングフレームは存在し
ていなかった。
【０３４６】 EST DNA をプローブとして使用し、HGMP 由来のH9 胎盤cDNA プラスミドライ
ブラリーからcDNA を単離した。このクローンの長さは1.6kbしかなかったが、ポ
リアデニル化されており、やはりコード配列を含んではいなかった。全クローン
のシークエンスを行い、５’末端配列を用いて胎盤由来のIL-1L1 cDNA の５’末
端のプライマー依存性増幅（primer dependent amplification）を行った。生成
物の長さは約1.1kbであり、cDNA クローンの配列と重複していた。増幅反応のた
めに多数の５’プライマーのセットを使用することにより、２つの異なる非コー
ド５’末端を含むと思われる５個以上の別異の単離体（各５’末端につき少なく
とも２個の単離体）を得ており、それらは図１に示している。mRNA の推定総全
長は2.6kbと計算された。コード配列には最初の600個までのヌクレオチドが含ま
れていた。予測されるクローニングエラーを排除すると、すべてのcDNA 配列（
発明者らが全体をシークエンスしたのは３個）は同一のタンパク質をコードして
おり、このことから、リーダー配列は存在しないと考えられた。確かに、発明者
らが本明細書において報告している配列と同一のヒトのcDNA が既に報告されて
いる（ムレロ（Mulero）ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 263:702-706(199
9)；スミス（Smith）ら、J. Biol. Chem. 275:1169-1175(2000)；バスフィール
ド（Busfield）ら、Genomics 66:213-216(2000)）。
【０３４７】 IL-1L1 のゲノムのシークエンスおよびマッピング：PAC 131J6 のサブクロー
ンはXba I およびEcoR-I で切断したDNA から作出し、プライマーウォーキング
（primer walking）によってシークエンスを行った。両鎖から少なくとも一回は
良好な解析結果が得られた。IL-1L1 遺伝子は6072個のヌクレオチドからなり、
これは図１１に示している。イントロン−エクソン境界の位置は図１０のｂに示
しており、これは、既にIL-1 構造ファミリーの他の遺伝子群について記載され
ているように、IL-1RN のイントロン−エクソン境界の位置と非常に類似してい
る。PAC 131J6 由来のシークエンス済みの全セグメント（6540個のヌクレオチド
からなる、アクセッション番号AJ271338）は、エクソン１の450ヌクレオチド上
流からポリアデニル化部位の18ヌクレオチド下流までの中に６個のエクソンを含
む。最近、PAC RP11-339F22 のハイスループットゲノム配列（アクセッション番
号AC016724）もEMBL データベースに寄託された。相違を調べるために初期のデ
ータを再確認したところ、発明者らのゲノム配列は、データベースの配列と44の
位置（0.67％）において異なっていた。PAC RP11-339F22 は195kbのゲノム性挿
入体（インサート）を含んでいるが、現時点では12個の非重複フラグメント内に
おいてこの挿入体がシークエンスされている。既知のマーカーの位置（ヒルダー
ブラント（Hilderbrandt）ら、(1996) Cytogenet. Cell Genet. 73:235-239）お
よびIL-1RN 遺伝子座のうちの位置が定まっている配列を利用する目的で12個の
フラグメントのうちの11個を配置した。を配置した。制限酵素地図ならびにIL-1
L1 由来の５’および３’プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、残
りのフラグメントの位置を定め、他のフラグメントの方向を定めることができた
。故に、IL-1L1 はSTSマーカーの10H8S と131P6S との間に配置され、131P6S 方
向に転写される。IL-1RN 内の３個のギャップから示唆されるように、AC016724
から排除される配列は小さいと考えられることから、IL-1L1 のポリアデニル化
シグナルはIL-1RN の第一エクソンの５’側約53kbの位置に存在しており、２個
の遺伝子は同方向を向いていると結論づけた。発明者らのこれまでのマッピング
から、このことは、IL-1L1 とIL-1B との間に約270kbの隔たりがあることを意味
している。
【０３４８】 ヒトとマウスのIL-1Lクラスター間に断絶が生じたことから（ザヘディ（Zahed
i）ら、J. Immunol. 146:4228-4233(1991)）、種間におけるIL-1L1 転写体の相
違は、マウスIL-1L1 のエクソン６内に存在する分裂によるものであるか否かを
考察した。マウスIL-1L1 cDNA プローブを用いて129/Sv RPCI21 ライブラリー（
イオアノー（Ioannou）ら、ドラコポリ（Dracopoli）ら編、「ヒト遺伝子学に関
する最新プロトコール（Current Protocols in Human Genetics）」より、5.15.
1−5.15.24、ウィレー（Wiley）社、ニューヨーク、1996年）由来のマウスPAC
クローンについてスクリーニングを行い、３個のプラスミドを得たが、このうち
の２個がIl1rn ORFをも含んでおり、これらのことから、Il1l1 およびIl1rn が
隣接して存在しており、また、相同領域の断絶はIl1l1 とIl1rn との間よりもむ
しろIl1b とIl1l1 との間において生じるという明らかな証拠が得られた。ズー
ブロット（クロンテック（Clontech）社）のストリンジェンシーの低いハイブリ
ダイゼーションにより、真獣類のすべての種にIL-1L1 遺伝子が存在することが
明らかになった（図８）。
【０３４９】 図９は、IL-1遺伝子クラスター内のIL-1L1遺伝子座のマッピングを示している
。図９（a）は、確認されている３個の遺伝子IL1A、IL1BおよびIL1RNに対するIL
-1L1のおよその位置を示している。クラスターの全長は、CpG集団であるX、Yお
よびZに対する制限酵素位置から求められる。マーカーおよびPAC 131J6の位置は
図示している。図９（b）は、IL1RNの細胞内型第一エクソン（IL1Rnex1'）に対
するIL-1L1の第一エクソン、ならびにフランキングマーカーである10H8Sおよび1
31P6Sのより詳細なマッピングを示す。IL1RN遺伝子座由来の既知の配列の大きさ
を示している（アクセッション番号U65590）。（c）遺伝子のシークエンスから
得られたIL-1L1遺伝子内のエクソン分布。太数字は各エクソンの位置を表す。
【０３５０】 IL-1L1 mRNAの５’選択的スプライシングについて評価を行った。発明者らが
実験を行った７個の５’RACE産物のうちの６個は、明らかに別異にクローニング
されたが、これは、第一残基の差異によるものである（図１０（a））。７個の
産物は５つのグループに分けることができ、そのうちの２つは、５’末端に全く
異なる配列を有しており、別の第一エクソンに由来していると考えられた（エク
ソン１および２、図９および図１０（c）参照）。発明者らは、２つのエクソン
が、いずれもTATAAボックスを欠いた別のプロモーターを有していると予測した
。エクソン１は、16個のコドンからなるORFのフレーム外上流部を有しており（
図１０（a）に示す）、停止コドンがそれに続いている。それらの配置は、IL-1L
1の翻訳制御に適切であると考えられる。
【０３５１】 図１０は、IL-1L1転写体のスプライシングをある程度詳細に示すものである。
（a）mRNA合成においては、２種の明らかな第一エクソン（エクソン１および２
）を使用する。胎盤mRNAの５’RACEに由来する７個の別異のcDNAクローニング産
物についてシークエンスを行った。最も長いcDNA配列の出現は、稀少mRNA型（エ
クソン１開始）および一般mRNA型（エクソン２開始）の両方において確認された
。矢印はcDNA配列の開始点を示している（真の転写はAまたはGから開始されなけ
ればならないことに注意）。良好な前後関係におけるAUGを有するORFのフレーム
外上流の短い配列は、エクソン１に含まれ、さらに、翻訳されたものが１文字コ
ードとして示されている。（b）IL-1L1遺伝子のイントロン−エクソン境界を示
す。cDNA配列内の「＋１」は、コードエクソン３のはじめとして定義されている
。転写開始位置が定まっていない場合には、ゲノム配列位置は、データベース付
記事項AJ271338に記載されているゲノム配列に関して任意に定められる。「５’
フランク」および「３’フランク」は、それぞれのフランキング配列を表す。「
開始」および「終了」は、エクソンの最初および最後の塩基を示す。「エクソン
」はエクソンの番号を示す。「開始配列」および「終了配列」は、エクソンの開
始および終了の配列を示す。「cDNA」は、エクソン内にコードされているcDNA配
列を意味する。（c）ヒトIL-1L1とそれに最も近い相同体であるIL-1raとの間の
スプライス部位の保存状態を２つの遺伝子の翻訳産物を並記することによって示
す。スプライス部位の位置は、スプライスドナーとして作用する先行するの三つ
組みコドン内のヌクレオチドを表すかっこ入り上書き数字によって示されている
。
【０３５２】 図１１は、ヒトIL-1L1遺伝子の全ゲノム配列を示す。IL-1L1 cDNA配列の全長
のEMBLアクセッション番号はAJ242737およびAJ242738である。マウスIL-1L1をコ
ードしているIMAGE cDNAクローン＃332733の全配列のアクセッション番号は、AJ
250429である。ヒトIL-1L1ゲノムは図１１に示しており、アクセッション番号は
AJ271338である。
【０３５３】５．２ IL-1L1 mRNAの組織分布 IL-1L1遺伝子の発現はノーザンブロットによって確認した。IL-1L1 ORFに対応
するプローブを用い、ポリ（A）＋組織mRNAの市販ブロットを調査した。胎盤の
みが強いシグナルを発し、2.7kbおよびより弱い1.2kbのバンドが確認された（図
７（a））。胸腺には少量のmRNAが存在しているように思われた。IL-1L1の同定
に用いた最初のESTはエンドトキシンおよびPHA刺激を受けたPBMC由来であったた
め、原料の確認を行った。白血球を分画し、全RNAをIL-1L1 ORFとハイブリダイ
ズした。エンドトキシン刺激単球内およびイン・ビトロ（in vitro）で分化した
マクロファージ内において、予期した大きさのIL-1L1 mRNAがはっきりと検出さ
れた。NK細胞、リンパ球、ならびにイン・ビトロ（in vitro）において分化した
樹状細胞からは検出されなかった（図７（b））。白血球のすべてのフラクショ
ンにおいてIL-1raのより強い発現が観察された。IL-1L1 mRNAは、分化マクロフ
ァージ内で比較的強く発現していた。RT−PCRを用いることにより、ヒトの皮膚
、脳、心臓、腎臓、白血球、胎盤および脾臓においてIL-1L1 ORFの発現を検出し
たが、肝臓からは検出できなかった ノーザンブロットをIL-1L1プローブとハイブリダイズし、胎盤中の約2.7kbの
転写体に対応するmRNAが明らかになった。図７は、ヒトの組織内において検出さ
れたIL-1L1 mRNAを示す。（a）１レーンあたり５μgのポリA＋組織から単離した
RNA（クロンテック（ Clontech ）社）を用いて行ったIL-1L1 ORFのノーザンブ
ロットハイブリダイゼーション。組織としては以下のものを使用した。Pa＝膵臓
；Ki＝腎臓；Mu＝骨格筋；Li＝肝臓；Lu＝肺；Pl＝胎盤；Br＝脳；He＝心臓；Le
＝末梢血白血球；Co＝結腸；In＝腸；Ov＝卵巣、Te＝精巣；Pr＝前立腺；Th＝胸
腺；Sp＝脾臓。主要図の左の矢印は、2.6KbのIL-1L1 mRNAの位置を示している。
RNA分子量マーカーは右側に示している。上部パネルは、対照であるβ−アクチ
ンプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った後の同一ブロットの出現状
況を示す。（b）上記と同一のIL-1L1プローブを用い、細胞から単離したmRNAの
すべてを含むノーザンブロットに対してハイブリダズした。細胞としては以下の
ものを使用した。Ly+＝５μg/mlのPHAを用いて48時間刺激したリンパ球；Mc -＝
未刺激単球；MC+＝100ng/mlのLPSを用いて活性化した単球；Pm-＝未刺激PMN；Pm
+＝100ng/mlのLPSを用いて４時間刺激化したPMN；MF＝マクロファージの由来源
の血清中で６日間培養したマクロファージ；NK-＝未刺激NK細胞；NK+＝IL-2で48
時間活性化したNK細胞；DC-＝未熟樹状細胞；DC+＝成熟樹状細胞；HE-＝未刺激H
UVEC；HEI＝６nMのIL-1bを用いて４時間処理したHUVEC；HEL＝100ng/mlのLPSを
用いて４時間処理したHUVEC。画像は、ブロットを10日間露光させたものである
。続いて、炎症に応答する対照遺伝子であるIL-1raのORF、および装填対照とし
てβ−アクチンを用いてブロットをプローブした。リボゾームRNAの位置は、主
要図に示している。
【０３５４】５．３ IL-1L1ポリペプチド配列および構造の分析 IL-1L1遺伝子のタンパク質産物は、ヒトのインターロイキン−１レセプターア
ンタゴニストタンパク質と47％の残基が同一であることが予測された（図５参照
）。配列同一性に関するさらなる調査から、IMAGEデータベース（332733）のマ
ウスクローン由来の部分cDNA配列が明らかになった。ここで、マウスクローン由
来の部分cDNA配列は、ヒトIL-1L1タンパク質配列に対するマウス同級体であると
考えられる部分ポリペプチド配列をコードしている。発明者らはそのクローンを
入手し、挿入体をすべてシークエンスした。推定マウスおよびヒトのIL-1L1タン
パク質、ならびにヒトIL-1L1およびIL-1raのタンパク質の最終的な比較は図４に
示している。IMAGE cDNAもポリアデニル化されているが、３’非コード領域にお
いては、ヒトIL-1L1 cDNA配列と大きく異なっており、mRNAの長さはわずか1.2kb
であって、ヒト mRNAよりも非常に短い。これまでのところでは、マウス組織の
ノーザンブロットにおいてはIL-1L1 mRNAを検出できていない。ヒトの遺伝子に
おいては、最後の非常に長いエクソン４内において配列変化が生じている。多数
のゲノム性DNA切断物（主に哺乳類由来）のサザンブロット上においてヒトIL-1L
1特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションをストリンジェンシーを低下
させて行ったところ、試験を行ったすべての哺乳類において一本のはっきりした
相同性バンドが現れたが、酵母では現れず、ニワトリでははっきりしたシグナル
が現れなかった（図８参照）。イントロン−エクソン構造は、IL-1ファミリーの
その他の構成員のそれと類似している。
【０３５５】 ヒトIL-1L1の新規なオープンリーディングフレームを比較することにより、ヒ
トIL-1L1は、ヒトIL-1raの処理分泌型とは155残基中73残基（47％）が一致して
おり、ヒトIL-1βとは155残基中42残基（27％）が一致していることが明らかに
なった（図１３）。BLAST（アルツシュル（Altschul）ら、J. Mol. Biol. 215:
403-410(1990)）調査からも、IL-1L1のマウス同級体のORFを明らかに含んでいる
フラグメント性オープンリーディングフレーム（アクセッション番号W08205、IM
AGEクローン番号#332733に対応）が確認された。発明者らは、クローンのシーク
エンスを完全に行った。マウスORFは２個のAUGコドンから開始している。ヒト配
列との関係および類推から、２番目のAUGが開始に関与していると考えられる。
マウスおよびヒトのIL-1L1 ORFの同一性は90％である（図１３）。しかしながら
、クローン#332733は、ORFを有し、かつポリアデニル化されているにもかかわら
ず、長さはわずか1.2kbであり、その配列は、翻訳終了後の2.7kbのヒトcDNA 34n
tとは全く異なっている。逆転写およびRAW264.7マウスマクロファージ由来のmRN
AのPCRによって、マウスIL-1L1 ORFの発現を検出してはいるが、ノーザンブロッ
トハイブリダイゼーションによる長さの確認を行ってはいない。
【０３５６】 発明者らは、以下のような予測される配列（図６参照）を用いて、ヒトIL-1レ
セプターアンタゴニストタンパク質およびIL-1L1前駆体を調製し、ニッケルキレ
ートクロマトグラフィーにかけて単離し、次にイミダゾールを用いて溶出し、ト
ロンビンで処理することによって次のような推定ポリペプチドを得た。15 N＋ 1 3 Cで二重ラベルしたIL-1L1タンパク質についての核磁気共鳴予備実験から、タン
パク質はβ−シート構造様に大きく折り畳まれていることが示唆され、また、解
析結果から、その構造は、ヒトIL-1raに物理的に非常に類似していることが示唆
された。
【０３５７】 組換えIL-1タンパク質が折り畳まれていることは、詳細なNMR構造研究によっ
ても推定された。rhIL-1L1の折り畳まれ方が誤っているために生物学的に不活性
であることを確認することを目的として、rhIL-1L1の折り畳み様式を調査した。
A形およびB形の一次元1H NMRスペクトルから、十分に折り畳まれたモノマータン
パク質であることが示唆された。A形は、人工的なN−末端伸長を保有していない
場合には、多次元NMR法に用いることができるほど十分に溶解しないことが明ら
かになった。しかしながら、非解裂A形前駆体IL-1L1の一次元スペクトルは、解
裂B形（これを生物学的実験のすべてにおいて使用した）とかなり重複していた
ことから、同一のコンホメーションであることが示唆された。発明者らは、15 N
＋ 13Cで二重にラベルした非解裂A形前駆体を調製した（LH、MNおよびジョン・
ワルソ（John Waltho）、未発表データ）。α 13C−炭素のシフトが観察された
。0.7ppm以上高磁場にシフトしているα炭素のまとまりから、β−シート構造の
存在が示唆され（ウィシャート（Wishart）ら、NMR 4:171-178(1994)）、図１３
において＊で示している。これらの結果は、IL-1ra内のβ−シート残基の位置と
よく相関しており、図１３において＞で示している。処理されたB形rhIL-1L1お
よび非解裂A形は非常に類似した方法で折り畳まれており、折り畳み様式は、そ
れらに最も近似したタンパク質相同体であるIL-1raのそれと基本的に同様である
。
【０３５８】 図１３は、ヒトおよびマウスのIL-1L1配列をその他の既知のIL-1ファミリー構
成員の配列と共に並記したものである。相同性ブロックならびにIL-1βおよびIL
-1ra内に存在する保存性の構造上の特徴が保持されているように並べ方を選択し
た。IL-1raの保存性β−シートのコア領域は、配列の上の＞で示している。＊は
、13Cでラベルしたα炭素が0.7ppm以上高磁場にシフトしたIL-1L1残基を示す。
そのような残基のまとまりから、β−シート構造が示唆される。白抜きで表した
残基は、このならび内において、ヒトIL-1L1と標的配列との間で保存されている
。
【０３５９】５．４ IL-1L1抗体および免疫沈降アッセイ 上述の組換えIL-1L1抗体を用いることにより、ウサギにおいて抗体を誘起させ
ることもできる。
【０３６０】 発明者らは、絨毛癌細胞系JEG-3が本質的にIL-1L1 mRNAを産生することを示し
た。タンパク質を代謝的にラベルし、17kDaタンパク質がウサギ抗IL-1L1ポリク
ローナル抗血清と特異的に免疫沈降することを示した。IL-1L1タンパク質の発現
は免疫沈降によって検出した。栄養芽層性細胞系JEG-3（コーラー（Kohler）ら
、J. Clin. Endocrinol. 32: 683-687(1971)）は、構造的にIL-1L1の2.7kbのmRN
Aを有するものと考えられ（図１２（a））、このことは、胎盤、絨毛の主要な細
胞性構成要素がIL-1L1を発現す場合には、予測されることである。ウサギにおい
て、組換えヒトIL-1L1（rhIL-1L1）に対する特異的ポリクローナル血清を誘起さ
せた。JEG-3を代謝的にラベルし、細胞溶解物を調製した。免疫沈降から、17kDa
のタンパク質の移動度に相当する特異的放射活性バンドが明らかになり（図１２
（b）のレーン３〜５）、対照である全血清では同様の生成物は免疫沈降しなか
った（図１２（b）のレーン１）。抗体とrhIL-1L1を事前に競合させることによ
り、17kDaのバンドの免疫沈降を阻害したことから、さらに、これが内在性IL-1L
1タンパク質であることが示唆された（図１２（c）のレーン１と２、ならびにレ
ーン５と６を比較すること）。IL-1raタンパク質とは異なり、IL-1L1はN−グリ
コシル化シグナルを欠いており、内在性タンパク質の移動度を大腸菌（E . coli
）において調製した材料のそれと比較すると一致していることから、変形されて
いないことが確認された。
【０３６１】 図１２は、JEG-3細胞由来の天然型IL-1L1タンパク質の免疫沈降を示す。（a）
JEG-3細胞内の構成性IL-1L1 mRNAの検出。IL-1L1 ORFのcDNAプローブを用い、２
×107 個のJEG-3細胞から選択したポリA＋RNAのノーザンブロットを行った。矢
印は2.7kbのmRNAを示す。RNA分子量マーカーの位置は左に示す。（b）代謝的に
放射ラベルした細胞の抽出物に関する免疫沈降。沈降に用いた材料は、レーン１
＝20μlの無関係な抗血清；レーン２＝血清なし；レーン３＝５μlの抗IL-1L1抗
血清；レーン４＝10μlの抗IL-1L1抗血清；レーン５＝20μlの抗IL-1L1抗血清。
タンパク質分子量標準の移動度は左に示す。図の右の矢印はIL-1L1タンパク質の
バンドと思われるものを示す。このバンドの免疫沈降は、rhIL-1L1を用いて抗体
をブロックした後は観察されなかった。（c）JEG-3細胞からIL-1L1が分泌されて
いることの証拠。細胞溶解物（レーン１〜４）および上清（レーン５〜８）につ
いて免疫沈降を行った。沈降に用いた材料は、レーン１および５＝40μlの抗IL-
1L1抗血清；レーン２および６＝20μgのrhIL-1L1を用いて事前にブロックした20
μlの抗IL-1L1抗血清；レーン３および７＝無関係な血清；レーン４および８＝
血清なし。ゲルを部分的に示す。矢印はrhIL-1L1の移動位置を示す。上清には、
細胞に関連したTCA沈降可能な総放射活性量のわずか15%しか含まれていなかった
。
【０３６２】５．５ IL-1活性を測定するための細胞に基づくIL-1L1アッセ イ IL-1L1がIL-1様シグナルに与える影響について、簡便なアッセイを用いて調査
し、IL-1に良好かつ直接応答するサイトカインの一種であるIL-6の産生に及ぼす
効果を測定した（ジルバーステイン（Zilberstein）ら、EMBO J. 5:2529-2537(1
986)）。大腸菌（E . coli）内において、３つの型のIL-1L1が、６Hisタグ付け
組換え融合タンパク質として産生され、これをトロンビンで切断して（スミス（
Smith）ら、Gene 67: 31-40(1988)）、所望するタンパク質を得た。A型は、開始
Metコドンを欠いており、Gly-Ser-Ser−に置き換えられていた（図６参照）。N
−末端の正確な性質が重要である場合には、Met1を含むB型およびVal2から始ま
るC型も作出した（図６参照）。比較のため、IL-1raを調製して同様に単離し、
最初の２個の解裂後残基であるPro-Lys−を除去し、さらにGly-Ser-Serを付加す
るという変形も行った。３つの型のIL-1L1のすべてについて、一次繊維芽細胞を
刺激してIL-6を分泌させるというIL-1様活性について予備実験を行い、分泌され
たIL-6はELISAによって検出した。B型IL-1L1が繊維芽細胞および内皮細胞に及ぼ
す影響について詳細な実験を行った。IL-1L1が0.1μM以下の場合、活性は、0.1n
MのIL-1βのそれの１％未満であった。これらのデータから、IL-1L1のIL-1様活
性の上限は１／105以下である。
【０３６３】 同様の系を用い、IL-1L1の活性はIL-1raとも比較した。初期投与量応答実験（
データは示していない）から、10nMのIL-1raタンパク質は、0.1nMのIL-1βに応
答して繊維芽細胞から産生されるIL-6の量を95％以上削減することが示された。
再度３つの型のIL-1L1のすべてについて予備実験を行った。次に、0.1μMのIL-1
raまたはIL-1L1を用い、10nMのIL-1αまたはIL-1β（R&Dシステムズ（R&D Syste
ms）社）と競合させた。B型のIL-1L1をIL-1raと比較する詳細な実験を再度行っ
た。IL-1raは、IL-6の産生を完全に排除したが、IL-1L1は、いずれの型のIL-1活
性に対しても再現性のある強力な効果は示さなかった。繊維芽細胞からのIL-6放
出量が若干、目立たない程度に減少したが、１μMのIL-1L1を用いて行った予備
実験では減少幅が大きくならなかった。IL-1L1はレセプターアンタゴニストでは
ないと結論づける前に、上述のIL-1L1発現ベクターを用いてトランスフェクトし
たCOS-7細胞の上清を用いて実験を行ったが、この細胞は、より自然に処理され
たタンパク質の産生源であると考えられた。実験は同時に２回行ったが、繊維芽
細胞に対する0.1nMのIL-1βによるシグナリングに関して、約20nMのCOS産生IL-1
L1（細胞コンディションドメディウムについてウェスタンブロットを行って測定
した）が及ぼす効果は全く検出することができず、如何なるアゴニスト効果も観
察されなかった。対照実験には、からのベクターを用いてトランスフェクトした
細胞由来のコンディションドメディウムを使用した。20μMのIL-1raはIL-1βの
影響を排除することが見出された。故に、発明者らは、IL-1L1はIL-1系に直接影
響を及ぼさないという結論に達した。
【０３６４】 IL-18系におけるrhIL-1L1の活性をヒト骨髄単球性細胞系KG-1を用いて試験し
たが、このKG-1系は、IL-18刺激に応答してIFNgを産生することが報告されてい
る（コニシ（Konishi）ら、J. Immunol. Methods 209: 187-19(1997)）。発明者
らは、細胞にIL-18による刺激を与える前に、PHAを用いて２時間刺激をする変形
アッセイを用いた。B型rhIL-1L1について、IL-18様アゴニストとしての作用およ
びアンタゴニストとしての作用を調べた。PHA単独の場合に比べ、PHAおよびIL-1
8の存在下においては、細胞のIFNg産生は３〜５倍に増加した。さらに、IL-18に
対するモノクローナル抗体と比較した場合には、rhIL-1L1は、この系におけるIL
-18の効果を阻止することができなかった。PHA単独での細胞刺激において0.1μM
のIL-1L1を添加すると、細胞からのIFNg産生が若干減少することに気付いた。IL
-18アッセイは、IL-1アッセイに比べると感度が低く、変動が大きいが、これら
の結果から、IL-1L1はIL-18系に対しても直接作用していないことが示唆された
。
【０３６５】 次に、繊維芽細胞上のIL-1L1レセプターの存在についてアッセイを行った。繊
維芽細胞上のIL-1レセプター存在度は非常に低い。IL-1L1に対する生物学的応答
が存在しないことはレセプターの不在によるものか否かを調べることを目的とし
て、IL-1L1およびIL-1ra（対照）用に非常に感度の高い結合アッセイを開発する
必要性があった。トロンビン解裂後、GSSGLRRA* SLGSS（ここで、＊は、タンパ
ク質キナーゼAのための基質であるセリン残基を示す）というN末端伸長を行って
IL-1L1およびIL-1raを調製した。２個の伸長タンパク質は、KA-IL-1raおよびKA-
IL-1L1と名付けた。KA-IL-1raは、処理された分泌型タンパク質の最初の２個の
残基を欠いていた（生物学的実験において用いた機能性rhIL-1raと同様）。KA-I
L-1L1は開始メチオニンを欠いていたのみであった。タンパク質キナーゼA（ニュ
ーイングランド・バイオラブズ（New England BioLabs）社）を用いてこれらの
タンパク質をリン酸化し、特異活性を上げた（１〜２×1017 Bq/mol）。繊維芽
細胞について行った一連の３回同時実験において、KA-IL-1raの結合が0.1μMのI
L-1raによって競合されることを示すことができた。一般的には、特異的結合は
、約100Bq／４×104 個、または１細胞あたり約2000レセプター（従来確立され
ている細胞系において）であった。比較を行ったところ、繊維芽細胞上にはKA-I
L-1L1に対するレセプターは検出されなかった（１細胞あたり200レセプター未満
）（データは示していない）。
【０３６６】５．６ COS細胞内における組換えIL-1L1の発 現 発明者らは、IL-1L1 mRNAの本来の翻訳開始部位を用い、哺乳類細胞内におい
て組換えヒトIL-1L1を産生した。SV40プロモーターおよび合成性イントロンの下
流に1.4kbのIL-1L1 ５’RACE cDNAを融合させ、さらに、SV40のポリアデニル化
シグナル（pSG5、ストラタジーン（Stratagene）社）を連結した。この構築体を
用いてトランスフェクトしたCOS7細胞から目的の大きさのタンパク質を得た。同
一の抗IL-1L1抗血清を用いて行った細胞溶解物および上清のウェスタンブロット
分析（データは示していない）から、17kDaの特異的タンパク質の存在が示され
（トランスフェクトを行っていないサンプル中には存在しなかった）、その存在
量は、細胞質フラクションに比べて上清フラクションが３倍以上であった。この
ことは、IL-1ファミリーの他の構成員と同様に、IL-1L1が通常とは異なる分泌経
路を有することを示唆している。発明者らは、培養したJEG-3細胞の細胞境界フ
ラクションおよび上清フラクション中に内在性IL-1L1が検出されたことによって
この知見を確認した。上述したように細胞を代謝的にラベルし、免疫沈降によっ
て上清画分と細胞質画分とを比較した。図１２（c）から、JEG-3の細胞溶解物と
比較して、上清中のTCA沈降可能な放射活性は総活性の15％以下であるにもかか
わらず、上清中には実質的により多量のIL-1L1が存在しており、このことは、IL
-1L1が細胞から選択的に放出され、シグナルとは無関係な分泌経路が存在するこ
とを示唆している。
【０３６７】 一般的には、シグナル配列を欠くヒトIL-1L1タンパク質の全長または可溶性IL
-1L1タンパク質をコードしている核酸を含む発現構築体は、次のようにして構築
することができる。上述したヒトIL-1L1タンパク質の全長または可溶性IL-1L1タ
ンパク質をコードしている核酸は、ヒト細胞から抽出したmRNAの逆転写（RT-PCR
）によって得ることができる。PCRプライマーはさらに、発現プラスミド内に導
入するするための適切な制限酵素部位を含む。次に、増幅した核酸をpcDNAI/Amp
（インヴィトロジェン（In Vitrogen）社）などの真核細胞性発現プラスミドに
挿入した。そのようなプラスミドは、１）SV40の複製起点、２）アンピシリン耐
性遺伝子、３）大腸菌（E . coli）の複製起点、４）CMVプロモーターおよびそ
れに続くポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。
次に、すでに記載されているインフルエンザ赤血球凝集タンパク質由来のエピト
ープに対応するHAタグのポリリンカー領域にヒトIL-1L1の全長、ならびにフレー
ムの３’末端に融合したHAタグもしくはmycタグをコードしているDNAフラグメン
トをクローニングした（I. ウィルソン（Wilson）、H. ニーマン（Niman）、R.
ハイテン（Heighten）、A. チェレソン（Chereson）、M. コノリー（Connolly）
およびR. ラーナー（Lerner）、Cell 37, 767(1984)）。HAタグをIL-1L1に融合
させることにより、HAエピトープを認識する抗体を用いて組換えタンパク質を容
易に検出できるようになった。
【０３６８】 組換えIL-1L1の発現に関しては、DEAE-DEXTRAN法（J. サンブルック（Sambroo
k）、E. フリッシュ（Fritsch）、T. マニアティス（Maniatis）、「分子クロー
ニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、コ
ールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laborator
y Press ）社、1989年）により、発現ベクターを用いてCOS細胞をトランスフェ
クトした。IL-1L1-HAタンパク質の発現は、抗HA抗体を用い、放射ラベルおよび
免疫沈降によって検出することができる（E. ハーロウ（Harlow）、D. レーン（
Lane）、「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、
コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laborat
ory Press ）社、1988年）。この検出のためには、細胞をトランスフェクト後、 35 S−システインを用い、２日間かけてラベルした。次に、細胞または別の方法
とししては培養培地（例えば、可溶性IL-1L1の場合など）を回収し、HA特異的モ
ノクローナル抗体を用いてIL-1L1を免疫沈降した。IL-1L1の全長が膜タンパク質
であるのか、および／または分泌タンパク質であるのかを判定することを目的と
して、IL-1L1タンパク質の全長をコードしているベクターを用いてトランスフェ
クトした細胞を界面活性緩衝液（RIPA緩衝液：150mMのNaCl、１％のNP-40、0.1
％のＳＤＳ １％のNP-40中、0.5％のDOC、50mMのTris、pH7.5）（I. ウィルソ
ン（Wilson）ら、同上、37: 767(1984)）で溶解した。次に、沈降したタンパク
質をSDS-PAGEゲルで分析した。従って、細胞内にIL-1L1が存在することは、IL-1
L1の全長が膜結合性であることを示唆しており、上清にIL-1L1が存在することは
、分泌タンパク質として産生されたかまたは細胞からの漏出によって放出された
かのいずれであっても、タンパク質が溶解型をもとり得ることを示唆している。
【０３６９】５．７ 材料および方法 新規な転写体の同定：100ng/mlの大腸菌（E . coli）リポ多糖および100μg/m
lのPHAを用いてPMBCを６時間または18時間刺激した。処理および混合後、RNAを
調製した。基本的には記載（モーガン（Morgan）ら、Nucleic Acids Res. 20: 5
173-5179(1992)；フュートリアル（Futreal）ら、Hum. Mol. Genet. 3: 1359-13
64(1994)）に従い、ドライバーとして680kbのYAC 766E12（CEPH（パリ）から入
手）（チュマコフ（Chumakov）ら、Nature 377: 175(1995)）を用い、２回の液
層ハイブリダイゼーションを行ってcDNAを選択した。100個のクローンを別異に
シークエンスした。多コピーエレメント（high copy-number elements）を含む
配列を除去した。
【０３７０】 cDNAおよびゲノム性DNAライブラリー：ヒトのゲノム性PACクローン131J6につ
いては記載がある（ノスワン（Nothwang）ら、Genomics 41: 370-378(1997)）。
ヒト胎盤cDNAライブラリーH9（pCDM8の一次融合混合物）はリソースセンターHGM
P（イギリス、ケンブリッジ）から入手した。マウスPACクローンは、IMAGEクロ
ーン#332733（レノン（Lennon）ら、Genomics 33: 151-152(1996)）由来の1.2kb
のマウスIL-1L1 cDNAプローブを用いてグリッドマウス（gridded mouse）129 PA
Cライブラリー（RPCI21）をスクリーニングした後、リソースセンターHGMP（イ
ギリス、ケンブリッジ）から入手した。
【０３７１】 cDNAクローンの単離：標準的な手法に従い、SETクローン由来の474bpのプロー
ブ（エクソン６のゲノム性配列（図２）のヌクレオチド番号5902番〜6369番）を
用いてヒトH9 cDNAライブラリーから約５×105 個のコロニーをスクリーニング
した。２個のクローンの同種性について確認、スクリーニングを行い、ほぼ同じ
大きさの挿入体を有することを見出した。
【０３７２】 cDNAの５’伸長：一本目のcDNA鎖は、MMLV−逆転写酵素およびオリゴ（dT）プ
ライマーを用い、胎盤のmRNAから調製した。二本目の鎖の合成は、メーカー（マ
ラソンRACE（Marathon RACE）、クロンテック（ Clontech ）社）の指示に従っ
て、大腸菌（E . coli）のDNA ポリメラーゼI、RNase Hのカクテルを用いて行い
、さらに、大腸菌（E . coli）のDNAリガーゼおよびcDNAアダプターを連結した
。５’RACEは、アダプター特異的プライマーおよびゲノム性配列の5295番〜5270
番に相補的な遺伝子特異的プライマーを用いて行い（68℃で30サイクル）、次に
、アダプター重複プライマー（adapter nested primer）およびヌクレオチド番
号5273番〜5244番に対応するプライマーを用いて重複PCR（nested PCR）を行っ
た（60℃で20サイクル）。1.4kbの５’RACE生成物をpCRIIベクター（インヴィト
ロジェン（Invitrogen）社）に直接クローニングし、特異的オリゴヌクレオチド
プライマーを用いてシークエンスした。
【０３７３】 ノーザンブロット分析：ヒトの複数組織ブロットはクロンテック・ラボラトリ
ー（Clontech Laboratory）社から購入したが、これは、各レーンに５μgのmRNA
を含んでいる。JEG-3細胞からmRNAを単離することを目的として、２×107 個の
細胞をRNAzol B（バイオジェネシス（Biogenesis）社）に加えてホモジナイズし
、メーカーの指示に従って抽出した。オリゴ（dT）−セルロース・タイプ３（プ
ロメガ（Promega）社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行って総R
NAからJEG-3 ポリ（A）＋RNAを単離した。標準的な濃度−遠心分離プロトコール
（コロッタ（Colotta）ら、J. Immunol. 132: 936-944(1984)；ベルターニ（Ber
tani）ら、Blood 74: 1811-1816(1989)）に従って白血球を分画した。NK細胞は
、PBMCからCD3+細胞およびCD14+細胞を除去することによって得た。樹状細胞は
、単球をGM-CSFおよびIL-4で７日間処理することによって得た（ソザーニ（Sozz
ani）ら、J. Immunol. 159: 1993-2000(1997）。機能的成熟は、TNF、IL-1βま
たはLPSを用いて３〜４時間刺激することによって進行した。グアニジンチオシ
アネート法に従って白血球から総RNAを調製した。1.2％のホルムアルデヒド／ア
ガロースゲル中における電気泳動によってRNAを解析し、電荷ナイロン膜（ゼー
タ−プローブ（Zeta-Probe）、バイオラド（ Biorad ）社）に移した。IL-1L1 O
RFに対応するcDNAプローブを用いたハイブリダイゼーションによってIL-1L1 mRN
Aを可視化した。
【０３７４】 組換えタンパク質の調製：rhIL-1L1のA型、B型およびC型、rhIL-1ra、KA-IL-1
L1ならびにKA-IL-lraは、変形pETプラスミドからBL21（DE3）細胞内において6-H
isタグ付け組換えタンパク質として発現させたが、これは、タンパク質のN末端
、フレキシブルリンカーおよびトロンビン解裂部位に6-Hisタグを加えたもので
ある。バクテリアは記載（スチュディアー（Studier）ら、Methods Enzymol. 18
5:60-89(1990)）に従って培養し、冷却後、0.5mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド（IPTG）を用いて誘導し、25℃で18時間振とうした。回収し
たバクテリアを100mMのNaCl／20mMのTris／HCl pH7.3 ／10％のグリセロール（
緩衝液A)に再懸濁し、１mMのフェニルメタンスルホニルフルオライドを添加して
超音波破砕した。溶解液は600,000×ｇで20分間遠心分離し、1000mlの培養液か
ら得た6-Hisタグ付けタンパク質は、5mlのNi-NTAアガロースカラム（キアゲン（
Quiagen）社）を用いてアフィニティー精製した。カラムは、50mlの緩衝液A、続
いて50mlの緩衝液A／20mMのイミダゾールを用いて洗浄し、タグ付けタンパク質
は最少量の緩衝液A／100mMのイミダゾールで溶出させた。タンパク質は、トロン
ビン（融合タンパク質１mgあたり３ユニット）を用い、30℃で４時間かけてタン
パク質を切断し、緩衝液A／２mMのジチオスレイトールを用いたセファデックスG
-75（Sephadex G-75）によるゲルろ過によってN−末端フラグメントから分離し
た。最初は、LPSに由来する混入物が存在する可能性があったため、ポリミキシ
ンB−アガロースカラム（シグマ（ Sigma ）社））を用いたアフィニティー精製
によってタンパク質サンプルからLPSを除去した。後には、LPSに由来する顕著な
影響が検出されなかったことから、この最後の精製過程は行わなかった。純度は
ゲル電気泳動によって確認し、濃度は、タンパク質のアミノ酸組成用に調製した
A280の測定から計算した。おそらく、β分岐Val残基に由来する立体障害のため
に、rhIL-1L1のC型の調製において痕跡量の未切断材料が存在しており、また、K
A-IL-lL1においてさらなるC−末端処理産物の徴候が認められた以外は、精製タ
ンパク質は同一であると考えられた。
【０３７５】 抗IL-1L1血清の産生：垂耳矮小ウサギに150μgのrhIL-1L1のA型をフロインド
アジュバントとともに４週間間隔で５回投与した。IL-1L1を用いた酵素標識免疫
吸着測定法（ELISA）によって血清サンプルを調べた。
【０３７６】 JEG-3細胞の代謝的ラベリングおよび免疫沈降：75cm2 の培養ボトル中の細胞
（80％融合）を等張性生理食塩水で洗浄し、システイン／メチオニン不含MEM（
ライフテクノロジーズ（Life Technologies）社）／１mMのグルタミン／１mMの
ピルビン酸ナトリウム／0.5％のウシ血清アルブミン中に入れて37℃で１時間放
置した。その後、50mCi/mlの（35 S）−システイン／メチオニン（プロミックス
（Promix）、NENライフサイエンシーズ（NEN Life Sciences）社）を添加した5m
lの新鮮培地を加え、４時間インキュベートした。さらに50mCi/mlの（35 S）−
システイン／メチオニンを添加し、20時間インキュベートを続けた。培地を回収
した。図１２の（b）においては、プロテアーゼインヒビターカクテル（ベーリ
ンガー・マンハイム）社）を含む1.0mlのRIPA緩衝液（100mMのNaCl／50mMのTris
/HCl pH8.0／１％のNonidet P-40／0.5％のデオキシコール酸ナトリウム／0.1％
のドデシル硫酸ナトリウム）中で細胞を洗浄、溶解し、次に、４℃、13000×ｇ
で遠心分離を行い、細胞の微細残渣を除去した。20μｌ（充填容量）のプロテイ
ンA−セファロース（Protein A-Sepharose）ビーズ（シグマ（ Sigma ）社）を
用い、0.5mlのサンプル中の細胞溶解液を４℃、１時間かけて予備洗浄し、試験
血清を加えて４℃でゆっくり振とうしながら24時間インキュベートし、その後、
20μｌのプロテインA−セファロース（Protein A-Sepharose）を加えてさらに４
時間インキュベートした。固体マトリックスを回収し、RIPA緩衝液を用いて４回
洗浄し、その後、60μｌのサンプル緩衝液に再懸濁し、100℃で２分間加熱した
。30μｌのサンプルをゲル電気泳動による解析に使用した。図１２（c）におい
ては、方法は基本的には同じであるが、2.5mlの細胞上清または2.5mlのRIPA緩衝
液で溶解した細胞を用いた。
【０３７７】 ヒト細胞中のIL-1L1がIL-1様、IL-1ra様およびIL-18様活性を有する可能性に
ついての調査：ヒトの歯肉繊維芽細胞を24ウェル組織培養プレートに入れ（２×
104 個／ウェル）、10％のウシ胎児血清添加DMEM中で24時間増殖させた。ヒト臍
静脈内皮細胞（TCSバイオロジカルズ（TCS Biologicals）社）を24ウェル組織培
養プレートに入れ、メーカーの指示に従い、80％コンフルエントの状態にになる
まで増殖させた。適量のIL-1α、IL-1β（R&Dシステムズ（R&D Systems）社）、
rhIL-1raまたはrhIL-1L1（上記に従って調製したもの）を添加した新鮮培地を用
いて細胞を24時間刺激した。事前に行った実験（データは示していない）から、
IL-6の分泌を十分に活性化するためにはいずれのIL-1も0.1nMの濃度が適切であ
ることが示されていたが、10nMのIL-1raは、0.1nMのIL-1に対する応答を95％以
上減弱させた。IL-6の産生は、メーカー（R&Dシステムズ（R&D Systems）社）の
指示に従い、アッセイの直線領域内においてELISAによって測定した。同様の実
験においてIL-6の産生が日によって変動することについては（細胞密度またはIL
-1種の活性のわずかな変化によるものであると思われる）、同一の実験において
作成したIL-1処理ウェルパネルからの平均産出量に対して各データーの組を標準
化することによって補正した。多数回の実験を通して観察されたIL-1単独で処理
した繊維芽細胞培養物の１ウェルあたりのIL-６産生量の変化は、IL-1αおよびI
L-1βに関しては７〜30ng/mlであり、内皮細胞における変化は1.3〜7.0ng/mlで
あった。
【０３７８】 KG-1細胞（ATCC CCL-246）を１×106 個／mlとなるように24ウェル組織培養プ
レートに入れ、このとき、培地としては20％のウシ胎児血清を加えたイスコーヴ
変形ダルベッコ培地（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）社）を用い
、50mg／mlのPHA（シグマ（ Sigma ）社）を含んだ、または含まない条件下で２
時間放置した。PHA単独またはIL-18（３nM）および／もしくはIL-1L1（0.1μM）
と共に用いて48時間細胞を刺激した。IL-18によってIFNgの産生が増加したこと
を示すことを目的として、いくつかの試験においては、中和抗IL-18抗体（50μg
／ml、R&Dシステムズ（R&D Systems）社）を添加した。刺激時間終了後、900×
ｇで５分間上清を遠心分離し、細胞を除去した。IFNgの産生はELISA（バイオソ
ース（Biosource）社）によって測定した。PHAおよびIL-18で刺激した同一実験
内の４ウェルにおける平均産生量に対してデータの組を標準化した。４ウェルで
行った２回に実験において、PHA／IL-18刺激細胞が産生したIFNg量の範囲は2.3
〜10.8i.u./mlであった。
【０３７９】 等価性 当業者であれば、通常の実験を行うだけで、本明細書に記載されている特定の
実施態様と等価な態様が存在することを認識し、確認することができるはずであ
る。そのような等価な態様も本出願の請求項に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ２種の５’末端を有する２つのヒトIL-1L1のcDNA の核酸配列
【図２】 マウスIL-1L1のcDNA 配列の核酸配列
【図３】 ヒトIL-1L1およびマウスIL-1L1によってコードされている推定ポリペプチド配
列
【図４】 ヒトおよびマウスのIL-1L1のポリペプチド配列の比較
【図５】 ヒトIL-1L1のポリペプチド配列およびヒトのプロ−IL-1ra ポリペプチド配列
の比較
【図６】 IL-1L1遺伝子生成物の３種の組換え体のポリペプチド配列
【図７】 ヒトIL-1L1の伝達暗号の組織分布を示すノーザンブロット
【図８】 哺乳類中のIL-1L1遺伝子配列の保存性を示すズーブロット
【図９】 ヒトの２番染色体におけるIL-1遺伝子座内のIL-1L1遺伝子の染色体位置、なら
びにIL-1L1遺伝子のイントロン／エクソン構造
【図１０】 IL-1L1転写体のスプライシングの詳細
【図１１】 IL-1L1遺伝子の全ゲノム配列
【図１２】 JEG-3 細胞由来の天然型IL-1L1タンパク質の免疫沈降
【図１３】 ヒトおよびマウスのIL-1L1遺伝子とヒトにおけるその他のIL-1 様遺伝子ファ
ミリーとの並記 １）外国語書面の明細書第３頁第１行から第３頁第２９行まで、第５頁第８行か
ら第１１頁第１９行まで、第１３頁第２３行から第１１２頁第１８行まで、第１
１４頁第２５行から第１２７頁最終行までの各部分の翻訳が欠落していたので、
補充して誤訳訂正する。 ２）外国語書面の請求の範囲第１２９頁第１行から第１３０頁最終行までの部分
の翻訳が欠落していたので、補充して誤訳訂正する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 11/00 13/12 13/12 17/00 17/00 17/14 17/14 19/10 19/10 29/00 29/00 31/00 31/00 37/02 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ＺＮＡ Ａ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA26 CA04 CA11 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4C084 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 DA12 NA14 ZA402 ZA592 ZA662 ZA672 ZA812 ZA892 ZA922 ZA972 ZB072 ZB112 ZB322 ZC352 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA03 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】単離されたポリペプチドであって、配列番号５または６に示す
    ポリペプチド配列との同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を含む少なく
    とも50個のアミノ酸から構成されることを特徴とするポリペプチド。
  2. 【請求項２】単離されたポリペプチドであって、配列番号５または６に示す
    ポリペプチド配列との同一性が少なくとも80％であるアミノ酸配列を含む少なく
    とも30個のアミノ酸から構成されることを特徴とするポリペプチド。
  3. 【請求項３】単離されたポリペプチドであって、配列番号５または６に示す
    ポリペプチド配列との同一性が少なくとも90％であるアミノ酸配列を含む少なく
    とも20個のアミノ酸から構成されることを特徴とするポリペプチド。
  4. 【請求項４】単離されたポリペプチドであって、配列番号５または６に示す
    ポリペプチド配列と同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも10個のアミノ酸か
    ら構成されることを特徴とするポリペプチド。
  5. 【請求項５】単離されたポリペプチドであって、配列番号10もしくは11に示
    す全ヌクレオチド配列またはそれらと相補的なヌクレオチド配列との同一性が少
    なくとも70％である核酸によってコードされていることを特徴とするポリペプチ
    ド。
  6. 【請求項６】単離されたポリペプチドであって、ストリンジェント条件下に
    おいて、配列番号１のヌクレオチド番号310〜2561に対応する核酸配列、配列番
    号１のヌクレオチド番号１〜29に対応する核酸配列、配列番号２、配列番号３、
    および配列番号４のヌクレオチド番号390〜1284に対応する核酸配列を含む群か
    ら選択される核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされていることを特
    徴とするポリペプチド。
  7. 【請求項７】配列番号５または６に示す全アミノ酸配列との同一性が少なく
    とも70％であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５または請求項６記
    載の単離されたポリペプチド。
  8. 【請求項８】哺乳類の核酸配列によってコードされていることを特徴とする
    請求項１から請求項６いずれか１項記載の単離されたポリペプチド。
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