JP2003523233A

JP2003523233A - ブタ内因性レトロウイルスの伝達を欠くブタおよびその用途

Info

Publication number: JP2003523233A
Application number: JP2001554062A
Authority: JP
Inventors: ペイシェンス，クライブ
Original assignee: バイオトランスプラント，インコーポレイテッド
Priority date: 2000-01-19
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2003-08-05
Also published as: AU3099801A; US20050216964A1; US6867347B2; EP1250594A4; WO2001053825A1; US20020010948A1; CA2397931A1; EP1250594A1

Abstract

(57)【要約】そのゲノムがブタ内因性レトロウイルス遺伝子の特有の配列を含むが、ヒトには非感染性であるミニチュアブタが、ヒト患者へ導入される器官、組織および細胞の源として開示される。前記ヒト患者は、不適切に機能する器官の存在を伴うために、疾病に悩みまたは疾病のリスクにある。前記器官、組織および細胞の前記ヒト患者への異種移植は、緩和効果を持つであろう。このような動物を産生しまた望ましい性質のために動物を検査する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本出願は２０００年１０月２７日出願された合衆国暫定特許出願番号６０／２
４３６９５号、２０００年２月１６日出願された合衆国暫定特許出願番号６０／
１８２９６５号および２０００年１月１９日出願された合衆国暫定特許出願番号
６０／１７７００３号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに
組み込まれている。

【０００２】本発明は、ヒト細胞に感染するウイルスに寄与する可能性のあるブタ内因性レ
トロウイルス（ＰＥＲＶ）配列を持たない近交系ブタ、前記ブタからヒトへの器
官の異種移植の方法、ヒト親和性内因性レトロウイルス成分からの免除、言い換
えればヒトへの感染の免除を確実にするために高い厳密性を持って前記ブタを検
査する方法および前記ブタの生産方法に関する。

【０００３】

【発明の背景】

器官移植は末期器官疾病に対して確立された処置である。しかし、移植に利用
できる器官は世界的に不足している。アメリカ合衆国内だけで、現在おおよそ６
０，０００人の人が器官移植を待ち、毎年４，０００人が移植の前に死亡してい
る。移植は、利用できる提供者移植片の制限された型および数に基づいて人為的
に強制された移植希望者リストに従って行うことができる〔１〕。器官移植の恩
恵を受けることができる更に多くの患者がリストに記載されていない。異種移植
、ヒトへの移植における動物器官および細胞の使用はこの不足を軽減する可能性
を持つ〔２〕。提供者としてヒト以外の霊長類を使用するといういくつかの考慮
がすでに得られているが、現在はブタが、実地試験の数、経済的、倫理的理由に
より、異種移植のために選択された動物として受け入れられている〔２〕。

【０００４】本発明は、異種移植用に好ましくはミニチュアブタを、また好ましくはＭＨＣ
（主要組織適合抗原複合体）遺伝子座が近交系であるブタを提供することにより
、異種移植の問題を解決する。本発明に従って、ミニチュアブタがここで用いる
ために選択された。ミニチュアブタは幾つかの魅力的な性質を示すからである。
家畜ブタのように、ミニチュアブタは４−５ヶ月齢で性成熟し、多数の子孫を産
む（同腹子当り３−１０子）。加えてミニチュアブタは３週毎の発情サイクルを
持ち、年間を通して生殖が可能である。家畜ブタが１０００ポンド以上の体重に
達するのとは対照的に、ミニチュアブタは２００−３００ポンド（成熟ヒトにほ
ぼ匹敵する大きさ）の成熟した大きさに達する。この違いは移植ブタ器官のプロ
グラムされた成長においては重要である。更に、ここにおいて開発された動物は
、定められた条件の下で飼育され、また関連する多数の診断歴を持つ。

【０００５】異種移植は明らかに多くの受難を軽減する可能性を持っている。特定の安全性
の問題は方法〔３、４〕に関連する。これらの問題は、患者への感染の危険と、
特に異種移植に伴う受容者の接触への危険に分けることができる。最も重大な問
題は異種移植片から受容者への微生物の伝達の可能性と、それに続く新しいヒト
感染あるいは疾病の発現である。ブタがヒト以外の霊長類に先立って選択される
提供者動物であると考えられる主な理由は、保有する微生物の心配が少ないから
である。微生物の伝達の危険は異種移植に特有のものではない。同種移植法の間
に、疾病を引き起こす生物が伝達したという多くの事例が報告されている〔５〕
。

【０００６】一種内に制限された伝達との比較における、種交差感染（人獣共通伝染病）は
特に問題である。なぜなら、一度種の障壁を越えた生物の態様は本来の宿主内で
の病原性に基づいて予測することができないからである。本来の宿主内では良性
の生物が、人獣共通伝染性の背景において、重大な病的状態を引き起こす可能性
がある。これは、ブタのＮｉｐａｈウイルス、霊長類のヘルペスＢウイルスおよ
びげっ歯類のハンタウイルスのヒトへの強力な致死感染によって例示される〔６
−８〕。第二に、生物の伝達の結果は異種移植受容者単独では止めることができ
ない。一度異種移植受容者が疾病に罹ると、生物は受容者の接触に対して伝達可
能となる可能性がある。従って、異種移植法時に時々起こる感染の管理および監
視は重要な公衆衛生問題と見なされている〔２〕。加えて、微生物による受容者
の感染を素早く、また疾病の発症が確認される前に発見することは可能であろう
が、効果的な処置は開発されていないであろう。なぜなら殆どの場合において、
この生物による既往感染は報告されていないからである。結果として、異種移植
を通して伝達可能である人獣共通感染微生物による感染の予後は本質的に未知で
あり、従って除去のために特定された生物は、ヒトまたはブタにおいて疾病を生
じさせると知られている全生体を含む。

【０００７】器官と一緒に輸送される可能性のある微生物は、受容者体内で感染させる可能
性を持つように変化する。従って、異種移植に対して重要である。ラクリフおよ
びフォハン（１９８７）、ラボラトリーアニマルズ２１巻：５３−５９ページ
に示されたような無菌方法下で飼育された動物は、異種移植に対して潜在的危険
性が考えられる生物の集団における再発生の除去および予防を容易にする。感染
の最大の危険は、恐らく器官内の無症候性の潜伏実体として輸送される能力を持
つこのような生物を伴うことであろう。これらの問題となる性質のため、内因性
レトロウイルス（ＥＲＶ）およびヘルペスウイルスは、調節作用および第一にそ
のような生物を取り除いた動物の生産による考慮の焦点となった。本発明に従っ
て、この問題は全体、あるいは少なくとも部分的に、内因性微生物の点において
他のブタよりも特定の利点を持った集団内の（ここで用いられるミニチュアブタ
などの）特定の動物を生産することにより解決される。

【０００８】内因性レトロウイルス（ＥＲＶｓ）はブタおよびヒトを含む試験された全ての
脊椎動物種の通常のＤＮＡの構成要素として同定されている。通常のレトロウイ
ルスの生活様式の特定の性質は、宿主細胞染色体ＤＮＡ内への遺伝物質の安定し
た結合である。宿主細胞は生殖系列であり、ウイルス核酸物質（またはプロウイ
ルス）は続いて、その他のメンデル遺伝子の典型的な様式で子孫に遺伝する。結
果として、もし生殖系列細胞のＤＮＡ内の特定のプロウイルスの存在により、子
孫が選択的な障害を受けたならば、進化の時を越えて生存できないであろうし、
このＥＲＶは進行中の遺伝子プール中には存在しないであろう。従って、今日動
物の生殖系列に存在するＥＲＶは自身の種に対して病原性を持たない傾向にある
。個々のＥＲＶ遺伝子座はまた、自身のゲノム中に存在する突然変異により不完
全に複製する傾向がある。しかし、感染ウイルスを形成するための相補性および
組換えにより個々の不完全な遺伝子座が作用しあう可能性はある。ＥＲＶの通常
の宿主種に対する病原性の欠如は充足の余地を残さない。なぜなら全く同一のウ
イルスが、異種間の伝達が起こったときに、その病原性を変化させることができ
るからである。例えば、テナガザル白血病ウイルスは、マウスの非病原性内因性
ウイルスと共にテナガザルに感染を発生すると考えられている

〔９〕。今ではリ
ンパ系および骨髄系悪性疾患を引き起こす捕えられたテナガザルにまで広がって
いると考えられている。更に、ＥＲＶの活性による腫瘍形成の性質は、レトロウ
イルス遺伝子治療処置を受けた非ヒト霊長類で観察されている〔１０〕。

【０００９】ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）は、異種移植に対して、特定のそして
恐らく最も重要な安全性の問題を示す。ブタの保有するその他の感染性生物と異
なり、これらのウイルスは感染要素として動物間に伝達されないが、むしろ生殖
系列ＤＮＡの一部として全ての動物で遺伝する。このウイルスはブタの全種に存
在し、全細胞中に存在する通常のＤＮＡの一部を形成する。ウイルスのおおよそ
５０複製が全細胞中に存在し、従って、通常の繁殖技術では完全に除去すること
ができない。結果として、これらのＤＮＡ配列は、異種移植に用いられるブタ細
胞の全てに存在することは確実である。

【００１０】ＰＥＲＶの産物とヒト細胞への伝達は、これまで相当細部に亘って、試験管内
で研究されてきた。そしてそれによりＰＥＲＶの２つの科（ＰＥＲＶ−Ａおよび
ＰＥＲＶ−Ｂ）がヒトおよびブタ細胞内で複製できることが示された〔１１、１
２〕。第三の科（ＰＥＲＶ−Ｃ）はブタ細胞内でのみ複製できる〔１１、１２〕
。ヒト腎臓細胞系列２９３は、ＰＥＲＶ複製に対して明らかに最も寛容であり、
従って共存培養分析のために選択されている〔１１〕。レトロウイルスは細胞表
面分子を受容体として扱い、細胞内への進入を仲介させるために用いる。これら
の細胞受容体の発現パターンは、ＰＥＲＶの３つの科が各々の受容体を使用し、
その他の感染性レトロウイルスによって使用されないことを示す〔１２〕。重要
なことは、ウイルスの進入に寛容な、いつくかの細胞はウイルスの複製を補佐し
ないということである。ＰＥＲＶ産物はブタ細胞系列から、そしてまたいくつか
のブタ種由来の初代培養系から調査されてきた〔１３〕。全ブタ細胞は、細胞系
列ＳＴ−ＩＯＷＡの一つの例外もあるが、ヒト細胞内で感染および複製する可能
性のあるＰＥＲＶを産生するように見える。今日まで試験されたブタの種は、Ｎ
ＩＨミニブタ、ユカタン、多産ランド種、および現在臨床実験で用いられている
動物を含む。要約すれば、特定病原体免除（ＳＰＦ）繁殖プログラムは、異種移
植の間に伝達する可能性のあるほとんどの病原体を除去しうる。しかし、生殖系
列を通して伝達されるＥＲＶのような病原体は除去されないであろうし、また最
近の証拠は、特定のＰＥＲＶｓはヒト細胞に感染する可能性を持ち、そのために
ブタ器官の使用の潜在的危険性の一つはそのような病原体の伝達であるという前
記の実例を述べている。

【００１１】ＰＥＲＶについての研究はウイルスの不完全な複製の支配により複雑である。
不完全な複製は、ウイルスの完全な複製と非常に密接に関連している。複製完全
ウイルスについてコード化するための単一遺伝子座のために、ＰＥＲＶのゲノム
複製は、機能的ＬＴＲ′ｓおよびｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに対するオープン
リーディングフレームを含んでいなければならず、そして、従ってこれらの遺伝
子座を明確に同定できることが必要である。加えて、不完全な遺伝子座からのＲ
ＮＡは一度ヒト細胞内で型が擬制され、複製完全レトロウイルス（ＲＣＲ）を形
成するためにその他のＰＥＲＶ遺伝子座と組換えを起こす。単離された単一遺伝
子の塩基配列決定は、オープンリーディングフレームを同定することができるか
もしれないが、複製に対する遺伝子座の完全性を推定するのに用いることはでき
ない。

【００１２】共同でアメリカ合衆国および英国両方の異種移植実験を統治する規制委員会は
、ヒト細胞がＰＥＲＶにより感染される可能性があるという最初の発見に反応し
て臨床試験を停止している。そのため、限定された患者が比較的少ない数のブタ
細胞および器官に短期間露出されることを示した情報を提示した公表された報告
はＰＥＲＶ伝達の証拠を示していない〔１４−１６〕。数少ない臨床実験は、Ｐ
ＥＲＶ感染に対する受容者の長期的な検査の必要性を奨めている。現在必要とさ
れる長期の検査は、明らかに、異種移植法に対するかなりの費用だけでなく、繰
り返されるモニタリング法による患者に対する実施上の負担を与える。結果とし
て、伝達可能なＰＥＲＶを欠いた動物を異種移植片提供者として用いることは、
より安全であるだけでなく、移植後の検査法の費用の削減をもたらす。

【００１３】本発明に従って、ここで用いられるブタの近交系群は、組換えによりヒト細胞
内で複製の可能なＰＥＲＶを産生しない動物の新規な小群を含む。ここでの開示
に基づいて、ブタ内に存在するヒト親和性複製完全ＰＥＲＶの形成に寄与する可
能性のある全ての遺伝子要素を除去するための特定の繁殖を行うことができる。

【００１４】

【発明の簡単な要約】

本発明の目的は、ブタ種、およびそのブタ種を生産する方法を提供することで
ある。そのブタ種は、ヒト細胞に感染し得るブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲ
Ｖ）を産生せず、それにより、異種移植に対する内因性微生物の安全性の点にお
いて他のブタ種よりも特定の利点を持ったものである。

【００１５】本発明の更なる目的は、繁殖プログラムの実施上の源として提供するために、
十分な量でそのような動物を産生する為の成功裡の繁殖プログラムを含めて、Ｒ
ＣＲを形成する可能性のある遺伝子要素を欠いたヒト異種移植のための器官の源
として、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）近交系ブタ、好ましくはミニチュア
ブタを提供することである。一つの実施例においては、そのようなブタはミニチ
ュアブタである。

【００１６】本発明のまた更なる目的は、臨床グレードの器官、組織または細胞の源として
大規模にそのような動物を提供することである。

【００１７】本発明のまた一つの目的は、ヒトに対する固体器官提供者として提供するため
に、十分に成長した成熟体がより適した大きさであり、更にそのような動物の関
連する種に対する長期間、２５年程度の医療および良質の情報を持つような単一
血統の種、および免疫寛容を示す動物を提供することである。

【００１８】本発明の更なる目的は、外因性幹細胞のための幹細胞、および、例えばＡＩＤ
Ｓの処置における胸腺交換治療の源としてのこのようなミニチュアブタからの組
織を提供することである。

【００１９】

【発明の説明】

一つの見地においては、本発明は、ここに開示された高い厳密性を持った試験
管内分析により測定されたように、少しでも存在していたとしてもヒト細胞に非
感染であるＰＥＲＶｓを伴う一つのブタの系を提供する。そのような動物は従っ
て、異種移植のための器官、組織または細胞の有益な源である。

【００２０】ここに開示されたように、ヒト親和性ウイルスを同定するという目的において
、複製完全性について選択するためにヒト細胞（例えば２９３細胞）が用いられ
た。２９３細胞系列がここで用いられたが、それは今日までに同定されたなかで
ＰＥＲＶ複製に対して最も感受性の強い細胞系列であるためである。本発明に従
って、その他のヒト細胞系列も、適しているならば用いることができる。また、
ここでの２９３細胞系列の使用は、決して本発明を限定するものではないと考え
る。

【００２１】複製完全ウイルスについての選択の後、（ＬＴＲからＬＴＲまでの）長いＰＣ
Ｒ産物は産生されクローン化される。これらの産物の配列分析により、ヒト細胞
内で生産的に複製できるウイルスを形成するために相互作用できる遺伝子座の同
定ができる。このウイルスは、単一遺伝子座の産物からの形成が可能であろうし
、また２またはそれ以上の遺伝子座の産物から形成された組換え体でもあり得る
。ここに開示されたようなこれらの遺伝子座に対する特異的なプローブを用いる
ことで、動物は、特定の遺伝子座つまりはヒト親和性ＰＥＲＶの決定的な構成要
素の存在について検査される。これらの情報に基づいて、複製完全ＰＥＲＶを構
成する遺伝子要素の全てを迅速に除去する繁殖プログラムは確立される。

【００２２】従って、本発明は、感染性ヒト親和性ＰＥＲＶを形成できる遺伝子座のないブ
タから得た器官、組織または細胞を、それが必要ならばヒト患者内に導入するこ
とより成る異種移植の方法に関する。ここで好ましくは、ブタはミニチュアブタ
であり、最も好ましくはＤＤハプロタイプの特徴を持つものである。本発明の更
なる実施例において、前記ブタはＰＥＲＶを含む可能性があるが、もし存在した
としてもヒト細胞に感染するウイルスを形成できないものである。

【００２３】そのような方法は、疾病の処置およびまたは予防における、特にヒト患者にお
ける特定の使用を発見した。ここで前記疾病は、不完全に機能する器官または組
織の結果によるものであるか、あるいはそのような疾病は、重大な生理学上の機
能を持つ細胞数が不適切であるための結果によるものである。この点において、
そのような患者への、本発明のブタなどの提供者生物から得られた細胞のサンプ
ルの導入は、細胞の不足により引き起こされる、または細胞数が不適切であるた
めに引き起こされる疾病を軽減することにおいて、治療法上効果的であることを
証明できる。従って、そのような細胞の導入は、疾病状態を軽減するだけでなく
、不健康な患者の健康状態を改善するための補助細胞を提供する。そのような細
胞はミニチュアブタ提供者の器官、組織または細胞から得ることができる一方で
、より好ましい実施例はそのような処置のために幹細胞を用いる。

【００２４】従って、別の見地において、本発明はヒト患者内における疾病を予防する方法
に関する。その方法は、本発明のミニチュアブタから得られた器官、組織または
細胞を内因性レトロウイルス、特にブタ内因性レトロウイルスが移植方法の結果
として伝達され得る恐れなく、前記疾病の危険性のある状態でヒト患者内に導入
することより成る。好ましい実施例においては、前記ブタはミニチュアブタであ
り、最も好ましくはＤＤハプロタイプの特徴を持つものである。

【００２５】本発明は更に、ここに開示されたブタから得られた器官、組織または細胞を、
それが必要な場合にヒト患者体内に導入することより成る疾病に苦しむヒト患者
の疾病を処置する方法に関する。特にここでそのようなブタはミニチュアブタで
あり、最も特にはＤＤハプロタイプのブタである。本発明に従って、そのような
ブタは、ヒト細胞に非感染性のＰＥＲＶを持つブタであろう。ここに開示された
発明を続けるにあたって、そのようなブタの細胞は、その他のブタ細胞または非
ヒト動物細胞に感染できるＰＥＲＶ要素を保持するかもしれないが、そのような
細胞は、その細胞と接触したときにヒト細胞に感染ＰＥＲＶ要素を保持しない。
従って、そのような器官、組織または細胞を移植のためにヒト受容者体内へ使用
すること、言い換えれば、そのような器官、組織または細胞をヒト受容者体内へ
導入することは、結果として、移植された器官、組織または細胞から得られたＥ
ＲＶによるそのようなヒト受容者の細胞の感染には至らない。

【００２６】本発明に従って、そのような疾病を処置することにおいて有益なミニチュアブ
タなどのブタは、好ましくは（ここに開示されたように）ＤＤハプロタイプのも
のである。本発明の異種移植法を実施することにおいて有益な、移植された器官
または組織は、治療法上有効な量の細胞サンプルを含む。この細胞は通常そのよ
うな器官または組織から得られたものである。より好ましい実施例において、こ
の細胞は幹細胞である。

【００２７】他の一見地において、本発明は、以下のステップより成る内因性レトロウイル
ス（ＥＲＶ）ＤＮＡのための動物を検査する方法に関する：（ａ）試験される動物から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを獲得し、
前記細胞におけるＥＲＶ発現を、前記細胞と刺激できる量のＥＲＶ刺激因子とを
接触させることにより刺激する；（ｂ）ステップ（ａ）の前記刺激細胞を未感染指標細胞のサンプルと接触させ
、感染させるために前記細胞を共存培養する；（ｃ）第二共存培養を形成するために、別の細胞画分に対してステップ（ａ）
およびステップ（ｂ）の方法を繰り返す；（ｄ）ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）により生産された共存培養を組み
合わせる；（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞における逆転写酵素活性を測定する。

【００２８】それにより、前記逆転写酵素活性の存在はＥＲＶウイルス要素の存在を表示で
きる。

【００２９】前記検査方法の間に、ブタはＰＥＲＶを伝達しないことを同定され得る。これ
らの動物は明確に同定されるものであり、従って、ヒト親和性ＰＥＲＶを持たな
い群の基礎を形成するために用いられるであろう。

【００３０】ここで提供された例に開示されたように、このような検査は、産物増強逆転写
酵素（ＰＥＲＴ）分析により簡便に行うことができる。しかしその他の分析も利
用可能である。また本発明に従って、検査される動物は通常ブタ、特にミニチュ
アブタ、最も特にはＤＤハプロタイプのミニチュアブタであり、ＥＲＶはＰＥＲ
Ｖである。

【００３１】特異的な実施例において、指標細胞はヒト細胞であるが、ブタ、特にはミニチ
ュアブタなどのその他の種から得られた細胞であることもまたあり得る。加えて
、ＥＲＶ刺激因子はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびホルボールエステル
：ホルボール１，２ミリステート１，３アセテート（ＰＭＡ）であろう。さらに
特異的な例は、ここでステップ（ｃ）がステップ（ｂ）の２４時間後実施され、
ステップ（ｄ）がステップ（ｂ）の最低７日後実施されることを含む。別の特異
的な実施例において、共存培養中に存在する細胞はＰＢＭＣ：指標細胞が約５：
１の割合であり、特にここで指標細胞の数が約２×１０^５個、またＰＢＭＣの数
が約１０^６個である。

【００３２】特異的な実施例において、刺激に十分な時間は最低約３日間であるが、研究者
およびまたは臨床医学者の要求および傾向と同様、検査方法に用いられるその他
の条件に依存して長くも短くもなり得る。

【００３３】更なる実施例において、本発明は、ミニチュアブタ、より好ましくはＤＤハプ
ロタイプのミニチュアブタなどの近交系ブタに関する。ここで前記ミニチュアブ
タは、ゲノム自体からヒトに感染するＰＥＲＶ遺伝子配列を除去するために近交
系である。より好ましい実施例において、そのようなＰＥＲＶ配列はまったく存
在しないが、一方その他の実施例において、そのようなＰＥＲＶは存在しうるが
、ヒトおよびヒト細胞には非感染性である。

【００３４】一般に、試験管内でのＰＥＲＶ伝達の分析は基本プロトコルに基づく。簡単に
は、血液は標準静脈切開技術を用いて試験動物から採取され、末梢血単核細胞（
ＰＢＭＣ）は標準技術を用いたフィコール^ＴＭ分離により単離される。細胞内の
ＰＥＲＶ発現は、２０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、フィトヘマグルチン（ＰＨＡ
、２μｇ／ｍｌ）およびホルボールエステルＰＭＡ（１０μｇ／ｍｌ）を含むＰ
ＲＭＩ培地中での刺激により引き起こされる。４−５日間の刺激に続いて、未感
染ヒト（２９３）またはブタ（ＳＴ−ＩＯＷＡ）細胞はブタＰＢＭＣ（ＳＴ−Ｉ
ＯＷＡ細胞は、感染性ＰＥＲＶ要素を産生しないと同定された唯一のブタ細胞系
列である）に添加される。最低４８時間待った後、細胞は、１０％ＦＢＳを追加
したダルベッコ培地より成る培養培地中に維持される。ウイルス複製について、
確立されるようにし、また検出できるレベルまで増加させるために、培養細胞は
、明確な結果が得られる前に、６０日近くまでの維持を必要とすることもある。
ウイルスの伝達は、産物増強ＲＴ（ＰＥＲＴ）分析（１８）または標準放射性核
種ＲＴ分析あるいはＥＬＩＳＡを用いて、培養細胞の上澄みにおける転写酵素（
ＲＴ）活性の存在により測定される。初期共存培養時期においては、ブタＰＢＭ
Ｃはヒトおよびブタ標的細胞と共存する。結果として、ＰＥＲＶ伝達は、陽性の
逆転写酵素は残存ブタＰＢＭＣの欠如に帰することが想定されるのみである。

【００３５】本発明の方法の実施において、特定の緩衝剤、培地、試薬、細胞、培養条件お
よびその他は限定するように意図されているのではなく、その技術分野における
通常の知識を有する者が、これらの方法が開示される特定の関係において利益ま
たは価値があると認め得る全ての関連材料を含むように解釈することができるこ
とは勿論理解することができる。例えば、一つの緩衝システムまたは培養培地を
他のものに代えて、同一でないとしても類似した結果を得ることはしばしば可能
である。この技術分野における通常の知識を有する者は、過度の実験が無くとも
、ここに開示された方法を用いることにおいて、そのような交換を行い自分たち
の目的を最適に達成させることができるようにするそのようなシステムおよび方
法の十分な知識を持つであろう。

【００３６】一般に、ここに開示された方法により利用される技術の多くは、サンブルック
他、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル第二版、コー
ルドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）、ウー他、メソッズイン
ジーンバイオテクノロジー（ＣＲＣプレス、ニューヨーク、ニューヨーク、
１９９７）およびリコンビナントジーンエクスプレッションプロトコル、
インメソッズインモレキュラーバイオロジー、Ｖｏｌ．６２（Ｔｕａｎ
，ｅｄ．、ヒュマーナプレス、トトワ、ニュージャージー、１９９７）などの
文献を含むが、これに限定されない公知の分子生物学参考文献および刊行物に見
ることができる。これらの開示は、この文書には参考文献により編入されている
。

【００３７】本発明は、以下の限定されない例により、さらに開示されるであろう。これら
の例の開示を利用することにおいて、本発明に従って開示された方法のその他の
、および異なる実施例は、それ自体をその技術分野に属する通常の知識を有する
者に疑いもなく示唆するであろうということは明確に記憶されねばならない。

【００３８】

【発明の実施の形態】

（実施例１）Ｄ／Ｄミニチュアブタがヒト親和性ＰＥＲＶを産生しないことを示す共存培養
実験この分析において、以下の共存培養条件が行われた。この分析は、いくつかの
重要な細部が、文献〔１３〕に開示されている確立された方法と異なることは、
注意すべきである。Ｄ／Ｄハプロタイプミニチュアブタ由来の新鮮血からの単離
に続いて、５×１０^６個のリンパ球は（２ＧｙのＸ線照射による前処置を伴うか
または伴わない条件で）ＰＨＡおよびＰＭＡにより刺激され、直ちに１×１０^６個のヒトまたはブタ細胞と共に共存培養された。ブタ腎臓細胞系列ＰＫ１５が共
存培養分析に対する陽性のコントロールとして用いられた。なぜならこれらの細
胞が、ヒト細胞内で複製できる２科のＰＥＲＶを産生するからである〔１１、１
２〕。ヒトおよびブタ標的細胞単独のコントロール培養細胞は、レトロウイルス
汚染の欠如を確実にするために実施され、従って、発現したＰＥＲＶはブタＰＢ
ＭＣから生じたものであり、ブタ標的細胞自体から生じたものではない。表１に
は、ブタおよびヒト細胞の共存培養後３９日間行われたＲＴの結果を示す。

【００３９】

【表１】

【００４０】結果は、Ｄ／ＤミニチュアブタＰＢＭＣはブタ細胞に感染性ＰＥＲＶを産生で
きるが、ヒト（２９３）細胞内で複製できるウイルスは産生されなかったことを
示す。ＰＫ１５細胞コントロールにより示唆されるように、２９３培養細胞はＰ
ＥＲＶ複製に対して十分に寛容であった。

【００４１】（実施例２）共存培養実験における厳密性の増強は、Ｄ／Ｄミニチュアブタがヒト親和性Ｐ
ＥＲＶを産生しないことを確認するヒト細胞に対するＰＥＲＶ伝達のより厳密な分析として、以下の刺激プロトコ
ルが採用された。ＰＢＭＣｓは、Ａ／ＡおよびＤ／Ｄハプロタイプ動物由来の新
鮮血から単離され、ＲＰＭＩ培地中に細胞１０^６個／ｍｌが再懸濁され、ＰＨＡ
およびＰＭＡで刺激された。刺激後３日間で、２×１０^６個の未感染ヒトまたは
ブタ指標細胞はＰＢＭＣ１０^７個に添加された。この共存培養方法は、ＰＥＲＶ
がＰＢＭＣから指標細胞に伝達できる期間を最大にするために、更に２４時間後
細胞画分に繰り返された。２つの別々の共存培養細胞は、その後７日間プールさ
れ、培養器中に維持された。ＲＴ産生はＰＥＲＴ分析により評価された。

【００４２】重要なことは、その他の個々の動物由来のＤ／Ｄハプロタイプ細胞は、再びヒ
ト細胞に伝達するウイルスを産生しないことである。これらの厳密性の増強され
た条件下においては、Ｄ／Ｄハプロタイプと同様Ａ／ＡハプロタイプもＳＴ−Ｉ
ＯＷＡ細胞に感染したＰＥＲＶを産生した。これは、前記のＳＴ−ＩＯＷＡ共存
培養中で観察された環境親和性ウイルス産物の欠如が、恐らくＤ／Ｄとその他の
ハプロタイプ動物との間で環境親和性ウイルス産物における量的な差異を表すこ
とを示している。

【００４３】

【表２】

【００４４】表１および２で示された結果は、Ｄ／Ｄハプロタイプミニチュアブタが異種移
植法に用いる新規で有益な動物であることを示す。従って、異種移植用のそのよ
うな動物を提供することが本発明の更なる目的である。

【００４５】ほとんどの状況下で、微生物の産生の特徴づけは、十分に確立された試験およ
び方法により行われる。しかし、ＥＲＶの調査は、ウイルスの内因性性質のため
に、およびウイルスの感染性複製がゲノム中に存在する複製の小数のみに表れる
ためにかなり複雑である。確立された標準分析方法を用いることの結果として、
感染性ウイルスに特異的に関連する結果は、密接に関連するが不完全な要素の作
用により隠され得る。

【００４６】結果として、ここに開示された厳密な分析方法を提供することもまた本発明の
更なる目的である。

【００４７】この、または類似した分析を展開するにあたって、いくつかの考慮が含まれ、
これらは成功した厳密な分析により検討されなくてはならない。そのような考慮
の一つは、Ｄ／Ｄハプロタイプ細胞由来のヒト親和性ＰＥＲＶの欠如に対する起
こり得る原因の考慮である。これは、Ｄ／ＤハプロタイプミニチュアブタＰＢＭ
Ｃが、ここで用いられたようなマイトジェン刺激に反応し損なった可能性に因る
かもしれない。ここに開示された分析において、ＰＢＭＣｓは、ＰＥＲＶ発現を
引き起こすＰＨＡおよびＰＭＡの組み合わせに露出される〔１３〕。最大ウイル
ス産生と共存培養分析の感度を確実にするために、細胞の効果的な刺激が必要で
ある。従って、Ｄ／Ｄハプロタイプ細胞が効果的に刺激されることを確実にする
ことは重要である。これらの細胞で観察されるウイルス産生の欠如が、細胞ゲノ
ム中に存在する感染性ＰＥＲＶのスペクトルにおける差異よりも、むしろ刺激の
減少によるかもしれないためである。これらの問題を検討するために、ＰＢＭＣ
ｓは、フィコール分離を用いてミニチュアブタ血液の全ハプロタイプの血液から
単離される。標準細胞数を用いた培養細胞は、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ中で確
立される。細胞はその後異なる濃度のＰＨＡおよびＰＭＡで刺激され、刺激効率
が刺激後７日に至るまでの時間測定され、細胞増殖査定のためにトリチウム原子
含有チミジン取込みが用いられた。ＰＭＡ活性化効率は、ＰＥＲＶ発現に対する
効果により評価された。測定は、複製完全ＰＥＲＶの３つの科（ＰＥＲＶ−Ａ、
−Ｂおよび−Ｃ）間で異なるエンベロープ遺伝子に位置する領域に対して設計さ
れたＤＮＡプローブを用いた細胞ＲＮＡのノーザンブロッティングにより行われ
た。量的ＲＴ−ＰＣＲは、同一科特異的ＰＥＲＶ領域を標的として行われた。ヒ
ト親和性ＰＥＲＶのＲＮＡについて細胞を特異的に試験することは不可能である
一方、全ＰＥＲＶ集団に関する情報は、Ｄ／ＤＰＢＭＣはミニチュアブタおよ
びブタ種のその他のハプロタイプから得られたＰＢＭＣといくらか類似点があり
、培養器中でマイトジェン刺激に反応できるという我々の推定に信用を与える。

【００４８】本発明のＤ／Ｄ動物ＰＢＭＣ由来のヒト親和性ウイルス産物の欠如に関する第
二の問題は、ヒト細胞内で複製を仲介できるＰＥＲＶがブタゲノム中に存在する
かどうかを同定することである。今日まで、ヒト細胞に感染するＰＥＲＶのスペ
クトルは十分に調査されておらず、その結果、異なる機能ＰＥＲＶ遺伝子座がど
れ位ブタゲノム中に存在するのかはまだ明らかになっていない。これは異種移植
において臨床上重要である。

【００４９】もしこの数が低ければ、Ｄ／Ｄ動物由来の細胞内で観察されるウイルス産物の
欠如が、重大なＰＥＲＶ遺伝子座の少数の欠如に因るということが可能であろう
。この数が高い場合には、結果はＰＥＲＶ転写の活性、産生あるいはＤ／Ｄハプ
ロタイプ動物により産生されるウイルス要素の安定性の差異に因るかもしれない
。

【００５０】今日まで、ヒト細胞に感染するＰＥＲＶのスペクトルは十分に調査されておら
ず、その結果、異なる機能ＰＥＲＶ遺伝子座がどれ位ゲノム中に存在するのかは
まだ明らかになっていない。これは異種移植において臨床上重要である。ここに
開示された結果から、ヒト親和性複製完全ＰＥＲＶがＡ／Ａハプロタイプミニチ
ュアブタに存在することは明らかである。文献から、ＰＥＲＶをその他のブタ種
から単離できることは知られている〔１７〕。従って、Ａ／Ａハプロタイプミニ
チュアブタは、複製完全ＰＥＲＶの問題に寄与する遺伝子座を評価できる対象と
してのコントロールとして容易に利用できる。これらの動物に存在する遺伝子座
の測定は、Ｄ／Ｄミニチュアブタのゲノム中にこれらのウイルスが存在するか否
かの測定を容易にする。しかし、繰り返されるべきは、問題の動物がＰＥＲＶを
持つか否かは、本発明に従って開示された動物が、異種移植における受容者に感
染する危険性のない提供者として用いられることから、ここに開示された発明を
限定することにはならないことである。本発明は、このような動物を提供者とし
て用いることを可能とし、前記動物を用いたそのような移植のための方法を提供
し、さらに、そのような動物の検査および主張された問題に対する有用性、また
はヒト患者を感染の危険のある状態に置くＰＥＲＶの存在についてのその他の動
物の測定に用いるための厳密な分析を開示する。

【００５１】そのような問題は、新鮮血から単離され、ＰＨＡおよびＰＭＡに刺激され、こ
こに開示された増強された厳密な検査方法を用いてヒト２９３細胞と共存培養さ
れた全ハプロタイプミニチュアブタ由来のＰＢＭＣｓを用いることにより検討さ
れる。ここに開示された増強された厳密な検査方法により、被感染細胞の配列サ
ンプルを回収し、ゲノムＤＮＡを調製し、さらにＤＮＡＰＣＲにより細胞に輸
送されるＰＥＲＶのスペクトルを検査できる。ここに開示された新規の厳密な検
査方法のこの見地に従って、細胞ＤＮＡからＰＥＲＶゲノムの全長を効果的に増
幅し、密接に関連する遺伝子座間を区別するためのＰＣＲに基づくＰＥＲＶタイ
ピングシステムが提供される。ヒト細胞内で複製可能な配列のスペクトルを測定
したことにより、これらの配列がＤ／Ｄハプロタイプミニチュアブタのゲノム中
に存在するかを測定することが可能となる。それにより、それらの欠如は、Ｄ／
Ｄハプロタイプ動物の細胞由来のヒト親和性ウイルスの産物の欠如を示す。

【００５２】本発明のこの見地に従って、ＰＥＲＶタイピングシステムに用いられるＰＣＲ
プライマーは、ウイルスＬＴＲｓのＵ５およびＵ３領域における保存配列間に位
置する。従って、これらのプライマーを用いて得られたアンプリコンは、図２に
構成図として詳細に示したように、３つの主要オープンリーディングフレームの
全てを含むであろう。どの遺伝子座が感染性ウイルスの形成に寄与しているかを
測定するために、全長に近いＰＥＲＶゲノムを増幅することが必要である。個々
の遺伝子の増幅は、密接に関連する配列間の区別をする能力が非常に損なわれて
いること、および同一遺伝子座内に存在する特定の機能遺伝子とその他の機能遺
伝子の連鎖が不可能であるために完全に不可解な結果を与えるであろう。

【００５３】用いられるプライマー配列は以下のようである：ＰａｎＵ５ＦＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＴＧＧＴＴＴＣ配列識別
番号：１７ＰａｎＵ３ＲＣＣＡＣＧＣＡＧＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＣＴ配列識別番号：
１８ＰａｎＵ５Ｆは、Ｓｕｓｓｃｒｏｆａブタ内因性レトロウイルスＰＥＲＶ−
ＭＳＬ（ジーンバンクアクセッション番号、ｇｂＡＦ０３８６００）の５１
６−５３８残基に一致する。一方、ＰａｎＵ３Ｒは、ブタ内因性レトロウイルス
ＰＥＲＶ−ＭＳＬ（ジーンバンクアクセッション番号、ｇｂＡＦ０３８６６
０）の逆方向相補鎖（８０６７−８０４８残基）に一致する。

【００５４】長領域（プルーフリーディング）Ｔａｑポリメラ−ゼを用いたＰＣＲにより、
ゲノムＤＮＡ由来の全長アンプリコンを獲得した後で、それらはクローン化され
、６または４塩基認識配列か、またはＤＮＡ配列決定に用いる酵素を用いた制限
酵素消化により分析された。得られた制限断片の分析は、非常に密接に関連した
ＰＥＲＶ間の区別を容易にする。多数のコントロールの使用は、複製完全ＰＥＲ
Ｖの数は過大に見積もられていないことを確実にする。

【００５５】本発明の新規検査方法により検討される更なる問題は、Ｄ／Ｄ動物由来のヒト
親和性ＰＥＲＶの産生の欠如が、質的結果なのか量的結果なのかということであ
る。

【００５６】試験管内共存培養を伴わずにヒト親和性ウイルスを特異的に測定することは現
時点では不可能であるため、エンベロープ遺伝子配列により明確に示されたＰＥ
ＲＶの２つの科（ＰＥＲＶ−ＡおよびＰＥＲＶ−Ｂ）は、ヒト細胞に対して複製
完全であると同定されていた。図１に詳細に示すように、３つの近交系ＭＨＣハ
プロタイプおよび４つの組換えハプロタイプは、群内の選択的育種により維持さ
れた。表１および２に示された結果は、ミニチュアブタの３つの近交系ハプロタ
イプ（Ａ／Ａ、Ｃ／ＣおよびＤ／Ｄ）から得られたものである一方、これは、こ
こでの開示の使用を容易に近交系ハプロタイプ動物およびＭＨＣクラスＩ−クラ
スＩＩ組換え動物の分析にまで拡張することができる。感染性ウイルスに対する
分析の全ては、ここに開示された厳密性の高い分析において容易に行われる。従
って、ＰＢＭＣのＰＨＡおよびＰＭＡによる刺激は、共存培養の開始後４−５日
間の比較的短期間のウイルス産生を引き起こす〔１３〕。従って、ここでは分析
は、Ｄ／Ｄハプロタイプ細胞がこの性質を伴い、従ってヒト指標細胞系列がこの
期間ＰＢＭＣとの直接共存培養中にあることを確実にするために行われる。

【００５７】加えて、伝達ミニチュアブタ由来の新鮮ＰＢＭＣの標準数は単離され、ＰＨＡ
およびＰＭＡ存在下で培養され、産物増強ＲＴ（ＰＥＲＴ）分析を用いて培養上
澄み中のＲＴ活性が測定され、細胞内で生じるウイルス産物の動態が追跡された
〔１９〕。ＰＥＲＴ分析に加えて、ＲＴ活性はまた、ＰＥＲＶ発現に対して最適
化された市販の量的ＥＬＩＳＡに基づくＲＴ分析（キャビッジテックＡＢ、
スウェーデン）により測定することができる。

【００５８】本発明はまた、幾種ものＰＥＲＶ感染に対して感受性の強い標的細胞の使用を
容易に可能にする。従って、本発明に従って、代わりのヒト指標細胞系列も、Ｄ
／Ｄハプロタイプ細胞が２９３細胞と異なるヒト細胞内で複製可能なヒト親和性
ウイルスを産生しないことを確実にするために利用可能である。今日までに、ほ
とんどの共存培養分析が、ヒト親和性ＰＥＲＶ複製に対して最も寛容であると思
われるために、２９３細胞系列を用いて行われてきた。本発明のこれらの見地に
従って、２９３と異なるウイルス侵入に対して寛容な（すなわちＰＥＲＶエンベ
ロープ受容体分子を発現する）細胞系列は、ここに開示された厳密性の高い共存
培養方法に用いるための標的細胞として利用可能である。適合する系列は、初代
ヒトＰＢＭＣ、細胞系列ＨＴ１０８０、ＴＥ６７１およびヒーラを含む。ＨＴ１
０８０細胞系列は、ＰＥＲＶ−Ｃの義型として特に有益である。ブタ細胞にのみ
感染可能であるとされているウイルスが、これらの細胞内に進入することが可能
である〔１２〕。

【００５９】ここに開示された厳密性の高い方法により検討される追加の問題は、Ｄ／Ｄお
よびＡ／Ａハプロタイプ動物由来の細胞が同様の力価のウイルスを産生が、Ｄ／
Ｄから得られたウイルスが３７℃での培養で安定性が低下したために感染性が低
いという可能性である。Ｄ／ＤおよびＡ／Ａミニチュアブタの細胞により産生さ
れたウイルス要素のショ糖勾配分離は、そのような要素が安定であるか否かにつ
いて示唆を与える。ここで、培養上澄みは刺激を受けたＰＢＭＣｓから回収され
、ショ糖勾配遠心分離法を用いて密度に従って分離される〔１１〕。ショ糖勾配
によるＰＥＲＶ要素の分離は、細胞から放出された要素が十分に成熟しているか
の測定を容易にできるようにする。（２９３共存培養を用いた）勾配分離におけ
るＤ／ＤおよびＡ／Ａハプロタイプミニチュアブタの細胞由来の感染性ＰＥＲＶ
要素の存在は、標準化ウイルス調製の感染力価に対する３７℃でのインキュベー
ションの影響を示す。

【００６０】（実施例３）全長に近いＰＥＲＶ配列のＰＣＲに用いるプライマーの同定プライマー設計本発明に従って、全長に近いＰＥＲＶ配列を増幅する能力を持つＰＣＲプライ
マーは、全て既知のＣ型ＰＥＲＶヌクレオチド配列の増幅するために設計され、
プログラムジーンワークスを用いて配列された。配列のために、以下のＰＥＲ
Ｖヌクレオチド配列は、ジーンバンクのブラスト検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いて検索された。

【００６１】ウイルス名称アクセッション番号ＰＥＲＶ−ＡＡＦ０３８６０１ＰＥＲＶ−ＢＹ１７０１３ＰＥＲＶ−ＣＡＦ０３８６００

【００６２】ＰＥＲＶ−Ａ、−Ｂおよび−ＣのＬＴＲ領域は配列された。これらのＬＴＲ領
域において、３つのプロウイルス全てに共通するヌクレオチド配列は更なる分析
のために同定された。その後それぞれのヌクレオチド配列は、ＰＣＲプライマー
としての安定性を測定するために、プログラムジーノシスオリゴカリキュ
レーションにかけられた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｓｙｓ．ｃｏｍ）。
適合性基準は以下のものを含む：２０から２８塩基長、約６５℃のＴｍ、４５％
から７５％のＧＣ含量、二次構造を形成する可能性がない、プライマーダイマー
を形成しない。加えて、各プライマーはＰＥＲＶＬＴＲｓの５′または３′末
端のどちらかに対する特異的結合部位を有する必要がある。これらの基準に基づ
いて、以下のＰＣＲプライマーが同定された：

【００６３】

【表３】

【００６４】ＰＣＲ最適化ＰＥＲＶ−Ｂが感染したヒト２９３細胞由来のＤＮＡを用いることの最適化が
行われた。これらの細胞は、既知の全長ＰＥＲＶＤＮＡに対するシステムを最
適化する機会を与える一つのブタプロウイルスのみが感染している。感染された
細胞系列は、ＰＫ−１５ブタ腎臓細胞系列との共存培養によって引き起こされた
。

【００６５】全長に近いレトロウイルスゲノムを増幅するために、および密接に関連した配
列を区別するのに確実に十分な配列を増幅するために、ＤＮＡの長領域を増幅で
きるＤＮＡポリメラ−ゼを用いることが必要である。そのような酵素の例は、タ
カラＤＮＡポリメラ−ゼ（インタージェンカンパニー、パーチェイス、ニ
ューヨーク）、クロンテックアドバンテージＤＮＡポリメラ−ゼ（パロ
アルト、カリフォルニア）を含む。

【００６６】ＰＣＲプロトコルステップＰＣＲプログラムＰＣＲプログラム温度（℃）時間１９４３分２９４１０秒３６４３０４６８６分５６８２０分６６停止ステップ２から４は、ステップ５および６を行う前に３０回繰り返された。

【００６７】この分析から、続くヒト親和性ＰＥＲＶｓの同定に用いるための４つのプライ
マーの組み合わせが選択された。すなわち、ＪＷＦ−１／ＪＷＲ−５、ＪＷＦ−
２／ＪＷＲ−５、ＪＷＦ−３／ＪＷＲ−５およびＪＷＦ−４／ＪＷＲ−５である
。

【００６８】（実施例４）個々のブタ内に存在するヒト親和性ＰＥＲＶに寄与する遺伝子座の特徴付けこの方法は二つのステップを含む：個々のブタ由来のブタ細胞とヒト、例えば
２９３細胞との共存培養、およびそれに続く、個々のクローンのＤＮＡ配列分析
を伴うサンプル中に存在するＰＥＲＶの異なる型の数の同定。

【００６９】番号１２００２および１１６１９のブタ白血球抗原（ＳＬＡ）近交系ミニチュ
アブタ（トランスプランテーションバイオロジーリサーチセンター、マサ
チューセッツジェネラルホスピタル、ボストン、マサチューセッツ）由来の
末梢血単核細胞は、フィコール^ＴＭ勾配分離により、新鮮吸引血から単離され、
分析まで液体窒素下で凍結保存された。細胞１０^６個／ｍｌを用いて、細胞内の
ＰＥＲＶ発現は、ＲＰＭＩ培地中での刺激により引き起こされた。ＲＰＭＩ培地
は２０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ）および１０ｎｇ／ｍｌのホルボール１，２ミリステート１，３アセテート（
ＰＭＡ）を含む。刺激３日後で、おおよそ２×１０^６個の未感染ヒト２９３細胞
は、１０^７個のブタＰＢＭＣ中に添加された。この共存培養方法は、ＰＥＲＶが
ＰＢＭＣから指標細胞に伝達する期間を最大にするために、２４時間後に更なる
細胞画分に対して繰り返された。二つの別個の共存培養は、その後７日間プール
され、培養器中に維持された。細胞の感染は、培養上澄み中の逆転写酵素（ＲＴ
）活性の存在により測定され、これはＰＥＲＴまたは市販のＥＬＩＳＡｓ（キャ
ビッジテックＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）により測定することができる
。

【００７０】

【表４】

【００７１】ゲノムＤＮＡは単離され、ＰＣＲ産物は、ＲＴ活性レベルの高い培養細胞から
のＬＴＲＬＴＲ間ＰＣＲを用いて生産される。

【００７２】ＰＣＲ産物は、製造者の指示により、ＴＯＰＯＸＬクローニングキット（
インバイトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア）を用いてクローン化さ
れる。コロニーはカナマイシン（１００ｎｇ／μｌ）を含むＬＢ寒天培地プレー
ト上で生育された。

【００７３】ＤＮＡ配列決定は、（ウイルス配列を単離するのに用いるＬＴＲＬＴＲ間プ
ライマーの結合により）ＰＥＲＶゲノムについて行うことができる。しかし、最
も有益な配列情報は、エンベロープ領域の高い多様性の中にある。以下に詳細に
示されたようなプライマーは、エンベロープオープンリーディングフレー
ムの完全配列の測定に用いることができる。今日までに行われた試験においては
、ＤＮＡは標準技術により１６コロニーより調製され、２つのサンプル中に存在
する複製完全ＰＥＲＶの異なる型の数を測定するために配列分析にかけられた。
配列決定プライマーＤＡ１８５は、ジーンバンクアクセッション番号ＡＦ０３
８６００のヌクレオチド５５６１−５５８５、ｅｎｖタンパク質の５′から開始
メチオニンコドン領域に一致する。ＤＡ１８５の使用は、ＰＥＲＶ−ＡＨ１お
よびＰＥＲＶ−ＡＨ２と定義されている少なくとも２つの異なる点突然変異を示
すＰＥＲＶｅｎｖのタンパク質の配列決定分析を可能にする。７つの配列がブ
タ１２００２から得られ（図３、４参照）、９つの配列がブタ１１６１９から得
られた（図５、６参照）。

【００７４】

【表５】

【００７５】（実施例５）ヒト細胞に感染できるＰＥＲＶを持たないブタを発生させる繁殖プログラム繁殖プログラムの一つの例は以下のように実施される：実施例２に開示された方法を用いて、オスブタが任意にＰＥＲＶ１、２および
４と称したヒト親和性ＰＥＲＶｓを保有することが同定される（存在するＰＥＲ
Ｖｓの数は変わりうるが、この例ではブタは３つのヒト親和性ＰＥＲＶｓを持つ
）。同様に、メスブタがヒト親和性ＰＥＲＶ１、２および３を保有することが同
定される。この二頭のブタを交配する。この交配から生じる可能性のある子孫は
、以下のヒト親和性ＰＥＲＶの組み合わせを持つであろう：１、２、３、４１、２、３１、２、４１、２１、２動物は、３および４を保有すると同定されたブタと交配され、その結果生
じる子孫の可能性は：１、２、３、４１、２、３１、２、４１、３、４１、３１、４１、２２、３、４２、３２、４３、４１２３４無し

【００７６】繁殖プログラムは、ヒト親和性ＰＥＲＶを持たない動物を用いて続けられるで
あろう。

【００７７】従って、本発明はまた、少なくとも片方がヒト親和性ＥＲＶ陽性の親動物から
ヒト親和性ＰＥＲＶを持たない動物を産生するための方法に関連し、以下の構成
から成る：（ａ）同種のオスおよびメス動物、ここで少なくとも前記動物の片方がヒト親
和性ＥＲＶ遺伝子座に陽性である、を交配し、それにより子孫を産生する；（ｂ）ヒト親和性ＥＲＶを持たない子孫を選択する。

【００７８】一つの特異的な見地において、本発明はまた、少なくとも片方がヒト親和性Ｅ
ＲＶ陽性の親動物からヒト親和性ＥＲＶを持たない動物を産生するための方法に
関連し、以下の構成からなる：（ａ）同種のオスおよびメス動物、ここで少なくとも前記動物の片方がヒト親
和性ＥＲＶ遺伝子座に陽性である、を交配し、それにより子孫を産生する；（ｂ）（ａ）で産生されたオス動物と（ａ）で産生されたメス動物、ここで少
なくとも前記オスおよびメスの片方がヒト親和性ＥＲＶ遺伝子座に陽性であり、
もし両方がＥＲＶ遺伝子座に陽性である場合には、前記オスおよびメスはそれぞ
れ同一ヒト親和性ＥＲＶ遺伝子座に陽性でない、を交配する；（ｃ）ヒト親和性ＥＲＶを持たない子孫を選択する。

【００７９】一つの好ましい実施例において、前記動物はブタであり、最も好ましくはミニ
チュアブタであり、特にはＤＤハプロタイプのミニチュアブタである。

【００８０】他の好ましい実施例において、本発明は、少なくとも片方がヒト親和性ＥＲＶ
陽性の親動物から、ヒト親和性ＥＲＶを持たない動物を産生するための方法に関
する。ここで前記ＥＲＶはＰＥＲＶである。そのようなヒト親和性ＥＲＶ遺伝子
座は、通常オリゴヌクレオチドプローブを用いて測定される。

【００８１】本発明の方法の一つの好ましい実施例において、前述のステップ（ａ）におい
て交配されたオスおよびメスブタの両方は、ヒト親和性ＰＥＲＶ陽性であり、こ
こで前述の（ｂ）において交配された（ａ）の子孫はそれぞれヒト親和性ＰＥＲ
Ｖ陽性動物である。そのような方法の一つの好ましい実施例において、前記ブタ
はミニチュアブタであり、特にＤＤハプロタイプのミニチュアブタである。

【００８２】本発明の他の好ましい実施例において、前述の（ａ）において交配されたブタ
はそれぞれ一つのヒト親和性ＰＥＲＶ遺伝子座以外の全てに陽性であり、交配さ
れた前記オスおよびメスはそれぞれ異なるＰＥＲＶ遺伝子座に陰性である。前述
の（ｂ）において交配された子孫の交配組それぞれのオスおよびメスは、それぞ
れ陽性であったとしても、共通するヒト親和性ＰＥＲＶ遺伝子座の無いヒト親和
性ＰＥＲＶ遺伝子座の組み合わせに陽性である。

【００８３】本発明の方法の特異的実施例において、ステップ（ａ）は、子孫を産生するた
めに、ＰＥＲＶ１、２、４を保有するブタとＰＥＲＶ１、２、３を保有するブタ
を交配させることより成り、ステップ（ｂ）はＰＥＲＶ３、４を保有する（ａ）
の子孫とステップ（ａ）の１、２陽性の子孫を交配することより成る。

【００８４】そのような方法の一つの特異性の高い実施例において、ステップ（ａ）におい
てＰＥＲＶ１、２、４を保有するブタはオスブタであり、ステップ（ａ）におい
てＰＥＲＶ１、２、３を保有する前記ブタはメスブタである。他の特異性の高い
実施例において、（ｂ）においてＰＥＲＶ３、４を保有するブタはオスブタであ
り、ステップ（ｂ）においてＰＥＲＶ１、２を保有する前記ブタはメスブタであ
る。一つの非常に特異的なそれらの実施例において、ステップ（ａ）においてＰ
ＥＲＶ１、２、４を保有するブタはオスブタであり、ステップ（ａ）においてＰ
ＥＲＶ１、２、３を保有するブタはメスブタである。そして、ここにおいて（ｂ
）においてＰＥＲＶ３、４を保有する前記ブタはオスブタであり、ステップ（ｂ
）においてＰＥＲＶ１、２を保有する前記ブタはメスブタである。この方法の好
ましい一つの実施例において、前記ブタはミニチュアブタであり、特にＤＤハプ
ロタイプのミニチュアブタである。

【００８５】参考文献：１．クリティカルデータ、ＵＮＯＳ．ａｔｗｗｗ．ｕｎｏｓ．ｏｒｇ．２．インスティチュートオブメディシン．異種移植、科学、倫理学および公
序良俗（ナショナルアカデミープレス、ワシントンＤ．Ｃ．、１９９６年）
３．ストイＪＰおよびコフィンＪＭ、ネイチャーメディシン、１巻：１１
００ページ（１９９５年）４．アランＪＳ、ネイチャーメディシン、２巻：１８−２０ページ（１９９
６）５．フィッシュマンＪＡとルービンＲＨ、ＮＥＪＭ、３３８巻：１７４１−
５１ページ（１９９８）６．リムＣＣ他、シンガポールメディカルジャーナル、５巻：３５６−８
ページ（１９９９年）７．フィッシュマンＪＡ、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ、５１、Ｓｕｐｌ５８巻：
Ｓ４１−５５（１９９７年）８．ミルズＪＮ他、ＥｍｅｒｇＩｎｆｅｃｔＤｉｓ、５巻：１３５−４２
ページ（１９９９年）９．リーバーＭＭ他、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、７２
巻：２３１５−９ページ（１９９２年）１０．ドナフ他、ＪＥｘｐＭｅｄ、１７６巻：１１２５−３５ページ（１９
９２年）１１．ペイシェンス他、ネイチャーＭｅｄ、３巻：２８２−６ページ（１９９
７年）１２．タケウチ他、ＪＶｉｒｏｌ、７２巻：９９８６−９ページ（１９９８年
）１３．ウィルソンＣＡ他、ＪＶｉｒｏｌ、７２巻：３０８２−７（１９９８
年）１４．へナインＷ他、ランセット、３５２巻：６９５−９ページ（１９９８年
）１５．ペイシェンスＣ他、ランセット、３５２巻：６９９−７０１ページ（１
９９８年）１６．パラディスＫ他、サイエンス、２８５巻：１２３６−４１ページ（１９
９９年）１７．マーティンＵ他、ランセット、３５２巻：６９２−４ページ（１９９８
年）１８．シルバーＪ他、核酸Ｒｅｓ２１：３５９３−４（１９９４年）

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に従って開示された群内で維持される３つの異なるハプロ
タイプと３つの組換え体を示す図。ミニチュアブタの群は、主要組織適合抗原複
合体／ブタ白血球抗原（ＭＨＣ／ＳＬＡ）については完全に近交系で、その他の
遺伝子座については部分的に近交系である（一般に、近交系交配の〜０．８２程
度）。

【図２】ＰＥＲＶ（ＰｉｇＥｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓＲｅｔｒｏｖｉｒ
ｕｓ）ゲノムの配置およびゲノムを増幅するために用いるプライマーの位置を示
す図である。

【図３（ａ）】番号１２００２が付けられた、７種のクローンを生じた（
パネル３（ａ）から３（ｇ）における、それぞれ番号１から７。これらのクロー
ンの調製は実施例４に開示される）、ブタ白血球抗原（ＳＬＡ）近交系ミニチュ
アブタ由来の末梢血単核細胞から得られた種々のクローンのヌクレオチド配列を
示す図である。

【図３（ｂ）】図３（ａ）と同じ。

【図３（ｃ）】図３（ａ）と同じ。

【図３（ｄ）】図３（ａ）と同じ。

【図３（ｅ）】図３（ａ）と同じ。

【図３（ｆ）】図３（ａ）と同じ。

【図３（ｇ）】図３（ａ）と同じ。

【図４】実施例４により生じた７つのクローンのヌクレオチド配列および
図３で示された配列の比較の結果を示す図。クローン１２００２−１は、３４９
番目の位置で１ヌクレオチドだけ他のクローンとの違いを示す。この結果はＰＥ
ＲＶ配列の他の変形を反映する可能性もあり、一方、クローニングおよび塩基配
列決定法による人工産物の可能性もまたある。

【図５（ａ）】番号１１６１９が付けられた、９種のクローンを生じた（
パネル６（ａ）から６（ｉ）における、それぞれ番号１から９。これらのクロー
ンの調製は実施例４に開示される）、ブタ白血球抗原（ＳＬＡ）近交系ミニチュ
アブタ由来の末梢血単核細胞から得られた種々のクローンのヌクレオチド配列を
示す図である。

【図５（ｂ）】図５（ａ）と同じ。

【図５（ｃ）】図５（ａ）と同じ。

【図５（ｄ）】図５（ａ）と同じ。

【図５（ｅ）】図５（ａ）と同じ。

【図５（ｆ）】図５（ａ）と同じ。

【図５（ｇ）】図５（ａ）と同じ。

【図５（ｈ）】図５（ａ）と同じ。

【図５（ｉ）】図５（ａ）と同じ。

【図６】実施例４により生じた７つ〔原文通り〕のクローンのヌクレオチ
ド配列および図５で示された配列の比較の結果を示す図。分析された全ての配列
はＰＥＲＶ−ＡＨ２型のものである。配列の数と、エンベロープ遺伝子の開始か
らＶＲＢ領域までの詳細に研究されたこれらのクローンに対する配列が示される
。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＭＧ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｈ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (31)優先権主張番号６０／２４３，６９５ (32)優先日平成12年10月27日(2000．10．27) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B063 QA01 QA19 QQ10 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR55 QS25 QS26 QS34 QX01 4B065 AA90X AC20 BA30 CA44 4C081 AB35 BA14 CD34 EA01 EA11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】異種移植のための一つのプロセスであって、ヒトに感染性を
示す内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）を持たないブタから得られた器官、組織
または細胞をそれを必要とするヒト患者に導入することを含むことを特徴とする
プロセス。
【請求項２】請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ブタがミニチ
ュアブタであることを特徴とするプロセス。
【請求項３】請求項２記載のプロセスであって、ここで前記ミニチュアブ
タがＤＤハプロタイプであることを特徴とするプロセス。
【請求項４】ヒト患者における疾病を予防する一つのプロセスであって、
請求項１で使用できる器官、組織または細胞を前記疾病の危険にさらされている
ヒト患者に導入することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項５】請求項４記載のプロセスであって、ここで前記ブタがミニチ
ュアブタであることを特徴とするプロセス。
【請求項６】請求項５記載のプロセスであって、ここでミニチュアブタが
ＤＤハプロタイプであることを特徴とするプロセス。
【請求項７】請求項１記載のプロセスであって、ここで前記器官または組
織が細胞サンプルの治療有効量であることを特徴とするプロセス。
【請求項８】請求項７記載のプロセスであって、ここで細胞が幹細胞であ
ることを特徴とするプロセス。
【請求項９】疾病に悩むヒト患者における疾病を処置する一つのプロセス
であって、請求項１で使用される器官、組織または細胞をそれを必要とするヒト
患者に導入することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１０】請求項９記載のプロセスであって、ここでブタがミニチュ
アブタであることを特徴とするプロセス。
【請求項１１】請求項１０記載のプロセスであって、ここでミニチュアブ
タがＤＤハプロタイプのものであることを特徴とするプロセス。
【請求項１２】請求項９記載のプロセスであって、ここで器官または組織
が細胞サンプルの治療有効量であることを特徴とするプロセス。
【請求項１３】請求項１２記載のプロセスであって、ここで細胞が幹細胞
であることを特徴とするプロセス。
【請求項１４】内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）ＤＮＡについて動物を検
査する一つのプロセスであって、（ａ）試験される動物から末梢血単核細胞（ＰＥＭＣ）のサンプルを入手し、
前記細胞をＥＲＶ刺激因子の刺激量と接触させて前記細胞でのＥＲＶ発現を刺激
し、（ｂ）（ａ）段階の前記刺激細胞を未感染指標細胞のサンプルと接触させ、前
記細胞を感染を受けるように共存培養し、（ｃ）第２の共存培養を形成するために細胞の個別画分で（ａ）と（ｂ）の段
階の手続を繰返し、（ｄ）（ｂ）と（ｃ）の段階で産生された共存培養物を組合せ、また（ｅ）（ｄ）段階の細胞での逆転写酵素活性を測定するという段階を含み、これにより前記逆転写酵素活性の存在がＥＲＶＤＮＡの存
在を指示することを特徴とするプロセス。
【請求項１５】請求項１４記載のプロセスであって、ここで動物がミニチ
ュアブタであることを特徴とするプロセス。
【請求項１６】請求項１４記載のプロセスであって、ここでＥＲＶがＰＥ
ＲＶであることを特徴とするプロセス。
【請求項１７】請求項１４記載のプロセスであって、ここで指標細胞がヒ
ト細胞であることを特徴とするプロセス。
【請求項１８】請求項１５記載のプロセスであって、ここで逆転写酵素が
生産物増強逆転写酵素（ＰＥＲＴ）検定で検定されることを特徴とするプロセス
。
【請求項１９】請求項１４記載のプロセスであって、ここでＥＲＶ刺激因
子がフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）またはＰＭＡであることを特徴とするプロ
セス。
【請求項２０】請求項１４記載のプロセスであって、ここで（ｃ）段階が
（ｂ）段階２４時間後に行われることを特徴とするプロセス。
【請求項２１】請求項１４記載のプロセスであって、ここで（ｄ）段階が
（ｂ）段階の少なくとも約７日後に行われることを特徴とするプロセス。
【請求項２２】請求項１４記載のプロセスであって、ここで共存培養内に
存在する細胞がＰＢＭＣ：指標細胞が約５：１の割合で存在することを特徴とす
るプロセス。
【請求項２３】請求項２２記載のプロセスであって、ここで指標細胞数が
約２×１０^５であり、ＰＢＭＣ数が約１０^６であることを特徴とするプロセス。
【請求項２４】請求項１４記載のプロセスであって、ここで刺激に十分な
前記期間が少なくとも約３日であることを特徴とするプロセス。
【請求項２５】請求項１５記載のプロセスであって、ここでミニチュアブ
タがＤＤハプロタイプのものであることを特徴とするプロセス。
【請求項２６】ＤＤハプロタイプの一匹の近交系ブタであって、ここで前
記ミニチュアブタがそのゲノムから感染性ＰＥＲＶ遺伝子配列を除去するために
近交系であることを特徴とする近交系ブタ。
【請求項２７】請求項２６記載の近交系ブタであって、ここで前記ブタが
ミニチュアブタであることを特徴とする近交系ブタ。
【請求項２８】少なくともその一匹がヒト親和性ＥＲＶ陽性である親動物
からヒト親和性ＥＲＶを持たない動物を産生する一つのプロセスであって、（ａ）同じ種の雄と雌の動物を交配させ、ここで少なくとも前記動物の一匹は
ヒト親和性ＥＲＶ遺伝子座で陽性でありこれにより子孫を産出し、また（ｂ）ヒト親和性ＥＲＶを持たない子孫を選別する、ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２９】少なくともその一匹がヒト親和性ＥＲＶ陽性である親動物
からヒト親和性ＥＲＶを持たない動物を産生する一つのプロセスであって、（ａ）同じ種の雄と雌の動物を交配させ、ここで少なくとも前記動物の一匹は
ヒト親和性ＥＲＶ遺伝子座で陽性であり、これにより子孫を産出し、（ｂ）（ａ）で産生された雄動物と（ａ）で産生された雌動物を交配させ、こ
こで前記雄と雌動物の少なくとも一匹がヒト親和性ＥＲＶ遺伝子座で陽性であり
、またここでもしその両方がＥＲＶ遺伝子座で陽性であるならば前記雄と雌は同
じヒト親和性ＥＲＶ遺伝子座にそれぞれが陽性ではなく、また（ｃ）ヒト親和性ＥＲＶを持たないこれらの子孫を選別する、ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項３０】請求項２９記載のプロセスであって、ここで前記動物がブ
タであることを特徴とするプロセス。
【請求項３１】請求項３０記載のプロセスであって、ここで前記動物がミ
ニチュアブタであることを特徴とするプロセス。
【請求項３２】請求項３１記載のプロセスであって、ここで前記ミニチュ
アブタがＤＤハプロタイプのものであることを特徴とするプロセス。
【請求項３３】請求項２９記載のプロセスであって、ここで前記ＥＲＶが
ＰＥＲＶであることを特徴とするプロセス。
【請求項３４】請求項２９記載のプロセスであって、ここで前記ヒト親和
性ＥＲＶ遺伝子座がオリゴヌクレオチドプローブを用いて決定されることを特徴
とするプロセス。
【請求項３５】請求項３０記載のプロセスであって、ここで（ａ）段階で
交配される雄および雌ブタの両方がヒト親和性ＰＥＲＶ陽性であり、またここで
（ｂ）で交配される（ａ）の子孫がそれぞれヒト親和性ＰＥＲＶ陽性動物である
ことを特徴とするプロセス。
【請求項３６】請求項３５記載のプロセスであって、ここで前記ブタがミ
ニチュアブタであることを特徴とするプロセス。
【請求項３７】請求項３６記載のプロセスであって、ここで前記ミニチュ
アブタがＤＤハプロタイプのものであることを特徴とするプロセス。
【請求項３８】請求項３５記載のプロセスであって、ここで（ａ）で交配
されたブタが１個のヒト親和性ＰＥＲＶ座を除きすべてそれぞれ陽性であり、そ
のように交配された雄と雌が異なるＰＥＲＶ遺伝子座に対してそれぞれ陰性であ
り、また（ｂ）で交配された子孫のそれぞれの交配組の雄と雌は、共通するヒト
親和性ＰＥＲＶ陽性であったとしても遺伝子座の無いヒト親和性ＰＥＲＶ遺伝子
座の組み合わせに陽性であることを特徴とするプロセス。
【請求項３９】請求項３８記載のプロセスであって、ここで（ａ）段階が
子孫を産生するためにＰＥＲＶ１、２、４を保有するブタとＰＥＲＶ１、２、３
を保有するブタを交配することを含み、また（ｂ）段階がＰＥＲＶ３、４を保有
する（ａ）の子孫と（ａ）段階の１、２陽性の子孫を交配することを含むことを
特徴とするプロセス。
【請求項４０】請求項３９記載のプロセスであって、ここでＰＥＲＶ１、
２、４を保有する（ａ）段階の前記ブタが雄ブタであり、ＰＥＲＶ１、２、３を
保有する（ａ）段階の前記ブタが雌ブタであることを特徴とするプロセス。
【請求項４１】請求項３９記載のプロセスであって、ここでＰＥＲＶ３、
４を保有する（ｂ）の前記ブタが雄ブタであり、ＰＥＲＶ１、２を保有する（ｂ
）段階の前記ブタが雌ブタであることを特徴とするプロセス。
【請求項４２】請求項３９記載のプロセスであって、ここでＰＥＲＶ１、
２、４を保有する（ａ）段階の前記ブタが雄ブタであり、ＰＥＲＶ１、２、３を
保有する（ａ）段階の前記ブタが雌ブタであり、またここでＰＥＲＶ３、４を保
有する（ｂ）の前記ブタが雄ブタであり、ＰＥＲＶ１、２を保有する（ｂ）段階
の前記ブタが雌ブタであることを特徴とするプロセス。
【請求項４３】請求項４２記載のプロセスであって、ここで前記ブタがミ
ニチュアブタであることを特徴とするプロセス。
【請求項４４】請求項４３記載のプロセスであって、ここで前記ミニチュ
アがＤＤハプロタイプのものであることを特徴とするプロセス。