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JP2003521943A - エンドヌクレアーゼ活性を有するヌクレオザイム - Google Patents

エンドヌクレアーゼ活性を有するヌクレオザイム

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Publication number
JP2003521943A
JP2003521943A JP2001558240A JP2001558240A JP2003521943A JP 2003521943 A JP2003521943 A JP 2003521943A JP 2001558240 A JP2001558240 A JP 2001558240A JP 2001558240 A JP2001558240 A JP 2001558240A JP 2003521943 A JP2003521943 A JP 2003521943A
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JP
Japan
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nucleic acid
acid molecule
cell
rna
nucleotide
Prior art date
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Pending
Application number
JP2001558240A
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English (en)
Inventor
ブレイカー，ロナルド
ベイジェルマン，レオニド
エミルソン，ゲイル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yale University
Original Assignee
Yale University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yale University filed Critical Yale University
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Abstract

(57)【要約】 本発明は，酵素的核酸分子，例えば，リボザイムおよびヌクレオザイム（ＤＮＡ触媒，ＤＮＡ酵素），その合成方法，およびその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本特許出願は，Ｂｒｅａｋｅｒら，米国特許出願（６０／１９３，６４６，２
０００年３月３１日出願，表題"ＮＵＣＬＥＯＺＹＭＥＳ ＷＩＴＨ ＥＮＤＯ
ＮＵＣＬＥＡＳＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ"）およびＢｒｅａｋｅｒら，米国特許出
願（６０／１８１，３６０，２０００年２月８日出願，表題"ＮＵＣＬＥＩＣ
ＡＣＩＤ ＣＡＴＡＬＹＳＴＳ ＷＩＴＨ ＥＮＤＯＮＵＣＬＥＡＳＥ ＡＣＴ
ＩＶＩＴＹ"）に基づく優先権を主張する。これらの特許出願は，図面を含めそ
の全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００２】 本発明は，酵素活性を有する核酸分子（ヌクレオザイム），例えばデオキシリ
ボ核酸分子，およびその誘導体に関する。
【０００３】 以下は酵素的核酸分子の簡単な説明である。この概要は，完全であることを意
味するものではなく，以下の本発明を理解するために提供される。この概要は，
以下に記載されるすべての研究が本発明に対する先行技術であることを認めるも
のではない。
【０００４】 酵素的核酸分子は，別個の核酸分子をヌクレオチド塩基配列特異的様式で繰り
返し（多数ターンオーバー）切断することを含む，種々の反応の１またはそれ以
上を触媒しうる核酸分子である。このような酵素的核酸分子を用いて，例えば，
事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的化することができる（Ｚａｕｇ ｅｔ ａ
ｌ．，３２４，Ｎａｔｕｒｅ ４２９ １９８６；Ｃｅｃｈ，２６０ ＪＡＭＡ
３０３０，１９８８）。
【０００５】 トランス切断酵素的核酸分子は，その配列特異性のため，ヒト疾患の治療薬と
して有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５ Ａｎｎ．Ｒｅｐ
．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ
ａｎｄ Ｍａｒｒ，１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３
７）。酵素的核酸分子は，細胞ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的
を切断するように設計することができる。そのような切断事象は，ｍＲＮＡを非
機能的にして，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除することができる。このよう
にして，疾病状態に関連する蛋白質の合成を選択的に阻害することができる。
【０００６】 一般に，ＲＮＡ切断活性を有する酵素的核酸は，最初に標的ＲＮＡに結合する
ことにより作用する。そのような結合は，標的ＲＮＡを切断する作用をする分子
の酵素的部分に近接して保持された，酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。
すなわち，酵素的核酸は，まず標的ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によ
りこれに結合し，いったん正しい部位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮ
Ａを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合
成を指示するその能力を破壊するであろう。酵素的核酸は，そのＲＮＡ標的に結
合し切断した後，そのＲＮＡから離れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し
結合して切断することができる。
【０００７】 新規な核酸触媒を進化させるためにいくつかのアプローチ，例えばインビトロ
選択および／またはインビトロ進化戦略が用いられてきた（Ｏｒｇｅｌ，１９７
９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）。これらのアプ
ローチを用いて，種々の反応，例えばホスホジエステル結合およびアミド結合の
切断およびライゲーションを触媒しうる新規な核酸触媒が進化してきた（Ｊｏｙ
ｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ．
，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９９２
，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６７，９０−９７；Ｂｒｅａｋ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ
ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８；Ｓ
ｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９６
，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２）。
【０００８】 酵素活性が最適であるリボザイムの開発は，遺伝子発現の制御の目的でＲＮＡ
切断リボザイムを用いるすべての戦略に著しく貢献するであろう。例えば，ハン
マーヘッドリボザイムは，飽和濃度（１０ｍＭ）のＭｇ2+補因子の存在下で，約
１ｍｉｎ-1の触媒速度（ｋｃａｔ）で機能する。しかし，細胞内部で見いだされ
る濃度と近いＭｇ2+濃度（０．５−２ｍＭ）においては，このリボザイムの速度
は１０から１００倍遅い。これに対し，ＲＮａｓｅＰホロ酵素は，最適アッセイ
条件下で約３０ｍｉｎ-1のｋｃａｔでプレｔＲＮＡ切断を触媒しうる。人工的な
"ＲＮＡリガーゼ"リボザイムは，約１００ｍｉｎ-1の速度で対応する自己修飾反
応を触媒することが示されている。さらに，ＤＮＡからなる基質結合アームを有
するある種の改変ハンマーヘッドリボザイムは，１００ｍｉｎ-1にほぼ等しい多
数ターンオーバー速度でＲＮＡ切断を触媒することが知られている。最後に，あ
る種のヌクレオチド類似体を有するハンマーヘッドの触媒コア中の特定の残基を
置換すると，触媒速度において１０倍程度の改良を示す修飾リボザイムが得られ
る。これらの知見は，リボザイムがほとんどの天然の自己切断リボザイムによっ
てインビトロで示されるより有意に速い触媒速度で化学的変換を促進しうること
を示す。したがって，ある種の自己切断リボザイムの構造を最適化して最大の酵
素活性を与えること，または，ＲＮＡホスホジエステル切断について有意に速い
速度を示す全く新規なＲＮＡモチーフを作成することが可能である。
【０００９】 リボザイム，例えばハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムを用
いて，ヌクレオチド配列と酵素活性との間の相関を探索するために，一連の大規
模な部位特異的突然変異実験が行われてきた。これらの系統的実験は，リボザイ
ムの保存されたコア中のほとんどのヌクレオチドは，酵素活性の顕著な喪失なし
では変異させられないことを明らかにした。これに対し，突然変異リボザイムの
大きなプールを酵素活性を有するＲＮＡについて同時にスクリーニングするコン
ビナトリアル戦略をより有効に用いて，不変の配列を規定し，新規リボザイム変
種を同定することができた。
【００１０】 Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７，ＲＮＡ ３，９１４）は，エンドヌクレ
アーゼ活性を有する新規リボザイム配列を報告しており，ここで，著者らはこれ
らのリボザイムを単離するためにインビトロ選択を用いた。
【００１１】 Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８ ＰＮＡＳ ９５，２１５８−２１６２
）は，拡大された範囲の切断可能なトリプレットを有するハンマーヘッド様リボ
ザイムのインビトロ選択を記載する。
【００１２】 Ｂｒｅａｋｅｒ（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９８／４３９９３）は，触媒コアを包含
する配列変種を有するハンマーヘッド様リボザイムのインビトロ選択を記載する
。
【００１３】 最近まで，触媒的核酸分子はすべて，その酵素的機能のためには，分子中に２
’−ヒドロキシル（２’−ＯＨ）基の存在が必要であることが知られていた。Ｕ
ｓｍａｎおよび共同研究者らは，最近，２’−ヒドロキシル基を欠失している核
酸分子，例えばＤＮＡ分子が化学反応を触媒しうることを報告した（Ｃｈａｒｔ
ｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，２３（２０），４０９２−４０９６；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国
特許５，８６１，２８８）。化学反応を触媒しうる２’−ＯＨを含有しない核酸
分子についてのいくつかの報告が存在する（Ｌｉ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ，１
９９９，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，９，３１５−３２３；
Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７
，４２２−４２３）。インビトロ選択および／またはインビトロ進化手法を一本
鎖ＤＮＡのランダムプールに適用して用いることにより，ＲＮＡの切断（Ｕｓｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８６１，２８８；Ｂｒｅａｋｅｒ ａｎｄ
Ｊｏｙｃｅ，１９９４，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１，２２３−２２９；Ｂｒｅａ
ｋｅｒ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６５５−６６
０），化学的に活性化されたＤＮＡのライゲーションの促進（Ｃｕｅｎｏｕｄ
ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ，３７５，６１１−６１４）
，およびポルフィリン環の金属化（Ｌｉ ａｎｄ Ｓｅｎ，１９９６，Ｎａｔ．
Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３，７４３−７４７）を触媒しうる触媒的ＤＮＡ，
またはデオキシリボザイムが得られている。
【００１４】 触媒的ＤＮＡ構造によるトランスエステル化によるＲＮＡの切断は，しばしば
，金属イオン補因子，例えばＭｇ2+，Ｍｎ2+，Ｚｎ2+，Ｐｂ2+，Ｃａ2+，および
Ｃｄ2+，またはアミノ酸補因子，例えばヒスチジンに依存性である（Ｒｏｔｈ
ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９８，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９５，６０２７−６
０３１）。しかし，触媒作用を担う化学基を提供するためには，ＤＮＡ単独の天
然の構造で十分であろう（Ｇｅｙｅｒ ａｎｄ Ｓｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｌ．，４，５７９−５９３）。
【００１５】 Ｊｏｙｃｅ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（米国特許５，８０７，７１８）は，規
定された構造および標的配列の制約を有する特定のマグネシウム依存性ＲＮＡ切
断ＤＮＡ酵素を記載する。
【００１６】発明の概要 本発明は，ＲＮＡまたはＤＮＡの切断に特に有用な，酵素活性を有する核酸分
子に関する。本発明の核酸触媒は，当該技術分野において知られる他の核酸触媒
とは異なる。本発明の核酸触媒は，他の既知の酵素的核酸分子，例えば他の既知
のＤＮＡ酵素とは，共通の配列ホモロジーを有しない。特に本発明の核酸触媒は
，分子間または分子内エンドヌクレアーゼ反応を触媒することができる。
【００１７】 好ましい態様においては，本発明は，式ＩまたはＩＩ： 式Ｉ
【化５】 式ＩＩ
【化６】 のいずれかを有する，酵素活性を有する核酸分子を特徴とする。
【００１８】 上述の式ＩおよびＩＩにおいて，ＸおよびＹは，独立して，標的核酸分子と安
定に相互作用する（例えば，標的中の相補的ヌクレオチドと水素結合を形成する
ことにより）のに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり（標的は，ＲＮＡ，Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ混合ポリマーであることができ，例えば，塩基，糖，
および／またはリン酸ヌクレオチド修飾を含んでいてもよいポリマーであり；そ
のような修飾は，好ましくは天然に生ずる修飾である），好ましくは，Ｘおよび
Ｙの長さは，独立して，３−２０ヌクレオチドの長さ（特に，３，４，５，６，
７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１７，および２０）であり
；ＸおよびＹは，同じ長さであっても異なる長さであってもよく；＿は化学結合
（例えば，リン酸エステル結合，アミド結合または当該技術分野において知られ
る他の結合）を表し；Ｚは，独立して，５’−ＧＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧ
ＧＣＧＴＴＴ−３’（配列番号１０３）を含むヌクレオチド配列であり，Ｒは，
独立して，５’−ＧＧＧＧＡ−３’を含むヌクレオチド配列であり，Ｖは，ヌク
レオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し，これは存在しても存在しなくて
もよく，（例えば，分子は，２つの別々の分子から組み立てられる），存在する
場合には，一本鎖および／または二本鎖領域を含んでいてもよいヌクレオチドお
よび／または非ヌクレオチドリンカーであり；Ｗは，独立して，５’−ＴＧＧＧ
ＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号１０４），５’−ＴＧＧＧＧＡＡＧ
ＣＴＣＴＧＧＧＴ−３’（配列番号１０５），５’−ＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＡ
ＧＧＧＴ−３’（配列番号１０６），および５’−ＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴ
ＧＧＴ−３’（配列番号１０７）を含む群から選択されるヌクレオチド配列であ
り；分子の活性を有意に変更することなくこれらの配列への付加，欠失および置
換が可能であり，したがってこれらも本発明の範囲内であり；およびＣ，Ｇ，Ａ
，およびＴは，それぞれシチジン，グアノシン，アデノシンおよびチミジンヌク
レオチドを表す。式ＩおよびＩＩの各々の中のヌクレオチドは，当該技術分野に
おいて知られるように，糖，塩基，および／またはリン酸で修飾されていてもよ
く修飾されていなくてもよい。
【００１９】 好ましい態様においては，ヌクレオチドリンカー（Ｖ）は，５’−ＡＣＣＴＧ
ＡＧＧＧ−３’，５’−ＧＣＧＴＴＡＧ−３’および５’−ＡＧＧＡＡＧＣＡＴ
ＣＴＴＡＴＧＣＧＡＣＣ−３’（配列番号１０８）からなる群より選択される核
酸配列である。
【００２０】 ヌクレオチドリンカーＶは，好ましくは５−４０ヌクレオチドの長さであり，
より好ましくは７−２０ヌクレオチドの長さであり，さらに好ましくは７−１２
ヌクレオチドの長さである。
【００２１】 さらに別の態様においては，ヌクレオチドリンカー（Ｖ）は核酸アプタマー，
例えば，ＡＴＰアプタマー，ＨＩＶＲｅｖアプタマー（ＲＲＥ），ＨＩＶＴａｔ
アプタマー（ＴＡＲ）および他のアプタマーである（概説として，Ｇｏｌｄ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；
およびＳｚｏｓｔａｋ＆Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，１９９３，Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏ
ｒｌｄ，ｅｄ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ ａｎｄ Ａｔｋｉｎｓ，ｐｐ．５１１，Ｃ
ＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照）。本明細書において用いる
場合，"核酸アプタマー"とは，リガンドと相互作用しうる核酸配列を示すことを
意味する。リガンドは任意の天然または合成の分子であることができ，例えば，
限定されないが，樹脂，代謝産物，ヌクレオシド，ヌクレオチド，薬剤，トキシ
ン，遷移状態類似体，ペプチド，脂質，蛋白質，アミノ酸，核酸分子，ホルモン
，炭水化物，レセプター，細胞，ウイルス，細菌および他のものでありうる。
【００２２】 別の態様においては，非ヌクレオチドリンカー（Ｖ）は本明細書において定義
されるとおりである。本明細書において用いる場合，"非ヌクレオチド"には，無
塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化
物，脂質，またはポリ炭化水素化合物が含まれる。これらの化合物は，１または
それ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖中に組み込むことができ，糖およ
び／またはリン酸置換を含んでいてもよく，残りの塩基がその酵素的活性を示す
ことを可能とする。基または化合物は，一般的に認識されるヌクレオチド塩基，
例えば，アデニン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まない場合
，無塩基である。本明細書において用いる場合，"無塩基"または"無塩基ヌクレ
オチド"との用語は，塩基を欠失しているか，１’位置にヌクレオチド塩基の代
わりに他の化学基を有する糖成分を包含する。非ヌクレオチドの特定の例には，
Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
９９０，１８：６３５３およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７
，１５：３１１３；Ｃｌｏａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ
Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０
９；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２
１：２５８５およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２：１７５１；Ｄ
ｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，
１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ ｅ ｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１９９１，１０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９３，３４：３０１；Ｏｎｏ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ
ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国
際公開ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５
／１１９１０およびＦｅｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４０００（すべて本明細書の一部としてここ
に引用する）に記載されるものが含まれる。すなわち，好ましい態様においては
，本発明は，１またはそれ以上の非ヌクレオチド成分を有し，ＲＮＡまたはＤＮ
Ａ分子を切断する酵素的活性を有する酵素的核酸分子を特徴とする。
【００２３】 本明細書において用いる場合，"ヌクレオザイム"または"ＤＮＡ酵素"または"
ＤＮＡｚｙｍｅ"または"デオキシリボザイム"とは，その活性のために分子中に
リボヌクレオチド（２’−ＯＨ）基の存在を必要としない酵素的核酸分子を意味
する。これらの分子はまた，触媒的ＤＮＡ，核酸触媒，制限エンドヌクレアーゼ
，触媒的オリゴヌクレオチド，および酵素的ＤＮＡ分子とも称される。特定の態
様においては，酵素的核酸分子は，付加されたリンカーまたは他の付加されたま
たは会合した基，成分，または２’−ＯＨ基を有する１またはそれ以上のヌクレ
オチドを含む鎖を有していてもよい。ＤＮＡｚｙｍｅｓは，化学的に合成するか
または一本鎖ＤＮＡベクターまたはその同等物によりインビボで内生的に発現さ
せることができる。
【００２４】 "酵素的核酸分子"とは，基質結合領域において特定の遺伝子標的に相補性を有
し，かつ，標的ＲＮＡを特異的に切断するよう作用する酵素的活性を有する核酸
分子を意味する。すなわち，酵素的核酸分子は，分子間でＲＮＡを切断し，この
ことにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。これらの相補的領域は
，酵素的核酸分子が標的ＲＮＡに十分にハイブリダイズして切断が生ずることを
可能にする。１００％の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い相補性も
また本発明において有用である（例えば，Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂ
ｅｃｋ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２
０９２−２０９６；Ｈａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｓｅｎ
ｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，２５−３
１を参照）。核酸は塩基，糖および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。
【００２５】 本発明の酵素的核酸分子（例えば，式ＩおよびＩＩの分子）は，種々の反応を
触媒する（その速さおよび／または速度を変更する）ことができ，例えば，ヌク
レオチド塩基配列特異的様式で他の別個の核酸分子を繰り返し（多数ターンオー
バー）切断する能力（エンドヌクレアーゼ活性）を有する。エンドヌクレアーゼ
活性を有するそのような分子は，基質結合領域（例えば，式ＩおよびＩＩのＸお
よびＹ）において特定の遺伝子標的に対する相補性を有することができ，その標
的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に切断する酵素的活性を有する。すなわち，
エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は，分子内でまたは分子間でＲＮＡま
たはＤＮＡを切断し，このことにより，標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を不活性化
することができる。相補性は，酵素的ＤＮＡ分子が標的ＲＮＡまたはＤＮＡに十
分にハイブリダイズして切断が生ずることを可能にする。１００％の相補性が好
ましいが，５０−７５％程度の低い相補性もまた本発明において有用である。核
酸は塩基，糖および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。当業者に容易に
認識されるように，必要なことは，酵素的核酸分子がその酵素活性のために分子
中のリボヌクレオチドの存在に依存しないことのみである。
【００２６】 好ましい態様においては，式ＩおよびＩＩの酵素的核酸は，１またはそれ以上
の非リボヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドのストレッチを含み，これは分子
の酵素的活性を与える。必要な非リボヌクレオチド成分は当該技術分野において
知られている。
【００２７】 すなわち，１つの好ましい態様においては，本発明は，遺伝子発現および／ま
たは細胞増殖を阻害するＤＮＡ酵素を特徴とする。これらの化学的にまたは酵素
的に合成された核酸分子は，特定の標的核酸分子のアクセス可能な領域に結合す
る基質結合ドメインを含む。核酸分子はまた，標的の切断を触媒するドメインを
含む。酵素的核酸分子は，標的分子に結合するとこれを切断し，例えば，翻訳お
よび蛋白質蓄積を防止する。標的遺伝子が発現されないため，例えば細胞増殖が
阻害される。本発明の別の観点においては，標的分子を切断する酵素的核酸分子
は一本鎖ＤＮＡ細胞間発現ベクターから発現される。好ましくは，ＤＮＡ酵素を
発現しうるベクターは，下記のように輸送され，標的細胞中に残留する。ＤＮＡ
酵素の過渡的発現を与える適切なベクターを用いることができる。そのようなベ
クターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば
，ＤＮＡ酵素は標的ｍＲＮＡを切断する。ＤＮＡ酵素を発現するベクターの輸送
は，全身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標
的細胞に投与した後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中へ
の導入を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる（総説について
は，Ｃｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照
）。
【００２８】 好ましい態様においては，本発明は，式ＩＩＩおよびＩＶ： 式ＩＩＩ
【化７】 式ＩＶ
【化８】 のいずれかを有し，酵素活性を有する核酸分子を特徴とする。
【００２９】 上述の式ＩＩＩおよびＩＶにおいて，各Ｎは，独立して，ヌクレオチドまたは
非ヌクレオチドリンカーを表し，これは同じであっても異なっていてもよく；Ｘ
およびＹは，独立して，標的核酸分子と安定に相互作用する（例えば，標的中の
相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することにより）のに十分な長さのオリゴ
ヌクレオチドであり（標的は，ＲＮＡ，ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ混合ポリマ
ーであることができ，例えば，塩基，糖，および／またはリン酸ヌクレオチド修
飾を含んでいてもよいポリマーであり；そのような修飾は，好ましくは天然に生
ずる修飾である），好ましくは，ＸおよびＹの長さは，独立して，３−２０ヌク
レオチドの長さであり，例えば，特に，３，４，５，６，７，８，９，１０，１
１，１２，１３，１４，１５，１７，および２０の長さであり；ＸおよびＹは，
同じ長さであっても異なる長さであってもよく；ｍ，ｎ，ｏ，およびｐは，独立
して，１以上の整数であり，好ましくは約１００より小さく，特に，２，３，４
，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，２５，３０，３５，５０であり；こ
こで，（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎおよび／または（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｐがヌクレ
オチドであるとき，（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎおよび／または（Ｎ）ｏおよび（Ｎ
）ｐは任意に水素結合相互作用により相互作用することができ；好ましくは，（
Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎおよび／または（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｐは，独立して，１
，２，３，４，５，６，７，８，９個の塩基対形成ステム構造を形成し；Ｄは，
Ｕ，ＧまたはＡであり；Ｌ1およびＬ2は，独立してリンカーであり，これは同じ
であっても異なっていてもよく，存在しても存在しなくてもよいが（すなわち，
分子は２つの別々の分子から組み立てられる），存在する場合には，一本鎖およ
び／または二本鎖領域を含んでいてもよいヌクレオチドおよび／または非ヌクレ
オチドリンカーであり；＿は，化学結合（例えば，リン酸エステル結合，アミド
結合または当該技術分野において知られる他の結合）を表し；・は塩基対形成相
互作用を表し；Ｚは，独立して，５’−ＡＧＡＵＡＡＣＧＵＧＡＡＧＡＵ−３’
（配列番号１０９）および５’−ＡＡＵＧＧＣＣＵＡＵＣＧＧＵＧＣＧＡ−３’
（配列番号１１０）を含む群より選択されるヌクレオチド配列であり，分子の活
性を有意に変更することなくこれらの配列への付加，欠失および置換が可能であ
り，したがってこれらも本発明の範囲内であり；およびＣ，Ｇ，Ａ，およびＵは
，それぞれシチジン，グアノシン，アデノシンおよびウリジンヌクレオチドを表
す。式ＩＩＩおよびＩＶのそれぞれのヌクレオチドは，当該技術分野において知
られるように，糖，塩基，および／またはリン酸において修飾されていてもされ
ていなくてもよい。
【００３０】 好ましい態様においては，本発明は，式ＩＩＩの核酸分子を特徴とし，ここで
，オリゴヌクレオチド（Ｎ）ｍの配列は，５’−ＡＣ−３’，５’−ＧＣ−３’
，および５’−ＣＧ−３’からなる群より選択される。
【００３１】 別の好ましい態様においては，本発明は，式ＩＩＩの核酸分子を特徴とし，こ
こで，オリゴヌクレオチド（Ｎ）ｎの配列は，５’−ＧＵ−３’，５’−ＧＣ−
３’，および．５’−ＣＧ−３’からなる群より選択される。
【００３２】 さらに別の好ましい態様においては，本発明は，式ＩＩＩの核酸分子を特徴と
し，ここで，オリゴヌクレオチド（Ｎ）ｏの配列は，５’−ＡＵＵＧ−３’，５
’−ＵＵＧ−３’，５’−ＵＵＣ−３’，および５’−ＵＡＧ−３’からなる群
より選択される。
【００３３】 別の好ましい態様においては，本発明は，式ＩＩＩの核酸分子を特徴とし，こ
こで，オリゴヌクレオチド（Ｎ）ｐの配列は，５’−ＣＡＡＵ−３’，５’−Ｃ
ＡＡ−３’，５’−ＧＡＡ−３’，および５’−ＣＵＡ−３’からなる群より選
択される。
【００３４】 別の態様においては，ヌクレオチドリンカー（Ｌ1）は，５’−ＣＵＵＡＡ−
３’および５’−ＣＵＡＡＡ−３’からなる群より選択される核酸配列である。
【００３５】 別の態様においては，ヌクレオチドリンカー（Ｌ2）は，５’−ＵＧＵＧＡＡ
−３’および５’−ＧＵＧＡ−３’からなる群より選択される核酸配列である。
【００３６】 さらに別の態様においては，ヌクレオチドリンカー（Ｌ1および／またはＬ2）
は核酸アプタマー，例えば，ＡＴＰアプタマー，ＨＩＶＲｅｖアプタマー（ＲＲ
Ｅ），ＨＩＶ Ｔａｔアプタマー（ＴＡＲ）および他のアプタマー（総説として
，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
６４，７６３；およびＳｚｏｓｔａｋ＆Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，１９９３，Ｔｈｅ
ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ，ｅｄ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ ａｎｄ Ａｔｋｉｎｓ，ｐ
ｐ．５１１，ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）である。本明
細書において用いる場合，"核酸アプタマー"とは，リガンドと相互作用しうる核
酸配列を示すことを意味する。リガンドは，任意の天然のまたは合成の分子であ
ることができ，例えば，限定されないが，樹脂，代謝産物，ヌクレオシド，ヌク
レオチド，薬剤，毒素，遷移状態類似体，ペプチド，脂質，蛋白質，アミノ酸，
核酸分子，ホルモン，炭水化物，レセプター，細胞，ウイルス，細菌および他の
ものでありうる。
【００３７】 別の態様においては，非ヌクレオチドリンカー（Ｌ1および／またはＬ2）は本
明細書において定義されるとおりである。本明細書において用いる場合，"非ヌ
クレオチド"との用語は，無塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポリアミン，ポ
リアミド，ペプチド，炭水化物，脂質，またはポリ炭化水素化合物のいずれかを
含む。これらの化合物は，１またはそれ以上のヌクレオチドユニットのかわりに
核酸鎖中に取り込ませることができ，糖および／またはリン酸のいずれかの置換
を含み，残りの塩基がその酵素的活性を示すことを可能とする。基または化合物
は，一般に認識されているヌクレオチド塩基，例えばアデニン，グアニン，シト
シン，ウラシルまたはチミンを含まない場合，無塩基である。本明細書において
用いる場合，"無塩基"または"無塩基ヌクレオチド"との用語は，塩基を欠失して
いるかまたは１’位置にヌクレオチド塩基の代わりに他の化学基を有する糖成分
を包含する。非ヌクレオチドの特定の例には，Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅ
ｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３およびＮ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７，１５：３１１３；Ｃｌｏａｄ
ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３
：６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０９；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２１：２５８５およびＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ１９９３，３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９１，
１０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．１９９３，３４：３０１；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １９９１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ８
９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／０６７３１；
Ｄｕｄｙｃｚ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１９１０およびＦｅｒｅｎ
ｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１
３：４０００（すべて本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるもの
が含まれる。すなわち，好ましい態様においては，本発明は，１またはそれ以上
の非ヌクレオチド成分を有し，ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を切断する酵素的活性を
有する酵素的核酸分子を特徴とする。
【００３８】 好ましい態様においては，式ＩＩＩおよびＩＶの酵素的核酸は，非ヌクレオチ
ド成分に結合した，分子の酵素的活性を与える１またはそれ以上のＲＮＡのスト
レッチを含む。必要なＲＮＡ成分は当該技術分野において知られている（例えば
，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照）。
【００３９】 すなわち，１つの好ましい態様においては，本発明は，遺伝子発現および／ま
たは細胞増殖を阻害するリボザイムを特徴とする。これらの化学的または酵素的
に合成された核酸分子は，特定の標的核酸分子のアクセス可能な領域に結合する
基質結合ドメインを含む。核酸分子はまた，標的の切断を触媒するドメインを含
む。酵素的核酸分子は，結合すると標的分子を切断し，例えば，翻訳および蛋白
質蓄積を防止する。標的遺伝子が発現されないため，例えば細胞増殖が阻害され
る。本発明の別の観点においては，標的分子を切断する酵素的核酸分子は，ＤＮ
ＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベ
クターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。リボザ
イムを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，レ
トロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築するこ
とができる。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベクターは，以下に記
載されるように輸送し，標的細胞中に残留する。あるいは，核酸分子の過渡的発
現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必
要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，リボザイム
は標的ｍＲＮＡを切断する。リボザイムを発現するベクターの輸送は，全身的（
例えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与
した後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能
とする他のいずれかの手段により行うことができる（総説については，Ｃｏｕｔ
ｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。
【００４０】 "相補性"とは，核酸が，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタ
イプのいずれかにより，別のＲＮＡ配列と水素結合を形成しうる能力を意味する
。本発明の核酸分子に関して，核酸分子とその標的または相補的配列との結合自
由エネルギーは，核酸の関連する機能，例えば，ＤＮＡｚｙｍｅによる切断が進
行するのに十分である。核酸分子についての結合自由エネルギーの決定は当該技
術分野においてよく知られている（例えば，Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３
３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７
，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照）。相補性
のパーセンテージは，核酸分子中の，第２の核酸配列と水素結合（例えば，ワト
ソン−クリック塩基対形成）を形成しうる連続する残基のパーセンテージを示す
（例えば，１０塩基中の５，６，７，８，９，１０塩基は，５０％，６０％，７
０％，８０％，９０％，および１００％の相補性である）。"完全な相補性"とは
，核酸配列の連続する残基がすべて第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と
水素結合するであろうことを意味する。
【００４１】 "十分な長さ"とは，予測される条件下で意図する機能を提供するのに十分な長
さの，３ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドを意味する。例えば，酵素的核
酸の結合アームについては，"十分な長さ"とは，結合アーム配列が予測される結
合条件下で標的部位に対して安定な結合を提供するのに十分に長いことを意味す
る。好ましくは，結合アームは，核酸分子の有用なターンオーバーを妨害するほ
ど長くはない。
【００４２】 "安定に相互作用する"とは，オリゴヌクレオチドが，意図される目的（例えば
，酵素による標的ＲＮＡの切断）に十分なように標的核酸と相互作用すること（
例えば，生理学的条件下で標的中の相補的なヌクレオチドと水素結合を形成する
ことにより）を意味する。
【００４３】 "阻害する"とは，所定の蛋白質の活性または所定の蛋白質標的の１またはそれ
以上の蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡもしくは同等のＲＮＡのレベルが
，本発明の核酸分子の非存在下において観察されるレベルより減少することを意
味する。１つの態様においては，酵素的核酸分子による阻害は，好ましくは，標
的ＲＮＡ上の同じ部位に結合することができるがそのＲＮＡを切断することがで
きない，酵素的に不活性なまたは弱体化された分子の存在下で観察されるレベル
より低い。別の態様においては，本発明の核酸分子を用いる標的遺伝子の阻害は
，核酸分子の存在下において，存在しない場合よりも大きい。
【００４４】 本明細書において用いる場合，"核酸分子"とは，ヌクレオチドを有する分子を
意味する。核酸は，一本鎖，二本鎖または多数の鎖であることができ，修飾また
は非修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドまたはこれらの種々の混合物および
組み合わせを含むことができる。
【００４５】 "遺伝子"とは，ＲＮＡをコードする核酸を意味し，例えば，限定されないが，
リペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸配列である。
【００４６】 "ＲＮＡ"とは，少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する
。"リボヌクレオチド"とは，ベータ−Ｄ−リボフラノース成分の２’位にヒドロ
キシル基を有するヌクレオチドを意味する。
【００４７】 本明細書において用いる場合，"細胞"とは，その通常の生物学的意味において
用いられ，多細胞生物全体を表さず，例えば特にヒトを表さない。細胞は，ヒト
であってもよい生物中に存在することができるが，好ましくは非ヒト多細胞生物
，例えば，鳥，植物および哺乳動物，例えばウシ，ヒツジ，無尾猿，有尾猿，ブ
タ，イヌ，およびネコに存在する。細胞は原核生物（例えば細菌細胞）または真
核生物（例えば哺乳動物または植物細胞）であってもよい。
【００４８】 "患者"とは，外植した細胞のドナーまたはレシピエントである生物，または細
胞それ自体を意味する。"患者"とはまた，酵素的核酸分子を投与することができ
る生物を表す。好ましくは，患者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。より好
ましくは，患者はヒトまたはヒト細胞である。
【００４９】 "ベクター"とは，所望の核酸を輸送するために用いられる任意の核酸系および
／またはウイルス系手法を意味する。
【００５０】 別の好ましい態様においては，本発明において記載される分子の触媒活性を最
適化することができる。細胞におけるその抗力を増強する修飾および，ステムル
ープ構造から塩基を除去して酵素的核酸分子の合成時間を短くし，化学物質の必
要性を減少させることが望ましい。本発明に記載される分子の触媒的活性は，Ｕ
ｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８６１，２８８に記載されるように最適
化することができる。ここでは詳細は繰り返さないが，酵素的核酸分子の結合ア
ームの長さを変化させること，または血清ヌクレアーゼによる分解を防止し，お
よび／またはその酵素的活性を増強する修飾（塩基，糖および／またはリン酸）
を有する酵素的核酸分子を化学的に合成することが含まれる（例えば，Ｅｃｋｓ
ｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ
Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ
．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；
およびＲｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａ
ｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲
）を参照；これらはすべて，酵素的核酸分子の塩基，リン酸および／または糖成
分に行うことができる種々の化学修飾を記載する）。これらの刊行物はすべて本
明細書の一部としてここに引用する。
【００５１】 "増強された酵素的活性"とは，細胞および／またはインビボで測定した活性を
含むことを意味し，ここで，活性は，触媒活性と酵素的核酸分子の安定性との両
方を反映する。
【００５２】 さらに別の好ましい態様においては，酵素的活性を維持または増強する化学修
飾を有する核酸触媒が提供される。そのような核酸はまた，一般に，非修飾核酸
よりもヌクレアーゼに対する耐性が高い。すなわち，細胞中および／またはイン
ビボにおいて，活性は有意に低下しないであろう。本明細書に例示されるように
，そのような酵素は，全体の活性が１０倍低下しても細胞および／またはインビ
ボで有用である（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，３５，１４０９０）。
【００５３】 好ましい態様においては，本発明は，一群の酵素的核酸分子に基づく，所望の
標的のＲＮＡに高い特異性を示す遺伝子阻害剤を製造する方法を提供する。例え
ば，酵素的核酸分子は，好ましくは，本発明の１またはいくつかの核酸分子を用
いて疾病または状態の特異的治療を与えることができるように，標的蛋白質をコ
ードする標的ＲＮＡの高度に保存された配列領域を標的とする。そのような核酸
分子は，必要に応じて特定の組織または細胞標的に外的に輸送することができる
。あるいは，核酸分子（例えばＤＮＡ酵素）は，特定の細胞に輸送される一本鎖
ＤＮＡ発現ベクターから発現させてもよい。
【００５４】 好ましい態様においては，本発明の核酸触媒の少なくとも１つをコードする核
酸配列を含む発現ベクターが開示される。本発明の核酸触媒をコードする核酸配
列は，その核酸分子の発現を可能とする様式で動作可能なように連結されている
。
【００５５】 １つの態様においては，発現ベクターは以下のものを含む：転写開始領域（例
えば，真核生物ｐｏｌＩ，１１またはＩＩＩ開始領域）；ｂ）転写終止領域（例
えば，真核生物ｐｏｌＩ，ＩＩまたはＩＩＩ終止領域）；ｃ）本発明の核酸触媒
の少なくとも１つをコードする核酸配列；ここで，前記配列は前記核酸分子の発
現および／または輸送を可能とする様式で前記開始領域および前記終止領域に動
作可能なように連結されている。ベクターは任意に本発明の核酸触媒をコードす
る配列の５’側または３’側に動作可能なように連結された蛋白質用のオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ），および／またはイントロン（介在配列）を含
んでいてもよい。
【００５６】 高濃度のリボザイムを細胞中に蓄積する別の手段は，リボザイムをコードする
配列をＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター中に組み込むことである。リボザイム配
列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ），ＲＮＡポリメラー
ゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ），またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）
のプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモー
ターからの転写産物は，すべての細胞において高いレベルで発現されるであろう
。所定の細胞タイプ中における所定のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは，近
くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイレンサー等）の性質に依存す
るであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で発現される限り
，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（Ｅｌｒｏｙ−Ｓ
ｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ １９９３
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅ
ｒ ｅｔ．ａｌ．，１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４
７−６６；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
，１０，４５２９−３７）。何人かの研究者が，そのようなプロモーターから発
現したリボザイムが哺乳動物細胞中で機能しうることを示している（例えば，Ｋ
ａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒ
ｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８９，１０８０２−６；Ｃｈ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０
，４５８１−９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，９０，６３４０−４；Ｌ'Ｈｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ
ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅ
ｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。上述のリボザイム転写
ユニットは，哺乳動物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むこと
ができる。ベクターとしては，限定されないが，プラスミドＤＮＡベクター，ウ
イルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクタ
ー），またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウ
イルスベクター）が挙げられる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓ
ｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）。
【００５７】 "高度に保存された配列領域"とは，標的遺伝子中の１またはそれ以上の領域の
ヌクレオチド配列が，１つの世代と他の世代において，または１つの生物学的シ
ステムと他の生物学的システムにおいて，有意に異ならないことを意味する。
【００５８】 本発明の核酸に基づく阻害剤は，直接加えるか，またはカチオン性脂質と複合
体を形成するか，リポソーム中に封入するか，または他の方法を用いて，標的細
胞または組織に輸送することができる。核酸または核酸複合体は，エクスビボで
，または，バイオポリマー中に取り込ませるかまたは取り込ませずに，注射，注
入ポンプもしくはステントを用いることによりインビボで，関連する組織に局所
的に輸送することができる。
【００５９】 別の観点においては，本発明は，１またはそれ以上の本発明の核酸分子および
／または発現ベクターを含む哺乳動物細胞を提供する。１またはそれ以上の核酸
分子は，独立して，同じまたは異なる部位を標的とすることができる。
【００６０】 "・・を含む"とは，"・・を含む"の単語の前にあるものを含むがそれには限定
されないことを意味する。すなわち，"・・を含む"との用語の使用は，挙げられ
る要素が必要または強制的なものであるが，他の要素は任意であり，存在しても
存在しなくてもよいことを示す。"・・からなる"とは，"・・からなる"の語句の
前にあるものをすべて含みかつそれに限定されることを意味する。すなわち，"
・・からなる"との語句は，挙げられる要素が必要または強制的なものであり，
他の要素は存在しないことを示す。
【００６１】 本発明の他の特徴および利点は，以下の本発明の好ましい態様の説明および特
許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００６２】好ましい態様の説明 まず図面を簡単に説明する。図面： 図１は，これに基づいてＤＮＡ酵素選択を行った構築物を示す図解である。大
文字は，すべての分子の間で一定であった，分子ライブラリの領域中の４つの標
準的ＤＮＡ塩基およびＲＮＡ塩基（逆タイプ）を示す。これらの領域は，ＲＮＡ
基質を提供し，塩基対形成によりランダム領域を基質に隣接して配置し，選択の
間に標準的な方法を用いてライブラリを操作することを可能とする。触媒的配列
は５０ヌクレオチドの領域に由来し，定常領域の間に挟まれ，ランダムＤＮＡ配
列を含むよう合成された。分子は，ＲＮＡ残基上で自己切断する能力に基づいて
選択した。分子はＲＮＡ切断に関連することが予測される条件に関してＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの細胞質の組成と同様の緩衝液中で溶液中で反応させ
た。
【００６３】 図２は，本発明のクラスＩＤＮＡ酵素のクローン２７の非限定的二次構造モデ
ルを示す図解である。図２ａに示される二次構造は，表２において下線が施され
ている保存ヌクレオチドの領域に基づいており，触媒の３’末端の塩基対形成が
復帰している。この酵素が基質と相互作用するＫdは５μＭである。酵素はグル
タチオンを必要としないが，プトレシンの非存在下では活性を１０倍失う。この
ｐＫaは約７．９であり，０．５ｍＭ Ｍｇ2+中で最大擬似一次速度定数０．０
６ｍｉｎ-1に達する。酵素はまた，図２ｂに示されるインビトロ転写標的を切断
し，このことは，これが基質中にＤＮＡ残基を必要とせず，基質結合アームを変
更することにより汎用化しうることを示す。
【００６４】 図３は，本発明のクラスＩＩＤＮＡ酵素のクローン３７の非限定的二次構造モ
デルを示す図解である。
【００６５】 図４は，ランダム配列ＤＮＡ集団からの自己切断ＤＮＡ酵素の単離の選択スキ
ームを示す図解である。
【００６６】 図５は，本発明のクラスＩモチーフヌクレオザイムの基質配列要求性を示す図
解である。
【００６７】 図６は，本発明のクラスＩモチーフヌクレオザイムの速度論的パラメータを示
す図解である。
【００６８】 図７は，本発明のクラスＩＶおよびクラスＶトランス切断ヌクレオザイムの提
唱される二次構造を示す図解である。
【００６９】 図８Ａは，ランダム配列ＲＮＡ集団から自己切断リボザイムを単離する選択ス
キームを示す図解である。（Ｉ）ＲＮＡを許容的反応条件下でインキュベートす
る。（ＩＩ）変性１０％ＰＡＧＥにより切断されたＲＮＡ５’フラグメントを未
切断前駆体から分離し，適当なゲル断片から破砕／浸漬により回収する。（ＩＩ
Ｉ）回収されたＲＮＡフラグメントを，Ｔ７プロモーター配列を導入しリボザイ
ム切断の際に失われたヌクレオチドを復帰させるＲＴ−ＰＣＲにより増幅する。
得られた二本鎖ＤＮＡをＴ７ＲＮＡＰにより転写して，ＲＮＡの次の集団を生成
する。
【００７０】 図８Ｂは，インビトロ選択プロセスを開始するために用いたＲＮＡ構築物の図
解である。Ｎ40は４０のランダム配列位置を示す。下線を施したヌクレオチドは
，１６種類すべての可能な最も近い隣接部位の組み合わせを表す領域を識別する
。
【００７１】 図９は，本発明の種々のクラスの自己切断リボザイムの非限定的二次構造モデ
ルを示す図解である。各クラス（Ｉ−ＸＩＩ）について，選択プロセス（図８を
参照）において最初に出現する世代が丸で囲まれている。さらに，示されるよう
に，すべてのＲＮＡ構築物について切断部位（矢羽）および観察される速度定数
が示されている。場合によっては，二次構造モデルは，人工的系統発生データ（
例えば，表１１を参照）に基づくか，あるいはインターネットでアクセス可能な
（ｗｗｗ．ｉｂｃ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／〜ｍｆｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍｌ．
ｃｇｉ）ＺｕｋｅｒＲＮＡ折り畳みプログラムにより予測される最も安定な構造
を反映する。予測ワトソンクリック塩基対形成相互作用はダッシュにより示され
，予測Ｇ・Ｕ動揺相互作用はドットにより示される。クラスＶＩおよびＶＩＩは
一分子構築物として実験したことに注意されたい。クラスＶＩＩリボザイムにつ
いては，合理的な二次構造モデルは確立されなかった。この場合，ボックスで囲
まれた領域は，元のランダム配列ドメイン中に存在する可変（影付き）または保
存ヌクレオチドを識別する。ハンマーヘッドリボザイム（クラスＶＩＩＩ）のヌ
クレオチドは，Ｈｅｒｔｅｌら（Ｈｅｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０，３２５２）によって示唆さ
れるシステムにしたがって番号付けされている。
【００７２】 図１０Ａは，図９に示されるような二分子クラスＩ（白丸）およびクラスＩＩ
（黒丸）リボザイムの，許容的反応条件下における切断反応プロファイルを示す
図解である。クラスＩおよびクラスＩＩリボザイムについて観察された速度定数
は，線の負の傾きにより決定して，それぞれ０．０１および０．０５ｍｉｎ-1で
あった。図１０Ｂは，１２のクラスのリボザイムの切断部位のコンパイルを示す
。番号は，図８Ｂに示される最も近い隣接ドメイン中のヌクレオチドを識別する
。
【００７３】 図１１は，２つのハンマーヘッドリボザイムの二次構造および支配的なＸモチ
ーフの比較を示す。図１１Ａは，単離して，Ｓ２１基質を用いて酵素活性を調べ
たハンマーヘッドリボザイムの２つの異なる型（ｉおよびｉｉ）の図解である。
いずれの型も，位置７においてのみ配列変動を許容することが知られている高度
に保存された触媒コアを保持する（Ｔａｎｇ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９
７，ＲＮＡ，３，９１４−９２５）。（Ｉ）中のステム要素およびヌクレオチド
は，Ｈｅｒｔｅｌらにより定義された命名法にしたがって番号付けされている（
Ｈｅｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，（上掲））。図１１Ｂは，合計２５ラウンドのイ
ンビトロ選択の後に単離された支配的な一分子構築物が自己切断リボザイムのＸ
−モチーフ（クラスＩ）のクラスに適合することを示す。この自己切断リボザイ
ムは，別々の基質ＲＮＡ（Ｓ２１）が４３ヌクレオチド酵素ドメインにより切断
される二分子フォーマットに再編成することができる。この後者は，再選択（表
１１）の間に同定された高度に保存されたヌクレオチドをすべて包含する。酵素
−基質相互作用は，モチーフを規定する４つの予測らせん領域の２つ（ステムＩ
およびＩＶ）の形成から生ずる。矢羽はリボザイム媒介性切断の部位を識別する
。
【００７４】 図１２は，Ｘモチーフリボザイムの切断部位の多様性を示す。図１２は，Ｘモ
チーフの保存コアを有する３つの異なる４３−ｎｔＲＮＡを示す。リボザイムの
クラスは，各々が結合アームＩおよびＩＶの塩基対ポテンシャルにおいて異なる
ように，インビトロ転写により生成した。特に，リボザイムＸ−Ｅ１は，塩基対
形成していないＧが存在する部位の５’側および３’側の両方を挟む８塩基対を
形成するよう工学的に改変されている。線は，結合アームＩおよびＩＶ中のＸ−
Ｅ１標的部位（矢印により示される）に相補的なヌクレオチドを示す。同様に，
リボザイムＸ−Ｅ２およびＸ−Ｅ３は，対応する結合アーム配列を有し，その対
応する標的部位とのみ塩基対形成することができる。塩基対形成相互作用はダッ
シュで示される。
【００７５】 図１３は，クラスＶリボザイムモチーフの代表的な図解であり，リボザイムコ
ア中の一連の２’−Ｏ−メチル置換がＫobsに及ぼす影響を示す。図１３はまた
，クラスＶリボザイムの基質切断の典型的な部位，ならびにこの出願において表
ＶＩ−ＩＸに示されるようなこのクラスのリボザイムへの修飾を記述するために
用いられる番号付けシステムを示す。
【００７６】 図１４は，本発明のクラスＩ酵素的核酸分子（配列番号１４６）（基質の配列
番号１４７）とクラスＶＩＩＩ酵素的核酸分子（配列番号１４８）（基質の配列
番号１４９）との間の構造的類似性の代表的な図解である。
【００７７】 図１５は，本発明のクラスＩおよびクラスＶＩＩＩ酵素的核酸分子の速度論的
特徴の比較である。（Ａ）それぞれ，クラスＩモチーフおよびクラスＶＩＩＩモ
チーフ酵素に基づく酵素を用いる基質の飽和。（Ｂ）リボザイム活性に及ぼす一
価イオンの影響。（Ｃ）各リボザイムのマグネシウム依存性。反応は，特に記載
しない限り，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５，２３℃），および２０
ｍＭ塩化マグネシウム中で行った。
【００７８】核酸触媒 本発明は，所望の標的の核酸配列に対して高度の特異性を示す核酸触媒および
，一群の酵素的核酸切断剤を製造するための方法を提供する。酵素的核酸分子は
，好ましくは，１個の酵素的核酸で種々の生物学的システムにおいて疾病または
状態の特異的な診断および／または治療を提供することができるように，標的の
高度に保存された配列領域を標的とする。そのような酵素的核酸分子は，必要に
応じて，特定の細胞に外的に輸送することができる。好ましいクラスＩおよびＩ
Ｉモチーフにおいては，小さいサイズ（６０ヌクレオチド未満，好ましくは２５
−４０ヌクレオチドの長さ）の分子により，治療のコストを低減させることがで
きる。
【００７９】 本明細書において用いる場合，"核酸触媒"とは，種々の反応を触媒しうる（速
さおよび／または速度を変更する），例えばヌクレオチド塩基配列特異的様式で
他の別個の核酸分子を繰り返し切断する能力（エンドヌクレアーゼ活性）を有す
る核酸分子（例えば，式Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩおよびＩＶの分子）を意味する。その
ようなエンドヌクレアーゼ活性を有する分子は，基質結合領域（例えば，式Ｉ，
ＩＩ，ＩＩＩ，およびＩＶ中のＸおよびＹ）において，特定の遺伝子標的に対す
る相補性を有し，かつ，その標的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に切断する酵
素的活性を有する。すなわち，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は，分
子内または分子間でＲＮＡまたはＤＮＡを切断し，このことにより標的ＲＮＡま
たはＤＮＡ分子を不活性化することができる。このような相補性は，酵素的ＲＮ
Ａ分子が標的ＲＮＡまたはＤＮＡに十分にハイブリダイズし，切断が生ずること
を可能にする。１００％の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い相補性
もまた本発明において有用である。核酸は塩基，糖および／またはリン酸基で修
飾されていてもよい。酵素的核酸との用語は，リボザイム，触媒的ＲＮＡ，酵素
的ＲＮＡ，触媒的ＤＮＡ，ヌクレオザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアー
ゼ，エンドヌクレアーゼ，ミニザイム，オリゴザイム，フィンデロンまたは核酸
触媒のような句と互換的に使用される。これらすべての用語は酵素的活性を有す
る核酸分子を記述する。本出願に記載されている酵素的核酸分子の特定の例は本
発明において限定的なものではない。当業者は，本発明の酵素的核酸分子におい
て重要なことは，これが１またはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的基質
結合部位を有し，かつ基質結合部位内または周辺に分子に核酸切断活性を与える
ヌクレオチド配列を有することであることを認識するであろう。
【００８０】 本発明の好ましい態様においては，酵素的核酸分子は，１３−１００ヌクレオ
チドの長さであり，例えば，特定の態様においては，３５，３６，３７，または
３８ヌクレオチドの長さである（例えば特定のＤＮＡ酵素について）。特定の態
様においては，核酸分子は，１５−１００，１７−１００，２０−１００，２１
−１００，２３−１００，２５−１００，２７−１００，３０−１００，３２−
１００，３５−１００，４０−１００，５０−１００，６０−１００，７０−１
００，または８０−１００ヌクレオチドの長さでありうる。上で特定した１００
ヌクレオチドは，長さの範囲の上限ではなく，長さの範囲の上限は，例えば，３
０，４０，５０，６０，７０，または８０ヌクレオチドでありうる。すなわち，
任意の長さの範囲において，特定の態様についての長さの範囲は，特定される下
限を有し，下限より大きい特定される上限を有する。例えば，特定の態様におい
ては，長さの範囲は３５−５０ヌクレオチドの長さでありうる。そのような範囲
のすべてが明示的に含まれる。また，特定の態様においては，核酸分子は，上で
規定された任意の長さを有することができ，例えば，種々の長さの結合アームお
よび／または可変領域を有する２１個の保存ヌクレオチドの長さの触媒コアであ
りうる。
【００８１】 式１，ＩＩ，ＩＩＩおよびＩＶの酵素的核酸分子は独立してキャップ構造を含
んでいてもよく，これは独立して存在してもしなくてもよい。
【００８２】 "キメラ核酸分子"または"混合ポリマー"とは，分子が修飾ヌクレオチドまたは
非修飾ヌクレオチドの両方から構成されていてもよいことを意味する。
【００８３】 "キャップ構造"とは，オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれてい
る化学修飾を意味する。これらの末端修飾は，核酸分子をエキソヌクレアーゼ分
解から保護し，輸送および／または細胞中の局在化を助けることができる。キャ
ップは，５’−末端（５’−キャップ）または３’−末端（３’−キャップ）の
いずれに存在していてもよく，両末端に存在していてもよい。非限定的例におい
ては，５’−キャップは，反転無塩基残基（成分）；４’，５’−メチレンヌク
レオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド，４’−チオ
ヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレ
オチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；
ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３
’，４’−セコヌクレオチド；非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド
；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３’−３’反転ヌクレオ
チド成分；３’−３’−反転無塩基成分；３’−２’−反転ヌクレオチド成分；
３’−２’−反転無塩基成分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホル
アミデート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホ
スホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋メチルホス
ホネート成分からなる群より選択される（詳細については，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，国際公開９７／２６２７０を参照，本明細書の一部としてここ
に引用する）。
【００８４】 さらに別の好ましい態様においては，３’−キャップは，４’，５’−メチレ
ンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’
−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；
１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミ
ノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸
；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ
ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ−ペント
フラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒ
ドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５
’−５’−反転ヌクレオチド成分；５’−５’−反転無塩基成分；５’−ホスホ
ルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５
’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート，ホスホロチ
オエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホ
ネートおよび５’−メルカプト成分からなる群より選択される（詳細については
，Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
４９，１９２５を参照；本明細書の一部としてここに引用する）。
【００８５】 本明細書において用いる場合，"オリゴヌクレオチド"とは，２またはそれ以上
のヌクレオチドを含む分子を意味する。
【００８６】 本出願に記載される特定の酵素的核酸分子は本発明において限定的なものでは
なく，当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，これが標的核
酸領域の１またはそれ以上に相補的な特異的基質結合部位（例えば，上述の式Ｉ
，ＩＩ，ＩＩＩおよびＩＶのＸおよびＹ）を有し，かつ，その基質結合部位の中
または周囲に分子に核酸切断活性を与えるヌクレオチド配列を有することのみで
あることを認識するであろう。
【００８７】 ＶまたはＬ領域を欠失または変更しうるか否かは，本明細書に記載される方法
を用いて実験により決定し，インビボで試験することができる。同様に，Ｖ領域
が存在する場合，その長さを増加または減少させることができるか否かは，本明
細書に記載される選択プロトコルを用いて評価することができる。
【００８８】 "酵素的部分"とは，その酵素的核酸分子のＲＮＡ基質の切断に必須の部分を意
味する。
【００８９】 "基質結合アーム"または"基質結合ドメイン"とは，その基質の一部に相補的な
（すなわち，塩基対を形成しうる）酵素的核酸分子の部分を意味する。一般に，
そのような相補性は１００％であるが，所望の場合にはそれ未満でもよい。例え
ば，１４の内の１０程度でも塩基対を形成しうる。そのようなアームは一般に図
２，３，７，９，および１１，および式Ｉ−ＩＶのＸおよびＹとして示される。
すなわち，これらのアームは，相補的塩基対形成相互作用により酵素的核酸分子
と標的ＲＮＡとを一緒にすることが意図される配列を酵素的核酸分子中に含む。
本発明の酵素的核酸分子，例えばリボザイムおよびＤＮＡｚｙｍｅは連続または
非連続的な，種々の長さの結合アームを有することができる。結合アームの長さ
は，好ましくは４ヌクレオチド以上であり，特に，１２−１００ヌクレオチド；
より特別には１４−２４ヌクレオチドの長さである。２つの結合アームは，結合
アームの長さが対称的（すなわち，各々の結合アームは同じ長さである；例えば
，５および５ヌクレオチド，６および６ヌクレオチドまたは７および７ヌクレオ
チド長）または非対称的（すなわち，結合アームは異なった長さである；例えば
，６および３ヌクレオチド；３および６ヌクレオチド長；４および５ヌクレオチ
ド長；４および６ヌクレオチド長；４および７ヌクレオチド長など）であるよう
に選択される。
【００９０】 本発明に記載される酵素的核酸分子の触媒的活性は，Ｕｓｍａｎら（米国特許
５，８０７，７１８）に記載されるように最適化することができる。Ｄｒａｐｅ
ｒら（上掲）により記載される核酸触媒についての方法を，本発明の核酸分子を
最適化するのに用いるために容易に適用することができる。ここでは特定の詳細
は繰り返さないが，これには，酵素的核酸分子の結合アームの長さの変更，また
は血清リボヌクレアーゼによる分解を防止するか，および／またはその酵素的活
性を増強する修飾（塩基，糖および／またはリン酸）を有する酵素的核酸分子の
化学的合成が含まれる（例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開Ｗ
Ｏ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ Ｔｒ
ｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開
ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢ
ｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照；これらはすべて，酵素的ＤＮＡお
よび／またはＲＮＡ分子の塩基，リン酸および／または糖成分に行うことができ
る種々の化学修飾を記載する）。これらの刊行物はすべて本明細書の一部として
ここに引用する。細胞におけるその効力を増強し，ステムループ構造から塩基を
除去して酵素的核酸分子の合成時間を短くし，化学物質の必要性を減少させる修
飾が望ましい。酵素的核酸分子は，全部デオキシリボヌクレオチドで合成しても
よく，核酸触媒が機能的である限り，他の２’−修飾ヌクレオチド（例えば；２
’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，２’−Ｃ−アリル，２’デオキシ−２’−
アミノ，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−アミノ等）を個々にまた
は組み合わせて含んでいてもよい。
【００９１】 治療用の酵素的核酸分子は，望ましくない蛋白質のレベルが減少するのに十分
長い間標的ＲＮＡの翻訳が阻害されるまで，細胞中で安定でなければならない。
この期間は疾病状態により，数時間から数日まで様々である。特に，ＤＮＡｚｙ
ｍｅｓは，有効な細胞内治療剤として機能するためには，ヌクレアーゼに対して
耐性でなければならない。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成の改良（Ｗｉｎｃｏｔ
ｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２
６７７（本明細書の一部としてここに引用する）は，ＤＮＡ酵素を修飾してその
ヌクレアーゼ安定性を高める能力を拡大した。
【００９２】 "ヌクレオチド"とは，リン酸化された糖を有し，Ｎ−グリコシル結合した複素
環窒素塩基を意味する。ヌクレオチドは，天然の塩基（標準的な），および当該
技術分野においてよく知られる修飾塩基を含むことが当該技術分野において認識
されている。そのような塩基は，一般に，ヌクレオチド糖成分の１’位に位置す
る。ヌクレオチドは，一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは
，糖，リン酸および／または塩基成分において，修飾されていても修飾されてい
なくてもよい（ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，
非標準的ヌクレオチドおよび他のものとして互換的に称される。例えば，Ｕｓm
ａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，国際公開９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９３／１
５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲）を参照，すべて本明細書の一
部としてここに引用する）。修飾核酸塩基のいくつかの例が当該技術分野におい
て知られており，Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸中に導入するこ
とができる化学的に修飾された核酸塩基および他の天然の核酸塩基のいくつかの
非限定的例には，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン
，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３−メチ
ルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニル，５−アルキルシチ
ジン（例えば，５−メチルシチジン），５−アルキルウリジン（例えば，リボチ
ミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロモウリジン）または６−アザピ
リミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば，６−メチルウリジン），プロ
ピン，ケソシン，２−チオウリジン，４−チオウリジン，ワイブトシン，ワイブ
トキソシン，４−アセチルシチジン，５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリ
ジン，５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン，５−カルボキ
シメチルアミノメチルウリジン，ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン，１−メチ
ルアデノシン，１−メチルイノシン，２，２−ジメチルグアノシン，３−メチル
シチジン，２−メチルアデノシン，２−メチルグアノシン，Ｎ６−メチルアデノ
シン，７−メチルグアノシン，５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン，
５−メチルアミノメチルウリジン，５−メチルカルボニルメチルウリジン，５−
メチルオキシウリジン，５−メチル−２−チオウリジン，２−メチルチオ−Ｎ６
−イソペンテニルアデノシン，β−Ｄ−マンノシルケオシン，ウリジン−５−オ
キシ酢酸，２−チオシチジン，トレオニン誘導体および他のものが含まれる（Ｂ
ｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４
０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲））。この観点において"修飾塩
基"とは，１’位におけるアデニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外の
ヌクレオチド塩基またはその同等物を意味する。このような塩基は，任意の位置
で，例えば酵素的核酸分子の触媒コア中でおよび／または核酸分子の基質結合領
域中で用いることができる。
【００９３】 好ましい態様においては，本発明はリン酸骨格修飾を有する修飾ＤＮＡｚｙｍ
ｅを特徴とし，これは１またはそれ以上のホスホロチオエート，ホスホロジチオ
エート，メチルホスホネート，モルホリノ，アミデート，カルバメート，カルボ
キシメチル，アセトアミデート，ポリアミド，スルホネート，スルホンアミド，
スルファメート，ホルムアセタール，チオホルムアセタール，および／またはア
ルキルシリル置換を含む。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については，Ｈｕ
ｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，
Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７
，およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋ
ｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔ
ｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照。
【００９４】 本発明のさらに別の好ましい態様においては，酵素的核酸分子の３’末端に反
転デオキシ無塩基成分を用いる。
【００９５】 特に本発明は，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュー
ドウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒド
ロウラシル，ナフチル，６−メチル−ウラシルおよびアミノフェニルから選択さ
れる塩基置換を有する修飾された酵素的核酸分子を特徴とする。
【００９６】 当該技術分野には，触媒活性に有意に影響を与えることなくそのヌクレアーゼ
安定性および効力を有意に増強することができる，酵素的核酸分子中に導入する
ことができる糖およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。酵素的核酸分
子は，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−
フルオロ，２’−Ｏ−メチルヌクレオチド塩基修飾により修飾して，安定性を高
め，および／または酵素活性を高める（概説としてはＵｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅ
ｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ１７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂ
ｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１４
０９０を参照）。酵素的核酸分子の糖修飾は，当該技術分野において広く記載さ
れている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；
Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５−５
６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５３，３１４
−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ
ａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７
１１，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７０，２５７０２；を参照）。
【００９７】 さらに，酵素的核酸分子を種々の化学成分および／またはリガンドと連結させ
て，安定性，局在化，および／または効力を増強することができる。そのような
成分およびリガンドにには，限定されないが，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
），コレステロール，サイトフェクチン（例えば，ＤＯＰＥ，ＤＤＡＢ，ＤＯＧ
Ｓ，ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＭＡ類似体，例えばＤＯＴＡＰ，ＤＭＲＩＥ，ＤＯ
ＳＰＡ，ＤＯＲＩＥ，ＤＯＲＩ，およびＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ），グルコース，ガ
ラクトース，スペルミン，スペルミジン，Ｃ−デキストラン，ポリアクリルアミ
ド，ビオチン，レチノイン酸，ペプチド核酸，抗原（例えば，ＣＤ４０，ＣＤ４
４，癌胎児性抗原，エンドグリン，および前立腺特異的抗原），レセプター（例
えば，ＶＥＧＦ，ＨＥＲ２／ｎｅｕ），および他の脂肪酸，ステロイド，カチオ
ン性脂質，ポリアミン，ポリアミド，グルココルチコイド，インテグリン，ヒス
トン，プロタミン，トキシン，ウイロイド，ウイルソイド，アミノ酸，ペプチド
，蛋白質，糖，多糖類，糖コンジュゲート，オリゴヌクレオチド，金属，小分子
，高分子およびこれらの組み合わせが含まれる。非限定的な炭水化物修飾，例え
ば２’−コンジュゲートの概説としては，Ｍａｎｏｈａｒａｎ，１９９９，Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４８９（１），１１７−１３０を
参照。非限定的な薬剤高分子コンジュゲートの概説としては，Ｔａｋａｋｕｒａ
ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｄｖａｎ．Ｄｒｕｇ，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ
．，１９（３），３７７−３９９を参照。これらの刊行物は，触媒活性を阻害す
ることなく糖，塩基および／またはリン酸修飾等を核酸分子中に取り込む位置を
決定する一般的方法および戦略を記載しており，本明細書の一部としてここに引
用する。このような教示を参照して，本明細書に記載されるように類似の修飾を
用いて本発明の核酸触媒を修飾することができる。
【００９８】 本明細書において用いる場合，非ヌクレオチド含有酵素的核酸との用語は，酵
素的核酸分子の一部を置き換える少なくとも１つの非ヌクレオチド成分，例えば
，限定されないが，二本鎖ステム，一本鎖"触媒コア"配列，一本鎖ループまたは
一本鎖認識配列を含む核酸分子を意味する。これらの分子は，別個のＲＮＡまた
はＤＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的様式で切断（好ましくは，多数回タ
ーンオーバーにより繰り返し切断）することができる。そのような分子はまた，
所望の場合には分子内で切断するよう作用することができる。そのような酵素的
分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができる。
【００９９】 化学的に合成した，本研究で有用な酵素的核酸分子の配列は，表および図面に
示される。当業者は，これらの配列が酵素的核酸分子の酵素的部分（結合アーム
以外のすべて）が活性を生ずるように変更されている多くのそのような配列の代
表例にすぎないことを認識するであろう。表および図面に挙げられる酵素的核酸
分子の配列は，デオキシリボヌクレオチドまたは他のヌクレオチドまたは非ヌク
レオチドから形成することができる。酵素的活性を有するそのような酵素的核酸
分子は，表および図面に特定的に記載される酵素的核酸分子の同等物である。
【０１００】核酸分子の合成 １００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難
であり，そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては，
好ましくは，小さい核酸モチーフ（"小さい"とは，１００ヌクレオチド以下の長
さ，好ましくは８０ヌクレオチド以下の長さ，最も好ましくは５０ヌクレオチド
以下の長さの核酸モチーフ，例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド，ハンマー
ヘッドまたはイノザイム酵素的核酸を表す）が外的輸送に用いられる。これらの
分子は構造が簡単であるため，核酸がＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高
い。本発明の例示的分子を化学的に合成するが，他の分子も同様に合成すること
ができる。
【０１０１】 ある種の酵素的核酸分子を含む本発明の核酸分子は，先に記載される方法を用
いて合成することができる（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇ ｅ ｔａｌ．，１９
９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３；およびＷｉｎ
ｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２
３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９）。このような方法においては，一般の
核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル，お
よび３’−末端にホスホルアミダイトを用いる。非限定的例においては，３９４
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で，０．２μｍｏｌ
スケールのプロトコルで，アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．５分
間のカップリング工程，および２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．
５分間のカップリング工程で，小スケールの合成を行う。表１は，合成サイクル
で用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケ
ールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造されるＰＧ２１００装置で，サイクルに最
少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサ
イクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μ
Ｌの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトおよ
び７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ
）を用いることができる。リボ残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマ
ー結合５’−ヒドロキシルに対して６６倍過剰（１２０μＬの０．１１Ｍ＝１３
．２μｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホルアミダイトおよび１５０
倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬの０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ）を
用いることができる。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ
．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定
して，典型的には９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔeｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下
のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であ
り；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）および
ＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶
液は，１６．９ｍＭ Ｉ2，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（ＰＥＲＳＥＰ
ＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセ
トニトリルは，試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニ
トリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは，ホスホロ
チオエート結合の導入のために，ボーケージ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオ
ール−３−オン−１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる
。
【０１０２】 固体支持体からの切断およびオリゴヌクレオチドの脱保護は，典型的には２ポ
ットプロトコルまたは１ポットプロトコルのいずれかを用いて行う。２ポットプ
ロトコルについては，ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍ
Ｌのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中
で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体か
ら除去する。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で
３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌク
レオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得る。塩基脱保護オリゴリ
ボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロ
リジノン，７５０μＬ ＴＥＡおよび１．０ｍＬ ＴＥＡ・３ＨＦの溶液３００
μＬ，ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し，６５℃に加熱する。１．５時間後，オリ
ゴマーを１．５Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3で急冷する。
【０１０３】 あるいは，１ポットプロトコルのためには，ポリマー結合トリチルオンオリゴ
リボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，３３％エタノール性
メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液中で，６５℃で１５分間
懸濁する。バイアルを室温にする。ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を加え，バイ
アルを６５℃で１５分間加熱する。試料を−２０℃に冷却し，次に１．５Ｍ Ｎ
Ｈ4ＨＣＯ3で急冷する。１ポットプロトコルにおいて用いるための別の脱保護カ
クテルは，水性メチルアミン（０．５ｍｌ）を６５℃で１５分間，続いてＤＭＳ
Ｏ（０．８ｍｌ）およびＴＥＡ・３ＨＦ（０．３ｍｌ）を６５℃で１５分間使用
することを含む。同様の方法論を用いて，９６ウエルプレート合成フォーマット
で，Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｌｅｘ Ｃｈｅｍｂｌｏｃｋを
用い，オリゴヌクレオチドの切断および脱保護のために試薬を加えることができ
る。
【０１０４】 脱保護オリゴマーのアニオン交換脱塩のためには，ＴＥＡＢ溶液を，５０ｍＭ
ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で予備洗浄したＱｉａｇｅｎ ５００（登録商標）アニオ
ン交換カートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に負荷する。負荷したカートリ
ッジを５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で洗浄した後，２Ｍ ＴＥＡＢ（１０ｍ
Ｌ）でＲＮＡを溶出し，乾燥して白色粉体を得る。
【０１０５】 トリチルオンオリゴマーの精製のためには，急冷したＮＨ4ＨＣＯ3溶液を，ア
セトニトリル，続いて５０ｍＭ ＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８含有カートリ
ッジに負荷する。負荷したカートリッジを水で洗浄した後，ＲＮＡを０．５％Ｔ
ＦＡで１３分間脱トリチル化する。次にカートリッジを水で再び洗浄し，１Ｍ
ＮａＣｌで塩交換し，再び水で洗浄する。次に，３０％アセトニトリルでオリゴ
ヌクレオチドを溶出する。あるいは，９６ウエルフォーマットで合成したオリゴ
ヌクレオチドのためには，Ｂｏｈｄａｎ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎワークステーシ
ョンで，Ｃ１８物質を充填した９６ウエル固相抽出ブロックを用いて粗精製トリ
チルオンオリゴヌクレオチドを精製する。
【０１０６】 平均段階カップリング収率は，典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７
７−２６８４）。当業者は，合成のスケールは，上述の例より大きくまたは小さ
く，例えば，限定されないが，９６ウエルのフォーマットに適合させることがで
きること，および，重要なことは，反応において用いられる化学物質の比率のみ
であることを認識するであろう。
【０１０７】 本発明の核酸分子の合成の質を確実にするために，核酸物質の分析に品質管理
の尺度を用いる。例えば，Ｂｅｃｋｍａｎ ＭＤＱ ＣＧＥ装置を用いるキャピ
ラリーゲル電気泳動を用いて，キャピラリーの短末端に試料を導入することによ
り，核酸分子の迅速分析を行うことができる。さらに，例えばＰＥ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＭＡＬＤＩ装置をＢｏｈｄａｎワークステ
ーションと組み合わせて用いる質量分析を用いて，オリゴヌクレオチド，例えば
９６ウエルフォーマットにおいて合成したオリゴヌクレオチドの分析を行うこと
ができる。
【０１０８】 酵素的核酸はまた，２つの部分で合成し，アニーリングして活性な酵素的核酸
を再構築物してもよい（Ｃｈｏｗｒｉｒａ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９２ Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，２８３５−２８４０）。酵素的核
酸はまた，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレ
ートから合成する（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９
，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。
【０１０９】 あるいは，本発明の核酸分子は，別々に合成して，合成後に例えばライゲーシ
ョンにより一緒につなげてもよい（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３
／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ
．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５
１；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈ
ｅｍ．８，２０４）。
【０１１０】 本発明の核酸分子は，好ましくは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミ
ノ，２’−Ｃ−アリル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｈによる修
飾により安定性を高めるよう修飾する（概説としてはＵｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅ
ｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．
，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を
参照）。酵素的核酸は，既知の方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，ま
たは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，
（上掲）を参照，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）により精製
し，水に再懸濁する。
【０１１１】核酸分子の投与 Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５は，酵素的
核酸分子を輸送するための一般的な方法を記載する。ＤＮＡｚｙｍｅは当業者に
知られる種々の方法によって細胞に投与することができ，これには，限定されな
いが，リポソームへの封入，イオントホレシス，または他のベヒクル，例えば，
ヒドロゲル，シクロデキストリン，生分解性ナノカプセル，および生体接着性小
球体への組み込みが含まれる。ある適応症に対しては，ＤＮＡｚｙｍｅをエクス
ビボで，上述のベヒクルを用いてまたは用いずに，細胞または組織に直接輸送す
ることができる。あるいは，ＤＮＡｚｙｍｅ／ベヒクルの組み合わせを，直接注
入により，またはカテーテル，注入ポンプもしくはステントを用いることにより
局所的に輸送する。他の輸送経路には，限定されないが，静脈内，筋肉内，皮下
または関節注射，エアロゾル吸入，経口（錠剤またはピル形態），局所，全身，
眼，腹腔内および／またはくも膜下腔内輸送が含まれる。核酸分子の輸送および
投与のより詳細な説明はＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）およびＤｒ
ａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９に提供されており，こ
れらを本明細書の一部としてここに引用する。
【０１１２】 本発明の分子は医薬品として用いることができる。医薬品は患者の疾病状態を
予防し，発症を阻害し，またはそれを治療する（症状をある程度，好ましくは全
ての症状を緩和する）。
【０１１３】 本発明の負に荷電したポリヌクレオチド（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡまたは蛋白
質）は，医薬組成物を形成するために安定化剤，緩衝剤等を用いて，または用い
ることなく，任意の標準的手段により患者に投与および導入することができる。
リポソーム輸送メカニズムを用いることが望ましい場合，リポソームを形成する
ための標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物はまた，経口投与
用の錠剤，カプセルまたはエリキシル；直腸投与用の座剤；無菌溶液；注射投与
用の懸濁液および当該技術分野において知られる他の組成物として，処方して用
いることもできる。
【０１１４】 本発明はまた，記載される化合物の薬学的に許容しうる処方を含む。これらの
処方には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢
酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。
【０１１５】 医薬組成物または処方とは，細胞または患者への投与（例えば全身投与），好
ましくはヒトへの投与に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は，
部分的には，使用する投与経路（例えば経口，経皮，または注射）に依存する。
そのような形態は，組成物または処方が標的細胞（すなわち，負に荷電したポリ
マーが輸送されることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。
例えば，血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子
は当該技術分野において知られており，例えば，毒性，および組成物または処方
がその効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
【０１１６】 "全身投与"とは，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の
後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には，限
定されないが，静脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれ
る。これらの投与経路のそれぞれは，所望の負に荷電したポリマー（例えば核酸
）をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，分子量ま
たはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソーム
または他の薬剤担体を使用することにより，薬剤を，例えば，あるタイプの組織
（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることが可能である。薬剤
と細胞（例えば白血球およびマクロファージ）の表面との会合を容易にすること
ができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は，マクロファージおよび
白血球による異常な細胞（例えば癌細胞）の免疫認識の特異性を利用することに
より，薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。
【０１１７】 本発明はまた，ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾，または長期
間循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む，表面修飾リポソームを含
む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は，標的組織における薬剤の蓄積を
増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は，単核食細胞システム（ＭＰ
ＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり，したがって
，封入された薬剤の血流循環時間を長くし，組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉ
ｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉ
ｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，
４３，１００５−１０１１）。長期間循環リポソームは，特に，ＭＰＳの組織で
蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べて，ＤＮＡおよ
びＲＮＡの薬物動態学および薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ ｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，国際
公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６
／１０３９２；これらをすべて本明細書の一部としてここに引用する）。長期間
循環リポソームはまた，代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織，例えば肝臓および脾臓に
おける蓄積を回避するその能力に基づいて，カチオン性リポソームと比較して薬
剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護するようである。そのようなリポソーム
は，おそらくは脈管新生標的組織における溢出および捕獲のため，腫瘍中に選択
的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
１９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。
【０１１８】 本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体また
は希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用
いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られ
ており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａ
ｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載さ
れている。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を組成物に添加するこ
とができる（同，１４４９）。適切な例には，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸
，およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤およ
び懸濁剤を組成物に添加してもよい。
【０１１９】 薬学的に有効な用量とは，疾病状態の予防，発症の阻害または治療（症状をあ
る程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学
的に有効な用量は，疾病の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物
の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時投与される薬剤，および
医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，負に
荷電したポリマーの効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重
／日の活性成分を投与する。１つの観点においては，本発明は，必要に応じて特
定の細胞に外的に輸送することができる酵素的核酸分子を提供する。酵素的核酸
分子は，直接加えてもよく，またはカチオン性脂質と複合体化して，リポソーム
中に封入して，または他の方法により，平滑筋細胞に輸送する。ＲＮＡまたはＲ
ＮＡ複合体は，カテーテル，注入ポンプまたはステントを用いて，生物学的ポリ
マー中に組み込んでまたは組み込まずに，関連する組織に局所的に投与すること
ができる。本明細書に記載される方法を用いて，標的核酸を切断する他の酵素的
核酸分子を得て，上述のように用いることができる。本発明の核酸触媒の特定の
例は，以下の表および図面に提供される。
【０１２０】 あるいは，本発明の酵素的核酸分子は，細胞中で真核生物プロモーターから発
現させることもできる（例えば，Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１
９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄ
ｑｕｉｓｔ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａ
ｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２
，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６
６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９，１０８０２−６；Ｃｈ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０
，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ １
９９７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５（これらの文献はその内容の全て
を本明細書の一部としてここに引用する））。当業者は，真核生物細胞中で適当
なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから任意の核酸を発現させることができることを理解
するであろう。そのような核酸の活性は，酵素的核酸によってそれらを一次転写
産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ
ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ＣＴ ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１
２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，
１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６（いずれもその全体を
本明細書の一部としてここに引用する））。
【０１２１】 本発明の別の観点においては，標的分子を切断する酵素的核酸分子は，ＤＮＡ
またはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される（例えばＣｏ
ｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。組換
えベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。酵
素的核酸を発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス
，レトロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築す
ることができる。好ましくは，酵素的核酸を発現しうる組換えベクターは，上述
のように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，酵素的核酸の過渡的発現
を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必要
に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，酵素的核酸は
標的ｍＲＮＡを切断する。活性な酵素的核酸は，標的部位における切断が生ずる
ように，実施例におけるものと同等の酵素中心またはコア，および標的核酸分子
に結合しうる結合アームを含む。そのような切断を妨害しない他の配列が存在し
てもよい。酵素的核酸を発現するベクターの輸送は，全身的（例えば，静脈内ま
たは筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与した後，患者に再
導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれ
かの手段により行うことができる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。
【０１２２】 本発明の１つの観点においては，少なくとも１つの本発明の核酸触媒をコード
する核酸配列を含む発現ベクターが開示される。本発明の核酸触媒をコードする
核酸配列は，その核酸分子の発現を可能とする様式で，動作可能なように連結さ
れている。
【０１２３】 本発明の別の観点においては，本発明は，ａ）転写開始領域（例えば真核生物
ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核生
物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの終止領域）；ｃ）本発明の核酸触媒の少なく
とも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。ここで，前記
配列は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始
領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。ベクターは，任意
に本発明の核酸触媒をコードする配列の５'側または３’側に動作可能なように
連結された蛋白質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／または
イントロン（介在配列）を含んでいてもよい。
【０１２４】 核酸分子配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ），ＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ），またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏ
ｌ ＩＩＩ）のプロモーターから駆動することができる。ｐｏｌ ＩＩまたはｐ
ｏｌ ＩＩＩプロモーターからの転写産物は，一般にすべての細胞において高い
レベルで発現されるであろう。所定の細胞タイプ中における所定のｐｏｌ ＩＩ
プロモーターのレベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイ
レンサー等）の性質に依存するであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適
当な細胞中で発現される限り，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた
用いられる（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０ Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ ａ
ｎｄ Ｈｕａｎｇ １９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，
２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７；これらの参考文献はすべ
て本明細書の一部としてここに引用する）。何人かの研究者が，そのようなプロ
モーターから発現した核酸分子，例えば酵素的核酸が哺乳動物細胞中で機能しう
ることを示している（例えば，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１
９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ
ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ
，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９
３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，９０，６３４０−４
；Ｌ'Ｈｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４４
１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２
５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１
５６６）。より詳細には，転写ユニット，例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ），転移
ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子に由
来するものは，細胞中において高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えば酵素的核酸）
を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）；Ｃｏ
ｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂ
ｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２
，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，１６２４，８０３
；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉ
ｃｒｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１８７３６；（これらのす
べての刊行物を本明細書の一部としてここに引用する）。上述の酵素的核酸転写
ユニットは，哺乳動物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むこと
ができる。ベクターとしては，限定されないが，プラスミドＤＮＡベクター，ウ
イルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクタ
ー），またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウ
イルスベクター）が挙げられる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓ
ｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）。
【０１２５】 さらに別の観点においては，本発明は，本発明の核酸分子の少なくとも１つを
コードする核酸配列を，その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクタ
ーを特徴とする。１つの態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含
み；前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で
，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。別の好
ましい態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域
；ｃ）オープンリーディングフレーム；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコ
ードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３
'末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現
および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記オープンリーディ
ングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別
の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ
）イントロン；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；
前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
記開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されて
いる。別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止
領域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；ｅ）前記核酸分子
の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリー
ディングフレームの３'末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は
，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，
前記イントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作
可能なように連結されている。
【０１２６】 あるいは，本発明の酵素的核酸分子は，一本鎖ＤＮＡ発現ベクターから発現さ
せることができる。
【０１２７】 本発明はまた，本発明の核酸触媒の効果をインビボで増強する方法を特徴とす
る。該方法は，核酸触媒をインビボでその標的とともに局在化させる工程を含む
。関連する観点においては，本発明は，インビボで薬剤のウイルス標的を局在化
するのに適合されている核酸触媒を特徴とする。
【０１２８】 当業者は，核酸触媒を標的とともに適切な区画内に局在させるよう，多くの方
法を用いて修飾することができることを認識するであろう。これらの方法の例は
，本発明にしたがうが，限定的なものではない。すなわち，例えば，本発明の核
酸触媒は，ターゲティング剤と共有結合でまたは非共有結合で結合するように，
インビボでベクターから合成する（またはインビトロで形成する）ことができ，
そのような例は当該技術分野においてよく知られている（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ
ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８５４，０３８；Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０００；３１３：４０１−２０；Ｒ
ｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８５，１６８５）。こ
れらのターゲティング剤は，"局在シグナル"と称される。さらに，核酸触媒は，
インビトロで合成し，多くの標準的方法のいずれかを用いて投与して，核酸触媒
を患者の適切な細胞区画にターゲティングさせることができる。
【０１２９】 核酸触媒の効果をインビボで"増強する"とは，局在シグナルがその核酸触媒を
細胞中の特定の部位にターゲティングし，このことによりその核酸触媒がより効
率的に作用するようにすることを意味する。すなわち，インビボで細胞に投与さ
れたより低い濃度の核酸触媒が，より高い濃度の局在化されていない核酸触媒と
同等の効果を有することができる。ターゲティングまたは局在化された核酸触媒
の効力のそのような増加は，当業者によく知られる任意の標準的な方法により測
定することができる。一般に，核酸触媒の効果は，核酸触媒をその標的に対して
所望の効果を有するように標的のごく近くに配置することにより増強される。こ
れは，核酸触媒を標的とともに小さな規定された区画内（例えば，ウイルス粒子
内）に局在させることにより，または区画内の同じ場所，例えば標的が合成され
る位置である核に局在させることにより，行うことができる。
【０１３０】 局在シグナルには，自然に所望の区画に局在化される任意の蛋白質性または核
酸成分，例えば，ウイルスパーケージングシグナル，またはその同等物が含まれ
る。局在シグナルは，当業者が，これらに付随する核酸触媒をある種の区画に局
在化させるシグナルとして同定することができ，標準的な方法論を用いて容易に
発見することができる（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８５
４，０３８；Ｓｈａｊｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８３４，１８６）。これ
らの局在シグナルは，任意の所望の方法により，例えば，局在シグナルおよび核
酸触媒の両方を同じ分子の一部として生成するＤＮＡテンプレートを構築するこ
とにより，または，２つの成分の間の共有結合またはイオン結合の形成により，
核酸触媒に連結させることができる。本発明において本質的なことは，核酸触媒
が，標的部位中に局在したときにその阻害的効果を有することができ，かつ局在
シグナルがその核酸触媒をその標的部位に局在化することができることのみであ
る。例えば，ＨＩＶのＲｅｖ応答要素等の局在シグナルをＤＮＡ酵素に連結させ
て，ある種独特の方法でソーティングすることができる。当業者は，当該技術分
野において知られる方法を用いて他の核酸局在要素を本発明のＤＮＡｚｙｍｅに
結合させることができることを認識するであろう。
【０１３１】 他の例には，シグナルを含むＲＮＡ／ＤＮＡを多数の不適当な標的を含まない
経路中にソーティングする任意の細胞ＲＮＡ／ＤＮＡ局在シグナル；ウイルス蛋
白質局在／組立シグナル，例えばＲｅｖまたはｇａｇ蛋白質が含まれる。
【０１３２】 ウイルス複製または組立に重要な細胞内部位においてウイルス阻害剤の濃度を
増加させることは，核酸触媒の有効性を増加させる一般的方法である。上述の共
局在化戦略は，例えば，ウイルスパーケージングシグナルを用いて核酸触媒をウ
イルス複製を担う標的と共局在化させることにより行うことができる。このよう
にして，ウイルス複製を減少させるかまたは防止することができる。この方法を
用いて，核酸触媒を適切な局在シグナルに連結させて，ウイルス複製機構が活動
する治療上重要な細胞内およびウイルスの位置にこれらをソーティングすること
により，核酸触媒の有効性を増強することができる。
【０１３３】 酵素的核酸分子戦略のそのような共局在または制御は，天然に生ずる局在およ
び制御シグナルの利用に限られない。核酸触媒は，人工的に進化させたＤＮＡ／
ＲＮＡおよび／または蛋白質デコイを用いることにより，重要な細胞内位置にタ
ーゲティングすることができる（Ｓｚｏｓｔａｋ，１７ＴＩＢＳ８９，１９９２
）。これらの進化した分子を，例えばウイルス蛋白質に結合するように選択し，
これを用いて，そのようなデコイに対する阻害剤を連結することにより，核酸触
媒をウイルス標的と共局在させることができる。
【０１３４】 "本質的に・・・からなる"とは，活性な酵素的核酸分子が，標的部位における
切断が生ずるように，実施例のものと同等の酵素的中心またはコア，および標的
核酸分子に結合することができる結合アームを含むことを意味する。そのような
切断を妨害しない他の配列が存在していてもよい。
【０１３５】 本発明の核酸触媒を用いて，インビトロまたはインビボで，原核生物細胞また
は真核生物細胞において，細菌，真菌，マイコプラズマ，始原細菌，藻類，植物
または任意の他の生物学的システムにおいて，外来または外因性遺伝子の発現を
阻害することができる。
【０１３６】 "内因性"遺伝子とは，通常は細胞内のゲノム中のその天然の位置において見い
だされる遺伝子を意味する。
【０１３７】 "外来"または"異種"遺伝子とは，宿主細胞において通常は見いだされないが，
標準的な遺伝子伝達手法により導入されるか，または感染の結果として（例えば
，細菌，ウイルスまたは真菌感染により）獲得された遺伝子を意味する。
【０１３８】 "植物"とは光合成生物を意味し，真核生物でも原核生物でもよい。
【０１３９】実施例 以下は本発明の酵素的核酸の選択，単離，合成および活性を示す非限定的例で
ある。
【０１４０】 本出願人は，インビトロ選択を用いて，ランダム配列分子のプールからＭｇ2+ 依存性自己切断ＤＮＡ酵素の集団を単離した。種々の集団からの少数の個々のＤ
ＮＡｚｙｍｅｓを特性決定することにより，異なる二次構造モチーフをとる少な
くとも６個のクラスのＤＮＡ酵素の出現が明らかとなった。６個のクラスのいず
れも，これまでに知られている折り畳みパターンとは対応しない。各プロトタイ
プＤＮＡ酵素は，対応する触媒されない速度より少なくとも１０００倍上昇した
化学的速度で自己切断を促進する。
【０１４１】実施例１：ランダムプールからの触媒的ＤＮＡのインビトロ選択 最初のランダム集団は，分子のプール，すなわち，ランダム領域［Ｎ５０］，
続いて（５’−ＴＴＡＴＴＡＣＧＧＴＡＡＣＧＴＴＧＧＣＡＣ−３’）（配列番
号１１２）（Ｎ５０は５０ヌクレオチドのランダム領域を示す）に接続したＲ１
９（５’−ＡＣＧＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣ−３’）（配列番号１１１）を，Ｔ
４ＤＮＡリガーゼおよびライゲーションのテンプレートとしてオリゴ１．３０（
５’−ＴＧＣＡＣＡＣＧＴＡＧＣＧＴＣＧＣＴ−３’）（配列番号１１４）を用
いて，合成ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ基質，２．２６（５’−ＧＧＣＡＣＡＣＣＡＣ
ＡＡＧＡＧＵＡＡＵＡＡＵＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＡＣＧＣＴ−３’）（配列番号
１１３）（下線はＲＮＡ領域を示す）にライゲーションすることにより作成した
。合成Ｒ１９分子のプールを最初にリン酸化し，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて［γ−32Ｐ］ＡＴＰで末端標識して，Ｔ４リガーゼに必要な５’リン酸
を得た。全長集団は，変性ＰＡＧＥによりライゲーションしていない成分から分
離した。ゲルから溶出した後，全長分子をエタノール沈澱させ，０．００１％Ｓ
ＤＳ（初期のラウンド）または直接１Ｘ選択緩衝液（後のラウンド）のいずれか
に再懸濁した。次に，集団を選択緩衝液中で３７℃で反応させ，変性ＰＡＧＥに
より好結果の触媒を未反応分子から分離した。すべての可能なＲＮＡ切断事象を
包含するためにゲルのゾーンを切り出した。溶出した触媒を，ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼおよびプライマー１．１（５’−ＧＴＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＣＣＧ３’
）（配列番号１１５）および２．２９（５’−ＡＣＧＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣ−
３’）（配列番号１１６）を用いるＰＣＲにより増幅して，好結果の触媒の多コ
ピーを作成した。次に，プライマーｌ．ｌｒ（５’−ＧＴＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡ
ＣＣＧ−３’，リボースで終了する）（配列番号１１７）および２．２９を用い
て反応の一部をＰＣＲで増幅して，負鎖中に埋め込まれたリボースを有する分子
を生成した。負鎖をアルカリおよび加熱によりこのリボースで切断した。次に，
変性ＰＡＧＥにより正鎖を負鎖フラグメントから分離した。最初の集団と同様に
，正鎖をリン酸化し，基質２．２６にライゲーションした。次に，次のラウンド
の選択のために，変性ＰＡＧＥにより新たなプールを取り込まれていない基質お
よびライゲーションテンプレートから精製した。図４は，上述した選択プロセス
の概略図である。
【０１４２】 最初のランダムプールから構成される第０世代は，５０ｍＭ塩化マグネシウム
，中性に近いｐＫａを有するアミノ酸（ａｒｇ，ａｓｎ，ｃｙｓ，ｇｌｎ，ｇｌ
ｕ，ｈｉｓ，ｌｙｓ，ｍｅｔ，ｐｈｅ，ｓｅｒ）については２０ｍＭ，チロシン
については１ｍＭ（その低い溶解性のため），および残りの天然のアミノ酸につ
いては２ｍＭの緩衝液中で，３７℃で１２時間反応させた。選択緩衝液はまた，
すべてのラウンドにおいて，１５０ｍＭ塩化カリウム，７ｍＭプトレシン（折り
畳みを助ける可能性のため），および１０ｍＭ還元型グルタチオンを含み，すべ
ての成分を加えた後に，３７℃でｐＨ７．６±０．１に調節した。反応時間およ
びマグネシウムおよびアミノ酸の濃度は，選択の経過の間に低下させ，最後には
，反応時間は１０分間であり，マグネシウムおよび各アミノ酸は両方とも０．５
ｍＭであった。アミノ酸含量を減少させたときは，ＨＥＰＥＳを５０ｍＭで加え
て，緩衝効果の喪失を補償した。
【０１４３】 選択プロセスの間，ライゲーションに，およびライゲーションアクリルアミド
ゲルからのプールの溶出に許容される時間を短縮して，これらのプロセスの間の
ＲＮＡ切断を防止した。グルタチオンを選択緩衝液に細胞質と同様の濃度で含ま
せて，成分，特にシステインを還元状態に維持した。追加の注意として，システ
インおよびグルタチオンは，使用直前に再懸濁し選択緩衝液中に新たに加えるか
（初期のラウンド），または新たに調製した溶液を使い捨てアリコート中で凍結
し使用直前に溶解した（後のラウンド）。さらに，アルギニンをシステイン／グ
ルタチオン混合物に含ませた。これは，アルギニンの溶液が空気から二酸化炭素
を吸収し，したがってｐＨを変化させる可能性があるという点において，アルギ
ニンもまたいくぶん不安定であるためである。
【０１４４】 細胞においてＲＮＡを切断するのに理想的に適合した新規なデオキシリボザイ
ムを発見する目的で，インビトロ選択を行った。いくつかの新たなクラスのマグ
ネシウム依存性ＲＮＡ切断ＤＮＡ配列が回収された。これらの酵素は，同じ化学
反応を行う既知のデオキシリボザイムに対して一次配列類似性を示さない。これ
らのクラスのそれぞれからの代表的プロトタイプ一分子は，埋め込まれたＲＮＡ
成分で自己切断し，観察された速度定数は，０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１５０ｍ
Ｍ ＫＣｌ，７ｍＭプトレシン，１０ｍＭ還元型グルタチオン，および５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６中で３７℃において約１０-2ｍｉｎ-1であった。支配
的クラスの配列の短い型であるクラスＩは，２０ヌクレオチドの触媒コアを有す
る。このデオキシリボザイムは，標的をトランスで少なくとも０．０６ｍｉｎ-1 の擬似一次速度定数で切断するよう作成することができ，インビトロで転写され
た異なる配列のＲＮＡ標的を切断するよう生成することができ，触媒的に重要な
官能基に対するｐＫａは約７．９である。この速度論的速度はより高い濃度のマ
グネシウム中で増加するが，その最大速度はまだ決定していない。
【０１４５】 それに基づいてライブラリを作成した構築物は図１に示され，用いた選択スキ
ームは図４に示される。大文字は，分子ライブラリの領域中の４つの標準的なＤ
ＮＡ塩基およびＲＮＡ塩基（反転）を示し，これはすべての分子の間で一定であ
った。これらの領域はＲＮＡ基質を提供し，塩基対形成によりランダム領域を基
質に隣接して配置し，選択の間に標準的方法を用いてライブラリを操作すること
を可能とする。触媒的配列は５０ヌクレオチドの領域に由来するものであり，定
常領域の間に埋め込まれ，ランダムＤＮＡ配列を含むよう合成した。
【０１４６】 分子は，ＲＮＡ残基で自己切断する能力に基づいて選択した。分子は，ＲＮＡ
切断に関連すると予測される条件に関してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細
胞質の組成と類似する緩衝液中で，溶液中で反応させた（図１，凡例）。インキ
ュベーションは３７℃で行った。マグネシウムイオンおよびアミノ酸は，ランダ
ムライブラリからのデオキシリボザイムのコピー数を増加させて，ＲＮＡ切断に
有利となるよう，最初は細胞質レベルより十分に高い濃度で選択緩衝液に含有さ
せた。変性ＰＡＧＥによりＲＮＡ領域中のすべての可能な切断事象についてサイ
ズ分離することにより，プールの残りから活性な触媒を単離した。触媒的集団が
いったん確立されれば，選択の条件は，分子を反応させる時間を減少させること
により，およびすべての緩衝液成分の濃度を生理学的レベルに低下させることに
より，より一層ストリンジェントにした。
【０１４７】 現在の選択から調べた６個のクラスのＤＮＡの間では既知のＤＮＡｚｙｍｅモ
チーフは同定されなかった。そうではなく，既知のＲＮＡ切断デオキシリボザイ
ムに対して検出可能な一次または二次配列類似性を有しない全く新しい触媒的モ
チーフが発見された（表２）。各クラスからの代表的クローンをその一分子フォ
ーマットで試験して，触媒速度および切断部位を決定した（表３）。これらの新
たな配列は，速度論的特性が変化したユニークな三次構造であるかもしれない。
各クラスを個別に評価するための実験が進行中である。
【０１４８】 クラスＩのクローン２７を最小化された二分子フォーマットで調べた（図２）
。図２ａに示される二次構造は，表２で下線を施してある保存ヌクレオチドの領
域に基づき，触媒の３’末端で塩基対形成が復活している。この酵素が基質と相
互作用するＫdは５μＭであり，これは予測基質結合アームのＡ−Ｕリッチの性
質のために結合が弱いことを反映しているのであろう。酵素はグルタチオンを要
求しないが，プトレシンの非存在下では活性が１０倍低下する。このｐＫａは約
７．９であり，０．５ｍＭＭｇ2+中で０．０６ｍｉｎ-1の最大擬似一次速度定数
に達する。酵素はまた，図２ｂに示されるインビトロ転写された標的を切断し，
このことは，これが基質中にＤＮＡ残基を要求せず，基質結合アームを変化させ
ることにより一般化しうることを示す。図６に示される種々の基質に対するクラ
スＩモチーフの相対的切断速度は表４に示される。１回ターンオーバー条件下で
は，各酵素の速度は１つのマグネシウムイオンに１ｍＭのＫdで結合することに
より制限される（図６）。したがって，触媒コアは，細胞におけるマグネシウム
およびｐＨレベルによく適合している。模擬的生理学的条件（ｐＨ７．６，２ｍ
Ｍ Ｍｇ2+，１５０ｍＭ Ｋ+，７ｍＭプトレシン，３７℃）におけるＲＮＡ切
断の擬似一次速度定数は０．０６０ｍｉｎ-1である。Ｍｇ2+を８ｍＭに増加させ
，ｐＨが８．９であるとき，室温における最大速度定数は０．２２ｍｉｎ-1であ
る。
【０１４９】 予測基質結合領域を新規な標的に相補的なように変更することにより，クラス
Ｉモチーフを種々のＲＮＡ基質を模倣生理学的１回ターンオーバー条件下で切断
するよう標的化した。追加の切断部位は図５に示される。図２からのモデル基質
に対する切断速度は表４にまとめられており，広い変動を示す。この変動は，元
の選択に存在したようにＲＮＡ／ＤＮＡキメラ中で全ＲＮＡ基質を認識すること
ができないためではなく，おそらくは，ＲＮＡ標的の分子内構造の結果であろう
。図５Ａの基質は細菌蛋白質のｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよびＯＲＦの一部に対応
し，図５Ｂの基質はこの試験のために特に設計した。後者の基質の適合性は，二
次構造予測プログラムｍｆｏｌｄ（Ｍａｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８，９１１−９４０）バージョン３．１により，
以下のように確認した：（１）基質が顕著な分子内構造を有しないと予測された
；（２）各デオキシリボザイムはＲＮＡの１つの部位とのみ相互作用するであろ
う；（３）各デオキシリボザイム／基質塩基対形成相互作用は図２に示されるモ
デル基質相互作用より４−８ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ安定であろう。いずれにしても
，特に分子内で有意な影響を有するかもしれない三次的および非標準的相互作用
は予測されないであろう。
【０１５０】 クラスＩＶおよびクラスＶモチーフもまた，トランスで基質を切断することが
できる（図７）。インビトロ選択からのクラスＩＶクローン配列は切断されたコ
ア中に延長されたステム−ループを含み，コアサイズを２９ヌクレオチド以下に
する。同様に，クラスＶは，２８ヌクレオチドのコアサイズに切断されている。
クラスＩＶモチーフは，０．５ｍＭ Ｍｇ2+，１５０ｍＭ Ｋ+，７ｍＭプトレ
シン，ｐＨ７．６中で３７℃で，０．００２ｍｉｎ-1の擬似一次速度定数でイン
ビトロ転写ＲＮＡを切断するよう標的化することができる。この基質については
，同じ緩衝液中でＫdは約１μＭである。このモチーフは，グルタチオンの要求
性を有しないことが示されている。クラスＶモチーフの速度定数は，上述と同様
であるが１０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液中で試験したとき，約０．００６ｍ
ｉｎ-1であると見積もられる。
【０１５１】 クラスＩＩのクローン２７および３７について実験を行った。クローン２７に
ついては，触媒的に活性な最小配列であるが完全な基質認識部位を有すると考え
られる分子の合成を試みた（図３）。この構築物を用いると，活性が劇的に喪失
した。全長分子の全配列が存在するが分子が接続ループ領域中で分断されている
元のクローン３７についてのライゲーションしていない二分子アッセイも不活性
であった。
【０１５２】 一分子的にシスでＲＮＡを切断する他のモチーフを調べた。クラスＩＩＩクロ
ーンである２１は，ライゲーションしていない二分子アッセイで切断する。しか
し，一分子反応があまり進行しないことは（わずか７％が進行した，表３）ある
程度の妨害を示し，これは，より多くの構造的データが入手可能であれば，切断
により解決する可能性がある。クローン３４は活性を示すが，精製ゲルからの溶
出およびその後の調製の間に活性化するようである。クローン３４の反応は，時
間０において有意な切断を示すが，いくつかの緩衝液条件，例えば溶出緩衝液を
模倣するよう設計された条件下ではさらなる切断を示さない。単離されたクラス
ＶＩモチーフはマグネシウム依存性触媒であることが示されており，切断速度定
数は０．００２ｍｉｎ-1であると見積もられる（０．５ｍＭ Ｍｇ2+，１５０ｍ
Ｍ Ｋ+，７ｍＭプトレシン，１０ｍＭグルタチオン，ｐＨ７．６，３７℃）。
【０１５３】ＤＮＡｚｙｍｅの工学的改変 本発明のＤＮＡｚｙｍｅｓの配列，化学的および構造的変種は，上述の手法お
よび当該技術分野において知られる手法を用いて，別個の標的ＲＮＡまたはＤＮ
Ａをトランスで切断するように，工学的に改変することができる。ＤＮＡｚｙｍ
ｅは，当該技術分野において知られる手法を用いて，そのサイズを減少または増
加させることができる。２’−ヒドロキシル（２’−ＯＨ）基を含む分子を工学
的に改変するために記載されている手法を，本発明のＤＮＡ酵素に適用すること
ができる（例えば，Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４
，４２９；Ｒｕｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９
，１０６９５；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
２９，６５３４；ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８９，５７１０；Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，
１９９４，（上掲）；Ｈｅｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＢＢＡ １２１
９，４０５；Ｂｅｎｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＪＡＣＳ，１１５，
８４８３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，２４，４４０１；Ｍｉｃｈｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，３４，２９６５；Ｂｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，３１，１１８４３；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ
，１４，３６８；Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３，
９５６１；Ｃｅｃｈ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，２，
６０５；Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，
３９２，２１５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｏｒｇ
．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４，１７１５を参照；これらの参考文献はすべて，その
全体を本明細書の一部としてここに引用する）。例えば，ＤＮＡｚｙｍｅｓのス
テム−ループドメインは酵素活性に必須でないかもしれず，したがって，当該技
術分野において知られる種々の方法を用いて，ＤＮＡｚｙｍｅの全体の酵素活性
が有意に低下しない程度に，そのサイズを系統的に減少させることができる。さ
らに，部位特異的突然変異および／または化学的修飾により変種のステム−ルー
プ構造を導入することを用いて，改良された触媒作用または増加した安定性，ま
たはその両方を有するＤＮＡｚｙｍｅｓを開発することができる。
【０１５４】 当業者は，本明細書に記載されるインビトロ選択戦略のさらなるラウンドおよ
びその変形を用いて，追加の核酸触媒を容易に進化させることができ，そのよう
な新規触媒は本発明の範囲内である。さらに，"変異原的ＰＣＲ"（Ｃａｄｗｅｌ
ｌ ＲＣ，Ｊｏｙｃｅ ＧＦ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ １９９４
Ｊｕｎ ３：６ Ｓ１３６−４０）を用いて，式ＩおよびＩＩに記載される配列
をさらに最適化することができる。さらに，当該技術分野において知られるよう
な，ステムループ構造の修飾によるこれらの変種ＤＮＡｚｙｍｅ構築物の最適化
により，改良された切断活性を有する種を提供することができる。
【０１５５】 ＤＮＡｚｙｍｅｓの標的配列要求性は，当該技術分野において知られる方法を
用いて決定し評価することができる。
【０１５６】新規リボザイムモチーフ ハンマーヘッドリボザイムを用いて部位特異的突然変異の拡張された一連の実
験を行って，ヌクレオチド配列と酵素活性との間の関係を調べた。これらの系統
的研究は，ハンマーヘッドリボザイムの保存コア（Ｆｏｒｓｔｅｒ＆Ｓｙｍｏｎ
ｓ，１９８７，Ｃｅｌｌ，４９，２１１）中のほとんどのヌクレオチドは酵素活
性の有意な喪失なしには変異することができないことを明らかにした。これに対
し，突然変異リボザイムの大きなプールを酵素活性を保持するＲＮＡについて同
時にスクリーニングするコンビナトリアル戦略をより効率的に用いて，変異不可
能な配列を規定し，新たなリボザイム変種を同定することができる（Ｂｒｅａｋ
ｅｒ，１９９７，（上掲））。例えば，Ｊｏｓｅｐｈ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ（１
９９３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２４５１５）は，インビトロ選択
方法を用いて，改良された酵素活性を示す’ヘアピン’自己切断ＲＮＡの配列変
種を迅速にスクリーニングした。この方法により，いずれも触媒速度が１０倍改
良されたヘアピンリボザイムの２つの変異体の同定に成功した。
【０１５７】 本出願人は，インビトロ選択を用いて，ランダム配列分子のプールからＭｇ2+ 依存性自己切断リボザイムの集団を単離した。種々の集団からの少数の個々のリ
ボザイムを特性決定することにより，異なる二次構造モチーフをとる少なくとも
１２のクラスのリボザイムが出現したことが明らかとなった。１２のクラスの１
つのみがこれまでに知られている折り畳みパターン（天然のハンマーヘッドリボ
ザイムのもの）に対応する。各プロトタイプリボザイムは，隣接する２’−ヒド
ロキシル基が関与する内部ホスホエステル転移反応により，対応する触媒されな
い速度の少なくとも１０００倍増加した化学的速度で，自己切断を促進する。
【０１５８】ランダムプールからの自己切断ＲＮＡのインビトロ選択 図８Ａに示される選択的増幅スキームを用いて，約１０14種類の異なるＲＮＡ
の集団から新規リボザイムを単離した。インビトロ選択において用いた各ＲＮＡ
構築物は，その５’側および３’側の両方で規定ヌクレオチド配列のドメインに
挟まれた４０ヌクレオチドのランダム配列領域を含んでいた（図８Ｂ）。３’フ
ランキングドメインは，リボザイム切断の標的部位として働くよう設計した。延
長された長さのため，３’フランキングドメインはリボザイムの作用によりヌク
レオチドを欠失しうるが，なおＲＴ−ＰＣＲによる増幅のプライマー結合部位と
して機能する。さらに，このドメインのヌクレオチド配列は，その切断部位にお
いて特定の種類のジヌクレオチドを有する必要があるかもしれないリボザイムの
単離を容易にするために，１６種の可能なすべての最も近い隣接の組み合わせを
表すように設計した。
【０１５９】 選択の各ラウンドにおいて，ＲＮＡはＴ７ＲＮＡＰを用いてインビトロで転写
し，未切断ＲＮＡ前駆体はＰＡＧＥにより単離した。効率的なＭｇ2+依存性リボ
ザイムが酵素的合成の間に切断され，このことにより未切断ＲＮＡ前駆体の単離
の際に失われる可能性を低下させるために，インビトロ転写において用いたＭｇ 2+ 濃度およびインキュベーション時間は最小にした。さらに，ポリアクリルアミ
ドゲルからのＲＮＡ前駆体の破砕／浸漬単離に用いたインキュベーション時間を
最小にして，Ｍｇ2+の非存在下で反応する自己切断リボザイムの単離を排除した
。選択のためには，精製ＲＮＡ前駆体を許容的反応条件（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ［ｐＨ７．５，２３℃］，２５０ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＭｇＣｌ2）
で，２３℃で４時間インキュベートした。このインキュベーションの間に３’ド
メインにおいて切断したＲＮＡをＰＡＧＥにより単離した。詳細には，前駆体Ｒ
ＮＡより約１０から約３０ヌクレオチド短いＲＮＡ切断フラグメントを含むゾー
ンを切り出し，回収したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。
【０１６０】 ６ラウンドの選択の後に単離されたＲＮＡの集団（Ｇ６）は，Ｍｇ2+の存在下
において有意なレベルの自己切断活性を示す。この段階において，主要な５’−
切断産物を単離し，単離されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングして配
列決定した。典型的には，切り出されたゾーンの残りは種々の長さの５’−切断
フラグメントを含むと予測され，これを用いて選択的増幅プロセスを続けた。こ
の単離戦略は２つの目的にかなう。第１に，図１Ｃにおいて観察される主要な切
断生成物を生成する，おそらくはＧ６において集団を支配するリボザイムをさら
に詳細に調べることができる。第２に，これらのより一般的に占められる配列は
続く選択のラウンドからほとんど除かれ，したがって，以降のラウンドにおいて
ＲＮＡ集団を支配する可能性が低い。このことにより，存在する頻度がより低い
リボザイムが後の集団においてその頻度が増加することが可能となる。同様にし
て，Ｇ９，Ｇ１２およびＧ１５において５’−切断フラグメントを表す主要な生
成物のバンドをゲルから選択的に回収し，ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行い，次にクロー
ニングおよび配列決定を行った。この戦略は，多くの異なる自己切断ＲＮＡモチ
ーフを単離することができる有効な手段を提供する。
【０１６１】 "ランダム配列領域"とは，完全にランダムな配列および／または部分的にラン
ダムな配列の領域を意味する。完全にランダムな配列とは，理論的にはＡ，Ｔ，
ＧおよびＣヌクレオチドまたはそれらの修飾された誘導体が配列中の各位置にお
いて等しく存在する配列を意味する。部分的にランダムな配列とは，Ａ，Ｔ，Ｇ
およびＣヌクレオチドまたはそれらの修飾された誘導体が配列の各位置において
同等でなく存在する配列を意味する。したがって，部分的にランダムな配列は，
完全なランダム性を有する１またはそれ以上の位置および規定ヌクレオチドを有
する１またはそれ以上の位置を有する。
【０１６２】新規自己切断リボザイム配列の特性決定 Ｇ６，Ｇ９，Ｇ１２およびＧ１５集団からの自己切断リボザイムを表す１００
を越えるクローンを配列分析すると，２０もの多くの異なる配列のクラスのＲＮ
Ａが明らかとなった。場合によっては，関連する変種の間で共通する配列要素に
基づいて，多くのＲＮＡが１つのクラスの自己切断リボザイムと同じであった。
例えば，我々が"クラスＩ"リボザイムとして定義した，類似するコアヌクレオチ
ドを有する共通の二次構造を形成しうる約３０クローンが同定された。別の場合
には，他のすべてのクローンと比較して完全にユニークな配列を有するＲＮＡが
単離された。これらの"オーファン"配列は，"クラスＩＩ"リボザイムについて行
ったものと同様に別々に分類した。最終的に，これらの２０種類の異なる配列ク
ラスを，特徴的な配列要素の存在，二次構造および切断部位に基づいて同定され
た自己切断リボザイムの１２個の異なる構造的クラスにグループ化した（図９）
。１２のクラスのうち１つのみ（クラスＩＸ）が，天然に生ずるＲＮＡ，すなわ
ち自己切断ハンマーヘッドリボザイムに対応した。異なる構造的クラスのリボザ
イムの間の区別は，クラスＩおよびクラスＩＩリボザイムについて以下に記載す
るように確立した。
【０１６３】 リボザイムを最初に分類した２０の推定配列クラスのそれぞれについて，代表
的クローンのヌクレオチド配列に基づいたリボザイム変種の集団から始めて，自
己切断活性について３−５ラウンドの再選択（図８Ａ）を行った。予測されたよ
うに，各クローンの元のＮ４０ドメインにランダム変異（ｄ＝０．２１；Ｆｅｄ
ｏｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３
１，１２０４２−１２０５４を参照）を導入すると，集団の酵素活性が有意に低
下した。しかし，３−５ラウンドの再選択の後，変異させた集団は，有意なレベ
ルの自己切断活性を回復した。特定の集団の酵素活性がその親クローンとほぼ同
一になったとき，代表的リボザイム変種をクローニングおよび配列決定により同
定した。
【０１６４】 各クラスについてクローニングされたＲＮＡの変種リボザイムドメインに対応
するヌクレオチド配列をアラインメントして，人工的系統発生を得た。表１１は
クラスＩ，クラスＩＩ，およびクラスＶリボザイムの人工的系統発生分析を示す
。各親配列の元のランダム配列ドメインに対応する４０ヌクレオチドについて配
列の変動が示されている（番号付けされている）。点は最初に示される親配列か
ら変化していないことを示す。アスタリスクは，位置１８および２６において変
異を有し，塩基対形成する能力を保持するクラスＩリボザイム変種を識別する。
例えば，クラスＩおよびクラスＩＩリボザイムのいずれの親配列も，酵素活性を
完全に破壊することなく実質的に変異したことが見いだされた（表１１）。しか
し，各場合における変異獲得のパターンは，おそらくはリボザイム機能に重要で
ある保存された一次および二次構造の存在を示す。クラスＩについて得られたリ
ボザイム変種のすべてが位置１２−１６においてプロトタイプヌクレオチド配列
を保持しており（図９および表１１），このことは，これらのヌクレオチドが自
己切断活性に重要であることを示唆する。保存１２−１６ｎｔ領域と重複するヌ
クレオチド８−１４は，３’プライマー結合ドメイン中のヌクレオチドに相補性
を示す。さらに，位置１７−１９および２５−２７のヌクレオチドはいずれも相
互に相補的であり，高度に保存されている。このことは，これらの後者の２つの
配列要素もまたヘアピン構造を形成するかもしれず，介在ヌクレオチド２０−２
４は接続ループとして働くことを示す。この解釈と一致して，クラスＩリボザイ
ム変種により獲得された位置１７−１９および２５−２７中の変異（表１１；ア
スタリスク）は塩基相補性を保持しうることが観察された。さらに，ヌクレオチ
ド２０−２４にまたがる予測ループ配列は，ループ中のヌクレオチドがステム形
成に，および最終的にリボザイムの作用に重要でないのであれば，予測されるよ
うに有意な変異に対して許容性を有するであろう。
【０１６５】 クラスＩＩリボザイム（表１１）の人工的系統発生についても，構造形成およ
び保存配列の同様の特性が明らかである。しかし，データは，クラスＩＩリボザ
イムはクラスＩとは異なる触媒的構造を形成することを示す。例えば，元のラン
ダム配列ドメインの相補的セグメントもまた，２つの別々のステム要素の形成と
一致する。しかし，これらのステムは，存在する場合，クラスＩリボザイムにお
いて形成されることが予測されるものとは異なるように配置される。この時点で
は，クラスＩＩの人工的系統発生における配列変種の出現により判定して，ヌク
レオチド８−１１と１６−１９との間に形成される１つのステムのみが存在する
ようである。さらに，クラスＩＩＲＮＡの２つの保存領域（ヌクレオチド１−７
および２２−３０）（図９および表１１）は，クラスＩＲＮＡにおいて見いださ
れる保存配列とは異なってり，このことは，２つのクラスのリボザイムが実際に
異なることを示す。
【０１６６】 同様に，残りの１８クローンについての人工的系統発生データの分析から，本
出願人は，１２個もの異なるクラスのリボザイムを同定した（図９）。多くの場
合，再選択により生成した各人工的系統発生を調べると，異なる配列クラスの間
で不明瞭な配列および構造的類似性が明らかとなった。このような予見しえなか
った類似性は，典型的にはリボザイムドメインのコア中に配列の保存性をほとん
ど必要としない構造的クラス（例えば，クラスＶおよびＶＩＩＩ）にしたがう代
表的ＲＮＡの間で同定された。図９に示される構造的モデルは，確認された二次
構造を表すことを意図するものではないことに注意することも重要である。ほと
んどの場合において，限定された人工的系統発生データを二次構造予測アルゴリ
ズム（Ｚｕｋｅｒ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，４８−５２）を用いる
予備的分析と組み合わせて用いて，モデルを導く。
【０１６７】二分子リボザイム反応の特性決定 予備的配列分析に基づいて，クラスＩ自己切断リボザイムはＸ形状の二次構造
を形成する（図９）。このモデルにおいては，別のリボザイムドメインがその対
応する基質ドメインと塩基対形成し，元のＲＮＡ構築物の最も近い隣接配列中に
位置する塩基対を形成しないＧ残基の５’側および３’側の両方でデュープレッ
クス形成が生ずる（最も近い隣接ドメインの位置４，図８Ｂ；２１−ｎｔ基質"
Ｓ２１"の位置９，図９）。この二次構造の配置はまた，保存ヌクレオチドおよ
び予測ヘアピン構造をこの塩基対を形成しないＧ残基の近くに位置させる。
【０１６８】 ヘリックス構造の外側に位置する残基のホスホジエステル結合は，おそらくリ
ボザイム作用の標的であろう。安定なＲＮＡらせんはホスホジエステル結合のコ
ンフォメーションの自由度を制限するが，塩基対を形成しないヌクレオチドを連
結する結合は，内部トランスエステル化に必要な"インライン"幾何学をより容易
にとることができる（Ｓｏｕｋｕｐ，１９９９，ＲＮＡ，５，１３０８−１３２
５）。したがって，構造モデルは，Ｓ２１の切断が位置９に存在するＧ残基で生
ずるはずであることを示す（図９）。提唱される"Ｘ−モチーフ"モデルと一致し
て，最小化Ｘモチーフ変種（図９）の酵素ドメインに対応するＳ２１および４６
−ｎｔＲＮＡから構成される二分子構築物がＭｇ2+依存性切断活性を示すことが
観察された。さらに，ＲＮＡ切断は，Ｓ２１の塩基対を形成していないＧ（ヌク
レオチド９と１０の間）の３’側に位置するホスホジエステル結合において生ず
ることが決定された。
【０１６９】 本出願人はまた，クラスＩＩリボザイムにおいて同定された保存配列および構
造的要素を有する４４−ｎｔ構築物の切断活性を調べた。このＲＮＡはＳ２１と
二分子相互作用して，おそらくは位置６および７の基質ヌクレオチドＧおよびＡ
を塩基対形成しないままにする（表１１）。この構造モデルと一致して，反応混
合物にＭｇ2+が含まれるとき，複合体はＳ２１中のヌクレオチド６と７との間で
切断されることが見いだされた。同様にして，残りの１０個のクラスの８個につ
いて二分子構造を試験した。ほとんどの場合において，リボザイムの活性および
切断パターンは，図９に示される提唱される二次構造と一致する。
【０１７０】１２のリボザイムクラスを代表するプロトタイプ構築物の速度定数 図９に示される１２個の構築物のそれぞれについてＲＮＡトランスエステル化
の速度定数を決定した。例えば，クラスＩおよびクラスＩＩ構築物のいずれも，
基質ＲＮＡの半減期を超えて直線的切断速度論を生ずる（図１０Ａ）。本明細書
において調べた代表的なクラスＩおよびクラスＩＩ構築物は，それぞれ０．０１
および０．０５ｍｉｎ-1の速度定数を示す。残りのリボザイム構築物を同様に試
験したところ，ほぼ全ての場合においてＲＮＡ切断の速度定数は０．０５ｍｉｎ -1 未満であることが明らかとなった。これに対し，天然の自己切断ＲＮＡ，例え
ばハンマーヘッドおよびＨＤＶリボザイムの速度定数は，典型的には１ｍｉｎ-1 −１００ｍｉｎ-1の範囲である（Ｆｅｄｏｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１
９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１２０４２−１２０５４）。比較の
ため，用いた選択条件下における内部ＲＮＡトランスエステル化の触媒されてい
ない速度は約１０-7ｍｉｎ-1である（Ｌｉ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９９
，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，５３６４−５３７２）。したがって
，図９に示される最も遅い構築物でさえも，ＲＮＡ切断の化学的工程を少なくと
も１，０００倍加速する。最も活性なプロトタイプ構築物（クラスＶＩＩＩ，Ｋ obs ＝０．１ｍｉｎ-1）は，対応する触媒されていない速度の約１００万倍の全
体的な化学的速度の増強を与える。
【０１７１】 しかし，元の選択および２０個の独立した再選択は，非常に遅いリボザイムで
さえも集団中に残留するように行ったことに注意することが重要である。ランダ
ム配列からのリボザイムの単離には，４時間のリボザイムインキュベーション時
間を用いた。これらの選択条件下では，１０-3ｍｉｎ-1より高い速度定数で自己
切断するＲＮＡは，無限に速い切断速度で切断するリボザイムと比較して，選択
的な不利をほとんどまたは全く有しない。同様に，再選択の目標は，それぞれの
代表的ＲＮＡについて人工的系統発生を作成することができるように活性を保持
している変種リボザイムを作成することである。再選択の間のリボザイムインキ
ュベーションは，典型的には３０−６０分間実施した。したがって，この段階で
加えた選択圧もまた，天然に生ずるリボザイムに匹敵する速度を有するリボザイ
ムの単離を有利にするには十分ではなかった。
【０１７２】リボザイム切断部位 環化メカニズムによりＲＮＡの切断を触媒するリボザイムおよびデオキシリボ
ザイムは，典型的には，切断の部位に特定のコンセンサス配列を必要とする。ほ
とんどの場合，基質結合の特異性は，酵素と基質ドメインとの間のワトソン・ク
リック塩基対形成により決定され，この特異性は，ユーザにより容易に工学的に
改変することができる。しかし，ハンマーヘッドリボザイムは，ＵＨ部位（Ｈは
Ａ，ＵまたはＣである）のホスホジエステル結合の切断を好む（Ｖａｉｓｈ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９５，２１５８−２１６２）。本出
願人の選択スキームにより単離することができるリボザイムの多様性を最大化す
るためには，図８Ｂに示される最も近い隣接ドメインを含ませた。このドメイン
は，１６個すべてのジヌクレオチドの包括的サンプリングを提供し，このことに
より，不定配列組成物のほとんどの基質ドメイン中に存在するものより高い切断
部位の多様性を与える。本出願人は，この実験で調べた１２個のクラスのリボザ
イムが，最も近い隣接ドメイン中の５種類の異なる位置で切断することを見いだ
した（図１０Ｂ）。ＲＮＡ切断パターンから予測されるように，Ｇ６集団から単
離されたリボザイム（クラスＩ−ＩＶ）は２つの位置で切断し，これはいずれも
このドメインの５’末端の近くである。次のラウンドから単離されたリボザイム
について，切断パターンと切断部位選択との間に類似する対応が観察された。し
かし，最も長い５’−切断フラグメントを生成するＧ１２およびＧ１５からのリ
ボザイムは，最も近い隣接ドメインの３’末端に近い新たな切断部位の代表的な
ものではない。いくつかのリボザイムは，他のリボザイムによっても用いられる
部位でプロセシングされるにもかかわらず，元のＮ４０ドメイン中の挿入物を累
積し，より長い５’切断フラグメントを与えることが見いだされた。最も頻繁に
用いられる切断部位は，最も近い隣接ドメインの５’末端の最初のＧＡジヌクレ
オチドの間の結合である（図１０Ｂ）。しかし，このジヌクレオチド配列が自己
切断する構造の形成に本質的に望ましいか否かは明らかではない。
【０１７３】クラスＩ"Ｘモチーフ" 再選択から得られたほぼすべてのリボザイム構築物（図９）は，天然の自己切
断リボザイムについて得られる最大値よりはるかに低いＲＮＡ切断の速度定数を
示す。この知見から，新たなＲＮＡ切断モチーフが，現在天然に存在するモチー
フの触媒効率にまで達することができるか否かという疑問が生ずる。この時点ま
で，本出願人のインビトロ選択および再選択の努力は，自己切断リボザイムの新
たな構造的モチーフの同定および確認に向けられてきた。したがって，新規モチ
ーフの非常に欠陥のある変種であってもＲＮＡ集団中で濃縮されて最終的にクロ
ーニングおよび配列決定により同定することができるように，選択反応は意図的
にきわめて許容的な条件下で行った。同様に，再選択は，人工的系統発生の組立
に寄与する変種を同定するために，かつ必ずしも優れた触媒を生成する必要がな
いため，ほぼ同等の許容的条件下で行った。実際，実施した２０回の再選択のい
ずれも，ハンマーヘッドｉに由来する変異集団を用いて行ったものを含めて，天
然の自己切断リボザイムにより示されるものと同様の速度論的特性を示す変種リ
ボザイムを与えなかった。
【０１７４】 したがって，本出願人は，速度定数が一般集団より有意に高いリボザイム変種
を濃縮することにした。この目的のために，本出願人は，Ｇ６，Ｇ９，Ｇ１２お
よびＧ１５からのＲＮＡサンプルをプールした。次にこの合わせた出発集団につ
いて，図８Ａに示されるようにインビトロ選択の追加のラウンドを行った。ただ
し，選択反応についてインキュベーション時間を短くして（５秒程度の短さ），
最も速いリボザイムの単離を有利にした。１０ラウンドの追加の選択の後，得ら
れたＲＮＡ集団は，許容的反応条件下で５秒間のインキュベーションで約６％の
切断を行うことが見いだされた。驚くべきことに，最も近い隣接ドメイン中の多
数の部位で切断するリボザイムが選択的に増幅されたにもかかわらず，単一の５
’−切断フラグメントのみが観察された。これらの結果は，単一の種類の比較的
速いリボザイム（ｋobs＝約０．７ｍｉｎ-1）がＲＮＡ集団を支配するようにな
ったことを示す。実際，クローニングおよび配列決定は，集団が主として元のＸ
モチーフリボザイム（図９，クラスＩ）の変形物に対応する単一のＲＮＡ配列（
図１１Ｂ）からなることを明らかにした。
【０１７５】 支配的自己切断ＲＮＡ（図１１Ｂ）に基づく二分子構築物は，１回ターンオー
バー条件下で約０．２ｍｉｎ-1のｋobsを示し，これは図９に示される対応する
クラスＩ構築物の２０倍の改良に相当する。この知見は，試験した最初の構築物
が最適ではない変種を反映しているようであるため，リボザイムの残りのクラス
について触媒的性能をさらに改良しうることを示唆する。興味深いことに，最適
ハンマーヘッドリボザイムについて予測される最大速度定数（約１ｍｉｎ-1）は
，図１１Ｂに示される改良されたＸモチーフの二分子版について測定されるもの
よりもなお数倍高い。いずれにしても，これらの知見から，他の小ＲＮＡモチー
フが，触媒速度の増強において天然のリボザイムと比較して好ましいＲＮＡ切断
構造を形成することができると結論づけられる。
【０１７６】リボザイムの工学的改変 上述の手法および当該技術分野において知られる手法を用いて，本発明のリボ
ザイムの配列的，化学的および構造的変種を工学的に改変して，別の標的ＲＮＡ
またはＤＮＡをトランスで切断することができる。例えば，リボザイムのサイズ
は，当該技術分野において知られる手法を用いて，減少または増加させることが
できる（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，４２９；
Ｒｕｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９，１０６９
５；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９，６５
３４；ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８９，５７１０；Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，
上掲；Ｈｅｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＢＢＡ １２１９，４０５；Ｂ
ｅｎｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＪＡＣＳ，１１５，８４８３；Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２
４，４４０１；Ｍｉｃｈｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
３４，２９６５；Ｂｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１
，１１８４３；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．，１４，３６
８；Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３，９５６１；Ｃ
ｅｃｈ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，２，６０５；Ｓｕ
ｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９２，２１
５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．，４，１７１５；（全てその全体を本明細書の一部としてここに引用す
る）。例えば，リボザイムのステムループドメインは，酵素活性には必須ではな
いかもしれず，したがって，当該技術分野において知られる種々の方法を用いて
，リボザイムの全体的酵素活性が有意に低下しない程度に，系統的にそのサイズ
を減少させることができる。さらに，部位特異的突然変異および／または化学的
修飾により変種ステムループ構造を導入することにより，改良された触媒特性，
増加した安定性，またはその両方を有するリボザイムを開発することができる。
【０１７７】 当業者は，本明細書に記載されるインビトロ選択戦略のさらなるラウンドおよ
びその変形を用いて，追加の核酸触媒を容易に進化させることができ，そのよう
な新規触媒は本発明の範囲内である。さらに，当該技術分野において知られるよ
うに，ステム−ループ構造の改変によるこれらの変種リボザイム構築物の最適化
により，改良された切断活性を有する種が得られるであろう。
【０１７８】実施例２：オリゴヌクレオチド合成 合成ＤＮＡおよび２１ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ基質（Ｓ２１）は，標準的
固相法を用いて製造し（Ｋｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒ
ｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），変性（８Ｍ
尿素）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製した。合成ＲＮ
Ａの２’−ＴＢＤＭＳ基は，トリエチルアミン三フッ化水素酸（１５μｌ／ＡＵ 260 粗ＲＮＡ）で２４時間処理することにより除去した。Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（Ｔ４ＰＮＫ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および［γ
−32Ｐ］ＡＴＰを用いて製造元の指針にしたがって放射性標識した分子は，以下
に記載されるように，次に変性２０％ＰＡＧＥにより精製し，１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５，２３℃），２００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中で破砕浸漬することによりゲルから単離し，次
にエタノールで沈澱させた。
【０１７９】実施例３：インビトロ選択 インビトロ選択のためのＲＮＡの最初の集団は，まずインビトロ転写用の二本
鎖ＤＮＡテンプレートを生成することにより作成した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ
（登録商標）ＩＩリバーストランスクリプターゼ（ＲＴ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を
用いて，２７０ｐｍｏｌｅのテンプレートＤＮＡ（５’−ＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡ ＣＴＣＡＣＴＡＴＡ ＧＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＣＣＡＡ−３’）（配列番号１１９
），続いてランダム領域（Ｎ40），続いて（５’−ＴＡＣＧＧＴＣＧＣＴＧＴＣ
ＣＴＧ−３’）（配列番号１２０）を用いて，２８０ｐｍｏｌｅｓのＤＮＡオリ
ゴヌクレオチド"プライマー１"（５’−ＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＣＧＣＴＴＧＧＡ ＧＴＡＡＣＣＡＴＣ ＡＧＧＡＣ−ＡＧＣＧＡＣＣＧＴＡ−３’）（配列番号１１
８）；１６個の可能な最も近い隣接の組み合わせを示す領域に下線が施されてい
る）を伸長した（Ｔ７プロモーターには下線が施され，Ｎは４つの標準的ヌクレ
オチドの等量混合物を表す）。伸長反応は，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３，２３℃），７５ｍＭ ＫＣｌ，３ｍＭＭｇＣｌ2，１０ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ），各０．２ｍＭの４種類のデオキシリボヌクレオシド−５’
三リン酸（ｄＮＴＰｓ），および１０Ｕμｌ-1ＲＴを含む総容量５０μｌ中で，
３７℃で１時間インキュベーションすることにより行った。得られた二本鎖ＤＮ
Ａは，５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）および１４０μｌの１００％
エタノールを加えることにより沈澱させ，遠心分離によりペレット化した。この
伸長反応は，約１０14種類の異なるテンプレート配列を与えた。
【０１８０】 ＤＮＡテンプレートは，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５，２３℃）
，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，５０ｍＭ ＤＴＴ，２０ｍＭスペルミジン，各２ｍＭ
の４種類のリボヌクレオシド−５’三リン酸（ＮＴＰｓ），および３５Ｕμｌ-1 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を含む総容量１００μｌ中で，３７℃
で１時間インキュベーションすることにより転写させた。必要な場合には，［α
−32Ｐ］ＵＴＰを転写反応に加えて，内部32Ｐ標識ＲＮＡを生成した。５０μｌ
の４０ｍＭ ＥＤＴＡを加えることにより反応を停止させ，適当な量の酢酸ナト
リウムおよびエタノールを加えることにより沈澱させた。未切断前駆体ＲＮＡは
，変性１０％ＰＡＧＥにより単離し，上述したようにゲルから回収し，使用する
まで脱イオン水（ｄＨ2Ｏ）中で−２０℃で保存した。選択の次のラウンドにお
いては，ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）からの二本鎖ＤＮＡを上述のように転写
したが，ただし，転写の間に効率的に切断するリボザイムの喪失を最小にするた
めにより短い時間（例えば１０分間）で行った。
【０１８１】 最初の選択反応（Ｇ０）は，合計４００μｌの反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ［ｐＨ７．５，２３℃］，２５０ｍＭ ＫＣｌおよび２０ｍＭ ＭｇＣｌ2
）中に２０００ｐｍｏｌｅのＲＮＡを含み，これを２３℃で４時間インキュベー
トした。反応はＥＤＴＡを加えることにより終了させ，ＲＮＡはエタノールで沈
澱させることにより回収した。ＲＮＡ切断生成物は変性１０％ＰＡＧＥで分離し
，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ（登
録商標）を用いて可視化および定量した。所望のＲＮＡ切断生成物の位置に対応
するゲルの領域を切り出した。ＲＮＡは，切り出したゲルから破砕浸漬溶出する
ことにより回収し，エタノールで沈澱させた。選択されたＲＮＡを，先に記載さ
れているように（１０），プライマー１および２（５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ ＧＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＣＣＡＡ−３’）（配列番
号１２１）；Ｔ７プロモーターには下線が施されている）を用いてＲＴ−ＰＣＲ
により増幅した。インビトロ選択の各ラウンドから得られた二本鎖ＤＮＡを用い
て，次のラウンドのためにＲＮＡ集団を転写し，ここではすべての工程はＧ０の
スケールの約１／１０のスケールで行った。選択プロセスの他のすべてのパラメ
ータは，Ｇ０と同様に保った。選択の６，９，１２および１５ラウンドに由来す
る集団からの代表的リボザイムは，クローニング（ＴＯＰＯ（登録商標）−ＴＡ
クローニングキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および配列決定（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｋｉｔ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により
調べた。
【０１８２】実施例４：人工的系統発生 種々のクローンの自己切断活性を確認するために，内部32Ｐ標識リボザイム前
駆体を選択反応条件下で数時間までインキュベートして，変性１０％ＰＡＧＥに
より分離した後に切断産物を検出した。変異を導入した後に再選択を行うことに
より，それぞれが約２０の異なる配列のクラスの１つを表す活性なクローンの人
工的系統発生を生成した。再選択は，まずインビトロ転写用のテンプレート鎖に
対応する各個体についてＤＮＡ構築物を合成することにより行った。それぞれの
場合において，元の配列に対して６またはそれより少ない変異を有するすべての
可能な変種が存在するように，元のランダム配列ドメインに対応するヌクレオチ
ドを１つの位置につき０．２１の縮重度（ｄ）で合成した。典型的には，各集団
が元のクローンのレベルに対応するレベルの酵素活性を示すためには，上述した
３−５ラウンドの選択的増幅（１時間またはそれ以下の選択反応インキュベーシ
ョンを用いる）が必要であった。これが生じたとき，集団をクローニングし配列
決定した。
【０１８３】実施例５：リボザイムの触媒機能の特性決定 ほとんどの場合，異なる構造クラスのリボザイムのより詳細な速度論的および
構造的特性決定は，最も一般的には再選択の間に獲得した変異を含む対応する人
工的系統発生からの変種を用いて行った。自己切断の初期速度定数（クラスＶＩ
およびＶＩＩ）は，内部32Ｐ標識リボザイム前駆体を選択緩衝液中で種々の時間
インキュベートし，ＰＡＧＥにより生成物を分離し，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇ
ｅｒ（登録商標）で収量を定量することにより決定した。速度定数は先に記載さ
れるように求めた（Ｓｏｕｋｕｐ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９９，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，３５８４−３５８９）。二分
子リボザイム機能の速度定数は類似の戦略を用いて確立したが，ただし，反応は
基質の半減期の少なくとも２回分進行させた。１回ターンオーバー条件を達成す
るために，痕跡量の32Ｐ標識基質を５００ｎＭのリボザイムとともにインキュベ
ートした。
【０１８４】 一分子反応の切断部位は，５’−32Ｐ標識前駆体ＲＮＡを選択緩衝液中でイン
キュベートし，変性１０％ＰＡＧＥで生成物を分離し，５’切断フラグメントの
ゲル移動度を，先に記載されているように（Ｓｏｕｋｕｐ ａｎｄ Ｂｒｅａｋ
ｅｒ，１９９９，ＲＮＡ，５，１３０８−１３２５），ＲＮａｓｅＴ１またはア
ルカリを用いて部分的ＲＮＡ消化を行うことにより生成した各切断フラグメント
の移動度と比較することにより決定した。同様に，各二分子リボザイム反応の切
断部位は，痕跡量の５’−32Ｐ標識基質ＲＮＡを５００ｎＭのリボザイムととも
にインキュベートし，リボザイム切断，ＲＮａｓｅＴ１消化，およびアルカリ分
解の生成物を変性２０％ＰＡＧＥを用いて比較することにより確立した。
【０１８５】実施例６：リボザイムモチーフ（クラスＶ）の化学的安定化 この実験において有用な安定化クラスＶリボザイムおよび対照リボザイムの例
は表１０に示される。最初に，２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの種々の組み合わ
せを有するリボザイム（クラスＶ）を設計した。リボザイムは化学的に合成した
。切断反応は，５００ｎＭの最終リボザイム濃度，１回ターンオーバー速度論で
，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ Ｍ
ｇ2+中で，３７℃で痕跡量の基質を用いて実施した。結果は表５にまとめられて
いる。対照として用いた全リボ野生型Ｖリボザイム（ＲＰＩＮｏ．１４１８９）
の切断速度（Ｋobs）は０．０４４ｍｉｎ-1であった。２’−Ｏ−メチル構築物
の２つ（６および７置換２’−Ｏ−Ｍｅアームを有するＲＰＩＮｏ．１４８８０
，および５および７置換２’−Ｏ−Ｍｅアームを有するＲＰＩＮｏ．１４８８１
）は，いずれも改良された切断活性を有し，Ｋobs値は０．０６６ｍｉｎ-1であ
った。次に，ＲＰＩ構築物Ｎｏ１４８８０を，上述と同じ切断反応条件を用いる
２’−Ｏ−メチル"ウォーク"実験によりクラスＶリボザイムモチーフコアにおけ
る２’−Ｏ−メチル置換の影響を決定する実験の対照として用いた。この実験の
結果は図１３にまとめられており，ＫobsおよびＫrelの値は表６にまとめられて
いる。クラスＶリボザイムコアにおける２’−Ｏ−メチル置換の種々の組み合わ
せの影響を同じ条件下で調べた。表７はこの実験の結果の概要を示し，ここでは
，"７リボース"コアモチーフが０．１２７ｍｉｎ-1のＫobs値を有することが明
らかとなった。このクラスＶリボザイムの７リボースモチーフ（ＲＰＩＮｏ．１
５７０５）を，さらなるコア安定化実験のための基本モチーフとして用いた。別
の実験は，クラスＶモチーフのコアピリミジン残基の安定化に焦点を当てた。表
８は，修飾コアピリミジンを有し，ホスホロジチオエート，２’−フルオロ，２
’−アミノ，および２’−デオキシ置換を有するクラスＶモチーフリボザイムの
切断活性を決定する実験からのデータの概要を示す。この実験は，Ｃ７位（図１
３）が修飾に対して最も許容性であり，Ｕ４位は修飾に対して最も許容性が低か
ったことを示す。リボコア残基をさらに減少させると，クラスＶモチーフの"７
リボ"コア型と比較して減少した活性を有するリボザイムが得られたが，これら
のさらに安定化した型は活性を保持していた。追加の化学修飾と組み合わせたさ
らに減少させたリボ構築物の試験は表９にまとめられている。
【０１８６】実施例７：クラスＩリボザイムとクラスＶＩＩＩリボザイムとの類似性 ２つの戦略を用いて，クラスＩおよびクラスＶＩＩＩリボザイムが共通の配列
および構造的類似性を有するか否かを調べた。第１に，一連の１４種類の変種構
築物を生成し，クラスＶＩＩＩリボザイムの種々の構造的特徴の重要性を調べた
。例えば，クラスＶＩＩＩの５’−リーダー配列は，ステムＩＩ要素のすぐ前に
余分のバルジが存在する場合にのみ必須である。このバルジおよび予測ステムＩ
Ｉ要素を，クラスＩモチーフ構造（図１４）に存在するもののようなより納得し
うるステムＩＩ構造で置き換えれば，クラスＶＩＩＩのリーダー配列を除去する
ことができる。同様にして，クラスＶＩＩＩリボザイムの他の要素を調べると，
クラスＩリボザイムのものに対して類似性を示す。一連の速度論的分析を用いて
，クラスＩおよびクラスＶＩＩＩモチーフの特性を比較した。いずれの場合にお
いても，図１４に示される二分子構築物を比較に用いた。図１５ａに示されるよ
うに，これらの基質（痕跡量）のそれぞれをリボザイムで飽和させることができ
る。さらに，各モチーフは，一価の塩（図１５ｂ），ｐＨ（図１５ｃ），および
二価マグネシウム（図１５ｄ）の変動に対してほぼ同一の特性を有する。これら
の結果は，クラスＩおよびクラスＶＩＩＩモチーフがそのそれぞれのコアにおい
て類似するという見解を支持する。
【０１８７】診断用途 本発明の酵素的核酸を診断手段として使用して，疾病を有する細胞内の遺伝的
浮動および変異を検査するか，または細胞において標的ＲＮＡの存在を検出する
ことができる。酵素的核酸の活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により
，分子のいずれの領域においても，標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を
変更する変異を検出することができる。本発明に記載される酵素的核酸を複数使
用することにより，ＲＮＡの構造およびインビトロならびに細胞および組織にお
ける機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。酵素的核酸
による標的ＲＮＡの切断を使用して，遺伝子の発現を阻害し，疾病の進行におけ
る特定の遺伝子産物の役割を（本質的に）明らかにすることができる。このよう
にして，他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにすることができる
。これらの実験は，組み合わせ療法（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数の
酵素的核酸，既知の小分子阻害剤とカップリングさせた酵素的核酸，酵素的核酸
および／または他の化学的または生物学的分子を組み合わせた間欠的治療）の可
能性を提供することにより，疾病進行のよりよい治療につながるであろう。本発
明の酵素的核酸の他のインビトロにおける使用は当該技術分野においてよく知ら
れており，これには，疾病状態に関係するｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。そ
のようなＲＮＡは，酵素的核酸で処理した後，標準的な方法論を使用して切断産
物の存在を判定することにより検出する。
【０１８８】 特定の例においては，標的ＲＮＡの野生型または変異型のみしか切断できない
酵素的核酸をアッセイに使用する。第１の酵素的核酸を用いて試料中の野生型Ｒ
ＮＡの存在を同定し，第２の酵素的核酸を用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定す
る。反応対照として野生型および変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方の酵素
的核酸で切断し，反応における酵素的核酸の相対効率および“非標的"ＲＮＡ種
を切断しないことを明らかにする。合成基質からの切断産物は，試料集団中の野
生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。従っ
てそれぞれの分析は２つの酵素的核酸，２つの基質，および１つの未知の試料を
含み，これらを組み合わせて６つの反応を行う。切断産物の存在をＲＮａｓｅ保
護アッセイを使用して判定し，各ＲＮＡの完全長および切断フラグメントをポリ
アクリルアミドゲルの１レーンで分析できるようにする。標的細胞における変異
体ＲＮＡの発現および所望の表現型の変化の推定されるリスクへの洞察を得るた
めに，必ずしも結果を定量する必要はない。その蛋白質産物が表現型の発生に関
与することが示唆されるｍＲＮＡの発現はリスクを確立するのに十分である。同
等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば，ＲＮＡレベルの定性的比
較で十分であり，初期の診断のコストが低減する。ＲＮＡレベルを定性的に比較
するにしても定量的に比較するにしても，より高い変異型と野生型の比率はより
高いリスクと相関関係があるであろう。
【０１８９】追加の用途 本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的な有用性は，ＤＮＡ制限エンドヌ
クレアーゼがＤＮＡの研究のために有するものと同様の多くの用途をＲＮＡの研
究のために有する（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９７５ Ａｎｎ．Ｒｅｖ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：２７３）。例えば，制限フラグメントのパターンを使
用して２つの関連するＲＮＡ間の配列の関係を確立することができ，大型のＲＮ
Ａを研究のためにより有用なサイズのフラグメントに特異的に切断することがで
きる。酵素的核酸の配列特異性を工学的に操作できることは未知の配列のＲＮＡ
の切断に理想的である。
【０１９０】 本発明の核酸触媒を用いて，適切に工学的に改変された核酸触媒が指定フラン
キング領域（例えば，式Ｉ−ＩＶのＸおよびＹ）において塩基対形成するＲＮＡ
配列を特異的に切断することができる。適当な標的ＲＮＡ基質には，ウイルス，
メッセンジャーＲＮＡ，トランスファーＲＮＡ，リボソームＲＮＡ，核ＲＮＡ，
オルガネラＲＮＡ，他の細胞性ＲＮＡ，または切断配列を有する任意の他の天然
のＲＮＡ，ならびに適当な切断配列を含むよう工学的に改変されたＲＮＡが含ま
れる。核酸触媒は，原核生物または植物または動物に由来する真核生物において
，インビボでウイルス感染を管理するのに，または特定の遺伝子の発現を制御す
るのに有用であろう。
【０１９１】 いったん細胞中に導入されれば，核酸触媒は標的ＲＮＡ配列または核酸触媒に
対して設計された配列に結合して切断し，ＲＮＡを不活性化することができる。
ＲＮＡがウイルスの生活環に必要である場合には，ウイルスは排除されるであろ
う。ＲＮＡが特定の遺伝子の産物である場合には，その遺伝子の発現が制御され
るであろう。核酸触媒は，原核生物においておよび核（ポリ（Ａ）テールなしで
），植物および動物については真核生物細胞（ポリアデニル化シグナルを有する
）の細胞質で作用するよう設計することができる。
【０１９２】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用されるすべての参考文献
は，それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用さ
れることと同じ程度に本明細書の一部として引用される。
【０１９３】 当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならび
に本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するで
あろう。本明細書に記載される方法および組成物は，現在のところ好ましい態様
の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを
意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の
精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。
【０１９４】 当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示さ
れる本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。すなわち，そのような追加の態様は，本発明および特許請求
の範囲の範囲内である。
【０１９５】 本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として
用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては
，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図
するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が
可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により
本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更
および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義さ
れる本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０１９６】 さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループまたは他の代替グルー
プの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループま
たは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載され
ていることを認識するであろう。
【０１９７】 従って他の態様も本発明および特許請求の範囲の範囲内である。
【０１９８】
【表１】
【０１９９】
【表２】
【０２００】
【表３】
【０２０１】
【表４】
【０２０２】
【表５】
【０２０３】
【表６】
【０２０４】
【表７】
【０２０５】
【表８】
【０２０６】
【表９】
【０２０７】
【表１０】
【０２０８】
【表１１】
【０２０９】
【表１２】
【０２１０】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は，これに基づいてＤＮＡ酵素選択を行った構築物を示す。
【図２】 図２は，本発明のクラスＩＤＮＡ酵素のクローン２７の非限定的
二次構造モデルを示す。
【図３】 図３は，本発明のクラスＩＩＤＮＡ酵素のクローン３７の非限定
的二次構造モデルを示す。
【図４】 図４は，ランダム配列ＤＮＡ集団からの自己切断ＤＮＡ酵素の単
離の選択スキームを示す。
【図５】 図５は，本発明のクラスＩモチーフヌクレオザイムの基質配列要
求性を示す。
【図６】 図６は，本発明のクラスＩモチーフヌクレオザイムの速度論的パ
ラメータを示す
【図７】 図７は，本発明のクラスＩＶおよびクラスＶトランス切断ヌクレ
オザイムの二次構造を示す。
【図８】 図８は，ランダム配列ＲＮＡ集団から自己切断リボザイムを単離
する選択スキームを示す。
【図９】 図９は，本発明の種々のクラスの自己切断リボザイムの非限定的
二次構造モデルを示す。
【図１０】 図１０は，クラスＩおよびクラスＩＩリボザイムの切断反応プ
ロファイルおよび１２のクラスのリボザイムの切断部位のコンパイルを示す。
【図１１】 図１１は，２つのハンマーヘッドリボザイムの二次構造および
支配的なＸモチーフの比較を示す。
【図１２】 図１２は，Ｘモチーフリボザイムの切断部位の多様性を示す。
【図１３】 図１３は，クラスＶリボザイムモチーフの代表的な図解である
。
【図１４】 図１４は，本発明のクラスＩ酵素的核酸分子とクラスＶＩＩＩ
酵素的核酸分子との間の構造的類似性を示す。
【図１５】 図１５は，本発明のクラスＩおよびクラスＶＩＩＩ酵素的核酸
分子の速度論的特徴を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年８月２６日（２００２．８．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【化１】 ［式中，ＸおよびＹは，独立して，標的核酸分子と安定に相互作用するのに十分
な長さのオリゴヌクレオチドであり；およびＺは，独立して，５’−ＧＡＴＧＣ
ＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＴＴ−３’（配列番号９７）を含むヌクレオチド
配列である］ を有する，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【化２】 ［式中，ＸおよびＹは，独立して，標的核酸分子と安定に相互作用するのに十分
な長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｒは，独立して，５’−ＧＧＧＧＡ−３’
を含むヌクレオチド配列であり；Ｖは，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリン
カーを表し，これは存在しても存在しなくてもよく；およびＷは，独立して，５
’−ＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号９８），５’−ＴＧＧ
ＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＧＴ−３’（配列番号９９），および５’−ＴＧＧＧＧ
ＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号１００）からなる群より選択されるヌ
クレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである］ を有する，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【化３】 ［式中，Ｎは，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し；ＸおよびＹ
は，独立して，標的核酸分子と安定に相互作用するのに十分な長さのオリゴヌク
レオチドであり；およびＺは，５’−ＡＧＡＵＡＡＣＧＵＧＡＡＧＡＵ−３’（
配列番号１０８）および５’−ＡＡＵＧＧＣＣＵＡＵＣＧＧＵＧＣＧＡ−３’（
配列番号１０９）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌ
クレオチドである］ を有する，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】 上述の式ＩおよびＩＩにおいて，ＸおよびＹは，独立して，標的核酸分子と安
定に相互作用する（例えば，標的中の相補的ヌクレオチドと水素結合を形成する
ことにより）のに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり（標的は，ＲＮＡ，Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ混合ポリマーであることができ，例えば，塩基，糖，
および／またはリン酸ヌクレオチド修飾を含んでいてもよいポリマーであり；そ
のような修飾は，好ましくは天然に生ずる修飾である），好ましくは，Ｘおよび
Ｙの長さは，独立して，３−２０ヌクレオチドの長さ（特に，３，４，５，６，
７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１７，および２０）であり
；ＸおよびＹは，同じ長さであっても異なる長さであってもよく；＿は化学結合
（例えば，リン酸エステル結合，アミド結合または当該技術分野において知られ
る他の結合）を表し；Ｚは，独立して，５’−ＧＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧ
ＧＣＧＴＴＴ−３’（配列番号９７）を含むヌクレオチド配列であり，Ｒは，独
立して，５’−ＧＧＧＧＡ−３’を含むヌクレオチド配列であり，Ｖは，ヌクレ
オチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し，これは存在しても存在しなくても
よく，（例えば，分子は，２つの別々の分子から組み立てられる），存在する場
合には，一本鎖および／または二本鎖領域を含んでいてもよいヌクレオチドおよ
び／または非ヌクレオチドリンカーであり；Ｗは，独立して，５’−ＴＧＧＧＧ
ＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号９８），５’−ＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴ
ＣＴＧＧＧＴ−３’（配列番号９９），５’−ＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧ
Ｔ−３’（配列番号１０４），および５’−ＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴＧＧＴ
−３’（配列番号１００）を含む群から選択されるヌクレオチド配列であり；分
子の活性を有意に変更することなくこれらの配列への付加，欠失および置換が可
能であり，したがってこれらも本発明の範囲内であり；およびＣ，Ｇ，Ａ，およ
びＴは，それぞれシチジン，グアノシン，アデノシンおよびチミジンヌクレオチ
ドを表す。式ＩおよびＩＩの各々の中のヌクレオチドは，当該技術分野において
知られるように，糖，塩基，および／またはリン酸で修飾されていてもよく修飾
されていなくてもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】 好ましい態様においては，ヌクレオチドリンカー（Ｖ）は，５’−ＡＣＣＴＧ
ＡＧＧＧ−３’，５’−ＧＣＧＴＴＡＧ−３’および５’−ＡＧＧＡＡＧＣＡＴ
ＣＴＴＡＴＧＣＧＡＣＣ−３’（配列番号１０１）からなる群より選択される核
酸配列である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】 上述の式ＩＩＩおよびＩＶにおいて，各Ｎは，独立して，ヌクレオチドまたは
非ヌクレオチドリンカーを表し，これは同じであっても異なっていてもよく；Ｘ
およびＹは，独立して，標的核酸分子と安定に相互作用する（例えば，標的中の
相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することにより）のに十分な長さのオリゴ
ヌクレオチドであり（標的は，ＲＮＡ，ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ混合ポリマ
ーであることができ，例えば，塩基，糖，および／またはリン酸ヌクレオチド修
飾を含んでいてもよいポリマーであり；そのような修飾は，好ましくは天然に生
ずる修飾である），好ましくは，ＸおよびＹの長さは，独立して，３−２０ヌク
レオチドの長さであり，例えば，特に，３，４，５，６，７，８，９，１０，１
１，１２，１３，１４，１５，１７，および２０の長さであり；ＸおよびＹは，
同じ長さであっても異なる長さであってもよく；ｍ，ｎ，ｏ，およびｐは，独立
して，１以上の整数であり，好ましくは約１００より小さく，特に，２，３，４
，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，２５，３０，３５，５０であり；こ
こで，（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎおよび／または（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｐがヌクレ
オチドであるとき，（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎおよび／または（Ｎ）ｏおよび（Ｎ
）ｐは任意に水素結合相互作用により相互作用することができ；好ましくは，（
Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎおよび／または（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｐは，独立して，１
，２，３，４，５，６，７，８，９個の塩基対形成ステム構造を形成し；Ｄは，
Ｕ，ＧまたはＡであり；Ｌ1およびＬ2は，独立してリンカーであり，これは同じ
であっても異なっていてもよく，存在しても存在しなくてもよいが（すなわち，
分子は２つの別々の分子から組み立てられる），存在する場合には，一本鎖およ
び／または二本鎖領域を含んでいてもよいヌクレオチドおよび／または非ヌクレ
オチドリンカーであり；＿は，化学結合（例えば，リン酸エステル結合，アミド
結合または当該技術分野において知られる他の結合）を表し；・は塩基対形成相
互作用を表し；Ｚは，独立して，５’−ＡＧＡＵＡＡＣＧＵＧＡＡＧＡＵ−３’
（配列番号１０８）および５’−ＡＡＵＧＧＣＣＵＡＵＣＧＧＵＧＣＧＡ−３’
（配列番号１０９）を含む群より選択されるヌクレオチド配列であり，分子の活
性を有意に変更することなくこれらの配列への付加，欠失および置換が可能であ
り，したがってこれらも本発明の範囲内であり；およびＣ，Ｇ，Ａ，およびＵは
，それぞれシチジン，グアノシン，アデノシンおよびウリジンヌクレオチドを表
す。式ＩＩＩおよびＩＶのそれぞれのヌクレオチドは，当該技術分野において知
られるように，糖，塩基，および／またはリン酸において修飾されていてもされ
ていなくてもよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】 図１４は，本発明のクラスＩ酵素的核酸分子（配列番号１４３）（基質の配列
番号１２５）とクラスＶＩＩＩ酵素的核酸分子（配列番号１４４）（基質の配列
番号１２５）との間の構造的類似性の代表的な図解である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】実施例１：ランダムプールからの触媒的ＤＮＡのインビトロ選択 最初のランダム集団は，分子のプール，すなわち，ランダム領域［Ｎ５０］，
続いて（５’−ＴＴＡＴＴＡＣＧＧＴＡＡＣＧＴＴＧＧＣＡＣ−３’）（配列番
号１０３）（Ｎ５０は５０ヌクレオチドのランダム領域を示す）に接続したＲ１
９（５’−ＡＣＧＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣ−３’）（配列番号１０２）を，Ｔ
４ＤＮＡリガーゼおよびライゲーションのテンプレートとしてオリゴ１．３０（
５’−ＴＧＣＡＣＡＣＧＴＡＧＣＧＴＣＧＣＴ−３’）（配列番号１０５）を用
いて，合成ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ基質，２．２６（５’−ＧＧＣＡＣＡＣＣＡＣ
ＡＡＧＡＧＵＡＡＵＡＡＵＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＡＣＧＣＴ−３’）（配列番号 １０４ ）（下線はＲＮＡ領域を示す）にライゲーションすることにより作成した
。合成Ｒ１９分子のプールを最初にリン酸化し，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて［γ−32Ｐ］ＡＴＰで末端標識して，Ｔ４リガーゼに必要な５’リン酸
を得た。全長集団は，変性ＰＡＧＥによりライゲーションしていない成分から分
離した。ゲルから溶出した後，全長分子をエタノール沈澱させ，０．００１％Ｓ
ＤＳ（初期のラウンド）または直接１Ｘ選択緩衝液（後のラウンド）のいずれか
に再懸濁した。次に，集団を選択緩衝液中で３７℃で反応させ，変性ＰＡＧＥに
より好結果の触媒を未反応分子から分離した。すべての可能なＲＮＡ切断事象を
包含するためにゲルのゾーンを切り出した。溶出した触媒を，ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼおよびプライマー１．１（５’−ＧＴＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＣＣＧ３’
）（配列番号１０６）および２．２９（５’−ＡＣＧＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣ−
３’）（配列番号１０７）を用いるＰＣＲにより増幅して，好結果の触媒の多コ
ピーを作成した。次に，プライマーｌ．ｌｒ（５’−ＧＴＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡ
ＣＣＧ−３’，リボースで終了する）（配列番号１４６）および２．２９を用い
て反応の一部をＰＣＲで増幅して，負鎖中に埋め込まれたリボースを有する分子
を生成した。負鎖をアルカリおよび加熱によりこのリボースで切断した。次に，
変性ＰＡＧＥにより正鎖を負鎖フラグメントから分離した。最初の集団と同様に
，正鎖をリン酸化し，基質２．２６にライゲーションした。次に，次のラウンド
の選択のために，変性ＰＡＧＥにより新たなプールを取り込まれていない基質お
よびライゲーションテンプレートから精製した。図４は，上述した選択プロセス
の概略図である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】実施例３：インビトロ選択 インビトロ選択のためのＲＮＡの最初の集団は，まずインビトロ転写用の二本
鎖ＤＮＡテンプレートを生成することにより作成した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ
（登録商標）ＩＩリバーストランスクリプターゼ（ＲＴ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を
用いて，２７０ｐｍｏｌｅのテンプレートＤＮＡ（５’−ＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡ ＣＴＣＡＣＴＡＴＡ ＧＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＣＣＡＡ−３’）（配列番号１１１ ），続いてランダム領域（Ｎ40），続いて（５’−ＴＡＣＧＧＴＣＧＣＴＧＴＣ
ＣＴＧ−３’）（配列番号１１２）を用いて，２８０ｐｍｏｌｅｓのＤＮＡオリ
ゴヌクレオチド"プライマー１"（５’−ＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＣＧＣＴＴＧＧＡ ＧＴＡＡＣＣＡＴＣ ＡＧＧＡＣ−ＡＧＣＧＡＣＣＧＴＡ−３’）（配列番号１１ ０ ）；１６個の可能な最も近い隣接の組み合わせを示す領域に下線が施されてい
る）を伸長した（Ｔ７プロモーターには下線が施され，Ｎは４つの標準的ヌクレ
オチドの等量混合物を表す）。伸長反応は，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３，２３℃），７５ｍＭ ＫＣｌ，３ｍＭＭｇＣｌ2，１０ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ），各０．２ｍＭの４種類のデオキシリボヌクレオシド−５’
三リン酸（ｄＮＴＰｓ），および１０Ｕμｌ-1ＲＴを含む総容量５０μｌ中で，
３７℃で１時間インキュベーションすることにより行った。得られた二本鎖ＤＮ
Ａは，５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）および１４０μｌの１００％
エタノールを加えることにより沈澱させ，遠心分離によりペレット化した。この
伸長反応は，約１０14種類の異なるテンプレート配列を与えた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】 最初の選択反応（Ｇ０）は，合計４００μｌの反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ［ｐＨ７．５，２３℃］，２５０ｍＭ ＫＣｌおよび２０ｍＭ ＭｇＣｌ2
）中に２０００ｐｍｏｌｅのＲＮＡを含み，これを２３℃で４時間インキュベー
トした。反応はＥＤＴＡを加えることにより終了させ，ＲＮＡはエタノールで沈
澱させることにより回収した。ＲＮＡ切断生成物は変性１０％ＰＡＧＥで分離し
，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ（登
録商標）を用いて可視化および定量した。所望のＲＮＡ切断生成物の位置に対応
するゲルの領域を切り出した。ＲＮＡは，切り出したゲルから破砕浸漬溶出する
ことにより回収し，エタノールで沈澱させた。選択されたＲＮＡを，先に記載さ
れているように（１０），プライマー１および２（５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ ＧＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＣＣＡＡ−３’）（配列番
号１１３）；Ｔ７プロモーターには下線が施されている）を用いてＲＴ−ＰＣＲ
により増幅した。インビトロ選択の各ラウンドから得られた二本鎖ＤＮＡを用い
て，次のラウンドのためにＲＮＡ集団を転写し，ここではすべての工程はＧ０の
スケールの約１／１０のスケールで行った。選択プロセスの他のすべてのパラメ
ータは，Ｇ０と同様に保った。選択の６，９，１２および１５ラウンドに由来す
る集団からの代表的リボザイムは，クローニング（ＴＯＰＯ（登録商標）−ＴＡ
クローニングキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および配列決定（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｋｉｔ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により
調べた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
【表１】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
【表２】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
【表３】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
【表４】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
【表５】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
【手続補正２７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
【手続補正２８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８７ 1/21 9/00 ＺＮＡ 5/10 15/00 Ａ 9/00 ＺＮＡ 5/00 Ｂ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブレイカー，ロナルド アメリカ合衆国 06437 コネチカット州， ギルフォード，ウェザリー トレイル 133 (72)発明者 ベイジェルマン，レオニド アメリカ合衆国 80503 コロラド州，ロ ングモント，コルト ドライブ 5530 (72)発明者 エミルソン，ゲイル アメリカ合衆国 06492 コネチカット州， ウォーリングフォード，ハイランド ドラ イブ 18 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA01 CA05 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 HA19 4B050 CC01 CC03 CC04 DD20 EE10 LL01 4B065 AA01X AA57X AA87X AB01 CA23 CA31 CA44 4C084 AA02 AA03 AA13 BA35 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA31 MA35 MA36 MA37 MA52 MA56 MA58 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA06 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA31 MA35 MA36 MA37 MA52 MA58 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA35 MA36 MA37 MA52 MA58 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14

Claims (96)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式Ｉ： 【化１】 ［式中，ＸおよびＹは，独立して，標的核酸分子と安定に相互作用するのに十分
    な長さのオリゴヌクレオチドであり；およびＺは，独立して，５’−ＧＡＴＧＣ
    ＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＴＴ−３’（配列番号５１）を含むヌクレオチド
    配列である］ を有する，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子。
  2. 【請求項２】 式ＩＩ： 【化２】 ［式中，ＸおよびＹは，独立して，標的核酸分子と安定に相互作用するのに十分
    な長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｒは，独立して，５’−ＧＧＧＧＡ−３’
    を含むヌクレオチド配列であり；Ｖは，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリン
    カーを表し，これは存在しても存在しなくてもよく；およびＷは，独立して，５
    ’−ＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号５２），５’−ＴＧＧ
    ＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＧＴ−３’（配列番号５３），５’−ＴＧＧＧＧＡＡＧ
    ＣＡＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号５４），および５’−ＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡ
    ＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号５５）からなる群より選択されるヌクレオチド配
    列を含むオリゴヌクレオチドである］ を有する，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子。
  3. 【請求項３】 Ｖがヌクレオチドリンカーである，請求項２記載の核酸分子
    。
  4. 【請求項４】 Ｖが非ヌクレオチドリンカーである，請求項２記載の核酸分
    子。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチドリンカーが，５’−ＡＣＣＴＧＡＧＧＧ−
    ３’，５’−ＧＣＧＴＴＡＧ−３’および５’−ＡＧＧＡＡＧＣＡＴＣＴＴＡＴ
    ＧＣＧＡＣＣ−３’（配列番号５６）からなる群より選択される配列である，請
    求項３記載の核酸分子。
  6. 【請求項６】 前記ヌクレオチドリンカーが核酸アプタマーである，請求項
    ３記載の核酸分子。
  7. 【請求項７】 前記アプタマーがＡＴＰアプタマーである，請求項６記載の
    核酸分子。
  8. 【請求項８】 前記化学結合が，独立して，または組み合わせて，リン酸エ
    ステル，アミド，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，メチルホスホネ
    ート，アラビノ，およびアラビノフルオロ結合からなる群より選択される，請求
    項１または２記載の核酸分子。
  9. 【請求項９】 前記核酸分子が化学的に合成されたものである，請求項１ま
    たは２記載の核酸分子。
  10. 【請求項１０】 前記核酸分子が少なくとも１つの糖修飾を含む，請求項１
    または２記載の核酸分子。
  11. 【請求項１１】 前記核酸分子が少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，請
    求項１または２記載の核酸分子。
  12. 【請求項１２】 前記核酸分子が少なくとも１つのリン酸骨格修飾を含む，
    請求項１または２記載の核酸分子。
  13. 【請求項１３】 前記糖修飾が２’−修飾である，請求項１０記載の核酸分
    子。
  14. 【請求項１４】 前記糖修飾が，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，２
    ’−Ｃ−アリル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−デオキシ−２’−ア
    ラビノフルオロ，２’−デオキシ−２’−アミノ，および２’−Ｏ−アミノ修飾
    からなる群より選択される，請求項１３記載の核酸分子。
  15. 【請求項１５】 前記リン酸骨格修飾が，ホスホロチオエート，ホスホロジ
    チオエート，メチルホスホネート，およびアミド修飾からなる群より選択される
    ，請求項１２記載の核酸分子。
  16. 【請求項１６】 前記核酸分子が，５’−キャップ，３’−キャップ，また
    は５’−キャップおよび３’−キャップの両方を含む，請求項１または２記載の
    核酸分子。
  17. 【請求項１７】 前記５’−キャップが，前記核酸分子中の少なくとも１つ
    の５’末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項１６記載の核
    酸分子。
  18. 【請求項１８】 前記５’−キャップが，前記核酸分子中の少なくとも２つ
    の５’末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項１６記載の核
    酸分子。
  19. 【請求項１９】 前記５’−キャップが，前記核酸分子中の少なくとも３つ
    の５’末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項１６記載の核
    酸分子。
  20. 【請求項２０】 前記５’−キャップが，前記核酸分子中の少なくとも４つ
    の５’末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項１６記載の核
    酸分子。
  21. 【請求項２１】 前記３’−キャップが３’−３’反転リボ無塩基成分であ
    る，請求項１６記載の核酸分子。
  22. 【請求項２２】 前記３’−キャップが３’−３’反転デオキシリボ無塩基
    成分である，請求項１６記載の核酸分子。
  23. 【請求項２３】 前記核酸が別個の核酸分子を切断する，請求項１および２
    のいずれかに記載の核酸分子。
  24. 【請求項２４】 前記別個の核酸分子がＲＮＡである，請求項２３記載の核
    酸分子。
  25. 【請求項２５】 前記核酸が，前記別個の核酸分子に相補的な１２−１００
    塩基を含む，請求項２３記載の核酸分子。
  26. 【請求項２６】 前記核酸が，前記別個の核酸分子に相補的な１４−２４塩
    基を含む，請求項２３記載の核酸分子。
  27. 【請求項２７】 前記ＸおよびＹが，独立して，３，４，５，６，７，８，
    ９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１７，および２０ヌクレオチドから
    なる群より選択される長さである，請求項１または２記載の核酸分子。
  28. 【請求項２８】 前記Ｘの長さが前記Ｙの長さと等しい，請求項１または２
    記載の核酸分子。
  29. 【請求項２９】 前記Ｘの長さが前記Ｙの長さと等しくない，請求項１また
    は２記載の核酸分子。
  30. 【請求項３０】 請求項１または２記載の核酸分子を含む細胞。
  31. 【請求項３１】 前記細胞が原核生物細胞である，請求項３０記載の細胞。
  32. 【請求項３２】 前記細胞が真核生物細胞である，請求項３０記載の細胞。
  33. 【請求項３３】 前記細胞が哺乳動物細胞である，請求項３０記載の細胞。
  34. 【請求項３４】 前記細胞がヒト細胞である，請求項３３記載の細胞。
  35. 【請求項３５】 前記細胞が植物細胞である，請求項３０記載の細胞。
  36. 【請求項３６】 請求項１または２記載の核酸分子の少なくとも１つをコー
    ドする核酸配列を，核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクター。
  37. 【請求項３７】 請求項３６記載の発現ベクターを含む細胞。
  38. 【請求項３８】 前記細胞が哺乳動物細胞である，請求項３７記載の細胞。
  39. 【請求項３９】 前記細胞がヒト細胞である，請求項３８記載の細胞。
  40. 【請求項４０】 請求項１または２記載の核酸分子を含む医薬組成物。
  41. 【請求項４１】 細胞に請求項１または２記載の核酸分子を投与することに
    より，植物細胞において遺伝子の発現を調節する方法。
  42. 【請求項４２】 細胞に請求項１または２記載の核酸分子を投与することに
    より，哺乳動物細胞において遺伝子の発現を調節する方法。
  43. 【請求項４３】 細胞に請求項１または２記載の核酸分子を投与することに
    より，細菌細胞において遺伝子の発現を調節する方法。
  44. 【請求項４４】 細胞に請求項１または２記載の核酸分子を投与することに
    より，真菌細胞において遺伝子の発現を調節する方法。
  45. 【請求項４５】 別個の核酸を切断する方法であって，請求項１または２記
    載の核酸分子を前記別個の核酸分子の切断に適当な条件下で前記別個の核酸分子
    と接触させることを含む方法。
  46. 【請求項４６】 前記切断が二価カチオンの存在下で行われる，請求項４５
    記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記二価カチオンがＭｇ2+である，請求項４６記載の方法
    。
  48. 【請求項４８】 式ＩＩＩ： 【化３】 ［式中， 各Ｎは，独立して，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し，これは
    同じであっても異なっていてもよく；ＸおよびＹは，独立して，標的核酸分子と
    安定に相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｍ，ｎ，ｏ，
    およびｐは，独立して，１以上の整数であり，ここで，（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎ
    および／または（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｐがヌクレオチドであるとき，（Ｎ）ｍお
    よび（Ｎ）ｎおよび／または（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｐは，任意に，水素結合相互
    作用により相互作用することができ；ＤはＵ，ＧまたはＡであり；およびＬ１お
    よびＬ２は，独立してリンカーであり，これは同じであっても異なっていてもよ
    く，存在していても存在していなくてもよいが，存在する場合にはヌクレオチド
    および／または非ヌクレオチドリンカーであり，これは一本鎖および／または二
    本鎖領域であってもよい］ を有する，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子。
  49. 【請求項４９】 式ＩＶ： 【化４】 ［式中，Ｎは，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し；ＸおよびＹ
    は，独立して，標的核酸分子と安定に相互作用するのに十分な長さのオリゴヌク
    レオチドであり；およびＺは，５’−ＡＧＡＵＡＡＣＧＵＧＡＡＧＡＵ−３’（
    配列番号５３）および５’−ＡＡＵＧＧＣＣＵＡＵＣＧＧＵＧＣＧＡ−３’（配
    列番号５４）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレ
    オチドである］ を有する，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子。
  50. 【請求項５０】 前記（Ｎ）ｍが５’−ＡＣ−３’，５’−ＧＣ−３’，お
    よび５’−ＣＧ−３’からなる群より選択され，および（Ｎ）ｎが５’−ＧＵ−
    ３’，５’−ＧＣ−３’，および５’−ＣＧ−３’からなる群より選択される，
    請求項４８記載の核酸分子。
  51. 【請求項５１】 前記（Ｎ）ｏが５’−ＡＵＵＧ−３’，５’−ＵＵＧ−３
    ’，５’−ＵＵＣ−３’，および５’−ＵＡＧ−３’からなる群より選択され，
    および（Ｎ）ｐが５’−ＣＡＡＵ−３’，５’−ＣＡＡ−３’，５’−ＧＡＡ−
    ３’，および５’−ＣＵＡ−３’からなる群より選択される，請求項４８記載の
    核酸分子。
  52. 【請求項５２】 Ｌ１がヌクレオチドリンカーである，請求項４８記載の核
    酸分子。
  53. 【請求項５３】 Ｌ２がヌクレオチドリンカーである，請求項４８記載の核
    酸分子。
  54. 【請求項５４】 前記ヌクレオチドリンカーが，５’−ＣＵＵＡＡ−３’ま
    たは５’−ＣＵＡＡＡ−３’からなる配列である，請求項５２記載の核酸分子。
  55. 【請求項５５】 前記ヌクレオチドリンカーが，５’−ＵＧＵＧＡＡ−３’
    または５’−ＧＵＧＡ−３’からなる配列である，請求項５３記載の核酸分子。
  56. 【請求項５６】 前記ヌクレオチドリンカーが核酸アプタマーである，請求
    項５２または５３記載の核酸分子。
  57. 【請求項５７】 前記アプタマーがＡＴＰアプタマーである，請求項５６記
    載の核酸分子。
  58. 【請求項５８】 Ｌ１，Ｌ２またはＬ1およびＬ2が非ヌクレオチドリンカー
    である，請求項４８記載の核酸分子。
  59. 【請求項５９】 前記化学結合が，独立して，または組み合わせて，リン酸
    エステル結合，アミド結合，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，アラ
    ビノ，およびアラビノフルオロ結合からなる群より選択される，請求項４８また
    は４９記載の核酸分子。
  60. 【請求項６０】 前記核酸分子が化学的に合成されたものである，請求項４
    ８または４９記載の核酸分子。
  61. 【請求項６１】 前記核酸分子が少なくとも１つの糖修飾を含む，請求項４
    ８または４９記載の核酸分子。
  62. 【請求項６２】 前記核酸分子が少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，請
    求項４８または４９記載の核酸分子。
  63. 【請求項６３】 前記核酸分子が少なくとも１つのリン酸骨格修飾を含む，
    請求項４８または４９記載の核酸分子。
  64. 【請求項６４】 前記糖修飾が，２’−Ｈ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−
    アリル，２’−Ｃ−アリル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，および２’−デ
    オキシ−２’−アミノ修飾からなる群より選択される，請求項６１記載の核酸分
    子。
  65. 【請求項６５】 前記リン酸骨格修飾が，ホスホロチオエート，ホスホロジ
    チオエート，およびアミド修飾からなる群より選択される，請求項６３記載の核
    酸分子。
  66. 【請求項６６】 前記核酸分子が，５’−キャップ，３’−キャップ，また
    は５’−キャップおよび３’−キャップの両方を含む。請求項４８または４９記
    載の核酸分子。
  67. 【請求項６７】 前記５’−キャップが，前記核酸分子中の少なくとも１つ
    の５’末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項６６記載の核
    酸分子。
  68. 【請求項６８】 前記５’−キャップが，前記核酸分子中の少なくとも２つ
    の５’末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項６６記載の核
    酸分子。
  69. 【請求項６９】 前記５’−キャップが，前記核酸分子中の少なくとも３つ
    の５’末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項６６記載の核
    酸分子。
  70. 【請求項７０】 前記５’−キャップが，前記核酸分子中の少なくとも４つ
    の５’末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項６６記載の核
    酸分子。
  71. 【請求項７１】 前記３’−キャップが３’−３’反転リボ無塩基成分であ
    る，請求項６６記載の核酸分子。
  72. 【請求項７２】 前記３’−キャップが３’−３’反転デオキシリボ無塩基
    成分である，請求項６６記載の核酸分子。
  73. 【請求項７３】 前記核酸が別個の核酸分子を切断する，請求項４８および
    ４９のいずれかに記載の核酸分子。
  74. 【請求項７４】 前記別個の核酸分子がＲＮＡである，請求項７３記載の核
    酸分子。
  75. 【請求項７５】 前記核酸が，前記別個の核酸分子に相補的な１２−１００
    塩基を含む，請求項７３記載の核酸分子。
  76. 【請求項７６】 前記核酸が，前記別個の核酸分子に相補的な１４−２４塩
    基を含む，請求項７３記載の核酸分子。
  77. 【請求項７７】 前記ＸおよびＹが，独立して，３，４，５，６，７，８，
    ９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１７，および２０ヌクレオチドから
    なる群より選択される長さである，請求項４８または４９記載の核酸分子。
  78. 【請求項７８】 Ｘの長さがＹの長さと等しい，請求項４８または４９記載
    の核酸分子。
  79. 【請求項７９】 Ｘの長さがＹの長さと等しくない，請求項４８または４９
    記載の核酸分子。
  80. 【請求項８０】 請求項４８または４９記載の核酸分子を含む細胞。
  81. 【請求項８１】 前記細胞が哺乳動物細胞である，請求項８０記載の細胞。
  82. 【請求項８２】 前記細胞がヒト細胞である，請求項８１記載の細胞。
  83. 【請求項８３】 請求項４８または４９記載の核酸分子の少なくとも１つを
    コードする核酸配列を，核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクター。
  84. 【請求項８４】 請求項８３記載の発現ベクターを含む細胞。
  85. 【請求項８５】 前記細胞が哺乳動物細胞である，請求項８４記載の細胞。
  86. 【請求項８６】 前記細胞がヒト細胞である，請求項８５記載の細胞。
  87. 【請求項８７】 請求項４８または４９記載の核酸分子を含む医薬組成物。
  88. 【請求項８８】 細胞に請求項４８または４９記載の核酸分子を投与するこ
    とにより，植物細胞において遺伝子の発現を調節する方法。
  89. 【請求項８９】 細胞に請求項４８または４９記載の核酸分子を投与するこ
    とにより，哺乳動物細胞において遺伝子の発現を調節する方法。
  90. 【請求項９０】 標的核酸を切断する方法であって，請求項４８または４９
    記載の核酸分子を，前記標的核酸分子の切断に適当な条件下で前記標的核酸分子
    と接触させることを含む方法。
  91. 【請求項９１】 前記切断が二価カチオンの存在下で行われる，請求項９０
    記載の方法。
  92. 【請求項９２】 前記二価カチオンがＭｇ2+である，請求項９１記載の方法
    。
  93. 【請求項９３】 前記ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；
    ｃ）請求項４８または４９記載の少なくとも１つの核酸分子をコードする核酸配
    列；を含み，前記配列は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする
    様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている，
    請求項８３記載の発現ベクター。
  94. 【請求項９４】 前記ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；
    ｃ）オープンリーディングフレーム；ｄ）請求項４８または４９記載の少なくと
    も１つの核酸分子をコードする核酸配列を含み，前記配列は前記オープンリーデ
    ィングフレームの３’末端に動作可能なように連結されており；および前記配列
    は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域
    ，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連
    結されている，請求項８３記載の発現ベクター。
  95. 【請求項９５】 前記ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；
    ｃ）イントロン；ｄ）請求項４８または４９記載の少なくとも１つの核酸分子を
    コードする核酸配列を含み，前記配列は，前記核酸分子の発現および／または輸
    送を可能とする様式で，前記開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動
    作可能なように連結されている，請求項８３記載の発現ベクター。
  96. 【請求項９６】 前記ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；
    ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；ｅ）請求項４８または４
    ９記載の少なくとも１つの核酸分子をコードする核酸配列を含み，前記配列は，
    前記オープンリーディングフレームの３’末端に動作可能なように連結されてお
    り；および前記配列は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様
    式で，前記開始領域，前記イントロン，前記オープンリーディングフレームおよ
    び前記終止領域に動作可能なように連結されている，請求項８３記載の発現ベク
    ター。
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