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JP2003521876A - 癌関連タンパク質 - Google Patents

癌関連タンパク質

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Publication number
JP2003521876A
JP2003521876A JP2000594916A JP2000594916A JP2003521876A JP 2003521876 A JP2003521876 A JP 2003521876A JP 2000594916 A JP2000594916 A JP 2000594916A JP 2000594916 A JP2000594916 A JP 2000594916A JP 2003521876 A JP2003521876 A JP 2003521876A
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JP
Japan
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cap
polynucleotide
sequence
seq
polypeptide
Prior art date
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Pending
Application number
JP2000594916A
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English (en)
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ヒルマン、ジェニファー・エル
ユエ、ヘンリー
タング、ワイ・トム
アジムザイ、ヤルダ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Incyte Corp
Original Assignee
Incyte Pharmaceuticals Inc
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Publication date
Application filed by Incyte Pharmaceuticals Inc filed Critical Incyte Pharmaceuticals Inc
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、癌関連タンパク質（CAP）と、CAPを同定及びコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、CAPの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、癌関連タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列、並びにこれらの配
列を用いた細胞増殖異常症及び自己免疫異常／炎症性疾患の診断及び治療、予防
に関する。
【０００２】 （発明の背景） 新形成とも呼ばれる癌の特徴は連続的な細胞増殖である。癌は、癌腫及び肉腫
、白血病の３つに分類することができる。癌腫は、周囲の組織に浸潤して転移を
起こし得る新しく増殖した軟質性の悪性上皮細胞である。肉腫には、上皮細胞を
起源とするもの、或いは結合組織から生じるものとがある。白血病は血液形成組
織の進行性悪性腫瘍であって、白血球及びその前駆体を発生する。また、白血病
は、骨髄性白血病（骨髄）とリンパ性白血病とに分類できる。腫瘍細胞は、起源
組織の正常細胞に極めて類似した悪性細胞から、退形成（未分化）によって正常
組織からかけ離れた細胞までと様々である。腫瘍細胞は、殆ど核を有しない或い
は１つの大きな多形核を有し得る。退生細胞は、血管化しにくい構築異常集団に
成長することがあり、その場合乏血性壊死領域を含み得る。分化した腫瘍細胞は
、起源組織と同じタンパク質を分泌し得る。体腔若しくは表面腔の直接接種を介
して、或いはリンパ拡散や血行拡散によって、癌が成長し、周囲の組織に浸潤及
び転移し、組織を破壊する。
【０００３】 癌は、正常細胞を悪性細胞に変え得るオンコプロテインに関連する。ある種の
オンコプロテインは、正常なタンパク質の変異アイソフォームであり、一方別の
オンコプロテインは、発現レベルや部位に対して異常に発現する。正常な細胞増
殖は、成長因子が細胞膜のその受容体に結合することによって開始され、核調節
因子を誘発し活性化するシグナル伝達系が活性化され、DNAの転写が開始され、
細胞分化につながる。細胞周期の制御に影響を及ぼすとして知られるオンコプロ
テインのクラスには、成長因子及び成長因子受容体、細胞内シグナル伝達物質、
核転写因子、細胞周期制御タンパク質が含まれる。一般に、オンコプロテインは
正常な調節要素が不足し、成長因子及び細胞接着などの他のシグナルに無関係に
発現される。
【０００４】 オンコプロテインは、オンコジーンと呼ばれる遺伝子によってコードされる。
オンコジーンは、細胞の成長及び発達を正常に制御する遺伝子に由来する。ウイ
ルスオンコジーンは、ある種のウイルスによってヒトの細胞に感染した後、ヒト
ゲノムの中に組み込まれる。ウイルスオンコジーンの中には、v-src及びv-abl、
v-fpsが含まれる。正常な遺伝子からオンコジーンへの転換は、染色体の転座に
よっても起こり得る。慢性骨髄性白血病及び急性リンパ芽球性白血病のサブセッ
トの特徴であるPhiladelphia染色体は、プロトオンコジーンc-ablの切断部分を
染色体２２の限界点クラスター領域（bcr:breakpoint cluster region）に転座
させる染色体９と染色体２２の相互転座から生じる。ハイブリッドc-abl-bcr遺
伝子は、チロシンキナーゼ活性を有するキメラタンパク質をコードする。慢性骨
髄白血病では、キメラタンパク質の分子量は210 kDaであり、急性白血病では、
より活性な180 kDaのチロシンキナーゼが形成される（Robbins, S.L. 他 (1994)
Pathologic Basis of Disease, W.B. Saunders Co., Philadelphia PA）。
【０００５】 癌に対する免疫的な防御には、癌抑制遺伝子による突然変異細胞のアポトーシ
スへの誘導、Tリンパ球による腫瘍抗原の認識が含まれる。腫瘍抗原には、種々
の腫瘍及び精巣で発現するGAGE遺伝子によってコードされるものが含まれる。GA
GE-7は、精巣及び胎盤の組織に特異的に発現し、前立腺癌の初期アンドロゲン感
受性ステージから後期アンドロゲン不感性ステージへの進行に関与する（Chen,
M.E. 他. (1998) J. Biol. Chem. 273:17618-17625）。
【０００６】 癌の中には、正常なアポトーシス細胞死を抑制するものがある。別の染色体転
座の例には、E2A遺伝子のトランス活性化ドメインが、HLFのbZIP DNA結合及びタ
ンパク質二量体化領域と結合する、プロB細胞急性白血病に関連するE2AとHLFと
の融合がある。HLFは、通常は肝臓及び腎臓、CNSニューロン細胞に発現するロイ
シンジッパー型転写因子である。キメラタンパク質は、プロB細胞のアポトーシ
スに関与する遺伝子の転写レベルを変化させると考えられる。プロB細胞は欠陥
細胞が多く、通常は自己破壊的に生存し増殖する。SRPUL（白血病で増大するsus
hi反復タンパク質）は、E2A-HLF遺伝子タンパク質の標的の１つである。SRPULは
、細胞接着において機能すると思われるコンセンサス反復モチーフを含む（Kuro
sawa, H. 他 (1999) Blood 93:321-332）。
【０００７】 新規の癌関連タンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチドの発見によ
り、細胞増殖異常症及び自己免疫異常／炎症性疾患の診断及び治療、予防に有用
な新規の組成物を提供することで当分野のニーズに答えることができる。
【０００８】 （発明の要約） 本発明は、総称して「CAP」、個別にはそれぞれ「CAP-1」及び「CAP-2」、「C
AP-3」と呼ぶ癌関連タンパク質である実質的に精製されたポリペプチドを提供す
る。本発明の一実施態様では、a）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択された
アミノ酸配列、b）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列と
９０％以上の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−3
からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）S
EQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含む
単離したポリペプチドを提供する。別法では、SEQ ID NO:1−3のアミノ酸配列を
含む単離したポリペプチドを提供する。
【０００９】 更に本発明は、a）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列
、b）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の
配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−3からなる一群
から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1−
3からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片むポリペプチドをコ
ードする単離したポリヌクレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオチ
ドは、SEQ ID NO:4−6からなる一群から選択される。
【００１０】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−3からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含む
組換えポリヌクレオチドを提供する。別法では、本発明は、この組換えポリヌク
レオチドで形質転換された細胞を提供する。更なる別法では、本発明は、この組
換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生物を提供する。
【００１１】 また、本発明は、a）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−3からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドの製造方法を提供する。この方法は、a）このポリペプチドの発現に好適な条
件の下で、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合され
たプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養
するステップと、b）このように発現したポリペプチドを回収するステップとを
含む。
【００１２】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−3からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００１３】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:4−6からなる一群から選択されたポリヌクレ
オチド配列、b）SEQ ID NO:4−6からなる一群から選択されたポリヌクレオチド
酸配列と７０％以上の配列同一性を有する自然発生のポリヌクレオチド配列、c
）前記a）に相補的なポリヌクレオチド配列、またはd）前記b）に相補的なポリ
ヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、こ
のポリヌクレオチドは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドである。
【００１４】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:4−6からなる一群から選択されたポリヌクレ
オチド配列、b）SEQ ID NO:4−6からなる一群から選択されたポリヌクレオチド
と７０％以上の配列同一性を有する自然発生のポリヌクレオチド配列、c）前記a
）に相補的なポリヌクレオチド配列、またはd）前記b）に相補的なポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチド配列を有するサンプルの中の標的ポリヌクレオ
チドを検出する方法を提供する。この方法は、a）前記サンプル内の標的ポリヌ
クレオチドと相補的な配列を含む少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含
むプローブと前記サンプルをハイブリダイズさせるステップであって、前記プロ
ーブと前記標的ポリヌクレオチドとでハイブリダイゼーション複合体が形成され
る条件の下、前記プローブが特異的に前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズする、該ステップと、b）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在の有無を
検出し、存在する場合には随意選択でその量を測定するステップとを含む。別法
では、前記プローブは、少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含む。更な
る別法では、前記プローブは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む
。
【００１５】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−3からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含む効果的な量
のポリペプチド及び好適な医薬用賦形剤を含む医薬品組成物を提供する。更に、
本発明は、患者にこの医薬品組成物を投与することを含む、機能的CAPの発現の
低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００１６】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−3からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドのアゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。こ
の方法は、a）前記ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと
、b）前記サンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、
本発明は、前記方法によって同定されたアゴニスト化合物及び好適な医薬用賦形
剤を含む医薬品組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この医薬品組成
物の患者への投与を含む、機能的CAPの発現の低下に関連した疾患やその症状の
治療方法を提供する。
【００１７】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−3からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片含むポリペプチド
のアンタゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
この方法は、a）前記ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップ
と、b）前記サンプルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法
では、本発明は、前記方法によって同定されたアンタゴニスト化合物及び好適な
医薬用賦形剤を含む医薬品組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この
医薬品組成物の患者への投与を含む、機能的CAPの過剰な発現に関連した疾患や
その症状の治療方法を提供する。
【００１８】 更に本発明は、SEQ ID NO:4−6からなる一群から選択された配列を含む標的ポ
リヌクレオチドの発現を変える効果的な化合物をスクリーニングする方法であっ
て、a）前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップ
と、b）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含む、
該スクリーニング方法を提供する。
【００１９】 （本発明の記載について） 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。
【００２０】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００２１】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。
【００２２】 （定義） 用語「CAP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ
、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に
精製されたCAPのアミノ酸配列を指す。
【００２３】 用語「アゴニスト」は、CAPの生物学的活性を強化したり、模倣する分子を指
す。このアゴニストは、CAPに直接相互作用するか、或いはCAPが関与する生物学
的経路の成分と作用して、CAPの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分
子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００２４】 用語「アレル変異配列」は、CAPをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル
変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異mRNA若
しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わ
らない場合もある。ある遺伝子は、自然発生型のアレル変異配列が存在しないも
の、１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変異は
、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は、単
独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じる。
【００２５】 CAPをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或
いは置換が起こっても、CAPと同じポリペプチド或いはCAPの機能特性の少なくと
も１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、CAPをコードするポリヌク
レオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配列との不
適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにCAPをコードするポリヌ
クレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或い
は検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレン
ト変化を生じCAPと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換
を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にCAPの活性が
保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または
両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷電したアミノ
酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリ
シン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち極性非荷電側鎖を有
するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンが含まれ得
る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イソ
ロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びチロシンが含ま
れ得る。
【００２６】 用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び
合成分子を含む。「アミノ酸配列」が自然発生のタンパク質分子である場合、「
アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を、記載したタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００２７】 用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は
、この技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術によって行われる。
【００２８】 用語「アンタゴニスト」は、CAPの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子で
ある。アンタゴニストは、CAPに直接相互作用するか、或いはCAPが関与する生物
学的経路の成分と作用して、CAPの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、
任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００２９】 用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab')2、及びそれらの断片
、Fv断片などの無傷の分子を指す。CAPポリペプチドと結合する抗体は、抗体を
免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて産生可能である。
動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用される
ポリペプチド或いはオリゴペプチドは、RNAの翻訳から、或いは化学的に合成可
能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペプチ
ドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロ
ブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン（KLH）を含む。次ぎに、この結
合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００３０】 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）
を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用い
られるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の特定
の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原
決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために
用いられる免疫原）と競合し得る。
【００３１】 用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス鎖に相補的な核酸配列を含
む任意の組成物を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作
り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入されると、細胞に
よって作られた自然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。
「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖、「プラス（＋）」という表現
はセンス鎖を指す。
【００３２】 用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的、或いは生化学的な
機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」は、天然或い
は組換え体のCAP、合成のCAPまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動
物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００３３】 用語「相補的」及び「相補性」は、ポリヌクレオチド同士が塩基対を形成して
自然に結合することを指す。例えば、配列「５'Ａ−Ｇ−Ｔ３'」が相補的な配列
「３'Ｔ−Ｃ−Ａ５'」と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核
酸のみが結合する部分的な場合、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全
な相補性となる場合もあり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブ
リダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間
の結合に左右される増幅反応、並びにペプチド核酸（PNA）分子の設計若しくは
使用において特に重要である。
【００３４】 「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を
含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含
む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。
CAP若しくはCAPの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状
態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイ
ブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、NaCl）及び界面活性剤
（例えば、SDS：ドデシル硫酸ナトリウム）、その他の物質（例えば、デンハー
ト液、乾燥ミルク、サケ精子DNAなど）を含む水溶液に展開され得る。
【００３５】 「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにシークエンシングされ
た核酸配列であって、XL-PCRTM（Perkin Elmer, Norwalk, CT）を用いて５'及び
／または３'の方向に延長されてシークエンシングされた核酸配列、或いはGELVI
EW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）などのフラグメントの構築のための
コンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のインサイト社クローン、
及び場合によっては、１つ以上のパブリックのドメインESTの重複によって構築
された核酸配列を指す。延長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配
列もある。
【００３６】 用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換
を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、
そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の
元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile. Leu, Thr 一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、a）置換された領域のポリペプチ
ドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、b）置換された部位
の分子の電荷または疎水性、及び／または、c）側鎖の大半が維持される。
【００３７】 用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或
いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００３８】 用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指
す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒ
ドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチ
ドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも１
つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリ
ペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持する、グ
リコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって
修飾されたポリペプチドのことである。
【００３９】 用語「断片」は、CAPまたはCAPをコードするポリヌクレオチドの固有の部分で
あって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さが短
いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオチド／アミ
ノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、５〜１０００個の連続
するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、治
療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０、１５、１
６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若し
くは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断片は
、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプチド
断片は、所定の配列に示された最初の２５０若しくは５００のアミノ酸（或いは
、ポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された連続するアミノ酸
の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面を含
む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。
【００４０】 SEQ ID NO:4−6のある断片は、例えば、同じゲノム内の他の配列とは異なる、
SEQ ID NO:4−6を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SE
Q ID NO:4−6のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、また
はSEQ ID NO:4−6を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用で
ある。ある断片と一致するSEQ ID NO:4−6の正確な断片の長さや領域は、その断
片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【００４１】 SEQ ID NO:1−3のある断片は、SEQ ID NO:4−6のある断片によってコードされ
る。SEQ ID NO:1−3のある断片は、特異的にSEQ ID NO:1−3を同定する固有のア
ミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1−3のある断片は、特異的にSEQ
ID NO:1−3を認識する抗体の作製用の免疫原性ペプチドとして有用である。ある
断片と一致するSEQ ID NO:1−3の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に
基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【００４２】 用語「類似性」は相補性の程度を表す。これには、部分的類似性と完全な類似
性とがある。用語「同一性」を「類似性」とも言える。同一の配列と標的の核酸
とのハイブリダイゼーションが少なくとも部分的に阻止される部分的に相補的な
配列は、「実質的に類似」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハ
イブリダイゼーションの阻止は、緩いストリンジェントな条件の下、ハイブリダ
イゼーションアッセイ（サザンブロッティング或いはノーザンブロッティング法
、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査される。実質的に類似の配列或
いはハイブリダイゼーションプローブは、緩いストリンジェントな条件の下、完
全に類似（同一）の配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これ
は、緩いストリンジェントな条件の下では非特異的な結合が許容されるというこ
とではなく、緩いストリンジェントな条件では、２つの配列の互いへの結合が特
異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならい。部分的な相補性ともいえな
い（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用いて、非特
異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合
は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイブリダイ
ズしない。
【００４３】 ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」又は「％の同一
性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上
のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなア
ルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメントを
最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の比
較を行うことができる。
【００４４】 ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN version 3.12e配
列アラインメントプログラムに組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト
パラメータを用いて決定可能である。このプログラムはLASERGENEソフトウェア
パッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（DNASTAR, Madison W
I）である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポ
リヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Kt
uple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み
付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセ
ントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列の対の「類似性のパーセン
ト」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００４５】 別法では、一般に用いられ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が、
NCBI、Bethesda、MD、及びインターネット（http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS
T/）などから入手できるNational Center for Biotechnology Information (NCB
I) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F. 他 (1990) J
. Mol. Biol. 215:403-410)によって得られる。このBLASTソフトウェア一式には
、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配
列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラ
ムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、２
つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequen
ces」は、http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにアクセスして、対話形
式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以
下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、デ
フォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、
２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設
定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblast
nを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のよ
うにする。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: -2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の
全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大き
な所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０
、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定
してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細
書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される
長さを示すことができる。
【００４６】 高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードの縮重によって類似のアミ
ノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的に
同じタンパク質をコードする様々な核酸配列を作製できることを理解されたい。
【００４７】 ポリペプチド配列に用いられる用語「パーセントの同一性」又は「％の同一性
」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポ
リペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラ
インメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ
酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般
に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も）
が保存される。
【００４８】 ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN バージョン3.12e配列
アラインメントプログラム（上記）に組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフ
ォルトパラメータを用いて決定可能である。CLUSTAL Vを用いる対方式のポリぺ
プチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ktuple=1、gap
penalty=3、window=5、及び「diagonals saved」=5と設定する。PAM250マトリク
スが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアライ
ンメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパー
セントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００４９】 別法では、NCBI BLASTソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペ
プチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定され
た「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblastpを使
用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにす
る。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペ
プチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例え
ば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少
なくとも１５、２０または３０、４０、５０、７０、１５０の残基の断片の長さ
に対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図
面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセント
が測定される長さを示すことができる。
【００５０】 「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA
配列を含み得り、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を
含む直鎖状の小染色体である。
【００５１】 用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せる
ために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【００５２】 「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件の下で
、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニー
リングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配
列が高い同一性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件の下で
、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリ
ダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性
即ちストリンジェント（stringency）の決定において特に重要であり、よりスト
リンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の
対の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者に
よって日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過
程は、目的のストリンジェントにするためにその最中に条件の変更が可能であり
、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は
、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００
μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【００５３】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェントは、洗浄過程を行う際の
温度によっても左右される。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨにお
ける特定の配列の熱融点（Tm）より約５〜２０℃低く選択される。このTmは、（
所定のイオン強度とｐＨの下）標的の配列の５０％が完全に一致するプローブと
ハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーシ
ョンの条件は、周知であり、Sambrook, J. 他による, 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 第2版の1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview
NY; 特に2巻の9章に記載されている。
【００５４】 本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ンでは、約０．２×SSC及び約１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過
程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。SSCの濃
度は、約０．１％のSDSが存在の下、約０．１〜２×SSCの範囲である。通常は、
遮断剤を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断
剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子DNAが含まれ
る。約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤が、例えば、RNAと
DNAのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これら
の洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知である。特に高いストリンジェント
な条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化における類似性を
示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリ
ペプチドが類似の役割を果たしていることを強く示唆する。
【００５５】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によっ
て、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体
は溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の
１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、
或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）
に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。
【００５６】 用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチド
がそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【００５７】 「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連
する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイト
カイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴を
もつ。
【００５８】 用語「マイクロアレイ」は、基板上に配列されたそれぞれ異なったポリヌクレ
オチドの配列を指す。
【００５９】 マイクロアレイの文脈に用いられる用語「要素」或いは「アレイ要素」は、基
板の表面に配列されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。
【００６０】 用語「変調」は、CAPの活性の変化を指す。例えば、変調によって、CAPのタン
パク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは
免疫学的特性の変化が起こる。
【００６１】 用語「核酸」或いは「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポ
リヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若しくは二本鎖であ
って、センス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のＤＮ
Ａ或いはＲＮＡ、ペプチド核酸（PNA）、任意のＤＮＡ様物質、及びＲＮＡ様物
質を指す。
【００６２】 「機能的に結合した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係に
ある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を
与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般
に、機能的に結合したDNA配列は、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードす
る領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。
【００６３】 「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド
骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含
む、アンチセンス分子又は抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組
成物が溶解性となる。PNAは、相補的な一本鎖DNAやRNAに優先的に結合して転写
物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る
。
【００６４】 「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出
に用いる、CAPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列
のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単
離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放
射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」と
は、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、
通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレ
オチドにアニーリングした後、あるDNAポリメラーゼ酵素によって、標的のDNA一
本鎖に沿って延長される。プライマーの組は、例えば、PCR法における核酸配列
の増幅（及び同定）に用いることができる。
【００６５】 本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも１５
の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及び
プライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少
なくとも２０または２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００
、１５０のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相
当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意
の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。
【００６６】 プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Sambrook,
J.他による、1989年、名称「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2
版の1-3巻(Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、またはAusubel, F.M.
他による、1987年、名称「Current Protocols in Molecular Biology」(Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY)、並びに Innis他による、
1990年、名称「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」(Acade
mic Press, San Diego CA.)を参照されたい。PCR用のプライマーの組は、例えば
、Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research
, Cambridge MA)などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用い
て、ある既知の配列から引き出すことができる。
【００６７】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選
択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、OLIGO 4.06ソフトウェア
は、それぞれが最大１００ヌクレオチドまでのPCR用のプライマーの対の選択、
及び３２，０００塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大５，０００ヌク
レオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用で
ある。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含
まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（Genome Center at Uni
versity of Texas South West Medical Center, Dallas TXより入手可能）は、
メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ
（genome-wide scope）におけるプライマーの設計に有用である。Primer3プライ
マー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research,
Cambridge MA1より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位とし
て避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libaray
）」を入力できる。また、Primer3は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチ
ドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコー
ドは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように
変更することもできる）。PrimerGenプログラム（UK Human Genome Mapping Pro
ject Resource Centre, Cambridge UK より入手可能）は、多数の配列アライン
メントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の
最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイ
ズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及
び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である
。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド
の断片は、例えば、PCR法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイ要素
、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定
する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴ
ヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。
【００６８】 本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離
れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化
学合成によって作られる場合も多いが、前出のSambrook に記載されたような遺
伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一
般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失
によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的
に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある
細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。
【００６９】 別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワ
クチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニ
アウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。
【００７０】 用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。CAPをコードする
核酸若しくはその断片、CAP自体を含むと推定されるサンプルには、体液と、細
胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶
液中に存在する又は基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織又は組織プ
リント等も含まれ得る。
【００７１】 用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチ
ドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しく
は合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子に
よって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特
定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して
特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エ
ピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在する
と、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【００７２】 用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或い
は分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物
が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除
去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものを指す。
【００７３】 「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【００７４】 用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィ
ルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲ
ル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板に
は、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこ
にポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【００７５】 「形質転換」とは、外来DNAが入り込み受容体細胞を変化させるプロセスのこ
とである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条
件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を
挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、
形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、ウイルス
感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子
照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換された」細胞
には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の
一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限
られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【００７６】 特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメーター設定の「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastnによって、あ
る核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％
と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて
、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば
、「アレル」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列
、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一
性が極めて高い可能性があるが、mRNAプロセッシング中のエキソンの択一的スプ
ライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする
。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり
、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって
異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミ
ノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポ
リヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１
つのヌクレオチドが異なる「１ヌクレオチド多型」（SNP）も含み得る。SNPの存
在は、例えば、或る集団（population）、病態、病態の特徴を表し得る。
【００７７】 特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメーター設定の「
BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastpによっ
て、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少
なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このようなポリペプチドの
対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８
０％、８５％、９０％、９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。
【００７８】 （発明） 本発明は、新規の癌関連タンパク質（CAP）及びCAPをコードするポリヌクレオ
チドの発見に基づき、細胞増殖異常症及び自己免疫異常／炎症性疾患の診断、治
療、及び予防におけるそれらの組成物の使用に関する。
【００７９】 本発明のCAP-1をコードする核酸は、核酸及び／またはアミノ酸配列のアライ
ンメント用のコンピュータ検索によって、ヒト膀胱腫瘍cDNAライブラリ（BLADTU
T04）のインサイト社クローン1518859H1において同定された。コンセンサス配列
であるSEQ ID NO:4は、インサイト社クローン番号1518859H1 (BLADTUT04), 2634
789F6 (COLNTUT15), 2762312F6 (BRSTNOT12)、及び配列SBCA02155F1, SBCA05656
F1, SBIA02789D1, SBIA03101D1 (プールされたcDNAライブラリ由来)の核酸配列
の重複及び／または伸長によって導き出された。
【００８０】 一実施例では、本発明は、図１Ａ−図１Ｆに示されているように、SEQ ID NO:
1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。CAP-1はアミノ酸４６５個の長
さであり、S112残基における１個の潜在的なサイクリックAMP及びサイクリックG
MP依存性プロテインキナーゼリン酸化部位と、S36及びT85、S143、S170、T242、
S279、S348、T377、T436、T442、S450残基における１１個の潜在的なカゼインキ
ナーゼIIリン酸化部位と、T6及びS73、S108、T200、T222、S252、T266、S308、S
353、T455残基における１０個のプロテインキナーゼCリン酸化部位と、Y431残基
における１個の潜在的なチロシンキナーゼリン酸化部位とを有する。PFAM分析に
よって、CAP-1が、C59からC117残基及びC122からC176残基、C264からC319残基に
おいて、Sushi（短いコンセンサス反復）ドメインモチーフと相同性を有するこ
とが示された。SPScan及びHMM分析によって、CAP-1が、M1から約T22残基におけ
る潜在的なシグナルペプチド配列を有することが示された。図４Ａ及び図４Ｂに
示されているように、CAP-1は、ラットdrs（v-srcによってダウンレギュレート
された）遺伝子作成物（GI 1345423; SEQ ID NO:7）と化学的及び構造的類似性
を有する。SEQ ID NO:4のヌクレオチドの概ね1057から1101番目までの断片は、
例えば、SEQ ID NO:4の同定、及びSEQ ID NO:4と関連配列とを区別するハイブリ
ダイゼーションまたは増幅技術に有用である。コードされたポリペプチドは、例
えば免疫原性ペプチドとして有用である。ノーザン分析によって、この配列が様
々なライブラリで発現し、その内の少なくとも５７％が細胞増殖に関連し、少な
くとも２４％が炎症及び免疫応答に関連することが示された。特に注目すべきは
、CAP-1が心血管組織（３３％）及び神経組織（２９％）、胃腸組織（１４％）
において発現することである。
【００８１】 本発明のCAP-2をコードする核酸は、核酸及び／またはアミノ酸配列のアライ
ンメント用のコンピュータ検索によって、ヒト胆嚢cDNAライブラリ（GBLANOT01
）のインサイト社クローン2616269H1において同定された。コンセンサス配列で
あるSEQ ID NO:5は、インサイト社クローン番号2616269H1 (GBLANOT01)及び3557
735H1 (LUNGNOT31), 1965572R6 (BRSTNOT04), 2182972F6 (SININOT01). 1857443
F6 (PROSNOT18), 3568062H1 (HEAPNOT01), 1878060T6 (LEUKNOT03), 1795056R6
(PROSTUT05), 1486038H1 (CORPNOT02)の核酸配列の重複及び／または伸長によっ
て導き出された。
【００８２】 一実施例では、本発明は、図２Ａ−図２Ｅに示されているように、SEQ ID NO:
2のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。CAP-2はアミノ酸２７８個の長
さであり、T50残基における１個の潜在的なサイクリックAMP及びサイクリックGM
P依存性プロテインキナーゼリン酸化部位と、S29及びT50、S187残基における３
個の潜在的なカゼインキナーゼIIリン酸化部位と、T183及びT211、S219、S312、
T380残基における５個の潜在的なプロテインキナーゼCリン酸化部位とを有する
。PFAM分析によって、CAP-2が、R141からK177残基及びS180からP216残基、G233
からD264残基、M271からD308残基において、WDドメインGβ反復モチーフと相同
性を有することが示された。PRINTS分析によって、CAP-2が、I164からI178残基
及びI203からL217残基、L295からL309残基において、WDドメインGβ反復モチー
フと相同性を有することが示された。SPScan分析によって、CAP-2が、M1から約A
35残基における潜在的なシグナルペプチドを有することが示された。図５Ａ及び
図５Ｂに示されているように、CAP-2は、ヒトBCR遺伝子タンパク質（GI 487348;
SEQ ID NO:8）と化学的及び構造的類似性を有する。特に、CAP-2は、ヒトbcr-a
bl遺伝子タンパク質と４４％の同一性を有する。SEQ ID NO:5のヌクレオチドの
概ね483から527番目までの断片は、例えば、SEQ ID NO:5の同定、及びSEQ ID NO
:5と関連配列とを区別するハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用である
。コードされたポリペプチドは、例えば免疫原性ペプチドとして有用である。ノ
ーザン分析によって、この配列が様々なライブラリで発現し、その内の少なくと
も５２％が細胞増殖に関連し、少なくとも３４％が炎症及び免疫応答に関連する
ことが示された。特に注目すべきは、CAP-2が生殖組織（３０％）及び神経組織
（２２％）、胃腸組織（１６％）において発現することである。
【００８３】 本発明のCAP-3をコードする核酸は、核酸及び／またはアミノ酸配列のアライ
ンメント用のコンピュータ検索によって、ヒト肺腫瘍cDNAライブラリ（LUNGTUT1
3）のインサイト社クローン3117642H1において同定された。コンセンサス配列で
あるSEQ ID NO:6は、インサイト社クローン番号3117642H1及び3117642F6 (LUNGT
UT13), 1980062H1 (LUNGTUT03), 791000R1 (PROSTUT03)の核酸配列の重複及び／
または伸長によって導き出された。
【００８４】 一実施例では、本発明は、図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、SEQ ID N
O:3のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。CAP-3はアミノ酸４００個の
長さであり、S19及びS23、T41、T71、T113、T136残基における６個の潜在的なカ
ゼインキナーゼIIリン酸化部位と、T81残基における１個の潜在的なプロテイン
キナーゼCリン酸化部位とを有する。図６に示されているように、CAP-3は、ヒト
GAGE-7前立腺腫瘍抗原（GI 3511023; SEQ ID NO:9）と化学的及び構造的類似性
を有する。特に、CAP-3は、ヒトGAGE-7前立腺腫瘍抗原と１８％の同一性を有す
る。SEQ ID NO:6の概ね117から159番目までの断片及びヌクレオチドの概ね262か
ら306番目までの断片は、例えば、SEQ ID NO:6の同定、及びSEQ ID NO:6と関連
配列とを区別するハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用である。各断片
によってコードされたポリペプチドは、例えば、免疫原性ペプチドとして有用で
ある。ノーザン分析によって、この配列が４つのライブラリで発現し、その全て
が細胞増殖に関連することが示された。その４つのライブラリの内の２つが肺腫
瘍組織に由来し、１つが前立腺腫瘍組織に由来し、１つがK562慢性骨髄性白血病
前駆細胞株に由来する。
【００８５】 本発明はまた、CAPの変異体も含む。好適なCAPの変異体は、CAPの機能的或い
は構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつCAPアミノ酸配列に対して
少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ
酸配列同一性、更には少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００８６】 本発明はまた、CAPをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例
において、本発明は、CAPをコードするSEQ ID NO:4−6からなる一群から選択さ
れた配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。
【００８７】 本発明はまた、CAPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、CAPをコードするポリ
ヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少
なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポ
リヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:4
−6からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチ
ド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には
少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:4−6から
なる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する
。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、CAPの機能的或いは構造的特徴
の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【００８８】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るCAPをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出
され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み
合わせは、自然発生のCAPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプ
レット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【００８９】 CAPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択されたス
トリンジェントな条件の下で、自然発生のCAPのヌクレオチドとハイブリダイズ
可能なことが望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なった
コドンの使用を有するCAP或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作
り出すことは有益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基
づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生
する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、
CAP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由
は、自然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性
を備えるRNA転写物を作ることにある。
【００９０】 本発明はまた、CAP及びその誘導体をコードするDNA配列又はそれらの断片を完
全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で
良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの
中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、CAPまたはその任意の断片を
コードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【００９１】 更に本発明には、種々のストリンジェント条件の下で、請求項に記載されたポ
リヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:4−6及びそれらの断片とハイブリダイズ
可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (
1987) Methods Enzymol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzy
mol. 152:507-511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼー
ションの条件は、「定義」に記載されている。
【００９２】 当分野で周知のDNAのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例
も実行可能である。この方法には、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SE
QUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）
、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway NJ）、
或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)にみられる
ような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用い
られる。好ましくは、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、
PTC200 Thermal Cycler200（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 80
0 (Perkin-Elmer) などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373
或いは377 DNAシークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、MEGABACE 1000 DNAシ
ークエンシングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyvale CA)または当分野で周
知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の
様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Pr otocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7;
Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New
York NY, pp. 856-853.を参照)。
【００９３】 当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配
列を利用して、CAPをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要素な
どの上流にある配列を検出する。例えば制限部位PCR法を利用する１つの方法で
は、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベクター
内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する（例えば、Sarkar, G. (1993) PCR Met
hods Applic 2:318-322を参照）。逆PCR法を用いる別法では、広範な方向に伸長
して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は
、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する（例えば
、Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186を参照）。キャプチャPCR
法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接す
るDNA断片のPCR増幅を含む（例えば、Lagerstrom, M.他（1991）PCR Methods Ap
plic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ
−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列を
挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配列
を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (1991)Nucleic Acids Res
. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネスト化プライマー、PROMOTERFINDERライ
ブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いれば、ゲノムDNA内の歩行が可能であ
る。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エ
キソン接合部を探すのに有用である。全てのPCR法をベースにした方法では、プ
ライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis software（National Bioscien
ces, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３
０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対
してアニーリングするよう設計される。
【００９４】 完全な長さのcDNAのスクリーニングの際は、大きなcDNAを含むようにサイズが
選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴd(T)ライブラリが完
全な長さのcDNAを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有する配列を含むも
のが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライ
ブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【００９５】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR
産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、
キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマ
ー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色
素、放出された波長の検出に利用するCCDカメラを使用することが可能である。
出力／光強度は、適切なソフトウエア（例えば、GENOTYPER及びSEQUENCE NAVIGA
TOR、Perkin-Elmer）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングか
らコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能
である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合
もあるDNAの小片のシークエンシングに特に適している。
【００９６】 本発明の別の実施例では、CAPをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にCAP、その断片ま
たは機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、
実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作
られ得り、これらの配列をCAPのクローン化及び発現に利用可能である。
【００９７】 種々の目的でCAPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この
目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるDNAの混
合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのPCR再組み立てを用いて、ヌクレオ
チド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による定方
向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコ
シル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等が可
能である。
【００９８】 本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara C
A; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793
-797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A
. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用い
てシャフリングして、CAPの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化
合物と結合する能力などのCAPの生物学的特性を変更或いは向上させることがで
きる。DNAシャフリングは、PCR法による遺伝子断片の組換えで遺伝子変異体のラ
イブラリが作製されるプロセスである。次に、このライブラリは、目的の特性を
備えた遺伝子変異体を同定するための選択或いはスクリーニングが行われる。こ
れらの好ましい変異体はプールされ、DNAシャフリング及び選択／スクリーニン
グが繰り返される。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な
遺伝子が作られる。例えば、ランダムな位置に変異がある１つの遺伝子の断片を
組換えてスクリーニングし、目的の特性が最適となるまでシャフリングを実施す
ることもできる。別法では、所定の遺伝子の断片を、同じ或いは異なった種の同
じ遺伝子ファミリーの相同な遺伝子の断片で組換え、それによってプロトコルに
基づいた調節可能な方法で、多数の天然遺伝子の遺伝子多様性を最大化すること
ができる。
【００９９】 別の実施例によれば、CAPをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1980
）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acid
s Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてCAP自体
またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固
相技術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 269:
202-204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイザ
（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にCAPのアミノ酸配列または任意のそ
の一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタン
パク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプ
チドを作ることが可能である。
【０１００】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei ns, Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York, NYを参照)
。
【０１０１】 生物学的に活性なCAPを発現させるために、CAPをコードするヌクレオチド配列
またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適
な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含む
。これらの要素には、ベクター及びCAPをコードするポリヌクレオチド配列にお
けるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳
領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性が様々
である。特定の開始シグナルによって、CAPをコードする配列のより効果的な翻
訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及
びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。CAPをコードする配列及びその開
始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転
写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コ
ーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ
開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければな
らない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得
ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含め
ることで発現の効率を高めることが可能である。(例えば、Scharf, D. 他 (1994
) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参照)。
【０１０２】 当業者に周知の方法を用いて、CAPをコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro 組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる。(
例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び１6-17章; 及び
Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wi
ley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章1−4章を参照)。
【０１０３】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、CAPをコードする配列の保持及び発
現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファ
ージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌など
の微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス
、TMV）または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR３２２プラスミド）で形
質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明は使用される宿
主細胞によって限定されるものではない。
【０１０４】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、CAPをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、CAPを
コードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、
増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミド(G
IBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多
数のクローニング部位にCAPをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝
子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリ
ーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされ
た配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージに
よる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。(例えば、V
an Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.を参照
)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のCAPが必要な場合は、CAPの発現をハ
イレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するT5ま
たはT7バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【０１０５】 CAPの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダ
ーゼやPGHプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種の
ベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用
可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内
への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列
を組み込む。(例えば、上記のAusubel.; 及びBitter, G.A. 他 (1987) Methods
Enzymol.153:51-794: Scorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181-184.
を参照) 植物系もCAPの発現に使用可能である。CAPをコードする配列の転写は、例えば
、CaMV由来の35S及び19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、或
いはTMV（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配
列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のDNA形質転換或いは病
原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。
（例えば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）McGr
aw Hill NY, pp.191-196を参照）。
【０１０６】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にCAPをコードする配列を結
合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感
染した宿主細胞にCAPを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan, J.
及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。さらに
、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、
哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を高
レベルで発現させるために、SV40またはEBVを基にしたベクターを用いることが
可能である。
【０１０７】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなDNAの断片を供給可能である。治療のために約６kb〜１０MbのHACs
を作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または
ベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:3
45-355.を参照)。
【０１０８】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるCAPの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、CAPをコー
ドする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクタ
ーは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベ
クターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地
に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択
的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列を
うまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞
の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１０９】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk−又はapr−細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1
977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（cCAPsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ
（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigler
, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F.
他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。さらに選択に利用できる遺伝子、
例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記載され
ている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad.
Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clonte
ch）、βグルクロニダーゼ及びその基質GUS，ルシフェラーゼ及びその基質ルシ
フェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（GFP）(Clonte
ch, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォー
マントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定し
たタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Rhodes, C.A.他（1995
）Methods Mol. Biol. 55:121-131を参照）。
【０１１０】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、CAPをコード
する配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、CAPをコードする配列を
含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。
または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がCAPをコードする配列
と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子
の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１１１】 一般に、CAPをコードする核酸配列を含み、CAPを発現する宿主細胞は、当業者
に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、DN
A−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパク
質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの
技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。
【０１１２】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるCA
Pの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。この
ような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。CAP上の２
つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノク
ローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が
好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及び
その他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton. R.
他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul.
MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology, Greene P
ub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; 及びPound, J.D. (19
90) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。
【０１１３】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。CAPをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或い
はPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション
、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別
法として、CAPをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成
するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であ
り市販されているこのようなベクターを、T7，T3，またはSP6などの好適なRNAポ
リメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in vitroでのRNAプロ
ーブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Amersham Pharmac
ia Biotech及びPromega（Madison WI）、U.S. Biochemical Corp（Cleveland OH
）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い
得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター
、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含
まれる。
【０１１４】 CAPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換され
た細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用され
るその配列及び／またはそのベクターによる。CAPをコードするポリヌクレオチ
ドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するCAPの分泌を誘
導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１１５】 更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（
lipidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「prepro」または「pro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利
用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能で
ある。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿
主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture C
ollection（ATCC; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正
しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【０１１６】 本発明の別の実施例では、CAPをコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラCA
Pタンパク質が、CAPの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリ
ーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、市
販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分に
は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（M
BP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6−His、
FLAG、c−mc、赤血球凝集素（HA）が含まれるが、これらに限定されるものでは
ない。GST及びMBP、Trx、CBP、6−Hisによって、固定されたグルタチオン、マル
トース、フェニルアルシン酸化物（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、金
属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG、
c−mc、及び赤血球凝集素（HA）によって、これらのエピトープ標識を特異的に
認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた融合タンパ
ク質の免疫親和性の精製ができる。また、CAPをコードする配列と異種タンパク
質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝
子操作すると、CAPが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の
発現と精製の方法は、Ausubel. (1995、前出 ch 10).に記載されている。市販さ
れている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。
【０１１７】 本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽
出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したCAPの合成が可能である。これ
らの系は、T7またはT3、SP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコー
ドする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、３５Ｓメチオニンである
放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０１１８】 CAPの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド合
成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。タン
パク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えばABI 431Aペ
プチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能である。CAPの種
々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成する。
【０１１９】 （治療） CAPのある領域と癌関連タンパク質のある領域との間に、例えば配列及びモチ
ーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、CAPの発現は、
細胞増殖異常症及び自己免疫異常／炎症性疾患と密接に関連する。従って、CAP
は、細胞増殖異常症及び自己免疫異常／炎症性疾患においてある役割を果たすと
考えられる。CAPの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、C
APの発現または活性を低下させることが望ましい。また、CAPの発現または活性
の低下に関連する疾患の治療においては、CAPの発現または活性を増大させるこ
とが望ましい。
【０１２０】 従って、一実施例において、CAPの発現または活性の低下に関連した疾患の治
療または予防のために、患者にCAPまたはその断片や誘導体を投与することが可
能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、細胞増殖異常症
が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変
、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症
、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒
色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳
房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、
副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含
まれ、また、自己免疫異常症／炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全
症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊
椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性
貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロ
フィ（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚
炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球
症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グ
レーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症
、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋
炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、
全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少
症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィ
ルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感
染症、外傷が含まれる。
【０１２１】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCAPの発現
または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CAPまたはその断
片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１２２】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCAPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製
されたCAPを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも
可能である。
【０１２３】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCAPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CAPの活性を
調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１２４】 更なる実施例では、CAPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または
予防のために、患者にCAPのアンタゴニストを投与することが可能である。限定
するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常症及び自
己免疫異常／炎症性疾患が含まれる。一実施態様では、CAPと特異的に結合する
抗体が直接アンタゴニストとして、或いはCAPを発現する細胞または組織に薬剤
を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０１２５】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCAPの発現
または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、CAPをコードする
ポリヌクレオチドの相補体（complement）を発現するベクターを患者に投与する
ことも可能である。
【０１２６】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０１２７】 CAPのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。詳しくは、精製されたCAPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてCAPと特異的に結合するものを同定が可能である。CAPの
抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような
抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fa
bフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれ
る。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、二
量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０１２８】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、CAPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバント
にはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバ
ント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳
剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活
性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュ
バントの中では、BCG（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvum が特に好ましい。
【０１２９】 CAPに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には約１０以上のアミ
ノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、または
それらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望
ましく、小さな自然発生の分子の全アミノ酸配列も含む。CAPアミノ酸の短い伸
展部は、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が
産生され得る。
【０１３０】 CAPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術に
は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV−ハイブリ
ドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohler,
G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol. Met
hods 81−8-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030
; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。
【０１３１】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:6
04-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分
野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して
、CAP特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタ
イプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖
混合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. 88:11120-3を参照）。
【０１３２】 抗体は、リンパ球集団の中のin vivo産生を誘発することによって、または免
疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度
に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生すること
もできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833
-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。
【０１３３】 CAPに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば、
このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF（ab'）に断
片と、F（ab'）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるFab
断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Fab発現ライ
ブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルFab断片の迅速
且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (1989) Science 254:12
75-1281を参照）。
【０１３４】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、CAP
とその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性CAPエ
ピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナル
ベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用する
ことができる(Pound、前出)。
【０１３５】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、C
APに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、
平衡状態の下でCAP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除
して得られる値である。多数のCAPエピトープに対して親和性が不均一なポリク
ローナル抗体医薬のＫａは、CAPに対する抗体の平均親和性または結合活性を表
す。特定のCAPエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のＫａは、親
和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体医
薬は、CAP抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用
いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、CA
Pが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurific
ation）及び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach . IRL Press, Washington, DC; Liddell, J.
E. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John
Wiley & Sons, New York NY)。
【０１３６】 ある下流の適用についてのこのような医薬品の品質及び適性を調べるために、
ポリクローナル抗体医薬の抗体価及び結合活性を更に評価する。例えば、少なく
とも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的
な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、CAP抗体複合体を沈殿させなけ
ればならない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価
、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、Cat
ty, 前出, 及びColigan 他、前出を参照)。
【０１３７】 本発明の別の実施例では、CAPをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態で
は、CAPをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止するのに
好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、CAPをコードする
ポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがって、相
補的分子または断片は、CAPの活性の調節、または遺伝子機能の調節のために使
用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、CAPをコードする配列の制
御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。
【０１３８】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてCAPをコード
ポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することができ
る(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)。
【０１３９】 CAPをコードする遺伝子は、CAPをコードするポリヌクレオチド又はその断片を
高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することによっ
て止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又はアン
チセンス配列を細胞の中に導入することができる。DNAの中に組み入れられない
場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損なわれ
るまでmRNA分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一ヶ月以上
に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに長く持続
し得る。
【０１４０】 上記した通り、遺伝子の発現は、CAPをコードする遺伝子の制御５’または調
節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（DNA或いはRNA、PNA）を
設計することによって調節することができる。例えば開始部位から約−１０から
約＋１０までの転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを用いることが可能
である。同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる。
三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結
合のために十分に広がるのを阻止するため有用である。三重式DNAを用いる最近
の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In: Hub
er, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Pu
blishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子
もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を
阻止するように設計できる。
【０１４１】 酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために用いる
ことができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的RNAへのリボザイム分
子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。
例えば、CAPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触
媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０１４２】 任意の潜在的RNA標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵ
Ａ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャ
ニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む
標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いRNA配
列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価
することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを
用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテ
ストすることによって評価することが可能である。
【０１４３】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、RNA分子がin vitro及びin vivoでCAPをコードするDNA配列の転
写によって生成され得る、このようなDNA配列はT7またはSP6等の好適なRNAポリ
メラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能であ
る。別法では、相補的なRNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA作製
物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０１４４】 RNA分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くする
ことができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキ
ング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よ
りむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに限
定されるものではない。PNAの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレ
アーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、
及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく
、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）など
の従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大する
ことができる。
【０１４５】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr o 、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。
【０１４６】 上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサ
ギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【０１４７】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、CAP、CAPに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はCAPのイ
ンヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類以
上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。こ
のような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが含
まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又は
ホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【０１４８】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０１４９】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, PA)に
記載されている。
【０１５０】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。
【０１５１】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。
【０１５２】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。
【０１５３】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。
【０１５４】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。
【０１５５】 局部または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用
いられる。このような浸透剤は当業者には周知である。
【０１５６】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。
【０１５７】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の薬
剤の形態には、１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、及び
２％〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４．５〜５．
５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることができる。
【０１５８】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。CAPの投与のため、このようなラベルには、量、頻
度、及び投与の方法が含まれるであろう。
【０１５９】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。
【０１６０】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。
【０１６１】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばCAP又はその
断片、CAPの抗体、CAPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの
活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ED５０（服用
に対して集団の５０％に医薬的効果がある）またはLD５０（服用に対して集団の
５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験における
標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬用
量比は治療指数であり、LD５０／ED５０と示すことができる。高い治療指数を示
す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータ
が、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このよう
な組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED５０を含む血中
濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の感
受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０１６２】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。
【０１６３】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０１６４】 （診断） 別の実施例では、CAPに特異的に結合する抗体が、CAPの発現によって特徴付け
られる疾患の診断、またはCAPやCAPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒ
ビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診
断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。CAP
の診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採
取されたものからCAPを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして
或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接
着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いられる
が、その内の幾つかは上記した。
【０１６５】 CAPを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分
野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのCAPの発現を診断する元とな
るものを提供する。正常或いは標準的なCAPの発現の値は、複合体の形成に適し
た条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または
細胞とCAPに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体
形成の量は、測光法（photometric）などの種々の方法で定量され得る。被験者
のCAPの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較され
る。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパラメーターとなる。
【０１６６】 別の実施例によれば、CAPをコードするポリヌクレオチドを診断のために用い
ることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、
相補的なRNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて
、疾患と相関し得るCAPを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量
する。この診断アッセイを用いて、CAPの不在、存在、及び過度の発現を調べ、
治療中のCAPレベルの制御を監視する。
【０１６７】 ある実施形態では、CAPまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションに
よって、CAPをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'調節
領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性
の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション
或いは増幅のストリンジェントは、プローブがCAPをコードする自然界の配列の
みを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみを
同定するかどうかによって決まるであろう。
【０１６８】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、CAPをコードする任意の配
列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼ
ーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:4−6の配列、
或いはCAP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列
に由来し得る。
【０１６９】 CAPをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製
方法には、CAP及びCAP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブ
の作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクターは
市販されており、当業者には周知であり、好適なRNAポリメラーゼ及び好適な標
識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成す
るために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば３２Ｐ或いは ３５ Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biotin）結合系によって
プローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレポー
ターの集団によって標識され得る。
【０１７０】 CAPをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、CAPの発現に関連する疾患を
診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には
、細胞増殖異常症が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化
、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間
ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血
病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、
骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋
肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、
子宮の癌などが含まれ、また、自己免疫異常症／炎症性疾患も含まれ、その中に
は後天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレ
ルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、
自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ
性外胚葉ジストロフィ（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病
、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ
球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー
症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候
群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症
、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ
−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬
化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、
体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫
感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれる。CAPをコードするポリヌクレオチド配
列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術
、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、ELISA式アッセイ、
及び変異CAPの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用す
るマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法
は、当分野では周知である。
【０１７１】 特定の形態において、CAPをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、
特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。CAPをコードする
ヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合
体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加え
ることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを
定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと
較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のCAPをコードするヌクレオチド
配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッ
セイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、
特定の治療効果を推定することが可能である。
【０１７２】 CAPの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常あ
るいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出され
た体液或いは細胞と、CAPをコードする配列或いはその断片とを結合させること
により達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得
た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの
値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な
値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験者の
値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０１７３】 疾患の存在が確定され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な
患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返
し行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用い
ることができる。
【０１７４】 癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因
を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが
可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積
極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる
。
【０１７５】 CAPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、PCRの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、 酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましくは
CAPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはCAPをコードするポリヌクレオ
チドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子
や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジ
ェントな条件の下、近縁のDNA或いはRNA配列の検出及び／または定量のため用い
ることが可能である。
【０１７６】 CAPの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。多数のサンプルの定量速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含まれ
、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速なハイスループット型のアッセ
イを用いることで加速された。
【０１７７】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。
【０１７８】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、CAPをコードする核酸配列を用いて、自然発生
のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生
成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。
特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工染
色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌Ｐ１生成
物或いは単一染色体cDNAライブラリである。（例えば、Harrington, 1.3. 他 (1
997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 5−87-134, 及
びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照） in sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, 前出, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は
、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のワー
ルドワイドウェブのサイトで見付けることができる。物理的な染色体マップ上の
CAPをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対
する素因が、このような疾患と関係するDNAの領域を決定するのに役立つ。本発
明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子
配列における違いを検出することもある。
【０１７９】 染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580
を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することも
ある。
【０１８０】 本発明の別の実施例では、CAP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに
用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細
胞内に存在する。CAPと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定しても
よい。
【０１８１】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、CAP、或いはその断片と反応してから洗
浄される。次ぎに、結合されたCAPが、当分野で周知の方法で検出される。精製
されたCAPはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレー
ト上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを
捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０１８２】 別の実施例では、CAPと結合可能な中和抗体がCAPと結合するため試験用化合物
と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。こ
の方法では、抗体が、CAPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの
存在も検出する。
【０１８３】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にCAPをコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。
【０１８４】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本
発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は
、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【０１８５】 前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国出願通し番
号[1999年1月22日に出願した代理人整理番号PF-0661P]に言及することをもって
本明細書の一部とする。
【０１８６】 （実施例）BLADTUT １ cDNAライブラリの作製 CAP-1 BLADTUT04ライブラリは、60歳白人男性の根治膀胱切除及び前立腺切除、精管
切除術の際に採取した膀胱腫瘍組織から単離したRNAを用いて作製した。病理学
的には、グレード３の左膀胱壁の移行上皮癌であった。上皮内癌がドーム及び三
角で見つかった。家族歴には、I型糖尿病及び胃の悪性腫瘍、アテローム硬化性
冠状動脈疾患、急性心筋梗塞があった。
【０１８７】 この凍結組織を、Polytron PT-3000ホモジナイザー(Brinkmann Instruments,
Westhury NJ)を用いて、グアニジンイソチオシアネート液中でホモジナイズし溶
解した。RNAを、StratageneのRNA単離プロトコル(Stratagene, San Diego CA)に
従って単離した。RNAを、酸性フェノールで２回抽出し、酢酸ナトリウムとエタ
ノールで沈殿させ、RNA分解酵素を含まない水で再懸濁し、DNA分解酵素で処理し
た。OLIGOTEXキット(QIAGEN, Chatsworth CA)を用いてポリ（A+）RNAを単離した
。
【０１８８】 CAP-2 GBLANOT01ライブラリは、53歳白人女性の胆嚢摘出の際に採取した病変胆嚢組
織から単離したRNAを用いて作製した。病理学的には、軽度の急性胆嚢炎及び約
１５０個の胆石を伴った胆石症を示していた。家族歴には、良性高血圧症があっ
た。
【０１８９】 この凍結組織を、Polytron PT-3000ホモジナイザー（Brinkmann Instruments,
Westbury NY）を用いて、フェノール及びグアニジンイソチオシアネートの単相
液であるTRIZOL試薬（組織1g／TRIZOL 10ml；Life Technologies）の中でホモジ
ナイズして溶解した。氷上で短時間インキュベートした後、クロロホルムを加え
（1:5 v/v）、混合液を遠心分離して各相に分離した。上澄水相を新しいチュー
ブに移し、イソプロパノールを加えてRNAを沈殿させた。RNAを、RNA分解酵素を
含まない水で再懸濁し、DNA分解酵素で処理した。RNAを、酸性フェノールクロロ
ホルムで再抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿させた。OLIGOTEX mRN
A精製キット(QIAGEN)を用いて、ポリ（A+）RNAを単離した。
【０１９０】 CAP-3 LUNGTUT13ライブラリは、４７歳白人男性の肺区域切除術の際に採取した腫瘍
肺組織から単離したRNAを用いて作製した。病理学的には、グレード３（４の３
）の浸潤性の腺癌を示していた。家族歴には、アテローム硬化性冠状動脈疾患及
びII型糖尿病があった。
【０１９１】 この凍結組織を、Polytron PT-3000ホモジナイザー（Brinkmann Instruments,
Westbury NY）を用いて、フェノール及びグアニジンイソチオシアネートの単相
液であるTRIZOL試薬（組織1g／TRIZOL 10ml；Life Technologies）の中でホモジ
ナイズして溶解した。氷上で短時間インキュベートした後、クロロホルムを加え
（1:5 v/v）、混合液を遠心分離して各相に分離した。上澄水相を新しいチュー
ブに移し、イソプロパノールを加えてRNAを沈殿させた。RNAを、RNA分解酵素を
含まない水で再懸濁し、DNA分解酵素で処理した。RNAを、酸性フェノールクロロ
ホルムで再抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿させた。OLIGOTEX mRN
A精製キット(QIAGEN)を用いて、ポリ（A+）RNAを単離した。
【０１９２】 SUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）の推奨プロトコルに従
って、ポリ（A+）RNAを用いてcDNAを合成し、３つすべてのcDNAライブラリを作
製した。これらのcDNAは、SEPHAROSE CL4Bカラム（Amersham Pharmacia Biotech
）上で分画化し、400 bpを超える大きさのcDNAをpINCY（Incyte Pharmaceutical
s, Palo Alto CA）に結合した。この組み換えプラスミドを、DH5αコンピテント
細胞若しくはElectroMAX 細胞（Life Technologies）の中に導入した。
【０１９３】 ２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用して、in vivo切
除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps
DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, G
aithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QI
AWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキットの内の少
なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留
水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０１９４】 別法では、ハイスループットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解物からプ
ラスミドDNAを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主
細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理
してから３８４ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度
をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光スキャ
ナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した。
【０１９５】 ３ シークエンシング及び分析 cDNAのシークエンシング反応は、標準的な方法で、或いはABI CATALYST 800 (
Perkin-Elmer) thermal cyclerまたはPTC-200 thermal cycler (MJ Research)と
HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific) またはMICROLAB 2200 (Ham
ilton) 液体転移システムとの組み合わせなどのハイスループット装置で行った
。cDNAのシークエンシング反応の準備には、Amersham Pharmacia Biotech社の試
薬、またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reactionキ
ット(Perkin-Elmer)などのABIシークエンシングキットに含まれる試薬を用いた
。cDNAのシークエンシング反応の電気泳動的な分離及び標識したポリヌクレオチ
ドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynami
cs)、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 37
3または377シークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、当分野で周知のその他の
配列解析システムを用いた。cDNA配列の読み枠は、標準的な方法(Ausubel, 1997
, 前出, unit 7.7)を用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、本実施例
の５に記載した方法で配列を延長した。
【０１９６】 cDNAのシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列の構築及び解析は、当
分野の技術者に周知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行った。
表１は、利用したツール、ソフトウェア、アルゴリズム、それらの説明、引用文
献、閾値パラメーターの概要を示す。表１の列１は用いたツール及びプログラム
、アルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の
一部とした引用文献、列４の記載部分は２つの配列の一致度の評価に用いたスコ
ア及び確率値、他のパラメータを示す（確率値が高ければ高いほど配列間の相同
性が高くなる）。配列の解析には、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Softwa
re Engineering, S. San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア (DNASTAR)
を用いた。
【０１９７】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、
BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースで
あるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベー
スやBLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMなどのデータベースから選択した配
列に対してこれらの配列を問合わせて注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基
づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を
構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムでオープンリーディン
グフレームのためにスクリーンした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して
対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、GenBankデータベース(上記)及びSwi
ssProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPrositeなどのデータベース、また
はPFAMなどのHidden Markov Model (HMM)に基づいたタンパク質ファミリーデー
タベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析した。HMMは、確率
を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次構造を解析する（例えば、Eddy
, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照）。
【０１９８】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記
のプログラムは、SEQ ID NO:4−6からのポリヌクレオチド配列の断片の同定にも
使用できる。約２０から４０００個までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼ
ーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。
【０１９９】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織由来のRNAを結合した膜に対する標識された
ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,前出, 7
章; 及び Ausubel. F.M. 他、前出, 4章及び16章を参照)。
【０２００】 BLASTに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ（Inc
yte Pharmaceuticals）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連
する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションよりも速度
が非常に速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が
、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することがで
きる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大BLASTスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。
【０２０１】 ノーザン分析の結果は、CAPをコードする転写物が発生したライブラリの分布
割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるcDNAライブラリの
分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、
胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿器が含まれる。疾患のカテゴリー
には、癌、炎症／外傷、細胞増殖、神経、貯留(pooled)が含まれる。カテゴリー
別に、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全ての範囲のライ
ブラリの数で除した。各組織に特異的に発現する割合（パーセント）と各疾患で
発現する割合は本明細書に示した。
【０２０２】 ５ CAPをコードするポリヌクレオチドの延長 SEQ ID NO:4−6の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計した
オリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を延長して
作製した。一方のプライマーは既知の断片の５'の延長を開始するために合成し
、他方のプライマーは既知の断片の３'の延長を開始するために合成した。開始
プライマーは、OLIGO 4．06ソフトウェア（National Biosciences）或いは他の
適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５
０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールす
るように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じない
ようにヌクレオチドを延長した。
【０２０３】 選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を延長した。２段階以上の延
長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組
を設計する。
【０２０４】 当分野で既知の方法を利用したPCR法で高い忠実度で増幅した。PCRはPTC-200
thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて96ウェルブロックプレートで行った
。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg２+と(NH4)2SO4とβ
−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pha
rmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(St
ratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメーター
で増幅を行った。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管 別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメーターで増幅を行っ
た。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ５７℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。
【０２０５】 各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した
100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugen
e OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分
配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをFluoroskan
II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サンプルの蛍光を計
測してDNAの濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlのアリコットを１％のア
ガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を延長す
ることに成功したかを決定する。
【０２０６】 延長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、Cvi
JIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison W
I)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する前に音
波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化し
たヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断
片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New England B
iolabs, Beverly MA)を用いて延長したクローンをpUC 18ベクター(Amersham Pha
rmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位の延
び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を
選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカ
ルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０２０７】 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ７２℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す ステップ６ ７２℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。 上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収
率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20％のジメチル
サルホサイド（dimethysulphoxide）( 1−15, v/v)で希釈し、DYENAMIC DIRECT
キット(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycl
e sequencing ready reactionキット(Perkin-Elmer)を用いてシークエンシング
した。
【０２０８】 同様に上述の手順で、SEQ ID NO:4−6のヌクレオチド配列を利用し、この延長
のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて５′調
節配列を得た。
【０２０９】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:4−6から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、
cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオ
リゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなcDNAフラグメントの場
合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウ
ェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザイン
し、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ‐３２Ｐ]アデノシン三リン酸（Ame
rsham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Boston
MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオ
チドを、SEPHADEX G-25超精細排除デキストランビードカラム（Amersham Pharma
cia Biotech）を用いて実質的に精製する。毎分１０７カウントの標識されたプ
ローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ase I、Bgl II、Eco RI
、Pst I、Xba1或いはPvu II（DuPont NEN）の１つを用いて切断したヒトゲノムD
NAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【０２１０】 各切断物からのDNAを、0.7％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブ
ラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハイブリ
ダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くた
め、例えば、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸
ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して
比較する。
【０２１１】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である（例えば、上記Baldeschweilerを参照）。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べること
が可能である。
【０２１２】 完全長のcDNA、発現遺伝子配列断片（EST）、或いはそれらの断片が、マイク
ロアレイの要素を構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、LASERG
ENEソフトウェア（DNASTAR）などの当分野で公知のソフトウェアを用いて選択す
ることが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のcDNA、EST、
或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するcDNAライブラリから任意に選択さ
れたcDNAを、ガラススライドなどの好適な基板に整列する。cDNAは、例えばＵＶ
交差結合（UV cross-linking）を利用してスライドに固定してから、熱処理及び
化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena, M. 他. (1995) Science
270:467-470; 及び Shalon, D. 他. (1996) Genome Res. 6:639-645を参照)。蛍
光プローブを準備して、基板上の要素にハイブリダイゼーションするために用い
る。上記した方法でこの基質を分析する。
【０２１３】 ８ 相補的ポリヌクレオチド CAPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然発
生のCAPの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の塩基
対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大き
な配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソ
フトウェア（National Biosciences）及びCAPのコーディング配列を用いて、適
切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′
配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコ
ーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオ
リゴヌクレオチドを設計して、リボソームがCAPをコードする転写物に結合する
のを阻害する。
【０２１４】 １０ CAPの発現 CAPの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行うこ
とができる。細菌でCAPが発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベル
を高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニング
する。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節要素に関連するT5ま
たはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモー
ターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、BL21
(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソ
プロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとCAPを発現する。真
核細胞でのCAPの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウ
イスルスとして知られているAutographica californica核多面性ウイルス(AcMNP
V)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組
換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらか
によって、CAPをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強
いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換え
バキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感
染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の
場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(例えば、Engelha
rd. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.
他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.を参照)。
【０２１５】 殆どの発現系では、CAPが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、
またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質
となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの
精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６キロ
ダルトンの酵素GSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で固
定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる(Amersham Pharmaci
a Biotech)。精製の後、GST部分を特定の操作部位でCAPからタンパク分解的に切
断できる。アミノ酸８個のペプチドであるFLAGで、市販のモノクロナール及びポ
リクロナール抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた免疫親和性の精製が可能とな
る。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-Hisによって、金属キレート樹
脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ausubel
(1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製したCAPを直接
用いて以下のアッセイを行うことができる。
【０２１６】 １０ 機能的アッセイ CAPの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのC
APをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現
する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。こ
のようなベクターには、pCMV SPORTTM (Life Technologies.)及びpCR 3.1 (Invi
trogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーター
を含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来の
ヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する。
更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に
形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入さ
れていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの
組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質には
、緑色蛍光タンパク質(GFP；Clontech)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパク
質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM
)を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細
胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、FCMで、先行した或い
は同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これ
らの現象には、プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって計測される核DNA内
容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測される
DNA合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及
び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細
胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞
計測法は、Ormerod, M. G.による (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, N
Y.に記載されている。
【０２１７】 遺伝子発現におけるCAPの影響は、CAPをコードする配列とCD64またはCD64-GFP
のどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することが
できる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロ
ブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換され
ない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビード
を用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分野で
公知の方法で細胞から精製することができる。CAP及び目的の他の遺伝子をコー
ドするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができ
る。
【０２１８】 １１ CAPに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990)
Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製
されたCAPを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す
。
【０２１９】 別法では、CAPアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解
析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを
用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する
親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で
周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。
【０２２０】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペプチド
シンセサイザABI 431Aペプチドシンセサイザー（Perkin-Elmer）を用いてfmoc法
のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（MBS）を用いた反応によりKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis M
O）に結合させて、免疫原性を高める(例えば、前出のAusubel, 1995を参照)。フ
ロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウ
サギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗CAP活性を検査する
には、ペプチドまたはCAPを基板に結合し、１％BSAを用いてブロックし、ウサギ
抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと
反応させる。
【０２２１】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生CAPの精製 自然発生CAP或いは組換えCAPを、CAPに特異的な抗体を用いるイムノアフィニ
ティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラム
は、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロ
マトグラフィー用レジンと抗CAP抗体とを共有結合させることにより構築する。
結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄する。
【０２２２】 CAPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、CAPを優先的に吸着で
きる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで
）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とCAPとの結合を切るような条件
で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸
塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、CAPを回収する。
【０２２３】 １３ CAPと相互作用する分子の同定 CAP又は生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬（例え
ば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識
する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したCAP
と共にインキュベートし、洗浄して、標識したCAP複合体を有する全てのウェル
をアッセイする。様々なCAP濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とCAPと
の関連、親和性、数について数値を計算する。
【０２２４】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施方法の様々な改変
は、特許請求の範囲に含まれる。
【０２２５】 （表の簡単な説明） 表１は、CAPの分析に用いたツール、プログラム、及びアルゴリズム、並びに
その説明、引用文献、閾値パラメーターを示す。
【表１】
【表２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 CAP-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engine
ering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｂ】 CAP-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engine
ering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｃ】 CAP-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engine
ering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｄ】 CAP-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engine
ering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｅ】 CAP-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engine
ering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｆ】 CAP-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engine
ering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図２Ａ】 CAP-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:5）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェアを用いて作成した。
【図２Ｂ】 CAP-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:5）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェアを用いて作成した。
【図２Ｃ】 CAP-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:5）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェアを用いて作成した。
【図２Ｄ】 CAP-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:5）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェアを用いて作成した。
【図２Ｅ】 CAP-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:5）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェアを用いて作成した。
【図３Ａ】 CAP-3のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）及び核酸配列（SEQ ID NO:6）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェアを用いて作成した。
【図３Ｂ】 CAP-3のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）及び核酸配列（SEQ ID NO:6）を示す。
このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェアを用いて作成した。
【図４Ａ】 CAP-1(インサイト社クローン1518859; SEQ ID NO:1)とラットdrs（v-srcによ
ってダウンレギュレートされた）遺伝子作成物（GI 1345423; SEQ ID NO:7）と
の間のアミノ酸配列アラインメントを示す。このアラインメントは、LASERGENE
ソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTAR, Madison
WI)を用いて作成した。
【図４Ｂ】 CAP-1(インサイト社クローン1518859; SEQ ID NO:1)とラットdrs（v-srcによ
ってダウンレギュレートされた）遺伝子作成物（GI 1345423; SEQ ID NO:7）と
の間のアミノ酸配列アラインメントを示す。このアラインメントは、LASERGENE
ソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTAR, Madison
WI)を用いて作成した。
【図５Ａ】 CAP-2(インサイト社クローン2616269; SEQ ID NO:2)とヒトBCR遺伝子タンパク
質（GI 487348; SEQ ID NO:8）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。こ
のアラインメントは、LASERGENE ソフトウェアのマルチシーケンスアラインメン
トプログラムを用いて作成した。
【図５Ｂ】 CAP-2(インサイト社クローン2616269; SEQ ID NO:2)とヒトBCR遺伝子タンパク
質（GI 487348; SEQ ID NO:8）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。こ
のアラインメントは、LASERGENE ソフトウェアのマルチシーケンスアラインメン
トプログラムを用いて作成した。
【図６】 CAP-3(インサイト社クローン3117642; SEQ ID NO:3)とヒトGAGE-7前立腺腫瘍
抗原（GI 3511023; SEQ ID NO:9）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す
。このアラインメントは、LASERGENE ソフトウェアのマルチシーケンスアライン
メントプログラムを用いて作成した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ｃ０７Ｋ 16/32 ４Ｃ０８４ Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/32 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 タング、ワイ・トム アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94545・ ヘイワード・ロックスプリングスドライブ 2045 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA13 FB02 FB03 FB07 FB08 4B024 AA01 AA12 BA45 BA80 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA01 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ42 QQ52 QR56 QR82 QS34 4B064 AG01 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 CE13 DA05 DA08 DA14 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA16 BA01 CA53 DA27 NA14 ZB07 ZB11 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA41 DA76 DA86 EA22 EA28 EA51 FA74 GA26

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたポリペプチドであって、 ａ）SEQ ID NO:2及びSEQ ID NO:3（SEQ ID NO:2−3）からなる一群から選択さ
    れたアミノ酸配列、 ｂ）SEQ ID NO:2−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９
    ０％の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、 ｃ）SEQ ID NO:2−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活
    性な断片、 またはｄ）SEQ ID NO:2−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原
    性断片を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 SEQ ID NO:2−3からなる一群から選択されたアミノ酸配列
    を含むことを特徴とする請求項１の単離されたポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチド。
  4. 【請求項４】 SEQ ID NO:5−6からなる一群から選択された配列を含むこ
    とを特徴とする請求項３の単離されたポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチドに機能的に結合するプロモー
    ター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項５の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞
    。
  7. 【請求項７】 請求項５の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生
    物。
  8. 【請求項８】 請求項１のポリペプチドを作製する方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１のポリペプチドを
    コードするポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換
    えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、 ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収するステップとを含むことを特徴
    とする請求項１のポリペプチドの製造方法。
  9. 【請求項９】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する単離された抗
    体。
  10. 【請求項１０】 単離されたポリヌクレオチドであって、 ａ）SEQ ID NO:5−6からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列、 ｂ）SEQ ID NO:5−6からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と少な
    くとも７０％の配列同一性を有する自然発生のポリヌクレオチド配列、 ｃ）前記ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、 またはｄ）前記ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする
    単離されたポリヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 請求項１０のポリヌクレオチドの少なくとも６０個の連
    続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１０のポリヌクレオチド配列を有するサンプル内
    の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を含む少なく
    とも１６個の連続するヌクレオチドを含むプローブと前記サンプルとをハイブリ
    ダイズするステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドとによ
    ってハイブリダイゼーション複合体が形成される条件の下で、前記プローブが前
    記標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、該ステップと、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在の有無を検出し、存在する場合
    には随意選択でその量を測定するステップとを含むことを特徴とする標的ポリヌ
    クレオチドを検出する方法。
  13. 【請求項１３】 前記プローブが少なくとも３０個の連続するヌクレオチ
    ドを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記プローブが少なくとも６０個の連続するヌクレオチ
    ドを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 有効量の請求項１のポリペプチド及び医薬的に容認でき
    る賦形剤を含む医薬品組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項１５の医薬品組成物を患者に投与することを含む
    、機能的CAPの発現の低下に関連する疾患やその症状の治療方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドのアゴニストとして効果的な化
    合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、 ｂ）前記サンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴と
    するスクリーニング方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７のスクリーニング方法によって同定されたア
    ゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む医薬品組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項１８の医薬品組成物を患者に投与することを含む
    、機能的CAPの発現の低下に関連する疾患やその症状の治療方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとして効果的
    な化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、 ｂ）前記サンプルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特
    徴とするスクリーニング方法。
  21. 【請求項２１】 請求項２０のスクリーニング方法によって同定されたア
    ンタゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む医薬品組成物。
  22. 【請求項２２】 請求項２１の医薬品組成物を患者に投与することを含む
    、機能的CAPの過剰な発現に関連する疾患やその症状の治療方法。
  23. 【請求項２３】 請求項４の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を効
    果的に変える化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと
    、 ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含むこと
    を特徴とするスクリーニング方法。
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