JP2003518953A

JP2003518953A - 核酸分析の方法

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Publication number: JP2003518953A
Application number: JP2001550413A
Authority: JP
Inventors: ジョエルエス．バデール，; スティーブンゴールド，; ウラジミルグセフ，; シュシャリ，; スレシュシェノイ，; オスワルドアール．クラスタ，; パスカルブフォール，
Original assignee: キュラジェンコーポレイション
Priority date: 2000-01-06
Filing date: 2001-01-05
Publication date: 2003-06-17
Also published as: CA2395341A1; WO2001049886A2; EP1244815A2; US20020015951A1; WO2001049886A8; WO2001049886A3

Abstract

(57)【要約】サンプル中において選択的に核酸を分析する方法が開示される。本方法は、核酸の集団において、標的配列の選択的同定を可能にする。例えば本方法は、定量的発現分析（ＱＥＡ）アッセイにおいて、暫定的に同定された核酸の同定を確認することを可能にする。本発明は、オリゴ競合ＱＥＡ手順の改善による核酸集団中の候補配列を同定するための、高感度かつ正確な方法の発見に一部基づく。本発明は、ＱＥＡ選択プロセスの増強を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）分子生物学研究および遺伝子研究が進歩するにつれ、遺伝子の一時的発現およ
び空間的発現が、健康および疾患の両方で生じるプロセスにおいて、重要な役割
を果たすことがますます明確になってきている。さらに、生物学の分野は、多数
のより複雑な障害（例えば、腫瘍形成）の病因における種々の環境要因に関する
複数の遺伝子欠陥の相互作用の重要性の理解に対して、単一の遺伝子欠陥が、伝
統的に認識されていた遺伝性の障害（例えば、地中海貧血症）をどのように起こ
すかという理解から進歩してきた。

【０００２】例えば、腫瘍形成の場合、現在の実験的証拠によって、いくつかの遺伝子の発
現における複数の欠損の役割が実証されている。他の複雑な疾患は、類似の病因
を有することが示されている。従って、遺伝子発現と疾患状態との間で確立され
得る、関係が、より完全かつ信頼性があるほど、疾患はより良好に認識、診断お
よび処置され得る。この重要な関係は、組織サンプル中のＤＮＡ発現の定量的決
定および分類によって確立され得る。

【０００３】ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）配列は、細胞のゲノムを構成する天然に存在す
るＤＮＡ配列である。任意の所定の時点の、ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）内の
遺伝子発現の全体的状態は、ｇＤＮＡの調節された転写によって合成される、細
胞のメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の組成によって示される。相補的Ｄ
ＮＡ（「ｃＤＮＡ」）配列は、ウイルスの逆転写酵素の使用によるｍＲＮＡの逆
転写のプロセスによって合成され得る。細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡはまた、
所定の時間に、細胞内で発現されたゲノム配列を示す。従って、特定のｃＤＮＡ
またはｇＤＮＡサンプル内のＤＮＡ配列の全ての迅速、経済的かつ非常に定量的
な検出を可能にする方法が、所望され得る。

【０００４】既存のｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ分析技術は、代表的には、単一の時点での、単
に１または２つの既知または未知の遺伝子配列の決定および分析に関する。これ
らの技術は、代表的には、単に１つの特定のＤＮＡ配列または遺伝子を（ハイブ
リダイゼーションのプロセスによって）特異的に認識するように合成されている
、プローブを用いてきた。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．１９９２．Ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔＤＮＡ，第７章（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ．）
を参照のこと。さらに、サンプル内の全ての配列の認識に対するこれらの方法の
適合は、よくても、非常に煩雑であり、そして経済的でない。

【０００５】未知の遺伝子を検出、単離および配列決定するための既存の方法の１つは、整
列された（アレイ化された）ｃＤＮＡライブラリーを用いる。特定の組織または
標品から、ｍＲＮＡを単離し、そして適切なベクター中にクローニングし、この
ベクターを、形質転換のプロセスを通じて細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中に導
入する。次いで、単一のｃＤＮＡ配列のクローンを保有する個々のベクターの子
孫が、別々に同定され得るような様式で、この形質転換した細菌を、プレートす
る。次いで、このようなプレートのフィルター「レプリカ（複製）」を（しばし
ば、目的の遺伝子を示すｃＤＮＡとハイブリダイズするように選択された標識さ
れたＤＮＡオリゴマーを用いて）探索し、そして目的のｃＤＮＡを保有する細菌
コロニーを同定し、そして単離する。次いで、このｃＤＮＡを抽出し、そしてそ
こに含まれるインサートを配列決定に供する。この配列決定は、ジデオキシヌク
レオチド鎖終止法を含むがこれに限定されないプロトコールを介する。Ｓａｎｇ
ｅｒ，Ｆ．，ら、１９９７．ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈＣｈａ
ｉｎＴｅｒｍｉｎａｔｉｎｇＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４（１２）：５４６３〜５４６７を参照のこと。

【０００６】未知の遺伝子のためのコロニー選択プロトコールで用いるオリゴヌクレオチド
プローブは、好ましくは、目的の遺伝子のｃＤＮＡとのみハイブリダイズするよ
うに合成する。この特異性を獲得する方法の１つは、目的の遺伝子のタンパク質
産物を用いて開始することである。目的のタンパク質の活性領域由来（すなわち
、５〜１０アミノ酸残基を含むペプチドフラグメント由来）の部分配列が、決定
され得る場合、このペプチドフラグメントをコードする、対応する１５〜３０ヌ
クレオチド（ｎｔ．）縮重オリゴヌクレオチドが合成され得る。従って、縮重オ
リゴヌクレオチドの回収物は、代表的に、対応する遺伝子を特有に同定するため
に十分である。同様に、１５〜３０ヌクレオチド部分配列をもたらすいずれかの
情報を用いて、単一の遺伝子プローブを作製し得る。

【０００７】組織サンプルから調製されたｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ中の既知の遺伝子を検索
する、別の既存の方法はまた、既に既知の遺伝子配列の特有の部分配列に相補的
である、単一遺伝子または単一配列オリゴヌクレオチドプローブを用いる。例え
ば、サンプル中の特定の癌遺伝子の発現は、癌遺伝子の発現された配列タグの部
分配列由来のプローブを用いて、組織由来ｃＤＮＡを探索することによって決定
され得る。珍しいかまたは培養することが困難な病原体（例えば、結核を起こす
細菌）の存在はまた、この病原体によって保有される遺伝子に特異的なハイブリ
ダイゼーションプローブを用いてｇＤＮＡを探索することによって決定され得る
。同様に、表現型が正常な個体における変異体対立遺伝子のヘテロ接合性（異種
接合性）の存在、または胎児におけるそのホモ接合性（同種接合性）の存在は、
変異体対立遺伝子のみに相補的である、対立遺伝子特異的プローブの利用によっ
て決定され得る（例えば、Ｇｕｏ，Ｎ．Ｃ．ら、１９９４．ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ２２：５４５６〜５４６５を参照のこと）。

【０００８】現在、単一遺伝子プローブを用いる既存の方法論の全ては、所定の組織サンプ
ル内で発現された遺伝子の全てを決定するように適用される場合、何千から何万
もの個々のプローブを必要とする。単一のヒト細胞は、代表的に、約５，０００
〜１５，０００遺伝子を発現すること、そして最も複雑なタイプの組織（例えば
、脳組織）は、ヒトゲノム内に含まれる総遺伝子の１／２までを発現し得ること
が、見積もられている。Ｌｉａｎｇら、１９９２を参照のこと。「Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｌＤｉｓｐｌａｙｏｆＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＭｅｓｓｅｎｇ
ｅｒＲＮＡｂｙＭｅａｎｓｏｆｔｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈ
ａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ連鎖反応の手段による、真核生物メッ
センジャーＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ２５
７：９６７〜９７１を参照のこと。このような多数のプローブを必要とするスク
リーニング方法は、経済的にも実際上でも煩雑すぎる。

【０００９】対照的に、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−
ｂｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（「ＳＢＨ」）として公知の、既存の方法
の別のクラスは、遺伝子特異的でないコンビナトリアルプローブを用いる。例え
ば、Ｄｒｍａｎａｃら、１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１６４９〜１６５
２；Ｄｒｍａｎａｃらの、米国特許第５，２０２，２３１号を参照のこと。未知
の遺伝子の決定のためのＳＢＨの例示的な実行のためには、単一のｃＤＮＡクロ
ーンが所定の長さのＤＮＡオリゴマーの全て（言ってみれば、例えば、全て６ヌ
クレオチドのオリゴマー）で探索され得ることが必要である。いずれの型の選択
もなしに合成される所定の長さの１セットのオリゴマーは、コンビナトリアルプ
ローブライブラリーと呼ばれる。ｃＤＮＡクローンについての部分的ＤＮＡ配列
は、所定のコンビナトリアルライブラリーのハイブリダイゼーションの結果（す
なわち、６ヌクレオチドの長さを有する４０９６のオリゴマープローブのハイブ
リダイゼーション結果）からのアルゴリズム操作によって再構築され得る。しか
し、完全なヌクレオチド配列は、決定できない。なぜなら、反復された部分配列
は、定量的な様式に完全に割り当てられられないからである。

【００１０】既知の遺伝子の同定に適合されたＳＢＨは、オリゴマー配列サイン（ｏｌｉｇ
ｏｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｇｎａｔｕｒｅ）（「ＯＳＳ」）と呼ばれる
。例えば、Ｌｅｎｎｏｎら、１９９１．ＴｒｅｎｄｓＩｎＧｅｎｅｔｉｃｓ
７（１０）：３１４〜３１７を参照のこと。ＯＳＳは、コンビナトリアルライ
ブラリー全体または有意なサブライブラリーに対する探索「ヒット」（すなわち
、ハイブリダイゼーション）のパターンに基づいて単一のクローンを分類する。
この方法は、この組織サンプルライブラリーがクローン中で整列（アレイ化）さ
れる必要がある。ここでは、各クローンは、このライブラリーから単一配列のみ
を含む。この技術は、配列の混合物には適用され得ない。

【００１１】これらの以前の、例示的方法論は、全て、クローンのアレイにおいて１つの配
列を見出すことに関する。この各クローンは、所定の組織サンプルから単一の配
列を発現する。従って、それらは、代表的には、配列の混合物（例えば、特定の
総細胞ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡサンプル）中で全てのＤＮＡ配列の、迅速で、経
済的で、定量的で、かつ正確な特徴づけには関連しない。そしてこのような仕事
へのそれらの方法の適応は、不可である。１クローンのＤＮＡを配列決定するこ
とによる決定、ましてや数千のゲノム配列のサンプル全体を配列決定することに
よる決定は、経済的かつ有用な診断に十分なほど、迅速でも安価でもないかもし
れない。既存の遺伝子決定または分類のプローブベースの技術は、この遺伝子が
、既知であれ、未知であれ、何千ものプローブ（各々が観察されるべき可能性の
ある遺伝子の１つに特異的である）、またはコンビナトリアルライブラリー中の
少なくとも数千または数万ものプローブを必要とする。さらに、これらの前述の
方法の全ては、サンプルがクローン（各々がこのサンプルの単一の遺伝子を発現
する）内に整列（アレイ化）されることを必要とする。

【００１２】上記の遺伝子決定および分類技術と対照的に、ディファレンシャルディスプレ
イとして公知の別の方法は、プールされたｃＤＮＡライブラリー中に見出される
ような発現された遺伝子の混合物を、「フィンガープリント」しようとする。し
かし、この「フィンガープリント」は、２つのサンプルが同じかまたは異なるか
を単に確認しようとするものである。特定の遺伝子の定量的発現または定性的発
現でさえ決定する試みはされていない。例えば、Ｌｉａｎｇら、１９９５．Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７４〜２８０；Ｌｉａｎｇら、１９９
２．Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６７〜９７１；Ｗｅｌｓｈら、１９９２．Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２０：４９６５〜４９７０；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、
１９９３．Ｅｘｓ．６７：１０３〜１１５およびＬｉｓｉｔｓｙｎ，１９９３．
Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：９４６〜９５０を参照のこと。ディファレンシャルデ
ィスプレイは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を用いて、種々の長さのＤ
ＮＡ部分配列を増幅する。次いで、このＤＮＡ部分配列は、随意に選択されたプ
ライマーのアニーリング部位の間の存在によって規定される。ポリメラーゼ連鎖
反応方法および装置は周知である。例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；
同第４，６８３，１９５号；同第４，９６５，１８８号；同第５，３３３，６７
５号（各々が本明細書において参考として詳細に援用されている）を参照のこと
。理想的には、観察された長さのパターンは、特定の組織（この組織からライブ
ラリーがもともと調製された）の特徴である。代表的には、ディファレンシャル
ディスプレイ中で用いたプライマーの１つは、オリゴ（ｄＴ）であり、そして他
方は、１つ以上の随意のオリゴヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは
、このライブラリー中のｃＤＮＡの２００〜３００塩基対（ｂｐ）内のホモポリ
マー性ポリ−ｄＡテールにハイブリダイズするように設計されている。それによ
り、電気泳動分離の際、２００〜３００塩基対までの長さの増幅されたフラグメ
ントは、このサンプルの特徴であり特有であるバンドを生じるはずである。さら
に、この組織内の遺伝子発現の変化は、このｃＤＮＡバンドの１つ以上における
変化として観察され得る。

【００１３】示差的発現方法において、特徴的な電気泳動バンド形成パターンが発達するが
、特定の遺伝子の発現に対してこれらのパターンを定量的に「リンクする」こと
試みられていない。同様に、第二の随意的プライマーはまた、以下の理由によっ
て特定の遺伝子に対して追跡され得ない。第一に、このＰＣＲプロセスは、完全
な特異性ではない。１〜数個の塩基対不適合（ミスマッチ）が、より低いストリ
ンジェンシーのアニーリング工程によって可能になる。この工程は、代表的に、
この方法において用いられ、そして一般に、新しい鎖がＰＣＲ反応においてしば
しば用いられるＴａｑポリメラーゼによって実際に開始され得るように十分許容
される。第二に、単一の部分配列の位置（またはその部分配列がないこと）は、
全ての発現された遺伝子を識別するのに不十分である。第３に、得られた塩基対
長の情報（すなわち、随意のプライマーからポリｄＡテールまで）は、一般に、
以下に起因して配列の特徴であるとは見いだされない：（ｉ）遺伝子の３’−非
翻訳領域のプロセシングにおけるバリエーション、（ｉｉ）ポリアデニル化プロ
セスにおけるバリエーション、および（ｉｉｉ）正確な位置での繰り返し配列に
対するプライミングにおける可変性。従って、頻繁に生成されるバンドでさえ、
多くの非特異的なバックグラウンドの配列によってスメアーである。

【００１４】さらに、高いＧ＋Ｃ含量および短い配列を有する核酸配列に対する既知のＰＣ
Ｒの偏り（バイアス）は、さらにこの方法の特異性を制限する。従って、この技
術は、一般に、類似性または相違点決定のためのサンプルの「フィンガープリン
ト」に限定され、そして同定可能な遺伝子の示差的発現の定量的決定における用
途からは除外される。

【００１５】基準（参照）状態と、特定の疾患、病状または実験的操作の特徴的状態との間
の、示差的に発現された遺伝子のレパートリーを確立するためのさらなる方法と
しては、定量的発現分析（ＱＥＡ）の使用が挙げられる。このような手順は、ゲ
ノムＤＮＡ、あるいは、ｍＲＮＡ（このようなｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ調製物に
おいて反映されるように）の部分の組織サンプルにおける示差的発現を検出し得
る。ＱＥＡ手順は、例えば、その全体が参考として本明細書に援用されている、
米国特許第５，８７１，６９７号、ならびにＳｈｉｍｋｅｔら、「Ｇｅｎｅｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｂｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｐｒｏ
ｆｉｌｉｎｇｃｏｕｐｌｅｄｔｏａｇｅｎｅｄａｔａｂａｓｅｑｕ
ｅｒｙ」、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：１９８〜８０３
（１９９９）において開示されている。要するに、ＱＥＡは、ゲノムＤＮＡまた
はｃＤＮＡ（その配列が一般に、その検討が始められる時点で知られていない）
のフラグメントの生成に依存する。このフラグメントは、二本鎖核酸配列の一方
の末端で特定のオリゴマー性部分配列を、そしてこの二本鎖配列の第二の末端で
第二のオリゴマー性部分配列を認識することによって得られる。このようなフラ
グメントが増幅され、そして特別に設計されたプライマーおよびリンカーを用い
て標識される。このプライマーおよびリンカーは、増幅したフラグメントを提供
する。そのフラグメントの同定可能な特徴としては、フラグメントの長さによっ
て提供される特定のサイズ、およびこのリンカーによって加えられた任意のさら
なる塩基の計算、このプライマーおよび／またはリンカーにおいて始まる増幅さ
れたフラグメントに通常含まれた標識、ならびに初めに使用された元の部分配列
によって提供された２つの末端での末端配列、そしてこのリンカーに含まれたヌ
クレオチドが挙げられる。この標識は、フラグメントの存在を検出することを意
図した手順において、このフラグメントの存在を検出することを可能にする。こ
れによりこの検出は、このフラグメントに長さまたはサイズ（ここで、「長さ」
および「サイズ」は、互換可能に用いられる）を割り当てる工程を包含する。高
い精度でこのフラグメントのサイズを決定した後、フラグメント全体の完全な配
列は、核酸配列の概要を含む適切なデータベースを参照して、同定されやすくな
り、その結果、任意の同定された配列は、ＱＥＡ手順によって提供された長さお
よび末端配列を含む。

【００１６】記載されたとおり、ＱＥＡの適用においては困難性が生じる。このような困難
性によって、ＱＥＡ手順によって提供された情報に基づく所定のフラグメントに
ついての特有の長さ−配列の組み合わせの同定、分類、または定量においてあい
まいさが生じ得る。共通して困難なのは、長さ−部分配列の組み合わせを満たす
、より多くのフラグメントがサンプルによって提供され得ることである。あるい
は、ＱＥＡ実験によって提供される長さ−部分配列の組み合わせは、問い合わせ
られたデータベースに存在しないかもしれない。従って、いずれかの状況では、
確認手順が、提供され得る。このような確認は、既知の部分配列およびリンカー
情報を用いて、所定のＱＥＡフラグメントを増幅することが意図される増幅反応
が、２つの別のサンプル中で実行される方法によって実施され得る。この第一の
サンプルには、いずれの競合プライマーも存在せず、そして第二のサンプルには
、第一のものと同じ部分配列およびリンカー情報を提供するプライマーおよび／
またはリンカーが存在するが、標識された成分を含まない。非標識成分の存在は
、標識された成分を効率的に競合し、そしてＱＥＡ手順において検出できない増
幅産物を提供する。この手順は、本明細書において「位置決め（ポジショニング
）」と呼ばれ得、そして上記のあいまいさの一部または全てを減らすことにより
、ＱＥＡ実験において同定されたフラグメントを確認することを意図する。位置
決め（ポジショニング）は、ＷＯ９９／０７８９６において開示されており、そ
してその全体が、参考として本明細書に援用されている。

【００１７】（発明の要旨）本発明は、オリゴ競合ＱＥＡ手順の改善による核酸集団中の候補配列を同定す
るための、高感度かつ正確な方法の発見に一部基づく。本発明は、ＱＥＡ選択プ
ロセスの増強を可能にする。

【００１８】１つの局面において、本発明は、異なるヌクレオチド配列を有する多数の核酸
を含むサンプル中の、１つ以上の核酸を同定、分類、または定量するための方法
を特徴とする。この方法は、１つ以上の認識手段を用いてサンプルを探索する工
程を包含し、ここで、各認識手段は、異なる標的ヌクレオチド部分配列または標
的ヌクレオチド部分配列の異なるセットを認識して、１つ以上の標的核酸を提供
する。１つ以上の第１のシグナルは、この認識手段によって探索されたサンプル
から産生される。各産生された第１のシグナルは、サンプル中の標的核酸から生
じ、そして、（ｉ）標的核酸の標的部分配列の出現間の長さ、および（ｉｉ）標
的核酸中の標的部分配列の同一性、または標的核酸中の標的部分配列間に含まれ
る標的部分配列の同一性の提示を含む。１つ以上の標的核酸が、それらの対応す
る第１のシグナルに基づいて選択される。

【００１９】選択された標的核酸中の１つ以上の標的部分配列からの配列情報は、１つ以上
のヌクレオチドによって伸長されており、このヌクレオチドは、サンプル中で、
選択された標的核酸から生じる１つ以上の第２のシグナルを産生する条件下で（
ここで、この選択された標的核酸のうちの少なくとも１つは、伸長される）、１
つ以上の伸長された部分配列を提供する。第２のシグナルは、（ｉ）核酸中の標
的部分配列（このうちの少なくとも１つは、伸長されている）の出現間の長さ、
および（ｉｉ）選択された標的核酸中の選択された標的部分配列（このうちの少
なくとも１つは、伸長されている）の同一性、または選択された標的核酸中の標
的部分配列間に含まれる標的部分配列（このうちの少なくとも１つは、伸長され
ている）の同一性の提示を含む。

【００２０】次いで、ヌクレオチド配列データベースが検索されて、少なくとも１つの伸長
部分配列を有しそして産生された第２のシグナルによって提示される１つ以上の
選択された標的核酸と一致する配列を決定するか、または少なくとも１つの伸長
部分配列を有しそして産生された第２のシグナルによって提示される１つ以上の
選択された標的核酸と一致する任意の配列が存在しないことを決定する。データ
ベースとしては、サンプル中に存在し得る核酸の、複数の公知ヌクレオチド配列
を含む。このデータベースからの配列が、以下の両方：（ｉ）産生されるシグナ
ルによって示されるように、標的部分配列（このうちの少なくとも１つは、伸長
されている）の出現間での同じ長さ、および（ｉｉ）産生されるシグナルによっ
て示されるように、同じ標的部分配列（このうちの少なくとも１つは、伸長され
ている）、または産生されるシグナルによって示される標的部分配列の同じセッ
トのメンバーである標的部分配列（このうちの少なくとも１つは、伸長されてい
る）を有する場合、データベースからの配列は産生される第２のシグナルを提供
する選択された標的核酸の一致を決定する。

【００２１】第２の産生されるシグナルは、例えば、陰性オリゴ競合シグナルまたは陽性オ
リゴ競合シグナルであり得る。

【００２２】いくつかの実施形態において、配列情報の伸長は、核酸サンプルをオリゴヌク
レオチド混合物と接触させることを含み、この混合物は、（ｉ）その各々のヌク
レオチド配列が標的部分配列を含む、標識プライマーのセット、および（ｉｉ）
その配列が（ｉ）で同定された標的部分配列のうちの１つ、続いて少なくとも１
つのさらなるヌクレオチドを含む、非標識プライマーを含む。配列情報の所望の
伸長には、核酸サンプルをオリゴヌクレオチドの混合物と接触させることを含み
得、この混合物は、（ｉ）各々のヌクレオチド配列が標的部分配列を含む、第１
の非標識プライマーおよび第２の非標識プライマーを含むセット、ならびに（ｉ
ｉ）その配列が第１の非標識プライマーの部分配列を含む標識された第３のプラ
イマー、およびその配列が少なくとも１つのヌクレオチドによって伸長される第
２の非標識プライマーの部分配列を含む標識された第４のプライマー、を含むセ
ットを含む。

【００２３】いくつかの実施形態において、産生されたシグナルのうちの少なくとも１つは
、配列データベース中に存在する配列の大きさおよび標的部分配列を有する配列
に対応する。

【００２４】いくつかの実施形態において、この方法は、シグナルを産生するサンプル中の
核酸フラグメントを回収すること、このフラグメントについて少なくとも一部の
配列を決定するためにこのフラグメントを配列決定すること、および決定された
配列の少なくとも一部を含む配列を有する核酸を含むサンプルを評価することを
含む。

【００２５】好ましい実施形態において、核酸の大多数はＤＮＡである。この方法は、サン
プルを１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化すること（ここで、この制限エ
ンドヌクレアーゼは、標的部分配列である認識部位を有し、そしてこの消化末端
に一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを残す）、二本鎖アダプター核酸を消化さ
れたサンプルフラグメントとハイブリダイズすること（このアダプター核酸は、
一本鎖オーバーハングの一方に相補的な末端を有する）；およびアダプター核酸
の相補末端を消化されたサンプルフラグメントの鎖の相補５’末端に連結して、
連結核酸フラグメントを形成することを含む。

【００２６】いくつかの実施形態において、伸長部分配列は、非標識である。

【００２７】さらなる局面において、本発明は、異なるヌクレオチド配列を有する複数の核
酸を含むサンプルにおいて、１つ以上の核酸の長さ−部分配列の組合わせで配列
を伸長するための方法である。この方法は、サンプルを１つ以上の認識手段で探
索することを含む。各認識手段は、異なる標的ヌクレオチド部分配列または標的
ヌクレオチド部分配列の異なるセットを認識して、１つ以上の標的核酸を提供す
る。

【００２８】この認識手段によって探索されたサンプル由来の１つ以上の第１のシグナルが
、産生される。各産生された第１のシグナルは、サンプル中の標的核酸から生じ
、そして、（ｉ）標的核酸の標的部分配列の出現間の長さ、および（ｉｉ）標的
核酸中の標的部分配列の同一性、または標的核酸中の標的部分配列間に含まれる
標的部分配列の同一性の提示を含む。その対応する第１のシグナルに基づく１つ
以上の標的核酸が、選択され、そしてこの標的核酸中の１つ以上の標的部分配列
からの配列情報は、１つ以上の伸長部分配列を提供する１つ以上のヌクレオチド
によって伸長される。

【００２９】伸長は、サンプル中で、選択された標的核酸から生じる１つ以上の第２のシグ
ナルを産生する条件下で実施され、その部分配列のうちの少なくとも１つが伸長
されている。第２のシグナルは、（ｉ）核酸中の標的部分配列（このうちの少な
くとも１つは、伸長されている）の出現間の長さ、および（ｉｉ）選択された標
的核酸中の標的部分配列（このうちの少なくとも１つは、伸長されている）の同
一性、または選択された標的核酸中の標的部分配列間に含まれる標的部分配列（
このうちの少なくとも１つは、伸長されている）の同一性の提示を含む。サンプ
ル中の一致した核酸は、長さ−部分配列の組合わせで伸長配列を有する。

【００３０】いくつかの実施形態において、第２の産生されたシグナルは、陰性オリゴ競合
シグナルである。他の実施形態において、第２の産生されたシグナルは、陽性オ
リゴ競合シグナルである。

【００３１】いくつかの実施形態において、配列情報の伸長は、核酸サンプルをオリゴヌク
レオチド混合物と接触させることを含み、この混合物は、（ｉ）その各々のヌク
レオチド配列が標的部分配列を含む、標識プライマーのセット、および（ｉｉ）
その配列が（ｉ）で同定された標的部分配列のうちの１つ、続いて少なくとも１
つのさらなるヌクレオチドを含む、非標識プライマーを含む。例えば、配列情報
の伸長は、核酸サンプルをオリゴヌクレオチドの混合物と接触させることを含み
得、この混合物は、（ｉ）その各々のヌクレオチド配列が標的部分配列を含む、
第１の非標識プライマーおよび第２の非標識プライマーを含むセット、ならびに
（ｉｉ）その配列が第１の非標識プライマーの部分配列を含む標識された第３の
プライマー、およびその配列が少なくとも１つのヌクレオチドによって伸長され
る第２の非標識プライマーの部分配列を含む標識された第４のプライマーを含む
セット、を含む。

【００３２】本発明の利点の間にあるのは、本発明が、非常に正確かつ感度の高い、ゲノム
ＤＮＡサンプルまたはｃＤＮＡサンプル中の部分配列（これにより、得られたフ
ラグメントに存在する部分配列は、意図された部分配列と異なる）の同定、分類
、または定量を可能にすることである。本発明はまた、ＱＥＡ手順における正確
な連結および／またはプライミングを可能にする。さらに、この方法は、類似す
るが異なるサイズのフラグメントおよび関連する実験的に困難なことを解決する
サイズ分画手順を提供する。

【００３３】本発明は、さらに、ＱＥＡ分析において末端部分配列の明白な同定を可能にす
る。さらに、本発明は、単一遺伝子フラグメントが配列の不明確さを伴わずに提
供されるＱＥＡ手順を実行することを可能にする。

【００３４】本明細書中に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当
業者によって通常理解される意味を同じ意味を有する。本明細書中に記載される
方法および材料に類似または等価な方法および材料が本発明の実施に使用され得
るが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本願内の任意の引用文献
の引用または同定は、このような引用文献が本発明の先行技術として利用可能で
あることを認定すると解釈されるべきではない。本明細書中に言及される全ての
刊行物は、本明細書中にその全体が参考として援用される。

【００３５】（発明の詳細な説明）本発明は、２本鎖ＱＥＡフラグメントの２つの末端のうちの１端または両端に
おいて、さらなるヌクレオチド位置数まで３’方向に内向きで、既知の部分配列
を伸長するための方法を提供する。本明細書中に開示される一般的な方法は、「
オリゴ競合（ｏｌｉｇｏ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）」「伸長オリゴ競合（ｅｘ
ｔｅｎｄｅｄｏｌｉｇｏ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）」または「トレースオリ
ゴ競合（ｔｒａｃｅｏｌｉｇｏ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）」または類似の用
語で称され得る。伸長は、増幅工程において、プライマーとして、本来既知の部
分配列の３’末端にさらなる塩基を含む競合オリゴヌクレオチドを使用すること
によって達成される。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書中において「
伸長（された）」オリゴヌクレオチドを言われる。既知の部分配列に対して３’
の塩基の同一性は、最初は知られていないので、この塩基の同一性は、４つの可
能性のある天然に存在する塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のうちの任意の１つで
あり得る。４つ別々のオリゴヌクレオチド競合の進行は、平行して実施され、各
々は、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴの
いずれかを有する。これらは標識されていないので、伸長されたオリゴヌクレオ
チドによって標的化されるフラグメントの検出の減少または消失を提供する、４
つの伸長オリゴヌクレオチドプライマーのうちの特定の１つが、本来の部分配列
の３’末端に正確なさらなる塩基を同定する。

【００３６】既知の部分配列は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡサンプル中の部分配列を同定
するための当該分野で公知の方法に基づいて、任意の長さを有し得る。好ましい
実施形態において、これらの既知の部分配列は、種々の制限エンドヌクレアーゼ
の認識配列によって提供される。従って、例えば、部分配列の長さは、約４ヌク
レオチドから８ヌクレオチド程度までの範囲であり得る。従って、フラグメント
の１末端における本発明の伸長オリゴ−競合の１サイクルの操作は、１ヌクレオ
チドごとに既知の部分配列の長さを伸長し；例えば、４塩基の最初の既知の部分
配列は、５塩基の伸長された既知の配列になるか、または８塩基の最初の既知の
部分配列は、９塩基の伸長された既知の配列になる。この手順は、フラグメント
の各末端において、各サイクルについて４の因数で最終伸長部分配列中の多義性
を減少する。

【００３７】図１は、本明細書中に記載されるＰＣＲ手順によって調製される二本鎖ＱＥＡ
フラグメントを示す。このフラグメントは、検出を容易にするためにＦＡＭ標識
によって１つの鎖の１端で標識され、単離を容易にするためにビオチン標識によ
って相補鎖上の第２の末端で標識される。各末端に特異的な部分配列は、Ｊ部分
配列（Ｊ特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列に対応する）、Ｒ部分
配列（Ｒ特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列に対応する）と呼ばれ
る。

【００３８】伸長オリゴ競合の重要な実施形態は、以下のように記載され得る（図１を参照
のこと）。ＱＥＡプロセス（あるいは、本明細書中において「ＧｅｎｅＣａｌｌ
ｉｎｇ^ＴＭ」と称される）は、ａ）２つの異なる制限酵素を用いたｃＤＮＡの断
片化、ｂ）フラグメントの１端におけるＦＡＭ−標識化ＤＮＡアダプター（Ｊア
ダプター）への制限フラグメントの連結およびフラグメントの第２の末端におけ
るビオチン標識ＤＮＡアダプター（Ｒアダプター）の連結；ｃ）２つのアダプタ
ー分子内に含まれる配列に特異的なプライマーを用いた連結ＤＮＡ分子のポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅であって、これは、約３００の蛍光ＤＮＡのフラ
グメント（定量的発現分析バンド、またはＱＥＡバンドと呼ばれる）の産生を導
く；ｄ）ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ上のビオチン標識フラグメ
ントの精製；およびｅ）サイズラダーの存在下での、この精製されたＱＥＡバン
ドのキャピラリー電気泳動による、このフラグメントのサイズの決定を含む。電
気泳動工程は、本来のｃＤＮＡプール中の各フラグメント中に含まれる（０．２
ｂｐ内の塩基対の）配列の長さ、ならびにその正確な存在量（ピークの高さとし
て）を提供する。ｃＤＮＡ制限フラグメントの長さおよびこのフラグメントを産
生するために使用された２つの制限酵素の同一性に基づいて、可能性のある遺伝
子の列挙が、この制限フラグメントを有することが推測される遺伝子に関して公
知のデータベースおよび独自のデータベースを問い合わせすることによって作製
される。

【００３９】バンドの同一性の確認は、３つのプライマー（ＦＡＭ標識プライマーのＪ２３
、ビオチン標識プライマーのＲ２３、および５０倍モル過剰の第３の非標識プラ
イマー（オリゴ競合プライマーとして公知）（図３を参照のこと）を用いた上記
のＱＥＡバンドを用いた競合ＰＣＲ反応を含む。このオリゴ競合プライマーは、
その５’末端にＪプライマー（Ｊオリゴ競合プライマーの場合）またはＲプライ
マー（Ｒオリゴ競合プライマーの場合）のいずれかと５塩基の重複を共有し、こ
れに制限酵素部分配列、およびその３’末端に遺伝子特異的配列を含む９〜１１
ヌクレオチド領域が続く。後者の配列は、先行の段落において記載されたデータ
ベースの検査工程後に提供された遺伝子同定に由来する。Ｒ２３プライマーとの
ＰＣＲ反応に関与するための、Ｆａｍ標識Ｊオリゴ競合プライマーとの間の競合
は、約３００の他のＱＥＡフラグメントの環境中にＧｅｎｅＣａｌｌｅｄ^ＴＭピ
ークのみを含む。従って、ＧｅｎｅＣａｌｌが正確である場合、オリゴ競合プラ
イマーの設計は、特定のピークに対して非標識ＰＣＲ産生物を提供するが、全て
の他のＦａｍ標識ピークの産生は影響されない。オリゴ競合ＰＣＲ反応は、競合
しない対応物（Ｆａｍ−Ｊ２３プライマーおよびビオチンＲ２３プライマーのみ
を用いたＰＣＲ反応の産生物）に対してオリゴ競合ＰＣＲ蛍光のトレースを比較
することによって可視化される。好首尾なオリゴ競合において、全てのピークは
、オリゴ競合プライマーが設計されたピーク以外の、両方のトレースにおいて反
復される。ＱＥＡピークのＧｅｎｅＣａｌｌが正確でない場合、設計されたプラ
イマーは、ピーク中に含まれる遺伝子とは異なる遺伝子に特異的である。従って
、好首尾でないオリゴ競合反応において、オリゴ競合されたトレースおよびオリ
ゴ競合されていないトレースの両方は、同一である。

【００４０】本発明は、新規オリゴ競合プライマー（オリゴ競合プライマーと呼ばれる）を
記載し、これは、この方法の所定のサイクルにおいて、ｃＤＮＡ中に１つのオリ
ゴヌクレオチドのみを伸長して、このヌクレオチドの同一性を決定する（図５を
参照のこと）。従って、選択された部分配列の３’末端における塩基が例えばＡ
であるオリゴ競合反応（段階反応（ｐｈａｓｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎ）と呼ば
れる）の場合、段階反応は、その３’末端にＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴヌクレオチド
のいずれかを有するオリゴ競合プライマーを用いて実行されて、どのＱＥＡピー
クがその３’プライム末端にＡを有するフラグメントに対応するかを決定し、制
限部位のその最初のヌクレオチド３’としてこのヌクレオチドを有する全てのピ
ークは、非標識プライマーによって位置付けられ、そして検出されないままであ
る。その３’末端でオリゴ競合プライマーによってＡと競合した反応のみが、減
少したシグナルを提供し、このようにしてＡは、次の３’ヌクレオチドとして同
定される。Ｊ制限側において４つの平行した段階反応を設定することによって（
各々は、３’末端がＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴで終わるオリゴ競合プライマーを用い
る）、そしてさらなるＲ末端上での４つの平行した段階反応によって、両方の制
限酵素認識部分配列の３’側のヌクレオチドの同一性が、決定され得る。さらな
るサイクルにおいて、各制限酵素部分配列部位の３’末端から取り出された第２
の位置におけるヌクレオチドがまた、その３’末端にジヌクレオチドＸＡ、ＸＣ
、ＸＧ、またはＸＴ（Ｘは、ここで、先行のサイクルで既に同定された特的の塩
基を表す）を有するオリゴ競合プライマーを用いることによって上記のような段
階反応に類似した段階反応を実施することによって同定され得る。あるいは、第
１のヌクレオチド位置は、その３’末端において４つの塩基のうちのいずれか、
すなわちＮＡ、ＮＣ、ＮＧ、またはＮＴ（Ｎは、ここで、任意のヌクレオチドま
たは４つのヌクレオチドの混合物を表す）で占有され得る。Ｎはまた、不正確な
塩基であり得るか、またはＩのような普遍的に対合する塩基であり得る。本考察
において、オリゴ競合プライマーによって標的化されるフラグメントのＪ部位お
よびＲ部位の各々における、２サイクルの方法の操作は、４つのさらなるヌクレ
オチドの同一性を提供する（２つのヌクレオチドは、Ｊ制限酵素部位の３’であ
り、そして２つのヌクレオチドは、Ｊ制限酵素部位の３’である）。従って、各
ピークに関する所定の遺伝子ＧｅｎｅＣａｌｌ^ＴＭ列挙に由来するようなフラグ
メントを同定する際の不明確さは、４^４（すなわち、２５６）の因数によって正
確にされ、ほとんど特有な部分配列長の組合わせを導き、制限フラグメントの本
質的に明白な遺伝子同定を可能にする。

【００４１】（実施例）本発明は、以下の実施例（これは、添付の特許請求の範囲を限定しない）にお
いてさらに例示される。

【００４２】（実施例１．伸長オリゴ競合方法において使用される制限エンドヌクレアーゼ
の特徴）表１は、試験された全ての制限酵素およびプライマー設計に使用されたこれら
のモジュールを示す。表１に示されるモジュールは、所定のエンドヌクレアーゼ
によって触媒される非対称切断から生じる一本鎖オーバーハングである。

【００４３】（表１．試験された制限モジュールの列挙）

【００４４】

【表１】表２は、制限酵素部位がＪ側またはＲ側にある酵素の同定とともに試験された
全ての制限酵素対を示す。

【００４５】（表２．試験された制限酵素二重消化の列挙）

【００４６】

【表２】（実施例２．ＱＥＡ消化に適用される伸長オリゴ−競合）（プライマー設計（図１を参照のこと））１．Ｆａｍ標識Ｊ２３：Ｊ２３プライマーは、その５’末端をＦａｍで標識し
、そして以下の配列を有する：５’ ＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＡＴ
ＧＡＡＧ３’（配列番号１）。

【００４７】２．ビオチン−Ｒ２３プライマーは、その５’末端をビオチンで標識し、そし
て以下の配列を有する：５’ ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧ
Ａ３’（配列番号２）。

【００４８】オリゴ−競合プライマー。競合プライマーは、ＪアダプターまたはＲアダプタ
ーの３’部分から構成される標識されていないオリゴヌクレオチドであり（図１
）、制限酵素部分配列の最後の５ヌクレオチドによって与えられるモジュールに
融合され、そして１つまたは２つの識別塩基で終結する（表３を参照のこと）。
具体的には、Ｊ末端オリゴ−競合プライマーの配列（５’末端で開始する）は、
制限酵素認識配列の最後の５ヌクレオチドにＪの３’末端が連結した少なくとも
１４ヌクレオチドを共有する。これらは、競合の最初のサイクルにおける使用の
ために、４つの識別ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）の１つで終結する。
制限酵素認識配列の３’末端から除去されたヌクレオチド２塩基の同一性を調査
する段階反応（ｐｈａｓｉｎｇ）プライマーは、３’末端の４つの識別ヌクレオ
チド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のうちの１つが続く、オリゴ−競合プライマーの
３’の最後から２番目の位置で、ヌクレオチド（４ヌクレレオチド、またはＮの
等モル混合物）の多義性の混合物を有する。制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＢｇｌＩ
Ｉを含むＱＥＡ反応から４塩基の情報を抽出するために必要な１６オリゴヌクレ
オチド競合プライマーが、表３に示される；この実施例において、第１のサイク
ルは、長さ２１塩基の競合プライマーを適用し、そして、第２のサイクルは、２
２塩基長である競合プライマーを適用する。

【００４９】（表３．ＢｓｐＨＩ（ＴＣＡＴＧＡ）およびＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）二重
制限酵素消化由来のＱＥＡピークについて４つの位置での段階反応に必要なプラ
イマー）

【００５０】

【表３】（段階反応）段階反応を、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＮａＣｌ、２２ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ，ｐＨ８．８、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２ｍＭＭｇＳＯ４、２ｍ
ＭＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭベタイン（Ｓ
ｉｇｍａ）０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、およ
び０．８ユニットのＤｅｅｐＶｅｎｔ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を含む緩衝液中で、１ｎｇのＱＥＡ反応
産物、１００ｐｍｏｌの各Ｆａｍ−Ｊ２３およびビオチンＲ−２３、１ｎｍｏｌ
の適切なＪまたはＲオリゴ−競合プライマーを用いて行なった。この反応のため
に使用されたＰＣＲプログラムは、９６℃で５分間、その後、９５℃で３０秒間
、５７℃で１分間、そして７２℃で２分間の１３サイクルであった。反応を７２
℃で１０分間の工程によって終結した。

【００５１】オリゴ−競合産物を、磁性ストレプトアビジンコーティングビーズを使用して
精製し、９５℃で５分間加熱して変成し、Ｆａｍで標識した鎖を放出し、Ｒｏｘ
標識したＤＮＡサイジングラダーと混合し、そして、ＭｅｇａＢａｃｅ１０００
システム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｍａｍｉｃｓ）を使用してサイズ決定のた
めにキャピラリー電気泳動に供した。

【００５２】（結果）オリゴ−競合反応をＢｓｐＨＩ−ＢｇｌＩＩ二重消化由来のラット肝臓ＱＥＡ
反応を使用して行なった。Ｊ側の第１の伸長位置について、各々１００ｐｍｏｌ
のＪ２３およびＲ２３プライマー、および１ｎｍｏｌのＭ０Ｊ１Ａ、Ｍ０Ｊ１Ｃ
、Ｍ０Ｊ１Ｇ、またはＭ０Ｊ１Ｔ（表３において提供される名称を使用する）の
いずれかを使用して４反応を行なった。同様に、Ｒ側の第１の位置について、各
々１００ｐｍｏｌのＪ２３およびＲ２３プライマー、および１ｎｍｏｌのＩ０Ｒ
１Ａ、Ｉ０Ｒ１Ｃ、Ｉ０Ｒ１Ｇ、またはＩ０Ｒ１Ｔのいずれかを含む４つのさら
なる反応を行なった。ＰＣＲ反応を行ない、精製し、そして、キャピラリー電気
泳動に供した。Ｊ側およびＲ側の各反応由来のトレースを表６に示す。

【００５３】ＱＥＡピークに対応する図６の上のパネル中の４つのトレースを、それぞれＩ
０Ｒ１Ａ、Ｉ０Ｒ１Ｃ、Ｉ０Ｒ１Ｇ、およびＩ０Ｒ１Ｔオリゴ−競合プライマー
を含む競合反応後に得た。同様に、下のパネルは、Ｍ０Ｊ１Ａ、Ｍ０Ｊ１Ｃ、Ｍ
０Ｊ１Ｇ、およびＭ０Ｊ１Ｔプライマーとのオリゴ−競合反応後に得られたＱＥ
Ａピークを示す。所定のピークについて最も低い高さを有するトレースは、制限
酵素部位の３’側のヌクレオチドを同定する。例えば、このトレースの領域にお
いて、８８．２ｂｐのピークは、ＢｇｌＩＩ部位の３’側のシトシン（Ｃ）残基
（図６、上のパネル）、およびＢｓｐＨＩ部位の３’側のチミジン（Ｔ）残基（
図６、下のパネル）を有する。図６のパネルにおける同様の名称は、サイズの検
出における他のＱＥＡピークについて首尾良い競合を提供する塩基を示す。（図
６の下のパネルにおける名称「Ｓ」は、ＣおよびＧの両方が、このフラグメント
のこの位置において首尾良く競合するような多義性を示す。）第２の位置でのヌクレオチドオリゴ−競合について、プライマーＭ０Ｊ２Ａ、
Ｍ０Ｊ２Ｃ、Ｍ０Ｊ２Ｇ、およびＭ０Ｊ２Ｔは、Ｊ側のＢｓｐＨＩ制限酵素部位
についてのオリゴ−競合反応において使用され、そして、プライマーＩ０Ｒ２Ａ
、Ｉ０Ｒ２Ｃ、Ｉ０Ｒ２Ｇ、およびＩ０Ｒ２Ｔは、Ｒ側のＢｇｌＩＩ制限部位に
ついてのオリゴ−競合反応において使用される。図７は、例えば、８８．２ｂｐ
でのＱＥＡピークについて、Ｊ側の第２のヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）であ
り、そして、Ｒ側がアデニン（Ａ）であることを示す。他のＱＥＡピークについ
て対応する結果が、図７において同様に提供される。

【００５４】（オリゴ−競合の有用性）Ｇｅｎｅｃａｌｌｉｎｇ表は、ＪおよびＲ部分配列の両方での２サイクルにつ
いてオリゴ−競合によって提供されるさらなる情報を有する２５６の推定因子に
よって定義される。この特異性の実用的な適用の例としては、ラット肝臓ｃＤＮ
ＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ二重制限消化は、本来のＧｅｎｅＣａｌｌｉｎ
ｇ表が、１０個の候補遺伝子（その部分配列長の組み合わせが実験情報に適合す
る）を有する１５３．８ｂｐフラグメントを提供する。１０個の候補遺伝子の中
で１つのみ（ラットグリコーゲンシンターゼ）が、このフラグメントについての
ＪおよびＲ部分配列の各々のための段階反応の２サイクルによって提供されるオ
リゴ−競合データに適合する。従って、フラグメントへの遺伝子の明白な適合は
、オリゴ−競合プロセスの結果として提供される。この適合は、図６および７な
らびにこの段落に記載されている伸長オリゴ−競合プロセスによって同定された
塩基を取り込むオリゴヌクレオチドを使用するオリゴ−競合実験によって確かめ
られる（図８を参照のこと）。図８における１５３．８ｂｐでの上のトレースは
、オリゴ−競合オリゴヌクレオチドの非存在下でのコントロールトレースであり
、そして、下のトレースは、オリゴヌクレオチドの存在下および過剰のオリゴヌ
クレオチドの存在下で得られる。

【００５５】（実施例３．毒性バンドの同定）オリゴ−競合（自動または手動あるいは両方）は、それらの公知の切断部位に
隣接したｃＤＮＡフラグメントの制限されたヌクレオチド配列を見出すプロセス
である。目的の配列は、４つ（１つの位置について）の配列特異的オリゴ−競合
プライマーの１つを使用するオリゴ−競合ＰＣＲプロセスにおけるｃＤＮＡフラ
グメントの量を変更すること（詳細な説明および実施例２を参照のこと）、およ
びｃＤＮＡフラグメント長（ｂｐ）によって表される電気泳動移動度の関数とし
てのそれらの強度の点に関するオリゴ−競合ＰＣＲ産物の得られた電気泳動トレ
ースを分析することによって、決定される。オリゴ−競合ヌクレオチド（オリゴ
−競合配列）は、オリゴ−競合ＰＣＲ増幅における差異に基づいて同定され、こ
れは、次に、ＰＣＲ産物の所定のｃＤＮＡフラグメントに対応するピークの狭い
近辺におけるトレースの強度における差異によって決定される。オリゴ−競合Ｐ
ＣＲプロセスは、オリゴ−競合ＰＣＲ産物中の毒性のｃＤＮＡフラグメントの強
度が、同じ長さおよび切断配列の非毒性フラグメントに対応する強度に関して、
減少する（陰性オリゴ−競合）かまたは増加する（陽性オリゴ−競合）ように設
計され得る。以下に陰性オリゴ−競合アルゴリズムが記載されるが、陽性オリゴ
−競合アルゴリズムに関する差異は、適用可能である括弧内に示される。オリゴ
−競合データの分析は、オリゴ−競合電気泳動トレースのみに対して適用され得
る（所定のヌクレオチド位置における４つの可能性のあるヌクレオチドＡ、Ｃ、
Ｇ、およびＴに対応する４つのトレースまで）か、または、オリゴ−競合ＰＣＲ
プロセス（５つのトレースまで）にインプットされる場合に使用されるｃＤＮＡ
フラグメントの最初の混合物に対応する電気泳動トレースと組み合わせたオリゴ
−競合電気泳動トレースに対して、適用され得る。この分析は、以下の工程から
なり得る。

【００５６】１）電気泳動トレースの強度の正規化、平均化およびスケーリング。原則とし
て、電気泳動トレースの強度は、ＰＣＲ産物の長さの関数としてそれらのｃＤＮ
Ａフラグメントの量を特徴付ける。しかし、トレース強度の値は、オリゴ−競合
プロセスの異なった段階で作用するいくつかの望ましくない因子によって影響さ
れる。これらの因子としては、以下を含むがこれらに限定されない；（ｉ）オリ
ゴ−競合ＰＣＲにおいて使用されるｃＤＮＡフラグメントの最初の量の不確定度
、（ｉｉ）オリゴ−競合ＰＣＲプライマー、フラグメント長、および他のＰＣＲ
プロセスのパラメーターに依存するオリゴ−競合ＰＣＲ増幅におけるバリエーシ
ョン、（ｉｉｉ）電気泳動機器ノイズなど。オリゴ−競合トレースに対するこれ
らの因子の影響は、正規化およびスケーリングによって減少される（ＷＯ００／
４１１２２を参照のこと）。正規化およびスケーリングは、オリゴ−競合トレー
ス単独に適用され得るか、または最初のｃＤＮＡフラグメントのトレースと組み
合わせたオリゴ−競合トレースに対して適用され得る。

【００５７】２）ピーク見出。工程１で定義されたトレースは、それらの切断配列および長
さの両方によってｃＤＮＡを同定するピーク（局所的な強度最大値）を決定する
ために分析される。切断部位の各対について、可能な選択肢としては、以下を含
むがこれらに限定されない；（ｉ）各々が、特異的なオリゴ−競合ＰＣＲプライ
マーに対応する個々のオリゴ−競合トレースの分析、（ｉｉ）全てのオリゴ−競
合トレースの平均を示す複合性トレースの分析、（ｉｉｉ）全てのオリゴ−競合
トレースおよび最初のｃＤＮＡフラグメントのトレースの平均を示す複合性トレ
ースの分析、（ｉｖ）最初のｃＤＮＡフラグメントのトレースの分析。ピーク見
出アルゴリズムは、所定の条件のセット（例えば、所定の数の連続的な点におけ
るトレースの形状、シグナル／ノイズ比率およびその他）によって同定される、
最大値について、所定のトレースをスキャンする。

【００５８】３）差異見出。工程２で見出される各ピークについて、正規化およびスケーリ
ングされたオリゴ−競合トレースは、所定のピークの位置の狭い近辺内で決定さ
れるそれらの最大強度の上行性（陽性オリゴ−競合について下行性）順序で並べ
られる。次いで、このピークは、並べられた強度の相互関係に関して特定の条件
が満たされる場合、毒性であると考えられる。陰性ＰｈａｓｅＣａｌｌｉｎｇに
おけるこれらの条件についての可能性のある選択肢として、以下を含むがこれら
に限定されない：（ｉ）ｎ個（ｎ＜４）の１番目に並べられたオリゴ−競合トレースの強度は、
所定のピークの位置内の任意の他のオリゴ−競合トレースの強度より、少なくと
もｋ倍（ｋ＞１）低い（陽性ＰＣについては、より高い）。これらのオリコ競合
トレースの各々に対応するオリゴ−競合プライマーは、ｃＤＮＡフラグメントの
切断部位に関連して、１〜ｎ個の毒性のヌクレオチドおよびそれらの位置を決定
する。

【００５９】（ｉｉ）ｎ個（ｎ４）の１番目に並べられたオリゴ−競合トレースの強度は
、所定のピークの位置内のＰＣ処置していないｃＤＮＡフラグメントのトレース
の強度よりｋ倍（ｋ＞１）低い（陽性ＰＣについては、より高い）。この場合、
これらのオリゴ−競合トレースの各々に対応するオリゴ−競合プライマーは、ｃ
ＤＮＡフラグメントの切断部位に関連して、１〜ｎ個の毒性のヌクレオチドおよ
びそれらの位置を決定する。

【００６０】ｎおよびｋの値は、経験的に決定され得、そして、ｃＤＮＡフラグメントの配
列をより良好に複製するために最適化され得る。試験的なオリゴ−競合ソフトウ
ェアにおいて、ｎおよびｋの値は、対応して２および１．５に固定される。

【００６１】図９および１０は、１４３．８ｂｐ長のｃＤＮＡフラグメントについて陰性な
オリゴ−競合ＰＣＲ産物の４つのオリゴ−競合トレースに適用されるオリゴ−競
合アルゴリズムの例を示す。赤色の垂直の線は、目的のピークを同定し、そして
、その数は、オリゴ−競合トレースの並んでいる順序を同定する。

【００６２】図９において、緑色のオリゴ−競合トレースの強度は、上記の第１のトレース
よりも１．５倍低く、その結果、このｃＤＮＡフラグメントは、切断配列にすぐ
に隣接するヌクレオチドＧを有することが決定された（緑色トレースは、切断部
位に関連した第１の位置のＧヌクレオチドに特異的なオリゴ−競合プライマーに
対応する）。

【００６３】図１０において、黒色および赤色のオリゴ−競合トレースの両方の強度は、上
記の任意のトレースよりも少なくとも１．５倍低く、その結果、ｃＤＮＡフラグ
メント（この特定の切断配列および長さによって特徴付けられる）は、切断配列
の次に位置するＴおよびＣヌクレオチドを有することが決定された（黒色および
赤色トレースは、それぞれ、切断部位に隣接したＴおよびＣヌクレオチドに特異
的なオリゴ−競合プライマーに対応する）。

【００６４】（実施例４．確認効率を改善するためのトレース−オリゴ−競合−データの適
用）表４に示されるように、３つの異なる生物において、全部で１０回の異なった
トレースオリゴ−競合投影を行なった。バンドの制限酵素認識部位に隣接した４
つまでのヌクレオチドのさらなる配列情報を、このバンドについて作成した。こ
の情報を使用して、フラグメントを同定するためのジーンコールを最適化した。
次いで、このジーンコールを、オリゴ−競合（発明の背景を参照のこと）または
配列決定のような手順から得られるさらなる確認の結果と比較した。この確認要
求は、バンドとこれらのジーンコールとの間のトレースオリゴ−競合の一致（「
トレースオリゴ−競合スコア」といわれる）に付加されたヌクレオチドの数に
基づいて５つの集団に分類した。スコアは、付加されたヌクレオチドの０から４
まで変化する。このプロセスの効果を、各分類における確認要求の総数に関する
陽性な確認の割合を評価することによって、評価した。これらの比率をまた、確
認がトレースオリゴ−競合なしで行なわれた初期の背景となるデータと比較した
。

【００６５】（表４：３つの異なる生物（生物ＩＤによって示されるような）および種々の
組織（組織ＩＤによって示されるような）において完了した１０回のトレースオ
リゴ−競合投影の表）

【００６６】

【表４】（結果：）（１．トレースオリゴ−競合データは確認効率を改善する）１０回の異なったトレースオリゴ−競合投影における確認効率に関するトレー
スオリゴ−競合スコアの影響を図１１に要約する。１０回のトレースオリゴ−競
合投影から１８２８の確認が提示された。これらの確認を、バンドとこれらのジ
ーンコールとの間のトレースオリゴ−競合−ヌクレオチド一致の数（トレースオ
リゴ−競合スコア）に基づいて分類した。トレースオリゴ−競合効率を、各分類
における確認要求の総数に対するオリゴ−競合によって確認されたトレースオリ
ゴ−競合の実行の割合として測定した。結果をまた、トレースオリゴ−競合デー
タが作成されていない別の１１０８個の背景となるサンプルの確認効率と比較し
た。

【００６７】全体のトレースオリゴ−競合効果は、トレースオリゴ−競合手順において使用
されるヌクレオチドの数と共に増加することが図１１から観察される。トレース
オリゴ−競合スコア１の場合、確認効率は、一致が全く見出されない場合、また
は背景となるデータの確認効率と比較した場合よりもより低かった。これは、ト
レースオリゴ−競合データが利用可能でない場合（背景となるまたはスコア＝０
）の、特異的なバンド対遺伝子会合の選択に対する実験者の偏見に起因し得る。
平均的に、トレースオリゴ−競合効率は、０から４の全範囲にわたって、塩基あ
たり９．３％まで増加した（４０．２％〜７７．５％）。この一般的な傾向は、
１０回のトレースオリゴ競合投影全回にわたって一貫していた（種々の投影にお
いて、トレースオリゴ−競合効率の詳細な崩壊を示す、表５を参照のこと）。所
定のトレースオリゴ−競合スコアについてのトレースオリゴ−競合投影間の確認
効率におけるバリエーションは、少なくとも部分的に、質、組織特異性および配
列データベースの重複性によって説明され得る。

【００６８】（表５．いくつかのトレースオリゴ−競合投影におけるトレースオリゴ−競合
スコアとオリゴ−競合成功の関連）

【００６９】

【表５】トレースオリゴ−競合組織Ｃｋ＝トレースオリゴ−競合データセットが利用可能
であるか否か、０＝いいえ、１＝はい。トレースオリゴ−競合スコア＝バンドのトレースオリゴ−競合データとジーンコ
ールの配列のトレースオリゴ−競合データと間のヌクレオチド一致の数。ＮＯＰＡＳＳ＝「オリゴ−競合」（競合的ＰＣＲ）による、遺伝子会合に対する
バンドの確認の失敗。ＰＡＳＳ＝「オリゴ−競合」（競合的ＰＣＲ）による、遺伝子会合に対するバン
ドの陽性な確認。ＴＯＴＡＬ＝提示されたオリゴ−競合の総数。Ｐａｓｓ％＝ＴＯＴＡＬに対するＰＡＳＳの割合。Ｈｉｓｔ＝任意のトレースオリゴ−競合投影のなしの背景となる確認データ。

【００７０】（ＩＩ．トレースオリゴ−競合は、確認効率をさらに改善する際に、他の技術
を補完する）ＣｕｒａＧｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの独自の配列データベース由来のジ
ーンコールを使用する種々の投影において行なわれた全部で１０７３の確認を使
用して、トレースオリゴ−競合データの効果を評価した。１０７３の確認の中で
、トレースオリゴ−競合データが、６８８の確認要求について利用可能であった
。残りの３８５確認要求は、確認が独自のデータベースのみを用いて行なわれた
、背景となるデータとして処理された。異なったトレースオリゴ−競合投影由来
のトレースオリゴ−競合データを使用して、行なわれた各確認についてのトレー
スオリゴ−競合を同定した。以前に記載されたように、確認効率を、各分類にお
ける確認要求の総数に対する陽性な確認の割合として測定した。結果をまた、ト
レースオリゴ−競合データが全く使用され得なかった３８５の背景の確認の確認
効率と比較した。

【００７１】独自のデータベース由来のジーンコールの中での確認効率をさらに改善するこ
とに関するトレースオリゴ−競合の全体の効率が、図１２に示される。背景とな
るデータにおいて、ＳｉｚｅｄＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ^ＴＭデータベースを使用
する全体の確認効率は、独自のデータベースが同じ組織および発育段階内で使用
される場合、６１％であった。確認効率は、背景となるデータにおける６１％か
ら、トレースオリゴ−競合投影においてスコア＝０を有する要求確認の中で３０
％に減少した。この減少は、独自のデータベースが作成されたサンプルとジーン
コールが確認のために使用されたサンプルとの間の組織および発育段階の差異に
起因する。トレースオリゴ−競合効果は、トレースオリゴ−競合スコアと共に増
加する。２つ以上のヌクレオチドが一致する場合、確認効率は、背景となるデー
タにおいて観察される確認効率以上であった。これらの結果は、トレースオリゴ
−競合が、独自のデータベースの使用を補完し、そして、確認効率をさらに改善
することを示す。これらの結果は、確認が独自のデータベースを使用して提示さ
れた、全てのトレースオリゴ−競合投影において一貫していた（種々の投影にお
けるトレースオリゴ−競合効果の詳細な崩壊を示す、表６を参照のこと）。

【００７２】（表６．いくつかのトレースオリゴ−競合投影におけるＳｉｚｅｄＳｅｑＣ
ａｌｌｉｎｇデータベース由来のＧｅｎｅＣａｌｌの中のトレースオリゴ−競合
スコアとオリゴ−競合成功の関係）

【００７３】

【表６】トレースオリゴ−競合組織Ｃｋ＝トレースオリゴ−競合データセットが利用可能
であるか否か、０＝いいえ、１＝はい。トレースオリゴ−競合スコア＝バンドのトレースオリゴ−競合データとジーンコ
ールの配列のトレースオリゴ−競合データ間のヌクレオチド一致の数。ＮＯＰＡＳＳ＝「オリゴ−競合」（競合的ＰＣＲ）による、遺伝子会合に対する
バンドの確認の失敗。ＰＡＳＳ＝「オリゴ−競合」（競合的ＰＣＲ）による、遺伝子会合に対するバン
ドの陽性な確認。ＴＯＴＡＬ＝提示されたオリゴ−競合の総数。Ｐａｓｓ％＝ＴＯＴＡＬに対するＰＡＳＳの割合。Ｈｉｓｔ＝任意のトレースオリゴ−競合投影なしの背景となる確認データ。

【００７４】（等価物）本発明の特定の実施形態の前述の詳細な説明から、特定の新規の組成物、およ
び核酸、ポリペプチド、抗体、検出および処置を含む方法が、記載されているこ
とが明らかであるべきである。これらの特定の実施形態は、本明細書中に詳細に
開示されているが、これは、例示のみの目的のための例として行なわれており、
上記の添付の特許請求の範囲に関して制限することを意図するのではない。特に
、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく、種々の置換、変更、および改変が、本発明に対して、当業者にとっての慣
例的な事項として行なわれ得ることが、発明者らによって意図されている。確か
に、本明細書中に記載される改変に加えて、本発明の種々の改変が、前述の説明
および添付の図面から当業者に明らかとなる。このような改変は、添付の特許請
求の範囲内であることが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＱＥＡフラグメントの異なる部分を記載する図である。

【図２】図２は、塩基対における蛍光フラグメントの大きさに対してプロットされた蛍
光強度のトレース（ｔｒａｃｅ）を示すグラフである。

【図３】図３は、オリゴヌクレオチド競合アッセイの原理を記載した図である。

【図４】図４は、コントロールサンプルおよびオリゴ競合サンプルについての塩基対に
おける大きさに対してブロットされた蛍光強度のトレースを示すグラフである。

【図５】図５は、オリゴヌクレオチド競合反応を説明する図である。

【図６】図６は、２つのトレースを含む図である。上のトレースは、４つの異なるＲプ
ライマーバージョンを用いて、４つの異なるオリゴ競合反応の蛍光をプロットす
る。これらの４つのバージョンは、制限部位の３’末端のヌクレオチドにおいて
異なる。下のトレースは、Ｊプライマーについての同様のデータをプロットする
。

【図７】図７は、２つのトレースを含む図である。上のトレースは、４つの異なるＲプ
ライマーバージョンを用いて、４つの異なるオリゴ競合反応の蛍光をプロットす
る。これらの４つのバージョンは、３’制限部位の３’側の第２のヌクレオチド
において異なる。下のトレースは、Ｊプライマーについての同様のデータをプロ
ットする。

【図８】図８は、コントロールおよびオリゴ競合サンプルの核酸サイズに対してプロッ
トした蛍光の２つのトレースを示すグラフである。

【図９】図９は、核酸サイズに対してプロットした蛍光の４つのトレースを示すグラフ
である。

【図１０】図１０は、核酸サイズに対する蛍光の４つのトレースを示すグラフである。

【図１１】図１１は、過去のデータと比較したトレース中毒スコアおよびトレース中毒有
効性の全体的な関連を示した図である。

【図１２】図１２は、配列データベース由来のＧｅｎｅＣａｌｌｓ^ＴＭのうちでトレース
中毒スコアおよび中毒成果の全体的な関連を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者グセフ，ウラジミルアメリカ合衆国コネチカット 06443，マディソン，ダラムロード 1209 (72)発明者リ，シュシャアメリカ合衆国コネチカット 06502，ウッドブリッジ，サンセットサークル 15 (72)発明者シェノイ，スレシュアメリカ合衆国コネチカット 06405，ブランフォード，ミルウッドドライブ 15 (72)発明者クラスタ，オスワルドアール．アメリカ合衆国コネチカット 06511，ブランフォード，フローレンスロード 95−２シー (72)発明者ブフォール，パスカルアメリカ合衆国コネチカット 06810，ダンバリー，クロウズネストレーン 27，アパートメント 20ビーＦターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 HA12 4B063 QA08 QA13 QQ43 QR08 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】異なるヌクレオチド配列を有する複数個の核酸を含むサンプ
ルにおいて１つ以上の核酸を同定、分類または定量する方法であり、ここで該方
法が、以下：（ａ）１つ以上の認識手段を用いて該サンプルを探索する工程であって、ここ
で各認識手段は、異なる標的ヌクレオチド部分配列または標的ヌクレオチド部分
配列の異なるセットを認識して、１つ以上の標的核酸を提供する、工程；（ｂ）該認識手段により探索された該サンプルから１つ以上の第１のシグナル
を産生する工程であって、産生された各第１のシグナルが、該サンプル中の標的
核酸より生じ、そして以下、（ｉ）該標的核酸における標的部分配列の存在の間の長さ、ならびに（ｉｉ）該標的核酸における該標的部分配列の同一性、または該標的核酸にお
ける標的部分配列を含む該標的部分配列の同一性の提示を含む、工程；（ｃ）１つ以上の標的核酸を、それらの対応する第１のシグナルに基づいて選
択する工程；（ｄ）該選択された標的核酸における１つ以上の標的部分配列由来の配列情報
を、該サンプルにおいて該選択された標的核酸から生じる１つ以上の第２のシグ
ナルを産生する条件下において、１つ以上の伸長した部分配列を提供する１つ以
上のヌクレオチドによって伸長する工程であって、少なくとも１つの該選択され
た標的核酸の部分配列が伸長され、ここで該第２のシグナルが以下、（ｉ）該核酸において、少なくとも１つが伸長された標的部分配列の存在の間
の長さ、および（ｉｉ）該選択された標的核酸における、少なくとも１つが伸長された該選択
された標的部分配列の同一性、または該選択された標的核酸における標的部分配
列を含む、少なくとも１つが伸長された該標的部分配列の同一性の提示を含む、
工程；ならびに（ｅ）ヌクレオチド配列データベースを検索して、整合する配列、または少な
くとも１つの伸長された部分配列を有し、かつ該産生された第２のシグナルによ
って提示される１つ以上の該選択された標的核酸に整合するいかなる配列も不在
であることを決定する工程であって、ここで該データベースは、サンプル中に存
在し得る核酸の既知の複数個のヌクレオチド配列を含み、ここで該データベース
由来の配列は、該データベース由来の配列が以下：（ｉ）該産生されたシグナルによって提示されるような、少なくとも１つが伸
長された標的部分配列の存在の間の同じ長さ、および（ｉｉ）該産生されたシグナル、または少なくとも１つが伸長され、産生され
たシグナルによって提示される標的部分配列の同じセットのメンバーである標的
部分配列によって提示されるような、少なくとも１つが伸長された同じ標的部分
配列、の両方を有する場合に、第２のシグナルの産生を提供する該選択された標的核酸
に整合することを決定され、ここで該サンプル中における整合した核酸が、同定
、分類または定量される、工程を包含する、方法。
【請求項２】前記第２の産生されたシグナルが陰性オリゴ競合シグナルで
ある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記第２の産生されたシグナルが陽性オリゴ競合シグナルで
ある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】請求項２に記載の方法であって、ここで前記配列情報の伸長
が以下：（ｉ）標識されたプライマーのセットであって各プライマーのヌクレオチド配
列は、標的部分配列を含む、セット、および（ｉｉ）非標識プライマーであって、該標識プライマーの配列が、少なくとも
１つのさらなるヌクレオチドが続く（ｉ）において同定される１つの標的部分配
列を含む、非標識プライマーを含むオリゴヌクレオチド混合物と核酸サンプルを
接触させる工程を含む、方法。
【請求項５】請求項３に記載の方法であって、ここで前記配列情報の伸長
が以下、（ｉ）第１の非標識プライマーおよび第２の非標識プライマーを含むセットで
あって、各プライマーのヌクレオチド配列が標的部分配列を含む、セット、なら
びに（ｉｉ）配列が該第１の非標識プライマーの部分配列を含む標識された第３の
プライマーと、配列が少なくとも１つのヌクレオチドによって伸長された該第２
の非標識プライマーの部分配列を含む標識された第４のプライマーとを含むセッ
トを含む、オリゴヌクレオチドの混合物と核酸サンプルを接触させる工程を含む
、方法。
【請求項６】請求項１に記載の方法であって、ここで少なくとも１つの前
記産生されたシグナルが、前記配列データベースに存在する配列のサイズおよび
標的部分配列を有する配列に対応する、方法。
【請求項７】請求項１に記載の方法であって、ここで前記方法がさらに以
下：該シグナルを産生するサンプルにおいて核酸のフラグメントを回収する工程；該フラグメントについて少なくとも部分的な配列を決定するために該フラグメ
ントを配列決定する工程；および該サンプルが、該決定された配列の少なくとも一部分を含む配列を有する核酸
を含むことを確認する工程、を包含する方法。
【請求項８】前記複数の核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】請求項８に記載の方法であって、ここで前記探索する工程が
、以下：１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて前記サンプルを消化する工程であ
って、該制限エンドヌクレアーゼが前記標的部分配列である認識部位を有し、か
つ消化された切断末端において１本鎖ヌクレオチド突出を残す、工程；消化されたサンプルフラグメントと２本鎖アダプター核酸をハイブリダイズす
る工程であって、該アダプター核酸は、該１本鎖突出の１つに対して相補的な末
端を有する、工程；ならびに連結された核酸フラグメントを形成するために、該消化されたサンプルフラグ
メントの相補的な５’末端鎖に、アダプター核酸の相補鎖を連結する工程を包含する方法。
【請求項１０】前記複数個の核酸がＲＮＡである、請求項７に記載の方法
。
【請求項１１】異なるヌクレオチド配列を有する複数個の核酸を含むサン
プルにおける１つ以上の核酸の長さ−部分配列の組み合わせにおいて該配列を伸
長する方法であって、ここで該方法が、以下：（ａ）１つ以上の認識手段を用いて該サンプルを探索する工程であって、ここ
で各認識手段は、異なる標的ヌクレオチド部分配列または標的ヌクレオチド部分
配列の異なるセットを認識して、１つ以上の標的核酸を提供する、工程；（ｂ）該認識手段により探索された該サンプルから１つ以上の第１のシグナル
を産生する工程であって、産生された各第１のシグナルが、該サンプル中の標的
核酸より生じ、そして以下、（ｉ）該標的核酸における標的部分配列の存在の間の長さ、ならびに（ｉｉ）該標的核酸における該標的部分配列の同一性、または該標的核酸にお
ける標的部分配列を含む該標的部分配列の同一性の提示を含む、工程；（ｃ）１つ以上の標的核酸を、それらの対応する第１のシグナルに基づいて選
択する工程；（ｄ）該選択された標的核酸における１つ以上の標的部分配列由来の配列情報
を、該サンプルにおいて該選択された標的核酸から生じる１つ以上の第２のシグ
ナルを産生する条件下において、１つ以上の伸長した部分配列を提供する１つ以
上のヌクレオチドによって伸長する工程であって、少なくとも１つの該選択され
た標的核酸の部分配列が伸長され、ここで該第２のシグナルが以下、（ｉ）該核酸において、少なくとも１つが伸長された標的部分配列の存在する
間の長さ、および（ｉｉ）該選択された標的核酸における、少なくとも１つが伸長された該標的
部分配列の同一性、または該選択された標的核酸における標的部分配列を含む、
少なくとも１つが伸長された該標的部分配列の同一性の提示を含む工程、を含み、ここで該サンプルにおける整合した核酸が該長さ−部分配列の組み合わ
せにおいて伸長された配列を有する、方法。
【請求項１２】前記第２の産生されたシグナルが陰性オリゴ競合シグナル
である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記第２の産生されたシグナルが陽性オリゴ競合シグナル
である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】請求項１２に記載の方法であって、ここで前記配列情報の
伸長が以下：（ｉ）標識されたプライマーのセットであって各プライマーのヌクレオチド配
列は、標的部分配列を含む、セット、および（ｉｉ）非標識プライマーであって、該標識プライマーの配列が、少なくとも
１つのさらなるヌクレオチドが続く（ｉ）において同定される１つの標的部分配
列を含む、非標識プライマーを含むオリゴヌクレオチド混合物と核酸サンプルを
接触させる工程を含む、方法。
【請求項１５】請求項１３に記載の方法であって、ここで前記配列情報の
伸長が以下、（ｉ）第１の非標識プライマーおよび第２の非標識プライマーを含むセットで
あって、各プライマーのヌクレオチド配列が標的部分配列を含む、セット、なら
びに（ｉｉ）配列が該第１の非標識プライマーの部分配列を含む標識された第３の
プライマーと、配列が少なくとも１つのヌクレオチドによって伸長された該第２
の非標識プライマーの部分配列を含む標識された第４のプライマーとを含むセッ
トを含む、オリゴヌクレオチドの混合物と核酸サンプルを接触させる工程を含む
、方法。