JP2003518369A - 多不飽和脂肪酸および脂質の合成に関与するタンパク質をコードするフィスコミトレラ・パテンス由来のコケの遺伝子 - Google Patents
多不飽和脂肪酸および脂質の合成に関与するタンパク質をコードするフィスコミトレラ・パテンス由来のコケの遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
例えば、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）に由来する新規なＬＭＲＰをコードする単離された核酸分子（ＬＭＲＰ核酸分子と呼ばれる）が記載される。本発明はまた、アンチセンス核酸分子、ＬＭＲＰ核酸分子を含有する組換え発現ベクター、および発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明はさらにまた、単離されたＬＭＲＰ、変異型ＬＭＲＰ、融合タンパク質、抗原性ペプチド、およびその生物におけるＬＭＲＰ遺伝子を遺伝子操作することに基づく形質転換細胞、形質転換生物または形質転換植物からの所望する化合物の製造を向上させるための方法をさらに提供する。
Description
【０００１】
（発明の背景）
細胞内の天然に存在する代謝プロセスのある種の生成物および副生成物は、食
品業界、飼料業界、化粧品業界および製薬業界を含む広範囲の業界で有用である
。総称的に「ファインケミカル」と呼ばれるこれらの分子には、脂質および脂肪
酸、補助因子および酵素が含まれる。ファインケミカルは、１つまたは複数の所
望する分子を大量に産生して分泌するように開発された微生物を大規模に培養す
ることによって微生物において製造することができる。
品業界、飼料業界、化粧品業界および製薬業界を含む広範囲の業界で有用である
。総称的に「ファインケミカル」と呼ばれるこれらの分子には、脂質および脂肪
酸、補助因子および酵素が含まれる。ファインケミカルは、１つまたは複数の所
望する分子を大量に産生して分泌するように開発された微生物を大規模に培養す
ることによって微生物において製造することができる。
【０００２】
それらの製造は、１つまたは複数の所望する分子を大量に産生して分泌するよ
うに開発された微生物の大規模な培養を行うことによって最も都合よく行われて
いる。この目的のために特に有用な生物の１つが、グラム陽性の非病原性細菌で
あるコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇ
ｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
うに開発された微生物の大規模な培養を行うことによって最も都合よく行われて
いる。この目的のために特に有用な生物の１つが、グラム陽性の非病原性細菌で
あるコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇ
ｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
【０００３】
さらにこの目的のために特に有用な生物として、ファエダクチルム・トリコル
ヌツム（Ｐｈａｅｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｏｃｒｎｕｔｕｍ）、多不飽和脂肪
酸（ＰＵＦＡ）を産生する藻類またはスチロニキア・レムナエ（Ｓｔｙｌｏｎｙ
ｃｈｉａ ｌｅｍｎａｅ）のような繊毛虫類が挙げられる。菌株を選択すること
により、一連の所望される化合物を産生するそれぞれの微生物の多数の変異菌株
が開発されている。しかし、特定の分子を産生させるために改良された菌株を選
択することは、時間のかかる困難なプロセスである。
ヌツム（Ｐｈａｅｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｏｃｒｎｕｔｕｍ）、多不飽和脂肪
酸（ＰＵＦＡ）を産生する藻類またはスチロニキア・レムナエ（Ｓｔｙｌｏｎｙ
ｃｈｉａ ｌｅｍｎａｅ）のような繊毛虫類が挙げられる。菌株を選択すること
により、一連の所望される化合物を産生するそれぞれの微生物の多数の変異菌株
が開発されている。しかし、特定の分子を産生させるために改良された菌株を選
択することは、時間のかかる困難なプロセスである。
【０００４】
あるいは、ファインケミカルの製造は、上記のファインケミカルの１つを産生
するように開発された植物を大規模に製造することによって最も都合よく行うこ
とができる。この目的のために特に十分に適した植物として、アブラナ、カノー
ラ、亜麻、ダイズおよびヒマワリのような、多量の脂質化合物を含有する脂肪種
子植物が挙げられる。しかし、オイルまたは脂質および脂肪酸を含有する他の作
物植物もまた、本発明の詳細な説明において言及されているように十分に適する
。従来の育種により、一連の所望する脂質および脂肪酸、補助因子および酵素を
産生する多数の変異植物が開発されている。しかし、特定の分子を産生させるた
めに改良された新しい植物品種を選択することは、時間のかかる困難なプロセス
であるか、または多不飽和脂肪酸の場合のように化合物がそれぞれの植物におい
て天然に存在しない場合には不可能でさえある。
するように開発された植物を大規模に製造することによって最も都合よく行うこ
とができる。この目的のために特に十分に適した植物として、アブラナ、カノー
ラ、亜麻、ダイズおよびヒマワリのような、多量の脂質化合物を含有する脂肪種
子植物が挙げられる。しかし、オイルまたは脂質および脂肪酸を含有する他の作
物植物もまた、本発明の詳細な説明において言及されているように十分に適する
。従来の育種により、一連の所望する脂質および脂肪酸、補助因子および酵素を
産生する多数の変異植物が開発されている。しかし、特定の分子を産生させるた
めに改良された新しい植物品種を選択することは、時間のかかる困難なプロセス
であるか、または多不飽和脂肪酸の場合のように化合物がそれぞれの植物におい
て天然に存在しない場合には不可能でさえある。
【０００５】
（発明の要約）
本発明は、多不飽和脂肪酸を産生させるために特にそして最も好まれる微生物
および植物において脂質および脂肪酸、補助因子および酵素を改変するために使
用することができる新規な核酸分子を提供する。ファエオダクチルム（Ｐｈａｅ
ｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、スチロニキア・レムナエおよびコリネバクテリウムのよ
うな微生物、菌類および植物が、様々なファインケミカルを大規模に製造するた
めに産業界で広く使用されている。
および植物において脂質および脂肪酸、補助因子および酵素を改変するために使
用することができる新規な核酸分子を提供する。ファエオダクチルム（Ｐｈａｅ
ｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、スチロニキア・レムナエおよびコリネバクテリウムのよ
うな微生物、菌類および植物が、様々なファインケミカルを大規模に製造するた
めに産業界で広く使用されている。
【０００６】
米国特許第４，６４９，１１９号（Ｓｉｎｓｋｅｙら）に開示されるベクター
などの、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいて使用されるクローニングベ
クター、そしてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよび関連するブレビバクテリウム種
（例えば、ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の遺伝子操作技術の有用性が示され
た場合（Ｙｏｓｈｉｈａｍａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：５９１〜５
９７（１９８５）；Ｋａｔｓｕｍａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：
３０６〜３１１（１９８４）；Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．１３０：２２３７〜２２４６（１９８４））、本発明の核酸分子を
この生物の遺伝子工学において利用して、その生物を１つまたは複数のファイン
ケミカルのより良好な生産者またはより効率的な生産者にすることができる。フ
ァインケミカルのこの改善された産生または産生効率は、本発明の遺伝子を操作
することの直接的な効果のためであり得るか、またはそのような操作の間接的な
効果のためであり得る。
などの、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいて使用されるクローニングベ
クター、そしてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよび関連するブレビバクテリウム種
（例えば、ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の遺伝子操作技術の有用性が示され
た場合（Ｙｏｓｈｉｈａｍａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：５９１〜５
９７（１９８５）；Ｋａｔｓｕｍａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：
３０６〜３１１（１９８４）；Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．１３０：２２３７〜２２４６（１９８４））、本発明の核酸分子を
この生物の遺伝子工学において利用して、その生物を１つまたは複数のファイン
ケミカルのより良好な生産者またはより効率的な生産者にすることができる。フ
ァインケミカルのこの改善された産生または産生効率は、本発明の遺伝子を操作
することの直接的な効果のためであり得るか、またはそのような操作の間接的な
効果のためであり得る。
【０００７】
国際特許出願公開ＷＯ９８０１５７２に開示されるなどの繊毛虫類、または藻
類および関連する生物（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら、１９９９、Ｍａｒｉｎｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１（３）：２３９〜２５１、ならびにＤｕｎａｈａ
ｙら、１９９５、珪藻の遺伝子形質転換、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３１：１０００４
〜１０１２、およびそれにおける参考文献に記載されるファエオダクチルム・ト
リコルヌツムなど）のクローニングベクターおよび遺伝子操作技術の有用性が示
された場合、本発明の核酸分子をこの生物の遺伝子工学において利用して、その
生物を１つまたは複数のファインケミカルのより良好な生産者またはより効率的
な生産者にすることができる。ファインケミカルのこの改善された産生または産
生効率は、本発明の遺伝子を操作することの直接的な効果のためであり得るか、
またはそのような操作の間接的な効果のためであり得る。
類および関連する生物（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら、１９９９、Ｍａｒｉｎｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１（３）：２３９〜２５１、ならびにＤｕｎａｈａ
ｙら、１９９５、珪藻の遺伝子形質転換、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３１：１０００４
〜１０１２、およびそれにおける参考文献に記載されるファエオダクチルム・ト
リコルヌツムなど）のクローニングベクターおよび遺伝子操作技術の有用性が示
された場合、本発明の核酸分子をこの生物の遺伝子工学において利用して、その
生物を１つまたは複数のファインケミカルのより良好な生産者またはより効率的
な生産者にすることができる。ファインケミカルのこの改善された産生または産
生効率は、本発明の遺伝子を操作することの直接的な効果のためであり得るか、
またはそのような操作の間接的な効果のためであり得る。
【０００８】
コケ類および藻類は、アラキドン酸（ＡＲＡ）および／またはエイコサペンタ
エン酸（ＥＰＡ）および／またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような多不飽
和脂肪酸を相当の量で産生する唯一知られている植物システムである。従って、
フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）
のようなコケに由来する核酸分子は、宿主（特に、微生物および植物）における
脂質およびＰＵＦＡの産生系を改変するために特に適している。さらに、フィス
コミトレラ・パテンスのコケに由来する核酸は、それぞれの生物におけるＰＵＦ
Ａの前駆体分子の生合成を改変するために有用である他の種におけるそのような
ＤＮＡ配列および酵素を同定するために使用することができる。
エン酸（ＥＰＡ）および／またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような多不飽
和脂肪酸を相当の量で産生する唯一知られている植物システムである。従って、
フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）
のようなコケに由来する核酸分子は、宿主（特に、微生物および植物）における
脂質およびＰＵＦＡの産生系を改変するために特に適している。さらに、フィス
コミトレラ・パテンスのコケに由来する核酸は、それぞれの生物におけるＰＵＦ
Ａの前駆体分子の生合成を改変するために有用である他の種におけるそのような
ＤＮＡ配列および酵素を同定するために使用することができる。
【０００９】
コケのフィスコミトレラ・パテンスは蘚類のメンバーの１つである。これは、
光のないところで生育することができるセラトドン・プルプレウス（Ｃｅｒａｔ
ｏｄｏｎ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）などの他の蘚類と同類である。セラトドン属お
よびフィスコミトレラ属のような蘚類はＤＮＡ配列レベルおよびポリペプチドレ
ベルで大きな相同性を有し、このような相同性により、他の蘚類または生物から
進化したＤＮＡ分子のプローブによる異種スクリーニングの使用が可能になり、
従って、さらに別の種における異種スクリーニングまたは遺伝子機能の機能的な
理解および予測に好適なコンセンサス配列を得ることができる。従って、そのよ
うな機能が同定できることは、例えば、酵素の基質特異性を予測することに大き
く関連する。さらに、これらの核酸分子は、コケのゲノムまたは関連する生物の
ゲノムをマッピングするための基準点として役立ち得る。
光のないところで生育することができるセラトドン・プルプレウス（Ｃｅｒａｔ
ｏｄｏｎ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）などの他の蘚類と同類である。セラトドン属お
よびフィスコミトレラ属のような蘚類はＤＮＡ配列レベルおよびポリペプチドレ
ベルで大きな相同性を有し、このような相同性により、他の蘚類または生物から
進化したＤＮＡ分子のプローブによる異種スクリーニングの使用が可能になり、
従って、さらに別の種における異種スクリーニングまたは遺伝子機能の機能的な
理解および予測に好適なコンセンサス配列を得ることができる。従って、そのよ
うな機能が同定できることは、例えば、酵素の基質特異性を予測することに大き
く関連する。さらに、これらの核酸分子は、コケのゲノムまたは関連する生物の
ゲノムをマッピングするための基準点として役立ち得る。
【００１０】
これらの新規な核酸分子は、本明細書中では脂質代謝関連タンパク質（ＬＭＲ
Ｐ）として示されるタンパク質をコードする。これらのＬＭＲＰは、例えば、脂
質または脂肪酸の生合成に必要な化合物の代謝（例えば、生合成または分解）に
関与する機能を行うことができ、あるいは膜を通過する１つまたは複数の脂質／
脂肪酸化合物の細胞内への輸送または細胞外への輸送のいずれかを助けることが
できる。植物において使用されるクローニングベクターおよび植物形質転換、例
えば、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄ
ａ）、６／７章、Ｓ．７１〜１１９（１９９３）；Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ、高等植
物における遺伝子移入用ベクター、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ、第１
巻、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、編者：Ｋｕｎ
ｇおよびＲ．Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９３、１５〜３８；Ｂ
．Ｊｅｎｅｓら、遺伝子移入技術、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ、第１
巻、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、編者：Ｋｕｎ
ｇおよびＲ．Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、１２８〜１４
３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１）、２０５〜２２５に発表され
ているベクターおよび技術、ならびにそれらに引用されているベクターおよび技
術などが利用できる場合、本発明の核酸分子を広範囲の植物の遺伝子工学におい
て利用して、その生物を１つまたは複数のファインケミカルのより良好な生産者
またはより効率的な生産者にすることができる。ファインケミカルのこの改善さ
れた産生または産生効率は、本発明の遺伝子を操作することの直接的な効果のた
めであり得るか、またはそのような操作の間接的な効果のためであり得る。
Ｐ）として示されるタンパク質をコードする。これらのＬＭＲＰは、例えば、脂
質または脂肪酸の生合成に必要な化合物の代謝（例えば、生合成または分解）に
関与する機能を行うことができ、あるいは膜を通過する１つまたは複数の脂質／
脂肪酸化合物の細胞内への輸送または細胞外への輸送のいずれかを助けることが
できる。植物において使用されるクローニングベクターおよび植物形質転換、例
えば、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄ
ａ）、６／７章、Ｓ．７１〜１１９（１９９３）；Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ、高等植
物における遺伝子移入用ベクター、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ、第１
巻、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、編者：Ｋｕｎ
ｇおよびＲ．Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９３、１５〜３８；Ｂ
．Ｊｅｎｅｓら、遺伝子移入技術、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ、第１
巻、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、編者：Ｋｕｎ
ｇおよびＲ．Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、１２８〜１４
３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１）、２０５〜２２５に発表され
ているベクターおよび技術、ならびにそれらに引用されているベクターおよび技
術などが利用できる場合、本発明の核酸分子を広範囲の植物の遺伝子工学におい
て利用して、その生物を１つまたは複数のファインケミカルのより良好な生産者
またはより効率的な生産者にすることができる。ファインケミカルのこの改善さ
れた産生または産生効率は、本発明の遺伝子を操作することの直接的な効果のた
めであり得るか、またはそのような操作の間接的な効果のためであり得る。
【００１１】
本発明のＬＭＲＰの変化が、そのような改変されたタンパク質のために、脂肪
種子植物からのファインケミカルの収率、産生および／または産生効率に直接的
な影響を及ぼし得る機構が多数存在する。細胞からのファインケミカル分子の輸
送に関与するそのようなＬＭＲＰは、より多くの量のこれらの化合物が、それら
がより容易に回収される種々の植物細胞区画または細胞の外側空間に配置され、
そして生合成流束に分配されるか、または堆積するように数または活性を増大さ
せることができる。同様に、１つまたは複数のファインケミカル（例えば、脂肪
酸、極性脂質および中性脂質）の生合成に必要な栄養分の細胞内への輸送に関与
するそのようなＬＭＲＰは、これらの前駆体、補助因子または中間体化合物の細
胞内または貯蔵区画内の濃度が増大するように数または活性を増大させることが
できる。さらに、脂肪酸および脂質はそれ自体、望ましいファインケミカルであ
る。従って、これらの化合物の生合成に関与している本発明の１つまたは複数の
ＬＭＲＰの活性を最適化するか、またはその数を増大させることによって、ある
いはこれらの化合物の分解に関与している１つまたは複数のＬＭＲＰの活性を損
なうことによって、植物または微生物からの脂肪酸分子および脂質分子の収率、
産生および産生効率を増大させることが可能になり得る。
種子植物からのファインケミカルの収率、産生および／または産生効率に直接的
な影響を及ぼし得る機構が多数存在する。細胞からのファインケミカル分子の輸
送に関与するそのようなＬＭＲＰは、より多くの量のこれらの化合物が、それら
がより容易に回収される種々の植物細胞区画または細胞の外側空間に配置され、
そして生合成流束に分配されるか、または堆積するように数または活性を増大さ
せることができる。同様に、１つまたは複数のファインケミカル（例えば、脂肪
酸、極性脂質および中性脂質）の生合成に必要な栄養分の細胞内への輸送に関与
するそのようなＬＭＲＰは、これらの前駆体、補助因子または中間体化合物の細
胞内または貯蔵区画内の濃度が増大するように数または活性を増大させることが
できる。さらに、脂肪酸および脂質はそれ自体、望ましいファインケミカルであ
る。従って、これらの化合物の生合成に関与している本発明の１つまたは複数の
ＬＭＲＰの活性を最適化するか、またはその数を増大させることによって、ある
いはこれらの化合物の分解に関与している１つまたは複数のＬＭＲＰの活性を損
なうことによって、植物または微生物からの脂肪酸分子および脂質分子の収率、
産生および産生効率を増大させることが可能になり得る。
【００１２】
本発明の１つまたは複数のＬＭＲＰの変異誘発はまた、植物から１つまたは複
数の所望するファインケミカルを製造することに対して間接的な影響を及ぼす変
化した活性を有するＬＭＲＰを生じさせることができる。例えば、不用産物の細
胞外への輸送に関与する本発明のＬＭＲＰは、（所望するファインケミカルが過
剰に産生されるために量がおそらくは増大する）細胞の正常な代謝不用物が、そ
れらによる細胞内のヌクレオチドおよびタンパク質の損傷（これは細胞の生存性
を低下させる）またはファイケミカルの生合成経路の妨害（これは所望するファ
インケミカルの収率、産生または産生効率を低下させる）が生じ得る前に細胞外
に効率的に輸送されるように数または活性を増大させることができる。さらに、
所望するファインケミカルの比較的大きな細胞内の量はそれ自体、細胞にとって
毒性であり得るか、またはアロステリック調節などの酵素のフィードバック機構
を妨害することがあり、従って、このような化合物を区画から細胞外に輸送する
ことができる輸送体の活性または数を増大させることによって、種子細胞の生存
性を増大させることができ、これにより、所望するファインケミカルを製造する
培養において、より多くの細胞数を得ることができる。本発明のＬＭＲＰはまた
、相対的な様々な量の種々の脂質分子および脂肪酸分子が産生されるように操作
することができる。これは、細胞の膜の脂質組成に対して大きな影響を有し得る
。各タイプの脂質は異なる物理的性質を有するので、膜の脂質組成の変化は膜の
流動性を著しく変化させることがある。膜流動性の変化は、膜を横断する分子の
輸送ならびに細胞の一体性に影響し得る。これらはともに、ファインケミカルを
製造することに対して大きな影響を有する。植物では、これらの変化はさらにま
た、非生物的ストレス条件および生物的ストレス条件に対する耐性のような他の
特性にも影響を及ぼし得る。
数の所望するファインケミカルを製造することに対して間接的な影響を及ぼす変
化した活性を有するＬＭＲＰを生じさせることができる。例えば、不用産物の細
胞外への輸送に関与する本発明のＬＭＲＰは、（所望するファインケミカルが過
剰に産生されるために量がおそらくは増大する）細胞の正常な代謝不用物が、そ
れらによる細胞内のヌクレオチドおよびタンパク質の損傷（これは細胞の生存性
を低下させる）またはファイケミカルの生合成経路の妨害（これは所望するファ
インケミカルの収率、産生または産生効率を低下させる）が生じ得る前に細胞外
に効率的に輸送されるように数または活性を増大させることができる。さらに、
所望するファインケミカルの比較的大きな細胞内の量はそれ自体、細胞にとって
毒性であり得るか、またはアロステリック調節などの酵素のフィードバック機構
を妨害することがあり、従って、このような化合物を区画から細胞外に輸送する
ことができる輸送体の活性または数を増大させることによって、種子細胞の生存
性を増大させることができ、これにより、所望するファインケミカルを製造する
培養において、より多くの細胞数を得ることができる。本発明のＬＭＲＰはまた
、相対的な様々な量の種々の脂質分子および脂肪酸分子が産生されるように操作
することができる。これは、細胞の膜の脂質組成に対して大きな影響を有し得る
。各タイプの脂質は異なる物理的性質を有するので、膜の脂質組成の変化は膜の
流動性を著しく変化させることがある。膜流動性の変化は、膜を横断する分子の
輸送ならびに細胞の一体性に影響し得る。これらはともに、ファインケミカルを
製造することに対して大きな影響を有する。植物では、これらの変化はさらにま
た、非生物的ストレス条件および生物的ストレス条件に対する耐性のような他の
特性にも影響を及ぼし得る。
【００１３】
本発明は、例えば、細胞膜または脂質および脂肪酸の構築に必要な化合物の代
謝あるいは膜を横断する分子の輸送に関与し得るタンパク質（これは本明細書中
ではＬＭＲＰと呼ばれる）をコードする新規な核酸分子を提供する。ＬＭＲＰを
コードする核酸分子は、本明細書中ではＬＭＲＰ核酸分子として示される。好ま
しい実施形態において、ＬＭＲＰは、植物における細胞膜の構築に必要な化合物
の代謝、または脂肪種子植物のこれらの膜を横断する分子の輸送に関わっている
。そのようなタンパク質の例には、表１に示される遺伝子によってコードされる
タンパク質が含まれる。生物的ストレスおよび非生物的ストレスの耐性として、
トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、
ダイズ、ピーナッツ、ワタ、アブラナおよびカノーラ、カサバ、コショウ、ヒマ
ワリおよびマンジュギク（ｔａｇｅｔｅｓ）、ナス科植物（ジャガイモ、タバコ
、ナスビおよびトマトなど）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ）属の種、エンドウ、アル
ファルファ、低木植物（コーヒー、カカオ、茶）、シダレヤナギ（Ｓａｌｉｘ）
属の種、樹木（アブラヤシ、ココナッツ）、ならびに多年草および飼料作物のよ
うな広範囲の植物に受け継がれることが望まれる一般的な形質が挙げられる。こ
れらの作物植物はまた、本発明の１つのさらなる実施形態として、遺伝子工学の
好ましい標的植物である。
謝あるいは膜を横断する分子の輸送に関与し得るタンパク質（これは本明細書中
ではＬＭＲＰと呼ばれる）をコードする新規な核酸分子を提供する。ＬＭＲＰを
コードする核酸分子は、本明細書中ではＬＭＲＰ核酸分子として示される。好ま
しい実施形態において、ＬＭＲＰは、植物における細胞膜の構築に必要な化合物
の代謝、または脂肪種子植物のこれらの膜を横断する分子の輸送に関わっている
。そのようなタンパク質の例には、表１に示される遺伝子によってコードされる
タンパク質が含まれる。生物的ストレスおよび非生物的ストレスの耐性として、
トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、
ダイズ、ピーナッツ、ワタ、アブラナおよびカノーラ、カサバ、コショウ、ヒマ
ワリおよびマンジュギク（ｔａｇｅｔｅｓ）、ナス科植物（ジャガイモ、タバコ
、ナスビおよびトマトなど）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ）属の種、エンドウ、アル
ファルファ、低木植物（コーヒー、カカオ、茶）、シダレヤナギ（Ｓａｌｉｘ）
属の種、樹木（アブラヤシ、ココナッツ）、ならびに多年草および飼料作物のよ
うな広範囲の植物に受け継がれることが望まれる一般的な形質が挙げられる。こ
れらの作物植物はまた、本発明の１つのさらなる実施形態として、遺伝子工学の
好ましい標的植物である。
【００１４】
従って、本発明の１つの態様は、ＬＭＲＰまたはその生物学的に活性な一部分
をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ）
、ならびにＬＭＲＰをコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を検出
または増幅するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして
好適な核酸フラグメントに関する。特に好ましい実施形態において、単離された
核酸分子は、付表Ａに示されるヌクレオチド配列の１つ、あるいはこれらのヌク
レオチド配列の１つのコード領域または相補体を含む。他の特に好ましい実施形
態において、本発明の単離された核酸分子は、付表Ａに示される１つのヌクレオ
チド配列にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列、あるいは付表Ａに示
される１つのヌクレオチド配列に対する相同性が少なくとも約５０％であり、好
ましくは少なくとも約６０％であり、より好ましくは少なくとも約７０％、８０
％または９０％であり、さらに最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％またはそれ以上であるヌクレオチド配列、あるいはその一
部分を含む。別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、付表Ｂに
示されるアミノ酸配列の１つをコードする。本発明の好ましいＬＭＲＰはまた、
好ましくは、本明細書中に記載されるＬＭＲＰ活性の少なくとも１つを有する。
をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ）
、ならびにＬＭＲＰをコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を検出
または増幅するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして
好適な核酸フラグメントに関する。特に好ましい実施形態において、単離された
核酸分子は、付表Ａに示されるヌクレオチド配列の１つ、あるいはこれらのヌク
レオチド配列の１つのコード領域または相補体を含む。他の特に好ましい実施形
態において、本発明の単離された核酸分子は、付表Ａに示される１つのヌクレオ
チド配列にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列、あるいは付表Ａに示
される１つのヌクレオチド配列に対する相同性が少なくとも約５０％であり、好
ましくは少なくとも約６０％であり、より好ましくは少なくとも約７０％、８０
％または９０％であり、さらに最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％またはそれ以上であるヌクレオチド配列、あるいはその一
部分を含む。別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、付表Ｂに
示されるアミノ酸配列の１つをコードする。本発明の好ましいＬＭＲＰはまた、
好ましくは、本明細書中に記載されるＬＭＲＰ活性の少なくとも１つを有する。
【００１５】
別の実施形態において、単離された核酸分子はタンパク質またはその一部分を
コードする。この場合、タンパク質またはその一部分は、付表Ｂのアミノ酸配列
に対して十分な相同性を有するアミノ酸配列、例えば、タンパク質またはその一
部分がＬＭＲＰ活性を維持するように付表Ｂのアミノ酸配列に対して十分な相同
性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によってコードされるタ
ンパク質またはその一部分は、植物の細胞膜の構築に必要な化合物の代謝または
これらの膜を横断する分子の輸送に関与する能力を維持している。１つの実施形
態において、核酸分子によってコードされるタンパク質は、付表Ｂの１つのアミ
ノ酸配列（例えば、付表Ｂに示されるそのような配列から選択される１つの完全
なアミノ酸配列）に対する相同性が少なくとも約５０％であり、好ましくは少な
くとも約６０％であり、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％または９０
％であり、さらに最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％またはそれ以上である。別の好ましい実施形態において、タンパク質は
、（付表Ａに示される１つのオープンリーディングフレームによってコードされ
る）付表Ｂの１つの完全なアミノ酸配列に対して実質的に相同的であるフィスコ
ミトレラ・パテンスの全長型タンパク質である。
コードする。この場合、タンパク質またはその一部分は、付表Ｂのアミノ酸配列
に対して十分な相同性を有するアミノ酸配列、例えば、タンパク質またはその一
部分がＬＭＲＰ活性を維持するように付表Ｂのアミノ酸配列に対して十分な相同
性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によってコードされるタ
ンパク質またはその一部分は、植物の細胞膜の構築に必要な化合物の代謝または
これらの膜を横断する分子の輸送に関与する能力を維持している。１つの実施形
態において、核酸分子によってコードされるタンパク質は、付表Ｂの１つのアミ
ノ酸配列（例えば、付表Ｂに示されるそのような配列から選択される１つの完全
なアミノ酸配列）に対する相同性が少なくとも約５０％であり、好ましくは少な
くとも約６０％であり、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％または９０
％であり、さらに最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％またはそれ以上である。別の好ましい実施形態において、タンパク質は
、（付表Ａに示される１つのオープンリーディングフレームによってコードされ
る）付表Ｂの１つの完全なアミノ酸配列に対して実質的に相同的であるフィスコ
ミトレラ・パテンスの全長型タンパク質である。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子はフィスコミトレラ・パ
テンスに由来し、そして付表Ｂのアミノ酸配列の１つに対する相同性が少なくと
も約５０％以上であり、かつ細胞膜の構築に必要な化合物の代謝またはこれらの
膜を横断する分子の輸送に関与することができ、あるいは表１に示される活性の
１つまたは複数を有する、生物学的に活性なドメインを含むタンパク質（例えば
、ＬＭＲＰ融合タンパク質）をコードする。単離された核酸分子はまた、異種の
ポリペプチドまたは調節領域をコードする異種の核酸配列を含む。
テンスに由来し、そして付表Ｂのアミノ酸配列の１つに対する相同性が少なくと
も約５０％以上であり、かつ細胞膜の構築に必要な化合物の代謝またはこれらの
膜を横断する分子の輸送に関与することができ、あるいは表１に示される活性の
１つまたは複数を有する、生物学的に活性なドメインを含むタンパク質（例えば
、ＬＭＲＰ融合タンパク質）をコードする。単離された核酸分子はまた、異種の
ポリペプチドまたは調節領域をコードする異種の核酸配列を含む。
【００１７】
本発明の別の態様は、例えば、改善された活性または変化した調節を有するポ
リペプチドをもたらすこの分野で知られているコンピューターシュミレーション
プログラム（分子モデリング）の助けをかりてそのアミノ酸配列が調節され得る
ＬＭＲＰポリペプチドに関する。この人為的に作製されたポリペプチド配列に基
づいて、そのような調節されたポリペプチドをコードする対応する核酸配列を、
所望する宿主細胞（例えば、微生物、コケ、藻類、繊毛虫類、菌類または植物）
の特定のコドン使用を使用してインビトロで合成することができる。
リペプチドをもたらすこの分野で知られているコンピューターシュミレーション
プログラム（分子モデリング）の助けをかりてそのアミノ酸配列が調節され得る
ＬＭＲＰポリペプチドに関する。この人為的に作製されたポリペプチド配列に基
づいて、そのような調節されたポリペプチドをコードする対応する核酸配列を、
所望する宿主細胞（例えば、微生物、コケ、藻類、繊毛虫類、菌類または植物）
の特定のコドン使用を使用してインビトロで合成することができる。
【００１８】
好ましい実施形態において、改善されたＬＭＲＰタンパク質をコードするこれ
らの人為的な核酸分子さえも本発明の範囲内である。
らの人為的な核酸分子さえも本発明の範囲内である。
【００１９】
別の実施形態において、単離された核酸分子は、長さが少なくとも１５ヌクレ
オチドであり、そしてストリンジェントな条件のもとで、付表Ａのヌクレオチド
配列を含む核酸分子にハイブリダイゼーションする。好ましくは、単離された核
酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。より好ましくは、単離された核
酸分子は、天然に存在するフィスコミトレラ・パテンスのＬＭＲＰまたはその生
物学的に活性な一部分をコードする。
オチドであり、そしてストリンジェントな条件のもとで、付表Ａのヌクレオチド
配列を含む核酸分子にハイブリダイゼーションする。好ましくは、単離された核
酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。より好ましくは、単離された核
酸分子は、天然に存在するフィスコミトレラ・パテンスのＬＭＲＰまたはその生
物学的に活性な一部分をコードする。
【００２０】
本発明の別の態様は、本発明の核酸分子を含有するベクター（例えば、組換え
発現ベクター）、およびそのようなベクターが導入されている宿主細胞（特に、
微生物、植物細胞、植物の組織または器官あるいは植物全体）に関する。１つの
実施形態において、そのような宿主細胞は、所望する化合物を集めた材料から単
離するために、ファインケミカル化合物を貯蔵することができる細胞である。そ
の場合、化合物またはＬＭＲＰを培地または宿主細胞から単離することができ、
宿主細胞は、植物では、ファインケミカル化合物を含有および貯蔵する細胞であ
り、最も好ましくは、表皮細胞および種子細胞のような貯蔵組織の細胞である。
発現ベクター）、およびそのようなベクターが導入されている宿主細胞（特に、
微生物、植物細胞、植物の組織または器官あるいは植物全体）に関する。１つの
実施形態において、そのような宿主細胞は、所望する化合物を集めた材料から単
離するために、ファインケミカル化合物を貯蔵することができる細胞である。そ
の場合、化合物またはＬＭＲＰを培地または宿主細胞から単離することができ、
宿主細胞は、植物では、ファインケミカル化合物を含有および貯蔵する細胞であ
り、最も好ましくは、表皮細胞および種子細胞のような貯蔵組織の細胞である。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、ＬＭＲＰ遺伝子が導入されているか、またはＬＭ
ＲＰ遺伝子が変化している遺伝子的に変化させたフィスコミトレラ・パテンス植
物に関する。１つの実施形態において、フィスコミトレラ・パテンス植物のゲノ
ムは、野性型または変異型のＬＭＲＰ配列をコードする本発明の核酸分子をトラ
ンスジーンとして導入することによって変化している。別の実施形態において、
フィスコミトレラ・パテンス植物のゲノム内に存在する内因性のＬＭＲＰ遺伝子
は、変化させたＬＭＲＰ遺伝子との相同的組換えによって変化している（例えば
、機能的に破壊されている）。好ましい実施形態において、植物生物はフィスコ
ミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）属またはセラトドン（Ｃｅｒａｔｏ
ｄｏｎ）属に属し、フィスコミトレラ属が特に好ましい。好ましい実施形態にお
いて、フィスコミトレラ・パテンス植物は、脂質または脂肪酸などの所望する化
合物（ＰＵＦＡが特に好ましい）を製造するためにもまた利用される。
ＲＰ遺伝子が変化している遺伝子的に変化させたフィスコミトレラ・パテンス植
物に関する。１つの実施形態において、フィスコミトレラ・パテンス植物のゲノ
ムは、野性型または変異型のＬＭＲＰ配列をコードする本発明の核酸分子をトラ
ンスジーンとして導入することによって変化している。別の実施形態において、
フィスコミトレラ・パテンス植物のゲノム内に存在する内因性のＬＭＲＰ遺伝子
は、変化させたＬＭＲＰ遺伝子との相同的組換えによって変化している（例えば
、機能的に破壊されている）。好ましい実施形態において、植物生物はフィスコ
ミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）属またはセラトドン（Ｃｅｒａｔｏ
ｄｏｎ）属に属し、フィスコミトレラ属が特に好ましい。好ましい実施形態にお
いて、フィスコミトレラ・パテンス植物は、脂質または脂肪酸などの所望する化
合物（ＰＵＦＡが特に好ましい）を製造するためにもまた利用される。
【００２２】
従って、別の好ましい実施形態において、コケのフィスコミトレラ・パテンス
は、本発明に記載される核酸に基づく相同的組換えを使用して、コケまたは植物
の新しいが、まだ同定されていない遺伝子の機能を明らかにするために使用する
ことができる。
は、本発明に記載される核酸に基づく相同的組換えを使用して、コケまたは植物
の新しいが、まだ同定されていない遺伝子の機能を明らかにするために使用する
ことができる。
【００２３】
本発明のさらにまた別の態様は、単離されたＬＭＲＰまたはその一部分（例え
ば、生物学的に活性な一部分）に関する。好ましい実施形態において、単離され
たＬＭＲＰまたはその一部分は、微生物細胞または植物細胞における細胞膜の構
築に必要な化合物の代謝あるいはその膜を横断する分子の輸送に関与し得る。別
の好ましい実施形態において、単離されたＬＭＲＰまたはその一部分は、タンパ
ク質またはその一部分が微生物細胞または植物細胞における細胞膜の構築に必要
な化合物の代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与する能力を維持
するように、付表Ｂのアミノ酸配列に対して十分な相同性を有する。
ば、生物学的に活性な一部分）に関する。好ましい実施形態において、単離され
たＬＭＲＰまたはその一部分は、微生物細胞または植物細胞における細胞膜の構
築に必要な化合物の代謝あるいはその膜を横断する分子の輸送に関与し得る。別
の好ましい実施形態において、単離されたＬＭＲＰまたはその一部分は、タンパ
ク質またはその一部分が微生物細胞または植物細胞における細胞膜の構築に必要
な化合物の代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与する能力を維持
するように、付表Ｂのアミノ酸配列に対して十分な相同性を有する。
【００２４】
本発明はまた、ＬＭＲＰの単離された調製物を提供する。好ましい実施形態に
おいて、ＬＭＲＰは、付表Ｂのアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態にお
いて、本発明は、（付表Ａに示される１つのオープンリーディングフレームによ
ってコードされる）付表Ｂの１つの完全なアミノ酸配列に対して実質的に相同的
である単離された全長型タンパク質に関する。さらに別の実施形態において、タ
ンパク質は、付表Ｂの１つの完全なアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも約
５０％であり、好ましくは少なくとも約６０％であり、より好ましくは少なくと
も約７０％、８０％または９０％であり、さらに最も好ましくは少なくとも約９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。別の実施形態に
おいて、単離されたＬＭＲＰは、付表Ｂのアミノ酸配列の１つに対する相同性が
少なくとも約５０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ微生物細胞または植物
細胞における脂肪酸の構築に必要な化合物の代謝またはこれらの膜を横断する分
子の輸送に関与することができ、あるいは表１に示される活性の１つまたは２つ
以上を有する。
おいて、ＬＭＲＰは、付表Ｂのアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態にお
いて、本発明は、（付表Ａに示される１つのオープンリーディングフレームによ
ってコードされる）付表Ｂの１つの完全なアミノ酸配列に対して実質的に相同的
である単離された全長型タンパク質に関する。さらに別の実施形態において、タ
ンパク質は、付表Ｂの１つの完全なアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも約
５０％であり、好ましくは少なくとも約６０％であり、より好ましくは少なくと
も約７０％、８０％または９０％であり、さらに最も好ましくは少なくとも約９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。別の実施形態に
おいて、単離されたＬＭＲＰは、付表Ｂのアミノ酸配列の１つに対する相同性が
少なくとも約５０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ微生物細胞または植物
細胞における脂肪酸の構築に必要な化合物の代謝またはこれらの膜を横断する分
子の輸送に関与することができ、あるいは表１に示される活性の１つまたは２つ
以上を有する。
【００２５】
あるいは、単離されたＬＭＲＰは、付表Ｂの１つのヌクレオチド配列にハイブ
リダイゼーションする（例えば、ストリンジェントな条件のもとでハイブリダイ
ゼーションする）ヌクレオチド配列によって、あるいは付表Ｂの１つのヌクレオ
チド配列に対する相同性が少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約
６０％であり、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％または９０％であり
、さらに最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
またはそれ以上であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含
むことができる。
リダイゼーションする（例えば、ストリンジェントな条件のもとでハイブリダイ
ゼーションする）ヌクレオチド配列によって、あるいは付表Ｂの１つのヌクレオ
チド配列に対する相同性が少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約
６０％であり、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％または９０％であり
、さらに最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
またはそれ以上であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含
むことができる。
【００２６】
ＬＭＲＰポリペプチドまたはその生物学的に活性な一部分は、融合タンパク質
を形成させるために非ＬＭＲＰポリペプチドに対して機能的に連結することがで
きる。好ましい実施形態において、この融合タンパク質は、ＬＭＲＰ単独の活性
とは異なる活性を有する。別の好ましい実施形態において、この融合タンパク質
は、微生物または植物における脂質および脂肪酸、補助因子および酵素の合成に
必要な化合物の代謝あるいは植物の膜を横断する分子の輸送に関与する。特に好
ましい実施形態において、この融合タンパク質を宿主細胞に組み込むことにより
、所望する化合物の宿主細胞からの産生が調節される。
を形成させるために非ＬＭＲＰポリペプチドに対して機能的に連結することがで
きる。好ましい実施形態において、この融合タンパク質は、ＬＭＲＰ単独の活性
とは異なる活性を有する。別の好ましい実施形態において、この融合タンパク質
は、微生物または植物における脂質および脂肪酸、補助因子および酵素の合成に
必要な化合物の代謝あるいは植物の膜を横断する分子の輸送に関与する。特に好
ましい実施形態において、この融合タンパク質を宿主細胞に組み込むことにより
、所望する化合物の宿主細胞からの産生が調節される。
【００２７】
本発明の別の態様はファインケミカルの製造方法に関する。この方法は、ファ
インケミカルが産生されるように、本発明のＬＭＲＰ核酸分子の発現を行わせる
ベクターを含有する好適な微生物を培養すること、あるいはそのようなベクター
を含有する植物の細胞、組織、器官または植物全体を培養することのいずれかを
含む。好ましい実施形態において、この方法はさらに、そのようなベクターを含
有する細胞を得る工程を含む。この場合、細胞は、ＬＭＲＰ核酸の発現を行わせ
るベクターで形質転換される。別の好ましい実施形態において、この方法はさら
に、ファインケミカルを培養物から回収する工程を含む。特に好ましい実施形態
において、細胞は、フィスコミトレラ属、ファエオダクチルム属、コリネバクテ
リウム属、繊毛虫類、菌類または植物に由来し、特に脂肪種子に由来する。
インケミカルが産生されるように、本発明のＬＭＲＰ核酸分子の発現を行わせる
ベクターを含有する好適な微生物を培養すること、あるいはそのようなベクター
を含有する植物の細胞、組織、器官または植物全体を培養することのいずれかを
含む。好ましい実施形態において、この方法はさらに、そのようなベクターを含
有する細胞を得る工程を含む。この場合、細胞は、ＬＭＲＰ核酸の発現を行わせ
るベクターで形質転換される。別の好ましい実施形態において、この方法はさら
に、ファインケミカルを培養物から回収する工程を含む。特に好ましい実施形態
において、細胞は、フィスコミトレラ属、ファエオダクチルム属、コリネバクテ
リウム属、繊毛虫類、菌類または植物に由来し、特に脂肪種子に由来する。
【００２８】
本発明の別の態様は、本発明のＬＭＲＰ核酸分子を含むことによってそのゲノ
ムＤＮＡが変化している好適な宿主細胞を培養することを含むファインケミカル
の製造方法に関する。別の実施形態において、この方法は、本発明のＬＭＲＰポ
リペプチドを含むことによってその膜が変化している好適な宿主細胞を培養する
ことを含む。
ムＤＮＡが変化している好適な宿主細胞を培養することを含むファインケミカル
の製造方法に関する。別の実施形態において、この方法は、本発明のＬＭＲＰポ
リペプチドを含むことによってその膜が変化している好適な宿主細胞を培養する
ことを含む。
【００２９】
本発明の別の態様は、微生物からの分子の産生を調節する方法に関する。その
方法は、細胞に結合した活性が薬剤の非存在下でこの同じ活性に対して変化する
ように、細胞を、ＬＭＲＰ活性またはＬＭＲＰ核酸の発現を調節する薬剤と接触
させることを含む。好ましい実施形態において、細胞は、脂質および脂肪酸、補
助因子および酵素に対する１つまたは複数の代謝経路について調節されるか、あ
るいはそのような膜を横断する化合物の輸送について調節され、その結果、この
微生物による所望するファインケミカルの収率または生成速度が改善される。Ｌ
ＭＲＰ活性を調節する薬剤として、ＬＭＲＰ活性またはＬＭＲＰ核酸の発現を刺
激する薬剤を挙げることができる。ＬＭＲＰ活性またはＬＭＲＰ核酸の発現を刺
激する薬剤の例には、小分子、活性なＬＭＲＰ、および細胞に導入されているＬ
ＭＲＰをコードする核酸が含まれる。ＬＭＲＰの活性または発現を阻害する薬剤
の例には、小分子およびアンチセンスＬＭＲＰ核酸分子が含まれる。
方法は、細胞に結合した活性が薬剤の非存在下でこの同じ活性に対して変化する
ように、細胞を、ＬＭＲＰ活性またはＬＭＲＰ核酸の発現を調節する薬剤と接触
させることを含む。好ましい実施形態において、細胞は、脂質および脂肪酸、補
助因子および酵素に対する１つまたは複数の代謝経路について調節されるか、あ
るいはそのような膜を横断する化合物の輸送について調節され、その結果、この
微生物による所望するファインケミカルの収率または生成速度が改善される。Ｌ
ＭＲＰ活性を調節する薬剤として、ＬＭＲＰ活性またはＬＭＲＰ核酸の発現を刺
激する薬剤を挙げることができる。ＬＭＲＰ活性またはＬＭＲＰ核酸の発現を刺
激する薬剤の例には、小分子、活性なＬＭＲＰ、および細胞に導入されているＬ
ＭＲＰをコードする核酸が含まれる。ＬＭＲＰの活性または発現を阻害する薬剤
の例には、小分子およびアンチセンスＬＭＲＰ核酸分子が含まれる。
【００３０】
本発明の別の態様は、細胞からの所望する化合物の収率を調節する方法に関す
る。この方法は、野性型または変異型のＬＭＲＰ遺伝子を細胞に導入することを
伴う。この場合、そのようなＬＭＲＰ遺伝子は、別個のプラスミドに維持される
か、または宿主細胞のゲノム内に組み込まれるかのいずれかである。ゲノム内に
組み込まれる場合、そのような組み込みはランダムであり得るか、あるいは、組
み込みは、導入された遺伝子によって本来の遺伝子が置換され、これにより、細
胞からの所望する化合物の産生が調節されるような組換えによって生じ得るか、
または遺伝子の発現を促進させる配列および機能的に転写された遺伝子のポリア
デニル化を促進させる配列を少なくとも含有する機能的な発現ユニットに対して
機能的に連結されている遺伝子などの遺伝子をトランスで使用することによって
生じ得る。
る。この方法は、野性型または変異型のＬＭＲＰ遺伝子を細胞に導入することを
伴う。この場合、そのようなＬＭＲＰ遺伝子は、別個のプラスミドに維持される
か、または宿主細胞のゲノム内に組み込まれるかのいずれかである。ゲノム内に
組み込まれる場合、そのような組み込みはランダムであり得るか、あるいは、組
み込みは、導入された遺伝子によって本来の遺伝子が置換され、これにより、細
胞からの所望する化合物の産生が調節されるような組換えによって生じ得るか、
または遺伝子の発現を促進させる配列および機能的に転写された遺伝子のポリア
デニル化を促進させる配列を少なくとも含有する機能的な発現ユニットに対して
機能的に連結されている遺伝子などの遺伝子をトランスで使用することによって
生じ得る。
【００３１】
好ましい実施形態において、前記の収率が改変される。別の好ましい実施形態
において、前記の所望される化学物質を増大させ、その一方で望ましくない妨害
化合物を低下させることができる。特に好ましい実施形態において、前記の所望
するファインケミカルは、脂質または脂肪酸、補助因子または酵素である。特に
好ましい実施形態において、前記化学物質は多不飽和脂肪酸である。
において、前記の所望される化学物質を増大させ、その一方で望ましくない妨害
化合物を低下させることができる。特に好ましい実施形態において、前記の所望
するファインケミカルは、脂質または脂肪酸、補助因子または酵素である。特に
好ましい実施形態において、前記化学物質は多不飽和脂肪酸である。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、コケのフィスコミトレラ・パテンスにおける脂質および脂肪酸、補
助因子および酵素の代謝またはそのような膜を横断する親油性化合物の輸送に関
与しているＬＭＲＰ核酸分子およびＬＭＲＰタンパク質分子を提供する。本発明
の分子は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ヘルクリス（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・アセト
アシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈ
ｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセト
フィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｐｈｉｌｕｍ）、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍ
ｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・フジオケンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｊｉｏｋｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・ニトリロフィ
ルス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｉｔｒｉｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏ
ｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・ブタニクム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｂｕｔａｎｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ジバリカツム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フ
ラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム
・ヘアリイ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅａｌｉｉ）、ブレビバクテリ
ウム・ケトグルタミクム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋｅｔｏｇｌｕｔａ
ｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ケトソレヅクツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｋｅｔｏｓｏｒｅｄｕｃｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）
、ブレビバクテリウム・リネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎ
ｓ）またはブレビバクテリウム・パラフィノリチクム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｐａｒａｆｆｉｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）からなる群から選択されるコリネ
バクテリオウム属またはブレビバクテリウム属などの微生物からのファインケミ
カルの産生を調節する際に利用することができる。さらに、本発明の分子は、繊
毛虫類、菌類、コケ、藻類および植物（トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オー
トムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ピーナッツ、ワタ、アブラナ属
の種（アブラナ、カノーラおよびカブなど）、コショウ、ヒマワリおよびマンジ
ュギク（ｔａｇｅｔｅｓ）、ナス科植物（ジャガイモ、タバコ、ナスビおよびト
マトなど）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ）属の種、エンドウ、カサバ、アルファルフ
ァ、低木植物（コーヒー、カカオ、茶）、シダレヤナギ（Ｓａｌｉｘ）属の種、
樹木（アブラヤシ、ココナッツ）、ならびに多年草および飼料作物など）からの
ファインケミカルの産生を調節する際に直接的に利用することができ（例えば、
脂肪酸生合成タンパク質の過剰発現または最適化が、改変された植物からの脂肪
酸の収率、産生および／または産生効率に対して直接的な影響を有する場合）、
あるいはそれにも関わらず、所望する化合物の収率、産生および／または産生効
率を増大させるか、または望ましくない化合物を低下させる間接的な影響を有し
得る（例えば、脂質および脂肪酸、補助因子および酵素の代謝を調節することに
より、所望する化合物の収率、産生および／または産生効率または細胞内の所望
する化合物組成が変化し、これにより、１つまたは複数のファインケミカルの産
生が影響され得る場合）。本発明の様々な態様を下記においてさらに説明する。
助因子および酵素の代謝またはそのような膜を横断する親油性化合物の輸送に関
与しているＬＭＲＰ核酸分子およびＬＭＲＰタンパク質分子を提供する。本発明
の分子は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ヘルクリス（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・アセト
アシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈ
ｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセト
フィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｐｈｉｌｕｍ）、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍ
ｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・フジオケンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｊｉｏｋｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・ニトリロフィ
ルス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｉｔｒｉｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏ
ｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・ブタニクム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｂｕｔａｎｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ジバリカツム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フ
ラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム
・ヘアリイ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅａｌｉｉ）、ブレビバクテリ
ウム・ケトグルタミクム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋｅｔｏｇｌｕｔａ
ｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ケトソレヅクツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｋｅｔｏｓｏｒｅｄｕｃｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）
、ブレビバクテリウム・リネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎ
ｓ）またはブレビバクテリウム・パラフィノリチクム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｐａｒａｆｆｉｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）からなる群から選択されるコリネ
バクテリオウム属またはブレビバクテリウム属などの微生物からのファインケミ
カルの産生を調節する際に利用することができる。さらに、本発明の分子は、繊
毛虫類、菌類、コケ、藻類および植物（トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オー
トムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ピーナッツ、ワタ、アブラナ属
の種（アブラナ、カノーラおよびカブなど）、コショウ、ヒマワリおよびマンジ
ュギク（ｔａｇｅｔｅｓ）、ナス科植物（ジャガイモ、タバコ、ナスビおよびト
マトなど）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ）属の種、エンドウ、カサバ、アルファルフ
ァ、低木植物（コーヒー、カカオ、茶）、シダレヤナギ（Ｓａｌｉｘ）属の種、
樹木（アブラヤシ、ココナッツ）、ならびに多年草および飼料作物など）からの
ファインケミカルの産生を調節する際に直接的に利用することができ（例えば、
脂肪酸生合成タンパク質の過剰発現または最適化が、改変された植物からの脂肪
酸の収率、産生および／または産生効率に対して直接的な影響を有する場合）、
あるいはそれにも関わらず、所望する化合物の収率、産生および／または産生効
率を増大させるか、または望ましくない化合物を低下させる間接的な影響を有し
得る（例えば、脂質および脂肪酸、補助因子および酵素の代謝を調節することに
より、所望する化合物の収率、産生および／または産生効率または細胞内の所望
する化合物組成が変化し、これにより、１つまたは複数のファインケミカルの産
生が影響され得る場合）。本発明の様々な態様を下記においてさらに説明する。
【００３３】
ファインケミカル
用語「ファインケミカル」はこの分野では認識されており、これには、製薬業
界、農業および化粧品業界（これらに限定されない）などの様々な業界で様々な
用途を有する、生物により産生される分子が含まれる。そのような化合物には、
脂質、脂肪酸、補助因子および酵素、タンパク質原性および非タンパク質原性の
両方のアミノ酸、プリン塩基およびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ならびにヌ
クレオチド（例えば、Ｋｕｎｉｎａｋａ，Ａ．（１９９６）、ヌクレオチドおよ
び関連化合物、５６１頁〜６１２頁、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、Ｒ
ｅｈｍら編、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、およびそれに含まれる参考文献に記載
されるような化合物）、脂質、飽和型および多価不飽和型の両方の脂肪酸（例え
ば、アラキドン酸）、ジオール（例えば、プロパンジオールおよびブタンジオー
ル）、炭水化物（例えば、ヒアルロン酸およびトレハロース）、芳香族化合物（
例えば、芳香族アミン、バニリンおよびインジゴ）、ビタミンおよび補助因子（
Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第Ａ２７巻、Ｖｉｔａｍｉｎｅ、４４３頁〜６１３頁（
１９９６）、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、およびそれに含まれる参考文献；Ｏｎ
ｇ，Ａ．Ｓ．、Ｎｉｋｉ，Ｅ．＆Ｐａｃｋｅｒ，Ｌ．（１９９５）、ＵＮＥＳＣ
Ｏ／マレーシア科学技術協会およびフリーラジカル研究会（アジア）連合（ペナ
ン（マレーシア）において１９９４年９月１日〜３日に開催）の「栄養、脂質、
健康および疾患」の議事録、ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されるよ
うなもの）、酵素、ならびにＧｕｔｃｈｏ（１９８３）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
ｂｙ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（Ｎｏｙｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ、ＩＳＢＮ：０８１８８０５０８６）およびその参考文献に記載されるすべ
ての他の化学物質が含まれる。これらのファインケミカルのいくつかの代謝およ
び使用を下記においてさらに説明する。
界、農業および化粧品業界（これらに限定されない）などの様々な業界で様々な
用途を有する、生物により産生される分子が含まれる。そのような化合物には、
脂質、脂肪酸、補助因子および酵素、タンパク質原性および非タンパク質原性の
両方のアミノ酸、プリン塩基およびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ならびにヌ
クレオチド（例えば、Ｋｕｎｉｎａｋａ，Ａ．（１９９６）、ヌクレオチドおよ
び関連化合物、５６１頁〜６１２頁、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、Ｒ
ｅｈｍら編、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、およびそれに含まれる参考文献に記載
されるような化合物）、脂質、飽和型および多価不飽和型の両方の脂肪酸（例え
ば、アラキドン酸）、ジオール（例えば、プロパンジオールおよびブタンジオー
ル）、炭水化物（例えば、ヒアルロン酸およびトレハロース）、芳香族化合物（
例えば、芳香族アミン、バニリンおよびインジゴ）、ビタミンおよび補助因子（
Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第Ａ２７巻、Ｖｉｔａｍｉｎｅ、４４３頁〜６１３頁（
１９９６）、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、およびそれに含まれる参考文献；Ｏｎ
ｇ，Ａ．Ｓ．、Ｎｉｋｉ，Ｅ．＆Ｐａｃｋｅｒ，Ｌ．（１９９５）、ＵＮＥＳＣ
Ｏ／マレーシア科学技術協会およびフリーラジカル研究会（アジア）連合（ペナ
ン（マレーシア）において１９９４年９月１日〜３日に開催）の「栄養、脂質、
健康および疾患」の議事録、ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されるよ
うなもの）、酵素、ならびにＧｕｔｃｈｏ（１９８３）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
ｂｙ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（Ｎｏｙｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ、ＩＳＢＮ：０８１８８０５０８６）およびその参考文献に記載されるすべ
ての他の化学物質が含まれる。これらのファインケミカルのいくつかの代謝およ
び使用を下記においてさらに説明する。
【００３４】
Ｉ．脂質および脂肪酸、補助因子および酵素
細胞膜は細胞内の様々な機能を果たしている。まず第一に、膜は、細胞の内容
物を周囲の環境から区別し、従って細胞に一体性を提供する。膜はまた、有害な
化合物または望ましくない化合物の流入に対するバリアとして、そしてまた所望
する化合物の流出に対するバリアとして役立ち得る。細胞膜は、本質的には、そ
の構造（脂質分子の二重層、この二重層において、極性の頭部基が（それぞれ細
胞の外側および内側に向かって）外側を向き、そして非極性の尾部が二重層の中
心部で内側を向き、これにより疎水性のコアが形成される）のために、タンパク
質、水分子およびイオンなどの親水性化合物の促進されない拡散に対して不浸透
性である（膜の構造および機能の一般的な総説については、Ｇｅｎｎｉｓ，Ｒ．
Ｂ．（１９８９）、Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｈｅｉｄｅｌｂｅ
ｒｇを参照のこと）。このバリアにより、細胞は、周囲の培地に含有されるより
も相対的に高い濃度の所望する化合物および相対的に低い濃度の望ましくない化
合物を維持することができる。これは、これらの化合物の拡散が膜によって効果
的に阻止されるからである。
物を周囲の環境から区別し、従って細胞に一体性を提供する。膜はまた、有害な
化合物または望ましくない化合物の流入に対するバリアとして、そしてまた所望
する化合物の流出に対するバリアとして役立ち得る。細胞膜は、本質的には、そ
の構造（脂質分子の二重層、この二重層において、極性の頭部基が（それぞれ細
胞の外側および内側に向かって）外側を向き、そして非極性の尾部が二重層の中
心部で内側を向き、これにより疎水性のコアが形成される）のために、タンパク
質、水分子およびイオンなどの親水性化合物の促進されない拡散に対して不浸透
性である（膜の構造および機能の一般的な総説については、Ｇｅｎｎｉｓ，Ｒ．
Ｂ．（１９８９）、Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｈｅｉｄｅｌｂｅ
ｒｇを参照のこと）。このバリアにより、細胞は、周囲の培地に含有されるより
も相対的に高い濃度の所望する化合物および相対的に低い濃度の望ましくない化
合物を維持することができる。これは、これらの化合物の拡散が膜によって効果
的に阻止されるからである。
【００３５】
しかし、膜はまた、所望する化合物を細胞内に輸送し、そして不用な分子を細
胞外に輸送するための効果的なバリアを提供する。この困難なことを克服するた
めに、細胞膜は、異なる種類の化合物の膜貫通輸送を促進させることができる多
種類の輸送体タンパク質を含む。これらの輸送タンパク質には、ポアまたはチャ
ンネルおよび輸送体の２つの一般的な種類がある。前者は、膜を通り抜ける調節
された穴を形成する内在性膜タンパク質（ときにはタンパク質の複合体）である
。この調節または「ゲーティング」は、一般に、ポアまたはチャンネルによって
輸送される分子に対して特異的であり、このため、これらの膜貫通構造物は、特
定の種類の物質に対して選択的透過性になる。例えば、カリウムチャンネルは、
カリウムの電荷およびサイズに類似する電荷およびサイズを有するイオンのみが
通過できるように組み立てられる。チャンネルタンパク質およびポアタンパク質
は、タンパク質の疎水性の面が膜の内側と会合することができ、その一方で、親
水性の面がチャンネルの内側に並び、従って、選択された親水性分子が通過でき
る保護された親水性環境が提供されるように別々の疎水性ドメインおよび親水性
ドメインを有する傾向がある。カリウムイオン、カルシウムイオン、ナトリウム
イオンおよび塩化物イオンに対するポア／チャンネルを含む多くのそのようなポ
ア／チャンネルがこの分野では知られている。
胞外に輸送するための効果的なバリアを提供する。この困難なことを克服するた
めに、細胞膜は、異なる種類の化合物の膜貫通輸送を促進させることができる多
種類の輸送体タンパク質を含む。これらの輸送タンパク質には、ポアまたはチャ
ンネルおよび輸送体の２つの一般的な種類がある。前者は、膜を通り抜ける調節
された穴を形成する内在性膜タンパク質（ときにはタンパク質の複合体）である
。この調節または「ゲーティング」は、一般に、ポアまたはチャンネルによって
輸送される分子に対して特異的であり、このため、これらの膜貫通構造物は、特
定の種類の物質に対して選択的透過性になる。例えば、カリウムチャンネルは、
カリウムの電荷およびサイズに類似する電荷およびサイズを有するイオンのみが
通過できるように組み立てられる。チャンネルタンパク質およびポアタンパク質
は、タンパク質の疎水性の面が膜の内側と会合することができ、その一方で、親
水性の面がチャンネルの内側に並び、従って、選択された親水性分子が通過でき
る保護された親水性環境が提供されるように別々の疎水性ドメインおよび親水性
ドメインを有する傾向がある。カリウムイオン、カルシウムイオン、ナトリウム
イオンおよび塩化物イオンに対するポア／チャンネルを含む多くのそのようなポ
ア／チャンネルがこの分野では知られている。
【００３６】
促進された拡散のこのポアおよびチャンネルにより媒介されるシステムはイオ
ンなどの非常に小さい分子に限られている。これは、促進された拡散によるタン
パク質全体の通過を可能するために十分に大きいポアまたはチャンネルはまた、
それよりも小さい親水性分子の通過を妨げることができないからである。このプ
ロセスによる分子の輸送は、濃度勾配の駆動力が輸送を生じさせるために必要で
あるために、「促進された拡散」と呼ばれることがある。パーミアーゼはまた、
グルコースまたは他の糖などのより大きな分子の細胞内への促進された拡散を、
膜の一方側におけるこれらの分子の濃度が反対側の濃度よりも大きい場合に可能
にする（これはまた「単輸送」と呼ばれている）。ポアまたはチャンエルとは対
照的に、（膜を貫通する６個〜１４個のα−ヘリックスを有することが多い）こ
れらの内在性膜タンパク質は、膜を通り抜ける開いたチャンネルを形成せず、む
しろ膜の表面で標的分子に結合し、その後、標的分子が膜の反対側で放出される
ような立体配座の変化を受ける。
ンなどの非常に小さい分子に限られている。これは、促進された拡散によるタン
パク質全体の通過を可能するために十分に大きいポアまたはチャンネルはまた、
それよりも小さい親水性分子の通過を妨げることができないからである。このプ
ロセスによる分子の輸送は、濃度勾配の駆動力が輸送を生じさせるために必要で
あるために、「促進された拡散」と呼ばれることがある。パーミアーゼはまた、
グルコースまたは他の糖などのより大きな分子の細胞内への促進された拡散を、
膜の一方側におけるこれらの分子の濃度が反対側の濃度よりも大きい場合に可能
にする（これはまた「単輸送」と呼ばれている）。ポアまたはチャンエルとは対
照的に、（膜を貫通する６個〜１４個のα−ヘリックスを有することが多い）こ
れらの内在性膜タンパク質は、膜を通り抜ける開いたチャンネルを形成せず、む
しろ膜の表面で標的分子に結合し、その後、標的分子が膜の反対側で放出される
ような立体配座の変化を受ける。
【００３７】
しかし、細胞は、多くの場合、存在する濃度勾配に逆らった分子の細胞内また
は細胞外への輸送（「能動輸送」）を必要とする。そのような状況では、促進さ
れた拡散は生じ得ない。２つの一般的な機構がそのような膜輸送のために細胞に
よって使用されている：共輸送または対向輸送、およびＡＢＣ輸送体によって媒
介される輸送などのエネルギー共役輸送。共輸送および対向輸送のシステムは、
（２つの異なる分子に対して２つの別々の結合部位を有するパーミアーゼを介し
て）膜を横断する２つの異なる分子の動きを結び付けている。すなわち、共輸送
では、２つの分子が同じ方向に輸送されるが、対向輸送では、１つの分子が細胞
内に輸送され、同時にもう一方の分子が細胞外に輸送される。これは、２つの分
子のうちの一方が濃度勾配に従って移動するためにエネルギー的に可能であり、
そしてエネルギー的に有利なこの事象は、支配的な濃度勾配に逆らって所望する
化合物が同時に動くときにだけ可能になる。単分子は、ＡＢＣ輸送体によって利
用されるプロセスなどのエネルギー駆動プロセスで濃度勾配に逆らって膜を横断
して輸送され得る。このシステムにおいて、膜に存在する輸送タンパク質はＡＴ
Ｐ結合カセットを有する；標的分子が結合したとき、ＡＴＰがＡＤＰ＋Ｐｉに変
換され、生じたエネルギー放出が標的分子を膜の反対側に移動させるために使用
される。これは輸送体によって促進される。これらの輸送システムのすべてのよ
り詳しい記載については、Ｂａｍｂｅｒｇ，Ｅ．ら（１９９３）、脂質二重層膜
におけるイオンポンプの電荷輸送、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｙｓ．２６：１〜２５
；Ｆｉｎｄｌａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｃ．（１９９１）、膜輸送システムにおける構造お
よび機能、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１：８０４〜８１０
；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｃ．Ｆ．（１９９２）、微生物からヒトまでのＡＢＣ輸送体
、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：６７〜１１３；Ｇｅｎｎｉｓ，Ｒ
．Ｂ．（１９８９）、ポア、チャンネルおよび輸送体：Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ
ｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ：Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２７０頁〜３２２頁；Ｎｉｋａｉｄｏ
，Ｈ．およびＳａｉｅｒ，Ｈ．（１９９２）、細菌における輸送タンパク質：そ
れらの設計における共通したテーマ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：９３６〜９４２
；ならびにこれらの参考文献のそれぞれに含まれる参考文献を参照のこと。
は細胞外への輸送（「能動輸送」）を必要とする。そのような状況では、促進さ
れた拡散は生じ得ない。２つの一般的な機構がそのような膜輸送のために細胞に
よって使用されている：共輸送または対向輸送、およびＡＢＣ輸送体によって媒
介される輸送などのエネルギー共役輸送。共輸送および対向輸送のシステムは、
（２つの異なる分子に対して２つの別々の結合部位を有するパーミアーゼを介し
て）膜を横断する２つの異なる分子の動きを結び付けている。すなわち、共輸送
では、２つの分子が同じ方向に輸送されるが、対向輸送では、１つの分子が細胞
内に輸送され、同時にもう一方の分子が細胞外に輸送される。これは、２つの分
子のうちの一方が濃度勾配に従って移動するためにエネルギー的に可能であり、
そしてエネルギー的に有利なこの事象は、支配的な濃度勾配に逆らって所望する
化合物が同時に動くときにだけ可能になる。単分子は、ＡＢＣ輸送体によって利
用されるプロセスなどのエネルギー駆動プロセスで濃度勾配に逆らって膜を横断
して輸送され得る。このシステムにおいて、膜に存在する輸送タンパク質はＡＴ
Ｐ結合カセットを有する；標的分子が結合したとき、ＡＴＰがＡＤＰ＋Ｐｉに変
換され、生じたエネルギー放出が標的分子を膜の反対側に移動させるために使用
される。これは輸送体によって促進される。これらの輸送システムのすべてのよ
り詳しい記載については、Ｂａｍｂｅｒｇ，Ｅ．ら（１９９３）、脂質二重層膜
におけるイオンポンプの電荷輸送、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｙｓ．２６：１〜２５
；Ｆｉｎｄｌａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｃ．（１９９１）、膜輸送システムにおける構造お
よび機能、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１：８０４〜８１０
；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｃ．Ｆ．（１９９２）、微生物からヒトまでのＡＢＣ輸送体
、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：６７〜１１３；Ｇｅｎｎｉｓ，Ｒ
．Ｂ．（１９８９）、ポア、チャンネルおよび輸送体：Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ
ｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ：Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２７０頁〜３２２頁；Ｎｉｋａｉｄｏ
，Ｈ．およびＳａｉｅｒ，Ｈ．（１９９２）、細菌における輸送タンパク質：そ
れらの設計における共通したテーマ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：９３６〜９４２
；ならびにこれらの参考文献のそれぞれに含まれる参考文献を参照のこと。
【００３８】
膜の合成は、脂質分子がその最も重要な成分である多数の成分を伴う十分に特
徴付けられたプロセスである。脂質合成は、脂肪酸の合成および脂肪酸のｓｎ−
グリセロール−３−リン酸への結合と、極性頭部基の付加または修飾との２つの
部分に分けることができる。細菌の膜において利用されている典型的な脂質には
、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質およびホスホグリセリドが含まれる。脂肪
酸は、長い炭化水素鎖および末端のカルボン酸基を含有する一群の化合物である
。脂肪酸には下記が含まれる：ラウリン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸
、ステアリン酸、オレイン酸、タキソオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸
、リノレイン酸、γ−リノレイン酸、ピノレイン酸、α−リノレイン酸、ステア
リドン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、ベヘン酸、エルカ酸、ドカサジエン酸
、アラキドン酸、ω６−エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレイン酸、エイ
カサペンタン酸（チムノドン酸）、ω３−エイコサトリエン酸、ω３−エイコサ
テトラエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸（セルボン酸）、リグ
ノセリン酸、および明示的に示されていないこのクラスのさらなる脂肪酸。脂肪
酸合成は、アセチルＣｏＡのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼによるマロニルＣ
ｏＡへの変換またはアセチルトランスアシラーゼによるアセチルＡＣＰへの変換
のいずれかとともに始まる。縮合反応後、これらの２つの生成物分子は一緒にな
ってアセトアセチルＡＣＰを形成し、これは、一連の縮合反応、還元反応および
脱水反応によって変換され、所望する鎖長を有する飽和脂肪酸分子になる。その
ような分子からの不飽和脂肪酸の産生は、分子状酸素の助けによって好気的に、
または嫌気的に、そのいずれかで特異的なデサチュラーゼにより触媒される（微
生物における脂肪酸合成に対する参照については、Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ
ら（１９９６）、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＡＳＭ Ｐｒ
ｅｓｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ，Ｄ．Ｃ．、６１２頁〜６３２頁、およびそれに含
まれる参考文献；Ｌｅｎｇｅｌｅｒら（編）（１９９９）、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ、Ｔｈｉｅｍｅ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、およびそれに含まれる参考文献；Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｋ．ら（１９９３
）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５７：５２２〜５４２
、およびそれに含まれる参考文献を参照のこと）。
徴付けられたプロセスである。脂質合成は、脂肪酸の合成および脂肪酸のｓｎ−
グリセロール−３−リン酸への結合と、極性頭部基の付加または修飾との２つの
部分に分けることができる。細菌の膜において利用されている典型的な脂質には
、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質およびホスホグリセリドが含まれる。脂肪
酸は、長い炭化水素鎖および末端のカルボン酸基を含有する一群の化合物である
。脂肪酸には下記が含まれる：ラウリン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸
、ステアリン酸、オレイン酸、タキソオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸
、リノレイン酸、γ−リノレイン酸、ピノレイン酸、α−リノレイン酸、ステア
リドン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、ベヘン酸、エルカ酸、ドカサジエン酸
、アラキドン酸、ω６−エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレイン酸、エイ
カサペンタン酸（チムノドン酸）、ω３−エイコサトリエン酸、ω３−エイコサ
テトラエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸（セルボン酸）、リグ
ノセリン酸、および明示的に示されていないこのクラスのさらなる脂肪酸。脂肪
酸合成は、アセチルＣｏＡのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼによるマロニルＣ
ｏＡへの変換またはアセチルトランスアシラーゼによるアセチルＡＣＰへの変換
のいずれかとともに始まる。縮合反応後、これらの２つの生成物分子は一緒にな
ってアセトアセチルＡＣＰを形成し、これは、一連の縮合反応、還元反応および
脱水反応によって変換され、所望する鎖長を有する飽和脂肪酸分子になる。その
ような分子からの不飽和脂肪酸の産生は、分子状酸素の助けによって好気的に、
または嫌気的に、そのいずれかで特異的なデサチュラーゼにより触媒される（微
生物における脂肪酸合成に対する参照については、Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ
ら（１９９６）、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＡＳＭ Ｐｒ
ｅｓｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ，Ｄ．Ｃ．、６１２頁〜６３２頁、およびそれに含
まれる参考文献；Ｌｅｎｇｅｌｅｒら（編）（１９９９）、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ、Ｔｈｉｅｍｅ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、およびそれに含まれる参考文献；Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｋ．ら（１９９３
）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５７：５２２〜５４２
、およびそれに含まれる参考文献を参照のこと）。
【００３９】
様々なシクロプロパン脂肪酸（ＣＦＡ）が、ＳＡＭを共基質として使用する特
異的なＣＦＡシンターゼによって合成される。分枝状脂肪酸は、脱アミノ化され
て分枝鎖の２−オキソ酸が生成する分枝鎖のアミノ酸から合成される（Ｌｅｎｇ
ｅｌｅｒら（編）（１９９９）、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅ
ｓを参照のこと）。
異的なＣＦＡシンターゼによって合成される。分枝状脂肪酸は、脱アミノ化され
て分枝鎖の２−オキソ酸が生成する分枝鎖のアミノ酸から合成される（Ｌｅｎｇ
ｅｌｅｒら（編）（１９９９）、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅ
ｓを参照のこと）。
【００４０】
植物脂肪酸の生合成、不飽和化、脂質代謝およびリポ（ｌｉｐｏｉｃ）化合物
の膜輸送、β−酸化、脂肪酸修飾および補助因子、トリアシルグリセロール貯蔵
、およびアセンブリーに関する刊行物（それらにおける参考文献を含む）につい
ては下記の論文を参照のこと：Ｋｉｎｎｅｙ、１９９７、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ
ｇｅｎｅｅｒｉｎｇ、編者：ＪＫ Ｓｅｔｌｏｗ、１９：１４９〜１６６；Ｏｈ
ｌｒｏｇｇｅおよびＢｒｏｗｓｅ、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、７：９５
７〜９７０；ＳｈａｎｋｌｉｎおよびＣａｈｏｏｎ、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅ
ｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４９：６
１１〜６４１；Ｖｏｅｌｋｅｒ、１９９６、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｅｎｅｅｒ
ｉｎｇ、編者：ＪＫ Ｓｅｔｌｏｗ、１８：１１１〜１３；Ｇｅｒｈａｒｄｔ、
１９９２、Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒ．３１：３９７〜４１７；Ｇｕｈｎｅｍａ
ｎｎ−Ｓｃｈａｆｅｒ＆Ｋｉｎｄｌ、１９９５、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ Ａｃｔａ、１２５６：１８１〜１８６；Ｋｕｎａｕら、１９９５、Ｐｒｏｇ
．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３４：２６７〜３４２；Ｓｔｙｍｎｅら、１９９３、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｌｉｐｉｄｓ ｏｆ Ｐｌａｎ
ｔｓ（編者：ＭｕｒａｔａおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉ
ｓｔ、１５０〜１５８）；Ｍｕｒｐｈｙ＆Ｒｏｓｓ、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ．１３（１）：１〜１６。
の膜輸送、β−酸化、脂肪酸修飾および補助因子、トリアシルグリセロール貯蔵
、およびアセンブリーに関する刊行物（それらにおける参考文献を含む）につい
ては下記の論文を参照のこと：Ｋｉｎｎｅｙ、１９９７、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ
ｇｅｎｅｅｒｉｎｇ、編者：ＪＫ Ｓｅｔｌｏｗ、１９：１４９〜１６６；Ｏｈ
ｌｒｏｇｇｅおよびＢｒｏｗｓｅ、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、７：９５
７〜９７０；ＳｈａｎｋｌｉｎおよびＣａｈｏｏｎ、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅ
ｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４９：６
１１〜６４１；Ｖｏｅｌｋｅｒ、１９９６、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｅｎｅｅｒ
ｉｎｇ、編者：ＪＫ Ｓｅｔｌｏｗ、１８：１１１〜１３；Ｇｅｒｈａｒｄｔ、
１９９２、Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒ．３１：３９７〜４１７；Ｇｕｈｎｅｍａ
ｎｎ−Ｓｃｈａｆｅｒ＆Ｋｉｎｄｌ、１９９５、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ Ａｃｔａ、１２５６：１８１〜１８６；Ｋｕｎａｕら、１９９５、Ｐｒｏｇ
．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３４：２６７〜３４２；Ｓｔｙｍｎｅら、１９９３、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｌｉｐｉｄｓ ｏｆ Ｐｌａｎ
ｔｓ（編者：ＭｕｒａｔａおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉ
ｓｔ、１５０〜１５８）；Ｍｕｒｐｈｙ＆Ｒｏｓｓ、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ．１３（１）：１〜１６。
【００４１】
さらに、脂肪酸は、様々な修飾の後、トリアシルグリセロール貯蔵脂質に輸送
され、取り込まれなければならない。脂質体が、オレオシンなどの構造タンパク
質によって囲まれているＥＲから出芽することによって作製され得る。オレオシ
ンは、植物の脂質貯蔵体と特異的に結合する両親媒性ポリペプチドである（Ｍｕ
ｒｐｈｙ ＤＪ（１９９０）、Ｐｒｏｇ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、２９：２９９〜
３２４）。表１のクローンＰＰ０１３００９０３９Ｒなどのオレオシンは、油体
の安定化、油体のサイズ決定、および水ストレス時の合体からの油体の保護に関
与している。フィスコミトレラ・パテンスのオレオシンのｃＤＮＡ配列を、油体
の数を増大させるために、または油体を安定化するために、それぞれ、オレオシ
ンのｃＤＮＡを単一遺伝子として過剰発現するか、または他の脂質生合成の遺伝
子と組み合わせて過剰発現するトランスジェニック植物を作製するために使用す
ることができる。さらに、油体の産生を、内因性の油体産生を有しない植物組織
において、コケのオレオシンをこの特定の組織で過剰に発現させることによって
誘導することができる。コケのＡＣＣａｓｅは、植物の脂肪酸含有量を増大また
は変化させるための道具である。
され、取り込まれなければならない。脂質体が、オレオシンなどの構造タンパク
質によって囲まれているＥＲから出芽することによって作製され得る。オレオシ
ンは、植物の脂質貯蔵体と特異的に結合する両親媒性ポリペプチドである（Ｍｕ
ｒｐｈｙ ＤＪ（１９９０）、Ｐｒｏｇ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、２９：２９９〜
３２４）。表１のクローンＰＰ０１３００９０３９Ｒなどのオレオシンは、油体
の安定化、油体のサイズ決定、および水ストレス時の合体からの油体の保護に関
与している。フィスコミトレラ・パテンスのオレオシンのｃＤＮＡ配列を、油体
の数を増大させるために、または油体を安定化するために、それぞれ、オレオシ
ンのｃＤＮＡを単一遺伝子として過剰発現するか、または他の脂質生合成の遺伝
子と組み合わせて過剰発現するトランスジェニック植物を作製するために使用す
ることができる。さらに、油体の産生を、内因性の油体産生を有しない植物組織
において、コケのオレオシンをこの特定の組織で過剰に発現させることによって
誘導することができる。コケのＡＣＣａｓｅは、植物の脂肪酸含有量を増大また
は変化させるための道具である。
【００４２】
プラスチドのアセチル補酵素Ａ（ＣｏＡ）カルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）
は、デノボ脂肪酸生合成の最初の関係した反応を触媒する。ＡＴＰに依存した反
応において、マロニルＣｏＡがアセチルＣｏＡから合成される。ＡＣＣａｓｅ酵
素の２つの形態（ホモ二量体ＡＣＣａｓｅおよびヘテロ二量体ＡＣＣａｓｅ）が
植物に存在する。
は、デノボ脂肪酸生合成の最初の関係した反応を触媒する。ＡＴＰに依存した反
応において、マロニルＣｏＡがアセチルＣｏＡから合成される。ＡＣＣａｓｅ酵
素の２つの形態（ホモ二量体ＡＣＣａｓｅおよびヘテロ二量体ＡＣＣａｓｅ）が
植物に存在する。
【００４３】
四量体のＡＣＣａｓｅが、プラスチドによりコードされる１つのサブユニット
（β−カルボキシルトランスフェラーゼ）および核によりコードされる３つのサ
ブユニット（ビオチンカルボキシキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、ビオチンカ
ルボキシラーゼ（ＢＣ）、α−カルボキシルトランスフェラーゼ）から構成され
る。共有結合的修飾およびアロステリック制御機構により、ＡＣＣａｓｅ酵素の
活性が調節されている。コケのフィスコミトレラ・パテンスに由来する新規なα
−カルボキシルトランスフェラーゼは、葉緑体トランジットペプチドをＮ末端（
１位〜４７位）に有し、プラスチドへの標的化のために使用することができる。
さらに、ＡＣＣａｓｅは、酵素活性のためにビオチン化を必要とする。従って、
ビオチン化およびビオチン合成に関与する酵素（ビオチンカルボキシラーゼなど
）が、活性なＡＣＣａｓｅを形成させるために重要である。
（β−カルボキシルトランスフェラーゼ）および核によりコードされる３つのサ
ブユニット（ビオチンカルボキシキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、ビオチンカ
ルボキシラーゼ（ＢＣ）、α−カルボキシルトランスフェラーゼ）から構成され
る。共有結合的修飾およびアロステリック制御機構により、ＡＣＣａｓｅ酵素の
活性が調節されている。コケのフィスコミトレラ・パテンスに由来する新規なα
−カルボキシルトランスフェラーゼは、葉緑体トランジットペプチドをＮ末端（
１位〜４７位）に有し、プラスチドへの標的化のために使用することができる。
さらに、ＡＣＣａｓｅは、酵素活性のためにビオチン化を必要とする。従って、
ビオチン化およびビオチン合成に関与する酵素（ビオチンカルボキシラーゼなど
）が、活性なＡＣＣａｓｅを形成させるために重要である。
【００４４】
α−カルボキシルトランスフェラーゼのノーザンブロット分析により、サブユ
ニットのｍＲＮＡが葉緑体の多い組織に蓄積することが明らかにされる。この組
織は、膜の生合成およびオイル（トリアシルグリセロール）産生のために使用さ
れる脂肪酸を活発に合成している。胚特異的なプロモーターの制御下でのオイル
貯蔵植物におけるα−カルボキシラーゼの過剰発現は、より大きなタンパク質発
現をもたらし、従って、より大きな酵素活性およびオイル合成の改変をもたらし
得る。脂肪酸の増大した量は、この分野で知られている方法に従って定量的に測
定することができる。
ニットのｍＲＮＡが葉緑体の多い組織に蓄積することが明らかにされる。この組
織は、膜の生合成およびオイル（トリアシルグリセロール）産生のために使用さ
れる脂肪酸を活発に合成している。胚特異的なプロモーターの制御下でのオイル
貯蔵植物におけるα−カルボキシラーゼの過剰発現は、より大きなタンパク質発
現をもたらし、従って、より大きな酵素活性およびオイル合成の改変をもたらし
得る。脂肪酸の増大した量は、この分野で知られている方法に従って定量的に測
定することができる。
【００４５】
脂肪種子の脂肪酸プロフィルにより、脂質化合物またはオイルの農学的価値が
大きく決定される。オイルの均一性、鎖長および不飽和度により、酸化安定性、
潤滑剤としての使用、コポリマーなどが決定される。植物などの生物の脂肪酸プ
ロフィルは、さらに、生物的ストレスおよび無生物的ストレスに対する耐性など
の生育および発達の特性に影響する。従って、不飽和化プロセスまたは伸長プロ
セスに関与する遺伝子の使用は、脂質化合物を最適化するために使用することが
できる。そのような遺伝子は、遊離のシトクロームｂ５、ＮＡＤＨシトクローム
ｂ５レダクターゼ、シトクロームＰ４５０、チオレドキシンΔ５−、Δ６−、Δ
９−、Δ１２−デサチュラーゼ（アシル脂質デサチュラーゼまたはＡＣＰデサチ
ュラーゼのいずれか）、ならびにアシルＣｏＡシンターゼまたはアセチルＣｏＡ
シンターゼ、ケトアシル（ＣｏＡまたはＡＣＰ）シンターゼ、ケトアシルレダク
ターゼ、ワックス生合成酵素のような遺伝子である。
大きく決定される。オイルの均一性、鎖長および不飽和度により、酸化安定性、
潤滑剤としての使用、コポリマーなどが決定される。植物などの生物の脂肪酸プ
ロフィルは、さらに、生物的ストレスおよび無生物的ストレスに対する耐性など
の生育および発達の特性に影響する。従って、不飽和化プロセスまたは伸長プロ
セスに関与する遺伝子の使用は、脂質化合物を最適化するために使用することが
できる。そのような遺伝子は、遊離のシトクロームｂ５、ＮＡＤＨシトクローム
ｂ５レダクターゼ、シトクロームＰ４５０、チオレドキシンΔ５−、Δ６−、Δ
９−、Δ１２−デサチュラーゼ（アシル脂質デサチュラーゼまたはＡＣＰデサチ
ュラーゼのいずれか）、ならびにアシルＣｏＡシンターゼまたはアセチルＣｏＡ
シンターゼ、ケトアシル（ＣｏＡまたはＡＣＰ）シンターゼ、ケトアシルレダク
ターゼ、ワックス生合成酵素のような遺伝子である。
【００４６】
脂質合成における別の必須段階は、例えば、グリセロールリン酸アシルトラン
スフェラーゼによる脂肪酸の極性頭部基への転移である（Ｆｒｅｎｔｚｅｎ、１
９９８、Ｌｉｐｉｄ、１００（４−５）：１６１〜１６６を参照のこと）。さら
に、酵素的段階を、アシルグリセロール生成の中間体化合物に影響を及ぼすため
に改変することができる。ジアシルグリセロールキナーゼ、ホスファチジルイノ
シトールシンターゼ、ホスファチジルセリンシンターゼおよびホスファチダート
ホスファターゼは、中間体化合物を修飾するために有用なそのような遺伝子であ
る。様々な前駆体分子および生合成酵素を組合せることにより、膜の組成に対し
て大きな作用を有する種々の脂肪酸分子が生成する。
スフェラーゼによる脂肪酸の極性頭部基への転移である（Ｆｒｅｎｔｚｅｎ、１
９９８、Ｌｉｐｉｄ、１００（４−５）：１６１〜１６６を参照のこと）。さら
に、酵素的段階を、アシルグリセロール生成の中間体化合物に影響を及ぼすため
に改変することができる。ジアシルグリセロールキナーゼ、ホスファチジルイノ
シトールシンターゼ、ホスファチジルセリンシンターゼおよびホスファチダート
ホスファターゼは、中間体化合物を修飾するために有用なそのような遺伝子であ
る。様々な前駆体分子および生合成酵素を組合せることにより、膜の組成に対し
て大きな作用を有する種々の脂肪酸分子が生成する。
【００４７】
同様に、分解経路も、脂質化合物の生成、分布および貯蔵を改変するために使
用することができる。特に、リソホスホリパーゼ、トリアシルグリセロールリパ
ーゼ、ホスホリパーゼＤ１およびＤ２、リポキシゲナーゼ、およびチオエステラ
ーゼなどの脂質分解酵素、ならびにペルオキシソームのアシルＣｏＡシンターゼ
、アシルＣｏＡオキシダーゼ、メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼおよび
ケトアシルＣｏＡチオラーゼなどのβ−酸化経路の酵素は、脂質化合物の分解に
影響を与えるために十分に適する遺伝子である。また、脂質化合物の分布は、ア
シルＣｏＡ結合タンパク質、脂質輸送タンパク質またはチオエステラーゼのよう
な遺伝子が脂質合成生物に導入された場合に影響を受け得る。
用することができる。特に、リソホスホリパーゼ、トリアシルグリセロールリパ
ーゼ、ホスホリパーゼＤ１およびＤ２、リポキシゲナーゼ、およびチオエステラ
ーゼなどの脂質分解酵素、ならびにペルオキシソームのアシルＣｏＡシンターゼ
、アシルＣｏＡオキシダーゼ、メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼおよび
ケトアシルＣｏＡチオラーゼなどのβ−酸化経路の酵素は、脂質化合物の分解に
影響を与えるために十分に適する遺伝子である。また、脂質化合物の分布は、ア
シルＣｏＡ結合タンパク質、脂質輸送タンパク質またはチオエステラーゼのよう
な遺伝子が脂質合成生物に導入された場合に影響を受け得る。
【００４８】
多不飽和脂肪酸
ビタミン、補助因子および健康栄養物には、細菌などの他の生物によって容易
に合成されるが、高等動物がその合成能を失っており、従って摂取しなければな
らないか、または高等動物が自分自身で十分に産生することができず、従ってさ
らに摂取しなければならない別の分子群が含まれる。これらの分子は、それ自体
生物活性な物質であるか、または様々な代謝経路における電子キャリアまたは中
間体として役立ち得る生物学的に活性な物質の前駆体である。それらの栄養的価
値のほかに、これらの化合物はまた、着色剤、抗酸化剤および触媒または他の加
工補助剤としての重要な産業的価値を有する。（これらの化合物の構造、活性お
よび産業的応用の概説については、例えば、Ｕｌｌｍａｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏ
ｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ビタミン、第
Ａ２７巻、４４３頁〜６１３頁、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９６を参照の
こと）。多不飽和脂肪酸の場合、Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、１９９９、Ａｍ．Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７０（３増補）：５６０〜５６９；Ｔａｋａｈａｔａら
、Ｂｉｏｓｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９８、６２（１１
）：２０７９〜２０８５；ＷｉｌｌｉｃｈおよびＷｉｎｔｈｅｒ、１９９５、Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ、１
２０（７）：２２９以降）、およびそれらに引用されている参考文献もまた参照
のこと。
に合成されるが、高等動物がその合成能を失っており、従って摂取しなければな
らないか、または高等動物が自分自身で十分に産生することができず、従ってさ
らに摂取しなければならない別の分子群が含まれる。これらの分子は、それ自体
生物活性な物質であるか、または様々な代謝経路における電子キャリアまたは中
間体として役立ち得る生物学的に活性な物質の前駆体である。それらの栄養的価
値のほかに、これらの化合物はまた、着色剤、抗酸化剤および触媒または他の加
工補助剤としての重要な産業的価値を有する。（これらの化合物の構造、活性お
よび産業的応用の概説については、例えば、Ｕｌｌｍａｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏ
ｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ビタミン、第
Ａ２７巻、４４３頁〜６１３頁、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９６を参照の
こと）。多不飽和脂肪酸の場合、Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、１９９９、Ａｍ．Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７０（３増補）：５６０〜５６９；Ｔａｋａｈａｔａら
、Ｂｉｏｓｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９８、６２（１１
）：２０７９〜２０８５；ＷｉｌｌｉｃｈおよびＷｉｎｔｈｅｒ、１９９５、Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ、１
２０（７）：２２９以降）、およびそれらに引用されている参考文献もまた参照
のこと。
【００４９】
補助因子の表現には、正常な酵素活性を生じさせるために必要とされる非タン
パク質性の化合物が含まれる。そのような化合物は有機または無機であり得るが
、本発明の補助因子分子は好ましくは有機である。健康栄養物の用語には、植物
および動物（特に、ヒト）において健康的利益を有する栄養補助食品が含まれる
。そのような分子の例には、ビタミン、抗酸化剤、そしてまたある種の脂質（例
えば、多不飽和脂肪酸）が挙げられる。
パク質性の化合物が含まれる。そのような化合物は有機または無機であり得るが
、本発明の補助因子分子は好ましくは有機である。健康栄養物の用語には、植物
および動物（特に、ヒト）において健康的利益を有する栄養補助食品が含まれる
。そのような分子の例には、ビタミン、抗酸化剤、そしてまたある種の脂質（例
えば、多不飽和脂肪酸）が挙げられる。
【００５０】
これらの分子を産生し得る生物（細菌など）におけるそれらの生合成は広く特
徴づけられている（Ｕｌｌｍａｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ビタミン、第Ａ２７巻、４４３頁〜６
１３頁、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９６；Ｍｉｃｈａｌ，Ｇ．（１９９９
）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｗａｙｓ：Ａｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｏｎｇ，Ａ．Ｓ．、Ｎｉｋｉ，Ｅ．＆Ｐａｃｋｅ
ｒ，Ｌ．（１９９５）、ＵＮＥＳＣＯ／マレーシア科学技術協会およびフリーラ
ジカル研究会（アジア）連合（ペナン（マレーシア）において１９９４年９月１
日〜３日に開催）の「栄養、脂質、健康および疾患」の議事録、ＡＯＣＳ Ｐｒ
ｅｓｓ：Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、ＩＬ Ｘ、３７４Ｓ）。
徴づけられている（Ｕｌｌｍａｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ビタミン、第Ａ２７巻、４４３頁〜６
１３頁、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９６；Ｍｉｃｈａｌ，Ｇ．（１９９９
）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｗａｙｓ：Ａｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｏｎｇ，Ａ．Ｓ．、Ｎｉｋｉ，Ｅ．＆Ｐａｃｋｅ
ｒ，Ｌ．（１９９５）、ＵＮＥＳＣＯ／マレーシア科学技術協会およびフリーラ
ジカル研究会（アジア）連合（ペナン（マレーシア）において１９９４年９月１
日〜３日に開催）の「栄養、脂質、健康および疾患」の議事録、ＡＯＣＳ Ｐｒ
ｅｓｓ：Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、ＩＬ Ｘ、３７４Ｓ）。
【００５１】
本発明の別の態様は、他のファインケミカルの生合成および製造における製造
されたファインケミカルそのものの使用に関する。例えば、製造されたファイン
ケミカルそのものは、あるファインケミカル（例えば、飽和脂肪酸）を別のファ
インケミカル（例えば、不飽和脂肪酸）に変換することを助ける、デサチュラー
ゼなどの触媒活性を有し得る。
されたファインケミカルそのものの使用に関する。例えば、製造されたファイン
ケミカルそのものは、あるファインケミカル（例えば、飽和脂肪酸）を別のファ
インケミカル（例えば、不飽和脂肪酸）に変換することを助ける、デサチュラー
ゼなどの触媒活性を有し得る。
【００５２】
ＩＩＩ．本発明の要素および方法
本発明は、少なくとも一部は、本明細書中においてＬＭＲＰ核酸分子およびＬ
ＭＲＰタンパク質分子として示される新規な分子の発見に基づく。これらの分子
は、フィスコミトレラ・パテンスおよびセラトドン・プルプレウスにおける細胞
膜の産生を制御し、かつそのような膜を横断する分子の移動を支配している。１
つの実施形態において、ＬＭＲＰ分子は、微生物および植物における細胞膜の構
築に必要な化合物の代謝またはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与している
。好ましい実施形態において、膜化合物の産生および膜輸送を調節する本発明の
ＬＭＲＰ分子の活性は、所望するファインケミカルのこの生物による製造に対し
て影響を及ぼす。特に好ましい実施形態において、本発明のＬＭＲＰ分子は活性
が調節され、その結果、本発明のＬＭＲＰが調製する微生物または植物の代謝経
路が収率、産生および／または産生効率において調節され、そして膜を通過する
化合物の輸送効率が変化し、それにより、微生物および植物による所望するファ
インケミカルの収率、産生および／または産生効率が直接的または間接的のいず
れかで調節されるようになる。
ＭＲＰタンパク質分子として示される新規な分子の発見に基づく。これらの分子
は、フィスコミトレラ・パテンスおよびセラトドン・プルプレウスにおける細胞
膜の産生を制御し、かつそのような膜を横断する分子の移動を支配している。１
つの実施形態において、ＬＭＲＰ分子は、微生物および植物における細胞膜の構
築に必要な化合物の代謝またはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与している
。好ましい実施形態において、膜化合物の産生および膜輸送を調節する本発明の
ＬＭＲＰ分子の活性は、所望するファインケミカルのこの生物による製造に対し
て影響を及ぼす。特に好ましい実施形態において、本発明のＬＭＲＰ分子は活性
が調節され、その結果、本発明のＬＭＲＰが調製する微生物または植物の代謝経
路が収率、産生および／または産生効率において調節され、そして膜を通過する
化合物の輸送効率が変化し、それにより、微生物および植物による所望するファ
インケミカルの収率、産生および／または産生効率が直接的または間接的のいず
れかで調節されるようになる。
【００５３】
ＬＭＲＰまたはＬＭＲＰポリペプチドの表現には、微生物および植物における
細胞膜の構築に必要な化合物の代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸送に
関与するタンパク質が含まれる。ＬＭＲＰの例には、表１および付表Ａに示され
るＬＭＲＰ遺伝子によってコードされるＬＭＲＰが含まれる。ＬＭＲＰ遺伝子ま
たはＬＭＲＰ核酸配列の用語には、コード領域、そしてまた対応する翻訳されな
い５’配列領域および３’配列領域からなるＬＭＲＰをコードする核酸配列が含
まれる。ＬＭＲＰ遺伝子の例には、表１に示される遺伝子が含まれる。産生また
は生産性の用語は、この分野で認識されており、特定の時間および特定の発酵容
量で生成される発酵生成物（例えば、所望するファインケミカル）の濃度（例え
ば、ｋｇ生成物／時／リットル）を含む。産生効率の用語は、特定レベルの産生
が達成されるために必要とされる時間を含む（例えば、細胞が所望するファイン
ケミカルの特定の産出速度を達成するためにどのくらいの時間を要するかである
）。生成物／炭素収率の用語は、この分野で認識されており、炭素源の生成物（
すなわち、ファインケミカル）への変換効率を含む。これは、一般には、例えば
、ｋｇ生成物／ｋｇ炭素源として表される。化合物の収率または産生を増大させ
ることにより、特定の時間での特定の培養量におけるそのような化合物の回収さ
れる分子の量または有用な回収される分子の量が増大する。生合成または生合成
経路の用語は、この分野で認識されており、多段階の高度に制御されたプロセス
であり得る、細胞による中間体化合物からの化合物（好ましくは、有機化合物）
の合成を含む。分解または分解経路の用語は、この分野で認識されており、多段
階の高度に制御されたプロセスであり得る、分解生成物（一般的に言えば、より
小さい分子またはあまり複雑でない分子）への細胞による化合物（好ましくは、
有機化合物）の分解を含む。代謝の表現は、この分野で認識されており、生物に
おいて行われる生化学的反応の全体を含む。従って、特定化合物の代謝（例えば
、脂肪酸の代謝）は、この化合物に関連する生物における生合成経路、修飾経路
および分解経路の全体を含む。
細胞膜の構築に必要な化合物の代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸送に
関与するタンパク質が含まれる。ＬＭＲＰの例には、表１および付表Ａに示され
るＬＭＲＰ遺伝子によってコードされるＬＭＲＰが含まれる。ＬＭＲＰ遺伝子ま
たはＬＭＲＰ核酸配列の用語には、コード領域、そしてまた対応する翻訳されな
い５’配列領域および３’配列領域からなるＬＭＲＰをコードする核酸配列が含
まれる。ＬＭＲＰ遺伝子の例には、表１に示される遺伝子が含まれる。産生また
は生産性の用語は、この分野で認識されており、特定の時間および特定の発酵容
量で生成される発酵生成物（例えば、所望するファインケミカル）の濃度（例え
ば、ｋｇ生成物／時／リットル）を含む。産生効率の用語は、特定レベルの産生
が達成されるために必要とされる時間を含む（例えば、細胞が所望するファイン
ケミカルの特定の産出速度を達成するためにどのくらいの時間を要するかである
）。生成物／炭素収率の用語は、この分野で認識されており、炭素源の生成物（
すなわち、ファインケミカル）への変換効率を含む。これは、一般には、例えば
、ｋｇ生成物／ｋｇ炭素源として表される。化合物の収率または産生を増大させ
ることにより、特定の時間での特定の培養量におけるそのような化合物の回収さ
れる分子の量または有用な回収される分子の量が増大する。生合成または生合成
経路の用語は、この分野で認識されており、多段階の高度に制御されたプロセス
であり得る、細胞による中間体化合物からの化合物（好ましくは、有機化合物）
の合成を含む。分解または分解経路の用語は、この分野で認識されており、多段
階の高度に制御されたプロセスであり得る、分解生成物（一般的に言えば、より
小さい分子またはあまり複雑でない分子）への細胞による化合物（好ましくは、
有機化合物）の分解を含む。代謝の表現は、この分野で認識されており、生物に
おいて行われる生化学的反応の全体を含む。従って、特定化合物の代謝（例えば
、脂肪酸の代謝）は、この化合物に関連する生物における生合成経路、修飾経路
および分解経路の全体を含む。
【００５４】
別の実施形態において、本発明のＬＭＲＰ分子は、微生物および植物における
ファインケミカルなどの所望する分子の産生を調節することができる。本発明の
ＬＭＲＰの変化が、そのような変化したタンパク質を含む微生物株または植物株
からのファインケミカルの収率、産生および／または産生効率に直接的に影響を
及ぼし得る機構が多数存在する。細胞内または細胞からのファインケミカル分子
の輸送に関与するそのようなＬＭＲＰは、これらの化合物のより多くの量が、よ
り容易に回収および相互変換される膜を通って輸送されるように数または活性を
増大させることができる。同様に、１つまたは複数のファインケミカルの生合成
に必要な栄養物の細胞内への輸送に関与するそのようなＬＭＲＰは、これらの前
駆体化合物、補助因子化合物または中間体化合物の濃度が所望する細胞の内部で
増大するように数または活性を増大させることができる。さらに、脂肪酸および
脂質はそれ自体、望ましいファインケミカルである。従って、これらの化合物の
生合成に関与する１つまたは複数の本発明のＬＭＲＰの活性を最適化するか、あ
るいはその数を増大させることによって、あるいはこれらの化合物の分解に関与
する１つまたは複数のＬＭＲＰの活性を損なうことによって、微生物または植物
からの脂肪酸分子および脂質分子の収率、産生および／または産生効率を増大さ
せることが可能であり得る。
ファインケミカルなどの所望する分子の産生を調節することができる。本発明の
ＬＭＲＰの変化が、そのような変化したタンパク質を含む微生物株または植物株
からのファインケミカルの収率、産生および／または産生効率に直接的に影響を
及ぼし得る機構が多数存在する。細胞内または細胞からのファインケミカル分子
の輸送に関与するそのようなＬＭＲＰは、これらの化合物のより多くの量が、よ
り容易に回収および相互変換される膜を通って輸送されるように数または活性を
増大させることができる。同様に、１つまたは複数のファインケミカルの生合成
に必要な栄養物の細胞内への輸送に関与するそのようなＬＭＲＰは、これらの前
駆体化合物、補助因子化合物または中間体化合物の濃度が所望する細胞の内部で
増大するように数または活性を増大させることができる。さらに、脂肪酸および
脂質はそれ自体、望ましいファインケミカルである。従って、これらの化合物の
生合成に関与する１つまたは複数の本発明のＬＭＲＰの活性を最適化するか、あ
るいはその数を増大させることによって、あるいはこれらの化合物の分解に関与
する１つまたは複数のＬＭＲＰの活性を損なうことによって、微生物または植物
からの脂肪酸分子および脂質分子の収率、産生および／または産生効率を増大さ
せることが可能であり得る。
【００５５】
本発明の１つまたは複数のＬＭＲＰ遺伝子の変異誘発はまた、１つまたは複数
の所望するファインケミカルを微生物および植物から産生させることに対して間
接的な影響を及ぼす変化した活性を有するＬＭＲＰを生じさせることができる。
例えば、不用産物の細胞外への輸送に関与する本発明のＬＭＲＰは、（所望する
ファインケミカルが過剰に産生されるために量が増大すると考えられる）細胞の
正常な代謝不用物が、それらにより細胞内のヌクレオチドおよびタンパク質の損
傷（これにより、細胞の生存性が低下する）またはファインケミカル生合成の妨
害（これにより、所望するファインケミカルの収率、産生および／または産生効
率が低下する）が生じ得る前に効率的に細胞外に輸送されるように数または活性
を増大させることができる。さらに、所望するファインケミカルの比較的大きな
細胞内の量は基本的には細胞にとって毒性であることがあり、従って、この化合
物を細胞から外に輸送することができる輸送体の活性または数を増大させること
によって、培養における細胞の生存性を増大させることができ、これにより、所
望するファインケミカルを産生するより多くの数の細胞が培養においてもたらさ
れる。本発明のＬＭＲＰはまた、異なる脂質分子および脂肪酸分子の相対的な量
が産生されるように操作することができる。これは、細胞の膜の脂質組成に対し
て大きな作用を有し得る。それぞれのタイプの脂質は異なる物理的性質を有する
ので、膜の脂質組成の変化は、膜の流動性を著しく変化させることがある。膜流
動性の変化は、細胞の一体性だけでなく、膜を横断する分子の輸送にも影響を及
ぼし得る。これらはともに、ファインケミカルを大規模な発酵培養で微生物およ
び植物から産生させることに対して大きな影響を有する。植物の膜は、熱、低温
、塩、干ばつに対する耐性、ならびに細菌および菌類のような病原体に対する耐
性などの特異的な特徴をもたらす。従って、膜の化合物を調節することは、上記
のストレス条件のもとで生存するための植物の適応度に対して大きな影響を有し
得る。これは、シグナル変換カスケードにおける変化を介して生じ得るか、また
は変化した膜組成を介して直接的に生じ得るし（例えば、Ｃｈａｐｍａｎ、１９
９８、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３（１１）：４１９
〜４２６を参照のこと）、そしてシグナル変換カスケードに影響を及ぼし得る（
Ｗａｎｇ、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１２０：６４５〜６
５１を参照のこと）。哺乳動物の系では、グリセロ脂質合成およびシグナル伝達
に関与するホスファチダートホスファターゼの形態がいくつか同定されている。
酵母では、ホスファチダートホスファターゼもまた精製され、部分的に特徴づけ
られている（Ｂｒｉｎｄｌｅｙ ＤＮ（１９８８）、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔ
ｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｂｒｉｎｄｌｅｙ ＤＮ編）、第１巻
、２１頁〜７７頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）。同じ二次メ
ッセンジャー機能が植物の系について推定することができる。
の所望するファインケミカルを微生物および植物から産生させることに対して間
接的な影響を及ぼす変化した活性を有するＬＭＲＰを生じさせることができる。
例えば、不用産物の細胞外への輸送に関与する本発明のＬＭＲＰは、（所望する
ファインケミカルが過剰に産生されるために量が増大すると考えられる）細胞の
正常な代謝不用物が、それらにより細胞内のヌクレオチドおよびタンパク質の損
傷（これにより、細胞の生存性が低下する）またはファインケミカル生合成の妨
害（これにより、所望するファインケミカルの収率、産生および／または産生効
率が低下する）が生じ得る前に効率的に細胞外に輸送されるように数または活性
を増大させることができる。さらに、所望するファインケミカルの比較的大きな
細胞内の量は基本的には細胞にとって毒性であることがあり、従って、この化合
物を細胞から外に輸送することができる輸送体の活性または数を増大させること
によって、培養における細胞の生存性を増大させることができ、これにより、所
望するファインケミカルを産生するより多くの数の細胞が培養においてもたらさ
れる。本発明のＬＭＲＰはまた、異なる脂質分子および脂肪酸分子の相対的な量
が産生されるように操作することができる。これは、細胞の膜の脂質組成に対し
て大きな作用を有し得る。それぞれのタイプの脂質は異なる物理的性質を有する
ので、膜の脂質組成の変化は、膜の流動性を著しく変化させることがある。膜流
動性の変化は、細胞の一体性だけでなく、膜を横断する分子の輸送にも影響を及
ぼし得る。これらはともに、ファインケミカルを大規模な発酵培養で微生物およ
び植物から産生させることに対して大きな影響を有する。植物の膜は、熱、低温
、塩、干ばつに対する耐性、ならびに細菌および菌類のような病原体に対する耐
性などの特異的な特徴をもたらす。従って、膜の化合物を調節することは、上記
のストレス条件のもとで生存するための植物の適応度に対して大きな影響を有し
得る。これは、シグナル変換カスケードにおける変化を介して生じ得るか、また
は変化した膜組成を介して直接的に生じ得るし（例えば、Ｃｈａｐｍａｎ、１９
９８、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３（１１）：４１９
〜４２６を参照のこと）、そしてシグナル変換カスケードに影響を及ぼし得る（
Ｗａｎｇ、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１２０：６４５〜６
５１を参照のこと）。哺乳動物の系では、グリセロ脂質合成およびシグナル伝達
に関与するホスファチダートホスファターゼの形態がいくつか同定されている。
酵母では、ホスファチダートホスファターゼもまた精製され、部分的に特徴づけ
られている（Ｂｒｉｎｄｌｅｙ ＤＮ（１９８８）、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔ
ｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｂｒｉｎｄｌｅｙ ＤＮ編）、第１巻
、２１頁〜７７頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）。同じ二次メ
ッセンジャー機能が植物の系について推定することができる。
【００５６】
本発明の単離された核酸配列は、ハンブルグ大学のコケコレクションから得る
ことができるフィスコミトレラ・パテンス株のゲノムに含まれる。単離されたフ
ィスコミトレラ・パテンスＬＭＲＰのｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびフィス
コミトレラ・パテンスＬＭＲＰの予測されるアミノ酸配列が付表ＡおよびＢにそ
れぞれ示されている。
ことができるフィスコミトレラ・パテンス株のゲノムに含まれる。単離されたフ
ィスコミトレラ・パテンスＬＭＲＰのｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびフィス
コミトレラ・パテンスＬＭＲＰの予測されるアミノ酸配列が付表ＡおよびＢにそ
れぞれ示されている。
【００５７】
細胞膜成分の代謝に関与するタンパク質またはそのような膜を横断する化合物
の輸送に関与するタンパク質をコードする配列としてこれらのヌクレオチド配列
を分類および／または同定するコンピューター分析が行われた。
の輸送に関与するタンパク質をコードする配列としてこれらのヌクレオチド配列
を分類および／または同定するコンピューター分析が行われた。
【００５８】
本発明はまた、付表Ｂの１つのアミノ酸配列に対して実質的に相同的であるア
ミノ酸配列を有するタンパク質に関する。本明細書中で使用されているように、
選択されたアミノ酸配列に対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質は、選択された１つのアミノ酸配列（例えば、１つの選択されたアミノ
酸配列全体）に対する相同性が少なくとも約５０％である。選択されたアミノ酸
配列に対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するタンパク質はまた、選
択されたアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも約５０％〜６０％であり得る
し、好ましくは少なくとも約６０％〜７０％であり得るし、より好ましくは少な
くとも約７０％〜８０％、８０％〜９０％または９０％〜９５％であり得るし、
最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上で
あり得る。
ミノ酸配列を有するタンパク質に関する。本明細書中で使用されているように、
選択されたアミノ酸配列に対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質は、選択された１つのアミノ酸配列（例えば、１つの選択されたアミノ
酸配列全体）に対する相同性が少なくとも約５０％である。選択されたアミノ酸
配列に対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するタンパク質はまた、選
択されたアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも約５０％〜６０％であり得る
し、好ましくは少なくとも約６０％〜７０％であり得るし、より好ましくは少な
くとも約７０％〜８０％、８０％〜９０％または９０％〜９５％であり得るし、
最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上で
あり得る。
【００５９】
本発明のＬＭＲＰタンパク質あるいはその生物学的に活性な一部分またはフラ
グメントは、微生物または植物における細胞膜の構築に必要な化合物の代謝ある
いはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与し得るか、あるいは表１に示される
活性の１つまたは２つ以上を有し得る。
グメントは、微生物または植物における細胞膜の構築に必要な化合物の代謝ある
いはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与し得るか、あるいは表１に示される
活性の１つまたは２つ以上を有し得る。
【００６０】
本発明の様々な態様を下記の節においてさらに詳しく説明する。
【００６１】
Ａ．単離された核酸分子
本発明の１つの態様は、ＬＭＲＰポリペプチドまたはその生物学的に活性な一
部分をコードする単離された核酸分子、ならびにＬＭＲＰをコードする核酸（例
えば、ＬＭＲＰのＤＮＡ）を同定または増幅するためのハイブリダイゼーション
プローブまたはプライマーとして使用するために十分な核酸フラグメントに関す
る。本明細書中で使用されている用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃ
ＤＮＡまたゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌ
クレオチドアナログを使用して作製されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含む
ものとする。この用語はまた、遺伝子のコード領域の３’末端および５’末端の
両方に存在する非翻訳配列を包含する：コード領域の５’末端から上流の少なく
とも約１００ヌクレオチドの配列およびコード領域の３’末端から下流の少なく
とも約２０ヌクレオチドの配列。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、
好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「単離された」核酸分子は、核酸の天然の供給
源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子である。好ましくは、「
単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて核酸に天然に
隣接する配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に存在する配列）を有
しない。例えば、様々な実施形態において、単離されたＬＭＲＰ核酸分子は、核
酸が由来する細胞（例えば、フィスコミトレラ・パテンス細胞）のゲノムＤＮＡ
において核酸に天然に隣接する、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、
約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満、約０．５ｋｂ未満または約０．１ｋｂ未満のヌク
レオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分
子は、組換え技術によって作製された場合には他の細胞物質または培養培地を実
質的に有し得ず、あるいは化学合成された場合には化学的な前駆体または他の化
学物質を実質的に有し得ない。
部分をコードする単離された核酸分子、ならびにＬＭＲＰをコードする核酸（例
えば、ＬＭＲＰのＤＮＡ）を同定または増幅するためのハイブリダイゼーション
プローブまたはプライマーとして使用するために十分な核酸フラグメントに関す
る。本明細書中で使用されている用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃ
ＤＮＡまたゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌ
クレオチドアナログを使用して作製されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含む
ものとする。この用語はまた、遺伝子のコード領域の３’末端および５’末端の
両方に存在する非翻訳配列を包含する：コード領域の５’末端から上流の少なく
とも約１００ヌクレオチドの配列およびコード領域の３’末端から下流の少なく
とも約２０ヌクレオチドの配列。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、
好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「単離された」核酸分子は、核酸の天然の供給
源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子である。好ましくは、「
単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて核酸に天然に
隣接する配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に存在する配列）を有
しない。例えば、様々な実施形態において、単離されたＬＭＲＰ核酸分子は、核
酸が由来する細胞（例えば、フィスコミトレラ・パテンス細胞）のゲノムＤＮＡ
において核酸に天然に隣接する、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、
約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満、約０．５ｋｂ未満または約０．１ｋｂ未満のヌク
レオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分
子は、組換え技術によって作製された場合には他の細胞物質または培養培地を実
質的に有し得ず、あるいは化学合成された場合には化学的な前駆体または他の化
学物質を実質的に有し得ない。
【００６２】
本発明の核酸分子（例えば、付表Ａのヌクレオチド配列を有する核酸分子）ま
たはその一部分は、標準的な分子生物学的技術および本明細書中に提供されてい
る配列情報を使用して単離することができる。例えば、Ｐ．ｐａｔｅｎｓのＬＭ
ＲＰのｃＤＮＡを、付表Ａの配列の１つの全体または一部分をハイブリダイゼー
ションプローブとして使用して、そして標準的なハイブリダイゼーション技術（
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、
１９８９に記載されるような技術）を使用してＰ．ｐａｔｅｎｓのライブラリー
から単離することができる。さらに、付表Ａの配列の１つの全体または一部を含
む核酸分子を、この配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを
使用してポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる（例えば、付表Ａ
の配列の１つの全体または一部を含む核酸分子は、付表Ａのこの同じ配列に基づ
いて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応
によって単離することができる）。例えば、ｍＲＮＡを（例えば、Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８：５２９４〜５２９９のグ
アニジニウムチオシアナート抽出法によって）植物細胞から単離することができ
、そしてｃＤＮＡを逆転写酵素（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ、ＭＤ）から入手可能なモロニーＭＬＶ逆転写酵素；またはＳｅｉｋａｇａｋ
ｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬ）から入手
可能なＡＭＶ逆転写酵素）を使用して調製することができる。ポリメラーゼ連鎖
反応による増幅に必要な合成オリゴヌクレオチドプライマーは、付表Ａに示され
るヌクレオチド配列の１つに基づいて設計することができる。本発明の核酸は、
標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてのｃＤＮＡあるいはゲノ
ムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅することが
できる。そのようにして増幅された核酸は適切なベクターにクローン化され、そ
してＤＮＡ配列分析による特徴づけを行うことができる。さらに、ＬＭＲＰヌク
レオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例
えば、自動化されたＤＮＡ合成機を使用して調製することができる。
たはその一部分は、標準的な分子生物学的技術および本明細書中に提供されてい
る配列情報を使用して単離することができる。例えば、Ｐ．ｐａｔｅｎｓのＬＭ
ＲＰのｃＤＮＡを、付表Ａの配列の１つの全体または一部分をハイブリダイゼー
ションプローブとして使用して、そして標準的なハイブリダイゼーション技術（
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、
１９８９に記載されるような技術）を使用してＰ．ｐａｔｅｎｓのライブラリー
から単離することができる。さらに、付表Ａの配列の１つの全体または一部を含
む核酸分子を、この配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを
使用してポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる（例えば、付表Ａ
の配列の１つの全体または一部を含む核酸分子は、付表Ａのこの同じ配列に基づ
いて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応
によって単離することができる）。例えば、ｍＲＮＡを（例えば、Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８：５２９４〜５２９９のグ
アニジニウムチオシアナート抽出法によって）植物細胞から単離することができ
、そしてｃＤＮＡを逆転写酵素（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ、ＭＤ）から入手可能なモロニーＭＬＶ逆転写酵素；またはＳｅｉｋａｇａｋ
ｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬ）から入手
可能なＡＭＶ逆転写酵素）を使用して調製することができる。ポリメラーゼ連鎖
反応による増幅に必要な合成オリゴヌクレオチドプライマーは、付表Ａに示され
るヌクレオチド配列の１つに基づいて設計することができる。本発明の核酸は、
標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてのｃＤＮＡあるいはゲノ
ムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅することが
できる。そのようにして増幅された核酸は適切なベクターにクローン化され、そ
してＤＮＡ配列分析による特徴づけを行うことができる。さらに、ＬＭＲＰヌク
レオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例
えば、自動化されたＤＮＡ合成機を使用して調製することができる。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、付表Ａに示され
るヌクレオチド配列の１つを含む。付表Ａの配列は、本発明のフィスコミトレラ
・パテンスＬＭＲＰのｃＤＮＡに対応する。このｃＤＮＡは、ＬＭＲＰをコード
する配列（すなわち、付表Ａにおけるそれぞれの配列に示される「コード領域」
）、ならびに５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。あるいは、核酸分子
は、付表Ａの配列のいずれかのコード領域のみを含むか、またはゲノムＤＮＡか
ら単離されたゲノムフラグメント全体を含有し得る。
るヌクレオチド配列の１つを含む。付表Ａの配列は、本発明のフィスコミトレラ
・パテンスＬＭＲＰのｃＤＮＡに対応する。このｃＤＮＡは、ＬＭＲＰをコード
する配列（すなわち、付表Ａにおけるそれぞれの配列に示される「コード領域」
）、ならびに５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。あるいは、核酸分子
は、付表Ａの配列のいずれかのコード領域のみを含むか、またはゲノムＤＮＡか
ら単離されたゲノムフラグメント全体を含有し得る。
【００６４】
本出願のために、付表Ａに示される配列のそれぞれは識別用のエントリー番号
を有することが理解される。これらの配列はそれぞれ、５’上流領域、コード領
域および下流領域の３つまでの部分を含む。これらの３領域はそれぞれ、混乱を
除くために同じエントリー番号表示によって識別される。その場合、付表Ａの配
列の１つの列挙は付表Ａにおける配列のいずれかを参照し、それらの異なるエン
トリー番号表示により区別され得る。これらの配列のそれぞれのコード領域は、
付表Ｂに示される対応するアミノ酸配列に翻訳される。付表Ｂの配列は、それら
が容易に相関し得るように付表Ａと同じエントリー番号表示によって識別される
。例えば、３８＿ｃｋ２１＿ｇ０７ｆｗｄとして示される付表Ｂのアミノ酸配列
は、核酸分子３８＿ｃｋ２１＿ｇ０７ｆｗｄのヌクレオチド配列のコード領域の
翻訳物である。表１には、３８＿ｃｋ２１＿ｇ０７ｆｗｄがＭＧＤシンターゼ（
モノガラトシルジアシルグリセロールシンターゼ）として同定されるように、個
々のクローンの機能および有用性が示されている。さらに、表１には、最長クロ
ーンのエントリー番号が示されている。例えば、エントリー番号ＰＰ０１０００
４０４１Ｒは、クローン３８＿ｃｋ２１＿ｇ０７ｆｗｄに対応するｃＤＮＡ配列
を表す。それは、さらに多くの配列情報を提供するより長いクローンを表す。そ
のようなより長いクローンは、ＭＧＤポリペプチド配列を有する機能的に活性な
タンパク質を産生させるために使用することができるか、またはそのようなより
長い配列は、ＭＧＤシンターゼがその一部である数個のポリペプチドの複合体の
一部に影響を及ぼすために使用することができる。
を有することが理解される。これらの配列はそれぞれ、５’上流領域、コード領
域および下流領域の３つまでの部分を含む。これらの３領域はそれぞれ、混乱を
除くために同じエントリー番号表示によって識別される。その場合、付表Ａの配
列の１つの列挙は付表Ａにおける配列のいずれかを参照し、それらの異なるエン
トリー番号表示により区別され得る。これらの配列のそれぞれのコード領域は、
付表Ｂに示される対応するアミノ酸配列に翻訳される。付表Ｂの配列は、それら
が容易に相関し得るように付表Ａと同じエントリー番号表示によって識別される
。例えば、３８＿ｃｋ２１＿ｇ０７ｆｗｄとして示される付表Ｂのアミノ酸配列
は、核酸分子３８＿ｃｋ２１＿ｇ０７ｆｗｄのヌクレオチド配列のコード領域の
翻訳物である。表１には、３８＿ｃｋ２１＿ｇ０７ｆｗｄがＭＧＤシンターゼ（
モノガラトシルジアシルグリセロールシンターゼ）として同定されるように、個
々のクローンの機能および有用性が示されている。さらに、表１には、最長クロ
ーンのエントリー番号が示されている。例えば、エントリー番号ＰＰ０１０００
４０４１Ｒは、クローン３８＿ｃｋ２１＿ｇ０７ｆｗｄに対応するｃＤＮＡ配列
を表す。それは、さらに多くの配列情報を提供するより長いクローンを表す。そ
のようなより長いクローンは、ＭＧＤポリペプチド配列を有する機能的に活性な
タンパク質を産生させるために使用することができるか、またはそのようなより
長い配列は、ＭＧＤシンターゼがその一部である数個のポリペプチドの複合体の
一部に影響を及ぼすために使用することができる。
【００６５】
別の好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、付表Ａに示
されるヌクレオチド配列の１つの相補体である核酸分子またはその一部分を含む
。付表Ａに示されるヌクレオチド配列の１つに対して相補的である核酸分子は、
それが付表Ａに示されるヌクレオチド配列の１つにハイブリダイゼーションし、
それにより安定な二重鎖を形成し得るように、付表Ａに示されるヌクレオチド配
列の１つに対して十分に相補的である核酸分子である。
されるヌクレオチド配列の１つの相補体である核酸分子またはその一部分を含む
。付表Ａに示されるヌクレオチド配列の１つに対して相補的である核酸分子は、
それが付表Ａに示されるヌクレオチド配列の１つにハイブリダイゼーションし、
それにより安定な二重鎖を形成し得るように、付表Ａに示されるヌクレオチド配
列の１つに対して十分に相補的である核酸分子である。
【００６６】
さらにまた別の好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、
付表Ａに示される１つのヌクレオチド配列に対する相同性が少なくとも約５０％
〜６０％であり、好ましくは少なくとも約６０％〜７０％であり、より好ましく
は少なくとも約７０％〜８０％、８０％〜９０％または９０％〜９５％であり、
さらに最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ま
たはそれ以上であるヌクレオチド配列またはその一部分を含む。さらなる好まし
い実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、例えば、ストリンジェン
トな条件のもとで、付表Ａに示されるヌクレオチド配列の１つにハイブリダイゼ
ーションするヌクレオチド配列またはその一部分を含む。
付表Ａに示される１つのヌクレオチド配列に対する相同性が少なくとも約５０％
〜６０％であり、好ましくは少なくとも約６０％〜７０％であり、より好ましく
は少なくとも約７０％〜８０％、８０％〜９０％または９０％〜９５％であり、
さらに最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ま
たはそれ以上であるヌクレオチド配列またはその一部分を含む。さらなる好まし
い実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、例えば、ストリンジェン
トな条件のもとで、付表Ａに示されるヌクレオチド配列の１つにハイブリダイゼ
ーションするヌクレオチド配列またはその一部分を含む。
【００６７】
さらに、本発明の核酸分子は、付表Ａにおける配列の１つのコード領域の一部
のみを含むことができ、例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得る
フラグメント、あるいはＬＭＲＰの生物学的に活性な一部分をコードするフラグ
メントを含むことができる。Ｐ．ｐａｔｅｎｓからＬＭＲＰ遺伝子をクローニン
グすることから決定されるヌクレオチド配列は、他のコケまたは関連する種に由
来するＬＭＲＰホモログだけでなく、他の細胞タイプおよび生物におけるＬＭＲ
Ｐホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計される
プローブおよびプライマーの作製を可能にする。プローブ／プライマーは、典型
的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、
典型的には、ストリンジェントな条件のもとで、付表Ａに示される配列の１つの
センス鎖、付表Ａに示される配列の１つのアンチセンス配列、または天然に存在
するその変異体の少なくとも約１２個（好ましくは約２５個、より好ましくは約
４０個、５０個または７５個）の連続したヌクレオチドにハイブリダイゼーショ
ンするヌクレオチド配列の領域を含む。付表Ａのヌクレオチド配列に基づくプラ
イマーは、ＬＭＲＰホモログをクローン化するためにＰＣＲ反応で使用すること
ができる。ＬＭＲＰヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じタンパク質また
は相同的なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使
用することができる。好ましい実施形態において、プローブはさらに、それに結
合した標識基を含む。例えば、標識基は、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、
または酵素の補助因子であり得る。そのようなプローブは、ＬＭＲＰをコードす
る核酸のレベルを細胞のサンプルにおいて測定することなどによって、例えば、
ＬＭＲＰのｍＲＮＡレベルを検出するか、あるいはゲノムのＬＭＲＰ遺伝子が変
異または欠失しているかどうかを決定することによって、ＬＭＲＰを誤って発現
する細胞を同定するためのゲノムマーカー試験キットの一部として使用すること
ができる。
のみを含むことができ、例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得る
フラグメント、あるいはＬＭＲＰの生物学的に活性な一部分をコードするフラグ
メントを含むことができる。Ｐ．ｐａｔｅｎｓからＬＭＲＰ遺伝子をクローニン
グすることから決定されるヌクレオチド配列は、他のコケまたは関連する種に由
来するＬＭＲＰホモログだけでなく、他の細胞タイプおよび生物におけるＬＭＲ
Ｐホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計される
プローブおよびプライマーの作製を可能にする。プローブ／プライマーは、典型
的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、
典型的には、ストリンジェントな条件のもとで、付表Ａに示される配列の１つの
センス鎖、付表Ａに示される配列の１つのアンチセンス配列、または天然に存在
するその変異体の少なくとも約１２個（好ましくは約２５個、より好ましくは約
４０個、５０個または７５個）の連続したヌクレオチドにハイブリダイゼーショ
ンするヌクレオチド配列の領域を含む。付表Ａのヌクレオチド配列に基づくプラ
イマーは、ＬＭＲＰホモログをクローン化するためにＰＣＲ反応で使用すること
ができる。ＬＭＲＰヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じタンパク質また
は相同的なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使
用することができる。好ましい実施形態において、プローブはさらに、それに結
合した標識基を含む。例えば、標識基は、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、
または酵素の補助因子であり得る。そのようなプローブは、ＬＭＲＰをコードす
る核酸のレベルを細胞のサンプルにおいて測定することなどによって、例えば、
ＬＭＲＰのｍＲＮＡレベルを検出するか、あるいはゲノムのＬＭＲＰ遺伝子が変
異または欠失しているかどうかを決定することによって、ＬＭＲＰを誤って発現
する細胞を同定するためのゲノムマーカー試験キットの一部として使用すること
ができる。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、タンパク質またはその一部分
が微生物または植物における細胞膜の構築に必要な化合物の代謝あるいはこれら
の膜を横断する分子の輸送に関与する能力を維持するように、付表Ｂの１つのア
ミノ酸配列に対して十分に相同的であるアミノ酸配列を含むタンパク質またはそ
の一部分をコードする。本明細書中で使用されている表現「十分に相同的」は、
タンパク質またはその一部分が微生物または植物における細胞膜の構築に必要な
化合物の代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与し得るように、付
表Ｂの１つのアミノ酸配列に対して最少数の同一のアミノ酸残基または等価なア
ミノ酸残基（例えば、付表Ｂの配列の１つにおけるアミノ差残基と類似する側鎖
を有するアミノ酸残基）を含むアミノ酸配列を有するタンパク質またはその一部
分をいう。そのような膜成分代謝経路または膜輸送システムのタンパク質メンバ
ーは、本明細書中に記載されているように、１つまたは複数のファインケミカル
の産生および分泌において役割を果たし得る。そのような活性の例もまた本明細
書中に記載されている。従って、ＬＭＲＰの機能は、１つまたは複数のファイン
ケミカルの収率、産生および／または産生効率に直接的または間接的のいずれか
で寄与する。ＬＭＲＰ活性の例が表１に示されている。
が微生物または植物における細胞膜の構築に必要な化合物の代謝あるいはこれら
の膜を横断する分子の輸送に関与する能力を維持するように、付表Ｂの１つのア
ミノ酸配列に対して十分に相同的であるアミノ酸配列を含むタンパク質またはそ
の一部分をコードする。本明細書中で使用されている表現「十分に相同的」は、
タンパク質またはその一部分が微生物または植物における細胞膜の構築に必要な
化合物の代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与し得るように、付
表Ｂの１つのアミノ酸配列に対して最少数の同一のアミノ酸残基または等価なア
ミノ酸残基（例えば、付表Ｂの配列の１つにおけるアミノ差残基と類似する側鎖
を有するアミノ酸残基）を含むアミノ酸配列を有するタンパク質またはその一部
分をいう。そのような膜成分代謝経路または膜輸送システムのタンパク質メンバ
ーは、本明細書中に記載されているように、１つまたは複数のファインケミカル
の産生および分泌において役割を果たし得る。そのような活性の例もまた本明細
書中に記載されている。従って、ＬＭＲＰの機能は、１つまたは複数のファイン
ケミカルの収率、産生および／または産生効率に直接的または間接的のいずれか
で寄与する。ＬＭＲＰ活性の例が表１に示されている。
【００６９】
別の実施形態において、タンパク質は、付表Ｂの１つのアミノ酸配列全体に対
する相同性が少なくとも約５０％〜６０％であり、好ましくは少なくとも約６０
％〜７０％であり、より好ましくは少なくとも約７０％〜８０％、８０％〜９０
％または９０％〜９５％であり、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、
９８％、９９％またはそれ以上である。
する相同性が少なくとも約５０％〜６０％であり、好ましくは少なくとも約６０
％〜７０％であり、より好ましくは少なくとも約７０％〜８０％、８０％〜９０
％または９０％〜９５％であり、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、
９８％、９９％またはそれ以上である。
【００７０】
本発明のＬＭＲＰ核酸分子によってコードされるタンパク質の一部分は、好ま
しくは、ＬＭＲＰの１つの生物学的に活性な一部分である。本明細書中で使用さ
れている用語「ＬＭＲＰの生物学的に活性な一部分」は、微生物または植物にお
ける細胞膜の構築に必要な化合物の代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸
送に関与するか、または表１に示されているような活性を有するＬＭＲＰの一部
分（例えば、ドメイン／モチーフ）を含むものとする。ＬＭＲＰまたはその生物
学的に活性な一部分が微生物または植物における細胞膜の構築に必要な化合物の
代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与し得るかどうかを明らかに
するために、酵素活性アッセイを行うことができる。そのようなアッセイ方法は
、実施例の実施例８に詳述されているように当業者には十分に知られている。
しくは、ＬＭＲＰの１つの生物学的に活性な一部分である。本明細書中で使用さ
れている用語「ＬＭＲＰの生物学的に活性な一部分」は、微生物または植物にお
ける細胞膜の構築に必要な化合物の代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸
送に関与するか、または表１に示されているような活性を有するＬＭＲＰの一部
分（例えば、ドメイン／モチーフ）を含むものとする。ＬＭＲＰまたはその生物
学的に活性な一部分が微生物または植物における細胞膜の構築に必要な化合物の
代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与し得るかどうかを明らかに
するために、酵素活性アッセイを行うことができる。そのようなアッセイ方法は
、実施例の実施例８に詳述されているように当業者には十分に知られている。
【００７１】
ＬＭＲＰの生物学的に活性な一部分をコードするさらなる核酸フラグメントは
、付表Ｂにおける配列の１つの一部分を単離することによって、ＬＭＲＰまたは
ペプチドのコードされる一部分を（例えば、インビトロでの組換え発現で）発現
させることによって、そしてＬＭＲＰまたはペプチドのコードされる一部分の活
性を評価することによって調製することができる。
、付表Ｂにおける配列の１つの一部分を単離することによって、ＬＭＲＰまたは
ペプチドのコードされる一部分を（例えば、インビトロでの組換え発現で）発現
させることによって、そしてＬＭＲＰまたはペプチドのコードされる一部分の活
性を評価することによって調製することができる。
【００７２】
本発明はさらに、遺伝暗号の縮重性のために付表Ａに示されるヌクレオチド配
列の１つとは異なり、従って付表Ａに示されるヌクレオチド配列によってコード
されるＬＭＲＰと同じＬＭＲＰをコードする核酸分子（およびその一部分）を包
含する。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、付表Ｂに示さ
れるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
さらにまたさらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、（付表Ａに示され
るオープンリーディングフレームによってコードされる）付表Ｂのアミノ酸配列
に対して実質的に相同的であるフィスコミトレラ・パテンスの全長タンパク質を
コードする。
列の１つとは異なり、従って付表Ａに示されるヌクレオチド配列によってコード
されるＬＭＲＰと同じＬＭＲＰをコードする核酸分子（およびその一部分）を包
含する。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、付表Ｂに示さ
れるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
さらにまたさらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、（付表Ａに示され
るオープンリーディングフレームによってコードされる）付表Ｂのアミノ酸配列
に対して実質的に相同的であるフィスコミトレラ・パテンスの全長タンパク質を
コードする。
【００７３】
付表Ａに示されるフィスコミトレラ・パテンスのＬＭＲＰヌクレオチド配列に
加えて、ＬＭＲＰのアミノ酸配列変化をもたらすＤＮＡ配列の多型体が集団（例
えば、フィスコミトレラ・パテンスの集団）内に存在し得ることが当業者により
理解される。ＬＭＲＰ遺伝子におけるそのような遺伝子多型は、自然の変化のた
めに集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用されている用語「遺伝子」
および用語「組換え遺伝子」は、ＬＭＲＰ（好ましくは、フィスコミトレラ・パ
テンスのＬＭＲＰ）をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子
をいう。そのような自然の変化は、典型的には、ＬＭＲＰ遺伝子のヌクレオチド
配列において１％〜５％の変動を生じさせ得る。天然の変化の結果であり、そし
てＬＭＲＰの機能的な活性を変化させないＬＭＲＰにおけるそのようなヌクレオ
チド変化および得られるアミノ酸多型のいずれかおよびすべてが本発明の範囲に
含まれるものとする。
加えて、ＬＭＲＰのアミノ酸配列変化をもたらすＤＮＡ配列の多型体が集団（例
えば、フィスコミトレラ・パテンスの集団）内に存在し得ることが当業者により
理解される。ＬＭＲＰ遺伝子におけるそのような遺伝子多型は、自然の変化のた
めに集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用されている用語「遺伝子」
および用語「組換え遺伝子」は、ＬＭＲＰ（好ましくは、フィスコミトレラ・パ
テンスのＬＭＲＰ）をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子
をいう。そのような自然の変化は、典型的には、ＬＭＲＰ遺伝子のヌクレオチド
配列において１％〜５％の変動を生じさせ得る。天然の変化の結果であり、そし
てＬＭＲＰの機能的な活性を変化させないＬＭＲＰにおけるそのようなヌクレオ
チド変化および得られるアミノ酸多型のいずれかおよびすべてが本発明の範囲に
含まれるものとする。
【００７４】
本発明のフィスコミトレラ・パテンスＬＭＲＰのｃＤＮＡの天然の変異体およ
びフィスコミトレラ・パテンス以外のホモログに対応する核酸分子は、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでの標準的なハイブリダイゼーシ
ョン技術に従ってフィスコミトレラ・パテンスのｃＤＮＡまたはその一部分をハ
イブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書中に開示されるフィス
コミトレラ・パテンスのＬＭＲＰ核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離す
ることができる。従って、別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子
は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、そしてストリンジェントな条件
のもとで、付表Ａの１つのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイゼー
ションする。他の実施形態において、核酸は、長さが少なくとも３０ヌクレオチ
ド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、または２５０ヌクレオチド以上で
ある。本明細書中で使用されている用語「ストリンジェントな条件のもとでハイ
ブリダイゼーションする」は、相互の相同性が少なくとも６０％であるヌクレオ
チド配列が典型的には互いにハイブリダイゼーションした状態を維持するハイブ
リダイゼーション条件および洗浄条件を記載するものとする。好ましくは、その
条件は、相互の相同性が少なくとも約６５％（より好ましくは少なくとも約７０
％、さらに最も好ましくは少なくとも約７５％またはそれ以上）であるヌクレオ
チド配列が典型的には互いにハイブリダイゼーションした状態を維持するような
条件である。そのようなストリンジェントな条件は当業者にに知られており、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６
．３．６に見出され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好
ましい非限定的な例には、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）
における約４５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、０．２ＸＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳにおける５０℃〜６５℃での１回または数回の洗浄が挙げられる
。好ましくは、ストリンジェントな条件のもとで付表Ａの配列にハイブリダイゼ
ーションする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応す
る。本明細書中で使用されている「天然に存在する」核酸分子は、自然界に存在
するヌクレオチド配列（例えば、天然のタンパク質をコードするヌクレオチド配
列）を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。１つの実施形態において、核
酸は、天然のフィスコミトレラ・パテンスＬＭＲＰをコードする。
びフィスコミトレラ・パテンス以外のホモログに対応する核酸分子は、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでの標準的なハイブリダイゼーシ
ョン技術に従ってフィスコミトレラ・パテンスのｃＤＮＡまたはその一部分をハ
イブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書中に開示されるフィス
コミトレラ・パテンスのＬＭＲＰ核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離す
ることができる。従って、別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子
は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、そしてストリンジェントな条件
のもとで、付表Ａの１つのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイゼー
ションする。他の実施形態において、核酸は、長さが少なくとも３０ヌクレオチ
ド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、または２５０ヌクレオチド以上で
ある。本明細書中で使用されている用語「ストリンジェントな条件のもとでハイ
ブリダイゼーションする」は、相互の相同性が少なくとも６０％であるヌクレオ
チド配列が典型的には互いにハイブリダイゼーションした状態を維持するハイブ
リダイゼーション条件および洗浄条件を記載するものとする。好ましくは、その
条件は、相互の相同性が少なくとも約６５％（より好ましくは少なくとも約７０
％、さらに最も好ましくは少なくとも約７５％またはそれ以上）であるヌクレオ
チド配列が典型的には互いにハイブリダイゼーションした状態を維持するような
条件である。そのようなストリンジェントな条件は当業者にに知られており、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６
．３．６に見出され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好
ましい非限定的な例には、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）
における約４５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、０．２ＸＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳにおける５０℃〜６５℃での１回または数回の洗浄が挙げられる
。好ましくは、ストリンジェントな条件のもとで付表Ａの配列にハイブリダイゼ
ーションする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応す
る。本明細書中で使用されている「天然に存在する」核酸分子は、自然界に存在
するヌクレオチド配列（例えば、天然のタンパク質をコードするヌクレオチド配
列）を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。１つの実施形態において、核
酸は、天然のフィスコミトレラ・パテンスＬＭＲＰをコードする。
【００７５】
集団に存在し得るＬＭＲＰ配列の天然に存在する変異体に加えて、当業者はさ
らに、変化を変異によって付表Ａのヌクレイチド配列に導入することができ、そ
れにより、ＬＭＲＰの機能的能力を変化させることなく、コードされるＬＭＲＰ
のアミノ酸配列を変化させることができることを理解する。例えば、「非必須」
アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を付表Ａの配列
において行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、ＬＭＲＰの１つの野性
型配列（付表Ｂ）から、前記ＬＭＲＰの活性を変化させることなく変化させるこ
とができる残基であり、これに対して、「必須」アミノ酸残基はＬＭＲＰ活性に
必要である。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＬＭＲＰ活性を有するドメイ
ンに保存されていない残基、または半保存されているすぎない残基）は、活性に
は必要でない場合があり、従ってＬＭＲＰ活性を変化させることなく変化させる
ことができると考えられる。
らに、変化を変異によって付表Ａのヌクレイチド配列に導入することができ、そ
れにより、ＬＭＲＰの機能的能力を変化させることなく、コードされるＬＭＲＰ
のアミノ酸配列を変化させることができることを理解する。例えば、「非必須」
アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を付表Ａの配列
において行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、ＬＭＲＰの１つの野性
型配列（付表Ｂ）から、前記ＬＭＲＰの活性を変化させることなく変化させるこ
とができる残基であり、これに対して、「必須」アミノ酸残基はＬＭＲＰ活性に
必要である。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＬＭＲＰ活性を有するドメイ
ンに保存されていない残基、または半保存されているすぎない残基）は、活性に
は必要でない場合があり、従ってＬＭＲＰ活性を変化させることなく変化させる
ことができると考えられる。
【００７６】
従って、本発明の別の態様は、ＬＭＲＰ活性に必須でないアミノ酸残基におけ
る変化を含有するＬＭＲＰをコードする核酸分子に関する。そのようなＬＭＲＰ
は、アミノ酸残基が付表Ｂに含まれる配列とは異なるが、本明細書中に記載され
るＬＭＲＰ活性の少なくとも１つを保持する。１つの実施形態において、単離さ
れた核酸分子は、付表Ｂの１つのアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも約５
０％であるアミノ酸配列を含み、かつＰ．Ｐａｔｅｎｓにおける細胞膜の構築に
必要な化合物の代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与し得るか、
または表１に示される１つもしくは２つ以上の活性を有するタンパク質をコード
するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、そのような核酸分子によってコード
されるタンパク質は、付表Ｂにおける配列の１つに対する相同性が少なくとも約
５０％〜６０％であり、好ましくは付表Ｂにおける配列の１つに対する相同性が
少なくとも約６０％〜７０％であり、さらにより好ましくは付表Ｂにおける配列
の１つに対する相同性が少なくとも約７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％
〜９５％であり、最も好ましくは付表Ｂにおける配列の１つに対する相同性が少
なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％である。
る変化を含有するＬＭＲＰをコードする核酸分子に関する。そのようなＬＭＲＰ
は、アミノ酸残基が付表Ｂに含まれる配列とは異なるが、本明細書中に記載され
るＬＭＲＰ活性の少なくとも１つを保持する。１つの実施形態において、単離さ
れた核酸分子は、付表Ｂの１つのアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも約５
０％であるアミノ酸配列を含み、かつＰ．Ｐａｔｅｎｓにおける細胞膜の構築に
必要な化合物の代謝あるいはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与し得るか、
または表１に示される１つもしくは２つ以上の活性を有するタンパク質をコード
するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、そのような核酸分子によってコード
されるタンパク質は、付表Ｂにおける配列の１つに対する相同性が少なくとも約
５０％〜６０％であり、好ましくは付表Ｂにおける配列の１つに対する相同性が
少なくとも約６０％〜７０％であり、さらにより好ましくは付表Ｂにおける配列
の１つに対する相同性が少なくとも約７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％
〜９５％であり、最も好ましくは付表Ｂにおける配列の１つに対する相同性が少
なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％である。
【００７７】
２つのアミノ酸配列（例えば、付表Ｂの配列の１つおよびその変異形態）また
は２つの核酸の相同性％を決定するために、配列は最適な比較のためにアライン
メントされる（例えば、ギャップを、もう一方のタンパク質または核酸との最適
なアラインメントのために一方のタンパク質または核酸の配列に導入することが
できる）。その後、アミノ酸残基あるいは対応するアミノ酸位置またはヌクレオ
チド位置におけるヌクレオチドが比較される。一方の配列（例えば、付表Ｂの配
列の１つ）における位置が、もう一方の配列（付表Ｂから選択される配列の変異
形態）における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占
められている場合、これらの分子はその位置において相同的である（すなわち、
本明細書中で使用されてるように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸
または核酸の「同一性」と等価である）。２つの配列の間における相同性％は、
それらの配列がともに有する同一位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝
同一位置の数／位置の総数ｘ１００）。
は２つの核酸の相同性％を決定するために、配列は最適な比較のためにアライン
メントされる（例えば、ギャップを、もう一方のタンパク質または核酸との最適
なアラインメントのために一方のタンパク質または核酸の配列に導入することが
できる）。その後、アミノ酸残基あるいは対応するアミノ酸位置またはヌクレオ
チド位置におけるヌクレオチドが比較される。一方の配列（例えば、付表Ｂの配
列の１つ）における位置が、もう一方の配列（付表Ｂから選択される配列の変異
形態）における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占
められている場合、これらの分子はその位置において相同的である（すなわち、
本明細書中で使用されてるように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸
または核酸の「同一性」と等価である）。２つの配列の間における相同性％は、
それらの配列がともに有する同一位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝
同一位置の数／位置の総数ｘ１００）。
【００７８】
付表Ｂのタンパク質配列に対して相同的なＬＭＲＰをコードする単離された核
酸分子は、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタン
パク質に導入されるように、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠
失を付表Ａのヌクレオチド配列に導入することによって作製することができる。
変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準的な技術によ
って付表Ａの配列の１つに導入することができる。好ましくは、保存的なアミノ
酸置換が１つまたは複数の予測される非必須アミノ酸残基において行われる。「
保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基
で置換される置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーがこ
の分野では定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミ
ノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸
（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷の極性側鎖を有するアミノ
酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロ
シン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン
、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプ
トファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イ
ソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニル
アラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。従って、ＬＭＲＰにおけ
る予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーに由来す
る別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異を、
ＬＭＲＰをコードする配列の全体または一部に沿って飽和変異誘発などによって
ランダムに導入することができ、そして得られた変異体を、本明細書中に記載さ
れるＬＭＲＰ活性についてスクリーニングして、ＬＭＲＰ活性を保持する変異体
を同定することができる。付表Ａの配列の１つを変異誘発した後、コードされる
タンパク質を組換え発現させることができ、そしてそのタンパク質の活性を、例
えば、本明細書中に記載されるアッセイを使用して測定することができる（実施
例の実施例８を参照のこと）。
酸分子は、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタン
パク質に導入されるように、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠
失を付表Ａのヌクレオチド配列に導入することによって作製することができる。
変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準的な技術によ
って付表Ａの配列の１つに導入することができる。好ましくは、保存的なアミノ
酸置換が１つまたは複数の予測される非必須アミノ酸残基において行われる。「
保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基
で置換される置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーがこ
の分野では定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミ
ノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸
（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷の極性側鎖を有するアミノ
酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロ
シン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン
、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプ
トファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イ
ソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニル
アラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。従って、ＬＭＲＰにおけ
る予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーに由来す
る別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異を、
ＬＭＲＰをコードする配列の全体または一部に沿って飽和変異誘発などによって
ランダムに導入することができ、そして得られた変異体を、本明細書中に記載さ
れるＬＭＲＰ活性についてスクリーニングして、ＬＭＲＰ活性を保持する変異体
を同定することができる。付表Ａの配列の１つを変異誘発した後、コードされる
タンパク質を組換え発現させることができ、そしてそのタンパク質の活性を、例
えば、本明細書中に記載されるアッセイを使用して測定することができる（実施
例の実施例８を参照のこと）。
【００７９】
ＬＭＲＰをコードする上記の核酸分子に加えて、本発明の別の態様は、それに
対してアンチセンスである単離された核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸
は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的であるヌクレオチド
配列、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的であるか、または
ｍＲＮＡ配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセ
ンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、ＬＭ
ＲＰのコード鎖全体に対して相補的であり得るか、またはその一部分に対しての
み相補的であり得る。１つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＬＭ
ＲＰをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチ
センスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む
ヌクレオチド配列の領域をいう（例えば、，，，，，のコード領域全体はヌクレ
オチド１〜．．．．を含む）。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は
、ＬＭＲＰをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対し
てアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されない、コ
ード領域に隣接する５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域
および３’非翻訳領域としても示される）。
対してアンチセンスである単離された核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸
は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的であるヌクレオチド
配列、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的であるか、または
ｍＲＮＡ配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセ
ンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、ＬＭ
ＲＰのコード鎖全体に対して相補的であり得るか、またはその一部分に対しての
み相補的であり得る。１つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＬＭ
ＲＰをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチ
センスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む
ヌクレオチド配列の領域をいう（例えば、，，，，，のコード領域全体はヌクレ
オチド１〜．．．．を含む）。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は
、ＬＭＲＰをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対し
てアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されない、コ
ード領域に隣接する５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域
および３’非翻訳領域としても示される）。
【００８０】
本明細書中に開示されるＬＭＲＰをコードするコード鎖配列（例えば、付表Ａ
に示される配列）が与えられると、本発明のアンチセンス核酸をワトソンおよび
クリックの塩基対形成則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子
は、ＬＭＲＰのｍＲＮＡのコード領域全体に対して相補的であり得るが、より好
ましくは、ＬＭＲＰのｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部分に対し
てのみ相補的であるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、ＬＭＲＰのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に対して相補的で
あり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５ヌクレオチ
ド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌ
クレオチド、約３０ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、
約４５ヌクレオチドまたは約５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセン
ス核酸は、この分野で知られている手法を使用する化学合成反応および酵素連結
反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドを使用して化
学合成することができ、あるいは分子の生物学的安定性を増大させるために、ま
たはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を
増大させるために設計された種々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学合成
することができる（例えば、ホスホロチオアート誘導体およびアクリジン置換ヌ
クレオチドを使用することができる）。アンチセンス核酸を作製するために使用
され得る修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシ
ル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、
４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−
カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミ
ノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イ
ノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノ
シン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、
３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニ
ン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウ
ラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウ
ラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニ
ン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、
キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウ
ラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メ
チルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシ
ル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ
３）ｗ、および２，６−ジメチルプリンが含まれる。あるいは、アンチセンス核
酸は、核酸分子がアンチセンス方向でサブクローン化されている発現ベクターを
使用して生物学的に作製することができる（すなわち、挿入された核酸から転写
されるＲＮＡは目的とする標的核酸に対してアンチセンス方向である。下記の節
においてさらに説明される）。
に示される配列）が与えられると、本発明のアンチセンス核酸をワトソンおよび
クリックの塩基対形成則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子
は、ＬＭＲＰのｍＲＮＡのコード領域全体に対して相補的であり得るが、より好
ましくは、ＬＭＲＰのｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部分に対し
てのみ相補的であるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、ＬＭＲＰのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に対して相補的で
あり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５ヌクレオチ
ド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌ
クレオチド、約３０ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、
約４５ヌクレオチドまたは約５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセン
ス核酸は、この分野で知られている手法を使用する化学合成反応および酵素連結
反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドを使用して化
学合成することができ、あるいは分子の生物学的安定性を増大させるために、ま
たはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を
増大させるために設計された種々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学合成
することができる（例えば、ホスホロチオアート誘導体およびアクリジン置換ヌ
クレオチドを使用することができる）。アンチセンス核酸を作製するために使用
され得る修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシ
ル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、
４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−
カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミ
ノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イ
ノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノ
シン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、
３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニ
ン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウ
ラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウ
ラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニ
ン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、
キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウ
ラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メ
チルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシ
ル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ
３）ｗ、および２，６−ジメチルプリンが含まれる。あるいは、アンチセンス核
酸は、核酸分子がアンチセンス方向でサブクローン化されている発現ベクターを
使用して生物学的に作製することができる（すなわち、挿入された核酸から転写
されるＲＮＡは目的とする標的核酸に対してアンチセンス方向である。下記の節
においてさらに説明される）。
【００８１】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、アンチセンス核酸分子が、Ｌ
ＭＲＰをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイゼ
ーションするか、またはそれらに結合し、それにより、例えば、転写および／ま
たは翻訳を阻害することによってタンパク質の発現を阻害するように、細胞に投
与されるか、またはインシトゥで生成させられる。ハイブリダイゼーションは、
安定な二重鎖を形成させるための通常的なヌクレオチド相補性によって生じ得る
か、または、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重ら
せんの主溝における特異的な相互作用を介して生じ得る。アンチセンス分子は、
例えば、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセ
ンス核酸分子を結合させることによって、アンチセンス分子が、選択された細胞
表面に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように改変することができ
る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを使用して
細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内における濃度を
達成するために、強力な原核生物プロモーター、ウイルスプロモーターまたは真
核生物プロモーター（植物プロモーターを含む）の制御下にアンチセンス核酸分
子が置かれるベクター構築物が好ましい。
ＭＲＰをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイゼ
ーションするか、またはそれらに結合し、それにより、例えば、転写および／ま
たは翻訳を阻害することによってタンパク質の発現を阻害するように、細胞に投
与されるか、またはインシトゥで生成させられる。ハイブリダイゼーションは、
安定な二重鎖を形成させるための通常的なヌクレオチド相補性によって生じ得る
か、または、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重ら
せんの主溝における特異的な相互作用を介して生じ得る。アンチセンス分子は、
例えば、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセ
ンス核酸分子を結合させることによって、アンチセンス分子が、選択された細胞
表面に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように改変することができ
る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを使用して
細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内における濃度を
達成するために、強力な原核生物プロモーター、ウイルスプロモーターまたは真
核生物プロモーター（植物プロモーターを含む）の制御下にアンチセンス核酸分
子が置かれるベクター構築物が好ましい。
【００８２】
さらに別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー
核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常のβユニットとは対照的に、鎖
が互いに平行している、相補的なＲＮＡとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成
する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチ
ルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８）またはキメラなＲＮＡ−ＤＮＡアナログ
（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０）
を含むことができる。
核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常のβユニットとは対照的に、鎖
が互いに平行している、相補的なＲＮＡとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成
する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチ
ルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８）またはキメラなＲＮＡ−ＤＮＡアナログ
（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０）
を含むことができる。
【００８３】
さらにまた別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムで
ある。リボザイムは、リボザイムが相補的な領域を有する一本鎖核酸（ｍＲＮＡ
など）を切断することができる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒作用ＲＮＡ
分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（Ｈａ
ｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５
８５〜５９１に記載される））を使用して、ＬＭＲＰのｍＲＮＡ転写物を触媒的
に切断し、それによりＬＭＲＰのｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＬＭ
ＲＰをコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムを、本明細書中に開示
されるＬＭＲＰのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、付表Ａの３８＿ｃｋ
２１＿ｇ０７ｆｗｄ）に基づいて、あるいは本発明に教示される方法に従って単
離され得る異種の配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌ
クレオチド配列がＬＭＲＰコードｍＲＮＡ内の切断され得るヌクレオチド配列に
対して相補的であるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｒａ）Ｌ−１９ ＩＶＳ
のＲＮＡの誘導体を構築することができる。例えば、米国特許第４，９８７，０
７１号（Ｃｅｃｈら）および米国特許第５，１１６，７４２号（Ｃｅｃｈら）を
参照のこと。あるいは、ＬＭＲＰのｍＲＮＡを使用して、特異的なリボヌクレア
ーゼ活性を有する触媒作用のＲＮＡをＲＮＡ分子のプールから選択することがで
きる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３
）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
ある。リボザイムは、リボザイムが相補的な領域を有する一本鎖核酸（ｍＲＮＡ
など）を切断することができる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒作用ＲＮＡ
分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（Ｈａ
ｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５
８５〜５９１に記載される））を使用して、ＬＭＲＰのｍＲＮＡ転写物を触媒的
に切断し、それによりＬＭＲＰのｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＬＭ
ＲＰをコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムを、本明細書中に開示
されるＬＭＲＰのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、付表Ａの３８＿ｃｋ
２１＿ｇ０７ｆｗｄ）に基づいて、あるいは本発明に教示される方法に従って単
離され得る異種の配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌ
クレオチド配列がＬＭＲＰコードｍＲＮＡ内の切断され得るヌクレオチド配列に
対して相補的であるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｒａ）Ｌ−１９ ＩＶＳ
のＲＮＡの誘導体を構築することができる。例えば、米国特許第４，９８７，０
７１号（Ｃｅｃｈら）および米国特許第５，１１６，７４２号（Ｃｅｃｈら）を
参照のこと。あるいは、ＬＭＲＰのｍＲＮＡを使用して、特異的なリボヌクレア
ーゼ活性を有する触媒作用のＲＮＡをＲＮＡ分子のプールから選択することがで
きる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３
）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【００８４】
あるいは、ＬＭＲＰの遺伝子発現は、ＬＭＲＰヌクレオチド配列の調節領域（
例えば、ＬＭＲＰのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に対して相補的
なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞におけるＬＭＲＰ遺伝子の転写を妨
げる三重らせん構造を形成させることによって阻害することができる。一般的に
は、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅ
ｓ．６（６）：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら（１９９２）、Ａｎｎ．Ｎ
．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；Ｍａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９
２）、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、１４（２）：８０７〜１５を参照のこと。
例えば、ＬＭＲＰのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に対して相補的
なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞におけるＬＭＲＰ遺伝子の転写を妨
げる三重らせん構造を形成させることによって阻害することができる。一般的に
は、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅ
ｓ．６（６）：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら（１９９２）、Ａｎｎ．Ｎ
．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；Ｍａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９
２）、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、１４（２）：８０７〜１５を参照のこと。
【００８５】
Ｂ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の態様は、ＬＭＲＰをコードする核酸（またはその一部）を含むベ
クター（好ましくは、発現ベクター）に関する。本明細書中で使用されている用
語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子をいう。ベク
ターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメン
トが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループ体をいう。ベクターの別のタイプは
、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得るウイルスベクター
である。ある種のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞で自律的に複製す
ることができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソ
ームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳動物
ベクター）は、宿主細胞に導入されたときに宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そ
れにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、機能的
に連結されている遺伝子の発現を行わせることができる。そのようなベクターは
、本明細書中では「発現ベクター」として示される。一般に、組換えＤＮＡ技術
において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態にある。プラス
ミドはベクターの最もよく使用される形態であるので、本明細書中では、「プラ
スミド」および「ベクター」は交換可能に使用することができる。しかし、本発
明は、同等の機能をもたらす、発現ベクターのそのような他の形態（ウイルスベ
クター（例えば、複製欠陥のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連
ウイルス）など）を含むものとする。
クター（好ましくは、発現ベクター）に関する。本明細書中で使用されている用
語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子をいう。ベク
ターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメン
トが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループ体をいう。ベクターの別のタイプは
、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得るウイルスベクター
である。ある種のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞で自律的に複製す
ることができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソ
ームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳動物
ベクター）は、宿主細胞に導入されたときに宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そ
れにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、機能的
に連結されている遺伝子の発現を行わせることができる。そのようなベクターは
、本明細書中では「発現ベクター」として示される。一般に、組換えＤＮＡ技術
において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態にある。プラス
ミドはベクターの最もよく使用される形態であるので、本明細書中では、「プラ
スミド」および「ベクター」は交換可能に使用することができる。しかし、本発
明は、同等の機能をもたらす、発現ベクターのそのような他の形態（ウイルスベ
クター（例えば、複製欠陥のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連
ウイルス）など）を含むものとする。
【００８６】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞において核酸を発
現させるために適した形態で含む。このことは、組換え発現ベクターが、発現の
ために使用される宿主に基づいて選択され、発現させる核酸配列に対して機能的
に連結されている１つまたは複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現
ベクター内において、「機能的に連結されている」は、互い融合されたヌクレオ
チド配列の発現を可能にし、その結果、両方の配列により、使用された配列に伴
う提示された機能が果たされる様式で（例えば、インビトロ転写／翻訳システム
において、またはベクターが宿主細胞に導入されたときには宿主細胞において）
、目的とするヌクレオチド配列が調節配列（１つまたは複数）に連結されている
ことを意味するものとする。用語「調節配列」には、プロモーター、エンハンサ
ーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれ
るものとする。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、
ＣＡ（１９９０）に記載されているか、またはＧｒｕｂｅｒおよびＣｒｏｓｂｙ
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔ
ｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、編者：ＧｌｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ）、第７章、
８９頁〜１０８頁（それにおける参考文献を含む）を参照のこと。調節配列には
、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的な発現を行わせる配列、
およびある種の宿主細胞またはある種の条件でのみヌクレオチド配列の発現を行
わせる配列が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択
、所望するタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得ることが当業者
により理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより
、本明細書中に記載されているような核酸によってコードされる、融合タンパク
質または融合ペプチドを含むタンパク質またはペプチド（例えば、ＬＭＲＰ、Ｌ
ＭＲＰの変異形態、融合タンパク質など）を産生させることができる。
現させるために適した形態で含む。このことは、組換え発現ベクターが、発現の
ために使用される宿主に基づいて選択され、発現させる核酸配列に対して機能的
に連結されている１つまたは複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現
ベクター内において、「機能的に連結されている」は、互い融合されたヌクレオ
チド配列の発現を可能にし、その結果、両方の配列により、使用された配列に伴
う提示された機能が果たされる様式で（例えば、インビトロ転写／翻訳システム
において、またはベクターが宿主細胞に導入されたときには宿主細胞において）
、目的とするヌクレオチド配列が調節配列（１つまたは複数）に連結されている
ことを意味するものとする。用語「調節配列」には、プロモーター、エンハンサ
ーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれ
るものとする。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、
ＣＡ（１９９０）に記載されているか、またはＧｒｕｂｅｒおよびＣｒｏｓｂｙ
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔ
ｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、編者：ＧｌｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ）、第７章、
８９頁〜１０８頁（それにおける参考文献を含む）を参照のこと。調節配列には
、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的な発現を行わせる配列、
およびある種の宿主細胞またはある種の条件でのみヌクレオチド配列の発現を行
わせる配列が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択
、所望するタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得ることが当業者
により理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより
、本明細書中に記載されているような核酸によってコードされる、融合タンパク
質または融合ペプチドを含むタンパク質またはペプチド（例えば、ＬＭＲＰ、Ｌ
ＭＲＰの変異形態、融合タンパク質など）を産生させることができる。
【００８７】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞においてＬ
ＭＲＰを発現させるために設計することができる。例えば、ＬＭＲＰ遺伝子を下
記において発現させることができる：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの細菌細胞
、昆虫細胞（バキュロウイルス発現システムを含む）、酵母および他の菌類細胞
（Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ら（１９９２）、酵母における外来遺伝子の発現：
総説、Ｙｅａｓｔ、８：４２３〜４８８；ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．
Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ら（１９９１）、糸状菌における異種遺伝子の発現、Ｍｏｒｅ
Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ、Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎ
ｎｅｔ＆Ｌ．Ｌ．Ｌａｓｕｒｅ編、３９６頁〜４２８頁：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．
Ｊ．Ｊ．およびＰｕｎｔ．Ｐ．Ｊ．（１９９１）、糸状菌のための遺伝子移入シ
ステムおよびベクター開発、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ（Ｐｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．Ｆ．ら編）、１頁〜２８頁、
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
）、藻類（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら、１９９９、Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、１、３：２３９〜２５１）、様々なタイプの繊毛虫類（全毛亜綱
（Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ）、周毛亜綱（Ｐｅｒｉｔｒｉｃｈｉａ）、旋毛亜綱
（Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈｉａ）、吸管虫亜綱（Ｓｕｃｔｏｒｉａ）、テトラヒメ
ナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）、ゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）、ナガマ
メガタミズケムシ（Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ）、グラウコーマ（Ｇｌａｕｃｏｍａ）
、プラチオフリア（Ｐｌａｔｙｏｐｈｒｙａ）、ポトマクス（Ｐｏｔｏｍａｃｕ
ｓ）、シュードコーニレンブス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｈｎｉｌｅｍｂｕｓ）、ユー
プロテス（Ｅｕｐｌｏｔｅｓ）、エンゲルマニエラ（Ｅｎｇｅｌｍａｎｉｅｌｌ
ａ）およびスチロニキア亜綱（Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ）、特に国際特許出願公
開ＷＯ９８０１５７２に記載されるような形質転換方法に従ったベクターを有す
るスチロニキア・レムナエ（Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ ｌｅｍｎａｅ）属の繊毛
虫）、および多細胞植物細胞（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．およびＷｉｌｌｍｉｔｚｅ
ｒ，Ｌ．（１９８８）、アラビドプシス・タリアナの葉および子葉の外稙片の高
効率のアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換、Ｐｌａｎｔ Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｐ．５８３〜５８６；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、６／７章、Ｓ．７１〜１１９（１９９３）；Ｆ．Ｆ．
Ｗｈｉｔｅ、Ｂ．Ｊｅｎｅｓら、遺伝子移入技術、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌ
ａｎｔｓ、第１巻Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、
編者：ＫｕｎｇおよびＲ．Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、
１２８〜４３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１）、２０５〜２２５
（およびそれらに引用される参考文献）、または哺乳動物細胞。好適な宿主細胞
が、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）にさらに記載されている。
あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーターの調節配列および
Ｔ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳することができる。
ＭＲＰを発現させるために設計することができる。例えば、ＬＭＲＰ遺伝子を下
記において発現させることができる：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの細菌細胞
、昆虫細胞（バキュロウイルス発現システムを含む）、酵母および他の菌類細胞
（Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ら（１９９２）、酵母における外来遺伝子の発現：
総説、Ｙｅａｓｔ、８：４２３〜４８８；ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．
Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ら（１９９１）、糸状菌における異種遺伝子の発現、Ｍｏｒｅ
Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ、Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎ
ｎｅｔ＆Ｌ．Ｌ．Ｌａｓｕｒｅ編、３９６頁〜４２８頁：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．
Ｊ．Ｊ．およびＰｕｎｔ．Ｐ．Ｊ．（１９９１）、糸状菌のための遺伝子移入シ
ステムおよびベクター開発、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ（Ｐｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．Ｆ．ら編）、１頁〜２８頁、
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
）、藻類（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら、１９９９、Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、１、３：２３９〜２５１）、様々なタイプの繊毛虫類（全毛亜綱
（Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ）、周毛亜綱（Ｐｅｒｉｔｒｉｃｈｉａ）、旋毛亜綱
（Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈｉａ）、吸管虫亜綱（Ｓｕｃｔｏｒｉａ）、テトラヒメ
ナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）、ゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）、ナガマ
メガタミズケムシ（Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ）、グラウコーマ（Ｇｌａｕｃｏｍａ）
、プラチオフリア（Ｐｌａｔｙｏｐｈｒｙａ）、ポトマクス（Ｐｏｔｏｍａｃｕ
ｓ）、シュードコーニレンブス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｈｎｉｌｅｍｂｕｓ）、ユー
プロテス（Ｅｕｐｌｏｔｅｓ）、エンゲルマニエラ（Ｅｎｇｅｌｍａｎｉｅｌｌ
ａ）およびスチロニキア亜綱（Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ）、特に国際特許出願公
開ＷＯ９８０１５７２に記載されるような形質転換方法に従ったベクターを有す
るスチロニキア・レムナエ（Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ ｌｅｍｎａｅ）属の繊毛
虫）、および多細胞植物細胞（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．およびＷｉｌｌｍｉｔｚｅ
ｒ，Ｌ．（１９８８）、アラビドプシス・タリアナの葉および子葉の外稙片の高
効率のアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換、Ｐｌａｎｔ Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｐ．５８３〜５８６；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、６／７章、Ｓ．７１〜１１９（１９９３）；Ｆ．Ｆ．
Ｗｈｉｔｅ、Ｂ．Ｊｅｎｅｓら、遺伝子移入技術、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌ
ａｎｔｓ、第１巻Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、
編者：ＫｕｎｇおよびＲ．Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、
１２８〜４３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１）、２０５〜２２５
（およびそれらに引用される参考文献）、または哺乳動物細胞。好適な宿主細胞
が、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）にさらに記載されている。
あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーターの調節配列および
Ｔ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳することができる。
【００８８】
原核生物におけるタンパク質の発現が、非常に多くの場合、融合タンパク質ま
たは非融合タンパク質のいずれかの発現を行わせる構成的プロモーターまたは誘
導性プロモーターを含むベクターを用いて行われている。融合ベクターは、それ
にコードされるタンパク質に多数のアミノ酸を付加し、通常的には組換えタンパ
ク質のアミノ末端に付加するが、Ｃ末端にも付加し、またはタンパク質内の好適
な領域内において融合させる。そのような融合ベクターは、典型的には３つの目
的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増大させるため；２）組換えタンパ
ク質の溶解性を増大させるため；そして３）アフィニティー精製におけるリガン
ドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けるため。多くの場
合、融合発現ベクターには、タンパク質分解的な切断部位が融合成分と組換えタ
ンパク質との接続部に導入され、融合タンパク質を精製した後で組換えタンパク
質を融合成分から分離することができる。そのような酵素、およびそれらの同系
の認識配列には、ファクターＸａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれ
る。
たは非融合タンパク質のいずれかの発現を行わせる構成的プロモーターまたは誘
導性プロモーターを含むベクターを用いて行われている。融合ベクターは、それ
にコードされるタンパク質に多数のアミノ酸を付加し、通常的には組換えタンパ
ク質のアミノ末端に付加するが、Ｃ末端にも付加し、またはタンパク質内の好適
な領域内において融合させる。そのような融合ベクターは、典型的には３つの目
的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増大させるため；２）組換えタンパ
ク質の溶解性を増大させるため；そして３）アフィニティー精製におけるリガン
ドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けるため。多くの場
合、融合発現ベクターには、タンパク質分解的な切断部位が融合成分と組換えタ
ンパク質との接続部に導入され、融合タンパク質を精製した後で組換えタンパク
質を融合成分から分離することができる。そのような酵素、およびそれらの同系
の認識配列には、ファクターＸａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれ
る。
【００８９】
典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８
８）、Ｇｅｎｅ、６７：３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテイ
ンＡを標的の組換えタンパク質に融合する。１つの実施形態において、ＬＭＲＰ
のコード配列がｐＧＥＸ発現ベクターにクローン化され、Ｎ末端からＣ末端に、
ＧＳＴ−トロンビン切断部位−Ｘタンパク質を含む融合タンパク質をコードする
ベクターが作製される。この融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース樹脂
を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
ＧＳＴに融合していない組換えタンパク質を、融合タンパク質をトロンビンで切
断することによって回収することができる。
ｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８
８）、Ｇｅｎｅ、６７：３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテイ
ンＡを標的の組換えタンパク質に融合する。１つの実施形態において、ＬＭＲＰ
のコード配列がｐＧＥＸ発現ベクターにクローン化され、Ｎ末端からＣ末端に、
ＧＳＴ−トロンビン切断部位−Ｘタンパク質を含む融合タンパク質をコードする
ベクターが作製される。この融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース樹脂
を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
ＧＳＴに融合していない組換えタンパク質を、融合タンパク質をトロンビンで切
断することによって回収することができる。
【００９０】
好適な誘導性の非融合型大腸菌発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ
ら（１９８８）、Ｇｅｎｅ、６９：３０１〜３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔ
ｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）、６０〜８９）
が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ
−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼの転写に依存する。ｐ
ＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子の発現は、同時に発現するウイルスＲＮＡ
ポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）によって媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロ
モーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プ
ロモーターの転写制御下にＴ７ｇｎ１遺伝子を有する内在性のλプロファージか
らＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の宿主菌株によって供給さ
れる。
ら（１９８８）、Ｇｅｎｅ、６９：３０１〜３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔ
ｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）、６０〜８９）
が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ
−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼの転写に依存する。ｐ
ＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子の発現は、同時に発現するウイルスＲＮＡ
ポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）によって媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロ
モーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プ
ロモーターの転写制御下にＴ７ｇｎ１遺伝子を有する内在性のλプロファージか
らＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の宿主菌株によって供給さ
れる。
【００９１】
組換えタンパク質の発現を最大にする１つの方法は、組換えタンパク質をタン
パク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細胞においてタンパク質を発現さ
せることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇ．、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５
、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
（１９９０）、１１９〜１２８）。別の方法は、各アミノ酸に対する個々のコド
ンが、発現のために選ばれた細菌（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど）において優
先的に利用されているコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核
酸配列を変えることである（Ｗａｄａら（１９９２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１〜２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変
化は標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
パク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細胞においてタンパク質を発現さ
せることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇ．、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５
、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
（１９９０）、１１９〜１２８）。別の方法は、各アミノ酸に対する個々のコド
ンが、発現のために選ばれた細菌（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど）において優
先的に利用されているコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核
酸配列を変えることである（Ｗａｄａら（１９９２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１〜２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変
化は標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
【００９２】
別の実施形態において、ＬＭＲＰ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。
酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおいて発現させるためのベクターの例には、ｐＹ
ｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）、Ｅｍｂｏ Ｊ．６：２２９〜２
３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）、Ｃ
ｅｌｌ、３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７
）、Ｇｅｎｅ、５４：１１３〜１２３）およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれる。糸状菌
などの他の菌類において使用される適切なベクターおよびベクターの構築方法に
は、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆Ｐｕｎｔ．Ｐ．Ｊ
．（１９９１）、「糸状菌のための遺伝子移入システムおよびベクター開発」、
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ（
Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙら編、１頁〜２８頁、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に詳しく記載されているものが
含まれる。
酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおいて発現させるためのベクターの例には、ｐＹ
ｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）、Ｅｍｂｏ Ｊ．６：２２９〜２
３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）、Ｃ
ｅｌｌ、３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７
）、Ｇｅｎｅ、５４：１１３〜１２３）およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれる。糸状菌
などの他の菌類において使用される適切なベクターおよびベクターの構築方法に
は、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆Ｐｕｎｔ．Ｐ．Ｊ
．（１９９１）、「糸状菌のための遺伝子移入システムおよびベクター開発」、
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ（
Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙら編、１頁〜２８頁、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に詳しく記載されているものが
含まれる。
【００９３】
あるいは、本発明のＬＭＲＰは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆
虫細胞において発現させることができる。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９
細胞）においてタンパク質を発現させるために利用できるバキュロウイルスベク
ターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗおよ
びＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０：３１〜３９）が含
まれる。
虫細胞において発現させることができる。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９
細胞）においてタンパク質を発現させるために利用できるバキュロウイルスベク
ターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗおよ
びＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０：３１〜３９）が含
まれる。
【００９４】
さらに別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物の発現ベクターを使
用して哺乳動物細胞において発現させられる。哺乳動物発現ベクターの例には、
ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０）お
よびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７
〜１９５）が含まれる。哺乳動物細胞において使用されたとき、発現ベクターの
制御機能は、多くの場合、ウイルスの調節エレメントによって提供される、例え
ば、広く使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイ
トメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および
真核生物細胞の両方に関して他の好適な発現システムについては、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２
版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）の第１６章および第１７章を
参照のこと。
用して哺乳動物細胞において発現させられる。哺乳動物発現ベクターの例には、
ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０）お
よびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７
〜１９５）が含まれる。哺乳動物細胞において使用されたとき、発現ベクターの
制御機能は、多くの場合、ウイルスの調節エレメントによって提供される、例え
ば、広く使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイ
トメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および
真核生物細胞の両方に関して他の好適な発現システムについては、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２
版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）の第１６章および第１７章を
参照のこと。
【００９５】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプに
おいて優先的に核酸を発現させることができる（例えば、組織特異的な調節エレ
メントが、核酸を発現させるために使用される）。組織特異的な調節エレメント
はこの分野では知られている。好適な組織特異的なプロモーターの非限定的な例
には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）、
Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８〜２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃ
ａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２
３５〜２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａ
ｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）、ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９〜７３３）および免疫
グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）、Ｃｅｌｌ、３３：
７２９〜７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）、Ｃｅｌｌ
、３３：７４１〜７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロ
フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）、ＰＮ
ＡＳ、８６：５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら
（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：９１２〜９１６）、ならびに乳腺特異
的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号
および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が含まれる。発達段階により調節
されるプロモーターもまた含まれ、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓ
ｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３７４〜３７
９）およびフェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈａｍ
（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７〜５４６）が含まれる。
おいて優先的に核酸を発現させることができる（例えば、組織特異的な調節エレ
メントが、核酸を発現させるために使用される）。組織特異的な調節エレメント
はこの分野では知られている。好適な組織特異的なプロモーターの非限定的な例
には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）、
Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８〜２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃ
ａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２
３５〜２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａ
ｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）、ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９〜７３３）および免疫
グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）、Ｃｅｌｌ、３３：
７２９〜７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）、Ｃｅｌｌ
、３３：７４１〜７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロ
フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）、ＰＮ
ＡＳ、８６：５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら
（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：９１２〜９１６）、ならびに乳腺特異
的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号
および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が含まれる。発達段階により調節
されるプロモーターもまた含まれ、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓ
ｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３７４〜３７
９）およびフェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈａｍ
（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７〜５４６）が含まれる。
【００９６】
別の実施形態において、本発明のＬＭＲＰは、単細胞の植物細胞（藻類など）
（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら、１９９９、Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、１（３）：２３９〜２５１およびその参考文献）および高等植物に由来す
る植物細胞（例えば、作物植物などの種子植物）において発現させることができ
る。植物発現ベクターの例には、下記に記載されるベクターが含まれる：Ｂｅｃ
ｋｅｒ，Ｄ．、Ｋｅｍｐｅｒ，Ｅ．、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＭａｓｔｅｒｓ
ｏｎ，Ｒ．（１９９２）、「選択マーカーがレフト領域の近くに存在する新しい
植物バイナリーベクター」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１１９５〜
１１９７；Ｂｅｖａｎ，Ｍ．Ｗ．（１９８４）、「植物形質転換用のバイナリー
アグロバクテリウムベクター」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：８７１１
〜８７２１；「高等植物における遺伝子移入用ベクター」、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃ Ｐｌａｎｔｓ、第１巻、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａ
ｔｉｏｎ、編者：ＫｕｎｇおよびＲ．Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１
９９３、Ｓ．１５〜３８。
（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら、１９９９、Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、１（３）：２３９〜２５１およびその参考文献）および高等植物に由来す
る植物細胞（例えば、作物植物などの種子植物）において発現させることができ
る。植物発現ベクターの例には、下記に記載されるベクターが含まれる：Ｂｅｃ
ｋｅｒ，Ｄ．、Ｋｅｍｐｅｒ，Ｅ．、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＭａｓｔｅｒｓ
ｏｎ，Ｒ．（１９９２）、「選択マーカーがレフト領域の近くに存在する新しい
植物バイナリーベクター」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１１９５〜
１１９７；Ｂｅｖａｎ，Ｍ．Ｗ．（１９８４）、「植物形質転換用のバイナリー
アグロバクテリウムベクター」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：８７１１
〜８７２１；「高等植物における遺伝子移入用ベクター」、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃ Ｐｌａｎｔｓ、第１巻、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａ
ｔｉｏｎ、編者：ＫｕｎｇおよびＲ．Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１
９９３、Ｓ．１５〜３８。
【００９７】
植物発現カセットは、好ましくは、植物細胞において遺伝子発現を行わせるこ
とができ、そして各配列が転写終結などのその機能を果たし得るように機能的に
連結されている調節配列（ポリアデニル化シグナルなど）を含む。好ましいポリ
アデニル化シグナルは、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５のオクトピンシンターゼ
として知られている遺伝子３（Ｇｉｅｌｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）
、８３５以降）またはその機能的等価体などの、アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のｔ−ＤＮ
Ａに由来するシグナルであるが、植物において機能的に活性なすべての他のター
ミネーターもまた好適である。
とができ、そして各配列が転写終結などのその機能を果たし得るように機能的に
連結されている調節配列（ポリアデニル化シグナルなど）を含む。好ましいポリ
アデニル化シグナルは、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５のオクトピンシンターゼ
として知られている遺伝子３（Ｇｉｅｌｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）
、８３５以降）またはその機能的等価体などの、アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のｔ−ＤＮ
Ａに由来するシグナルであるが、植物において機能的に活性なすべての他のター
ミネーターもまた好適である。
【００９８】
植物の遺伝子発現は、非常に多くの場合、転写レベルでは制限されないので、
植物の発現カセットは、好ましくは、ＲＮＡあたりのタンパク質比を高めるタバ
コモザイクウイルス由来の５’非翻訳リーダー配列を含有する過駆動配列などの
翻訳エンハンサーのような他の機能的に連結された配列を含む（Ｇａｌｌｉｅら
、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：８６９３〜８７
１１）。
植物の発現カセットは、好ましくは、ＲＮＡあたりのタンパク質比を高めるタバ
コモザイクウイルス由来の５’非翻訳リーダー配列を含有する過駆動配列などの
翻訳エンハンサーのような他の機能的に連結された配列を含む（Ｇａｌｌｉｅら
、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：８６９３〜８７
１１）。
【００９９】
植物の遺伝子発現は、時間、細胞または組織に特異的な様式で遺伝子発現をも
たらす適切なプロモーターに対して機能的に連結しなければならない。好ましい
ものは、３５Ｓ ＣＡＭＶ（Ｆｒａｎｃｋら、Ｃｅｌｌ、２１（１９８０）、２
８５〜２９４）または１９Ｓ ＣａＭＶ（米国特許第５３５２６０５号および国
際特許出願公開ＷＯ８４０２９１３もまた参照のこと）のような植物ウイルスに
由来するプロモーター、あるいは米国特許第４９６２０２８号に記載されるＲｕ
ｂｉｓｃｏ小サブユニットに由来するプロモーターのような植物のプロモーター
のような構成的な発現を行わせるプロモーター（Ｂｅｎｆｅｙら、ＥＭＢＯ Ｊ
．８（１９８９）、２１９５〜２２０２）である。
たらす適切なプロモーターに対して機能的に連結しなければならない。好ましい
ものは、３５Ｓ ＣＡＭＶ（Ｆｒａｎｃｋら、Ｃｅｌｌ、２１（１９８０）、２
８５〜２９４）または１９Ｓ ＣａＭＶ（米国特許第５３５２６０５号および国
際特許出願公開ＷＯ８４０２９１３もまた参照のこと）のような植物ウイルスに
由来するプロモーター、あるいは米国特許第４９６２０２８号に記載されるＲｕ
ｂｉｓｃｏ小サブユニットに由来するプロモーターのような植物のプロモーター
のような構成的な発現を行わせるプロモーター（Ｂｅｎｆｅｙら、ＥＭＢＯ Ｊ
．８（１９８９）、２１９５〜２２０２）である。
【０１００】
植物の遺伝子発現カセットにおける機能的な連結において使用される他の好ま
しい配列は、植物細胞の液胞、核、アミロプラストおよび葉緑体および有色体の
ようなすべてのタイプのプラスチド、細胞外空間、ミトコンドリア、小胞体、油
体、ペルオキシソームならびに他の区画などのその適切な細胞区画に遺伝子産物
を誘導させるために必要な標的化配列である（総説については、Ｋｅｒｍｏｄｅ
、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５、４（１９９６）、２８５〜４
２３、およびそれに引用されている参考文献を参照のこと）。
しい配列は、植物細胞の液胞、核、アミロプラストおよび葉緑体および有色体の
ようなすべてのタイプのプラスチド、細胞外空間、ミトコンドリア、小胞体、油
体、ペルオキシソームならびに他の区画などのその適切な細胞区画に遺伝子産物
を誘導させるために必要な標的化配列である（総説については、Ｋｅｒｍｏｄｅ
、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５、４（１９９６）、２８５〜４
２３、およびそれに引用されている参考文献を参照のこと）。
【０１０１】
植物の遺伝子発現はまた、化学的に誘導され得るプロモーターによって促進さ
れ得る（総説については、Ｇａｔｚ、１９９７、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：８９〜１０８を参
照のこと）。化学的に誘導され得るプロモーターは、遺伝子の発現を時間依存的
な様式で行わせることが求められる場合には特に適する。そのようなプロモータ
ーの例には、サリチル酸誘導プロモーター（国際特許出願公開ＷＯ９５／１９４
４３）、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｇａｔｚら（１９９２）、Ｐｌａ
ｎｔ Ｊ．２、３９７〜４０４）およびエタノール誘導プロモーター（国際特許
出願公開ＷＯ９３／２１３３４）が挙げられる。
れ得る（総説については、Ｇａｔｚ、１９９７、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：８９〜１０８を参
照のこと）。化学的に誘導され得るプロモーターは、遺伝子の発現を時間依存的
な様式で行わせることが求められる場合には特に適する。そのようなプロモータ
ーの例には、サリチル酸誘導プロモーター（国際特許出願公開ＷＯ９５／１９４
４３）、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｇａｔｚら（１９９２）、Ｐｌａ
ｎｔ Ｊ．２、３９７〜４０４）およびエタノール誘導プロモーター（国際特許
出願公開ＷＯ９３／２１３３４）が挙げられる。
【０１０２】
また、生物的または無生物的なストレス条件に応答するプロモーターも好適な
プロモーターであり、例えば、病原体により誘導され得るＰＲＰ１遺伝子のプロ
モーター（Ｗａｒｄら、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１９９３）、３
６１〜３６６）、トマト由来の熱誘導性のｈｓｐ８０プロモーター（米国特許第
５１８７２６７号）、ジャガイモ由来の低温誘導性のα−アミラーゼプロモータ
ー（国際特許出願公開ＷＯ９６１２８１４）または障害誘導性のｐｉｎＩＩプロ
モーター（欧州特許３７５０９１）などがある。
プロモーターであり、例えば、病原体により誘導され得るＰＲＰ１遺伝子のプロ
モーター（Ｗａｒｄら、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１９９３）、３
６１〜３６６）、トマト由来の熱誘導性のｈｓｐ８０プロモーター（米国特許第
５１８７２６７号）、ジャガイモ由来の低温誘導性のα−アミラーゼプロモータ
ー（国際特許出願公開ＷＯ９６１２８１４）または障害誘導性のｐｉｎＩＩプロ
モーター（欧州特許３７５０９１）などがある。
【０１０３】
特に、脂質およびオイルの生合成が胚乳および発達中の胚の細胞などの種子の
細胞で行われている組織および器官における遺伝子発現をもたらすそのようなプ
ロモーターが好ましい。好適なプロモーターは、アブラナ由来のナピン遺伝子プ
ロモーター（米国特許第５６０８１５２号）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ
）由来のＵＳＰプロモーター（Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．１９９１、２２５（３）：４５９〜６７）、アラビドプシス由来のオレオ
シンプロモーター（国際特許出願公開ＷＯ９８４５４６１）、インゲンマメ（Ｐ
ｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のファセオリンプロモーター（米国
特許第５５０４２００号）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）由来のＢｃｅ４プ
ロモーター（国際特許出願公開ＷＯ９１１３９８０）、またはレグミンＢ４プロ
モーター（ＬｅＢ４；Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら、１９９２、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ、２（２）：２３３〜９）、ならびにトウモロコシ、オオムギ、コムギ、
ライムギ、イネなどのような単子葉植物における種子特異的な発現をもたらすプ
ロモーターが挙げられる。注目される好適なプロモーターは、オオムギ由来のｌ
ｐｔ２遺伝子またはｌｐｔ１遺伝子のプロモーター（国際特許出願公開ＷＯ９５
１５３８９および同ＷＯ９５２３２３０）、あるいは国際特許出願公開ＷＯ９９
１６８９０に記載されるプロモーター（オオムギのホルデイン遺伝子、イネのグ
ルテン遺伝子、イネのオリジン遺伝子、イネのプロラミン遺伝子、コムギのグリ
アジン遺伝子、コムギのグルテリン遺伝子、トウモロコシのゼイン遺伝子、オー
トムギのグルテリン遺伝子、モロコシのカシリン遺伝子、ライムギのセカリン遺
伝子に由来するプロモーター）である。
細胞で行われている組織および器官における遺伝子発現をもたらすそのようなプ
ロモーターが好ましい。好適なプロモーターは、アブラナ由来のナピン遺伝子プ
ロモーター（米国特許第５６０８１５２号）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ
）由来のＵＳＰプロモーター（Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．１９９１、２２５（３）：４５９〜６７）、アラビドプシス由来のオレオ
シンプロモーター（国際特許出願公開ＷＯ９８４５４６１）、インゲンマメ（Ｐ
ｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のファセオリンプロモーター（米国
特許第５５０４２００号）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）由来のＢｃｅ４プ
ロモーター（国際特許出願公開ＷＯ９１１３９８０）、またはレグミンＢ４プロ
モーター（ＬｅＢ４；Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら、１９９２、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ、２（２）：２３３〜９）、ならびにトウモロコシ、オオムギ、コムギ、
ライムギ、イネなどのような単子葉植物における種子特異的な発現をもたらすプ
ロモーターが挙げられる。注目される好適なプロモーターは、オオムギ由来のｌ
ｐｔ２遺伝子またはｌｐｔ１遺伝子のプロモーター（国際特許出願公開ＷＯ９５
１５３８９および同ＷＯ９５２３２３０）、あるいは国際特許出願公開ＷＯ９９
１６８９０に記載されるプロモーター（オオムギのホルデイン遺伝子、イネのグ
ルテン遺伝子、イネのオリジン遺伝子、イネのプロラミン遺伝子、コムギのグリ
アジン遺伝子、コムギのグルテリン遺伝子、トウモロコシのゼイン遺伝子、オー
トムギのグルテリン遺伝子、モロコシのカシリン遺伝子、ライムギのセカリン遺
伝子に由来するプロモーター）である。
【０１０４】
また、特に好適なものは、プラスチド特異的な遺伝子発現をもたらすプロモー
ターである。これは、プラスチドが、脂質生合成の前駆体およびいくつかの最終
生成物が合成される区画であるからである。ウイルスＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーターなどの好適なプロモーターが国際特許出願公開ＷＯ９５１６７８３およ
び同ＷＯ９７０６２５０に記載され、そしてアラビドプシスに由来するｃｌｐＰ
プロモーターが国際特許出願公開ＷＯ９９４６３９４に記載されている。
ターである。これは、プラスチドが、脂質生合成の前駆体およびいくつかの最終
生成物が合成される区画であるからである。ウイルスＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーターなどの好適なプロモーターが国際特許出願公開ＷＯ９５１６７８３およ
び同ＷＯ９７０６２５０に記載され、そしてアラビドプシスに由来するｃｌｐＰ
プロモーターが国際特許出願公開ＷＯ９９４６３９４に記載されている。
【０１０５】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローン化された本発明
のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、
ＬＭＲＰのｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の
転写による）発現を可能にする様式で調節配列に機能的に連結されている。アン
チセンス方向でクローン化された核酸に機能的に連結され、様々な細胞タイプに
おいてアンチセンスＲＮＡ分子の連続した発現を行わせる調節配列を選ぶことが
できる。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的な発現あるいは組織特異的または
細胞タイプ特異的な発現を行わせるウイルスのプロモーターおよび／またはエン
ハンサーまたは調節配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、ア
ンチセンス核酸が高効率の調節領域の制御下で産生される組換えプラスミド、フ
ァージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得る。その活性は、ベクターが導
入されている細胞タイプによって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用した
遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、遺伝子分析
に対する分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ、総説−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１（１）巻、１９８６；Ｍｏｌら、１９９０、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｅｓ、２６８：４２７〜４３０を参照のこと。
のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、
ＬＭＲＰのｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の
転写による）発現を可能にする様式で調節配列に機能的に連結されている。アン
チセンス方向でクローン化された核酸に機能的に連結され、様々な細胞タイプに
おいてアンチセンスＲＮＡ分子の連続した発現を行わせる調節配列を選ぶことが
できる。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的な発現あるいは組織特異的または
細胞タイプ特異的な発現を行わせるウイルスのプロモーターおよび／またはエン
ハンサーまたは調節配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、ア
ンチセンス核酸が高効率の調節領域の制御下で産生される組換えプラスミド、フ
ァージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得る。その活性は、ベクターが導
入されている細胞タイプによって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用した
遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、遺伝子分析
に対する分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ、総説−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１（１）巻、１９８６；Ｍｏｌら、１９９０、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｅｓ、２６８：４２７〜４３０を参照のこと。
【０１０６】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞
に関する。用語「宿主細胞」および用語「組換え宿主細胞」は、本明細書中では
交換可能に使用される。そのような用語は、特定の対象とする細胞を示すだけで
なく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をも示すことが理解される。い
くつかの改変が変異的または環境的ないずれかの影響のために後の世代に生じ得
るため、そのような子孫は、実際には親の細胞と同一でないことがあるが、本明
細書中で使用されている用語の範囲に依然として含まれる。さらに、形質転換さ
れた宿主細胞または組換え宿主細胞に由来する子孫、種子または繁殖可能な細胞
体も本発明の範囲に含まれる。それらは、この分野で知られている育種技術によ
って、ファインケミカルの産生が改善された新しい細胞系統または植物を作出す
るために使用することができる。
に関する。用語「宿主細胞」および用語「組換え宿主細胞」は、本明細書中では
交換可能に使用される。そのような用語は、特定の対象とする細胞を示すだけで
なく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をも示すことが理解される。い
くつかの改変が変異的または環境的ないずれかの影響のために後の世代に生じ得
るため、そのような子孫は、実際には親の細胞と同一でないことがあるが、本明
細書中で使用されている用語の範囲に依然として含まれる。さらに、形質転換さ
れた宿主細胞または組換え宿主細胞に由来する子孫、種子または繁殖可能な細胞
体も本発明の範囲に含まれる。それらは、この分野で知られている育種技術によ
って、ファインケミカルの産生が改善された新しい細胞系統または植物を作出す
るために使用することができる。
【０１０７】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物であり得る。例えば、ＬＭＲ
Ｐを、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの細菌細胞、昆虫細胞、菌類細胞または哺
乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞など
）、コケ、藻類、繊毛虫類、植物細胞、菌類、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
のような他の微生物において発現させることができる。他の好適な宿主細胞が当
業者には知られている。
Ｐを、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの細菌細胞、昆虫細胞、菌類細胞または哺
乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞など
）、コケ、藻類、繊毛虫類、植物細胞、菌類、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
のような他の微生物において発現させることができる。他の好適な宿主細胞が当
業者には知られている。
【０１０８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によ
って原核生物細胞または真核生物細胞に導入することができる。本明細書中で使
用されている用語「形質転換」および用語「トランスフェクション」、接合およ
び形質導入は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するためにこの分
野で認識されている様々な技術を示すものとする。これには、リン酸カルシウム
共沈殿または塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェク
ション、リポフェクション、自然の受容能、化学物質媒介移入またはエレクトロ
ポレーションが含まれる。植物細胞を含む宿主細胞を形質転換またはトランスフ
ェクションするための好適な方法をＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）および他の実験室マニュアル（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、第４４巻、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（編者：Ｇａｒｔｌａｎｄおよび
Ｄａｖｅｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ
）など）に見出すことができる。
って原核生物細胞または真核生物細胞に導入することができる。本明細書中で使
用されている用語「形質転換」および用語「トランスフェクション」、接合およ
び形質導入は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するためにこの分
野で認識されている様々な技術を示すものとする。これには、リン酸カルシウム
共沈殿または塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェク
ション、リポフェクション、自然の受容能、化学物質媒介移入またはエレクトロ
ポレーションが含まれる。植物細胞を含む宿主細胞を形質転換またはトランスフ
ェクションするための好適な方法をＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）および他の実験室マニュアル（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、第４４巻、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（編者：Ｇａｒｔｌａｎｄおよび
Ｄａｖｅｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ
）など）に見出すことができる。
【０１０９】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションの場合、使用される発現ベクタ
ーおよびトランスフェクション技術に依存して、少数の細胞のみが外部ＤＮＡを
そのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定およ
び選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードす
る遺伝子が、一般に、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選
択マーカーには、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物
に対する耐性を付与する選択マーカー、あるいは植物においては、グリホサート
またはグルフォシナートなどの除草剤に対する耐性を付与する選択マーカーが含
まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＬＭＲＰをコードするベクターと同
じベクターで宿主細胞に導入することができ、あるいは別個のベクターで導入す
ることができる。導入された核酸で安定的にトランスフェクションされた細胞は
、例えば、薬物選抜によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝
子を含む細胞は生存するが、それ以外の細胞は生存できない）。
ーおよびトランスフェクション技術に依存して、少数の細胞のみが外部ＤＮＡを
そのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定およ
び選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードす
る遺伝子が、一般に、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選
択マーカーには、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物
に対する耐性を付与する選択マーカー、あるいは植物においては、グリホサート
またはグルフォシナートなどの除草剤に対する耐性を付与する選択マーカーが含
まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＬＭＲＰをコードするベクターと同
じベクターで宿主細胞に導入することができ、あるいは別個のベクターで導入す
ることができる。導入された核酸で安定的にトランスフェクションされた細胞は
、例えば、薬物選抜によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝
子を含む細胞は生存するが、それ以外の細胞は生存できない）。
【０１１０】
相同的組換えによって微生物を作製するために、欠失、付加または置換が導入
され、それにより、ＬＭＲＰ遺伝子が変化している（例えば、ＬＭＲＰ遺伝子が
機能的に破壊されている）ＬＭＲＰ遺伝子の一部分を少なくとも含有するベクタ
ーが調製される。好ましくは、このＬＭＲＰ遺伝子はフィスコミトレラ・パテン
スのＬＭＲＰ遺伝子であるが、関連する植物に由来するホモログであり得るか、
あるいは哺乳動物、酵母または昆虫に起源を有するホモログでさえあり得る。好
ましい実施形態においては、相同的組換えのときに、内因性のＬＭＲＰ遺伝子が
機能的に破壊されるように（すなわち、機能的なタンパク質をもはやコードしな
いように）、ベクターが設計される（これはまた、ノックアウトベクターとも呼
ばれる）。あるいは、相同的組換えのときに、内因性のＬＭＲＰ遺伝子が変異す
るか、またはそうでない場合には変化するが、依然として機能的なタンパク質を
コードするように（例えば、上流の調節領域を変化させ、それにより内因性ＬＭ
ＲＰの発現を変化させることができるように）、ベクターが設計される。相同的
組換えによって点変異を作製するために、Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓら、１９９
９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（５）：１３２３〜
１３３０；Ｋｍｉｅｃ、Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、８７（３）：２４０〜２４７から知られているキメラ
形成（ｃｈｉｍｅｒａｐｌａｓｔｙ）として知られているＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リッドもまた使用することができる。
され、それにより、ＬＭＲＰ遺伝子が変化している（例えば、ＬＭＲＰ遺伝子が
機能的に破壊されている）ＬＭＲＰ遺伝子の一部分を少なくとも含有するベクタ
ーが調製される。好ましくは、このＬＭＲＰ遺伝子はフィスコミトレラ・パテン
スのＬＭＲＰ遺伝子であるが、関連する植物に由来するホモログであり得るか、
あるいは哺乳動物、酵母または昆虫に起源を有するホモログでさえあり得る。好
ましい実施形態においては、相同的組換えのときに、内因性のＬＭＲＰ遺伝子が
機能的に破壊されるように（すなわち、機能的なタンパク質をもはやコードしな
いように）、ベクターが設計される（これはまた、ノックアウトベクターとも呼
ばれる）。あるいは、相同的組換えのときに、内因性のＬＭＲＰ遺伝子が変異す
るか、またはそうでない場合には変化するが、依然として機能的なタンパク質を
コードするように（例えば、上流の調節領域を変化させ、それにより内因性ＬＭ
ＲＰの発現を変化させることができるように）、ベクターが設計される。相同的
組換えによって点変異を作製するために、Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓら、１９９
９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（５）：１３２３〜
１３３０；Ｋｍｉｅｃ、Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、８７（３）：２４０〜２４７から知られているキメラ
形成（ｃｈｉｍｅｒａｐｌａｓｔｙ）として知られているＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リッドもまた使用することができる。
【０１１１】
一方、相同的組換えベクターにおいて、ＬＭＲＰ遺伝子の変化した部分は、そ
の５’末端および３’末端において、ベクターにより運ばれる外因性のＬＭＲＰ
遺伝子と微生物または植物における内因性のＬＭＲＰ遺伝子との間での相同的組
換えを生じさせるＬＭＲＰ遺伝子のさらなる核酸が隣接している。さらなる隣接
するＬＭＲＰ核酸は、内因性遺伝子との相同的組換えを成功させるのに十分な長
さである。典型的には、（５’末端および３’末端の両方において）数百塩基対
〜数キロ塩基の隣接ＤＮＡがベクターに含まれる（例えば、相同的組換えベクタ
ーの説明についてはＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．
（１９８７）、Ｃｅｌｌ、５１：５０３；またはフィスコミトレラ・パテンスに
おけるｃＤＮＡに基づく組換えについてはＳｔｒｅｐｐら、１９９８、ＰＮＡＳ
、９５（８）：４３６８〜４３７３を参照のこと）。ベクターは、（例えば、ポ
リエチレングリコール媒介ＤＮＡによって）微生物細胞または植物細胞に導入さ
れ、そして導入されたＬＭＲＰ遺伝子が内因性のＬＭＲＰ遺伝子と相同的に組み
換えられた細胞が、この分野で知られている技術を使用して選択される。
の５’末端および３’末端において、ベクターにより運ばれる外因性のＬＭＲＰ
遺伝子と微生物または植物における内因性のＬＭＲＰ遺伝子との間での相同的組
換えを生じさせるＬＭＲＰ遺伝子のさらなる核酸が隣接している。さらなる隣接
するＬＭＲＰ核酸は、内因性遺伝子との相同的組換えを成功させるのに十分な長
さである。典型的には、（５’末端および３’末端の両方において）数百塩基対
〜数キロ塩基の隣接ＤＮＡがベクターに含まれる（例えば、相同的組換えベクタ
ーの説明についてはＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．
（１９８７）、Ｃｅｌｌ、５１：５０３；またはフィスコミトレラ・パテンスに
おけるｃＤＮＡに基づく組換えについてはＳｔｒｅｐｐら、１９９８、ＰＮＡＳ
、９５（８）：４３６８〜４３７３を参照のこと）。ベクターは、（例えば、ポ
リエチレングリコール媒介ＤＮＡによって）微生物細胞または植物細胞に導入さ
れ、そして導入されたＬＭＲＰ遺伝子が内因性のＬＭＲＰ遺伝子と相同的に組み
換えられた細胞が、この分野で知られている技術を使用して選択される。
【０１１２】
別の実施形態において、導入された遺伝子の調節された発現を可能にする選択
されたシステムを含む組換え微生物を作製することができる。例えば、ｌａｃオ
ペロンの制御下に遺伝子を置くベクターにＬＭＲＰ遺伝子を含むことにより、Ｌ
ＭＲＰ遺伝子の発現がＩＰＴＧの存在下でのみ可能になる。そのような調節シス
テムはこの分野では十分に知られている。
されたシステムを含む組換え微生物を作製することができる。例えば、ｌａｃオ
ペロンの制御下に遺伝子を置くベクターにＬＭＲＰ遺伝子を含むことにより、Ｌ
ＭＲＰ遺伝子の発現がＩＰＴＧの存在下でのみ可能になる。そのような調節シス
テムはこの分野では十分に知られている。
【０１１３】
本発明の宿主細胞（培養状態にある原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞
など）は、ＬＭＲＰを産生（すなわち、発現）させるために使用することができ
る。代わりの方法を、エレクトロポレーションまたはアグロバクテリウム媒介遺
伝子移入によりＤＮＡを発達中の花に直接移入することによって、さらに植物に
おいて適用することができる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使
用するＬＭＲＰの製造方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法
は、ＬＭＲＰが産生されるまで、（ＬＭＲＰをコードする組換え発現ベクターが
導入されているか、または野性型ＬＭＲＰもしくは変化型ＬＭＲＰをコードする
遺伝子がそのゲノムに導入されている）本発明の宿主細胞を好適な培地で培養す
ることを含む。別の実施形態において、本発明の方法はさらに、ＬＭＲＰを培地
または宿主細胞から単離することを含む。
など）は、ＬＭＲＰを産生（すなわち、発現）させるために使用することができ
る。代わりの方法を、エレクトロポレーションまたはアグロバクテリウム媒介遺
伝子移入によりＤＮＡを発達中の花に直接移入することによって、さらに植物に
おいて適用することができる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使
用するＬＭＲＰの製造方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法
は、ＬＭＲＰが産生されるまで、（ＬＭＲＰをコードする組換え発現ベクターが
導入されているか、または野性型ＬＭＲＰもしくは変化型ＬＭＲＰをコードする
遺伝子がそのゲノムに導入されている）本発明の宿主細胞を好適な培地で培養す
ることを含む。別の実施形態において、本発明の方法はさらに、ＬＭＲＰを培地
または宿主細胞から単離することを含む。
【０１１４】
Ｃ．単離されたＬＭＲＰ
本発明の別の態様は、単離されたＬＭＲＰおよびその生物学的に活性な一部分
に関する。「単離された」または「精製された」タンパク質あるいはその生物学
的に活性な一部分は、組換えＤＮＡ技術によって産生されたときには細胞物質を
実質的に含まず、あるいは化学合成されたときには化学的前駆体または他の化学
物質を実質的に含まない。表現「細胞物質を実質的に含まない」には、タンパク
質が天然または組換え的に産生される細胞の細胞成分からタンパク質が分離され
ているＬＭＲＰの調製物が含まれる。１つの実施形態において、表現「細胞物質
を実質的に含まない」には、約３０％未満（乾燥重量比）の非ＬＭＲＰ（これは
また本明細書中では「混入タンパク質」として示される）を有し、より好ましく
は約２０％未満の非ＬＭＲＰを有し、さらにより好ましくは約１０％未満の非Ｌ
ＭＲＰを有し、最も好ましくは約５％未満の非ＬＭＲＰを有するＬＭＲＰの調製
物が含まれる。ＬＭＲＰまたはその生物学的に活性な一部分が組換え的に産生さ
れた場合、ＬＭＲＰまたはその生物学的に活性な一部分はまた、好ましくは、培
養培地を実質的に有しない。すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の
約２０％未満であり、より好ましくは約１０％未満であり、最も好ましくは約５
％未満である。表現「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」に
は、タンパク質の合成において含まれる化学的前駆体または他の化学物質からタ
ンパク質が分離されているＬＭＲＰの調製物が含まれる。１つの実施形態におい
て、表現「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」には、約３０
％未満（乾燥重量比）の化学的前駆体または非ＬＭＲＰ化学物質を有し、より好
ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＬＭＲＰ化学物質を有し、さらに
より好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＬＭＲＰ化学物質を有し、
最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＬＭＲＰ化学物質を有するＬ
ＭＲＰの調製物が含まれる。好ましい実施形態において、単離されたタンパク質
またはその生物学的に活性な一部分は、ＬＭＲＰが得られる同じ生物に由来する
混入タンパク質を有しない。典型的には、そのようなタンパク質は、例えば、フ
ィスコミトレラ・パテンス以外の植物において、あるいはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍなどの微生物または繊毛虫類、コケ、藻類または菌類においてフィスコミト
レラ・パテンスのＬＭＲＰを組換え発現することによって製造される。
に関する。「単離された」または「精製された」タンパク質あるいはその生物学
的に活性な一部分は、組換えＤＮＡ技術によって産生されたときには細胞物質を
実質的に含まず、あるいは化学合成されたときには化学的前駆体または他の化学
物質を実質的に含まない。表現「細胞物質を実質的に含まない」には、タンパク
質が天然または組換え的に産生される細胞の細胞成分からタンパク質が分離され
ているＬＭＲＰの調製物が含まれる。１つの実施形態において、表現「細胞物質
を実質的に含まない」には、約３０％未満（乾燥重量比）の非ＬＭＲＰ（これは
また本明細書中では「混入タンパク質」として示される）を有し、より好ましく
は約２０％未満の非ＬＭＲＰを有し、さらにより好ましくは約１０％未満の非Ｌ
ＭＲＰを有し、最も好ましくは約５％未満の非ＬＭＲＰを有するＬＭＲＰの調製
物が含まれる。ＬＭＲＰまたはその生物学的に活性な一部分が組換え的に産生さ
れた場合、ＬＭＲＰまたはその生物学的に活性な一部分はまた、好ましくは、培
養培地を実質的に有しない。すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の
約２０％未満であり、より好ましくは約１０％未満であり、最も好ましくは約５
％未満である。表現「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」に
は、タンパク質の合成において含まれる化学的前駆体または他の化学物質からタ
ンパク質が分離されているＬＭＲＰの調製物が含まれる。１つの実施形態におい
て、表現「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」には、約３０
％未満（乾燥重量比）の化学的前駆体または非ＬＭＲＰ化学物質を有し、より好
ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＬＭＲＰ化学物質を有し、さらに
より好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＬＭＲＰ化学物質を有し、
最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＬＭＲＰ化学物質を有するＬ
ＭＲＰの調製物が含まれる。好ましい実施形態において、単離されたタンパク質
またはその生物学的に活性な一部分は、ＬＭＲＰが得られる同じ生物に由来する
混入タンパク質を有しない。典型的には、そのようなタンパク質は、例えば、フ
ィスコミトレラ・パテンス以外の植物において、あるいはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍなどの微生物または繊毛虫類、コケ、藻類または菌類においてフィスコミト
レラ・パテンスのＬＭＲＰを組換え発現することによって製造される。
【０１１５】
本発明の単離されたＬＭＲＰまたはその一部分は、フィスコミトレラ・パテン
スにおける細胞膜の構築に必要な化合物の代謝またはこれらの膜を横断する分子
の輸送に関与し得るか、あるいは表１に示される活性の１つまたは２つ以上を有
する。好ましい実施形態において、タンパク質またはその一部分は、タンパク質
またはその一部分がフィスコミトレラ・パテンスにおける細胞膜の構築に必要な
化合物の代謝またはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与する能力を維持する
ように付表Ｂの１つのアミノ酸配列に対して十分に相同的であるアミノ酸配列を
含む。タンパク質の一部分は、好ましくは、本明細書中に記載されるような生物
学的に活性な一部分である。別の好ましい実施形態において、本発明のＬＭＲＰ
は、付表Ｂに示されるアミノ酸を有する。さらに別の好ましい実施形態において
、ＬＭＲＰは、付表Ａの１つのヌクレオチドにハイブリダイゼーションする（例
えば、ストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする）ヌクレオ
チド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する。さらに別の好ましい実施
形態において、ＬＭＲＰは、付表Ｂのアミノ酸配列の１つに対する相同性が少な
くとも約５０％〜６０％であり、好ましくは少なくとも約６０％〜７０％であり
、より好ましくは少なくとも約７０％〜８０％、８０％〜９０％または９０％〜
９５％であり、さらに最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９
９％またはそれ以上であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
を有する。本発明の好ましいＬＭＲＰはまた、好ましくは、本明細書中に記載さ
れるＬＭＲＰ活性の少なくとも１つを有する。例えば、本発明の好ましいＬＭＲ
Ｐは、付表Ａの１つのヌクレオチドにハイブリダイゼーションする（例えば、ス
トリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする）ヌクレオチド配列
によってコードされるアミノ酸配列を有し、そしてフィスコミトレラ・パテンス
における細胞膜の構築に必要な化合物の代謝またはこれらの膜を横断する分子の
輸送に関与し得るか、あるいは表１に示される活性の１つまたは２つ以上を有す
る。
スにおける細胞膜の構築に必要な化合物の代謝またはこれらの膜を横断する分子
の輸送に関与し得るか、あるいは表１に示される活性の１つまたは２つ以上を有
する。好ましい実施形態において、タンパク質またはその一部分は、タンパク質
またはその一部分がフィスコミトレラ・パテンスにおける細胞膜の構築に必要な
化合物の代謝またはこれらの膜を横断する分子の輸送に関与する能力を維持する
ように付表Ｂの１つのアミノ酸配列に対して十分に相同的であるアミノ酸配列を
含む。タンパク質の一部分は、好ましくは、本明細書中に記載されるような生物
学的に活性な一部分である。別の好ましい実施形態において、本発明のＬＭＲＰ
は、付表Ｂに示されるアミノ酸を有する。さらに別の好ましい実施形態において
、ＬＭＲＰは、付表Ａの１つのヌクレオチドにハイブリダイゼーションする（例
えば、ストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする）ヌクレオ
チド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する。さらに別の好ましい実施
形態において、ＬＭＲＰは、付表Ｂのアミノ酸配列の１つに対する相同性が少な
くとも約５０％〜６０％であり、好ましくは少なくとも約６０％〜７０％であり
、より好ましくは少なくとも約７０％〜８０％、８０％〜９０％または９０％〜
９５％であり、さらに最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９
９％またはそれ以上であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
を有する。本発明の好ましいＬＭＲＰはまた、好ましくは、本明細書中に記載さ
れるＬＭＲＰ活性の少なくとも１つを有する。例えば、本発明の好ましいＬＭＲ
Ｐは、付表Ａの１つのヌクレオチドにハイブリダイゼーションする（例えば、ス
トリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする）ヌクレオチド配列
によってコードされるアミノ酸配列を有し、そしてフィスコミトレラ・パテンス
における細胞膜の構築に必要な化合物の代謝またはこれらの膜を横断する分子の
輸送に関与し得るか、あるいは表１に示される活性の１つまたは２つ以上を有す
る。
【０１１６】
他の実施形態において、ＬＭＲＰは、上記のＩ節に詳しく記載されているよう
に、付表Ｂのアミノ酸配列の１つに対して実質的に相同的であり、そして付表Ｂ
の配列の１つのタンパク質の機能的な活性を保持するが、天然の変化または変異
誘発のためにアミノ酸配列が異なる。従って、別の実施形態において、ＬＭＲＰ
は、付表Ｂの１つのアミノ酸配列全体に対する相同性が少なくとも約５０％〜６
０％であり、好ましくは少なくとも約６０％〜７０％であり、より好ましくは少
なくとも約７０％〜８０％、８０％〜９０％または９０％〜９５％であり、最も
好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である
アミノ酸配列を含み、かつ本明細書中に記載されるＬＭＲＰ活性の少なくとも１
つを有するタンパク質である。別の実施形態において、本発明は、付表Ｂの１つ
のアミノ酸配列全体に対して実質的に相同的である完全なフィスコミトレラ・パ
テンスタンパク質に関する。
に、付表Ｂのアミノ酸配列の１つに対して実質的に相同的であり、そして付表Ｂ
の配列の１つのタンパク質の機能的な活性を保持するが、天然の変化または変異
誘発のためにアミノ酸配列が異なる。従って、別の実施形態において、ＬＭＲＰ
は、付表Ｂの１つのアミノ酸配列全体に対する相同性が少なくとも約５０％〜６
０％であり、好ましくは少なくとも約６０％〜７０％であり、より好ましくは少
なくとも約７０％〜８０％、８０％〜９０％または９０％〜９５％であり、最も
好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である
アミノ酸配列を含み、かつ本明細書中に記載されるＬＭＲＰ活性の少なくとも１
つを有するタンパク質である。別の実施形態において、本発明は、付表Ｂの１つ
のアミノ酸配列全体に対して実質的に相同的である完全なフィスコミトレラ・パ
テンスタンパク質に関する。
【０１１７】
ＬＭＲＰの生物学的に活性な一部分には、ＬＭＲＰのアミノ酸配列（例えば、
付表Ｂに示されるアミノ酸配列）に由来するアミノ酸配列、またはＬＭＲＰに対
して相同的なタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドであって、全長のＬＭＲ
ＰまたはＬＭＲＰに対して相同的である全長のタンパク質よりも少ないアミノ酸
を含み、かつＬＭＲＰの少なくとも１つの活性を示すペプチドが含まれる。典型
的には、生物学的に活性な一部分（ペプチド、例えば、長さが、例えば、５アミ
ノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ
酸、３６アミノ酸、３７アミノ酸、３８アミノ酸、３９アミノ酸、４０アミノ酸
、５０アミノ酸、１００アミノ酸またはそれ以上であるペプチド）は、ＬＭＲＰ
の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。さらに、タン
パク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な一部分を組換え技術によ
って調製して、本明細書中に記載される１つまたは２つ以上の活性について評価
することができる。好ましくは、ＬＭＲＰの生物学的に活性な一部分は、生物学
的活性を有する１つまたは２つ以上の選択されたドメイン／モチーフまたはその
一部分を含む。
付表Ｂに示されるアミノ酸配列）に由来するアミノ酸配列、またはＬＭＲＰに対
して相同的なタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドであって、全長のＬＭＲ
ＰまたはＬＭＲＰに対して相同的である全長のタンパク質よりも少ないアミノ酸
を含み、かつＬＭＲＰの少なくとも１つの活性を示すペプチドが含まれる。典型
的には、生物学的に活性な一部分（ペプチド、例えば、長さが、例えば、５アミ
ノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ
酸、３６アミノ酸、３７アミノ酸、３８アミノ酸、３９アミノ酸、４０アミノ酸
、５０アミノ酸、１００アミノ酸またはそれ以上であるペプチド）は、ＬＭＲＰ
の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。さらに、タン
パク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な一部分を組換え技術によ
って調製して、本明細書中に記載される１つまたは２つ以上の活性について評価
することができる。好ましくは、ＬＭＲＰの生物学的に活性な一部分は、生物学
的活性を有する１つまたは２つ以上の選択されたドメイン／モチーフまたはその
一部分を含む。
【０１１８】
ＬＭＲＰは、好ましくは、組換えＤＮＡ技術によって製造される。例えば、タ
ンパク質をコードする核酸分子が（上記に記載されるような）発現ベクターにク
ローン化され、そして発現ベクターが（上記に記載されるような）宿主細胞に導
入され、そしてＬＭＲＰが宿主細胞において発現させられる。その後、ＬＭＲＰ
を、標準的なタンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによって細胞か
ら単離することができる。組換え発現の代わりに、ＬＭＲＰ、ポリペプチドまた
はペプチドを、標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成することがで
きる。さらに、天然のＬＭＲＰを、例えば、本発明のＬＭＲＰまたはそのフラグ
メントを利用して標準的な技術によって作製され得る抗ＬＭＲＰ抗体を使用して
細胞（例えば、内皮細胞）から単離することができる。別の実施形態において、
上記の特異的な抗ＬＭＲＰ抗体を含む試験キットを使用して、他の細胞タイプま
たは生物におけるさらなるＬＭＲＰ分子またはそのフラグメントを同定および／
または精製することができる。
ンパク質をコードする核酸分子が（上記に記載されるような）発現ベクターにク
ローン化され、そして発現ベクターが（上記に記載されるような）宿主細胞に導
入され、そしてＬＭＲＰが宿主細胞において発現させられる。その後、ＬＭＲＰ
を、標準的なタンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによって細胞か
ら単離することができる。組換え発現の代わりに、ＬＭＲＰ、ポリペプチドまた
はペプチドを、標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成することがで
きる。さらに、天然のＬＭＲＰを、例えば、本発明のＬＭＲＰまたはそのフラグ
メントを利用して標準的な技術によって作製され得る抗ＬＭＲＰ抗体を使用して
細胞（例えば、内皮細胞）から単離することができる。別の実施形態において、
上記の特異的な抗ＬＭＲＰ抗体を含む試験キットを使用して、他の細胞タイプま
たは生物におけるさらなるＬＭＲＰ分子またはそのフラグメントを同定および／
または精製することができる。
【０１１９】
本発明はまた、ＬＭＲＰのキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する
。本明細書中で使用されているように、ＬＭＲＰの「キメラタンパク質」または
「融合タンパク質」は、非ＬＭＲＰポリペプチドに機能的に連結されたＬＭＲＰ
ポリペプチドを含む。「ＬＭＲＰポリペプチド」は、ＬＭＲＰに対応するアミノ
酸配列を有するポリペプチドを示し、これに対して「非ＬＭＲＰポリペプチド」
は、ＬＭＲＰに対して実質的に相同的でないタンパク質（例えば、ＬＭＲＰとは
異なり、同じ生物または異なる生物に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸
を有するポリペプチドをいう。融合タンパク質において、用語「機能的に連結さ
れている」は、ＬＭＲＰポリペプチドおよび非ＬＭＲＰポリペプチドが、両配列
が使用された配列に属する提案された機能を果たすように互いに融合しているこ
とを示すものとする。非ＬＭＲＰポリペプチドはＬＭＲＰポリペプチドのＮ末端
またはＣ末端に融合させることができる。例えば、１つの実施形態において、融
合タンパク質は、ＬＭＲＰ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合しているＧＳＴ−Ｌ
ＭＲＰ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組換えＬＭＲＰの
精製を容易にすることができる。別の実施形態において、融合タンパク質は、異
種のシグナル配列をそのＮ末端に含むＬＭＲＰである。ある種の宿主細胞（例え
ば、哺乳動物宿主細胞）では、ＬＭＲＰの発現および／または分泌を、異種のシ
グナル配列を使用することによって増大させることができる。
。本明細書中で使用されているように、ＬＭＲＰの「キメラタンパク質」または
「融合タンパク質」は、非ＬＭＲＰポリペプチドに機能的に連結されたＬＭＲＰ
ポリペプチドを含む。「ＬＭＲＰポリペプチド」は、ＬＭＲＰに対応するアミノ
酸配列を有するポリペプチドを示し、これに対して「非ＬＭＲＰポリペプチド」
は、ＬＭＲＰに対して実質的に相同的でないタンパク質（例えば、ＬＭＲＰとは
異なり、同じ生物または異なる生物に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸
を有するポリペプチドをいう。融合タンパク質において、用語「機能的に連結さ
れている」は、ＬＭＲＰポリペプチドおよび非ＬＭＲＰポリペプチドが、両配列
が使用された配列に属する提案された機能を果たすように互いに融合しているこ
とを示すものとする。非ＬＭＲＰポリペプチドはＬＭＲＰポリペプチドのＮ末端
またはＣ末端に融合させることができる。例えば、１つの実施形態において、融
合タンパク質は、ＬＭＲＰ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合しているＧＳＴ−Ｌ
ＭＲＰ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組換えＬＭＲＰの
精製を容易にすることができる。別の実施形態において、融合タンパク質は、異
種のシグナル配列をそのＮ末端に含むＬＭＲＰである。ある種の宿主細胞（例え
ば、哺乳動物宿主細胞）では、ＬＭＲＰの発現および／または分泌を、異種のシ
グナル配列を使用することによって増大させることができる。
【０１２０】
好ましくは、本発明のＬＭＲＰキメラタンパク質またはＬＭＲＰ融合タンパク
質は標準的な組換えＤＮＡ技術によって製造される。例えば、種々のポリペプチ
ド配列をコードするＤＮＡフラグメントが、従来の技術に従って、例えば、連結
のための平滑末端または接着末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、望まし
くない連結を避けるための適切なアルカリホスファターゼ処理としての付着末端
の充填、および酵素連結を用いることによって読み枠を合わせて連結される。別
の実施形態において、融合遺伝子を、自動化されたＤＮＡ合成機を含む従来の技
術によって合成することができる。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅
を、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的な重なりを生じさせ、続いて
キメラな遺伝子配列を作製するためにアニールおよび再増幅され得るアンカープ
ライマーを使用して行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、編者：Ａｕｓｕｂｅｌら
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成
分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている多くの発現ベクターが
市販されている。ＬＭＲＰをコードする核酸は、融合成分がＬＭＲＰに読み枠を
合わせて連結されるようにそのような発現ベクターにクローン化することができ
る。
質は標準的な組換えＤＮＡ技術によって製造される。例えば、種々のポリペプチ
ド配列をコードするＤＮＡフラグメントが、従来の技術に従って、例えば、連結
のための平滑末端または接着末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、望まし
くない連結を避けるための適切なアルカリホスファターゼ処理としての付着末端
の充填、および酵素連結を用いることによって読み枠を合わせて連結される。別
の実施形態において、融合遺伝子を、自動化されたＤＮＡ合成機を含む従来の技
術によって合成することができる。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅
を、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的な重なりを生じさせ、続いて
キメラな遺伝子配列を作製するためにアニールおよび再増幅され得るアンカープ
ライマーを使用して行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、編者：Ａｕｓｕｂｅｌら
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成
分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている多くの発現ベクターが
市販されている。ＬＭＲＰをコードする核酸は、融合成分がＬＭＲＰに読み枠を
合わせて連結されるようにそのような発現ベクターにクローン化することができ
る。
【０１２１】
ＬＭＲＰのホモログを変異誘発（例えば、ＬＭＲＰの不連続な点変異または短
縮化）によって作製することができる。本明細書中で使用されている用語「ホモ
ログ」は、ＬＭＲＰの活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するＬ
ＭＲＰの変異体形態をいう。ＬＭＲＰのアゴニストは、ＬＭＲＰの生物学的活性
の同じ活性またはその一部を実質的に保持し得る。ＬＭＲＰのアンタゴニストは
、例えば、ＬＭＲＰを含む細胞膜成分の代謝カスケードの下流メンバーまたは上
流メンバーに競合的に結合することによって、あるいはそのような膜を横断する
化合物の輸送を媒介するＬＭＲＰに結合し、それによりトランスロケーションを
生じさせないことによって、ＬＭＲＰの自然に存在する形態の活性の１つまたは
２つ以上を阻害することができる。
縮化）によって作製することができる。本明細書中で使用されている用語「ホモ
ログ」は、ＬＭＲＰの活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するＬ
ＭＲＰの変異体形態をいう。ＬＭＲＰのアゴニストは、ＬＭＲＰの生物学的活性
の同じ活性またはその一部を実質的に保持し得る。ＬＭＲＰのアンタゴニストは
、例えば、ＬＭＲＰを含む細胞膜成分の代謝カスケードの下流メンバーまたは上
流メンバーに競合的に結合することによって、あるいはそのような膜を横断する
化合物の輸送を媒介するＬＭＲＰに結合し、それによりトランスロケーションを
生じさせないことによって、ＬＭＲＰの自然に存在する形態の活性の１つまたは
２つ以上を阻害することができる。
【０１２２】
代わりの実施形態において、ＬＭＲＰのホモログを、ＬＭＲＰの変異体（例え
ば、短縮変異体）のコンビナトリアルライブラリーをＬＭＲＰのアゴニスト活性
またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって同定するこ
とができる。１つの実施形態において、ＬＭＲＰ変異体の多様なライブラリーが
、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって作製され、多様な遺伝子ラ
イブラリーによってコードされる。ＬＭＲＰ変異体の多様なライブラリーは、例
えば、潜在的なＬＭＲＰ配列の縮重した集合が個々のポリペプチドとして発現可
能であるように、あるいはＬＭＲＰ配列の集合がそれに含まれる（例えば、ファ
ージディスプレイ用の）より大きな融合タンパク質の集合として発現可能である
ように合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することに
よって作製することができる。様々な方法を、縮重したオリゴヌクレオチド配列
から潜在的なＬＭＲＰホモログのライブラリーを作製するために使用することが
できる。縮重した遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機で行うことができ、
その後、合成遺伝子を適切な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮
重した集合を使用することにより、潜在的なＬＭＲＰ配列の所望する集合をコー
ドする配列のすべてを１つの混合物で得ることができる。縮重したオリゴヌクレ
オチドを合成する方法はこの分野では知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ
．Ａ．（１９８３）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（
１９８４）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒ
ａら（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
ば、短縮変異体）のコンビナトリアルライブラリーをＬＭＲＰのアゴニスト活性
またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって同定するこ
とができる。１つの実施形態において、ＬＭＲＰ変異体の多様なライブラリーが
、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって作製され、多様な遺伝子ラ
イブラリーによってコードされる。ＬＭＲＰ変異体の多様なライブラリーは、例
えば、潜在的なＬＭＲＰ配列の縮重した集合が個々のポリペプチドとして発現可
能であるように、あるいはＬＭＲＰ配列の集合がそれに含まれる（例えば、ファ
ージディスプレイ用の）より大きな融合タンパク質の集合として発現可能である
ように合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することに
よって作製することができる。様々な方法を、縮重したオリゴヌクレオチド配列
から潜在的なＬＭＲＰホモログのライブラリーを作製するために使用することが
できる。縮重した遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機で行うことができ、
その後、合成遺伝子を適切な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮
重した集合を使用することにより、潜在的なＬＭＲＰ配列の所望する集合をコー
ドする配列のすべてを１つの混合物で得ることができる。縮重したオリゴヌクレ
オチドを合成する方法はこの分野では知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ
．Ａ．（１９８３）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（
１９８４）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒ
ａら（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【０１２３】
さらに、ＬＭＲＰをコードする配列のフラグメントのライブラリーを使用して
、ＬＭＲＰの多様な集団をＬＭＲＰのホモログのスクリーニングおよびその後の
選択のために作製することができる。１つの実施形態においては、ＬＭＲＰをコ
ードする配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニッキングが分子あたり約１カ所
でのみ生じる条件のもとでヌクレアーゼで処理し、そしてその二本鎖ＤＮＡを変
性させ、種々のニック生成物に由来するセンス／アンチセンス対を含み得る二本
鎖ＤＮＡを形成するようにＤＮＡを再生し、再形成された二重鎖から一本鎖部分
をＳ１ヌクレアーゼによる処理によって除き、その後、得られたフラグメントラ
イブラリーを発現ベクターに連結することによって、コード配列のフラグメント
のライブラリーを作製することができる。この方法によって、ＬＭＲＰの様々な
サイズのＮ末端フラグメント、Ｃ末端フラグメントおよび内部フラグメントをコ
ードする発現ライブラリーを得ることができる。
、ＬＭＲＰの多様な集団をＬＭＲＰのホモログのスクリーニングおよびその後の
選択のために作製することができる。１つの実施形態においては、ＬＭＲＰをコ
ードする配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニッキングが分子あたり約１カ所
でのみ生じる条件のもとでヌクレアーゼで処理し、そしてその二本鎖ＤＮＡを変
性させ、種々のニック生成物に由来するセンス／アンチセンス対を含み得る二本
鎖ＤＮＡを形成するようにＤＮＡを再生し、再形成された二重鎖から一本鎖部分
をＳ１ヌクレアーゼによる処理によって除き、その後、得られたフラグメントラ
イブラリーを発現ベクターに連結することによって、コード配列のフラグメント
のライブラリーを作製することができる。この方法によって、ＬＭＲＰの様々な
サイズのＮ末端フラグメント、Ｃ末端フラグメントおよび内部フラグメントをコ
ードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０１２４】
いくつかの技術が、この分野では、点変異または短縮化によって作製されたコ
ンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするために、そして
選択された性質を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングするために知られている。そのような技術は、ＬＭＲＰホモログのコンビナ
トリアル変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニン
グに適合させることができる。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングする
ために最も広く使用されている技術（これは高速処理分析に合わせることができ
る）には、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクロー
ン化すること、適切な細胞を得られたベクターライブラリーで形質転換すること
、および所望する活性を検出することにより、その産物が検出される遺伝子をコ
ードする遺伝子の単離が容易になる条件のもとでコンビナトリアル遺伝子を発現
させることが含まれる。回帰的集合変異誘発（ＲＥＭ）はライブリラリーにおけ
る機能的な変異体の頻度を増大させる新しい技術であり、これは、ＬＭＲＰホモ
ログを同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することがで
きる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）、ＰＮＡＳ、８９：７８１
１〜７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ、６（３）：３２７〜３３１）。
ンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするために、そして
選択された性質を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングするために知られている。そのような技術は、ＬＭＲＰホモログのコンビナ
トリアル変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニン
グに適合させることができる。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングする
ために最も広く使用されている技術（これは高速処理分析に合わせることができ
る）には、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクロー
ン化すること、適切な細胞を得られたベクターライブラリーで形質転換すること
、および所望する活性を検出することにより、その産物が検出される遺伝子をコ
ードする遺伝子の単離が容易になる条件のもとでコンビナトリアル遺伝子を発現
させることが含まれる。回帰的集合変異誘発（ＲＥＭ）はライブリラリーにおけ
る機能的な変異体の頻度を増大させる新しい技術であり、これは、ＬＭＲＰホモ
ログを同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することがで
きる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）、ＰＮＡＳ、８９：７８１
１〜７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ、６（３）：３２７〜３３１）。
【０１２５】
別の実施形態において、細胞に基づくアッセイを、この分野で十分に知られて
いる方法を使用して多様なＬＭＲＰライブラリーを分析するために利用すること
ができる。
いる方法を使用して多様なＬＭＲＰライブラリーを分析するために利用すること
ができる。
【０１２６】
Ｄ．本発明の使用および方法
本明細書中に記載されている核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、融
合タンパク質、プライマー、ベクターおよび宿主細胞は下記の方法の１つまたは
２つ以上において使用することができる：フィスコミトレラ・パテンスおよび関
連する生物の同定；フィスコミトレラ・パテンスに関連する生物のゲノムのマッ
ピング；目的とするフィスコミトレラ・パテンスの配列の同定および局在化；進
化論的研究；機能に必要なＬＭＲＰ領域の決定；ＬＭＲＰ活性の調節；１つまた
は２つ以上の細胞膜成分の代謝の調節；１つまたは２つ以上の化合物の膜輸送の
調節；およびファインケミカルなどの所望する化合物の細胞産生の調節。
合タンパク質、プライマー、ベクターおよび宿主細胞は下記の方法の１つまたは
２つ以上において使用することができる：フィスコミトレラ・パテンスおよび関
連する生物の同定；フィスコミトレラ・パテンスに関連する生物のゲノムのマッ
ピング；目的とするフィスコミトレラ・パテンスの配列の同定および局在化；進
化論的研究；機能に必要なＬＭＲＰ領域の決定；ＬＭＲＰ活性の調節；１つまた
は２つ以上の細胞膜成分の代謝の調節；１つまたは２つ以上の化合物の膜輸送の
調節；およびファインケミカルなどの所望する化合物の細胞産生の調節。
【０１２７】
本発明のＬＭＲＰ核酸分子は様々な用途を有する。第１に、本発明のＬＭＲＰ
核酸分子は、生物をフィスコミトレラ・パテンスまたはその近縁であると同定す
るために使用することができる。また、本発明のＬＭＲＰ核酸分子は、微生物の
混合集団におけるフィスコミトレラ・パテンスまたはその類縁の存在を同定する
ために使用することができる。本発明は、多数のフィスコミトレラ・パテンスの
遺伝子を提供する。従って、微生物の単一集団または混合集団の培養物の抽出さ
れたゲノムＤＮＡを、ストリンジェントな条件のもと、この生物に特徴的なフィ
スコミトレラ・パテンスの遺伝子の１つの領域に広がるプローブでプローブする
ことによって、この生物が存在するかどうかを確認することができる。フィスコ
ミトレラ・パテンス自体は、多不飽和脂肪酸を商業的に製造するために使用され
ていないが、コケは、ＰＵＦＡを産生する唯一知られている植物である。従って
、ＬＭＲＰに関連するＤＮＡ配列は、他の生物におけるＰＵＦＡ製造のために使
用するために特に適している。
核酸分子は、生物をフィスコミトレラ・パテンスまたはその近縁であると同定す
るために使用することができる。また、本発明のＬＭＲＰ核酸分子は、微生物の
混合集団におけるフィスコミトレラ・パテンスまたはその類縁の存在を同定する
ために使用することができる。本発明は、多数のフィスコミトレラ・パテンスの
遺伝子を提供する。従って、微生物の単一集団または混合集団の培養物の抽出さ
れたゲノムＤＮＡを、ストリンジェントな条件のもと、この生物に特徴的なフィ
スコミトレラ・パテンスの遺伝子の１つの領域に広がるプローブでプローブする
ことによって、この生物が存在するかどうかを確認することができる。フィスコ
ミトレラ・パテンス自体は、多不飽和脂肪酸を商業的に製造するために使用され
ていないが、コケは、ＰＵＦＡを産生する唯一知られている植物である。従って
、ＬＭＲＰに関連するＤＮＡ配列は、他の生物におけるＰＵＦＡ製造のために使
用するために特に適している。
【０１２８】
さらに、本発明の核酸分子およびタンパク質分子は、ゲノムの特定領域のマー
カーとして役立ち得る。これは、ゲノムをマッピングすることにおいて有用であ
るだけでなく、フィスコミトレラ・パテンスのタンパク質の機能的研究のために
も有用である。例えば、特定のフィスコミトレラ・パテンスのＤＮＡ結合タンパ
ク質が結合するゲノムの領域を同定するために、フィスコミトレラ・パテンスの
ゲノムを消化することができ、そしてそのフラグメントをＤＮＡ結合タンパク質
とインキュベーションすることができる。タンパク質に結合するフラグメントは
、好ましくは容易に検出され得る標識を有する本発明の核酸分子でさらにプロー
ブされ得る。そのような核酸分子がゲノムフラグメントに結合することにより、
フラグメントをフィスコミトレラ・パテンスのゲノムマップに局在化させること
ができ、そして異なる酵素を用いて複数回行った場合には、タンパク質が結合す
る核酸配列の迅速な決定が容易になる。さらに、本発明の核酸分子は、これらの
核酸分子が、フィスコミトレラ・パテンスなどの類縁のコケにおけるゲノムマッ
プを構築するためのマーカーとして役立ち得るように、類縁種の配列に対して十
分に相同的であり得る。
カーとして役立ち得る。これは、ゲノムをマッピングすることにおいて有用であ
るだけでなく、フィスコミトレラ・パテンスのタンパク質の機能的研究のために
も有用である。例えば、特定のフィスコミトレラ・パテンスのＤＮＡ結合タンパ
ク質が結合するゲノムの領域を同定するために、フィスコミトレラ・パテンスの
ゲノムを消化することができ、そしてそのフラグメントをＤＮＡ結合タンパク質
とインキュベーションすることができる。タンパク質に結合するフラグメントは
、好ましくは容易に検出され得る標識を有する本発明の核酸分子でさらにプロー
ブされ得る。そのような核酸分子がゲノムフラグメントに結合することにより、
フラグメントをフィスコミトレラ・パテンスのゲノムマップに局在化させること
ができ、そして異なる酵素を用いて複数回行った場合には、タンパク質が結合す
る核酸配列の迅速な決定が容易になる。さらに、本発明の核酸分子は、これらの
核酸分子が、フィスコミトレラ・パテンスなどの類縁のコケにおけるゲノムマッ
プを構築するためのマーカーとして役立ち得るように、類縁種の配列に対して十
分に相同的であり得る。
【０１２９】
本発明のＬＭＲＰ核酸分子はまた、進化的研究およびタンパク質構造研究のた
めにも有用である。本発明の分子が関与する代謝プロセスおよび輸送プロセスは
、広範囲の原核生物細胞および真核生物細胞によって利用されている。従って、
本発明の核酸分子の配列を、他の生物に由来する類似した酵素をコードする配列
と比較することによって、これらの生物の進化的類縁度を評価することができる
。同様に、そのような比較により、配列のどの領域が保存されているか、そして
保存されていないかを評価することができる。これは、酵素を機能化するために
不可欠なタンパク質のそのような領域を決定することを助けることができる。こ
のタイプの決定はタンパク質工学研究には有益であり、そして、タンパク質が、
機能を失うことなく変異誘発に関して何を許容し得るかということの指標を提供
し得る。
めにも有用である。本発明の分子が関与する代謝プロセスおよび輸送プロセスは
、広範囲の原核生物細胞および真核生物細胞によって利用されている。従って、
本発明の核酸分子の配列を、他の生物に由来する類似した酵素をコードする配列
と比較することによって、これらの生物の進化的類縁度を評価することができる
。同様に、そのような比較により、配列のどの領域が保存されているか、そして
保存されていないかを評価することができる。これは、酵素を機能化するために
不可欠なタンパク質のそのような領域を決定することを助けることができる。こ
のタイプの決定はタンパク質工学研究には有益であり、そして、タンパク質が、
機能を失うことなく変異誘発に関して何を許容し得るかということの指標を提供
し得る。
【０１３０】
本発明のＬＭＲＰ核酸分子を操作することにより、野性型のＬＭＲＰとの機能
的差異を有するＬＭＲＰを作製することができる。このようなタンパク質は、効
率または活性を改善することができ、あるいは通常よりも多くの数を細胞に存在
させることができ、あるいは効率または活性を低下させることができる。
的差異を有するＬＭＲＰを作製することができる。このようなタンパク質は、効
率または活性を改善することができ、あるいは通常よりも多くの数を細胞に存在
させることができ、あるいは効率または活性を低下させることができる。
【０１３１】
本発明のＬＭＲＰの変化が、そのような変化したタンパク質を含むファインケ
ミカルの収率、産生および／または産生効率に対して直接的な影響を及ぼし得る
機構が多く存在する。細胞が所望する化合物を分泌する場合、（培養された細胞
の塊から抽出される場合とは対照的に）そのような化合物が培養培地から容易に
精製することができるので、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、繊毛虫類、コケ、藻類
または菌類の大規模培養物からファインケミカル化合物を回収することが大きく
改善される。ＬＭＲＰを発現する植物の場合、増大した輸送は、植物の組織内ま
たは器官内における改善された分配をもたらし得る。ファインケミカルを細胞か
ら外に輸送する輸送体分子の数または活性のいずれかを増大させることによって
、細胞外の培地に存在する産生されたファインケミカルの量を増大させることが
可能になり、従ってより容易な回収および精製、または植物の場合にはより効率
的な分配が可能になる。逆に、１つまたは複数のファインケミカルを効率よく過
剰に産生させるためには、適切な生合成経路に対する補助因子、前駆体分子およ
び中間体化合物の量を増大させることが必要である。従って、炭素源（すなわち
、糖）、窒素源（すなわち、アミノ酸、アンモニウム塩）、リン酸塩およびイオ
ウなどの栄養分の細胞内への輸送に関与する輸送体タンパク質の数および／また
は活性を増大させることによって、生合成プロセスにおける何らかの栄養分供給
制限が除かれるために、ファインケミカルの産生を改善することが可能になり得
る。さらに、脂肪酸および脂質はそれ自体、望ましいファインケミカルであり、
従って、これらの化合物の生合成に関与する本発明の１つまたは２つ以上のＬＭ
ＲＰの活性を最適化するか、またはその数を増大させることによって、あるいは
これらの化合物の分解に関与する１つまたは２つ以上のＬＭＲＰの活性を損なう
ことによって、コケ、藻類、植物、菌類、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのよ
うな他の微生物における脂肪酸分子および脂質分子の収率、産生および／または
産生効率を増大させることが可能になり得る。
ミカルの収率、産生および／または産生効率に対して直接的な影響を及ぼし得る
機構が多く存在する。細胞が所望する化合物を分泌する場合、（培養された細胞
の塊から抽出される場合とは対照的に）そのような化合物が培養培地から容易に
精製することができるので、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、繊毛虫類、コケ、藻類
または菌類の大規模培養物からファインケミカル化合物を回収することが大きく
改善される。ＬＭＲＰを発現する植物の場合、増大した輸送は、植物の組織内ま
たは器官内における改善された分配をもたらし得る。ファインケミカルを細胞か
ら外に輸送する輸送体分子の数または活性のいずれかを増大させることによって
、細胞外の培地に存在する産生されたファインケミカルの量を増大させることが
可能になり、従ってより容易な回収および精製、または植物の場合にはより効率
的な分配が可能になる。逆に、１つまたは複数のファインケミカルを効率よく過
剰に産生させるためには、適切な生合成経路に対する補助因子、前駆体分子およ
び中間体化合物の量を増大させることが必要である。従って、炭素源（すなわち
、糖）、窒素源（すなわち、アミノ酸、アンモニウム塩）、リン酸塩およびイオ
ウなどの栄養分の細胞内への輸送に関与する輸送体タンパク質の数および／また
は活性を増大させることによって、生合成プロセスにおける何らかの栄養分供給
制限が除かれるために、ファインケミカルの産生を改善することが可能になり得
る。さらに、脂肪酸および脂質はそれ自体、望ましいファインケミカルであり、
従って、これらの化合物の生合成に関与する本発明の１つまたは２つ以上のＬＭ
ＲＰの活性を最適化するか、またはその数を増大させることによって、あるいは
これらの化合物の分解に関与する１つまたは２つ以上のＬＭＲＰの活性を損なう
ことによって、コケ、藻類、植物、菌類、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのよ
うな他の微生物における脂肪酸分子および脂質分子の収率、産生および／または
産生効率を増大させることが可能になり得る。
【０１３２】
本発明の１つまたは２つ以上のＬＭＲＰ遺伝子の操作はまた、コケ、藻類、植
物、繊毛虫類または菌類、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのような他の微生物
から１つまたは複数の所望するファインケミカルを産生させることに対して間接
的な影響を及ぼす変化した活性を有するＬＭＲＰをもたらし得る。例えば、代謝
の正常な生化学的プロセスは、これらの同じ代謝プロセスを激しく妨害し得る様
々な不用産物（例えば、過酸化水素および他の反応性酸素化学種）の産生をもた
らす（例えば、ペルオキシ亜硝酸塩は、チロシンの側鎖を硝酸塩化し、それによ
り、活性部位にチロシンを有するいくつかの酵素を不活性化することが知られて
いる（Ｇｒｏｖｅｓ，Ｊ．Ｔ．（１９９９）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｌ．３（２）：２２６〜２３５）。これらの不用産物は典型的には排出さ
れるが、発酵による大規模な製造のために利用される細胞は、１つまたは２つ以
上のファインケミカルを過剰に産生させるために最適化されており、従って、野
性型細胞の場合には典型的であるよりも多くの不用産物を産生し得る。不用分子
の細胞外への輸送に関与する本発明の１つまたは２つ以上のＬＭＲＰの活性を最
適化することによって、細胞の生存性が改善され、そして効率的な代謝活性を維
持することが可能になり得る。また、所望するファインケミカルが大きな細胞内
レベルで存在することは、実際には、細胞にとって毒性になることがあり、従っ
て、これらの化合物を分泌する細胞の能力を増大させることによって、細胞の生
存性を改善することができる。
物、繊毛虫類または菌類、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのような他の微生物
から１つまたは複数の所望するファインケミカルを産生させることに対して間接
的な影響を及ぼす変化した活性を有するＬＭＲＰをもたらし得る。例えば、代謝
の正常な生化学的プロセスは、これらの同じ代謝プロセスを激しく妨害し得る様
々な不用産物（例えば、過酸化水素および他の反応性酸素化学種）の産生をもた
らす（例えば、ペルオキシ亜硝酸塩は、チロシンの側鎖を硝酸塩化し、それによ
り、活性部位にチロシンを有するいくつかの酵素を不活性化することが知られて
いる（Ｇｒｏｖｅｓ，Ｊ．Ｔ．（１９９９）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｌ．３（２）：２２６〜２３５）。これらの不用産物は典型的には排出さ
れるが、発酵による大規模な製造のために利用される細胞は、１つまたは２つ以
上のファインケミカルを過剰に産生させるために最適化されており、従って、野
性型細胞の場合には典型的であるよりも多くの不用産物を産生し得る。不用分子
の細胞外への輸送に関与する本発明の１つまたは２つ以上のＬＭＲＰの活性を最
適化することによって、細胞の生存性が改善され、そして効率的な代謝活性を維
持することが可能になり得る。また、所望するファインケミカルが大きな細胞内
レベルで存在することは、実際には、細胞にとって毒性になることがあり、従っ
て、これらの化合物を分泌する細胞の能力を増大させることによって、細胞の生
存性を改善することができる。
【０１３３】
さらに、本発明のＬＭＲＰは、産生される様々な脂質分子および脂肪酸分子の
相対的な量が変化するように操作することができる。これは、細胞の膜の脂質組
成に対して大きな影響を有し得る。各タイプの脂質は異なる物理的性質を有する
ので、膜の脂質組成の変化は、膜の流動性を大きく変化させることがある。膜流
動性の変化は、膜を横断する分子の輸送に影響を及ぼし得る。これにより、以前
に説明されているように、不用産物または産生されたファインケミカルの細胞外
への輸送または必要な栄養分の細胞内への輸送が変化し得る。そのような膜流動
性の変化はまた、細胞の一体性にも大きな影響を及ぼし得る。比較的より弱い膜
を有する細胞は、細胞を損傷させ得るか、または細胞を殺傷し得る非生物的スト
レス条件および生物的ストレス条件による損傷をより受けやすい。得られた膜が
、ファインケミカルを製造するために利用される培養における環境的条件の程度
に対してより適合しやすい膜組成を有するように、膜構築に必要な脂肪酸および
脂質の産生に関与するＬＭＲＰを操作することによって、より大きな割合の細胞
が生存し、増殖するはずである。産生細胞の数が大きくなることは、培養からの
ファインケミカルの収率、産生または産生効率を大きく変化させるはずである。
相対的な量が変化するように操作することができる。これは、細胞の膜の脂質組
成に対して大きな影響を有し得る。各タイプの脂質は異なる物理的性質を有する
ので、膜の脂質組成の変化は、膜の流動性を大きく変化させることがある。膜流
動性の変化は、膜を横断する分子の輸送に影響を及ぼし得る。これにより、以前
に説明されているように、不用産物または産生されたファインケミカルの細胞外
への輸送または必要な栄養分の細胞内への輸送が変化し得る。そのような膜流動
性の変化はまた、細胞の一体性にも大きな影響を及ぼし得る。比較的より弱い膜
を有する細胞は、細胞を損傷させ得るか、または細胞を殺傷し得る非生物的スト
レス条件および生物的ストレス条件による損傷をより受けやすい。得られた膜が
、ファインケミカルを製造するために利用される培養における環境的条件の程度
に対してより適合しやすい膜組成を有するように、膜構築に必要な脂肪酸および
脂質の産生に関与するＬＭＲＰを操作することによって、より大きな割合の細胞
が生存し、増殖するはずである。産生細胞の数が大きくなることは、培養からの
ファインケミカルの収率、産生または産生効率を大きく変化させるはずである。
【０１３４】
ファインケミカルの収率を増大させるためのＬＭＲＰに対する上記の変異誘発
法は限定的であることを意味しない。従って、これらの方法に対する様々な変化
が当業者には容易に明らかである。そのような方法を使用して、そして本明細書
中に開示された機構を組み入れることによって、本発明の核酸分子およびタンパ
ク質分子は、所望する化合物の収率、産生および／または産生効率が改善される
ように変異型のＬＭＲＰ核酸分子およびタンパク質分子を発現するコケ、藻類、
繊毛虫類、植物、菌類、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのような微生物を作製
するために利用することができる。この所望される化合物には、コケ、繊毛虫類
、植物、菌類またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの任意の天然の生成物を挙げるこ
とができるが、生合成経路の最終生成物、および天然に存在する代謝経路の中間
体、ならびに前記細胞の代謝において自然界に存在しないが、本発明の前記細胞
によって産生される分子が含まれる。
法は限定的であることを意味しない。従って、これらの方法に対する様々な変化
が当業者には容易に明らかである。そのような方法を使用して、そして本明細書
中に開示された機構を組み入れることによって、本発明の核酸分子およびタンパ
ク質分子は、所望する化合物の収率、産生および／または産生効率が改善される
ように変異型のＬＭＲＰ核酸分子およびタンパク質分子を発現するコケ、藻類、
繊毛虫類、植物、菌類、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのような微生物を作製
するために利用することができる。この所望される化合物には、コケ、繊毛虫類
、植物、菌類またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの任意の天然の生成物を挙げるこ
とができるが、生合成経路の最終生成物、および天然に存在する代謝経路の中間
体、ならびに前記細胞の代謝において自然界に存在しないが、本発明の前記細胞
によって産生される分子が含まれる。
【０１３５】
本発明は、限定として解釈すべきでない下記の実施例によってさらに例示され
る。本明細書中に引用されているすべての参考文献、特許出願、特許および公開
特許出願の内容はそれらにより参考として組み込まれる。
る。本明細書中に引用されているすべての参考文献、特許出願、特許および公開
特許出願の内容はそれらにより参考として組み込まれる。
【０１３６】
実施例
実施例１
一般的プロセス
ａ）一般的なクローニングプロセス：
クローニングプロセス（例えば、制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ
フラグメントの精製、核酸のニトロセルロースメンブランまたはナイロンメンブ
ランへの転写、ＤＮＡフラグメントの連結、大腸菌細胞および酵母細胞の形質転
換、細菌の増殖、および組換えＤＮＡの配列分析など）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ：ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）またはＫａｉｓｅｒ、Ｍ
ｉｃｈａｅｌｉｓおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ（１９９４）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ＩＳＢＮ０−８７９６９−４５１−３）
に記載される通りに行った。形質転換および培養：クロレラまたはファエオダク
チルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）などの２１の藻類を、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋ
ｈ（１９９９）、Ｂｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、４２：２０９〜２１
６；Ａｐｔら（１９９６）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ、２５２（２）：８７２〜９によって記載される通りに形質転換
する。
フラグメントの精製、核酸のニトロセルロースメンブランまたはナイロンメンブ
ランへの転写、ＤＮＡフラグメントの連結、大腸菌細胞および酵母細胞の形質転
換、細菌の増殖、および組換えＤＮＡの配列分析など）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ：ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）またはＫａｉｓｅｒ、Ｍ
ｉｃｈａｅｌｉｓおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ（１９９４）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ＩＳＢＮ０−８７９６９−４５１−３）
に記載される通りに行った。形質転換および培養：クロレラまたはファエオダク
チルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）などの２１の藻類を、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋ
ｈ（１９９９）、Ｂｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、４２：２０９〜２１
６；Ａｐｔら（１９９６）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ、２５２（２）：８７２〜９によって記載される通りに形質転換
する。
【０１３７】
ｂ）化学物質：
使用された化学物質は、本文中に別途言及されていない限り、Ｆｌｕｋａ（Ｎ
ｅｕ−Ｕｌｍ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、Ｒｏｔｈ（Ｋａｒｌｓｒ
ｕｌｅ）、Ｓｅｒｖａ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）およびＳｉｇｍａ（Ｄｅｉｓｅ
ｎｈｏｆｅｎ）の各会社から所定量で購入した。溶液を、Ｍｉｌｉ−Ｑ水システ
ムの水精製装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）から得られる、パイ
ロジェンを含まない精製水（下記においてはＨ２Ｏとして示される）を使用して
調製した。制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾酵素および分子生物学キットを
、ＡＧＳ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅ
ｉｇ）、Ｂｉｏｍｅｔｒａ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｇｅｎｏｍｅｄ（Ｂａｄ Ｏｅｙｎｎｈ
ａｕｓｅｎ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓｃｈｗａｌｂａｃ
ｈ／Ｔａｕｎｕｓ）、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、
米国）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ）、Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）およびＳｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）の各会社から入手した。それらを
、別途記載されていない限り、製造者の説明書に従って使用した。
ｅｕ−Ｕｌｍ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、Ｒｏｔｈ（Ｋａｒｌｓｒ
ｕｌｅ）、Ｓｅｒｖａ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）およびＳｉｇｍａ（Ｄｅｉｓｅ
ｎｈｏｆｅｎ）の各会社から所定量で購入した。溶液を、Ｍｉｌｉ−Ｑ水システ
ムの水精製装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）から得られる、パイ
ロジェンを含まない精製水（下記においてはＨ２Ｏとして示される）を使用して
調製した。制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾酵素および分子生物学キットを
、ＡＧＳ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅ
ｉｇ）、Ｂｉｏｍｅｔｒａ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｇｅｎｏｍｅｄ（Ｂａｄ Ｏｅｙｎｎｈ
ａｕｓｅｎ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓｃｈｗａｌｂａｃ
ｈ／Ｔａｕｎｕｓ）、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、
米国）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ）、Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）およびＳｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）の各会社から入手した。それらを
、別途記載されていない限り、製造者の説明書に従って使用した。
【０１３８】
ｃ）植物材料：
この研究のために、ハンブルグ大学の遺伝学研究部門のコレクションから得ら
れる種フィスコミトレラ・パテンス（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．の植物を使用し
た。植物は、Ｈ．Ｌ．Ｋ．Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ（Ｇｒａｎｓｄｅｎ Ｗｏｏｄ
、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎｓｈｉｒｅ、英国）によって集められた系統１６／１４
に由来し、Ｅｎｇｅｌ（１９６８、Ａｍ Ｊ Ｂｏｔ、５５、４３８〜４４６）
により胞子から継代された。植物の増殖を、胞子によって、そして配偶体の再生
によって行った。原糸体を半数体の胞子から高葉緑体クロロネマおよび低葉緑体
クロロネマとして発達させ、芽を約１２日後に形成させた。これらを生育させて
、造精器および造卵器を有するガメトフォアを生じさせた。受精後、還元胞子が
成熟する、短い剛毛および胞子カプセルを有する二倍体の胞子体が生じた。
れる種フィスコミトレラ・パテンス（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．の植物を使用し
た。植物は、Ｈ．Ｌ．Ｋ．Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ（Ｇｒａｎｓｄｅｎ Ｗｏｏｄ
、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎｓｈｉｒｅ、英国）によって集められた系統１６／１４
に由来し、Ｅｎｇｅｌ（１９６８、Ａｍ Ｊ Ｂｏｔ、５５、４３８〜４４６）
により胞子から継代された。植物の増殖を、胞子によって、そして配偶体の再生
によって行った。原糸体を半数体の胞子から高葉緑体クロロネマおよび低葉緑体
クロロネマとして発達させ、芽を約１２日後に形成させた。これらを生育させて
、造精器および造卵器を有するガメトフォアを生じさせた。受精後、還元胞子が
成熟する、短い剛毛および胞子カプセルを有する二倍体の胞子体が生じた。
【０１３９】
ｄ）植物の生育：
培養を２５℃の空気温度および５５マイクロモル−ｌｍ−２の光強度（白色光
；Ｐｈｉｌｉｐｓ ＴＬ６５Ｗ／２５蛍光灯）および１６／８時間の明暗変化で
気象実験室において行った。コケを、ＲｅｓｋｉおよびＡｂｅｌ（１９８５、Ｐ
ｌａｎｔａ、１６５、３５４〜３５８）に従ったＫｎｏｐ培地を使用して液体培
地で改変するか、あるいは１％オキソイド寒天（Ｕｎｉｐａｔｈ、Ｂａｓｉｎｇ
ｓｔｏｋｅ、英国）を使用するＫｎｏｐ固体培地で培養した。ＲＮＡおよびＤＮ
Ａを単離するために使用された原糸体は通気液体培養で培養された。原糸体を９
日毎に細かく砕き、新しい培養培地に移した。
；Ｐｈｉｌｉｐｓ ＴＬ６５Ｗ／２５蛍光灯）および１６／８時間の明暗変化で
気象実験室において行った。コケを、ＲｅｓｋｉおよびＡｂｅｌ（１９８５、Ｐ
ｌａｎｔａ、１６５、３５４〜３５８）に従ったＫｎｏｐ培地を使用して液体培
地で改変するか、あるいは１％オキソイド寒天（Ｕｎｉｐａｔｈ、Ｂａｓｉｎｇ
ｓｔｏｋｅ、英国）を使用するＫｎｏｐ固体培地で培養した。ＲＮＡおよびＤＮ
Ａを単離するために使用された原糸体は通気液体培養で培養された。原糸体を９
日毎に細かく砕き、新しい培養培地に移した。
【０１４０】
実施例２
植物からの総ＤＮＡの単離
総ＤＮＡを単離するための詳細は、１グラムの新鮮重量の植物材料を処理する
ことに関する。ＣＴＡＢ緩衝液：２％（ｗ／ｖ）Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ
メチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）；１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８
．０；１．４ＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＥＤＴＡ。Ｎ−ラウリルサルコシン緩衝
液：１０％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン；１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、
ｐＨ８．０；２０ｍＭのＥＤＴＡ。
ことに関する。ＣＴＡＢ緩衝液：２％（ｗ／ｖ）Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ
メチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）；１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８
．０；１．４ＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＥＤＴＡ。Ｎ−ラウリルサルコシン緩衝
液：１０％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン；１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、
ｐＨ８．０；２０ｍＭのＥＤＴＡ。
【０１４１】
植物材料を乳鉢において液体窒素のもとで粉砕して、微粉末にし、２ｍｌのエ
ッペンドルフ容器に移した。その後、凍結植物材料を１ｍｌの分解緩衝液（１ｍ
ｌのＣＴＡＢ、１００ｍｌのＮ−ラウリルサルコシン緩衝液、２０ｍｌのβ−メ
ルカプトエタノールおよび１０ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）
）の層で覆い、連続的に振とうしながら６０℃で１時間インキュベーションした
。得られたホモジネートを２つのエッペンドルフ容器（２ｍｌ）に分け、同じ容
量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で振とうすることによっ
て２回抽出した。相分離のために、それぞれについて遠心分離を８０００ｘｇお
よびＲＴで１５分間行った。その後、ＤＮＡを、氷冷したイソプロパノールを使
用して７０℃で３０分間沈殿させた。沈殿したＤＮＡを４℃および１０，０００
ｇで３０分間沈降させ、そして１８０ｍｌのＴＥ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ：ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）に再懸濁した。さらに精製す
るために、ＤＮＡをＮａＣｌ（最終濃度：１．２Ｍ）で処理し、２倍容量の無水
アルコールを使用して７０℃で３０分間再び沈殿させた。７０％エタノールを用
いた洗浄工程の後、ＤＮＡを乾燥させ、その後、５０ｍｌのＨ２Ｏ＋ＲＮＡｓｅ
（最終濃度：５０ｍｇ／ｍｌ）に溶解させた。ＤＮＡを４℃で一晩溶解し、続い
てＲＮＡｓｅ消化を３７℃で１時間行った。ＤＮＡの保存を４℃で行った。
ッペンドルフ容器に移した。その後、凍結植物材料を１ｍｌの分解緩衝液（１ｍ
ｌのＣＴＡＢ、１００ｍｌのＮ−ラウリルサルコシン緩衝液、２０ｍｌのβ−メ
ルカプトエタノールおよび１０ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）
）の層で覆い、連続的に振とうしながら６０℃で１時間インキュベーションした
。得られたホモジネートを２つのエッペンドルフ容器（２ｍｌ）に分け、同じ容
量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で振とうすることによっ
て２回抽出した。相分離のために、それぞれについて遠心分離を８０００ｘｇお
よびＲＴで１５分間行った。その後、ＤＮＡを、氷冷したイソプロパノールを使
用して７０℃で３０分間沈殿させた。沈殿したＤＮＡを４℃および１０，０００
ｇで３０分間沈降させ、そして１８０ｍｌのＴＥ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ：ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）に再懸濁した。さらに精製す
るために、ＤＮＡをＮａＣｌ（最終濃度：１．２Ｍ）で処理し、２倍容量の無水
アルコールを使用して７０℃で３０分間再び沈殿させた。７０％エタノールを用
いた洗浄工程の後、ＤＮＡを乾燥させ、その後、５０ｍｌのＨ２Ｏ＋ＲＮＡｓｅ
（最終濃度：５０ｍｇ／ｍｌ）に溶解させた。ＤＮＡを４℃で一晩溶解し、続い
てＲＮＡｓｅ消化を３７℃で１時間行った。ＤＮＡの保存を４℃で行った。
【０１４２】
実施例３
植物からの総ＲＮＡおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡの単離
転写物を調べるために、総ＲＮＡおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡの両方を単離した
。総ＲＮＡを野性型の９日目の原糸体からＧＴＣ法（Ｒｅｓｋｉら、１９９４、
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２４４：３５２〜３５９）に従って得た。ポリ
Ａ＋ＲＮＡの単離を製造者のプロトコルの説明書に従ってＤｙｎａ Ｂｅａｄｓ Ｒ （Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、フィンランド）を使用して単離した。総ＲＮＡまた
はポリ（Ａ）＋ＲＮＡの濃度を測定した後、ＲＮＡを、１／１０容量の３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ４．６）および２容量のエタノールを加えることによって沈殿
させ、７０℃で保存した。
。総ＲＮＡを野性型の９日目の原糸体からＧＴＣ法（Ｒｅｓｋｉら、１９９４、
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２４４：３５２〜３５９）に従って得た。ポリ
Ａ＋ＲＮＡの単離を製造者のプロトコルの説明書に従ってＤｙｎａ Ｂｅａｄｓ Ｒ （Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、フィンランド）を使用して単離した。総ＲＮＡまた
はポリ（Ａ）＋ＲＮＡの濃度を測定した後、ＲＮＡを、１／１０容量の３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ４．６）および２容量のエタノールを加えることによって沈殿
させ、７０℃で保存した。
【０１４３】
実施例４
ｃＤＮＡライブラリーの構築
ｃＤＮＡライブラリーを構築するために、第１鎖の合成を、ネズミ白血病ウイ
ルス逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）およびオリゴｄ（Ｔ
）プライマーを使用して達成し、第２鎖の合成を、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレ
ノウ酵素）とのインキュベーション、そして１２℃（２時間）、１６℃（１時間
）および２２℃（１時間）でのＲＮＡｓｅＨ消化によって達成した。反応を、６
５℃（１０分間）でインキュベーションすることによって停止させ、続いて氷に
移した。二本鎖ＤＮＡ分子をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ）によって３７℃（３０分間）で平滑化した。ヌクレオチドをフェノール
／クロロホルム抽出およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０スピンカラムによって除い
た。ＥｃｏＲＩアダプター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）
をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ、１２℃、一晩）によってｃＤＮＡの両末端
に連結し、そしてポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ、３７℃、３０分間）
とのインキュベーションによってリン酸化した。この混合物を低融点アガロース
ゲルでの分離に供した。３００塩基対よりも大きいＤＮＡ分子をゲルから溶出さ
せ、フェノール抽出し、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎ
ｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、ドイツ）で濃縮して、ベクターアームに連
結し、そして製造者の材料を使用し、製造者の説明者に従って、Ｇｉｇａｐａｋ Ｇｏｌｄキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）を
使用してラムダＺＡＰＩＩファージまたはラムダＺＡＰ−Ｅｘｐｒｅｓｓファー
ジにパッケージングした。
ルス逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）およびオリゴｄ（Ｔ
）プライマーを使用して達成し、第２鎖の合成を、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレ
ノウ酵素）とのインキュベーション、そして１２℃（２時間）、１６℃（１時間
）および２２℃（１時間）でのＲＮＡｓｅＨ消化によって達成した。反応を、６
５℃（１０分間）でインキュベーションすることによって停止させ、続いて氷に
移した。二本鎖ＤＮＡ分子をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ）によって３７℃（３０分間）で平滑化した。ヌクレオチドをフェノール
／クロロホルム抽出およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０スピンカラムによって除い
た。ＥｃｏＲＩアダプター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）
をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ、１２℃、一晩）によってｃＤＮＡの両末端
に連結し、そしてポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ、３７℃、３０分間）
とのインキュベーションによってリン酸化した。この混合物を低融点アガロース
ゲルでの分離に供した。３００塩基対よりも大きいＤＮＡ分子をゲルから溶出さ
せ、フェノール抽出し、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎ
ｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、ドイツ）で濃縮して、ベクターアームに連
結し、そして製造者の材料を使用し、製造者の説明者に従って、Ｇｉｇａｐａｋ Ｇｏｌｄキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）を
使用してラムダＺＡＰＩＩファージまたはラムダＺＡＰ−Ｅｘｐｒｅｓｓファー
ジにパッケージングした。
【０１４４】
実施例５
目的とする遺伝子の同定
遺伝子の配列は、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーから相同的
な遺伝子または異種の遺伝子を同定するために使用することができる。相同的な
遺伝子（例えば、全長ｃＤＮＡのクローン）を、例えば、ｃＤＮＡライブラリー
を使用して核酸ハイブリダイゼーションによって単離することができる。目的と
する遺伝子の存在量に依存して、１０００００個から１００００００個までの組
換えバクテリオファージが置床され、ナイロンメンブランに移される。アルカリ
で変性させた後、ＤＮＡを、例えば、ＵＶ架橋によりメンブランに固定化する。
ハイブリダイゼーションが高ストリンジェンシーの条件のもとで行われる。水溶
液において、ハイブリダイゼーションおよび洗浄が、１Ｍ ＮａＣｌのイオン強
度および６８℃の温度で行われる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば
、放射能（３２Ｐ）ニック転写標識によって作製される（Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ
、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）。シグナルはオートラジオグラフィ
ーによって検出される。
な遺伝子または異種の遺伝子を同定するために使用することができる。相同的な
遺伝子（例えば、全長ｃＤＮＡのクローン）を、例えば、ｃＤＮＡライブラリー
を使用して核酸ハイブリダイゼーションによって単離することができる。目的と
する遺伝子の存在量に依存して、１０００００個から１００００００個までの組
換えバクテリオファージが置床され、ナイロンメンブランに移される。アルカリ
で変性させた後、ＤＮＡを、例えば、ＵＶ架橋によりメンブランに固定化する。
ハイブリダイゼーションが高ストリンジェンシーの条件のもとで行われる。水溶
液において、ハイブリダイゼーションおよび洗浄が、１Ｍ ＮａＣｌのイオン強
度および６８℃の温度で行われる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば
、放射能（３２Ｐ）ニック転写標識によって作製される（Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ
、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）。シグナルはオートラジオグラフィ
ーによって検出される。
【０１４５】
関連するが、同一ではない部分的な相同的な遺伝子または異種の遺伝子を、低
いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を使用して
上記に記載される手順と同様にして同定することができる。ハイブリダイゼーシ
ョン水溶液の場合、イオン強度は、通常、１Ｍ ＮａＣｌで保たれるが、温度は
６８℃から４２℃まで順次下げられる。
いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を使用して
上記に記載される手順と同様にして同定することができる。ハイブリダイゼーシ
ョン水溶液の場合、イオン強度は、通常、１Ｍ ＮａＣｌで保たれるが、温度は
６８℃から４２℃まで順次下げられる。
【０１４６】
（例えば、１０個〜２０個のアミノ酸の）別個のドメインにおいてのみ相同性
を有する遺伝子の単離を、放射能標識された合成オリゴヌクレオチドプローブを
使用して行うことができる。放射能標識されたオリゴヌクレオチドは、２つの相
補的なオリゴヌクレオチドの５’プライム末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
でリン酸化することによって調製される。相補的なオリゴヌクレオチドは、コン
カテマーを得るためにアニールおよび連結される。その後、二本鎖のコンカテマ
ーは、例えば、ニック転写によって放射能標識される。ハイブリダイゼーション
は、通常、大きなオリゴヌクレオチド濃度を使用して低いストリンジェンシーの
条件で行われる。
を有する遺伝子の単離を、放射能標識された合成オリゴヌクレオチドプローブを
使用して行うことができる。放射能標識されたオリゴヌクレオチドは、２つの相
補的なオリゴヌクレオチドの５’プライム末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
でリン酸化することによって調製される。相補的なオリゴヌクレオチドは、コン
カテマーを得るためにアニールおよび連結される。その後、二本鎖のコンカテマ
ーは、例えば、ニック転写によって放射能標識される。ハイブリダイゼーション
は、通常、大きなオリゴヌクレオチド濃度を使用して低いストリンジェンシーの
条件で行われる。
【０１４７】
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション溶液：
６ｘＳＳＣ；０．０１Ｍリン酸ナトリウム；１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）；０
．５％ＳＤＳ；１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ；０．１％脱脂乾燥乳。
．５％ＳＤＳ；１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ；０．１％脱脂乾燥乳。
【０１４８】
ハイブリダイゼーションのとき、温度は、推定されたオリゴヌクレオチドのＴ
ｍよりも５℃〜１０℃低い温度または室温にまで段階的に下げられ、その後、洗
浄工程およびオートラジオグラフィーが行われる。洗浄は、４ｘＳＳＣを使用す
る３回の洗浄工程などの低いストリンジェンシーで徹底的に行われる。さらなる
詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）またはＡｕｓｕｂｅ
ｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９４）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に
よって記載されている。
ｍよりも５℃〜１０℃低い温度または室温にまで段階的に下げられ、その後、洗
浄工程およびオートラジオグラフィーが行われる。洗浄は、４ｘＳＳＣを使用す
る３回の洗浄工程などの低いストリンジェンシーで徹底的に行われる。さらなる
詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）またはＡｕｓｕｂｅ
ｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９４）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に
よって記載されている。
【０１４９】
実施例６
発現ライブラリーを抗体でスクリーニングすることによる目的遺伝子の単離
ｃＤＮＡ配列は、例えば、大腸菌において組換えタンパク質を産生させるため
に使用することができる（例えば、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｐＱ
Ｅシステム）。その後、組換えタンパク質は、通常、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティ
ークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によってアフィニティー精製される。そ
の後、組換えタンパク質は、例えば、ウサギを免疫化するために標準的な技術を
使用することによって特異的な抗体を産生させるために使用することができる。
抗体は、Ｇｕら（１９９４）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１７：２５７〜２
６２によって記載されるように、組換え抗原を飽和させたＮｉ−ＮＴＡカラムを
使用してアフィニティー精製される。その後、抗体は、免疫学的スクリーニング
によって発現ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、相同的な遺伝子また
は異種の遺伝子を同定するために使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ
．ら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９４）、「Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）。
に使用することができる（例えば、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｐＱ
Ｅシステム）。その後、組換えタンパク質は、通常、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティ
ークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によってアフィニティー精製される。そ
の後、組換えタンパク質は、例えば、ウサギを免疫化するために標準的な技術を
使用することによって特異的な抗体を産生させるために使用することができる。
抗体は、Ｇｕら（１９９４）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１７：２５７〜２
６２によって記載されるように、組換え抗原を飽和させたＮｉ−ＮＴＡカラムを
使用してアフィニティー精製される。その後、抗体は、免疫学的スクリーニング
によって発現ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、相同的な遺伝子また
は異種の遺伝子を同定するために使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ
．ら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９４）、「Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）。
【０１５０】
実施例７
ノーザンハイブリダイゼーション
ＲＮＡハイブリダイゼーションのために、２０ｍｇの総ＲＮＡまたは１ｍｇの
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、Ａｍａｓｉｎｏ（１９８６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．１５２、３０４）に記載されるようにホルムアルデヒドを使用する１．２５％
濃度のアガロースゲルでのゲル電気泳動によって分離し、そして１０ｘＳＳＣを
使用して毛細管吸引によって正荷電のナイロンメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋
、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に移し、ＵＶ光で固定化し、
そしてハイブリダイゼーション緩衝液（１０％デキストラン硫酸（ｗ／ｖ）、１
Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１００ｍｇのニシン精子ＤＮＡ）を使用して６８℃
で３時間プレハイブリダイゼーションした。Ｈｉｇｈｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キ
ット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を用いたＤＮＡプローブの標識
化を、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、
ドイツ）を使用してプレハイブリダイゼーション時に行った。ハイブリダイゼー
ションを、標識されたＤＮＡプローブを加えた後、同じ緩衝液中で６８℃で一晩
行った。洗浄工程を、６８℃で、２ｘＳＳＣを使用して１５分間で２回、そして
１ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳを使用して３０分間で２回行った。シールしたフィルタ
ーの感光を−７０℃で１日間〜１４日間行った。
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、Ａｍａｓｉｎｏ（１９８６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．１５２、３０４）に記載されるようにホルムアルデヒドを使用する１．２５％
濃度のアガロースゲルでのゲル電気泳動によって分離し、そして１０ｘＳＳＣを
使用して毛細管吸引によって正荷電のナイロンメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋
、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に移し、ＵＶ光で固定化し、
そしてハイブリダイゼーション緩衝液（１０％デキストラン硫酸（ｗ／ｖ）、１
Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１００ｍｇのニシン精子ＤＮＡ）を使用して６８℃
で３時間プレハイブリダイゼーションした。Ｈｉｇｈｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キ
ット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を用いたＤＮＡプローブの標識
化を、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、
ドイツ）を使用してプレハイブリダイゼーション時に行った。ハイブリダイゼー
ションを、標識されたＤＮＡプローブを加えた後、同じ緩衝液中で６８℃で一晩
行った。洗浄工程を、６８℃で、２ｘＳＳＣを使用して１５分間で２回、そして
１ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳを使用して３０分間で２回行った。シールしたフィルタ
ーの感光を−７０℃で１日間〜１４日間行った。
【０１５１】
実施例８
ＤＮＡの配列決定
実施例４に記載されるｃＤＮＡライブラリーを、標準的な方法に従ったＤＮＡ
配列決定のために、特に、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎ
ａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、ドイツ）を使用
するチェーンターミネーション法によるＤＮＡ配列決定のために使用した。ラン
ダム配列決定を、インビボでの大量切り出し、および寒天平板上でのＤＨ１０１
Ｂの再形質転換によるｃＤＮＡライブラリーからの調製的なプラスミド回収の後
に行った（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）から得られ
る材料およびプロトコル詳細）。プラスミドＤＮＡを、アンピシリンを含有する
Ｌｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ＩＳＢＮ０−８７９
６９−３０９−６）を参照のこと）で一晩生育させた大腸菌の培養物から、製造
者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎｅのＤＮＡ調製ロボット（Ｑｉａｇｅｎｅ
、Ｈｉｌｄｅｎ）で調製した。下記のヌクレオチド配列を有する配列決定用プラ
イマーを使用した： ５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’ ５’−ＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧ−３’ ５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’
配列決定のために、特に、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎ
ａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、ドイツ）を使用
するチェーンターミネーション法によるＤＮＡ配列決定のために使用した。ラン
ダム配列決定を、インビボでの大量切り出し、および寒天平板上でのＤＨ１０１
Ｂの再形質転換によるｃＤＮＡライブラリーからの調製的なプラスミド回収の後
に行った（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）から得られ
る材料およびプロトコル詳細）。プラスミドＤＮＡを、アンピシリンを含有する
Ｌｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ＩＳＢＮ０−８７９
６９−３０９−６）を参照のこと）で一晩生育させた大腸菌の培養物から、製造
者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎｅのＤＮＡ調製ロボット（Ｑｉａｇｅｎｅ
、Ｈｉｌｄｅｎ）で調製した。下記のヌクレオチド配列を有する配列決定用プラ
イマーを使用した： ５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’ ５’−ＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧ−３’ ５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’
【０１５２】
実施例９
植物を形質転換するためのプラスミド
植物を形質転換するために、ｐＢｉｎＡＲなどのバイナリーベクターを使用す
ることができる（ＨｏｆｇｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ、Ｐｌａｎｔ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、６６（１９９０）、２２１〜２３０）。バイナリーベクターの構築
を、ｃＤＮＡをセンス方向またはアンチセンス方向でＴ−ＤＮＡに連結すること
によって行うことができる。ｃＤＮＡの５’−プライム端にある植物プロモータ
ーにより、ｃＤＮＡの転写が活性化される。ポリアデニル化配列がｃＤＮＡの３
’−プライム端に存在する。
ることができる（ＨｏｆｇｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ、Ｐｌａｎｔ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、６６（１９９０）、２２１〜２３０）。バイナリーベクターの構築
を、ｃＤＮＡをセンス方向またはアンチセンス方向でＴ−ＤＮＡに連結すること
によって行うことができる。ｃＤＮＡの５’−プライム端にある植物プロモータ
ーにより、ｃＤＮＡの転写が活性化される。ポリアデニル化配列がｃＤＮＡの３
’−プライム端に存在する。
【０１５３】
組織特異的な発現を、組織特異的なプロモーターを使用することによって達成
することができる。例えば、種子特異的な発現を、ナピンまたはファセオリン、
ＤＣ３、ＬｅＢ４またはＵＳＰのプロモーターをｃＤＮＡの５−プライム端にク
ローン化することによって達成することができる。また、任意の他の種子特異的
なプロモーターエレメントを使用することができる。植物全体における構成的な
発現のために、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを使用することができる。発現した
タンパク質は、例えば、プラスチド、ミトコンドリアまたは小胞体に対するシグ
ナルペプチドを使用して細胞区画に向けさせることができる（Ｋｅｒｍｏｄｅ、
Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５、４（１９９６）、２８５〜４２
３）。シグナルペプチドは、融合タンパク質の細胞内局在化をもたらすために、
ｃＤＮＡに対して読み枠を合わせて５’−プライム端にクローン化される。
することができる。例えば、種子特異的な発現を、ナピンまたはファセオリン、
ＤＣ３、ＬｅＢ４またはＵＳＰのプロモーターをｃＤＮＡの５−プライム端にク
ローン化することによって達成することができる。また、任意の他の種子特異的
なプロモーターエレメントを使用することができる。植物全体における構成的な
発現のために、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを使用することができる。発現した
タンパク質は、例えば、プラスチド、ミトコンドリアまたは小胞体に対するシグ
ナルペプチドを使用して細胞区画に向けさせることができる（Ｋｅｒｍｏｄｅ、
Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５、４（１９９６）、２８５〜４２
３）。シグナルペプチドは、融合タンパク質の細胞内局在化をもたらすために、
ｃＤＮＡに対して読み枠を合わせて５’−プライム端にクローン化される。
【０１５４】
実施例１０
アグロバクテリウムの形質転換
アグロバクテリウムによって媒介される植物の形質転換を、例えば、ＧＶ３１
０１（ｐＭＰ９０）（ＫｏｎｃｚおよびＳｃｈｅｌｌ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．２０４（１９８６）、３８３〜３９６）またはＬＢＡ４４０４（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）のアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を使用して行うことがで
きる。形質転換は標準的な形質転換技術によって行うことができる（Ｄｅｂｌａ
ｅｒｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｔｅｓ．１３（１９８４）、４７７７〜４７
８８）。
０１（ｐＭＰ９０）（ＫｏｎｃｚおよびＳｃｈｅｌｌ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．２０４（１９８６）、３８３〜３９６）またはＬＢＡ４４０４（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）のアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を使用して行うことがで
きる。形質転換は標準的な形質転換技術によって行うことができる（Ｄｅｂｌａ
ｅｒｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｔｅｓ．１３（１９８４）、４７７７〜４７
８８）。
【０１５５】
実施例１１
植物の形質転換
アグロバクテリウムによって媒介される植物の形質転換を、標準的な形質転換
技術および再生技術を使用して行うことができる（Ｇｅｌｖｉｎ、Ｓｔａｎｔｏ
ｎ Ｂ．；Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ，Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：
Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌ．、１９９５）、節：Ｒｉｎｇｂｕ
ｃ Ｚｅｎｔｒａｌｅ Ｓｉｇｎａｔｕｒ：ＢＴ１１−Ｐ ＩＳＢＮ０−７９２
３−２７３１−４；Ｇｌｉｃｋ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｒ．；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ
ｏｈｎ Ｅ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３、３６０Ｓ、ＩＳＢＮ０−８４９３−５１６４−２
）。
技術および再生技術を使用して行うことができる（Ｇｅｌｖｉｎ、Ｓｔａｎｔｏ
ｎ Ｂ．；Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ，Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：
Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌ．、１９９５）、節：Ｒｉｎｇｂｕ
ｃ Ｚｅｎｔｒａｌｅ Ｓｉｇｎａｔｕｒ：ＢＴ１１−Ｐ ＩＳＢＮ０−７９２
３−２７３１−４；Ｇｌｉｃｋ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｒ．；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ
ｏｈｎ Ｅ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３、３６０Ｓ、ＩＳＢＮ０−８４９３−５１６４−２
）。
【０１５６】
例えば、アブラナは子葉または胚軸の形質転換によって形質転換することがで
きる（Ｍｏｌｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ、８（１９８９
）、２３８〜２４２；Ｄｅ Ｂｌｏｃｋら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１
（１９８９）、６９４〜７０１）。アグロバクテリウムおよび植物選抜に対する
抗生物質の使用は、形質転換のために使用されたバイナリーベクターおよびアグ
ロバクテリウム株に依存する。アブラナの選抜は、通常、植物の選択マーカーと
してカナマイシンを使用して行われる。
きる（Ｍｏｌｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ、８（１９８９
）、２３８〜２４２；Ｄｅ Ｂｌｏｃｋら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１
（１９８９）、６９４〜７０１）。アグロバクテリウムおよび植物選抜に対する
抗生物質の使用は、形質転換のために使用されたバイナリーベクターおよびアグ
ロバクテリウム株に依存する。アブラナの選抜は、通常、植物の選択マーカーと
してカナマイシンを使用して行われる。
【０１５７】
亜麻に対するアグロバクテリウム媒介遺伝子移入を、例えば、Ｍｌｙｎａｒｏ
ｖａら（１９９４）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ、１３：２８２〜２
８５によって記載される技術を使用して行うことができる。
ｖａら（１９９４）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ、１３：２８２〜２
８５によって記載される技術を使用して行うことができる。
【０１５８】
ダイズの形質転換を、例えば、欧州特許０４２４０４７、米国特許第３２２７
８３号（Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、あ
るいは欧州特許０３９７６８７、米国特許第５３７６５４３号、米国特許第５１
６９７７０号（トレド大学）に記載される技術を使用して行うことができる。
８３号（Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、あ
るいは欧州特許０３９７６８７、米国特許第５３７６５４３号、米国特許第５１
６９７７０号（トレド大学）に記載される技術を使用して行うことができる。
【０１５９】
粒子衝撃、ポリエチレングリコール媒介ＤＮＡ取り込みを使用する植物の形質
転換、または炭化ケイ素ファイバー技術による植物の形質転換が、例えば、Ｆｒ
ｅｅｌｉｎｇおよびＷａｌｂｏｔ、「Ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｈａｎｄｂｏｏｋ」
、（１９９３）（ＩＳＢＮ３−５４０−９７８２６−７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖ
ｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。
転換、または炭化ケイ素ファイバー技術による植物の形質転換が、例えば、Ｆｒ
ｅｅｌｉｎｇおよびＷａｌｂｏｔ、「Ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｈａｎｄｂｏｏｋ」
、（１９９３）（ＩＳＢＮ３−５４０−９７８２６−７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖ
ｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。
【０１６０】
実施例１２
インビボ変異誘発
微生物のインビボ変異誘発を、その遺伝情報の完全性を維持するその能力が損
なわれている大腸菌または他の微生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．ま
たは酵母（サッカロマイセス・セレビジアエなど））を介してプラスミド（また
は他のベクター）ＤＮＡを継代することによって行うことができる。典型的な変
異体株は、ＤＮＡ修復システムの遺伝子に変異を有する（例えば、ｍｕｔＨＬＳ
、ｍｕｔＤ、ｍｕｔＴなど；参考については、Ｒｕｐｐ，Ｗ．Ｄ．（１９９６）
、ＤＮＡ修復機構、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ、２２７７頁〜２２９４頁、ＡＳＭ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎを参照のこ
と）。そのような菌株は当業者には十分に知られている。そのような菌株の使用
が、例えば、Ｇｒｅｅｎｅｒ，Ａ．およびＣａｌｌａｈａｎ，Ｍ．（１９９４）
、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、７：３２〜３４に例示されている。変異させたＤＮＡ
分子を植物に移すことが、好ましくは、微生物における選抜および試験の後に行
われる。トランスジェニック植物が、本明細書の実施例に含まれる様々な実施例
に従って作製される。
なわれている大腸菌または他の微生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．ま
たは酵母（サッカロマイセス・セレビジアエなど））を介してプラスミド（また
は他のベクター）ＤＮＡを継代することによって行うことができる。典型的な変
異体株は、ＤＮＡ修復システムの遺伝子に変異を有する（例えば、ｍｕｔＨＬＳ
、ｍｕｔＤ、ｍｕｔＴなど；参考については、Ｒｕｐｐ，Ｗ．Ｄ．（１９９６）
、ＤＮＡ修復機構、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ、２２７７頁〜２２９４頁、ＡＳＭ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎを参照のこ
と）。そのような菌株は当業者には十分に知られている。そのような菌株の使用
が、例えば、Ｇｒｅｅｎｅｒ，Ａ．およびＣａｌｌａｈａｎ，Ｍ．（１９９４）
、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、７：３２〜３４に例示されている。変異させたＤＮＡ
分子を植物に移すことが、好ましくは、微生物における選抜および試験の後に行
われる。トランスジェニック植物が、本明細書の実施例に含まれる様々な実施例
に従って作製される。
【０１６１】
実施例１３
大腸菌とコリネバクテリウム・グルタミクムとの間でのＤＮＡ移動
コリネバクテリウムおよびブレビバクテリウムのいくつかの種は、自律的に複
製する内因性プラスミド（例えば、ｐＨＭ１５１９またはｐＢＬ１のようなプラ
スミド）を含有する（総説については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｆ．ら（１
９８７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５：１３７〜１４６を参照のこと）。
大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミクムに対するシャトルベクターを、
コリネバクテリウム・グルタミクムに対する複製起点およびコリネバクテリウム
・グルタミクムに由来する好適なマーカーが加えられている大腸菌用の標準的な
ベクターを使用することによって容易に構築することができる（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．ら（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９
４）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）。そのような複製起点は、
好ましくは、コリネバクテリウムおよびブレビバクテリウムの種から単離された
内因性プラスミドから得られる。これらの種に対する形質転換マーカーとして特
に有用なマーカーは、カナマイシン耐性遺伝子（Ｔｎ５またはＴｎ９０３のトラ
ンスポゾンに由来するカナマイシン耐性遺伝子など）またはクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子である（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．（１９８７）、Ｆｒｏｍ
Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。大腸菌およびＣ．ｇｌ
ｕｔａｍｉｃｕｍの両方で複製し、そして遺伝子の過剰発現を含むいくつかの目
的のために使用することができる広範囲のシャトルベクターを構築する文献には
多数の例がある（参考については、例えば、Ｙｏｓｈｉｈａｍａ，Ｍ．ら（１９
８５）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：５９１〜５９７；Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ
．Ｆ．ら（１９８７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５：１３７〜１４６；Ｅ
ｉｋｍａｎｎｓ，Ｂ．Ｊ．ら（１９９１）、Ｇｅｎｅ、１０２：９３〜９８を参
照のこと）。
製する内因性プラスミド（例えば、ｐＨＭ１５１９またはｐＢＬ１のようなプラ
スミド）を含有する（総説については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｆ．ら（１
９８７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５：１３７〜１４６を参照のこと）。
大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミクムに対するシャトルベクターを、
コリネバクテリウム・グルタミクムに対する複製起点およびコリネバクテリウム
・グルタミクムに由来する好適なマーカーが加えられている大腸菌用の標準的な
ベクターを使用することによって容易に構築することができる（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．ら（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９
４）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）。そのような複製起点は、
好ましくは、コリネバクテリウムおよびブレビバクテリウムの種から単離された
内因性プラスミドから得られる。これらの種に対する形質転換マーカーとして特
に有用なマーカーは、カナマイシン耐性遺伝子（Ｔｎ５またはＴｎ９０３のトラ
ンスポゾンに由来するカナマイシン耐性遺伝子など）またはクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子である（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．（１９８７）、Ｆｒｏｍ
Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。大腸菌およびＣ．ｇｌ
ｕｔａｍｉｃｕｍの両方で複製し、そして遺伝子の過剰発現を含むいくつかの目
的のために使用することができる広範囲のシャトルベクターを構築する文献には
多数の例がある（参考については、例えば、Ｙｏｓｈｉｈａｍａ，Ｍ．ら（１９
８５）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：５９１〜５９７；Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ
．Ｆ．ら（１９８７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５：１３７〜１４６；Ｅ
ｉｋｍａｎｎｓ，Ｂ．Ｊ．ら（１９９１）、Ｇｅｎｅ、１０２：９３〜９８を参
照のこと）。
【０１６２】
標準的な技術を使用して、目的の遺伝子を上記に記載されるシャトルベクター
の１つにクローン化して、そのようなハイブリッドベクターをコリネバクテリウ
ム・グルタミクムの様々な菌株に導入することが可能である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍの形質転換を、プロトプラスト形質転換（Ｋａｔｓｕｍａｔａ，Ｒ．ら
（１９８４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９３０６〜３１１）、エレクトロ
ポレーション（Ｌｉｅｂｌ，Ｅ．ら（１９８９）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｌｅｔｔｅｓ、５３：３９９〜３０３）によって達成することができ、そし
て特別なベクターが使用される場合には、（例えば、Ｓｃｈａｆｅｒ，Ａ．ら（
１９９０）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１６６３〜１６６６に記載され
るように）接合によっても達成することができる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍか
らプラスミドＤＮＡを（この分野で十分に知られている標準的な方法を使用して
）調製し、それを大腸菌に形質転換することによってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
用のシャトルベクターを大腸菌に移すことができる。この形質転換工程は、標準
的な方法を使用して行うことができるが、ＮＭ５２２などのＭｃｒ欠損の大腸菌
株を使用することが好都合である（Ｇｏｕｇｈ＆Ｍｕｒｒａｙ（１９８３）、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：１〜１９）。
の１つにクローン化して、そのようなハイブリッドベクターをコリネバクテリウ
ム・グルタミクムの様々な菌株に導入することが可能である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍの形質転換を、プロトプラスト形質転換（Ｋａｔｓｕｍａｔａ，Ｒ．ら
（１９８４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９３０６〜３１１）、エレクトロ
ポレーション（Ｌｉｅｂｌ，Ｅ．ら（１９８９）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｌｅｔｔｅｓ、５３：３９９〜３０３）によって達成することができ、そし
て特別なベクターが使用される場合には、（例えば、Ｓｃｈａｆｅｒ，Ａ．ら（
１９９０）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１６６３〜１６６６に記載され
るように）接合によっても達成することができる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍか
らプラスミドＤＮＡを（この分野で十分に知られている標準的な方法を使用して
）調製し、それを大腸菌に形質転換することによってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
用のシャトルベクターを大腸菌に移すことができる。この形質転換工程は、標準
的な方法を使用して行うことができるが、ＮＭ５２２などのＭｃｒ欠損の大腸菌
株を使用することが好都合である（Ｇｏｕｇｈ＆Ｍｕｒｒａｙ（１９８３）、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：１〜１９）。
【０１６３】
実施例１４
形質転換された生物における組換え遺伝子産物の発現の評価
形質転換された宿主生物における組換え遺伝子産物の活性は転写レベルおよび
／または翻訳レベルで調べられている。遺伝子の転写レベル（遺伝子産物の翻訳
に利用され得るｍＲＮＡの量の指標）を確認するために有用な方法は、ノーザン
ブロット（参考について、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８８）、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉ
ｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）を行うことである。この場合、目的の
遺伝子に結合するように設計されたプライマーが、（通常的には放射能または化
学発光性の）検出可能な標識で標識されており、その結果、生物の培養物の総Ｒ
ＮＡが抽出され、ゲルで泳動され、安定なマトリックスに移され、そしてこのプ
ローブとともにインキュベーションされたときに、プローブの結合および結合量
がこの遺伝子に対するｍＲＮＡの存在を示し、そしてまたその量を示す。この情
報により、形質転換された遺伝子の転写の程度が明らかにされる。総細胞ＲＮＡ
を、Ｂｏｒｍａｎｎ，Ｅ．Ｒ．（１９９２）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６
：３１７〜３２６に記載される方法などのいくつかの方法（すべてこの分野では
十分に知られている）によって、細胞、組織または器官から調製することができ
る。
／または翻訳レベルで調べられている。遺伝子の転写レベル（遺伝子産物の翻訳
に利用され得るｍＲＮＡの量の指標）を確認するために有用な方法は、ノーザン
ブロット（参考について、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８８）、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉ
ｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）を行うことである。この場合、目的の
遺伝子に結合するように設計されたプライマーが、（通常的には放射能または化
学発光性の）検出可能な標識で標識されており、その結果、生物の培養物の総Ｒ
ＮＡが抽出され、ゲルで泳動され、安定なマトリックスに移され、そしてこのプ
ローブとともにインキュベーションされたときに、プローブの結合および結合量
がこの遺伝子に対するｍＲＮＡの存在を示し、そしてまたその量を示す。この情
報により、形質転換された遺伝子の転写の程度が明らかにされる。総細胞ＲＮＡ
を、Ｂｏｒｍａｎｎ，Ｅ．Ｒ．（１９９２）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６
：３１７〜３２６に記載される方法などのいくつかの方法（すべてこの分野では
十分に知られている）によって、細胞、組織または器官から調製することができ
る。
【０１６４】
このｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の存在または相対的な量を評価するた
めに、ウエスタンブロットなどの標準的な技術を用いることができる（例えば、
Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照の
こと）。この方法では、総細胞タンパク質が抽出され、ゲル電気泳動によって分
離され、ニトロセルロースなどのマトリックスに移され、そして所望するタンパ
ク質に特異的に結合するプローブ（抗体など）とともにインキュベーションされ
る。このようなプローブは、一般に、容易に検出され得る化学発光性の標識また
は比色測定用の標識で標識される。観測された標識の存在および量により、細胞
に存在する所望する変異タンパク質の存在および量が示される。
めに、ウエスタンブロットなどの標準的な技術を用いることができる（例えば、
Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照の
こと）。この方法では、総細胞タンパク質が抽出され、ゲル電気泳動によって分
離され、ニトロセルロースなどのマトリックスに移され、そして所望するタンパ
ク質に特異的に結合するプローブ（抗体など）とともにインキュベーションされ
る。このようなプローブは、一般に、容易に検出され得る化学発光性の標識また
は比色測定用の標識で標識される。観測された標識の存在および量により、細胞
に存在する所望する変異タンパク質の存在および量が示される。
【０１６５】
実施例１５
遺伝子的に改変されたコリネバクテリウム・グルタミクムの増殖
培地および培養条件
遺伝子的に改変されたコリネバクテリウムは合成増殖培地または天然増殖培地
で培養される。コリネバクテリウムに対する多数の異なる増殖培地が十分に知ら
れており、そしてまた容易に利用することができる（Ｌｉｅｂら（１９８９）、
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２：２０５〜２１
０；ｖｏｎ ｄｅｒ Ｏｓｔｅｎら（１９９８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、１１：１１〜１６；ドイツ国特許ＤＥ４，１２０，８６７；
Ｌｉｅｂ（１９９２）、「コリネバクテリウム属」、Ｔｈｅ Ｐｒｏｃａｒｙｏ
ｔｅｓ、第ＩＩ巻、Ｂａｌｏｗｓ，Ａ．ら編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
）。これらの培地は、１つまたは２つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン
および微量元素からなる。好ましい炭素源は、単糖、二糖または多糖などの糖で
ある。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボー
ス、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノ
ース、デンプンまたはセルロースが非常に良好な炭素源として役に立つ。糖精製
から得られる糖蜜または他の副生成物などの複雑な化合物によって糖を培地に供
給することもまた可能である。種々の炭素源の混合物を供給することもまた好都
合であり得る。他の可能な炭素源はアルコールおよび有機酸であり、例えば、メ
タノール、エタノール、酢酸または乳酸などである。窒素源は、通常、有機また
は無機の窒素化合物、あるいはこれらの化合物を含む物質である。例示的な窒素
源には、アンモニアガスまたはアンモニア塩（ＮＨ４Ｃｌまたは（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４など）、ＮＨ４ＯＨ、硝酸塩、尿素、アミノ酸または複雑な窒素源（コーン
スチープリカー、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母抽出物、肉抽出物など）が
含まれる。
で培養される。コリネバクテリウムに対する多数の異なる増殖培地が十分に知ら
れており、そしてまた容易に利用することができる（Ｌｉｅｂら（１９８９）、
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２：２０５〜２１
０；ｖｏｎ ｄｅｒ Ｏｓｔｅｎら（１９９８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、１１：１１〜１６；ドイツ国特許ＤＥ４，１２０，８６７；
Ｌｉｅｂ（１９９２）、「コリネバクテリウム属」、Ｔｈｅ Ｐｒｏｃａｒｙｏ
ｔｅｓ、第ＩＩ巻、Ｂａｌｏｗｓ，Ａ．ら編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
）。これらの培地は、１つまたは２つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン
および微量元素からなる。好ましい炭素源は、単糖、二糖または多糖などの糖で
ある。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボー
ス、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノ
ース、デンプンまたはセルロースが非常に良好な炭素源として役に立つ。糖精製
から得られる糖蜜または他の副生成物などの複雑な化合物によって糖を培地に供
給することもまた可能である。種々の炭素源の混合物を供給することもまた好都
合であり得る。他の可能な炭素源はアルコールおよび有機酸であり、例えば、メ
タノール、エタノール、酢酸または乳酸などである。窒素源は、通常、有機また
は無機の窒素化合物、あるいはこれらの化合物を含む物質である。例示的な窒素
源には、アンモニアガスまたはアンモニア塩（ＮＨ４Ｃｌまたは（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４など）、ＮＨ４ＯＨ、硝酸塩、尿素、アミノ酸または複雑な窒素源（コーン
スチープリカー、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母抽出物、肉抽出物など）が
含まれる。
【０１６６】
培地に含まれ得る無機塩化合物には、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム
、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物塩、
リン酸塩または硫酸塩が含まれる。キレート化化合物を、金属イオンを溶液中に
保つために培地に加えることができる。特に有用なキレート化化合物には、カテ
コールまたはプロトカテク酸塩のようなジヒドロキシフェノール、あるいはクエ
ン酸などの有機酸が含まれる。ビタミンまたは増殖促進因子などの他の増殖因子
を含有することもまた培地には典型的である。それらの例には、ビオチン、リボ
フラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンが含
まれる。増殖因子および塩は、多くの場合、酵母抽出物、糖蜜およびコーンスチ
ープリカーなどの複雑な培地成分に由来する。これらの培地化合物の正確な組成
は直接的な実験に強く依存し、そしてそれぞれの具体的な場合について個々に決
定される。培地の最適化に関する情報は書籍「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（
編者：Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ、Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ
（１９９７）、５３頁〜７３頁、ＩＳＢＮ０−１９−９６３５７７−３）におい
て得ることができる。スタンダード１（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（グレインハ
ート滲出物、ＤＩＦＣ）などのような、市販供給者から得られる増殖培地を選択
することもまた可能である。
、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物塩、
リン酸塩または硫酸塩が含まれる。キレート化化合物を、金属イオンを溶液中に
保つために培地に加えることができる。特に有用なキレート化化合物には、カテ
コールまたはプロトカテク酸塩のようなジヒドロキシフェノール、あるいはクエ
ン酸などの有機酸が含まれる。ビタミンまたは増殖促進因子などの他の増殖因子
を含有することもまた培地には典型的である。それらの例には、ビオチン、リボ
フラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンが含
まれる。増殖因子および塩は、多くの場合、酵母抽出物、糖蜜およびコーンスチ
ープリカーなどの複雑な培地成分に由来する。これらの培地化合物の正確な組成
は直接的な実験に強く依存し、そしてそれぞれの具体的な場合について個々に決
定される。培地の最適化に関する情報は書籍「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（
編者：Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ、Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ
（１９９７）、５３頁〜７３頁、ＩＳＢＮ０−１９−９６３５７７−３）におい
て得ることができる。スタンダード１（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（グレインハ
ート滲出物、ＤＩＦＣ）などのような、市販供給者から得られる増殖培地を選択
することもまた可能である。
【０１６７】
すべての培地成分は、加熱（１．５ｂａｒおよび１２１℃で２０分間）または
滅菌ろ過のいずれかで滅菌される。成分は一緒に滅菌することができ、または必
要な場合には別個に滅菌することができる。すべての培地成分を増殖の開始時に
存在させることができ、あるいは必要に応じて連続的または回分式に添加するこ
とができる。
滅菌ろ過のいずれかで滅菌される。成分は一緒に滅菌することができ、または必
要な場合には別個に滅菌することができる。すべての培地成分を増殖の開始時に
存在させることができ、あるいは必要に応じて連続的または回分式に添加するこ
とができる。
【０１６８】
培養条件は、それぞれの実験について別個に定義される。温度は１５℃〜４５
℃の範囲にしなければならない。温度は一定に保つことができ、または実験の途
中で変化させることができる。培地のｐＨは、５〜８．５の範囲（好ましくは約
７）にしなければならず、緩衝剤を培地に加えることによって維持することがで
きる。この目的に対する例示的な緩衝剤には、リン酸カリウム緩衝液が挙げられ
る。ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳおよびその他などの合成緩衝剤が代わりに
使用され得るか、または同時に使用され得る。ＮａＯＨまたはＮＨ４ＯＨを増殖
時に添加することによって一定の培養ｐＨを維持することもまた可能である。酵
母抽出物などの複雑な培地成分が利用される場合、多くの複雑な化合物は大きな
緩衝能を有するという事実のために、さらなる緩衝剤の必要性が低下し得る。発
酵装置が微生物を培養するために利用される場合、ｐＨは、ガス状のアンモニア
を使用して制御することもできる。
℃の範囲にしなければならない。温度は一定に保つことができ、または実験の途
中で変化させることができる。培地のｐＨは、５〜８．５の範囲（好ましくは約
７）にしなければならず、緩衝剤を培地に加えることによって維持することがで
きる。この目的に対する例示的な緩衝剤には、リン酸カリウム緩衝液が挙げられ
る。ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳおよびその他などの合成緩衝剤が代わりに
使用され得るか、または同時に使用され得る。ＮａＯＨまたはＮＨ４ＯＨを増殖
時に添加することによって一定の培養ｐＨを維持することもまた可能である。酵
母抽出物などの複雑な培地成分が利用される場合、多くの複雑な化合物は大きな
緩衝能を有するという事実のために、さらなる緩衝剤の必要性が低下し得る。発
酵装置が微生物を培養するために利用される場合、ｐＨは、ガス状のアンモニア
を使用して制御することもできる。
【０１６９】
インキュベーション時間は、通常、数時間〜数日間の範囲である。この時間は
、生成物の最大量を培養液中に蓄積させるために選択することができる。開示さ
れた増殖実験を、種々のサイズのマイクロタイタープレート、カラス管、ガラス
フラスコ、あるいはガラス製または金属製の発酵糟などの様々な容器で行うこと
ができる。非常に多くのクローンをスクリーニングする場合、微生物はマイクロ
タイタープレート、ガラス管または振とうフラスコ（バッフル付きまたはバッフ
ルなしのいずれか）で培養されるはずである。好ましくは、１００ｍｌの振とう
フラスコが、１０％（容量比）の必要な増殖培地が充填されて使用される。フラ
スコは、１００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍの速度範囲を使用して回転式振とう機（振
幅：２５ｍｍ）で振とうされるはずである。蒸発損失は、湿った雰囲気を維持す
ることによって減らすことができ、あるいは、蒸発損失に対する数学的補正が行
われるはずである。
、生成物の最大量を培養液中に蓄積させるために選択することができる。開示さ
れた増殖実験を、種々のサイズのマイクロタイタープレート、カラス管、ガラス
フラスコ、あるいはガラス製または金属製の発酵糟などの様々な容器で行うこと
ができる。非常に多くのクローンをスクリーニングする場合、微生物はマイクロ
タイタープレート、ガラス管または振とうフラスコ（バッフル付きまたはバッフ
ルなしのいずれか）で培養されるはずである。好ましくは、１００ｍｌの振とう
フラスコが、１０％（容量比）の必要な増殖培地が充填されて使用される。フラ
スコは、１００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍの速度範囲を使用して回転式振とう機（振
幅：２５ｍｍ）で振とうされるはずである。蒸発損失は、湿った雰囲気を維持す
ることによって減らすことができ、あるいは、蒸発損失に対する数学的補正が行
われるはずである。
【０１７０】
遺伝子的に改変されたクローンが試験される場合、改変されていないコントロ
ールクローン、またはインサートを全く有しない基本プラスミドを含有するコン
トロールクローンもまた使用されるはずである。培地は、３０℃でインキュベー
ションされたＣＭ平板（１０ｇ／ｌのグルコース、２．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２
ｇ／ｌの尿素、１０ｇ／ｌのポリペプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌの
肉抽出物、２２ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌの尿素、１０ｇ／ｌのポリペプトン
、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌの肉抽出物、２２ｇ／ｌの寒天、２ＭのＮａ
ＯＨでｐＨ６．８）などの寒天平板で生育させた細胞を使用して０．５〜１．５
のＯＤ６００に接種される。培地の接種は、ＣＭ平板からＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ細胞の生理食塩水懸濁物を導入するか、またはこの細菌の液体の前培養物を
添加することのいずれかによって行われる。
ールクローン、またはインサートを全く有しない基本プラスミドを含有するコン
トロールクローンもまた使用されるはずである。培地は、３０℃でインキュベー
ションされたＣＭ平板（１０ｇ／ｌのグルコース、２．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２
ｇ／ｌの尿素、１０ｇ／ｌのポリペプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌの
肉抽出物、２２ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌの尿素、１０ｇ／ｌのポリペプトン
、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌの肉抽出物、２２ｇ／ｌの寒天、２ＭのＮａ
ＯＨでｐＨ６．８）などの寒天平板で生育させた細胞を使用して０．５〜１．５
のＯＤ６００に接種される。培地の接種は、ＣＭ平板からＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ細胞の生理食塩水懸濁物を導入するか、またはこの細菌の液体の前培養物を
添加することのいずれかによって行われる。
【０１７１】
実施例１６
トランスジェニック生物におけるフィスコミトレラ・パテンス遺伝子の機能の
インビトロ分析 酵素の活性および速度論的パラメーターの測定はこの分野では十分に確立され
ている。任意の所与の変化した酵素の活性を測定する実験は野性型酵素の比活性
に合わせなければならないが、これは当業者の能力の範囲に十分に含まれる。酵
素に関する一般的な概要、ならびに、多くの酵素の活性を測定するための構造、
速度論、原理、方法、応用および例に関する具体的な詳細を、例えば、下記の参
考文献に見出すことができる：Ｄｉｘｏｎ，Ｍ．およびＷｅｂｂ，Ｅ．Ｃ．（１
９７９）、Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｌｏｎｇｍａｎｓ；Ｌｏｎｄｏｎ；Ｆｅｒｓｈｔ（
１９８５）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
、Ｆｒｅｅｍａｎ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗａｌｓｈ（１９７９）、Ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、Ｆｒｅｅｍａｎ：Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｐｒｉｃｅ，Ｎ．Ｃ．、Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｌ．（１９８２
）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．編（１９８３）、
Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ；Ｂｉｓｓｗａｎｇｅｒ，Ｈ．（１９９４）、Ｅｎｚｙｍｋｉｎｅｔｉｋ
、第２版、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（ＩＳＢＮ３５２７３００３２５）；Ｂｅ
ｒｇｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｕ．、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｊ．、Ｇｒａβｌ，Ｍ．編（
１９８３〜１９８６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ、第３版、Ｉ巻〜ＸＩＩ巻、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ：Ｗｅｉｎｈ
ｅｉｍ；Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７）、Ａ９巻、Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＶＣＨ
：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、３５３頁〜３６２頁。
インビトロ分析 酵素の活性および速度論的パラメーターの測定はこの分野では十分に確立され
ている。任意の所与の変化した酵素の活性を測定する実験は野性型酵素の比活性
に合わせなければならないが、これは当業者の能力の範囲に十分に含まれる。酵
素に関する一般的な概要、ならびに、多くの酵素の活性を測定するための構造、
速度論、原理、方法、応用および例に関する具体的な詳細を、例えば、下記の参
考文献に見出すことができる：Ｄｉｘｏｎ，Ｍ．およびＷｅｂｂ，Ｅ．Ｃ．（１
９７９）、Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｌｏｎｇｍａｎｓ；Ｌｏｎｄｏｎ；Ｆｅｒｓｈｔ（
１９８５）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
、Ｆｒｅｅｍａｎ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗａｌｓｈ（１９７９）、Ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、Ｆｒｅｅｍａｎ：Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｐｒｉｃｅ，Ｎ．Ｃ．、Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｌ．（１９８２
）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．編（１９８３）、
Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ；Ｂｉｓｓｗａｎｇｅｒ，Ｈ．（１９９４）、Ｅｎｚｙｍｋｉｎｅｔｉｋ
、第２版、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（ＩＳＢＮ３５２７３００３２５）；Ｂｅ
ｒｇｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｕ．、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｊ．、Ｇｒａβｌ，Ｍ．編（
１９８３〜１９８６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ、第３版、Ｉ巻〜ＸＩＩ巻、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ：Ｗｅｉｎｈ
ｅｉｍ；Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７）、Ａ９巻、Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＶＣＨ
：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、３５３頁〜３６２頁。
【０１７２】
ＤＮＡに結合するタンパク質の活性は、ＤＮＡバンドシフトアッセイ（ゲル遅
延アッセイとも呼ばれる）などのいくつかのよく確立された方法で測定すること
ができる。他の分子の発現に対するそのようなタンパク質の作用を、（Ｋｏｌｍ
ｅｒ，Ｈ．（１９９５）、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：３８９５〜３９０４およびそれ
に引用されている参考文献に記載されるアッセイなどの）レポーター遺伝子アッ
セイを使用して測定することができる。レポーター遺伝子試験システムは十分に
知られており、そしてβ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質およびその他
などの酵素を使用して原核生物細胞および真核生物細胞の両方において適用する
ために確立されている。
延アッセイとも呼ばれる）などのいくつかのよく確立された方法で測定すること
ができる。他の分子の発現に対するそのようなタンパク質の作用を、（Ｋｏｌｍ
ｅｒ，Ｈ．（１９９５）、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：３８９５〜３９０４およびそれ
に引用されている参考文献に記載されるアッセイなどの）レポーター遺伝子アッ
セイを使用して測定することができる。レポーター遺伝子試験システムは十分に
知られており、そしてβ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質およびその他
などの酵素を使用して原核生物細胞および真核生物細胞の両方において適用する
ために確立されている。
【０１７３】
膜輸送タンパク質の活性測定を、Ｇｅｎｎｉｓ，Ｒ．Ｂ．（１９８９）、ポア
、チャンネルおよび輸送体、Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｈｅｉｄ
ｅｌｂｅｒｇ、８５頁〜１３７頁、１９９頁〜２３４頁および２７０頁〜３２２
頁に記載される技術などの技術に従って行うことができる。
、チャンネルおよび輸送体、Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｈｅｉｄ
ｅｌｂｅｒｇ、８５頁〜１３７頁、１９９頁〜２３４頁および２７０頁〜３２２
頁に記載される技術などの技術に従って行うことができる。
【０１７４】
実施例１７
所望する生成物の産生に対する組換えタンパク質の影響の分析
植物、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、菌類、コケ、藻類、繊毛虫類における遺伝
子改変の影響、または所望する化合物（脂肪酸など）の産生に対する影響を、改
変された微生物または植物を好適な条件（上記に記載される条件など）のもとで
生育させ、培地および／または細胞成分を所望する生成物（すなわち、脂質また
は脂肪酸）の増大した産生について分析することによって評価することができる
。そのような分析技術は当業者には十分に知られており、これには、分光法、薄
層クロマトグラフィー、様々な種類の染色法、酵素的方法および微生物学的方法
、ならびに高速液体クロマトグラフィーなどの分析的クロマトグラフィーが含ま
れる（例えば、Ｕｌｌｍａｎ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２巻、８９頁〜９０頁および４４３頁〜６１
３頁、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８５）；Ｆａｌｌｏｎ，Ａ．ら（１９８
７）、生化学におけるＨＰＬＣの適用、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、第１７巻；Ｒｅｈｍら（１９９３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、第３巻第ＩＩＩ章：生成物の回収および精製、４６９頁〜７１４頁、ＶＣＨ：
Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｅｌｔｅｒ，Ｐ．Ａ．ら（１９８８）、Ｂｉｏｓｅｐａｒ
ａｔｉｏｎｓ：ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｋｅｎｎｅ
ｄｙ，Ｊ．Ｆ．およびＣａｂｒａｌ，Ｊ．Ｍ．Ｓ．（１９９２）、Ｒｅｃｏｖｅ
ｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ
ｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｓｈａｅｉｗｉｔｚ，Ｊ．Ａ．
およびＨｅｎｒｙ，Ｊ．Ｄ．（１９８８）、生化学的分離、Ｕｌｍａｎｎ’ｓ、
Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、Ｂ３巻第１１章、１頁〜２７頁、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｄｅｃｈｏｗ，
Ｆ．Ｊ．（１９８９）、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏｙｅｓ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。
子改変の影響、または所望する化合物（脂肪酸など）の産生に対する影響を、改
変された微生物または植物を好適な条件（上記に記載される条件など）のもとで
生育させ、培地および／または細胞成分を所望する生成物（すなわち、脂質また
は脂肪酸）の増大した産生について分析することによって評価することができる
。そのような分析技術は当業者には十分に知られており、これには、分光法、薄
層クロマトグラフィー、様々な種類の染色法、酵素的方法および微生物学的方法
、ならびに高速液体クロマトグラフィーなどの分析的クロマトグラフィーが含ま
れる（例えば、Ｕｌｌｍａｎ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２巻、８９頁〜９０頁および４４３頁〜６１
３頁、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８５）；Ｆａｌｌｏｎ，Ａ．ら（１９８
７）、生化学におけるＨＰＬＣの適用、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、第１７巻；Ｒｅｈｍら（１９９３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、第３巻第ＩＩＩ章：生成物の回収および精製、４６９頁〜７１４頁、ＶＣＨ：
Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｅｌｔｅｒ，Ｐ．Ａ．ら（１９８８）、Ｂｉｏｓｅｐａｒ
ａｔｉｏｎｓ：ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｋｅｎｎｅ
ｄｙ，Ｊ．Ｆ．およびＣａｂｒａｌ，Ｊ．Ｍ．Ｓ．（１９９２）、Ｒｅｃｏｖｅ
ｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ
ｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｓｈａｅｉｗｉｔｚ，Ｊ．Ａ．
およびＨｅｎｒｙ，Ｊ．Ｄ．（１９８８）、生化学的分離、Ｕｌｍａｎｎ’ｓ、
Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、Ｂ３巻第１１章、１頁〜２７頁、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｄｅｃｈｏｗ，
Ｆ．Ｊ．（１９８９）、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏｙｅｓ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。
【０１７５】
上記に述べられた方法に加えて、植物の脂質は、Ｃａｈｏｏｎら（１９９９）
、ＰＮＡＳ、９６（２２）：１２９３５〜１２９４０およびＢｒｏｗｓｅら（１
９８６）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５２：１４１
〜１４５によって記載されているように植物材料から抽出される。脂質または脂
肪酸の定性的および定量的な分析が下記に記載されている：Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，
Ｗｉｌｌｉａｍ Ｗ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔｈｏｄｏ
ｌｏｇｙ、Ａｙｒ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ：Ｏｉｌｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｏｉｌｙ Ｐｒ
ｅｓｓ Ｌｉｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ；２）；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｗｉｌｌｉａ
ｍ Ｗ．、Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｌｉｐｉｄｓ．Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ−Ａｙｒ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ：Ｏｉｌｙ Ｐ
ｒｅｓｓ、１９８９（再版：１９９２年）−ＩＸ，３０７Ｓ．−（Ｏｉｌｙ Ｐ
ｒｅｓｓ Ｌｉｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ；１）；「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌ
ｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｏｘｆｏｒｄ：Ｐａｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ
、１（１９５２）〜１６（１９７７）ｕ．ｄ．Ｔ．：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ
ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｆａｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｌｉｐｉ
ｄｓ ＣＯＤＥＮ。
、ＰＮＡＳ、９６（２２）：１２９３５〜１２９４０およびＢｒｏｗｓｅら（１
９８６）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５２：１４１
〜１４５によって記載されているように植物材料から抽出される。脂質または脂
肪酸の定性的および定量的な分析が下記に記載されている：Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，
Ｗｉｌｌｉａｍ Ｗ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔｈｏｄｏ
ｌｏｇｙ、Ａｙｒ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ：Ｏｉｌｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｏｉｌｙ Ｐｒ
ｅｓｓ Ｌｉｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ；２）；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｗｉｌｌｉａ
ｍ Ｗ．、Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｌｉｐｉｄｓ．Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ−Ａｙｒ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ：Ｏｉｌｙ Ｐ
ｒｅｓｓ、１９８９（再版：１９９２年）−ＩＸ，３０７Ｓ．−（Ｏｉｌｙ Ｐ
ｒｅｓｓ Ｌｉｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ；１）；「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌ
ｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｏｘｆｏｒｄ：Ｐａｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ
、１（１９５２）〜１６（１９７７）ｕ．ｄ．Ｔ．：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ
ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｆａｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｌｉｐｉ
ｄｓ ＣＯＤＥＮ。
【０１７６】
発酵の最終生成物を測定することに加えて、所望する化合物の産生に利用され
る代謝経路の他の成分（中間体および副生成物など）を分析して、化合物の全体
的な産生効率を決定することもまた可能である。分析方法には、培地中の栄養物
レベルの測定（例えば、糖、炭化水素、窒素源、リン酸塩および他のイオン）、
バイオマス組成の測定、および生合成経路の共通した代謝物の産生の分析、およ
び発酵時に産生するガスの測定が含まれる。これらの測定に関する標準的な方法
が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐ．Ｍ．ＲｈｏｄｅｓおよびＰ．Ｆ．Ｓｔａ
ｎｂｕｒｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１０３頁〜１２９頁、１３１頁〜１６３頁
および１６５頁〜１９２頁（ＩＳＢＮ：０１９９６３５７７３）、そしてそれに
引用されている参考文献に概略されている。
る代謝経路の他の成分（中間体および副生成物など）を分析して、化合物の全体
的な産生効率を決定することもまた可能である。分析方法には、培地中の栄養物
レベルの測定（例えば、糖、炭化水素、窒素源、リン酸塩および他のイオン）、
バイオマス組成の測定、および生合成経路の共通した代謝物の産生の分析、およ
び発酵時に産生するガスの測定が含まれる。これらの測定に関する標準的な方法
が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐ．Ｍ．ＲｈｏｄｅｓおよびＰ．Ｆ．Ｓｔａ
ｎｂｕｒｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１０３頁〜１２９頁、１３１頁〜１６３頁
および１６５頁〜１９２頁（ＩＳＢＮ：０１９９６３５７７３）、そしてそれに
引用されている参考文献に概略されている。
【０１７７】
一例として、脂肪酸の分析が挙げられる（略号：ＦＡＭＥ、脂肪酸メチルエス
テル；ＧＣ−ＭＳ、気液クロマトグラフィー−質量分析；ＴＡＧ、トリアシルグ
リセロール；ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィー）。
テル；ＧＣ−ＭＳ、気液クロマトグラフィー−質量分析；ＴＡＧ、トリアシルグ
リセロール；ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィー）。
【０１７８】
脂肪酸生成物の存在について曖昧でない証拠を、Ｃｈｒｉｓｔｉｅおよびそれ
における参考文献（１９９７、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔｈ
ｏｄｏｌｏｇｙ−Ｆｏｕｒｓ編：Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、Ｏｉｌｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｄ
ｕｎｄｅｅ、１１９〜１６９；１９９８、気液クロマトグラフィー−質量分析に
よる方法、Ｌｉｐｉｄｓ、３３：３４３〜３５３）によって様々に記載されてい
るような標準的な分析手法（ＧＣ、ＧＣ−ＭＳまたはＴＬＣ）に従って組換え生
物を分析することによって得ることができる。
における参考文献（１９９７、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔｈ
ｏｄｏｌｏｇｙ−Ｆｏｕｒｓ編：Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、Ｏｉｌｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｄ
ｕｎｄｅｅ、１１９〜１６９；１９９８、気液クロマトグラフィー−質量分析に
よる方法、Ｌｉｐｉｄｓ、３３：３４３〜３５３）によって様々に記載されてい
るような標準的な分析手法（ＧＣ、ＧＣ−ＭＳまたはＴＬＣ）に従って組換え生
物を分析することによって得ることができる。
【０１７９】
分析される材料は、超音波処理、ガラス摩砕、液体窒素および粉砕によって、
あるいは他の適用可能な方法によって分解することができる。材料は分解後に遠
心分離しなければならない。沈殿物は水（Ａｑｕａ ｄｅｓｔ）に再懸濁され、
１００℃で１０分間加熱され、そして氷で冷却され、そして再び遠心分離され、
その後、２％ジメトキシプロパンを含有するメタノールにおける０．５Ｍ硫酸で
９０℃において１時間抽出され、これにより、加水分解された油脂化合物に導か
れ、その結果、トランスメチル化された脂質が得られる。これらの脂肪酸メチル
エステルは石油エーテルに抽出され、最終的には、１７０℃〜２４０℃の２０分
間にわたる温度勾配および２４０℃で５分間での、キャピラリーカラム（Ｃｈｒ
ｏｍｐａｃｋ、ＷＣＯＴ溶融シリカ、ＣＰ−Ｗａｘ−５２ＣＢ、２５ｍ、０．３
２ｍｍ）を使用するＧＣ分析に供される。得られる脂肪酸メチルエステルの正体
は、市販供給源（すなわち、Ｓｉｇｍａ）から入手可能な標準品を使用すること
によって明らかにされるにちがいない。
あるいは他の適用可能な方法によって分解することができる。材料は分解後に遠
心分離しなければならない。沈殿物は水（Ａｑｕａ ｄｅｓｔ）に再懸濁され、
１００℃で１０分間加熱され、そして氷で冷却され、そして再び遠心分離され、
その後、２％ジメトキシプロパンを含有するメタノールにおける０．５Ｍ硫酸で
９０℃において１時間抽出され、これにより、加水分解された油脂化合物に導か
れ、その結果、トランスメチル化された脂質が得られる。これらの脂肪酸メチル
エステルは石油エーテルに抽出され、最終的には、１７０℃〜２４０℃の２０分
間にわたる温度勾配および２４０℃で５分間での、キャピラリーカラム（Ｃｈｒ
ｏｍｐａｃｋ、ＷＣＯＴ溶融シリカ、ＣＰ−Ｗａｘ−５２ＣＢ、２５ｍ、０．３
２ｍｍ）を使用するＧＣ分析に供される。得られる脂肪酸メチルエステルの正体
は、市販供給源（すなわち、Ｓｉｇｍａ）から入手可能な標準品を使用すること
によって明らかにされるにちがいない。
【０１８０】
標準品が得られない脂肪酸の場合、分子的正体を、誘導体化およびその後のＧ
Ｃ−ＭＳ分析によって示さなければならない。例えば、三重結合脂肪酸の存在が
、４，４−ジメトキシオキサゾリン−Ｄｅｒｉｖａｔｅｎによる誘導体化の後（
Ｃｈｒｉｓｔｉｅ（１９９８）、上記を参照のこと）、ＧＣ−ＭＳによって示さ
れるにちがいない。
Ｃ−ＭＳ分析によって示さなければならない。例えば、三重結合脂肪酸の存在が
、４，４−ジメトキシオキサゾリン−Ｄｅｒｉｖａｔｅｎによる誘導体化の後（
Ｃｈｒｉｓｔｉｅ（１９９８）、上記を参照のこと）、ＧＣ−ＭＳによって示さ
れるにちがいない。
【０１８１】
実施例１８
形質転換された生物からの所望する生成物の精製
植物材料または菌類、コケ、藻類、繊毛虫類またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
細胞、あるいは上記に記載された培養物の上清からの所望する生成物の回収を、
この分野で十分に知られている様々な方法で行うことができる。所望する生成物
が細胞から分泌されない場合、細胞を低速遠心分離によって培養物から集めるこ
とができ、そして細胞を、機械的な力または超音波処理などの標準的な技術によ
って溶解することができる。植物の器官を他の組織または器官から機械的に分離
することができる。ホモジネーション後、細胞破片が遠心分離によって除かれ、
そして可溶性タンパク質を含有する上清画分が、所望する化合物のさらなる精製
のために保持される。生成物が所望する細胞から分泌される場合、細胞が低速遠
心分離によって培養物から分離され、上清画分がさらなる精製のために保持され
る。
細胞、あるいは上記に記載された培養物の上清からの所望する生成物の回収を、
この分野で十分に知られている様々な方法で行うことができる。所望する生成物
が細胞から分泌されない場合、細胞を低速遠心分離によって培養物から集めるこ
とができ、そして細胞を、機械的な力または超音波処理などの標準的な技術によ
って溶解することができる。植物の器官を他の組織または器官から機械的に分離
することができる。ホモジネーション後、細胞破片が遠心分離によって除かれ、
そして可溶性タンパク質を含有する上清画分が、所望する化合物のさらなる精製
のために保持される。生成物が所望する細胞から分泌される場合、細胞が低速遠
心分離によって培養物から分離され、上清画分がさらなる精製のために保持され
る。
【０１８２】
いずれかの精製方法に由来する上清画分は、所望する分子がクロマトグラフィ
ー樹脂に保持され、その一方で、サンプル中の多くの不純物が保持されず、また
は不純物が樹脂により保持され、その一方で、サンプルが保持されない好適な樹
脂を用いたクロマトグラフィーに供される。そのようなクロマトグラフィー工程
は、同じクロマトグラフィー樹脂または異なるクロマトグラフィー樹脂を使用し
て、必要な場合には繰り返すことができる。当業者は、精製される特定の分子に
ついて適切なクロマトグラフィー樹脂の選択およびその最も効果的な適用を十分
に熟知している。精製された生成物はろ過または限外ろ過によって濃縮すること
ができ、そして生成物の安定性が最大化される温度で保存することができる。
ー樹脂に保持され、その一方で、サンプル中の多くの不純物が保持されず、また
は不純物が樹脂により保持され、その一方で、サンプルが保持されない好適な樹
脂を用いたクロマトグラフィーに供される。そのようなクロマトグラフィー工程
は、同じクロマトグラフィー樹脂または異なるクロマトグラフィー樹脂を使用し
て、必要な場合には繰り返すことができる。当業者は、精製される特定の分子に
ついて適切なクロマトグラフィー樹脂の選択およびその最も効果的な適用を十分
に熟知している。精製された生成物はろ過または限外ろ過によって濃縮すること
ができ、そして生成物の安定性が最大化される温度で保存することができる。
【０１８３】
非常に様々な精製方法が当業者には知られており、前記の精製方法は限定であ
ることを意味しない。そのような精製技術は、例えば、Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．
＆Ｏｌｌｉｓ，Ｄ．Ｆ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
８９６）に記載されている。
ることを意味しない。そのような精製技術は、例えば、Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．
＆Ｏｌｌｉｓ，Ｄ．Ｆ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
８９６）に記載されている。
【０１８４】
単離された化合物の正体および純度は、この分野で標準的な技術によって評価
することができる。このような技術には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）、分光学的方法、染色法、薄層クロマトグラフィー、ＮＩＲＳ、酵素アッセ
イ、または微生物学的な方法が含まれる。そのような分析方法は下記に総説され
ている：Ｐａｔｅｋら（１９９４）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．６０：１３３〜１４０；Ｍａｌａｋｈｏｖａら（１９９６）、Ｂｉｏｔ
ｅｋｈｎｏｌｏｇｉｙａ、１１：２７〜３２；Ｓｃｈｍｉｄｔら（１９９８）、
Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ、１９：６７〜７０；Ｕｌｍａｎｎ’
ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ（１９９６）、Ａ２７巻、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、８９頁〜９０頁、５
２１頁〜５４０頁、５４０頁〜５４７頁、５５９頁〜５６６頁、５７５頁〜５８
１頁および５８１頁〜５８７頁；Ｍｉｃｈａｌ，Ｇ．（１９９９）、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｗａｙｓ：Ａｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｆａｌｌｏｎ，Ａ．ら（１９８７）、生化学におけるＨ
ＰＬＣの適用、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１７巻。
することができる。このような技術には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）、分光学的方法、染色法、薄層クロマトグラフィー、ＮＩＲＳ、酵素アッセ
イ、または微生物学的な方法が含まれる。そのような分析方法は下記に総説され
ている：Ｐａｔｅｋら（１９９４）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．６０：１３３〜１４０；Ｍａｌａｋｈｏｖａら（１９９６）、Ｂｉｏｔ
ｅｋｈｎｏｌｏｇｉｙａ、１１：２７〜３２；Ｓｃｈｍｉｄｔら（１９９８）、
Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ、１９：６７〜７０；Ｕｌｍａｎｎ’
ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ（１９９６）、Ａ２７巻、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、８９頁〜９０頁、５
２１頁〜５４０頁、５４０頁〜５４７頁、５５９頁〜５６６頁、５７５頁〜５８
１頁および５８１頁〜５８７頁；Ｍｉｃｈａｌ，Ｇ．（１９９９）、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｗａｙｓ：Ａｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｆａｌｌｏｎ，Ａ．ら（１９８７）、生化学におけるＨ
ＰＬＣの適用、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１７巻。
【０１８５】
実施例１９
作物植物におけるフィスコミトレラ遺伝子の発現
作物植物においてコケの遺伝子を発現させるために、発現カセットを実施例９
に従って作製しなければならない。過剰発現または同時抑制を得るために、個々
のコード配列（好ましくは最長のオープンリーディングフレーム、より好ましく
は開始コドンおよび停止コドンを含むオープンリーディングフレーム）がセンス
方向またはアンチセンス方向で高等植物に形質転換される。好適な発現ベクター
および形質転換システムについては実施例９〜１１を参照のこと。
に従って作製しなければならない。過剰発現または同時抑制を得るために、個々
のコード配列（好ましくは最長のオープンリーディングフレーム、より好ましく
は開始コドンおよび停止コドンを含むオープンリーディングフレーム）がセンス
方向またはアンチセンス方向で高等植物に形質転換される。好適な発現ベクター
および形質転換システムについては実施例９〜１１を参照のこと。
【０１８６】
ｃＤＮＡフラグメントを発現ベクターにクローン化するには２通りの方法があ
る。インサートのクローニング部位は、クローニング目的のために使用すること
ができ、あるいはクローン化するｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲおよび設計され
たＰＣＲプライマーの使用によって設計することができる。最長のオープンリー
ディングフレームの開始コドンおよび停止コドンは、表１Ｂに示されているよう
に決定され、そして好適なプライマーを定めるために使用することができる。好
適なオープンリーディングフレームの開始および停止コドンおよびフラグメント
長が表１に所与クローンについて例示されている。
る。インサートのクローニング部位は、クローニング目的のために使用すること
ができ、あるいはクローン化するｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲおよび設計され
たＰＣＲプライマーの使用によって設計することができる。最長のオープンリー
ディングフレームの開始コドンおよび停止コドンは、表１Ｂに示されているよう
に決定され、そして好適なプライマーを定めるために使用することができる。好
適なオープンリーディングフレームの開始および停止コドンおよびフラグメント
長が表１に所与クローンについて例示されている。
【０１８７】
下記には、このことが、フィスコミトレラ・パテンスに由来するホスファチダ
ートホスファターゼまたは略号ＰＡＰ（クローンエントリー番号ＰＰ００４０７
２１４０Ｒ）などの表１のコードｃＤＮＡ配列について例示され得る。これは、
その後、他のｃＤＮＡ配列に対して類似する方法で適用することができる。ＰＡ
ＰのｃＤＮＡクローンは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してクローン
ＰＰ００４０７２１４０Ｒから増幅される。フォワードプライマーは、ｃＤＮＡ
の５’末端に由来するＰＡＰ遺伝子のコード配列を含み、そしてＡＴＧコドンの
前の制限部位および翻訳最適化配列、ならびに下記のプライマーなどのＰＣＲプ
ライマーに含まれる１８個〜２４個のさらなるコード塩基対を含む： ５’−フォワードプライマー：ＧＧＴＡＣＣＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＣＧＧＡ
ＴＡＣＡＧＴＴＣＣＣ ３’−リバースプライマー：ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＴＴＴＡＣＡＧＡＣＡＴＡ
ＧＴＡＣＧＴＧＴ
ートホスファターゼまたは略号ＰＡＰ（クローンエントリー番号ＰＰ００４０７
２１４０Ｒ）などの表１のコードｃＤＮＡ配列について例示され得る。これは、
その後、他のｃＤＮＡ配列に対して類似する方法で適用することができる。ＰＡ
ＰのｃＤＮＡクローンは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してクローン
ＰＰ００４０７２１４０Ｒから増幅される。フォワードプライマーは、ｃＤＮＡ
の５’末端に由来するＰＡＰ遺伝子のコード配列を含み、そしてＡＴＧコドンの
前の制限部位および翻訳最適化配列、ならびに下記のプライマーなどのＰＣＲプ
ライマーに含まれる１８個〜２４個のさらなるコード塩基対を含む： ５’−フォワードプライマー：ＧＧＴＡＣＣＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＣＧＧＡ
ＴＡＣＡＧＴＴＣＣＣ ３’−リバースプライマー：ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＴＴＴＡＣＡＧＡＣＡＴＡ
ＧＴＡＣＧＴＧＴ
【０１８８】
ＰＣＲプライマーは、類似する方法で本発明のすべての他の遺伝子について設
計することができる。制限部位は変化させることができ、特定の遺伝子に基づい
て選ばなければならない。選ばれた制限モチーフが個々の遺伝子のコード領域内
に存在しないことを確実にしなければならない。このことは、小さくなったｃＤ
ＮＡフラグメントまたは短縮型ｃＤＮＡフラグメントを生じさせない制限酵素に
よる切断をＰＣＲ増幅後に可能にするために必要である。代わりの制限部位は、
例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に由来する部
位である。
計することができる。制限部位は変化させることができ、特定の遺伝子に基づい
て選ばなければならない。選ばれた制限モチーフが個々の遺伝子のコード領域内
に存在しないことを確実にしなければならない。このことは、小さくなったｃＤ
ＮＡフラグメントまたは短縮型ｃＤＮＡフラグメントを生じさせない制限酵素に
よる切断をＰＣＲ増幅後に可能にするために必要である。代わりの制限部位は、
例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に由来する部
位である。
【０１８９】
リバースプライマーは、停止コドン前の２１ヌクレオチドに対して相補的な配
列、停止コドン自体、および制限クローニング部位を含む。適用可能な場合には
、開始ＡＴＧコドンの前のＡｓｐ７１８部位および停止コドンの後のＢａｍＨＩ
部位が、設計されたプライマーの合成およびＰＣＲ産物のその後の制御されたク
ローニングのために使用される。所望する場合には、他の配列をＰＣＲプライマ
ーまたはクローニングカセットによって受け継ぐことができる。
列、停止コドン自体、および制限クローニング部位を含む。適用可能な場合には
、開始ＡＴＧコドンの前のＡｓｐ７１８部位および停止コドンの後のＢａｍＨＩ
部位が、設計されたプライマーの合成およびＰＣＲ産物のその後の制御されたク
ローニングのために使用される。所望する場合には、他の配列をＰＣＲプライマ
ーまたはクローニングカセットによって受け継ぐことができる。
【０１９０】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用するＰＣＲの後、得ら
れたフラグメントを、Ａｓｐ７１８／ＢａｍＨＩで消化されたｐＢＳＳＫ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ、米国）にクローン化する。誤りがＰＣＲ反応によって
導入されていないことを保証するために、クローン化された遺伝子のヌクレオチ
ド配列が確認される。
れたフラグメントを、Ａｓｐ７１８／ＢａｍＨＩで消化されたｐＢＳＳＫ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ、米国）にクローン化する。誤りがＰＣＲ反応によって
導入されていないことを保証するために、クローン化された遺伝子のヌクレオチ
ド配列が確認される。
【０１９１】
クローン化された配列を含むプラスミドはＡｓｐ７１８／ＢａｍＨＩで消化さ
れる。ｃＤＮＡ配列を含む得られたフラグメントをアガロースゲルから溶出して
、Ａｓｐ７１８／ＢａｍＨＩで消化されたベクターに連結する。ｃＤＮＡ配列を
ベクターに含む得られたプラスミドをアグロバクテリウムに形質転換する（実施
例９を参照のこと）。このアグロバクテリウムは、アラビドプシス・タリアナ、
アブラナまたは亜麻の植物を形質転換するために使用される。
れる。ｃＤＮＡ配列を含む得られたフラグメントをアガロースゲルから溶出して
、Ａｓｐ７１８／ＢａｍＨＩで消化されたベクターに連結する。ｃＤＮＡ配列を
ベクターに含む得られたプラスミドをアグロバクテリウムに形質転換する（実施
例９を参照のこと）。このアグロバクテリウムは、アラビドプシス・タリアナ、
アブラナまたは亜麻の植物を形質転換するために使用される。
【０１９２】
ホスファチダートホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．４）は、ホスファチダー
トの加水分解を触媒して、ｓｎ−１，２−ジアシルグリセロールおよび無機リン
酸を生じさせる。これは、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）が生成する際の重
要な段階である。ｓｎ−１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）はジアシルグ
リセロールアシルトランスフェラーゼによってｓｎ−３位がアシル化され、最終
的にはＴＡＧが生成する。
トの加水分解を触媒して、ｓｎ−１，２−ジアシルグリセロールおよび無機リン
酸を生じさせる。これは、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）が生成する際の重
要な段階である。ｓｎ−１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）はジアシルグ
リセロールアシルトランスフェラーゼによってｓｎ−３位がアシル化され、最終
的にはＴＡＧが生成する。
【０１９３】
様々な方法を使用して、植物材料からこの酵素活性を測定することができる。
植物に由来するホスファチダートホスファターゼ（ＰＡＰ）の特徴づけを、本発
明の記載に従ってトリグリセリドおよびオイルの総脂肪アシル組成を改変するた
めに使用することができる。高等植物における脂質含有量を改変するために、そ
して植物の発達プロセスおよび生理学（例えば、ストレス耐性）を変化させるた
めに、フィスコミトレラ・パテンス由来のＰＡＰが、アラビドプシス・タリアナ
、アブラナ、亜麻または他の作物植物、特に、実施例９〜１１に記載される植物
において発現させられる。酵素アッセイを使用して、コントロール植物、ならび
にセンス構築物およびアンチセンス構築物で形質転換された植物の様々な組織に
おけるＰＡＰ活性が測定される。葉の脂質が、そのグリセロ脂質の組成について
、Ｉａｔｒｏｓｃａｎ装置（Ｉａｔｒｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、東京、
日本）を使用するＦＩＤ検出を伴うガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）で分析される。コントロール植物およびトランスジェニック植
物の種子の脂質が、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールまたはリン
脂質のレベルにおける変化について調べられる。この目的のために、成熟した種
子から蒸留されたオイルが膵臓リパーゼによる消化に供される。膵臓リパーゼ（
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｗ．、ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｇ．、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６５（１）：１０７〜１１、１
９７６）は、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位から脂肪酸を切断するが、ｓｎ−２位
からは切断しない。従って、得られたモノグリセリドにおける脂肪酸は、ｓｎ−
２位における脂肪酸であると考えられる。消化生成物はＴＬＣプレートでクロマ
トグラフィー分離される。その後、クロマトグラフィー分離された生成物は溶出
され、脂肪酸メチルエステルとして分析される。さらに、ＰＡＰ酵素の活性は、
クロロホルム可溶性［３２Ｐ］ＰＡからの水溶性３２Ｐｉの放出に従うことによ
って測定される（Ｃａｒｍａｎ ＧＭおよびＬｉｎ ＹＰ（１９９１）、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９７、５４８〜５５３）。反応混合物は、１００
μｌの総容量において、５０ｍＭのＴｒｉｓマレイン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）
、０．１ｍＭのＰＡ、１ｍＭのトリトンＸ−１００、２ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、
１０ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび酵素を含む。酵素アッセイは３０℃
で３０分間行われる。
植物に由来するホスファチダートホスファターゼ（ＰＡＰ）の特徴づけを、本発
明の記載に従ってトリグリセリドおよびオイルの総脂肪アシル組成を改変するた
めに使用することができる。高等植物における脂質含有量を改変するために、そ
して植物の発達プロセスおよび生理学（例えば、ストレス耐性）を変化させるた
めに、フィスコミトレラ・パテンス由来のＰＡＰが、アラビドプシス・タリアナ
、アブラナ、亜麻または他の作物植物、特に、実施例９〜１１に記載される植物
において発現させられる。酵素アッセイを使用して、コントロール植物、ならび
にセンス構築物およびアンチセンス構築物で形質転換された植物の様々な組織に
おけるＰＡＰ活性が測定される。葉の脂質が、そのグリセロ脂質の組成について
、Ｉａｔｒｏｓｃａｎ装置（Ｉａｔｒｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、東京、
日本）を使用するＦＩＤ検出を伴うガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）で分析される。コントロール植物およびトランスジェニック植
物の種子の脂質が、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールまたはリン
脂質のレベルにおける変化について調べられる。この目的のために、成熟した種
子から蒸留されたオイルが膵臓リパーゼによる消化に供される。膵臓リパーゼ（
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｗ．、ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｇ．、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６５（１）：１０７〜１１、１
９７６）は、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位から脂肪酸を切断するが、ｓｎ−２位
からは切断しない。従って、得られたモノグリセリドにおける脂肪酸は、ｓｎ−
２位における脂肪酸であると考えられる。消化生成物はＴＬＣプレートでクロマ
トグラフィー分離される。その後、クロマトグラフィー分離された生成物は溶出
され、脂肪酸メチルエステルとして分析される。さらに、ＰＡＰ酵素の活性は、
クロロホルム可溶性［３２Ｐ］ＰＡからの水溶性３２Ｐｉの放出に従うことによ
って測定される（Ｃａｒｍａｎ ＧＭおよびＬｉｎ ＹＰ（１９９１）、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９７、５４８〜５５３）。反応混合物は、１００
μｌの総容量において、５０ｍＭのＴｒｉｓマレイン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）
、０．１ｍＭのＰＡ、１ｍＭのトリトンＸ−１００、２ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、
１０ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび酵素を含む。酵素アッセイは３０℃
で３０分間行われる。
【０１９４】
（均等論）
当業者は、日常的にすぎない実験を使用して、本明細書中に記載された本発明
の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはそのような均等物
を確認することができる。そのような均等物は、添付された請求項によって包含
されるものとする。
の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはそのような均等物
を確認することができる。そのような均等物は、添付された請求項によって包含
されるものとする。
【０１９５】
表１
Ａ：脂質代謝に関与するタンパク質および酵素、ならびに対応する部分核酸分
子のアクセション／エントリー番号。 Ｂ：脂質代謝に関与するタンパク質および酵素、ならびに対応する部分核酸ク
ローンに対する最長核酸クローンのクローンエントリー番号、ならびに対応する
部分核酸クローンを有しないさらなる最長クローンのクローンエントリー番号。
さらに、最長核酸クローンの総塩基対数ならびにオープンリーディングフレーム
および停止コドンの開始位置が示される。 付表Ａ：脂質代謝関連タンパク質（ＬＭＲＰ）をコードする核酸配列。 付表Ｂ：ＬＭＲＰポリペプチド配列。
子のアクセション／エントリー番号。 Ｂ：脂質代謝に関与するタンパク質および酵素、ならびに対応する部分核酸ク
ローンに対する最長核酸クローンのクローンエントリー番号、ならびに対応する
部分核酸クローンを有しないさらなる最長クローンのクローンエントリー番号。
さらに、最長核酸クローンの総塩基対数ならびにオープンリーディングフレーム
および停止コドンの開始位置が示される。 付表Ａ：脂質代謝関連タンパク質（ＬＭＲＰ）をコードする核酸配列。 付表Ｂ：ＬＭＲＰポリペプチド配列。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 14/415 Ｃ０７Ｋ 16/14
16/14 16/16
16/16 Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 Ｃ１２Ｐ 7/64
15/02 Ｃ１２Ｒ 1:13
Ｃ１２Ｐ 7/64 1:15
//(Ｃ１２Ｎ 1/21 1:91
Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ
Ｃ１２Ｒ 1:15）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｐ 7/64
Ｃ１２Ｒ 1:13）
(Ｃ１２Ｐ 7/64
Ｃ１２Ｒ 1:15）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 エールハルト，トーマス
ドイツ、67346、シュパイァ、マウルブロ
ナー、ホーフ、49
(72)発明者 ラインドル，アンドレアス
ドイツ、67134、ビルケンハイデ、アルベ
ルティネ−シェラー−シュトラーセ、21
(72)発明者 チルプス，ペトラ
ドイツ、68163、マンハイム、ラントタイ
ルシュトラーセ、12
(72)発明者 ビショフ，フリードリヒ
ドイツ、68163、マンハイム、アイヒェル
スハイマー、シュトラーセ、６
(72)発明者 フランク，マルクス
ドイツ、67061、ルートヴィッヒスハーフ
ェン、ゲオルク−ヘルヴェグ−シュトラー
セ、14
(72)発明者 フロイント，アネテ
ドイツ、67117、リムブルガーホーフ、レ
ーマーヴェーク、17ツェー
(72)発明者 ドゥヴェニッヒ，エルケ
ドイツ、79102、フライブルク、シュテル
ンヴァルトシュトラーセ、７
(72)発明者 シュミット，ラルフ−ミヒャエル
ドイツ、67489、キルヴァイラー、アム、
シュロスガルテン、９デー
(72)発明者 レスキ，ラルフ
ドイツ、79254、オベリート、アム、オス
ターバッハ、26
Ｆターム(参考） 2B030 AA07 AD08 CA06 CA17 CA19
CB03 CD03 CD07 CD09
4B024 AA03 AA05 BA80 CA04 DA01
DA06 DA11 EA01 EA04 GA11
GA14 HA11
4B064 AD88 AD90 AF27 CC03 CD06
CD09 DA10 DA20
4B065 AA01X AA22X AA24X AA57X
AA83X AA88X AA89Y AB01
BA02 BA03 BA23 CA13 CA23
CA24
4H045 AA10 AA20 BA09 BA54 CA30
DA89 EA01 EA20 FA73 FA74
Claims (53)
- 【請求項１】 コケに由来し、脂質代謝関連タンパク質（ＬＭＲＰ）をコー
ドする単離された核酸分子またはその一部分。 - 【請求項２】 コケがフィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒ
ｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）またはセラトドン・プルプレウス（Ｃｅｒａｔｏｄｏ
ｎ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）から選択される単離された核酸分子。 - 【請求項３】 前記核酸分子が、ファインケミカルの産生に関与するＬＭＲ
Ｐタンパク質をコードする、請求項１または２に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項４】 前記核酸分子が、脂肪酸または脂質の産生に関与するＬＭＲ
Ｐタンパク質をコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された核
酸分子。 - 【請求項５】 前記核酸分子が、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸または多不飽和
脂肪酸の産生に関与するＬＭＲＰタンパク質をコードする、請求項１〜４のいず
れか１項に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項６】 前記核酸分子が、膜貫通輸送を助けるＬＭＲＰタンパク質を
コードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項７】 コケに由来し、付表Ａに示される配列からなる群から選択さ
れる単離された核酸分子またはその一部分。 - 【請求項８】 付表Ｂに示される配列からなる群から選択されるポリペプチ
ド配列をコードする単離された核酸分子。 - 【請求項９】 付表Ｂに示される配列からなるアミノ酸配列の群から選択さ
れるポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする単離された核
酸分子。 - 【請求項１０】 付表Ａに示される配列からなる群から選択されるヌクレオ
チド配列に対する相同性が少なくとも５０％であるヌクレオチド配列を含む単離
された核酸分子またはその一部分。 - 【請求項１１】 付表Ａに示される配列からなる群から選択されるヌクレオ
チド配列を含む核酸の少なくとも１５ヌクレオチドのフラグメントを含む単離さ
れた核酸分子。 - 【請求項１２】 ストリンジェントな条件のもとで請求項１〜１１のいずれ
か１項に記載された核酸分子にハイブリダイゼーションする単離された核酸分子
。 - 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載された核酸分子また
はその一部分と、異種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む単
離された核酸分子。 - 【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれか１項に記載された核酸分子を含
むベクター。 - 【請求項１５】 発現ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
- 【請求項１６】 請求項１５に記載された発現ベクターで形質転換された宿
主細胞。 - 【請求項１７】 微生物である、請求項１６に記載の宿主細胞。
- 【請求項１８】 蘚類属または藻類属に属する、請求項１６に記載の宿主細
胞。 - 【請求項１９】 植物細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
- 【請求項２０】 前記核酸分子が発現することにより、前記細胞からのファ
インケミカルの産生が調節される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の宿
主細胞。 - 【請求項２１】 前記核酸分子が発現することにより、前記細胞からの脂肪
酸または脂質の産生が調節される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の宿
主細胞。 - 【請求項２２】 前記核酸分子が発現することにより、前記細胞からの多不
飽和脂肪酸の産生が調節される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の宿主
細胞。 - 【請求項２３】 前記多不飽和脂肪酸がアラキドン酸またはエイコサペンタ
エン酸である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞。 - 【請求項２４】 請求項１６〜２３のいずれか１項に記載された宿主細胞に
由来する子孫、種子または繁殖可能な細胞体。 - 【請求項２５】 請求項１６〜１９のいずれか１項に記載された宿主細胞を
適切な培養培地において培養し、これによりポリペプチドを産生させるポリペプ
チドの製造方法。 - 【請求項２６】 蘚類または藻類に由来する単離されたＬＭＲＰポリペプチ
ドまたはその一部分。 - 【請求項２７】 微生物または菌類に由来する単離されたＬＭＲＰポリペプ
チドまたはその一部分。 - 【請求項２８】 植物に由来する単離されたＬＭＲＰポリペプチドまたはそ
の一部分。 - 【請求項２９】 前記ポリペプチドがファインケミカルの産生に関与してい
る、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。 - 【請求項３０】 前記ポリペプチドが、膜貫通輸送を助けることに関与して
いる、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。 - 【請求項３１】 付表Ｂに示される配列からなる群から選択されるアミノ酸
配列を含む単離されたポリペプチド。 - 【請求項３２】 付表Ｂに示される配列からなる群から選択されるアミノ酸
配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体を含む単離されたポ
リペプチドまたはその一部分。 - 【請求項３３】 異種のアミノ酸配列をさらに含む、請求項２６〜３２のい
ずれかに記載の単離されたポリペプチド。 - 【請求項３４】 付表Ａに示される配列からなる群から選択される核酸に対
する相同性が少なくとも５０％であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によって
コードされる単離されたポリペプチド。 - 【請求項３５】 付表Ｂに示される配列からなる群から選択されるアミノ酸
配列に対する相同性が少なくとも５０％であるアミノ酸配列を含む単離されたポ
リペプチド。 - 【請求項３６】 請求項２６〜３５のいずれか１項に記載されたＬＭＲＰポ
リペプチドまたはその一部分に対して特異的に結合する抗体。 - 【請求項３７】 脂肪酸または脂質の合成に関与する他の核酸分子の同定お
よび／またはクローニングを行うか、あるいは他の細胞種または他の生物におけ
る膜輸送の支援に関与するためのプローブまたはプライマーとして使用される請
求項１〜１２のいずれか１項に記載された核酸分子、その一部分および／または
相補体を含む試験キット。 - 【請求項３８】 他の細胞種または生物における他のＬＭＲＰ分子またはそ
のフラグメントを同定および／または精製するための、請求項３６に記載された
ＬＭＲＰ抗体を含む試験キット。 - 【請求項３９】 請求項１４または１５に記載されたベクターを含有する細
胞を、ファインケミカルが産生されるように培養することを含む、ファインケミ
カルの製造方法。 - 【請求項４０】 前記培養物から前記ファインケミカルを回収する工程をさ
らに含む、請求項３９に記載の方法。 - 【請求項４１】 請求項１４または１５に記載されたベクターで前記細胞を
形質転換して、前記ベクターを含有する細胞を得る工程をさらに含む、請求項３
９または４０に記載の方法。 - 【請求項４２】 前記細胞が微生物である、請求項３９〜４１のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項４３】 前記細胞がコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に
属する、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項４４】 前記細胞が蘚類属または藻類属に属する、請求項３９〜４
１のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項４５】 前記細胞が植物細胞である、請求項３９〜４１のいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項４６】 前記核酸分子が前記ベクターから発現することにより、前
記ファインケミカルの産生が調節される、請求項３９〜４５のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項４７】 前記ファインケミカルが、脂質、飽和脂肪酸および不飽和
脂肪酸からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。 - 【請求項４８】 前記ファインケミカルが多不飽和脂肪酸である、請求項４
６に記載の方法。 - 【請求項４９】 前記アミノ酸が、アラキドン酸またはエイコサペンタエン
酸からなる群から得られる、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項５０】 請求項１〜１３のいずれか１項に記載された核酸分子を含
有することによってそのゲノムＤＮＡが変化している細胞を培養するファインケ
ミカルの製造方法。 - 【請求項５１】 請求項２６〜３５のいずれか１項に記載されたポリペプチ
ドを含有することによってその膜が変化している細胞を培養することを含む、請
求項５０に記載の方法。 - 【請求項５２】 請求項３９〜５１のいずれか１項に記載された方法によっ
て製造されるファインケミカル。 - 【請求項５３】 別のファインケミカルを製造するための、請求項５２に記
載されたファインケミカルまたは請求項２６〜３５のいずれか１項に記載された
ポリペプチドの使用法。
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