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JP2003512854A - Ａｘｏｒ３５、ｇ蛋白結合受容体 - Google Patents

Ａｘｏｒ３５、ｇ蛋白結合受容体

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JP2003512854A
JP2003512854A JP2001535055A JP2001535055A JP2003512854A JP 2003512854 A JP2003512854 A JP 2003512854A JP 2001535055 A JP2001535055 A JP 2001535055A JP 2001535055 A JP2001535055 A JP 2001535055A JP 2003512854 A JP2003512854 A JP 2003512854A
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polynucleotide
sequence
compound
axor35
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JP2001535055A
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ダーク・ジェイ・バーグスマ
ローラ・アール・フィッツジェラルド
トッド・エル・グレイビル
リ・シャオトン
デイビッド・ミカロビッチ
ドワイト・エム・モロー
ユアン・ジュ
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SmithKline Beecham Ltd
SmithKline Beecham Corp
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SmithKline Beecham Ltd
SmithKline Beecham Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 ＡＸＯＲ３５ポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびに組換え技術によりかかるポリペプチドを産生する方法を開示する。さらに、診断分析においてＡＸＯＲ３５ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連する出願） 本発明は、１９９９年１１月２日に提出された米国特許出願番号０９／４３１
８９８の一部継続出願である２０００年２月３日に提出された米国特許出願番号
０９／４９７７９０の一部継続出願であり、両出願は本発明の一部として参照さ
れる。
【０００２】 （技術分野） 本発明は、新しく同定されたポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドに関し、診断および療法において有用である可能性のある
化合物の同定におけるその使用、ならびにかかるポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドの産生法に関する。
【０００３】 （背景技術） 医薬開発プロセスは、「機能的ゲノム」、すなわち、高処理量ゲノムまたは遺
伝子ベースの生物学を包含するので、現在、根本的な変革を受けている。治療標
的として遺伝子および遺伝子産物を同定するための手段としてのこの方法は、「
位置的クローニング」に基づく初期の方法と急速に取って代わっている。生物学
的機能または遺伝子疾患である表現型は同定され、これは、その遺伝子地図の位
置に基づいて、その原因の遺伝子にさかのぼって追跡される。
【０００４】 機能的ゲノムは、高処理量ＤＮＡ配列決定技術、および現在利用可能な多くの
分子生物学データベースから潜在的に興味のある遺伝子配列を同定するための生
物学的情報のさまざまなツールにかなり依存する。医薬開発のための目的として
、さらなる遺伝子およびその関連するポリペプチド／蛋白を同定し、特徴づける
必要がある。 多くの医学的に重要な生物学的プロセスは、Ｇ蛋白および／またはセカンドメ
ッセンジャー、例えば、ｃＡＭＰが関与するシグナルトランスダクション経路に
関与する蛋白により媒介されることが確立されている（Lefkowitz, Nature, 199
1, 351:353-354）。本明細書において、これらの蛋白は、Ｇ蛋白またはＰＰＧ蛋
白とともに経路において関与する蛋白と称する。これらの蛋白のいくつかの例と
しては、ＧＰＣ受容体、例えば、アドレナリン作用薬およびドーパミンに関する
もの（Kobilka, B.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1987, 84:46-50;
Kobilka, B.K., et al., Science 1987, 238:650-656; Bunzow, J.R., et al.,
Nature, 1988, 336:783-787）、Ｇ蛋白そのもの、エフェクター・蛋白、例えば
、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ、およ
びアクチュエーター・蛋白、例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキ
ナーゼＣ（Simon, M.I., et al., Science, 1991, 252:802-8）が挙げられる。
【０００５】 例えば、シグナルトランスダクションの一つの形態において、ホルモン結合の
効果は、酵素であるアデニレートシクラーゼの細胞内部での活性化である。ホル
モンによる酵素活性化は、ヌクレオチド、ＧＴＰの存在に依存している。ＧＴＰ
は、ホルモン結合にも影響を及ぼす。Ｇ蛋白は、アデニレートシクラーゼに対す
るホルモン受容体と結合する。Ｇ蛋白は、ホルモン受容体により活性化された場
合に、ＧＴＰを結合型ＧＤＰと交換することが証明されている。ＧＴＰを有する
形態は活性化されたアデニレートシクラーゼと結合する。Ｇ蛋白それ自身により
触媒されるＧＴＰのＧＤＰへの加水分解は、Ｇ蛋白をそのもとの不活性形態に戻
す。このように、Ｇ蛋白は、シグナルを受容体からエフェクターに中継する中間
体として、およびシグナルの存続期間を制御する時計としての二重の役割を果た
す。
【０００６】 Ｇ蛋白結合受容体の膜蛋白遺伝子スーパーファミリーは、７個の推定貫膜領域
を有することを特徴とする。該領域は、細胞外ループまたは細胞質ループにより
連結された貫膜α−へリックスを表すと考えられている。Ｇ蛋白結合受容体は、
広範囲に及ぶ生物学的に活性な受容体、例えば、ホルモン受容体、ウイルス受容
体、成長因子受容体および神経受容体を包含する。
【０００７】 Ｇ蛋白結合受容体（７ＴＭ受容体とも称する）は、少なくとも８個の異なる親
水性ループを連結する、約２０ないし３０個のアミノ酸のこれらの７の保存的疎
水性鎖を含むことを特徴とする。結合受容体のＧ蛋白ファミリーは、精神病およ
び神経疾患を治療するために使用される神経弛緩薬と結合するドーパミン受容体
を包含する。このファミリーのメンバーの他の例としては、カルシトニン、アド
レナリン様、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン様、アセチルコ
リン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプ
シン、内皮分化遺伝子−１、ロドプシン、オドラント、およびサイトメガロウイ
ルス受容体が挙げられるが、これに限定されない。ほとんどのＧ蛋白結合受容体
は、機能的蛋白構造を安定化すると考えられているジスルフィド結合を形成する
最初の２つの細胞外ループのそれぞれにおいて単一の保存的システイン残基を有
する。７つの貫膜領域は、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、
およびＴＭ７と称する。ＴＭ３はシグナルトランスダクションに関与する。
【０００８】 システイン残基のリン酸化および脂質化（パルミチル化またはファルネシル化
）は、いくつかのＧ蛋白結合受容体のシグナルトランスダクションに影響を及ぼ
す可能性がある。ほとんどのＧ蛋白結合受容体は、第三の細胞質ループおよび／
またはカルボキシ末端に潜在的なリン酸化部位を含む。いくつかのＧ蛋白結合受
容体、例えば、β−アドレナリン受容体について、プロテインキナーゼＡおよび
／または特異的受容体キナーゼによるリン酸化が受容体の脱感作を媒介する。 いくつかの受容体については、Ｇ蛋白結合受容体のリガンド結合部位は、いく
つかのＧ蛋白結合受容体貫膜領域により形成された親水性ソケットを含み、該ソ
ケットは、Ｇ蛋白結合受容体の疎水性残基により囲まれていると考えられる。各
Ｇ蛋白結合受容体貫膜へリックスの親水性側は、内側に向き、極性リガンド結合
部位を形成すると仮定される。ＴＭ３は、リガンド結合部位、例えばＴＭ３アス
パラギン酸残基を有するので、いくつかのＧ蛋白結合受容体に関連する。ＴＭ５
セリン、ＴＭ６アスパラギンおよびＴＭ６またはＴＭ７フェニルアラニンまたは
チロシンもリガンド結合に関与する。
【０００９】 Ｇ蛋白結合受容体は、ヘテロトリマーＧ蛋白により、さまざまな細胞内酵素、
イオンチャンネルおよびトランスポーターと細胞内で結合し得る（Johnson et a
l., Endoc. Rev., 1989, 10:317-331）。異なるＧ蛋白α−サブユニットは、特
定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞におけるさまざまな生物学的機能を
調節する。Ｇ蛋白結合受容体の細胞質残基のリン酸化は、いくつかのＧ蛋白結合
受容体のＧ蛋白結合を調節する重要なメカニズムとして確認されている。Ｇ蛋白
結合受容体は、哺乳動物宿主内のさまざまな部位において見いだされる。 過去１５年にわたり、７貫膜（７ＴＭ）受容体を標的とする約３５０の治療薬
が市販されてきた。
【００１０】 （発明の開示） 本発明は、ＡＸＯＲ３５、特にＡＸＯＲ３５ポリペプチドおよびＡＸＯＲ３５
ポリヌクレオチド、組換え材料およびその産生法に関する。かかるポリペプチド
およびポリヌクレオチドは、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染症を包含
するが、これに限定されないある種の疾患、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に
より引き起こされる感染症；免疫不全症；移植片拒絶反応；胃腸管障害、例えば
、胃または十二指腸潰瘍、下痢、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性
大腸炎；過敏性腸症候群；嘔吐；炎症、例えば、掻痒およびアトピー性皮膚炎；
喘息、アレルギー性鼻炎を包含するアレルギーおよびアレルギー性障害；遅延型
過敏症、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、インシュリン依存性（Ｉ型）糖尿病
（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症、および強皮症を包含するがこれに限定されない自
己免疫疾患；泌尿器疾患、例えば、尿閉、尿失禁、間質性膀胱炎および良性前立
腺肥大；心血管疾患、例えば、狭心症、心筋梗塞、急性心不全、心筋虚血、鬱血
性心不全；低血圧；高血圧；肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患；咳；腎臓病、例
えば腎虚血、急性腎不全、および慢性腎不全；動脈硬化症；関節硬化症；偏頭痛
、慢性痛、過食、食欲不振、不安、精神分裂症、躁鬱病、抑鬱、妄想、痴呆、お
よび重度の精神遅滞を包含する精神および神経疾患；およびジスキネジア、例え
ば、パーキンソン病；ハンチントン病またはジル・ド・ラ・トーレット症候群；
白血病およびリンパ腫を包含するガンならびに他の疾患、例えば、ＩＩ型糖尿病
、肥満症、発作、敗血性ショック、移植片対宿主病および骨粗鬆症などの、以下
、「本発明の疾患」と記載するものの治療法に関連することを目的とする。さら
にもう一つの態様において、本発明は、本発明により提供される物質を用いたア
ゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、阻害剤）を同定する方法、さらに同定
された化合物についてアンバランスなＡＸＯＲ３５に関連する状態を治療する方
法に関する。さらにもう一つの態様において、本発明は不適当なＡＸＯＲ３５活
性またはレベルに関連する疾患を検出するための診断分析法に関する。
【００１１】 本発明のもう一つの態様にしたがって、本発明のＡＸＯＲ３５ポリペプチド（
受容体）と結合し、活性化する化合物（アゴニストと称する）、またはＡＸＯＲ
３５ポリペプチドの受容体リガンドとの相互作用を阻害する化合物（アンタゴニ
ストと称する）のスクリーニング法が提供される。特に、本発明の受容体のアゴ
ニストまたはアンタゴニストを同定するための好ましい方法は： （ａ）化合物と受容体との結合に反応して検出可能なシグナルを提供すること
ができる第二の成分と関連する受容体をその表面上で発現する細胞を、ポリペプ
チドとの結合を可能にする条件下でスクリーンされる化合物と接触させる工程；
および （ｂ）化合物の受容体との相互作用から生じるシグナルのレベルを測定するこ
とにより、該化合物が該受容体と結合し、活性化するか、または阻害するかどう
かを決定することを含む本発明の受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを同
定する方法が提供される。
【００１２】 さらに、本発明の受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための
好ましい方法は： （ａ）その表面上で、化合物の受容体との結合に反応して検出可能なシグナル
を提供できる第二の成分に関連した受容体を発現する細胞を、受容体との結合が
可能になるような条件下でスクリーンされる化合物と接触させる工程； （ｂ）受容体と化合物の相互作用から生じるシグナルのレベルを、該化合物が
存在しない場合のシグナルのレベルと比較することにより、化合物が受容体と結
合し、活性化するか、または阻害するかどうかを決定する工程を含む。 さらに好ましい例において、前記の２つの方法はさらに、標識または未標識ヒ
スタミンあるいはヒスタミン様化合物の存在下で、アゴニストまたはアンタゴニ
ストの同定を行うことを含む。
【００１３】 したがって、もう一つの例において、本発明の受容体のアゴニストまたはアン
タゴニストを同定するための方法は： 受容体との結合を可能にする条件下で、候補化合物の存在下で、その表面上に
受容体を有する細胞、または受容体を含有する細胞膜に対するリガンドの結合の
阻害を測定する工程、およびリガンドの結合を減少させることができる化合物が
アゴニストまたはアンタゴニストであるような受容体と結合するリガンドの量を
測定する工程を含む。好ましくは、リガンドはヒスタミンまたはヒスタミン様化
合物である。さらにより好ましくは、ヒスタミンまたはヒスタミン様化合物は標
識されている。さらに詳細には、ＡＸＯＲ３５受容体ンタゴニストまたはアゴニ
ストのスクリーニング法は、 （ａ）標識されたヒスタミンおよびヒスタミン様化合物を、細胞表面上でＡＸ
ＯＲ３５ポリペプチドを発現する全細胞、またはＡＸＯＲ３５受容体を含む細胞
膜と共にインキュベートする工程； （ｂ）全細胞または細胞膜と結合した標識されたヒスタミンまたはヒスタミン
様化合物の量を測定する工程； （ｃ）標識されたヒスタミンまたはヒスタミン様化合物と工程（ａ）の全細胞
または細胞膜の混合物に候補化合物を添加し、平衡にする工程； （ｄ）工程（ｃ）の後に全細胞または細胞膜と結合した標識されたヒスタミン
またはヒスタミン様化合物の量を測定する工程；および （ｅ）工程（ｄ）において結合を減少させる化合物がアゴニストまたはアンタ
ゴニストとなる工程（ｂ）および（ｄ）において結合した標識されたヒスタミン
またはヒスタミン様化合物における違いを比較する工程 を含む。
【００１４】 さらにも一つの態様において、本発明は本発明のスクリーニング法のいずれか
により見いだされるアゴニストおよびアンタゴニストに関する。さらにもう一つ
の態様において、本発明はＡＸＯＲ３５のアゴニストまたはアンタゴニスト、特
に本発明のスクリーニング法のいずれかにより同定されるアゴニストまたはアン
タゴニストとアンバランスなＡＸＯＲ３５に関連する状態の治療法に関する。 さらに、本発明は、ＡＸＯＲ３５のアゴニストまたはアンタゴニストを、それ
を必要とする患者に投与することによる、本発明の疾患、特に喘息の治療法に関
する。本発明はさらに、ＡＸＯＲ３５のアゴニストまたはアンタゴニストをそれ
を必要とする患者に投与することによる、本発明の疾患を治療するために、ＡＸ
ＯＲ３５を促進または拮抗する方法に関する。
【００１５】 さらに、本発明は、本明細書において記載されているスクリーニング法のいず
れかにより同定されるＡＸＯＲ３５のアゴニストまたはアンタゴニストをそれを
必要とする患者に投与することによる、本発明の疾患、特に喘息を治療する方法
に関する。さらに、本発明はまた、本明細書において記載されているスクリーニ
ング法のいずれかにより同定されるＡＸＯＲ３５のアゴニストまたはアンタゴニ
ストをそれを必要とする患者に投与することによる、本発明の疾患、特に喘息を
治療するためにＡＸＯＲ３５を促進または拮抗する方法に関する。
【００１６】 （発明を実施するための最良の形態） 第一の態様において、本発明はＡＸＯＲ３５ポリペプチドに関する。かかるポ
リペプチドは： （ａ）配列番号：１の配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離さ
れたポリペプチド； （ｂ）配列番号：２のポリペプチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％
、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離されたポ
リペプチド； （ｃ）配列番号：２のポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド； （ｄ）配列番号：２のポリペプチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％
、９８％、または９９％の同一性を有する単離されたポリペプチド； （ｅ）配列番号：２のポリペプチド配列；および （ｆ）配列番号：２のポリペプチド配列と比較して、０．９５、０．９６、０
．９７、０．９８、または０．９９の同一性指数を有するポリペプチド配列を有
するかまたは含む単離されたポリペプチド； （ｇ）（ａ）ないし（ｆ）におけるポリペプチドのフラグメントおよび変種 を含む。
【００１７】 本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの７ＴＭ受容体ファミリーのメンバー
であると考えられる。他の遺伝子ファミリーより多くのＧ蛋白結合（７ＴＭ）受
容体が医薬的介入の標的であるので、これらは目的とするものである。 ＡＸＯＲ３５の生物学的特性を、以下、「ＡＸＯＲ３５の生物学的活性」また
は「ＡＸＯＲ３５活性」と記載する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、少
なくとも１つのＡＸＯＲ３５の生物学的活性を示す。
【００１８】 本発明のポリペプチドはさらに、すべての対立遺伝子形態およびスプライス変
種を包含するポリペプチドの変種を含む。かかるポリペプチドは、保存的または
非保存的である挿入、欠失、および置換、またはその組合せにより、参照ポリペ
プチドと異なる。特に好ましい変種は、いくつか、例えば、５０ないし３０、３
０ないし２０、２０ないし１０、１０ないし５、５ないし３、３ないし２、２な
いし１または１個のアミノ酸が任意の組合せにおいて挿入、置換、または欠失さ
れているものである。
【００１９】 本発明のポリペプチドの好ましいフラグメントは、配列番号：２のアミノ酸配
列から得られる少なくとも３０、５０または１００の隣接するアミノ酸を有する
アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号：２のアミノ酸配
列から切断または欠失した少なくとも３０、５０または１００個の隣接するアミ
ノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。好ましいフラ
グメントは、類似した活性または向上された活性を有するか、あるいは望ましく
ない活性が減少したものを含むＡＸＯＲ３５の生物学的活性を媒介する生物学的
に活性なフラグメントである。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免
疫原性であるフラグメントも好ましい。
【００２０】 本発明のポリペプチドのフラグメントは、ペプチド合成により対応する完全長
ポリペプチドを産生するために用いることができ；したがって、これらの変種は
本発明の完全長ポリペプチド産生するための中間体として用いることができる。
本発明のポリペプチドは、「成熟」蛋白の形態であるか、またはより大きな蛋白
、例えば前駆体または融合蛋白の一部であってもよい。分泌またはリーダー配列
、プロ配列、精製を助ける配列、例えば複数のヒスチジン残基を含むさらにもう
一つのアミノ酸配列、あるいは組換え体産生中の安定性のためのさらにもう一つ
の配列を含むのが有利であることが多い。
【００２１】 本発明のポリペプチドは、任意の適当な方法、例えば、天然に存在する供給源
から、発現系（下記参照）を含む遺伝子操作された宿主細胞からの単離または化
学合成により、例えば自動化ペプチド合成器を用いて、あるいはかかる方法の組
合わせにより調製することができる。かかるポリペプチドを調製するための手段
は、当該分野においてよく理解されている。
【００２２】 さらにもう一つの態様において、本発明はＡＸＯＲ３５ポリヌクレオチドに関
する。かかるポリヌクレオチドは： （ａ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離
されたポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチ
ド； （ｃ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％の同一性を有する単離されたポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：１の単離されたポリヌクレオチド配列； （ｅ）配列番号：２のポリペプチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％
、９８％、または９９％の同一性を有する単離されたポリペプチド配列をコード
するポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド； （ｆ）配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有す
る単離されたポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号：２のポリペプチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％
、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌ
クレオチド配列を有する単離されたポリペプチド配列をコードする単離されたポ
リヌクレオチド； （ｈ）配列番号：２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド
； （ｉ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列と比較して、０．９５、０．９６
、０．９７、０．９８、または０．９９の同一性指数を有するポリヌクレオチド
配列を有するかまたは含む単離されたポリヌクレオチド； （ｊ）配列番号：２のポリペプチド配列と比較して、０．９５、０．９６、０
．９７、０．９８、または０．９９の同一性指数を有するポリペプチド配列をコ
ードするポリヌクレオチド配列を有するかまたは含む単離されたポリヌクレオチ
ド；および 前記ポリヌクレオチドのフラグメントおよび変種であるか、またはその全長にわ
たって前記ポリヌクレオチドに対して相補性であるポリヌクレオチドを含む。
【００２３】 本発明のポリヌクレオチドの好ましいフラグメントは、少なくとも１５、３０
、５０または１００個の配列番号：１の配列からの隣接したヌクレオチドを有す
るヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、あるいは配列番号：１
から少なくとも３０、５０または１００個の隣接するヌクレオチドが切断または
欠失した配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。 本発明のポリヌクレオチドの好ましい変種は、スプライス変種、対立遺伝子変
種、および１またはそれ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を有するポリヌクレオチド
包含する多形性を含む。
【００２４】 本発明のポリヌクレオチドはさらに、配列番号：２のアミノ酸配列を含み、い
くつか、例えば５０ないし３０、２０なし１０、１０ないし５、５ないし３、３
ないし２、２ないし１または１個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失または
付加されているポリペプチド変種をコードするポリヌクレオチドを包含する。 さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写
物であるポリヌクレオチドを提供する。したがって、 （ａ）配列番号：２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を
含む； （ｂ）配列番号：２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物で
ある； （ｃ）配列番号：１のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含む；または （ｄ）配列番号：１のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物である ＲＮＡポリヌクレオチド、およびこれに対して相補性であるＲＮＡポリヌクレオ
チドが提供される。
【００２５】 配列番号：１のポリヌクレオチド配列は、ヒトヒスタミンＨ３受容体と相同性
を示す（Lovenberg, T. W. et al. Mol. Pharm. 55:1101-1107, 1999）。配列
番号：１のポリヌクレオチド配列は、配列番号：２のポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡ配列である。配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド配列は、配列番号：１の配列をコードするポリペプチドと同一であるか、また
は遺伝子コードの重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）（縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ
））の結果、配列番号：２のポリペプチドもコードする配列番号：１以外の配列
であってもよい。配列番号：２のポリペプチドは、ヒトヒスタミンＨ３受容体と
相同性および／または構造的類似性を有する７ＴＭ受容体ファミリーの他の蛋白
に関連にする（Lovenberg, T.W. et al. Mol. Pharm. 55:1101-1107,1999）。
【００２６】 本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特にそのホモロー
ガスなポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対して類似した機能／特性を有す
ることが期待される。さらに、好ましい本発明のポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドは少なくとも１つのＡＸＯＲ３５活性を有する。 本発明のポリヌクレオチドは、ヒト骨髄の細胞におけるｍＲＮＡ由来のｃＤＮ
Ａライブラリーから標準的クローニングおよびスクリーニング技術を用いて得る
ことができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory M
anual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y. (1989)参照）。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡライブラリな
どの天然供給源から得ることもでき、または一般的で、商業的に利用可能な技術
を用いて合成することもできる。
【００２７】 本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの組換え産生に用いられ
る場合、ポリヌクレオチドは成熟ポリペプチドのコーディング配列そのもの、ま
たはリーダーまたは分泌配列、プレ、またはプロまたはプレプロ蛋白配列、ある
いは他の融合ペプチド部分をコードするものなどの他のコーディング配列と共に
リーディングフレーム内に成熟ポリペプチドのコーディング配列を含む。例えば
、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列をコードすることができる。
本発明のこの態様のある好ましい例において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター
（Quiagen,Inc.）として提供され、Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA (19
89) 86:821-824に記載されているヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、または
ＨＡタグである。ポリヌクレオチドは非コーディング５’および３’配列、例え
ば転写、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソー
ム結合部位およびｍＲＮＡを安定化させる配列も含む。
【００２８】 配列番号：１のポリヌクレオチド配列と同一であるかまたは十分な同一性を有
するポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーショ
ンプローブとして、あるいは核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）のためのプライマ
ーとして用いることができる。かかるプローブおよびプライマーは、本発明のポ
リペプチドをコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、
および配列番号：１と高い配列類似性、典型的には少なくとも９５％同一性を有
する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために用いることが
できる（ヒト供給源から得られるパラログならびにヒト以外の種からのオルトロ
グおよびパラログをコードする遺伝子を包含する）。好ましいプローブおよびプ
ライマーは、一般に、少なくとも１５のヌクレオチド、好ましくは少なくとも３
０のヌクレオチドを含み、少なくとも１００でなくても、少なくとも５０のヌク
レオチドを有する。特に好ましいプローブは３０〜５０のヌクレオチドを有する
。特に好ましいプライマーは、２０〜２５のヌクレオチドを有する。
【００２９】 ヒト以外の種からのホモログを包含する本発明のポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドは、配列番号：１またはそのフラグメント、好ましくは少なくと
も１５のヌクレオチドを有するものを有する標識されたプローブで、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下で、ライブラリーをスクリーニングする
工程；および完全長ｃＤＮＡおよび前記ポリヌクレオチド配列を含むゲノムクロ
ーンを単離する工程を含むプロセスにより得ることができる。かかるハイブリダ
イゼーション技術は当業者には一般的である。好ましいストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．６）、５×デンハート溶液、１０％デキストランスルフェート、および２
０マイクログラム／ｍｌ変性、剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一夜
インキュベーションし；続いて約６５℃で０．１×ＳＳＣにおいてフィルターを
洗浄することを含む。したがって、本発明はまた、配列番号：１の配列、または
そのフラグメント、好ましくは少なくとも１５のヌクレオチドを有する標識され
たプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライ
ブラリーをスクリーニングすることにより得られる単離されたポリヌクレオチド
、好ましくは少なくとも１００のヌクレオチド配列を有するものを包含する。
【００３０】 当業者らは、多くの場合において、単離されたｃＤＮＡ配列が、ポリペプチド
のコーディング領域が５’末端まで伸びていない点で不完全であることを理解す
るであろう。これは、逆転写酵素、つまり本質的に低「プロセシビティー（ｐｒ
ｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）」（酵素が重合反応中にテンプレートに付着したままで
いる能力の基準）を有する酵素の結果であり、第一鎖ｃＤＮＡ合成中にｍＲＮＡ
テンプレートのＤＮＡコピーを完成できない。
【００３１】 完全長ｃＤＮＡを得る方法、または短いｃＤＮＡを延長する方法、例えばｃＤ
ＮＡ末端の急速増幅法（ＲＡＣＥ）（例えば、Frohman et al., Proc Natl Acad
Sci USA 85, 8998-9002, 1998）に基づくものはいくつか当業者には利用可能で
あり、一般的である。Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）テクノロジー（Clontech L
aboratories Inc.）に例示される最近の技術の変形は、例えば、長いｃＤＮＡに
ついての調査が著しく簡略化されている。Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）テクノ
ロジーにおいて、ｃＤＮＡは、選択された組織から抽出されたｍＲＮＡおよび各
末端に結紮された「アダプター」配列から調製される。遺伝子特異性およびアダ
プター特異性オリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてｃＤＮＡの「欠失
」５’末端を増幅するために、核酸増幅法（ＰＣＲ）を次に行う。次に「繰り込
まれた（ｎｅｓｔｅｄ）」プライマー、すなわち、増幅産物内にアニールするよ
うに設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列における３’をさらに
アニールするアダプター特異性プライマーおよび公知遺伝子配列における５’末
端をさらにアニールする遺伝子特異性プライマー）を使用してＰＣＲ反応を繰り
返す。この反応の生成物を次に、ＤＮＡシーケンシングおよび完全長ｃＤＮＡを
存在するｃＤＮＡと直接結合させることにより完全な配列を得るか、または５’
プライマーのデザインに関する新しい配列情報を用いて別の完全長ＰＣＲを行う
かのいずれかにより構築される完全長ｃＤＮＡにより分析することができる。
【００３２】 本発明の組換えポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から
当業界において一般的なプロセスにより調製することができる。したがって、さ
らにもう一つの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現
系に関し、かかる発現系で遺伝子操作された宿主細胞に関し、さらに組換え技術
による本発明のポリペプチドの産生に関する。本発明のＤＮＡ構築物に由来する
ＲＮＡを用いてかかる蛋白を産生するために、無細胞翻訳系を使用することがで
きる。
【００３３】 組換え産生に関して、本発明のポリヌクレオチドについて、発現系またはその
一部を組み入れるために宿主細胞を遺伝子操作することができる。多くの標準的
実験室マニュアル、例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biolo
gy (1986)およびSambrook et al.（同書）において記載されている方法により宿
主細胞中にポリヌクレオチドを導入することができる。ポリヌクレオチドを宿主
細胞中へ導入するための好ましい方法としては、例えば、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トラン
スベクション、マイクロインジェクション、カチオン性リピッド媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープローデ
ィング、バリスティックイントロダクション、または感染が挙げられる。
【００３４】 適当な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば、連鎖球菌属（Streptococci
）、ブドウ球菌属（Staphylococi）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミセス（St
reptomyces）および枯草菌（Bacillus subtilis）細胞；真菌細胞、例えば、酵
母細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えば、ショ
ウジョウバエ(Drosophila)Ｓ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞；
動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ，ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、Ｈ
ＥＫ２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。
【００３５】 さまざまな発現系、例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例
えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵
母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス
、例えば、バクロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイ
ルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス
由来のベクター、ならびにその組合わせ、例えばプラスミドおよびバクテリオフ
ァージ遺伝子エレメント、例えばコスミッドおよびファージミド由来のものを用
いることができる。発現系は、発現を制御し、発現を行う調節領域を含んでいて
もよい。一般的に、宿主においてポリペプチドを産生するために、ポリヌクレオ
チドを維持、繁殖、または発現することができる任意の系またはベクターを用い
ることができる。さまざまな周知の慣例的技術、例えば、Sambrook et al.（同
書）において記載されているものにより適当なポリヌクレオチド配列を発現系中
に挿入することができる。適当な分泌シグナルを所望のポリペプチド中に組み入
れて、翻訳された蛋白を小胞体内腔、周辺腔、または細胞外環境中に分泌させる
ことができる。これらのシグナルはペプチドについて固有であってもよいし、ま
たはヘテロローガスなシグナルであってもよい。
【００３６】 本発明のポリペプチドをスクリーニング分析において使用するために発現させ
る場合、該ポリペプチドを細胞の表面で生成させるのが一般的に好ましい。この
場合、スクリーニング分析において使用する前に細胞を収穫してもよい。ポリペ
プチドが培地中に分泌されるならば、ポリペプチドを回収し、精製するために、
該培地を回収することができる。細胞内で産生される場合、ポリペプチドを回収
する前に細胞をまず溶解させなければならない。
【００３７】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、
アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラ
フィーを包含する一般的な方法により組換え細胞培養物から回収し、精製するこ
とができる。高性能液体クロマトグラフィーを精製するために使用するのが最も
好ましい。ポリペプチドが細胞内合成、単離、および／または精製中に変性する
場合、活性なコンフォメーションを再生するために、蛋白の再生のための一般的
な技術を用いることができる。
【００３８】 関連する遺伝子における突然変異を検出することにより、本発明のポリヌクレ
オチドを診断薬として用いることができる。ｃＤＮＡまたはゲノム配列における
配列番号：１のポリヌクレオチドを特徴とし、機能不全に関与する遺伝子の突然
変種体の検出により、遺伝子の発現不足、過剰発現または変更された空間的また
は時間的発現により生じる本発明の疾患または本発明の疾患のかかりやすさの診
断に加えるか、または特定することができる診断手段を提供する。遺伝子におい
て突然変異を有する個体は、当該分野において一般的なさまざまな技術によりＤ
ＮＡレベルで検出することができる。
【００３９】 診断のための核酸は、対象の細胞、例えば、血液、尿、唾液、組織生検または
剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡを検出のために直接使用してもよ
く、あるいはＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ、または他の増幅技術を分析前に
用いることにより、酵素的に増幅させてもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同様に
用いることができる。欠失および挿入は、通常の遺伝子型との比較において、増
幅された生成物のサイズの変化により検出することができる。点突然変異は、増
幅されたＤＮＡを標識されたＡＸＯＲ３５ヌクレオチド配列にハイブリッド形成
させることにより同定することができる。完全に一致した配列を、ＲＮａｓｅ消
化または融点の差により、一致しない二重らせんから区別することができる。Ｄ
ＮＡ配列の違いも、変性剤を用いるかまたは用いないで、ゲル中のＤＮＡフラグ
メントの電気泳動移動度における変化により、あるいは直接ＤＮＡシーケンシン
グにより検出することができる（例えば、Myers et al., Science (1985) 230:1
242）参照）。特定の位置での配列の変化は、ヌクレアーゼ保護分析、例えば、
ＲＮａｓｅおよびＳ１保護または化学的開裂法により解明することができる（例
えば、Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401参照）。
【００４０】 ＡＸＯＲ３５ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むオリゴヌク
レオチドプローブのアレイ（ａｒｒａｙ）を構築して、例えば遺伝子突然変異の
有効なスクリーニングを行うことができる。かかるアレイは、好ましくは高密度
アレイまたはグリッド（ｇｒｉｄ）である。アレイテクノロジーは周知であり、
一般的に適用でき、遺伝子発現、遺伝的連鎖、および遺伝的変化を包含する分子
遺伝学におけるさまざまな問題に取り組むために用いることができる。例えば、
M. Chee et al., Science, 274, 610-613 (1996)およびこれに記載されている他
の文献参照。
【００４１】 ポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現のレベルの異常な減少または増加の検出も、
本発明の疾患に対する対象のかかりやすさを診断または決定するために用いるこ
とができる。発現の減少または増加は、ポリヌクレオチドを定量化するための当
該分野において一般的な任意の方法、例えば、核酸増幅、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ
−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼー
ション法により、ＲＮＡレベルで測定することができる。宿主由来のサンプルに
おける本発明のポリペプチドなどの蛋白のレベルを測定するために用いることが
できる分析技術は、当業者には周知である。かかる分析法としては、ラジオイム
ノアッセイ、競合的結合分析、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ分析が
挙げられる。
【００４２】 したがって、もう一つの態様において、本発明は： （ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号：１のヌクレオチド配
列、あるいはそのフラグメントまたはＲＮＡ転写物； （ｂ）（ａ）と相補性であるヌクレオチド配列； （ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号：２のポリペプチドまたは
そのフラグメント；あるいは （ｄ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号：２のポリペプチドに対す
る抗体 を含む診断キットに関する。 任意のかかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は、実質
的な成分を含むことができることは理解されるであろう。かかるキットは、疾患
、特に、本発明の疾患またはこれに対するかかりやすさの診断において用いられ
る。
【００４３】 本発明のポリヌクレオチド配列は、染色体局在化研究において有用である。配
列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的とし、これとハイブリッ
ド形成することができる。本発明にしたがった染色体に対する関連する配列のマ
ッピングは、これらの配列を遺伝子関連疾患と関連づける重要な第一段階である
。配列を正確な染色体位置にマッピングしたら、染色体上の配列の物理的位置を
遺伝子地図のデータと関連づけることができる。かかるデータは、例えば、V. M
cKusick,Mendelian Inheritence in Man (Johns Hopkins University Welch Med
ical Libraryからオンライで利用可能)においてみられる。同じ染色体領域にマ
ッピングされた遺伝子と疾患の関係は、リンケージ分析により確認される（物理
的に隣接する遺伝子の同時遺伝）。ゲノム配列（遺伝子フラグメントなど）の正
確なヒト染色体局在化は、ラジエーションハイブリッド（ＲＨ）マッピング（Wa
lter, M. Spillett, D., Thomas, P., Weissenbach, J. and Goodfellow, P., (
1994) A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes,
Nature Genetics 7, 22-28）を用いて決定することができる。多くのＲＨパネル
、例えば、GeneBridge 4 RHパネル（Hum Mol Genet 1996 Mar; 5(3):339-46 A r
adiation hybrid map of the human genome. Gyapay G, Schimitt K, Fizames C
, Jones H, Vega-Czarny N, Spillett D, Muselet D, Prud'Homme JF, Dib C, A
uffray C, Morissette J, Weissenbach J, Goodfellow PN）が、Research Genet
ics(Huntsville, AL, USA)から入手可能である。このパネルを用いて遺伝子の染
色体を決定するためには、ＲＨ ＤＮＡについて目的とする遺伝子から設計され
たプライマーを用いて９３ＰＣＲを行う。これらのＤＮＡのそれぞれは、ハムス
ターバックグラウンド（ヒト／ハムスターハイブリッド細胞系）中に維持された
ランダムなヒト遺伝子フラグメントを含む。これらのＰＣＲの結果は９３点で、
目的とする遺伝子のＰＣＲ産物が存在するかまたは存在しないことを示す。これ
らの得点を、位置がわかっているゲノム配列から得られたＰＣＲ産物を用いて得
られた得点と比較する。この比較は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗ
ｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕで行われている。
【００４４】 本発明のポリヌクレオチド配列は、組織発現研究においても有用である。かか
る研究により、本発明のポリヌクレオチドの発現パターンが決定され、これによ
り、これらをコードするｍＲＮＡを検出することにより、組織においてコードさ
れたポリペプチドの発現パターンについて指摘が得られる。使用される技術は、
当該分野において一般的であり、グリッド上に配列されたクローンに対するイン
・サイチュー・ハイブリダイゼーション技術、例えば、ｃＤＮＡミクロアレイハ
イブリダイゼーション（Schena et al, Science, 270, 467-470, 1995およびSha
lon et al, Genome Res, 6, 639-645, 1996）およびヌクレオチド増幅技術、例
えば、ＰＣＲが挙げられる。好ましい方法は、Perkin Elmerから入手可能なＴＡ
ＱＭＡＮ（登録商標）テクノロジーを使用する。これらの研究の結果、生体にお
けるポリペプチドの正常な機能が示される。加えて、ｍＲＮＡの正常な発現パタ
ーンを同じ遺伝子の別の形態（例えば、ペプチドコーディング可能性または調節
突然変異において変更されているもの）によりコードされたｍＲＮＡのものと比
較する研究から、疾患における本発明のポリペプチドまたはその不適当な発現を
有するものの役割についての有用な洞察が得られる。かかる不適当な発現は、時
間的、空間的または単に定量的な性質のものである
【００４５】 Ｔａｑｍａｎにより、本発明のポリペプチドは末梢血単球および骨髄において
発現される。イン・サイチュー・ハイブリダイゼーションにより、ＡＸＯＲ３５
の発現が、喘息性肺におけるリンパ球、マクロファージ、好酸球、および好中球
において検出されたが、正常な肺においては検出されなかった。したがって、本
発明は、ＡＸＯＲ３５アゴニストまたはアンタゴニストをそれを必要とする患者
に投与することにより、疾患組織、例えば、これに限定されないが喘息肺におけ
るリンパ球、マクロファージ、好酸球、および好中球の機能を阻害または促進す
る方法に関する。さらにもう一つの態様において、本発明は、本明細書において
記載されたスクリーニング法のいずれかにより同定されるＡＸＯＲ３５アゴニス
トまたはアンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することにより、疾患組
織、例えば、これに限定されないが、喘息肺におけるリンパ球、マクロファージ
、好酸球、または好中球の機能を阻害または促進する方法に関する。本発明はさ
らに、ＡＸＯＲ３５アゴニストまたはアンタゴニストをそれを必要とする患者に
投与することにより、疾患組織、例えば、これに限定されないが、喘息肺におけ
るリンパ球、マクロファージ、好酸球、または好中球の機能を阻害または促進す
るためにＡＸＯＲ３５を促進または拮抗する方法に関する。さらに、本発明は、
本明細書において記載されたスクリーニング法のいずれかにより同定されるＡＸ
ＯＲ３５アゴニストまたはアンタゴニストをそれを必要とする患者に投与するこ
とにより、疾患組織、例えば、これに限定されないが、喘息肺におけるリンパ球
、マクロファージ、好酸球、または好中球の機能を阻害または促進するために、
ＡＸＯＲ３５を促進または拮抗する方法に関する。
【００４６】 本発明のさらにもう一つの態様は、抗体に関する。本発明のポリペプチドまた
はそのフラグメント、あるいはこれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチド
に対して免疫特異性である抗体を産生するための免疫源として用いることができ
る。「免疫特異性」なる用語は、抗体が、先行技術における他の関連するポリペ
プチドの親和力よりも、本発明のポリペプチドに対して実質的により大きな親和
力を有することを意味する。
【００４７】 本発明のポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドまたはエピト
ープを有するフラグメント、あるいは細胞を動物、好ましくはヒト以外の動物に
、慣例のプロトコルを用いて投与することにより得ることができる。モノクロー
ナル抗体を調製するために、連続細胞系培養により産生される抗体を提供する任
意の技術を用いることができる。例としては、ハイブリドーマ技術（Kohler, G.
and Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ−
細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72）お
よびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and C
ancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985）が挙げられる。
【００４８】 一本鎖抗体を産生するための技術、例えば、米国特許番号第４９４６７７８号
に記載されているものを、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生する
ためにも適用することができる。さらに、トランスジェニックマウス、または哺
乳動物以外を包含する他の生物をヒト化抗体を発現するために用いることができ
る。 前記抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離するかまたは同定するた
めに、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製す
るために用いることができる。本発明のポリペプチドに対する抗体も、特に、本
発明の疾患を治療するために用いることができる。
【００４９】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドはワクチンとしても用いること
がでいる。したがって、さらにもう一つの態様において、本発明は、哺乳動物に
おいて免疫学的反応を誘発する方法であって、疾患が個体内ですでに確立されて
いるかどうかに関わらず、前記動物を疾患から防御するために、例えば、サイト
カイン産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞を包含する抗体および／またはＴ細胞免
疫反応を生じるために適当な本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種することを
含む方法に関する。哺乳動物における免疫学的反応は、本発明のポリペプチドを
ポリヌクレオチドの発現を行うベクターにより送達し、前記動物を本発明の疾患
から防御するために抗体を産生するためにかかる免疫学的反応を誘発するために
インビボでポリペプチドをコードすることを含む方法によっても惹起することが
できる。該ベクターを投与する一方法は、粒子上のコーティングなどとしてこれ
を所望の細胞中に増進することによる。かかる核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ
、または修飾された核酸、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含むことがで
きる。ワクチンの使用に関して、ポリペプチドまたは核酸ベクターはワクチン処
方（組成物）として通常提供される。処方はさらに適当な担体を含んでもよい。
ポリペプチドは胃の中で分解される可能性があるので、非経口投与（例えば、皮
下，筋肉内、静脈内、または皮内注射）されるのが好ましい。非経口投与に適し
た処方としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および処方を受容者の血液と等張
にする溶質を含むことができる水性および非水性滅菌注射用溶液；懸濁化剤また
は増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。処方を、１
回投与または複数回投与用容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルに入れて
提供してもよく、使用直前に滅菌液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態に
おいて保存してもよい。ワクチン処方は、水中油系および当該分野において公知
の他の系などの処方の免疫原性を増大させるアジュバント系を含んでもよい。用
量は、ワクチンの比活性によって決まり、慣例的な実験により容易に決定するこ
とができる。
【００５０】 本発明のポリペプチドは、１またはそれ以上の症状、特にすでに記載した本発
明の疾患に関連する１またはそれ以上の生物学的機能を有する。したがって、ポ
リペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定することは有
用である。したがって、さらにもう一つの態様において、本発明はポリペプチド
の機能またはレベルを刺激または阻害するものを同定する化合物をスクリーニン
グする方法を提供する。かかる方法は、すでに記載した本発明のかかる疾患を治
療し、予防する目的で使用することができるアゴニストまたはアンタゴニストを
同定する。化合物は、さまざまな供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的
ライブラリー、化合物の集合、および天然の産物の混合物から同定することがで
きる。このようにして同定されたアゴニストまたはアンタゴニストは、場合によ
り、ポリペプチドの、天然の、または修飾された基質、リガンド、受容体、酵素
；その構造的または機能的模倣物（Coligan et al., Current Protocols in Imm
unology 1(2): Chapter 5 (1991)参照）または小分子であってもよい。かかる小
分子は、好ましくは２０００ダルトンより少ない分子量を有し、より好ましくは
３００〜１０００ダルトンであり、最も好ましくは４００〜７００ダルトンであ
る。これらの小分子は有機分子であるのが好ましい。
【００５１】 スクリーニング法は、候補化合物と直接または間接的に関連する標識により、
候補化合物のポリペプチド、あるいはポリペプチドを有する細胞または膜、ある
いはその融合蛋白に対する結合を単に測定するものであってもよい。別法として
、スクリーニング法は、標識された競争相手（例えば、アゴニストまたはアンタ
ゴニスト）に対する化合物のポリペプチドとの競合的結合を（定量的または定性
的に）測定または検出することを含む。さらに、これらのスクリーニング法は、
ポリペプチドを有する細胞に対して適切な検出システムを用いて、候補化合物に
よりポリペプチドの活性化または抑制により生じるシグナルが得られるかどうか
を試験することができる。活性化の阻害剤は、公知のアゴニストの存在下で一般
に分析され、候補物質の存在によるアゴニストによる活性化に対する影響が観察
される。さらに、スクリーニング法は、単に候補化合物を本発明のポリペプチド
を含む溶液と混合して、混合物を形成し、該混合物におけるＡＸＯＲ３５活性を
測定し、混合物のＡＸＯＲ３５活性と候補化合物を含まない対象混合物と比較す
ることを含む。
【００５２】 本発明のポリペプチドは、通常の低容量スクリーニング法および高処理量スク
リーニング（ＨＴＳ）フォーマットにおいても用いることができる。かかるＨＴ
Ｓフォーマットは、よく確立された９６−、最近では３８４−ウェルマイクロタ
イタープレートの使用だけでなく、新規方法、例えば、Schullek et al, Anal B
iochem., 246, 20-29 (1997)により記載されているナノウェル法を包含する。 融合蛋白、例えば、前記のようにＦｃ蛋白とＡＸＯＲ３５ポリペプチドから調
製されるものは、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを同定するための高処
理量スクリーニング分析においても使用することができる（D. Benett et al.,
J Mol Recognition, 8: 52-58 (1995);およびK. Johanson et al., J Biol Chem
, 270 (16):9459-941 (1995)参照）。
【００５３】 本発明者らは、ヒスタミンまたはヒスタミン様化合物がＡＸＯＲ３５ポリペプ
チドのリガンドであることを見いだした。本発明のＡＸＯＲ３５ポリペプチドは
、本発明のＡＸＯＲ３５ポリペプチドと結合し、活性化する化合物（アゴニスト
と称する）、またはＡＸＯＲ３５ポリペプチドの受容体リガンドとの相互作用を
阻害する化合物（アンタゴニストと称する）のスクリーニング法において用いる
ことができる。 一般に、かかるスクリーニング法は、その表面上に本発明の受容体ポリペプチ
ドを発現する適当な細胞を提供することを含む。かかる細胞としては、哺乳動物
、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌から得られる細胞が挙げられる。特に、
本発明の受容体をコードするポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェクトし、
これによりＡＸＯＲ３５ポリペプチドを発現するために用いられる。発現された
受容体を、次に機能応答の結合、刺激または阻害を観察するために試験化合物と
接触させる。
【００５４】 かかるスクリーニング法の一例は、本発明のＡＸＯＲ３５ポリペプチドを発現
するためにトランスフェクトされるメラニン保有細胞の使用を含む。かかるスク
リーニング技術は、１９９２年２月６日に公開されたＰＣＴＷＯ９２／０１８１
０に記載されている。かかる分析は、受容体をコードするメラニン保有細胞を、
受容体リガンド、例えばヒスタミンまたはヒスタミン様化合物、およびスクリー
ンされる化合物の両方と接触させることによる、本発明の受容体ポリペプチドの
活性化を阻害する化合物のスクリーンに用いることができる。リガンドにより生
じるシグナルの阻害は、化合物が受容体の潜在的なアンタゴニストであること、
すなわち、受容体の活性化を阻害することを示す。
【００５５】 該技術は、かかる細胞をスクリーンされる化合物と接触させ、かかる化合物が
シグナルを生成するか、すなわち、受容体を活性化するかどうか決定することに
より、受容体を活性化する化合物のスクリーニングにも使用することができる。
他のスクリーニング技術は、受容体活性化により生じる細胞外のｐＨ変化を測定
する系におけるＡＸＯＲ３５ポリペプチドを発現する細胞（例えば、トランスフ
ェクトされたＣＨＯ細胞）の使用を含む。この技術において、化合物を本発明の
受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させてもよい。潜在的な化合物が受容
体を活性化するかまたは阻害するかどうかを決定するためにセカンドメッセンジ
ャー反応、例えばシグナルトランスダクションまたはｐＨ変化を測定する。
【００５６】 もう一つのスクリーニング技術は、受容体がホスホリパーゼＣまたはＤと結合
するＡＸＯＲ３５ポリペプチドを発現することを含む。かかる細胞の代表例とし
ては、これに限定されないが、内皮細胞、平滑筋細胞、および胎生腎細胞が挙げ
られる。スクリーニングは、ホスホリパーゼの第二のシグナルから受容体の活性
化または受容体の活性化の阻害を検出することにより前記のようにして行うこと
ができる。
【００５７】 もう一つ別の方法は、標識されたリガンド、例えば、ヒスタミンまたはヒスタ
ミン様化合物の、その表面上に受容体を有する化合物、または受容体を含む細胞
膜との結合の阻害を測定することによる、アンタゴニストまたはアゴニストであ
る化合物のスクリーニングを含む。かかる方法は、細胞がその表面上で受容体を
発現するために細胞（例えば、真核細胞）をＡＸＯＲ３５ポリペプチドをコード
するＤＮＡでトランスフェクトすることを含む。該細胞を次に潜在的なアンタゴ
ニストまたはアゴニストと標識された形態のリガンド、例えば、ヒスタミンまた
はヒスタミン様化合物と接触させる。リガンドは例えば、放射能により標識する
ことができる。受容体と結合した標識されたリガンドの量は、例えば、トランス
フェクトされた細胞またはこれらの細胞から得られる膜と関連する放射能を測定
することにより測定される。化合物が受容体と結合するならば、標識されたリガ
ンドの受容体との結合は、受容体と結合する標識されたリガンドの減少により確
認されるように阻害される。この方法は、結合分析と呼ばれる。
【００５８】 もう一つのスクリーニング法は、目的とする受容体を発現するためにトランス
フェクトされる哺乳動物または両生類細胞（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ツメガエル
（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞、ＲＢＬ−２Ｈ３など）の使用を含む。細胞に、カ
ルシウムと結合すると蛍光シグナルを生じる指示染料を加え、細胞を試験物質お
よび受容体ゴニスト、例えば、ヒスタミンまたはヒスタミン様化合物と接触させ
る。蛍光シグナルにおける変化を、例えば、蛍光分光光度計または蛍光イメージ
ングプレートリーダーを用いて一定時間にわたり測定する。リガンドにより生じ
る蛍光シグナルパターンにおける変化は、化合物が受容体の潜在的なアンタゴニ
ストまたはアゴニストであることを示す。
【００５９】 もう一つのスクリーニング法は、目的とする受容体を発現するためにトランス
フェクトされ、受容体の活性化と関連するレポーター遺伝子構築物（例えば、適
当なプロモーター後のルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはベー
タ−ラクタマーゼ）でトランスフェクトされる哺乳動物または両生類細胞（ＣＨ
Ｏ、ＨＥＫ２９３、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞、ＲＢＬ−２Ｈ３な
ど）の使用を含む。細胞を試験化合物および受容体ゴニスト（リガンド）、例え
ば、ヒスタミンまたはヒスタミン様化合物と接触させ、レポーター遺伝子により
生じるシグナルを一定時間の後に測定する。レポーター遺伝子産物の適当な基質
をシグナルの測定前に添加する。例えば、ルシフェリンは、ルシフェラーゼ活性
を測定する前に添加することができ、あるいはＣＣＦ２／ＡＭはベータ−ラクタ
マーゼ活性を測定する前に添加することができる（Zlokarnik et al, Science 1
998, 279, 84-88）。このシグナルは、照度計、分光光度計、蛍光計、または使
用した特定のレポーター構築物に適当な他の装置を使用して測定することができ
る。リガンドにより生じたシグナルの変化は、化合物が受容体の潜在的なアンタ
ゴニストまたはアゴニストであることを示す。
【００６０】 もう一つのアンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニング技術は、受容体
を発現するために、ＡＸＯＲ３５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（
ＲＮＡまたはＤＮＡ）をツメガエル卵母細胞（またはＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｒ
ＢＬ−２Ｈ３など）中に導入することを含む。受容体卵母細胞を次に受容体リガ
ンド、例えば、ヒスタミンまたはヒスタミン様化合物、およびスクリーンされる
化合物と接触させる。ｃＡＭＰ、カルシウム、プロトン、または他のイオンなど
のシグナルにおける変化を検出することにより、受容体の阻害または活性化を測
定する。
【００６１】 例えば、一方法は、ＡＸＯＲ３５ポリペプチドが媒介するｃＡＭＰおよび／ま
たはアデニレートシクラーゼ蓄積または減少の阻害または刺激を測定することに
よるＡＸＯＲ３５ポリペプチド阻害剤のスクリーニングを含む。かかる方法は、
細胞表面上に受容体を発現するために、真核細胞をＡＸＯＲ３５ポリペプチド受
容体で一時的にまたは安定してトアランスフェクトすることを含む。細胞を次に
ＡＸＯＲ３５ポリペプチドリガンド、例えば、ヒスタミンまたはヒスタミン様化
合物の存在下で潜在的なアンタゴニストまたはアゴニストに曝す。ｃＡＭＰのレ
ベルにおける変化を、例えばラジオイムノアッセイまたは蛋白結合分析（例えば
、フラッシュプレートまたはシンチレーションプロキシミティー分析を使用）に
より、一定時間測定する。ｃＡＭＰレベルにおける変化も、破壊した細胞調製物
において、酵素、アデニリルシクラーゼの活性を直接測定することより確認する
ことができる。潜在的なアンタゴニストまたはアゴニストが受容体と結合し、し
たがってＡＸＯＲ３５ポリペプチド−リガンド結合を阻害するならば、ＡＸＯＲ
３５ポリペプチドに媒介されるｃＡＭＰ、またはアデニレートシクラーゼ活性の
レベルは減少または増加する。
【００６２】 アゴニストおよびアンタゴニストのもう一つのスクリーニング法は、酵母、サ
ッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における内因性フェロ
モン反応経路による。酵母の異体性株は、２つの有糸分裂的に安定な半数体交配
タイプ、ＭＡＴａおよびＭＡＴａにおいて存在することができる。各細胞タイプ
は、細胞融合の前兆としてのＧ１阻止に至るＭＡＰキナーゼ化スケートを起こす
反対の交配タイプの細胞についてＧ蛋白結合受容体と結合する少量のペプチドホ
ルモンを分泌する。フェロモン反応経路におけるある遺伝子の遺伝的変更は、フ
ェロモンに対する正常な反応を変更することができ、内因性フェロモン受容体を
含まない酵母細胞におけるヒトＧ蛋白結合受容体およびヒト化Ｇ蛋白サブユニッ
トのヘテロローガスな発現および結合は、下流のシグナリング経路およびレポー
ター遺伝子（例えば、米国特許第５０６３１５４号；第５４８２８３５号；第５
６９１１８８号）と関連づけることができる。かかる遺伝的変更は、これに限定
されないが、（ｉ）内因性Ｇ蛋白結合フェロモン受容体をコードするＳＴＥ２ま
たはＳＴＥ３遺伝子の欠失；（ｉｉ）細胞サイクル阻止に至る通常サイクリン依
存性キナーゼと関連する蛋白をコードするＦＡＲ１遺伝子の欠失；および（ｉｉ
ｉ）ＦＵＳ１遺伝子プロモーターと融合したレポーター遺伝子の構築（ＦＵＳ１
が、細胞融合に必要な膜に固定された糖蛋白をコードする場合）を包含する。下
流レポーター遺伝子は、使用した特定のレポーター構築物によって（例えば、Ｆ
ＵＳ−１ＬａｃＺレポーターを用いたｂ−ガラクトシダーゼ誘発）、正の成長選
択（例えば、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３レポーターを用いたヒスチジンプロトトロフィ
ー）、または比色、蛍光、分光分析読み出しのいずれかを可能にする。
【００６３】 その一部がヘテロローガスに発現されたヒト（または哺乳動物）Ｇ蛋白結合受
容体のオートクリン活性化を可能にするランダムなペプチドライブラリーから小
ペプチドを発現し、分泌するために、酵母細胞をさらに操作することができる（
Broach, J.R. and Thorner, J. Nature 384:14-16, 1996; Manfredi et al., Mo
l. Cell. Biol. 16: 4700-4709, 1996）。これにより、特徴づけられた受容体ま
たはオーファン受容体を活性化するサロゲートペプチドアゴニストの迅速な直接
的成長選択（例えば、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３レポーターを使用）ができる。別法と
して、レポーター遺伝子読み取り（例えば、ＦＵＳ１−ＬａｃＺ）と関連するヒ
ト（または哺乳動物）Ｇ蛋白結合受容体を機能的に発現する酵母細胞（例えば、
ＦＵＳ−１ＬａｃＺ）を、公知リガンド、生物学的抽出物のフラクションおよび
天然またはサロゲートリガンドのいずれかの化合物のライブラリーの高処理量ス
クリーニングのプラットフォームとして用いることができる。十分な有効性を有
する機能的アゴニスト（天然またはサロゲート）を、Ｇ蛋白結合受容体ンタゴニ
ストを同定するための酵母細胞ベースの分析におけるスクリーニング手段として
用いることができる。例えば、アゴニストはＦＵＳ−ＨＩＳ３レポーターで細胞
の成長を促進するか、またはＦＵＳ１−ＬａｃＺで細胞について正の読み出しを
与える。しかしながら、成長を阻害するかまたはアゴニストにより生じる正の読
み出しをうち消す候補化合物はアンタゴニストである。この目的に関して、酵母
系は、その使用の容易性およびアゴニストまたはアンタゴニストを同定する能力
を妨害することが多い受容体バックグラウンドがないこと（Ｇ蛋白結合受容体が
ないこと）により、哺乳動物発現系よりも有利である。
【００６４】 本発明はまた、ＡＸＯＲ３５ポリペプチドと結合することができることが知ら
れていない新規リガンドを同定する方法を提供する。アゴニストを同定するため
にすでに記載されたスクリーニング分析を新規リガンドを同定するために用いる
ことができる。 本発明はさらに、前記スクリーニング法のいずれかから得られるアゴニストお
よびアンタゴニストも包含する。
【００６５】 潜在的なＡＸＯＲ３５ポリペプチド受容体ンタゴニストの例としては、受容体
と結合するが、受容体の活性が防止されるようなセカンドメッセンジャー反応を
惹起しないペプチド模倣物、合成有機分子、天然の生成物、抗体などが挙げられ
る。 潜在的なアンタゴニストはまた、ＡＸＯＲ３５ポリペプチド受容体のリガンド
、すなわち、生物学的機能が失われ、ＡＸＯＲ３５ポリペプチド受容体と結合し
た場合に応答を惹起しないリガンドのフラグメントと密接に関連した蛋白を包含
する。 好ましい一例において、本発明は、表Ｉおよび表ＩＩにおいて示すような本明
細書に記載するスクリーニング法により同定される特定のアンタゴニストおよび
さらにアゴニスト（以下に定義するようなヒスタミンおよびヒスタミン様化合物
を除いて）に関する。
【００６６】
【表１】 ａ 前記化合物は、０．０１０５−０．４５２ｕＭの範囲のＥＣ５０を有する。
ＥＣ５０についての分析は、実施例９に記載する。
【００６７】
【表２】 ｂ 前記化合物は、０．１９５−０．３２３ｕＭの範囲のＩＣ５０を有する。Ｉ
Ｃ５０についての分析は、実施例９に記載する。
【００６８】 潜在的なアンタゴニストは、アンチセンステクノロジーと使用することにより
調製されるアンチセンス構築物も含む。アンチセンステクノロジーは、三本鎖形
成あるいはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ（どちらの方法もポリヌクレオチド
のＤＮＡまたはＲＮＡとの結合に基づく）により遺伝子発現を制御するために用
いることができる。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列の５’コーディング領域は、約１０ないし４０塩基対の長さのアンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチド設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴヌク
レオチドは、転写に関与する遺伝子の領域（三本鎖−Lee, et al. Nucl. Acids
Res., 6:3073 (1979); Cooney, et al, Science, 241:456 (1988);およびDervan
, et al., Science, 251: 1360 (1991)参照）と相補性であるように設計され、
これにより、ＡＸＯＲ３５ポリペプチドの転写および産生が防止される。アンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡとインビボでハイブリッド形成し、
ｍＲＮＡ分子のＡＸＯＲ３５ポリペプチドへの転写をブロックする（アンチセン
ス−Okano, J., Neurochem., 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTI
SENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)）
。前記のオリゴヌクレオチドは、ＡＸＯＲ３５ポリペプチド産生を阻害するため
にアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現されるために細胞に送達す
ることもできる。
【００６９】 したがって、もう一つの態様において、本発明は： （ａ）ＡＸＯＲ３５ポリペプチド、好ましくは配列番号：２を有するもの；さ
らに好ましくは標識されたまたは未標識のヒスタミンまたはヒスタミン様化合物
を含むもの； （ｂ）ＡＸＯＲ３５ポリペプチド、好ましくは配列番号：２を有するもの；さ
らに好ましくは標識されたまたは未標識ヒスタミンまたはヒスタミン様化合物を
含むものを発現する組換え細胞；または （ｃ）ＡＸＯＲ３５ポリペプチド；好ましくは配列番号：２を有するもの；さ
らに好ましくは標識されたまたは未標識ヒスタミンまたはヒスタミン様化合物を
含むものを発現する細胞膜 を含む、ＡＸＯＲ３５ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、およびリガ
ンドを同定するためのスクリーニングキットに関する。 任意のかかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）は実質的な成分
を含むことができる。
【００７０】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリペプチドに対する抗体は
、細胞におけるｍＲＮＡおよびポリペプチド産生に対する添加された化合物の効
果を検出するためのスクリーニング法を設定するためにも用いることができる。
例えば、ＥＬＩＳＡ分析は、当該分野において公知の標準的方法によりモノクロ
ーナルおよびポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌されたレベルまた
は細胞に関連するレベルを測定するために構成される。これは、適当に操作され
た細胞または組織からポリペプチドの産生を阻害または向上させる薬剤（それぞ
れ、アンタゴニストまたはアゴニストとも称する）を開発するために用いること
ができる。
【００７１】 ポリペプチドは、当該分野において公知の標準的結合技術により、もしあるな
らば膜結合または可溶性受容体を同定するために用いることができる。これらと
しては、ポリペプチドが放射性同位体（例えば、１２５Ｉ）で標識されるか、化
学的に修飾されるか（例えば、ビオチニル化）、または検出または精製に適当な
ペプチド配列と融合し、推定受容体の供給源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽
出物、体液）とともにインキュベートされるリガンド結合およびクロスリンキン
グ分析が挙げられるが、これに限定されない。他の方法は、生物物理学的技術、
例えば、表面プラズモン共鳴および分光分析を包含する。これらのスクリーニン
グ法は、もしあるならば、ポリペプチドのその受容体との結合と競合するポリペ
プチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためにも用いることができ
る。かかる分析を行う標準的方法は当業界において周知である。
【００７２】 潜在的なポリペプチドアンタゴニストの例としては、リガンド、基質、受容体
、酵素のフラグメントなどのポリペプチドの、場合によっては、リガンド、基質
、受容体、酵素などと密接に関連した抗体、または場合によっては、オリゴヌク
レオチドまたは蛋白；または本発明のポリペプチドと結合するが、ポリペプチド
の活性が防止されるための反応を惹起しない小分子が挙げられる。
【００７３】 したがって、もう一つ別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドの
アゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など；またはかか
るポリペプチドの産生を減少または増大させる化合物を同定するためのスクリー
ニングキットであって： （ａ）本発明のポリペプチド； （ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞； （ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体 （該ポリペプチドは好ましくは配列番号：２を有するものである）を含むキット
に関する。 任意のかかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は実質的
な成分を含むことができることは理解されるであろう。
【００７４】 本発明のポリペプチドは： （ａ）第一段階において、ポリペプチドの三次元構造を決定する： （ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤と反応しやすいかまたは結合
する部位の三次元構造を予測する； （ｃ）予測される結合または反応性部位と結合するかまたは反応することが予
測される候補化合物を合成する；および （ｄ）候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤であるか
どうかを試験することによる、ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニストまた
は阻害剤の構造に基づいて設計する方法において用いることができることは当業
者には容易に理解されるであろう。これは通常相互作用プロセスであることも理
解されるであろう。
【００７５】 ポリペプチドの活性が過剰であるならば、いくつかの方法が利用可能である。
一の方法は、それを必要とする対象に、前記の阻害剤化合物（アンタゴニスト）
を、所望により医薬的に許容される担体と組み合わせて、例えば、リガンド、基
質、受容体、酵素などの結合をブロックすることによるか、または第二のシグナ
ルを阻害することによりポリペプチドの機能を阻害し、これにより異常な状態を
軽減するのに有効な量において投与することを含む。もう一つの方法において、
内因性ポリペプチドとの競合において、依然としてリガンド、基質、酵素、受容
体などを結合できるポリペプチドの可溶性形態を投与してもよい。かかる競争相
手の典型例は、ＡＸＯＲ３５ポリペプチドのフラグメントを包含する。
【００７６】 さらにもう一つの方法において、内因性ＡＸＯＲ３５ポリペプチドをコードす
る遺伝子の発現は、発現ブロック技術を用いて阻害することができる。公知のか
かる技術は、内部で発生したか、または別に投与されたかのいずれかのアンチセ
ンス配列を含む（例えば、O'Connor, J Neurochem (1991) 56:560 in Oligodeox
ynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca
Raton, FL (1988)参照）。別法として、遺伝子について三本鎖を形成するオリ
ゴヌクレオチドを供給することができる（例えば、Lee et al., Nucleic Acids
Res (1979) 6:3073; Cooney et al., Science (1988) 241:456; Dervan et al.,
Science (1991) 251:1360参照）。これらのオリゴマーは、それ自体を投与する
ことができる、また関連するオリゴマーをインビボで発現させることができる。
【００７７】 ＡＸＯＲ３５およびその活性の不十分な発現に関連する異常な状態を治療する
ために、いくつかの方法が利用できる。一の方法は、対象に治療的に有効な量の
本発明のポリペプチドを活性化する化合物、すなわち、前記のアゴニストを、医
薬的に許容される担体と組み合わせて投与し、これにより異常な状態を軽減する
ことを含む。別法として、対象において関連する細胞によりＡＸＯＲ３５の内因
生産性を行うために遺伝子療法を採用することができる。例えば、本発明のポリ
ヌクレオチドは、前記のように複製が不完全なレトロウイルスベクターにおける
発現のために操作することができる。レトロウイルス発現構築物を次に単離し、
パッケージング細胞が目的とする遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するた
めに本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミド
ベクターで形質導入されたパッケージング細胞中に導入してもよい。これらのプ
ロデューサー細胞は、インビボの細胞およびインビボでのポリペプチドの発現を
操作するために対象に投与することができる。遺伝子療法のあらましについては
、Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic
Approaches（およびここに記載されている参考文献） in Human Molecular Gen
etics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)参
照。もう一つの方法は、治療量の本発明のポリペプチドを適当な医薬担体と組み
合わせて投与することである。
【００７８】 さらにもう一つの態様において、本発明は治療的に有効量のポリペプチド、例
えば、可溶性形態の本発明のポリペプチド、アゴニスト／アンタゴニストペプチ
ドまたは小分子化合物を、医薬的に許容される担体または賦形剤と組み合わせて
含む医薬組成物を提供する。かかる担体としては、これに限定されないが、塩溶
液、緩衝塩溶液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその
組合せが挙げられる。本発明はさらに、１またはそれ以上の前記の本発明の組成
物で満たされた１またはそれ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する
。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独で、または他の化合物、例え
ば、治療化合物と組み合わせて用いることができる。
【００７９】 組成物は、投与経路、例えば、全身または経口経路に適用される。全身投与の
好ましい形態は注射を包含し、典型的には静脈注射による。他の注射経路、例え
ば、皮下、筋肉内、または腹膜組織内注射を用いることができる。全身投与のた
めの別の手段は、浸透剤、例えば、胆汁酸塩またはフシジン酸などまたは他の洗
浄剤を用いた経粘膜および経皮投与を包含する。加えて、本発明のポリペプチド
または他の化合物が腸溶剤またはカプセルに処方できるならば、経口投与も可能
である。これらの化合物の投与は、軟膏、ペースト、ジェル等の形態において局
所的および／または局所化することもできる。
【００８０】 必要な用量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、処
方の性質、対象の状態の性質、およびかかっている医師の判断によって変わる。
しかしながら、適当な用量は、対象の体重１ｋｇあたり０．１−１００μｇの範
囲である。しかしながら、利用可能な化合物がさまざまであり、さまざまな投与
形路の有効性が異なることを考慮すると、必要な用量は広範囲にわたることが予
想される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与予も高い投与量が必要で
あると予想される。これらの用量の変動は、当該分野においてよく理解されてい
るように、最適化するために標準的な経験的手順を用いて調節することができる
。
【００８１】 治療において用いられるポリペプチドは、前記のように、よく「遺伝子療法」
と呼ばれる治療様式において、対象において内因的に生成させることができる。
したがって、例えば、対象から得られる細胞を、例えば、レトロウイルスプラス
ミドベクターの使用により、エキソビボでポリペプチドをコードするために、ポ
リヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡで操作することができる。細胞を
次に対象中に導入する。
【００８２】 ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、さらに類似したホモロジーの配
列を同定するための有用な情報源を形成する。これは、配列をコンピューター読
み出し媒体中に記憶させ、その後、周知の検索ツール、例えばＧＣＣを用いて配
列データベースを検索するために記憶させたデータを用いることにより最も容易
に行われる。したがって、さらにもう一つの態様において、本発明は配列番号：
１の配列を含むポリヌクレオチドおよび／またはこれによりコードされるポリペ
プチド配列を記憶させたコンピューター読み出し媒体を提供する。
【００８３】 スクリーニング法はさらに、トランスジェニックテクノロジーおよびＡＸＯＲ
３５遺伝子の使用を含む。トランスジェニック動物を構築する技術は十分に確立
されている。例えば、ＡＸＯＲ３５遺伝子を、受精卵母細胞のオス前核中へのマ
イクロインジェクション、着床前または着床後の胚中へのレトロウイルスによる
移動、または例えばエレクトロポレーションなどにより遺伝的に修飾された胚幹
細胞を宿主胞胚中に注射することにより、導入することができる。特に有用なト
ランスジェニック動物は、動物遺伝子が該動物のゲノム内でヒトの同等物により
置換されている、いわゆる「ノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）」動物である。ノ
ックイントランスジェニック動物は、化合物がヒト標的に対して特異性である場
合、薬剤開発過程において目的物を認可するために有用である。他の有用なトラ
ンスジェニック動物は、本発明のポリペプチドの動物のオルトログの発現および
細胞における内因性ＤＮＡ配列によりコードされるものが部分的または完全に無
効にされている、いわゆる「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）」動物である
。遺伝子ノックアウトは特定の細胞または組織を目的とし、テクノロジーの制約
の結果、ある細胞または組織においてのみ存在してもよいし、または動物におけ
るすべて、または実質的にすべての細胞において存在してもよい。トランスジェ
ニック動物テクノロジーはまた、導入された遺伝子が、多量の本発明のポリペプ
チドを産生するために発現される全動物発現−クローニング系を提供する。
【００８４】 （用語説明） 以下の定義は、本明細書において汎用する用語の理解を容易にするためのもの
である。 本発明において使用される「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル
抗体、キメラ、１本鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ産物または他のイム
ノグロブリン発現ライブラリーの産物を包含するＦａｂフラグメントを包含する
。
【００８５】 「単離」とは、「人間の手により」その自然の状態から変更された、すなわち
、天然において存在する場合、その本来の環境から変更または除去されたかまた
はその両方であることを意味する。例えば、生きている生物において天然に存在
するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然
の状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本発明おいて使用される用語として「単離」される。さらに、形質転換、遺
伝子操作また任意の他の組換え法により生物中に導入されるポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは、その生物の生死に関わらず、前記生物において存在する場
合でも、「単離」される。
【００８６】 「ポリヌクレオチド」は、一般に、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡある
いは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド
またはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」は、一
本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ
の混合物であるＤＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ
、一本鎖、またはより典型的には二本鎖、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混
合物であるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、これに限
定されない。加えて、本発明において使用される「ポリヌクレオチド」は、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。か
かる領域における鎖は、同じ分子由来であってもよいし、あるいは異なる分子由
来であってもよい。三本螺旋領域の分子の一つはオリゴヌクレオチドであること
が多い。本発明において使用する場合、「ポリヌクレオチド」なる用語は、１ま
たはそれ以上の修飾された塩基を含む前記のＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに安定
性またはその他の理由で就職された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも包含する
。「修飾された」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシン
などの通常でない塩基を包含する。さまざまな修飾がＤＮＡまたはＲＮＡに対し
てなされている；したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然におい
て見いだされるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾さ
れた形態、ならびにウイルスおよび例えば単純および複雑な細胞を包含する細胞
に特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「ポリヌクレオチド」
はさらに、オリゴヌクレオチドと称することが多い短ポリヌクレオチドも包含す
る。
【００８７】 「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合により互いに結合
された１またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のポリペプチド、すなわち、ペプ
チドアイソスター（ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）を意味する。「ポリ
ペプチド」とは、一般的にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称する
短鎖、および一般に蛋白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは２０遺
伝子でコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」
は、自然のプロセス、例えば、翻訳後プロセッシングによるか、または当業者に
周知の化学修飾技術により修飾されたアミノ酸を包含する。かかる修飾は、基本
テキストにおいてよく説明され、さらに詳細な小論文、ならびに多冊の研究刊行
物においてさらに詳細に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖
、およびアミノまたはカルボキシル末端を包含するポリペプチドにおける任意の
場所において起こり得る。同じタイプの修飾が、所定のポリペプチドのいくつか
の部位で、同じかまたは異なる程度で存在し得ることは理解できるであろう。ま
た、所定のポリペプチドは多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。ポリペプチ
ドは、ユビキチネーション（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｏｎ）の結果、分岐していて
もよく、分岐しているかまたはしていない環状であってもよい。環状、分岐およ
び分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセスによって生じたもので
あってもよく、または合成法により製造されたものであってもよい。修飾は、ア
セチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビン
の共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共
有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有
結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シス
テインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化
、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、
ミリストイル化、酸化、蛋白分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセ
ミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡに媒介
されるアミノ酸の蛋白への付加、およびユビキチネーションを包含する（例えば
、Proteins Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton,
W.H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Post-translatio
nal Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12 in Post-tran
slational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academi
c Press, New York (1983); Seifter et al., "Analysis for protein modifica
tions and nonproteiin cofactors", Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) and
Rattan et al., "Protein Synthesis; Post-translational Modifications and
Aging", Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)参照）。
【００８８】 ポリペプチド配列の「フラグメント」は、参照配列よりも短いが、ポリペプチ
ドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド配列を意味す
る。ポリペプチド配列の「フラグメント」は、配列番号：１の参照配列よりも短
いポリヌクレオチド配列を意味する。
【００８９】 本発明において使用される「変種」は、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドと異なるが、基本的性質を保持するポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドである。典型的なポリヌクレオチドの変種は、参照ポリヌクレオチドとヌ
クレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列における変化は、参照ポリヌ
クレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しな
くてもよい。ヌクレオチド変化の結果、以下に説明するように、参照配列により
コードされるポリペプチドにおて、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端
切断が生じる。典型的なポリペプチドの変種は、参照ポリペプチドとアミノ酸配
列が異なる。一般に、相違は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が全体的に極
めて類似し、多くの領域において同一であるように限定される。変種および参照
ペプチドは、アミノ酸配列において、１またはそれ以上の置換、挿入、欠失の任
意の組合せにより異なる。置換された、または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝
子コードによりコードされてもよいし、またはコードされなくてもよい。典型的
な保存的置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅおよびＴｙｒ
を包含する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、天然に存在する、
例えば対立遺伝子変種であってもよいし、または天然に存在しない変種であって
もよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在することが知られて
いない変種は、突然変異誘発技術、直接合成、および当業者に一般的な他の組換
え法により調製することができる。変種としては、１またはそれ以上の翻訳後修
飾、例えば、グリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＰリボシル化などを有す
るポリペプチドが包含される。例としては、Ｎ−末端アミノ酸のメチル化、セリ
ンおよびスレオニンのリン酸化およびＣ−末端グリシンの修飾が挙げられる。
【００９０】 「対立遺伝子」とは、ゲノムにおける所定の位置で存在する遺伝子の２または
それ以上の代替形態の一つを意味する。 「多形性」とは、集団内のゲノムにおける所定の位置でのヌクレオチド配列（
および関連するならばコードされたポリペプチド配列）における多様性を意味す
る。
【００９１】 「一塩基多型」（ＳＮＰ）は、集団内のゲノムにおける一つのヌクレオチドの
位置でのヌクレオチドの可変性を意味する。ＳＮＰは、遺伝子内またはゲノムの
遺伝子間領域内で存在する。ＳＮＰは、対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）を用い
て分析することができる。該プロセスについて、少なくとも３個のプライマーが
必要である。共通のプライマーは、分析される多形性について逆相補性において
用いられる。この共通のプライマーは、多形性塩基から得られる５０から１５０
０ｂｐの間である。他の２（またはそれ以上）のプライマーは、最後の３’塩基
が、多形性を構成する２（またはそれ以上）の対立遺伝子の１つと一致するため
に変動する以外は互いに同一である。それぞれ共通のプライマーおよび対立遺伝
子特異性プライマーの１つを使用する２（またはそれ以上）のＰＣＲ反応をサン
プルＤＮＡについて行う。
【００９２】 本発明において使用される「スプライス変種」は、まず同じゲノムＤＮＡ配列
から転写されるが、交互ＲＮＡスプライシングを受けたＲＮＡ分子から産生され
るｃＤＮＡ分子を意味する。交互ＲＮＡスプライシングは、一般にイントロンを
除去するために、一次ＲＮＡ転写物がスプライシングを受けた場合に起こり、そ
の結果、それぞれが異なるアミノ酸配列をコードする１以上のＲＮＡ分子が産生
される。スプライス変種なる用語はまた、前記ｃＤＮＡ分子によりコードされる
蛋白も意味する。
【００９３】 「同一性」は、配列を比較することにより確認される、２またはそれ以上のポ
リペプチド配列または２またはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映
する。一般に、同一性は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリ
ペプチド配列のヌクレオチドとヌクレオチドまたはアミノ酸とアミノ酸が、比較
される配列の全長にわたって正確に一致することを意味する。
【００９４】 「同一性（％）」−正確に一致しない配列については、「同一性（％）」を決
定することができる。一般に、比較される２つの配列を一直線に並べて、配列間
の最大の相関を得る。これは、いずれか一方または両方の配列中に「ギャップ」
を挿入して、整列度を増大させることを含む。同一性（％）は、比較される配列
（いわゆるグローバルな配列）のそれぞれの全長にわたって測定することができ
、これは同じかまたは非常に類似した長さの配列に特に適している。また、より
短い、限定された長さにわたっては（いわゆる局所的整列）、等しくない長さの
配列についてより適している。
【００９５】 「類似性」は、さらに、２つのポリペプチド配列間の関係のより複雑な基準で
ある。一般に、「類似性」は、残基に基づき、比較される配列のそれぞれから残
基対間の正確な一致だけでなく、正確に一致しない場合、進化に基づき、１つの
残基が他と置換しやすいかどうかを考慮して、２つのポリペプチド鎖のアミノ酸
を比較をすることを意味する。類似性は、関連する「得点」を有し、これから２
つの配列の「類似性」を決定することができる。
【００９６】 ２またはそれ以上の配列の同一性および類似性を比較する方法は、当該分野に
おいて一般的である。したがって、例えば、Wisconin Sequence Analysis Packa
ge, version 9.1(Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984、
Genetics Computer Groups, Madison, Wisconsin, USAから入手可能)において利
用可能なプログラム、例えば、２つのポリヌクレオチドの同一性（％）ならびに
２つのポリペプチド配列間の同一性（％）および類似性（％）を決定するために
、プログラムＢＥＴＳＦＩＴおよびＧＡＰを用いることができる。ＢＥＳＴＦＩ
ＴはSmith and Watermanの「局所的相同性」（J Mol Biol, 147, 195-197, 1981
, Advances inn Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981）を使用し、２つの配
列間で最も類似している１つの領域を見いだす。ＢＥＳＴＦＩＴは長さが異なる
２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列を比較するのにより
適し、該プログラムは、短い配列は長いものの一部であると仮定している。比較
として、ＧＡＰは２つの配列を整列させ、Neddleman and Wunschのアルゴリズム
（J Mol Biol, 48, 443-453, 1970）にしたがって、「最大類似性」を見いだす
。ＧＡＰは、ほぼ同じ長さの配列を比較するのにより適し、配列は全長にわたっ
て予想される。好ましくは、各プログラムにおいて用いられるパラメーター「Ｇ
ａｐ重量」および「長さ重量」は、ポリヌクレオチド配列については５０および
３であり、ポリペプチド配列については１２および４である。好ましくは、同一
性（％）および類似性は、２つの比較される配列が最適に整列されている場合に
決定される。
【００９７】 配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラム、例え
ば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Altschul S F et al, J Mol Biol, 21
5, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1
997、National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Mar
yland , USAから入手可能であり、ＮＣＢＩのホームページ（www.ncbi.nlm.nih.
gov）によりアクセス可能である）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R, Methods in
Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Natl Aca
d Sci USA, 85, 2444-2448, 1988、Wisconsin Sequence Analysis Packageの一
部として入手可能）も当該分野において公知である。
【００９８】 好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス（Henikoff S and H
enikoff J G. Proc. Nat. Acad Sci, USA, 89, 10915-10919, 1992）は、ヌクレ
オチド配列がまず比較の前にアミノ酸に翻訳されるポリペプチド配列の比較にお
いて用いられる。 好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴは、参照ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド配列に関して、問題のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の同一
性（％）を決定するために用いられ、問題の配列および参考配列は、最適に整列
され、プログラムのパラメーターは、以下に記載するように、デフォルト値に設
定される。
【００９９】 「同一性指数」は、候補配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）と参照
配列を比較するために用いることができる配列の関連性の基準である。したがっ
て、例えば、参照ポリペプチド配列と比較して、例えば、０．９５の同一性指数
を有する候補ポリヌクレオチド配列は、候補ポリヌクレオチドが、参照配列のそ
れぞれ１００のヌクレオチドにつき平均で５までの違いを含む以外は、参照配列
と同一である。かかる違いは、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、移行およ
び横断を包含する置換、または挿入からなる群から選択される。これらの違いは
、参照ポリヌクレオチド配列の５’または３’末端で、またはこれらの末端位置
の間の任意の場所で、参照配列においてヌクレオチド間で個々に分散されている
か、または参照配列内の１またはそれ以上の隣接したグループにおいて生じる。
言い換えれば、参照ポリヌクレオチド配列と比較して、同一性指数が０．９５で
あるポリヌクレオチド配列を得るためには、参照配列の１００のヌクレオチドに
つき平均５までが、以下に記載するように、欠失、置換または挿入、あるいは任
意の組合せがなされていてもよい。同じことは、同一性指数の他の値、例えば、
０．９６、０．９７、０．９８および０．９９について、必要な変更を加えてあ
てはまる。
【０１００】 同様に、ポリペプチドについて、例えば参照ポリペプチド配列と比較して同一
性指数が０．９５である候補ポリペプチド配列は、参照配列の１００個のアミノ
酸につき平均５までの違いを含んでもよい。かかる違いは、少なくとも１つのア
ミノ酸の欠失、保存的および非保存的置換を包含する置換、または挿入からなる
群から選択される。これらの違いは、参照ポリペプチド配列のアミノ−またはカ
ルボキシ−末端の位置で、あるいはこれらの末端位置の間のどこかで起こり、参
照配列におけるここのアミノ酸間で分散されているか、または参照配列内の１ま
たはそれ以上の隣接したグループにおいて起こるかのいずれかである。言い換え
れば、参照ポリペプチド配列と比較して０．９５の同一性指数を有するポリペプ
チドを得るためには、参照配列において１００のアミノ酸につき平均５までが以
下に記載するように、欠失、置換または挿入、またはその任意の組合せがなされ
ていてもよい。同じことは、他の同一性指数の値、例えば、０．９６、０．９７
、０．９８および０．９９について、必要な変更を加えて当てはまる。
【０１０１】 ヌクレオチドまたはアミノ酸の数の差と同一性指数間の関係は、次式： ｎａ≦ｘａ・（ｘａ・Ｉ） （式中： ｎａはヌクレオチドまたはアミノ酸の差の数である。 ｘａはそれぞれ配列番号：１または配列番号：２におけるヌクレオチドまたはア
ミノ酸の合計数である。 Ｉは同一性指数である ・はかけ算の演算子の記号である。 ここに、ｘａとＩの任意の整数でない積は、ｘａから差し引く前に最も近い整数
とする） により表される。
【０１０２】 「ホモログ」は、参照配列と高度の配列関連性を有するポリヌクレオチドまた
はポリペプチド配列を示すために当該分野において用いられる一般用語である。
かかる関連性は、以下に定義するような２つの配列間の同一性および／または類
似性の程度を測定することにより定量化することができる。「オルトログ」およ
び「パラログ」なる用語もこの一般用語に含まれる。「オルトログ」は、別の種
におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的同等物であるポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドを意味する。「パラログ」は、機能的に類似している
同じ種内のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
【０１０３】 「融合蛋白」は、２つの、しばしば関連しない融合遺伝子またはそのフラグメ
ントによりコードされる蛋白を意味する。一例において、ＥＰ−Ａ−０４６４５
３３−Ａは、免疫グロブリン分子の定常領域のさまざまな部分を、別のヒト蛋白
またはその一部と共に含む融合蛋白を開示している。多くの場合において、融合
蛋白の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用いることは、療法および診断にお
ける使用に有利であり、例えば、薬物動態学的性質が向上される［例えば、ＥＰ
−Ａ−０２３２２６２参照］。一方、用途によっては、融合蛋白が発現され、検
出され、精製された後にＦｃ部分を欠失できることが望ましい。
【０１０４】 ヒスタミン様化合物は、ヒスタミン（１Ｈ−イミダゾール−４−エタナミン）
の誘導体を意味し、好ましい例においては、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）ま
たは（ＩＶ）の化合物である。
【化１】
【０１０５】 本明細書において言及される特許および特許出願に限定されないすべての刊行
物および参考文献は、それぞれの刊行物または参考文献のそれぞれが完全に記載
されているかのように、全体として本発明の一部として参照される。本出願が優
先権を主張するすべての特許出願も刊行物および参考文献について記載したよう
に、全体として本発明の一部として参照される。
【０１０６】 実施例 実施例１：哺乳動物細胞発現 本発明の受容体は、ヒト胎生腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞または癒着性ｄｈ
ｆｒＣＨＯ細胞のいずれかにおいて発現される。受容体の発現を最大にするため
に、典型的にはすべての５’および３’未翻訳領域（ＵＴＲ）を、ｐＣＤＮまた
はｐＣＤＮＡ３ベクター中に挿入する前に受容体ｃＤＮＡから除去する。細胞を
リポフェクチンにより各受容体ｃＤＮＡでトランスフェクトし、４００ｍｇ／ｍ
ｌのＧ４１８の存在下で選択する。３週間選択した後、各クローンを採取し、さ
らに分析するために増殖させる。ベクターのみでトランスフェクトされたＨＥＫ
２９３またはＣＨＯ細胞は負の対照として働く。各受容体を安定に発現する細胞
系を単離するために、約２４のクローンが典型的に選択され、ノザンブロット分
析により分析される。受容体ｍＲＮＡは一般に分析されたＧ４１８−耐性クロー
ンの約５０％において検出可能である。
【０１０７】 実施例２ 結合および機能分析のためのリガンドバンク ６００を越える推定受容体リガンドのバンクをスクリーニングのために組み立
てた。該バンクは：ヒトの７個の貫膜（７ＴＭ）受容体により作用することが知
られているトランスミッター、ホルモンおよびケモカイン；ヒト７ＴＭ受容体の
推定アゴニストである天然に存在する化合物、哺乳動物カウンターパートが同定
されていない哺乳動物以外の生物学的に活性なペプチド；および天然に見いださ
れないが、未知の天然のリガンドで７ＴＭ受容体を活性化する化合物を含む。こ
のバンクを機能的分析（すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメ
ーターならびに卵母細胞電気生理現象など、下記参照）ならびに結合分析の両方
を用いてまず公知のリガンドの受容体についてスクリーンするために用いる。
【０１０８】 実施例３ リガンド結合分析 リガンド結合分析は、受容体薬理学を確認するための直接法を提供し、高処理
量フォーマットに応用可能である。受容体の精製されたリガンドを結合研究のた
めに高比活性（５０−２０００Ｃｉ／ミリモル）に放射標識する。次に、放射標
識のプロセスがリガンドのその受容体に対する活性を減少させないことを確認す
る。緩衝液、イオン、ｐＨおよび他のモジュレーター、例えば、ヌクレオチドの
分析条件を最適化して、膜および全細胞受容体供給源の両方について実行可能な
シグナル対ノイズ比を確立する。これらの分析について、特定の受容体結合は、
（すべての関連する放射能）−（過剰の標識されていない競合するリガンドの存
在下で測定された放射能）として定義される。可能ならば、残存する比特異性結
合を定義するために、２以上の競合するリガンドを用いる。
【０１０９】 実施例４ ツメガエル卵母細胞における機能分析 本発明の受容体ＤＮＡをコードする直線化されたプラスミドテンプレートから
得られるキャップされたＲＮＡ転写物を、インビトロでＲＮＡポリメラーゼを用
いて標準的手順に従って合成する。インビトロ転写物を水中に最終濃度０．２ｍ
ｇ／ｍｌで懸濁させる。卵巣葉を成体メスカエルから取り出し、Ｖ期の小胞を有
さない卵母細胞を得、ＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）を、マイクロインジ
ェクション装置を用いて５０ｎｌボーラスにおいて注射する。２つの電極電圧ク
ランプを用いて、アゴニスト暴露に反応して各ツメガエル卵母細胞から生じる電
流を測定する。室温のＣａ２＋を含まないＢａｒｔｈの培地において記録を行う
。リガンドを活性化するための公知のリガンドおよび組織／細胞抽出物をスクリ
ーンするためにツメガエル系を用いることができる。
【０１１０】 実施例５： マイクロフィジオメトリー分析 広範囲におよぶセカンドメッセンジャー系を活性化すると、細胞から少量の酸
が噴出する。生じる酸は、主に細胞内シグナル化プロセスを活性化するために必
要な代謝活性の増加の結果である。細胞を取り巻く培地におけるｐＨの変化は、
非常に小さいが、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲマイクロフィジオメーター（Molecular
Devices Ltd., Menlo Park, CA）により検出可能である。ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ
は、したがって細胞内シグナル化経路を利用したエネルギーと関連する受容体、
例えば、本発明のＧ蛋白結合受容体の活性化を検出することができる。
【０１１１】 実施例６： 抽出／細胞上清スクリーニング 多数の哺乳動物受容体は、まだこれについての同起源の活性化リガンド（アゴ
ニスト）がない状態である。したがって、これらの受容体の活性なリガンドは、
今日まで同定されたリガンドバンクに含まれない。したがって、天然のリガンド
を同定するために、本発明の７ＴＭ受容体を組織抽出物に対して機能的にスクリ
ーン（カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理現
象などの機能的スクリーンを使用）する。正の機能的応答を生じる抽出物を、活
性化リガンドが単離され、同定されるまで、逐次的に副分割することができる。
【０１１２】 実施例７： カルシウムおよびｃＡＭＰ機能分析 ＨＥＫ２９３細胞において発現される７ＴＭ受容体は、ＰＣＬの活性化および
カルシウム流動化および／またはｃＡＭＰ刺激または阻害と機能的に関連するこ
とが証明されている。受容体でトランスフェクトされた、またはベクターコント
ロール細胞におけるＨＥＫ２９３細胞における基礎的カルシウムレベルは、正常
な、１００ｎＭないし２００ｎＭの範囲内にあることが観察された。組換え受容
体を発現するＨＥＫ２９３細胞にｆｕｒａ２を加え、一日に、１５０より多い選
択されたリガンドまたは組織／細胞抽出物をアゴニストにより誘発されたカルシ
ウム流動化により評価する。同様に、標準的ｃＡＭＰ定量化分析を用いて、組換
え受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞をｃＡＭＰ産生の刺激または阻害について
評価する。カルシウムトランジェントまたはｃＡＭＰ変動をもたらすアゴニスト
を、ベクターコントロール細胞において試験して、反応が受容体を発現するトラ
ンスフェクトされた細胞について独自のものであるかどうかを確認する。
【０１１３】 実施例８ 好ましい一のスクリーニング法は、ＨＥＫ−２９３細胞を、Ｇ蛋白結合受容体
（ＧＰＣＲ）をコードする哺乳動物発現プラスミド、例えば、ＡＸＯＲ３５と、
Ｇα１５（Wilkie T. M. et al Proc Natl Acad Sci USA 1991 88: 10049-10053
）、Ｇα１６（Amatruda T.T. et al Proc Natl Acad Sci USA 1991 8:5587-559
1）、およびＧｑｉ５、Ｇｑｓ５、およびＧｑｏ５と称する３種のキメラＧ蛋白(
Conklin BR et al Nature 1993 363: 274-276, Conklin B.R. et al Mol Pharma
col 1996 50:885-890)をコードする哺乳動物発現プラスミドｃＤＮＡを含む混合
物と共にコトランスフェクトすることを含む。２４時間インキュベーション後に
、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞をポリ−Ｄ−リシンでコートされ
た９６ウェルブラック／クリアプレート（Becton Dickinson, Bedford, MA）中
にプレートする。細胞をＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー、Mole
cular Devices, Sunnyvale, CA）で、試験リガンドを添加した後のカルシウム流
動化反応について分析する。所定のＧＰＣＲおよびＧ蛋白混合物を発現するＨＥ
Ｋ−２９３細胞におけるカルシウム流動化を刺激するリガンドの同定により、も
しあるならばどのＧ蛋白が機能的反応に必要とされるかを確認するためにその後
の実験を行う。ＨＥＫ−２９３細胞を次に試験ＧＰＣＲでトランスフェクトする
か、または試験ＧＰＣＲおよびＧα１５、Ｇα１６、Ｇｑｉ５、Ｇｑｓ５、また
はＧｑｏ５とともにコトランスフェクトする。ＧＰＣＲがＨＥＫ−２９３細胞に
おける機能発現にＧ蛋白の１つが存在することを必要とするならば、その後のす
べての実験をＧＰＣＲおよび最良の反応をもたらすＧ蛋白と共にコトランスフェ
クトしたＨＥＫ−２９３細胞について行う。別法として、受容体を異なる細胞系
、例えば、ＲＢＬ−２Ｈ３において、Ｇ蛋白を追加せずに発現させることができ
る。 同様の方法を用いて、本発明者らは、ヒスタミンおよびヒスタミン様化合物は
ＡＸＯＲ３５のリガンドであることを見いだした。さらに、本発明者らは、Ｇα
１５（Feild JA, Foley JJ, Testa TT, Nuthulaganti P, Ellis C, Sarau HM, A
mes RS. Cloning and characterization of a rabbit ortholog of human Galph
a 16 and mouse G(alpha)15. FEBS Lett. 1999 Oct 22;460 (1):53-6）)、Ｇα
１６、Ｇｑｉ５、およびＧｑｏ５はＡＸＯＲ３５と結合するが、Ｇｑｓ５は結合
しないことを見いだした。
【０１１４】 実施例９ ヒスタミンで攻撃する前に、一時的にＡＸＯＲ３５を発現する細胞を試験化合
物の濃度を増大させて処理した。試験化合物がアゴニストであるならば、カルシ
ウムの細胞内移動の結果生じる、濃度に依存した蛍光シグナルが観察される。こ
れは、ヒスタミン（ＥＣ８０＝１００ｎＭ）で攻撃された対照細胞に対してシグ
ナルの減少が観察される場合に確認される。これは、試験化合物による受容体の
脱感作により起こる。アゴニスト活性は、最大ヒスタミン反応の５０％を生じる
のに必要な試験化合物の濃度（ＥＣ５０）として計算される。試験化合物がアン
タゴニストであるならば、化合物から蛍光シグナルは生じず、ヒスタミン攻撃の
濃度に依存した減少が観察される。アンタゴニスト活性は、最大ヒスタミン応答
の５０％を阻害するのに必要とされる試験化合物の濃度（ＩＣ５０）として計算
される。
【０１１５】 実施例１０ ベータ−フェニルヒスタミン二塩酸塩（ＶＩＩ） ２−（１Ｈ−イミダゾール−４（５）−イル）−２−フェニルアセトニトリル
（２５０ｍｇ）（米国特許第５１７１７４４号）の乾燥ＴＨＦ中溶液に、０．６
ＭのＡｌＨ３のＴＨＦ溶液を添加した（Brown & Yoon, J. Am. Chem. Soc. 1966
, 88, 1464）。結果として得られる溶液を室温で１時間撹拌し、還流温度で３時
間、その後室温で一夜撹拌した。数滴の水を添加し、ＴＨＦを真空下で除去した
。残存する固体を部分的に水中に溶解させ、ろ過した。濾液をクロロホルムで抽
出し、水性相を濃縮乾固させ、アセトンで沈殿させて、粗生成物を得た。この沈
殿を水中に溶解させ、ろ過し、Ｋ２ＣＯ３でｐＨ１１の塩基性にし、クロロホル
ムで抽出した。有機物を乾燥し、濃縮して、緑色油状物を得、これをエタノール
性ＨＣｌで処理し、白色固体が析出した。この固体をエタノールから再結晶して
、白色結晶としてベータ−フェニルヒスタミン二塩酸塩を得た。融点２６４−２
６６℃。
【０１１６】 実施例１１ ベータ−（４−クロロベンジル）ヒスタミン二塩酸塩（ＶＩＩ） １ａ 水（１０ｍＬ）中水酸化ナトリウム（１．６ｇ）を、４−イミダゾール
アセトニトリル（８ｇ）およびｐ−クロロベンズアルデヒド（１５．８ｇ）のメ
タノール（８０ｍＬ）中混合物に添加した。暗赤色混合物を室温で１８時間放置
し、その後還流温度で２時間加熱した。混合物を真空下で約４０ｍＬに濃縮し、
水（２００ｍＬ）で希釈し、黄色固体が析出した。この固体をろ過により集めて
、純粋でない生成物を得た。熱酢酸エチルを用いて固体を再結晶し、褐色結晶を
３回収穫して、純粋な２−（４−イミダゾリル）−ｐ−クロロシンナモトリル（
１０．５ｇ）を得た。 １ｂ ナトリウムアマルガム（１５０ｇ、３％）を少量ずつ、室温の前記２−
（４−イミダゾリル）−ｐ−クロロシンナモニトリル（１０．５ｇ）のメタノー
ル（５００ｍＬ）および水（１９０ｍＬ）中撹拌溶液に添加した。二酸化炭素を
溶液に吹き込んで、ｐＨを９付近に維持した。結果として得られた混合物を室温
で１．５時間撹拌し、その後、還流温度に加熱した。さらにナトリウムアマルガ
ム（５０ｇ）を添加し、還流を１．５時間続けた。冷却後、反応混合物をセライ
トを通してろ過し、濾液を真空中で濃縮し、白色固体を得た。固体を、沸騰５０
％酢酸エチル／イソプロパノールを用いて２回抽出し（２×２００ｍＬ）、抽出
物を約８０ｍＬまで濃縮した。濃縮された抽出物を冷凍庫中に一夜放置すると、
生成物が結晶化し、純粋な３−ｐ−クロロフェニル−２−（４−イミダゾリル）
プロピオニトリルが得られた。 １ｃ 塩化アルミニウム（１．１ｇ）を少量ずつ乾燥ＴＨＦ（３０ｍＬ）に窒
素雰囲気下で添加した（注意−これは激しく反応する）。その後、ＬｉＡｌＨ４ （０．９ｇ）を数回に分けて添加し、結果として得られた混合物を１．５時間撹
拌した。この後、混合物をセライトを通してろ過して、無色濾液を得た。前記３
−ｐ−クロロフェニル−２−（４−イミダゾリル）プロピオニトリル（２．５ｇ
）を数回に分けて撹拌しながら濾液に添加すると、激しく発泡した。添加が完了
したら、反応混合物を３０分間室温で撹拌した。水を添加することにより（注意
して滴下する）過剰の水素化物を分解し、白色沈殿が生じた。混合物をセライト
を通して濾過し、酢酸エチルで洗浄した。濾液を濃縮し、洗浄すると、濃厚な黄
色油状物が得られた。油状物をエタノール性ＨＣｌ中に溶解させ、濃縮して、黄
色油状物を得た。イソプロパノールでトリチュレートして、白色固体を得、これ
をメタノール／イソプロパノールから再結晶して、白色結晶として、ベータ−（
４−クロロベンジル）ヒスタミン二塩酸塩を得た。融点２５４−２５６℃。
【０１１７】 実施例１２ Ｎ−（２，５−ジフルオロ−ベンジル）−Ｎ’−［２−（３，４
−ジメトキシ−フェニル）−エチル］−Ｎ”−［２−（１Ｈ−イミダゾール−４
−イル）エチル］−［１，３，５］トリアジン−２，４，６−トリアミン（ＸＩ
ＩＩ）
【化２】
【０１１８】 Garigipatiの方法（Garrigipati R.S. Tetrahedron Letter 1997, 38(39), 68
07-6810）を用いて、商業的に入手可能なリンク酸樹脂１（１％架橋ＤＶＢ、ポ
リスチレン、１．３７ミリモル／ｇ）から大量に塩化リンク樹脂２を調製した。 塩化リンク樹脂２（２５ｍｇ、〜０．０３４ミリモル、１当量）の０．８５ｍ
Ｌのジクロロメタン中懸濁液に、３，４−ジメトキシフェネチルアミン（１０当
量）およびジイソプロピルエチルアミン（５当量）を添加した。結果として得ら
れる懸濁液を一夜室温で混合した。樹脂３を次にジクロロメタン（２×２ｍＬ）
、ジメチルホルムアミド（２×２ｍＬ）、メタノール（２×２ｍＬ）およびジク
ロロメタン（２×２ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥した。 −１０℃の樹脂３の０．８５ｍＬのジクロロメタン中懸濁液に、窒素雰囲気下
で、ジイソプロピルエチルアミン（１２当量）およびシアヌル酸塩化物（６当量
）を添加した。反応温度を室温まで上げ、懸濁液を一夜混合した。過剰の試薬お
よび溶剤を除去し、樹脂４を続いてジクロロメタン（２×２ｍＬ）、メタノール
（２×２ｍＬ）、ジクロロメタン（２×２ｍＬ）、メタノール（２×２ｍＬ）、
ジクロロメタン（２×２ｍＬ）、メタノール（２×２ｍＬ）で洗浄した。樹脂４
を次に真空オーブン中で一夜乾燥した（３０℃）。 ２，５−ジフルオロベンジルアミン（６当量）を、室温の樹脂４の１．４ｍＬ
のテトラヒドロフラン中懸濁液に添加した。６時間混合した後、過剰の試薬およ
び溶剤を除去した。樹脂をその後、テトラヒドロフラン（２×２ｍＬ）、メタノ
ール（２×２ｍＬ）、ジクロロメタン（２×２ｍＬ）、メタノール（２×２ｍＬ
）、ジクロロメタン（２×２ｍＬ）で洗浄し、その後、真空オーブン中で一夜乾
燥した（３０℃）。 ヒスタミン（９当量）を窒素雰囲気下で、樹脂の乾燥ジオキサン（１．２ｍＬ
）中懸濁液に添加した。混合物をその後９０℃で１６時間加熱した。過剰の試薬
および溶剤を除去した。樹脂５を、ジオキサン（２×２ｍＬ）、ジメチルホルム
アミド（２×２ｍＬ）、テトラヒドロフラン（２×２ｍＬ）、メタノール（２×
２ｍＬ）、ジクロロメタン（２×２ｍＬ）、メタノール（２×２ｍＬ）、ジクロ
ロメタン（２×２ｍＬ）で洗浄し、その後、真空オーブン中で一夜乾燥した（３
０℃）。 樹脂５をその後２０％トリフルオロ酢酸／ジクロロエタンで処理した（２×１
．５ｍＬ、１回の処理につき３０分）。風袋を測定した４ｍＬガラスバイアル中
に濾液を集め、減圧下で遠心エバポレーター中で蒸発させた。粗生成物（１２ｍ
ｇ）を６００ｕＬのジメチルスルホキシド中に溶解させ、その後、自動化分取Ｈ
ＰＣＬＣ（ＹＭＣ Ｃ１８逆相、２０×５０ｍｍ；１０−９５％ ＡＣＮ／水５
分勾配、流量２５ｍＬ／分）により精製した。溶剤を蒸発させた後、純粋なＮ−
（２，５−ジフルオロ−ベンジル）−Ｎ’−［２−（３，４−ジメトキシ−フェ
ニル）−エチル］−Ｎ”−［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−エチル］
−［１，３，５］トリアジン−２，４，６−トリアミン（ＸＩＩＩ）をＴＦＡ塩
として得た（１．２ｍｇ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ ５１１．２、２１４ｎｍでＵＶ検
出））。
【０１１９】 実施例１３ ＡＸＯＲ３５のアゴニストおよびアンタゴニストの基本的炎症応答に影響を及
ぼす能力を評価するために、以下のアラキドン酸誘発耳炎症およびＰＭＡ−誘発
性耳炎症モデルを用いることができる。 アラキドン酸誘発耳炎症 アセトン（２ｍｇ／２０μＬ）中アラキドン酸（ＡＡ、Sigma Chemicals, St.
Louis, MO）を左耳に上角皮から適用する。両耳の厚さを処置後１時間に定圧厚
さゲージ（Mitutoyo, Japan）で測定し、データを処置した耳と未処置の耳間で
の厚さの変化（平均±平均の標準誤差、ＳＥＭ、×１０−３ｃｍ）として表す。
ＡＡの投与の直前に、試験化合物をジメチルアセトイミド中局所的に投与する。
処置した耳を切り取り、ミエロペルオキシダーゼおよびサイトカインレベルにつ
いて試験するまで凍結する。 ＰＭＡ誘発耳炎症 アセトン（４μｇ／２０μＬ）中ＰＭＡ（Sigma Chemicals, St. Louis, MO）
を左耳に上角皮から適用する。両耳の厚さを処置後４時間に定圧厚さゲージ（Mi
tutoyo, Japan）で測定し、データを、処置した耳と未処置の耳間での厚さの変
化（平均±平均の標準誤差、ＳＥＭ、×１０−３ｃｍ）として表す。ＰＭＡの投
与の直前に、試験化合物をジメチルアセトイミド中局所的に投与する。処置した
耳を切り取り、ミエロペルオキシダーゼおよびサイトカインレベルについて試験
するまで凍結する。
【０１２０】 実施例１４ 細胞免疫性または遅延型過敏症反応についてのＡＸＯＲ３５のアゴニストおよ
びアンタゴニストの影響を試験するために、次のオキサゾロン誘発耳炎症モデル
を使用することができる。 オキサゾロン誘発耳炎症 オスＢＡＬＢ／ｃマウスの左耳を上角皮より、１．６％の接触増感剤であるオ
キサゾロンで処置した。７日後、マウスを０．８％のオキサゾロンで再攻撃し、
８時間後にさまざまな終点を測定した。終点は、これに限定されないが、耳の厚
さの変化（平均±ＳＥＭ、×１０−３ｃｍ）、ミエロペルオキシダーゼ含量およ
びサイトカインレベルを包含する。１．６％のオキサゾロンでの感作の少なくと
も３時間前に試験化合物を投与する。
【０１２１】 実施例１５ 喘息を治療するためのＡＸＯＲ３５のアゴニストまたはアンタゴニストの有効
性を評価するために、次のモルモットモデルにおける抗原誘発気管反応を用いる
ことができる。 感作プロトコル ０．３５ｍｌの５％（ｗ／ｗ）卵白アルブミン（ＯＡ）／塩溶液をそれぞれの
太股に１および４日に筋肉内注射（合計０．７ｍｌ）することによりオスＨａｒ
ｔｌｅｙモルモット（２００−２５０ｇ）を感作させる。モルモットは４週間（
覚醒実験）または６週間後（麻酔実験）に使用できる。 麻酔したモルモットにおける抗原誘発気管支収縮 抗原誘発気管支収縮を、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＡを静脈内投与することにより
惹起する。ＯＡの初期応答のピークで、次の用量０．２ｍｇ／ｋｇのＯＡ（０．
３ｍｇ／ｋｇ、累積）を投与する。抗原反応のピークで、１ｃｃ／ｋｇの飽和Ｋ
Ｃｌ溶液を注射する。ＯＡに対する反応を、ＫＣｌ誘発最大気管支収縮（％）と
して表す。この反応に影響を及ぼす薬剤を試験するために、化合物を静脈内（Ｏ
Ａ攻撃の１０分前）または皮下、腹膜組織内または経口（ＯＡ攻撃の３０分〜２
時間前）投与する。 エアゾル抗原誘発気管支収縮および意識のある動物への好酸球流入 ＯＡ感作したモルモットを、特異的気管コンダクタンス（ｓＧａｗ）を計算す
る非侵襲性呼吸分析器（Buxco Electronics, Sharon, CN）と連結したダブルフ
ローボディープレスチモグラフ（Penn-Century, Philadelphia, PA）中に入れる
。 実験によっては、アナフィラキシーを防止するために、動物をクロロフェニラ
ミン（０．１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）で処置する。この反応に影響を及ぼす薬剤
を試験するために、化合物を皮下、腹膜組織内または経口投与する（ＯＡ攻撃の
３０分〜２時間前）。 １０分安定化後、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓプルモソニックネブライザーにより１％
ＯＡのエアゾルを発生させ、１０秒間２５０ｍｌ／分の流量でプレスチモグラフ
中にノーズコーンにより送達する。 結果を抗原攻撃の直前のベースラインのよみからのｓＧＡＷにおける変化（％
）として表し、攻撃後１０分まで１〜２分ごとに報告する。 気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）をＯＡ暴露の２４時間後に行う。モルモットを致死
量のペントバルビトールで安楽死させ、放血させる。肺を５０ｍｌのダルベッコ
ＰＢＳで洗浄し（５×１０ｃｃ）、胸をやさしくマッサージした後に吸引する。
ＢＡＬ液をスピンダウンさせ、ペレットを０．２５％ＮａＣｌ中に再懸濁させて
、残存する赤血球を溶解させる。遠心分離後、ペレットを再び０．９％ＮａＣｌ
中に再懸濁させる。全細胞計数後、スライドを調製し、染色する。最少の２００
細胞を計数し、全細胞の百分率として表すことにより、細胞は好酸球、好中球、
および単核細胞として同定される。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/00 ４Ｃ０８５ 48/00 3/10 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 1/00 9/10 ４Ｈ０４５ 3/10 １０１ 9/10 11/00 １０１ 11/06 11/00 13/00 11/06 13/12 13/00 19/02 13/12 25/00 19/02 25/16 25/00 25/18 25/16 25/22 25/18 25/24 25/22 25/28 25/24 29/00 25/28 29/02 29/00 31/04 29/02 31/12 31/04 37/02 31/12 37/08 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/705 37/08 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，Ｕ Ｓ (71)出願人 スミスクライン ビーチャム パブリック リミテッド カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ． イギリス国 ティダブリュ８ ９ジーエ ス，ミドルセックス，ブレントフォード， グレート ウェスト ロード 980 (72)発明者 ケリー・エム・オーバート アメリカ合衆国19355ペンシルベニア州マ ルバーン、ペンズ・レイン101番 (72)発明者 ダーク・ジェイ・バーグスマ アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、アイリッシュ・ロード271番 (72)発明者 ローラ・アール・フィッツジェラルド アメリカ合衆国19348ペンシルベニア州ケ ネット・スクエア、メドーバンク・ロード 741番 (72)発明者 トッド・エル・グレイビル アメリカ合衆国19465ペンシルベニア州ポ ッツタウン、ハーモニービル・ロード1240 番 (72)発明者 リ・シャオトン アメリカ合衆国19333ペンシルベニア州デ ボン、シュガータウン・ロード332番 (72)発明者 デイビッド・ミカロビッチ イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス (72)発明者 ドワイト・エム・モロー アメリカ合衆国19380ペンシルベニア州ウ エスト・チェスター、ウォーターフォー ド・ロード1230番 (72)発明者 ユアン・ジュ アメリカ合衆国19422ペンシルベニア州ブ ルー・ベル、オークモント・ドライブ203 番 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB20 CA25 CB01 CB03 CB07 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB04 FB06 FB07 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 GA11 HA12 4B064 AG20 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 MA01 NA14 ZA012 ZA052 ZA082 ZA122 ZA152 ZA182 ZA362 ZA372 ZA392 ZA402 ZA422 ZA452 ZA512 ZA592 ZA662 ZA702 ZA732 ZA812 ZA962 ZB072 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZB332 ZB352 ZC352 ZC412 4C085 AA13 AA14 CC32 DD33 DD62 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA05 ZA08 ZA12 ZA15 ZA18 ZA36 ZA37 ZA39 ZA40 ZA42 ZA45 ZA51 ZA59 ZA66 ZA70 ZA73 ZA81 ZA96 ZB07 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB33 ZB35 ZC35 ZC41 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA75 EA22 EA50 FA72 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：１の配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離さ
    れたポリペプチド； （ｂ）配列番号：２のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する
    ポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド； （ｃ）配列番号：２のポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド； （ｄ）配列番号：２のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する
    単離されたポリペプチド； （ｅ）配列番号：２のポリペプチド配列；および （ｆ）（ａ）ないし（ｅ）におけるポリペプチドのフラグメントおよび変種 からなる群から選択される単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 （ａ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有
    するポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１のポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：１のポリヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性を有する
    単離されたポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：１の単離されたポリヌクレオチド； （ｅ）配列番号：２のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する
    ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌク
    レオチド； （ｆ）配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む
    単離されたポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号：２のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する
    ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌ
    クレオチド； （ｈ）配列番号：２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド
    ； （ｉ）配列番号：１の配列または少なくとも１５個のヌクレオチドを有するそ
    のフラグメントを有する標識されたプローブを用いるストリンジェントなハイブ
    リダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングすることにより得られ
    る、少なくとも１００個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する単離された
    ポリヌクレオチド；および （ｊ）（ａ）ないし（ｉ）のポリヌクレオチドのＲＮＡ同等物であるポリヌク
    レオチド； または前記の単離されたポリヌクレオチドと相補性であるポリヌクレオチド配列
    および前記ポリヌクレオチドの変種およびフラグメントであるか、またはその全
    長にわたって前記ポリヌクレオチドと相補性であるポリヌクレオチド からなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチドに対して免疫特異性である抗体
    。
  4. 【請求項４】 ポリクローナル抗体である請求項３記載の抗体。
  5. 【請求項５】 発現ベクターが適合性宿主細胞中に存在する場合に請求項１
    記載のポリペプチドの産生能を有するポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  6. 【請求項６】 適当な培養条件下で宿主細胞がポリペプチドを産生するよう
    に請求項１記載のポリペプチドの産生能を有するポリヌクレオチドを含む発現ベ
    クターを細胞中に導入する工程を含む組換え宿主細胞を産生する方法。
  7. 【請求項７】 請求項６記載の方法により産生される組換え宿主細胞。
  8. 【請求項８】 ポリペプチドを発現する請求項７記載の組換え宿主細胞の膜
    。
  9. 【請求項９】 ポリペプチドの産生に十分な条件下で請求項７記載の宿主細
    胞を培養し、該ポリペプチドを培養物から回収することを含むポリペプチドを産
    生する方法。
  10. 【請求項１０】 ＡＸＯＲ３５ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニ
    ストを同定する方法であって、 細胞表面にポリペプチド、すなわち一の化合物と該ポリペプチドとの結合に応
    答して検出可能なシグナルの供給能を有する第二の成分と結合するポリペプチド
    を発現する細胞を、ポリペプチドとの結合を可能にする条件下でスクリーンされ
    るべき化合物と接触させ； 化合物とポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルのレベルを測定するこ
    とにより、該化合物が該ポリペプチドと結合し、そのポリペプチドを活性化する
    か、または阻害するかどうかを決定することを含む、方法。
  11. 【請求項１１】 ＡＸＯＲ３５ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニ
    ストを同定する方法であって、 （ａ）細胞表面にポリペプチド、すなわち一の化合物と該ポリペプチドとの結
    合に応答して検出可能なシグナルの供給能を有する第二の成分と結合するポリペ
    プチドを発現する細胞を、ポリペプチドとの結合を可能にする条件下でスクリー
    ンされるべき化合物と接触させ； （ｂ）化合物とポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルのレベルを、化
    合物が存在しない場合のシグナルのレベルと比較することにより、該化合物が該
    ポリペプチドと結合し、そのポリペプチドを活性化するか、または阻害するかど
    うかを決定することを含む、方法。
  12. 【請求項１２】 さらに、標識または未標識ヒスタミンまたはヒスタミン様
    化合物の存在下でアゴニストまたはアンタゴニストの同定を行うことを含む請求
    項１０または１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ＡＸＯＲ３５ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニ
    ストを同定する方法であって、 ポリペプチドとの結合を可能とする条件下、候補化合物の存在下で、リガンド
    と、細胞表面にポリペプチドを有する細胞との、またはペプチドを含む細胞膜と
    の結合の阻害を測定し、ポリペプチドと結合するリガンドの量を測定し、リガン
    ドの結合を減少させることができる化合物がアゴニストまたはアンタゴニストと
    なることを含む、方法。
  14. 【請求項１４】 リガンドが標識または未標識ヒスタミンまたはヒスタミン
    様化合物である請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ＡＸＯＲ３５ポリペプチドアンタゴニストまたはアゴニス
    トをスクリーニングする方法であって、 （ａ）標識されたヒスタミンおよびヒスタミン様化合物を、細胞表面でＡＸＯ
    Ｒ３５ポリペプチドを発現する全細胞、またはＡＸＯＲ３５ポリペプチドを含む
    細胞膜と共にインキュベートし； （ｂ）全細胞または細胞膜と結合した標識されたヒスタミンまたはヒスタミン
    様化合物の量を測定し； （ｃ）標識されたヒスタミンまたはヒスタミン様化合物と工程（ａ）の全細胞
    または細胞膜の混合物に候補化合物を添加して平衡状態にし； （ｄ）工程（ｃ）の後に全細胞または細胞膜と結合した標識されたヒスタミン
    またはヒスタミン様化合物の量を測定し； （ｅ）工程（ｄ）において結合を減少させる化合物がアゴニストまたはアンタ
    ゴニストとなる工程（ｂ）および（ｄ）において結合した標識されたヒスタミン
    またはヒスタミン様化合物における違いを比較する ことを含む、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１０〜１５に記載の方法のいずれか１つにより同定
    されるアゴニストまたはアンタゴニストを、治療を必要とする患者に投与するこ
    とによる、本発明の疾患を治療する方法。
  17. 【請求項１７】 喘息である請求項１６記載の疾患。
  18. 【請求項１８】 ＡＸＯＲ３５アゴニストまたはアンタゴニストを患者に投
    与することを含む、患部組織におけるリンパ球、マクロファージ、好酸球または
    好中球の機能を阻害または促進する方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１０〜１５の記載の方法のいずれかにより同定され
    るＡＸＯＲ３５アゴニストまたはアンタゴニストを患者に投与することを含む、
    患部組織におけるリンパ球、マクロファージ、好酸球または好中球の機能を阻害
    または促進する方法。
  20. 【請求項２０】 喘息性肺である請求項１８または１９記載の患部組織。
  21. 【請求項２１】 ＡＸＯＲ３５アゴニストまたはアンタゴニストを患者に投
    与することを含む患部組織におけるリンパ球、マクロファージ、好酸球、または
    好中球の機能を阻害または促進するためにＡＸＯＲ３５を促進または阻害する方
    法。
  22. 【請求項２２】 請求項１０〜１５に記載の方法のいずれか一つにより同定
    されるＡＸＯＲ３５アゴニストまたはアンタゴニストを患者に投与することを含
    む、患部組織におけるリンパ球、マクロファージ、好酸球、または好中球の機能
    を阻害または促進するためにＡＸＯＲ３５を促進または阻害する方法。
  23. 【請求項２３】 喘息性肺である請求項２１または２２記載の患部組織。
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