JP2003506086A

JP2003506086A - ＴＧＦ−βファミリーの単量体タンパク質

Info

Publication number: JP2003506086A
Application number: JP2001515827A
Authority: JP
Inventors: ヘッテン，ゲルトラッド; ベヒトールド，ロルフ; ポール，ジェンズ
Original assignee: ハイゲンアーゲー
Priority date: 1999-08-06
Filing date: 2000-08-04
Publication date: 2003-02-18
Also published as: WO2001011041A1; EP1074620A1; EP1198570B1; AU782481B2; EP1574578A1; AU6992700A; ES2242630T3; US7569227B2; ATE299937T1; CA2381219C; DE60021388D1; US20050282255A1; US6972321B1; ZA200201032B; EP1198570A1; DE60021388T2; DK1198570T3; NZ517125A; CA2381219A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、二量体形成に関与するシステインが置換または欠失しているために単量体である、TGF-βスーパーファミリーのメンバーから選択されるタンパク質に関する。本発明はまた、かかる単量体タンパク質をコードする核酸、該核酸を含有するベクターまたは宿主細胞、ならびに該タンパク質または該タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、それぞれの二量体タンパク質が有効であるあらゆる適応症に有利に適用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はTGF-βスーパーファミリーに属する生物学的に活性なタンパク質であ
って、その野生型において二量体化に関与する1個のシステイン残基が置換また
は欠失しているために単量体の形態を保っている該タンパク質に関する。さらに
本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸、その核酸を含む発現ベクター
、および、対応する核酸または発現ベクターを含む宿主細胞に関し、前記核酸は
前記タンパク質を発現させるのに適している。また本発明は、本発明のタンパク
質または該タンパク質をコードする核酸を含有する医薬組成物に関する。本発明
に係る医薬組成物は、対応するタンパク質の二量体によっても治療されうる全て
の症状の予防または治療に使用することができる。

【０００２】 TGF-βスーパーファミリーに属する多くの増殖因子（Kingsley, Genes and De
velopment 8, 133-146(1994)、並びにその文献中で引用された参照文献）は、幅
広い範囲の医学的治療方法、ならびに、特に外傷の治療や組織の再生などの細胞
増殖と組織形成の促進に関係する用途に適している。特に、そのような増殖因子
には、TGF-β（トランフォーミング増殖因子；例えば、RobertsおよびSporn, Ha
ndbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), pp. 419-472, SpornおよびR
oberts編を参照）、BMP（骨形成タンパク質；例えば、RosenおよびThies, Growt
h Factors in Perinatal Development (1993), pp. 39-58、Tsang、Lemonsおよ
びBalistreri編）およびGDF（増殖分化因子）を含むDVRグループ（Hottenら、 B
iochem. Biophys. Res. Comm. 206 (1995), pp. 608-613、および、その文献中
で引用されたその他の文献）、インヒビン／アクチビン（例えば、Valeら、The
Physiology of Reproduction, 第2版 (1994), pp. 1861-1878, KnobilおよびNei
ll編を参照）、およびGDNFタンパク質ファミリー(Rosenthal, Neuron 22 (1999)
, pp. 201-203; Airaksinenら、Mol Cell Neurosci 13 (1999), pp. 313-325)の
メンバーが含まれる。TGF-βスーパーファミリーのメンバーは、タンパク質の成
熟部分において高いアミノ酸相同性を示し、特に７個の保存されたシステインを
示すが、それらの実際の働きは非常に多様である。多くの場合、これらのファミ
リーのそれぞれの増殖因子は同時に複数の機能を示す。そのため、その応用は、
様々な医学的徴候において、関心がもたれている。これらの多機能性タンパク質
の中には、多くの細胞型において増殖と分化を制御するなどの機能に加えて、ニ
ューロンに対しては生存促進効果を持つものもある（RobertsおよびSporn, 前掲
; Sakurai ら、J. Biol. Chem. 269(1994), pp. 14118-14122）。一例を挙げる
と、TGF-βには、胚の運動ニューロンと感覚ニューロンに対する栄養効果がある
ことがin vitroにおいて示された（Martinouら、Devl. Brain Res. 52, pp. 175
-181(1990) およびChalazonitisら、Dev. Biol. 152, pp. 121-132(1992)）。加
えて、タンパク質 TGF-β-1、-2、-3、アクチビンA、および、TGF-βスーパーフ
ァミリーのメンバーと構造的に類似したタンパク質であるGDNF（グリア細胞由来
神経栄養因子）については、中脳のドーパミン作動性ニューロンに対して生存を
促進する効果があることが示されており、その効果は星状膠細胞によって媒介さ
れないものである（Krieglsteinら、EMBO J. 14, pp. 736-742 (1995)）。

【０００３】 TGF-βスーパーファミリーもしくはその活性型変異体のうちで、興味深いもの
としては、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5 (U.S. 5,284,763; E
P 0376785; U.S.4,886,747; DNA 7 (1988), pp. 1-8; EMBO J. 7 (1988), pp. 3
737-3743; Mol. Endo. 2 (1988), pp. 1186-1195; J. Biol. Chem. 265 (1990),
pp. 1089-1093)、OP1、OP2、OP3タンパク質(U.S. 5,011,691, U.S. 5,652,337,
WO 91/05802)があり、並びに、BMP2、BMP3、BMP4 (WO 88/00205, U.S. 5,013,6
49およびWO 89/10409, Science 242 (1988), pp. 1528-1534)、BMP5、BMP6、BMP
7 (OP1) (Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (1990), pp. 9841-9847, WO 90/11366)、
BMP8 (OP2) (WO 91/18098)、BMP9 (WO 93/00432)、BMP10 (WO 94/26893)、BMP11
(WO 94/26892)、BMP12 (WO 95/16035)、BMP13 (WO 95/16035)、BMP15 (WO 96/3
6710)、BMP16(WO 98/12322)、BMP3b (Biochem. Biophys. Res. Comm. 219 (1996
), pp. 656-662)、GDF1 (WO 92/00382 および Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (199
1), pp. 4250-4254)、GDF8 (WO 94/21681)、GDF10 (WO 95/10539)、GDF11 (WO 9
6/01845)、GDF5 (CDMP1, MP52) (WO 95/04819; WO 96/01316; WO 94/15949, WO
96/14335 および WO 93/16099 および Nature 368 (1994), pp. 639-643)、GDF6
(CDMP2, BMP13) (WO 95/01801, WO 96/14335 および WO 95/16035)、GDF7 (CDM
P3, BMP12) (WO 95/01802 および WO 95/16035)、GDF14 (WO 97/36926)、GDF15
(WO 99/06445)、GDF16 (WO 99/06556)、60A (Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991
), pp. 9214-9218)、DPP (Nature 325 (1987), pp. 81-84)、Vgr-1 (Proc. Natl
. Acad. Sci. 86 (1989), pp. 4554-4558)、Vg-1 (Cell 51 (1987), pp. 861-86
7)、ドーサリン (Cell 73 (1993), pp. 687-702)、MIS (Cell 45 (1986), pp. 6
85-698)、pCL13 (WO 97/00958)、BIP (WO 94/01557)、インヒビンa、アクチビン
βAおよびアクチビンβB (EP 0222491)、アクチビンβC (MP121) (WO 96/01316)
、アクチビンβEおよびGDF12 (WO 96/02559およびWO 98/22492)、アクチビンβD
(Biochem. Biophys. Res. Comm. 210 (1995), pp. 581-588)、GDNF (Science 2
60 (1993), pp. 1130-1132, WO 93/06116)、Neurturin (Nature 384 (1996), pp
. 467-470)、Persephin (Neuron 20 (1998), pp. 245-253, WO 97/33911)、Arte
min (Neuron 21 (1998), pp. 1291-1302)、Mic-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94 (1997), pp. 11514-11519)、Univin (Dev. Biol. 166 (1994), pp. 149-158
)、ADMP (Development 121 (1995), pp. 4293-4301)、Nodal (Nature 361 (1993
), pp. 543-547)、Screw (Genes Dev. 8 (1994), pp. 2588-2601) のようなTGF-
βタンパク質がある。他の有用なタンパク質としては、２種以上の形態形成タン
パク質由来の配列を用いて設計された生合成タンパク質を含めた、生物学的に活
性な生合成構築物が含まれる。生合成構築物の例は、米国特許第5,011,691号（
例えば、COP-1、COP-3、COP-4、COP-5、COP-7、およびCOP-16）に開示されてい
る。特許および特許出願を含めた引用刊行物の開示は、参照により本明細書に組
み入れられるものとする。

【０００４】様々な組織段階や発生段階におけるTGF-βスーパーファミリーのタンパク質の
出現は、標的部位、寿命、補助因子の要件、細胞の必要とされる生理的環境、お
よび／または、分解に対する抵抗性だけでなく、それらのタンパク質の実際の機
能に関しての差異にも合致したものである。

【０００５】 TGF-βスーパーファミリーのタンパク質は、ジスルフィド結合を一つ持つホモ
二量体またはヘテロ二量体として存在する。このジスルフィド結合は、各単量体
に含まれる、特定の、該タンパク質のほとんどで保存されたシステイン残基によ
って媒介される。従来、該タンパク質が二量体として存在することが生物学的な
活性にとって必須であるとみなされていた。幾つかの刊行物が、生物学的な活性
は二量体タンパク質によってしか引き起こされないことを示したため、この二量
体の形成は、細胞上のTGF-βスーパーファミリーのタイプIおよびタイプII受容
体に同時に結合することによって細胞間のシグナル伝達を達成できるように、２
個以上の二量体がさらにポリマーを形成するうえで重要であると推測された。こ
の、両方の種類の受容体への同時結合だけが、患者にとって有益な細胞間シグナ
ル伝達を可能にすると推定されていた。（Bone, volume 19 (1996), pp. 569-57
4）。

【０００６】これらのタンパク質の医薬としての利用とその製造についての問題点は、該タ
ンパク質は、原核生物による組換え体の発現では、苛酷な復元（再生）操作をし
ない限り、生物学的に活性で、しかも、十分に高純度な形で簡単には入手できな
いことである。

【０００７】そこで、本発明の課題は、高い生物学的活性を示すタンパク質を再現可能に製
造するための簡単で安価な可能性を提供することである。ここで、その生物学的
活性は、前記ファミリーに属するタンパク質の二量体の活性に実質的に一致する
べきである。

【０００８】本発明によれば、この課題は、TGF-βタンパク質スーパーファミリーのメンバ
ーから選ばれたタンパク質により解決される。ここで、そのタンパク質は、二量
体化に関与する1個のシステインの置換または欠失のために単量体である必要が
ある。

【０００９】驚くべきことに、通常は該タンパク質の二量体化に影響を及ぼすシステイン残
基を置換または欠失させると、発現および正しい折り畳み（分子内でのジスルフ
ィド架橋の適切な形成）の後に、二量体の形態での生物学的活性を保持した単量
体タンパク質が得られることが分かった。更に驚くべきことに、その単量体タン
パク質のうちの少なくとも一部は、タンパク質の重量基準で、それぞれの二量体
の形態よりも高い活性を示すことが分かった。この改善された生物学的活性とは
別に、本発明のタンパク質の重要な利点は、原核生物宿主においてそれらを大量
に発現させることができ、かつ、単量体の簡便な再生後に、二量体化していない
タンパク質（単量体）から二量体化したものを分離する必要なしに、高純度かつ
非常に高収率で得ることができる点である。

【００１０】本発明の知見は、すでに上述したとおり、形態形成タンパク質の二量体だけが
生物学的活性を持っていると広く理解されていたがゆえに、非常に驚くべきもの
である。このように理解されていたにも関わらず、本発明のタンパク質は、タン
パク質重量基準で、二量体よりも最大で２倍高い活性を示す。本発明のタンパク
質が、生物学的活性を維持しつつも、より小さいサイズであることは利点だと考
えることができる。例えば、単量体タンパク質は二量体タンパク質よりも容易に
血液脳関門を通過できるため、脳へ応用する場合に有利である。

【００１１】本発明のタンパク質は、通常は二量体の形態で存在する前記タンパク質ファミ
リーに属する全てのタンパク質を包含する。また、実質的な活性を保持する該タ
ンパク質の一部分または該タンパク質の融合タンパク質もしくは該タンパク質の
前駆体、ならびに、TGF-βスーパーファミリータンパク質の天然あるいは生合成
された生物学的に活性な変異体も、それらが少なくとも認めうる生物学的活性を
示す限りは、本発明に包含されるものとみなす。

【００１２】本発明の好ましい実施形態において、単量体タンパク質は、成熟タンパク質ま
たはその生物学的に活性な部分もしくは変異体である。「生物学的に活性な部分
もしくは変異体」という用語は、活性を保持する断片、または例えば活性部位で
切断されて成熟形態となるかもしくはそれ自体が生物学的活性を示す前駆体タン
パク質、あるいは依然として野生型タンパク質の生物学的活性を本質的に保持す
る変異体のいずれかを定義するものである。そのような変異体は、好ましくは保
存的アミノ酸置換を含むが、特に成熟タンパク質のＮ末端部分では、相当量の欠
失または置換であっても、生物学的活性の顕著な低下にはつながらない。あるタ
ンパク質が必要な生物学的活性を示すかどうかを調べる手法は当業者には周知で
ある。上記タンパク質ファミリーの成熟野生型タンパク質に対して少なくとも70
％、好ましくは少なくとも80％の相同性を示すタンパク質は、本発明のタンパク
質に必要とされるシステインの欠失または置換を含有し、そのため二量体を形成
しないものである限りは、本発明に包含されると理解すべきである。

【００１３】特に好ましくは、本発明のタンパク質は、少なくとも、TGF-βタンパク質スー
パーファミリーに特徴的な7個のシステインを含む領域（以後、「７システイン
領域」という）を含有する。

【００１４】この特異的な7システイン領域は、生物学的活性に関してタンパク質の最も重
要な部分であると考えられる。従って、この最重要な領域を保持するタンパク質
は本発明の好ましいタンパク質である。どのシステインが特定のタンパク質ファ
ミリーまたはタンパク質の二量体形成に関与しているかは当技術分野で開示され
ている（例えば、SchluneggerおよびGrutter (1992) Nature 358, 430-434；Dao
pinら(1992) Science 257, 369-373；ならびにGriffithら、Proc. Natl. Acad.
Sci. 93 (1996), 878-883を参照のこと）。本発明のタンパク質を生成するには
、このシステインを欠失させるかまたは他のアミノ酸と置換する必要がある。

【００１５】 7システイン領域は、TGF-βタンパク質スーパーファミリーの多くのタンパク
質で知られている。この領域では、システイン残基同士のそれぞれの位置が重要
であり、生物学的活性を低下させないためにはごくわずかな変更しか可能でない
。このようなタンパク質のコンセンサス配列は、当技術分野で公知であり、かか
るコンセンサス配列を有するタンパク質は全て本発明に包含されるものとみなさ
れる。

【００１６】本発明の特に好ましい実施形態において、タンパク質は、以下の配列で示され
るコンセンサス配列を含有する： C(Y)_25-29CYYYC(Y)_25-35XC(Y)_27-34CYC（式I）〔式中、Cはシステインを表し、Yはシステインを含めて任意のアミノ酸を表し、
Xはシステイン以外の任意のアミノ酸を表す〕。

【００１７】より好ましくは、本発明のタンパク質は、以下の配列で示されるコンセンサス
配列を含有する： C(Y)₂₈CYYYC(Y)_30-32XC(Y)₃₁CYC（式II）〔式中、C、XおよびYは上記定義と同じ意味を表す〕。

【００１８】よりさらに好ましくは、本発明のタンパク質は、以下の配列で示されるコンセ
ンサス配列を含有する： C(X)₂₈CXXXC(X)_31-33C(X)₃₁CXC（式III）〔式中、CおよびXは上記定義と同じ意味を表す〕。

【００１９】上記コンセンサス配列においては、それぞれのシステイン残基間の特に好適な
距離が含まれており、また二量体を形成するシステインがすでに他のアミノ酸で
置換されている。上記タンパク質スーパーファミリーの全てのタンパク質と同様
に、システインの位置とそれら同士の距離は、この領域に含まれる他のアミノ酸
の正体よりも重要である。従って、コンセンサス配列は、システインのそれぞれ
の位置を示すが、他のアミノ酸の正体を示していない。なぜならば、これらの他
のアミノ酸はTGF-βタンパク質スーパーファミリーのタンパク質において非常に
可変性であるためである。

【００２０】本発明の好ましい実施形態において、本発明の単量体タンパク質は形態形成タ
ンパク質である。

【００２１】 TGF-βタンパク質スーパーファミリーのメンバーの大部分は形態形成タンパク
質であり、これは、細胞または前駆細胞の分化および増殖の調節を目的とする治
療に有用である。これによって、損傷したおよび／または罹病した組織、例えば
、骨格（骨、軟骨）組織、結合組織、歯周または歯組織、神経組織、感覚神経系
組織、肝臓、膵臓、心臓、血管および腎臓組織、子宮または甲状腺組織などのよ
うな組織を置き換えることができる。形態形成タンパク質は、潰瘍または炎症性
組織損傷の治療、および潰瘍、火傷、外傷または植皮の治癒の改善などの任意の
種類の創傷治癒に有効な場合もよくある。特に好ましくは、本発明のタンパク質
は、TGF-β、BMP、GDF、アクチビンまたはGDNFファミリーに属するものである。
最初に骨形成を誘導する能力に基づいて発見された数種のBMPタンパク質は上述
したように既に記載されている。同時に、GDFのメンバーにもあてはまるように
、さらにいくつかの機能が見出された。これらのタンパク質は非常に広範囲の応
用例を示し、特に、その骨および軟骨成長促進活性（例えば、WO 88/00205号、W
O 90/11366号、WO 91/05802号参照）は、歯周病、歯周および歯組織の損失の抑
制、歯髄腔の封鎖、歯槽への歯の組込みの促進（例えば、WO 96/26737号、WO 94
/06399号、WO 95/24210号参照）、腱または靱帯などの結合組織（例えばWO 95/1
6035号参照）、神経細胞の生存力改善、神経細胞の増殖および神経欠損の修復の
誘導、卒中または外傷による損傷したCNS組織（例えば、WO 97/34626号、WO 94/
03200号、WO 95/05846号参照）、感覚認知の維持または回復（例えばWO 98/2089
0号、WO 98/20889号参照）、腎不全（例えばWO 97/41880号、WO 97/41881号参照
）、肝臓再生（例えばWO 94/06449号参照）、心筋の再生（例えば WO 98/27995
号参照）、器官または組織移植のための組織または細胞の処理または保存、胃腸
管壁の完全化（例えば WO 94/06420号参照）、ex vivo刺激による前駆細胞集団
（例えば造血前駆細胞）の増大（例えば WO 92/15323号参照）などに有効である
。GDFファミリーの好ましい一メンバーは、GDF-5またはCDMP-1とも称されるタン
パク質MP52である。MP52の用途はBMP/GDFファミリーに関して既に記載されてい
るいくつかの用途を反映するものである。MP52は、骨および軟骨形成ならびに結
合組織形成の非常に有効な促進因子であると考えられる（例えば WO 95/04819号
、Hottenら(1996), Growth Factors 13, 65-74；Stormら(1994) Nature 368, 63
9-643；Changら(1994) J. Biol. Chem. 269 (45), 28227-28234参照）。この点
に関して、MP52は、骨格要素間の関節に関係する用途に有用である（例えば Sto
rmおよびKingsley (1996) Development 122, 3969-3979参照）。結合組織の一例
は、腱および靱帯である（Wolfmanら(1997), J. Clin. Invest. 100, 321-330；
AspenbergおよびForslund (1999), Acta Orthop Scand 70, 51-54；WO 95/16035
号参照）。MP52はまた、歯（歯および歯周）の用途にも有用である（例えば WO
95/04819号、WO 93/16099号、Morotomeら(1998), Biochem Biophys Res Comm 24
4, 85-90参照）。MP52は、どのような種類の創傷治癒にも有用である。さらに、
神経系の組織増殖およびドーパミン作動性ニューロンの生存を促進させるにも非
常に有用であり、例えばこの点に関してMP52は、パーキンソン病や、おそらくア
ルツハイマー病などの神経変性疾患における用途、ならびにハンチントン舞踏病
の組織に有用である（例えば WO 97/03188号、Krieglsteinら(1995) J. Neurosc
i Res. 42, 724-732；Sullivanら(1997) Neurosci Lett 233, 73-76；Sullivan
ら(1998), Eur. J. Neurosci 10, 3681-3688参照）。MP52は、神経機能の維持、
または既に損傷を受けた組織における神経機能の保持を可能にする。従ってMP52
は、一般的に適用可能な神経栄養因子であると考えられる。また、眼、特に網膜
、角膜および視神経の疾患にも有用である（例えばWO 97/03188号；Youら(1999)
, Invest Opthalmol Vis Sci 40, 296-311参照）。単量体MP52は、二量体型に関
して既に記載されている全ての活性、ならびに二量体BMP/GDFファミリーメンバ
ーに関して記載されているさらにいくつかの活性を示すと推測される。例えば、
前駆細胞集団を増大させたり、ex vivoで前駆細胞の分化を刺激したりするにも
有用であると推測される。前駆細胞は、軟骨形成過程に関与している細胞または
造血前駆細胞でありうる。また、損傷したまたは罹病した組織にも有用であり、
この場合、脈管形成の刺激が有利である（例えばYamashitaら(1997), Exp Cell
Res 235, 218-226参照）。

【００２２】従って、特に好ましい本発明のタンパク質は、タンパク質MP52またはその生物
学的に活性な部分もしくは変異体である。これらの用語の既に上述した定義と同
様に、MP52は、例えばその成熟形態に用いることができるが、少なくとも7シス
テイン領域を含有する断片、または前駆体形態に用いてもよい。成熟MP52のＮ末
端部分における逸脱は、その活性に対し相当な程度には影響を及ぼさない。従っ
て、該タンパク質のＮ末端部分における置換、欠失または付加は依然として本発
明の範囲内である。該タンパク質のＮ末端部分に、例えば精製のために、ペプチ
ドを付加することは有用であるかもしれない。この付加されたペプチドは、該タ
ンパク質の発現および精製後に切断する必要はないだろう。上記タンパク質のＮ
またはＣ末端部分における付加ペプチドはまた、神経または骨組織などの特定の
組織に該タンパク質をターゲティングしたり、血液／脳関門を通過させるように
機能するものであってもよい。一般的には、本発明の単量体タンパク質と他のペ
プチドまたは基との融合タンパク質もまた本発明の範囲内とみなされ、こうした
他のペプチドまたは基は、例えば特定の組織タイプに対する親和性などによって
、融合タンパク質の局在化を指令する。かかる融合タンパク質の例は、WO 97/23
612号に記載されている。かかる付加物を含有するタンパク質は、少なくともそ
の付加物が該タンパク質の生物学的に活性なコンホメーションの形成を損なうも
のでない限り、その生物学的活性を保持するであろう。

【００２３】本発明の特に好ましい実施形態において、タンパク質は、それぞれ配列番号１
（DNAおよびタンパク質配列）および配列番号２（タンパク質配列のみ）に示さ
れるアミノ酸配列を含むものである。配列番号２は、ヒトMP52のプレプロタンパ
ク質の完全なタンパク質配列を示すものであり、既にWO 95/04819号に記載され
ている。成熟タンパク質の開始点は、好ましくはアミノ酸352-400の範囲内、特
に好ましくはアミノ酸381または382に位置する。従って成熟タンパク質は、アミ
ノ酸381-501または382-501からなる。成熟タンパク質の最初のアラニンは欠失し
ていてもよく、従って成熟タンパク質は好ましくはアミノ酸383-501からなる。
既に記載されている二量体MP52タンパク質に存在する465位におけるシステイン
は、本発明においては、欠失しているかまたは他のアミノ酸で置換されている。
この欠失または置換は、配列番号１および２のそれぞれの位置においてXaaで表
される。

【００２４】アクチビン／インヒビンファミリータンパク質は、避妊、不妊および妊娠に関
連する用途に重要である（例えばWO 94/19455号、米国特許第5,102,868号参照）
。これらはまた、神経系疾患の回復または予防などの用途に重要であり、肝臓な
どの器官組織、ならびに骨および軟骨でもその回復に用いることができる。この
点に関して、MP121（アクチビンβC）は、損傷したおよび／または罹病した組織
、特に肝臓組織、神経組織、骨格組織の増殖または再生のための用途に特に有用
である（例えばWO 96/01316号、WO 98/22492号およびWO 97/03188号参照）。MP1
21は、肝臓において主に発現されるため、そのmRNAは部分肝切除術後は著しく低
減することが知られている。MP121は、肝臓の体積を調節すると推定されている
（Zhangら、Endocrine Journal 44 (1997), 759-764）。単量体MP121は、二量体
型の既に記載されている活性の全て、ならびに二量体TGF-βスーパーファミリー
メンバーについて記載されているさらにいくつかの活性を示す。例えば、潰瘍形
成（例えば胃潰瘍形成）の治療に有用であり、また胃腸管壁の完全化、および前
駆細胞の分化のex vivoにおける刺激、例えば器官または組織移植用の哺乳動物
組織または細胞の処理または保存のために有用であるとも推測される。従って、さらに好ましい本発明のタンパク質は、アクチビン／インヒビンタン
パク質ファミリーのメンバーであるMP121である。またこのタンパク質に関して
、その生物学的に活性な部分もしくは変異体も上記規定に従って本発明に包含さ
れる。特に好ましい実施形態は、それぞれ配列番号３（DNAおよびタンパク質配
列）ならびに配列番号４（タンパク質配列のみ）に示される。配列番号４は、ヒ
トMP121のプレプロタンパク質の完全アミノ酸配列を示すものであり、これはWO
96/01316号に既に記載されている。成熟タンパク質の開始点は、好ましくはアミ
ノ酸217〜247、最も好ましくはアミノ酸237に位置する。従って好ましい成熟タ
ンパク質は、アミノ酸237で開始し、アミノ酸352で終了するタンパク質の成熟部
分からなるものである。しかしながら、記載した完全なアミノ酸配列を含む前駆
体タンパク質もまた本発明に包含される。316位におけるシステインは、本発明
では、欠失しているかまたは他のアミノ酸で置換されており、これは配列番号３
および４においてXaaで表される。

【００２５】二量体化をもたらすシステイン残基と置換されるアミノ酸は、生物学的に活性
なコンホメーションの形成を損なわないアミノ酸を選択しうる。該アミノ酸は、
好ましくは、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、イソロイシン、グリシ
ンおよびバリンからなる群より選択される。

【００２６】まとめると、本発明のタンパク質は、二量体形成に関与するアミノ酸配列中の
システイン残基の不在を特徴とする。この不在は、該システインの他のアミノ酸
との置換または欠失により行なわれうる。しかしながら欠失の場合には、生物学
的に活性なコンホメーションの形成を妨げることのないタンパク質であることを
保証する必要がある。置換アミノ酸の選択に関しても同じことが当てはまり、シ
ステインと類似した形態のアミノ酸を使用することが好ましい。

【００２７】本発明の単量体タンパク質は容易に作製することができ、特に公知方法による
原核生物における発現および再生により作製しうる。タンパク質は、特に高い生
物学的な活性を有する形態で得ることができると有利である。これらのタンパク
質は、単量体型で二量体とほぼ同じ活性を示すので、同じ陽性の生物学的効果を
達成するためには有効物質の量に基づいて同量の単量体タンパク質を用いる必要
があるだけである。

【００２８】本発明のさらなる主題は、本発明のタンパク質をコードする核酸である。該核
酸は、二量体形成に関与するシステインが欠失または置換されるような配列を有
する必要があることは明らかである。該核酸は、天然の核酸であってもよいが、
組換え手法により生成されるかまたはプロセシングされた核酸であってもよい。
該核酸は、適切な系においてこの核酸から発現される際に本発明のタンパク質が
得られる限り、DNA配列およびRNA配列のいずれでもありうる。

【００２９】本発明の好ましい実施形態において、核酸はDNA配列である。このDNA配列は、
本発明の特に好ましい実施形態においては、配列番号１および配列番号３に示す
配列、またはそれらの一部からなる。配列番号１は、MP52をコードする核酸を示
し、二量体形成に関与するシステインのコドンがシステインをコードしない他の
コドンで置き換わっているか、または欠失している。この置換または欠失は、配
列プロトコールにおいて「nnn」で示される。配列番号３は、MP121をコードする
核酸を示すものであり、二量体形成に関与するシステインのコドンをそれぞれ異
なるコドンで置換しているかまたは欠失している。配列番号１または３の完全な
配列の代わりに、上述した成熟タンパク質または断片をコードする一部を使用し
てもよい。本発明の構成において、核酸はまた、コード配列とは別に発現制御配列も含有
することが好ましい。かかる発現制御配列は当業者に公知であり、宿主細胞にお
いてコード化タンパク質の発現を制御するよう機能する。また、該宿主細胞は、
単離された細胞である必要はなく、該核酸をin vivoで患者において標的組織中
で発現させることができる。これは、核酸を細胞ゲノム中に挿入することにより
行いうるが、本発明の核酸を含有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換するこ
とも可能である。かかる発現ベクターは本発明のさらなる主題であり、該核酸が
適切なベクター系に挿入されたものであり、該ベクター系はタンパク質の所望と
する発現に応じて選択する。ベクター系は、真核生物ベクター系であってもよい
が、本発明の構成においては、タンパク質を特に簡便かつ純粋に原核宿主細胞で
生成することが可能な原核生物ベクター系であることが好ましい。さらに、発現
ベクターはウイルスベクターであってもよい。

【００３０】宿主細胞もまた、本発明のさらなる主題である。宿主細胞は、本発明の核酸ま
たは本発明の発現ベクターを含有し、該核酸および該発現ベクター中に存在する
本発明の単量体タンパク質の発現に関する情報を利用できることを特徴とする。

【００３１】本発明の構成において、タンパク質の産生には真核宿主細胞が好適であるが、
既に数回にわたり述べているように、本発明のタンパク質は原核宿主細胞におい
て生成され得ることが特に有利であり、従って原核宿主細胞は本発明の好ましい
実施形態を表す。

【００３２】原核宿主細胞における上記のような好ましい発現の後、公知の手法に従ってタ
ンパク質を精製し、再生させることにより、分子内システイン架橋が形成される
。

【００３３】しかしながら、単量体タンパク質のin vitro産生のみが可能であるわけではな
く、本発明の核酸のin vivo発現も可能であるため、さらなる好ましい実施形態
は、真核宿主細胞であり、特にそのゲノム中にまたは発現ベクターとして該DNA
を含有する真核宿主細胞である。かかる宿主細胞はまた、形態形成処置の必要な
個体に適用するのに有用でありうる。本発明のさらなる主題は、少なくとも１種類の本発明の単量体タンパク質もし
くはかかるタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸、または少なくとも１
種の対応する発現ベクター、あるいは該単量体タンパク質を発現する少なくとも
１種の真核生物宿主細胞を含む医薬組成物である。

【００３４】そのタンパク質自体、また本発明の核酸、発現ベクターまたは宿主細胞も、医
薬組成物中の有効物質として利点があると考えられうる。また好ましくは、医薬
組成物において、単量体タンパク質と生物学的活性とを組み合わせて同じもしく
は異なる適用法で使用してもよい。特に好ましくは、神経適用のために、MP52と
他のTGF-βスーパーファミリータンパク質（例えばGDNF（WO 97/03188号参照）
）とをいずれも単量体型で組み合わせる。また神経適用では、TGF-βとGDNFとを
いずれも単量体型で組み合わせることも好ましい。また、軟骨および／または骨
に関する適用のために、いくつかの単量体タンパク質の組み合わせ、例えば、MP
52とTGF-βタンパク質（例えばWO 92/09697号参照）、またはMP52と軟骨の維持
を誘導するBMP-9などのタンパク質（例えばWO 96/39170号参照）などが有効であ
りうる。しかしながら核酸または発現ベクターを利用する場合には、患者に投与
する際に、該核酸および発現ベクターそれぞれが発現されて本発明のタンパク質
がin vivoにて作用部位で産生されうるような環境を確保する必要がある。従っ
て、本発明の宿主細胞にも同じことが言える。また発現ベクターまたは宿主細胞
を利用する場合、２種以上の単量体タンパク質を組み合わせて生成するように１
種以上の本発明の単量体タンパク質をコードさせることも可能である。

【００３５】タンパク質および核酸の両方または発現ベクターもしくは宿主細胞を、生分解
性マトリックス中および／または該マトリックス上に保持させることは利点があ
る。マトリックス材料は、例えば外科手術により患者に移植することができ、こ
の場合、該タンパク質をマトリックス材料の表面上に適用するか、あるいは該タ
ンパク質または該タンパク質をコードするDNAを該マトリックス材料から徐放さ
せて、それにより長時間にわたって有効となるように適用してもよい。さらに、
医薬組成物中に生分解性マトリックス材料を使用することも可能であり、また利
点があるが、この場合、該材料は、タンパク質誘導型組織形成の過程で溶解して
、該マトリックスに保持されるタンパク質または核酸が放出されて、新たに形成
した組織がマトリックス材料と置き換わることが好ましい。

【００３６】最後に、骨形成に関連する適用の場合には、マトリックス材料自体が例えば骨
形成活性を有するマトリックス材料を使用すると有利である。かかるマトリック
ス材料を用いることによって、タンパク質とマトリックス材料との相乗効果を達
成し、特に迅速にかつ有効に骨形成をもたらすことが可能となる。

【００３７】特に好ましくは、本発明に従って使用しうるマトリックス材料は、米国特許第
5,231,169号および同第5,776,193号に記載のような、特に脊椎固定などの用途の
ためのマトリックス材料である。

【００３８】マトリックス材料と、タンパク質および／または核酸および／または発現ベク
ターとを組み合わせて用いる場合には、その使用前にかかる組み合わせを滅菌す
ることが好ましい。該マトリックスおよび形態形成タンパク質を別々に滅菌して
から混合してもよいが、マトリックスと形態形成タンパク質とから構成されるデ
バイスを最終的に滅菌することが好ましい。最後の滅菌は、既に二量体タンパク
質に関して記載（米国特許第5,674,292号）のように電離放射線により行いうる
が、酸化エチレンの使用もまた有利である。

【００３９】本発明はまた当然のことながら、例えば薬理学的に許容される補助物質および
担体物質などの追加物質を含有する医薬組成物を包含する。しかしながら、本発
明のタンパク質は、マトリックス材料を使用する場合にも、このマトリックス材
料と共に用いることは必ずしも必要ではなく、該タンパク質が、好ましくは埋め
込まれたマトリックス材料の周囲に集まるように全身投与することも可能である
。

【００４０】いくつかの適用例の場合、本発明のタンパク質および該タンパク質を形成する
核酸、または発現ベクターもしくは宿主細胞は、好ましくは、注射可能な組成物
中に存在することができる。埋込物は、本発明のタンパク質の全ての適用形態に
必要なものではないし可能でもない。しかしながら、本発明のタンパク質または
それを生成する核酸を含み、これらのいずれかを長い時間にわたって徐放するた
とえば半透膜を入れた埋込可能な容器または埋込可能なマイクロポンプを提供す
ることも可能である。本発明の医薬組成物はまた、タンパク質もしくは核酸、ま
たはこれらのタンパク質をコードする発現ベクターを作用部位に輸送してそこで
放出させる他のビヒクルを含有していてもよく、この場合には例えばリポソーム
またはナノスフェアを利用しうる。原則として、宿主細胞、例えばタンパク質を
発現する埋込まれた胚性細胞のような細胞を使用することも可能である。組換え
DNAでトランスフェクトした細胞は、埋込前にカプセルに封入してもよい。また
実施可能であるが本明細書で明示していない、他の本発明の医薬組成物の適用形
態およびそれらの対応する製造方法も、本発明のタンパク質もしくは核酸、また
はそれらをコードする発現ベクター、あるいはそれを発現する宿主細胞を含有す
る場合には、本発明に包含される。

【００４１】適応症は、本明細書中では限定されず、本発明のタンパク質の二量体型が示す
適応症の全てを含むものである。以下に、本発明の組成物の適用種類を挙げたが
、これは本発明のタンパク質の特に好ましい適応症であるとみなされるものであ
る。一方では、骨および／もしくは軟骨の損傷に関連するかまたは骨および／も
しくは軟骨の疾患に影響する疾患、または一般的には軟骨および／もしくは骨の
形成が望ましい病状の予防または治療、あるいは脊椎固定がある。その一方で、
腱および／または靱帯などの結合組織、歯科インプラントなどの歯周または歯組
織、CNS組織および神経病理学的状況などの神経組織、感覚神経系組織、肝臓、
膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮および甲状腺組織、皮膚組織、粘膜組織、内皮組
織ならびに上皮組織に関連する損傷したまたは罹病した組織の予防または治療；
神経成長、組織再生、脈管形成、および潰瘍、火傷、外傷または植皮などの創傷
治癒の促進または誘導；前駆細胞または骨髄細胞の増殖の誘導；増殖または分化
状態の維持；器官または組織移植用の組織または細胞の処理または保存；胃腸管
壁の完全化、ならびに不妊、避妊または妊娠における障害の治療がある。

【００４２】眼などの感覚器官に関する疾患もまた、本発明の医薬組成物の好ましい適応症
に含まれるものとする。神経疾患としては、パーキンソン病およびアルツハイマ
ー病が例として挙げられる。

【００４３】本発明の医薬組成物は、任意の所望の適用法で用いることができ、該医薬組成
物は、好ましくは外科的局部適用、局所または全身適用のために製剤化する。個
々の適用剤形に関して、当然のことながら本発明の医薬組成物中に補助物質を配
合してもよい。いくつかの適用法では、該医薬組成物に、さらにいくつかの物質
、例えばビタミンD（WO 92/21365号）、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（WO 97/
35607号）、コルディン(chordin)（WO 98/21335号）、抗繊維素溶解剤（EP 5350
91号）、代謝拮抗剤（WO 95/09004号）、アルキルセルロース（WO 93/00050号）
、マンニトール（WO 98/33514号）、糖、グリシン、グルタミン酸塩酸塩（米国
特許第5,385,887号）、抗生物質、防腐剤、アミノ酸、および／または単量体形
態形成タンパク質の溶解性もしくは安定性を改善する添加剤、例えば非イオン性
界面活性剤（Tween 80など）、塩基性アミノ酸、担体タンパク質（血清アルブミ
ンなど）、TGF-βスーパーファミリーの全長プロペプチドもしくはその断片、を
添加すると有利である場合もある。

【００４４】タンパク質、核酸および医薬組成物の記載から容易に推測可能なように、本発
明のタンパク質および該タンパク質を作用部位で発現させるための核酸は、記載
されている二量体型タンパク質を適用しうる全ての範囲において有利に適用しう
る。従って本発明の構成においては、本発明のタンパク質の二量体型のいずれか
の適応症の予防または治療のための、本発明の医薬組成物の使用がさらなる主題
である。

【００４５】本明細書において、外科手術を行い、医薬組成物（特にマトリックス材料上に
含有するもの）を埋込むことも可能であり、例えば注射または経口投与などによ
る液体またはその他適切な剤形での投与は、例えば組織再生のための局部投与と
して適切であると考えられる。

【００４６】実施例以下の実施例により、本発明に関してより例示的に説明するが、これは限定を
意図するものではない。

【００４７】大腸菌（E. coli）における単量体MP52の発現、再生、精製、および生物学的活
性を判定するための可能性のある試験系ヒトMP52の成熟タンパク質部分を、配列番号２の465位におけるシステインを
アラニンに変換することにより変異させた。このために、配列番号１の2032位お
よび2033位のヌクレオチドをTGからGCに変換した。ヌクレオチドの置換は、原核
性プラスミドであるpBP2MP52mおよびPCR法を用いて行った。

【００４８】ベクターpBP2MP52mは、アンピシリン耐性遺伝子、T7-プロモーターに続きリボ
ソーム結合部位、開始コドン、MP52の成熟タンパク質部分（配列番号２のアミノ
酸382-501をコードし、465位にシステインを有する）、リーディングフレーム毎
の終止コドン、およびターミネーターを含有するpBR322プラスミドの誘導体であ
る。このプラスミドはDSMに寄託した（DSM10029、1995年６月２日）。

【００４９】 Stratagene製（カタログ番号200518）のPfuTurbo^TM DNAポリメラーゼおよびDp
n Iエンドヌクレアーゼを含むQuickChange^TM部位特異的突然変異誘発キットを製
造業者の取扱説明書に従って用いることにより突然変異を行った。オリゴヌクレ
オチドCCACACCACCCACCGCCTGTGTGCCCACGC（配列番号５）およびオリゴヌクレオチ
ドGCGTGGGCACACAGGCGGTGGGTGGTGTGG（配列番号６）をポリアクリルアミドゲル電
気泳動により精製し、突然変異誘発用プライマーとして用いた。得られたプラス
ミドpBP2MP52_ALAは、開始コドンの後に、465位がアラニンである配列番号２のア
ミノ酸382-501をコードするヌクレオチド配列を含有しており、これを配列決定
により確認した。

【００５０】単量体MP52の発現は、T7 RNAポリメラーゼ源を与えることにより誘導しうる。
プラスミドpBP2MP52_ALAで形質転換した細菌株BL21(DE3)pLysS（Novagen）を利用
して、IPTGを用いて製造業者の取扱説明書に従ってT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を
誘導すると、封入体中に単量体MP52が発現され、これを標準的な手法により単離
しうる。０〜50％のバッファーBの勾配（バッファーA：0.1％ TFA水溶液、バッ
ファーB：90％アセトニトリル、0.1％ TFA）を用いる逆相カラム（Nucleosil 30
0-7C4, Machery-Nagel）にて50分（流速2ml/分）でさらに精製を行った。単量体
MP52を含む画分を回収し、凍結乾燥して-70℃にて保存した。MP52を変性バッフ
ァー（6M尿素、500mM NaCl、10mM DTT、1mM EDTA、20mM Tris pH8.3）中に可溶
化し、再生のために、CHAPS（20mM）、NaCl（500mM）および3mM GSSGを含有する
９倍量の50mMグリシンバッファー系（pH9.8）に添加して、４℃にて穏やかに撹
拌した。約24時間経過後、サンプルを14mM NaH₂PO₄で2.8倍に希釈し、等電沈殿
に供した。遠心後、沈殿物を0.1％ TFA中に溶解し、折りたたまれた単量体をさ
らに逆相HPLCで精製した。このために、25％バッファーB（バッファーA：0.1％
TFA水溶液、バッファーB：90％アセトニトリル、0.1％ TFA）で平衡化したカラ
ム（Aquapore Octyl 20 micron, Applied Biosystems）にMP52をロードした。70
分（流速3ml/分）で25〜60％のバッファーB勾配を用いて単量体MP52を溶出した
。再生された精製単量体MP52を含む画分を回収し、凍結乾燥して-70℃にて保存
し、これを生物学的活性試験に使用することができる。軟骨および骨誘導の分野
において単量体MP52の生物学的活性試験に有用なものとしては、例えば、WO95/0
4819号に記載の骨原性細胞様ROB-C26細胞（Yamaguchiら、Calcif. Tissue Int.
49, 221-225, 1991）またはATDC5細胞（Riken Gene Bank, RCB 0565；軟骨細胞
のように分化する胚性細胞）を用いたALP活性の上昇の測定（Takuwaら、Am. J.
Physiol. 257, E797-E803, 1989）がある。再生された単量体MP52の神経学的能
力を示す有用な活性試験としては、例えばKrieglsteinら（J. Neuroscience Res
. 42, 724-732, 1995）またはSullivanら（Neuroscience Letters 233, 73-76,
1997）により記載されているドーパミン作動性ニューロンの生存率上昇の測定が
あり、あるいは胚性網膜に由来する神経繊維の成長（outgrowth）は、例えばWO9
7/03188号に記載されている。折りたたまれた単量体MP52の脈管形成能は、例え
ば、in vivoにおける角膜微小ポケットモデルにおいて検証しうる。簡単に説明
すると、HydronをD’Amatoらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 4
082-4085）から改作した徐放性ペレットとして使用しうる。約２μgの単量体MP5
2を20μlの50％アセトニトリル中に溶解し、5mgスクラルファート（スクロース
硫酸アルミニウム；Bukh Meditec, Copenhagen）で安定化し、20μlの12％(wt/v
ol) Hydron NCC（Interferon Science, New Brunswick, NJ）エタノール溶液と
混合しうる。この混合物をピペットでテフロン（登録商標）ペグ（Teflon peg）上に添加し、乾燥してペレットを得ることができる。続いてこのペレットを、雄 New Zealandシロウサギの眼の網膜微小ポケット中に埋め込むことができる。このために、瞳孔面（pupillary plane）の垂直線上に切開を開始して角膜輪部の 2.75mm手前で終わる基質内トンネル（intrastromal tunnel）を作製しうる。外科手術後のケアとしては、単回用量のエリスロマイシン軟膏を網膜表面上に適用する必要がある。移植の約10日後に、移植部位に向かって新たに毛細管が成長しているのが観察されるはずである。ペレットに向かう成長（outgrowth）は、放出されたMA52に対する内皮細胞の化学走性応答を反映する可能性があり、またこれは脈管形成した領域および角膜輪部の血管数を測定することにより定量しうる。

【００５１】封入体から単離および精製するが再生処理を行っていない単量体MP52は陰性対
照として使用しうる。二量体MP52は陽性対照として使用しうる。

【００５２】大腸菌（E. coli）における単量体MP121の発現、再生、精製、および生物学的活性を判定するための可能性のある試験系ヒトMP121の成熟タンパク質部分を、配列番号４の316位におけるシステインを
アラニンに変換することにより変異させた。このために、配列番号３の1073位お
よび1074位のヌクレオチドをTGからGCに変換した。ヌクレオチドの置換は、本質
的に上記実施例のMP52に関して記載したように行ったが、プラスミドおよび突然
変異誘発用プライマーが異なるものである。pBP4MP121mプラスミドを使用したが
、これはMP52の成熟タンパク質部分の代わりにMP121の成熟タンパク質部分（配
列番号４のアミノ酸237-352をコードし、316位にシステインを有する）を含有し
、アンピシリン耐性遺伝子の代わりにテトラサイクリン耐性遺伝子を有する点で
pBP2MP52mとは異なるものである。突然変異誘発用プライマーとして、オリゴヌ
クレオチドCTGGAGGGGGCTCAGCCTGTGTACCCACGG（配列番号７）およびオリゴヌクレ
オチドCCGTGGGTACACAGGCTGAGCCCCCTCCAG（配列番号８）を使用した。

【００５３】得られたプラスミドpBP4MP121_ALAは、開始コドンの後に、316位がアラニンで
ある配列番号４のアミノ酸237-352をコードするヌクレオチド配列を含有してお
り、これを配列決定により確認した。

【００５４】単量体MP121の発現、封入体の単離、および精製は、本質的に上記実施例にお
いてMP52に関して記載したように行ったが、他の大腸菌株、すなわちHMS 174 (D
E3)（Novagen）を使用した。

【００５５】神経学的能力を示す、再生された単量体MP121の生物学的活性試験のために、M
P52に関して記載したものと同じアッセイを使用しうる。肝臓増殖に及ぼす再生
された単量体MP121の影響は、例えばラット肝細胞の一次培養物において、EGF誘
導型DNA合成を阻害することにより確認することができる。簡単に説明すると、
ラット（Wistar）肝臓から肝細胞を単離し、Yasudaらの方法（J. Clin. Invest.
Vol. 92, 1491-1496 (1993)）に従って培養しうる。該細胞は、インキュベーシ
ョンを行う前に、0.1nMインシュリン、0.1％BSAおよび1nM EGFを含有する新鮮な
無血清培地で洗浄する必要がある。可溶化した再生された単量体MP121を種々の
濃度でこの培地に添加し、続いてMead & Fausto（Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86, 1558-15562 (1989)）に記載のように、肝細胞を72時間インキュベートする
が、その最後の24時間では0.5μCi [³H]チミジン/mlを添加してインキュベート
する必要がある。トリクロル酢酸により沈殿しうる物質への[³H]チミジンの取り
込みをMcNielら（J. Cell Biol. 101, 372-379 (1985)）に記載のように測定し
うる。

【００５６】造血の刺激は、例えばWO98/22492号の実施例８に記載のように骨髄吸引液の培
養物で測定しうる。

【００５７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Aは、組換え手法により生成した、最初のアラニンを欠失している二量体M
P52のコンホメーションの２次元図表を示す。この図においては、二量体に含ま
れる７個のシステイン架橋が示され、単量体１ユニットあたり３個の分子内シス
テイン架橋と、２つの単量体を連結する１個の分子間システイン架橋が存在する
。図１Bは、本発明の単量体タンパク質を示しており、MP52のアミノ酸配列のシ
ステインは、システイン以外の任意のアミノ酸を表すＸで置換されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８７ 47/46 Ａ６１Ｌ 27/00 Ｆ４Ｈ０４５ 48/00 Ａ６１Ｐ 1/02 Ａ６１Ｌ 27/00 1/04 Ａ６１Ｐ 1/02 15/00 1/04 17/02 15/00 19/08 17/02 21/00 19/08 25/00 21/00 43/00 １０５ 25/00 Ｃ０７Ｋ 14/495 43/00 １０５Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/495 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 1/21 5/00 Ｂ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ベヒトールド，ロルフドイツ国ディー−69126 ハイデルベルグカール−ツァックマイヤー−ストラッセ 21 (72)発明者ポール，ジェンズドイツ国ディー−76707 ハンブリュッケンバストヴァルドストラッセ 25 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA12 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C076 AA16 AA19 AA61 BB11 CC26 EE56A FF15 GG41 GG46 4C081 AB03 AB06 AB11 AB19 BA12 CD111 CD28 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 CA59 DB52 MA02 MA66 NA14 ZA01 ZA67 ZA68 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZA97 ZB22 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 MA02 MA24 MA38 MA66 NA14 ZA01 ZA67 ZA68 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZA97 ZB22 4H045 AA10 BA10 CA40 DA01 EA21 EA24 FA74 GA21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】二量体形成に関与するシステインが置換または欠失している
ために必然的に単量体であることを特徴とする、TGF-βスーパーファミリーのメ
ンバーから選択されるタンパク質。
【請求項２】成熟タンパク質またはその生物学的に活性な部分もしくは変
異体であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】少なくともTGF-βタンパク質スーパーファミリーに特徴的な
7個のシステインを含む領域を含有することを特徴とする、請求項１または２記
載のタンパク質。
【請求項４】式I：C(Y)_25-29CYYYC(Y)_25-35XC(Y)_27-34CYCまたは式II：C(
Y)₂₈CYYYC(Y)_30-32XC(Y)₃₁CYC〔式中、Cはシステインを表し、Yは任意のアミノ
酸を表し、Xはシステイン以外の任意のアミノ酸を表す〕で示されるコンセンサ
ス配列を含有することを特徴とする、請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】形態形成タンパク質であることを特徴とする、請求項１〜４
のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】 TGF-β、BMP、GDF、アクチビンまたはGDNFファミリーに属す
るタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタ
ンパク質。
【請求項７】 MP52（GDF5）またはその生物学的に活性な部分もしくは変異
体であることを特徴とする、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】配列番号２に示すアミノ酸配列またはその一部を含むことを
特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】 MP121またはその生物学的に活性な部分もしくは変異体であ
ることを特徴とする、請求項６記載のタンパク質。
【請求項１０】配列番号４に示すアミノ酸配列またはその一部を含むこと
を特徴とする、請求項９記載のタンパク質。
【請求項１１】システイン残基が、アラニン、セリン、トレオニン、ロイ
シン、イソロイシン、グリシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸
で置換されていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタ
ンパク質。
【請求項１２】前記タンパク質の移動および特定の組織への局在化を促進
または媒介する追加のアミノ酸を含有することを特徴とする、請求項１〜１１の
いずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１３】請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質をコー
ドすることを特徴とする核酸。
【請求項１４】 DNAであることを特徴とする、請求項１３記載の核酸。
【請求項１５】配列番号１に示す配列またはその断片を含有することを特
徴とする、請求項１３または１４記載の核酸。
【請求項１６】配列番号３に示す配列またはその断片を含有することを特
徴とする、請求項１３または１４記載の核酸。
【請求項１７】コードしているタンパク質の発現を促進および／または駆
動する適切な発現制御配列をさらに含有することを特徴とする、請求項１３〜１
６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１８】適切なベクター系に請求項１３〜１７のいずれか１項に記
載の核酸を含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項１９】ベクター系が原核生物での発現に適していることを特徴と
する、請求項１８記載の発現ベクター。
【請求項２０】請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の核酸または請求
項１８もしくは１９記載の発現ベクターを含有し、かつ該核酸またはベクターの
発現時に、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単量体タンパク質を産生する
ことができることを特徴とする宿主細胞。
【請求項２１】原核宿主細胞であることを特徴とする、請求項２０記載の
宿主細胞。
【請求項２２】胚性細胞であることを特徴とする、請求項２０記載の宿主
細胞。
【請求項２３】請求項１〜１２のいずれか１項に記載の少なくとも１種の
タンパク質、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の少なくとも１種の核酸、
請求項１８もしくは１９記載の少なくとも１種の発現ベクター、または請求項２
０もしくは２２記載の少なくとも１種の宿主細胞を含有することを特徴とする医
薬組成物。
【請求項２４】前記タンパク質および／または核酸が、生物適合性のマト
リックス材料中および／または該材料上に保持されていることを特徴とする、請
求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】マトリックス材料が生物分解性であることを特徴とする、
請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】マトリックス材料自体が骨形成活性を有することを特徴と
する、請求項２４または２５記載の医薬組成物。
【請求項２７】前記タンパク質の二量体型の必要を示す疾患の予防または
治療のための、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】骨および／もしくは軟骨の損傷に関連するかまたは骨およ
び／もしくは軟骨の疾患に影響する疾患、または軟骨および／もしくは骨の成長
が望ましい病状を予防または治療するための、または脊椎固定のための、請求項
２７記載の医薬組成物。
【請求項２９】腱および／または靱帯を含む結合組織、歯科インプラント
を含む歯周または歯組織、CNS組織および神経病理学的状況を含む神経組織、感
覚神経系組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮および甲状腺組織、皮膚組
織、粘膜組織、内皮組織ならびに上皮組織に関連する損傷したまたは罹病した組
織を予防または治療するための；神経成長、組織再生、脈管形成、および潰瘍、
火傷、外傷または植皮を含む創傷治癒を促進または誘導するための；前駆細胞ま
たは骨髄細胞の増殖を誘導するための；増殖または分化状態を維持するための；
器官または組織移植用の組織または細胞を処理または保存するため；胃腸管壁を
完全にするための；あるいは不妊、避妊または妊娠における障害を治療するため
の、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項３０】外科的局部適用、局所または全身適用のための、請求項２
３〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】薬理学的に許容される補助物質をさらに含有することを特
徴とする、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】注射可能な組成物であることを特徴とする、請求項３０ま
たは３１記載の医薬組成物。
【請求項３３】所定の作用部位に該医薬組成物を方向づけて放出させるこ
とが可能なビヒクル中に保持されていることを特徴とする、請求項３０〜３２の
いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】前記ビヒクルが、リポソーム、ナノスフェア、より大きい
埋込可能な容器およびマイクロポンプより選択されることを特徴とする、請求項
３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】請求項２３〜３４のいずれか１項に記載の医薬組成物の使
用であって、前記タンパク質の二量体型を必要とするいずれかの適応症を予防ま
たは治療するための上記使用。