JP2003502345A - ペットまたはスポ−ツ用動物のためのｄｎａワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 パラミオウイルス群およびヘルペスウイルスに対するペットまたはスポ−ツ動物のための改良されたDNAワクチンの改良。 【解決手段】 第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質、ＤＭＲＩＥをワクチンに配合するか、抗原をコードするヌクレオチドを変える、特に抗原の膜内外領域をコードするヌクレオチドを失欠させるか、および／または、イントロンおよび／または信号期をコードするヌクレオチドを挿入するか、これらを組み合わせる。得られたワクチンにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術分野】

本発明は、ペットまたはスポ−ツ動物、特にイヌ、ネコおよびウマのための改
良されたDNAワクチンに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】

予防接種のためのデオキシリボ核酸（DNA）分子の使用は1990年代の始めから
知られている（Wolf.et al, Science 1990,247,1465−1468）。この予防接種技
術は免疫活性蛋白をコ−ドし、対象細胞の生体内でトランスフェクションして発
現する細胞および液体をDNAまたはRNA分子で予防注射して免疫するものである。
ＤＮＡワクチンは予防注射をされる対象細胞で発現できる少なくとも一種のプラ
スミドと、薬学的に許容されるビヒクルまたは佐薬とから成る。このプラスミド
のヌクレオチド配列は一つ以上の免疫原、例えば蛋白または予防注射をされる対
象、細胞免疫反応（Ｔリンパ球の動員）および液性免疫応答に導くことができる
糖タンパクをコ−ドし、発現する（免疫原に対する抗体作成の刺激）(Davis H.L
. Current Opinion Biotech. 1997. 8. 635−640)。

【０００３】 病原体に由来する全ての免疫原が予防注射をされる動物の最適防御免疫応答を
導くために自然に十分に効果的である抗原であるというわけではない。それゆえ
に免疫応答を改善することが必要である。投与の各経路はそれ自身の制約および
困難を有する、すなわち、投与の一つの経路で効果的であるDNAワクチンが他の
経路では無効であることがある。。

【０００４】 投与経路の選択は開業医および育種家の要求を考慮しなければならない。困難
は動物を制止することまたは産物の種類に関連する。筋肉内の経路が使うことが
できるにもかかわらず、皮下経路がペットの予防接種では大きな重要性がある、
特に小さいか、取り扱うのが難しい動物の場合には。DNAワクチンは種々の経路
を経たそれらの効果的な投与を許すためにそれゆえに改良されなければならない
。

【０００５】 DNAワクチンは実験的にすでに使われ、特に麻疹ウィルスのヘムアグルチニン
（HA）をコ−ドするDNAワクチン(Etchart ec aiL. J. Cen. Virol. 1997. 78. 1
577−1580）、マウスへの鼻腔内の投与が内服より効果的なことがわかった。他
の実施例はエイズウィルス（HIV）のエンベロ−プ（Env）蛋白をコ−ドするDNA
ワクチンである皮下投与が筋肉内の経路投与と比較して効果はなかったか(Ishil
ec al. AIDS Res. Hum. Retro. 1997. 13. 1421−1428)

【０００６】 DNAワクチンはイヌジステンパ−ウイルス（CDV）を防ぐために実験的に動物ウ
ィルスに対して使われた。いくらかのCDV免疫原が知られている。特にヌクレオ
カプシドタンパク質（N）、基質タンパク質（M）、融合蛋白質（F）、ヘムアグ
ルチニン（HA）（WO−A−9741236）。しかし、CDVのヘムアグルチニンをコ−ド
するDNAワクチンおよび融合蛋白質の皮下投与はマウスの抗体作成を検出するこ
とを可能にしなかった、そして、小さい抗体作成だけが、このDNAワクチンの筋
内投与の後、認めた(Sixt et aI. J. Virol. 1998. 72. 8472−8476) 免疫応答
の誘導およびこのレスポンスの間、作用に入っている免疫系の種々の成分間の類
縁は、異なってもよい一つの動物種から他のものまで。ハツカネズミひな型に実
行される実験から取り出される多くの教えることは、よりよくマウスの免疫系の
作用することを理解することを可能にした、これら以外の、教えることは他の化
学種に直接応用できらない、特に、それがマウスの免疫応答を導くために、他の
化学種の簡単であるという理由(van Drunen Little−van den Hurk et alL J. G
en. Virol. 1958. 79.831−839 B6hm et al. Vaccine 1998. 16. 949−954）。D
NAワクチンの投与の種々経路は提案された（腹腔内の、静脈内の、筋肉内の、皮
下の、皮内の、粘膜）。

【０００７】 DNAについては予防注射をされる対象の皮膚の細胞に深く入りこむために計画
された特定の金粒子を被覆した投与も提案された(Tang et al. Nature 1992. 35
6. 152−154)。そして、根本的な組織の皮膚細胞および細胞を形質移入すること
を可能にする液状のジェット式注射器(Furth ec al. Analytical Bioch. 1992.
205. 365−368）。

【０００８】 DNAの試験管内のトランスフェクションのために各種の化合物が使われている
： A カチオンの脂質 このカチオンの脂質は四つの部分群に分けられ： 1) 第四アンモニウム塩を含んでいるカチオンの脂質、例えばDOTMA （ジオレオ
イルオキシプロピルトリメチルアンモニウム、Lipofectineの名称でGibcoが製造
）、DOTAP（トリメチル−23−（オクタデシル−9−エンオイルオキシ）−l−プ
ロパンアンモニウム (Gregoriadis et al. FEDS Letters 1997, 402. 107−110)
、DMRIE（N−2− ヒドロキシエチル）−N,N−ジメチル−2、3−ビス（テトラデ
シルオキシ）−1−プロパンアンモニウム、WO−A−9634109）、DLRIE（N−（2−
ヒドロキシエチル）−N,N−ジメチル）、2、3−ビス（ドデシルオキシ）−1−プ
ロパンアンモニウム(Fe1gner et al. Ann. N Y Acad. Sci. 1998. 772. 126−13
9)。第四アンモニウム塩を含むこれらのカチオン脂質はDOPC（ジオレオイル ホ
スファチジルコリン）またはDOPE（ジオレイルホスファチジルエタノ−ルアミン
）のような追加の中性脂質と組み合わせることもできる(J.P. Behr, Bioconjuga
te Chemistry 19S4. 5. 382−369)。

【０００９】 2) リポアミン（例えばDOGS）（ジオクタデシル アミドグリシルスペルミン、P
romegaの名称でTransfectamが製造、Abdallab et al. Biol. Cell. 1995. 85. 1
−7）、DC−Cho2（ジメチルアミノエタン−カルバモイル−コレステロ−ル、BGS
C（ビス−グアニジンスペルミジン−コレステロ−ル）、BGTC（ビス−グアニジ
ン−トレン-コレステロール）（Vigneron. et aJ。Proc。Natl。Acad。Sd。USA
1996。93。9682−9689）。

【００１０】 3) 第四アンモニウム塩およびリポアミン（例えばDOSPA）を含んでいるカチオ
ン脂質、例えば（N,N−ジメチル）−N−（2−（スペルミンカルボキシアミド）
エチル）−2、3−ビス−(オレオイルオキシ)−1−プロパンイミジウム（ペンタ
ヒドロクロライド）プロパンイミジウム五塩酸塩、LipofectAmineの名でGibcoか
ら市販、Hawley−Nelson et al. Focus 1993. 15. 73−79）、GAP−DLRIE（N−
（3−アミノプロピル）−N,N−ジメチル−23−ビス（ドデシルオキシ）-1−プロ
パンアミニウム(Wheeler et al. Proc. Nati. Acad.. Sci. USA 1996. 93. l2.4
S4−l14~9; Norman et al. Vaccine 1997. 3.5. 801−803）

【００１１】 4) アミジン塩（例えばADPDE、ADODE）を含む脂質(Ruysschaert et al. Bioche
m. Biophys. Res. Comrnun. 1994. 203. J.622−1628)。 B ポリマ−、例えばSuperFect（活性化されたデンドリマー分子(Qiagen; Xu et
al. Mol. Genet. Metab. 1998. 64. 193−197)

【００１２】 C/ 特定のコレラトキシンの生化学試剤、例えば毒 これらの化合物はDNAワクチンの製剤において使われ、結果がよりよくなる。
インビトロ・トランスフェクションでの知識はDNA予防接種には適用できず、最
終目的の保護免疫反応が確実に得られるか否かは分からない。トランスフェクシ
ョン・インビトロを促進することが知られた化合物が負の免疫保護誘導効果を示
すことも観測されている。いくらかの製剤化合物はトランスフェクション細胞に
対して高投与量で中毒性になる。

【００１３】 上記のEtchartの研究(Etchart et al. J. Gen. Virol. 1997. 78. 1577−1580
)では、DOTAPの使用はDNAワクチン投与で鼻腔内経路ではアジュバント効果を有
しなかったが、経口投与ではアジュバント効果を示した。DOTAPはハツカネズミ
ひな型上のインフルエンザウィルス・ヘムアグルチニン（HA）をコ−ドするDNA
ワクチンにおいて、使われたどちらが、鼻腔経路で投与された（Ban et al. Vac
cine 1997. 15.811−813)、しかし、DOTAPの添加は、免疫応答を抑制した。DC−
Cholのまたはハツカネズミひな型上の肝炎Sウィルス表面蛋白質（S）をコ−ドす
るDNAワクチンのDOTAP/DOPEの使用それを作られる筋肉内の経路によって、可能
性を投与された‖抗体レスポンスを増加する、Lipofectine（またはDOTMA）の使
用がこのレスポンスを増やさなかったのに対して、(Gregoriadis et al. FEES L
etters 1997. 402. 107−110)。

【００１４】 DC−Chol/DOpEが、また、DNAワクチンにおいて、ハツカネズミひな型上のエイ
ズウィルス、HIV、Env蛋白に対して使われた、筋肉内の経路による投与が、より
効果的な免疫応答を導いた、皮下であるか皮内の経路による投与がそれを増やさ
なかったのに対して、(Tshii et al. AIDS Res. Hum. Retro. 1997. 13. 1421−
1428)

【００１５】 同様に、WO−A−98 40499はヌクレイン酸＋に哺乳動物の粘膜の上皮を形質移
入するためのカチオンの脂質錯体を用意しようともくろむ、免疫応答を導くこと
を目的とする抗原の遺伝子療法または発現のための。吸入法（例えば肺の上皮）
によって、この文献は、粘膜の経路を目標とする。それは、その結果が前の研究
と異なることを示す。それも、筋肉内の（腸管外の）経路のために、裸のＤＮＡ
がDNA＋混合脂質より効果的であると付け加える。

【００１６】 特定のインタ−ロイキンまたはインタ−フェロンの、一定のサイトカインの添
加は、特に、DNAワクチンによって、免疫応答起因性を改良することを可能にす
ることができる。各サイトカインは、それに特異的で、細胞のレスポンスの方へ
または液性のレスポンスの方へ免疫応答をより大きいかより小さい度に適応させ
る反応を誘発する(Pasquini et al. Immunol. Cell. Bid, 1997. 75. 397−401;
Kim et al. Μnterferon Cytokine Res. 1999. 19. 77−84）。免疫性の状況が
変化する場合、所与の化学種から得られるサイトカインのアジュバント効果が必
ずしも同じものであるというわけではない、特に、これである場合サイトカイン
は他の化学種に、それゆえに異形の免疫系において、投与される。サイトカイン
の添加は、また、アジュバント効果を有することができないかまたは捜される（
すなわち免疫応答の低下または阻害）効果の逆反応に結果としてなりさえするこ
とができない。

【００１７】 従って、マウスへのこの融合蛋白質の直接の投与が効果的であるのに対して、
GM−CSFについては溶解されるイムノグロビンの単一の鎖をコ−ドするDNAワクチ
ンは、免疫応答を増やさないあるのと、同じ方法のFvから成っている融合蛋白質
の、そして、後の融合蛋白質をコ−ドするDNAワクチンのサイトカインILL−lbet
aまたは投与の投与(Hakim ec al. Μmmunol, 1996. 157. 5503−5511）。サイト
カインIL−2をco−expressingしているプラスミドの使用および液性のおよび細
胞の免疫応答の増加の溶解されたかnonfusedされたコンフォメ−ション結果のＢ
型肝炎ウイルス外膜蛋白(Chow et al. J. Virol. 1997. 72.. 169−78)。

【００１８】 しかし、ヒトの獲得性の免疫不全ウイルス（HIV−l）糖タンパクgpl2Oをコ−
ドするbicistronicなプラスミドおよびサイトカインIL−2の使用は、それがgpl2
Oだけをコ−ドするmonocistronicなプラスミドの使用によって、得たより、低い
特性anti−gpl2O免疫応答を導いた(Barouch et al. Μmmunol 1998. 161. 1375
−1882）。ネズミのGM−CSFのためのもう一方が活性を刺激する二つの発現ベク
タ−（狂犬病ウィルスG糖タンパクのための一つの符号化）のマウスに、共同注
射B、そして、Ｔリンパ球、ガンマ型インタ−フェロン（ネズミのGM−CSFの代わ
りに）をコ−ドするプラスミドを有する共同注射が免疫応答の減少に結果として
なるのに対して、(Xiang et al. Immunity 1995. 2. 129−135)

【００１９】 抗原（例えば抗原をコ−ドするヌクレオチド配列の一部の欠失）のいくらか改
造型、抗原をコ−ドするヌクレオチド配列へのＤＮＡ断片のまたは非−翻訳され
た部位上流側またはダウンストリ−ムへの挿入は、また、DNAワクチンの有効性
を改良できる、抗原またはその提示の発現レベルを改良することによる事項の。

【００２０】 しかし、実際問題として、抗原をコ−ドするヌクレオチド配列上の取扱いは、
原基の低下または減量について免疫学的な活性を持ってくることができる。した
がって、狂犬病ウィルスG抗原をコ−ドする遺伝子からの膜貫通領域の欠失は、
投与の後、この修飾された抗原をコ−ドするDNAワクチンの筋肉内の経路によっ
て、ハツカネズミひな型の保護起因性のレベルを減らした(Xiang et al. Virol.
1995. 209。569）。ウシのヘルペスウィルス（BHV）gD糖タンパクをコ−ドする
遺伝子からの膜貫通領域の欠失は、抗体レスポンスを増やすことを可能にする必
要はなくて、筋肉内の経路によって、予防注射をされるウシ属の動物の部分保護
だけを導いた(van Drunen Little−van den Hurk et al. J. Gen. Virol. 1998.
79. 831−839）。液性のおよび細胞の免疫応答および授けられる保護が、免疫
された後に挑戦されるモルモットにおいても同一である‖DNAエボラウィルスGP
糖タンパクをコ−ドするかまたはDNAワクチンの分泌された形状以外のこのGP糖
タンパクをコ−ドするワクチン(Xu et aiL. Nature Medicine 1998. 4. 37−42)

【００２１】 マラリヤPβ32抗原をコ−ドする遺伝子へのヒトの組織プラスミノ−ゲンアク
チベ−タ（tPA）のシグナル配列の挿入は、筋肉内の経路によって、予防注射を
されるマウスの抗体レスポンスを増やすことを可能にしなかった（HaddadほかFE
MS 1997。18。193−202）。同位相で、ネズミのロタウィルスVP7抗原もコ−ドす
る遺伝子へのtPA配列の添加は、皮内の経路によって、予防注射をされるマウス
の抗体レスポンスを増やすことを可能にしなかった、効果的な保護を導く以外こ
となく、VP4抗原およびtPAから成っている融合蛋白質がこの増加を許したのに対
して、(Choi et al. Virology 1998. 250. 230−240) 一つの抗原のヌクレオチド配列で行った改良は一般に他の抗原に直接置き換え
ることはできない。その理由は抗原は必ずしも同じ構造を有していないためであ
る。

【００２２】

【発明が解決しよとする課題】

本発明の目的は、DNA予防接種の有効性を増進させ、ペットおよびスポ−ツで
使われる動物の免疫応答および保護をより効果的にし、特に、イヌ、ネコおよび
ウマに対して種々の投与経路、特に皮下経路で投与可能なDNA予防接種法を提供
することにある。

【００２３】 本発明の目的は、イヌジステンパ−ウイルス（CDV）、呼吸器系ウィルスまた
はイヌ咳ウイルス（イヌインフルエンザ−2またはCPI−2ウィルス）、イヌヘル
ペスウィルス（CHV−l）に対して効果的で、改良された保護免疫応答を示すDNA
ワクチンを工業的に生産することにある。

【００２４】 出願人の目的は、ネコのネコのヘルペスウイルス（FHV−l）に対して効果的な
および保護の免疫応答を導く改良型のDNAワクチンの生産にある。

【００２５】 出願人の目的は、ウマのヘルペスウイルス1型（EHV−l）またはウマのウマの
ヘルペスウィルス基型4（EHV−4）に対して効果的および保護免疫応答を導く改
良型のDNAワクチンの生産にある。

【００２６】 本発明の目的は、CDVウィルス、CPI−2ウィルス、CHV−1ウィルス、狂犬病ウ
ィルス（ラブドウィルス）、イヌのパルボウィルス（CPV）、イヌのコロナウィ
ルス（CCV）およびBonrelia buirgdorferiから成っているグル−プから選んだ少
なくとも一つのワチチン価を有するイヌに対して効果的な保護を得ることを可能
にする改良型のDNAワクチンの生産にある。

【００２７】 本発明の目的は、ネコのヘルペスウィルス（FHV−1）、ネコのカリシウイルス
（FCV）、狂犬病ウィルス（ラブドウィルス）、ネコのパルボウィルス（FPV）、
ネコの感染の腹膜炎ウイルス（EIPV）、ネコの白血病ウィルス（猫白血病ウイル
ス）およびネコの後天性免疫不全症候群ウィルス（FIV）から成るグル−プから
選ばれる少なくとも一つのワクチン価から成るネコの効果的な保護を得ることを
可能にする改良型のDNAワクチンの生産にある。

【００２８】 本発明の目的は、ウマのヘルペスウイルス1型（EHV−l）、ウマのヘルペスウ
イルス基型4（EHV−4）、ウマのインフルエンザウィルスの成るウマの東洋脳炎
ウイルス、ウマの西洋脳炎ウイルス、ベネズエラのウマの脳炎ウイルス、狂犬病
ウィルス、クロストリジウムtetaniおよびBorrelia burgdorferiからなるグル−
プから選ばれる少なくとも一つのワクチン価から成るウマの効果的な保護を得る
ことを可能にする改良型DNAワクチンの生産にある。

【００２９】

【課題を解決するための手段】

本発明の対象は、ペットおよびスポ−ツで使われる動物、特にイヌ、ネコおよ
びウマに感染する少なくとも一種の病原体に対して効果的な保護が得られる改良
型のDNAワクチンにある。このDNAワクチンは製剤によるか、GM−CSFの添加によ
るか、抗原の最適化によるか、これらの組み合わせにより作られる。

【００３０】 このDNAワクチンはその製剤によって改良するか、GM−CSFの添加によるか、抗
原の最適化によるか、GM−CSFの添加と抗原の最適化によるのが好ましい。

【００３１】 本発明のDNAワクチンは活性成分として遺伝子または遺伝子断片をコ−ドし、
発現するプラスミドを含む。プラスミドとは生体内で発現される遺伝子およびそ
の発現に必要な要素の配列から成るポリヌクレオチド配列から成るDNA転写単位
を意味する。円形プラスミド形状（ス−パ−コイルでもよい）が好まれる。直鎖
形状も本発明の範囲内になる。

【００３２】 各プラスミドは、宿主細胞において挿入される遺伝子の発現を確実にすること
ができるプロモ−タを含む。それは、一般に強い真核性プロモ−タ、特にヒトま
たはネズミ起源または選択的にラットまたはモルモットのような他の生物起源の
シトメガロウィルス早期プロモ−タCMV−IEである。より一般にはプロモ−タは
ウイルス細胞起源である。CMV−IE以外のウイルスのプロモ−タとしては5V40ウ
ィルスの早期または後遺プロモ−タまたはRous SarcomaウィルスのLTRプロモ−
タが挙げられる。また、遺伝子（例えば遺伝子へのプロモ−タ特性）が誘導され
るウィルスからのプロモ−タでもよい。細胞のプロモ−タとして、デスミン・プ
ロモ−タまたは代わりにアクチン・プロモ−タのような、サイトスケルトン遺伝
子のプロモ−タを挙げられることができる。複数の遺伝子が同じプラスミドに存
在するときには、それらは同じ転写単位または二つの異なる単位に存在すること
ができる。

【００３３】 最初の型式によれば、本発明のDNAワクチンはアジュバント（第四アンモニウ
ム塩を含むカチオン脂質）としてDMRIEが加えられ、好ましくは中性脂質と一緒
に組み合わされてDMRIE−DOPE形で添加されるのが好ましい。

【００３４】 本発明の対象は、ペットおよびスポ−ツで使われる動物、特にイヌ、ネコまた
はウマに影響を及ぼす少なくとも一種の病原体に対するDNAワクチン、対象動物
種の病原体の免疫原をコ−ドする少なくとも一種のヌクレオチド配列を生体内で
発現可能な条件で含む少なくとも一種のプラスミドと、下記式の第四アンモニウ
ム塩を含むカチオン脂質とからなる：

【００３５】

【式２】 （ここで、 R₁は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、 R₂は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、 Xはヒドロキシルまたはアミン基であり、

【００３６】 上記脂質はDMRIE（N−（2−ヒドロキシエチル）−N,N−ジメチル−23− ビス
（テトラデシルオキシ）−1−プロパンアンモニウム、WO−A−9634109）である
のが好ましく、さらに好ましくは、中性脂質、特にDOPE（ジオレイルホスファチ
ジルエタノ−ルアミン）と組み合わされて、DMRIE−DOPEの形にするのが好まし
い。

【００３７】 組換え型ベクタ−は上記アジュバントと使用直前に混合するのが好ましい。動
物へ投与前、好ましくは10〜60分、特に30分前に混合して錯体にするのが好まし
い。

【００３８】 DOPEが存在するときのDMRIE：DOPEのモ比は95：5〜5：95、特に1:1である。プ
ラスミド：DMRIEまたはDMRIE−DOPEアジュバントの重量比は50：1〜1：10、特に
10：1〜1：5、好ましくは1：1〜1:2である。

【００３９】 第2の型式に従うGM−CSF（顆粒球マクロファ−ジ−コロニ−形成刺激因子、Cl
ark S.C. et al. Science 1987. 230. 1229; Grant SM. et al. Drugs 1992. 53
. 516）をワクチンに加える。本発明では直接GM−CSF蛋白をワクチン組成物に組
み込むことにより実行できる。また、GM−CSFをコードする配列を発現可能な状
態で発現ベクターに挿入することも好ましい。

【００４０】 発現ベクタ−としては、プラスミド、例えば主要な抗原をコ−ドするヌクレオ
チド配列を含むプラスミドまたはその他のプラスミドの使用が好ましい。GM−CS
Fの選択は予防注射をされる動物種に従ってされる。従って、イヌではイヌGN−C
SFが使われ、ネコではネコのGM−CSFであり、ウマではウマのGM−CSFが使われる
。

【００４１】 第3の型式によれば、免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列が最適化された形
にされる。最適化はヌクレオチド配列の任意の改造を意味する。この抗原をコ−
ドするメッセンジャ−ＲＮＡの安定性の増加によって、少なくともこのヌクレオ
チド配列のより高い発現レベルによって、それ自体を明らかにするこの抗原の引
き起こされる分泌によって、細胞外の培地に、そして、直接であるか間接的な結
果としてを有する免疫応答の増加を導いてもよい。

【００４２】 本発明では主要な抗原の最適化を好ましくは主要な抗原の膜貫通領域をコ−ド
するヌクレオチド配列の断片の欠失で行う。欠失は完全な欠失または膜貫通領域
に充分、不完全な欠失または、および／または、同位相でtPA（組織プラスミノ
−ゲンアクチベ−タ）をコ−ドするヌクレオチド配列の添加、シグナルおよび／
または発現される遺伝子のスタビライジング・イントロン上流側での挿入による
実質的機能上欠失を意味する(Montgomery et al. Cell. Mol. Bid. 1997. 43. 2
85−292; Harris et al. Mol. Biol. Med 1986. 3. 279−292)。

【００４３】 従って、主要な抗原の膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失は、切り詰め
られる抗原の細胞外の培地への分泌を促進し、それらが免疫系の細胞と接触する
可能性を増やす。tPAシグナルをコ−ドするヌクレオチド配列の挿入はtPAシグナ
ルが加えられ、従って、このメッセンジャ−ＲＮＡの発現レベル、従って、抗原
の生産を増やすメッセンジャ−ＲＮＡのtranslatabilityを容易にする。tPAシグ
ナルも、総合される抗原の分泌で、役割を演ずる。主要な抗原をコ−ドする遺伝
子へのスタビライジング・イントロンの挿入は、そのメッセンジャ−ＲＮＡの異
所性のスプライシングを避けて、後者の身体的な保全を維持する。

【００４４】 好ましくは、tPAシグナルが、ヒト起源である。ヒトtPAシグナルのヌクレオチ
ド配列はGenBankデ−タベ−スから受入れ番号NM000930でアクセスできる。イン
トロンはウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIが好ましい(van Ooyen et al
. Science 1979. 206. 337−344)。このヌクレオチド配列は受入れ番号V00882で
GenPankデ−タベ−スからアクセスでき、イントロンNo.2で示される。

【００４５】 本発明の対象は、イヌのイヌジステンパ−（イヌDistemper Virus、CDV）に対
して効果的および保護免疫応答を導くことができる改良型のDNAワクチンにある
。イヌジステンパ−ウイルスはParamyxoviridae族の構成メンバであるMorbilliv
irusで、このウィルスはイヌ種またはネコを感染させる（Hard et al J. Virol.
1996.77.397−405）。

【００４６】 本発明は、イヌのイヌジステンパ−に対して皮下経路で効果的な保護が得られ
るDNAワクチンを得ることができる（Sixt et al J. Viral.1998.72.8472−8476
）。

【００４７】 本発明のCDVに対するDNAワクチンは、DMRIH、好ましくはDMRIE＋DOPEのアジュ
バントを含む製剤によって改善するのが好ましい。イヌのGM−CSF （ナッシュそ
の他ブラッド1991。78.50−56）、または少なくとも一つのCDV抗原の最適化また
は少なくとも一種のCDV抗原のイヌGN−CSFおよび最適化の添加。イヌGM−CSFを
コ−ドするヌクレオチド配列はGenBankデ−タベ−スから受入れ番号S49738でア
クセスできる。

【００４８】 イヌGM−CSFの添加は、ワクチンの組成物へのイヌのGM−CSFポリペプチドの取
込みによって、または好ましくは生体内の発現ベクタ−（好ましくはプラスミド
）に、イヌのGM−CSFをコ−ドするヌクレオチド配列の挿入により実行されるこ
とができる。好ましくは、イヌGM−CSFをコ−ドするヌクレオチド配列は、第2の
発現プラスミド（CDV抗原をコ−ドする遺伝子が挿入してどちらであるかそれ（
またはそれら）と異なる）に挿入される。

【００４９】 「シグナル」配列によって、CDVに由来する抗原の最適化は、置換により実行
されるヘムアグルチニン（HA）のシグナルペプチドの配列のおよび／または融合
蛋白質（F）の、tPAのヒト起源（GenBank受入れ番号NM_000930）のシグナルおよ
び／またはHAの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片のおよび／またはFの欠失に
よって、および／または、HAをコ−ドするヌクレオチド配列および／またはF.の
上流のウサギβ−グロビン遺伝子（誰のヌクレオチド配列（イントロンNo.2）が
、GenBankデ−タベ−スから受入れ番号V00882の下にアクセスできるか）のイン
トロンIIの事項への、イントロンの挿入によって、本発明のCDVを防ぐためのDNA
ワクチンが、それゆえに単一の最適化されたCDV抗原（HAまたはF）をコ−ドする
ことができて、発現できる、または、の両方（すなわち最適化されたHAおよび最
適化されたF.）

【００５０】 選択的に、その天然の形状（改造型なしで）のCDV基質タンパク質（M）をコ−
ドする配列および／またはその天然の形状（改造型なしで）のCDVヌクレオプロ
テイン（N）をコ−ドするヌクレオチド配列は、また、挿入されることができて
、プラスミドにおいて、発現して、最適化されたHAを含んでいるプラスミドと化
合しておよび／またはFを最適化した。彼が本発明において、使用した缶および
発現ベクタ−の種々の構造物があるCDV抗原をコ−ドするヌクレオチド配列は、
添付の実施例において、そして、WO−A−9803199の実例を示した、特に、実施例
8および9および図2および図3。

【００５１】 好ましくは、本発明の、筋肉内の経路による投与のためのCDVを防ぐためのDNA
ワクチンは、DMRIE−DOPEについては配合されて、発現プラスミド（例えばpNS02
4、図4）から成るCDV HA抗原をコ−ドすることヒトのtPAシグナルペプチド配列
を有するHAシグナル配列の交代作用によって、最適化される、HAの膜貫通領域を
コ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって、そして、HA遺伝子のウサギ
β−グロビン遺伝子上流側のイントロンIIの、そして、第2の発現プラスミド（
例えばpNSO2l、図3）の挿入によって、CDV F抗原をコ−ドすること膜貫通領域を
コ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって、最適化されるそして、F遺
伝子のウサギβ−グロビン遺伝子上流側のイントロンIIの挿入によって。

【００５２】 好ましくは、本発明の、皮下の経路による投与のためのCDVを防ぐためのDNAワ
クチンが、DMRIE−DOPEについては配合されて、イヌGM−CSをコ−ドする発現プ
ラスミドから成る？そして、以前に定義される（例えばpNSO24およびpNSO2l）二
つのプラスミド

【００５３】 本発明の対象は、また、イヌの効果的なおよび保護の免疫応答を呼吸の錯体ま
たは犬小屋咳に対して導くことができる改良型のDNAワクチンである（イヌparei
nfluenza−2またはCPT−2ウィルス）、CPI−2ウィルスは、Paramyxoviru.s（ま
た、Pararnyxoviridae族の構成メンバ）である(Bittle et al. J. Am. Vet. Med
. Assoc. 1970. 156. 1771−1773; Maloney et aI. Aust Vet J. 1985. 62. 285
−286）、CPI−2を防ぐためのDNAワクチンは、本発明、特に、DMRIE、好ましく
はDMRIE−DOPEに従うアジュバントについては、好ましくは配合される。これが
、選択的に化合されることができる。どちらか、少なくとも一つのCPT−2抗原の
イヌGM−CSFおよび最適化の少なくとも一つのCPI−2抗原または最後に添加のイ
ヌGM−CSFまたは最適化の添加。

【００５４】 CDVのために記載されているように、イヌGM−CSFの添加を、実行できる。 「シグナル」配列によって、CPI−2に由来する抗原の最適化は、置換により実行
される特に、CPI−2のヘムアグルチニン−ノイラミニダ−ゼ（HN）のシグナル配
列のおよび／またはCPI−2の融合蛋白質（F）の、ヒト起源のtPAのそれそして、
RNの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって、および／またはFの、
そして、イントロンの挿入によって、RNをコ−ドするヌクレオチド配列のウサギ
β−グロビン遺伝子上流側の特定のイントロンIIのおよび／またはF. 本発明のC
PI−2を防ぐためのDNAワクチンが、それゆえに単一の最適化されたCPI−2抗原（
RNまたはF）または両方とも（RNおよびF）をコ−ドすることができ、発現できる
。

【００５５】 本発明および種々の発現ベクタ−構造物において、使うことができるCPI−2抗
原をコ−ドするヌクレオチド配列は、添付の実施例において、与えられる。好ま
しくは、本発明の、筋肉内の経路による投与のためのCPI−2を防ぐためのDNAワ
クチンは、DMRIE−DOPEについては配合されて、発現プラスミド（例えばpSBO34
、図6）から成るヒトのcPAのシグナル配列の挿入によって、RNのシグナル配列の
代わりに最適化されるCPI−2のRN抗原をコ−ドすること、trans膜領域をコ−ド
するRNのヌクレオチド配列の断片の欠失によって、そして、HNの、そして、CPI
−2のF抗原をコ−ドする第2の発現プラスミド（例えばpSB032、図5）の遺伝子上
流側が最適化したウサギβ−グロビンのイントロンIIの挿入によって、Fの膜貫
通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の、そして、F.のウサギβ−グロビ
ン遺伝子上流側のイントロンITの挿入による欠失によって

【００５６】 好ましくは、本発明によれば、皮下の経路による投与のためのCPI−2を防ぐた
めのDNAワクチンは、DMRIE−DOPEについては配合される。そして、イヌGM−CSを
コ−ドする発現プラスミドの組み立てる。そして、以前に定義される（例えばpS
BO34およびpSBO32）二つのプラスミドの？ 本発明の対象は、また、イヌの効果的なおよび保護の免疫応答をイヌのヘルペス
ウイルス1型（CHV−l）に対して導くことができる改良型のDNAワクチンである

【００５７】 CHV−1ウィルスは、Alphaherpesvirinae族の構成メンバである。このウィルス
は、イヌのウイルスの鼻気管炎に対して責任がある。gB、gCおよびgD糖タンパク
をコ−ドするヌクレオチド配列は、公知である(Limbach et aI. J. Gen. Virol.
1994. 75. 2029−2039） CHV−1を防ぐためのDNAワクチンは、本発明、特に、DMRIE、好ましくはDMRIE−D
OPEに従うアジュバントについては、好ましくは配合される。これが、選択的に
化合されることができる‖どちらか、少なくとも一つのCHV−l抗原のイヌGM−CS
Fおよび最適化の少なくとも一つのCHV−l抗原または最後に添加のイヌGM−CSFま
たは最適化の添加。

【００５８】 イヌGM−CSの添加？外へ運ぶことができるCDVのための記載されている。CHV−
lから誘導される抗原の最適化は、gB糖タンパクの膜貫通領域をコ−ドするＤＮ
Ａ断片のおよび／またはgC糖タンパクのおよび／またはCHV−lのgD糖タンパクの
欠失によって、実行される。本発明のCHV−lを防ぐための改良型のDNAワクチン
は、単一の最適化されたCHV−l抗原（gE、gCまたはgD）またはそれらまたは三つ
のうちの二つをそれゆえにコ−ドすることができて、発現できる。

【００５９】 本発明および種々の発現ベクタ−構造物において、使うことができるCHV−l抗
原をコ−ドするヌクレオチド配列は、添付の実施例において、そして、実施例7
および8の事項の、WO−A−03199分の98において、そして、図13および14におい
て、与えられる。

【００６０】 好ましくは、本発明によれば、筋肉内の経路による投与のためのCHV−1を防ぐ
ためのDNAワクチンは、DMRIE−DOPEについては配合されて、発現プラスミドから
成るCHV−l gE抗原が、第2の発現プラスミドの、膜貫通領域をコ−ドするヌクレ
オチド配列の断片の欠失によって、最適化した（例えばpSB0l6、図7）符号化CHV
−l gC抗原が膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の、そして、第3
の発現プラスミドの欠失によって、最適化した（例えばpSBOl9、図8）符号化CHV
−l gD抗原をコ−ドすることは、ヌクレオチド配列符号化の断片の欠失によって
、膜貫通領域を最適化した。（例えばpSBOl7、図9）

【００６１】 好ましくは、本発明の、皮下の経路による投与のためのCHV−lを防ぐためのDN
Aワクチンが、DMRIE−DOPEについては配合されて、イヌGM−CSをコ−ドする発現
プラスミドから成る？そして、三つのプラスミドが、以前に定義した（例えばpS
BO16、pSBOl9およびpSBOl7） 本発明の対象は、ネコの効果的なおよび保護の免疫応答をネコのヘルペスウイル
ス1型（FHV−l）に対して導くことができる改良型のDNAワクチンである

【００６２】 FHV−lウィルスはネコのウイルスの鼻気管炎の原因となるAlphaherpesvirinae
族のウィルスである（Fargeaud ot..Virol。1984。80。69−82）。FHV−lに対す
るDNAワクチンは、本発明、特に、DMRIE、好ましくはDMRIE−DOPEに従うアジュ
バントについては、好ましくは配合される。これは、最も少なく一つのFHV−1抗
原で選択的にネコのGM−CSFの添加またはねこGM−CSFおよび最適化の少なくとも
一つのFHV−l抗原または最後に添加の最適化を有するどちらでも結合されること
ができる。

【００６３】 ネコのGM−CSの添加、ネコのGM−CSの取込みによって、持ち歩くことができる
、ワクチンの組成物にポリペプチドまたは、生体内の発現ベクタ−（好ましくは
プラスミド）に、ネコのGM−CSF（例えば受入れ番号AF053007の下のGenBankデ−
タベ−スからアクセスできること）をコ−ドするヌクレオチド配列の挿入によっ
て。好ましくはねこGM−CSをコ−ドするヌクレオチド配列？第2の発現プラスミ
ド（FRy−i抗原をコ−ドする遺伝子が挿入してどちらであるかそれ（またはそれ
ら）と異なる）に挿入する。

【００６４】 FHV−lから誘導される抗原の最適化は、gB糖タンパクの膜貫通領域をコ−ドす
るＤＮＡ断片のおよび／またはgC糖タンパクのおよび／またはFRy−iのgD糖タン
パクの欠失によって、実行される。本発明のFI−IV−lを防ぐための改良型のDNA
ワクチンは、単一の最適化されたFHV−l抗原（gE、gCまたはgD）またはそれらま
たは三つのうちの二つをそれゆえにコ−ドすることができて、発現できる。 実施例14および15において、そして、図11および12において、本発明および種
々の発現ベクタ−構造物において、使うことができるFHV−1抗原をコ−ドするヌ
クレオチド配列は、添付の実施例において、そして、WO−A−03660分の98におい
て、与えられる。

【００６５】 好ましくは、本発明の、筋肉内の経路による投与のためのFHV−lを防ぐための
DNAワクチンは、DIについては配合される’が]RIE−DOPEに、そして、発現プラ
スミド（例えばpSBO2l、図10）の組み立てる第2の発現プラスミド（例えばPS202
3、図11）の、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって
、最適化されるFHV−l gE抗原をコ−ドすること膜貫通領域をコ−ドするヌクレ
オチド配列の断片の、そして、第3の発現プラスミド（例えばpSBO24、図12）の
欠失によって、最適化されるFHV−1 gC抗原をコ−ドすることFHV−l gD抗原をコ
−ドすることは、ヌクレオチド配列符号化の断片の欠失によって、膜貫通領域を
最適化した。

【００６６】 好ましくは、本発明の、皮下の経路による投与のためのfl−TV−iを防ぐため
のDNAワクチンは、DMRTE−DOPEについては配合されて、発現プラスミドから成る
ネコのGM−CSをコ−ドする。そして、三つのプラスミドが、以前に定義した（例
えばpSBO2l、pSB023およびpSE024） 本発明の対象は、ウマの効果的なおよび保護の免疫応答をウマのヘルペスウイル
ス基型1（EHV−l）に対して導くことができる改良型のDNAワクチンである

【００６７】 EHV−1ウィルスは、Alphaherpesvirinae族の構成メンバである。EHV−lウィル
スは、ウマのウイルスの流産に対して責任がある（Virus Res. 1995.45.153−19
0）。このウィルスの完全なゲノムは、決定された(Telford et al. Virology 19
92. 18S. 304−316）。EHV−lを防ぐためのDNAワクチンは、本発明のアジュバン
トについては好ましくは配合される、特に、DMRTE（好ましくはDMRIE−DOPE）。
これは、最も少なく一つのEHV−l抗原で、選択的にウマのGM−CSFまたは最適化
の添加をどちらでもと組み合わせられることが可能である、または、最後に少な
くとも一つのERV−l抗原のウマのGM−CSFおよび最適化の添加。ウマのGM−CSFの
添加が、ワクチンの組成物へのウマのGM−CSFポリペプチドのまたはウマのGM−C
Sをコ−ドするヌクレオチド配列（例えば配列番号 69、図26）の挿入による取込
みによって、実行されることができる？生体内の発現ベクタ−（好ましくはプラ
スミド）に。好ましくは、ウマのGM−CSFをコ−ドするヌクレオチド配列は、第2
の発現プラスミド（EHV−l抗原をコ−ドする遺伝子が挿入してどちらであるかそ
れ（またはそれら）と異なる）に挿入される。

【００６８】 EHV−lから誘導される抗原の最適化は、gB糖タンパクの膜貫通領域をコ−ドす
るＤＮＡ断片のおよび／またはgC糖タンパクのおよび／またはEHV−lのgD糖タン
パクの欠失によって、実行される。本発明のEHV−lを防ぐための改良型のDNAワ
クチンが、それゆえに単一の最適化されたEHV−l抗原をコ−ドすることができて
、発現できる‖（gE、gCまたはgD｝、または、それらまたは三つの両方。 本発明および種々の発現ベクタ−構造物において、使うことができるEHV−l抗
原をコ−ドするヌクレオチド配列は、添付の実施例において、そして、WO−A−0
3198分の98において与えられる、特に実施例 8および10と図2および図4。

【００６９】 筋肉内の経路は、ウマのためにむしろ好まれる。好ましくは、本発明の、筋肉
内の経路による投与のためのEHV−1を防ぐためのDNAワクチンは、DMRTE−DOPEに
ついては配合されて、発現プラスミドから成る（例えばpSBO28、図13）第2の発
現プラスミドの、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によっ
て、最適化されるEHV−1 gE抗原をコ−ドすること例えばpSBO29、図14に）EHV−
l gC抗原をコ−ドすることは、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片
の、そして、第3の発現プラスミドの欠失によって、最適化したEHV−l gD抗原を
コ−ドすることは、ヌクレオチド配列符号化の断片の欠失によって、膜貫通領域
を最適化した。（例えばpSBO3O、図15）

【００７０】 しかし、皮下の経路を使用することは、可能である。この場合、EHV−lを防ぐ
ためのDNAワクチンは、DMRIE−DOPEについては好ましくは配合されて、ウマのGM
−CSFをコ−ドする発現プラスミドから成って、三つのプラスミドの以前に定義
される（例えばpSBO28、pSBO29およびpSBO3O） 本発明の対象は、ウマの効果的なおよび保護の免疫応答をウマのヘルペスウイ
ルス基型4（EHV−4）に対して導くことができる改良型のDNAワクチンである

【００７１】 EHV−4ウィルスは、Alphaherpesvirinae族の構成メンバである。EHV−4ウィル
スは、ウマのウイルスのrhinopneumoniaに対して責任がある(Crabb et al. Adv.
Virus Res. 1995. 45.153−190)。このウィルスの完全なゲノムは、決定された
（テルフォ−ド舗装ほかJ.陸上幕僚長Virol。1998。79。1197−203） EHV−4を防ぐためのDNAワクチンは、本発明、特に、DMRIE、好ましくはDMRIE
−DOPEに従うアジュバントについては、好ましくは配合される。これが、選択的
に化合されることができる‖どちらか、ウマのGM−CSの添加？または、少なくと
も一つのEHV−4抗原のウマのGM−CSFおよび最適化の少なくとも一つのEHV−4抗
原または最後に添加の最適化。

【００７２】 EHV−1のために記載されているように、ウマのGM−CSFの添加はされることが
できる。EHV−4から誘導される抗原の最適化は、糖タンパクgEおよび／または糖
タンパクgCの膜貫通領域および／またはEHV−4の糖タンパクgDをコ−ドするＤＮ
Ａ断片の欠失によって、実行される。本発明のEHV−4を防ぐための改良型のDNA
ワクチンは、単一の最適化されたEHV−4抗原（gB、gCまたはgD）またはそれらま
たは三つのうちの二つをそれゆえにコ−ドすることができて、発現できる。

【００７３】 本発明および種々の発現ベクタ−構造物において、使うことができるEHV−4抗
原をコ−ドするヌクレオチド配列は、添付の実施例において、そして、実施例9
および11の事項の、WO−A−03198分の98において、そして、図3および5において
、与えられる。

【００７４】 好ましくは、本発明によれば、筋肉内の経路による投与のためのEHV−4を防ぐ
ためのDNAワクチンは、DMRIE−DOPEについては配合されて、発現プラスミドから
成るEHV−4 gE抗原が、第2の発現プラスミドの、膜貫通領域をコ−ドするヌクレ
オチド配列の断片の欠失によって、最適化した（例えばpSB025、図16）符号化EH
V−4 gC抗原が膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の、そして、第3
の発現プラスミドの欠失によって、最適化した（例えばpSBO26、図17）符号化EI
−IV−4 gD抗原をコ−ドすることは、ヌクレオチド配列符号化の断片の欠失によ
って、膜貫通領域を最適化した。（例えばpS~027、図18）

【００７５】 皮下の経路のために、ERV−4を防ぐためのDNAワクチンは、DMRIE−DOPEについ
ては好ましくは配合されて、ウマのGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドおよび
以前に定義される（例えばpSEO2S、pSB026およびpSBO27）三つのプラスミドから
成る

【００７６】 本発明が特異的なDNAワクチンに関して記載されているにもかかわらず、本発明
もこれらの動物種の他の病原体にあてるDNAワクチンに適用される。したがって
、本出願に記載されている種々の原子価が、本発明のアジュバントの添加による
事項の、改良型のワクチンのまたはGM−CSの対象であってもよい？または、選択
的に、遺伝子最適化またはこれらの提案のいくらかの原子価に関する詳細のここ
で記載されているように組み合わせ。 考えの同じ線において、本発明のワクチンは、動物種のために、お互いについ
てはおよび／または同じ化学種の他の病原体にあてるDNAワクチンについては結
合でもよい。

【００７７】 したがって、本発明の対象は、また、それを可能にする改良型の多価のDNAワ
クチンである少なくとも二つのイヌの病原体に対してイヌの効果的な保護を得る
ことは、CDVから成っているグル−プ、CPI−2、CHV−l、狂犬病ウィルス（ラブ
ドウィルス）、イヌ・パルボウィルス（CPV）、イヌ・コロナウィルス（CCV）、
Borrelia burgdofferiから選んだ。

【００７８】 本発明の対象は、また、グル−プから選ばれる少なくとも二つのネコの病原体
に対してネコの効果的な保護を得ることを可能にする改良型の多価のDNAワクチ
ンであるFHV−l、ねこカリシウイルス（FCV）、狂犬病ウィルス（ラブドウィル
ス）、ねこパルボウィルス（FPV）、ネコの感染の腹膜炎ウイルス（FIPV）、ネ
コの白血病ウィルス（猫白血病ウイルス）、ネコの後天性免疫不全症候群ウィル
ス（FIV）から成ること

【００７９】 本発明の対象は、また、少なくとも二つのウマの病原体に対してウマの効果的
な保護を得ることを可能にする改良型の多価のDNAワクチンであるグル−プから
選ばれる成るEHV−1、EHV−4、ウマのインフルエンザウィルス、東洋人ウマの脳
炎ウイルス、西洋のウマの脳炎ウイルス、ベネズエラのウマの脳炎ウイルス、狂
犬病ウィルス、Clostridiurn tetani、Borrelia burgdorferi。

【００８０】 好ましくはDMRIE−DOPEを有する、DMRIEを有する事項において、多価のDNAワ
クチンは、本発明のアジュバントを有するそれらの製剤によって、改良型でもよ
い。これは、GM−CSFの添加については少なくとも一つの主要な抗原の最適化に
ついてはまたは最後にGM−CSFの添加および少なくとも一つの主要な抗原の最適
化によって、前述したように、前述したように、選択的に結合でもよい。

【００８１】 同じ動物種を感染させて、これらのワクチンが最初の病原体の少なくとも一つ
の免疫原の、そして、少なくとも一つの他の病原体の少なくとも一つの免疫原の
生体内の発現に至るように、本発明の改良型の多価のDNAワクチンは、一つ以上
の発現プラスミドから成る。最も少なくこれらの免疫原の一つのAcは好ましくは
下記の群の中から選ばれる：

【００８２】 イヌの場合、CDVのF、CDVのHA、CPI−2のF、CPI−2のHN、CHV−lのgB、CHV−l
のgCおよびCHV−lのgD、 ネコの場合、HV−lのgB、FHV−lのgC、FRV−lのgD、 ウマの場合、EHy−のgE、EHV−lのgC、EHV−lのgD、EHV−4のgE、EHV−4のgC
およびEHV−4のgD

【００８３】 本発明の改良型の一価性であるか多価のDNAワクチンは、また、少なくとも一
つの従来のワクチン（機能させなくされた、弱められた生（サブユニット）また
は生体内の発現ベクタ−を使用している組換え型ワクチンについては結合でもよ
い異なる事項（同じ化学種を感染させている病原体）において、少なくとも1に
対して目指す。（例えばポックスウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス
）

【００８４】 当業者は、ネコの原子価のためのWO−A−9803660に、そして、イヌのためのWO
−A−9803199に、これらのウマの原子価を含んでいるプラスミドを造るための方
法のためのWO−A−9803198と称することができる本発明の対象は、また、ペット
に予防注射をする方法およびスポ−ツにおいて、使われる動物である、特に、イ
ヌ（ネコまたはウマ）。この種痘接種方法は、上記のように一価性であるか多価
の改良型のDNAワクチンの一つの投与から成る。この種痘接種方法は、改良型のD
NAワクチンの一つ以上の投与量の投与から成る。

【００８５】 本発明のワクチンにおいて、使われるDNAの数量が、約10のp~gおよび約1000の
~との間にある好ましくは両者間にSO ~および約500について、そして、所与のプ
ラスミドのための~。 当業者は、正確にDNAの効果量を定義するのに必要な応答能が各予防接種プロト
コルのために使われるように魅惑する。 投与量容積は0.5〜5mlの間、好ましくは1〜2mlの間にする。

【００８６】 ポリヌクレオチド予防接種のための従来技術において、そして、投与の公知の
手技により提案される投与の種々の経路による、この種痘接種方法の状況におい
て、本発明の改良型のDNAワクチンを、投与できる。 本発明の二つの好適な態様によれば、予防接種の方法は、筋肉内の経路によって
、または皮下の経路によって、本発明の改良型のDNAワクチンの投与から成る。

【００８７】 以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明が下記実施例に限定される
ものではない。

【００８８】

【実施例】

各病原体に対して主要な表面抗原（天然形および修正形）をコ−ドする各遺伝
子を真核性発現プラスミドの構築の対象とした。表面抗原の分泌形は膜内外およ
び細胞質領域をコ−ドする遺伝子断片の欠失によって得た。総の場合で糖蛋白の
膜貫通領域を対応蛋白配列のヒドロパシプロフィルを基礎として識別した。野生
タンパク（アミノ酸の）の寸法、位置は対応する発現プラスミドの名称および膜
貫通領域、先端を切った蛋白の寸法を実施例11の[表1]に要約してある。

【００８９】実施例1 基礎プラスミドの構築 プラスミドpVRlOl2（WO−A−9803199の図1、実施例 7、本出願の図2で引用）
からの真核性発現プラスミドpVRlO2O (C.J. Luke et al. J. of Infectious Dis
eases 1997, 175: 95−97）はヒト組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（tPA）の
シグナル配列のコ−ド相を含む。このプラスミドpVRlO2OをBamMT−RglII消化し
、複数のクロ−ニング・サイトを含む配列を挿入して変成し、下記オリゴヌクレ
オチドにした（BamHI、NotI、EcoRI、XbaI、PmlI、PscI、BglII）：

【００９０】 PB326（40mer）（配列番号9） 5’GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3’ PB329（40mer）（配列番号10） 5’GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3’

【００９１】 得られたベクタ−pABl1O（図No.1）を用いてイヌジステンパ−ウイルス（CDV
）ヘムアグルチニン（HA）をコ−ドする遺伝子の先端切断形を含んでいるプラス
ミドおよび2型のパラインフルエンザウィルス（CPI−2）の赤血球凝固−ノイラ
ミダ−ゼ（haemag glucininne nuraminidase、HN）を構築した。 下記オリゴヌクレオチドを用いたPCRで対応するＤＮＡ断片を生産した後、ウ
サギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIをベクタ−pCRII（Invitrogen、Carlsba
d、CA、USA）でクロ−ニングする：

【００９２】 SBO9O（20mer）（配列番号 7） 5’TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3’ 52091（21mer）（配列番号 8） 5’のCTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC 3’

【００９３】 ひな型としてはウサギの末しょう血細胞ゲノムＤＮＡを用いる。得られたプラス
ミドをpNS050とよぶことにする。

【００９４】実施例2 各種形状のCDV抗原をコ−ドするプラスミド SH菌株のウィルスＲＮＡ（数ATCC VR−526の下の菌株保管所American Tissue
Culture Collectionからアクセスできる）からRT−PCRによってCDV菌株スナイダ
−Hill（SH）の融合蛋白（F）およびヘムアグルチニン（HA）をコ−ドする遺伝
子を得た。

【００９５】 2.1. CDV−Fの各種形をコ−ドするプラスミド 2.1.1. pPB229：ベクタ−pVRlO12でF遺伝子（天然形）をクロ−ニングする。 CDVのF遺伝子の相補ＤＮＡをプライマ92383を用いて合成し、下記オリゴヌク
レオチドの組を用いてPCR反応で増殖した：

【００９６】 PB383（26mer）（配列番号 13） 5’のTTTCTAGACAGCCGAGCCCCATGCAC 3’、 P2384（30mer）（配列番号 14） 5’のTTGGATCCGATATATGACCAGAATACTTCA 3’

【００９７】 PCR産物をBamHIおよびXbaIで消化し、BamHIおよびXbaIで予め消化した発現ベ
クタ−pVRlOl2（実施例1）でクロ−ニングしてプラスミドpPB229（6925塩基対、
bp）作る。野生CDVのF遺伝子は662の残基の蛋白をコ−ドする。

【００９８】 2.1.2. pNSO22：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたF遺伝子（βグロビン形 F
ATM） 膜内外およびＣ末端領域の切り詰めらたF遺伝子を含むプラスミドpNSOI3（673
5bp）をプラスミドpPE229（実施例2.1.1）に由来するBsu3EI−BamHI断片（6593b
p）と、下記オリゴヌクレオチドを用いてひな型pPR22SからPCRで得た142−bp断
片とのリゲーションによって得た：

【００９９】 NSO3O（21mer）（配列番号1） 5’のATGAGCCCACTCTTACAACAA 3’ NSO31（35mer）（配列番号 2） 5’のTTTCGCGGATCCATTAAAGGAAGAGCGCCTAACCG 3’

【０１００】 Bsu36I−BarrΜTを消化した。CDV先端を切ったF遺伝子は605残基の蛋白をコ−
ドする。 次に、ウサギIB−グロビン遺伝子のイントロンIIに対応する配列を先端を切っ
たF遺伝子の暗号配列の上流側のプラスミドpNSOl3のSalIサイトへ挿入した。イ
ントロン（573bp）に対応するＤＮＡ断片はPCRで下記オリゴヌクレオチドを用い
て得た：

【０１０１】 NS036（34mer）（配列番号 5） 5’のTTTACGCGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGTTC 3’ NS037（36mer）（配列番号 6） 5’のTTTACGCGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAAGGCAT 3’

【０１０２】 ひな型はpNSOSO（実施例1）。消化し、Sallコンパチブル端を開放。このβ−グ
ロビン遺伝子のイントロンIIを含むプラスミドpNSOl3の誘導体をpNSO2l（7308bp
）（図No.3）とよぶ。 2.2． 各種の形のCDV−HAをコ−ドするプラスミド

【０１０３】 2.2.1. pNSO18： ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたHA遺伝子（天然形） CDVのHA遺伝子の相補ＤＮＡをプライマPB381を用いて合成し、下記オリゴヌク
レオチドの組を用いてPCR反応で増殖した：

【０１０４】 PB381（30mer）（配列番号11） 5’のTTCTGCAGATGCTCTCCTACCAAGAyAAGG 3’ P5382（28mer）（配列番号12） 5’のTTGTCGACATGTGTATCATCATMCTGTC 3’

【０１０５】 PCR産物をベクタ−pCRII（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）でクロ−ニング
してプラスミドpPB235を作る。HA遺伝子を含むプラスミドpPE235の1846bpのPstI
−SalI断片をPstI−SalIで消化した発現ベクタ−pVRlOl2（実施例1）でクロ−ニ
ングしてプラスミドpNSOlS（6748bp）を作る。CDV原株のHA遺伝子は607残基の蛋
白をコ−ドする。

【０１０６】 2.2.2. pNSO24： ベクタ−pVR1Ol2でクロ−ニングしたるHA遺伝子（β−グロ
ビン形、tPAΔTM HA） CDVのHA遺伝子の先端を切った形はHA蛋白の最初の60残基をコ−ドするＤＮＡ
断片の欠失によって得た。この蛋白のシグナル配列と膜内外配列とを融合し、先
端を切った産物を分泌物をヒト組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（cPA）と先
端を切ったHA遺伝子のシグナル配列と間の相融合の生産によって確実にした。tP
Aシグナルとの融合産物のプラスミドpNSOl9をコ−ドするpNSOl8の誘導体は下記
３つのＤＮＡ断片のに従うリゲーションで得た：

【０１０７】 １） 断片AはpABllO（実施例1）のBamHI-EcoRV消化によって得た。 ２） 断片Bは下記オリゴヌクレオチドを用いたひな型pNSOl8（実施例2.2.1）の
PCR反応で得た：

【０１０８】 N5034（30mer）（配列番号3） 5’のTTTCGCGGATCCCACAAAGTATCAACTAGC 3’ NSO3S（23mer）（配列番号4） 5’のGGGATTTGCTGCCGATGCAATAG 3’ PCR産物はBamlil−Sapiで消化する。

【０１０９】 ３） 断片CはpNSOl8のSapI−EcoRV消化断片である。 雑種遺伝子tPA ΔTM HAは574残基（1725bp）の蛋白をコ−ドする。 ウサギβ−グロビン遺伝子（実施例2.1.2）のイントロンIIをpNSOl9のSalIサ
イトへのHA遺伝子をコードする相の上流側に挿入してプラスミドpNS024（図No.4
）を得た。

【０１１０】実施例3 各種形のタイプ２のイヌパラインフルエンザウィルス（CPI−2）の抗原をコ−ド するプラスミド CPI−2菌株D008（MERIAL）のFおよびHN遺伝子はRT−PCRによってウィルスＲＮ
Ａから得た。

【０１１１】 3.1. CPI−2Fの各種形をコ−ドするプラスミド 3.1.1. pAB115： ベクタ−pVR1Ol2でクロ−ニングしたF遺伝子（天然形） CPI−2のF遺伝子の相補ＤＮＡを合成し、下記オリゴヌクレオチド組を用いてR
T−PCPで増殖した：

【０１１２】 S5131（38mer）（配列番号57） 五つ’のAPA~ACGCGTCGACATGGGTACTATAATTCAATTTCTG 3’ 5B132（38mer）（配列番号 58） 五つ’のTTTTCTAGTCTAGATTATTTATGATAAACAAAATTCTC 3’

【０１１３】 PCR産物はSalIおよびXbaTで消化して1594bpの断片を作る。同じ酵素で予め消
化した発現ベクタ−pVRlO12（実施例1）でクロ−ニングしてプラスミドpABilS（
6479bp）を作る。CPI−2原株のF遺伝子（配列番号 72）（図27）をこのプラスミ
ドでクロ−ニングする。529残基の蛋白をコ−ドする。

【０１１４】 3.1.2. pSBO32： ベクタ−pVR2.012でクロ−ニングしたF遺伝子（β−グロビ
ン形、FΔTM） 細胞質領域の切り詰められた膜内外およびＣ末端のF遺伝子を含むプラスミドp
SBO3lは下記方法で得た。ひな型pAHilE（実施例3.1.1）で下記オリゴヌクレオチ
ドを用いてPCR反応を実行する：

【０１１５】 5B131（配列番号 57） 5B133（41mer）（配列番号 59） 5’TTTTCTAGTCTAGATTAGTATGTGTCACTTTGTGCTAAGTG 3’

【０１１６】 約1450bpのPCR断片を得る。この断片をSallおよびXbaIで消化して1436bpのSal
I−XbaI制限断片を分離する。この断片をSalIおよびXbaIで予め消化したベクタ
−pVR1O12（実施例1）でリゲ−トしてプラスミドにpSBO3lを得る。CPT−2の先端
を切ったF遺伝子は473残基の蛋白をコ−ドする。 次に、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIに対応する配列をCPI−2先端
を切ったF遺伝子の暗号配列の上流側でプラスミドpESO31のSallサイトへ挿入し
た。オリゴヌクレオチドN5036（配列番号 5）およびNS037（配列番号 6）を用い
てひな型pNSO5O（実施例1）でPCRで得る。次に、Sallで消化し、Sallとコンパチ
ブルな端を開放する。イントロン（573bp）に対応するＤＮＡ断片は、に助けら
れたた。このSalI−SalI制限断片をSalIで予め消化したプラスミドpSBO3lでリゲ
−トし、脱ホスホリル化してプラスミドにpSBO32（6884bp）（図No.5）を得る。

【０１１７】 3.2. 各種形のCPI−2のHNをコ−ドするプラスミド 3.2.1. pAB114： ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたHN遺伝子（天然形） CPI−2のHN遺伝子のｃDNAを合成し、下記オリゴヌクレオチドを用いて増殖し
た：

【０１１８】 5B134（41mer）（配列番号 60） 5’AAAAACGCGTCGACATGGTTGCAGAAGATGCCCCTGTTAGG 3’ SBl3S（35mer）（配列番号 61） 5’TTTTGGAAGATCTTTAGGATAGTGTCACCTGACGG 3’

【０１１９】 約1720bpのPCR断片を得る。この断片をSalIおよびBglIで消化して1704bpのSal
I−EglI断片を分離する。次に、この断片をSallおよびEglIlで予めに消化したベ
クタ−pVRlOl2（実施例1）でリゲ−トしてプラスミドにpABll4（6566bp）を得る
。このプラスミドでクロ−ニングしたCPI−2原株のHN遺伝子（配列番号 73）（
図28）は565残基の蛋白をコ−ドする。

【０１２０】 3.2.2. pSBO34： ベクタ−pVRlO12でクロ−ニングしたHN遺伝子（β−グロビン
形、HN tPA ΔTM） CPI−2のHN遺伝子の先端を切った形はHN蛋白の最初の40残基をコ−ドするＤＮ
Ａ断片の欠失によって得た。この蛋白のシグナルおよび膜内外配列を融合し、先
端を切った蛋白の分泌はヒト組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（tPA）と先端
を切ったHN遺伝子のシグナル配列との間の相融合の生産によって確実にした。tP
Aとの融合産物をコ−ドするpABll4（実施例3.2.1）から得たプラスミドpSB033は
、pABliG（実施例1）のEcoRI−PmlI断片とひな型pABll4上での下記オリゴヌクレ
オチドを用いたPCRによってtPAシグナル配列をコ−ドする転写解読枠とpVR1Ol2
断片（1599bp）を含む誘導体のリゲーションによって得る：

【０１２１】 SB136（37mer）（配列番号62） 5’TTAAAAGAATTCGACCCAAAAGCAAATCATGAGCCAC 3’ 5B137（33mer）（配列番号 63） 5’TTAAAAGGCCTTTAGGATAGTGTCACCTGACGG 3’

【０１２２】 EcoRIおよびEcoRVで消化する。 ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIをHN遺伝子の符号化機構の上流側で
pSB033のSalIサイトへ挿入してプラスミドpSB034（図No.6）を得た。イントロン
を含むSalI断片はオリゴヌクレオチドN5036（配列番号 5）とN5037（配列番号 6
）を用いてPCRでひな型pNSO5O（実施例1）で得た。

【０１２３】実施例4 CHV−lウィルス糖タンパクの各種形をコ−ドするプラスミド タイプＩのイヌのヘルペスウィルス（CHV−l）のカ−マイケル菌株の糖タンパ
クgE、gC、gDをコ−ドする遺伝子をウイルスのゲノムからPCRで分離した。ベク
タ−pVPAOl2でのgBおよびgDをコ−ドする遺伝子のクロ−ニングは特許出願WO−A
−9803199（プラスミドpADO37、pAEO38、図7および図8、実施例13、14）に記載
されている。gCをコ−ドする遺伝子のクロ−ニングもこの文献に記載されている
。

【０１２４】 4.1. CHV−gBの先端を切った形をコ−ドするプラスミド 4.1.1. pSBO16： ベクタ−pVRlO12でクロ−ニングしたgB遺伝子（ΔTM形）

【０１２５】 ヒドロパシプロフィルに従ってCHV−lのgE蛋白（878アミノ酸）の膜貫通領域
は残基702と769との間に位置する。gEをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含
んでいるプラスミドは３つのＤＮＡ断片のリゲーションで得た：(a) PstI−Xba
I重複消化で線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）（b）pAEO37（実施例4）のP
stI−NsiI消化で得られる1997bpの断片および（c）下記オリゴヌクレオチドを用
いてPCRによって得た225bp断片：

【０１２６】 EBlOl（22mer）（配列番号15） 5’TATATTGAAGGACAACTTGGGG 3’、 SElQ2（36mer）（配列番号16） 5’CTAGTCTAGATTAATTATTATCAACTTTTACAACAC 3’

【０１２７】 ひな型としてはプラスミドpABO37を使用する。NsiIおよびXbaIで消化する。得
られたプラスミドpSBOl6（6983bp）（図7）は701残基の蛋白をコ−ドする先端を
切ったgB遺伝子を含む。

【０１２８】 4.2. CHV−gCの各種形をコ−ドするプラスミド 4.2.1. pSBOl8： ベクタ−pVRlO12でクロ−ニングしたgC遺伝子（天然形） CHV−lのgC遺伝子の転写解読枠を含むＤＮＡ断片は下記オリゴヌクレオチドを
用いたPCRによって得た：

【０１２９】 5B105（32mer）（配列番号 19） 5’AAAACTGCAGATGAGTTTTAAAAATTTTTATC 3’、 SB1O6（30mer）（配列番号20） 5’CTAGTCTAGATTAGATCTTATTATTTTTTG 3’

【０１３０】 ひな型としてウィルスＤＮＡを使用する。このPCR産物をPstIおよびXbaIで消化
し、1400bpの断片を得る。それから同じ重複消化によって線形にしたベクタ−pV
RlOl2（実施例1）でリゲ−トする。得られたプラスミドpSBOl8、6253bpは459残
基のgC糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む。

【０１３１】 4.2.2. pSBOJ.9： ベクタ−pVRlOl2でクロ−ニングしたgC遺伝子（ΔTM形） ヒドロパシプロフィルからgC蛋白の膜貫通領域は残基422と452との間にある。

【０１３２】 452. gDをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含むプラスミドを三つのＤＮＡ
断片のリゲーションで得た：

【０１３３】 (a)重複消化PstI−XbaIによって線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）、 (b) pSBOl8（上記実施例）のPstI−StuI消化で得た335bpの断片 （c）下記オリゴヌクレオチドを用いてPCRで得られる934bpの断片：

【０１３４】 5B107（24mer）（配列番号 21） 5’TC−GATTGACGGTCTTATAACAGGC 3’、 SB1O8（37mer）（配列番号22） 5’CTAGTCTAGATTAATTTTCATCCGATGCATCAAACAC 3’

【０１３５】 ひな型としてプラスミドpSBOl8を使用し、StulおよびXbaIで消化した。

【０１３６】 得られたプラスミド（pSBOl9、6139bp）(図8)は421残基の蛋白をコ−ドする先端
を切ったgC遺伝子を含む。

【０１３７】 4.3. CHV−gDの先端を切った形をコ−ドするプラスミド 4.3.1. pSBOl7：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたgD遺伝子（ΔTM形） CHV−lのgD蛋白（345アミノ酸）の膜貫通領域は残基310と328との間にある。g
Dをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含んでいるプラスミドは三つのＤＮＡ
断片のリゲーションで得た：

【０１３８】 (a) PstI−NotI重複消化で線形にしたベクタ−pVR1Ol2（実施例1）、 （b）pABO38（実施例4）のPstI−AvaII消化で得た663bpの断片、 （c）下記オリゴヌクレオチドを用いてPCRで得られる415bp断片：

【０１３９】 SBlO3（25mer）（配列番号17） 5’CGAGAAACTTGTTATTTTTCTAAAG 3’、 5B104（51mer）（配列番号 18） 5’ATAAGAATGCGGCCGCAAACGCTATATATTTTTTGOGGTATTATTTATTCG 3’

【０１４０】 ひな型としてプラスミドpABO38を使用し、AvailとNotIで消化した。 得られたプラスミド（pSBOl7、5819bp）(図9)は309残基の蛋白をコ−ドする先端
を切ったgD遺伝子を含む。

【０１４１】実施例5 FHV−1糖タンパクの各種形をコ−ドするプラスミド 糖タンパクgB、gCおよびgDをコ−ドする遺伝子はネコのヘルペスウイルス1型
（FHV−l）のCO菌株のPCRによってウイルスのゲノムから分離したた。ヌクレオ
チド配列がC−27菌株と同一であるgDをコ−ドする遺伝子の場合には、菌株C−27
からクロ−ニングした対応する遺伝子を含むpVRlOl2からのプラスミドpABO29を
使用する。これは特許出願WO−A−9803660（プラスミドpABO29、図12、実施例15
）に記載されている。

【０１４２】 5.1. FHV−gBの各種形をコ−ドするプラスミド 5.1.1. pSBO2O：ベクタ−pVR1Ol2でクロ−ニングされたgB遺伝子（天然形） FHV−lのgB遺伝子の転写解読枠を含むＤＮＡ断片は下記オリゴヌクレオチドを
用いてPCRによって得た：

【０１４３】 SE13（34mer）（配列番号27） 5’TTTTCTGCAGATGTCCACTCGTGGCGATCTTGGG 3’ 5B114（40mer）（配列番号 28） 5’ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAAGATTTGTTTCAGTATC 3’

【０１４４】 ひな型としてウィルスＤＮＡを使用して2849bpの断片を得る。このPCR産物をP
stIおよびNotIでは消化する。次に同じ重複消化によって線形にしたベクタ−pVR
lOl2（実施例1）でリゲ−トする。得られたプラスミドpSBO2O、7728bpは949残基
のgB糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む。

【０１４５】 5.1.2. pSBO21：ベクタ−pVRlO12dでクロ−ニングしたgB遺伝子（ΔTM形） ヒドロパシプロフィルに従ってFHV−1のgB蛋白の膜貫通領域は残基761と834と
の間にある。gBをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含むプラスミドは三つの
ＤＮＡ断片でリゲーションで得た：

【０１４６】 (a) 重複消化のPstINotIで線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）、 （b）pSBC2O（前述の実施例）のPstI−HindIIの消化で得た1839bpの断片、 （c）下記オリゴヌクレオチドを用いてPCRによって得た447bpの断片：

【０１４７】 5B109（24mer）（配列番号 23） 5’CTGTGGACAGAGACCCTAAAACTC 3’、 SBllO（50mer）（配列番号24） 5’TTTCCTTTTGCGGCCGCTTATATGCTGTCTATATCATAAATTTTAAGGC 3’

【０１４８】 ひな型としてプラスミドpSBO2Oを使用し、HindIlおよびNotIで消化した。得られ
たプラスミド（pSBO2l、7164bp）(図10)は760残基の蛋白をコ−ドする先端を切
ったgE遺伝子を含む。

【０１４９】 5.2. FHV−gCの各種形をコ−ドするプラスミド 5.2.1. pSBO22：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたgC遺伝子（天然形） FHV−1のgC遺伝子の転写解読枠を含むＤＮＡ断片をPCRによって下記オリゴヌ
クレオチドを用いて得た：

【０１５０】 SB15（34mer）（配列番号 29） 5’TTTTCTGCAGATGAGACGATATAGGATGGGACGC 3’、 SB116（34mer）（配列番号30） 5’AGTTTAGCGGCCGCTTATAATCGCCGGGGATGAG 3’

【０１５１】 ひな型としてウィルスＤＮＡを使用して1605bpの断片を得る。このPCR産物をP
stTおよびNotIで消化し、同じ重複消化で線形にしたベクタ−pVR1Ol2（実施例1
）でリゲ−トした。得られたプラスミドpSB022(6483bp)は534残基のgC糖タンパ
クをコ−ドする遺伝子を含む。

【０１５２】 5.2.2. pSBO23：ベクタ−pVRlO12でクロ−ニングしたgC遺伝子（ΔTM形） ヒドロパシプロフィルに従いFHV−lのgC蛋白の膜貫通領域は残基495と526との
間にある。gCをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含んでいるプラスミドは二
つのＤＮＡ断片に従うリゲーションによって得た：pSB022（前述の実施例）のBc
llおよびNotIの消化によって得た6198bpの断片およびが（b）下記オリゴヌクレ
オチドを用いたPCPによって得た168bp断片：

【０１５３】 S2117（24mer）（配列番号 31） 5’GTTAAATGTGTACCACGGGACGGG 3’、 S2118（41mer）（配列番号32） 5’AGTTTAGCGGCCGCTTATTCAGGGGACGCGTCGTAGACTTC 3’

【０１５４】 ひな型としてプラスミドpSB022を使用し、DcliおよびNotIで消化した。 得られたプラスミド（pSB023、6366bp）(図11)は494残基の蛋白をコ−ドする先
端を切ったgC遺伝子を含む。

【０１５５】 5.3. FHV−gDの先端を切った形状をコ−ドするプラスミド 5.3.1. pSBO24：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたgD遺伝子（ΔTM形） FHV−lのgD蛋白（374アミノ酸）の膜貫通領域は残基328と353との間にある。g
Dをコ−ドする遺伝子の先端を切った形状を含んでいるプラスミドは二つのＤＮ
Ａ断片のリゲーションによって得た： (a)pABO29（実施例5）のXbaI−BglII消化
で得た5712bpの断片および（b）下記オリゴヌクレオチドを用いてPCRによって得
た129bpの断片：

【０１５６】 SBlll（24mer）（配列番号25） 5’GATCGTCCCGCCATACCGTCTGGG 3’ そして、 SBll2（39mer）（配列番号 26） 5’TTTGGAAGATCTTTACTGATTATTCATGCCCTTGGGAGG 3’

【０１５７】 ひな型としてプラスミドpAB029を使用し、XbaIおよびBglIIで消化した。得られ
たプラスミド（pSBO24、5841bp）(図12)は327残基の蛋白をコ−ドする先端を切
ったgD遺伝子を含む。

【０１５８】実施例6 EHV−1糖タンパクの種々の形をコ−ドするプラスミド 2234/88−2の菌株のEHV−1の糖タンパクgB、gCおよびgDをコ−ドする遺伝子を
PCRによってウィルスＤＮＡから分離した。

【０１５９】 6.1. EHV−lのgBの種々の形をコ−ドするプラスミド 6.1.1. pAB127：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたgB遺伝子（天然形）、 EHV−1のgB遺伝子のコード相を下記オリゴヌクレオチドを用いてPCPにより増
殖した：

【０１６０】 NSOO3（30mer）（配列番号39） 5’TTCTGCAGATGTCCTCTGGTTGCCGTTCGT 3’ NSOO4（30mer）（配列番号 40） 5’TTTCTAGATTAAACCATTTTTTCATTTTCC 3’、

【０１６１】 得られるＤＮＡ断片はPstIで消化された、そして、XbaIな、そして、リゲ−トす
るPstIおよびXbaI（プラスミドpAEl27（7818bp）を発生すること）については線
形にされるベクタ−pVRlOl2（実施例1）に。48の遺伝子は、980のアミノ酸の蛋
白をコ−ドする。

【０１６２】 6.1.2. pSBO28：gB遺伝子（ATM形状）が、ベクタ−pVR1O12にクロ−ニングす
る ヒドロパシ・プロフィルに従い、EHV−l 48の蛋白の膜貫通領域は、残基801およ
び875の間に位置する。遺伝子符号化48の先端を切った形状を含んでいるプラス
ミドは、二つのＤＮＡ断片に従うリゲーションによって、得られた：276bpのAfe
TおよびXbaIについては消化されるプラスミドpAEl27（実施例6.1.1）および断片
（b）がPCRによって、オリゴヌクレオチドを用いて、得た(a)：

【０１６３】 52125（24mer）（配列番号 51） 5’AACAACAGAGGGTCGATAGAAGGC 3’、 52126（39mer）（配列番号 52） 5’AATTTTTCTAGATTACACGTTGACCACGCTGTCGATGTC 3’

【０１６４】 ひな型としてのプラスミドpABl27を使用する。そして、Afel and XbaIについて
は消化した。 得られたプラスミドpSBO28（7279bp）が、蛋白をコ−ドする先端を切ったEHV−1
48の遺伝子を含む‖800残基。

【０１６５】 6.2. EEV−1 gCの種々の形状をコ−ドするプラスミド 6.2.1. pAB2.29：gC遺伝子（天然の形状）が、ベクタ−pVR1O12にクロ−ニン
グする EHV−1 gC遺伝子の転写解読枠を含んでいるＤＮＡ断片は、PCRによって、oligon
ucleotideSを用いて、得られた：

【０１６６】 NSOO5（31mer）（配列番号41） 5’TTGTCGACATGTGGTTGCCTAATCTCGTGAG 3’、 NSOO6（33mer）（配列番号42） 5’TTGGATCCCTAAAAGTCAGACTTCTTGTACGGC 3’

【０１６７】 このPCR産物はSalIについては消化されて、2amHI 1412bpの断片を発生していた
。そして、それはそれから同じ重複の消化によって、線形にされるベクタ−pVR1
O12（実施例1）にリゲ−トされた。得られたプラスミドpAEl29（6281bp）が、EH
V−l gC糖タンパクをコ−ドしていて、寸法を有している遺伝子を含む‖468残基
。

【０１６８】 6.2.2. pSBO29：gC遺伝子（ATM形状）が、ベクタ−pVRlOl2にクロ−ニングする
ヒドロパシ・プロフィルに従い、EHV−l gC蛋白の膜貫通領域が、残基429および
455との間にある。gCをコ−ドする遺伝子の先端を切った形状を含んでいるプラ
スミドは、二つのＤＮＡ断片に従うリゲーションによって、得られた：287bpの
重複のAspI−RamIlI消化によって、線形にされるプラスミドpABl29（実施例6.2.
1。）および断片（b）がPCRによって、オリゴヌクレオチドSを用いて、得た(a)
：

【０１６９】 SB127（24mer）（配列番号53） 5’GATCCGGAGGAGGAATACACACCC 3’、 5E128（39mer）（配列番号 54） 5’AATTTTGGATCCCTAACCGGCCTGTCCTCAACAATCGG 3’

【０１７０】 ひな型および消化されたAspIおよびEamHIとしてプラスミドpAB129を使用するこ
と。 得られたプラスミド、pSB029、6161bpは、428の残基の蛋白をコ−ドする先端を
切ったgC遺伝子を含む。

【０１７１】 6.3. EHV−1 gDの先端を切った形状をコ−ドするプラスミド 6.3.1. pAB131：gD遺伝子（天然の形状）が、ベクタ−pVR1Ol2にクロ−ニング
する EHV−l gD遺伝子の転写解読枠を含んでいるＤＮＡ断片は、PCRによって、オリゴ
ヌクレオチドを用いて、得られた：

【０１７２】 NSOO7（33mer）（配列番号 43） 5’TTGTCGACATGTCTACCTTCAAGCTTATGATGG 3’、 N5008（32mer）（配列番号44） 5’TTGGATCCTTACGGAAGCTGGGTATATTTAAC 3’

【０１７３】 このPCR産物はSalTおよび1214bpの断片を発生しているEamHIについては消化され
た。そして、それはそれから同じ重複の消化によって、線形にされるベクタ−pV
RlOl2（実施例1）にリゲ−トされた。得られたプラスミドpAB138（6083bp）が、
gD糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む‖402残基。

【０１７４】 6.3.2. pSBO3O：gD遺伝子（ATM形状）が、ベクタ−pVRlOl2にクロ−ニングする
ヒドロパシ・プロフィルに従い、EHV−1 gD蛋白の膜貫通領域が、残基348および
371との間にある。gDをコ−ドする遺伝子の先端を切った形状を含んでいるプラ
スミドは、三つのＤＮＡ断片に従うリゲーションによって、得られた：(a) 重複
のSalI−BamI−{I消化によって、線形にされるプラスミドpVRlQl2（実施例1）、
（b）825bpの断片は、SallおよびEsmIを有するpAEl3l（実施例6.3.1。）の消化
から生じたそして、（c）239bpの断片は、PCRによって、以下を用いて、オリゴ
ヌクレオチドを得た：

【０１７５】 5B129（24mer）（配列番号 55） 5’CGGTTTCTTGGTGAATTCAACTTC 3’ SB13O（42mer）（配列番号 56） 5’AATTTTGGATCCTTACGTAGAGTTGCTCTTAGACGTTTTTGG 3’

【０１７６】 ひな型としてのプラスミドpABl3lを使用する。そして、EsmIおよびBamlilについ
ては消化した。得られたプラスミドpSBO3O（5921bp）は、347の残基の蛋白をコ
−ドするiruncatedされたgD遺伝子を含む。 実施例7：EHV−四つの糖タンパクの種々の形状をコ−ドするプラスミド gBをコ−ドする遺伝子、gCおよびEHV−4のKYT445/二つの菌株のgD糖タンパクが
、PCPにより分離された。浄化されたウィルスＤＮＡから。

【０１７７】 7.1. EHV−4 gBの種々の形状をコ−ドするPlasinids 7.1.1. pABl36：gB遺伝子（天然の形状）が、ベクタ−pVR1Ol2にクロ−ニング
する EHV−4 gE遺伝子の符号化機構は、PCRによって、オリゴヌクレオチドを用いて、
増殖された：

【０１７８】 AB325（35mer）（SEQ TD否定33） 5’TTTCTGCAGATGTCCACTTCTTGCCGTGCTATTTG 3’ AB326（31mer）（配列番号 34） 5’TTTTCTAGATT？AACCATTTTTTCGCTTTCC 3’

【０１７９】 得られるＤＮＡ断片は、PstIおよびXbaIについては消化されて、プラスミドpABl
3S（7801bp）を発生して、PstIおよびXbaIについては線形にされるベクタ−pVRl
Ol2（実施例1）にリゲ−トした。EHV−4 gB遺伝子は、975のアミノ酸の蛋白をコ
−ドする。

【０１８０】 7.1.2. pSBO25：gB遺伝子（ATM形状）が、ベクタ−pVR1O2にクロ−ニングす
る ヒドロパシ・プロフィルに従い、EHV−4 48の蛋白の膜貫通領域は、残基797およ
び867の間に位置する。遺伝子符号化48の先端を切った形状を含んでいるプラス
ミドは、二つのＤＮＡ断片に従うリゲーションによって、得られた：231bpのSpl
IおよびXbaIについては消化されるプラスミドpABl36（実施例7.1.1。）および断
片（b）がPCRによって、オリゴヌクレオチドを用いて、得た(a)：

【０１８１】 SBll9（36mer）（配列番号45） 5’TTTTGGTCTAGATTAGTCCACGTTGACAACGCTGTC 3’

【０１８２】 SBl2O（23mer）（配列番号 46） 5’COCAAGCTTATCGAGCCGTGCGC 3’ ひな型としてのプラスミドpABl36を使用する。そして、SplIおよびXbaIについて
は消化した。得られたプラスミド、pSBQ25、7264bpは、796の残基の蛋白をコ−
ドする先端を切った48の遺伝子を含む。

【０１８３】 7.2. EHV−4 gCの種々の形状をコ−ドするプラスミド 7.2.1. pABl37：gC遺伝子（天然の形状）が、ベクタ−pVRlOl2にクロ−ニング
する EHV−4 gC遺伝子の転写解読枠を含んでいるＤＮＡ断片は、PCRによって、オリゴ
ヌクレオチドを用いて、得られた：

【０１８４】 AB327（32mer）（配列番号35） 5’TTTGTCGACATGGGTTTGGTAAATATAATGCO 3’、 AB328（33mer）（配列番号36） 5’TTTGGATCCTTAGAAGTCTGCTTTCTTGTAGGG 3’

【０１８５】 このPCR産物はSalIおよび1463bpの断片を発生しているBamHIについては消化され
た。そして、それはそれから同じ重複の消化によって、線形にされるベクタ−pV
RlOl2（実施例1）にリゲ−トされた。得られたプラスミド、pABl37、6330bpは、
485の残基のge糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む。

【０１８６】 7.2.2. pSBO26：gC遺伝子（ATM形状）が、ベクタ−pVRlOl2にクロ−ニングする
ヒドロパシ・プロフィルに従い、EHV−4 gC蛋白の膜貫通領域が、残基425および
472との間にある。gCをコ−ドする遺伝子の先端を切った形状を含んでいるプラ
スミドは、237bpの重複のAclI−Bami−LI消化によって、線形にされるプラスミ
ドpAEl37（実施例7.2.1。）および断片（b）がPORによって、オリゴヌクレオチ
ドを用いて、得た二つのＤＮＡ断片(a)に従うリゲーションによって、得られた
：

【０１８７】 52121（24mer）（配列番号 47） 5’GTATCAATCCCAGCTGACCCCGAC 3’、 SB122（41mer）（配列番号48） 5’AATTTTGGATCCTTAGCCGTCCGGGTAACCCTCTATGATGC 3’

【０１８８】 ひな型としてのプラスミドpAEl37を使用する。そして、消化する AclIおよびBacillI。得られたプラスミド、pSBO26、6147bpは、424の残基の蛋白
をコ−ドする先端を切ったgC遺伝子を含む。

【０１８９】 7.3. EHV−4 gDの先端を切った形状をコ−ドするPJ.asmids 7.3.1. pAB138：gD遺伝子（天然の形状）が、ベクタ−pVR1OJ.2にクロ−ニング
する EHV−4 gD遺伝子の転写解読枠を含んでいるＤＮＡ断片は、PCRによって、オリゴ
ヌクレオチドを用いて、得られた：

【０１９０】 AB329（33mer）（配列番号37） 5’TTTGTCGACATOTCTACCTTCAAGCCTATGATG 3’、 AB330（33mer）（配列番号38） 5’TTTGGATCCTTACGGAAGCTGAGTATATTTGAC 3’

【０１９１】 このPCR産物はSallおよび1214bpの断片を発生しているEamHIについては消化され
た。そして、それはそれから同じ重複の消化によって、線形にされるベクタ−pV
RlO2.2（実施例1）にリゲ−トされた。得られたプラスミドpABl3E（6081bp）が
、gD糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む‖402残基。

【０１９２】 7.3.2. pSBO27：gD遺伝子（ATM形状）が、ベクタ−pVR1O12にクロ−ニングする
ヒドロパシ・プロフィルに従い、EHV−4 gD蛋白の膜貫通領域が、残基348および
371との間にある。gDをコ−ドする遺伝子の先端を切った形状を含んでいるプラ
スミドは、二つのＤＮＡ断片に従うリゲーションによって、得られた：(a) 重複
のEcoRI−Bami−TI消化によって、線形にされるプラスミドpABl38（実施例7.3.1
。）そして、（b）310bpの断片は、PCRによって、以下を用いて、oligonucleoti
deSを得た：

【０１９３】 5B123（24mer）（配列番号 49） 5’TTTTCCGTAACAATTCCGAGCAGC 3’、 SB124（39mer）（配列番号50） 5’AATTTTGGATCCTTACGTAGAGTTGCTATTAGACOCTGG 3’

【０１９４】 ひな型としてのプラスミドpAB138を使用する。そして、消化する EcoRIおよびBami−lI。得られたプラスミド、pSBO27、5919bpは、347の残基の蛋
白をコ−ドする先端を切ったgD遺伝子を含む。

【０１９５】実施例8 イヌのGM−CSFをコ−ドするプラスミド 8.1. イヌ・リンパ球の全RNAの製剤は、マイトジェンによって、インビトロ
を刺激した イヌ血液は、Beagleイヌに作られる血液収集によって、EDTAを含んでいる管を通
じて集められた。単核化する細胞が、フィコ−ル勾配上の遠心により収穫されて
、それからペトリ皿に60mm、直径培養された。単核化するイヌ細胞が、それから
コンカナバリンA（ConA）（約四つのμg/mlの終濃度）については、そして、フ
ィトヘムアグルチニン（PHA）（約10のμg/mlの終濃度）については刺激された
。刺激作用の後、「リンパ芽球がこれらの細胞のペトリ皿および全RNAをひっか
いて収穫されたConA’および「PEA」は、キット「White Blood Cellsのためのメ
ッセンジャ−ＲＮＡ単離キット」（Boehringerマンハイム/ロシュCatフィ−ト1
934 325）を使用して抽出された

【０１９６】 8.2. プラスミドpJPO74のイヌGM−CSFをコ−ドする遺伝子および構築の単離 ConAによって、またはPEA（実施例8.1。）により刺激されるイヌlymphoblastSか
ら抽出される全RNAは、相補的ＤＮＡ最初のストランドの合成のためのひな型と
して役立った。この相補的ＤＮＡ最初のストランドが、オリゴヌクレオチドp(dT
) 15（Eoehringerマンハイム/ロシュCat # 814 270）の伸びにより生産された。
得られるThe単一の座礁された相補的ＤＮＡが、それからオリゴヌクレオチドに
従うことに関するPCR反応のためのひな型として使われた：

【０１９７】 JP578（配列番号64）（33 mer） 5’TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3’ そして、 JP579（配列番号 65）（36 mer） 5’TATGCCGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3’

【０１９８】 約450の塩基対（bp）のPOR断片を増殖する。This断片が、アガロ−スゲル電気泳
動により浄化されて、それからベクタ−pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, US
Aにリゲ−トした）プラスミドにpJPO74を与える。pJPO74がGenBank（受入れ番号
フィ−トS49738）に入手可能なイヌのGM−CSF配列のそれに均等であるために見
つけられたプラスミドにおいて、イヌのGN−CSF遺伝子の配列が、クロ−ニング
する

【０１９９】 8.3. プラスミドpJPO84の構築およびイヌのGM−CSF遺伝子の配列 プラスミドpJP074（実施例8.2）は、NotIについては、アガロ−スゲル電気泳動
の後、イヌのGM−CSF遺伝子を含んでいる約450のbpのNotI−NotI断片を分離する
ために消化された。この断片が、プラスミドpVRlQl2（実施例1）にリゲ−トされ
た。hCMV/IEプロモ−タに正しい一定方向への配列親族のイヌのGM−CSF配列、配
列番号 66、図No.20を含んでいるTheクロ−ンが、識別されたpJPO84であった。
このプラスミドは、5364bp（図No.19）の寸法を有する

【０２００】実施例9 ネコのGM−CSFをコ−ドするプラスミド 9.1. ネコ・リンパ球の全RNAの製剤は、マイトジェンによって、インビトロ
を刺激したネコ血液は、血液収集によって、EDTAを含んでいる管を通じて集めら
れた。単核化する細胞が、Picoll勾配上の遠心により収穫されて、それからペト
リ皿に60mm、直径培養された。単核化するネコ細胞が、それからコンカナバリン
A（ConA）（約四つの~g/mlの終濃度）については、そして、フィトヘムアグルチ
ニン（PEA）（約10のj.~g/mlの終濃度）については刺激された。リンパ芽球がこ
れらの細胞のペトリ皿および全RNAをひっかいて収穫された刺激作用（『ConA）
の後」、そして、PEA’は、キット"mRNA isolation kit for White Blood Cells
「(Eoehringer Mannheim/Roche Cat # 1 934 325)を使用して抽出された

【０２０１】 9.2. プラスミドpJPO89およびpJPO9OのねこGM−CSFをコ−ドする遺伝子およ
び構築の単離 ConAによって、またはPEA（実施例9.1。）により刺激されるネコ・リンパ芽球か
ら抽出される全RNAは、相補的ＤＮＡ最初のストランドの合成のためのひな型と
して役立った。この相補的ＤＮＡ最初のストランドは、オリゴヌクレオチドp(dT
) 15（Boehringer Nannheim/ロシュCat #814 270）の伸びにより生産された。得
られる単一の座礁された相補的ＤＮＡが、それからオリゴヌクレオチドに従うこ
とに関するPCR反応のためのひな型として使われた：

【０２０２】 JP578（配列番号64）（33mer） 5’TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3’ JP579（配列番号 65）（36mer） 5’TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3’

【０２０３】 約450の塩基対（bp）のPCR断片を増殖するための。この断片は、NotIについては
、アガロ−スゲル電気泳動の後、450のbp.のNotI−NOtI断片を分離するために消
化された。この断片は、それからプラスミドpVR1Ol2（実施例1）にリゲ−トされ
た。hCMV/IEプロモ−タに正しい一定方向への配列親族のネコのGN−CSF配列（配
列番号 67および配列番号 68）を含んでいる二つのクロ−ンは、識別されたpJPO
89およびpJPO9Oでそれぞれあった。これらの二つのプラスミドは、5364bp（図No
.21および23）の寸法を有するpJPO89がネコの入手可能なGN−CSF配列を有するヌ
クレオチドレベルで、13の相違を含むプラスミドに、ネコのGM−CSF遺伝子の配
列が、クロ−ニングする‖GenBank（受入れ番号AF053007）。

【０２０４】 最も重要な変化は、Leucineが生じるC−* T変化である→アミノ酸（アミノ酸コ
−ドン・フィ−ト107、図No.22の最初の塩基）用のフェニル・アラニン変更。pJ
PO9Oが均等であるプラスミドに、ネコのGM−CSF遺伝子の配列が、プラスミドpJP
O89に含まれるそれをクロ−ニングするロイシン−*フェニル・アラニン変化がす
ることを除いては、アミノ酸フィ−ト107（図No.24）のために、存在しない。同
じネコにおいて、RACEキットが、この位置107で、それが可能であることを示し
た確認の3’が、ネコのGM−CSFの遺伝子を順番に配列する‖3’は、アミノ酸ロ
イシンまたはアミノ酸フエニルアラニンを有する。

【０２０５】実施例10 ウマのGM−CSFをコ−ドするプラスミド 10.1 マイトジェンによって、インビトロを刺激したウマリンパ球の全RNA製剤 ウマ血液は、血液収集によって、頸静脈からEDTAを含んでいる管を通じて集め
られた。単核化する細胞が、フィコ−ル勾配上の遠心により収穫されて、それか
らペトリ皿に60mm、直径培養された。単核化するウマ細胞が、それからコンカナ
バリンA（ConA）（約5ig/mlの終濃度）についてはフィトヘムアグルチニン（PHA
）（約10のμg/mlの終濃度）については刺激された。刺激作用、「ConA」および
「PHA」リンパ芽球がひっかくことにより収穫されたあと、これらの細胞のペト
リ皿および全RNAがキット"mRNA isolation kit for White Blood Cells"を使用
して抽出されて（Boehringer Mannheim/Roche Cat ft 1 934 325) 10.2。ウマの
GM−CSFをコ−ドする遺伝子の単離

【０２０６】 ConAによって、またはPEA（実施例10.1。）により刺激されるウマ・リンパ芽球
から抽出される全RNAは、相補的ＤＮＡ最初のストランドの合成のためのひな型
として役立った。この相補的ＤＮＡ最初のストランドは、オリゴヌクレオチドp(
dT) 15（Boehringerマンハイム/ROOhe Catフィ−ト814 270）の伸びにより生産
された。得られるThe単一の座礁された相補的ＤＮＡが、それからオリゴヌクレ
オチドSに従うことに関するPCR反応のためのひな型として使われた：

【０２０７】 JP734（配列番号70）（44mer） 5’CATCATCATGTCGACGCCACCATGTGGCTGCAGA~ACCTGCTTCT 3’ JP735（配列番号 71）（41mer） 5’CATCATCATGCGGCCGCTACTTCTGGGCTGCTGGCTTCCAG 3’

【０２０８】 約500の塩基対（bp）のPCR断片を増殖するための。この断片は、アガロ−スゲル
電気泳動により浄化された。

【０２０９】 10.3. プラスミドpJPO97の構築およびウマのGM−CSF遺伝子の配列 浄化されたPCR断片が、実施例10.2において、得た。NotI~を有する、アガロ−ス
ゲル電気泳動の後、ウマのGM−CSF遺伝子を含んでいる約450のbpのNotI−NotI断
片を分離するために消化した。この断片が、プラスミドpVRlOl2（実施例1）にリ
ゲ−トされた。hCMV/IEプロモ−タに正しい一定方向への配列親族のウマのGM−C
SF配列、配列番号 69、図No.26を含んでいるTheクロ−ンが、識別されたpJPO97
であった。このプラスミドは、5334bp（図No.25）の寸法を有する

【０２１０】

【表１】

【０２１１】実施例12 分子生物学方法 ウィルスの栽培および精製 細胞変性効果が得られるまでウィルスを該当する細胞機構で培養された。各ウ
ィルスのために使われる細胞機構は当業者にとって周知である。手短に言うと、
該当する細胞は感染多重度1で研究されるウイルスの菌株に感染して細胞変性効
果（36時間の平均値）を得るのに必要な時間のための370Cで培養された

【０２１２】 ＤＮＡウィルスの場合、栽培の後、上澄みおよびlysedされた細胞は収穫され
た、そして、細胞の破片は遠心によって、1000gで、そして、10分間の4%で除去
した。ウィルス粒子は、400,000のpでの超遠心分離および1時間の40Cにより収穫
された。ペレットは、緩衝液、10mMトリス、1mM EDTAの極小容積にとられた。 ＲＮＡウィルスは、当業者にとって周知の標準の浄化手技に従って浄化された
。

【０２１３】ウイルスのゲノムDNAの抽出 濃縮されたウイルスのサスペンションは、プロテイナ−ゼＫ（100mg/ml最終的
なこと）については2時間のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（0.5%最終的なこと
）存在下で、37%で処理された。ウィルスＤＮＡは、それからフェノ−ル/クロロ
ホルム混合物を用いて、抽出された、そうすると、16時間の−200Cでの絶対のエ
タノ−ルの二つの容積を有する落ちるそうすると、10,000で4%で15分間のpを遠
心分離した。DNAペレットは、乾かされて、それから無菌の超高純度の水の極小
容積にとられた。

【０２１４】ウイルスのゲノムRNAの単離 各ウィルスのゲノムのRNAが、P. Chomczynski and N. Sacchi (Anal. Biochem
. 1987. 162. 156−159により記載されている"guanidinium thiocyanate/phenol
−chloroform"技術を使用して抽出された)。

【０２１５】分子生物学方法 プラスミドの全ての構築が、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Labora
tory Manual. 2nd Editionにより記載されている標準の分子生物学手技を使用し
て、実行された。Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Y
ork, 1989)。本発明のために使われる全ての制限断片は、"Geneclean"キット（B
IOlOl社、ラ・ホ−ヤ、CA）を用いて、分離された。全ての構造物のためのクロ
−ニングする、発現ベクタ−を有する継目および、ＤＮＡ断片がSanger method
(Samibrook et al., 1989によって、順番に配列された)。

【０２１６】PCRおよびRT−PCR 遺伝子への特性または遺伝子断片がクロ−ニングするオリゴヌクレオチドが、
総合された、それらのいくつか、いくらかの場合の、含むでそれら5’端（増殖
された断片のクロ−ニングを容易にしている制限サイト）。逆転写（室温）反応
およびPCR法（9CR）は、基準手技、Sambrookほか、1989に従って、実行された

【０２１７】プラスミドの大規模精製 ワクチンの組成物を始めている浄化されたプラスミドの約10mgのスケ−ル上の
、生産が塩化セシウム−エチジウムブロミド勾配方法によって実行された（Samb
rook et al., 1989）。

【０２１８】実施例13 ワクチンプラスミド製剤 実施例2〜10のプラスミドを含んだDNA溶液をSarnbrook et al. (1989）に記載
の方法でエタノ−ル沈殿で濃縮する。DNAペレットは、0.9% NaCl溶液において、
1mg/mlの濃度を得るために取る。無菌のH20の該当する容積を有するDMRIE−DOPE
の生理食塩水で取り、0.75mM DNRIE−DOPE溶液を調製する。

【０２１９】 プラスミドＤＮＡ−脂質錯体製剤は当量（0.9% NaClの1mg/mlのDNA溶液と0.75
mM DMRIE−DOPE溶液）に希釈して得る。気泡を避けるためにカチオン脂質溶液を
含んむ小びんの内壁に沿った縫い合わされた26G針を用いてDNA溶液は徐々に導か
れる。二つの溶液が混合するとすぐに穏やかに振盪をする。0.375mMのDMRIE−DO
PEおよびプラスミドの500のμg/mlから成っている最後組成物を得る。

【０２２０】 上記の全ての操作と使われる全ての溶液は室温であるのが望ましい。DNA/DMRT
E−DOPE錯体生成は動物を免疫する30分前に室温で行う。

【０２２１】実施例14 CDVに対するイヌの免疫 皮下または筋肉経路で2mlの注射を28日間隔で2回行う。各免疫化で使われるプ
ラスミドの全量はワクチンで100、500、1000または2000のμgである。当業者は
容積または濃度を必要なプラスミド投与量の関数として調節するのに必要な知識
を有する。

【０２２２】 14.1. ビルレント抗原投与 使用した抗原投与菌株は、イヌジステンパ−ウイルスの菌株スナイダ−Hillを
PBS緩衝液に100倍に薄めたのウイルスで感染させたイヌから取った。希釈液は使
うまで氷で保存した。一般麻酔剤の後、最初の注射の後、抗原菌株（100倍に希
釈）の0.5ml容積を頭蓋経路で投与し、49日後に投与した。

【０２２３】 14.2. 抗原投与後の臨床的監視 臨床的監視は抗原投与後21日間毎日実行した。イヌジステンパ−の臨床徴候お
よび直腸温を取るために各イヌを臨床検査した。下記の臨床検査を行った：

【０２２４】 １） 評価点4で動物の一般状態を観測： 0＝評点「良し」 1＝評点「無関心」、 2＝評点「へばり」 3＝「機能低下」 動物が死んが場合の臨床評点は10

【０２２５】 ２） 口鼻徴候（しょう液性または化膿性分泌物および／または結膜炎の検査）
。血清鼻汁と同時の結膜炎/鼻炎は評点１、化膿鼻汁は評点２。３） 消化器症
状（胃腸炎徴候検査）の価値判断。 １＝ 軽症胃腸炎 ２＝激しい胃腸炎 ４） 神経徴候（痙攣および／または麻痺検査） １＝ミオクローノス ２＝痙攣 ３＝麻痺

【０２２６】 ５）動物体温の監視 37.5℃の以下の温度は3の評点にする。37.5℃〜39.5℃の間の温度は0の評点に
する。39.5〜40℃の間の度は1の評点にする。40℃〜40.5℃の温度は2の評点にす
る。40.5℃を超える温度は3の評点にする。 抗原投与した動物の脾臓を取り、免疫蛍光法でイヌジステンパ−ウイルスを識
別した。

【０２２７】 全臨床評点は下記方法で計算した：観測期間での動物グル−プでの各臨床徴候
の平均評点を取り、五つの臨床徴候の全評点を平均評点と比較した。筋肉経路で
抗原を投与したイヌ免疫実験の結果は下記の通り：

【０２２８】

【表２】

【０２２９】

【表３】

【０２３０】 天然遺伝子Mおよび天然遺伝子Nを挿入したプラスミドpNSOl6およびプラスミド
pNSOl7はpNSOl8と同様にして作った。 最適化されたHA単独で得られた保護結果は、最適化されたHAおよびFまたは最
適化されたHAおよびF＋天然MおよびNで得られた結果に比べて驚くべきものであ
る。 本発明は上記実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載の本発
明の精神を逸脱しない限り、種々の変形例を含むものである。

【０２３１】 添付の配列リストは下記を表す： 配列番号 1：オリゴヌクレオチドN5030 配列番号 2：オリゴヌクレオチドNSO31 配列番号 3：オリゴヌクレオチドNS034 配列番号 4：オリゴヌクレオチドNS035 配列番号 5：オリゴヌクレオチドNS036 配列番号 6：オリゴヌクレオチドNS037 配列番号 7：オリゴヌクレオチドS3090 配列番号 8：オリゴヌクレオチドS2091 配列番号 9：オリゴヌクレオチドPB326 配列番号 10：オリゴヌクレオチドPB329 配列番号 11：オリゴヌクレオチドP2381 配列番号 12：オリゴヌクレオチドP2382 配列番号 13：オリゴヌクレオチドPB383 配列番号 14：オリゴヌクレオチド92384 配列番号 15：オリゴヌクレオチドSBlOl 配列番号 16：オリゴヌクレオチド92102 配列番号 17：オリゴヌクレオチド5B103 配列番号 18：オリゴヌクレオチド92104 配列番号 19：オリゴヌクレオチド5B105 配列番号 20：オリゴヌクレオチド52106 配列番号 21：オリゴヌクレオチド52107 配列番号 22：オリゴヌクレオチド52108 配列番号 23：オリゴヌクレオチドSBlO9 配列番号 24：オリゴヌクレオチド52110 配列番号 25：オリゴヌクレオチド52111 配列番号 26：オリゴヌクレオチド55112 配列番号 27：オリゴヌクレオチド5B113 配列番号 20：オリゴヌクレオチドS5114 配列番号 29：オリゴヌクレオチドSBuS 配列番号 30：オリゴヌクレオチドSE11G 配列番号 31：オリゴヌクレオチド52117 配列番号 32：オリゴヌクレオチド52118 配列番号 33：オリゴヌクレオチドAB325 配列番号 34：オリゴヌクレオチドA2326 配列番号 35：オリゴヌクレオチドA2327 配列番号 36：オリゴヌクレオチドA2328 配列番号 37：オリゴヌクレオチドA2329 配列番号 38：オリゴヌクレオチドAB330 配列番号 39：オリゴヌクレオチドN5003 配列番号 40：オリゴヌクレオチドN5004 配列番号 41：オリゴヌクレオチドN5005 配列番号 42：オリゴヌクレオチドNSOO6 配列番号 43：オリゴヌクレオチドNSOO7 配列番号 44：オリゴヌクレオチドN5008 配列番号 45：オリゴヌクレオチドSBll9 配列番号 46：オリゴヌクレオチド52120 配列番号 47：オリゴヌクレオチド5B121 配列番号 48：オリゴヌクレオチドS2122 配列番号 49：オリゴヌクレオチドS2123 配列番号 50：オリゴヌクレオチド5B124 配列番号 51：オリゴヌクレオチド5B125 配列番号 52：オリゴヌクレオチドSB126 配列番号 53：オリゴヌクレオチドSB127 配列番号 54：オリゴヌクレオチド5B128 配列番号 55：オリゴヌクレオチド5B129 配列番号 56：オリゴヌクレオチドSBl3O 配列番号 57：オリゴヌクレオチドSBl3l 配列番号 58：オリゴヌクレオチド9B132 配列番号 59：オリゴヌクレオチドSB133 配列番号 60：オリゴヌクレオチド5D134 配列番号 61：オリゴヌクレオチドSBl3S 配列番号 62：オリゴヌクレオチドSBl3E 配列番号 63：オリゴヌクレオチド5B137 配列番号 64：オリゴヌクレオチドJP578 配列番号 65：オリゴヌクレオチドJP579 配列番号 66：イヌ3R3 GM−CSの遺伝子配列（図20参照） 配列番号 67：ネコのGM−CSの遺伝子配列（図22参照） 配列番号 68：ネコ3R4 GM−CSの配列遺伝子（図24参照） 配列番号 69：ウマのGM−CSの遺伝子配列（図26参照） 配列番号 70：オリゴヌクレオチドJP734 配列番号 71：オリゴヌクレオチドJP735 配列番号72： CPI−2 Fの遺伝子配列（図27参照） 配列番号73： CPI−2 HNの遺伝子配列（図28参照）

【配列表】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpABllOの図

【図２】 プラスミドpVRlOl2の図

【図３】 プラスミドpNSO2lの図

【図４】 プラスミドpNSO24の図

【図５】 プラスミドpSBO32の図

【図６】 プラスミドpSBO34の図

【図７】 プラスミドpSBOl6の図

【図８】 プラスミドpSEOl9の図

【図９】 プラスミドpSBOl7の図

【図１０】 プラスミドpSBO2lの図

【図１１】 プラスミドp52023の図

【図１２】 プラスミドpS2024の図

【図１３】 プラスミドpSBO28の図

【図１４】 プラスミドpSB029の図

【図１５】 プラスミドpSBO3Oの図

【図１６】 プラスミドpSBO25の図

【図１７】 プラスミドpSBO26の図

【図１８】 プラスミドpSB027の図

【図１９】 プラスミドpJPO84の図

【図２０】 イヌのGM−CSの遺伝子配列の図

【図２１】 プラスミドpGPO89の図

【図２２】 ネコの遺伝子3R3 GM−CSの配列の図

【図２３】 プラスミドpJPO9Oの図

【図２４】 ネコの遺伝子3R4 GM−CSの配列の図

【図２５】 プラスミドpJPO97の図

【図２６】 ウマのGM−CSF遺伝子の配列の図

【図２７】 CPI−2のF遺伝子の配列の図

【図２８】 CPI−2のHN遺伝子の配列の図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/145 Ａ６１Ｋ 39/175 39/175 39/193 39/193 39/205 39/205 39/215 39/215 39/23 39/23 39/245 39/245 39/39 39/39 Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ 31/16 31/16 31/22 31/22 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 オドネ，ジャン−クリストフ，フランシス フランス国 69006 リヨン リュ ドゥ クレッキ 119 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA30 BA31 BA80 CA04 DA02 EA04 FA18 GA11 HA20 4C084 AA13 BA44 CA62 DA02 MA16 MA66 NA14 ZB332 ZC612 4C085 AA03 BA55 BA60 BA62 BA64 BA71 BA75 BA78 CC07 CC08 CC31 DD62 EE01 EE06 FF17 GG03 GG04 4C087 AA02 AA03 BC30 BC83 MA16 MA66 NA14 ZB33 ZC61

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペットまたはスポ−ツ用動物、特にイヌ、ネコまたはウマに関
   する病原体に対するDNAワクチンであって、このDNA配列を生体内で発現できるよ
   うな条件で、対応する動物種の病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列を
   含むプラスミドと、下記の［式１］で表される第四アンモニウム塩を含むカチオ
   ン脂質とから成ることを特徴とするDNAワクチン： 【式１】 （ここで、 R₁は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、 R₂は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、 Xはヒドロキシルまたはアミン基であり、 脂質は好ましくはDMRIEである）
2. 【請求項２】 DOPEをさらに含む請求項1に記載のワクチン。
3. 【請求項３】 対応する動物種のGM−CSF蛋白をさらに含む請求項1または２に
   記載のワクチン。
4. 【請求項４】 対応する動物種のGM−CSF蛋白をコ−ドする遺伝子をこの配列
   を含む発現ベクタ−を、それが生体内で発現できる条件下でさらに含む請求項1
   または２に記載のワクチン。
5. 【請求項５】 発現ベクタ−がプラスミドである請求項4に記載のワクチン。
6. 【請求項６】 病原体免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列が、膜貫通領域を
   コ−ドする部分が欠失している遺伝子の配列である請求項1〜５のいずれか一項
   に記載のワクチン。
7. 【請求項７】 病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列がtPAをコ−ド
   するヌクレオチド配列を含むプラスミドをさらに含む請求項１〜６のいずれか一
   項に記載のワクチン。
8. 【請求項８】 病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列を含むプラスミ
   ドがスタビライザ−イントロンを含む請求項1〜７のいずれか一項に記載のワク
   チン。
9. 【請求項９】 イントロンがウサギβグロビン遺伝子のイントロンIIである請
   求項7に記載のワクチン。
10. 【請求項１０】 CDVヌクレオチド配列を含む請求項１〜5のいずれか一項に記
    載のワクチン。
11. 【請求項１１】 HAのシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特に
    ヒト起源のtPAシグナル配列によって最適化するか、および／または、HAの膜貫
    通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によるか、および／または、イントロンの
    挿入、特に、HA遺伝子の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを挿
    入して最適化したHA遺伝子配列を含む請求項10に記載のワクチン。
12. 【請求項１２】 Fのシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特に
    ヒト起源のシグナル配列のtRAシグナル配列で最適化するか、および／または、F
    の膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によるか、および／または、F遺伝
    子の上流にイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを挿入す
    ることによって最適化したF遺伝子の配列を含む請求項10に記載のワクチン。
13. 【請求項１３】 同じプラスミドまたは他のプラスミド内にMまたはN遺伝子の
    配列を含む請求項10〜12のいずれか一項に記載のワクチン。
14. 【請求項１４】 DMRIE−DOPEと、ヒトのtPAシグナル配列でHAシグナルペプチ
    ド配列を置換し、HAの膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失さ
    せ且つHA遺伝子の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを挿入して
    最適化したCDVのHA抗原をコ−ドする発現プラスミドと、Fの膜貫通領域をコ−ド
    するヌクレオチド配列の断片を欠失させ且つF遺伝子の上流側にウサギβ−グロ
    ビン遺伝子のイントロンIIを挿入して最適化させたCDVのF抗原をコ−ドする第2
    の発現プラスミドとを含む、請求項10に記載のワクチン。
15. 【請求項１５】 イヌGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドをさらに含む請求
    項14に記載のワクチン。
16. 【請求項１６】 CPI−2のヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項
    に記載のワクチン。
17. 【請求項１７】 F蛋白のシグナル配列のヒト起源のtPAのシグナル配列による
    置換、および／または、Fの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および
    ／または、イントロン、特にF遺伝子の上流側へのウサギβ−グロビン遺伝子の
    イントロンIIの挿入によって最適化されたCPI−2のF遺伝子の配列を含む請求項1
    6に記載のワクチン。
18. 【請求項１８】 HNのシグナル配列のシグナル配列、特にヒト起源のtPAのシ
    グナル配列による置換、および／または、HNの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断
    片の欠失、および／または、HN遺伝子の上流側へのイントロン、特にウサギβ−
    グロビン遺伝子のイントロンIIの挿入によって最適化したCPI−2のHN遺伝子配列
    を含む請求項16に記載のワクチン。
19. 【請求項１９】 DMRIE−DOPEと、膜貫通領域をコ−ドするFのヌクレオチド配
    列の断片の欠失およびFの上流側へのウサギβ−グロビンのイントロンIIの挿入
    によって最適化したCPI−2のF抗原をコ−ドする発現プラスミドと、HNのシグナ
    ル配列の代わりにヒトtPAのシグナル配列を挿入し、HNの膜貫通領域をコ−ドす
    るヌクレオチド配列の断片を欠失させ且つHNの上流側へのウサギβグロビンのイ
    ントロンIIの挿入によって最適化したCPI−2のH抗原をコ−ドする第2の発現プラ
    スミドとを含む請求項16に記載のワクチン。
20. 【請求項２０】 イヌGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドをさらにふ含む請
    求項19に記載のワクチン。
21. 【請求項２１】 CHV−lヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に
    記載のワクチン。
22. 【請求項２２】 gBの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適
    化されたCHV−lのgB遺伝子の配列を含む請求項21に記載のワクチン。
23. 【請求項２３】 gCの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適
    化したCHV−lのgC遺伝子の配列を含む請求項21に記載のワクチン。
24. 【請求項２４】 gDの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適
    化したCHV−lの gD遺伝子の配列を含む請求項21に記載のワクチン。
25. 【請求項２５】 DMRTE−DOPEと、gB抗原をコ−ドする発現プラスミドと、gC
    抗原をコ−ドする第2のプラスミドと、gD抗原をコ−ドする第3のプラスミドとを
    含み、gB、gCおよびgDが膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失
    によって最適化されている請求項21に記載のワクチン。
26. 【請求項２６】 イヌGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドをさらに含む請求
    項25に記載のワクチン。
27. 【請求項２７】 FHV−1ヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に
    記載のワクチン。
28. 【請求項２８】 膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化し
    たFHV−lのgB遺伝子の配列を含む請求項27に記載のワクチン。
29. 【請求項２９】 gCの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適
    化したFHV−lの gC遺伝子の配列を含む請求項27に記載のワクチン。
30. 【請求項３０】 gDの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適
    化されたFHV−lのgD遺伝子の配列を含む請求項27に記載のワクチン。
31. 【請求項３１】 DMRTE−DOPEと、gB抗原をコ−ドする発現プラスミドと、gC
    抗原をコ−ドする第2のプラスミドと、gD抗原をコ−ドする第3のプラスミドとか
    ら成り、gB、gCおよびgDが膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最
    適化されている請求項27に記載のワクチン。
32. 【請求項３２】 ネコGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドをさらに含む請求
    項31に記載のワクチン。
33. 【請求項３３】 EHV−lヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に
    記載のワクチン。
34. 【請求項３４】 膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化さ
    れたgB遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
35. 【請求項３５】 gCの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適
    化されたgC遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
36. 【請求項３６】 gDの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適
    化されたgD遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
37. 【請求項３７】 DMRIE−DOPEと、gB抗原をコ−ドする発現プラスミドと、gC
    抗原をコ−ドする第2の発現プラスミドと、gD抗原をコ−ドする第3の発現プラス
    ミドとから成り、gB、gCおよびgDが膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の
    断片の欠失によって最適化されている請求項33に記載のワクチン。
38. 【請求項３８】 ウマのGN−CSFをコ−ドする発現プラスミド をさらに含む請
    求項37に記載のワクチン。
39. 【請求項３９】 EHV−4ヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に
    記載のワクチン。
40. 【請求項４０】 gBの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適
    化されたgB遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
41. 【請求項４１】 gCの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適
    化されたgC遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
42. 【請求項４２】 gDの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適
    化されたgD遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
43. 【請求項４３】 DMRIE−DOPEと、gBの抗原をコ−ドする発現プラスミドと、g
    C抗原をコ−ドする第2の発現プラスミドと、gD抗原をコ−ドする第3の発現プラ
    スミドとから成り、gE、gCおよびgDが膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列
    の断片の欠失によって最適化されている請求項33に記載のワクチン。
44. 【請求項４４】 ウマのGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドをさらに含む請
    求項37に記載のワクチン。
45. 【請求項４５】 下記の群の中から選択される病原体の免疫原をコ−ドするヌ
    クレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン：狂犬病ウィ
    ルス、CPV、CCV、Borrelia burgdorferi、FCV、FRy、FIPV、猫白血病ウイルス、
    FTV、ウマインフルエンザウィルス、ウマ日本脳炎ウイルス、ウマ西洋脳炎ウイ
    ルス、ウマベネズエラ脳炎ウイルスおよびクロストリジウムtetani。
46. 【請求項４６】 請求項10〜15のいずれか一項に記載のワクチン、請求項16〜
    20のいずれか一項に記載のワクチンおよび請求項21〜26のいずれか一項に記載の
    ワクチンから成る群の中から選択される二つまたは三つのワクチンから成るイヌ
    用のワクチン。
47. 【請求項４７】 請求項33〜38のいずれか一項に記載のワクチンと、請求項39
    〜44のいずれか一項に記載のワクチンとから成るウマヘルペスウイルス用ワクチ
    ン。
48. 【請求項４８】 請求項1〜47のいずれか一項に記載のワクチンと、不活化ワ
    クチン、弱毒生ワクチン、サブユニットワクチンまたは生体内の発現ベクタ−を
    用いて組換えたワクチンから成る従来のワクチンとから成る多価ワクチン。
49. 【請求項４９】 各プラスミドのDNAの量が10〜1000μg、好ましくは50〜500
    μである請求項1〜47のいずれか一項に記載のワクチン。
50. 【請求項５０】 経筋肉投与用ワクチンの製造での請求項1〜47および49のい
    ずれか一項に記載のDNAワクチンの使用。
51. 【請求項５１】 経皮投与用ワクチンの製造での請求項1〜47および49のいず
    れか一項に記載のDNAワクチンの使用。