JP2003501629A

JP2003501629A - 免疫ロゼットを用いる細胞分離法

Info

Publication number: JP2003501629A
Application number: JP2001500864A
Authority: JP
Inventors: トーマス，テリー，イー．; ピーターズ，ケリー; ランスドープ，ピーター
Original assignee: ステムセルテクノロジースインコーポレーテッド
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2003-01-14
Anticipated expiration: 2020-05-26
Also published as: HK1044819B; CA2375115A1; AU769903B2; HK1044819A1; IL146660A; CA2375115C; JP4526749B2; AU4905900A; DE60019111T2; CN1367876A; EP1185867B1; US20030092078A1; ATE292282T1; DE60019111D1; WO2000073794A2; CN1218182C; IL146660A0; US6872567B2; WO2000073794A3; EP1185867A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、免疫ロゼットを用いて細胞を分離する方法に関する。この方法は、有核細胞および赤血球を含有する試料を、有核細胞と赤血球との免疫ロゼット形成を可能にする抗体組成物と接触させることを含む。この抗体組成物は、好ましくは、２価抗体またはテトラマー抗体複合体を含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、免疫ロゼットを用いて細胞を分離する方法に関する。本発明は、本
発明の方法に用いるための新規な抗体組成物を含む。

【０００２】（発明の背景）多くの応用例において、生物試料中のある種の細胞集団を濃縮、あるいは枯渇
することが望ましい。血液学、免疫学、および腫瘍学の分野は、骨髄、脾臓、胸
腺、および胎児肝臓など、関連する組織からの末梢血、および細胞懸濁液の試料
に依存している。これらの不均質な試料から特定の細胞型を分離することが、こ
れらの分野での研究や、ある種の悪性疾患や免疫／造血障害の診断と治療にとっ
て不可欠である。

【０００３】Ｔ細胞、および抗原提示細胞などの免疫細胞が精製された集団は、免疫機能の
研究のために必要であり、免疫療法に用いられている。細胞、分子、および生化
学的プロセスの研究では、単離された特定の細胞型を分析する必要がある。Ｔ細
胞サブセット、Ｂ細胞、好塩基性細胞、ＮＫ細胞、および樹状細胞を単離するた
めに、数多くの手法が用いられてきた。

【０００４】造血幹細胞の単離もまた、非常に関心の高い分野である。幹細胞の純粋な集団
は、造血の研究を容易にすることになり、末梢血および／または骨髄由来の造血
細胞の移植は、悪性、非悪性および遺伝的疾患を含む多様な疾患の治療のために
、高用量化学療法および／または放射線療法と組み合わせて用いられることが多
くなった。そのような移植物中には、長期の造血再構築が可能な細胞は非常に少
なく、したがって造血幹細胞を精製するための手法を開発することが強く鼓舞さ
れる。さらに、移植受容者にリスクをもたらす移植組織中の細胞を除去するため
に用いられる手法の有効性が、重大な合併症、さらに言えば移植手法の成功を左
右する。そのような細胞には、同種異系移植片における移植片対宿主病（ＧＶＨ
Ｄ）の原因であるＴリンパ球、悪性増殖の再発を引き起こす可能性のある自己移
植における腫瘍細胞が含まれる。不必要な細胞を除去して移植物の量を減らすこ
とにより、注入される低温保存剤の量を低減することも重要である。

【０００５】場合によっては、たとえば骨髄移植組織のような生物試料から腫瘍細胞を除去
する、または枯渇させることが望ましい。気管支、乳管、胃腸管および尿生殖管
の上皮癌は、今日見られる固形腫瘍の主要な型である。微小転移性腫瘍細胞の移
動は、上皮癌患者の予後経過を示す重要な因子であると考えられている（Ｂｒａ
ｕｎ等、２０００年、Ｖａｕｇｈａｎ等、１９９０年）。そのような転移性細胞
を検出する能力は、組織、または液体試料採取の有効性、および腫瘍検出法の感
度によって制限される。血液試料中の循環上皮腫瘍細胞を濃縮する手法は、転移
性疾患を検出する能力を高め、そのような希少な細胞の研究や、疾病の拡散を可
能にする生物的変化を確定することが容易となろう。

【０００６】造血細胞、および免疫細胞は、密度などの物理特性に基づいて、および周期細
胞を殺傷するある種の薬剤への感受性に基づいて分離されてきた。細胞表面抗原
に対するモノクローナル抗体の登場は、異なる細胞型の識別、および分離の可能
性を大いに広げた。モノクローナル抗体を用いて血液、および関連する細胞懸濁
液から細胞集団を分離するには、２つの基本的なアプローチがある。それらの違
いは、抗体で識別／標識される細胞が所望の細胞であるか、または所望でない細
胞であるかという点である。

【０００７】ポジティブ選択法では、所望の細胞を抗体で標識し、残りの標識されていない
／所望でない細胞から回収する。ネガティブ選択では、所望でない細胞を標識し
、除去する。抗体／補体処理や免疫毒素の使用は、ネガティブ選択法であるが、
ＦＡＣＳ選別やほとんどのバッチ式免疫吸着法は、ポジティブ選択とネガティブ
選択の両方に使用することができる。免疫吸着法では、細胞はモノクローナル抗
体で選択され、残りの細胞から回収することのできるもの、たとえばビーズカラ
ム、フラスコ、磁性粒子などの表面に優先的に結合させる。免疫吸着法は、モノ
クローナル抗体を用い標的細胞に対する高い特異性を維持するが、ＦＡＣ選別と
は違って臨床採取で多量の細胞を直接に処理するためにスケールアップすること
ができ、かつ免疫毒素などの細胞毒性試薬は補体を用いる危険を回避できるので
、臨床でも研究でも人気があった。しかしながら、免疫吸着法は、デバイスすな
わち細胞を分離するための表面、たとえばビーズカラム、パンニングフラスコ、
または磁石などの使用を必要とする。

【０００８】造血幹細胞、免疫細胞、および循環上皮腫瘍細胞を単離するための現在の手法
はすべて、まず赤血球を除去し、次にデバイスまたは人工粒子に抗体を介して付
着させる段階を含む（Ｆｉｒａｔ等、１９８８年；ｄｅＷｙｎｔｅｒ等、１９
７５年；Ｓｈｐａｌｌ等、１９９４年；Ｔｈｏｍａｓ等、１９９４年；Ｍｉｌｔ
ｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＩｎｃ．、Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ポ
ジティブ選択の場合、装置または粒子から細胞を回収するさらなる段階がある。
これらの複数の工程はすべて時間がかかり、細胞損失を招く。Ｓｌａｐｅｒ−Ｃ
ｏｒｔｅｎｂａｃｈ等（１９９０年）は、免疫ロゼット形成を用いて、通常急性
白血病（ｃＡＬＬ）細胞の骨髄を駆逐する方法を述べている。この方法は、最初
に骨髄試料から赤血球を除去してｃＡＬＬ細胞に結合する抗体で標識する必要が
ある。次に標識赤血球を試料に戻して添加するとｃＡＬＬ細胞は免疫ロゼットを
形成する。この枯渇方法は、続いてｃＡＬＬ細胞を補体を介して溶解させるとき
、もっとも有効に機能する。

【０００９】密度分離は、顆粒細胞、および赤血球から末梢血単核細胞を単離するために通
例用いられる。フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａ
ｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）は、この用途
に用いられるもっとも一般的な密度溶液である。フィコール密度分離では、全血
をフィコールに重層し、次に遠心分離する。赤血球と顆粒細胞は細胞ペレットと
して沈降し、単核細胞はフィコールと血漿の界面に残留する。この手法が成功す
るかどうかは、単核細胞と顆粒細胞の間の密度の差異にかかっている。全血が２
４時間より長く保存された場合顆粒細胞の密度が変化し、赤血球と共にペレット
とならない。保存血液または細胞密度が変化した試料からは、１回の密度分離で
純粋な単核細胞の懸濁液を得ることはできない。

【００１０】これまでに述べたように、生物試料から所望の細胞を分離する、または所望で
ない細胞を除去する新規な方法を提供することが当分野において求められている
。（発明の概要）

【００１１】本発明者等は、細胞を試料中に存在している赤血球と免疫ロゼット形成させる
ことによって、その細胞を分離する方法を開発した。本発明の方法は、従来技術
の方法に比べてはるかに簡単であるにもかかわらず、同等に有効な免疫アフィニ
ティ手法である。「デバイス」、すなわち細胞懸濁液に通常存在しない人工分離
表面（たとえば、磁性粒子、アフィニティカラム）を必要としない。最初に試料
から赤血球を回収して抗体で標識した後にそれらを再び添加する必要もない。特
定の細胞型を、試料内に存在する自己赤血球と交差結合させ、できたロゼットを
その後、沈降、または遠心分離によって除去する。

【００１２】したがって、実施形態の１つでは、本発明は、（１）有核細胞と赤血球が免疫ロゼットを形成できる条件下で、（ａ）少なく
とも１種の、分離しようとする有核細胞上の抗原に結合する抗体と、それが直接
または間接的に結合している（ｂ）少なくとも１種の、赤血球に結合する抗体、
とを含む抗体組成物に試料を接触させる段階、および（２）試料から免疫ロゼットを除去する段階を含む、有核細胞と赤血球を含む
試料から有核細胞を分離する方法を提供する。

【００１３】この方法は、ポジティブ選択とネガティブ選択プロトコルの両方に用いること
ができる。この方法は、全血、骨髄、胎児肝臓、臍帯血、軟膜懸濁液、胸膜およ
び腹膜滲出液、ならびに胸腺細胞および脾細胞の試料を含む、赤血球を含有する
任意の試料に用いることができる。ここで本発明を図面に関して説明する。

【００１４】発明の詳細な説明Ｉ．本発明の方法前述のとおり、本発明は、細胞を赤血球と共に免疫ロゼット形成させることに
よって、その細胞を分離する方法に関する。

【００１５】もっとも広い態様では、本発明は、（１）有核細胞と赤血球が免疫ロゼットを形成できる条件下で、（ａ）少なく
とも１種の、分離しようとする有核細胞上の抗原に結合する抗体と、それが直接
または間接的に結合している（ｂ）少なくとも１種の、赤血球に結合する抗体、
とを含む抗体組成物に試料を接触させる段階、および（２）試料から免疫ロゼットを除去する段階を含む、有核細胞と赤血球を含む
試料から有核細胞を分離する方法を提供する。

【００１６】この方法は、ポジティブおよびネガティブ選択プロトコルの両方に用いること
ができる。ポジティブ選択においては、所望の細胞がロゼットを形成する。その
ような実施形態ではこの方法はさらに、免疫ロゼットの赤血球を溶解し、所望の
細胞を分離する段階を含むことになる。したがって、ポジティブ選択法において
、抗体組成物は、（ａ）試料から得るまたは分離することを所望する有核細胞に
特異的な少なくとも１種の抗体を含有する。

【００１７】好ましくは本発明の方法は、ネガティブ選択プロトコルに用いられる。ネガテ
ィブ選択においては、所望の細胞は免疫ロゼット形成せず、免疫ロゼット除去後
も試料中に残存する。ネガティブ選択法において抗体組成物は、（ａ）試料から
除去することを所望する細胞に特異的な少なくとも１種の抗体を含有することに
なる。したがって、本発明は、（１）所望でない細胞と赤血球が免疫ロゼットを形成できる条件下で、（ａ）
少なくとも１種の、所望でない細胞上の抗原に結合する抗体と、それが直接また
は間接的に結合している（ｂ）少なくとも１種の、赤血球に結合する抗体、とを
含む抗体組成物に試料を接触させる段階、および（２）試料から免疫ロゼットを除去する段階を含む、所望の細胞、赤血球、お
よび所望でない細胞を含む試料において所望の細胞を濃縮し回収するためのネガ
ティブ選択法を提供する。

【００１８】段階（１）で形成された赤血球と所望でない細胞との間の免疫ロゼットは、様
々な手法を用いて所望の細胞から分離することができる。１つのやり方は、免疫
ロゼットを含有する試料を、浮遊密度溶液（ｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅなど）
に重層し、遠心分離する。免疫ロゼットはペレットとなり、所望の細胞は、浮遊
密度溶液と試料との間の界面に留まる。次に所望の細胞をその後の使用のために
界面から回収する。別のやりかたでは、段階（１）で得られた免疫ロゼットを含
有する試料を、沈殿試薬（ヒドロキシエチルデンプン、ゼラチン、メチルセルロ
ースなど）と混合して、ロゼットを沈降させる。懸濁状態の所望の細胞はその後
の使用のために回収する。他の実施形態において、段階（１）で得られた免疫ロ
ゼットを含有する試料を、遠心分離や向流溶離（ＣｏｕｎｔｅｒＦｌｏｗＥ
ｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）を利用してまたは利用せずに沈降させる。所望の細胞は
懸濁液中に留まり、後で使用するために回収される。

【００１９】本発明に用いる抗体組成物は、以下にさらに詳しく記載する。本発明の方法は、血液（特に臍帯血、および全血）、骨髄、胎児肝臓、軟膜懸
濁液、胸膜および腹膜滲出液、ならびに胸腺細胞および脾細胞の懸濁液を含む、
赤血球を含有する生物試料の処理に用いることができる。驚いたことに、本発明
者等は、この方法で前処理なしに全血または全骨髄から細胞を直接除去できるこ
とを見出した。これは、従来技術の方法と比べて、本発明の方法の著しい利点で
ある。特に、赤血球を除去し、標識し、試料に戻して添加する必要がない。

【００２０】本発明の方法は、これに限定されるものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細
胞、樹状細胞、単核細胞、好塩基性細胞、マスト細胞、前駆細胞、幹細胞、およ
び腫瘍細胞を含む任意の細胞型の濃縮された試料を調製するために用いることが
できる。

【００２１】一実施形態において、本発明の方法は、骨髄試料から造血前駆細胞および幹細
胞標品を調製するために用いることができる。たとえば、本発明の方法は、試料
からＢリンパ球、Ｔリンパ球、単核細胞、ＮＫ細胞、顆粒細胞、および／または
腫瘍細胞を枯渇させまたは除いて、移植や当分野の技術者ならすぐわかる他の治
療法に用いる造血前駆細胞および幹細胞標品を調製するためのネガティブ選択プ
ロトコルに用いることができる。たとえば、同種異系移植組織の場合、ドナーか
ら骨髄または血液を採取し、本明細書に記載の方法によって前駆細胞および幹細
胞を濃縮することができる。ネガティブ選択を用いることにより、標品中のヒト
造血前駆細胞および幹細胞は抗体で被覆または変性されておらず、移植などの当
分野の技術者に容易に認められる他の治療法に極めて適している。

【００２２】他の実施形態において、本発明の方法は、血液から成熟樹状細胞およびそれら
の前駆体を単離回収するために用いることができる。樹状細胞は、ｉｎｖｉｔ
ｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方でＴ細胞を活性化することのできる抗原提示細
胞を含み、いろいろ有用な適用ができる。一例として、抗腫瘍Ｔ細胞反応を誘発
するために、ｉｎｖｉｔｒｏで樹状細胞に腫瘍抗原を負荷（パルス）し、ｉｎ
ｖｉｖｏに注入することができる。

【００２３】他の実施形態において、本発明の方法はさらに、血液や骨髄などの試料から、
Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単核細胞、樹状細胞、好塩基性細胞、プラスマ細胞
など選択された分化細胞型が濃縮された細胞標品を調製するのに用いることがで
きる。これは、成長因子産生とその成長因子に対する反応などの特定の細胞間相
互作用を研究を可能にする。さらに、特定の細胞型に関する分子的、生化学的分
析を可能にする。ＮＫ細胞、樹状細胞、およびＴ細胞が濃縮された細胞標品は、
ある種の悪性疾患に対する免疫療法に用いることもできる。

【００２４】他の実施形態において、本発明の方法は、非造血転移性腫瘍細胞などの腫瘍細
胞を試料から分離するために用いることができる。この方法は、転移性疾患の診
断および検出、転移性疾患の進行の監視、または治療の効能の監視を助けるため
に、患者の血液、骨髄、ならびに腹膜および胸膜滲出液から、非造血腫瘍細胞を
検出する際に有用である。

【００２５】ＩＩ．抗体組成物本発明は、本発明の方法に用いるための抗体組成物を含む。この抗体組成物は
（ａ）有核細胞上の抗原に結合する抗体少なくとも１種と、それが直接または間
接的に結合している（ｂ）少なくとも１種の、赤血球上の抗原に結合する抗体、
とを含むことになる。

【００２６】「少なくとも１種の抗体」という用語は、その抗体組成物が、少なくとも１種
類の抗体（少なくとも１つの抗体分子とは異なる）を含むことを意味する。１種
類の抗体とは、特定の抗原に結合する抗体を意味する。たとえば、抗原ＣＤ２に
結合する抗体は、１種類の抗体とみなされる。好ましくは、本発明の抗体組成物
は、（ａ）有核細胞に結合する複数種の抗体を含有する。

【００２７】２種の抗体（ａ）および（ｂ）は、二価抗体または二重特異性抗体を調製する
ことによって、直接結合してもよい。２種の抗体（ａ）および（ｂ）は、たとえ
ばテトラマー抗体複合体を調製することによって、間接的に結合してもよい。こ
れらはすべて以下に記載する。

【００２８】一態様では、有核細胞に特異的な抗体は、赤血球に特異的な抗体と直接結合し
ている。一実施形態において、本発明の抗体組成物は、有核細胞に特異的な少な
くとも１種の抗体、その抗体が直接結合している（ｂ）赤血球に特異的な少なく
とも１種の抗体、とを含む二価抗体を含有する。二価抗体は、たとえばＮ−スク
シンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用い
ることによって、１つの抗体を他の抗体に化学的に結合することによって調製で
きる。

【００２９】他の実施形態において、抗体組成物は二重特異性抗体を含有する。二重特異性
抗体は、赤血球に特異的な抗体の可変領域と、分離する有核細胞の表面上の少な
くとも１種の抗原に特異的な可変領域とを含む。この二重特異性抗体は、ハイブ
リッドハイブリドーマを形成することによって調製することができる。このハイ
ブリッドハイブリドーマは、Ｓｔａｅｒｚ、およびＢｅｖａｎ（１９８６年、Ｐ
ＮＡＳ（ＵＳＡ）８３：１４５３）、ならびにＳｔａｅｒｚ、およびＢｅｖａｎ
（１９８６年、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ７：２４１）に開示されて
いるものなど、当分野で知られている手法によって調製することができる。二重
特異性抗体はまた、Ｓｔａｅｒｚ等（１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ３１４：６２
８）、およびＰｅｒｅｚ等（１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ３１６：３５４）に記
載されているような手法を用いて化学的手段によって、または組換え免疫グロブ
リン遺伝子構築体を発現させることによって構築することができる。

【００３０】他の態様において、本発明の抗体組成物は、（ａ）有核細胞型に特異的な少な
くとも１種の抗体、その抗体が間接的に結合している（ｂ）赤血球に特異的な少
なくとも１種の抗体、とを含む。「間接的に結合」とは、抗体（ａ）および抗体
（ｂ）が互いに直接には共有結合してはいないが、免疫複合体などの結合部分に
よって連結していることを意味する。好ましい実施形態では、テトラマー抗体複
合体を形成することで有核細胞型に対する抗体は赤血球に特異的な抗体に間接的
に結合する。テトラマー抗体複合体は、赤血球に結合することのできる第１のモ
ノクローナル抗体と、分離する有核細胞に結合することのできる第２のモノクロ
ーナル抗体を混合することによって調製することができる。この第１および第２
のモノクローナル抗体は第１の動物種由来である。第１の動物種の抗体のＦｃ部
分に対する第２の動物種のモノクローナル抗体のほぼ等モル量を、第１および第
２の抗体と反応させる。第１および第２の抗体は、第１の動物種の抗体のＦｃ部
分に対する第２の動物種のモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）_２部分と反応させ
ることもできる（テトラマー抗体複合体、およびその調製方法の説明として参照
により本明細書の一部とするＬａｎｓｄｏｒｐの米国特許第４８６８１０９号を
参照のこと）。

【００３１】好ましくは、赤血球に特異的な抗体は、抗グリコフォリンＡ抗体である。本発
明の抗体組成物に含まれる抗グリコフォリンＡ抗体は、赤血球を結合するために
用いられる。グリコフォリンＡに特異的なモノクローナル抗体の例は、１０Ｆ７
ＭＮ（米国特許第４７５２５８２号、細胞系統：ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−８１６
２）、およびＤ２．１０（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａ
ｎｃｅ）である。

【００３２】好ましくは、有核細胞に特異的な抗体は、抗体の組み合わせである。この抗体
の組み合わせは、多くの細胞型を試料から除去することができるように、いくつ
かの細胞型に特異的であってよい。抗体の組み合わせを用いるとき、各抗体は赤
血球に特異的な抗体に（直接、または間接的に）結合される。

【００３３】好ましい実施形態において、抗体組成物は、（ａ）赤血球に結合する抗グリコ
フォリンＡ抗体、（ｂ）免疫ロゼット形成を望む有核細胞型と結合する抗体、な
らびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）両方のＦｃ部分と結合する抗体、任意選択でＦ
（ａｂ’）_２抗体断片でもよい、からなるテトラマー複合体である。（ａ）：（
ｂ）：（ｃ）のモル比は、およそ１：３：４である。数種の細胞型を分離すると
き、複合体は数種の抗有核細胞抗体（ｂ）を用いて作製される。次にこの複合体
を混合し、本発明の方法で用いるための抗体組成物を形成することができる。図
１は、テトラマー抗体複合体によって形成されたロゼットの概略図である。

【００３４】本発明のコンテクストにおいて、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナ
ル抗体、抗体断片（たとえばＦａｂやＦ（ａｂ’）_２）、キメラ抗体、２価また
は二重特異性抗体、およびテトラマー抗体複合体を含むものと理解される。抗体
は、それらが適切な親和性（結合定数）、たとえば１０^７Ｍ^−１以上、で結合す
る場合、有核細胞または赤血球の表面上の選択された抗原に対して反応性である
と理解される。

【００３５】モノクローナル抗体は、好ましくは本発明の抗体組成物に用いられる。有核細
胞の表面上の選択された抗原に特異的なモノクローナル抗体は、通常の手法を用
いて容易に生成することができる。たとえば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌ
ｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年によって最初に開発されたハイブリド
ーマ手法によって生成することができる（Ｎａｔｕｒｅ２５６、４９５〜４９
７；参照により本明細書の一部とする米国特許ＲＥ３２０１１、第４９０２６１
４号、第４５４３４３９号、および第４４１１９９３号も参照のこと；Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：ＡＮｅｗＤ
ｉｍｅｎｓｉｏｎｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎ
ｕｍＰｒｅｓｓ、Ｋｅｎｎｅｔｔ、ＭｃＫｅａｒｎ、およびＢｅｃｈｔｏｌ（
編）、１９８０年、ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８８年も参照のこと
）。モノクローナル抗体を構築するために、他の手法も用いることができる（た
とえば、ＷｉｌｌｉａｍＤ．Ｈｕｓｅ等、１９８９年、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏ
ｎｏｆａＬａｒｇｅＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌＬｉｂｒａｒｙｏ
ｆｔｈｅＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅｉｎＰ
ｈａｇｅＬａｍｂｄａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５〜１２８１、Ｌ
．Ｓａｓｔｒｙ等；１９８９年、「ＣｌｏｎｉｎｇｏｆｔｈｅＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉｆｏｒＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＣａｔ
ａｌｙｔｉｃＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａ
ＨｅａｖｙＣｈａｉｎＶａｒｉａｂｌｅＲｅｇｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳ
Ａ８６：５７２８〜５７３２；Ｋｏｚｂｏｒ等、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌ
．Ｔｏｄａｙ４、７２、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法に関して；Ｃｏｌｅ等
、１９８５年、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎＣａｎｃ
ｅｒＴｈｅｒａｐｙ、ＡｌｌｅｎＲ．Ｂｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁
、ヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ手法に関して
、を参照のこと；さらに、ＭｉｃｈｅｌｌｅＡｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ等、１９
９０年、「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ＡＲａｐｉｄＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｔｏＨｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ」、ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙ３：１〜９も参照のこと）。ハイブリドーマ細胞は、抗原に特異的に
反応する抗体産生について免疫化学的にスクリ−ニングすることができ、モノク
ローナル抗体を単離することができる。

【００３６】抗体は通常の手法を用いて断片にし、全抗体に関して上述したものと同じ方法
で使う断片を選別することができる。たとえば、抗体をペプシンで処理すること
によって、Ｆ（ａｂ’）_２断片をつくることができる。結果として生じるＦ（ａ
ｂ’）_２断片は、処理してジスルフィド架橋を還元することにより、Ｆａｂ’断
片とすることができる。

【００３７】本発明はさらに、キメラ抗体誘導体、すなわち非ヒト動物可変領域とヒト不変
領域とを合わせた抗体分子を企図する。キメラ抗体分子は、たとえばマウス、ラ
ット、または他の種の抗体に由来する抗原結合ドメインとヒト不変領域とを含む
ことができる。これまでにキメラ抗体を作製するための様々なアプローチが述べ
られており、それを用いて、分化細胞、または腫瘍細胞表面上の選択された抗原
を認識する免疫グロブリン可変領域を持つキメラ抗体を作製することができる。
たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１、６８５１；Ｔａｋｅｄａ等、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ
３１４：４５２；Ｃａｂｉｌｌｙ他、米国特許第４８１６５６７号；Ｂｏｓｓ
他、米国特許第４８１６３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ他、欧州特許公開ＥＰ１
７１４９６；欧州特許公開第０１７３４９４号、英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂ
を参照のこと。

【００３８】２価抗体は、化学的複合、体細胞ハイブリダイゼーション、または遺伝子工学
手法によって調製することができる。

【００３９】化学的連結は、ε−アミノ基またはヒンジ部のチオール基と、ホモおよびヘテ
ロ２官能性試薬の使用に基づく。５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
（ＤＮＴＢ）などのホモ２官能性試薬は、２つのＦａｂの間にジスルフィド結合
を生成し、０−フェニレンジマレイミド（Ｏ−ＰＤＭ）は、２つのＦａｂの間に
チオエーテル結合を生成する（Ｂｒｅｎｎｅｒ等、１９８５年、Ｇｌｅｎｎｉｅ
等、１９８７年）。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネート（ＳＰＤＰ）などのヘテロ２官能性試薬は、クラスやアイソタイプに関
わらず、抗体の露出アミノ基とＦａｂ部分を連結する（ＶａｎＤｉｊｋ等、１
９８９年）。

【００４０】体細胞ハイブリダイゼーションには、クアドローマを生成する、２つの確立し
たハイブリドーマの融合（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３年）
、またはトリオーマを生成する、第２の抗原で免疫化されたマウス由来のリンパ
球と１種の確立したハイブリドーマの融合（ＮｏｌａｎおよびＫｅｎｎｅｄｙ、
１９９０年）が含まれる。ハイブリッドハイブリドーマは、特定の薬剤耐性マー
カに耐性の各ハイブリドーマ細胞系統を作ることによって（ＤｅＬａｕ等、１
９８９年）、または各ハイブリドーマを異なる蛍光色素で標識し、ヘテロ蛍光細
胞を選別することによって（Ｋａｒａｗａｊｅｗ等、１９８７年）選択される。

【００４１】遺伝子工学には、プラスミドに特定の抗体断片をコードするＤＮＡ配列とプラ
スミドを連結し、組換えタンパク質を発現させる組換えＤＮＡに基づく技術を使
用することが含まれる。二重特異性抗体はまた、リンカーを用いて２つの１本鎖
Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片をつなぐことによって単一共有結合構造とする（Ｗｉｎｔ
ｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１年）、転写因子ｆｏｓおよびｊｕｎ由来
のロイシンジッパー共発現配列とする（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等、１９９２年）、ｐ
５３の相互作用領域を共発現するヘリックス−ターン−ヘリックスとする（Ｒｈ
ｅｉｎｎｅｃｋｅｒ等、１９９６年）、またはダイアボディとする（Ｈｏｌｌｉ
ｇｅｒ等、１９９３年）ことにより作製することもできる。

【００４２】表１は、本発明の方法に用いることのできる、有核細胞上の特定のヒト抗原に
対する抗体の例を示す。本発明の方法は、他の種に関しても用いることができる
。有核細胞に対する１種または複数の抗体の選択は、試料の性質、濃縮または枯
渇する細胞の選択、方法がポジティブかネガティブ選択プロトコルであるかによ
って決まることになる。すべての場合において、免疫ロゼットが形成される有核
細胞に対する抗体（または複数の抗体）は、本発明の方法に用いられるとき、赤
血球に特異的な抗体に直接または間接に結合することになる。

【００４３】本発明の方法および抗体組成物は、好ましくは、特定の細胞型に関して濃縮さ
れた細胞標品を調製するためにネガティブ選択プロトコルにおいて用いられる。
これは、単離したい特定の細胞型に対する抗体を欠く抗体組成物を用いることに
よって達成される。したがって、本発明は、（ａ）所望でない細胞上の抗原に結
合する少なくとも１種の抗体、その抗体が結合している（ｂ）赤血球に結合する
少なくとも１種の抗体、とを含む、所望の細胞、赤血球および所望でない細胞を
含有する試料中において、所望の細胞を濃縮し回収するための抗体組成物を提供
する。ヒトの細胞に関して本発明のネガティブ選択プロトコルにおいて用いるこ
とのできる抗体組成物の特定の実施形態を、表２に記載する。この表は、特定の
細胞型を濃縮する上述の方法において抗体（ａ）として用いることのできる、特
定の抗原に対する抗体のリストまたはカクテルを提供する。ほとんどの場合にお
いて、必須の抗体に関するいくつかの選択、ならびにいくつかの任意選択の抗体
を提供する。たとえば、Ｔ細胞を濃縮する場合、抗体（ａ）は、（１）ＣＤ１６
および／またはＣＤ６６ｂおよび／またはＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１５、
（２）ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣＤ２１および／または
ＣＤ２２および／またはＣＤ２４および／またはＩｇ、ならびに（３）ＣＤ３６
および／またはＣＤ１４に対する抗体のカクテルであることができる。このカク
テルは任意選択で、ＣＤ３３および／またはＣＤ５６および／またはＩｇＥおよ
び／またはＣＤ４１に対する抗体を含むことができる。表２に挙げた抗体の組み
合わせに加えて、参照により本明細書の一部とする米国特許第５８７７２９９号
に記載されているような特定の細胞型を濃縮するために他の抗体組み合わせを用
いてよいことを、当分野の技術者は理解するであろう。本発明は細胞濃縮標品を
調製するための免疫ロゼットの形成に関するので、当分野の技術者は、他の抗体
や抗体組み合わせを用いてもよいことが理解できよう。

【００４４】本発明の方法および抗体組成物は、細胞標品を調製するために、所望の細胞が
免疫ロゼット形成されるポジティブ選択プロトコルに用いることができる。ポジ
ティブ選択プロトコルに有用な抗体組み合わせのいくつかの例を以下に記載する
。

【００４５】ポジティブ選択プロトコルで非造血性腫瘍細胞を分離するための抗体組成物は
、腫瘍細胞に発現した非造血性抗原に特異的な抗体、たとえば乳癌や肺癌腫、な
らびに神経芽腫細胞の表面上に発現した抗原に対する抗体などを含む。上皮腫瘍
細胞に発現した非造血抗原に対する抗体は、（たとえば、表３に示したように）
市販品製造元から入手でき、あるいは当分野で知られている手法を用いて調製す
ることもできる。

【００４６】ポジティブ選択プロトコルでＢ細胞を分離するには抗体組成物は、ＣＤ２４お
よび／またはＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣＤ２２に対する
抗体を含有する。

【００４７】ポジティブ選択プロトコルでＴ細胞を分離するには、抗体組成物はＣＤ３およ
び／またはＣＤ２および／またはＣＤ５および／または、ＣＤ４およびＣＤ８の
両方に対する抗体を含有する。

【００４８】ポジティブ選択プロトコルでＮＫ細胞を分離するには、抗体組成物はＣＤ５６
に対する抗体を含有する。

【００４９】ポジティブ選択プロトコルで顆粒細胞を分離するには、抗体組成物はＣＤ１６
および／またはＣＤ６６ｅおよび／またはＣＤ６６ｂに対する抗体を含有する。

【００５０】ポジティブ選択プロトコルで単核細胞を分離するには、抗体組成物はＣＤ１４
に対する抗体を含有する。以下の非限定的な実施例は本発明を例示するものである。

【００５１】

【実施例】

実施例１テトラマーの調製本発明の方法に使用するテトラマー抗体複合体を調製するために、以下のプロ
トコルを用いることができる。（ａ）ロゼット形成する細胞に特異的な抗体（た
とえば、抗ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９な
ど）１ｍｇを取る。（ｂ）３ｍｇの抗グリコフォリンＡ抗体（対赤血球）を添加
し、充分に混合する。（ｃ）次に４．０ｍｇのＰ９抗体、または２．７２ｍｇの
Ｐ９Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片を添加する。３７℃で一晩インキュベートする。Ｐ
９抗体は、段階（ａ）および（ｂ）で添加した抗体のＦｃ部分に結合し、テトラ
マー抗体複合体を生じる。テトラマーの調製に関するさらなる情報は、参照によ
り本明細書の一部とするＬａｎｓｄｏｒｐの米国特許第４８６８１０９号を参照
されたい。有核細胞に発現した抗原に対する異なる抗体を包含するテトラマー抗
体複合体は別々に調製し、その後混合する。この抗体組成物は、枯渇を望む細胞に応じて、種々のテトラマー抗体複合体を
合わせることによって作製する。種々のテトラマー抗体複合体の濃度は多様であ
り、典型的に、有核細胞に発現した抗原に対する抗体は、テトラマー複合体中１
０〜３０μｇ／ｍｌである。次にこの組成物を細胞中１／１０に希釈し、それに
より細胞懸濁液中の各抗有核細胞抗体の最終濃度は１．０〜３．０μｇ／ｍｌと
なる。

【００５２】実施例２フィコールを用いる免疫ロゼット法フィコールハイペークを用いて、全末梢血から細胞を免疫ロゼット形成させる
ためのネガティブ選択プロトコルを以下に述べる。１．全末梢血１ｍｌ当たり１００μｌの抗体組成物を添加する。２．室温で２０分インキュベートする。３．等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋２％子ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
で試料を希釈し、緩やかに混合する。４．フィコールハイパークの上部に希釈試料を加層するか、または希釈試料の
下部にフィコールを加層する。５．ブレーキなし、室温、１２００×ｇで２０分間、遠心分離する。６．フィコール、プラスマ界面から濃縮細胞を除去する。７．濃縮細胞を５〜１０倍量のＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄する。注：単核細胞や他の付着細胞を濃縮する場合、１ｍＭのＥＤＴＡを全血試料、
およびすべての洗浄／希釈溶液に添加する。

【００５３】実施例３ヘタスターチ（ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）沈降を用いる免疫ロゼット法ヘタスターチを用いて、全末梢血から細胞を免疫ロゼット形成させるためのネ
ガティブ選択プロトコルを以下に述べる。ヘタスターチは、凝集作用によって赤
血球沈降速度を高める化合物の１つである。１．血液５ｍｌ当たり１ｍｌの食塩水中６％ヘタスターチを添加し、混合する
。２．各抗有核細胞抗体の最終濃度が１．０〜２．０μｇ／ｍｌとなるように、
実施例１に記載した抗体組成物を全血に添加する。３．室温で１０分インキュベートする。４．室温、５０×ｇで５分間、遠心分離する。５．上澄みを除去する。この分画は濃縮細胞を含有する。６．濃縮細胞分画を２〜５倍量のＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で洗浄
する。

【００５４】実施例４ヘタスターチ／イオジキサノール混合物を用いる免疫ロゼット法全末梢血から細胞を免疫ロゼット形成させるためのネガティブ選択プロトコル
を以下に述べる。１．血液５ｍｌ当たり１ｍｌの食塩水中６％ヘタスターチを添加し、混合する
。２．０．６ｍｌの６０％ｗ／ｖイオジキサノールを添加し混合する。イオジキ
サノールは、水溶液密度を相当に高める化合物の１つである。３．各抗有核細胞抗体の最終濃度が１．０〜２．０μｇ／ｍｌとなるように、
実施例１に記載した抗体組成物を全血に添加する。３．室温で１０分インキュベートする。４．室温、５０×ｇで５分間、遠心分離する。５．上澄みを回収する。この分画は濃縮細胞を含有する。６．濃縮細胞分画を２〜５倍量のＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄する。

【００５５】実施例５免疫ロゼット法ポジティブ選択全末梢血から細胞を免疫ロゼット形成させるためのポジティブ選択プロトコル
を以下に述べる。１．１ｍｌの血液を取りわけておく。２．１０ｍｌの血液をフィコールパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）に重層
し、ブレーキなし、室温、１２００×ｇで、２０分間、遠心分離する。３．フィコール−血漿界面のＭＮＣ層をとり、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄する
。４．細胞をカウントし、１×１０^８／ｍｌになるよう再懸濁する。５．試料の量を測定し、量Ａとする。６．段階１で取っておいた血液０．２ｍｌを添加する。７．ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで、全量を量Ａの２倍にする。８．実施例１に合成を記載した、所与の抗原に特異的なテトラマー抗体複合体
を、最終濃度１．０μｇ／ｍｌで添加する。９．室温で２０分インキュベートする。１０．ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２倍に希釈し、密度１．０８５ｇ／ｍｌ、オスモ
ル濃度２８０ｍＯｓｍに調製したパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）に重層する。１１．段階２のとおり、１２００×ｇで２０分間、遠心分離する。１２．上澄みを捨て、濃縮細胞を含有するペレットを再懸濁する。１３．赤血球を塩化アンモニウム溶液で溶解し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄す
る。

【００５６】実施例６Ｔ細胞の濃縮フィコールを用いる免疫ロゼット形成本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、全末梢血からのＴ細胞の濃縮
を例示する。ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、およびＣＤ５６に対する抗体を含
有するテトラマー抗体複合体のＴ細胞濃縮カクテルを調製した。表４に示した結
果は、本発明の方法が５０％に近い回収率で、Ｔ細胞の純度９５％をもたらすこ
とを示す。

【００５７】実施例７ＣＤ８^＋Ｔ細胞の濃縮フィコールを用いる免疫ロゼット形成本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、全末梢血からのＣＤ８^＋Ｔ細
胞の濃縮を例示する。テトラマー抗体複合体の２種のカクテルを試験した。１つ
のカクテルは、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、およびＣＤ５６に対す
る抗体を含有し、もう一方は、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５
６、およびＩｇＥに対する抗体を含有した。表５に示した結果は、カクテルに抗
ＩｇＥを添加することで、回収率に影響を及ぼさず、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の純度が向
上することを示す。

【００５８】実施例８ＣＤ４^＋Ｔ細胞の濃縮フィコールを用いる免疫ロゼット形成本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、全末梢血からのＣＤ４^＋Ｔ細
胞の濃縮を例示する。テトラマー抗体複合体の２種のＣＤ４Ｔ細胞濃縮カクテル
を調製した。１つのカクテルは、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、およ
びＣＤ５６に対する抗体を含有した。もう一方のカクテルは、ＣＤ８、ＣＤ１６
、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、およびＩｇＥに対する抗体を含有した。表６
に示した結果は、本発明の方法が回収率４６％で、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の純度９３％
をもたらし、かつ濃縮カクテルに抗ＩｇＥを添加することで、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の
純度が向上することを示す。

【００５９】実施例９Ｂ細胞の濃縮フィコールを用いる免疫ロゼット形成本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、全末梢血からのＢ細胞の濃縮
を例示する。テトラマー抗体複合体の２種のＢ細胞濃縮カクテルを調製した。１
つのカクテルは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３６、およびＣＤ５６に対す
る抗体を含有した。もう一方のカクテルは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３
６、ＣＤ５６、およびＩｇＥに対する抗体を含有した。表７に示した結果は、本
発明の方法が回収率４３％で、Ｂ細胞の純度８８％をもたらし、かつカクテルに
抗ＩｇＥを添加することで、Ｂ細胞の純度が向上することを示す。

【００６０】実施例１０ＮＫ細胞の濃縮−フィコールを用いる免疫ロゼット形成本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、全末梢血からのＮＫ細胞の濃
縮を例示する。テトラマー抗体複合体の２種のＮＫ細胞濃縮カクテルを調製した
。１つのカクテルは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ６６ｂ、およびＣＤ３６
に対する抗体を含有した。もう一方のカクテルは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、
ＣＤ６６ｂ、ＣＤ３６、およびＩｇＥに対する抗体を含有した。表８に示した結
果は、本発明の方法が回収率４４％で、ＮＫ細胞の純度７４％をもたらし、かつ
カクテルに抗ＩｇＥを添加することで、純度は向上するが、回収率が低下するこ
とを示す。

【００６１】実施例１１前駆細胞の濃縮本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、全臍帯血からの前駆細胞の濃
縮を例示する。テトラマー抗体複合体の２種の異なるカクテル、（ａ）ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６
、およびＣＤ６６ｂに対するテトラマー抗体複合体を含有する前駆細胞濃縮カク
テル、（ｂ）ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ６６ｂに対するテトラマー抗
体複合体を含有する減量（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）カクテルを用いた。表９に示した結果は、本発明の方法が、広範な前駆細胞濃縮カクテルの場合、
回収率５３％で、ＣＤ３４^＋細胞の純度２９％のをもたらし、４抗体減量カクテ
ルの場合、純度はわずか５％、回収率４５％となることを示す。

【００６２】実施例１２単核細胞の濃縮フィコールを用いる免疫ロゼット形成本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、全末梢血からの単核細胞の濃
縮を例示する。テトラマー抗体の単核細胞濃縮カクテルをいくつか調製した（表
１０を参照）。表１０に示した結果は、本発明の方法がＣＤ１４^＋の回収率６５
％で、ＣＤ１４^＋細胞の純度７６％をもたらし、抗ＣＤ８または抗ＩｇＥの添加
は単核細胞の純度を向上させたが、抗ＣＤ８とＩｇＥ両方の添加は付加的な効果
を有さなかったことを示す。

【００６３】実施例１３非造血腫瘍細胞の濃縮本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、全末梢血からの乳癌細胞の濃
縮を例示する。ＣＡＭＡ乳癌細胞系統由来の細胞を、頻度１／１０^３、１／１０ ^４、および１／１０^５で全末梢血の試料に接種した。テトラマー抗体複合体の３
種の腫瘍細胞濃縮カクテルを調製した。このカクテルの抗体組成を表１１に記載
する。表１２に示した結果は、本発明の方法が、腫瘍細胞の回収率２０〜５０％
で、２ｌｏｇを超える腫瘍細胞の濃縮をもたらすことを示す。より広範なカクテ
ルは、より高度の腫瘍細胞の濃縮をもたらす。

【００６４】実施例１４Ｔ細胞の濃縮−抗ＣＤ３６による抗ＣＤ１４代替の効果本実施例は、抗ＣＤ１４を抗ＣＤ３６に変えて濃縮カクテルを変更したとき、
実施例２に記載した方法を用いる全末梢血からのＴ細胞の濃縮が向上することを
例示する。表１３の結果は、抗体を置き換えた場合、ＣＤ３^＋の純度％が２４％
増加することを示している。

【００６５】実施例１５ヘタスターチ沈降を用いる特定細胞集団の濃縮本実施例は、実施例３に記載した方法を用いる、全末梢血からの多様な細胞集
団の濃縮を例示する。ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、およびＣＤ５６に対する抗体を含有するテト
ラマー抗体複合体のＴ細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回収率６
０％で、９５％を超えるＴ細胞の純度をもたらす。ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３６、およびＣＤ５６に対する抗体を含有す
るテトラマー抗体複合体のＢ細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回
収率３９％で、Ｂ細胞の純度７５％をもたらす。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ３６、およびＣＤ６６ｂに対する抗体を含有
するテトラマー抗体複合体のＮＫ細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は
、回収率２７％で、ＮＫ細胞の純度６５％をもたらす。

【００６６】実施例１６ヘタスターチ／イオジキサノール混合物を用いる特定細胞集団の濃縮本実施例は、実施例４に記載した方法を用いる、全末梢血からの多様な細胞集
団の濃縮を例示する。表１４に記載した結果を以下に要約する。ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、およびＣＤ５６に対する抗体を含有するテト
ラマー抗体複合体のＴ細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回収率６
１％で、Ｔ細胞の純度９５％をもたらす。ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、およびＣＤ５６に対する抗体を含有
するテトラマー抗体複合体のＣＤ４^＋Ｔ細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の
方法は、回収率６４％で、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の純度８９％をもたらす。ＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、およびＣＤ５６に対する抗体を含有
するテトラマー抗体複合体のＣＤ８^＋Ｔ細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の
方法は、回収率４３％で、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の純度８０％をもたらす。ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３６、およびＣＤ５６に対する抗体を含有す
るテトラマー抗体複合体のＢ細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回
収率５８％で、Ｂ細胞の純度８４％をもたらす。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ３６、およびＣＤ６６ｂに対する抗体を含有
するテトラマー抗体複合体のＮＫ細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は
、回収率５０％で、ＮＫ細胞の純度８０％をもたらす。

【００６７】実施例１７異なる成層媒質を用いる免疫ロゼット形成本実施例は、段階４のフィコールハイペークを異なる媒質に替えることによっ
て、実施例２の方法を変更できることを例示する。フィコールの密度は１．０７
７ｇ／ｍｌ、オスモル濃度は約３００ｍＯｓｍであった。パーコールとイオジキ
サノールの溶液を、密度１．０８５ｇ／ｍｌ、オスモル濃度は２８０ｍＯｓｍで
調製した。ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３６、およびＣＤ５６に対する抗体
複合体を含有するＢ細胞濃縮カクテルを調製した。表１５に示した２つの別の試料に関するＢ細胞濃縮の結果は、より高い密度の
別の成層媒質を使用することによって、Ｂ細胞の純度を低下させることなく、Ｂ
細胞の回収率を増大できることを示す。

【００６８】実施例１８免疫ロゼットを用いるＴ細胞の駆逐本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、全末梢血からのＴ細胞の除去
を例示する。ＣＤ３に対するテトラマー抗体複合体のＴ細胞駆逐カクテルを調製
した。本発明の方法は、２．３ｌｏｇでＣＤ３^＋細胞の枯渇をもたらした。

【００６９】実施例１９免疫ロゼットを用いるＢ細胞の駆逐本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、全末梢血からのＢ細胞の除去
を例示する。ＣＤ１９に対するテトラマー抗体複合体のＢ細胞駆逐カクテルを調
製した。本発明の方法は、３．０ｌｏｇでＣＤ１９^＋細胞の枯渇をもたらした。

【００７０】実施例２０免疫ロゼット形成を用いる乳癌細胞の駆逐本実施例は、実施例２に記載した方法を用いる、１〜５％ＣＡＭＡ乳癌細胞を
接種した全末梢血からの乳癌細胞の除去を例示する。抗乳癌抗体５Ｅ１１、およ
びＢＲＳＴ１を含有するテトラマー抗体複合体の駆逐カクテルを調製した。表１
６に示した結果は、本発明の方法が１．０〜１．４ｌｏｇで乳癌細胞の枯渇をも
たらすことを示す。

【００７１】実施例２１あらかじめ保存された全末梢血からの顆粒細胞の除去全末梢血試料中の顆粒細胞の密度は、２４時間を超える保存によって減少する
。新鮮全血から赤血球と顆粒細胞を除去するために通例用いられる密度分離方法
は、保存された血液試料からは有効に顆粒細胞を除去しない。保存顆粒細胞の沈
降速度を、免疫ロゼット形成によって、標準フィコール密度分離（１．０７７ｇ
／ｍｌ）で有効に除去できるように増大することができる。本実施例は、実施例
２に記載した方法を用いる、保存（４８時間）全末梢血からの顆粒細胞の除去を
例示する。ＣＤ６６ｂに対するテトラマー抗体複合体を含有する顆粒細胞枯渇カ
クテルを調製した。表１７に示した結果は、本発明の方法が１．８〜２．６ｌｏ
ｇの顆粒細胞の枯渇をもたらすことを示す。

【００７２】実施例２２免疫ロゼット形成を用いる特定細胞集団のポジティブ選択本実施例は、実施例５に記載したポジティブ選択方法を用いる、全末梢血から
のＣＤ８^＋の濃縮を例示する。ＣＤ８に対するテトラマー抗体複合体を調製した
。本発明の方法はＣＤ８^＋の濃縮をもたらし、単核細胞分画％は最初の２５％か
らペレット中の３２％となる。

【００７３】現在好ましいとみなされる実施例に関して本発明を述べたが、本発明は開示さ
れた実施例に限定されないものであると理解される。それとは反対に、本発明は
添付される請求の範囲の精神および範囲内に包含される多様な修正、および同等
の翻案を含むことを意図する。

【００７４】すべての出版物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の出版物、特許、ま
たは特許出願が、完全な形で参照により組み込まれると明確かつ個別に指示され
た場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。表４表５表６表７表８表９表１０表１１表１２表１３表１４表１５表１６表１７本明細書で参照した参考文献のリスト 1. Braun等、N.Engl.J.Med.、342:525:533 2. M.B.Brenner 、I.S.Trowbridge、J.L.Strominger、1985年、Cell 40:183〜1
90 3. W.B.De Lau、A.E.Van Loon、K.Heije、D.Valerio、B.J.Bast、1989年、J.Im
munol.Methods、117:1〜8 4. E.A.deWynter等、1975年、Stem Cells、Vol.13:524〜532 5. Firat等、1988年、Bone Marrow Transplantation、Vol.21:933〜938 6. M.J.Glennie、H.M.McBride、A.T.Worth、G.T.Stevenson、1987年、J.Immuno
l.139:2367〜2375 7. P.Holliger、T.Prospero、G.Winter、1993年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90
:6444〜6448 8. C.Horrocks、M.Fairhurst、およびT.Thomas、1998年、Blood.Vol.92、25A頁
9. L.Karawajew、B.Micheel、O.Behrsing、M.Gaestel、1987年、J.Immunol.Met
hods 96:265〜270 10. S.A.Kostelny、M.S.Cole、J.Y.Tso、1992年、J.Immunol.148:1547〜1553 11. Kohler、およびMilstein、1975年、Nature 256、495〜497 12. C.Milstein、A.C.Cuello、1983年、Nature、305:537〜540 13. O.Nolan、O.R.Kennedy、1990年、Biochem.Biophys.Acta、1040:1〜11 14. Perez等、1985年、Nature 316:354 15. Rheinnecker等、1996年、J.Immunol.157:2989〜2997 16. E.J.Shpall等、1994年、J.of Clinical Oncology 12:28〜36 17. Slaper-Cortenbach、C.M.Ineke等、1990年、Exp.Hematol.18:49〜54 18. Staerz、およびBevan、1986年、PNAS(USA)83:1453 19. Staerz、およびBevan、1986年、Immunology Today、7:241 20. Staerz等、1985年、Nature、314:628 21. T.E.Thomas、1994年、Cancer Research,Therapy and Control 4(2):119〜1
28 22. J.Van Dijk等、1989年、Int.J.Cancer 44:738〜743 23. Vaughan等、1990年、Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.9:9 24. G.Winter、C.Milstein、1991年、Nature、349:293〜299

【図面の簡単な説明】

【図１】テトラマー抗体複合体を用いて所望でない有核細胞の周囲に形成した赤血球の
ロゼットの概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／２０３，４７７ (32)優先日平成12年５月11日(2000．5．11) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ピーターズ，ケリーカナダヴィ５ヴィ１イー６ブリティッシュコロンビア，ヴァンクーバー，イーストエイティーンスアヴェニュー 228，スート 103 (72)発明者ランスドープ，ピーターカナダヴィ６アール２エックス４ブリティッシュコロンビア，ヴァンクーバー，ウエストフォーティーンスアヴェニュー 4068 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X BA25 BD39

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料
において所望の細胞を濃縮し回収するネガティブ選択方法であって、（１）所望でない細胞と赤血球とが免疫ロゼットを形成可能な条件下で、（ａ
）少なくとも１種の、所望でない細胞上の抗原に結合する抗体と、それが直接ま
たは間接的に結合している（ｂ）少なくとも１種の、赤血球に結合する抗体、と
を含む抗体組成物に試料を接触させる段階、および（２）試料から免疫ロゼットを分離して所望の細胞が濃縮された試料を得る段
階を含む方法。
【請求項２】段階（２）において免疫ロゼットが密度分離によって分離さ
れる請求項１に記載の方法。
【請求項３】段階（２）において免疫ロゼットが沈降によって分離される
請求項１に記載の方法。
【請求項４】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３およ
び／またはＣＤ５、（２）ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣＤ
２１および／またはＣＤ２２および／またはＣＤ２４、ならびに（３）ＣＤ６６
ｂおよび／またはＣＤ１６に結合することのできる抗体を含む、単核細胞を濃縮
し回収するための請求項１に記載の方法。
【請求項５】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６および／またはＣＤ８を含む
請求項４に記載の方法。
【請求項６】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３およ
び／または、ＣＤ４およびＣＤ８の両方、（２）ＣＤ１６および／またはＣＤ６
６ｂおよび／またはＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１５、ならびに（３）ＣＤ３
６および／またはＣＤ１４に結合することのできる抗体を含む、Ｂ細胞を濃縮し
回収するための請求項１に記載の方法。
【請求項７】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項６に記載の方法
。
【請求項８】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ１６および／またはＣＤ６６
ｂおよび／またはＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１５、（２）ＣＤ１９および／
またはＣＤ２０および／またはＣＤ２１および／またはＣＤ２２および／または
ＣＤ２４および／またはＩｇ、ならびに（３）ＣＤ３６および／またはＣＤ１４
に結合することのできる抗体を含む、Ｔ細胞を濃縮および回収するための請求項
１に記載の方法。
【請求項９】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項８に記載の方法
。
【請求項１０】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ８、（２）ＣＤ１６および
／またはＣＤ６６ｂおよび／またはＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１５、（３）
ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣＤ２１および／またはＣＤ２
２および／またはＣＤ２４および／またはＩｇ、ならびに（４）ＣＤ３６および
／またはＣＤ１４に結合することのできる抗体を含む、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を濃縮し
回収するための請求項１に記載の方法。
【請求項１１】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項１０に記載の
方法。
【請求項１２】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ４、（２）ＣＤ１６および
／またはＣＤ６６ｂおよび／またはＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１５、（３）
ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣＤ２１および／またはＣＤ２
２および／またはＣＤ２４および／またはＩｇ、ならびに（４）ＣＤ３６および
／またはＣＤ１４に結合することのできる抗体を含む、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を濃縮し
回収するための請求項１に記載の方法。
【請求項１３】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項１２に記載の
方法。
【請求項１４】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ３、（２）ＣＤ６６ｂおよ
び／またはＣＤ１５、（３）ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣ
Ｄ２１および／またはＣＤ２２および／またはＣＤ２４、ならびに（４）ＣＤ３
６および／またはＣＤ１４に結合することのできる抗体を含む、ＮＫ細胞を濃縮
し回収するための請求項１に記載の方法。
【請求項１５】抗体（ａ）が、さらにＣＤ４を含む請求項１４に記載の方
法。
【請求項１６】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ３、（２）ＣＤ２、（３）
ＣＤ１４、（４）ＣＤ１５、（５）ＣＤ１６、（６）ＣＤ１９、（７）ＣＤ２４
、（８）ＣＤ３４、（９）ＣＤ３６、（１０）ＣＤ５６、および（１１）ＣＤ４
５ＲＡに結合することのできる抗体を含む、好塩基性細胞を濃縮し回収するため
の請求項１に記載の方法。
【請求項１７】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ３、（２）ＣＤ１４、（３
）ＣＤ１６、（４）ＣＤ１９、（５）ＣＤ３４、（６）ＣＤ５６、および（７）
ＣＤ６６ｂに結合することのできる抗体を含む、樹状細胞を濃縮し回収するため
の請求項１に記載の方法。
【請求項１８】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３、
（２）ＣＤ１６および／またはＣＤ６６ｂ、（３）ＣＤ１９および／またはＣＤ
２４、ならびに（４）ＣＤ１４に結合することのできる抗体を含む、造血前駆細
胞を濃縮し回収するための請求項１に記載の方法。
【請求項１９】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項１８に記載の
方法。
【請求項２０】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３、
（２）ＣＤ１６および／またはＣＤ６６ｂ、（３）ＣＤ１９および／またはＣＤ
２４、（４）ＣＤ１４、（５）ＣＤ４５ＲＡ、（６）ＣＤ３３、ならびに（７）
ＣＤ１０に結合することのできる抗体を含む、赤血球前駆細胞を濃縮し回収する
ための請求項１に記載の方法。
【請求項２１】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項２０に記載の
方法。
【請求項２２】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３、
（２）ＣＤ１６および／またはＣＤ６６ｂ、（３）ＣＤ１９および／またはＣＤ
２４、ならびに（４）ＣＤ１４、（５）ＣＤ７１、ならびに（６）ＣＤ１０に結
合することのできる抗体を含む、骨髄前駆細胞を濃縮し回収するための請求項１
に記載の方法。
【請求項２３】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項２２に記載の
方法。
【請求項２４】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３、
（２）ＣＤ１６および／またはＣＤ６６ｂ、（３）ＣＤ１９および／またはＣＤ
２４、ならびに（４）ＣＤ１４、（５）ＣＤ４５ＲＡ、ならびに（６）ＣＤ１０
に結合することのできる抗体を含む、巨核球前駆細胞を濃縮し回収するための請
求項１に記載の方法。
【請求項２５】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項２４に記載の
方法。
【請求項２６】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ４５、および（２）ＣＤ６
６ｂに結合することのできる抗体を含む、非造血腫瘍細胞を濃縮し回収するため
の請求項１に記載の方法。
【請求項２７】抗体（ａ）が、さらにＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ
３６、およびＣＤ３８を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ４５、および（２）ＣＤ６
６ｂに結合することのできる抗体を含む、上皮腫瘍細胞を濃縮し回収するための
請求項１に記載の方法。
【請求項２９】抗体（ａ）が、さらにＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ
３６およびＣＤ３８を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】抗体（ａ）が、抗原ＣＤ６６ｂ、またはＣＤ６６ａｂｃｅ
に結合することのできる抗体を含む、顆粒細胞を含有する試料から単核細胞を濃
縮し回収するための請求項１に記載の方法。
【請求項３１】試料が保存された全血または臍帯血である請求項３０に記
載の方法。
【請求項３２】試料中の顆粒細胞の密度が、新鮮血液からの顆粒細胞の密
度よりも低い請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】抗体組成物が、（ａ）所望でない細胞上の抗原に結合する
抗体、（ｂ）赤血球に結合する抗体、ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）で定義
された抗体のＦｃ部分に結合する２種の抗体を含み、（ａ）および（ｂ）の抗体
が同一の動物種の抗体であり、（ｃ）の抗体が（ａ）および（ｂ）の抗体と異な
る動物種の抗体であるテトラマー抗体複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】（ａ）少なくとも１種の、所望でない細胞上の抗原に結合
する抗体と、それが直接または間接的に結合している（ｂ）少なくとも１種の、
赤血球に結合する抗体とを含む、所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を
含有する試料において所望の細胞を濃縮し回収するための抗体組成物。
【請求項３５】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３お
よび／またはＣＤ５、（２）ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣ
Ｄ２１および／またはＣＤ２２および／またはＣＤ２４、ならびに（３）ＣＤ６
６ｂおよび／またはＣＤ１６に結合することのできる抗体を含む、単核細胞を濃
縮し回収するための請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６および／またはＣＤ８を含
む請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３お
よび／または、ＣＤ４およびＣＤ８の両方、（２）ＣＤ１６および／またはＣＤ
６６ｂおよび／またはＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１５、ならびに（３）ＣＤ
３６および／またはＣＤ１４に結合することのできる抗体を含む、Ｂ細胞を濃縮
し回収するための請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項３７に記載の
組成物。
【請求項３９】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ１６および／またはＣＤ６
６ｂおよび／またはＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１５、（２）ＣＤ１９および
／またはＣＤ２０および／またはＣＤ２１および／またはＣＤ２２および／また
はＣＤ２４および／またはＩｇ、ならびに（３）ＣＤ３６および／またはＣＤ１
４に結合することのできる抗体を含む、Ｔ細胞を濃縮し回収するための請求項３
４に記載の組成物。
【請求項４０】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項３９に記載の
組成物。
【請求項４１】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ８、（２）ＣＤ１６および
／またはＣＤ６６ｂおよび／またはＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１５、（３）
ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣＤ２１および／またはＣＤ２
２および／またはＣＤ２４および／またはＩｇ、ならびに（４）ＣＤ３６および
／またはＣＤ１４に結合することのできる抗体を含む、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を濃縮し
回収するための請求項３４に記載の組成物。
【請求項４２】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項４１に記載の
組成物。
【請求項４３】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ４、（２）ＣＤ１６および
／またはＣＤ６６ｂおよび／またはＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１５、（３）
ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣＤ２１および／またはＣＤ２
２および／またはＣＤ２４および／またはＩｇ、ならびに（４）ＣＤ３６および
／またはＣＤ１４に結合することのできる抗体を含む、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を濃縮し
回収するための請求項３４に記載の組成物。
【請求項４４】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項４３に記載の
組成物。
【請求項４５】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ３、（２）ＣＤ６６ｂおよ
び／またはＣＤ１５、（３）ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣ
Ｄ２１および／またはＣＤ２２および／またはＣＤ２４、ならびに（４）ＣＤ３
６および／またはＣＤ１４に結合することのできる抗体を含む、ＮＫ細胞を濃縮
し回収するための請求項３４に記載の組成物。
【請求項４６】抗体（ａ）が、さらにＣＤ４を含む請求項４５に記載の組
成物。
【請求項４７】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ３、（２）ＣＤ２、（３）
ＣＤ１４、（４）ＣＤ１５、（５）ＣＤ１６、（６）ＣＤ１９、（７）ＣＤ２４
、（８）ＣＤ３４、（９）ＣＤ３６、（１０）ＣＤ５６、および（１１）ＣＤ４
５ＲＡに結合することのできる抗体を含む、好塩基性細胞を濃縮し回収するため
の請求項３４に記載の組成物。
【請求項４８】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ３、（２）ＣＤ１４、（３
）ＣＤ１６、（４）ＣＤ１９、（５）ＣＤ３４、（６）ＣＤ５６、および（７）
ＣＤ６６ｂに結合することのできる抗体を含む、樹状細胞を濃縮し回収するため
の請求項３４に記載の組成物。
【請求項４９】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３、
（２）ＣＤ１６および／またはＣＤ６６ｂ、（３）ＣＤ１９および／またはＣＤ
２４、ならびに（４）ＣＤ１４に結合することのできる抗体を含む、造血前駆細
胞を濃縮し回収するための請求項３４に記載の組成物。
【請求項５０】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項４９に記載の
組成物。
【請求項５１】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３、
（２）ＣＤ１６および／またはＣＤ６６ｂ、（３）ＣＤ１９および／またはＣＤ
２４、（４）ＣＤ１４、（５）ＣＤ４５ＲＡ、（６）ＣＤ３３、ならびに（７）
ＣＤ１０に結合することのできる抗体を含む、赤血球前駆細胞を濃縮し回収する
ための請求項３４に記載の組成物。
【請求項５２】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項５１に記載の
組成物。
【請求項５３】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３、
（２）ＣＤ１６および／またはＣＤ６６ｂ、（３）ＣＤ１９および／またはＣＤ
２４、ならびに（４）ＣＤ１４、（５）ＣＤ７１、ならびに（６）ＣＤ１０に結
合することのできる抗体を含む、骨髄前駆細胞を濃縮し回収するための請求項３
４に記載の組成物。
【請求項５４】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項５３に記載の
組成物。
【請求項５５】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ２および／またはＣＤ３、
（２）ＣＤ１６および／またはＣＤ６６ｂ、（３）ＣＤ１９および／またはＣＤ
２４、ならびに（４）ＣＤ１４、（５）ＣＤ４５ＲＡ、ならびに（６）ＣＤ１０
に結合することのできる抗体を含む、巨核球前駆細胞を濃縮し回収するための請
求項３４に記載の組成物。
【請求項５６】抗体（ａ）が、さらにＣＤ５６を含む請求項５５に記載の
組成物。
【請求項５７】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ４５、および（２）ＣＤ６
６ｂに結合することのできる抗体を含む、非造血腫瘍細胞を濃縮し回収するため
の請求項３４に記載の組成物。
【請求項５８】抗体（ａ）が、さらにＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ
３６、およびＣＤ３８を含む請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】抗体（ａ）が、抗原（１）ＣＤ４５、および（２）ＣＤ６
６ｂに結合することのできる抗体を含む、上皮腫瘍細胞を濃縮し回収するための
請求項３４に記載の組成物。
【請求項６０】抗体（ａ）が、さらにＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ
３６、およびＣＤ３８を含む請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】抗体（ａ）が、抗原ＣＤ６６ｂ、またはＣＤ６６ａｂｃｅ
に結合することのできる抗体を含む、顆粒細胞を含有する試料から単核細胞を濃
縮し回収するための請求項３４に記載の組成物。
【請求項６２】有核細胞と赤血球を含む試料から有核細胞を分離する方法
であって、（１）（ａ）少なくとも１種の、分離されるべき有核細胞上の抗原に結合する
抗体と、その抗体が直接または間接的に結合している（ｂ）少なくとも１種の、
赤血球に結合する抗体、とを含む抗体組成物に、有核細胞と赤血球とが免疫ロゼ
ットを形成可能な条件下で試料を接触させる段階、および（２）試料の残部と免疫ロゼットを分離する段階を含む方法。
【請求項６３】抗体組成物が二価抗体を含み、有核細胞に結合する抗体が
、赤血球に結合する抗体に直接結合している請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】（ａ）有核細胞上の抗原に結合する抗体、（ｂ）赤血球に
結合する抗体、ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）で定義された抗体のＦｃ部分
に結合する２種の抗体を含み、（ａ）および（ｂ）の抗体が同一の動物種の抗体
であり、（ｃ）の抗体が（ａ）および（ｂ）の抗体と異なる動物種の抗体である
テトラマー抗体複合体を、抗体組成物が含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】有核細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単核
細胞、好塩基性細胞、樹状細胞、プラスマ細胞、マスト細胞、造血前駆細胞、造
血幹細胞、前駆細胞、および腫瘍細胞からなるグループから選択される請求項６
２に記載の方法。
【請求項６６】赤血球に結合する抗体が、抗グリコフォリンＡ抗体である
請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】さらに（３）免疫ロゼット中の赤血球を溶解して細胞を単
離する段階を含む請求項６２に記載の方法。