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JP2003501010A - ノミ頭部、神経索、後腸及びマルピーギ管の核酸分子、蛋白質及びそれらの使用方法 - Google Patents

ノミ頭部、神経索、後腸及びマルピーギ管の核酸分子、蛋白質及びそれらの使用方法

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JP2003501010A
JP2003501010A JP2000611562A JP2000611562A JP2003501010A JP 2003501010 A JP2003501010 A JP 2003501010A JP 2000611562 A JP2000611562 A JP 2000611562A JP 2000611562 A JP2000611562 A JP 2000611562A JP 2003501010 A JP2003501010 A JP 2003501010A
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nucleic acid
sequence
protein
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ジェイ． ゲインズ、パトリック
ティ． スティンチコーム、ダン
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ヘスカ コーポレイション
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ノミ頭部、神経索、後腸及びマルピーギ管蛋白質、そのようなノミ頭部、神経索、後腸及びマルピーギ管蛋白質をコードする核酸分子を含めたノミ頭部、神経索、後腸及びマルピーギ管核酸分子、そのようなノミ頭部、神経索、後腸及びマルピーギ管蛋白質に対して作製した抗体、及びノミ頭部、神経索、後腸及びマルピーギ管蛋白質の活性を阻害する化合物に関する。また本発明は、そのような蛋白質、核酸分子、抗体、及び阻害化合物を得るための方法も包含する。さらに本発明は、蛋白質、核酸分子、又は本発明の蛋白質由来の阻害化合物を含有する治療組成物と、動物をノミ侵襲から保護するためのその治療組成物の使用方法も包含する。また本発明は、阻害化合物を得るためのノミ頭部、神経索、後腸及びマルピーギ管蛋白質の使用方法も包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の属する技術分野） 本発明は、ノミの頭部及び神経索から単離された核酸分子、ノミの後腸及びマ
ルピーギ管から単離された核酸分子、そのような核酸分子によってコードされた
蛋白質、そのような蛋白質に対して作製された抗体、並びにそのような蛋白質の
阻害剤に関する。本発明はまた、そのような核酸分子、蛋白質、抗体及び／又は
他の阻害剤を含む治療組成物とその使用方法も包含する。
【０００２】 （発明の背景） ノミは様々な疾病を引き起こしたり伝染させたりすることが知られているため
、動物へのノミによる侵襲は、健康上及び経済上重要である。ノミは、アレルギ
ーを含めた様々な疾病を直接引き起こすが、さらには、内部寄生虫（例えば線虫
、条虫、吸虫及び原虫類）、細菌、ウイルスを含むがそれらに限定されるわけで
はない様々な伝染原を伝える。侵襲は、ペットだけでなく、家が虫によって通常
汚染されていることを発見し得るペットの所有者にとっても迷惑の元となるため
、特にノミの咬創はペットとして飼育されている動物にとって問題である。その
ため、動物上に存在する場合だけでなく、動物の一般的な環境に存在する場合に
も、ノミは問題である。
【０００３】 ノミによる咬創は、疾病の伝染につながる可能性があるだけでなく、動物に過
敏性応答を引き起こす可能性があるため、特に問題である。例えば、ノミによる
咬創は、ノミアレルギー性皮膚炎（又はノミアレルギー）（ＦＡＤ）と呼ばれる
ノミの疾病を引き起こし得る。動物中の過敏性応答は、一般に局所的な組織の炎
症と損傷を起こす。これは、動物を非常に不快にする。
【０００４】 ノミ侵襲の医学的重要性から、ノミ侵襲をコントロールし得る試薬の開発が刺
激されている。ノミ侵襲をコントロールするためのよく見られる方法は、一般に
殺虫剤の使用に集中している。そのような製品のうちのいくつかは効験があるが
、大部分はせいぜい、非常に限られた持続時間の保護を与えるにすぎない。更に
、方法の多くは、ノミの個体数の減少に成功しない。特に、殺虫剤は、シャンプ
ー、パウダー、首輪、スプレー、スポットオン製剤、噴霧器、及び液体浴用トリ
ートメント（つまり浸液）にそのような殺虫剤を加えることによって、動物のノ
ミ侵襲を防ぐために使用されている。ペットのノミ侵襲を減少させることは以下
の１以上の理由から不成功に終わっていた。すなわち、所有者のコンプライアン
スの不足（頻繁な投与が必要）、殺虫剤製品又は投与手段へのペットの行動的又
は生理学的不耐性、及び殺虫剤の規定用量に耐性なノミ個体群の出現である。
【０００５】 従って、動物をノミ侵襲から保護する試薬及び方法を開発する必要がある。 （発明の概要） 本発明は、ノミ侵襲から動物を保護する新規な生産物及び方法に関する。 本発明は、ノミ頭部及び神経索（ＨＮＣ）蛋白質、及びノミ後腸及びマルピー
ギ管（ＨＭＴ）蛋白質、ノミＨＮＣ蛋白質及びノミＨＭＴ蛋白質をコードする核
酸分子、そのような蛋白質に対して作製された抗体（即ち、抗ノミＨＮＣ抗体及
び抗ノミＨＭＴ抗体）、そのような蛋白質又は抗体の模倣分子、並びにノミＨＮ
Ｃ又はＨＭＴ活性を阻害する化合物（即ち、阻害化合物又は阻害剤）を提供する
。
【０００６】 本発明は、さらにそのような蛋白質、模倣分子、核酸分子、抗体及び阻害化合
物を得る方法を包含する。本発明は、そのような阻害化合物を同定するための蛋
白質及び抗体の使用方法と、そのような阻害化合物を同定するためのキットも包
含する。さらに本発明は、本発明の蛋白質に由来するＨＮＣ及び／又はＨＭＴ蛋
白質の活性を阻害する保護化合物を含めた、本発明の蛋白質、模倣分子、核酸分
子、抗体及び阻害化合物を含有する治療組成物を包含する。また、ノミ侵襲を減
少させるそのような治療用化合物の使用方法も包含する。
【０００７】 本発明の１実施態様は、以下の配列番号を有する核酸配列と約３０％以下の塩
基対誤対合を許容する条件下でハイブリッド形成する単離核酸分子である：配列
番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列
番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番
号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号
２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３
３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０
、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、
配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号
１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５、
配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１８５９、配列番
号１８６０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番号１８６４、配列番
号１８６６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番号１８７０、配列番
号１８７１、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番号１８７５、配列番
号１８７６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８０、配列番
号１８８１、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番号１８８５、配列番
号１８８６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番号１８９０、配列番
号１８９１、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番号１８９４、配列番
号１８９５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番号１８９９、配列番
号１９００、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９０４、配列番
号１９０５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番号１９０８、配列番
号１９０９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番号１９１２、配列番
号１９１３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番号１９１７、配列番
号１９１８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番号１９２２、配列番
号１９２３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番号１９２７、配列番
号１９２８、配列番号１９２９及び／又は配列番号１９３１。本発明の別の実施
態様は、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ及び／又は表ＩＶの核酸配列若しくは表Ｉ、表
ＩＩ、表ＩＩＩ及び／又は表ＩＶの核酸配列と相補的な核酸配列から成る群から
選択された核酸分子と約３０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下でハイブリ
ッド形成する単離核酸分子である。
【０００８】 本発明の別の実施態様は、以下の配列と約７０％以上相同な核酸配列を有する
単離核酸分子である：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列
番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１
５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２
、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、
配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配
列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列
番号４６、配列番号４８、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、
配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号
１６４、配列番号１６５、配列番号、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番
号１８５９、配列番号１８６０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番
号１８６４、配列番号１８６６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番
号１８７０、配列番号１８７１、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番
号１８７５、配列番号１８７６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番
号１８８０、配列番号１８８１、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番
号１８８５、配列番号１８８６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番
号１８９０、配列番号１８９１、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番
号１８９４、配列番号１８９５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番
号１８９９、配列番号１９００、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番
号１９０４、配列番号１９０５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番
号１９０８、配列番号１９０９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番
号１９１２、配列番号１９１３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番
号１９１７、配列番号１９１８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番
号１９２２、配列番号１９２３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番
号１９２７、配列番号１９２８、配列番号１９２９及び／又は配列番号１９３１
、並びに／若しくは表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ及び／又は表ＩＶの核酸配列、若し
くはそれらの相補的配列。
【０００９】 また、本発明は、本発明の核酸分子を有する組換え分子、組換えウイルス及び
組換え細胞に関する。そのような核酸分子、組換え分子、組換えウイルス及び組
換え細胞を生産する方法も包含される。
【００１０】 本発明の別の実施態様は、以下の配列から成る群より選択されたアミノ酸配列
と約７０％以上相同な単離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質を包含する：配列
番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３
２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号１５４、配列番号１６０、配列番号
１６３、配列番号１６９、配列番号１８６２、配列番号１８６８、配列番号１８
７３、配列番号１８７９、配列番号１８８３、配列番号１８８８、配列番号１８
９７、配列番号１９０２、配列番号１９１５、配列番号１９２０、配列番号１９
２５、及び／又は配列番号１９３０、並びに／若しくは表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ
及び／又は表ＩＶの核酸配列によってコードされたアミノ酸配列、及びそれらの
フラグメント。このフラグメントは、各ノミ蛋白質に対する免疫応答を誘発する
か、各ノミ蛋白質に匹敵する活性を有する。
【００１１】 本発明の別の実施態様は、以下の配列を有する核酸配列の相補的配列と約３０
％以下の塩基対誤対合を許容する条件下でハイブリッド形成する核酸分子によっ
てコードされた単離蛋白質を包含する：配列番号１、配列番号４、配列番号７、
配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配
列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列
番号４０、配列番号４３、配列番号４６、配列番号１５３、配列番号１５６、配
列番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１６８、配列番号１
８５９、配列番号１８６１、配列番号１８６４、配列番号１８６７、配列番号１
８７０、配列番号１８７２、配列番号１８７５、配列番号１８７７、配列番号１
８７８、配列番号１８８１、配列番号１８８２、配列番号１８８５、配列番号１
８８７、配列番号１８９０、配列番号１８９２、配列番号１８９４、配列番号１
８９６、配列番号１８９９、配列番号１９０１、配列番号１９０４、配列番号１
９０６、配列番号１９０８、配列番号１９１０、配列番号１９１２、配列番号１
９１４、配列番号１９１７、配列番号１９１９、配列番号１９２２、配列番号１
９２４、配列番号１９２７及び／又は配列番号１９２９、並びに／若しくは表Ｉ
、表ＩＩ、表ＩＩＩ及び／又は表ＩＶの核酸配列。
【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ノミの頭部及び／又は神経索から単離された核酸分子、ノミの後腸
及び／又はマルピーギ管から単離された核酸分子、そのような核酸分子によって
コードされた蛋白質、そのような蛋白質に対して作製された抗体、及びそのよう
な蛋白質の阻害剤を提供する。本明細書で使用する場合、ノミの頭部及び／又は
神経索から単離された核酸分子と、そのような核酸分子によってコードされた蛋
白質は、ノミＨＮＣ核酸分子又はＨＮＣ蛋白質と各々称され、ノミの後腸及び／
又はマルピーギ管から単離された核酸分子と、そのような、核酸分子によってコ
ードされた蛋白質は、ノミＨＭＴ核酸分子又はＨＭＴ蛋白質と各々称される。本
発明のＨＮＣ核酸分子及びＨＭＴ核酸分子は、ノミＨＮＣ組織及びＨＭＴ組織で
主として各々発現されるが、ＨＮＣとＨＭＴ以外のノミ組織に由来した細胞でも
発現することが可能である。本発明のＨＮＣ及びＨＭＴの核酸分子及び蛋白質は
、ノミから単離してもよいし、組換え又は合成により調製してもよい。本発明の
ＨＭＴ及びＨＮＣ核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡである。核酸分子の例としては
、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、ゲノムＤＮＡ分子、合成ＤＮＡ分子、ＨＭＴ
及びＨＮＣ組織由来の伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）用の特定タグであるＤＮＡ分子、
及び対応するｍＲＮＡ分子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書で使用する場合、「ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質」及び「ＨＭＴ及び
ＨＮＣ蛋白質」という語句は、ノミＨＭＴ組織によって、ノミＨＮＣ組織によっ
て、又はノミＨＭＴ組織とＨＮＣ組織の両方によって発現された蛋白質のことを
指す。本明細書で使用する場合、「ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子」及び「Ｈ
ＭＴ及びＨＮＣ核酸分子」という語句は、ＨＭＴ ｃＤＮＡライブラリ、ＨＮＣ
ｃＤＮＡライブラリ、又は両方のライブラリから単離することが可能な核酸分
子若しくはそれに対応する遺伝子のことを指す。
【００１３】 本発明は、以下のノミ蛋白質の１つ以上をコードする部分長又は完全長のコー
ド領域を有する核酸分子を提供する：アラントイナーゼ（ＡＬＮ）蛋白質、キチ
ン結合蛋白質（ＣＢＰ）蛋白質、ナトリウム／カリウムＡＴＰアーゼベータサブ
ユニット（ＮＫＡＢ）蛋白質、リガンドゲート塩化物チャネル（ＬＧＩＣ）蛋白
質、ＡＮＯＮ／２３ＤＡ（ＡＮＯＮ）蛋白質、マルボリオ（ＭＡＬＶ）蛋白質、
嗅覚物質結合蛋白質様蛋白質（odorant-binding-protein-like（ＯＳ−Ｄ）prot
ein ）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体関連（ＮＭＤＡ）蛋白質、化学
感覚関連脂肪親和性リガンド結合蛋白質様（ＣＬＢＦ）蛋白質、ナトリウム／水
素輸送体様（ＮＡＨ）蛋白質、塩化物細胞内チャネル様（ＣＬＩＣ）蛋白質、ペ
リトロフィン様（ＰＬ２）蛋白質、ペリトロフィン様（ＰＬ３）蛋白質、ペリト
ロフィン様（ＰＬ４）蛋白質、シナプス小胞２Ｂ様（ＳＶＰ）蛋白質、電圧ゲー
ト塩化物様（ＶＧＣＣ）蛋白質、無酸素症非調節蛋白質様（ＡＵＰ）蛋白質、及
び神経内分泌特異的７Ｂ２様（７Ｂ２）蛋白質。上記核酸分子を、ＡＬＮ核酸分
子、ＣＢＰ核酸分子、ＮＫＡＢ核酸分子、ＬＧＩＣ核酸分子、ＡＮＯＮ核酸分子
、ＭＡＬＶ核酸分子、ＯＳ−Ｄ核酸分子、ＮＭＤＡ核酸分子、ＣＬＢＰ核酸分子
、ＮＡＨ核酸分子、ＣＬＩＣ核酸分子、ＰＬ２核酸分子、ＰＬ３核酸分子、ＰＬ
４核酸分子、ＳＶＰ核酸分子、ＶＧＣＣ核酸分子、ＡＵＰ核酸分子、及び７Ｂ２
核酸分子とそれぞれ称し、本明細書において以下により詳細に説明する。
【００１４】 アラントイナーゼは、アラントインをアラントイン酸に変換する反応の触媒作
用に関する。これはプリン異化作用の中間段階であり、虫の場合、最終生産物と
して尿素の分泌が起こる。アラントイナーゼは、両生類の肝臓及び腎臓のペルオ
キシソーム内にある。哺乳動物がアラントインの前駆物質である尿酸を分泌する
ときの、アラントイナーゼに対する既知の哺乳類同族体は存在していない。その
ように、ノミアラントイナーゼは、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規なター
ゲットを表す。
【００１５】 キチン結合蛋白質の機能の多くは未知である。Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｇｅ
ｎＢａｎｋアクセッション番号１８４１８５１）のキチナーゼ様蛋白質は、昆虫
キチナーゼのキチン結合ドメインと弱い類似性を持つと報告されている。しかし
ながら、該キチナーゼ様蛋白質は、既知のキチナーゼの触媒領域に対して重要な
類似点を持っていないため、キチナーゼ活性を有するとは予想されない。さらに
、Ｂ．ｍｏｒｉのキチナーゼ様蛋白質は、昆虫の囲食マトリクス（peritrophic
matrix）にある蛋白質のペリトロフィンファミリーにも類似している。これらの
蛋白質は推定キチン結合ドメインを有するが、任意の既知の蛋白質に対する他の
明らかな相同性を有していない。理論に拘束されるわけではないが、これらの蛋
白質は、キチンに結合すると共に、囲食マトリクスの構成成分であると考えられ
ている。そのように、ノミキチン結合蛋白質は、抗ノミワクチン及び化学療法剤
の新規なターゲットを表す。
【００１６】 Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼは、細胞から出るＮａ＋と細胞へ入るＫ＋の輸送に
動力を供給するＡＴＰの加水分解に関する。Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼは、原形
質膜のＮａ＋勾配を確立する責を負い、砂糖及びアミノ酸輸送、利尿、並びに神
経細胞シグナル伝達を含めた多くの機能のために細胞により使用される）。Ｎａ
＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼポンプは、１００キロダルトン（ｋＤａ）アルファ（α）
サブユニット、４０ｋＤａベータ（β）サブユニット、及び６ｋＤａガンマ（γ
）サブユニットの三量体である。大半の昆虫は、３つのアイソタイプのβサブユ
ニットを有し、それぞれが組織と細胞の種類に依存する様式で発現されている。
αサブユニットは、８回膜貫通ドメインを有するが、β及びγサブユニットは１
回を有するにすぎない。αサブユニットは、ＡＴＰアーゼとイオン輸送活性を媒
介し、γサブユニットと共に強心配糖体（ウアバイン）結合部位を構成する。β
サブユニットはポンプ活性を検知可能にするために必要になり、安定、局在化及
び陽イオン特異性決定において役割を果たすと考えられる。そのように、本発明
のノミＮＫＡＢ蛋白質は、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規なターゲットを
表す。
【００１７】 リガンドゲートイオンチャネルファミリー蛋白質は、ＧＡＢＡ、グリシン及び
グルタミン酸のような神経伝達物質の結合に応じて神経シグナルを伝えることが
示されている。ＧＡＢＡとグリシンの受容体が抑制信号を送る一方、グルタミン
酸受容体は刺激信号を送る。蛋白質のこのファミリーは神経シグナル伝達に影響
を与える多くの薬剤のターゲットであると共に、シクロジエン、ピレスロイド及
びフェニルピラゾールを含む殺虫剤のいくつかのファミリーのターゲットである
。ノーザンブロット解析は、本発明のＬＧＩＣ核酸分子に対応するｍＲＮＡが、
ＨＭＴ組織のみで発現されることを示している。これは、利尿の調節又は媒介に
おける役割を示唆している。理論に拘束されるわけではないが、蛋白質発現がｍ
ＲＮＡ発現と関連すると仮定すると、ノミＬＧＩＣは、専ら腎臓組織で発現され
ることが示されたこのファミリー受容体の第１のものを示し得る。シーケンス解
析は、ノミＬＧＩＣ蛋白質がリガンドゲートイオンチャネルの他のサブファミリ
ーとは異なり、新しいサブファミリーを意味し得ることを示す。そのように、本
発明のノミＬＧＩＣ蛋白質は、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規なターゲッ
トを表わす。
【００１８】 ＡＮＯＮ／２３ＤＡ蛋白質の機能の多くは未知である。ＡＮＯＮ／２３ＤＡ及
びＭＡＤが機能的に関連づけられるかどうかはわからないが、ＡＮＯＮ／２３Ｄ
Ａ遺伝子が、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＭＡＤ遺伝子に結合
されることが報告されている。ＡＮＯＮ／２３ＤＡは、さらにヒトの膜受容体蛋
白質ｐＨＰＳ１−２（腎機能に重要な役割を果たすロドプシン／ベータアドレナ
リン作用性受容体に類似）との機能的な類似点を有し得る。そのように、本発明
のノミＡＮＯＮ／２３ＤＡ蛋白質は、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規なタ
ーゲットを表わす。
【００１９】 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍａｌｖｏｌｉｏは、哺乳類自然耐性関連蛋白質（Ｎ
ＲＡＭＰ）と酵母Ｓｍｆ１とに対して高い配列相同性を示す。それらは、二価の
陽イオン、特にＭｎ＋＋、Ｚｎ＋＋及びＦｅ＋＋を輸送する蛋白質である。ＮＲ
ＡＭＰは、ＡＴＰアーゼ輸送体と類似しており、ＡＴＰをエネルギー源として使
用することも示されている。２つのタイプのＮＲＡＭＰ蛋白質、すなわちＮＲＡ
ＭＰ１及びＮＲＡＭＰ２がある。ＮＲＡＭＰ１はマクロファージ上でのみ発現さ
れ、微生物の細胞内での複製を防ぐ。ＮＲＡＭＰ２はマウス腸上皮を含めた、い
くつか細胞と組織の種類の中で発現される。本発明のノミマルボリオ蛋白質は、
ＮＲＡＭＰ１に最も見かけ上類似している。そのように、本発明のノミマルボリ
オ蛋白質は、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規なターゲットを表わす。
【００２０】 ＯＳ−Ｄ蛋白質の機能の多くは未知である。キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）触角ｃＤＮＡライブラリから単離
したＯＳ−Ｄ核酸分子は、脊椎動物の嗅覚物質結合蛋白質と共通な特徴を有する
蛋白質をコードし、嗅覚物質結合蛋白質とは異なる一次構造を有する。コードさ
れた蛋白質は、エジプトツチイナゴＳｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉ
ａの化学感覚器に由来の可溶性化学感覚蛋白質のファミリーに相同でもある。そ
のように、本発明のノミＯＳ−Ｄ蛋白質は、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新
規なターゲットを表わす。
【００２１】 ＮＭＤＡ受容体は、グルタミン酸ゲートイオンチャネルのサブタイプである。
グルタミン酸ゲートイオンチャネルはすべて、刺激されるとＮａ＋及びＫ＋を伝
達し、膜電位の脱分極を生じる。ＮＭＤＡ受容体は刺激時にさらにＣａ＋＋を細
胞に輸送する。これは、他のグルタミン酸ゲートイオンチャネル由来のＮＭＤＡ
受容体とは相違している。ＮＭＤＡ受容体は、グルタミン酸毒性刺激性に重要な
役割を果たし、それは焦点大脳虚血（ストローク）、パーキンソン病、ハンチン
トン舞踏病、アルツハイマー病、精神分裂病及びてんかんのような多くの神経変
性障害に関連する。細胞内Ｃａ＋＋濃度の増加が、Ｃａ＋＋依存プロテアーゼの
活性化及び無酸素ラジカルの生成を含めた細胞の代謝変化の誘導に結びつくので
、開いたＮＭＤＡチャネルでのＣａ＋＋流入が、上記疾病を媒介すると考えられ
る。そのように、本発明のノミＮＭＤＡ蛋白質は、抗ノミワクチン及び化学療法
剤の新規なターゲットを表わす。
【００２２】 本発明のＣＬＢＰ蛋白質は、ＰＢＰ／ＧＯＢＰ蛋白質（フェロモン結合蛋白質
／一般嗅覚物質結合蛋白質）のファミリーのメンバーとの配列相同性に基づくと
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのフェロモン結合蛋白質関
連蛋白質２であるＰＢＰＲＰ−２との３０％相同性と、Ｐｈｏｒｍｉａ ｒｅｇ
ｉｎａの化学感覚関連脂肪親和性リガンド結合蛋白質であるＣＳＲＬＬＢＰとほ
ぼ同じ相同性を有する）、該ファミリーの範疇に入るようである。理論によって
拘束されるわけではないが、上記蛋白質は、宿主か仲間の存在を感じる能力のよ
うな、臭い又はフェロモンの知覚に関係すると考えられている。そのように、本
発明のノミＣＬＢＰ蛋白質は、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規なターゲッ
トを表わす。
【００２３】 本発明のノミＰＬ２、ＰＬ３、ＰＬ４蛋白質を含めたペリトロフィンは、囲食
マトリクス、蛋白質から形成された無細胞膜、及び糖（最も一般的には、消化さ
れた食事内容物と腸上皮との間のバリアを形成するキチン）から成る構成成分を
含有する推定キチン結合蛋白質のファミリーである。ペリトロフィン様蛋白質も
、ショウジョウバエ胚の気管にあることが示されており、これは該蛋白質が中腸
の外側で追加の役割を有している可能性があることを示している。成虫ノミは腸
の中で囲食マトリクスを生産しないため、成虫ノミにおけるペリトロフィン様蛋
白質の機能は明らかになっていない。ペリトロフィンは、ヒツジクロバエ（Ｌｕ
ｃｉｌｉａ ｃｕｐｒｉｎａ）を含めた吸血性昆虫の免疫学的制御のターゲット
として研究されている。ヒツジクロバエにおいて、ペリトロフィンに対する抗体
の摂取により、幼虫の成長が抑制され、幼虫の死亡率が増加し得ることが示され
ている。ペリトロフィンに対する抗体の摂取により、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａ幼虫の
囲食マトリクスの浸透性が減少することも示されている。これは、次には、囲食
マトリクスを横切って腸上皮に至る消化された食物の移動を抑制し、飢餓を生じ
させる可能性がある。そのように、本発明のノミペリトロフィンは、抗ノミワク
チン及び化学療法剤の新規なターゲットを表わす。
【００２４】 一般に、電圧ゲート塩化物チャネル（ＶＧＧＣ）は、休止上皮と神経膜の電位
を維持し、筋細胞での過興奮（収縮の持続）を防止する。ショウジョウバエのマ
ルピーギ細管では、利尿ホルモンロイコキニンが細胞内カルシウムレベルを増加
させることにより星形細胞の電圧ゲート塩化物チャネルを刺激することが示され
た。本発明のノミＶＧＧＧ蛋白質配列は、カルシウムイオンによる可能な調節と
、故にロイコキニン及び利尿への可能なリンクとを示す、ＥＦハンドカルシウム
結合モチーフを含んでいる。塩化物が利尿を促進する主要な陰イオンであり、塩
化物は、利尿ペプチドに応じてルーメンに分泌されるナトリウム及びカリウム陽
イオンの中和を支援することが要求されるため、塩化物チャネルは利尿に関して
重要である。本発明のＶＧＣＣのｍＲＮＡは、成虫ノミにおけるＨＭＴ特異的で
あることが示されており、これは利尿における潜在的な役割を示している。その
ように、本発明のノミＶＧＣＣは、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規なター
ゲットを表わす。
【００２５】 塩化物チャネルのＣＬＩＣファミリーは、様々な小胞上で発現される電圧にゲ
ート塩化物チャネルであり、小胞内部のｐＨを調節するＶ−ＡＴＰアーゼポンプ
と協調して作用すると考えられている。ＣＬＩＣファミリーのメンバーも、Ｖ−
ＡＴＰアーゼポンプと共同して、原形質膜上で発現されることがやはり示されて
いる。ヒトでは、相同蛋白質が上皮組織の原形質膜上で発現されることを示され
ており、経上皮塩化物輸送における可能な役割を示唆している。また、雌牛では
、同族体チャネルに対する抗体が腎臓ミクロソーム中の全塩化物コンダクタンス
を抑制すると示された。ＣＬＩＣ遺伝子産物がＨＭＴ組織での経上皮塩化物輸送
に確かに関係する場合、それは利尿を媒介するのにおそらく重大な役割を果たす
。そのように、本発明のノミＣＬＩＣは、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規
なターゲットを表わす。
【００２６】 マルピーギ管のルーメンへ先端膜を横切るナトリウムイオンの輸送に動力を供
給するために、ＮＡＨ交換体は、該ルーメンにおいてプロトン勾配を使用する。
マルピーギ管上皮を横切るナトリウムイオンの輸送は、利尿ペプチドによって引
き起こされると共に、利尿の誘導の重大なステップである。本明細書で説明する
ノーザンブロット解析によると、ＮＡＨ ｍＲＮＡが成体において１５分間以内
にアップレギュレートされ、これは利尿における役割を有する分子と一致してい
る。多くの昆虫では、ナトリウムが、利尿を駆動する原理イオンであることを示
された。ＮＡＨ交換体は、マルピーギ管中の先端膜に位置することがわかってい
るが、後腸及び直腸に位置してもよい。もし後腸及び直腸に位置すれば、基底側
方又は先端膜に対する抗体攻撃にアクセス可能である。そのように、本発明のノ
ミＮＡＨは、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規なターゲットを表わす。
【００２７】 ＳＶＰ蛋白質は、プロトン共同輸送体の細菌ファミリー、哺乳類のプロトン／
グルコース輸送体、及び有機イオン輸送体と、構造上及び配列上の保存性を有し
ている。ＳＶＰは、内部複製から発生する１２の推定膜貫通領域を持っている。
哺乳動物では、ＳＶＰが神経小胞と内分泌小胞に置かれ、プロトン勾配を利用し
て小胞へ神経伝達物質を取り込む機能を果たすと考えられている。神経伝達物質
は、代わりに、膜上のイオンチネルの活性を調節する。マルピーギ管では、イオ
ンチャネルの活性が、利尿の割合、又は血リンパからルーメンへの流体分泌を決
定する。したがって、ＨＭＴ組織における神経伝達物質の輸送の抑制は、それら
の組織の機能に著しい効果がある可能性がある。そのように、本発明のノミＳＶ
Ｐは、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規なターゲットを表わす。
【００２８】 ノミＡＵＰ蛋白質の機能の多くは未知である。Ｃ．ｆｅｌｉｓ ＡＵＰは、キ
イロショウジョウバエの無酸素症調節遺伝子産物ｆａｕとの相同性を共有する。
キイロショウジョウバエｆａｕ遺伝子は、以前に記述されたデータベースエント
リとの相同性を有していないが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成によりショウ
ジョウバエＧＮＳのラミナ皮質のニューロンに局在し、無酸素症への過剰発現ｆ
ａｕに対して、トランスジェニックハエの損なわれた回復時間によって測定され
るような、Ｏ２欠乏に応じた重要な役割を果たす。そのように、本発明のノミＡ
ＵＰは、抗ノミワクチン及び化学療法剤の新規なターゲットを表わす。
【００２９】 ノミ７Ｂ２蛋白質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，Ｃ ｅｌｅｇａｎｓ、池に住む
巻貝であるモノアラガイＬｙｍｎａｅａ ｓｔａｇｎａｌｉｓ、及びヒトを含め
た様々な生物に由来する神経内分泌蛋白質７Ｂ２に対して、ＢＬＡＳＴ相同性を
幾分有している。７Ｂ２は、重要な神経内分泌系の前駆体プロセス用エンドプロ
テアーゼであるプロホルモンコンバーターゼ２（ＰＣ２）の活性化に関与する。
さらに、７Ｂ２は、低血糖症、高プロインスリン血症及び低グルカゴン症を示す
ヌル変異体を用いたマウスのランゲルハンス島ホルモンプロセスにおいて、重要
であることが判明した。そのように、本発明のノミ７Ｂ２は、抗ノミワクチン及
び化学療法剤の新規なターゲットを表わす。
【００３０】 Ｃ． ｆｅｌｉｓから単離された既知の長さのノミアラントイナーゼ核酸分子
は、「ｎＣｆＡＬＮ#」（例えばｎＣｆＡＬＮ2057）と表わされる。ここで、「
＃」は、その分子におけるヌクレオチドの数のことを指す。既知の長さのアラン
トイナーゼ蛋白質は、「ＰＣｆＡＬＮ#」（例えばＰＣｆＡＬＮ384）と表示され
る。ここで、「＃」は、ヌクレオチドの数のことを指す。同様に、既知の長さの
Ｃ．ｆｅｌｉｓ ＣＢＰ核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＣＢＰ#」及び「ＰＣ
ｆＣＢＰ#」とそれぞれ表わされる。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ ＮＫＡＢ核
酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＮＫＡＢ#」及び「ＰＣｆＮＫＡＢ#」とそれぞれ
表わされる。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ ＬＧＩＣ核酸分子及び蛋白質は、「
ｎＣｆＬＧＩＣ#」及び「ＰＣｆＬＧＩＣ#」とそれぞれ表わされる。既知の長さ
のＣ．ｆｅｌｉｓ ＡＮＯＮ核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＡＮＯＮ#」及び
「ＰＣｆＡＮＯＮ#」とそれぞれ表わされる。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ Ｍ
ＡＬＶ核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＭＡＬＶ#」及び「ＰＣｆＭＡＬＶ#」と
それぞれ表わされる。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ ＯＳ−Ｄ核酸分子及び蛋白
質は、「ｎＣｆＯＳＤ#」及び「ＰＣｆＯＳＤ#」とそれぞれ表される。既知の長
さのＣ．ｆｅｌｉｓ ＮＭＤＡ核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＮＭＤＡ#」及
び「ＰＣｆＮＭＤＡ#」とそれぞれ表される。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ Ｃ
ＬＢＰ核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＣＬＢＰ#」及び「ＰＣｆＣＬＢＰ」と
それぞれ表される。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ ＮＡＨ核酸分子及び蛋白質は
、「ｎＣｆＮＡＨ#」及び「ＰＣｆＮＡＨ#」とそれぞれ表される。既知の長さの
Ｃ．ｆｅｌｉｓ ＣＬＩＣ核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＣＬＩＣ#」及び「
ＰＣｆＣＬＩＣ#」とそれぞれ表される。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ ＰＬ２
核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＰＬ２#」及び「ＰＣｆＰＬ２#」とそれぞれ表
される。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ ＰＬ３核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆ
ＰＬ３#」及び「ＰＣｆＰＬ３#」とそれぞれ表される。既知の長さのＣ．ｆｅｌ
ｉｓ ＰＬ４核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＰＬ４#」及び「ＰＣｆＰＬ４#」
とそれぞれ表される。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ ＳＶＰ核酸分子及び蛋白質
は、「ｎＣｆＳＶＰ#」及び「ＰＣｆＳＶＰ#」とそれぞれ表される。既知の長さ
のＣ．ｆｅｌｉｓ ＶＧＣＣ核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＶＧＣＣ#」及び
「ＰＣｆＶＧＣＣ#」とそれぞれ表される。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ ＡＵ
Ｐ核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣｆＡＵＰ#」及び「ＰＣｆＡＵＰ#」とそれぞれ
表される。既知の長さのＣ．ｆｅｌｉｓ ７Ｂ２核酸分子及び蛋白質は、「ｎＣ
ｆ７Ｂ２#」及び「ＰＣｆ７Ｂ２#」とそれぞれ表される。
【００３１】 また、本発明は、ＨＭＴ及びＨＮＣ組織由来のｍＲＮＡ分子用の特定タグであ
るＨＭＴのＤＮＡ分子とＨＮＣのＤＮＡ分子を提供する。そのようなＤＮＡ分子
はｍＲＮＡの全部又は部分的な配列に相当し得るため、そのようなｍＲＮＡ分子
に対応するＤＮＡ分子（つまりｃＤＮＡ分子）は、全長又は部分長の蛋白質をコ
ードすることが可能である。部分長の蛋白質をコードする核酸分子は、プローブ
として直接的に使用することもできるし、対応するか又は構造的に関連する全長
蛋白質をコードするｃＤＮＡ核酸分子を同定及び／又は単離するためのプライマ
ーを生成するために間接的に使用することもできる。部分ｃＤＮＡ核酸分子も、
調節領域、エクソン及びイントロンを含めた完全な遺伝子を含む核酸分子のよう
なゲノム核酸分子を同定するために、同様の様式で使用することが可能である。
部分的ＨＭＴ及びＨＮＣ ｃＤＮＡ分子及び配列を使用して完全長の転写物及び
対応のｃＤＮＡ分子を単離する方法を、以下の実施例に説明する。
【００３２】 本発明の蛋白質及び核酸分子は、その天然源から得てもよいし、又は、例えば
組換え核酸技術又は化学合成法を使用して製造してもよい。さらに本発明には、
ノミ侵襲から動物を保護するためや、以下に開示するような他の用途における、
該蛋白質及び核酸分子と、それらの抗体及び阻害化合物の治療組成物としての使
用方法が包含される。
【００３３】 本発明のノミＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質及び核酸分子は、抗節足動物ワクチン及
び化学療法剤の新規なターゲットを表わすため、有用性を有する。本発明の生産
物及びプロセスは、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質が関わる節足動物の発育、変
態、飼育、消化及び／又は生殖のプロセスの阻害を可能にするため有利である。
【００３４】 触覚、脳、側心体、アラタ体、並びに食道下及び腹部神経節組織を始めとする
ノミの頭部及び神経索は、そのような組織ではニューロンと内分泌腺のターゲッ
トと化学感覚及び機械感覚受容に関与するターゲットとをコードする転写物が非
常に豊富なるため、重要である。ノミ頭部及び神経索の核酸配列（本明細書では
ＨＮＣ核酸配列と呼ぶ）に富んだライブラリからｃＤＮＡフラグメントを配列決
定することにより、遺伝子と、ノミ神経及び内分泌機能に統合的に関わるその各
々の完全長コード領域とが同定される。いったん同定されると、該遺伝子はさら
に特徴付けされ、特定の干渉戦略法が設計される。そのように、本発明のノミＨ
ＮＣ蛋白質及び核酸分子は、抗節足動物ワクチン及び化学療法剤の新規なターゲ
ットを表わすので、有用性を有する。
【００３５】 ノミなどの吸血虫は、その体重に対して大量の血液を摂取するが、そのような
ものとして、水の迅速な除去によって摂取した血液の量を減少するよう適合され
ている。さらに、血液中のナトリウム、カリウム及び塩化物イオンの濃度はノミ
の血リンパにおける濃度よりも大きいため、そのようなイオンのうちの過剰量を
排泄する必要がある。血リンパからマルピーギ管のルーメン及び後腸へのそのよ
うなイオンの能動輸送は、水及び他の血リンパ内容物の該器官への受動輸送を同
様に促進する。該器官を通過する間、血リンパからの廃棄物は排泄され、必要と
される栄養素、水及び塩類は再吸収される。そのため、これらの本質的プロセス
への干渉は、ノミの個体数を制御する製品を開発するための重要な戦略である。
後腸及びマルピーギ管の核酸配列（本明細書ではＨＭＴ核酸配列と呼ぶ）に富ん
だライブラリからのｃＤＮＡフラグメントを配列決定することにより、そのよう
なプロセスと統合的に関わる遺伝子と、その各々の完全長コード領域とが同定さ
れる。いったん同定されると、該遺伝子はさらに特徴付けされ、特定の干渉戦略
法が設計される。そのように、本発明のノミＨＭＴ蛋白質及び核酸分子は、抗節
足動物ワクチン及び化学療法剤の新規なターゲットを表わすので、有用性を有す
る。
【００３６】 本発明の１実施態様は、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質を含む単離蛋白質
である。「１つの（ａ又はａｎ）実体」という用語は、その実体の１つ以上のこ
とを指すに留意する。例えば、蛋白質（a protein ）、核酸分子（a nucleic ac
id）、抗体（an antibody ）及び治療組成物（a therapeutic composition ）は
、「１又は複数の」又は「１以上の」蛋白質、核酸分子、抗体、治療組成物をそ
れぞれ指す。従って、「１つの（ａ又はａｎ）」「１又は複数の」「１以上の」
という用語は本明細書では互換的に使用することができる。さらに、「含有する
」「含む」「有する」という用語も互換的に使用できることに留意する。本発明
によれば、単離したか生物学的に純粋な蛋白質は、その自然環境から取り除かれ
た蛋白質のことである。従って、「単離した」と「生物学的に純粋な」は、蛋白
質の純度の程度を必ずしも反映しない。本発明の単離蛋白質は、その天然源から
得てもよいし、組換えＤＮＡ技術を使用して生産してもよいし、化学合成法によ
って生産してもよい。
【００３７】 本明細書に使用する場合、本発明の単離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質は
、完全長の蛋白質であってもよいし、そのような蛋白質の任意の同族体であって
もよい。同族体を含む本発明の単離蛋白質は、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白
質に対する免疫応答を誘発する該蛋白質の能力によるかＨＭＴ及び／又はＨＮＣ
蛋白質の活性により、直接的な方法で同定することが可能である。ノミＨＭＴ及
びＨＮＣ同族体蛋白質の例としては、ノミＨＭＴ又はＨＮＣ蛋白質に対する免疫
応答を誘発できるか及び／又はノミＨＭＴ又はＨＮＣ蛋白質に対して直接抗体が
結合できる１以上のエピトープを該同族体が有するように、アミノ酸を欠失（例
えばペプチドのような蛋白質の欠失版）させるか、挿入するか、逆位にするか、
置換するか、及び／誘導体化（例えばグリコシル化、燐酸化、アセチル化、ミリ
ストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化及び／又はグリセロホスフ
ァチジルイノシトールの添加）したノミＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質が挙げられる。
すなわち、当業者に周知の技術を使用して同族体を免疫原として動物に投与する
時、動物は天然ノミＨＭＴ又はＮＮＣ蛋白質の少なくとも１つのエピトープに対
する免疫応答を生産するだろう。蛋白質が免疫応答を誘発する能力は、当業者に
周知の技術を使用して測定することが可能である。本明細書で使用する場合、「
エピトープ」という用語は、抗体の抗原結合部位又はＴ細胞受容体に選択的に結
合できる蛋白質又は他の抗原の最も小さな部分を指す。蛋白質エピトープの最小
のサイズが約４〜６アミノ酸であることは、当業者によってよく認められている
。当業者に理解されるように、エピトープは、天然蛋白質の三次構造により、エ
ピトープを形成する程度に十分に近接しているアミノ酸と同様、互いに本来的に
隣接したアミノ酸を含み得る。本発明によれば、エピトープは、長さが、約４以
上のアミノ酸、約５以上のアミノ酸、約６以上のアミノ酸、約１０以上のアミノ
酸、約１５以上のアミノ酸、約２０以上のアミノ酸、約２５以上のアミノ酸、約
３０以上のアミノ酸、約３５以上のアミノ酸、約４０以上のアミノ酸又は約５０
以上のアミノ酸を含む蛋白質の一部分を有する。
【００３８】 本発明の１実施態様において、ノミ同族体蛋白質は、ＨＭＴ又はＨＮＣ活性を
有する。すなわち、同族体はその天然相当物と類似の活性を示す。そのような活
性の例を本明細書に例えばすべて開示する。そのような活性を検出及び測定する
方法は、当業者によく知られている。そのような活性の例を本明細書に開示する
が、例えばアラントイナーゼ、キチン結合蛋白質、ナトリウム／カリウムＡＴＰ
アーゼ、リガンドにゲート塩化物チャネル、ＡＮＯＮ／２３ＤＡ、マルボリオ、
嗅覚物質結合蛋白質様蛋白質、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体関連蛋白
質、化学感覚関連脂肪親和性リガンド結合蛋白質、ナトリウム／水素輸送体様蛋
白質、塩化物細胞内チャネル様蛋白質、ペリトロフィン様蛋白質、ペリトロフィ
ン様蛋白質、ペリトロフィン様蛋白質、シナプス小胞２Ｂ様蛋白質、電圧ゲート
塩化物様蛋白質、無酸素症非調節蛋白質様蛋白質、及び神経内分泌特異的７Ｂ２
様蛋白質が挙げられる。
【００３９】 ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ同族体蛋白質は、自然対立遺伝子の変化又は自然
突然変異の結果であり得る。本発明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質同族体
は、蛋白質を直接修飾するか、例えばランダム突然変異又はターゲット突然変異
を起こす古典的又は組換えＤＮＡ技術を用いて蛋白質をコードする遺伝子を修飾
することを含めた当該技術分野で周知の技術を使用して生産することが可能であ
るが、それらに限定されるわけではない。
【００４０】 本発明のノミＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質は、ノミＨＭＴ及びＨＮＣ核酸分子によ
りそれぞれコードされる。本明細書で使用する場合、ノミＨＭＴ及びＨＮＣ核酸
分子は、天然ノミＨＭＴ及びＨＮＣ遺伝子好ましくはＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｌ
ｄｅｓ ｆｅｌｉｓＨＭＴ及びＨＮＣ遺伝子と関係する核酸配列を有する。本明
細書で使用する場合、ノミＨＭＴ及びＨＮＣ遺伝子は、そのような遺伝子により
コードされたノミＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質の生産を制御する調節領域（転写調節
領域、翻訳調節領域又は翻訳後調節領域を含むがそれらに限定されるわけではな
い）と同様、コード領域自体や、任意のイントロン若しくは非翻訳コード領域等
のすべての領域を含んでいる。本明細書で使用する場合、ある配列を「有する」
か「含む」核酸分子は、１つの隣接する配列でその配列を有してもよいし、ノミ
遺伝子に関してよく見られるように断片化エクソンとしてその配列を有してもよ
い。本明細書で使用する場合、「コード領域」という用語は、蛋白質に翻訳され
る隣接する線状の複数のヌクレオチドの並びのことを指す。完全長のコード領域
とは、完全長、すなわち任意の翻訳後修飾に先だって天然環境で最初に翻訳され
る完全な蛋白質に翻訳されるコード領域のことである。
【００４１】 本発明の１実施態様は、配列番号１及び／又は配列番号４の核酸配列を有する
Ｃ．ｆｅｌｉｓ ＡＬＮ遺伝子、配列番号７及び／又は配列番号１０の核酸配列
を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＣＢＰ遺伝子、配列番号１３及び／又は配列番号１６
の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＮＫＡＢ遺伝子、配列番号１９、配列番号
２２、配列番号１８６１及び／又は配列番号１８６４の核酸配列を有するＣ．ｆ
ｅｌｉｓ ＬＧＩＣ遺伝子、配列番号２５及び／又は配列番号２８の核酸配列を
有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＡＮＯＮ遺伝子、配列番号３１及び／又は配列番号３４
の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＭＡＬＶ遺伝子、配列番号３７及び／又は
配列番号４０の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＯＳ−Ｄ遺伝子、配列番号４
３及び／又は配列番号４６の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＮＭＤＡ遺伝子
、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列番
号１６５及び／又は配列番号１６８の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＣＬＢ
Ｐ遺伝子、配列番号１８６７及び／又は配列番号１８７０の核酸配列を有するＣ
．ｆｅｌｉｓ ＮＡＨ遺伝子、配列番号１８７２及び／又は配列番号１８７５の
核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＣＬＩＣ遺伝子、配列番号１８７７、配列番
号１８７８、配列番号１８８０、配列番号１８８２及び／又は配列番号１８８５
の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＰＬ２遺伝子、配列番号１８８７及び／又
は配列番号１８９０の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＰＬ３遺伝子、配列番
号１８９６及び／又は核酸配列１８９９の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ Ｐ
Ｌ４遺伝子、核酸配列１９０１及び／又は配列番号１９０４の核酸配列を有する
Ｃ．ｆｅｌｉｓ ＳＶＰ遺伝子、配列番号１９１４及び／又は配列番号１９１７
の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＶＧＣＣ遺伝子、配列番号１９１９及び／
又は配列番号１９２２の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ ＡＵＰ遺伝子、配列
番号１９２４及び／又は配列番号１９２７の核酸配列を有するＣ．ｆｅｌｉｓ
７Ｂ２遺伝子、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、及び／又は表ＩＶの核酸配列を有する
Ｃ．ｆｅｌｉｓ遺伝子、並びに、以上の核酸配列のうちの任意の相補的配列であ
る。以上の核酸配列は本明細書にて詳しく説明する。例えば、配列番号１は、本
明細書ではＣ．ｆｅｌｉｓ ＡＬＮ核酸分子ｎＣｆＡＬＮ2057と表される、Ｃ．
ｆｅｌｉｓ ｃＤＮＡのコード鎖の推定配列のことを指す。その作製方法は実施
例１に示す。配列番号１の核酸分子は見かけ上完全長のコード領域を有する。配
列番号１の相補的配列（本明細書に配列番号３で表わす）とは、配列番号１を有
する鎖と十分に相補的な鎖から成る核酸配列のことを指し、それは当業者により
容易に決定することができる。同様に、本発明の任意の核酸配列の相補的核酸配
列とは、配列を列挙した鎖に十分相補的な（即ち該鎖と完全な二重らせんを形成
することが可能な）核酸鎖の核酸配列のことを指す。例えば、配列番号４、７、
１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、
４６、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５及び１６８の相補的配列は、そ
れぞれ配列番号６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３
６、３９、４２、４５、４８、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７及び１
７０である。核酸配列決定技術が完全に誤差自由ではないので、配列番号１（他
の核酸と蛋白質のシーケンスがここに示したと同様に）が、本発明のＡＬＮ蛋白
質をコードする核酸分子の明白な核酸配列を表わすことが注目されるべきである
。
【００４２】 ｎＣｆＡＬＮ2057のコード鎖である配列番号１と、配列番号１のコード領域を
表すコード配列を示すｎＣｆＡＬＮ1152のコード鎖である配列番号４の翻訳は、
本明細書においてＰＣｆＡＬＮ384で示す約３８４アミノ酸から成る蛋白質を各
々生じ、配列番号２で示したアミノ酸配列は、配列番号４のヌクレオチド１から
ヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式をとる。
【００４３】 ｎＣｆＣＢＰ1128のコード鎖である配列番号７と、配列番号７のコード領域を
表すｎＣｆＣＢＰ1128のコード鎖である配列番号１０の翻訳は、本明細書におい
てＰＣｆＣＢＰ272で示す約２７２アミノ酸から成る蛋白質を各々生じ、配列番
号８で示したアミノ酸配列は、配列番号１０のヌクレオチド１からヌクレオチド
３までに延びる第１のインフレームコドンの形式をとる。
【００４４】 ｎＣｆＮＫＡＢ1714のコード鎖である配列番号１３と、配列番号１３のコード
領域を表すｎＣｆＮＫＡＢ978のコード鎖である配列番号１６の翻訳は、本明細
書においてＰＣｆＮＫＡＢ326で示す約３２６アミノ酸から成る蛋白質を各々生
じ、配列番号１４で示したアミノ酸配列は、配列番号１６のヌクレオチド１から
ヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式をとる。
【００４５】 ｎＣｆＬＧＩＣ2249のコード鎖である配列番号１９と、配列番号１９のコード
領域を表すｎＣｆＬＧＩＣ1707のコード鎖である配列番号２２の翻訳は、本明細
書においてＰＣｆＬＧＩＣ569で示す約５６９アミノ酸から成る蛋白質を各々生
じ、配列番号２０で示したアミノ酸配列は、配列番号２２のヌクレオチド１から
ヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式をとる。
【００４６】 ｎＣｆＡＮＯＮ1429のコード鎖である配列番号２５と、配列番号２５のコード
領域を表すｎＣｆＡＮＯＮ1194のコード鎖である配列番号２８の翻訳は、本明細
書においてＰＣｆＡＮＯＮ398で示す約３９８アミノ酸から成る蛋白質を各々生
じ、配列番号２６で示したアミノ酸配列は、配列番号２８のヌクレオチド１から
ヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式をとる。
【００４７】 ｎＣｆＭＡＬＶ765のコード鎖である配列番号３１と、配列番号３１のコード
領域を表すｎＣｆＭＡＬＶ762のコード鎖である配列番号３４の翻訳は、本明細
書においてＰＣｆＭＡＬＶ254で示す約３２７アミノ酸から成る蛋白質を各々生
じ、配列番号３２で示したアミノ酸配列は、配列番号３４のヌクレオチド１から
ヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式をとる。
【００４８】 ｎＣｆＯＳＤ604のコード鎖である配列番号３７と、配列番号３７のコード領
域を表すｎＣｆＯＳＤ405のコード鎖である配列番号４０の翻訳は、本明細書に
おいてＰＣｆＯＳＤ135で示す約１３５アミノ酸から成る蛋白質を各々生じ、配
列番号３８で示したアミノ酸配列は、配列番号４０のヌクレオチド１からヌクレ
オチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式をとる。
【００４９】 ｎＣｆＮＭＤＡ1227のコード鎖である配列番号４３と、配列番号４３のコード
領域を表すｎＣｆＮＭＤＡ738のコード鎖である配列番号４０の翻訳は、本明細
書においてＰＣｆＮＭＤＡ246で示す約２４６アミノ酸から成る蛋白質を各々生
じ、配列番号４４で示したアミノ酸配列は、配列番号４６のヌクレオチド１から
ヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式をとる。
【００５０】 ｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ633のコード鎖である配列番号１５３と、配列番号１５３
のコード領域を表すｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ441のコード鎖である配列番号１５６の
翻訳は、本明細書においてＰＣｆＣＬＢＰ１Ａ147で示す約１４７アミノ酸から
成る蛋白質を各々生じ、配列番号１５４で示したアミノ酸配列は、配列番号１５
６のヌクレオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドン
の形式をとる。
【００５１】 ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ631のコード鎖である配列番号１６２と、配列番号１６２
のコード領域を表すｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ441のコード鎖である配列番号１６５の
翻訳は、本明細書においてＰＣｆＣＬＢＰ１Ａ147で示す約１４７アミノ酸から
成る蛋白質を各々生じ、配列番号１６３で示したアミノ酸配列は、配列番号１６
５のヌクレオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドン
の形式をとる。
【００５２】 ｎＣｆＬＧＩＣ2739のコード鎖である配列番号１８６１と、配列番号１８６１
のコード領域を表すｎＣｆＬＧＩＣ2016のコード鎖である配列番号１８６４の翻
訳は、本明細書においてＰＣｆＬＧＩＣ672で示す約６７２アミノ酸から成る蛋
白質を各々生じ、配列番号１８６２で示したアミノ酸配列は、配列番号１８６４
のヌクレオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの
形式をとる。
【００５３】 ｎＣｆＮＡＨ2080のコード鎖である配列番号１８６７と、配列番号１８６７の
コード領域を表すｎＣｆＮＡＨ1824のコード鎖である配列番号１８７０の翻訳は
、本明細書においてＰＣｆＮＡＨ608で示す約６０８アミノ酸から成る蛋白質を
各々生じ、配列番号１８６８で示したアミノ酸配列は、配列番号１８７０のヌク
レオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式を
とる。
【００５４】 ｎＣｆＣＬＩＣ2283のコード鎖である配列番号１８７２と、配列番号１８７２
のコード領域を表すｎＣｆＣＬＩＣ786のコード鎖である配列番号１８７５の翻
訳は、本明細書においてＰＣｆＣＬＩＣ262で示す約２６２アミノ酸から成る蛋
白質を各々生じ、配列番号１８７３で示したアミノ酸配列は、配列番号１８７５
のヌクレオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの
形式をとる。
【００５５】 ｎＣｆＰＬ２1477のコード鎖である配列番号１８８２と、配列番号１８８２の
コード領域を表すｎＣｆＰＬ２1359のコード鎖である配列番号１８８５の翻訳は
、本明細書においてＰＣｆＰＬ２453で示す約４５３アミノ酸から成る蛋白質を
各々生じ、配列番号１８８３で示したアミノ酸配列は、配列番号１８８５のヌク
レオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式を
とる。
【００５６】 ｎＣｆＰＬ３406のコード鎖である配列番号１８８７と、配列番号１８８７の
コード領域を表すｎＣｆＰＬ３243のコード鎖である配列番号１８９０の翻訳は
、本明細書においてＰＣｆＰＬ３81で示す約８１アミノ酸から成る蛋白質を各々
生じ、配列番号１８８８で示したアミノ酸配列は、配列番号１８９０のヌクレオ
チド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式をとる
。
【００５７】 ｎＣｆＰＬ４1062のコード鎖である配列番号１８９６と、配列番号１８９６の
コード領域を表すｎＣｆＰＬ４855のコード鎖である配列番号１８９９の翻訳は
、本明細書においてＰＣｆＰＬ４285で示す約２８５アミノ酸から成る蛋白質を
各々生じ、配列番号１８９７で示したアミノ酸配列は、配列番号１８９９のヌク
レオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式を
とる。
【００５８】 ｎＣｆＳＶＰ1875のコード鎖である配列番号１９０１と、配列番号１９０１の
コード領域を表すｎＣｆＳＶＰ1590のコード鎖である配列番号１９０４の翻訳は
、本明細書においてＰＣｆＳＶＰ530で示す約５３０アミノ酸から成る蛋白質を
各々生じ、配列番号１９０２で示したアミノ酸配列は、配列番号１９０４のヌク
レオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式を
とる。
【００５９】 ｎＣｆＶＧＣＣ3126のコード鎖である配列番号１９１４と、配列番号１９１４
のコード領域を表すｎＣｆＶＧＣＣ2553のコード鎖である配列番号１９１７の翻
訳は、本明細書においてＰＣｆＶＧＣＣ851で示す約８５１アミノ酸から成る蛋
白質を各々生じ、配列番号１９１５で示したアミノ酸配列は、配列番号１９１７
のヌクレオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの
形式をとる。
【００６０】 ｎＣｆＡＵＰ1181のコード鎖である配列番号１９１９と、配列番号１９１９の
コード領域を表すｎＣｆＡＵＰ306のコード鎖である配列番号１９２２の翻訳は
、本明細書においてＰＣｆＡＵＰ102で示す約１０２アミノ酸から成る蛋白質を
各々生じ、配列番号１９２０で示したアミノ酸配列は、配列番号１９２２のヌク
レオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式を
とる。
【００６１】 ｎＣｆ７Ｂ２2161のコード鎖である配列番号１９２４と、配列番号１９２４の
コード領域を表すｎＣｆ７Ｂ２801のコード鎖である配列番号１９２７の翻訳は
、本明細書においてＰＣｆ７Ｂ２267で示す約２６７アミノ酸から成る蛋白質を
各々生じ、配列番号１９２５で示したアミノ酸配列は、配列番号１９２７のヌク
レオチド１からヌクレオチド３までに延びる第１のインフレームコドンの形式を
とる。
【００６２】 表Ｉは、本発明の種々のノミＨＮＣ核酸分子を表わす。さらに表Ｉには、本発
明の引用ＨＮＣ配列と最も近い配列相同性を共有する他の生物由来の核酸分子も
引用している。この相同性は、各ＨＮＣ配列を、国立バイオテクノロジー情報セ
ンター（ＮＣＢＩ）国立医学図書館、国立衛生研究所（メリーランド州、ボルテ
ィモア）に提出して検索することによりＢＬＡＳＴネットワークを用いて決定し
た。このデータベースは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋Ｇ
ｅｎＰｅｐｔ＋ＧＰＵｐｄａｔｅ＋ＰＤＢデータベースを含んでいる。その検索
は、ｘＢＬＡＳＴ機能を使用してデフォルトパラメータを用いて行った。
【００６３】
【表１】 表IIは、本発明の種々のノミＨＭＴ核酸分子を表す。表IIには、上述のように
ＢＬＡＳＴネットワークを通じた検索により決定した本発明の引用ＨＭＴ配列と
最も近い配列相同性を共有する他の生物由来の核酸分子も引用している。
【００６４】
【表２】 表III は、本発明の種々のノミＨＮＣ核酸分子を表す。
【００６５】
【表３】 表IVは、本発明の種々のノミＨＭＴ核酸分子を表す。
【００６６】
【表４】 １実施態様において、本発明の遺伝子又は他の核酸分子は、配列番号１、配列
番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号ｌ０、配
列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列
番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番
号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号
３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４
２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号１５
３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９、配列
番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６
７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１８５９、配列番号１８６０、
配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番号１８６４、配列番号１８６６、
配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番号１８７０、配列番号１８７１、
配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番号１８７５、配列番号１８７６、
配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８０、配列番号１８８１、
配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番号１８８５、配列番号Ｉ８８６、
配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番号１８９０、配列番号１８９１、
配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番号１８９４、配列番号１８９５、
配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番号１８９９、配列番号１９００、
配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９０４、配列番号１９０５、
配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番号１９０８、配列番号１９０９、
配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番号１９１２、配列番号１９１３、
配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番号１９１７、配列番号１９１８、
配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番号１９２２、配列番号１９２３、
配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番号１９２７、配列番号１９２８、
配列番号１９２９、及び／又は配列番号１９３１、又は表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ
、及び／又は表ＩＶのＣ．ｆｅｌｉｓ核酸配列、若しくはそれらの相補的配列に
類似してはいるが同一ではない配列を有する対立変異型であり得る。例えば、配
列番号１を含むＣ．ｆｅｌｉｓ ＡＬＮ遺伝子の対立変異型は、本質的に、配列
番号１を含む遺伝子であるとゲノム中の同じ座に生じるが、例えば突然変異や組
換えにより引き起こされた自然な変化により、類似しているが同じではない配列
を有する。自然淘汰が通常、作用を及ぼす変更に対する選択を行うため、対立変
異型（つまり、引用した核酸配列に対応するか該核酸配列に関する対立遺伝子）
は、通常、それと比較される遺伝子によってコードされた蛋白質の活性と同様の
活性を有する蛋白質を通常コードする。遺伝子又は核酸分子の対立変異型は、さ
らに遺伝子の５’又は３’非翻訳領域（例えば調節制御領域）に変更を含み得る
。また、遺伝子又は核酸分子の対立変異型は、形成されつつある転写物の選択的
スプライシングに関与し、選択的エキソンを並置させ得る。対立変異型は当業者
には周知であり、ゲノムが二倍性であり有性生殖が対立遺伝子の組合せ直すがた
めにＣ．ｆｅｌｉｓなどの所定のノミに自然に発生すると予測される。例えば、
配列番号１６２は、見かけ上、配列番号１５３の対立変異型又は同義遺伝子であ
る。
【００６７】 本発明の１実施態様において、単離ＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質は、ノミＨＭＴ及
びＨＮＣ蛋白質をコードする遺伝子又は他の核酸分子とストリンジェントなハイ
ブリッド形成条件下でハイブリッド形成する核酸分子により各々コードされる。
本発明のＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質の最小サイズは、対応する天然蛋白質をコード
する核酸分子の補足的配列と安定なハイブリッドを形成できる（つまり、ストリ
ンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成することができる）核
酸分子によってコードされるのに十分なサイズである。そのような蛋白質をコー
ドする核酸分子のサイズは、核酸組成と、ノミＨＭＴ又はＨＮＣ核酸分子と補足
的な核酸配列との間のパーセント相同性によって決まる。所定の核酸分子の全体
にわたって相同な配列が散在しているか所定の核酸分子上の別個の領域にクラス
ター状になっている（つまり、集中している）かどうかに依存して、ストリンジ
ェントな条件下で安定なハイブリッドを形成するのに必要な相同性の範囲が変わ
り得ることは、容易に理解される。
【００６８】 ノミＨＭＴ又はＨＮＣ蛋白質をコードする遺伝子と安定なハイブリッドを形成
することが可能な核酸分子の最小のサイズは、核酸分子がＧＣ豊富な場合は通常
約１２〜約１５ヌクレオチド長であり、核酸分子がＡＴ豊富な場合、約１５〜約
１７塩基である。本発明のＭＴ又はＨＮＣ蛋白質同族体をコードするのに使用さ
れる核酸分子の最小のサイズは、約１２〜約１８ヌクレオチド長である。したが
って、本発明のＨＭＴ又はＨＮＣ蛋白質同族体の最小のサイズは、約４〜約６ア
ミノ酸長である。本発明の核酸分子が、遺伝子の一部、遺伝子全体又は同義遺伝
子を含み得るため、本発明のノミＨＭＴ又はＨＮＣ蛋白質をコードする核酸分子
の最大のサイズには、実際の限界以外の限界はない。本発明の核酸分子によりコ
ードされる蛋白質の好ましいサイズは、そのような蛋白質の全長部分、融合部分
、多価部分、又は機能的部分のどれが望まれるかによる。
【００６９】 ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、核酸分子がハイブリッド形成さ
れる遺伝子の所定の物性に基づいて決定され、数学的に定義することが可能であ
る。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、当該技術分野に習熟している
者が相同な核酸分子間の有意な類似性を同定するのを許容する、実験的パラメー
タである。そのような条件は、当業者に周知である。例えば、サンブルック（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ）等、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓや、マインコス（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ）等、１９８４年
、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８、２６７−２８４を参照されたい。この引
用した参考文献に詳細に説明されるように、ハイブリッド形成条件の決定は、イ
オン強度（Ｍ、即ちモル／リットル）、ハイブリッド形成温度（℃）、核酸ヘリ
ックス不安定化剤（ホルムアミドなど）の濃度、最短のハイブリッド二重らせん
の平均長（ｎ）、及び未知の核酸分子とハイブリッド形成するフラグメントのＧ
＋Ｃパーセント組成を始めとする１組の変数の操作を含む。約１５０以上のヌク
レオチドから成る核酸分子の場合、所定核酸分子の融解温度Ｔｍを計算するため
に、そのような変数が標準的な数式に挿入される。以下の式で定義されるように
、Ｔｍは、２つの補足的核酸分子鎖が１００％の相補性を有すると仮定したとき
の、該２つの核酸分子鎖が解離する温度である。
【００７０】 Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６ｌｏｇＭ＋０．４ｌ（％Ｇ＋Ｃ）−５００／ｎ−
０．６１（％ホルムアミド） 約５０ヌクレオチドより小さな核酸分子の場合、ハイブリッドの安定性は解離
温度Ｔｄによって定義される。解離温度Ｔｄは、二重らせんの５０％が解離する
温度として定義される。そのような小分子の場合、標準的イオン強度における安
定性は次の方程式によって定義される。
【００７１】 Ｔｄ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ） 完全に対合した分子間のハイブリッド形成を検出するためには、Ｔｄ以下の５
℃の温度が使用される。 塩基対誤対合、すなわち比較されている２つの核酸分子間の相違が異なるサイ
ズの核酸分子のＴｍ又はＴｄにいかに影響を与えるかということも、当業者に周
知である。塩基対誤対合には、所定位置での塩基対の非相補性や、比較されてい
る核酸分子のいずれか一方の所与位置における１又は複数の挿入又は欠失による
ギャップが挙げられる。例えば、約１５０ｂｐより大きいハイブリッドでは１％
の各誤対合塩基対に対して、Ｔｍが約１℃低下する。約５０ｂｐより小さいのハ
イブリッドでは各誤対合塩基対に対して、Ｔｄが５℃低下する。約５０〜約１５
０塩基対の間のハイブリッドのための条件は、当業者に周知の標準的な研究方法
を使用して、経験的にかつ過度の実験を行わずに決定することが可能である。そ
のような簡単な方法により、当業者は、特定の％より大きな塩基対誤対合を有す
る核酸ハイブリッドのみがハイブリッド形成するように、例えば塩濃度、ホルム
アミド濃度又は温度を変えることにより）ハイブリッド形成条件を設定すること
ができる。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、約３０％以下の塩基対
誤対合（即ち約７０％の相同性）を許容する実験条件であるものとして、当業者
には通常理解されている。当業者は、試験する所定の核酸分子が約５０ヌクレオ
チドより小さいか大きいかを容易に決定でき、従ってハイブリッド形成条件に適
した式を選択できるため、核酸分子がストリンジェントなハイブリッド形成条件
下で所定の遺伝子とハイブリッド形成するかどうか、また同様に、核酸分子が所
望量の塩基対誤対合を許容するよう設計された条件下でハイブリッド形成するか
どうかを、当業者は決定することができる。
【００７２】 ハイブリッド形成反応は、ハイブリッド形成すべき核酸分子を膜等の固相支持
体に取り付け、次に、ハイブリダイゼーション溶液に懸濁させた通常プローブと
呼ばれる標識した核酸分子とハイブリッド形成することにより、行なわれること
が多い。一般的なハイブリッド形成反応技術の例としては、有名なサザンブロッ
ティング法とノーザンブロッティング法が挙げられるが、それらに限定されるわ
けではない。通常、実際のハイブリッド形成反応は、非ストリンジェントな条件
下、つまり、低い温度及び／又は高い塩濃度で行われてから、所望のストリンジ
ェンシーを達成するためにより高い温度及び／又はより低い塩濃度の溶液中で膜
を洗浄することにより高いストリンジェンシーを達成する。
【００７３】 例えば、熟練者が、約１５０ｂｐ以上の長さのノミ核酸分子との３０％以下の
塩基対誤対合を許容する条件下でハイブリッド形成する核酸分子を同定したい場
合、以下の条件を使用することが可能である。既知のノミ核酸配列から計算され
るように、ノミＤＮＡの平均Ｇ＋Ｃ含量は約３７％である。未知の核酸分子を支
持膜に取り付け、１５０ｂｐプローブを放射性標識等により標識する。ハイブリ
ッド形成反応は、２×ＳＳＣと０％ホルムアミドを含有する溶液中で、３７０℃
にて行われ得る（低ストリンジェンシー条件）。当業者は、２０×ＳＳＣ（水１
リットルに１７５．３グラムのＮａＣｌと約８８．２グラムのクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７）のストック溶液を希釈することにより、様々なＳＳＣ濃度の溶液を
作製し、所望濃度のＳＳＣを得ることが可能である。熟練者には、３０％までの
塩基対誤対合を許容するのに必要な洗浄条件を計算される。例えば、１×ＳＳＣ
と０％ホルムアミドを含有する洗濯溶液では、完全なハイブリッドのＴｍは約７
７℃である。
【００７４】 ８ｌ．５℃＋１６．６ｌｏｇ（．１５Ｍ）＋（０．４１×０．３７）−（５０
０／１５０）−（０．６１×０）＝７７．５℃ 従って、約３０％の塩基対誤対合を有する核酸分子とのハイブリッド形成を達
成するには、ハイブリッド形成の洗浄が４７．５℃以下の温度で実行されるだろ
う。従って、本明細書に開示した所望の塩基対誤対合の割合と、式と、Ｇ／Ｃ含
量とに基づき、さらなるハイブリッド形成温度を計算することは、当該技術にお
ける１つの技術の範囲内に包含される。例えば、当業者には、本明細書で特定し
た配列を有する本発明の核酸分子に対するハイブリッド形成を試験する核酸分子
が１５０のヌクレオチドより長くなるとき、３０％までの塩基対誤対合を許容す
るハイブリッド形成反応用のＴｍは、４７．５℃から大きくは変化しないことが
理解される。
【００７５】 さらに、２つの核酸配列間の類似性の程度を決定するための、市販のコンピュ
ータプログラムが存在することが当該技術技術でよく知られている。そのような
コンピュータプログラムは、同一性パーセントやハイブリッド核酸分子間のギャ
ップの数及び長さを決定する様々な既知の方法を含んでいる。アミノ酸配列間の
同一性パーセントや核酸配列間の同一性パーセントを決定する好ましい方法には
、核酸配列又はアミノ酸配列を比較及び分析することを目的とした１又は複数の
市販のコンピュータプログラムを使用した分析が挙げられる。そのようなコンピ
ュータプログラムには、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ
９．０配列分析ソフトウェア（ウィスコンシン州マディソン所在のＧｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧTM）より入手可能）、ＤＮＡｓ
ｉｓTM（カリフォルニア州サンブルーノ所在の日立ソフトウェアより入手可能）
、ＭａｃＶｅｃｔｏｒTM（コネティカット州ニューヘブン所在のイーストマンコ
ダック社より入手可能）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ア
ミノ酸配列中や核酸配列中の同一性パーセントを決定する好ましい方法は、以後
デフォルトパラメータと称する、ＧＣＧTM Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇ
ｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０配列分析ソフトウェアでペアワイズ比較に関するＧ
ＡＰプログラムを使用することを含む。
【００７６】 本発明の１実施態様は、ノミＡＬＮ、ＣＢＰ、ＮＫＡＢ、ＬＧＩＣ、ＡＮＯＮ
、ＭＡＬＶ、ＯＳ−Ｄ、ＮＭＤＡ、ＣＬＢＰ、ＮＡＨ、ＣＬＩＣ、ＰＬ２、ＰＬ
３、ＰＬ４、ＳＶＰ、ＶＧＣＣ、ＡＵＰ、及び７Ｂ２蛋白質を含む。
【００７７】 好ましいノミＡＬＮ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許容
する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で
、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好まし
くは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０％
以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基対
誤対合を許可する条件下で、配列番号３及び配列番号６から成るグループより選
択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる蛋白質か
ら成る。
【００７８】 好ましいノミＣＥＰ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許容
する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で
、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好まし
くは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０％
以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基対
誤対合を許可する条件下で、配列番号９及び配列番号１２から成るグループより
選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる蛋白質
から成る。
【００７９】 好ましいノミＮＫＡＢ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許
容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下
で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ま
しくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０
％以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基
対誤対合を許可する条件下で、配列番号１５及び配列番号１８から成るグループ
より選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる蛋
白質から成る。
【００８０】 好ましいノミＬＧＩＣ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許
容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下
で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ま
しくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０
％以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基
対誤対合を許可する条件下で、配列番号２１、配列番号２４、配列番号１８６０
、配列番号１８６３及び配列番号１８６６から成るグループより選択された核酸
分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。
【００８１】 好ましいノミＡＮＯＮ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許
容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下
で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ま
しくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０
％以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基
対誤対合を許可する条件下で、配列番号２７及び配列番号３０から成るグループ
より選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる蛋
白質から成る。
【００８２】 好ましいノミＭＡＬＶ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許
容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下
で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ま
しくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０
％以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基
対誤対合を許可する条件下で、配列番号３３及び配列番号３６から成るグループ
より選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる蛋
白質から成る。
【００８３】 好ましいノミＯＳ−Ｄ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許
容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下
で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ま
しくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０
％以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基
対誤対合を許可する条件下で、配列番号３９及び配列番号４２から成るグループ
より選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる蛋
白質から成る。
【００８４】 好ましいノミＮＭＤＡ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許
容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下
で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ま
しくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０
％以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基
対誤対合を許可する条件下で、配列番号４５及び配列番号４８から成るグループ
より選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる蛋
白質から成る。
【００８５】 好ましいノミＣＬＢＰ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許
容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下
で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ま
しくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０
％以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基
対誤対合を許可する条件下で、配列番号１５５、配列番号１５８、配列番号１６
１、配列番号１６４、配列番号１６７及び配列番号１７０から成るグループより
選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる蛋白質
から成る。
【００８６】 好ましいノミＮＡＨ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許容
する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で
、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好まし
くは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０％
以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基対
誤対合を許可する条件下で、配列番号１８６９及び配列番号１８７１から成るグ
ループより選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードさ
れる蛋白質から成る。
【００８７】 好ましいノミＣＬＩＣ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許
容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下
で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ま
しくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０
％以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基
対誤対合を許可する条件下で、配列番号１８７４及び配列番号１８７６から成る
グループより選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコード
される蛋白質から成る。
【００８８】 好ましいノミＰＬ２蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許容
する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で
、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好まし
くは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０％
以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基対
誤対合を許可する条件下で、配列番号１８７９、配列番号１８８１、配列番号１
８８４及び配列番号１８８６から成るグループより選択された核酸分子とハイブ
リッド形成する核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。
【００８９】 好ましいノミＣＰＬ３蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許
容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下
で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ま
しくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０
％以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基
対誤対合を許可する条件下で、配列番号１８８９及び配列番号１８９１から成る
グループより選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコード
される蛋白質から成る。
【００９０】 好ましいノミＰＬ４蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許容
する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で
、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好まし
くは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０％
以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基対
誤対合を許可する条件下で、配列番号１８９３、配列番号１８９５、配列番号１
８９８及び配列番号１９００から成るグループより選択された核酸分子とハイブ
リッド形成する核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。
【００９１】 好ましいノミＳＶＰ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許容
する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で
、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好まし
くは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０％
以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基対
誤対合を許可する条件下で、配列番号１９０３及び配列番号１９０５から成るグ
ループより選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードさ
れる蛋白質から成る。
【００９２】 好ましいノミＶＧＣＣ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許
容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下
で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ま
しくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０
％以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基
対誤対合を許可する条件下で、配列番号１９０７、配列番号１９０９、配列番号
１９１１、配列番号１９１３、配列番号１９１６、及び配列番号１９１８から成
るグループより選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコー
ドされる蛋白質から成る。
【００９３】 好ましいノミＡＵＰ蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許容
する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で
、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好まし
くは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０％
以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基対
誤対合を許可する条件下で、配列番号１９２１及び配列番号１９２３から成るグ
ループより選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によりコードさ
れる蛋白質から成る。
【００９４】 好ましいノミ７Ｂ２蛋白質は、好ましくは約３０％以下の塩基対誤対合を許容
する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で
、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好まし
くは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１０％
以下の塩基対誤対合を許可する条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基対
誤対合を許可する条件下で、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、及び／又は表ＩＶの核酸
配列に相補的な核酸配列から成るグループより選択された核酸分子とハイブリッ
ド形成する核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。
【００９５】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号３及び配列番号６から成るグループより選択された単離核酸配列
とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＡＬＮ蛋白質から成る
。
【００９６】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号９及び配列番号１３から成るグループより選択された単離核酸配
列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＣＢＰ蛋白質から成
る。
【００９７】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１５及び配列番号１８から成るグループより選択された単離核酸
配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＮＫＡＢ蛋白質か
ら成る。
【００９８】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号２１、配列番号２４、配列番号１８６０、配列番号１８６３及び
配列番号１８６６から成るグループより選択された単離核酸配列とハイブリッド
形成する核酸分子によりコードされるノミＬＧＩＣ蛋白質から成る。
【００９９】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号２７及び配列番号３０から成るグループより選択された単離核酸
配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＡＮＯＮ蛋白質か
ら成る。
【０１００】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号３３及び配列番号３６から成るグループより選択された単離核酸
配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＭＡＬＶ蛋白質か
ら成る。
【０１０１】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号３９及び配列番号４２から成るグループより選択された単離核酸
配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＯＳ−Ｄ蛋白質か
ら成る。
【０１０２】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号４５及び配列番号４８から成るグループより選択された単離核酸
配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＮＭＤＡ蛋白質か
ら成る。
【０１０３】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１５５、配列番号１５８、配列番号１６１、配列番号１６４、配
列番号１６７及び配列番号１７０から成るグループより選択された単離核酸配列
とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＣＬＢＰ蛋白質から成
る。
【０１０４】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１８６９及び配列番号１８７１から成るグループより選択された
単離核酸配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＮＡＨ蛋
白質から成る。
【０１０５】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１８７４及び配列番号１８７６から成るグループより選択された
単離核酸配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＣＬＩＣ
蛋白質から成る。
【０１０６】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１８７９、配列番号１８８１、配列番号１８８４及び配列番号１
８８６から成るグループより選択された単離核酸配列とハイブリッド形成する核
酸分子によりコードされるノミＰＬ２蛋白質から成る。
【０１０７】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１８８９及び配列番号１８９１から成るグループより選択された
単離核酸配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＰＬ３蛋
白質から成る。
【０１０８】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１８９３、配列番号１８９５、配列番号１８９８及び配列番号１
９００から成るグループより選択された単離核酸配列とハイブリッド形成する核
酸分子によりコードされるノミＰＬ４蛋白質から成る。
【０１０９】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１９０３及び配列番号１９０５から成るグループより選択された
単離核酸配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＳＶＰ蛋
白質から成る。
【０１１０】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１９０７、配列番号１９０９、配列番号１９１１、配列番号１９
１３、配列番号１９１６、及び配列番号１９１８から成るグループより選択され
た単離核酸配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＶＧＣ
Ｃ蛋白質から成る。
【０１１１】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１９２１及び配列番号１９２３から成るグループより選択された
単離核酸配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノミＡＵＰ蛋
白質から成る。
【０１１２】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、配列番号１９２６、配列番号２８及び配列番号３１から成るグループより
選択された単離核酸配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるノ
ミ７Ｂ２蛋白質から成る。
【０１１３】 本発明の別の実施態様は、（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムア
ミドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度
で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件
下で、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、及び／又は表ＩＶの核酸配列に相補的な核酸配
列から成るグループより選択された単離核酸分子とハイブリッド形成する核酸分
子によりコードされるノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質から成る。
【０１１４】 本発明の別の好ましいノミＡＬＮ蛋白質は、配列番号１及び／又は配列番号４
の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、より好ましくは
約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好ましくは約８
５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ましくは約９５
％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８以上のヌクレ
オチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント（すなわち部
分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最大対合による
Ｃｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１１５】 本発明の別の好ましいノミＣＢＰ蛋白質は、配列番号７及び／又は配列番号１
０の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、より好ましく
は約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好ましくは約
８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ましくは約９
５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８以上のヌク
レオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント（すなわち
部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ Ｖ
ｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最大対合によ
るＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１１６】 本発明の別の好ましいノミＮＫＡＢ蛋白質は、配列番号１３及び／又は配列番
号１６の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、より好ま
しくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好ましく
は約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ましくは
約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８以上の
ヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント（すな
わち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ
Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最大対合
によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１１７】 本発明の別の好ましいノミＬＧＩＣ蛋白質は、配列番号１９、配列番号２２、
配列番号１８６１、及び／又は配列番号１８６４の核酸配列を有する核酸分子と
好ましくは約７０％以上相同な、より好ましくは約７５％以上相同な、より好ま
しくは約８０％以上相同な、より好ましくは約８５％以上相同な、より好ましく
は約９０％以上相同な、さらに好ましくは約９５％以上相同な核酸分子によりコ
ードされる蛋白質から成る。約１８以上のヌクレオチドである核酸分子によりコ
ードされた該蛋白質のフラグメント（すなわち部分）も好ましい。本明細書に使
用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラム
のデフォルトパラメータを用いた最大対合によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を
用いて決定される。
【０１１８】 本発明の別の好ましいノミＡＮＯＮ蛋白質は、配列番号２５及び／又は配列番
号２８の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、より好ま
しくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好ましく
は約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ましくは
約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８以上の
ヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント（すな
わち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ
Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最大対合
によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１１９】 本発明の別の好ましいノミＭＡＬＶ蛋白質は、配列番号３１及び／又は配列番
号３４の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、より好ま
しくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好ましく
は約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ましくは
約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８以上の
ヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント（すな
わち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ
Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最大対合
によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１２０】 本発明の別の好ましいノミＯＳ−Ｄ蛋白質は、配列番号３７及び／又は配列番
号４０の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、より好ま
しくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好ましく
は約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ましくは
約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８以上の
ヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント（すな
わち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ
Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最大対合
によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１２１】 本発明の別の好ましいノミＮＭＤＡ蛋白質は、配列番号４３及び／又は配列番
号４６の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、より好ま
しくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好ましく
は約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ましくは
約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８以上の
ヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント（すな
わち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ
Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最大対合
によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１２２】 本発明の別の好ましいノミＣＬＢＰ蛋白質は、配列番号１５３、配列番号１５
６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６５及び／又は配列番号１６
８の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、より好ましく
は約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好ましくは約
８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ましくは約９
５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８以上のヌク
レオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント（すなわち
部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ Ｖ
ｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最大対合によ
るＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１２３】 本発明の別の好ましいノミＮＡＨ蛋白質は、配列番号１８６７及び／又は配列
番号１８７０の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、よ
り好ましくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好
ましくは約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ま
しくは約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８
以上のヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント
（すなわち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡ
ｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最
大対合によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１２４】 本発明の別の好ましいノミＣＬＩＣ蛋白質は、配列番号１８７２及び／又は配
列番号１８７５の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、
より好ましくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より
好ましくは約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好
ましくは約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１
８以上のヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメン
ト（すなわち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮ
Ａｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた
最大対合によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１２５】 本発明の別の好ましいノミＰＬ２蛋白質は、配列番号１８７７、配列番号１８
７８、配列番号１８８０、配列番号１８８２、及び／又は配列番号１８８５の核
酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、より好ましくは約７
５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好ましくは約８５％
以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ましくは約９５％以
上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８以上のヌクレオチ
ドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント（すなわち部分）
も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ Ｖｅｒｓ
ｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最大対合によるＣｏ
ｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１２６】 本発明の別の好ましいノミＰＬ３蛋白質は、配列番号１８８７及び／又は配
列番号１８９０の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、
より好ましくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より
好ましくは約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好
ましくは約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１
８以上のヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメン
ト（すなわち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮ
Ａｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた
最大対合によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１２７】 本発明の別の好ましいノミＰＬ４蛋白質は、配列番号１８９２、配列番号１８
９４、配列番号１８９６及び／又は配列番号１８９９の核酸配列を有する核酸分
子と好ましくは約７０％以上相同な、より好ましくは約７５％以上相同な、より
好ましくは約８０％以上相同な、より好ましくは約８５％以上相同な、より好ま
しくは約９０％以上相同な、さらに好ましくは約９５％以上相同な核酸分子によ
りコードされる蛋白質から成る。約１８以上のヌクレオチドである核酸分子によ
りコードされた該蛋白質のフラグメント（すなわち部分）も好ましい。本明細書
に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログ
ラムのデフォルトパラメータを用いた最大対合によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関
数を用いて決定される。
【０１２８】 本発明の別の好ましいノミＳＶＰ蛋白質は、配列番号１９０１及び／又は配列
番号１９０４の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、よ
り好ましくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好
ましくは約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ま
しくは約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８
以上のヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント
（すなわち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡ
ｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最
大対合によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１２９】 本発明の別の好ましいノミＶＧＣＣ蛋白質は、配列番号１９０６、配列番号１
９０８、配列番号１９１０、配列番号１９１２、配列番号１９１４及び／又は配
列番号１９１７の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、
より好ましくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より
好ましくは約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好
ましくは約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１
８以上のヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメン
ト（すなわち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮ
Ａｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた
最大対合によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１３０】 本発明の別の好ましいノミＡＵＰ蛋白質は、配列番号１９１９及び／又は配列
番号１９２２の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％以上相同な、よ
り好ましくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上相同な、より好
ましくは約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同な、さらに好ま
しくは約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質から成る。約１８
以上のヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質のフラグメント
（すなわち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセントは、ＤＮＡ
ｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメータを用いた最
大対合によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１３１】 本発明の別の好ましいノミ７Ｂ２蛋白質は、配列番号１９２４、配列番号１９
２７及び／又は配列番号１９２９の核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７
０％以上相同な、より好ましくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％
以上相同な、より好ましくは約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上
相同な、さらに好ましくは約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白
質から成る。約１８以上のヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋
白質のフラグメント（すなわち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パ
ーセントは、ＤＮＡｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパ
ラメータを用いた最大対合によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定され
る。
【０１３２】 本発明の別の好ましいノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質は、表Ｉ、表ＩＩ、
表ＩＩＩ、及び／又は表ＩＶの核酸配列を有する核酸分子と好ましくは約７０％
以上相同な、より好ましくは約７５％以上相同な、より好ましくは約８０％以上
相同な、より好ましくは約８５％以上相同な、より好ましくは約９０％以上相同
な、さらに好ましくは約９５％以上相同な核酸分子によりコードされる蛋白質か
ら成る。約１８以上のヌクレオチドである核酸分子によりコードされた該蛋白質
のフラグメント（すなわち部分）も好ましい。本明細書に使用する同一性パーセ
ントは、ＤＮＡｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１プログラムのデフォルトパラメ
ータを用いた最大対合によるＣｏｍｐａｒｅ（比較）関数を用いて決定される。
【０１３３】 本発明のさらなる好ましいノミＡＬＮ蛋白質は、配列番号２又は配列番号５の
アミノ酸配列を有する蛋白質と、配列番号２又は配列番号５のアミノ酸配列を有
する蛋白質の同族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号２又は
配列番号５のアミノ酸配列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なくと
も１つのエピトープを含む。同様に、配列番号１／又は配列番号４の核酸配列を
有する核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ましい。
【０１３４】 本発明のさらなる好ましいノミＣＢＰ蛋白質は、配列番号８又は配列番号１１
のアミノ酸配列を有する蛋白質と、配列番号８又は配列番号１１のアミノ酸配列
を有する蛋白質の同族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号８
又は配列番号１１のアミノ酸配列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少
なくとも１つのエピトープを含む。同様に、配列番号７及び／又は配列番号１０
の核酸配列を有する核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質
も好ましい。
【０１３５】 本発明のさらなる好ましいノミＮＫＡＢ蛋白質は、配列番号１４又は配列番号
１７のアミノ酸配列を有する蛋白質と、配列番号１４又は配列番号１７のアミノ
酸配列を有する蛋白質の同族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列
番号１４又は配列番号１７のアミノ酸配列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘
発する少なくとも１つのエピトープを含む。同様に、配列番号１３及び／又は配
列番号１６の核酸配列を有する核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードさ
れた蛋白質も好ましい。
【０１３６】 本発明のさらなる好ましいノミＬＧＩＣ蛋白質は、配列番号２０、配列番号２
３又は配列番号１８６２のアミノ酸配列を有する蛋白質と、配列番号２０、配列
番号２３又は配列番号１８６２のアミノ酸配列を有する蛋白質の同族体から成る
蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号２０、配列番号２３又は配列番号１
８６２のアミノ酸配列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１
つのエピトープを含む。同様に、配列番号１９、配列番号２２、配列番号１８５
９、配列番号１８６１及び／又は配列番号１８６４の核酸配列を有する核酸分子
又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ましい。
【０１３７】 本発明のさらなる好ましいノミＡＮＯＮ蛋白質は、配列番号２６又は配列番号
２９のアミノ酸配列を有する蛋白質と、配列番号２６又は配列番号２９のアミノ
酸配列を有する蛋白質の同族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列
番号２６又は配列番号２９のアミノ酸配列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘
発する少なくとも１つのエピトープを含む。同様に、配列番号２５及び／又は配
列番号２８の核酸配列を有する核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードさ
れた蛋白質も好ましい。
【０１３８】 本発明のさらなる好ましいノミＭＡＬＶ蛋白質は、配列番号３２又は配列番号
３５のアミノ酸配列を有する蛋白質と、配列番号３２又は配列番号３５のアミノ
酸配列を有する蛋白質の同族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列
番号３２又は配列番号３５のアミノ酸配列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘
発する少なくとも１つのエピトープを含む。同様に、配列番号３１及び／又は配
列番号３４の核酸配列を有する核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードさ
れた蛋白質も好ましい。
【０１３９】 本発明のさらなる好ましいノミＯＳ−Ｄ蛋白質は、配列番号３８又は配列番号
４１のアミノ酸配列を有する蛋白質と、配列番号３８又は配列番号４１のアミノ
酸配列を有する蛋白質の同族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列
番号３８又は配列番号４１のアミノ酸配列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘
発する少なくとも１つのエピトープを含む。同様に、配列番号３７及び／又は配
列番号４０の核酸配列を有する核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードさ
れた蛋白質も好ましい。
【０１４０】 本発明のさらなる好ましいノミＮＭＤＡ蛋白質は、配列番号４４又は配列番号
４７のアミノ酸配列を有する蛋白質と、配列番号４４又は配列番号４７のアミノ
酸配列を有する蛋白質の同族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列
番号４４又は配列番号４７のアミノ酸配列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘
発する少なくとも１つのエピトープを含む。同様に、配列番号４３及び／又は配
列番号４６の核酸配列を有する核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードさ
れた蛋白質も好ましい。
【０１４１】 本発明のさらなる好ましいノミＣＬＢＰ蛋白質は、配列番号１５４、配列番号
１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６６又は配列番号１６９
のアミノ酸配列を有する蛋白質と、配列番号１５４、配列番号１５７、配列番号
１６０、配列番号１６３、配列番号１６６又は配列番号１６９のアミノ酸配列を
有する蛋白質の同族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号１５
４、配列番号１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６６又は配
列番号１６９のアミノ酸配列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なく
とも１つのエピトープを含む。同様に、配列番号１５３、配列番号１５６、配列
番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６５及び／又は配列番号１６８の核酸
配列を有する核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ま
しい。
【０１４２】 本発明のさらなる好ましいノミＮＡＨ蛋白質は、配列番号１８６８のアミノ酸
配列を有する蛋白質と、配列番号１８６８のアミノ酸配列を有する蛋白質の同族
体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号１８６８のアミノ酸配列
を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含む
。同様に、配列番号１８６７及び／又は配列番号１８７０の核酸配列を有する核
酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ましい。
【０１４３】 本発明のさらなる好ましいノミＣＬＩＣ蛋白質は、配列番号１８７３のアミノ
酸配列を有する蛋白質と、配列番号１８７３のアミノ酸配列を有する蛋白質の同
族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号１８７３のアミノ酸配
列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含
む。同様に、配列番号１８７２及び／又は配列番号１８７５の核酸配列を有する
核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ましい。
【０１４４】 本発明のさらなる好ましいノミＰＬ２蛋白質は、配列番号１８８３のアミノ酸
配列を有する蛋白質と、配列番号１８８３のアミノ酸配列を有する蛋白質の同族
体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号１８８３のアミノ酸配列
を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含む
。同様に、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８０、配列番号
１８８２、及び／又は配列番号１８８５の核酸配列を有する核酸分子又は該核酸
分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ましい。
【０１４５】 本発明のさらなる好ましいノミＰＬ３蛋白質は、配列番号１８８８のアミノ酸
配列を有する蛋白質と、配列番号１８８８のアミノ酸配列を有する蛋白質の同族
体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号１８８８のアミノ酸配列
を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含む
。同様に、配列番号１８８７及び／又は配列番号１８９０の核酸配列を有する核
酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ましい。
【０１４６】 本発明のさらなる好ましいノミＰＬ４蛋白質は、配列番号１８９７のアミノ酸
配列を有する蛋白質と、配列番号１８９７のアミノ酸配列を有する蛋白質の同族
体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号１８９７のアミノ酸配列
を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含む
。同様に、配列番号１８９２、配列番号１８９４、配列番号１８９６及び／又は
配列番号１８９９の核酸配列を有する核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコ
ードされた蛋白質も好ましい。
【０１４７】 本発明のさらなる好ましいノミＳＶＰ蛋白質は、配列番号１９０２のアミノ酸
配列を有する蛋白質と、配列番号１９０２のアミノ酸配列を有する蛋白質の同族
体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号１９０２のアミノ酸配列
を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含む
。同様に、配列番号１９０１及び／又は配列番号１９０４の核酸配列を有する核
酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ましい。
【０１４８】 本発明のさらなる好ましいノミＶＧＣＣ蛋白質は、配列番号１９１５のアミノ
酸配列を有する蛋白質と、配列番号１９１５のアミノ酸配列を有する蛋白質の同
族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号１９１５のアミノ酸配
列を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含
む。同様に、配列番号１９０６、配列番号１９０８、配列番号１９１０、配列番
号１９１２、配列番号１９１４及び／又は配列番号１９１７の核酸配列を有する
核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ましい。
【０１４９】 本発明のさらなる好ましいノミＡＵＰ蛋白質は、配列番号１９２０のアミノ酸
配列を有する蛋白質と、配列番号１９２０のアミノ酸配列を有する蛋白質の同族
体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、配列番号１９２０のアミノ酸配列
を有する蛋白質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含む
。同様に、配列番号１９１９及び／又は配列番号１９２２の核酸配列を有する核
酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ましい。
【０１５０】 本発明のさらなる好ましいノミ７Ｂ２蛋白質は、配列番号１９２５又は配列番
号１９３０のアミノ酸配列を有する蛋白質と、配列番号１９２５又は配列番号１
９３０のアミノ酸配列を有する蛋白質の同族体から成る蛋白質とを包含する。該
同族体は、配列番号１９２５又は配列番号１９３０のアミノ酸配列を有する蛋白
質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含む。同様に、配
列番号１９２４、配列番号１９２７及び／又は配列番号１９２９の核酸配列を有
する核酸分子又は該核酸分子の同族体によりコードされた蛋白質も好ましい。
【０１５１】 本発明のさらなる好ましいＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質は、表Ｉ、表ＩＩ、
表ＩＩＩ、及び／又は表ＩＶの核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有す
る蛋白質と、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、及び／又は表ＩＶの核酸配列によりコー
ドされた蛋白質の同族体から成る蛋白質とを包含する。該同族体は、表Ｉ、表Ｉ
Ｉ、表ＩＩＩ、及び／又は表ＩＶの核酸配列によりコードされた蛋白質に対する
免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを含む。
【０１５２】 本発明の好ましい単離蛋白質は、次の核酸分子のうちの少なくとも１つにより
コードされた蛋白質である：ｎＣｆＡＬＮ2057、ｎＣｆＡＬＮ1152、ｎＣｆＣＢ
Ｐ1128、ｎＣｆＣＢＰ816、ｎＣｆＮＫＡＢ1714、ｎＣｆＮＫＡＢ978、ｎＣｆＬ
ＧＩＣ2240、ｎＣｆＬＧＩＣ1707、ｎＣｆＡＮＯＮ1429、ｎＣｆＡＮＯＮ1194、
ｎＣｆＭＡＬＶ765、ｎＣｆＭＡＬＶ762、ｎＣｆＯＳＤ604、ｎＣｆＯＳＤ405、
ｎＣｆＮＭＤＡ1227、ｎＣｆＮＭＤＡ738、ｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ633、ｎＣｆＣＬ
ＢＰｌＡ441、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ631、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ441、ｎＣｆＬＧＩ
Ｃ2739、ｎＣｆＬＧＩＧ2016、ｎＣｆＮＡＨ2080、ｎＣｆＮＡＨ1824、ｎＣｆＣ
ＬＩＣ2283、ｎＣｆＣＬＩＣ786、ｎＣｆＰＬ２1291、ｎＣｆＰＬ２1173、ｎＣ
ｆＰＬ３406、ｎＣｆＰＬ３243、ｎＣｆＰＬ４974、ｎＣｆＰＬ４1043、ｎＣｆ
ＰＬ４1062、ｎＣｆＰＬ４855、ｎＣｆＳＶＰ1875、ｎＣｆＳＶＰ1590、ｎＣｆ
ＶＧＣＣ381、ｎＣｆＶＧＣＣ2191、ｎＧｆＶＧＧＣ1968、ｎＣｆＶＧＣＣ673、
ｎＧｆＶＧＣＣ3126、ｎＧｆＶＧＣＣ2553、ｎＣｆＡＵＰ1181、ｎＣｆＡＵＰ30 6 、ｎＣｆ７Ｂ２2161、ｎＣｆ７Ｂ２801、ｎＣｆ７Ｂ２741、又はそれらの核酸
分子のうちの任意のものの対立変異型。別の好ましい単離蛋白質は、配列番号１
、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列
番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番
号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４６、配列番号
１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６５、
配列番号１６８、配列番号１８５９、配列番号１８６１、配列番号１８６４、配
列番号１８６７、配列番号１８７０、配列番号１８７２、配列番号１８７５、配
列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８１、配列番号１８８２、配
列番号１８８５、配列番号１８８７、配列番号１８９０、配列番号１８９２、配
列番号１８９４、配列番号１８９６、配列番号１８９９、配列番号１９０１、配
列番号１９０４、配列番号１９０６、配列番号１９０８、配列番号１９１０、配
列番号１９１２、配列番号１９１４、配列番号１９１７、配列番号１９１９、配
列番号１９２２、配列番号１９２４、配列番号１９２７及び／又は配列番号１９
２９の核酸配列を有する核酸分子によりコードされるか、若しくは上記に列挙し
た核酸分子のうちの任意のものの対立変異型よりコードされた蛋白質である。
【０１５３】 本発明の好ましい蛋白質は、ＰＣｆＡＬＮ384、ＰＣｆＣＢＰ272、ＰＣｆＮＫ
ＡＢ326、ＰＣｆＬＧＩＣ569、ＰＣｆＡＮＯＮ398、ＰＣｆＭＡＬＶ254、ＰＣｆ
ＯＳＤ135、ＰＣｆＮＭＤＡ246、ＰＣｆＣＬＢＰ１Ａ147またはＰＣｆＣＬＢＰ
２Ａ147と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約８５％以上、
好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約
１００％相同な蛋白質から成る。ＰＣｆＡＬＮ384、ＰＣｆＣＢＰ272、ＰＣｆＮ
ＫＡＢ326、ＰＣｆＬＧＩＣ569、ＰＣｆＡＮＯＮ398、ＰＣｆＭＡＬＶ254、ＰＣ
ｆＯＳＤ135、ＰＣｆＮＭＤＡ246、ＰＣｆＣＬＢＰ１Ａ147、ＰＣｆＣＬＢＰ２
Ａ147、ＰＣｆｆＬＧＩＣ672、ＰＣｆＮＡＨ608、ＰＣｆＣＬＩＣ262、ＰＣｆＰ
Ｌ２391、ＰＣｆＰＬ３81、ＰＣｆＰＬ４285、ＰＣｆＳＶＰ530、ＰＣｆＶＧＣ
Ｃ851、ＰＣｆＡＵＰ102、ＰＣｆ７Ｂ２267、ＰＣｆ７Ｂ２247の蛋白質をコード
する核酸分子の対立変異型によりコードされた蛋白質も好ましい。さらに、少な
くとも約６つのアミノ酸残基を有するそれらのフラグメントも好ましい。
【０１５４】 本発明の他の好ましいＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質には、配列番号２、配列番号８
、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、
配列番号４４、配列番号１５４、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１
６９、配列番号１８６２、配列番号１８６８、配列番号１８７３、配列番号１８
７９、配列番号１８８３、配列番号１８８８、配列番号１８９７、配列番号１９
０２、配列番号１９１５、配列番号１９２０、配列番号１９２５及び／又は配列
番号１９３０のアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好
ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９
５％以上、さらに好ましくは約１００％のと相同なアミノ酸配列を有する蛋白質
と、配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配
列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号１５４、配列番号１６０、
配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１８６２、配列番号１８６８、配列
番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号１８８３、配列番号１８８８、配列
番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号１９１５、配列番号１９２０、配列
番号１９２５及び／又は配列番号１９３０のアミノ酸配列を有するＨＭＴ及びＨ
ＮＣ蛋白質をコードする核酸分子の対立変異型によりコードされた蛋白質が含ま
れる。さらに、少なくとも約６つのアミノ酸残基を有するそれらのフラグメント
も好ましい。
【０１５５】 本発明の１実施態様において、Ｃ．ｆｅｌｉｓ ＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質は、
配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番
号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号１５４、配列番号１６０、配列
番号１６３、配列番号１６９、配列番号１８６２、配列番号１８６８、配列番号
１８７３、配列番号１８７９、配列番号１８８３、配列番号１８８８、配列番号
１８９７、配列番号１９０２、配列番号１９１５、配列番号１９２０、配列番号
１９２５及び／又は配列番号１９３０のアミノ酸配列（配列番号２、配列番号８
、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、
配列番号４４、配列番号１５４、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１
６９、配列番号１８６２、配列番号１８６８、配列番号１８７３、配列番号１８
７９、配列番号１８８３、配列番号１８８８、配列番号１８９７、配列番号１９
０２、配列番号１９１５、配列番号１９２０、配列番号１９２５及び／又は配列
番号１９３０のアミノ酸配列から成る蛋白質、融合蛋白質、多価蛋白質を含むが
それらに限定されるわけではない）と、配列番号２、配列番号８、配列番号１４
、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、
配列番号１５４、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号
１８６２、配列番号１８６８、配列番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号
１８８３、配列番号１８８８、配列番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号
１９１５、配列番号１９２０、配列番号１９２５及び／又は配列番号１９３０の
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードする核酸分子の対立変異型によりコードさ
れた蛋白質を含む。
【０１５６】 １実施態様において、好ましいノミＨＭＴ又はＨＮＣ蛋白質は、約３５以上の
アミノ酸、好ましくは約５０以上のアミノ酸、より好ましくは約１００以上のア
ミノ酸、より好ましくは約２００以上のアミノ酸、より好ましくは約２５０以上
のアミノ酸、より好ましくは約３００以上のアミノ酸、より好ましくは約３５０
以上のアミノ酸、より好ましくは約４００以上のアミノ酸、より好ましくは約５
００以上のアミノ酸、より好ましくは約５５０以上のアミノ酸、さらに好ましく
は約５７５以上のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、好ましい
ノミＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質は、完全長の蛋白質、すなわち、完全長のコード領
域によってコードされた蛋白質又はその翻訳後修飾蛋白質（例えば開始メチオニ
ン及び／又はシグナル配列若しくは「プロ」配列が除去された成熟蛋白質）を含
む。
【０１５７】 本発明のＨＮＣ及び／又はＨＮＣ蛋白質のフラグメントは、約５以上のアミノ
酸、より好ましくは約１０以上のアミノ酸、より好ましくは約１５以上のアミノ
酸、より好ましくは約２０以上のアミノ酸、より好ましくは約２５以上のアミノ
酸、より好ましくは約３０以上のアミノ酸、より好ましくは約３５以上のアミノ
酸、より好ましくは約４０以上のアミノ酸、より好ましくは約４５以上のアミノ
酸、より好ましくは約５０以上のアミノ酸、より好ましくは約５５以上のアミノ
酸、より好ましくは約６０以上のアミノ酸、より好ましくは約６５以上のアミノ
酸、より好ましくは約７０以上のアミノ酸、より好ましくは約７５以上のアミノ
酸、より好ましくは約８０以上のアミノ酸、より好ましくは約８５以上のアミノ
酸、より好ましくは約９０以上のアミノ酸、より好ましくは約９５以上のアミノ
酸、さらに好ましくは約１００のアミノ酸の長さを有する。
【０１５８】 本発明のさらなる好ましいＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質には、ｎＣｆＡＬＮ2057、
ｎＣｆＡＬＮ1152、ｎＣｆＣＢＰ1128、ｎＣｆＣＢＰ816、ｎＣｆＮＫＡＢ1714
、ｎＣｆＮＫＡＢ978、ｎＣｆＬＧＩＣ2240、ｎＣｆＬＧＩＣ1707、ｎＣｆＡＮ
ＯＮ1429、ｎＣｆＡＮＯＮ1194、ｎＣｆＭＡＬＶ765、ｎＣｆＭＡＬＶ762、ｎＣ
ｆＯＳＤ604、ｎＣｆＯＳＤ405、ｎＣｆＮＭＤＡ1227、ｎＣｆＮＭＤＡ738、ｎ
ＣｆＣＬＢＰ１Ａ633、ｎＣｆＣＬＢＰｌＡ441、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ631、ｎＣ
ｆＣＬＢＰ２Ａ441、ｎＣｆＬＧＩＣ2739、ｎＣｆＬＧＩＧ2016、ｎＣｆＮＡＨ2 080 、ｎＣｆＮＡＨ1824、ｎＣｆＣＬＩＣ2283、ｎＣｆＣＬＩＣ786、ｎＣｆＰＬ
２1291、ｎＣｆＰＬ２1173、ｎＣｆＰＬ３406、ｎＣｆＰＬ３243、ｎＣｆＰＬ４ 974 、ｎＣｆＰＬ４1043、ｎＣｆＰＬ４1062、ｎＣｆＰＬ４855、ｎＣｆＳＶＰ18 75 、ｎＣｆＳＶＰ1590、ｎＣｆＶＧＣＣ381、ｎＣｆＶＧＣＣ2191、ｎＧｆＶＧ
ＧＣ1968、ｎＣｆＶＧＣＣ673、ｎＧｆＶＧＣＣ3126、ｎＧｆＶＧＣＣ2553、ｎ
ＣｆＡＵＰ1181、ｎＣｆＡＵＰ306、ｎＣｆ７Ｂ２2161、ｎＣｆ７Ｂ２801、ｎＣ
ｆ７Ｂ２741、の少なくとも一部を含む核酸分子によりコードされた蛋白質と、
そのような核酸分子の対立変異型によってコードされたＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質
が含まれる。そのようなＨＭＴ及びＨＮＣ核酸分子の一部は、好ましくは長さが
１８以上のヌクレオチドである。
【０１５９】 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番
号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号
３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４
６、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列
番号１６５、配列番号１６８、配列番号１８５９、配列番号１８６１、配列番号
１８６４、配列番号１８６７、配列番号１８７０、配列番号１８７２、配列番号
１８７５、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８１、配列番号
１８８２、配列番号１８８５、配列番号１８８７、配列番号１８９０、配列番号
１８９２、配列番号１８９４、配列番号１８９６、配列番号１８９９、配列番号
１９０１年、配列番号１９０４、配列番号１９０６、配列番号１９０８、配列番
号１９１０、配列番号１９１２、配列番号１９１４、配列番号１９１７、配列番
号１９１９、配列番号１９２２、配列番号１９２４、配列番号１９２７及び／又
は配列番号１９２９の少なくとも一部を含む核酸配列を有する核酸分子によりコ
ードされたＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質及びそのような核酸分子の対立変異型により
コードされたＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質も好ましい。そのようなＨＭＴ及びＨＮＣ
核酸分子の一部は、好ましくは長さが１８以上のヌクレオチドである。
【０１６０】 別の実施態様において、本発明の好ましいノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質
は、長さが約１５以上のヌクレオチド、より好ましくは約１８以上のヌクレオチ
ド、より好ましくは約２０以上のヌクレオチド、より好ましくは約２５以上のヌ
クレオチド、より好ましくは約３０以上のヌクレオチド、より好ましくは約４０
以上のヌクレオチド、より好ましくは約５０以上のヌクレオチド、より好ましく
は約１００以上のヌクレオチド、より好ましくは約１５０以上のヌクレオチド、
より好ましくは約３５０以上のヌクレオチド、より好ましくは約４５０以上のヌ
クレオチド、より好ましくは約５５０以上のヌクレオチド、より好ましくは約６
５０以上のヌクレオチド、より好ましくは約７５０以上のヌクレオチド、より好
ましくは約１０００以上のヌクレオチド、より好ましくは約１５００以上のヌク
レオチド、より好ましくは約１７５０以上のヌクレオチド、より好ましくは約２
０００以上のヌクレオチド、さらに好ましくは約２２５０以上のヌクレオチドを
含む核酸分子によりコードされる。この実施態様の範囲内に、ｎＣｆＡＬＮ2057 、ｎＣｆＡＬＮ1152、ｎＣｆＣＢＰ1128、ｎＣｆＣＢＰ816、ｎＣｆＮＫＡＢ171 4 、ｎＣｆＮＫＡＢ978、ｎＣｆＬＧＩＣ2240、ｎＣｆＬＧＩＣ1707、ｎＣｆＡＮ
ＯＮ1429、ｎＣｆＡＮＯＮ1194、ｎＣｆＭＡＬＶ765、ｎＣｆＭＡＬＶ762、ｎＣ
ｆＯＳＤ604、ｎＣｆＯＳＤ405、ｎＣｆＮＭＤＡ1227、ｎＣｆＮＭＤＡ738、ｎ
ＣｆＣＬＢＰ１Ａ633、ｎＣｆＣＬＢＰｌＡ441、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ631、ｎＣ
ｆＣＬＢＰ２Ａ441、ｎＣｆＬＧＩＣ2739、ｎＣｆＬＧＩＧ2016、ｎＣｆＮＡＨ2 080 、ｎＣｆＮＡＨ1824、ｎＣｆＣＬＩＣ2283、ｎＣｆＣＬＩＣ786、ｎＣｆＰＬ
２1291、ｎＣｆＰＬ２1173、ｎＣｆＰＬ３406、ｎＣｆＰＬ３243、ｎＣｆＰＬ４ 974 、ｎＣｆＰＬ４1043、ｎＣｆＰＬ４1062、ｎＣｆＰＬ４855、ｎＣｆＳＶＰ18 75 、ｎＣｆＳＶＰ1590、ｎＣｆＶＧＣＣ381、ｎＣｆＶＧＣＣ2191、ｎＧｆＶＧ
ＧＣ1968、ｎＣｆＶＧＣＣ673、ｎＧｆＶＧＣＣ3126、ｎＧｆＶＧＣＣ2553、ｎ
ＣｆＡＵＰ1181、ｎＣｆＡＵＰ306、ｎＣｆ７Ｂ２2161、ｎＣｆ７Ｂ２801、ｎＣ
ｆ７Ｂ２741の少なくとも一部によりコードされたＨＭＴ蛋白質又はそのような
核酸分子の任意のものの対立変異型によりコードされるＨＭＴ蛋白質がある。さ
らに別の実施態様において、本発明の好ましいノミＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質は、
見かけ上完全長のＨＭＴ又はＨＮＣコード領域を各々含む核酸分子、つまり見か
け上完全長のＨＭＴ又はＨＮＣ蛋白質をコードする核酸分子によってコードされ
る。
【０１６１】 本発明の好ましいノミＨＭＴ及びＨＮＣ蛋白質は、有効な方法で動物に投与さ
れた時にノミ侵襲から該動物を保護する阻害剤を創出するために使用することが
可能である。本発明によれば、ノミ侵襲から動物を保護する本発明の阻害剤の能
力は、ノミによって引き起こされた侵襲を例えば治療し、改善し、及び／又は予
防する該蛋白質の能力のことを指す。特に「ノミ侵襲からの動物の保護」という
句は、動物上及び動物周囲のノミの個体数増大の可能性を減らす（つまりノミに
よる被害を減らす）ことを指す。好ましくは、ノミ個体数の大きさは、動物がノ
ミによってもはや悩まされないという程度まで最良に減小する。本明細書に使用
する場合、宿主動物とは、ノミが該動物の皮膚に付着して該動物の皮膚を介して
摂食できる、動物のことを指す。ノミや他の外部寄生虫は、長期間宿お主動物に
頼って生活してもよいし、摂食するために動物に一時的にくっついてもよい。任
意の時において、ノミの個体数のうちのある割合が宿主動物上に存在する一方で
、残りは動物の環境にいてもよい。そのような環境は、成ノミだけでなくノミの
卵及び／又はノミの幼虫も含み得る。該環境は、該環境の中にいるノミが宿主動
物上に対してくっついたり離れたりすることが可能な任意のサイズである。例え
ば、動物の環境には作物等の植物が含まれ、それを介してノミは動物に寄生する
。そのため、動物それ自身にかかるノミによる被害を減らすだけでなく、動物の
環境におけるノミによる被害を減らすこと望ましい。
【０１６２】 標的とするのに適切なノミには、本発明の阻害剤を投与された動物で疾病を本
質的に引き起こすことができない任意のノミを含んでいる。標的とするのに好ま
しいノミには、以下の属のノミが含まれる：Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ、
Ｃｙｏｐｓｙｌｌｕｓ、Ｄｉａｍａｎｕｓ（Ｏｒｏｐｓｙｌｌａ）、Ｅｃｈｉｄ
ｎｏｐｈａｇａ、Ｎｏｓｏｐｓｙｌｌｕｓ、Ｐｕｌｅｘ、Ｔｕｎｇａ、及びＸｅ
ｎｏｐｓｙｌｌａ。その中でも、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｃａｎｉｓ
、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｉｓ、Ｄｉａｍａｎｕｓ ｍｏｎｔ
ａｎｕｓ、Ｅｃｈｉｄｎｏｐｈａｇａ ｇａｌｌｉｎａｃｅａ、Ｎｏｓｏｐｓｙ
ｌｌｕｓ ｆａｃｉａｔｕｓ、Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ、Ｐｕｌｅｘ ｓ
ｉｍｕｌａｎｓ、Ｔｕｎｇａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ及びＸｅｎｏｐｓｙｌｌａ
ｃｈｅｏｐｉｓ属はより好ましく、Ｃ．ｆｅｌｉｓはさらに好ましい。そのよう
なノミも、本発明の蛋白質又は核酸分子の単離用に好まれる。
【０１６３】 本発明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の１実施態様は、１又は複数の融
合セグメントに取り付けられたノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質含有ドメイン
を有する融合蛋白質である。本発明の使用に適した融合セグメントは、蛋白質の
安定性を増強するセグメントには、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質に対する
免疫応答を増強する免疫増強剤として作用するセグメント、及び／又は（例えば
親和性クロマトグラフィーにより）ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＧ蛋白質の精製を
促進するセグメントが含まれるが、それらに限定されるわけではない。適切な融
合セグメントは、所望の機能（例えば、安定性の増加の付与、蛋白質免疫性を蛋
白質に増加させてかつ、または、蛋白質の精製を単純化する）を有する任意のサ
イズのドメインである。融合セグメントは、蛋白質のＨＭＴ含有ドメイン及び／
又はＨＮＣ含有ドメインのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端につなげるこ
とが可能であり、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の直接の回復を可能にする
ために分裂に弱くなりえる。融合蛋白質は、ＨＭＴ含有ドメイン及び／又はＨＮ
Ｃ含有ドメインのカルボキシル末端及び／又はアミノ末端に取り付けられた融合
セグメントを含む蛋白質をコードする融合核酸で形質転換した組換え細胞を培養
することにより好ましくは生産される。好ましい融合セグメントには、金属結合
ドメイン（例えばポリヒスチジンセグメント）、免疫グロブリン結合ドメイン（
例えばプロテインＡ、プロテインＧ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｆｃ受容体又は補体蛋白
質抗体結合ドメイン）、糖結合ドメイン（例えばマルトース結合ドメイン）、及
び／又は「タグ」ドメイン（例えば、β−ガラクトシダーゼの少なくとも一部、
連鎖球菌タグペプチド、Ｔ７タグペプチド、ＦｌａｇTMペプチド、又はモノクロ
ーナル抗体等のドメインと結合する化合物を用いて精製可能な他のドメイン）が
含まれる。より好ましい融合セグメントには、ポリヒスチジンセグメント等の金
属結合ドメイン、マルトース結合ドメイン、フロリダ州タンパ所在のＢｉｏｍｅ
ｔｒａ社より入手可能な連鎖球菌タグペプチド、並びにＳ１０ペプチドが含まれ
る。
【０１６４】 本発明は、本発明のノミＨＭＴ及び／又ＨＮＣ蛋白質の模倣分子も包含する。
本明細書に使用する場合、本発明のノミＨＭＴ及び／又ＨＮＣ蛋白質の模倣分子
とは、主に該模倣分子が特定のＨＭＴ及び／又ＨＮＣ蛋白質を模倣する構造を有
するが為にそのようなＨＭＴ及び／又ＨＮＣ蛋白質の活性を模倣することが可能
な任意の化合物を指す。模倣分子には、すべてのＤレトロペプチドなどの、分解
への感受性が低下するよう修飾されたペプチド、抗イディオタイプ抗体及び／又
は触媒抗体、それらのフラグメント、単離蛋白質の非蛋白質性免疫原性部分（例
えば炭水化物構造）、及び核酸を含めた合成又は天然の有機分子が含まれるが、
それらに限定されるわけではない。そのような模倣分子は、本発明の蛋白質のコ
ンピュータ生成構造を使用して設計することが可能である。模倣分子は、オリゴ
ヌクレオチド、ペプチド又は他の有機分子のような分子の無作為サンプルを生成
し、該サンプルを対応する結合相手を用いて親和性クロマトグラフィー技術によ
りスクリーニングすることによっても得ることが可能である。
【０１６５】 本発明の別の実施態様は、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子、すなわちＨ
ＭＴ ｃＤＮＡライブラリ、ＨＮＣ ｃＤＮＡライブラリ、又は両方のライブラ
リから単離可能な核酸分子ノミＨＭＴを含む、単離核酸分子である。本明細書で
使用する場合、ＨＭＴ及びＨＮＣ核酸分子は、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子
と同じ意味である。そのような核酸分子の同定特徴は先に説明している。本発明
の核酸分子は、単離した天然のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ遺伝子又はその同族
体を含み得る。該同族体については以下に詳しく説明する。本発明の核酸分子は
、１又は複数の調節領域、全長又は部分長のコード領域、又はそれらの組み合わ
せを含み得る。本発明の核酸分子の最小のサイズは、別の核酸分子の相補的配列
との安定なハイブリッドを形成する（つまりストリンジェントなハイブリッド形
成条件下でハイブリッド形成する）のに十分なサイズである。そのため、本発明
のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子の最小のサイズは、約１２〜約１８ヌクレオ
チド長である。本発明の核酸分子を単離するのに適した好ましいノミは、本明細
書に開示してある。特に好ましいＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子として、Ｃ．
ｆｅｌｉｓ ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子が挙げられる。
【０１６６】 本発明によれば、単離核酸分子は、その天然の環境から取り除かれた（つまり
人間の操作を受けた）核酸分子であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡかＲＮＡのい
ずれかの派生物を含む。その意味で、「単離（した）」とは、核酸分子が精製さ
れた程度を反映していない。本発明の単離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子
若しくはその同族体は、天然源から単離してもよいし、組換えＤＮＡ技術（例え
ばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅又はクローニング）や化学合成を使用し
て製造してもよい。単離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子、又はその同族体
は、例えば、天然対立変異型と、核酸分子本発明のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白
質をコードする核酸分子の能力に実質的に干渉しないようにヌクレオチドの挿入
、欠失、置換及び／又は逆位によって修飾された核酸分子を含み得る。
【０１６７】 本発明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子同族体は、当業者に周知の多く
の方法を用いて生産することが可能である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲）
を参照されたい。例えば、核酸分子は、部位特異的変異誘発などの古典的突然変
異生成及び組換えＤＮＡ技術、化学処理、制限酵素による開裂、核酸フラグメン
トのライゲーション、ＰＣＲ増幅、オリゴヌクレオチド混合物の合成、及び核酸
分子の混合物を「構築」するための混合物グループのライゲーション、並びにそ
れらの組み合わせを含むがそれらに限定されない種々の技術を用いて修正するこ
とが可能である。核酸分子の同族体は、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子と
のハイブリッド形成か、又は核酸分子によりコードされた蛋白質の機能（例えば
ノミＨＭＴ又はＨＮＣ蛋白質の少なくとも１つに対して免疫応答を誘発する能力
やＨＭＴ又はＨＮＣ活性に作用する能力）によりスクリーニングすることで選択
可能である。
【０１６８】 本発明の単離核酸分子には、本発明のノミＨＭＴ又はＨＮＣ蛋白質のうちの少
なくとも１つをコードする核酸配列を含み、そのような蛋白質の例を本明細書に
開示する。「核酸分子」という句は、主として物理的な核酸分子のことを指し、
「核酸配列」という句は、主として核酸分子上のヌクレオチドの配列のことを指
すが、２つの句は、特にノミＨＭＴ又はＨＮＣ蛋白質をコードすることが可能な
核酸分子又は核酸配列に関して、互換的に用いることが可能である。
【０１６９】 本発明の好ましい核酸分子は、動物に投与する場合、該動物をノミ侵襲から保
護できる。以下により詳細に開示するように、そのような核酸分子は、アンチセ
ンスＲＮＡ、３重ヘリックス形成できる分子、リボザイム、又は他の核酸ベース
の薬剤化合物であるか、それらをコードし得る。追加の実施態様では、本発明の
核酸分子は、保護蛋白質（例えば本発明のＨＭＴまたはＨＮＣ蛋白質）をコード
し得る。該核酸分子は、例えば、直接の注入（つまり遺伝ワクチンとしての）に
よって、又は組換えウイルスワクチン又は組換え細胞ワクチン等の賦形剤として
、動物に送達される。
【０１７０】 本発明の１実施態様において、好ましいノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子
は、好ましくは約３０以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは
約２５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約２０％以下
の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約１５％以下の塩基対誤対
合を許容する条件下で、より好ましくは約１０％以下の塩基対誤対合を許容する
条件下で、さらに好ましくは約５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、配
列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配
列番号ｌ０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列
番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番
号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号
３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４
０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８
、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番
号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５
、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１８５９、配列
番号１８６０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番号１８６４、配列
番号１８６６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番号１８７０、配列
番号１８７１、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番号１８７５、配列
番号１８７６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８０、配列
番号１８８１、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番号１８８５、配列
番号Ｉ８８６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番号１８９０、配列
番号１８９１、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番号１８９４、配列
番号１８９５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番号１８９９、配列
番号１９００、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９０４、配列
番号１９０５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番号１９０８、配列
番号１９０９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番号１９１２、配列
番号１９１３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番号１９１７、配列
番号１９１８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番号１９２２、配列
番号１９２３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番号１９２７、配列
番号１９２８、配列番号１９２９、及び／又は配列番号１９３１、又は表Ｉ、表
ＩＩ、表ＩＩＩ、及び／又は表ＩＶの核酸分子、及び／又は表Ｉ、表ＩＩ、表Ｉ
ＩＩ、又は表ＩＶの核酸分子に相補的な核酸分子から成る群より選択された核酸
分子とハイブリッド形成する単離核酸分子を含む。
【０１７１】 本発明の別の実施態様は、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子であって、約４７
．５℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で、配列番号１、
配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号ｌ０
、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、
配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配
列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列
番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番
号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号
１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９、
配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号
１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１８５９、配列番号１８６
０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番号１８６４、配列番号１８６
６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番号１８７０、配列番号１８７
１、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番号１８７５、配列番号１８７
６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８０、配列番号１８８
１、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番号１８８５、配列番号Ｉ８８
６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番号１８９０、配列番号１８９
１、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番号１８９４、配列番号１８９
５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番号１８９９、配列番号１９０
０、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９０４、配列番号１９０
５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番号１９０８、配列番号１９０
９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番号１９１２、配列番号１９１
３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番号１９１７、配列番号１９１
８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番号１９２２、配列番号１９２
３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番号１９２７、配列番号１９２
８、配列番号１９２９、及び／又は配列番号１９３１、又は表Ｉ、表ＩＩ、表Ｉ
ＩＩ、又は表ＩＶの核酸分子、及び／又は表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、又は表ＩＶ
の核酸分子に相補的な核酸分子から成る群より選択された単離核酸分子とハイブ
リッド形成する核酸分子を含む。
【０１７２】 本発明のさらに好ましい核酸分子は、単離核酸分子のオリゴヌクレオチドであ
って、前記核酸分子が、約４７．５℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドと
を含む溶液中で、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号
７、配列番号９、配列番号ｌ０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、
配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配
列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列
番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番
号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号
４６、配列番号４８、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列
番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６
４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列
番号１８５９、配列番号１８６０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列
番号１８６４、配列番号１８６６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列
番号１８７０、配列番号１８７１、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列
番号１８７５、配列番号１８７６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列
番号１８８０、配列番号１８８１、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列
番号１８８５、配列番号Ｉ８８６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列
番号１８９０、配列番号１８９１、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列
番号１８９４、配列番号１８９５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列
番号１８９９、配列番号１９００、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列
番号１９０４、配列番号１９０５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列
番号１９０８、配列番号１９０９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列
番号１９１２、配列番号１９１３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列
番号１９１７、配列番号１９１８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列
番号１９２２、配列番号１９２３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列
番号１９２７、配列番号１９２８、配列番号１９２９、及び／又は配列番号１９
３１、又は表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、又は表ＩＶの核酸分子、及び／又は表Ｉ、
表ＩＩ、表ＩＩＩ、又は表ＩＶの核酸分子に相補的な核酸分子から成る群より選
択された単離核酸分子とハイブリッド形成するものであり、約１８以上のヌクレ
オチドから成るオリゴヌクレオチドを含む。
【０１７３】 さらに好ましい本発明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子は、配列番号１
、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号ｌ
０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８
、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、
配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配
列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列
番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番
号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９
、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番
号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１８５９、配列番号１８
６０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番号１８６４、配列番号１８
６６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番号１８７０、配列番号１８
７１、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番号１８７５、配列番号１８
７６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８０、配列番号１８
８１、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番号１８８５、配列番号Ｉ８
８６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番号１８９０、配列番号１８
９１、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番号１８９４、配列番号１８
９５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番号１８９９、配列番号１９
００、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９０４、配列番号１９
０５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番号１９０８、配列番号１９
０９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番号１９１２、配列番号１９
１３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番号１９１７、配列番号１９
１８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番号１９２２、配列番号１９
２３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番号１９２７、配列番号１９
２８、配列番号１９２９、及び／又は配列番号１９３１、又は表Ｉ、表ＩＩ、表
ＩＩＩ、又は表ＩＶの核酸分子、及び／又は表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、又は表Ｉ
Ｖの核酸分子に相補的な核酸分子から成る群より選択された核酸分子と、好まし
くは約７０％以上、より好ましくは約７５％以上、より好ましくは約８０％以上
、より好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％、さらに好ましくは約
９５％以上相同な核酸配列を有する核酸分子を含む。そのような核酸分子の任意
のオリゴヌクレオチドも好ましい。同一性パーセントは、デフォルトパラメータ
を用いて、ＧＣＧTM Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ
９．０配列分析ソフトウェアを使用して決定される。
【０１７４】 本発明の１実施態様は、核酸分子ｎＣｆＡＬＮ2057、ｎＣｆＡＬＮ1152、ｎＣ
ｆＣＢＰ1128、ｎＣｆＣＢＰ816、ｎＣｆＮＫＡＢ1714、ｎＣｆＮＫＡＢ978、ｎ
ＣｆＬＧＩＣ2240、ｎＣｆＬＧＩＣ1707、ｎＣｆＡＮＯＮ1429、ｎＣｆＡＮＯＮ 1194 、ｎＣｆＭＡＬＶ765、ｎＣｆＭＡＬＶ762、ｎＣｆＯＳＤ604、ｎＣｆＯＳ
Ｄ405、ｎＣｆＮＭＤＡ1227、ｎＣｆＮＭＤＡ738、ｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ633、ｎ
ＣｆＣＬＢＰｌＡ441、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ631、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ441、ｎＣ
ｆＬＧＩＣ2739、ｎＣｆＬＧＩＧ2016、ｎＣｆＮＡＨ2080、ｎＣｆＮＡＨ1824、
ｎＣｆＣＬＩＣ2283、ｎＣｆＣＬＩＣ786、ｎＣｆＰＬ２1291、ｎＣｆＰＬ２117 3 、ｎＣｆＰＬ３406、ｎＣｆＰＬ３243、ｎＣｆＰＬ４974、ｎＣｆＰＬ４1043、
ｎＣｆＰＬ４1062、ｎＣｆＰＬ４855、ｎＣｆＳＶＰ1875、ｎＣｆＳＶＰ1590、
ｎＣｆＶＧＣＣ381、ｎＣｆＶＧＣＣ2191、ｎＧｆＶＧＧＣ1968、ｎＣｆＶＧＣ
Ｃ673、ｎＧｆＶＧＣＣ3126、ｎＧｆＶＧＣＣ2553、ｎＣｆＡＵＰ1181、ｎＣｆ
ＡＵＰ306、ｎＣｆ７Ｂ２2161、ｎＣｆ７Ｂ２801、ｎＣｆ７Ｂ２741又はそれら
の核酸分子のうちの任意のものの対立変異型の全体又は一部から成る核酸分子で
ある。
【０１７５】 本発明の別の好ましい核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配
列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号ｌ０、配列番号１２、配列番号１
３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１
、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、
配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配
列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列
番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号１５３、配列番号１５５、配
列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１
６２、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配
列番号１７０、配列番号１８５９、配列番号１８６０、配列番号１８６１、配列
番号１８６３、配列番号１８６４、配列番号１８６６、配列番号１８６７、配列
番号１８６９、配列番号１８７０、配列番号１８７１、配列番号１８７２、配列
番号１８７４、配列番号１８７５、配列番号１８７６、配列番号１８７７、配列
番号１８７８、配列番号１８８０、配列番号１８８１、配列番号１８８２、配列
番号１８８４、配列番号１８８５、配列番号Ｉ８８６、配列番号１８８７、配列
番号１８８９、配列番号１８９０、配列番号１８９１、配列番号１８９２、配列
番号１８９３、配列番号１８９４、配列番号１８９５、配列番号１８９６、配列
番号１８９８、配列番号１８９９、配列番号１９００、配列番号１９０１、配列
番号１９０３、配列番号１９０４、配列番号１９０５、配列番号１９０６、配列
番号１９０７、配列番号１９０８、配列番号１９０９、配列番号１９１０、配列
番号１９１１、配列番号１９１２、配列番号１９１３、配列番号１９１４、配列
番号１９１６、配列番号１９１７、配列番号１９１８、配列番号１９１９、配列
番号１９２１、配列番号１９２２、配列番号１９２３、配列番号１９２４、配列
番号１９２６、配列番号１９２７、配列番号１９２８、配列番号１９２９、及び
／又は配列番号１９３１、及び／又は表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、又は表ＩＶの核
酸分子、それらの核酸配列を有する核酸分子の対立変異型、並びに、それらの核
酸配列を有する核酸分子の同族体の少なくとも１部を含む。好ましくはそのよう
な同族体は、配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０、配列番号
２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号１５４、配列番号
１６０、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１８６２、配列番号１８６
８、配列番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号１８８３、配列番号１８８
８、配列番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号１９１５、配列番号１９２
０、配列番号１９２５及び／又は配列番号１９３０のアミノ酸配列を有する蛋白
質に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープをコードする核酸分
子をコードするか、該核酸分子に相補的である。上記配列番号に含まれる核酸分
子に加えて、該核酸分子は、全長遺伝子、全長コード領域、融合蛋白質をコード
する核酸分子、又は多価保護化合物をコードする核酸分子等のヌクレオチドを含
むがそれらに限定されるわけではない。
【０１７６】 １実施態様において、本発明のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子は、ＰＣｆＡ
ＬＮ384、ＰＣｆＣＢＰ272、ＰＣｆＮＫＡＢ326、ＰＣｆＬＧＩＣ569、ＰＣｆＡ
ＮＯＮ398、ＰＣｆＭＡＬＶ254、ＰＣｆＯＳＤ135、ＰＣｆＮＭＤＡ246、ＰＣｆ
ＣＬＢＰ１Ａ147、ＰＣｆＣＬＢＰ２Ａ147、ＰＣｆｆＬＧＩＣ672、ＰＣｆＮＡ
Ｈ608、ＰＣｆＣＬＩＣ262、ＰＣｆＰＬ２391、ＰＣｆＰＬ３81、ＰＣｆＰＬ４2 85 、ＰＣｆＳＶＰ530、ＰＣｆＶＧＣＣ851、ＰＣｆＡＵＰ102、ＰＣｆ７Ｂ２267 、ＰＣｆ７Ｂ２247及び／又は表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、及び／又は表ＩＶの配
列を有する核酸分子によりコードされた蛋白質と、約７０％以上、好ましくは約
７５％以上、より好ましくは約８０％以上、さらにより好ましくは約８５％以上
、さらにより好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上、さ
らにより好ましくは約９８％以上、さらにより好ましくは約１００％以上相同な
蛋白質をコードする。
【０１７７】 １実施態様において、本発明のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子は、配列番号
２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、
配列番号３８、配列番号４４、配列番号１５４、配列番号１６０、配列番号１６
３、配列番号１６９、配列番号１８６２、配列番号１８６８、配列番号１８７３
、配列番号１８７９、配列番号１８８３、配列番号１８８８、配列番号１８９７
、配列番号１９０２、配列番号１９１５、配列番号１９２０、配列番号１９２５
及び／又は配列番号１９３０、並びに／若しくは表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、及び
／又は表ＩＶの配列を有する核酸分子によりコードされた蛋白質と、約７０％以
上、好ましくは約７５％以上、より好ましくは約８０％以上、さらにより好まし
くは約８５％以上、さらにより好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは
約９５％以上、さらにより好ましくは約９８％以上、さらにより好ましくは約１
００％以上相同なアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする。本発明は、配列番
号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２
、配列番号３８、配列番号４４、配列番号１５４、配列番号１６０、配列番号１
６３、配列番号１６９、配列番号１８６２、配列番号１８６８、配列番号１８７
３、配列番号１８７９、配列番号１８８３、配列番号１８８８、配列番号１８９
７、配列番号１９０２、配列番号１９１５、配列番号１９２０、配列番号１９２
５及び／又は配列番号１９３０の少なくとも一部を有する蛋白質、並びに／若し
くは表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、及び／又は表ＩＶの配列を有する核酸分子により
コードされた蛋白質をコードするＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子、並びに（上
記核酸分子を発現する細胞のコドン利用特性の便宜を計るように修飾された核酸
分子を含めた）上記配列を有する蛋白質をコードする核酸分子の対立変異型も含
む。
【０１７８】 別の実施態様において、本発明の好ましいノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分
子は、長さが約１５以上のヌクレオチド、より好ましくは約１８以上のヌクレオ
チド、より好ましくは約２０以上のヌクレオチド、より好ましくは約２５以上の
ヌクレオチド、より好ましくは約３０以上のヌクレオチド、より好ましくは約４
０以上のヌクレオチド、より好ましくは約５０以上のヌクレオチド、より好まし
くは約１００以上のヌクレオチド、より好ましくは約１５０以上のヌクレオチド
、より好ましくは約３５０以上のヌクレオチド、より好ましくは約４５０以上の
ヌクレオチド、より好ましくは約５５０以上のヌクレオチド、より好ましくは約
６５０以上のヌクレオチド、より好ましくは約７５０以上のヌクレオチド、より
好ましくは約１０００以上のヌクレオチド、より好ましくは約１５００以上のヌ
クレオチド、より好ましくは約１７５０以上のヌクレオチド、より好ましくは約
２０００以上のヌクレオチド、さらに好ましくは約２２５０以上のヌクレオチド
を含む核酸分子から成る。
【０１７９】 別の実施態様において、好ましいノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子は、約
５以上のアミノ酸、好ましくは約６以上のアミノ酸、より好ましくは約１０以上
のアミノ酸、より好ましくは約１５以上のアミノ酸、より好ましくは約２０以上
のアミノ酸、より好ましくは約２５以上のアミノ酸、より好ましくは約３０以上
のアミノ酸、約４０以上のアミノ酸、好ましくは約５０以上のアミノ酸、より好
ましくは約１００以上のアミノ酸、より好ましくは約１５０以上のアミノ酸、よ
り好ましくは約２００以上のアミノ酸、より好ましくは約３００以上のアミノ酸
、より好ましくは約４００以上のアミノ酸、より好ましくは約５００以上のアミ
ノ酸、さらにより好ましくは約５６０以上のアミノ酸から成る蛋白質をコードす
る。
【０１８０】 別の実施態様において、本発明の好ましいノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分
子は、見かけ上完全長のＨＭＴ及び／又はＨＮＣコード領域を含む。つまり、好
ましい核酸分子は、見かけ上完全長のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質又はその翻
訳後修飾蛋白質をコードする。１実施態様において本発明の好ましいノミＨＭＴ
及び／又はＨＮＣ核酸分子は、成熟蛋白質をコードする。
【０１８１】 別の実施態様において、本発明の好ましいノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分
子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番
号９、配列番号ｌ０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１
６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４
、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、
配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配
列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列
番号４８、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８
、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番
号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１８５
９、配列番号１８６０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番号１８６
４、配列番号１８６６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番号１８７
０、配列番号１８７１、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番号１８７
５、配列番号１８７６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８
０、配列番号１８８１、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番号１８８
５、配列番号Ｉ８８６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番号１８９
０、配列番号１８９１、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番号１８９
４、配列番号１８９５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番号１８９
９、配列番号１９００、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９０
４、配列番号１９０５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番号１９０
８、配列番号１９０９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番号１９１
２、配列番号１９１３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番号１９１
７、配列番号１９１８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番号１９２
２、配列番号１９２３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番号１９２
７、配列番号１９２８、配列番号１９２９、及び／又は配列番号１９３１を有す
る核酸分子を含む。
【０１８２】 いくつかの本発明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子の核酸配列が分れば
、当業者が、例えば、（ａ）それらの核酸分子のコピーを作ったり、（ｂ）その
ような核酸分子の少なくとも一部（例えば、全長遺伝子、全長コード領域、調節
制御配列、切断コード領域を含めた核酸分子）を含む核酸分子を得たり、（ｃ）
他のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子を得たりすることができる。そのよう
な核酸分子は、本発明の抗体を用いた適切な発現ライブラリのスクリーニング；
適切なライブラリをスクリーニングするための本発明のオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いた慣用のクローニング技術；及び本発明のオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いた適切なライブラリ又はＤＮＡのＰＣＲ増幅を含めた種々の方法で得
ることができる。核酸分子のスクリーニング又は増幅に好ましいライブラリには
、ノミの第一齢幼虫；第三齢幼虫、移行期幼虫、さなぎ期幼虫、さなぎ及び全ノ
ミ成虫のｃＤＮＡライブラリ及びゲノムＤＮＡライブラリが含まれる。同様に、
核酸分子のスクリーニング又は増幅に好ましいＤＮＡ源としては、ノミさなぎｃ
ＤＮＡ、成虫ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡがある。遺伝子のクローニング及び増幅
技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲に開示されている。
【０１８３】 本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下に、Ｃ．ｆｅｌ
ｉｓＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子の又は他のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核
酸分子などを含む、本発明の他の好ましくはより長い核酸分子の相補領域とハイ
ブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである酢酸分子を包含する。本発明のオリ
ゴヌクレオチドは、ＲＮＡであっても、ＤＮＡであっても、どちらかの誘導体で
あってよい。そのようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、オリゴヌクレオチ
ドと本発明の核酸分子上の相補配列との間で安定したハイブリッドを形成するの
に要求されるサイズである。好ましい本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましく
は約１００〜２００ヌクレオチドの最大サイズを有する。本発明は、例えば、核
酸分子を同定するためのプローブ、核酸分子を産生させるためのプライマー、又
はノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の産生もしくは活性を阻害するための治療
試薬として（例えば、アンチセンス試薬、三重らせん形成試薬、リボザイム及び
／又はＲＮＡ薬剤ベースの試薬として）用い得るオリゴヌクレオチドを包含する
。さらに、本発明は、そのような技術を１種以上用いて病気から動物を保護する
ための上記オリゴヌクレオチドの使用を包含する。適切なオリゴヌクレオチド含
有治療組成物は、当業者には公知の技術を用いて動物に投与し得る。
【０１８４】 本発明の１つの実施態様は組換えベクターであって、宿主細胞内にこの核酸分
子を送達し得る任意のベクターに挿入された少なくとも１つの単離された本発明
の核酸分子を含むこの組換えベクターを包含する。そのようなベクターは、異種
核酸配列、すなわち、通常、本発明の核酸分子に隣接しては見出されず、好まし
くは、本発明の核酸分子が由来する種以外の種から誘導された核酸配列を含む。
組換えベクターは、ＲＮＡでもＤＮＡでもよいし、原核性でも真核性でもよく、
通常、ウイルス又はプラスミドである。組換えベクターは、本発明のノミＨＭＴ
及び／又はＨＮＣ核酸分子のクローニング、配列決定、及び／又は操作に用い得
る。
【０１８５】 本明細書で組換え分子と称する組換えベクターの１つのタイプは、発現ベクタ
ーに機能的に結合された本発明の核酸分子を含む。機能的に結合されたとという
表現は、核酸分子が宿主細胞内に形質転換されたときに発現し得るような方法で
核酸分子を発現ベクター中に挿入することを表す。本明細書に使用する場合、発
現ベクターとは、宿主細胞を形質転換して、特定の核酸分子を発現させ得るＤＮ
Ａ又はＲＮＡベクターである。また、発現ベクターは宿主細胞内で複製し得るの
が好ましい。発現ベクターは、原核生物由来でも真核生物由来もよく、通常、ウ
イルス又はプラスミドである。本発明の発現ベクターは、細菌、菌類、寄生虫、
昆虫、他の動物及び植物細胞内を含めた本発明の組換え細胞内で機能する（すな
わち、遺伝子発現を誘導する）任意のベクターを包含する。好ましい本発明の発
現ベクターは、細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞、より好ましくは本明細書に
開示されている細胞タイプ内で遺伝子発現を誘導し得る。
【０１８６】 特に、本発明の発現ベクターは、転写調節配列、翻訳調節配列、複製起点など
の調節配列、及び組換え細胞と適合しかつ本発明の核酸分子の発現を調節する他
の調節配列を含んでいる。特に、本発明の組換え分子には、転写調節配列が含ま
れる。転写調節配列は、転写の開始、延長及び終結を調節する配列である。特に
重要な転写調節配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレ
ッサー配列などの転写開始を調節するものである。適当な転写調節配列には、少
なくとも１つの本発明組換え細胞内で機能し得る任意の転写調節配列が含まれる
。種々のそのような転写調節配列は当業者には公知である。好ましい転写調節配
列としては、細菌、酵母、又は昆虫及び哺乳動物細胞内で機能するもの、例えば
、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／Ｉｐｐ、ｒｍＢ
、（λＰL及びλＰR、ならびにそのようなプロモーターを含む融合物などの）バ
クテリオファージλ、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファー
ジＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオ
ネイン、アルファ交配因子、Ｐｉｃｈｉａアルコールオキシダーゼ、アルファウ
イルスサブゲノムプロモーター、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、ヘリ
オティス・ゼア（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ）昆虫ウイルス、ワクシニアウイ
ルス、ヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、他のポックスウイルス
、アデノウイルス、（即時型プロモーターなどの）サイトメガロウイルス、ＳＶ
４０、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルス
、熱ショック、リン酸及び硝酸転写調節配列ならびに原核又は真核細胞中で遺伝
子発現を調節し得る他の配列などが含まれるが、それらには限定されない。追加
の適当な転写調節配列には、組織特異プロモーター及びエンハンサーならびにリ
ンホカイン誘導プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキン
によって誘導し得るプロモーター）が含まれる。本発明の転写調節配列は、Ｃ．
ｆｅｌｉｓ転写調節配列などの天然でノミに関連する天然転写調節配列をも包含
し得る。
【０１８７】 本発明の組換えベクターに挿入するのに適当かつ好ましい核酸分子は本明細書
に開示されている通りである。組換えベクター、特に、組換え分子に挿入するの
に好ましい核酸分子には、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ及び／又は表ＩＶの配列を有
する核酸分子が含まれる。組換えベクター、特に組換え分子に挿入するのに特に
好ましい核酸分子としては、ｎＣｆＡＬＮ2057、ｎＣｆＡＬＮ1152、ｎＣｆＣＢ
Ｐ1128、ｎＣｆＣＢＰ816、ｎＣｆＮＫＡＢ1714、ｎＣｆＮＫＡＢ978、ｎＣｆＬ
ＧＩＣ2240、ｎＣｆＬＧＩＣ1707、ｎＣｆＡＮＯＮ1429、ｎＣｆＡＮＯＮ1194、
ｎＣｆＭＡＬＶ765、ｎＣｆＭＡＬＶ762、ｎＣｆＯＳＤ604、ｎＣｆＯＳＤ405、
ｎＣｆＮＭＤＡ1227、ｎＣｆＮＭＤＡ738、ｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ633、ｎＣｆＣＬ
ＢＰ１Ａ441、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ631、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ441、ｎＣｆＬＧＩ
Ｃ2739、ｎＣｆＬＧＩＣ2016、ｎＣｆＮＡＨ2080、ｎＣｆＮＡＨ1824、ｎＣｆＣ
ＬＩＣ2283、ｎＣｆＣＬＩＣ786、ｎＣｆＰＬ２1291、ｎＣｆＰＬ２1173、ｎＣ
ｆＰＬ３406、ｎＣｆＰＬ３243、ｎＣｆＰＬ４974、ｎＣｆＰＬ４1043、ｎＣｆ
ＰＬ４1062、ｎＣｆＰＬ４855、ｎＣＦＳＶＰ1875、ｎＣｆＳＶＰ1590、ｎＣｆ
ＶＧＣＣ381、ｎＣｆＶＧＣＣ2191、ｎＣｆＶＧＣＣ1968、ｎＣｆＶＧＣＣ673、
ｎＣｆＶＧＣＣ3126、ｎＣｆＶＧＣＣ2553、ｎＣｆＡＵＰ1181、ｎＣｆＡＵＰ30 6 、ｎＣｆ７Ｂ２2161、ｎＣｆ７Ｂ２801、ｎＣｆ７Ｂ２741が挙げられる。
【０１８８】 本発明の組換え分子は、さらに、（ａ）発現した本発明のノミ蛋白質をその蛋
白質を産生する細胞から分泌させる分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメン
ト核酸配列）を含み、及び／又は（ｂ）本発明の核酸分子の発現を融合蛋白質と
してもたらす融合配列を含み得る。適当なシグナル配列の例としては、本発明の
蛋白質の分泌を誘導し得る任意のシグナルセグメントがある。好ましいシグナル
セグメントとしては、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、イン
ターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性及びウイルスエン
ベロープ糖蛋白質シグナルセグメントが挙げられるが、それらには限定されない
。融合セグメント核酸によってコードされる適当な融合セグメントは本明細書に
開示されている。さらに、本発明の核酸分子は、コードされた蛋白質をユビキチ
ン融合セグメントなどのプロテオソームに誘導する融合セグメントに結合させる
ことができる。真核細胞組換え分子はさらに、本発明の核酸分子の核酸配列を取
り囲み及び／又は核酸配列内の介在配列及び／又は非翻訳配列を含み得る。
【０１８９】 本発明の別の実施態様は、１つ以上の本発明の組換え分子で形質転換された宿
主細胞を含む組換え細胞を包含する。核酸分子の細胞内への形質転換は、核酸分
子を細胞内に挿入し得る任意の方法によって達成することができる。形質転換法
には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクシ
ョン、リポフェクション、吸着及びプロトプラスト融合法が含まれるが、それら
には限定されない。組換え細胞は、単細胞のままでいたり、又は、組織、器官も
しくは多細胞微生物に成長したりすることもある。細胞系とは、トランスジェニ
ック動物ではない任意の本発明組換え細胞を表すことに留意されたい。本発明の
形質転換核酸分子は、染色体外にとどまっていてもよいし、それらの発現能力が
保持されるように形質転換（すなわち、組換え）細胞の染色体内の１つ以上の部
位に挿入してもよい。細胞の形質転換に用いるのに好ましい核酸分子としては、
本明細書に開示されているＣ．ｆｅｌｉｓＨＭＴ及びＨＮＣ核酸分子が含まれる
。細胞の形質転換に用いるのに好ましい核酸分子には、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ
及び／又は表ＩＶの配列を有する核酸分子が含まれる。細胞の形質転換に用いる
のに特に好ましい核酸分子としては、ｎＣｆＡＬＮ2057、ｎＣｆＡＬＮ1152、ｎ
ＣｆＣＢＰ1128、ｎＣｆＣＢＰ816、ｎＣｆＮＫＡＢ1714、ｎＣｆＮＫＡＢ978、
ｎＣｆＬＧＩＣ2240、ｎＣｆＬＧＩＣ1707、ｎＣｆＡＮＯＮ1429、ｎＣｆＡＮＯ
Ｎ1194、ｎＣｆＭＡＬＶ765、ｎＣｆＭＡＬＶ762、ｎＣｆＯＳＤ604、ｎＣｆＯ
ＳＤ405、ｎＣｆＮＭＤＡ1227、ｎＣｆＮＭＤＡ738、ｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ633、
ｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ441、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ631、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ441、ｎ
ＣｆＬＧＩＣ2739、ｎＣｆＬＧＩＣ2016、ｎＣｆＮＡＨ2080、ｎＣｆＮＡＨ1824 、ｎＣｆＣＬＩＣ2283、ｎＣｆＣＬＩＣ786、ｎＣｆＰＬ２1291、ｎＣｆＰＬ２1 173 、ｎＣｆＰＬ３406、ｎＣｆＰＬ３243、ｎＣｆＰＬ４974、ｎＣｆＰＬ４1043 、ｎＣｆＰＬ４1062、ｎＣｆＰＬ４855、ｎＣＦＳＶＰ1875、ｎＣｆＳＶＰ1590
、ｎＣｆＶＧＣＣ381、ｎＣｆＶＧＣＣ2191、ｎＣｆＶＧＣＣ1968、ｎＣｆＶＧ
ＣＣ673、ｎＣｆＶＧＣＣ3126、ｎＣｆＶＧＣＣ2553、ｎＣｆＡＵＰ1181、ｎＣ
ｆＡＵＰ306、ｎＣｆ７Ｂ２2161、ｎＣｆ７Ｂ２801、ｎＣｆ７Ｂ２741が挙げら
れる。
【０１９０】 形質転換に適した宿主細胞には、本発明の核酸分子で形質転換し得る任意の細
胞が含まれる。宿主細胞は、形質転換されていない細胞であっても、少なくとも
１つの核酸分子（例えば、１種以上の本発明のタンパク質及び／又は多価ワクチ
ンの生産に有用な他の蛋白質をコードする核酸分子）で既に形質転換されている
細胞であってもよい。本発明の宿主細胞は、内因的に（すなわち、天然に）本発
明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質を産生し得るか、又は少なくとも１つの
本発明の核酸分子で形質転換された後でそのような蛋白質を産生し得る。本発明
の宿主細胞は、少なくとも１種の本発明蛋白質を産生し得る任意の細胞であって
よく、細菌、（酵母を含めた）真菌、（ぜん虫、原虫類及び外部寄生虫を含めた
）寄生虫、他の昆虫、他の動物及び植物細胞を包含する。好ましい宿主細胞には
、細菌、マイコバクテリア、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞が含まれる。より好ま
しい宿主細胞としては、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エシェリヒア（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カウロバクター（
Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サッカロミセス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、スポドプテラ（Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、トリ
コプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）、ＢＨＫ（ベイビーハムスター腎臓）
細胞、ＭＤＣＫ細胞〔マディン・ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓
細胞系〕、ＣＰＦＫ細胞〔クランデル（Ｃｒａｎｄｅｌｌ）ネコ腎臓細胞系〕、
ＣＶ−１細胞（例えば、アライグマポックスウイルスの培養に用いられるアフリ
カアカゲサル腎臓細胞系）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞、ならびにベロ
（Ｖｅｒｏ）細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）Ｋ−１２誘導体を含めた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）；チ
フス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｈｙｐｈｉ）；ＵＫ−１x３９８７及びＳＲ
−１１x４０７２などの弱毒化株を含めたネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；カウロバクター；ピチア；スポドプテラ・フル
ジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；トリコプルシア・
ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）；ＢＨＫ細胞；ＭＤＣＫ細胞；ＣＲＦＫ
細胞；ＣＶ−１細胞；ＣＯＳ細胞；ベロ細胞；ならびに非腫瘍形成マウス筋芽細
胞Ｇ８細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２４６）である。さらなる適切な哺
乳動物細胞宿主には、他の腎臓細胞系、他の線維芽細胞系（例えば、ヒト、ネズ
ミ又はニワトリ胚線維芽細胞系）、骨髄腫細胞系、チャイニーズハムスター卵巣
細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ31細胞及び／又はヒーラー細胞が含
まれる。１つの実施態様において、本発明の蛋白質は、免疫グロブリンプロモー
ターを用いて骨髄腫細胞系内で異種蛋白質として発現され得る。
【０１９１】 組換え細胞は、１つ以上の組換え分子を用いて宿主細胞を形質転換して産生さ
せるのが好ましく、これらの組換え分子はそれぞれ、本明細書に例が開示されて
いる１つ以上の転写調節配列を含む発現ベクターに機能的に結合された１つ以上
の本発明の核酸分子を含んでいる。機能的に結合されたという表現は、宿主細胞
に形質転換されたときに核酸分子が発現され得るように発現ベクター中に核酸分
子を挿入することを表す。
【０１９２】 本発明の組換え細胞には、少なくとも１つの任意の本発明核酸分子で形質転換
された任意の細胞が含まれる。細胞の形質転換に用いるのに適当かつ好ましい核
酸分子及び組換え分子は本明細書に開示されている。
【０１９３】 また、本発明の組換え細胞は、本明細書に開示されているように（例えば、多
価ワクチンを生産するために）、１種以上の本発明蛋白質をコードするノミＨＭ
Ｔ及び／又はＨＮＣ核酸分子と、他の保護化合物をコードする１つ以上の他の核
酸分子とを含む１つ以上の組換え分子で同時形質転換することもできる。
【０１９４】 組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、それ
らの核酸分子の転写効率、得られた転写物の翻訳効率、及び翻訳後修飾効率を操
作して形質転換された核酸分子の発現を高めることができる。本発明の核酸分子
の発現を増大させるのに有用な組換え技術には、核酸分子の高コピー数プラスミ
ドへの機能的結合、１つ以上の宿主細胞染色体への核酸分子の組み込み、プラス
ミドへのベクター安定性配列の付加、転写調節シグナル（例えば、プロモーター
、オペレーター、エンハンサー）の置換又は修飾、翻訳調節シグナル（例えば、
リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ配列）の置換又は修飾、宿主細胞の
コドン使用に対応するための本発明の核酸分子の修飾、転写物を不安定にする配
列の欠失、及び発酵時に一時的に組換え細胞の成長を組換え酵素産生から分離す
る調節シグナルの使用が含まれるが、それらには限定されない。発現された本発
明組換え蛋白質の活性は、そのような蛋白質をコードする核酸分子の断片形成、
修飾、又は誘導体化により高め得る。
【０１９５】 本発明の単離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質は、天然蛋白質の産生及び回
収、組換え蛋白質の産生及び回収、ならびに蛋白質の化学合成を含めた種々の方
法で生産することができる。１つの実施態様において、本発明の単離蛋白質は、
蛋白質の産生に有効な条件下で蛋白質を発現し得る細胞を培養し、蛋白質を回収
して生産する。培養するのに好ましい細胞は、本発明の組換え細胞である。有効
な培養条件には、有効培地、バイオリアクター、蛋白質の産生を可能にする温度
、ｐＨ及び酸素条件が含まれるが、それらには限定されない。有効培地とは、本
発明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質を産生させるために細胞を培養する任
意の培地を表す。そのような培地は、通常、同化性炭素、窒素及びリン酸源、な
らびに適切な塩、ミネラル、金属や、ビタミンなどの他の栄養素を有する水性培
地を含む。本発明の細胞は、慣用の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試
験管、マイクロタイター皿、及びシャーレで培養することができる。培養は、組
換え細胞に適した温度、ｐＨ及び酸素含量下に実施し得る。そのような培養条件
は、当業者の専門的技術の範囲内である。適当な条件の例は実施例の項に記載さ
れている。
【０１９６】 産生に用いられるベクター及び宿主系によって、得られた本発明の蛋白質は、
組換え細胞内に留まるか、発酵培地中に分泌されるか、大腸菌の細胞周辺腔など
の２つの細胞膜間の空間に分泌されるか、又は細胞もしくはウイルス膜の外面上
に保持され得る。
【０１９７】 「蛋白質を回収する」という表現及び同様な語句は、蛋白質を含有する発酵培
地全体を回収することを表し、追加の分離又は精製工程を必ずしも伴う必要はな
い。本発明の蛋白質は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラ
フィー、クロマトフォーカシング及び示差可溶化など（但し、それらには限定さ
れない）の種々の標準蛋白質精製技術を用いて精製することができる。本発明の
蛋白質は、「実質的に純粋な」形態で回収するのが好ましい。本明細書に使用す
る場合、「実質的に純粋」とは、治療組成物又は診断薬としての蛋白質の有効利
用を可能にする純度を表す。例えば、動物用の治療組成物は、実質的な毒性を示
してはならず、治療した動物における抗体の産生を刺激し得るのが好ましい。
【０１９８】 本発明はさらに、本発明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質又はその模倣分
子（例えば、抗Ｃ．ｆｅｌｉｓＨＭＴもしくはＨＮＣ抗体）に選択的に結合する
単離された（すなわち、それらの天然環境から取り出された）抗体を包含する。
本明細書に使用する場合、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質に「選択的に結合する
」という用語は、本発明の特定の蛋白質及びその模倣分子に選択的に結合する本
発明抗体の能力を表す。結合は、エンザイムイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳ
Ａ）、イムノブロットアッセイなどを含めた当該技術分野では標準的な種々の方
法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲、及びＨａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ １９８８年；Ｈａｒｌｏｗら，前掲参照
）を用いて測定し得る。本発明の抗ＨＭＴ又は抗ＨＮＣ抗体は、それぞれノミＨ
ＭＴ又はＨＮＣ蛋白質に、その蛋白質の機能を阻害するように選択的に結合する
のが好ましい。
【０１９９】 本発明の単離抗体は、血清中の抗体又は種々の程度に精製された抗体を含み得
る。本発明の抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい
し、一本鎖抗体又は１つ以上のエピトープに結合し得るキメラ抗体を含めた抗体
フラグメント及び遺伝子設計された抗体などの機能的均等物であってよい。
【０２００】 本発明の抗体を産生させるのに好ましい方法は、（ａ）抗体の産生に有効な量
の本発明の蛋白質、ペプチド又はその模倣分子を動物に投与する工程と、（ｂ）
抗体を回収する工程とを含む。別の方法において、本発明の抗体は、上記に開示
したような本発明のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質産生技術を用いて組換えによ
り産生させる。明確にされた蛋白質又は模倣分子に対して産生された抗体は有利
であり得る。何故なら、そのような抗体は、診断アッセイに干渉したり、又は治
療組成物に用いた場合には副作用を起こし得る他の物質に対する抗体で実質的に
汚染されていないからである。
【０２０１】 本発明の抗体は、本発明の範囲内の種々の潜在的用途を有している。例えば、
そのような抗体は、（ａ）そのような抗体による治療の作用を受けやすいノミか
ら動物を保護するために動物を受動免疫する治療化合物として、及び／又は（ｂ
）発現ライブラリをスクリーニングしかつ／もしくは蛋白質と他の汚染物質との
混合物から所望の本発明蛋白質を回収するためのツールとして用いることができ
る。さらに、本発明の抗体は、そのようなノミを直接死滅させるために細胞障害
性物質のターゲットをノミに向けるのに用い得る。ターゲッティングは、当業者
には公知の技術を用いて、そのような抗体を細胞障害性物質と抱合させる（すな
わち、安定に結合させる）ことによって達成し得る。適当な細胞障害性物質は当
業者には公知である。
【０２０２】 本発明の１つの実施態様は、ノミ侵襲を受けやすい動物に投与したときに、そ
の動物をノミ侵襲から保護し得る治療組成物である。本発明の治療組成物は、以
下の保護分子：単離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質；単離ノミＨＭＴ及び／
又はＨＮＣ蛋白質の模倣分子；単離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子；なら
びに／又はＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を阻害する単離ノミＨＭＴ及び／
又はＨＮＣ蛋白質由来の化合物のうちの少なくとも１種を含む。本発明の治療組
成物はさらに、賦形剤、キャリヤ及び／又はアジュバントから成る群より選択さ
れる成分を含み得る。これらの成分は本明細書に詳細に記載されている。本明細
書に使用する場合、保護分子又は保護化合物とは、有効な方法で動物に投与する
と、ノミ侵襲を治療、軽減及び／又は予防し得る化合物を表す。ターゲットとす
るのに好ましいノミは、これまでに開示されている。保護分子の１つの例は、裸
の核酸ワクチン、組換えウイルスワクチン、組換え細胞ワクチン及び組換え蛋白
質ワクチンなどのワクチンであるが、それらには限定されない。保護分子の別の
例は、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を阻害する化合物、例えば、選択的に
ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質に結合する単離抗体、ノミＨＭＴ及び／又は
ＨＮＣ蛋白質の基質類似体、アンチセンスや、三重らせん形成、リボザイム及び
／又はＲＮＡ薬剤をベースとする化合物、又はＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活
性を阻害する他の無機もしくは有機分子である。ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質
活性を阻害するとは、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の活性を低減させる化
合物の能力を表し得る。ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を阻害するとは
、また、ノミにおけるノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の量を低減させる化合
物の能力をも表し得る。
【０２０３】 本発明の別の実施態様は、ノミ侵襲を受けやすい動物のノミ侵襲を低減させる
方法を含む。そのような方法は、動物に、（ａ）単離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮ
Ｃ蛋白質；（ｂ）単離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の模倣分子；（ｃ）単
離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ核酸分子；ならびに（ｄ）ＨＭＴ及び／又はＨＮ
Ｃ蛋白質活性を阻害する単離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質由来の化合物か
ら成る群より選択される保護化合物を含む治療分子を投与する工程を含む。
【０２０４】 本発明の治療組成物は、ノミ侵襲を受けやすい任意の動物、好ましくは哺乳動
物、より好ましくは、イヌ、ネコ、ヒト、フェレット、ウマ、ウシ、ヒツジ及び
他のペット類、実用的食用動物、使役動物、ならびに動物園動物に投与し得る。
ノミ侵襲から保護するのに好ましい動物には、イヌ、ネコ、ヒト、及びフェレッ
トが含まれるが、イヌとネコが特に好ましい。
【０２０５】 本明細書に使用する場合、「由来する」又は「誘導された」という用語は、本
発明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質又は核酸分子から得られた、ペプチド
、抗体、模倣分子、核酸分子、又は他の化合物を表す。本発明のＨＭＴ及び／又
はＨＮＣ分子から誘導体を得る方法は、当該技術分野では公知であり、そのよう
な方法において、活性部位、すなわち、他の分子と相互作用する部位を同定する
ためにＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質を分子モデル化し、これらの活性部位から
、これらの活性部位を保持又は模擬する小フラグメント及び／又は模倣分子を予
測し、それによってＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を阻害すること；本発明
のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質に対してペプチド又は小化学化合物ライブラリ
をスクリーニングすること；ならびに本発明のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質に
特異的に結合する抗体を見つけるためにポリクローナル又はモノクローナル抗体
をスクリーニングすることを含むがそれらには限定されるわけではない。
【０２０６】 本発明のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質阻害剤は、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮ
Ｃ蛋白質に結合するか、この蛋白質を修飾するか、又はこの蛋白質と相互作用す
るそれらの能力によって同定される。ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性の適当
な阻害剤は、種々の方法のうちの少なくとも１つで、（ａ）ＨＭＴ及び／又はＨ
ＮＣ蛋白質部位に結合するか、これらの部位と相互作用するか、又はこれらの部
位を修飾することにより；（ｂ）ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性部位に結合
するか、これらの部位と相互作用するか、又はこれらの部位を修飾することによ
り；（ｃ）溶液中でＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質に結合して、ＨＭＴ及び／又
はＨＮＣ蛋白質の利用性を低減させることにより：かつ（ｄ）例えば、アロステ
リック相互作用によりＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を阻害するためにＨＭ
Ｔ及び／又はＨＮＣ蛋白質の他の領域と相互作用することにより、ＨＭＴ及び／
又はＨＮＣ蛋白質の活性を阻害する化合物である。
【０２０７】 ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質阻害剤は、そのような化合物が治療を受け
る宿主動物に有害でない限り、動物を治療するために本発明の組成物中の化合物
としてそのまま使用することができる。好ましい本発明のＨＭＴ及び／又はＨＮ
Ｃ蛋白質阻害剤には、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質基質類似体や、ノミＨ
ＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の活性を阻害するようにノミＨＭＴ及び／又はＨＮ
Ｃ蛋白質に（例えば、アロステリック部位に）結合する他の分子が含まれるが、
それらには限定されない。ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質基質類似体とは、ＨＭ
Ｔ及び／又はＨＮＣ蛋白質の活性部位と相互作用する（例えば、結合する、会合
する、修飾する）化合物を表す。好ましいＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質基質類
似体は、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を阻害する。ＨＭＴ及び／又はＨＮ
Ｃ蛋白質基質類似体は、任意の無機又は有機組成物であってよい。ＨＭＴ及び／
又はＨＮＣ蛋白質基質類似体は、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の活性部位と相
互作用し得る限り、構造的にＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の天然基質に類似す
る可能性はあるが、その必然性はない。ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質基質類似
体は、コンピューター設計された本発明のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質構造又
はＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の天然基質のコンピューター構造を用いて設計
することができる。モデル化に好ましい部位には、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白
質の１つ以上の活性部位が含まれる。基質類似体は、オリゴヌクレオチド、ペプ
チド、ペプチド模倣化合物などの分子、又は他の無機もしくは有機分子のランダ
ムサンプルを作製し、そのようなサンプルを、例えば、アフィニティークロマト
グラフィー技術によって、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質とそれらの基質との相
互作用に干渉する能力についてスクリーニングして得ることもできる。好ましい
ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質基質類似体は、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質模
倣化合物、すなわち、構造的及び／又は機能的に、本発明のＨＭＴ及び／又はＨ
ＮＣ蛋白質の天然基質、特に、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性部位と相互作
用する基質領域に類似しているがＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性部位と相互
作用するとＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の活性を阻害する化合物である。
【０２０８】 本発明はさらに治療組成物を包含し、この治療組成物は、少なくとも１種の本
発明の保護分子と組み合わせて、１種以上の感染物質に対して保護的な１種以上
の追加化合物を含む。
【０２０９】 １つの実施態様において、本発明の治療組成物は、ノミ侵襲を予防するために
そのような組成物をノミに投与することによりノミ侵襲から動物を保護するため
に用い得る。そのようなノミ及び／又は動物への投与は、経口投与、動物の体表
面への適用（例えば、局所適用、もしくは動物上への噴霧）、又は環境への適用
（例えば、噴霧）によって行い得る。そのような組成物の例としては、少なくと
も１種の本発明の治療組成物を産生し得るトランスジェニックベクターがあるが
、それには限定されない。別の実施態様において、ノミは、本発明の治療組成物
を投与された宿主動物の体表面上又は血液中に存在する治療組成物又はその産物
を、摂取し得る。
【０２１０】 本発明によれば、宿主動物（すなわち、ノミに侵襲されているか、侵襲され得
る動物）を、本発明の治療組成物自体（例えば、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質
阻害剤、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質合成抑制剤（すなわち、ノミにおけるＨ
ＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の産生又は半減期を減少させる化合物）、ＨＭＴ及
び／又はＨＮＣ蛋白質模倣分子、又は抗ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ抗体）、あるい
は、本発明の組成物の投与に応答して動物が産生する産物（例えば、ノミＨＭＴ
及び／又はＨＮＣ蛋白質もしくは核酸分子の投与、又は不活性阻害剤「プロドラ
ッグ」の活性ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質阻害剤への変換に応答して産生され
る抗体）が最後にノミに入るように本発明の治療組成物を宿主動物に投与するこ
とにより治療する。宿主動物は、化合物もしくはその産物が動物の体表面上に存
在するか、又は動物の血流に入るように治療するのが好ましい。次いで、ノミは
、動物から採餌するときに組成物又は産物に暴露される。例えば、動物に投与さ
れるノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質阻害剤は、動物の血流に入るように投与
し、そこで、ノミが栄養補給することによってノミに吸収され得る。
【０２１１】 さらに本発明は、ノミが本発明の治療組成物を投与された宿主動物から栄養補
給すると、ノミが吸った血液中の本発明の化合物又はその産物の少なくとも一部
がノミによって糞便中に分泌され、次いでそれをノミ幼虫が経口摂取するという
点でノミ幼虫の侵襲を低減させる能力をも有している。特に、ノミ幼虫はノミの
糞便からそれらの栄養の全部ではなくとも大部分を得ることに留意されたい。
【０２１２】 本発明によれば、ノミにおけるＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を低減させ
ると、治療した動物及びそれらを取り囲む環境上のノミ被害を低減させる多くの
成果をもたらし得る。そのような成果には、（ａ）治療した動物から栄養補給す
るノミの活力の低下、（ｂ）治療した動物から栄養補給する雌ノミの産卵力の低
下、（ｃ）治療した動物から栄養補給する雄ノミの生殖能力の低下、（ｄ）治療
した動物から栄養補給する雌ノミが生む卵の生存力の低下、（ｅ）治療した動物
から栄養補給するノミの血液栄養補給挙動の変化（例えば、ノミが栄養補給する
毎の栄養補給量の低下又は栄養補給頻度の低下）、（ｆ）例えば、治療した動物
から栄養補給するノミの糞から幼虫が栄養補給することによるノミ幼虫の生存力
の低下、（ｇ）〔例えば、栄養補給挙動の減少、成長阻害、脱皮阻害（例えば、
遅延もしくは阻止）、及び／又は成虫への成熟阻害による〕ノミ幼虫の成長の変
化、ならびに／又は血液食を消化するノミもしくはノミ幼虫の能力の変化もしく
は低下が含まれるが、それらには限定されない。
【０２１３】 ノミ侵襲から動物を保護するために、ノミ侵襲から動物を保護し得るような有
効な方法で本発明の治療組成物を動物に投与する。本発明の治療組成物は、侵襲
を予防するために（すなわち、予防ワクチンとして）侵襲前に動物に投与しても
よいし、及び／又は侵襲後に動物に投与してもよい。例えば、蛋白質、その模倣
分子、及びその抗体を免疫治療剤として用いることができる。
【０２１４】 本発明の治療組成物は、治療を受ける動物が耐え得る賦形剤中に配合すること
ができる。そのような賦形剤の例としては、水、塩類溶液、リンゲル液、デキス
トロース液、ハンクス液、及び他の生理的平衡食塩水がある。脂肪油、ごま油、
オレイン酸エチル、又はトリグリセリドなどの非水性キャリヤを用いてもよい。
他の有用な製剤には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、
又はデキストランなどの増粘剤を含有する懸濁液が含まれる。賦形剤は、等張性
及び化学的安定性を高める物質などの微量添加剤をさらに含み得る。緩衝液の例
としては、リン酸緩衝液、重炭酸塩緩衝液、トリス緩衝液が挙げられ、保存剤の
例としては、チメロサール、又はｏ−クレゾール、ホルマリン及びベンジルアル
コールが挙げられる。標準的な製剤は、注射用の懸濁液又は溶液として適当な液
体中に溶解し得る液体注射可能物質又は固体である。したがって、非液体製剤の
場合、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤などを含んでい
てよく、それらには投与前に滅菌水又は塩類溶液が添加され得る。
【０２１５】 本発明の１つの実施態様において、治療組成物はアジュバントを含み得る。ア
ジュバントは、特定の抗原に対する動物の免疫応答を増強し得る物質である。適
当なアジュバントには、サイトカイン、ケモカイン、及びサイトカインやケモカ
インの産生を誘発する化合物（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ
）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳ
Ｆ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インタ
ーロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキ
ン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（Ｉ
Ｌ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１０（ＩＬ−１
０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンγ、インターフ
ェロンγ誘発因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、トランスフォーミング成長因子β、ＲＡＮＴ
ＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ｎｏｒｍａｌ
Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ ｓｅｃｒ
ｅｔｅｄ）、マクロファージ炎症性蛋白質（例えば、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−
１β）、ならびにリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉ）延長開始因子（ＬＥＩ
Ｆ））；細菌成分（例えば、内毒素、特に超抗原、外毒素及び細胞壁成分）；ア
ルミニウム基塩；カルシウム基塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血
清蛋白質；ウイルスコート蛋白質；ブロックコポリマーアジュバント（例えば、
Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ ＴｉｔｅｒｍａｘTMアジュバント〔ＶａｘｃｅｌTM社、ジョ
ージア州ノークロス所在（ＶａｘｃｅｌTM，Ｉｎｃ．Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）
）、Ｒｉｂｉアジュバント（リビ イムノケム リサーチ社、モンタナ州ハミル
トン所在（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈ
ａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）））；ならびにサポニン及びそれらの誘導体（例えば、
Ｑｕｉ Ａ（スーパーフォス バイオセクター社、デンマーク所在（Ｓｕｐｅｒ
ｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）））が含まれるが、そ
れらには限定されない。本発明の蛋白質アジュバントは、本明細書に記載されて
いる方法を用いて、蛋白質自体の形態又はそのような蛋白質をコードする核酸分
子の形態で投与し得る。
【０２１６】 本発明の１つの実施態様において、治療組成物はキャリヤを含み得る。キャリ
ヤには、治療した動物内での治療組成物の半減期を増大させる化合物が含まれる
。適当なキャリヤとしては、高分子徐放キャリヤ、生物分解性インプラント、リ
ポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、油、エステル、及びグリコールが挙げら
れるが、それらには限定されない。
【０２１７】 本発明の１つの実施態様は、本発明の組成物を動物中に徐々に放出し得る徐放
製剤である。本明細書に使用する場合、徐放製剤は、徐放キャリヤ中の本発明組
成物を含む。適当な徐放キャリヤには、生物分解性ポリマー、他のポリマーマト
リックス、カプセル、マイクロカプセル、マイクロパーティクル、丸塊製剤、浸
透ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフェア、及び経皮送達システムが含ま
れるが、それらには限定されない。本発明の他の徐放製剤には、動物に投与する
と、その場で固体又はゲルを形成する液体が含まれる。好ましい徐放製剤は生物
分解性（すなわち、生体内崩壊性）である。
【０２１８】 好ましい本発明の徐放製剤は、ノミ侵襲から動物を保護する組成物の治療用量
レベルを達成するのに十分な一定速度で、治療した動物の血液中に本発明の組成
物を放出し得る。本発明の治療組成物は、約１〜約１２ヶ月の範囲の期間にわた
って放出されるのが好ましい。本発明の徐放製剤は、好ましくは約１ヶ月以上、
より好ましくは約３ヶ月以上、さらに好ましくは約６ヶ月以上、もっと好ましく
は約９ヶ月以上、さらにもっと好ましくは約１２ヶ月以上もの間治療効果を生じ
得るのが好ましい。
【０２１９】 有効な方法で治療組成物を投与するために許容可能なプロトコルは、単位用量
サイズ、用量の数、用量の投与頻度及び投与様式を含む。そのようなプロトコル
の決定は当業者が実施し得る。適当な単位用量は、適当な期間にわたって１回以
上投与したときに動物を病気から保護し得る用量である。例えば、組換え蛋白質
ワクチンを含めた、蛋白質、模倣分子又は抗体治療組成物の好ましい単位用量は
、動物の体重１ｋｇ当たり約１マイクログラム（μｇ）〜約１０ミリグラム（ｍ
ｇ）である。初回投与の後約２週間〜数年の間に追加免疫接種を実施し得る。追
加免疫接種は、動物の免疫応答が動物を病気から保護するには不十分になったと
きに行うのが好ましい。好ましい投与スケジュールは、約２週間〜約１２ヶ月の
期間にわたって約１回〜約２回、動物の体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約１ｍｇ
の治療組成物を投与するものである。投与法は、皮下、皮内、静脈内、鼻腔内、
経口、経皮、眼球内、鼻腔内、結膜及び筋肉内経路を含み得るが、それらには限
定されない。他の治療化合物の投与法は、当業者が決定することができ、一日、
週間、月間又は年間の投薬計画に基づいて１回以上治療組成物を投与することを
含み得る。投与経路は、当業者が決定することができ、任意の経路を含み得る。
ノミに投与する場合に好ましい阻害化合物の投与経路は、動物の体表面に投与さ
れる局所的又は「スポットオン」製剤であり、その結果、ノミは動物に取り付い
たときに阻害化合物に遭遇する。阻害化合物の別の好ましい投与経路は経口製剤
であり、これは、動物に投与すると、動物の血流に入り、次いで、その動物から
ノミが栄養補給している間にノミに移入する。
【０２２０】 本発明の組換え蛋白質ワクチンは、組換えにより産生されたＨＭＴ及び／又は
ＨＮＣ蛋白質を含み、この蛋白質は、ノミ侵襲から動物を保護するのに十分な免
疫応答を動物にもたらすプロトコルに従って動物に投与される。そのようなプロ
トコルは当業者が決定し得る。
【０２２１】 １つの実施態様によれば、本発明の核酸分子は、その核酸分子を動物内で保護
蛋白質又は保護ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、三重らせん
形態又はＲＮＡ薬剤）として発現させ得る方法で動物に投与し得る。核酸分子は
、（ａ）裸の（すなわち、ウイルスコートもしくは細胞膜内に封入されていない
）核酸を遺伝子ワクチンとして（例えば、Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２
４７巻，１４６５−１４６８ページ，１９９０年に教示されているような、裸の
ＤＮＡ又はＲＮＡ分子として）投与する方法、又は（ｂ）組換えウイルスワクチ
ンとしてもしくは組換え細胞ワクチン（すなわち、核酸分子がウイルスもしくは
細胞キャリヤによって送達される）としてパッケージされた核酸分子を投与する
方法を含むがそれらには限定されない種々の方法で動物に送達し得る。
【０２２２】 本発明の遺伝子（すなわち、裸の核酸）ワクチンは、本発明の核酸分子、好ま
しくは、複製又は増幅コンピテントであるのが好ましい本発明の組換え分子を含
む。本発明の遺伝子ワクチンは、例えば、ジシストロニック組換え分子の形態の
１つ以上の本発明核酸分子を含み得る。好ましい遺伝子ワクチンには、ウイルス
ゲノムの少なくとも一部、すなわち、ウイルスベクターが含まれる。好ましいウ
イルスワクチンには、アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、
ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、及びレトロウイルスをベースとするもの
が含まれ、シンドビスウイルス又はセムリキ森林熱ウイルスなどのアルファウイ
ルス、種特異性ヘルペスウイルス及びポックスウイルスをベースとするものが特
に好ましい。蛋白質の産生に適しているとして開示されているものを含めた任意
の適当な転写調節配列を用いてよい。特に好ましい転写調節配列としては、サイ
トメガロウイルス即時型（好ましくはイントロン−Ａと連結）、ラウス肉腫ウイ
ルスＬＴＲ、及び組織特異転写調節配列、ならびにウイルスベクターを用いる場
合にはウイルスベクター内因性転写調節配列が含まれる。「強力な」ポリアデニ
ル化シグナルを組み込むのも好ましい。
【０２２３】 本発明の遺伝子ワクチンは、種々の方法で投与し得るが、筋肉内、皮下、皮内
、経皮、結膜、眼球内、鼻腔内、及び経口投与経路が好ましい。遺伝子ワクチン
の好ましい単位用量は、当業者が決定し得るように、投与経路及び／又は送達法
に応じて、約１ナノグラム（ｎｇ）〜約６００μｇの範囲である。適当な送達法
には、例えば、注射により、滴剤として、エアゾール化及び／又は局所に送達す
る方法が含まれる。本発明の遺伝子ワクチンは、水性賦形剤（例えば、リン酸緩
衝塩類溶液）だけ又はキャリヤ（例えば、脂質ベースキャリヤ）中に含有させて
よい。
【０２２４】 本発明の組換えウイルスワクチンは、ウイルスコート中にパッケージされ、投
与後に動物中で発現し得る本発明の組換え分子を含んでいる。本発明の組換え分
子は、パッケージング欠失又は複製欠失であるか、及び／又は弱毒化ウイルスを
コードする。アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペス
ウイルス、ピコルナウイルス及びレトロウイルスをベースとするものを含むがそ
れらには限定されない多くの組換えウイルスを用いてよい。好ましい組換えウイ
ルスワクチンは、（シンドビスウイルスなどの）アルファウイルス、アライグマ
ポックスウイルス、種特異性ヘルペスウイルス及び種特異性ポックスウイルスを
ベースとするものである。アルファウイルス組換えウイルスワクチンの製造法及
び使用法の例は、ショング（Ｘｉｏｎｇ）及びグリーブ（Ｇｒｉｅｖｅ）に付与
された米国特許第５，７６６，６０２号に開示されている。
【０２２５】 本発明の組換えウイルスワクチンは、動物に投与すると免疫感作動物内の細胞
に感染し、本明細書に開示されているように、ノミ侵襲から動物を保護し得る保
護蛋白質又はＲＮＡ核酸分子の産生を誘導する。例えば、本発明のノミＨＭＴ及
び／又はＨＮＣ核酸分子を含む組換えワクチンは、ノミ侵襲から動物を保護する
のに十分な免疫応答を動物に生じさせるプロトコルに従って投与される。本発明
の組換えウイルスワクチンの好ましい単位用量は、動物の体重１ｋｇ当たり約１
×１０4〜約１×１０8ウイルスプラーク形成単位（ｐｆｕ）である。投与プロト
コルは、蛋白質ベースワクチンに関して本明細書に記載されているものと類似で
あり、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼球内、結膜及び経口投与経路が好ましい。
【０２２６】 本発明の組換え細胞ワクチンは、少なくとも１種の本発明蛋白質を発現する本
発明の組換え細胞を含んでいる。この実施態様に好ましい組換え細胞には、サル
モネラ、大腸菌、リステリア、マイコバクテリア、Ｓ．フルジペルダ、〔サッカ
ロミセス・セレビシエ及びピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ）を含めた〕酵母、ＢＨＫ、ＣＶ−１、筋芽細胞Ｇ８、ＣＯＳ（例えば、ＣＯ
Ｓ−７）、ベロ、ＭＤＣＫ及びＣＲＦＫ組換え細胞が含まれる。本発明の組換え
細胞ワクチンは、種々の方法で投与し得るが、好ましくは体重１ｋｇ当たり約１
０8〜約１０12細胞の範囲の用量で経口投与し得るという利点を有する。投与プ
ロトコルは、蛋白質ベースのワクチンに関して本明細書に記載されているものと
類似である。組換え細胞ワクチンは、全細胞、細胞壁が取り除かれた細胞又は細
胞溶解物を含み得る。
【０２２７】 ノミ侵襲から動物を保護する本発明の治療組成物の効力は、（例えば、本発明
の蛋白質もしくは模倣分子を用いた）保護抗体の検出、治療した動物内の細胞性
免疫の検出、又は治療した動物が侵襲耐性であるかどうかを決定するための治療
した動物のノミによるチャレンジを含むがそれらには限定されない種々の方法で
テストすることができる。チャレンジ研究は、治療した動物に直接ノミを投与す
ることを含み得る。１つの実施態様において、治療組成物は、マウスなどの動物
モデルでテストし得る。そのような技術は当業者には公知である。
【０２２８】 １種の本発明治療組成物は、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性の阻害剤
、すなわち、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性阻害剤により阻害を受けや
すいノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質機能に実質的に干渉し得る化合物を含ん
でいる。ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性阻害剤は、本発明のノミＨＭＴ及び
／又はＨＮＣ蛋白質を用いて同定し得る。ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質機能阻
害剤は、本発明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質を用いて同定し得る。好ま
しいＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質機能阻害剤は、ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ
蛋白質の機能に実質的に干渉し得るが、宿主動物の蛋白質には実質的に干渉しな
い化合物である。本明細書に使用する場合、宿主動物の蛋白質を実質的に阻害又
は干渉しない化合物とは、宿主動物に投与しても、宿主動物が、その化合物に起
因する著しい悪性作用を示さず、かつ有効な方法で動物に投与すると、ノミ侵襲
から動物を保護し得るものである。
【０２２９】 本発明の１つの実施態様は、ノミのＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を阻害
し得る化合物を同定する方法である。そのような方法は、（ａ）本発明の単離ノ
ミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質、好ましくは、Ｃ．ｆｅｌｉｓＨＭＴ及び／又
はＨＮＣ蛋白質と、推定阻害化合物とを、この化合物の不在下ではこの蛋白質が
ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を有する条件下で、接触させる（例えば、組
み合わせる、混合する）工程と、（ｂ）この推定阻害化合物がＨＭＴ及び／又は
ＨＮＣ蛋白質の活性を阻害するかどうかを決定する工程とを含む。ＨＭＴ及び／
又はＨＮＣ蛋白質活性は、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の基質と結合する能力
又は基質と相互作用する能力を決定することを含むがそれには限定されない、当
該技術分野では公知の種々の方法で定量し得る。ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質
がＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を有するような条件には、ＨＭＴ及び／又
はＨＮＣ蛋白質が、生理的条件、すなわち、生理的ｐＨ、生理的イオン濃度、及
び生理的温度下に正しい三次元折りたたみ構造を有する条件が含まれる。
【０２３０】 スクリーニングすべき推定阻害化合物には、抗体（そのフラグメント及び模倣
分子を含む）、推定基質類似体、及び好ましくは小さい他の有機又は無機分子が
含まれる。ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性の定量法は当業者には公知であり
、例えば、本願の実施例の項を参照されたい。推定阻害化合物と本発明のＨＭＴ
及び／又はＨＮＣ蛋白質との結合を定量する方法は、当業者には公知であり、例
えば、表面プラスモン共鳴を用いた分子量の変化の測定（例えば、阻害剤もしく
は蛋白質をそれぞれＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質と接触させる前及び接触させ
た後のＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質阻害剤による光の散乱の測定）又はＨＭＴ
及び／又はＨＮＣ蛋白質と基質との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング
を含む。
【０２３１】 ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を阻害し得る化合物を同定するのに好まし
い方法は、（ａ）配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０、配列
番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号１５４、配列
番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１８６２、配列番号１
８６８、配列番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号１８８３、配列番号１
８８８、配列番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号１９１５、配列番号１
９２０、配列番号１９２５、及び／又は配列番号１９３０から成る群より選択さ
れるアミノ酸配列を含む蛋白質、ならびに／又は表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ及び／
又は表ＩＶの核酸分子によってコードされる蛋白質；（ｂ）（ａ）に記載されて
いる１つの配列の連続アミノ酸部分と配列が同一の少なくとも２５の連続アミノ
酸部分を含み、ＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を有する蛋白質；（ｃ）（ａ
）に記載の蛋白質のフラグメントを含み、このフラグメントが、ＨＭＴ及び／又
はＨＮＣ分子に結合すること及びＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質基質を加水分解
することから成る群より選択される活性を有する蛋白質；ならびに（ｄ）（ａ）
（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の蛋白質をコードする核酸分子の対立遺伝子変異体
によってコードされる蛋白質から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する単
離ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質と、推定阻害化合物とを、この化合物の不
在下ではその蛋白質がＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質活性を有する条件下で、接
触させる工程と、この推定阻害化合物がＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の活性を
阻害するかどうかを決定する工程とを含む。
【０２３２】 本発明の別の実施態様は、本発明のノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質阻害剤
を同定するアッセイキットである。このキットは、本発明の単離ノミＨＭＴ及び
／又はＨＮＣ蛋白質と、阻害の検出が可能な場合には、ノミＨＭＴ及び／又はＨ
ＮＣ蛋白質活性の阻害を測定する手段とを含む。ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋
白質阻害が検出されると、推定阻害剤はノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の阻
害剤であると同定される。ノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の阻害を測定する
手段には、推定阻害剤とノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ分子との結合を検出するア
ッセイシステム、及びノミＨＭＴ及び／又はＨＮＣ蛋白質の基質加水分解能力が
推定阻害剤により干渉されるかどうかを検出するアッセイシステムが含まれる。
種々の手段及び方法は本明細書に記載されており、当業者には公知である。
【０２３３】 以下の実施例は、例示のために提供されており、本発明の範囲を限定するもの
ではない。以下の実施例には、当業者には公知の多くの組換えＤＮＡ及び蛋白質
化学技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲参照）が含まれている。
【０２３４】 実施例１ 本実施例は、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｉｓの後腸及びマルピ
ーギ管（ＨＭＴ）からのＲＮＡ単離と、単離ＲＮＡを使用したサブトラクティッ
ドｃＤＮＡライブラリ及びアンサブトラクティッドｃＤＮＡライブラリの構築に
ついて述べる。
【０２３５】 約１０，０００個の後腸及びマルピーギ管を、同数の、ネコ血液を与えたＣ．
ｆｅｌｉｓ成虫とネコ血液を与えていないＣ．ｆｅｌｉｓ成虫（雄と雌の割合は
１：４）から切り出し、総ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート溶解緩衝液
とＳａｍｂｒｏｏｋらにより述べられた標準的な手順を使用して抽出した。ポリ
Ａ濃縮ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ニュージャージー
州ピスカタウェイ所在から入手可能）を使用して、前述の総ＲＮＡから精製した
。同じ手順を使用して、ＨＭＴを除去した後に切断したＣ．ｆｅｌｉｓの体から
総ＲＮＡを抽出し、ポリＡ濃縮ｍＲＮＡを単離した（以下、「非ＨＭＴ ｍＲＮ
Ａ」と呼ぶ）。
【０２３６】 ポリＡ濃縮ｍＲＮＡを使用し、以下のようにサブトラクティブハイブリダイゼ
ーションとサプレッションＰＣＲを使用して、ｃＤＮＡライブラリを構築した。
サブトラクティブハイブリダイゼーションとサプレッションＰＣＲを、製造業者
のプロトコルに従い、ＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔTMｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カリフ
ォルニア州パロアルト所在から入手可能）を使用して行った。簡単に述べると、
このキットは、サブトラクティブハイブリダイゼーションとサプレッションＰＣ
Ｒを使用して、テスターｃＤＮＡに存在するがドライバーｃＤＮＡに存在しない
ｃＤＮＡ配列を特異的に増幅し、テスター特異的配列を濃縮する。サブトラクシ
ョンプロセスの効率は、製造業者のプロトコルのＶ．Ｄ．節に記載されているよ
うに、半定量的ＰＣＲと、アガロースゲル上でのサブトラクションが行われた試
料とサブトラクションが行われていない試料の臭化エチジウム染色パターンの比
較により評価することができる。半定量的ＰＣＲについては、ＨＭＴ組織外で発
現することが知られているｍＲＮＡを有する３種類の遺伝子を使用して、特異的
サブトラクションの試験を行った。これらの遺伝子は、推定アクチン、Ｎ−アミ
ノペプチダーゼ、及びセリンプロテアーゼ蛋白質をコードしていた。
【０２３７】 サブトラクティブハイブリダイゼーションとサプレッションＰＣＲを以下の条
件下で行った。この反応では、２マイクログラム（μｇ）のＨＭＴ ｍＲＮＡを
、テスター材料を合成するための鋳型として使用し、２μｇの非ＨＭＴ ｍＲＮ
Ａを、ドライバー材料を合成するための鋳型として使用した。選択的増幅ステッ
プに使用するサイクル数を、製造業者のプロトコルを使用して最適化した。最適
化により、標準的な２７サイクルではなく２４サイクルの一次ＰＣＲと、標準的
な１２サイクルではなく１５サイクルの二次ＰＣＲを使用した。
【０２３８】 サプレッシブＰＣＲ反応からの産物を、Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を使用して、ｐ
ＣＲ（登録商標）２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カ
ールズバッド所在から入手可能）に連結した。次いで、この連結反応物を使用し
て、ＩＮＶαＦ’Ｏｎｅ ＳｈｏｔTMコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
から入手可能）を形質転換し、これを、５０マイクログラム／ミリリットル（μ
ｇ／ｍｌ）のアンピシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，ミズーリ州
セントルイス所在から入手可能）と５０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，ニュージャージー州フェアローン所在から入手可能）を含むＬ
ｕｒｉａブロス（ＬＢ）寒天上にプレーティングした。形質転換されたコロニー
を増幅し、ＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）により述べられている標準的
なアルカリ溶解手順を使用して単離した。
【０２３９】 製造業者のプロトコルに従い、ＰＲＩＳＭTM Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
、又はＰＲＩＳＭTM ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、又はＰＲ
ＩＳＭTM ＢｉｇＤｙｅTM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）を使用して反応を行った後に、ＤＮＡ試料の
自動化サイクルシークエンシングを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTMモデル３７７（Ｐｅ
ｒｋｉｎｓ Ｅｌｍｅｒから入手可能）とＸＬアップグレードＤＮＡシーケンサ
ー（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスタ
ーシティ所在から入手可能）を使用して行った（以下、「標準的な配列決定法」
と呼ぶ）。配列解析を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒTM配列解析ソフトウエア（Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｈ
ａｖｅｎ，ＣＴから入手可能）と、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ バー
ジョン９．０配列解析ソフトウエア（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇ
ｒｏｕｐ（ＧＣＧ），ウィスコンシン州マディソン所在）（以下、ＧＣＧバージ
ョン９．０と呼ぶ）を使用し、デフォルトパラメータを使用して行った。読み取
られた各配列から両端のベクター配列を取り除き、この配列を、検索のために、
ＢＬＡＳＴネットワークを使用して米国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎ
ＣＢＩ）、米国立医学図書館、米国立衛生研究所，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤに
送った。このデータベースには、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＳＰｕｐｄａｔ
ｅ＋ＧｅｎＰｅｐｔ＋ＧＰＵｐｄａｔｅ＋ＰＤＰデータベースが含まれる。６つ
全てのリーディングフレーム内の翻訳配列をデータベースに含まれる蛋白質配列
と比較するｘＢＬＡＳＴ機能を使用して、検索を行った。ＧｅｎＢａｎｋデータ
ベースの配列と有意な相同性を有するクローンを提案された機能に従って分類し
、表ＩＩに列挙する。ＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列と有意な相同性を有さ
ないクローンをオープンリーディングフレームについて手作業で検索し、表ＩＶ
に列挙する。
【０２４０】 アンサブトラクティッドＨＭＴ ｃＤＮＡライブラリを以下のように構築した
。約１０，０００個のＨＭＴ組織を、同数の、ネコ血液を与えなかったＣ．ｆｅ
ｌｉｓ成虫とネコ血液を与えたＣ．ｆｅｌｉｓ成虫（雄と雌の割合は１：４）か
ら切り出した。総ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート溶解緩衝液とＳａｍ
ｂｒｏｏｋらにより述べられた手順を使用して抽出し、続いて、製造業者のプロ
トコルに従い、ｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を使用
して単離した。ライブラリを、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キッ
トを使用して５μｇの単離ｍＲＮＡにより構築し、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標
）Ｇｉｇａｐａｃｋ（登録商標）Ｇｏｌｄクローニングキットを使用してパッケ
ージングした（キットは両方ともＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
Ａから入手可能）。結果として得られたＨＭＴライブラリを、約５×１０9プラ
ーク形成単位／ミリリットル（ｐｆｕ／ｍｌ）の力価まで増幅した。シングルク
ローンエキシジョンをＥｘ−ＡｓｓｉｓｔTMヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅから入手可能）を使用して行い、これを使用し、製造業者のプロトコル（
以下の例外を除く）を使用して、配列決定用の二本鎖プラスミド鋳型を作成した
。ＳＯＬＲ細胞を清澄化ファージ溶解物とインキュベーションした後に、混合物
を使用してＬＢブロスに接種し、混合物を一晩インキュベートし、次いで、ミニ
プレッププラスミド調製にかけ、前述のサブトラクティッドＨＭＴライブラリに
ついて述べたように配列決定を行った。
【０２４１】 実施例２ 本実施例は、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｉｓの頭部及び神経索
（ＨＮＣ）からのＲＮＡ単離と、単離ＲＮＡを使用したサブトラクティッドｃＤ
ＮＡライブラリ及びアンサブトラクティッドｃＤＮＡライブラリの構築について
述べる。
【０２４２】 約４，０００個の頭部と、結合している神経索（腹側終神経節を含む）を、同
数の、ネコ血液を与えたＣ．ｆｅｌｉｓ成虫とネコ血液を与えていないＣ．ｆｅ
ｌｉｓ成虫（雄と雌の割合は１：４）から切り出し、総ＲＮＡを、グアニジンイ
ソチオシアネート溶解緩衝液とＳａｍｂｒｏｏｋらにより述べられた標準的な手
順を使用して抽出した。約６１８μｇの総ＲＮＡを回収した。ポリＡ濃縮ｍＲＮ
Ａを、製造業者のプロトコルに従い、ｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
から入手可能）を使用して前述の総ＲＮＡから精製した。約１３μｇのｍＲＮＡ
を単離した。同じ手順を使用して、ＨＮＣ組織を除去した後に切断されたＣ．ｆ
ｅｌｉｓの体から総ＲＮＡを抽出し、ポリＡ濃縮ｍＲＮＡを単離した（以下、「
非ＨＮＣ ｍＲＮＡ」と呼ぶ）。
【０２４３】 サプレッションサブトラクティブＰＣＲを、以下の条件下で、ＰＣＲ−Ｓｅｌ
ｅｃｔTMｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入
手可能）を使用して実施例１に記載のように行った。この反応では、２マイクロ
グラム（μｇ）のＨＮＣ ｍＲＮＡを、テスター材料を合成するための鋳型とし
て使用し、２μｇの非ＨＭＴ ｍＲＮＡを、ドライバー材料を合成するための鋳
型として使用した。選択的増幅ステップに使用するサイクル数を、製造業者のプ
ロトコルを使用して最適化した。最適化により、標準的な２７サイクルではなく
２４サイクルの一次ＰＣＲと、１２又は１５サイクルの二次ＰＣＲを使用した。
【０２４４】 様々なＰＣＲサイクリングの組み合わせからのｃＤＮＡプールを、ＴＡクロー
ニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を使用してＴＡベクターに
連結した。連結反応物のアリコートで、Ｕｌｔｒａｍａｘ ＤＨ５αTM細菌（Ｇ
ｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手可能）を形質転換
した。形質転換混合物の一部を使用して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む
ＬＢブロス培地に接種した。この一晩培養物をプレーティングして独立したコロ
ニーを作成し、これらのコロニーを、個々に、プラスミド調製用の一晩培養に使
用した。形質転換コロニーを増幅し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）により述べら
れている標準的なアルカリ溶解手順を使用して、ＤＮＡを単離した。
【０２４５】 ＤＮＡ試料の自動化サイクルシークエンシングを、実施例１に記載の標準的な
配列決定法を使用して行った。配列解析を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒTM配列解析ソフ
トウエア（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉ
ｎｃ．，コネチカット州ニューヘブンから入手可能）と、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．０配列解析ソフトウエア（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），ウィスコンシン州マディソン所在から
入手可能）（以下、ＧＣＧバージョン９．０と呼ぶ）を使用し、デフォルトパラ
メータを使用して行った。読み取られた各配列から両端のベクター配列を取り除
き、この配列を、実施例１に記載のようにｘＢＬＡＳＴ検索にかけた。ＧｅｎＢ
ａｎｋデータベースの配列と有意な相同性を有するクローンを提案された機能に
従って分類し、表Ｉに列挙する。ＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列と有意な相
同性を有さないクローンをオープンリーディングフレームについて手作業で検索
し、表ＩＩＩに列挙する。
【０２４６】 アンサブトラクティッドＤＮＡライブラリを以下のように構築した。約６４０
０個の頭部及び神経索をＣ．ｆｅｌｉｓから切り出し、ポリＡ ＲＮＡを前述の
ように単離した。約７μｇのＨＮＣポリＡ ＲＮＡを使用し、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ λＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔとプロトコルを使用し
てｃＤＮＡライブラリを構築した。結果として得られたＨＮＣライブラリを、約
５×１０9プラーク形成単位／ミリリットル（ｐｆｕ／ｍｌ）の力価まで増幅し
た。シングルクローンエキシジョンをＥｘ−ＡｓｓｉｓｔＴＭヘルパーファージ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）を使用して行い、これを使用し、製造業
者のプロトコル（以下の例外を除く）を使用して、配列決定用の二本鎖プラスミ
ド鋳型を作成した。ＳＯＬＲ細胞を清澄化ファージ溶解物とインキュベーション
した後に、混合物を使用してＬＢブロスに接種し、混合物を一晩インキュベート
し、次いで、ミニプレッププラスミド調製にかけ、前述のサブトラクティッドラ
イブラリについて述べたように配列決定を行った。
【０２４７】 実施例３ 本実施例は、Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅ
ｎｄｓ（ＲＡＣＥ）によるＣ．ｆｅｌｉｓ ｃＤＮＡプール（ＲＡＣＥ ｃＤＮ
Ａプール）の作成について述べる。
【０２４８】 総ＲＮＡを、以下のように、餌を与えたノミ成虫と餌を与えなかったノミ成虫
から抽出した。約１０００匹の餌を与えたノミ成虫と１０００匹の餌を与えなか
ったノミ成虫をドライアイス上で凍結させ、乳鉢と乳棒を使用して別々にひいて
粉末にし、総ＲＮＡを以下のように各粉末から抽出した。１０ｍｌの溶液Ｄ（４
Ｍグアニジンイソチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
、１．５％サルコシル、０．５Ｍ ２−メルカプトエタノール）を粉末に添加し
、懸濁液を振盪により混合した。２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１ｍｌとｐ
Ｈ４．７フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１２５：２４：１
）３ｍｌ（Ｓｉｇｍａから入手可能）を添加し、懸濁液をボルテックスシェーカ
ーで混合し、１５分間、氷上でインキュベートした。インキュベーション後、混
合物を１０，０００×ｇで２０分間、遠心分離し、上清を取り出し、ｐＨ４．７
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで２回抽出した。次に、等量
のイソプロパノールを上清に添加し、−２０℃で２時間インキュベートし、続い
て、１０，０００×ｇで２０分間、遠心分離した。遠心分離後に、上清を取り出
し、捨て、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、室温で乾燥させた。ペレット
を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。分光
光度計分析から、餌を与えていないノミからの総ＲＮＡの収量は１１４０μｇで
あり、餌を与えたノミからの収量は１５００μｇであることが分かった。
【０２４９】 餌を与えたノミ成虫と餌を与えていないノミ成虫それぞれの総ＲＮＡ抽出物か
ら６００μｇを混合し、次いで、ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコルを使用し、
ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ニュージャージー州ピスカタウェイ所在から入手可
能）を使用して抽出した。約１５〜２５μｇのｍＲＮＡを、分光光度計分析と臭
化エチジウム染色に基づいて単離した。１μｇの精製ｍＲＮＡを鋳型として使用
し、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州パロア
ルト所在から入手可能）を、製造業者のプロトコルに従って使用して、ＲＡＣＥ
ｃＤＮＡプールを構築した。
【０２５０】 実施例４ 本実施例は、本発明のＣ．ｆｅｌｉｓアラントイナーゼ核酸分子のクローニン
グ、配列決定、組換え蛋白質発現、及び精製について述べる。本実施例はまた、
様々なノミ組織におけるアラントイナーゼｍＲＮＡの発現について述べる。
【０２５１】 実施例１に記載のＨＭＴ ＥＳＴライブラリから１個のＴＡクローンを標準的
な配列決定法を使用して配列決定した。このクローンは、アラントイナーゼ遺伝
子と有意な相同性を有することが分かった。このクローンをＥｃｏＲＩで消化し
て、ノミ核酸分子ｎＣｆＡＬＮ682と呼ぶ６８２ヌクレオチド長のインサートを
切り出した。このインサートを、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（
Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州チャットワース所在から入手可能）を使用して
ゲル精製により単離した。約５０ナノグラム（ｎｇ）の精製ｎＣｆＡＬＮ682を
使用し、製造業者のプロトコルを使用し、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キッ
ト（Ａｍｅｒｓｈａｍ，イリノイ州アーリントンハイツ所在）を使用して、32Ｐ
α−ｄＡＴＰ標識ＤＮＡプローブを構築した。
【０２５２】 32Ｐα−ｄＡＴＰ標識プローブを標準的なプラークリフトハイブリダイゼーシ
ョン手順に使用して、クローンを、実施例１に記載のＨＭＴλ−ＺＡＰアンサブ
トラクティッドｃＤＮＡライブラリから単離した。以下のハイブリッド形成条件
を使用した（以下、「標準的なハイブリッド形成条件」と呼ぶ）。フィルターを
、５×ＳＳＰＥ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）を参照のこと）、１．２％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、及び５×デン
ハルト試薬（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）を参照のこと）中で、約１×１０6カ
ウント毎分（ｃｐｍ）／ｍｌのプローブと５５℃で約１４時間ハイブリッド形成
させた。フィルターを以下のとおり洗浄した。（ａ）５×ＳＳＰＥ及び１％ＳＤ
Ｓで１０分、（ｂ）２×ＳＳＰＥ及び１％ＳＤＳで１０分、（ｃ）１×ＳＳＰＥ
及び０．５％ＳＤＳで１０分、（ｄ）０．５×ＳＳＰＥ及び１％ＳＤＳで１０分
。全ての洗浄を５５℃で行った。プローブと強くハイブリッド形成したプラーク
を単離し、インビボエキシジョンに供した。インビボエキシジョンを、Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ Ｅｘ−ＡｓｓｉｓｔTMヘルパーファージシステムとプロトコルを
使用して行って、ポジティブプラークをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMプラスミドＤ
ＮＡに変換した。製造業者のプロトコルを使用してＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅ
ｐTMスピンミニプレップキットによりＤＮＡを調製し、各２０Ｕ／μｌのＥｃｏ
ＲＩ及びＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッ
ツ州ビバリー所在から入手可能）約１μｌを使用して制限酵素消化した後に、配
列決定を標準的な配列決定法を使用して行った。１個のクローンを一次プラーク
から単離した。このクローンは、本明細書中で配列番号１と示すヌクレオチド配
列を有する約２０５７塩基対の核酸分子（本明細書中ではｎＣｆＡＬＮ2057と呼
ぶ）を含んでいた。配列番号１の相補的配列を本明細書中では配列番号３と表す
。ｎＣｆＡＬＮ687の配列決定により、ｎＣｆＡＬＮ687は、配列番号１のヌクレ
オチド８５５から１５３６と１００％の同一性を有することが分かる。
【０２５３】 配列番号１の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＡＬＮ2057は、配列番号２により表
されるアミノ酸配列を有する、３８４アミノ酸の完全長アラントイナーゼ蛋白質
（本明細書中ではＰＣｆＡＬＮ384と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開
始コドンが、配列番号１のヌクレオチド１５２からヌクレオチド１５４に及び、
終結コドンが、配列番号１のヌクレオチド１３０４からヌクレオチド１３０６に
及ぶと仮定する。ＰＣｆＡＬＮ384をコードするコード領域は、配列番号４によ
り表される核酸配列を有するコード鎖と配列番号６により表される核酸配列を有
する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＡＬＮ1152により表される。ＰＣｆＡＬＮ 384 のアミノ酸配列（配列番号５とも表される）により、ＰＣｆＡＬＮ384は、約
４２．２キロダルトン（ｋＤａ）の推定分子量と約６の推定等電点（ｐＩ）を有
することが予想される。
【０２５４】 配列番号２のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列との比
較により、配列番号２は、Ｒａｎａ ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ（ウシガエル）ア
ラントイナーゼ蛋白質、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号４５８１２６と最大
の相同性（すなわち、約４８．６％の同一性）を示したことが分かる。配列番号
４とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番号４は、Ｒａ
ｎａ ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ核酸分子、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ
０３４７１と最大の相同性（すなわち、約５１％の同一性）を示したことが分か
る。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を使用し、デフォルト
パラメータを使用して行った。
【０２５５】 ｎＣｆＡＬＮ2057のコード領域（すなわち、配列番号４）を、ヌクレオチド配
列５’ＧＣＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＡＴ ＴＧＣ ＡＡＧ Ａ
ＡＣ ＣＴＴ Ｇ３’（下線で示すＢａｍＨＩ部位を有し、本明細書中では配列
番号３７と呼ぶ）を有するセンスプライマーＡＬＮ−ＦＥと、ヌクレオチド配列
５’ＣＡＧ ＧＴＡ ＣＣＣ ＴＣＴ ＴＴＴ ＡＧＡ ＡＧＣ ＡＣＣ ＧＧ
Ｔ ＣＣＣ３’（下線で示すＫｐｎ部位を有し、本明細書中では配列番号３８と
呼ぶ）を有するアンチセンスプライマーＡＬＮ−ＲＥを使用して、鋳型として前
述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMクローンからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応
を、以下の増幅サイクル：（ａ）９５℃３０秒で１サイクル、（ｂ）９５℃２０
秒、５０℃２０秒、７２℃２分で３０サイクル、（ｃ）７２℃５分で１サイクル
（以下、「標準的なサーモサイクリング条件」と呼ぶ）を使用して、２．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマー、５Ｕ／μｌ Ｔ
ａｑポリメラーゼ０．５μｌ、１μｇ／μｌの鋳型１μｌ、及び１０×Ｔａｑ緩
衝液３μｌを含む反応物（以下、「標準的なＰＣＲ反応条件」と呼ぶ）で行った
。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消
化され、アルカリホスファターゼで処理されているベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）に連結した。結果として生じる組換え分子
（本明細書中ではｐＴｒｃ−ｎＣｆＡＬＮ1152と呼ぶ）でＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２
１株（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．，ウィスコンシン州マディソン所在から入手可
能）を形質転換して、組換え細胞Ｅ．ｃｏｌｉ：ｐＴｒｃ−ｎＣｆＡＬＮ1152を
得た。
【０２５６】 組換え細胞を標準的な条件下で増殖させ、次いで、約４２．２ｋＤａと予想さ
れる組換え蛋白質の発現を誘導するために０．５μＭイソプロピルチオ−β−ガ
ラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下でインキュベートした。発現を、クマシーブル
ー染色したＴｒｉｓ−グリシンゲルを使用して、及びＴ７タグ抗体（Ｎｏｖａｇ
ｅｎから入手可能）を使用したウエスタンブロットにより確認した。Ｔ７タグ抗
体により、約５５ｋＤａの蛋白質が発現したことが示された。蛋白質産物を、Ｎ
ｉＣｌ2を充填したＨｉＴｒａｐTMＣｈｅｌａｔｉｎｇカラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａから入手可能）を使用した液体クロマトグラフィーにより精製した。この蛋
白質産物は、エドマン分解による自動蛋白質配列決定にかけた時に、ベクターの
Ｈｉｓタグを含むことが示された。
【０２５７】 アラントイナーゼがＨＭＴ組織のみで発現されるかを確かめるために、ノーザ
ンブロット分析を以下のように行った。ＨＭＴ組織を、ネコ血液を与えた１００
０匹のＣ．ｆｅｌｉｓ成虫（雄と雌の割合は１：４）から切り出した。総ＲＮＡ
を、以下のように、ＨＭＴ組織と、これらの解剖から生じたＨＭＴのない屠体か
ら別々に抽出した。組織を−８０℃で凍結させ、乳鉢と乳棒でひいて粉末にし、
粉末を均等に分けて４個の２ｍｌエッペンドルフチューブ（それぞれ溶解緩衝液
１ｍｌを含む）に入れた。溶解緩衝液は、４Ｍグアニジニウムチオシアネート、
２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、３％サルコシル、０．５Ｍ ２−
メルカプトエタノール、０．１％消泡剤、及び１ｍＭアウリントリカルボン酸（
全てＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ミズーリ州セン
トルイス所在から入手可能）を含んでいた。混合後に、チューブを１４，０００
ｒｐｍで２分間回転させ、上清を、フェノール（Ａｌｄｒｉｃｈ，ワイオミング
州ミルウォーキー所在から入手可能）２５０μｌを含む別々の２ｍｌエッペンド
ルフチューブに移した。混合後に、チューブを１４，０００ｒｐｍで５分間回転
させ、上清を新しい２ｍｌチューブに移した。フェノール／溶解緩衝液の界面に
蛋白質性物質が見えなくなるまで、このプロセスを３回繰り返し、次いで、クロ
ロホルム２５０μｌを各チューブに添加し、内容物を混合し、１４，０００ｒｐ
ｍで５分間回転させ、続いて、上清を新しいチューブに移した。上清の体積に等
しい体積のイソプロパノールを各チューブに添加し、チューブを５分間、氷上に
置いた。次いで、チューブを、室温で１５分間、１４，０００ｒｐｍで回転させ
、上清を取り出し、捨てて、残存しているＲＮＡペレットを７０％エタノールで
洗浄し、乾燥させた。ＲＮＡペレットを、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））１００μｌに再懸濁した。次いで、各チュ
ーブ内のＲＮＡ量を、分光光度計を使用して決定した。
【０２５８】 約１０μｇの各ＲＮＡを、ローディング緩衝液（５０％ホルムアミド、１６％
ホルムアルデヒド、１７％水、７％グリセロール、１×ＭＯＰＳ緩衝液（０．４
Ｍ ９３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）の１：２０希釈
液、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）からなる）１８．７５μｌ
、臭化エチジウム１０μｌ、及びブロモフェノールブルー色素１０μｌ（全てＳ
ｉｇｍａから入手可能）を含む別々のチューブに添加した。チューブを２分間９
５℃まで加熱し、次いで、氷上に置いた。ＲＮＡ試料を、３．２％ホルムアルデ
ヒドと１×ＭＯＰＳ緩衝液を含む１．５％アガロースゲルでのゲル電気泳動によ
り分離し、次いで、余分なホルムアルデヒドを除去するために、転写前に、ゲル
を水に３０分間浸けた。次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）により述べられた
標準的な技術を使用し、ゲルを、転写緩衝液として１０×ＳＳＰＥを使用してＮ
ｙｔｒａｎ（登録商標）ナイロンメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ
Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｉｎｃ．，Ｋｎｅｅｎｅ，ＮＨから入手可能）に転写した。こ
のメンブレンを、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅから入手可能）を使用してＵＶ架橋し、次いで、５０％ホルムアミド、５×Ｓ
ＳＰＥ、１．２％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１
００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中で、４２℃でプレハイブリダイゼーションした
。アラントイナーゼＥＳＴ核酸分子ｎＣｆＡＬＮ682を含むプローブを、ＤＮＡ
標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を使用してα−32Ｐ−ＡＴＰで標
識し、約１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの濃度で緩衝液に添加し、４２℃で１８時間ハ
イブリッド形成させた。次いで、ブロットを以下のように洗浄した。４×ＳＳＰ
Ｅ及び１％ＳＤＳで、４２℃で１０分；２×ＳＳＰＥ及び１％ＳＤＳで、４２℃
で１０分；０．５×ＳＳＰＥ及び０．５％ＳＤＳで、４２℃で１０分；０．２５
×ＳＳＰＥ及び０．２５％ＳＤＳで、４２℃で１０分。次いで、ブロットをフィ
ルムに１時間暴露し、フィルムを標準的な手順を使用して現像した。現像された
フィルムの分析から、アラントイナーゼｍＲＮＡはＨＭＴ組織に存在するが、非
ＨＭＴ組織には存在しないことが明らかになった。
【０２５９】 また、アラントイナーゼｍＲＮＡがノミ生活環のある特定の段階にだけ発現す
るかどうか、アラントイナーゼｍＲＮＡ発現が給餌により影響されるかどうかを
確かめるために、ノーザンブロット分析を行った。総ＲＮＡを、前述のように、
以下のそれぞれのノミ生活段階：卵、一齢幼虫、三齢幼虫、移行期幼虫、蛹の１
０００匹のノミから、及び以下の給餌条件：餌を与えていない、ネコ血液を１５
分間与えた、ネコ血液を２時間与えた、ネコ血液を８時間与えた、ネコ血液を２
４時間与えた、１０００匹のノミ成虫から抽出した。
【０２６０】 各ＲＮＡ試料をゲル電気泳動により分離し、ナイロンメンブレンに転写し、前
述したα−32Ｐ−ＡＴＰ標識ｎＣｆＡＬＮ682プローブとハイブリッド形成させ
た。現像されたフィルムの分析から、アラントイナーゼｍＲＮＡは、給餌条件に
かかわらず試験した全てのノミ成虫で発現し、卵及び蛹（この２つの生活段階で
は餌を食べず、尿を排出しない）を除く全ての生活段階で発現することが明らか
になった。
【０２６１】 実施例５ 本実施例は、Ｃ．ｆｅｌｉｓキチン結合蛋白質核酸分子のクローニング、配列
決定、組換え蛋白質発現、及び精製について述べる。本実施例はまた、様々なノ
ミ組織におけるキチン結合蛋白質ｍＲＮＡの発現について述べる。
【０２６２】 実施例１に記載のＨＭＴ ＥＳＴライブラリから１個のＴＡクローンを、標準
的な配列決定法を使用して配列決定した。このクローンは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏ
ｒｉ（カイコ）由来キチナーゼ様遺伝子と相同性を有することが分かった。この
クローンをＥｃｏＲＩで消化して、キチン結合蛋白質（ＣＢＰ）核酸分子ｎＣｆ
ＣＢＰ429と呼ぶ約４２９ヌクレオチド長のインサートを切り出した。このイン
サートを、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから入手
可能）を使用してゲル精製により単離した。約５０ｎｇの精製ｎＣｆＣＢＰ429
を使用し、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手
可能）と製造業者のプロトコルを使用して、32Ｐα−ｄＡＴＰ標識ＤＮＡプロー
ブを構築した。
【０２６３】 32Ｐα−ｄＡＴＰ標識プローブをプラークリフトハイブリダイゼーション手順
に使用して、クローンを、実施例４に記載の標準的なハイブリッド形成条件を使
用して、実施例１に記載のＨＭＴλ−ＺＡＰアンサブトラクティッドｃＤＮＡラ
イブラリから単離した。プローブと強くハイブリッド形成したプラークを単離し
、インビボエキシジョンに供した。インビボエキシジョンを、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ Ｅｘ−ＡｓｓｉｓｔTMヘルパーファージシステムとプロトコルを使用して
行って、ポジティブプラークをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMプラスミドＤＮＡに変
換した。製造業者のプロトコルを使用してＱｉａｇｅｎ ＱｉａｐｒｅｐTMスピ
ンミニプレップキットによりＤＮＡを調製し、各２０Ｕ／μｌのＥｃｏＲＩ及び
ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）約１μｌを
使用して制限酵素消化した後に、配列決定を行った。１個のクローンを一次プラ
ークから単離した。このクローンは、本明細書中で配列番号７と示すヌクレオチ
ド配列を有する約１１２８塩基対の核酸分子（本明細書中ではｎＣｆＣＢＰ1128 と呼ぶ）を含んでいた。配列番号７の相補的配列を本明細書中では配列番号９と
表す。ｎＣｆＣＢＰ429の配列決定により、ｎＣｆＣＢＰ429は、配列番号７のヌ
クレオチド１４８から５７６と１００％の同一性を有することが分かった。
【０２６４】 配列番号７の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＣＢＰ1128は、配列番号８により表
されるアミノ酸配列を有する、２７２アミノ酸の完全長キチン結合蛋白質（本明
細書中ではＰＣｆＣｆＣＢＰ272と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開始
コドンが、配列番号７のヌクレオチド６からヌクレオチド８に及び、終結コドン
が、配列番号７のヌクレオチド８２２からヌクレオチド８２４に及ぶと仮定する
。ＰＣｆＣＢＰ272をコードするコード領域は、配列番号１０により表される核
酸配列を有するコード鎖と配列番号１２により表される核酸配列を有する相補鎖
を有する、核酸分子ｎＣｆＣＢＰ816により表される。ＰＣｆＣＢＰ272のアミノ
酸配列（配列番号１１とも表される）により、ＰＣｆＣＢＰ272は、約３０．６
ｋＤａの推定分子量と約７．３の推定ｐＩを有することが予想される。
【０２６５】 配列番号８のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列との比
較により、配列番号８は、Ｌｕｃｉｌｉａ ｃｕｐｒｉｎａペリトロフィン（ｐ
ｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ）−４４蛋白質、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号４０
７９７６と最大の相同性（すなわち、約２６％の同一性）を示したことが分かる
。配列番号１０とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番
号１０は、Ｌｕｃｉｌｉａ ｃｕｐｒｉｎａペリトロフィン−４４核酸分子、Ｇ
ｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２５１０６と最大の相同性（すなわち、約４
０％の同一性）を示したことが分かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバー
ジョン９．０を使用し、デフォルトパラメータを使用して行った。
【０２６６】 推定成熟ノミキチン結合蛋白質をコードする、配列番号７のヌクレオチド５９
〜８２７を含む核酸分子を、ヌクレオチド配列５’ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＴ Ｇ
ＣＴ ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＣＣＣ ＡＣ３’（下線で示すＢａｍ
ＨＩ部位を有し、本明細書中では配列番号３９と呼ぶ）を有するセンスプライマ
ーＣＢＰ−ＦＥと、ヌクレオチド配列５’ＣＡＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＣＴ Ｇ
ＧＴ ＴＴＡ ＡＧＣ ＣＴＴ ＡＣＴ ＴＡＧ Ｃ３’（下線で示すＫｐｎ部
位を有し、本明細書中では配列番号３８と呼ぶ）を有するアンチセンスプライマ
ーＣＢＰ−ＲＥを使用して、鋳型として前述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMクロー
ンからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応を、標準的なＰＣＲ反応と実施例４に
記載のサーモサイクリング条件を使用して行った。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及び
ＫｐｎＩで消化し、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化され、アルカリホスファター
ゼで処理されているベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手
可能）に連結した。結果として生じる組換え分子（本明細書中ではｐＴｒｃ−ｎ
ＣｆＣＢＰ769と呼ぶ）でＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（Ｎｏｖａｇｅｎから入手
可能）を形質転換して、組換え細胞Ｅ．ｃｏｌｉ：ｐＴｒｃ−ｎＣｆＣＢＰ769
を得た。組換え細胞を標準的な条件下で増殖させ、次いで、約３２ｋＤａの蛋白
質であると予想される組換え蛋白質の発現を誘導するために０．５μＭ ＩＰＴ
Ｇの存在下でインキュベートした。蛋白質の発現を、クマシーブルー染色したＴ
ｒｉｓ−グリシンゲルを使用して、及びＴ７タグ抗体を使用したウエスタンブロ
ットにより確認した。Ｔ７タグ抗体により、約３２ｋＤａの蛋白質が発現したこ
とが示された。蛋白質産物を、ＮｉＣｌ2を充填したＨｉＴｒａｐTMＣｈｅｌａ
ｔｉｎｇカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を使用した液体クロマトグ
ラフィーにより精製した。この蛋白質産物は、エドマン分解による自動蛋白質配
列決定にかけた時に、ベクターのＨｉｓタグを含むことが示された。
【０２６７】 ＣＢＰ ｍＲＮＡが、ＨＭＴ組織だけで発現するのかどうか、ノミ生活環のあ
る特定の段階だけで発現するのかどうか、ＣＢＰ ｍＲＮＡの発現が給餌により
影響されるかどうかを確かめるために、ノーザンブロット分析を実施例４に記載
のように行った。総ＲＮＡを、実施例４に記載のようにノミ組織、生活段階及び
給餌条件から抽出した。各ＲＮＡ試料をゲル電気泳動により分離し、ナイロンメ
ンブレンに転写し、実施例４に記載のノザンブロッティング条件下でα−32Ｐ−
ＡＴＰ標識ｎＣｆＣＢＰ429とハイブリッド形成させた。現像されたフィルムの
分析から、ＣＢＰ ｍＲＮＡはＨＭＴ組織で発現するが、非ＨＭＴ組織では発現
しないことが明らかになった。ＣＢＰ ｍＲＮＡはまた、給餌条件にかかわらず
試験した全てのノミ成虫で検出されたが、成虫ではない、どの生活段階でも検出
されなかった。
【０２６８】 実施例６ 本実施例は、Ｃ．ｆｅｌｉｓナトリウム／カリウムＡＴＰアーゼβサブユニッ
ト核酸分子のクローニング及び配列決定について述べる。 実施例１に記載のＨＭＴ ＥＳＴライブラリから１個のＴＡクローンを、標準
的な配列決定法を使用して配列決定した。このクローンは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来神経系抗原１（ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅ
ｍ ａｎｔｉｇｅｎ １）遺伝子と相同性を有することが分かった。このクロー
ンをＥｃｏＲＩで消化して、ＮＫＡＢ核酸分子ｎＣｆＮＫＡＢ439と呼ぶ約４３
９ヌクレオチド長のインサートを切り出した。このインサートを、Ｇｅｌ Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使用してゲル精
製により単離した。約５０ｎｇの精製ｎＣｆＮＫＡＢ439を使用し、Ｍｅｇａｐ
ｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）と製造業者のプ
ロトコルを使用して、32Ｐα−ｄＡＴＰ標識ＤＮＡプローブを構築した。
【０２６９】 32Ｐα−ｄＡＴＰ標識プローブをプラークリフトハイブリダイゼーション手順
に使用して、クローンを、実施例４に記載の標準的なハイブリッド形成条件を使
用して、実施例１に記載のＨＭＴλ−ＺＡＰアンサブトラクティッドｃＤＮＡラ
イブラリから単離した。プローブと強くハイブリッド形成したプラークを単離し
、インビボエキシジョンに供した。インビボエキシジョンを、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ Ｅｘ−ＡｓｓｉｓｔTMヘルパーファージシステムとプロトコルを使用して
行って、ポジティブプラークをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMプラスミドＤＮＡに変
換した。製造業者のプロトコルを使用してＱｉａｇｅｎ ＱｉａｐｒｅｐTMスピ
ンミニプレップキットによりＤＮＡを調製し、各２０Ｕ／μｌのＥｃｏＲＩ及び
ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）約１μｌを
使用して制限酵素消化した後に、配列決定を行った。１個のクローンを二次プラ
ークから単離した。このクローンは、本明細書中で配列番号１３と示すヌクレオ
チド配列を有する約１７１４塩基対の核酸分子（本明細書中ではｎＣｆＮＫＡＢ 1714 と呼ぶ）を含んでいた。配列番号１３の相補的配列を本明細書中では配列番
号１５と表す。ｎＣｆＮＫＡＢ439の配列決定により、ｎＣｆＮＫＡＢ439は、配
列番号１３のヌクレオチド９０７から１３４５と１００％の同一性を有すること
が分かった。
【０２７０】 配列番号１３の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＮＫＡＢ1714は、配列番号１４に
より表されるアミノ酸配列を有する、３２６アミノ酸の完全長ＮＫＡＢ蛋白質（
本明細書中ではＰＣｆＮＫＡＢ326と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開
始コドンが、配列番号１３のヌクレオチド２９４からヌクレオチド２９６に及び
、終結コドンが、配列番号１３のヌクレオチド１２７２からヌクレオチド１２７
４に及ぶと仮定する。ＰＣｆＮＫＡＢ326をコードするコード領域は、配列番号
１６により表される核酸配列を有するコード鎖と配列番号１８により表される核
酸配列を有する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＮＫＡＢ978により表される。
ＰＣｆＮＫＡＢ326のアミノ酸配列（配列番号１７とも表される）により、ＰＣ
ｆＮＫＡＢ326は、約３７．７ｋＤａの推定分子量と約５の推定ｐＩを有するこ
とが予想される。
【０２７１】 配列番号１４のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列との
比較により、配列番号１４は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅ
ｒ神経系抗原２（ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｔｉｇｅｎ ２）蛋白質
、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号８８１３４４と最大の相同性（すなわち、
約４６％の同一性）を示したことが分かる。配列番号１６とＧｅｎＢａｎｋに報
告された核酸配列との比較により、配列番号１６は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍ
ｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ神経系抗原２核酸分子、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション
番号Ｕ２２４４０と最大の相同性（すなわち、約５２％の同一性）を示したこと
が分かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を使用し、デフ
ォルトパラメータを使用して行った。
【０２７２】 実施例７ 本実施例は、Ｃ．ｆｅｌｉｓリガンド依存性イオンチャネル核酸分子のクロー
ニング及び配列決定について述べる。本実施例はまた、様々なノミ組織における
リガンド依存性イオンチャネルｍＲＮＡの発現について述べる。
【０２７３】 実施例１に記載のＨＭＴ ＥＳＴライブラリから１個のＴＡクローンを、標準
的な配列決定法を使用して配列決定した。このクローンは、ヒトリガンド依存性
塩素チャネル核酸分子と相同性を有することが分かった。このクローンをＥｃｏ
ＲＩで消化して、ノミＬＧＩＣ核酸分子ｎＣｆＬＧＩＣ376と呼ぶ約３７６ヌク
レオチド長のインサートを切り出した。このインサートを、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使用してゲル精製によ
り単離した。約５０ｎｇの精製ｎＣｆＬＧＩＣ376を使用し、Ｍｅｇａｐｒｉｍ
ｅ ＤＮＡ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）と製造業者のプロトコ
ルを使用して、32Ｐα−ｄＡＴＰ標識ＤＮＡプローブを構築した。
【０２７４】 32Ｐα−ｄＡＴＰ標識プローブをプラークリフトハイブリダイゼーション手順
に使用して、クローンを、実施例４に記載の標準的なハイブリッド形成条件を使
用して、実施例１に記載のＨＭＴλ−ＺＡＰアンサブトラクティッドｃＤＮＡラ
イブラリから単離した。プローブと強くハイブリッド形成したプラークを単離し
、インビボエキシジョンに供した。インビボエキシジョンを、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ Ｅｘ−ＡｓｓｉｓｔTMヘルパーファージシステムとプロトコルを使用して
行って、ポジティブプラークをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMプラスミドＤＮＡに変
換した。製造業者のプロトコルを使用してＱｉａｇｅｎ ＱｉａｐｒｅｐTMスピ
ンミニプレップキットによりＤＮＡを調製し、各２０Ｕ／μｌのＥｃｏＲＩ及び
ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）約１μｌを
使用して制限酵素消化した後に、配列決定を行った。１個のクローンを二次プラ
ークから単離した。このクローンは、本明細書中で配列番号１９と示すヌクレオ
チド配列を有する約２２４０塩基対の核酸分子（本明細書中ではｎＣｆＬＧＩＣ 2240 と呼ぶ）を含んでいた。配列番号１９の相補的配列を本明細書中では配列番
号２１と表す。ｎＣｆＬＧＩＣ376の配列決定により、ｎＣｆＬＧＩＣ376は、配
列番号１９のヌクレオチド７６３から１１３８と１００％の同一性を有すること
が分かった。
【０２７５】 配列番号１９の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＬＧＩＣ2240は、配列番号２０に
より表されるアミノ酸配列を有する、５６９アミノ酸の部分長ＬＧＩＣ蛋白質（
本明細書中ではＰＣｆＬＧＩＣ569と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開
始コドンが、配列番号１９のヌクレオチド１からヌクレオチド３に及び、終結コ
ドンが、配列番号１９のヌクレオチド１７０８からヌクレオチド１７１０に及ぶ
と仮定する。ＰＣｆＬＧＩＣ569をコードするコード領域は、配列番号２２によ
り表される核酸配列を有するコード鎖と配列番号２４により表される核酸配列を
有する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＬＧＩＣ1707により表される。ＰＣｆＬ
ＧＩＣ569のアミノ酸配列（配列番号２３とも表される）により、ＰＣｆＬＧＩ
Ｃ569は、約６４ｋＤａの推定分子量と約６．６の推定ｐＩを有することが予想
される。
【０２７６】 配列番号２０のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列との
比較により、配列番号２０は、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓグリシン受
容体α−３鎖前駆体蛋白質、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号１２１５８０と
最大の相同性（すなわち、約２３％の同一性）を示したことが分かる。配列番号
２２とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番号２２は、
ヒトグリシン受容体α−３サブユニット核酸分子、ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ
ン番号ＡＦ０１７７１５と最大の相同性（すなわち、約３８％の同一性）を示し
たことが分かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を使用し
、デフォルトパラメータを使用して行った。
【０２７７】 ＬＧＩＣ ｍＲＮＡがＨＭＴ組織だけで発現するのかどうかを確かめるために
、ノーザンブロット分析を実施例４に記載のように行った。総ＲＮＡを、実施例
４に記載のようにＨＭＴ組織及び非ＨＭＴ組織から抽出した。各ＲＮＡ試料をゲ
ル電気泳動により分離し、ナイロンメンブレンに転写し、実施例４に記載のノザ
ンブロッティング条件下でα−32Ｐ−ＡＴＰ標識ｎＣｆＬＧＩＣ376とハイブリ
ッド形成させた。現像されたフィルムの分析から、ＬＧＩＣ ｍＲＮＡはＨＭＴ
組織で発現するが、非ＨＭＴ組織では発現しないことが明らかになった。
【０２７８】 前述のＬＧＩＣ ｃＤＮＡの５’末端コード領域に対応する、さらなる核酸配
列を、実施例３に記載のように調製したＲＡＣＥ ｃＤＮＡプールを鋳型として
使用してＰＣＲにより単離した。１回目のＰＣＲ反応を、配列番号１９のヌクレ
オチド２００〜２２３に相補的であり、核酸配列５’ＧＣＧ ＡＴＡ ＣＴＧ
ＧＴＧ ＧＴＡ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＡＧ３’ （本明細書中では配列番号１９
３２と示す）を有するリバースプライマーＬＧＩＣ−Ｒ４と、核酸配列５’ＣＣ
Ａ ＴＣＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＣ３’
（本明細書中では配列番号１９３３と示す）を有するフォワードリンカープライ
マーＡｄａｐｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ１を使用し、標準的なＰＣＲ反応条件と以下
のサーモサイクリング条件：（１）９４℃３０秒、（２）９４℃１０秒、次いで
、７２℃４分の５サイクル、（３）９４℃１０秒、次いで、７０℃４分の５サイ
クル、（４）９４℃１０秒、次いで、６８℃４分の２５サイクルを使用して行っ
た。反応産物を１．５％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムにより染色し
たが、明らかなバンドは見られなかった。１回目のＰＣＲ反応産物を水で１：５
０に希釈し、２回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。２回目のＰＣＲ反応で
は、１回目のＰＣＲ反応について述べた同じ反応条件下で、配列番号１９のヌク
レオチド８８〜１１０に相補的であり、核酸配列５’ＧＡＧ ＧＴＧ ＧＴＴ
ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＧＴ ＴＧ３’ （本明細書中では配列番号１９３
４と示す）を有するリバースプライマーＬＧＩＣ−Ｒ５と、核酸配列５’ＡＣＴ
ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣ３’ （本明細書中
では配列番号１９３５と示す）を有するフォワードＡｄａｐｔｅｒ Ｐｒｉｍｅ
ｒ２を使用した。反応産物を１．５％アガロースゲルでの電気泳動により分離し
、臭化エチジウムで染色し、これにより約７００ｂｐのバンドが見えるようにな
った。このバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａ
ｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製し、次いで、製造業者のプロトコルを使用し
てｐＣＲ ＩＩ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カリフォルニア州カールズバッド所在から入手可能）に連
結した。このクローン（本明細書中ではｎＣｆＬＧＩＣ613と呼び、配列番号１
８５９と示すコード配列と本明細書中で配列番号１８６０と示す相補鎖を有する
）を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７自動ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪから入手可能）を使用して配列決定した。
配列解析により、ｎＣｆＬＧＩＣ613のヌクレオチド５０３〜６１３は配列番号
１９のヌクレオチド１〜１１０と１００％の同一性を有することが明らかになっ
た。この２つの配列をアラインメントして、２７３９ヌクレオチドの連続配列（
本明細書中ではｎＣｆＬＧＩＣ2739と呼び、本明細書中で配列番号１８６１と示
すコード鎖と本明細書中で配列番号１８６３と示す相補鎖を有する）を得た。配
列番号１８６１の翻訳から、核酸分子ｎＣｆＬＧＩＣ2739は、６７２アミノ酸の
完全長ＬＧＩＣ蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＬＧＩＣ672と呼ぶ）をコードす
ることが示唆される。開始コドンが、配列番号１８６１のヌクレオチド１９１か
らヌクレオチド１９３に及び、終結コドンが、配列番号１８６１のヌクレオチド
２２０７からヌクレオチド２２０９に及ぶと仮定する。ＰＣｆＬＧＩＣ672をコ
ードするコード領域は、配列番号１８６４により表される核酸配列を有するコー
ド鎖と、配列番号１８６６により表される核酸配列を有する相補鎖を有する、核
酸分子ｎＣｆＬＧＩＣ2016により表される。ＰＣｆＬＧＩＣ672のアミノ酸配列
（すなわち、配列番号１８６２）から、ＰＣｆＬＧＩＣ672は、約７５．５ｋＤ
ａの推定分子量と約５．８９の推定ｐＩを有することが予想される。
【０２７９】 配列番号１８６２のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列
との比較により、配列番号１８６２は、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由
来グリシン受容体α３鎖前駆体ｃＤＮＡ（アクセッション番号Ｐ２４５２４）と
最大の相同性（すなわち、約３１．４％の同一性）を示したことが分かる。配列
番号１８６４とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番号
１８６４は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓグリシン受容体α３ ｃＤＮＡ（アクセ
ッション番号ＮＰ００６５２０）と最大の相同性（すなわち、約４３．１％の同
一性）を示したことが分かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョン９
．０を使用し、デフォルトパラメータを使用して行った。
【０２８０】 推定細胞外ドメインを組換え発現するためのＬＧＩＣ核酸分子を以下のように
作成した。ＬＧＩＣ ｃＤＮＡの推定細胞外ドメインをコードする領域をＩｎｓ
ｅｃｔＳｅｌｅｃｔTM発現ベクターｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓに連結するために、異
なるが重複する２つのＤＮＡフラグメントを作成して、ＰＣＲ重複伸張（ＰＣＲ
ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）での鋳型として使用した。３’ＤＮＡ
フラグメントを作成するために、１回目のＰＣＲ反応を、配列番号１９のヌクレ
オチド２〜１５に対応し、核酸配列５’ＣＡＡ ＴＴＴ ＴＡＡ ＡＣＧ ＣＡ
Ｔ ＣＣＡ ＣＧＡ ＣＣＧ３’（本明細書中では配列番号１９３６と示す）を
有するフォワードプライマーＬＧＩＣ−ＥＣＤ−Ｄ２Ｆと、配列番号１９のヌク
レオチド９３７〜９６１に相補的であり、核酸配列５’ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＴＴ ＴＣＡ ＣＧＡ ＣＴＴ ＡＴＴ ＴＧＡ ＡＴＣ
Ｇ３’（本明細書中では配列番号１９３７として示し、下線で示すＸｈｏＩ部
位を有する）を有するリバースプライマーＬＧＩＣ−ＥＣＤ−ＲＥを使用し、標
準的な反応条件と以下のサーモサイクリング条件：（１）９４℃３０秒、（２）
９４℃１０秒、５５℃１０秒、及び７２℃３分の２５サイクルで行って、鋳型と
して使用した配列番号１９からヌクレオチド２〜９６３を増幅した。この反応の
産物を１．５％アガロースゲルで分離し、約９６０ヌクレオチド分子に対応する
バンドをゲルから切り出し、前述のようにＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒ
ａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。５’ｃＤＮＡフラグメントを作成す
るために、リバースプライマーＬＧＩＣ−Ｒ５（配列番号１９３４）と、配列番
号１８５９のヌクレオチド１８８〜２１５に対応し、核酸配列５’ＧＧＡ ＡＴ Ｔ Ｃ ＴＡ ＡＡＡ ＴＧＣ ＡＣＡ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＣ
Ｃ ＴＧＧ３’（本明細書中では配列番号１９３８として示し、下線で示すＥｃ
ｏＲＩ部位を有する）を有するフォワードプライマーＬＧＩＣ−ＥＣＤ−ＦＥを
使用し、鋳型として配列番号１８５９を使用して、３’フラグメント作成につい
て述べたサーモサイクリング条件下で、２回目のＰＣＲ反応を行った。この反応
の産物を１．５％アガロースゲルで分離し、約４２５ヌクレオチド分子に対応す
るバンドをゲルから切り出し、前述のようにＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔ
ｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。
【０２８１】 ＰＣＲ重複伸張反応のために、前述した５’ｃＤＮＡフラグメント及び３’ｃ
ＤＮＡフラグメントを、フォワードプライマーＬＧＩＣ−ＥＣＤ−ＦＥとリバー
スプライマーＬＧＩＣ−ＥＣＤ−ＲＥを使用し、５’フラグメント及び３’フラ
グメント作成について述べたサーモサイクリング条件下でのＰＣＲ反応の鋳型と
して使用した。この反応の産物を１．５％アガロースゲルで分離し、約１３００
ヌクレオチド分子（本明細書中ではｎＣｆＬＧＩＣ1300と呼ぶ）に対応するバン
ド（アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色により視覚化された）をゲル
から切断し、前述のようにＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔを使用して精製した。
【０２８２】 ＰＣＲ重複伸張反応の産物を、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアー
ゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ
Ａ）で、３７℃で１時間、消化した。消化産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使用し
て精製し、ベクターｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ（これもＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消
化され、エビアルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ
ｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）で、３７℃で３０分間、消化されている）に連結し
た。標準的な形質転換手順の後、プラスミドｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｎＣｆＬＧ
ＩＣ1300を含む細菌クローンを単離した。ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｎＣｆＬＧＩ
Ｃ1300のＤＮＡ配列解析により、配列番号１８６１のヌクレオチド１８８〜１４
６４は、ベクターによりコードされるＣ末端Ｖ５エピトープと共に、ｐＩＢ／Ｖ
５発現ベクターに首尾よくインフレームで連結されていることが確認された。
【０２８３】 実施例８ 本実施例は、Ｃ．ｆｅｌｉｓ ＡＮＯＮ／２３ＤＡ核酸分子のクローニング及
び配列決定について述べる。本実施例はまた、様々なノミ組織におけるＡＮＯＮ
／２３ＤＡ ｍＲＮＡの発現について述べる。
【０２８４】 実施例１に記載のＨＭＴ ＥＳＴライブラリから１個のＴＡクローンを、標準
的な配列決定法を使用して配列決定した。このクローンは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来ＡＮＯＮ／２３ＤＡ遺伝子と相同性を有する
ことが分かった。このクローンをＥｃｏＲＩで消化して、ノミＡＮＯＮ核酸分子
ｎＣｆＡＮＯＮ177と呼ぶ約１７７ヌクレオチド長のインサートを切り出した。
このインサートを、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ
から入手可能）を使用してゲル精製により単離した。約５０ｎｇの精製ｎＣｆＡ
ＮＯＮ177を使用し、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍから入手可能）と製造業者のプロトコルを使用して、32Ｐα−ｄＡＴＰ標識Ｄ
ＮＡプローブを構築した。
【０２８５】 32Ｐα−ｄＡＴＰ標識プローブをプラークリフトハイブリダイゼーション手順
に使用して、クローンを、実施例４に記載の標準的なハイブリッド形成条件を使
用して、実施例１に記載のＨＭＴλ−ＺＡＰアンサブトラクティッドｃＤＮＡラ
イブラリから単離した。プローブと強くハイブリッド形成したプラークを単離し
、インビボエキシジョンに供した。インビボエキシジョンを、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ Ｅｘ−ＡｓｓｉｓｔTMヘルパーファージシステムとプロトコルを使用して
行って、ポジティブプラークをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMプラスミドＤＮＡに変
換した。製造業者のプロトコルを使用してＱｉａｇｅｎ ＱｉａｐｒｅｐTMスピ
ンミニプレップキットでＤＮＡを調製し、各２０Ｕ／μｌのＥｃｏＲＩ及びＸｈ
ｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）約１μｌで制限
酵素消化した後に、配列決定を行った。１個のクローンを二次プラークから単離
した。このクローンは、本明細書中で配列番号２５と示すヌクレオチド配列を有
する約１４２９塩基対の核酸分子（本明細書中ではｎＣｆＡＮＯＮ1429と呼ぶ）
を含んでいた。配列番号２５の相補的配列を本明細書中では配列番号２７と表す
。ｎＣｆＡＮＯＮ177の配列決定により、ｎＣｆＡＮＯＮ177は、配列番号２５の
ヌクレオチド２７９から４５５と１００％の同一性を有することが分かった。
【０２８６】 配列番号２５の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＡＮＯＮ1429は、配列番号２６に
より表されるアミノ酸配列を有する、３９８アミノ酸の完全長ＡＮＯＮ蛋白質（
本明細書中ではＰＣｆＡＮＯＮ398と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開
始コドンが、配列番号２５のヌクレオチド１８からヌクレオチド２０に及び、終
結コドンが、配列番号２５のヌクレオチド１２１２からヌクレオチド１２１４に
及ぶと仮定する。ＰＣｆＡＮＯＮ398をコードするコード領域は、配列番号２８
により表される核酸配列を有するコード鎖と配列番号３０により表される核酸配
列を有する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＡＮＯＮ1194により表される。ＰＣ
ｆＡＮＯＮ398のアミノ酸配列（配列番号２９とも表される）により、ＰＣｆＡ
ＮＯＮ398は、約４５ｋＤａの推定分子量と約８．８の推定ｐＩを有することが
予想される。
【０２８７】 配列番号２６のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列との
比較により、配列番号２６は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅ
ｒ ＡＮＯＮ／２３ＤＡ蛋白質、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号９２４９３
７と最大の相同性（すなわち、約６５％の同一性）を示したことが分かる。配列
番号２８とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番号２８
は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＡＮＯＮ／２３ＤＡ核
酸分子、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２９１７０と最大の相同性（すな
わち、約６０％の同一性）を示したことが分かる。同一性パーセントの計算を、
ＧＣＧバージョン９．０を使用し、デフォルトパラメータを使用して行った。
【０２８８】 ＡＮＯＮ ｍＲＮＡが、ＨＭＴ組織だけで発現するのかどうか、ノミ生活環の
ある特定の段階だけで発現するのかどうか、ＡＮＯＮ ｍＲＮＡの発現が給餌に
より影響されるかどうかを確かめるために、ノーザンブロット分析を実施例４に
記載のように行った。総ＲＮＡを、実施例４に記載のようにノミ組織、生活段階
、及び給餌条件から抽出した。各ＲＮＡ試料をゲル電気泳動により分離し、ナイ
ロンメンブレンに転写し、実施例４に記載のノザンブロッティング条件下でα− 32 Ｐ−ＡＴＰ標識ｎＣｆＡＮＯＮ177とハイブリッド形成させた。現像されたフ
ィルムの分析から、ＡＮＯＮ ｍＲＮＡは非ＨＭＴ組織で発現するが、ＨＭＴ組
織では発現しないことが明らかになった。ＡＮＯＮ ｍＲＮＡはまた、給餌条件
にかかわらず試験した全てのノミ成虫で検出され、移行期幼虫及び蛹の生活段階
で検出された。
【０２８９】 実施例９ 本実施例は、Ｃ．ｆｅｌｉｓ ｍａｏｖｏｌｉｏ核酸分子のクローニング及び
配列決定について述べる。 実施例１に記載のＨＭＴ ＥＳＴライブラリから１個のＴＡクローンをＥｃｏ
ＲＩで消化して、ｎＣｆＭＡＬＶ432と呼ぶ約４３２ヌクレオチド長のインサー
トを切り出した。このインサートを、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使用してゲル精製により単離した。このイン
サートは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来ｍａｌｖｏｌ
ｉｏ遺伝子と相同性を有することが分かり、以下、ノミＭＡＬＶ核酸分子と呼ぶ
。
【０２９０】 以下のようにネスティッドＰＣＲを使用して、実施例１に記載のＨＭＴアンサ
ブトラクティットライブラリからＣ．ｆｅｌｉｓ ＭＡＬＶ核酸分子を増幅する
ために、ｎＣｆＭＡＬＶ432からの配列情報を使用してＰＣＲプライマーを設計
した。ＨＭＴアンサブトラクティットライブラリを鋳型として使用し、標準的な
ＰＣＲ反応条件とサーモサイクリング条件（２μｌの鋳型を使用したことを除く
）を使用した１回目のＰＣＲ反応に、ヌクレオチド配列５’ＣＣＡ ＴＴＡ Ｔ
ＴＡ ＡＣＣ ＴＧＧ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＣ３’（配列番号４１と呼ぶ）を有
し、ｎＣｆＭＡＬＶ432のヌクレオチド３６５〜３８７に対応するセンスプライ
マーＭＡＬＶ Ｒ１と、ヌクレオチド配列５’ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＴ ＡＴＧ
ＡＣＣ ＡＴＧ３’（配列番号４２と呼ぶ）を有するリバースプライマーＭ１
３ Ｒｅｖｅｒｓｅを使用した。１回目のＰＣＲ反応からの反応産物を１：５０
に希釈し、以下のように２回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。標準的なＰ
ＣＲ反応とサーモサイクリング条件下での２回目のＰＣＲ反応に、ヌクレオチド
配列５’ＣＧＣ ＴＡＴ ＡＧＴ ＣＧＧ ＴＡＧ ＧＧＴ ＣＧＣ３’（配列
番号４３と呼ぶ）を有し、ｎＣｆＭＡＬＶ432のヌクレオチド２３９〜２５９に
対応するリバースプライマーｍａｌｖｏｌｉｏ Ｒ２と、ヌクレオチド配列５’
ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＣＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＡＡＧ ＧＧ３’を有するフォワー
ドプライマーＴ３を使用した。
【０２９１】 ２回目のＰＣＲ反応により約１０００ｂｐのＰＣＴ産物が得られ、この産物を
１．５％アガロースゲルでの電気泳動により分離し、切り出し、Ｇｅｌ Ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使用して精製した
。精製ＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩTM，Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡクローニングベク
ター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）に連結した。次いで、連結反応物を
使用して、ＩＮＶαＦ’Ｏｎｅ ＳｈｏｔTMコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎから入手可能）を形質転換し、これを、５０マイクログラム／ミリリット
ル（μｇ／ｍｌ）のアンピシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から入
手可能）と５０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈから入
手可能）を含むＬＢ寒天上にプレーティングした。約７６５塩基対の核酸分子（
本明細書中ではｎＣｆＭＡＬＶ765と呼び、本明細書中で配列番号３１と示すヌ
クレオチド配列を有する）を含む１個のクローンを、連結混合物から単離した。
配列番号３１の相補的配列を、本明細書中では配列番号３３と表す。
【０２９２】 配列番号３１の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＭＡＬＶ765は、配列番号３２に
より表されるアミノ酸配列を有する、２５４アミノ酸の部分長ＭＡＬＶ蛋白質（
本明細書中ではＰＣｆＭＡＬＶ254と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開
始コドンが、配列番号３１のヌクレオチド２からヌクレオチド４に及び、最後の
コドンが、配列番号３１のヌクレオチド７６１からヌクレオチド７６３に及ぶと
仮定する。ＰＣｆＭＡＬＶ254をコードするコード領域は、配列番号３４により
表される核酸配列を有するコード鎖と配列番号３６により表される核酸配列を有
する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＭＡＬＶ762により表される。ＰＣｆＭＡ
ＬＶ254のアミノ酸配列（配列番号３５とも表される）により、ＰＣｆＭＡＬＶ2 54 は、約３６ｋＤａの推定分子量と約４．９の推定ｐＩを有することが予想され
る。
【０２９３】 配列番号３２のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列との
比較により、配列番号３２は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅ
ｒ ｍａｌｖｏｌｉｏ蛋白質、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号７８０７７
６と最大の相同性（すなわち、約７１％の同一性）を示したことが分かる。配列
番号３４とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番号３４
は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｍａｌｖｏｌｉｏ核酸
分子、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２３９４８と最大の相同性（すなわ
ち、約６３％の同一性）を示したことが分かる。同一性パーセントの計算を、Ｇ
ＣＧバージョン９．０を使用し、デフォルトパラメータを使用して行った。
【０２９４】 実施例１０ 本実施例は、Ｃ．ｆｅｌｉｓ嗅覚物質結合蛋白質（ｏｄｏｒａｎｔ−ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）様（ＯＳ−Ｄ）核酸分子のクローニング、配列決定、
及び組換え発現について述べる。本実施例はまた、様々なノミ組織におけるＯＳ
−Ｄ ｍＲＮＡの発現について述べる。
【０２９５】 １９９６年４月２５日に公開されたＧｒｉｅｖｅらによるＰＣＴ公報ＷＯ／９
６／１１７０６の実施例８に記載のように調製した、ネコ血液を与えたノミ成虫
のｃＤＮＡライブラリから、約３１１ヌクレオチドのＣ．ｆｅｌｉｓ ＯＳ−Ｄ
核酸分子を、以下のようにＰＣＲ増幅により単離した。ネコ血液を与えたノミ成
虫のｃＤＮＡライブラリを鋳型として使用し、標準的なＰＣＲ反応とサーモサイ
クリング条件下での１回目のＰＣＲ反応に、ヌクレオチド配列５’ＣＡＡ ＡＡ
Ｃ ＴＧＧ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＧＣ ＴＣ３’（配列番号５７と示す）を有す
るセンスプライマー５’ｎｅｗＢｓａＩ５’と、ヌクレオチド配列５’ＴＡＡ
ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧ３’（配列番号５８と示す）を
有するベクタープライマーＴ７を使用した。３１１ヌクレオチドのフラグメント
（ｎＣｆＯＳＤ311と呼ぶ）を単離した。このフラグメントは、Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＯＳ−Ｄ蛋白質に似た配列を有する、４５
アミノ酸の部分長蛋白質をコードすることが分かった。プライマー５’ｎｅｗＢ
ｓａＩ５’を、Ｃ．ｆｅｌｉｓセルピン定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉ
ｏｎ）に特異的であるように設計したので、ｎＣｆＯＳＤ311は、このＰＣＲ反
応で偶然に増幅されたと考えられる。
【０２９６】 完全長ＯＳ−Ｄ蛋白質をコードするノミＯＳ−Ｄ核酸分子を単離するために、
核酸分子ｎＣｆＯＳＤ311を使用して、以下のようにネスティッドＰＣＲ用のプ
ライマーを設計した。ネコ血液を与えたノミ成虫のＣ．ｆｅｌｉｓ ｃＤＮＡラ
イブラリを鋳型として使用する１回目のＰＣＴ反応に、ｎＣｆＯＳＤ311のヌク
レオチド１０８〜１２７に配列が相補的なヌクレオチド配列５’ＧＧＴ ＴＣＧ
ＣＣＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＴＧ３’（配列番号５９と示す）を有する
センスプライマーＯＳＤ−Ｒ１と、Ｍ１３リバースプライマー（配列番号１３）
を使用した。１回目の反応の産物を１：５０に希釈し、２回目のＰＣＲ反応の鋳
型として使用した。２回目のＰＣＲ反応では、ｎＣｆＯＳＤ311のヌクレオチド
５２〜７２に配列が相補的なヌクレオチド配列５’ＣＧＧ ＴＴＧ ＧＡＴ Ｃ
ＧＴ ＡＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ３’（配列番号６０と示す）を有するリバースプ
ライマーＯＳＤ−Ｒ２と、フォワードプライマーＴ３（配列番号５６）を使用し
た。それぞれのＰＣＲ反応を、５０℃ではなく５５℃のアニーリング温度を使用
したことを除いて、標準的なＰＣＲ反応条件とサーモサイクリング条件下で行っ
た。
【０２９７】 約３６５ヌクレオチドのＤＮＡフラグメント（本明細書中ではｎＣｆＯＳＤ36 5 と呼ぶ）を２回目のＰＣＲ産物から単離し、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使用して精製した。精製フラグメン
トを、ｐＣＲＩＩTMＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手
可能）に連結し、標準的な配列決定法を使用して配列決定した。配列決定により
、ｎＣｆＯＳＤ365のヌクレオチド２９４〜３６５は、前述の分子ｎＣｆＯＳＤ3 11 のヌクレオチド１〜７２と一致することが明らかになった。前述の部分長クロ
ーンからの配列をアラインメントして、６０４ヌクレオチドの完全長コード領域
を含む配列（ｎＣｆＯＳＤ604と呼び、本明細書中では配列番号３７と示す）を
得た。ここで、ｎＣｆＯＳＤ311は、配列番号３７のヌクレオチド２９４〜６０
４と配列が同一であり、ｎＣｆＯＳＤ365は、配列番号３７のヌクレオチド１〜
３６５と配列が同一である。配列番号３７の相補的配列を、本明細書中では配列
番号３９と表す。
【０２９８】 配列番号３７の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＯＳＤ604は、配列番号３８によ
り表されるアミノ酸配列を有する、１３５アミノ酸の完全長ＯＳ−Ｄ蛋白質（本
明細書中ではＰＣｆＯＳＤ135と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開始コ
ドンが、配列番号３７のヌクレオチド２６からヌクレオチド２８に及び、終結コ
ドンが、配列番号３７のヌクレオチド４３１からヌクレオチド４３３に及ぶと仮
定する。ＰＣｆＯＳＤ135をコードするコード領域は、配列番号４０により表さ
れる核酸配列を有するコード鎖と配列番号４２により表される核酸配列を有する
相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＯＳＤ405により表される。ＰＣｆＯＳＤ135の
アミノ酸配列（配列番号４１とも表される）により、ＰＣｆＯＳＤ135は、約１
５ｋＤａの推定分子量と約８．６の推定ｐＩを有することが予想される。配列番
号３８の分析により、約アミノ酸１から約アミノ酸２０に及ぶアミノ酸ストレッ
チによりコードされるシグナルペプチドの存在が示唆される。提案された成熟蛋
白質（本明細書中ではＰＣｆＯＳＤ115と示す）は、配列番号３８のアミノ酸２
１から１３５に対応する約１１５のアミノ酸を含む。成熟蛋白質（すなわち、シ
グナルペプチドが除去された蛋白質）の推定ｐＩは６．６である。
【０２９９】 配列番号３８のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列との
比較により、配列番号３８は、Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａ化
学感覚蛋白質（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＣＳＰ−ｓｇ４、
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号３２８３９３８と最大の相同性（すなわち、
約６０％の同一性）を示したことが分かる。配列番号４０とＧｅｎＢａｎｋに報
告された核酸配列との比較により、配列番号４０は、Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ
ｇｒｅｇａｒｉａ化学感覚蛋白質ＣＳＰ−ｓｇ４核酸分子、ＧｅｎＢａｎｋア
クセッション番号ＡＦ０７０９６４と最大の相同性（すなわち、約５８％の同一
性）を示したことが分かる。配列番号４０と、実施例２に記載のＨＮＣサブトラ
クティッドライブラリ及びＨＮＣアンサブトラクティッドライブラリをスクリー
ニングしたときに配列決定された核酸分子との比較により、ＯＳ−Ｄ（すなわち
、配列番号４０）は、これらのライブラリのどちらでも発現していることが明ら
かになった。さらなる配列解析により、Ｃ．ｆｅｌｉｓ ＯＳ−Ｄには４つのシ
ステインが存在することが明らかになった。これらのシステインは、他の昆虫の
ＯＳ−Ｄ様分子（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＯＳ−Ｄ蛋白質、ＧｅｎＢａ
ｎｋアクセッション番号Ｕ０２５４６、Ｓ．ｇｒｅｇａｒｉａ化学感覚蛋白質Ｃ
ＳＰ−ｓｇ４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７０９６４、及びゴキ
ブリ肢再生蛋白質（ｌｅｇ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｇ
ｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３０３４０を含む）の４つのシステイン
との配列アラインメントにおいて保存されている。同一性パーセントの計算とさ
らなる配列解析を、ＧＣＧバージョン９．０を使用し、デフォルトパラメータを
使用して行った。
【０３００】 前述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMクローンを鋳型として使用し、ヌクレオチド
配列５’ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＴＡＣ
ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＴＧＡ ＴＡＡ Ｃ３’（下線で示すＢａｍＨＩ部位
を有し、本明細書中では配列番号６１と呼ぶ）を有するセンスプライマーＯＳＤ
−ＦＥと、ヌクレオチド配列５’ＧＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＴ Ｔ
ＴＧ ＧＡＡ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＡＣＧ Ｇ３’（下線で示す
ＥｃｏＲＩ部位を有し、本明細書中では配列番号６２と呼ぶ）を有するアンチセ
ンスプライマーＯＳＤ−ＲＥを使用して、推定成熟ノミＯＳ−Ｄ蛋白質をコード
する、配列番号３７のヌクレオチド９１から４４７を含む核酸分子をＰＣＲで増
幅した。ＰＣＲ反応を、実施例４に記載の標準的なＰＣＲ反応とサーモサイクリ
ング条件を使用して行った。産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、フラ
グメントを切り出し、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅ
ｎから入手可能）を使用して精製した。フラグメントをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで消化し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化され、アルカルホスファターゼで
処理されているベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能
）に連結した。結果として生じる組換え分子（本明細書中ではｐＴｒｃ−ｎＣｆ
ＯＳＤ357と呼ぶ）でＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能
）を形質転換して、組換え細胞Ｅ．ｃｏｌｉ：ｐＴｒｃ−−ｎＣｆＯＳＤ357を
得た。
【０３０１】 組換え細胞を標準的な条件下で増殖させ、次いで、約１７ｋＤａと予想される
組換え蛋白質の発現を誘導するために０．５ｍＭ ＩＰＴＧの存在下でインキュ
ベートした。蛋白質の発現を、クマシーブルー染色したＴｒｉｓ−グリシンゲル
を使用して、及びＴ７タグ抗体を使用したウエスタンブロットにより確認した。
Ｔ７タグ抗体により、約１７ｋＤａの蛋白質が発現したことが示された。
【０３０２】 ＯＳ−Ｄ ｍＲＮＡがＨＮＣ組織のみで発現するかを確かめるために、ノーザ
ンブロット分析を以下のように行った。ＨＮＣ組織を、ネコ血液を与えた１５０
０匹のＣ．ｆｅｌｉｓ成虫（雄と雌の割合は１：４）から切り出した。総ＲＮＡ
を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）により述べられた標準的なグアニジン溶解法を
使用して、ＨＮＣ組織と、これらの解剖から生じたＨＮＣのない屠体から別々に
抽出した。
【０３０３】 約１５μｇの各ＲＮＡを、Ｇｌｙｏｘａｌゲル（ＲＮＡをＢｕｒｎｅｔｔ，Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：４，６６８−６７１頁，１９９７に従って調
製する）又はホルムアルデヒドゲル（ＲＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に従
って調製する）での電気泳動により分離した。電気泳動の後、Ｂｕｒｎｅｔｔ及
びＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に記載のプロトコルに従って、ＲＮＡをＨｙｂｏ
ｎｄ Ｎナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）にブロットした
。このメンブレンを、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅから入手可能）を使用してＵＶ架橋し、次いで、４２℃で約３〜６時間、
５×ＳＳＰＥ、１％サルコシル、５０％ホルムアミド、５×デンハルト試薬、及
び２５ｍＭ ＥＤＴＡからなる約３０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液に入
れた。ノミＯＳ−Ｄ核酸分子ｎＣｆＯＳＤ357を含むプローブを、ＤＮＡ標識キ
ット（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を使用してα−32Ｐ−ＡＴＰで標識し、
約１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの濃度で緩衝液に添加し、４２℃で約１４〜１８時間
ハイブリッド形成させた。次いで、ブロットを、０．５×ＳＳＰＥ及び０．１％
サルコシルで、５５℃で１回の洗浄あたり１０分間、２回洗浄し、オートラジオ
グラフィー用のフィルムに暴露した。現像されたフィルムの分析から、非ＨＮＣ
組織と比較して、ＨＮＣ組織でのＯＳ−Ｄ ｍＲＮＡ発現は大きいことが分かっ
た。このことから、ＯＳ−Ｄは、ノミ頭部及び神経索においてアップレギュレー
トされている可能性があることが分かる。
【０３０４】 実施例１１ 本実施例は、Ｃ．ｆｅｌｉｓ Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体関連（
ＮＭＤＡ）核酸分子のクローニング及び配列決定について述べる。 実施例１に記載のＨＭＴ ＥＳＴライブラリから１個のＴＡクローンを、標準
的な配列決定法を使用して配列決定した。このクローンは、ＮＭＤＡ遺伝子と有
意な相同性を有することが分かった。このクローンをＥｃｏＲＩで消化して、ノ
ミＮＭＤＡ核酸分子ｎＣｆＮＭＤＡ279と呼ぶ約２７９ヌクレオチド長のインサ
ートを切り出した。このインサートを、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使用してゲル精製により単離した。約５０
ｎｇの精製ｎＣｆＮＭＤＡ279を使用し、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キッ
ト（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）と製造業者のプロトコルを使用して、32Ｐ
α−ｄＡＴＰ標識ＤＮＡプローブを構築した。
【０３０５】 32Ｐα−ｄＡＴＰ標識プローブをプラークリフトハイブリダイゼーション手順
に使用して、クローンを、実施例４に記載の標準的なハイブリッド形成条件を使
用して、実施例１に記載のＨＭＴλ−ＺＡＰアンサブトラクティッドｃＤＮＡラ
イブラリから単離した。プローブと強くハイブリッド形成したプラークを単離し
、インビボエキシジョンに供した。インビボエキシジョンを、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ Ｅｘ−ＡｓｓｉｓｔTMヘルパーファージシステムとプロトコルを使用して
行って、ポジティブプラークをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMプラスミドＤＮＡに変
換した。製造業者のプロトコルを使用してＱｉａｇｅｎ ＱｉａｐｒｅｐTMスピ
ンミニプレップキットでＤＮＡを調製し、各２０Ｕ／μｌのＥｃｏＲＩ及びＸｈ
ｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）約１μｌで制限
酵素消化した後に、配列決定を行った。１個のクローンを二次プラークから単離
した。このクローンは、本明細書中で配列番号４３と示すヌクレオチド配列を有
する約１２２７塩基対の核酸分子（本明細書中ではｎＣｆＮＭＤＡ1227と呼ぶ）
を含んでいた。配列番号４３の相補的配列を本明細書中では配列番号４５と表す
。ｎＣｆＮＭＤＡ279の配列決定により、ｎＣｆＮＭＤＡ279は、配列番号４３の
ヌクレオチド７０９から９８７と１００％の同一性を有することが分かった。
【０３０６】 配列番号４３の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＮＭＤＡ1227は、配列番号４４に
より表されるアミノ酸配列を有する、２４６アミノ酸の完全長ＮＭＤＡ蛋白質（
本明細書中ではＰＣｆＮＭＤＡ246と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開
始コドンが、配列番号４３のヌクレオチド３１２からヌクレオチド３１４に及び
、終結コドンが、配列番号４３のヌクレオチド１０５０からヌクレオチド１０５
２に及ぶと仮定する。ＰＣｆＮＭＤＡ246をコードするコード領域は、配列番号
４６により表される核酸配列を有するコード鎖と配列番号４８により表される核
酸配列を有する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＮＭＤＡ738により表される。
ＰＣｆＮＭＤＡ246のアミノ酸配列（配列番号４７とも表される）により、ＰＣ
ｆＮＭＤＡ246は、約２７ｋＤａの推定分子量と約５．６の推定ｐＩを有するこ
とが予想される。
【０３０７】 配列番号４４のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列との
比較により、配列番号４４は、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｎｉｄｕｌａｎｓの負に
作用する調節蛋白質（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ａｃｔｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号３６７６０５６と最大
の相同性（すなわち、約３４％の同一性）を示したことが分かる。配列番号４６
とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番号４６は、Ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＮＭＤＡ核酸分子、ＧｅｎＢａ
ｎｋアクセッション番号Ｌ３７３７７と最大の相同性（すなわち、約４５％の同
一性）を示したことが分かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョン９
．０を使用し、デフォルトパラメータを使用して行った。
【０３０８】 実施例１２ 本実施例は、Ｃ．ｆｅｌｉｓ 化学感覚関連親油性リガンド結合蛋白質核酸分
子のクローニング及び配列決定について述べる。本実施例はまた、様々なノミ組
織における化学感覚関連親油性リガンド結合蛋白質ｍＲＮＡの発現について述べ
る。
【０３０９】 実施例２に記載のＨＮＣ ＥＳＴライブラリから１個のＴＡクローンを、標準
的な配列決定法を使用して配列決定した。このクローンは、化学感覚関連親油性
リガンド結合蛋白質（ＣＬＢＰ）遺伝子と有意な相同性を有することが分かった
。このクローンをＥｃｏＲＩで消化して、ノミＣＬＢＰ核酸分子ｎＣｆＣＬＢＰ 339 と呼ぶ約３３９ヌクレオチド長のインサートを切り出した。このインサート
を、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗ
ｏｒｔｈ，ＣＡから入手可能）を使用してゲル精製により単離した。約５０ｎｇ
の精製ｎＣｆＣＬＢＰ339を使用し、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キット（
Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）と製造業者のプロトコルを使用して、32Ｐα−
ｄＡＴＰ標識ＤＮＡプローブを構築した。
【０３１０】 32Ｐα−ｄＡＴＰ標識プローブを標準的なプラークリフトハイブリダイゼーシ
ョン手順に使用して、クローンを、実施例２に記載のＨＮＣλ−ＺＡＰアンサブ
トラクティッドｃＤＮＡライブラリから単離した。以下のハイブリッド形成条件
を使用した。フィルターを、緩衝液（５×ＳＳＰＥ、１％サルコシル、０．１ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＬＯＴＴＯ）１００ｍｌに溶解した約５×１０7カウント毎分（ｃ
ｐｍ）／ｍｌのプローブと４５℃で約１４時間ハイブリッド形成させた。フィル
ターを、０．５×ＳＳＰＥ及び０．１％サルコシル５００ｍｌで１回の洗浄あた
り２０分、５５℃で２回洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。プローブと
強くハイブリッド形成した２つのプラークを単離し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｅ
ｘ−ＡｓｓｉｓｔTMヘルパーファージシステムとプロトコルを使用してインビボ
エキシジョンに供した。ミニプレップＤＮＡを、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐミニ
プレップキット（ＢｉｏＲａｄ，カリフォルニア州ヘラクレス所在から入手可能
）を使用して各ポジティブクローンから調製し、標準的な配列決定手順を使用し
て配列決定した。配列決定により、２つのポジティブクローンは互いに９７％の
アミノ酸同一性を有することが明らかになった。最初のクローンは、約６３３ヌ
クレオチドの核酸分子（本明細書中でｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ633と呼び、本明細書
中で配列番号１５３と示すヌクレオチド配列を有する）を含んでいた。配列番号
１５３の相補的配列を、本明細書中で配列番号１５５と表す。２番目のクローン
は、約６３１ヌクレオチドの核酸分子（本明細書中でｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ631と
呼び、本明細書中で配列番号１６２と示すヌクレオチド配列を有する）を含んで
いた。配列番号１６２の相補的配列を、本明細書中で配列番号１６４と表す。ｎ
ＣｆＣＬＢＰ340の配列決定により、ｎＣｆＣＬＢＰ399は、配列番号１５３のヌ
クレオチド１から３３９と１００％の同一性を有し、配列番号１６２のヌクレオ
チド２から３３９と１００％の同一性を有することが分かった。
【０３１１】 配列番号１５３の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ633は、配列番号
１５４により表されるアミノ酸配列を有する、１４７アミノ酸の完全長ＣＬＢＰ
蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＣＬＢＰ１Ａ147と呼ぶ）をコードすることが示
唆される。開始コドンが、配列番号１５３のヌクレオチド６７からヌクレオチド
６９に及び、終結コドンが、配列番号１５３のヌクレオチド５１１からヌクレオ
チド５１３に及ぶと仮定する。ＰＣｆＣＬＢＰ１Ａ147をコードするコード領域
は、配列番号１５６により表される核酸配列を有するコード鎖と配列番号１５８
により表される核酸配列を有する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ 441 により表される。ＰＣｆＣＬＢＰ１Ａ147のアミノ酸配列（配列番号１５７と
も表される）により、ＰＣｆＣＬＢＰ１Ａ147は、約１５ｋＤａの推定分子量と
約５の推定ｐＩを有することが予想される。
【０３１２】 配列番号１５４の分析により、約アミノ酸１から約アミノ酸１９に及ぶアミノ
酸ストレッチによりコードされるシグナルペプチドの存在が示唆される。提案さ
れた成熟蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＣＬＢＰ１Ａ128と示す）は、配列番号
１６０として本明細書中で示される約１２８のアミノ酸を含む。ＰＣｆＣＬＢＰ
１Ａ128は、配列番号１５９の核酸配列を有するコード鎖と配列番号１６１を有
する相補鎖を有する核酸分子（ｎＣｆＣＬＢＰ１Ａ384と呼ぶ）によりコードさ
れる。
【０３１３】 配列番号１６２の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ631は、配列番号
１６３により表されるアミノ酸配列を有する、１４７アミノ酸の完全長ＣＬＢＰ
蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＣＬＢＰ２Ａ147と呼ぶ）をコードすることが示
唆される。開始コドンが、配列番号１６２のヌクレオチド６５からヌクレオチド
６７に及び、終結コドンが、配列番号１６２のヌクレオチド５０９からヌクレオ
チド５１１に及ぶと仮定する。ＰＣｆＣＬＢＰ２Ａ147をコードするコード領域
は、配列番号１６５により表される核酸配列を有するコード鎖と配列番号１６７
により表される核酸配列を有する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ 441 により表される。ＰＣｆＣＬＢＰ２Ａ147のアミノ酸配列により、ＰＣｆＣＬ
ＢＰ２Ａ147は、約１５ｋＤａの推定分子量と約５の推定ｐＩを有することが予
想される。
【０３１４】 配列番号１６３の分析により、約アミノ酸１から約アミノ酸１９に及ぶアミノ
酸ストレッチによりコードされるシグナルペプチドの存在が示唆される。提案さ
れた成熟蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＣＬＢＰ２Ａ128と示す）は、配列番号
１６９として本明細書中で表される約１２８のアミノ酸を含む。ＰＣｆＣＬＢＰ
２Ａ128は、配列番号１６８の核酸配列を有するコード鎖と配列番号１７０を有
する相補鎖を有する核酸分子（ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ384と呼ぶ）によりコードさ
れる。
【０３１５】 配列番号１５４のアミノ酸配列及び配列番号１６３とＧｅｎＢａｎｋに報告さ
れたアミノ酸配列との比較により、それぞれの配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ
ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒフェロモン結合蛋白質関連蛋白質２（ｐｈｅｒｏｍｏ
ｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２
）（ＰＢＰＲＰ−２）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号１７０９５９５と最
大の相同性（すなわち、約２９％の同一性）を示したことが分かる。同一性パー
セントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を使用し、デフォルトパラメータを使
用して行った。核酸配列配列番号１５６及び配列番号１６５とＧｅｎＢａｎｋに
報告された核酸配列とのＢｌａｓｔ比較により、それぞれの配列は、ヒトＸｐ２
２ ＰＡＣ ＰＲＣＩ１−５Ｇ１１核酸分子、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番
号ＡＣ００２３６９と最大の相同性を示したことが分かる。ＧｅｎＢａｎｋのヒ
トクローンが大きすぎてＧＣＧバージョン９．０にロードすることができないの
で、ペアワイズ同一性（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を行うことがで
きなかった。デフォルトパラメータを使用して行われたＢｌａｓｔ比較により、
０．８７の有意でない同一性レベルが示された。さらなる配列解析にから、Ｃ．
ｆｅｌｉｓ ＣＬＢＰには６つのシステインが存在することが明らかになった。
これらのシステインは、ＰＢＰ／ＧＯＢＰファミリーにおけるニューロン／感覚
関連分子（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＰＢＰＲＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋア
クセッション番号１７０９５９５）及びＰＢＰＲＰ−５（ＧｅｎＢａｎｋアクセ
ッション番号Ｐ５４１９５）蛋白質ならびにＰｈｏｒｍｉａ ｒｅｇｉｎａ化学
感覚関連親油性リガンド結合蛋白質（ＣＳＲＬＬＢＰ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセ
ッション番号Ｓ６５４５８）を含む）の６つのシステインとの配列アラインメン
トにおいて保存されている。
【０３１６】 ＣＬＢＰ ｍＲＮＡがＨＮＣ組織のみで発現するかどうか確かめるために、ノ
ーザンブロット分析を行った。ＨＮＣ組織を切り出し、総ＲＮＡを単離し、実施
例１０に記載のように電気泳動により分離した。
【０３１７】 電気泳動の後、ＲＮＡを、実施例１０に記載のようにブロットし、α−32Ｐ−
ＡＴＰで標識したクローンｎＣｆＣＬＢＰ340を含むプローブを、約１×１０6ｃ
ｐｍ／ｍｌの濃度で緩衝液に添加し、約１４〜１８時間ハイブリッド形成させた
。次いで、ブロットを実施例１０に記載のように洗浄し、オートラジオグラフィ
ー用フィルムに暴露した。現像されたフィルムの分析から、非ＨＮＣ組織と比較
して、ＨＮＣ組織でのＣＬＢＰ ｍＲＮＡ発現は大きいことが分かった。このこ
とから、ＣＬＢＰは、ノミ頭部及び神経索においてアップレギュレートされてい
る可能性があることが分かる。
【０３１８】 ヌクレオチド配列５’ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＣＡ ＡＡＡ ＴＡＴ Ａ
ＣＣ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｇ３’（下線で示すＢａｍＨＩ部位を有し、本
明細書中では配列番号１９５２と示す）を有するセンスプライマー２Ａ１Ｂａｍ
Ｓｅｎと、ヌクレオチド配列５’ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＡＴ ＡＴＴ Ｇ
ＧＴ ＡＴＣ ＧＣＧ ＴＣＣ ＡＴＴ３’（下線で示すＥｃｏＲＩ部位を有し
、本明細書中では配列番号１９５３と示す）を有するアンチセンスプライマー２
Ａ１ａｎｔｉＲ１を使用して、ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ631（すなわち、配列番号１
６２）のコード領域を、鋳型として前述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMクローンか
らＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応を、以下のサーモサイクリング条件：（ａ）９
５℃１分で１サイクル、（ｂ）９４℃１０秒、４９℃２５秒、６９℃１分で５サ
イクル、（ｃ）９４℃１０秒、５３℃２０秒、６９℃７５秒で２３サイクルを使
用して、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマー、５Ｕ／μｌ Ｋｌｅｎ
Ｔａｑ Ａｄｖａｎｔａｇｅポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）０
．５μｌ、１μｇ／μｌの鋳型１μｌ、及び１×ＫｌｅｎＴａｑ緩衝液を含む反
応物（以下、「標準的なＰＣＲ反応条件」と呼ぶ）で行った。ＰＣＲ産物をＢａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化されているベ
クターｐＴｒｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）に連結した。結
果として生じる組換え分子（本明細書中ではｐＴｒｃ−ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ441
と呼ぶ）でＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．，ウィスコン
シン州マディソン所在から入手可能）を形質転換して、組換え細胞Ｅ．ｃｏｌｉ
：ｐＴｒｃ−ｎＣｆＣＬＢＰ２Ａ441を得た。
【０３１９】 組換え細胞を標準的な条件下で増殖させ、次いで、組換え蛋白質の発現を誘導
するために０．５μＭイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在
下でインキュベートした。発現を、クマシーブルー染色したＴｒｉｓ−グリシン
ゲルを使用して、及びＴ７タグ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能）を使用した
ウエスタンブロットにより確認した。Ｔ７タグ抗体により、約１８ｋＤａの蛋白
質が発現したことが示された。蛋白質産物を、以下のように精製した。組換え細
胞を遠心分離により収集し、上清を捨て、ペレットを再懸濁し、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌと１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）（全部で６０ｍｌ）中でホモジナイズした。次いで、
試料をマイクロフルイダイザーに５回通し、４℃で２０分間揺すり、２０，００
０×Ｇで３０分間遠心分離した。上清を収集し、０．４５μｍフィルターに通し
て濾過し、次いで、５０ｍＭ ＮａＣｌと１０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に溶解して、ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）に流し、漸増イミダゾー
ル勾配により溶出した。組換え蛋白質を、約１５０ｍＭイミダゾールで溶出した
。組換え蛋白質を含む画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０（
Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮し、ＰＢＳに溶解してダイアフィルトレーション
を行った。蛋白質を、既知の標準と比較してデンシトメトリーにより定量した。
【０３２０】 実施例１３ 本実施例は、実施例１に記載のＥＳＴ配列決定により単離されたナトリウム／
水素輸送体様ｃＤＮＡのさらなる特徴付け及び発現について述べる。 クローン２２３１−９４と呼ぶｃＤＮＡを、実施例１に記載のアンサブトラク
ティッドＨＭＴライブラリから単離した。クローン２２３１−９４の分析により
、このｃＤＮＡ（ｎＣｆＮＡＨ2080と示す）は約２０８０ヌクレオチド長であり
、核酸配列配列番号１８６７を有するコード鎖と配列番号１８６９を有する相補
鎖を有することが分かった。配列番号１８６７の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＮ
ＡＨ2080は、配列番号１８６８により表されるアミノ酸配列を有する、６０８ア
ミノ酸の完全長ナトリウム／水素輸送体様蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＮＡＨ 608 と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開始コドンが、配列番号１８６７
のヌクレオチド４５からヌクレオチド４７に及び、終結コドンが、配列番号１８
６７のヌクレオチド１８６９からヌクレオチド１８７１に及ぶと仮定する。ＰＣ
ｆＮＡＨ608をコードするコード領域は、配列番号１８７０により表される核酸
配列を有するコード鎖と配列番号１８７１により表される核酸配列を有する相補
鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＮＡＨ1824により表される。配列番号１８６８のア
ミノ酸配列により、ＰＣｆＮＡＨ608は、約６７．９ｋＤａの推定分子量と約６
．４７の推定等電点（ｐＩ）を有することが予想される。
【０３２１】 配列番号１８６８のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列
との比較により、配列番号１８６８は、ナトリウム水素交換輸送体ＮＨＥ１（ア
クセッション番号ＡＡＤ３２６８９．１）と最大の相同性（すなわち、約６７．
７％の同一性）を示したことが分かる。配列番号１８６７とＧｅｎＢａｎｋに報
告された核酸配列との比較により、配列番号１８６７は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ
ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒナトリウム水素交換輸送体ＮＨＥ１（アクセッショ
ン番号ＡＦ１４２６７６）と最大の相同性（すなわち、約５９．５％の同一性）
を示したことが分かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を
使用し、デフォルトパラメータを使用して行った。
【０３２２】 完全長推定ＮＡＨ蛋白質を発現させるために、以下のように、全コード領域を
ＰＣＲで増幅し、次いで、ＩｎｓｅｃｔＳｌｅｃｔTM発現ベクターｐＩＢ／Ｖ５
−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）に連結した。配列番号１８６７
を鋳型として使用するＰＣＲ反応に、配列番号１８６７のヌクレオチド４２〜７
４に対応し、配列５’ＧＡＣ ＴＡＧ ＴＡＡ ＡＡＴ ＧＧＧ ＣＧＴ ＴＡ
Ａ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＴＴＴ ＡＴＡ ＣＴＧ３’（配列番号１９３９
と示し、下線で示すＳｐｅＩ部位を有する）を有するフォワードプライマーＮＡ
Ｈ−ＩＳ−ＦＥと、配列番号１８６７のヌクレオチド１８４５〜１８６７に相補
的であり、配列５’ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＡ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＴＡ
ＣＴＡ ＡＣＧ ＴＣＡ ＴＣ３’ （配列番号１９４０と示し、下線で示す
ＸｈｏＩ制限部位を有する）を有するリバースプライマーＮＡＨ−ＩＳ−ＲＥを
使用した。標準的なＰＣＲ条件と、以下のサーモサイクリング条件：（１）９４
℃３０秒、（２）９４℃１０秒、５５℃１０秒、７２℃３分の２５サイクルを使
用した。この反応の産物を１．５％アガロースゲルで分離し、約１８２５ヌクレ
オチド分子に対応するバンドをゲルから切り出し、前述のようにＱＩＡｑｕｉｃ
ｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。次いで、ＰＣ
Ｒ産物を、ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで、３７℃で１８時間
消化した。消化産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒ
ｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使用して精製し、ベクタ
ーｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ（これもＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで消化され、エビアルカ
リホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．から入
手可能）で３７℃で３０分間処理されている）に連結した。標準的な形質転換手
順の後に、プラスミドｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＮＡＨを含む細菌クローンを単離
した。このクローンのＤＮＡ配列解析により、配列番号１８６７のヌクレオチド
４２〜１８６７（本明細書中ではｎＣｆＮＡＨ1826と呼ぶ）は、ベクターにより
コードされるＣ末端Ｖ５エピトープと共に、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ発現ベクター
に首尾よくインフレームで連結されていることが確認された。
【０３２３】 ＮＡＨ ｍＲＮＡが、ノミ生活環のある特定の生活段階だけで発現するのかど
うか、ＮＡＨ ｍＲＮＡが、ＨＭＴ組織だけで発現するのかどうかを確かめるた
めに、ノーザンブロット分析を実施例４に記載のように行った。総ＲＮＡを、卵
、一齢幼虫、三齢幼虫、移行期幼虫、蛹、餌を与えていない成虫、及びネコ血液
を０．２５時間、２時間、８時間、２４時間与えた成虫から抽出した。さらに、
総ＲＮＡを、ネコ血液を２４時間与えたノミ成虫から取り出した後腸及びマルピ
ーギ管から、ならびに後腸及びマルピーギ管を取り出した後に残っている体部分
から抽出した。各ＲＮＡ試料をゲル電気泳動により分離し、ナイロンメンブレン
に転写し、実施例４に記載のノザンブロッティング条件下でα−32Ｐ−ＡＴＰ標
識ｎＣｆＮＡＨ1826とハイブリッド形成させた。現像されたフィルムの分析から
、ＮＡＨ ｍＲＮＡは、０．２５、２、及び８時間、成虫に餌が与えられた時点
でのみ発現することが明らかになった。
【０３２４】 実施例１４ 本実施例は、実施例１に記載のＥＳＴ配列決定により単離された塩素細胞内チ
ャネル（Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｈａｎｎｅｌ）様
ｃＤＮＡのさらなる特徴付けについて述べる。
【０３２５】 クローン２２３３−２４と呼ぶｃＤＮＡを、実施例１に記載のアンサブトラク
ティッドＨＭＴライブラリから単離した。クローン２２３３−２４の分析により
、このｃＤＮＡ（ｎＣｆＣＬＩＣ2283と示す）は約２２８３ヌクレオチド長であ
り、核酸配列配列番号１８７２を有するコード鎖と配列番号１８７４を有する相
補鎖を有することが分かった。配列番号１８７２の翻訳により、核酸分子ｎＣｆ
ＣＬＩＣ2283は、配列番号１８７３により表されるアミノ酸配列を有する、２６
２アミノ酸の完全長塩素細胞内チャネル様蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＣＬＩ
Ｃ262と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開始コドンが、配列番号１８７
２のヌクレオチド６０からヌクレオチド６２に及び、終結コドンが、配列番号１
８７２のヌクレオチド８４６からヌクレオチド８４８に及ぶと仮定する。ＰＣｆ
ＣＬＩＣ262をコードするコード領域は、配列番号１８７５により表される核酸
配列を有するコード鎖と配列番号１８７６により表される核酸配列を有する相補
鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＣＬＩＣ786により表される。配列番号１８７３の
アミノ酸配列により、ＰＣｆＣＬＩＣ262は、約３０．２ｋＤａの推定分子量と
約６．０２の推定等電点（ｐＩ）を有することが予想される。
【０３２６】 配列番号１８７３のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列
との比較により、配列番号１８７３は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ塩素細胞内チ
ャネル２（アクセッション番号ＮＰ００１２８０．１）と最大の相同性（すなわ
ち、約３７．８％の同一性）を示したことが分かる。配列番号１８７２とＧｅｎ
Ｂａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番号１８７２は、Ｈｏｍｏ
ｓａｐｉｅｎｓ塩素細胞内チャネル２（アクセッション番号ＮＭ００１２８９
）と最大の相同性（すなわち、約３７．５％の同一性）を示したことが分かる。
同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を使用し、デフォルトパラ
メータを使用して行った。
【０３２７】 実施例１５ 本実施例は、実施例１に記載のＥＳＴ配列決定により単離されたペリトロフィ
ン様ｃＤＮＡ（本明細書中ではＰＬ２と呼ぶ）のさらなる特徴付けについて述べ
る。
【０３２８】 クローン２２３２−２３と呼ぶｃＤＮＡ（本明細書中では配列番号１８７７と
示す）を、実施例１に記載のアンサブトラクティッドＨＭＴライブラリから単離
した。クローン２２３２−２３の分析により、このｃＤＮＡ（ｎＣｆＰＬ２457
と示す）は約４５７ヌクレオチド長であることが分かった。ｎＣｆＰＬ２457コ
ード鎖の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＰＬ２457は、１１３アミノ酸の部分長ペ
リトロフィン様蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＰＬ２113と呼ぶ）をコードする
ことが示唆される。終結コドンが、ｎＣｆＰＬ２457のヌクレオチド３４２〜３
４４にあると仮定する。
【０３２９】 実施例３に記載のように調製したＲＡＣＥ ｃＤＮＡプールを鋳型として使用
して行ったＰＣＲにより、ｎＣｆＰＬ２457の５’末端に対応するさらなるコー
ド配列を単離した。ｎＣｆＰＬ２457 ｃＤＮＡのヌクレオチド１６７〜１８７
に相補的であり、核酸配列５’ＧＴＣ ＴＧＧ ＡＡＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＡＡ
Ｇ ＡＧＧ３’（本明細書中では配列番号１９４１と示す）を有するリバースプ
ライマーＰＬ２−Ｒ２と、前述したフォワードＡｄａｐｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ１
（配列番号１９３３）を使用し、以下のサーモサイクリング条件：（１）９４℃
３０秒、（２）９４℃１０秒及び７２℃４分の５サイクル、（３）９４℃１０秒
及び７０℃４分の５サイクル、（４）９４℃１０秒、次いで６８℃４分の２５サ
イクルで、１回目のＰＣＲ反応を行った。この反応の産物を１：５０に希釈し、
以下のように２回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。１回目のＰＣＲ反応に
ついて述べたサーモサイクリング条件を使用して、フォワードアダプタープライ
マー２（配列番号１９３５）を、ｎＣｆＰＬ２457 ｃＤＮＡのヌクレオチド２
９〜５２に相補的であり、核酸配列５’ＧＴＡ ＡＴＡ ＴＧＣ ＧＴＧ ＡＣ
Ａ ＡＴＣ ＧＴＧ ＴＧＧ３’ （本明細書中では配列番号１９４２と示す）
を有するリバースプライマーＰＬ２−Ｒ２と使用した。結果として生じる産物を
前述にようにゲル精製して、これにより約９００ｂｐ長の核酸分子に対応する明
瞭なバンドが見えるようになった。次いで、フラグメントをｐＣＲ ＩＩ ＴＡ
クローニングベクター（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）に連結し、ＡＢＩ ＰＲＩ
ＳＭ３７７自動ＤＮＡシーケンサーを使用して配列決定した。配列解析により、
フラグメントのヌクレオチド７９１〜８３５はｎＣｆＰＬ２457ｃＤＮＡのヌク
レオチド１〜４５と１００％の同一性を有することが明らかになった。この２つ
の配列をアラインメントして、約１２９１ヌクレオチドの連続配列（ｎＣｆＰＬ
２1291と呼び、配列番号１８７８の核酸配列を有するコード鎖と配列番号１８７
９を有する相補鎖を有する）を得た。配列番号１８７８の翻訳から、核酸分子ｎ
ＣｆＰＬ２1291は、３９１アミノ酸の非完全長ペリトロフィン様蛋白質をコード
することが示唆される。
【０３３０】 配列番号１８７８の５’末端に対応するさらなる配列を単離するために、ＲＡ
ＣＥ ｃＤＮＡプールを鋳型として使用して、ネスティッドＰＣＲ反応を行った
。１回目のＰＣＲでは、標準的なＰＣＲ反応条件と以下のサーモサイクリング条
件：（１）９４℃１分、（２）９４℃２０秒及び７０℃１分の５サイクル、（３
）９４℃２０秒及び６８℃１分の５サイクル、（４）９４℃２０秒及び６６℃１
分の１０サイクルで、フォワードアダプタープライマーＡＰ１とリバースプライ
マーＰＬ２−Ｒ１を使用した。この反応の産物を、水で１：５０に希釈し、２回
目のネスティッドＰＣＲの鋳型として使用した。２回目のＰＣＲ反応では、標準
的なＰＣＲ反応条件下で、以下のサーモサイクリング条件：（１）９４℃１分、
（２）９４℃２０秒及び７０℃１分の５サイクル、（３）９４℃２０秒及び６８
℃１分の５サイクル、（４）９４℃２０秒及び６６℃１分の４０サイクルを使用
して、フォワードアダプタープライマーＡＰ２と、配列番号１８７８のヌクレオ
チド７０〜９３に相補的であり、ヌクレオチド配列５’ＣＧＧ ＴＧＣ ＡＡＧ
ＴＴＡ ＴＡＧ ＡＡＣ ＣＴＴ ＣＣＧ３’ （本明細書中では配列番号１
９４３と示す）を有するリバースプライマーＰＬ２−Ｒ５を使用した。この反応
の産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、約２７９ヌクレオチド長のバン
ドをゲルから切り出し、前述のように精製した。次いで、フラグメント（ｎＣｆ
ＰＬ２279と呼び、配列番号１８８０と示すコード核酸配列と、配列番号１８８
１と示す相補配列を有する）をｐＣＲＯＩＩ ＴＡクローニングベクター（Ｑｉ
ａｇｅｎから入手可能）に連結し、前述のように配列決定した。配列解析により
、ｎＣｆＰＬ２279のヌクレオチド２２８〜２７９は、配列番号１８７８のヌク
レオチド４２〜９３と同一であるが、ｎＣｆＰＬ２279のヌクレオチド１８６〜
２２８は配列番号１８７８と有意な類似性を有さないことが明らかになった。こ
の相違は、ＲＮＡオルタナティブスプライシングの結果であるかもしれないし、
又はｃＤＮＡプールの人工産物であるかもしれない。この相違の理由を確かめる
ために、本明細書中に記載の技術を使用して、成虫の中腸、後腸、及びマルピー
ギ管と様々な齢の幼虫に由来するノミｃＤＮＡライブラリから、この領域に対応
するさらなるフラグメントをＰＣＲにより単離した。これらのライブラリから得
られたフラグメントの配列解析により、これらのフラグメントは、ｎＣｆＰＬ２ 279 の配列と同一であることが明らかになった。従って、ｎＣｆＰＬ２279と合致
しなかった配列番号１８７８の領域は人工産物であると考えられ、後のアライン
メントに使用しなかった。
【０３３１】 前述のＰＬ２配列をアラインメントして、配列番号１８８２の核酸配列を有す
るコード鎖と配列番号１８８４を有する相補鎖を有する、約１４７７ヌクレオチ
ド長の連続配列（ｎＣｆＰＬ２1477と呼ぶ）を得た。配列番号１８８２の翻訳に
より、核酸分子ｎＣｆＰＬ２1477は、配列番号１８８３により表されるアミノ酸
配列を有する４５３アミノ酸の完全長ペリトロフィン様蛋白質（本明細書中では
ＰＣｆＰＬ２453と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開始コドンが、配列
番号１８８２のヌクレオチド３からヌクレオチド５に及び、終結コドンが、配列
番号１８８２のヌクレオチド１３６２からヌクレオチド１３６４に及ぶと仮定す
る。ＰＣｆＰＬ２453をコードするコード領域は、配列番号１８８５により表さ
れる核酸配列を有するコード鎖と配列番号１８８６により表される核酸配列を有
する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＰＬ２1359により表される。配列番号１８
８３のアミノ酸配列により、ＰＣｆＰＬ２453は、約４９ｋＤａの推定分子量と
約４．７の推定等電点（ｐＩ）を有することが予想される。
【０３３２】 配列番号１８８３のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列
との比較により、配列番号１８８３は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇ
ａｓｔｅｒ遺伝子座ＡＥ００３４７４蛋白質（アクセッション番号ＡＡＦ４７６
２９）と最大の相同性（すなわち、約２８％の同一性）を示したことが分かる。
配列番号１８８２とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列
番号１８８２は、Ｐｅｎａｅｕｓ ｓｅｍｉｓｕｌｃａｔｕｓ（甲殻類）ペリト
ロフィン様蛋白質１ ｃＤＮＡ（アクセッション番号ＡＦ０９５５８０）と最大
の相同性（すなわち、約５０％の同一性）を示したことが分かる。同一性パーセ
ントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を使用し、デフォルトパラメータを使用
して行った。
【０３３３】 実施例１６ 本実施例は、実施例１に記載のＥＳＴ配列決定により単離されたペリトロフィ
ン様配列ｃＤＮＡ（本明細書中ではＰＬ３と呼ぶ）のさらなる特徴付け及び発現
について述べる。
【０３３４】 クローン２２４０−１７と呼ぶｃＤＮＡを、実施例１に記載のアンサブトラク
ティッドＨＭＴライブラリから単離した。クローン２２４０−１７の分析により
、このｃＤＮＡ（ｎＣｆＰＬ３406と示す）は約４０６ヌクレオチド長であり、
配列番号１８８７の核酸配列を有するコード鎖と、配列番号１８８９を有する相
補配列を有することが分かった。配列番号１８８７の翻訳により、核酸分子ｎＣ
ｆＰＬ３406は、配列番号１８８８により表されるアミノ酸配列を有する、８１
アミノ酸の完全長ペリトロフィン様蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＰＬ３81と呼
ぶ）をコードすることが示唆される。開始コドンが、配列番号１８８７のヌクレ
オチド２０からヌクレオチド２２に及び、終結コドンが、配列番号１８８７のヌ
クレオチド２６３からヌクレオチド２６５に及ぶと仮定する。ＰＣｆＰＬ３81を
コードするコード領域は、配列番号１８９０により表される核酸配列を有するコ
ード鎖と配列番号１８９１により表される核酸配列を有する相補鎖を有する、核
酸分子ｎＣｆＰＬ３243により表される。配列番号１８８８のアミノ酸配列によ
り、ＰＣｆＰＬ３81は、約９．１ｋＤａの推定分子量と約３．６４の推定等電点
（ｐＩ）を有することが予想される。
【０３３５】 配列番号１８８８のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列
との比較により、配列番号１８８８は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅペ
リトロフィン１蛋白質（アクセッション番号ＡＡＣ３９１２７）と最大の相同性
（すなわち、約３４．２％の同一性）を示したことが分かる。配列番号１８８７
とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番号１８８７は、
Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ塩素細胞内チャネル２（アクセッション番
号ＡＦ０３０４３１）と最大の相同性（すなわち、約３７％の同一性）を示した
ことが分かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を使用し、
デフォルトパラメータを使用して行った。
【０３３６】 完全長推定ＰＬ３蛋白質を発現させるために、以下のように、全コード領域を
ＰＣＲで増幅し、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）に連結した。標準的なＰＣＲ条件と以下のサーモ
サイクリング条件：（１）９４℃３０秒、（２）９４℃１０秒、５５℃１０秒、
７２℃３分の２５サイクルでの、配列番号１８８７を鋳型として使用するＰＣＲ
反応に、配列番号１８８７のヌクレオチド７０〜９３に対応し、配列５’ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣ Ｃ ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＡＣ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＴＧ
ＴＧ３’（配列番号１９４４と示し、下線で示すＢａｍＨＩ制限エンドヌクレ
アーゼ部位を有する）を有するフォワードプライマーＰＬ３ＦＥと、配列番号１
８８７のヌクレオチド２４５〜２６９に相補的であり、配列５’ＧＧＡ ＡＴＴ Ｃ ＴＧ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＴＧＧ ＴＡＡ ＣＡＴ ＴＣ３
’ （本明細書中では配列番号１９４５と示し、下線で示すＥｃｏＲＩ制限エン
ドヌクレアーゼ部位を有する）を有するリバースプライマーＰＬ３ＲＥを使用し
た。この反応産物を１．５％アガロースゲルで分離し、約２００ヌクレオチド分
子に対応するバンド（アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色により視覚
化された）をゲルから切り出し、前述のようにＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘ
ｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。
【０３３７】 ＰＣＲ反応産物を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）で、３７℃で１
８時間消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖ
ａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使用して精製し、ベクターｐＴｒ
ｃＨｉｓＢ（これも同様に消化され、エビアルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）で、３７℃で３０分間
処理されている）に連結し、精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ−２１コンピテント
細胞への標準的な形質転換手順の後に、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓＢ−ＰＬ３を
含む細菌クローンを単離した。このクローンのＤＮＡ配列解析により、配列番号
１８８７の７０〜２６９は、ベクターによりコードされるＮ末端Ｔ７タグエピト
ープと共に、ｐＴｒｃＨｉｓＢ発現ベクターに首尾よくインフレームで連結され
ていることが確認された。これによりコードされている組換え蛋白質は９７アミ
ノ酸長であり、１０．９ｋＤａの分子量（Ｔ７タグを含む）と４．０８のｐＩを
有すると予測される。
【０３３８】 組換えＰＬ３蛋白質を以下のように発現させた。Ｌｕｒｉａブロス５ｍｌに、
前述のように調製したｐＴｒｃＨｉｓＢ−ＰＬ３プラスミドで形質転換されてい
るＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ−２１コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，ウィスコンシ
ン州マディソン所在から入手可能）のグリセロールストックを接種し、１００μ
ｇ／ｍｌアンピシリン選択下で、３７℃で一晩増殖させた。次いで、この培養物
の１ｍｌアリコートを使用して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新鮮なＬ
ｕｒｉａブロス１０ｍｌに接種し、培養物を、おおよそ０．５のＯＤ値まで増殖
させた。培養物の１ｍｌアリコートを取り出し、細胞を遠心分離によりペレット
化し、上清を捨てた。細胞を、ＰＢＳ １００μｌと２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥロー
ディング緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グ
リセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー、及び１０％２−メルカプトエ
タノール）１００μｌからなる溶液に再懸濁した。前述の１ｍｌアリコートを取
り出した後、ＩＰＴＧを、５ｍＭ ＩＰＴＧの最終濃度になるように残りの９ｍ
ｌ培養物に添加し、培養物を、さらに６０分間３７℃でインキュベートし、１ｍ
ｌを取り出し、約０．６のＯＤが測定された。次いで、この１ｍｌ試料中の細胞
を遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳ １２０μｌとＳＤＳ−ＰＡＧＥローデ
ィング緩衝液１２０μｌからなる溶液に再懸濁した。等量のＩＰＴＧ誘導溶解物
と非誘導溶解物を、１４％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（
Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）にロードした。電気泳動
後、蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロースメンブレンに転写し、
ウエスタンブロット分析を、Ｔ７タグ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能）を使
用して行った。Ｔ７タグ抗体により、約１８ｋＤａの蛋白質がＩＰＴＧにより誘
導されたことが明らかになった。組換えＰＬ３蛋白質が、予想された分子量より
大きな分子量で移動したという事実は、他のペリトロフィン蛋白質について以前
に公表された結果と一致しており、ある程度、これらの蛋白質の特徴的に低いｐ
Ｉによるものだと考えられる（Ｔｅｌｌａｍら（１９９９）Ｐｅｒｉｔｒｏｐｈ
ｉｃ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２９：８７−１０１）。
この蛋白質の配列解析により、この蛋白質は、ベクターによりコードされるＮ末
端Ｔ７タグを含んでいたことが分かる。
【０３３９】 ４個のフラスコ（それぞれ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬｕｒｉａ
ブロス１リットルを含んでいる）に、前述のｐＴｒｃＨｉｓＢ−ＰＬ３で形質転
換されているＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ−２１細胞５ｍｌのスターターカルチャーを接
種した。光学密度が約０．５００に達するまで、培養物を３７℃で増殖させた。
光学密度が約０．５００に達したら、１ｍｌアリコートを誘導前試料として各フ
ラスコから取り出した。ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの最終濃度になるように各１リ
ットルフラスコに添加し、培養物を、３７℃で、さらに１３５分間増殖させた。
１３５分経ったら、１ｍｌアリコートを誘導後試料として各フラスコから取り出
した。これらの１ｍｌアリコートを遠心分離し、上清を捨て、０．５光学密度単
位が測定された試料当たり１００μｌの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝
液にペレットを再懸濁した。次いで、誘導前試料及び誘導後試料を、標準的なウ
エスタンブロット技術と前述のＴ７タグ抗体を使用して、組換えＰＬ３蛋白質発
現について試験した。約１８ｋＤａで移動した蛋白質は誘導後試料で検出された
が、誘導前試料では検出されなかった。
【０３４０】 残っている４リットルの培養物から細胞を遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレ
ットを混合し、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））１２０ｍｌに
再懸濁した。次いで、試料をマイクロフルイダイザーに５回通し、次いで、４℃
で２０分間揺すった。次いで、試料を３０分間遠心分離し、上清を収集した。上
清のウエスタンブロット分析により、組換えＰＬ３蛋白質は、最初の緩衝液Ａ抽
出において可溶性であったことが分かった。次いで、組換えＰＬ３蛋白質を含む
緩衝液Ａ上清を、当業者に周知の技術を使用して、ニッケルカラム、Ｑ２陰イオ
ン交換クロマトグラフィーカラム、及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより
さらに精製した。
【０３４１】 実施例１７ 本実施例は、実施例１に記載のＥＳＴ配列決定により単離されたペリトロフィ
ン様配列ｃＤＮＡ（本明細書中ではＰＬ４と呼ぶ）のさらなる特徴付けについて
述べる。
【０３４２】 クローン２２４４−７１と呼ぶｃＤＮＡを、実施例１に記載のアンサブトラク
ティッドＨＭＴライブラリから単離した。クローン２２４４−７１の分析により
、このｃＤＮＡ（ｎＣｆＰＬ４974と示す）は約９７４ヌクレオチド長であり、
配列番号１８９２の核酸配列を有するコード鎖と、配列番号１８９３を有する相
補配列を有することが分かった。配列番号１８９２の翻訳により、核酸分子ｎＣ
ｆＰＬ４974は、２８５アミノ酸の部分長ペリトロフィン様蛋白質をコードする
ことが示唆される。５’末端に対応するさらなる配列を、以下のように、実施例
３に記載のＲＡＣＥ ｃＤＮＡプールを鋳型として使用してＰＣＲにより単離し
た。標準的なＰＣＲ反応条件と以下のサーモサイクリング条件：（１）９４℃３
０秒、（２）９４℃１０秒、７２℃４分の５サイクル、（３）９４℃１０秒、７
０℃４分の５サイクル、（４）９４℃１０秒、次いで、６８℃４分の２５サイク
ルでのＰＣＲ反応に、フォワードプライマーとしてＡｄａｐｔｅｒ Ｐｒｉｍｅ
ｒ１（すなわち、配列番号１９３３）と、配列番号１８９２のヌクレオチド２２
９〜５５１に相補的であり、核酸配列５’ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＴＴ Ｇ
ＡＴ ＣＡＧ ＣＧＣ ＡＣ３’（本明細書中では配列番号１９４６と示す）を
有するリバースプライマーＰＬ４−Ｒ１を使用した。この反応の産物を１：５０
に希釈し、２回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。２回目のＰＣＲ反応では
、１回目のＰＣＲ反応について述べたサーモサイクリング条件を使用し、フォワ
ードプライマーとしてＡｄａｐｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ２（すなわち、配列番号１
９３５）と、配列番号１８９２のヌクレオチド５８〜７８に相補的であり、核酸
配列５’ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＣＧ ＧＧＣ３’（本明
細書中では配列番号１９４７と示す）を有するリバースプライマーＰＬ４−Ｒ２
を使用した。この反応の産物を前述のようにゲル精製し、フラグメントを、ｐＣ
Ｒ ＩＩ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇベクター（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）に連結
し、配列決定して、約１５０ヌクレオチド長のフラグメントを明らかにした。配
列解析により、このフラグメントのヌクレオチド６８〜１４６は、ｎＣｆＰＬ４ 974 のヌクレオチド１〜７９と１００％の同一性を有することが明らかになった
。この２つの配列をアラインメントして、約１０４３ヌクレオチド長の連続配列
（本明細書中ではｎＣｆＰＬ４1043と呼び、配列番号１８９４を有するコード鎖
と、配列番号１８９５を有する相補鎖を有する）を得た。しかしながら、この連
続配列は、推定蛋白質配列の開始メチオニンをコードしているようには見えない
。従って、以下のように、もう一度、５’末端にある残りのコード配列を単離し
ようと試みた。１回目のＰＣＲ反応を、前述のサーモサイクリング条件下で、Ｒ
ＡＣＥ ｃＤＮＡプールを鋳型として使用し、フォワードプライマーとしてＡｄ
ａｐｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ１とリバースプライマーとしてＰＬ４−Ｒ２を使用し
て行った。この反応の産物を１：５０に希釈し、２回目のＰＣＲ反応の鋳型とし
て使用した。２回目のＰＣＲ反応では、１回目のＰＣＲ反応について述べたサー
モサイクリング条件下で、フォワードプライマーとしてＡｄａｐｔｅｒ Ｐｒｉ
ｍｅｒ２と、配列番号１８９４のヌクレオチド５８〜８０に相補的であり、核酸
配列５’ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＣＡ ＴＴＡ ＡＡＣ ＴＣＡ ＣＣＡ ＴＣ３’
（配列番号１９４８と示す）を有するリバースプライマーＰＬ４−Ｒ４を使用
した。この反応の産物を前述のようにゲル精製し、フラグメントを、ｐＣＲ Ｉ
Ｉ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇベクター（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）に連結し、配
列決定して、約１００ヌクレオチド長のフラグメントを明らかにした。配列解析
により、このフラグメントのヌクレオチド２１〜１０１は、配列番号１８９２の
ヌクレオチド１〜８１と１００％の同一性を有することが明らかになった。この
２つの配列をアラインメントして、１０６２ヌクレオチド長の連続配列（本明細
書中ではｎＣｆＰＬ４1062と呼び、配列番号１８９６を有するコード鎖と、配列
番号１８９８を有する相補鎖を有する）を得た。配列番号１８９６の翻訳により
、核酸分子ｎＣｆＰＬ４1062は、配列番号１８９７により表されるアミノ酸配列
を有する２８５アミノ酸の完全長ペリトロフィン様蛋白質（本明細書中ではＰＣ
ｆＰＬ４285と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開始コドンが、配列番号
１８９６のヌクレオチド１９からヌクレオチド２１に及び、終結コドンが、配列
番号１８９６のヌクレオチド８７４からヌクレオチド８７６に及ぶと仮定する。
ＰＣｆＰＬ４285をコードするコード領域は、配列番号１８９９により表される
核酸配列を有するコード鎖と配列番号１９００により表される核酸配列を有する
相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＰＬ４855により表される。配列番号１８９７
のアミノ酸配列により、ＰＣｆＰＬ４285は、約３１．４ｋＤａの推定分子量と
約６．９９の推定等電点（ｐＩ）を有することが予想される。
【０３４３】 配列番号１８９７のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列
との比較により、配列番号１８９７は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇ
ａｓｔｅｒ Ｇａｓｐ前駆体（アクセッション番号ＡＡＤ０９７４８）と最大の
相同性（すなわち、約３１．５％の同一性）を示したことが分かる。配列番号１
８９６とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番号１８９
６は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｇａｓｐ前駆体（ア
クセッション番号ＡＦ０７０７３４）と最大の相同性（すなわち、約３９．４％
の同一性）を示したことが分かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョ
ン９．０を使用し、デフォルトパラメータを使用して行った。
【０３４４】 ＰＬ４ ｍＲＮＡが、ノミ生活環のある特定の段階だけで発現するのかどうか
、ＰＬ４ ｍＲＮＡが、ＨＭＴ組織だけで発現するのかどうかを確かめるために
、ノーザンブロット分析を実施例４に記載のように行った。総ＲＮＡを、卵、一
齢幼虫、三齢幼虫、移行期幼虫、蛹、餌を与えていない成虫、及びネコ血液を０
．２５時間、２時間、８時間、２４時間与えた成虫から抽出した。さらに、総Ｒ
ＮＡを、ネコ血液を２４時間与えたノミ成虫から取り出した後腸及びマルピーギ
管から、ならびに後腸及びマルピーギ管を取り出した後に残っている体部分から
抽出した。各ＲＮＡ試料をゲル電気泳動により分離し、ナイロンメンブレンに転
写し、実施例４に記載のノザンブロッティング条件下でα−32Ｐ−ＡＴＰ標識ｎ
ＣｆＰＬ４974とハイブリッド形成させた。
【０３４５】 ノーザンブロットアッセイの結果は複雑である。ストリンジェントな条件を使
用したが、異なる発現バターン有するいくつかのバンドが見られた。約１６００
ｂｐのメッセージが、卵、一齢幼虫、三齢幼虫、及び移行期幼虫の段階でのみ検
出された。約１５００ｂｐのメッセージが、全ての生活段階と成虫に餌が与えら
れた時点で検出されたが、最も強いシグナルが、卵、一齢幼虫、及び餌を与えて
いない成虫の段階で検出された。約１２００ｂｐに移動した第３のメッセージが
、卵、一齢幼虫、蛹、及び成虫の生活段階（全ての餌を与えていない成虫と成虫
に餌が与えられた時点を含む）で検出された。検出された３種類全てのメッセー
ジがＨＭＴ組織のみで見られ、屠体組織では検出されなかった。
【０３４６】 １種類ではなく３種類のｍＲＮＡの検出は、３種類の非常に相同な転写物が発
現された結果かもしれない。非常に関連する多数の遺伝子からなるペリトロフィ
ン遺伝子ファミリーが発見されたことが文献に報告されている（Ｓｃｈｏｒｄｅ
ｒｅｔら，１９８８，ｃＤＮＡ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉ
ｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ａ ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｃ ｍｅｍｂｒａｎ
ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，‘ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ−４８’，ｆｒｏｍ
ｔｈｅ ｌａｒｖａｅ ｏｆ Ｌｕｃｉｌｉａ ｃｕｐｒｉｎａ，Ｉｎｓｅｃ
ｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
２８，９９−１１１を参照のこと）。これらの転写物は、このようなファミリ
ーの産物であるか、又はこれらのメッセージは、単一遺伝子座のオルタナティブ
スプライシングのＲＮＡ産物である可能性がある。
【０３４７】 実施例１８ 本実施例は、実施例１に記載のＥＳＴ配列決定により単離されたシナプス小胞
２Ｂ様配列ｃＤＮＡのさらなる特徴付けについて述べる。 クローン２１０４−５９と呼ぶｃＤＮＡ（本明細書中では配列番号３５８と示
す）を、実施例１に記載のアンサブトラクティッドＨＭＴライブラリから単離し
た。クローン２１０４−５９からのＤＮＡを精製し、インサートを、以下のよう
にアンサブトラクティッドＨＭＴ ｃＤＮＡライブラリのプラークハイブリダイ
ゼーションスクリーニングに使用した。クローン２１０４−５９からインサート
をＥｃｏＲＩでの消化により切り出し、アガロースゲル電気泳動により分離し、
ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから
入手可能）を使用して精製した。Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キット（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を使用して、ランダムプライ
ム法により作成されるプローブ混合物にα−32Ｐ−ｄＡＴＰを組み込んだ。ハイ
ブリダイゼーション及びプラーク精製を前述にように行って、配列番号１９０１
の核酸配列を有するコード鎖と配列番号１９０３を有する相補鎖を有する、約１
８７５ヌクレオチドのシナプス小胞２Ｂ様配列（本明細書中ではｎＣｆＳＶＰ18 75 と呼ぶ）を含むクローンを単離した。配列番号１９０１の翻訳により、核酸分
子ｎＣｆＳＶＰ1875は、配列番号１９０２により表されるアミノ酸配列を有する
、５３０アミノ酸の完全長シナプス小胞２Ｂ様蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＳ
ＶＰ530と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開始コドンが、配列番号１９
０１のヌクレオチド４４からヌクレオチド４６に及び、終結コドンが、配列番号
１９０１のヌクレオチド１６３４からヌクレオチド１６３６に及ぶと仮定する。
ＰＣｆＳＶＰ530をコードするコード領域は、配列番号１９０４により表される
核酸配列を有するコード鎖と配列番号１９０５により表される核酸配列を有する
相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＳＶＰ1590により表される。配列番号１９０２
のアミノ酸配列により、ＰＣｆＳＶＰ530は、約５８．７ｋＤａの推定分子量と
約７．６１の推定ｐＩを有することが予想される。
【０３４８】 配列番号１９０２のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列
との比較により、配列番号１９０２は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇ
ａｓｔｅｒ ＢＡＣＲ７Ａ４．ｙ（アクセッション番号ＣＡＢ５１６８５）と最
大の相同性（すなわち、約３２％の同一性）を示したことが分かる。配列番号１
９０１とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比較により、配列番号１９０
１は、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓシナプス小胞蛋白質２Ｂ（ＳＶＰ２
Ｂ）ｍＲＮＡ（アクセッション番号Ｌ１０３６２）と最大の相同性（すなわち、
約３９％の同一性）を示したことが分かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧ
バージョン９．０を使用し、デフォルトパラメータを使用して行った。
【０３４９】 実施例１９ 本実施例は、実施例１に記載のＥＳＴ配列決定により単離された電圧ゲート塩
化物チャネル様配列ｃＤＮＡのさらなる特徴付けについて述べる。 クローン２１０８−０９と呼ぶｃＤＮＡを、実施例１に記載のアンサブトラク
ティッドＨＭＴライブラリから単離した。クローン２１０８−０９の分析により
、このｃＤＮＡ（ｎＣｆＶＧＣＣ381と呼ぶ）は、約３８１ヌクレオチド長であ
り、配列番号１９０６の核酸配列を有するコード鎖と配列番号１９０７を有する
相補鎖を有することが分かった。配列番号１９０６の翻訳により、核酸分子ｎＣ
ｆＶＧＣＣ381は、１２６アミノ酸の部分長電圧ゲート塩化物チャネル様蛋白質
をコードすることが示唆される。５’末端に対応するさらなる配列を、以下のよ
うにハイブリダイゼーションとＰＣＲにより単離した。
【０３５０】 クローン２１０８−０９からインサートをＥｃｏＲＩでの消化により切り出し
、アガロースゲル電気泳動により分離し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒ
ａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使用して精製した。Ｍｅｇ
ａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａから
入手可能）を使用して、ランダムプライム法により作成されるプローブ混合物に
、α−32Ｐ−ｄＡＴＰを組み込んだ。ハイブリダイゼーション及びプラーク精製
を、前述にようにアンサブトラクティッドＨＭＴ ｃＤＮＡライブラリに対して
行って、配列番号１９０８の核酸配列を有するコード鎖と配列番号１９０９を有
する相補鎖を有する、約２１９１ヌクレオチドのＶＧＣＣ様配列（本明細書中で
はｎＣｆＶＧＣＣ2191と呼ぶ）を含むクローンを単離した。配列番号１９０８の
翻訳により、核酸分子ｎＣｆＶＧＣＣ2191は、５９５アミノ酸の部分ＶＧＣＣ様
蛋白質をコードすることが示唆される。
【０３５１】 ５’末端にある残りのコード領域を単離するために、以下のように、ＰＣＲを
、実施例３に記載のように調製したＲＡＣＥ ｃＤＮＡプールを鋳型として使用
して行った。標準的なＰＣＲ反応条件と以下のサーモサイクリング条件：（１）
９４℃３０秒、（２）９４℃１０秒、７２℃４分の５サイクル、（３）９４℃１
０秒、７０℃４分の５サイクル、（４）９４℃１０秒、６８℃４分の２５サイク
ルで、フォワードプライマーとしてＡｄａｐｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ１と、配列番
号１９０８のヌクレオチド１４８２〜１５０３に相補的であり、核酸配列５’Ｃ
ＧＡ ＴＣＡ ＴＧＣ ＧＴＣ ＴＡＧ ＣＡＴ ＴＧＧ Ｃ３’（本明細書中
では配列番号１９４９と示す）を有するリバースプライマーＶＧＣＣ−Ｒ１を使
用した。反応産物をアガロースゲルで分離し、約１９７０ヌクレオチド分子に対
応するバンドを単離し、Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇ
ｅｎから入手可能）を使用して精製し、ｐＣＲ ＩＩ ＴＡクローニングベクタ
ー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）に連結し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７
７自動ＤＮＡシーケンサーを使用して配列決定した。配列解析により、配列番号
１９１０を有するコード鎖と配列番号１９１１を有する相補鎖を有する、約１９
６８ヌクレオチドフラグメント（ｎＣｆＶＧＣＣ1968と呼ぶ）が明らかになった
。配列解析により、核酸分子ｎＣｆＶＧＣＣ1968は、開始コドンをコードしてい
ないことも明らかになった。従って、さらなる配列を単離するために、もう一度
、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを以下のように行った。鋳型として実施例３に記載のよ
うに調製したＲＡＣＥ ｃＤＮＡプールと、１回目のＰＣＲ反応について述べた
ＰＣＲ反応条件とサーモサイクリング条件を使用して、フォワードプライマーと
してＡｄａｐｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ１と、配列番号１９１０のヌクレオチド３５
０〜３７２に相補的であり、核酸配列５’ＣＣＣ ＧＣＣ ＣＣＡ ＧＴＴ Ｃ
ＴＡ ＧＧＴ ＴＧＴ ＣＣ３’（本明細書中では配列番号１９５０と示す）を
有するリバースプライマーＶＧＣＣ−Ｒ４プライマーを使用した。次いで、この
反応の産物を水で１：５０に希釈し、２回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した
。２回目のＰＣＲ反応では、１回目のＰＣＲ反応について述べたＰＣＲ反応条件
とサーモサイクリング条件で、フォワードプライマーとしてＡｄａｐｔｅｒ Ｐ
ｒｉｍｅｒ２と、配列番号１９１０のヌクレオチド１３４〜１５３に相補的であ
り、核酸配列５’ＣＡＣ ＡＣＣ ＣＡＡ ＣＣＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＧＣ３’
（本明細書中では配列番号１９５１と示す）を有するリバースプライマーＶＧ
ＣＣ−Ｒ２を使用した。
【０３５２】 この反応の産物を前述のようにゲル精製し、フラグメントを、ｐＣＲ ＩＩ
ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇベクター（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）に連結し、配列決
定して、約６７３ヌクレオチド長のフラグメント（本明細書中ではｎＣｆＶＧＣ
Ｃ673と呼び、配列番号１９１２を有するコード鎖と配列番号１９１３を有する
相補鎖を有する）を明らかにした。配列解析により、このフラグメントのヌクレ
オチド５２０〜６７３は、配列番号１９１０のヌクレオチド１〜１５４と１００
％の同一性を有することが明らかになった。これらのＶＧＣＣフラグメントをア
ラインメントして、３１２６ヌクレオチド長の連続配列（本明細書中ではｎＣｆ
ＶＧＣＣ3126と呼び、配列番号１９１４を有するコード鎖と、配列番号１９１６
を有する相補鎖を有する）を得た。配列番号１９１４の翻訳により、核酸分子ｎ
ＣｆＶＧＣＣ3126は、配列番号１９１５により表されるアミノ酸配列を有する、
８５１アミノ酸の完全長ＶＧＣＣ様蛋白質（本明細書中ではＰＣｆＶＧＣＣ851
と呼ぶ）をコードすることが示唆される。開始コドンが、配列番号１９１４のヌ
クレオチド１６８からヌクレオチド１７０に及び、終結コドンが、配列番号１９
１４のヌクレオチド２７２１からヌクレオチド２７２３に及ぶと仮定する。ＰＣ
ｆＶＧＣＣ851をコードするコード領域は、配列番号１９１７により表される核
酸配列を有するコード鎖と配列番号１９１８により表される核酸配列を有する相
補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＶＧＣＣ2553により表される。配列番号１９１５
のアミノ酸配列により、ＰＣｆＶＧＣＣ851は、約９３．４ｋＤａの推定分子量
と約７．３５の推定ｐＩを有することが予想される。
【０３５３】 配列番号１９１５のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列
との比較により、配列番号１９１５は、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕ
ｌｕｓ（ウサギ）塩素チャネル蛋白質３（ＣＬＣＮ３）（アクセッション番号Ａ
ＡＢ９５１６３）と最大の相同性（すなわち、約６３．１％の同一性）を示した
ことが分かる。配列番号１９１４とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配列との比
較により、配列番号１９１４は、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ
塩素チャネル蛋白質３（ＣＬＣＮ３）ｍＲＮＡ（アクセッション番号ＡＦ０２９
３４８）と最大の相同性（すなわち、約６１．３％の同一性）を示したことが分
かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を使用し、デフォル
トパラメータを使用して行った。
【０３５４】 ＶＧＣＣ ｍＲＮＡが、ノミ生活環のある特定の段階だけで発現するのかどう
か、ＶＧＣＣ ｍＲＮＡが、ＨＭＴ組織だけで発現するのかどうかを確かめるた
めに、ノーザンブロット分析を実施例４に記載のように行った。総ＲＮＡを、卵
、一齢幼虫、三齢幼虫、移行期幼虫、蛹、餌を与えていない成虫、及びネコ血液
を０．２５時間、２時間、８時間、２４時間与えた成虫から抽出した。さらに、
総ＲＮＡを、ネコ血液を２４時間与えたノミ成虫から取り出した後腸及びマルピ
ーギ管から、ならびに後腸及びマルピーギ管を取り出した後に残っている体部分
から抽出した。各ＲＮＡ試料をゲル電気泳動により分離し、ナイロンメンブレン
に転写し、実施例４に記載のノザンブロッティング条件下でα−32Ｐ−ＡＴＰ標
識ｎＣｆＶＧＣＣ381とハイブリッド形成させた。約３ｋＢのバンドが、全ての
生活段階と餌を与えていない成虫及び成虫に餌が与えられた時点で検出された。
しかしながら、このシグナルの強度は段階間で異なり、最も強いシグナルが、卵
、餌を与えていない成虫、０．２５時間餌を与えた成虫の段階で見られ、最も弱
いシグナルが、三齢幼虫及び蛹の段階で見られた。２４時間餌を与えた成虫のＨ
ＭＴ組織において強いシグナルが検出されたが、屠体組織には非常に弱いシグナ
ルしか存在しなかった。
【０３５５】 実施例２０ 本実施例は、実施例２に記載のＥＳＴ配列決定により単離されたインターセク
チン様ｃＤＮＡのさらなる特徴付け及び発現について述べる。 クローン２２２５−２３と呼ぶｃＤＮＡ（本明細書中では配列番号１２１と示
す）を、実施例２に記載のようにアンサブトラクティッドＨＮＣライブラリから
単離した。クローン２２２５−２３ ｍＲＮＡがＮＨＣ組織でのみ発現するかど
うか確かめるために、ノーザンブロット分析を実施例１０に記載のように行った
。ハイブリダイゼーションステップのために、ノミクローン２２２５−２３核酸
分子を含むプローブを、ＤＮＡ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を
使用してα−32Ｐ−ＡＴＰで標識し、約１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの濃度で緩衝液
に添加し、４２℃で約１４〜１８時間ハイブリッド形成させた。次いで、ブロッ
トを、０．５×ＳＳＰＥ及び０．１％サルコシルで、５５℃で１回の洗浄あたり
１０分間、２回洗浄し、オートラジオグラフィー用フィルムに暴露した。現像さ
れたフィルムの分析により、非ＨＮＣ組織と比較して、ＨＮＣ組織でのクローン
２２２５−２３ ｍＲＮＡの発現は大きいことが分かった。このことから、クロ
ーン２２２５−２３は、ノミ頭部及び神経索においてアップレギュレートされて
いる可能性があることが分かる。
【０３５６】 実施例２１ 本実施例は、実施例２に記載のＥＳＴ配列決定により単離された神経内分泌特
異的プロテインＣ様ｃＤＮＡのさらなる特徴付け及び発現について述べる。 クローン２２４９−１９と呼ぶｃＤＮＡ（本明細書中では配列番号１７７５と
示す）を、実施例２に記載のアンサブトラクティッドＨＮＣライブラリから単離
した。クローン２２４９−１９ ｍＲＮＡがＨＮＣ組織でのみ発現するかどうか
確かめるために、ノーザンブロット分析を実施例１０に記載のように行った。ハ
イブリダイゼーションステップのために、クローン２２４９−１９核酸分子を有
するプローブを以下のように作成した。ヌクレオチド配列５’ＡＧＴ ＣＧＣ
ＡＴＡ ＧＴＧ ＣＡＣ ＴＴＣ ＴＧＡ ＡＴＧ３’（本明細書中では配列番
号１９５４と示す）を有するフォワードプライマー２２４９−１９ｆｏｒと、ヌ
クレオチド配列５’ＣＴＧ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＴＴ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＣＴ
Ｃ３’（本明細書中では配列番号１９５５と示す）を有するリバースプライマ
ー２２４９−１９ｒｅｖを使用し、実施例２に記載のように調製したＨＮＣ ｃ
ＤＮＡライブラリを鋳型として使用して、標準的なＰＣＲ反応条件と以下のサー
モサイクリング条件：（１）９５℃１分、（２）９４℃１０秒、５０℃２０秒、
７２℃２０秒の２サイクル、（３）９４℃１０秒、５３℃２０秒、７２℃４０秒
の３０サイクルで、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングキッ
ト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を使用してＴＡベクターに連結し、ク
ローンをＥｃｏＲＩ酵素で消化し、アガロースゲルから精製した。精製された核
酸分子を、ＤＮＡ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を使用してα− 32 Ｐ−ＡＴＰで標識し、約１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの濃度で緩衝液に添加し、４
２℃で約１４〜１８時間ハイブリッド形成させた。次いで、ブロットを、０．５
×ＳＳＰＥ及び０．１％サルコシルで、５５℃で１回の洗浄あたり１０分間、２
回洗浄し、オートラジオグラフィー用フィルムに暴露した。現像されたフィルム
の分析により、クローン２２４９−１９ ｍＲＮＡが、ＨＮＣ組織及び非ＨＮＣ
組織において発現されることが分かった。２つのバンド（一方は約１．５Ｋｂで
あり、他方は約２．５Ｋｂである）が明らかに見えた。
【０３５７】 実施例２２ 本実施例は、実施例２に記載のＥＳＴ配列決定により単離された、酸素欠乏症
アップレギュレート蛋白質（ａｎｏｘｉａ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）様ｃＤＮＡのさらなる特徴付け及び発現について述べる。
【０３５８】 実施例２に記載のＨＮＣ ＥＳＴライブラリから１個のＴＡクローン（クロー
ン２２１８−９５と呼び、本明細書中で配列番号１８５８と示す）を、標準的な
配列決定法を使用して配列決定した。このクローンは、酸素欠乏症アップレギュ
レート蛋白質（ＡＵＰ）遺伝子と有意な相同性を有する非完全長核酸分子を含む
ことが分かった。ＡＵＰ遺伝子をコードするさらなる配列を以下のように単離し
た。配列番号１８５８の核酸配列を含むハイブリダイゼーションプローブを以下
のように構築した。ヌクレオチド配列５’ＡＡＴ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＴＴ Ｇ
ＴＡ ＡＧＡ ＧＴＴ ＡＧＧ３’（本明細書中で配列番号１９５６と示す）を
有するフォワードプライマー２２１８−９５ｆｏｒと、ヌクレオチド配列５’Ｇ
ＴＴ ＴＡＡ ＴＡＴ ＴＧＣ ＡＴＧ ＴＴＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＡＡ Ａ
Ａ３’（本明細書中で配列番号１９５７と示す）を有するリバースプライマー２
２１８−９５ｒｅｖを使用し、実施例２に記載のように調製したＨＮＣ ｃＤＮ
Ａライブラリを鋳型として使用して、標準的なＰＣＲ反応条件と以下のサーモサ
イクリング条件：（１）９５℃１分、（２）９４℃１０秒、５５℃２０秒、７２
℃２０秒の３０サイクルで、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を、ＴＡクローニ
ングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を使用してＴＡベクターに連
結し、クローンをＥｃｏＲＩ酵素で消化し、アガロースゲルから精製した。精製
された核酸分子を、ＤＮＡ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を使用
してα−32Ｐ−ＡＴＰで標識した。
【０３５９】 32Ｐα−ｄＡＴＰ標識プローブを標準的なプラークリフトハイブリダイゼーシ
ョン手順に使用して、実施例２に記載のＨＮＣλ−ＺＡＰアンサブトラクティッ
ドｃＤＮＡライブラリから１個のクローンを単離した。ハイブリダイゼーション
を実施例１２に記載のように行い、プローブに強くハイブリッド形成したプラー
クを単離し、精製し、実施例１２に記載のように配列決定した。配列決定により
、このクローンは、配列番号１９１９として本明細書中で示すヌクレオチド配列
を有する、約１１８１ヌクレオチドの核酸分子（本明細書中ではｎＣｆＡＵＰ11 81 と呼ぶ）を含むことが明らかになった。配列番号１９１９の相補的配列を、本
明細書中で配列番号１９２１と表す。
【０３６０】 配列番号１９１９の翻訳により、核酸分子ｎＣｆＡＵＰ1181は、配列番号１９
２０により表されるアミノ酸配列を有する、１０２アミノ酸の完全長ＡＵＰ蛋白
質（本明細書中ではＰＣｆＡＵＰ102と呼ぶ）をコードすることが示唆される。
開始コドンが、配列番号１９１９のヌクレオチド１２７からヌクレオチド１２９
に及び、終結コドンが、配列番号１９１９のヌクレオチド４３３からヌクレオチ
ド４３５に及ぶと仮定する。ＰＣｆＡＵＰ102をコードするコード領域は、配列
番号１９２２により表される核酸配列を有するコード鎖と配列番号１９２３によ
り表される核酸配列を有する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆＡＵＰ306により
表される。ＰＣｆＡＵＰ102のアミノ酸配列により、ＰＣｆＡＵＰ102は、約１１
．９ｋＤａの推定分子量と約１０．５の推定ｐＩを有することが予想される。
【０３６１】 配列番号１９２０のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列
との比較により、配列番号１９２０は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇ
ａｓｔｅｒ酸素欠乏症アップレギュレート蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ
ン番号ＡＡＤ３８３９７）と最大の相同性（すなわち、約５２％の同一性）を示
したことが分かる。同一性パーセントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を使用
し、デフォルトパラメータを使用して行った。核酸配列配列番号１９１９とＧｅ
ｎＢａｎｋに報告された核酸配列とのＢｌａｓｔ比較により、配列番号１９１９
は、ニューレキシンＩＩＩ遺伝子を含むヒト染色体１４ｑ３１領域に由来するク
ローン（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＣ００７０５６）と最大の相同性を示したことが
分かる。ＧｅｎＢａｎｋのヒトクローンが大きすぎてＧＣＧバージョン９．０に
ロードすることができないので、ペアワイズ同一性を行うことができなかった。
【０３６２】 実施例２３ 本実施例は、実施例２に記載のＥＳＴ配列決定により単離された、神経内分泌
特異的７Ｂ２ポリペプチドのさらなる特徴付けについて述べる。 クローン２２１１−２１と呼ぶｃＤＮＡ（本明細書中では配列番号９２と示す
）を、実施例２に記載のサブトラクティッドＨＮＣライブラリから単離した。ク
ローン２２１１−２１からＤＮＡを精製し、インサートを、以下のように、アン
サブトラクティッドＨＭＴ ｃＤＮＡライブラリのプラークハイブリダイゼーシ
ョンスクリーニングに使用した。クローン２２１１−２１からインサートを、Ｅ
ｃｏＲＩでの消化により切り出し、アガロースゲル電気泳動により分離し、Ｑｉ
ａＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）を使
用して精製した。Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を使用して、ランダムプライム法により作成
されるプローブ混合物にα−32Ｐ標識ｄＡＴＰを組み込んだ。32Ｐα−ｄＡＴＰ
標識プローブを標準的なプラークリフトハイブリダイゼーション手順に使用して
、実施例２に記載のように調製したＨＮＣλ−ＺＡＰアンサブトラクティッドｃ
ＤＮＡライブラリからクローンを単離した。以下のハイブリッド形成条件を使用
した。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を、５０
ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８）、５×デンハルト試薬、１．２％ＳＤＳ、０．０２０ｍｇ／ｍＬサケ精子Ｄ
ＮＡ）中で、約２×１０6カウント毎分（ｃｐｍ）／ｍｌのプローブと５５℃で
約４８時間ハイブリッド形成させた。フィルターを、５５℃１５分、５０ｍｌの
４×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳで１回、５５℃１０分、洗浄し、５０ｍｌの２×ＳＳ
ＰＥ、１％ＳＤＳで１回、洗浄し、５５℃１０分、５０ｍｌの０．５×ＳＳＰＥ
、０．５％ＳＤＳで２回、洗浄した。次いで、フィルターをオートラジオグラフ
ィーにかけた。プローブと強くハイブリッド形成した１個のプラークを単離し、
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｅｘ−ＡｓｓｉｓｔTMヘルパーファージシステムとプロ
トコルを使用してインビボエキシジョンに供した。ミニプレップＤＮＡを、Ｍｉ
ｎｉｐｒｅｐキットとプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ
から入手可能）を使用してポジティブクローンから調製し、標準的な配列決定手
順を使用して配列決定した。このクローン（ｎＣｆ７Ｂ２2161と呼ぶ）は、配列
番号１９２４の核酸配列を有するコード鎖と配列番号１９２６を有する相補鎖を
有する、約２１６１ヌクレオチド長の核酸分子を含んでいる。
【０３６３】 配列番号１９２４の翻訳により、核酸分子ｎＣｆ７Ｂ２2161は、配列番号１９
２５により表されるアミノ酸配列を有する、２６７アミノ酸の完全長７Ｂ２様蛋
白質（本明細書中ではＰＣｆ７Ｂ２267と呼ぶ）をコードすることが示唆される
。開始コドンが、配列番号１９２４のヌクレオチド１０７からヌクレオチド１０
９に及び、終結コドンが、配列番号１９２４のヌクレオチド９０８からヌクレオ
チド９１０に及ぶと仮定する。ＰＣｆ７Ｂ２267をコードするコード領域は、配
列番号１９２７により表される核酸配列を有するコード鎖と配列番号１９２８に
より表される核酸配列を有する相補鎖を有する、核酸分子ｎＣｆ７Ｂ２801によ
り表される。配列番号１９２５のアミノ酸配列により、ＰＣｆ７Ｂ２267は、約
３１ｋＤａの推定分子量と約５の推定ｐＩを有することが予想される。ＰＣｆ７
Ｂ２267の分析により、約アミノ酸１から約アミノ酸２０に及ぶアミノ酸ストレ
ッチによりコードされるシグナルペプチドが存在することが示唆される。提案さ
れた成熟蛋白質（本明細書中ではＰＣｆ７Ｂ２247と呼ぶ）は、配列番号１９３
０と示す２４７アミノ酸を含み、配列番号１９２９を有するコード鎖と配列番号
１９３１を有する相補鎖を有する核酸分子（ｎＣｆ７Ｂ２741と呼ぶ）によりコ
ードされる。
【０３６４】 配列番号１９２５のアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋに報告されたアミノ酸配列
との比較により、配列番号１９２５は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇ
ａｓｔｅｒ蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ５２０３６）と最
大の相同性（すなわち、約３９％の同一性）を示したことが分かる。同一性パー
セントの計算を、ＧＣＧバージョン９．０を使用し、デフォルトパラメータを使
用して行った。核酸配列配列番号１９２４とＧｅｎＢａｎｋに報告された核酸配
列とのＢｌａｓｔ比較により、配列番号１９２４は、ヒト１９番染色体コスミド
Ｒ２８２０４クローン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ００６１３２）
と最大の相同性を示したことが分かる。ＧｅｎＢａｎｋのヒトクローンが大きす
ぎてＧＣＧバージョン９．０にロードすることができないので、ペアワイズ同一
性を行うことができなかった。しかしながら、ＢＬＡＳＴスコアは、有意なレベ
ルの同一性とみなされない０．２０であった。
【０３６５】 ７Ｂ２ ｍＲＮＡがＨＮＣ組織のみで発現するかどうか確かめるために、ノー
ザンブロット分析を実施例１０に記載のように行った。ハイブリダイゼーション
ステップのために、クローン２２１１−２１の核酸配列を有するプローブを以下
のように作成した。ヌクレオチド配列５’ＧＣＧ ＣＣＡ ＴＧＡ ＡＧＡ Ｔ
ＴＴ ＣＡＧ ＧＣＧ３’（本明細書中では配列番号１９５８と示す）を有する
フォワードプライマー２２１１−２１ｆｏｒと、ヌクレオチド配列５’ＡＡＧ
ＴＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＴＣＡ ＴＣＡ ＧＣＡ ＡＧ３’ （本明細書中で
は配列番号１９５９と示す）を有するリバースプライマー２２１１−２１ｒｅｖ
を使用し、実施例２に記載のように調製したＨＮＣ ｃＤＮＡライブラリを鋳型
として使用して、標準的なＰＣＲ反応条件と以下のサーモサイクリング条件：（
１）９５℃１分、（２）９４℃１０秒、５０℃２０秒、７２℃２０秒の５サイク
ル、（３）９４℃１０秒、５３℃２０秒、７２℃４０秒の３０サイクルで、ＰＣ
Ｒ反応を行った。ＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎから入手可能）を使用してＴＡベクターに連結し、クローンをＥｃｏＲＩ酵素
で消化し、アガロースゲルから精製した。精製された核酸分子を、ＤＮＡ標識キ
ット（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を使用してα−32Ｐ−ＡＴＰで標識し、
約１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの濃度で緩衝液に添加し、４２℃で約１４〜１８時間
ハイブリッド形成させた。次いで、ブロットを、０．５×ＳＳＰＥ及び０．１％
サルコシルで、５５℃で１回の洗浄あたり１０分間、２回洗浄し、オートラジオ
グラフィー用フィルムに暴露した。２．５日の暴露の後、現像されたフィルムの
分析により、クローン２２１１−２１ ｍＲＮＡはＨＮＣ組織のみで発現するこ
とが分かった。
【０３６６】 本発明の様々な実施態様を詳細に説明したが、これらの実施態様は改良及び変
更されることが当業者に明らかである。しかしながら、このような改良及び変更
は、以下の特許請求の範囲に示されるように本発明の範囲内であることが明らか
に理解されるだろう。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/00 Ａ６１Ｐ 37/08 ４Ｈ０４５ 33/14 Ｃ０７Ｋ 14/435 37/08 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 7/00 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 7/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｎ 1/19 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スティンチコーム、ダン ティ． アメリカ合衆国 80528 コロラド州 フ ォートコリンズ サウス カウンティ ロ ード ３ 8409 (72)発明者 ウィスニュースキー、ナンシー アメリカ合衆国 80526 コロラド州 フ ォートコリンズ ビーバー クリーク ド ライブ 4219 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA06 HA17 4B064 AG01 CA19 CC24 CE12 DA01 4B065 AA90Y AB01 CA24 CA44 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 DC01 DC50 MA05 NA14 ZA892 ZB132 ZB372 4C085 AA03 AA12 BB11 CC22 EE01 EE06 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA51 EA20 FA74

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含
    む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度で１×ＳＳ
    Ｃと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件下で、配列
    番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列
    番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番
    号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号
    ２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３
    ３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０
    、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、
    配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号
    １５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５、
    配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１８５９、配列番
    号１８６０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番号１８６４、配列番
    号１８６６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番号１８７０、配列番
    号１８７１、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番号１８７５、配列番
    号１８７６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８０、配列番
    号１８８１、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番号１８８５、配列番
    号１８８６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番号１８９０、配列番
    号１８９１、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番号１８９４、配列番
    号１８９５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番号１８９９、配列番
    号１９００、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９０４、配列番
    号１９０５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番号１９０８、配列番
    号１９０９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番号１９１２、配列番
    号１９１３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番号１９１７、配列番
    号１９１８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番号１９２２、配列番
    号１９２３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番号１９２７、配列番
    号１９２８、配列番号１９２９及び配列番号１９３１から成る群より選択された
    核酸配列とハイブリッド形成する単離核酸分子。
  2. 【請求項２】前記核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列
    番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３
    、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、
    配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配
    列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列
    番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番
    号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号１５３、配列番号１５５、配列
    番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６
    ２、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列
    番号１７０、配列番号１８５９、配列番号１８６０、配列番号１８６１、配列番
    号１８６３、配列番号１８６４、配列番号１８６６、配列番号１８６７、配列番
    号１８６９、配列番号１８７０、配列番号１８７１、配列番号１８７２、配列番
    号１８７４、配列番号１８７５、配列番号１８７６、配列番号１８７７、配列番
    号１８７８、配列番号１８８０、配列番号１８８１、配列番号１８８２、配列番
    号１８８４、配列番号１８８５、配列番号１８８６、配列番号１８８７、配列番
    号１８８９、配列番号１８９０、配列番号１８９１、配列番号１８９２、配列番
    号１８９３、配列番号１８９４、配列番号１８９５、配列番号１８９６、配列番
    号１８９８、配列番号１８９９、配列番号１９００、配列番号１９０１、配列番
    号１９０３、配列番号１９０４、配列番号１９０５、配列番号１９０６、配列番
    号１９０７、配列番号１９０８、配列番号１９０９、配列番号１９１０、配列番
    号１９１１、配列番号１９１２、配列番号１９１３、配列番号１９１４、配列番
    号１９１６、配列番号１９１７、配列番号１９１８、配列番号１９１９、配列番
    号１９２１、配列番号１９２２、配列番号１９２３、配列番号１９２４、配列番
    号１９２６、配列番号１９２７、配列番号１９２８、配列番号１９２９及び配列
    番号１９３１から成る群より選択された核酸配列と約７０％以上相同な核酸配列
    を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】前記核酸分子が、 配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９
    、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、
    配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配
    列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列
    番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番
    号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号
    ４８、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配
    列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１
    ６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１８５９、
    配列番号１８６０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番号１８６４、
    配列番号１８６６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番号１８７０、
    配列番号１８７１、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番号１８７５、
    配列番号１８７６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８０、
    配列番号１８８１、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番号１８８５、
    配列番号１８８６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番号１８９０、
    配列番号１８９１、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番号１８９４、
    配列番号１８９５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番号１８９９、
    配列番号１９００、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９０４、
    配列番号１９０５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番号１９０８、
    配列番号１９０９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番号１９１２、
    配列番号１９１３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番号１９１７、
    配列番号１９１８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番号１９２２、
    配列番号１９２３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番号１９２７、
    配列番号１９２８、配列番号１９２９及び配列番号１９３１から成る群より選択
    された核酸配列を有する核酸分子と、 配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９
    、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、
    配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配
    列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列
    番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番
    号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号
    ４８、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配
    列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１
    ６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１８５９、
    配列番号１８６０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番号１８６４、
    配列番号１８６６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番号１８７０、
    配列番号１８７１、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番号１８７５、
    配列番号１８７６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８０、
    配列番号１８８１、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番号１８８５、
    配列番号１８８６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番号１８９０、
    配列番号１８９１、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番号１８９４、
    配列番号１８９５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番号１８９９、
    配列番号１９００、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９０４、
    配列番号１９０５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番号１９０８、
    配列番号１９０９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番号１９１２、
    配列番号１９１３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番号１９１７、
    配列番号１９１８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番号１９２２、
    配列番号１９２３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番号１９２７、
    配列番号１９２８、配列番号１９２９及び配列番号１９３１から成る群より選択
    された核酸分子の対立変異型を有する核酸分子と から成る群より選択される、請求項１に記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】前記核酸分子が、配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配
    列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列
    番号１５４、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１８
    ６２、配列番号１８６８、配列番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号１８
    ８３、配列番号１８８８、配列番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号１９
    １５、配列番号１９２０、配列番号１９２５、及び配列番号１９３０から成る群
    より選択されたアミノ酸配列と約７５％以上相同なアミノ酸配列を有する蛋白質
    をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】前記核酸分子が、配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配
    列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列
    番号１５４、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１８
    ６２、配列番号１８６８、配列番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号１８
    ８３、配列番号１８８８、配列番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号１９
    １５、配列番号１９２０、配列番号１９２５、及び配列番号１９３０から成る群
    より選択されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする、請求項１に記載の核
    酸分子。
  6. 【請求項６】転写調節配列に機能的に結合させた請求項１に記載の核酸分子
    を含む組換え分子。
  7. 【請求項７】請求項１に記載の核酸分子を含む組換えウイルス。
  8. 【請求項８】請求項１に記載の核酸分子を含む組換え細胞。
  9. 【請求項９】（ａ）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含
    む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（ｂ）約４７．５℃の温度で１×ＳＳ
    Ｃと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件下で、配列
    番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８
    、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、
    配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４８、配
    列番号１５５、配列番号１５８、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１
    ６７、配列番号１７０、配列番号１８６０、配列番号１８６３、配列番号１８６
    ６、配列番号１８６９、配列番号１８７１、配列番号１８７４、配列番号１８７
    ６、配列番号１８８０、配列番号１８８４、配列番号１８８６、配列番号１８８
    ９、配列番号１８９１、配列番号１８９３、配列番号１８９５、配列番号１８９
    ８、配列番号１９００、配列番号１９０３、配列番号１９０５、配列番号１９０
    ７、配列番号１９０９、配列番号１９１１、配列番号１９１３、配列番号１９１
    ６、配列番号１９１８、配列番号１９２１、配列番号１９２３、配列番号１９２
    ６、配列番号１９２８、及び配列番号１９３１から成る群より選択された核酸配
    列とハイブリッド形成する単離核酸分子によってコードされる蛋白質を生産する
    方法であって、前記蛋白質をコードする核酸分子により形質転換した細胞を培養
    する工程から成る方法。
  10. 【請求項１０】前記核酸分子は、配列番号２、配列番号８、配列番号１４、
    配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配
    列番号１５４、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１
    ８６２、配列番号１８６８、配列番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号１
    ８８３、配列番号１８８８、配列番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号１
    ９１５、配列番号１９２０、配列番号１９２５、及び配列番号１９３０から成る
    群より選択されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする、請求項９に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】前記核酸分子が、 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番
    号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号
    ３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４
    ６、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列
    番号１６５、配列番号１６８、配列番号１８５９、配列番号１８６１、配列番号
    １８６４、配列番号１８６７、配列番号１８７０、配列番号１８７２、配列番号
    １８７５、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８１、配列番号
    １８８２、配列番号１８８５、配列番号１８８７、配列番号１８９０、配列番号
    １８９２、配列番号１８９４、配列番号１８９６、配列番号１８９９、配列番号
    １９０１、配列番号１９０４、配列番号１９０６、配列番号１９０８、配列番号
    １９１０、配列番号１９１２、配列番号１９１４、配列番号１９１７、配列番号
    １９１９、配列番号１９２２、配列番号１９２４、配列番号１９２７及び配列番
    号１９２９から成る群より選択された核酸配列を有する核酸分子と、 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番
    号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号
    ３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４
    ６、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列
    番号１６５、配列番号１６８、配列番号１８５９、配列番号１８６１、配列番号
    １８６４、配列番号１８６７、配列番号１８７０、配列番号１８７２、配列番号
    １８７５、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８１、配列番号
    １８８２、配列番号１８８５、配列番号１８８７、配列番号１８９０、配列番号
    １８９２、配列番号１８９４、配列番号１８９６、配列番号１８９９、配列番号
    １９０１、配列番号１９０４、配列番号１９０６、配列番号１９０８、配列番号
    １９１０、配列番号１９１２、配列番号１９１４、配列番号１９１７、配列番号
    １９１９、配列番号１９２２、配列番号１９２４、配列番号１９２７及び配列番
    号１９２９から成る群より選択された核酸分子の対立変異型を有する核酸分子と
    から成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】（ａ）（１）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムアミ
    ドとを含む溶液中でハイブリッド形成する工程と、（２）約４７．５℃の温度で
    １×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件下
    で、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列
    番号ｌ８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番
    号３３、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、配列番号
    ４８、配列番号１５５、配列番号１５８、配列番号１６１、配列番号１６４、配
    列番号１６７、配列番号１７０、配列番号１８６０、配列番号１８６３、配列番
    号１８６６、配列番号１８６９、配列番号１８７１、配列番号１８７４、配列番
    号１８７６、配列番号１８８０、配列番号１８８４、配列番号１８８６、配列番
    号１８８９、配列番号１８９１、配列番号１８９３、配列番号１８９５、配列番
    号１８９８、配列番号１９００、配列番号１９０３、配列番号１９０５、配列番
    号１９０７、配列番号１９０９、配列番号１９１１、配列番号１９１３、配列番
    号１９１６、配列番号１９１８、配列番号１９２１、配列番号１９２３、配列番
    号１９２６、配列番号１９２８、及び配列番号１９３１から成る群より選択され
    た核酸配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされた単離蛋白質と、 （ｂ）配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６
    、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号１５４、配列番号１６
    ０、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１８６２、配列番号１８６８、
    配列番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号１８８３、配列番号１８８８、
    配列番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号１９１５、配列番号１９２０、
    配列番号１９２５及び配列番号１９３０から成る群より選択されたアミノ酸配列
    と約７５％以上相同なアミノ酸配列を有する単離蛋白質と から成る群より選択される単離蛋白質。
  13. 【請求項１３】前記核酸分子は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配
    列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列
    番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番
    号４０、配列番号４３、配列番号４６、配列番号１５３、配列番号１５６、配列
    番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１６８、配列番号１８
    ５９、配列番号１８６１、配列番号１８６４、配列番号１８６７、配列番号１８
    ７０、配列番号１８７２、配列番号１８７５、配列番号１８７７、配列番号１８
    ７８、配列番号１８８１、配列番号１８８２、配列番号１８８５、配列番号１８
    ８７、配列番号１８９０、配列番号１８９２、配列番号１８９４、配列番号１８
    ９６、配列番号１８９９、配列番号１９０１年、配列番号１９０４、配列番号１
    ９０６、配列番号１９０８、配列番号１９１０、配列番号１９１２、配列番号１
    ９１４、配列番号１９１７、配列番号１９１９、配列番号１９２２、配列番号１
    ９２４、配列番号１９２７及び配列番号１９２９から成る群より選択された核酸
    配列と約７０％以上相同な核酸配列を有する、請求項１２の蛋白質。
  14. 【請求項１４】前記核酸分子は、 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番
    号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号
    ３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４
    ６、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列
    番号１６５、配列番号１６８、配列番号１８５９、配列番号１８６１、配列番号
    １８６４、配列番号１８６７、配列番号１８７０、配列番号１８７２、配列番号
    １８７５、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８１、配列番号
    １８８２、配列番号１８８５、配列番号１８８７、配列番号１８９０、配列番号
    １８９２、配列番号１８９４、配列番号１８９６、配列番号１８９９、配列番号
    １９０１年、配列番号１９０４、配列番号１９０６、配列番号１９０８、配列番
    号１９１０、配列番号１９１２、配列番号１９１４、配列番号１９１７、配列番
    号１９１９、配列番号１９２２、配列番号１９２４、配列番号１９２７及び配列
    番号１９２９から成る群より選択された核酸配列を有する核酸分子と、 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番
    号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号
    ３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４
    ６、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列
    番号１６５、配列番号１６８、配列番号１８５９、配列番号１８６１、配列番号
    １８６４、配列番号１８６７、配列番号１８７０、配列番号１８７２、配列番号
    １８７５、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８１、配列番号
    １８８２、配列番号１８８５、配列番号１８８７、配列番号１８９０、配列番号
    １８９２、配列番号１８９４、配列番号１８９６、配列番号１８９９、配列番号
    １９０１年、配列番号１９０４、配列番号１９０６、配列番号１９０８、配列番
    号１９１０、配列番号１９１２、配列番号１９１４、配列番号１９１７、配列番
    号１９１９、配列番号１９２２、配列番号１９２４、配列番号１９２７及び配列
    番号１９２９から成る群より選択された核酸分子の対立変異型を有する核酸分子
    とから成る群より選択される、請求項１２の蛋白質。
  15. 【請求項１５】前記蛋白質が、配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配
    列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列
    番号１５４、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１８
    ６２、配列番号１８６８、配列番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号１８
    ８３、配列番号１８８８、配列番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号１９
    １５、配列番号１９２０、配列番号１９２５、及び配列番号１９３０から成る群
    より選択されたアミノ酸配列と約７５％以上相同なアミノ酸配列を有する、請求
    項１２に記載の蛋白質。
  16. 【請求項１６】前記蛋白質が、配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配
    列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列
    番号１５４、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１８
    ６２、配列番号１８６８、配列番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号１８
    ８３、配列番号１８８８、配列番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号１９
    １５、配列番号１９２０、配列番号１９２５、及び配列番号１９３０から成る群
    より選択されたアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の蛋白質。
  17. 【請求項１７】請求項１２に記載の蛋白質に選択的に結合する単離抗体。
  18. 【請求項１８】請求項１２に記載の単離蛋白質の活性を阻害できる化合物を
    同定する方法であって、 請求項１２に記載の単離蛋白質を、前記化合物の不在下にて前記蛋白質が活性
    を有する条件下で、推定阻害化合物と接触させる工程と、 前記推定阻害化合物が前記活性を阻害するかどうかを測定する工程と から成る方法。
  19. 【請求項１９】請求項１２に記載の単離蛋白質の活性を阻害できる化合物を
    同定するキットであって、請求項１２の単離蛋白質と、推定阻害化合物の存在下
    での前記活性の阻害の程度を測定する手段とを備えたキット。
  20. 【請求項２０】賦形剤と化合物を含有する組成物であって、前記化合物が、 （ａ）（１）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中
    でハイブリッド形成する工程と、（２）約４７．５℃の温度で１×ＳＳＣと０％
    ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件下で、配列番号１、
    配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０
    、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、
    配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配
    列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列
    番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番
    号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号
    １５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９、
    配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号
    １６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１８５９、配列番号１８６
    ０、配列番号１８６１、配列番号１８６３、配列番号１８６４、配列番号１８６
    ６、配列番号１８６７、配列番号１８６９、配列番号１８７０、配列番号１８７
    １、配列番号１８７２、配列番号１８７４、配列番号１８７５、配列番号１８７
    ６、配列番号１８７７、配列番号１８７８、配列番号１８８０、配列番号１８８
    １、配列番号１８８２、配列番号１８８４、配列番号１８８５、配列番号１８８
    ６、配列番号１８８７、配列番号１８８９、配列番号１８９０、配列番号１８９
    １、配列番号１８９２、配列番号１８９３、配列番号１８９４、配列番号１８９
    ５、配列番号１８９６、配列番号１８９８、配列番号１８９９、配列番号１９０
    ０、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９０４、配列番号１９０
    ５、配列番号１９０６、配列番号１９０７、配列番号１９０８、配列番号１９０
    ９、配列番号１９１０、配列番号１９１１、配列番号１９１２、配列番号１９１
    ３、配列番号１９１４、配列番号１９１６、配列番号１９１７、配列番号１９１
    ８、配列番号１９１９、配列番号１９２１、配列番号１９２２、配列番号１９２
    ３、配列番号１９２４、配列番号１９２６、配列番号１９２７、配列番号１９２
    ８、配列番号１９２９及び配列番号１９３１から成る群より選択された核酸配列
    とハイブリッド形成する単離核酸分子と、 （ｂ）（１）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中
    でハイブリッド形成する工程と、（２）約４７．５℃の温度で１×ＳＳＣと０％
    ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件下で、配列番号３、
    配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番
    号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号
    ３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４８、配列番号１
    ５５、配列番号１５８、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６７、配
    列番号１７０、配列番号１８６０、配列番号１８６３、配列番号１８６６、配列
    番号１８６９、配列番号１８７１、配列番号１８７４、配列番号１８７６、配列
    番号１８８０、配列番号１８８４、配列番号１８８６、配列番号１８８９、配列
    番号１８９１、配列番号１８９３、配列番号１８９５、配列番号１８９８、配列
    番号１９００、配列番号１９０３、配列番号１９０５、配列番号１９０７、配列
    番号１９０９、配列番号１９１１、配列番号１９１３、配列番号１９１６、配列
    番号１９１８、配列番号１９２１、配列番号１９２３、配列番号１９２６、配列
    番号１９２８、及び配列番号１９３１から成る群より選択された核酸配列とハイ
    ブリッド形成する核酸分子によりコードされた単離蛋白質と、 （ｃ）（１）約３７℃の温度で１×ＳＳＣと０％ホルムアミドとを含む溶液中
    でハイブリッド形成する工程と、（２）約４７．５℃の温度で１×ＳＳＣと０％
    ホルムアミドとを含む溶液中で洗浄する工程とから成る条件下で、配列番号３、
    配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番
    号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号
    ３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４８、配列番号１
    ５５、配列番号１５８、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６７、配
    列番号１７０、配列番号１８６０、配列番号１８６３、配列番号１８６６、配列
    番号１８６９、配列番号１８７１、配列番号１８７４、配列番号１８７６、配列
    番号１８８０、配列番号１８８４、配列番号１８８６、配列番号１８８９、配列
    番号１８９１、配列番号１８９３、配列番号１８９５、配列番号１８９８、配列
    番号１９００、配列番号１９０３、配列番号１９０５、配列番号１９０７、配列
    番号１９０９、配列番号１９１１、配列番号１９１３、配列番号１９１６、配列
    番号１９１８、配列番号１９２１、配列番号１９２３、配列番号１９２６、配列
    番号１９２８、及び配列番号１９３１から成る群より選択された核酸配列とハイ
    ブリッド形成する核酸分子によりコードされた蛋白質と選択的に結合する単離抗
    体と、 から成る群より選択される、組成物。
  21. 【請求項２１】前記組成物は、アジュバント及びキャリアから成る群より選
    択された成分をさらに含有する、請求項２０の組成物。
  22. 【請求項２２】請求項２０に記載の組成物を動物に投与する工程から成る、
    動物を保護する方法。
  23. 【請求項２３】ノミＨＭＴ組織及びノミＨＮＣ組織から成る群より選択され
    た組織によって発現される単離核酸分子であって、 （ａ）ＨＭＴ又はＨＮＣ発現配列を豊富にしたｃＤＮＡライブラリを構築する
    工程と、 （ｂ）前記ライブラリ内の核酸分子を同定する工程と から成る方法により同定される単離核酸分子。
  24. 【請求項２４】配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０、配
    列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号１５４、配
    列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１８６２、配列番号
    １８６８、配列番号１８７３、配列番号１８７９、配列番号１８８３、配列番号
    １８８８、配列番号１８９７、配列番号１９０２、配列番号１９１５、配列番号
    １９２０、配列番号１９２５、配列番号１９３０、並びに表Ｉの核酸配列、表Ｉ
    Ｉの核酸配列、表ＩＩＩの核酸配列、及び表ＩＶの核酸配列から成る群より選択
    された核酸配列によりコードされた蛋白質から選択された蛋白質をコードする、
    請求項２３に記載の核酸分子。
  25. 【請求項２５】請求項２４に記載の蛋白質に選択的に結合する単離抗体。
  26. 【請求項２６】表Ｉの核酸配列、表ＩＩの核酸配列、表ＩＩＩの核酸配列及
    び表ＩＶの核酸配列から成る群より選択された核酸配列を有する、請求項２３の
    核酸分子。
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