JP2003339385A

JP2003339385A - 新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子、新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法、ならびに、新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いたケトン体の測定方法および測定用組成物

Info

Publication number: JP2003339385A
Application number: JP2002156078A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Sogabe; 敦曽我部; Masanori Oka; 岡　　正則; ＡｚｍｉＢｉｎＮｉｋＭａｎｍｏｏｄＮｉｋ; Azmi Bin Nik Manmood Nik; Kiyoshi Ito; 伊藤　　潔; Tadashi Yoshimoto; 忠芳本
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-05-29
Filing date: 2002-05-29
Publication date: 2003-12-02

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】新規な３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコード
する遺伝子、新規な３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、遺
伝子組換え技術による該酵素の製造法及び該３−ヒドロ
キシ酪酸脱水素酵素を用いたケトン体の測定用組成物を
提供する。【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質で
ある細菌由来の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコード
する遺伝子。（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパ
ク質、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつ、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
活性を有するタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な３−ヒドロ
キシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子、新規な３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素、遺伝子組換え技術による該酵
素の製造法及び該３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用い
たケトン体の測定用組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ
１．１．１．３０）はニコチンアミドジヌクレオチド
（ＮＡＤ）の存在下３−ヒドロキシ酪酸を酸化してアセ
ト酢酸と還元型ＮＡＤを生じる反応を可逆的に触媒する
酵素として知られている。自然界における存在はロドス
ピリラムルブラム（Rhodospirillum ruburum；C.W.Sh
usterら、J.Biol.Chem.,237,603(1962)）やシュードモ
ナスレミオグネイ（Pseudomonas lemoignei；F.P.Delaf
ieldら、J.Biol.Chem.,240,4023(1965)）、ロドシュー
ドモナススフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroi
des；H.U.Bergmeyerら、Biochem.J.,102,423(1967)）ア
ルカリゲネスエスピー（Alcaligenes sp. No.981；古
賀ら、特開平８−３８１６９）など各種の細菌に存在す
る事が知られている。また、動物由来の酵素としてはラ
ット脳（Zhang WWら、Biochem. Cell Biol.,68,980(199
0)）や牛心臓（McIntyre JOら、Arch. Biochem. Biophy
s., 262,85(1988)）等にも存在する事が知られている。

【０００３】また、細菌由来３−ヒドロキシ酪酸脱水素
酵素の遺伝子についてはアルカリゲネスフェカリス
（Alcaligenes fecalis；古賀ら、特開平８−７０８５
６）、リゾビウムメリオティ（Rhizobium melioti；
P.Anejaら、J.Bacteriol.,181,849(1999)）、ロドバク
タースフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides；シ
ューマックら、特開平１１−３１８４３８）、シュード
モナスエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa；Stover
CKら、Nature, 406 (6799), 959-964 (2000)）、シュ
ードモナスプチダ（Pseudomonas putida；A.Hanneman
nら、GenBankデータベース 02-April(2001)）等が知ら
れている。

【０００４】一方、臨床検査の分野では糖尿病患者の体
内インスリン作用の不足の程度を反映する代謝指標とし
て血中ケトン体の測定が行われている。ここで言うケト
ン体とはアセト酢酸、３−ヒドロキシ酪酸およびアセト
ンの総称であるが、血中ケトン体の殆どはアセト酢酸と
３−ヒドロキシ酪酸で占められている。また、ケトン体
は主として脂肪酸の肝臓酸化代謝物として生じるが、エ
ネルギー源として糖質の利用が適切に行われているか否
かの指標となりうる。３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は
このケトン体の定量に用いる事が可能な産業上有用な酵
素である。

【０００５】しかしこれまで臨床検査の分野で工業的に
利用されている細菌由来の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素は不安定な酵素が殆どである。３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素の安定化方法としては服部らによりハロゲン化
アルカリ金属塩による安定化方法が報告されているが
（特開２０００−８３６６０）、酵素の本質的特性とし
てより安定性に優れた新規な３−ヒドロキシ酪酸脱水素
酵素の生産が望まれていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】安定性に優れた３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素コードする遺伝子をクローニン
グし、ケトン体測定のために有用な３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素の工業的製造方法を確立すると共に該酵素を
用いた血中ケトン体測定組成物を提供する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
を解決するため、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産菌
として、シュードモナス・スピーシーズＴＥ３１９２
（Pseudomonas sp. TE3192）（FERM BP-8049）を選び、
該菌体より抽出した染色体ＤＮＡより３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全塩
基配列を決定した。さらに、３−ヒドロキシ酪酸脱水素
酵素を遺伝子組換え技術によって形質転換体に高生産さ
せることに成功し工業的に大量供給することを可能にし
た。すなわち、本発明は以下の（ａ）または（ｂ）のタ
ンパク質である３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコード
する遺伝子である。（ａ）配列表・配列番号１に記載さ
れたアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配
列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を有するタンパク質
また、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列
からなる３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素タンパク質であ
る。本発明は上記３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコー
ドする遺伝子を含有する組換えベクターである。本発明
は上記組換えベクターで宿主細胞を形質転換した形質転
換体である。さらに、本発明は上記形質転換体を培養
し、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生成させ、該３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取することを特徴とする
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法である。また、
本発明は上記３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いたケ
トン体測定組成物である。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素をコードする遺伝子は、３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素生産微生物、例えばシュードモナスエスピー
（Pseudomonas sp.）TE3192（FERM BP-8049）などから
抽出しても良く、または化学的に合成することもでき
る。

【０００９】上記遺伝子としては、例えば（ａ）配列表
・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパ
ク質をコードするＤＮＡ、または（ｂ）アミノ酸配列
（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置
換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、３
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡがある。具体的には配列表・配列番号
２に記載される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる
が、コードするアミノ酸配列が上記（ａ）または（ｂ）
に該当するものであればこれに限定されるものではな
い。ＤＮＡの欠失、置換、付加の程度については、基本
的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改
善するようにしたものを含む。これらの変異体を製造す
る方法は、従来から公知である方法に従う。

【００１０】本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を
コードする遺伝子を得る方法としては、例えばシュード
モナスエスピー（Pseudomonas sp.）TE3192（FERM BP
-8049）の染色体ＤＮＡを分離、精製した後、超音波破
砕、制限酵素処理等を用いて、ＤＮＡを断片化したもの
と、リニアーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端ま
たは接着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉
鎖させて組換ベクターを構築する。こうして得られた組
換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した後、３
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性の発現を指標としてス
クリーニングして、組換えベクターを保持する微生物を
得る。次いで該微生物を培養し、該培養菌体から該組換
えベクターを分離・精製し、該組換えベクターから３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を採取すれば良い。

【００１１】遺伝子供与体であるシュードモナスエス
ピー（Pseudomonas sp.）TE3192（FERM BP-8049）に由
来するＤＮＡは、具体的には以下のように採取される。
すなわち、供与微生物を例えば、１〜３日間攪拌培養し
て得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを
溶菌させることにより３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺
伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌方法と
しては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌
酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや
他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面
活性剤が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処
理のような物理的破砕方法と組み合わせても良い。この
ようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離・精製する
には常法、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理に
よる除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール
沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行う
ことができる。また、一般的に市販されている染色体Ｄ
ＮＡ抽出用の試薬も利用可能で有る。

【００１２】微生物から分離・精製されたＤＮＡを切断
する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などによ
り行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配
列に作用するII型制限酵素が適している。ベクターとし
ては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまた
はプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたもの
が適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア
・コリー(Escherichia coli)を宿主微生物とする場合に
は、ラムダZAPII （ストラタジーン製）、λｇｔ・１
０、λｇｔ・１１などが使用できる。またプラスミドと
しては、例えばエシェリヒア・コリー(Escherichia col
i)を宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ
１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔやｐＫＫ２２３−３など
が使用できる。

【００１３】このようなベクターを、上述した３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子供与体である微生物ＤＮＡ
の切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得
ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使
用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。
微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる
方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であれば良
く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とのアニーリン
グの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮ
Ａ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成
する。必要なら、アニーリングの後、宿主微生物に移入
して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを
作成することもできる。

【００１４】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できる
ものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーＷ
３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒ
ア・コリーＨＢ１０１、エシェリヒア・コリーＪＭ１０
９、エシェリヒア・コリーＸＬＩ−Ｂｌｕｅなどを用い
ることができる。宿主微生物に組換えベクターを移入す
る方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コ
リーの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセ
ル法やエレクトロポレーション法などが用いることがで
きる。

【００１５】このようにして得られた形質転換体である
微生物は、栄養培地で培養されることにより、３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素を安定に生産し得る。宿主微生物
への目的組換えベクターの移入の有無についての選択
は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マ
ーカーと３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を同時に発
現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカ
ーに基づく選択培地で生育し、且つ３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素を生成する微生物を選択すれば良い。

【００１６】上記の方法により得られた３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列は、市販のＤＮＡ配列
解析装置及び専用試薬を用いる事により解読可能で有
る。また３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のアミノ酸配列
は、決定した塩基配列より推定した。このようにして一
度選択された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を保
有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出さ
れ、他の微生物に移入することも容易に実施することが
できる。また、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を
保有する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法により
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子であるＤＮＡを回
収し、他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入
することも容易に実施できる。形質転換体である宿主微
生物の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して
培養条件を選択すれば良く、通常、多くの場合は液体培
養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利で
ある。培地の炭素源としては、微生物の培養に通常用い
られるものが広く使用される。宿主微生物が資化可能で
あれば良く、たとえばグルコース、シュークロース、ラ
クトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン
酸などが使用できる。窒素源としては、宿主微生物が利
用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉
エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物の
ような有機窒素化合物や、硫安、塩安のよおおうな無機
窒素化合物が使用できる。その他、リン酸塩、炭酸塩、
硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マ
ンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタ
ミンなどが必要に応じて使用できる。

【００１７】培養温度は宿主微生物が生育し、３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素を生産する範囲で適宜変更し得る
が、エシェリヒア・コリーの場合、２０〜４２℃程度で
好ましくは２５〜４０℃付近で培養可能である。培養時
間は培養条件により変動するが、３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素が最高収量に達する時期を見計らって適当な時
期に終了すれば良く、通常２０〜４８時間程度である。
培地ｐＨは宿主微生物が生育し、グリセロールキナーゼ
を生産する範囲で適宜変更し得るが、通常好ましくはｐ
Ｈ６．０〜９．０程度である。

【００１８】培養液より菌体を回収する方法は、通常、
用いられる方法により行えば良く、例えば遠心分離、濾
過などにより回収することができる。培養液中の３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素が菌体外にに分泌される場合
は、この菌体分離液を用いれば良く、下記の菌体破砕後
の方法に準じて３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を分離・
精製できる。３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が菌体内に
存在する場合は、前述したような酵素的または物理的破
砕方法により破砕抽出することができる。このようにし
て得られた粗酵素抽出液から例えば硫安沈殿により３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素画分を回収する。この粗酵素
液を通常用いるカラムクロマトグラフィーの組合わせの
ような精製方法、例えばトヨパールＨＷ６５Ｃ（東ソ
ー）カラムクロマトグラフィー、ＤＥＡＥトヨパール
（東ソー）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製
し精製酵素標品を得ることができる。

【００１９】本発明の製法により得られた３−ヒドロキ
シ酪酸脱水素酵素活性を有するタンパク質は、以下に示
す理化学的性質を有する。作用：３−ヒドロキシ酪酸＋ＮＡＤ ←→ アセト酢酸
＋ＮＡＤＨ至適ｐＨ：約１０．０（Britton and Robinson buffer
）至適温度：約３７〜４０℃（１００ｍＭＴｒｉｓ塩酸，
ｐＨ８．５） pH安定性：約６．５〜１．０（３７℃で６時間後も９０
％以上の残存活性を示す範囲）熱安定性：約３７℃以下（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液５０ｍＭｐＨ６．５で１５分間処理後もほぼ１００
％の残存活性を示す範囲）分子量：約２６，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の活性
は、以下のようにして測定した。０．８５ｍｌの酵素活
性測定溶液（２ｍＭＮＡＤを含む１００ｍＭＴｒｉｓ
塩酸緩衝液，ｐＨ８．５）に０．０５ｍｌの酵素溶液を
加え、３７℃で約５分間予備加温する。次いで２５ｍＭ
ＤＬ−３−ヒドロキシ酪酸溶液０．１ｍｌを加えよく
混合する。本反応混液をキュベットに移し、水を対照に
３７℃に制御された分光光度計で正確に２分間３４０ｎ
ｍの吸光度変化を測定し、１分間当りの吸光度変化量を
求める（ΔODtest）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希
釈液（０．１％牛血清アルブミンを含む１００ｍＭトリ
ス塩酸，ｐＨ８．５）を０．１ｍｌ加え上記同様に操作
を行って１分間当りの吸光度変化量を求めた（ΔODblan
k）。酵素活性の定義は上記条件で１分間に１マイクロ
モルの３−ヒドロキシ酪酸を酸化する酵素量１単位
（Ｕ）とした。また測定した酵素活性は下記計算式によ
り算出した。活性値(U/ml)＝｛ΔOD/min(ΔODtest-ΔODblank)×1.0
(ml)×希釈倍率｝／｛6.22×1.0(cm)×0.1(ml)｝ 1.0ml＝反応混液液量 6.22＝NADHのミリモル吸光係数 1.0cm＝セルの光路長 0.1ml＝酵素サンプル液量

【００２１】［参考例］シュードモナスエスピーＴ
Ｅ３１９２（FERM BP-8049）からの３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素の精製シュードモナスエスピーＴＥ３１９２（FERM BP-80
49）の１白金耳をＬＢ液体培地（６０ｍｌ仕込み／５０
０ｍｌ容坂口フラスコ；１．０％ポリペプトン、０．５
％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）植菌
し、３０℃で２４時間しんとう培養する。該培養液の全
量を６Ｌの生産培地（１０Ｌジャーファーメンター；
１．０％ポリペプトン、０.３％酵母エキス、１．０％
グルコース、０．５％リン酸２カリウム、アデカノール
０．０５％）へ植菌し、３０℃にて２４時間通気攪拌培
養を実施した。この時の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
の培養液あたり生産量はおよそ０．２Ｕ／ｍｌであっ
た。本培養液より遠心分離にて菌体を回収し、１ｍＭの
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．
５に懸濁したのち、ダイノミル破砕機により菌体を破砕
し粗酵素液とした。次いで、粗酵素液に硫安を添加し３
０〜６０％飽和度の画分を回収した。この３−ヒドロキ
シ酪酸脱水素酵素を含む画分を１ｍＭＥＤＴＡを含む
１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で緩衝化した
セファデックスＧ―２５（アマシャムバイオサイエンス
製）ゲル濾過により脱塩した。この酵素液を脱塩時と同
じ緩衝液にて緩衝化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６
Ｂ（アマシャムバイオサイエンス製）カラムクロマトグ
ラフィーにアプライし、０〜０．２ＭのＮａＣｌリニア
グラジェントにより溶出し３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素活性を有する画分を回収した。更にこの酵素液に６０
％飽和度硫安を添加し沈殿として３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素を遠心分離により回収し、上記緩衝液に再溶解
した。この酵素液をセファデックスＧ―２５ゲル濾過に
より脱塩した後、再度ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ
カラムクロマトグラフィーにアプライした。溶出は０〜
０．２ＭのＮａＣｌリアグラジェントで行い、溶出液の
タンパク濃度と３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を確
認し最も比活性の高い画分を回収した。本法により全工
程収率約１５％で精製酵素標品が取得でき、回収された
精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥでほぼ単一のバンドを
示した。この精製酵素標品のＮ末端配列を全自動タンパ
ク質一時構造分析装置（型番ＰＰＳＱ−１０；島津製作
所製）により分析した。その配列はＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａ
ｌ−Ｔｈｒ―Ｇｌｙ−Ｓｅｒ―Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ
と確認された。

【００２２】［実施例１］シュードモナスエスピー
ＴＥ３１９２（FERM BP-8049）からの染色体ＤＮＡの
分離シュードモナスエスピーＴＥ３１９２（FERM BP-80
49）の染色体ＤＮＡは次の方法で分離した。該菌株をＬ
Ｂ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管；１．０
％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、３０℃にて一晩振
とう培養した。この菌体１ｍｌ分から遠心分離（１２０
００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。
回収した菌体よりMagExtractor-genom-キット（東洋紡
績製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染
色体ＤＮＡを抽出した。１ｍｌの菌体より約２０μｇの
染色体ＤＮＡを取得できた。

【００２３】［実施例２］ポリメラーゼチェーンリア
クション（ＰＣＲ）ＰＣＲ用プライマーは、参考例により決定されたＮ末端
アミノ酸配列と現在クローニングの報告がされているシ
ュードモナスエルギノーサ及びシュードモナスプチダ
の塩基配列を基にして作成した。その配列は配列表・配
列番号３と配列表・配列番号４に記載した。なお、配列
番号３のプライマーには制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列、
配列番号４のプライマーにはＨｉｎｄＩＩＩの認識配列
を導入した。実施例１で得たＤＮＡ１００ｎｇ、各プラ
イマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合液５μｌ、反応緩衝
液５μｌ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）
２．５Ｕ、５％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯを混和し５０μｌと
した。これを９５℃、３０秒間の変性反応、５５℃、１
分間のアニーリング反応、および７２℃、１分間の伸長
反応を２５サイクル繰り返してＰＣＲを行った。その結
果、目的の大きさである約７７０ｂｐのフラグメントが
増幅された。このＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、シュ
ードモナスエルギノーサ、シュードモナスプチダの
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列と比較
したところ、高い相同性を示した。またその配列は開始
コドンから終始コドンまでのオープンリーディングフレ
ーム全長をコードしており、目的の３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素遺伝子が増幅されたことが明らかとなった。
決定したＤＮＡ配列及びＤＮＡ配列より推定されるアミ
ノ酸配列を配列表配列番号２に示した。ＤＮＡ配列より
推定されるアミノ酸配列から求められる３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素の分子量は２６２１４であった。

【００２４】［実施例３］３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素をコードする遺伝子を含有する組換えベクターの作成
及び形質転換体の作成実施例２で取得したＰＣＲ産物である３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片０．５μgを制限
酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩ（東洋紡製）にて切断した。一方、ｐＫＫ２２３−
３（アマシャムバイオサイエンス製）1μgを同じ制限酵
素にて切断し、アガロースゲル電気泳動により分離し、
大断片をMagExtractor -PCR&Gel Clean up-キット（東
洋紡績製）を用いて回収した。次いで両DNAをLigation
highキット（東洋紡績製）にて１６℃，１時間反応させ
連結した後、エシェリヒアコリーＪＭ１０９のコンピテ
ントセル（東洋紡績製）を形質転換した。形質転換体は
１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布
し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。なお
この組換えベクターはｐＢＤＨ／ＫＫと命名した。

【００２５】［実施例４］３−ヒドロキシ酪酸脱水素
酵素遺伝子の配列決定ｐＢＤＨ／ＫＫにサブクローニングされたＰＣＲ産物の
塩基配列はｐＫＫ２２３−３の配列を基に作成したシー
クエンシング用プライマーを用い、ビッグダイターミネ
ーターサイクルシーケンシングFSレディーリアクション
キット（アプライドバイオシステムズ社製）及びABI P
RISM310 Genetic Analyzer（パーキンエルマー社製）に
より挿入ＤＮＡの両端よりＤＮＡ配列を決定した。決定
したＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を、シュー
ドモナスエルギノーサ、シュードモナスプチダの３
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子のＤＮＡ配列と比較
したところ、高い相同性を示した。またその配列は開始
コドンから終始コドンまでのオープンリーディングフレ
ーム全長をコードしており、目的の３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素遺伝子が増幅されたことが明らかとなった。
決定したＤＮＡ配列及びＤＮＡ配列より推定されるアミ
ノ酸配列を配列表配列番号２に示した。ＤＮＡ配列より
推定されるアミノ酸配列から求められる３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素の分子量は２６２１４であった。［実施例５］形質転換体からの３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素の製造実施例３で得られた形質転換体エシェリヒア・コリーＪ
Ｍ１０９（ｐＨＢＤ／ＫＫ）を１００ｍｌのＬＢ液体培
地（５００ｍｌ容坂口フラスコ；１．０％ポリペプト
ン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１００μ
ｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．４）４本にそれぞれ１
白金耳植菌し３０℃、１６時間培養し種培養液とした。
この培養液を２０ＬのＮ−ブロス（３０Ｌジャーファー
メンター；１％肉エキス、１％ポリペプトン、０．５％
ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に全量植菌し、３７℃で１６時
間通気攪拌培養を行った。培養終了時の培養液の３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素の生産性は約０．５Ｕ／ｍｌで
あった。遠心分離により菌体を回収した後を２０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。ダイノミル
で菌体を破砕して粗酵素液を取得した。この粗酵素液に
対し４０％飽和度になるよう硫安を添加し不溶化する夾
雑物を遠心分離により除去した。この遠心上清液を４０
％飽和硫安を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）で平衡化したトヨパールＨＷ６５Ｃカラムにか
け、４０〜０％の硫安濃度勾配によって溶出を行い３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性画分回収した。回収した
活性画分をセファデックスＧ−２５ゲルろ過により脱塩
し、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化
したＤＥＡＥ−トヨパールカラムにアプライし、０〜
０．７ＭＮａＣｌの濃度勾配によって溶出を行い３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性画分を回収した。本法に
より分離・精製された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を
精製酵素表品として以後の検討に使用した。

【００２６】［実施例６］組換え３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素の酵素特性実施例５で取得した精製酵素標品を用いて酵素特性の確
認を実施した。（１）作用：３−ヒドロキシ酪酸＋ＮＡＤ ←→ アセ
ト酢酸＋ＮＡＤＨ（２）至適ｐＨ：約８〜８．５図１（３）至適温度：約３７〜４０℃（１００ｍＭＴｒｉｓ
塩酸，ｐＨ８．５）図２（４）pH安定性：約８〜８．５図３（５）熱安定性：約３７℃以下（５０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液５０ｍＭｐＨ６．５で１５分間処理後もほぼ
１００％の残存活性を示す範囲）図４（６）分子量：約２６，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（７）Ｋｍ値：約０．７ｍＭ（３−ヒドロキシ酪酸）、
０．０７ｍＭ（ＮＡＤ）

【００２７】

【発明の効果】本発明により、安定性の良好な新規３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子が単離さ
れ、遺伝子組換え技術による該酵素の製造法が確立さ
れ、ケトン体定量への利用が可能となった。

【００２８】

【配列表】 <110> Toyo Boseki Kabushiki Kaisya <120> 新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子及び新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法 <130> 02-0421 <141> 2002-05-29 <160> 4 <170> PatentIn version 2.1 <210> 1 <211> 255 <212> PRT <213> Pseudomanas sp.TE3192 （FERM BP-8049） <400> 1 Met Leu Lys Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ile 1 5 10 15 Gly Leu Gly Ile Ala Thr Ala Leu Ala Ala Gln Gly Ala Asp Ile Val 20 25 30 Leu Asn Gly Phe Gly Asp Ala Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ala Gly Leu 35 40 45 Ala Ala Gln His Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp Gly Ala Asp Leu Ser 50 55 60 Lys Gly Glu Ala Val Arg Gly Leu Val Asp Asn Ala Val Arg Gln Met 65 70 75 80 Gly Arg Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln His Thr Ala 85 90 95 Leu Ile Glu Asp Phe Pro Thr Glu Lys Trp Asp Ala Ile Leu Ala Leu 100 105 110 Asn Leu Ser Ala Val Phe His Gly Thr Ala Ala Ala Pro His Met Arg 115 120 125 Ala Ser Trp Gly Arg Ile Ile Asn Ile Ala Ser Ala His Gly Leu Val 130 135 140 Ala Ser Ala Asn Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val 145 150 155 160 Gly Phe Thr Lys Val Thr Pro Leu Glu Thr Ala Gly Gln Gly Ile Thr 165 170 175 Ala Asn Ala Ile Cys Pro Gly Trp Val Leu Thr Pro Leu Val Gln Lys 180 185 190 Gln Ile Asp Ala Arg Ala Glu Gly Gly Ser Pro Glu Gln Ala Ile His 195 200 205 Asp Leu Leu Ala Glu Lys Gln Pro Ser Leu Ala Phe Val Thr Pro Glu 210 215 220 Gln Leu Gly Gly Leu Thr Leu Phe Leu Cys Ser Glu Ala Ala Asp Gln 225 230 235 240 Val Arg Gly Ala Ala Trp Asn Met Asp Gly Gly Trp Val Ala Gln 245 250 255

【００２９】 <210> 2 <211> 765 <212> DNA <213> Pseudomanas sp.TE3192 （FERM BP-8049） <400> 2 ATG CTG AAA GGC AAG GTC GCC CTG GTC ACC GGT TCT ACC AGC GGG ATT 48 Met Leu Lys Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ile 1 5 10 15 GGC CTG GGT ATC GCC ACC GCG CTG GCC GCG CAG GGC GCC GAT ATC GTC 96 Gly Leu Gly Ile Ala Thr Ala Leu Ala Ala Gln Gly Ala Asp Ile Val 20 25 30 CTG AAC GGC TTC GGC GAC GCC GCC GAG ATC GAA AAG GCG GCC GGC CTG 144 Leu Asn Gly Phe Gly Asp Ala Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ala Gly Leu 35 40 45 GCC GCC CAG CAT GGC GTC AAG GTG CTG TAC GAC GGC GCC GAC CTG TCC 192 Ala Ala Gln His Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp Gly Ala Asp Leu Ser 50 55 60 AAG GGC GAG GCC GTG CGC GGC CTG GTC GAC AAC GCG GTG CGC CAG ATG 240 Lys Gly Glu Ala Val Arg Gly Leu Val Asp Asn Ala Val Arg Gln Met 65 70 75 80 GGC CGC ATC GAC ATC CTG GTC AAC AAC GCC GGC ATC CAG CAC ACC GCG 288 Gly Arg Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln His Thr Ala 85 90 95 CTG ATC GAG GAC TTT CCC ACC GAA AAA TGG GAC GCC ATC CTG GCG CTG 336 Leu Ile Glu Asp Phe Pro Thr Glu Lys Trp Asp Ala Ile Leu Ala Leu 100 105 110 AAC CTG TCG GCC GTG TTC CAT GGC ACC GCC GCC GCC CCG CAC ATG AGG 384 Asn Leu Ser Ala Val Phe His Gly Thr Ala Ala Ala Pro His Met Arg 115 120 125 GCT TCG TGG GGG CGC ATC ATC AAC ATC GCC TCG GCG CAC GGC CTG GTG 432 Ala Ser Trp Gly Arg Ile Ile Asn Ile Ala Ser Ala His Gly Leu Val 130 135 140 GCC TCG GCC AAC AAG TCG GCC TAC GTG GCC GCC AAG CAC GGC GTG GTG 480 Ala Ser Ala Asn Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val 145 150 155 160 GGC TTC ACC AAG GTG ACC CCG CTG GAA ACC GCC GGC CAG GGC ATC ACC 528 Gly Phe Thr Lys Val Thr Pro Leu Glu Thr Ala Gly Gln Gly Ile Thr 165 170 175 GCC AAC GCC ATC TGC CCG GGC TGG GTT TTG ACC CCG TTG GTG CAG AAA 576 Ala Asn Ala Ile Cys Pro Gly Trp Val Leu Thr Pro Leu Val Gln Lys 180 185 190 CAG ATC GAC GCT CGT GCT GAA GGC GGC TCG CCC GAA CAG GCG ATC CAT 624 Gln Ile Asp Ala Arg Ala Glu Gly Gly Ser Pro Glu Gln Ala Ile His 195 200 205 GAC CTG CTG GCG GAA AAG CAA CCC TCG CTG GCC TTC GTC ACC CCC GAG 672 Asp Leu Leu Ala Glu Lys Gln Pro Ser Leu Ala Phe Val Thr Pro Glu 210 215 220 CAA CTC GGC GGA CTG ACG CTG TTC CTT TGC AGC GAA GCC GCC GAC CAG 720 Gln Leu Gly Gly Leu Thr Leu Phe Leu Cys Ser Glu Ala Ala Asp Gln 225 230 235 240 GTG CGC GGC GCG GCC TGG AAC ATG GAT GGC GGC TGG GTG GCG CAG 765 Val Arg Gly Ala Ala Trp Asn Met Asp Gly Gly Trp Val Ala Gln 245 250 255

【００３０】 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> artificial DNA <400> 3 CCCGAATTCA TGCTGAAAGG CAAGGT 26

【００３１】 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> artificial DNA <400> 4 GGGAAGAAGC TTCTACTGCG CCACCCAGCC 30

【図面の簡単な説明】

【図１】至適ｐＨのグラフ

【図２】至適温度のグラフ

【図３】ｐＨ安定性のグラフ

【図４】熱安定性のグラフ

【図５】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を利用するケト
ン体の測定方法

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/32 5/00 Ａ (72)発明者ＮＩＫＡＺＭＩＢＩＮＮＩＫＭＡＮＭＯＯＤ長崎県長崎市文教町12番１号リッチ文教 202号 (72)発明者伊藤潔長崎県長崎市梁川町19番１−702号 (72)発明者芳本忠長崎県長崎市滑石２丁目29番10号Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA03 HA09 HA12 4B050 CC01 CC03 DD02 FF11E FF12E LL03 4B063 QA18 QQ03 QQ64 QQ83 QR04 QR41 QR42 QR57 QR65 QX01 4B065 AA26X AA41Y AB01 AC14 BA01 BD01 BD14 CA28 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
である、細菌由来の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコ
ードする遺伝子。（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を
有するタンパク質
【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
である、細菌由来の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列か
らなる３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を有するタン
パク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなる３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を有するタ
ンパク質
【請求項３】請求項１記載の３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】請求項３記載の組換えベクターで宿主細
胞を形質転換した形質転換体。
【請求項５】請求項４記載の形質転換体を培養し、３
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生成させ、該３−ヒドロ
キシ酪酸脱水素酵素を採取することを特徴とする３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。
【請求項６】請求項２記載の３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素を含有するケトン体の測定用組成物
【請求項７】請求項２記載の３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素を用いるケトン体の測定方法