JP2003322650A - High sensitivity detection technology using concentration - Google Patents
High sensitivity detection technology using concentrationInfo
- Publication number
- JP2003322650A JP2003322650A JP2002128402A JP2002128402A JP2003322650A JP 2003322650 A JP2003322650 A JP 2003322650A JP 2002128402 A JP2002128402 A JP 2002128402A JP 2002128402 A JP2002128402 A JP 2002128402A JP 2003322650 A JP2003322650 A JP 2003322650A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- array
- gel
- substance
- target substance
- bio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title abstract description 13
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims abstract description 91
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 68
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 48
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims description 17
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 239000010408 film Substances 0.000 claims description 8
- 239000010409 thin film Substances 0.000 claims description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 abstract description 106
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 52
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 41
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- SOGAXMICEFXMKE-UHFFFAOYSA-N Butylmethacrylate Chemical compound CCCCOC(=O)C(C)=C SOGAXMICEFXMKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000881 Cu alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N Methyl acrylate Chemical compound COC(=O)C=C BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 2
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007769 metal material Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229920002818 (Hydroxyethyl)methacrylate Polymers 0.000 description 1
- KGRVJHAUYBGFFP-UHFFFAOYSA-N 2,2'-Methylenebis(4-methyl-6-tert-butylphenol) Chemical compound CC(C)(C)C1=CC(C)=CC(CC=2C(=C(C=C(C)C=2)C(C)(C)C)O)=C1O KGRVJHAUYBGFFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMSGUKVDXXTJDQ-UHFFFAOYSA-N 4-(2-naphthalen-1-ylethylamino)-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCNC(=O)CCC(=O)O)=CC=CC2=C1 CMSGUKVDXXTJDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- JIGUQPWFLRLWPJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acrylate Chemical compound CCOC(=O)C=C JIGUQPWFLRLWPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710107035 Gamma-glutamyltranspeptidase Proteins 0.000 description 1
- 101710173228 Glutathione hydrolase proenzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000028180 Glycophorins Human genes 0.000 description 1
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 1
- CNCOEDDPFOAUMB-UHFFFAOYSA-N N-Methylolacrylamide Chemical compound OCNC(=O)C=C CNCOEDDPFOAUMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 229910006404 SnO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- LXEKPEMOWBOYRF-UHFFFAOYSA-N [2-[(1-azaniumyl-1-imino-2-methylpropan-2-yl)diazenyl]-2-methylpropanimidoyl]azanium;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC(=N)C(C)(C)N=NC(C)(C)C(N)=N LXEKPEMOWBOYRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003452 antibody preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006229 carbon black Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- SUPCQIBBMFXVTL-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)C(C)=C SUPCQIBBMFXVTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001038 ethylene copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088644 n,n-dimethylacrylamide Drugs 0.000 description 1
- YLGYACDQVQQZSW-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylprop-2-enamide Chemical compound CN(C)C(=O)C=C YLGYACDQVQQZSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AADPGYDUTSGSMI-UHFFFAOYSA-N n-(1-hydroxypropyl)prop-2-enamide Chemical compound CCC(O)NC(=O)C=C AADPGYDUTSGSMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JAOBQCFEUPZDQN-UHFFFAOYSA-N n-[2-(1-hydroxyethoxy)ethyl]prop-2-enamide Chemical compound CC(O)OCCNC(=O)C=C JAOBQCFEUPZDQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- PNJWIWWMYCMZRO-UHFFFAOYSA-N pent‐4‐en‐2‐one Natural products CC(=O)CC=C PNJWIWWMYCMZRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920005749 polyurethane resin Polymers 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002803 thermoplastic polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体関連物質とハイブリダイズした目的物質
を高感度にかつ低ノイズで検出する方法を提供するこ
と。
【解決手段】 生体関連物質が固定化されたゲルの配列
体に試料を添加して、該生体関連物質と該試料に含まれ
る検出の目的物質とのハイブリダイゼーション反応を行
い、反応した目的物質を濃縮し、濃縮された目的物質を
検出することを特徴とする目的物質の検出方法。
(57) [Problem] To provide a method for detecting a target substance hybridized with a biological substance with high sensitivity and low noise. SOLUTION: A sample is added to an array of gels on which a bio-related substance is immobilized, and a hybridization reaction between the bio-related substance and a detection target substance contained in the sample is performed. A method for detecting a target substance, comprising concentrating and detecting the concentrated target substance.
Description
【０００１】[0001]
【発明が属する技術分野】本発明は、生体関連物質とハ
イブリダイズする目的物質を検出する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting a target substance that hybridizes with a biological substance.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、種々の生物ゲノムのＤＮＡ解析が
進められており、ヒトゲノムについても、その塩基配列
が急速に明らかにされつつある。決定された塩基配列
は、その塩基配列が持つ意味、すなわち遺伝子の機能が
解明されてはじめて有用な情報となる。2. Description of the Related Art In recent years, DNA analysis of various organism genomes has been advanced, and the nucleotide sequence of the human genome is being clarified rapidly. The determined base sequence becomes useful information only after the meaning of the base sequence, that is, the function of the gene is elucidated.
【０００３】遺伝子の機能を解明するためには、生物個
体間における遺伝子の塩基配列の差や細胞内での発現頻
度などを高速かつ経済的に計測する技術が重要である。
従来、細胞内での遺伝子発現頻度の解析は、細胞から抽
出したｍＲＮＡをゲル電気泳動でサイズごとに分画後、
分画されたｍＲＮＡをゲルから膜に転写し、この膜に調
べたい遺伝子の一部を含みかつ放射性物質等で標識され
たプローブをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした
標識プローブの量に基づいて細胞の目的遺伝子の量を測
定する、いわゆるノーザン法などにより行われていた。
しかし、この方法では、適用しうる遺伝子の数に限度が
あり、細胞内で発現している多種類の遺伝子を一括して
解析することは困難であった。In order to elucidate the function of a gene, a technique for measuring the difference in the base sequence of the gene between individual organisms and the expression frequency in cells at high speed and economically is important.
Conventionally, the analysis of gene expression frequency in cells has been carried out by fractionating mRNA extracted from cells by size by gel electrophoresis,
Transfer the fractionated mRNA from the gel to a membrane, hybridize a probe containing a part of the gene to be examined and labeled with a radioactive substance, etc. on the membrane, and based on the amount of the labeled probe hybridized, The so-called Northern method was used to measure the amount of the target gene.
However, with this method, the number of applicable genes is limited, and it has been difficult to collectively analyze multiple types of genes expressed in cells.
【０００４】そのような状況の中で、多数の遺伝子を一
括して解析することができるＤＮＡマイクロアレイ法
（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい方法が開発され、
注目を集めている。ノーザン法とマイクロアレイ法を比
較すると、原理的には核酸間のハイブリダイゼーション
反応に基づく点で同じであるが、マイクロアレイ法では
マイクロアレイまたはチップと呼ばれる平面基盤片上
に、多数のＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたもの
を用いる点でノーザン法とは異なる。マイクロアレイ上
に核酸を固定化する方法としては、化学的または物理的
に修飾した基板上に核酸をスポッティング固定化する方
法（米国特許第5,700,637号）、直接固相合成法（Scien
ce 270, 467-470(1995)；米国特許第5,445,934号、米国
特許第5,774,305号）などが開発されている。しかし、
スポッティング固定化法は、単位面積あたりのスポット
可能な数（スポット密度）及びスポットあたりに固定化
できる核酸の量が直接固相合成法と比較して少なく、一
方、直接固相合成法では、固定化しうる核酸が短鎖の核
酸に限られていた。Under such circumstances, a new method called a DNA microarray method (DNA chip method) capable of collectively analyzing a large number of genes was developed,
It is getting attention. Comparing the Northern method and the microarray method, they are basically the same in that they are based on a hybridization reaction between nucleic acids, but in the microarray method, a large number of DNA fragments are densely arrayed on a planar base piece called a microarray or chip. It differs from the Northern method in that it uses a fixed one. As a method of immobilizing nucleic acid on a microarray, a method of spotting and immobilizing nucleic acid on a chemically or physically modified substrate (US Pat. No. 5,700,637) or direct solid phase synthesis method (Scien)
ce 270, 467-470 (1995); US Pat. No. 5,445,934, US Pat. No. 5,774,305) and the like have been developed. But,
In the spotting immobilization method, the number of spots per unit area (spot density) and the amount of nucleic acid that can be immobilized per spot are smaller than those in the direct solid-phase synthesis method. The nucleic acids that can be turned into were limited to short-chain nucleic acids.
【０００５】最近では、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭ
ＭＡ）等の透明樹脂製板状物上に設けられた多数の凹部
にキャプチャープローブを配置したもの（特開2000-605
54号公報）、多数の貫通孔を有するシート物の貫通孔部
にキャプチャープローブを配置したもの（WO95/11755号
公報、WO 99/55460号、特開2000-78998号公報）、また
中空繊維等の管状体の中空部にキャプチャープローブを
配置したものを束ねて薄片化したもの（WO99/13311号公
報、WO99/19711号公報、WO00/40942号公報）が提案され
ている。これらのＤＮＡチップにおいて、キャプチャー
プローブは中空繊維の中空部の内表面に直接保持され、
またはポリアクリルアミド架橋体等と水を含むゲル状物
を介して中空部内に保持されている。これらの従来技術
のうち中空繊維を用いるものは同じ形態のＤＮＡチップ
を大量生産できることから、生産コストの低減が期待さ
れている。Recently, polymethylmethacrylate (PM
(MA) or the like in which a capture probe is arranged in a large number of recesses provided on a plate-shaped object made of transparent resin (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-605).
54), a sheet having a large number of through holes, and a capture probe arranged in the through holes (WO95 / 11755, WO 99/55460, JP 2000-78998), hollow fibers, etc. There is proposed a tubular body in which a capture probe is arranged in the hollow portion and bundled into thin pieces (WO99 / 13311, WO99 / 19711, WO00 / 40942). In these DNA chips, the capture probe is directly held on the inner surface of the hollow portion of the hollow fiber,
Alternatively, it is held in the hollow portion via a gel-like material containing a crosslinked polyacrylamide or the like and water. Among these conventional techniques, those using hollow fibers are capable of mass-producing DNA chips of the same form, and therefore, reduction in production cost is expected.
【０００６】特開2000-60554号公報においては、ゲルを
配列した樹脂板に電極を具備して、ＤＮＡのハイブリダ
イゼーションを加速する目的、及び、フリーのＤＮＡを
電気泳動で除去する目的で用いている。しかしながら、
この方法では、検出時に、ゲル全域からの信号をＣＣＤ
カメラで直接検出する方法をとっているため、どの信号
にもゲル領域のノイズが含まれることになり、高感度な
検出は困難であった。従って、ハイブリダイゼーション
反応を利用した目的物質の検出を、さらに高感度にかつ
ノイズなく行う方法が望まれていた。[0006] In Japanese Patent Laid-Open No. 2000-60554, a resin plate on which a gel is arranged is equipped with an electrode to accelerate the hybridization of DNA and to remove free DNA by electrophoresis. There is. However,
In this method, signals from the entire gel are detected by the CCD at the time of detection.
Since the method of direct detection with a camera is adopted, noise in the gel region is included in every signal, making it difficult to detect with high sensitivity. Therefore, there has been a demand for a method of detecting a target substance using a hybridization reaction with higher sensitivity and without noise.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、生体関連物
質とハイブリダイズした目的物質を高感度にかつ低ノイ
ズで検出する方法を提供することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a method for detecting a target substance hybridized with a bio-related substance with high sensitivity and low noise.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、生体関連物質が固
定化されたゲルの配列体において、添加した試料中に含
まれる目的物質と該生体関連物質とをハイブリダイズさ
せ、反応した目的物質を濃縮した後に、その目的物質を
検出することによって、該目的物質の検出感度が向上
し、ノイズも低減することを見出し、本発明を完成する
に至った。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found that in an array of gels on which bio-related substances are immobilized, the target substance contained in the added sample The present invention was found to improve the detection sensitivity of the target substance by reducing the noise by detecting the target substance after the reacted target substance is concentrated by hybridizing It came to completion.
【０００９】すなわち、本発明は、生体関連物質が固定
化されたゲルの配列体に試料を添加して、該生体関連物
質と該試料に含まれる検出の目的物質とのハイブリダイ
ゼーション反応を行い、反応した目的物質を濃縮し、濃
縮された目的物質を検出することを特徴とする目的物質
の検出方法である。That is, according to the present invention, a sample is added to a gel array on which a biological substance is immobilized, and a hybridization reaction between the biological substance and a target substance for detection contained in the sample is carried out, A method of detecting a target substance, which comprises concentrating a reacted target substance and detecting the concentrated target substance.
【００１０】上記検出方法においては、濃縮を、配列体
に電気を印加することにより行うことができる。また電
気の印加は、例えば電極を介して行う手法が例示され
る。その電極としては、光透過性の薄膜電極からなるも
のが好ましく、例えばＩＴＯ電極が挙げられる。従っ
て、電極のうち少なくとも１つがＩＴＯ電極であること
が特に好ましい。In the above detection method, the concentration can be performed by applying electricity to the array. Moreover, the method of applying electricity is exemplified by, for example, an electrode. As the electrode, an electrode made of a light-transmitting thin film electrode is preferable, and for example, an ITO electrode can be mentioned. Therefore, it is particularly preferred that at least one of the electrodes is an ITO electrode.
【００１１】上記検出方法においては、濃縮した目的物
質をさらにスライドグラス又は膜に転写した後で該目的
物質を検出してもよい。また上記検出方法において、生
体関連物質としては、例えば核酸が挙げられる。In the above detection method, the target substance may be detected after the concentrated target substance is further transferred to a slide glass or a membrane. In the above detection method, examples of the biological substance include nucleic acid.
【００１２】[0012]
【発明の実施形態】以下、本発明を詳細に説明する。本
発明は、マイクロアレイなどの生体関連物質が固定化さ
れたゲルの配列体において、その生体関連物質とハイブ
リダイズする目的物質を高感度に検出する目的で、該生
体関連物質と該目的物質とのハイブリダイゼーション反
応を行い、反応した目的物質を濃縮した後で、該目的物
質を検出することを特徴とする。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will be described in detail below. The present invention relates to a gel array in which a bio-related substance is immobilized, such as a microarray, for the purpose of highly sensitively detecting a target substance that hybridizes with the bio-related substance. The method is characterized in that a hybridization reaction is performed and the reacted target substance is concentrated, and then the target substance is detected.
【００１３】生体関連物質が固定化されたゲルの配列体
は、一般的には３次元構造（立体構造）をとっており、
ゲル配列体に固定化される生体関連物質と該ゲル配列体
に添加した試料に含まれる目的物質とのハイブリダイゼ
ーション反応後は、該目的物質はゲル全体の３次元にわ
たって広範囲に存在する。本発明者は、目的物質が広範
囲に存在することによりその存在密度が低くなり、その
結果、目的物質の検出感度が低下してしまうと考えた。
従って、そのように３次元的に広範囲に存在する目的物
質を、より狭い範囲の領域（例えば２次元の面）に集合
させる（これを「濃縮」という）ことにより、目的物質
をより効率的に検出でき、その結果として生体関連物質
とハイブリダイズする目的物質を高感度に検出できると
考えられる。The gel array on which the bio-related substance is immobilized generally has a three-dimensional structure (three-dimensional structure).
After the hybridization reaction between the biological substance immobilized on the gel array and the target substance contained in the sample added to the gel array, the target substance exists in a wide range over the three dimensions of the entire gel. The present inventor considered that the presence of the target substance in a wide range reduces the density of the target substance, and as a result, the detection sensitivity of the target substance decreases.
Therefore, by collecting the target substances existing in such a three-dimensionally wide range in a narrower area (for example, a two-dimensional surface) (this is called “concentration”), the target substances can be more efficiently produced. It is considered that the target substance that can be detected and as a result hybridizes with the biological substance can be detected with high sensitivity.
【００１４】本発明において、ゲルの配列体（以下、ゲ
ル配列体ともいう）とは、生体関連物質を固定化するた
めのゲルを充填するゲル充填部を複数配列させてなる配
列体を指す。本発明において利用可能なゲル配列体とし
ては、生体関連物質を固定化するためのゲル充填部を備
えるものであれば特に限定されるものではなく、例え
ば、特開2000-245460号公報に記載のような、配列され
た中空繊維内部に生体関連物質を固定化するためのゲル
が充填されたようなものを用いることができる。その
他、多穴プレートの穴をゲル充填部として穴の中にゲル
を充填したものや、グラスアレイや高分子のシート上に
ゲルパッドを並べ、１つのゲルパッドを１つのゲル充填
部として利用するもの、ゲルのシートを区画に区切るこ
とによりゲル充填部を作製したものなどをゲル配列体と
して用いることもできる。以下に、本発明のゲル配列体
として利用するのに好ましい例として、複数の中空繊維
を配列してなる配列体について詳細に説明する。In the present invention, the gel array (hereinafter, also referred to as gel array) means an array in which a plurality of gel filling parts for filling a gel for immobilizing a biological substance are arrayed. The gel array that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it has a gel filling part for immobilizing a biological substance, for example, described in JP-A-2000-245460. It is possible to use such an array of hollow fibers in which a gel for immobilizing a bio-related substance is filled. In addition, one in which a gel of a multi-hole plate is used as a gel filling portion and gel is filled in the hole, one in which gel pads are arranged on a glass array or a polymer sheet, and one gel pad is used as one gel filling portion, It is also possible to use a gel array in which a gel-filled portion is prepared by dividing a gel sheet into compartments. Hereinafter, as a preferred example for use as the gel array of the present invention, an array comprising a plurality of hollow fibers arranged will be described in detail.
【００１５】複数の中空繊維を配列してなる配列体は、
例えば図１に示すように、中空部１１を有する複数の中
空繊維１２を備えた中空繊維配列体１０のような形をと
る。中空繊維の中空とは、繊維の内部が空洞で管状又は
ストロー状の状態を意味し、本発明においては、ゲルを
充填するためのゲル充填部１１として機能する。該配列
体で使用する中空繊維は、非多孔質であることが好まし
く、例えば、メチルメタクリレート、エチルメタクリレ
ート、ブチルメタクリレート等のメタクリレート系モノ
マー、メチルアクリレート、エチルアクリレート等のア
クリレート系モノマーの単独重合体若しくはこれらの共
重合体、ポリスチレン、ポリエチレン、ノボルネン／エ
チレン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリカ
ーボネート又はガラス等から形成されるものが挙げられ
る。An array body in which a plurality of hollow fibers are arrayed is
For example, as shown in FIG. 1, a hollow fiber array 10 having a plurality of hollow fibers 12 having hollow portions 11 is formed. The hollow of the hollow fiber means a tubular or straw-like state in which the inside of the fiber is hollow, and in the present invention, it functions as the gel filling portion 11 for filling the gel. The hollow fibers used in the array are preferably non-porous, and include, for example, methacrylate-based monomers such as methyl methacrylate, ethyl methacrylate and butyl methacrylate, homopolymers of acrylate-based monomers such as methyl acrylate and ethyl acrylate, or Examples thereof include those formed from these copolymers, polystyrene, polyethylene, nobornene / ethylene copolymer, polyethylene terephthalate, polycarbonate or glass.
【００１６】上述するような中空繊維配列体を得るべく
繊維を所定の間隔をもって平行に配列させる。また単位
面積あたりのゲル充填部の数を多くするために、中空繊
維の外径が、１ｍｍ以下であることが好ましく、０．３
ｍｍ以下であることがより好ましい。In order to obtain the hollow fiber array body as described above, the fibers are arrayed in parallel at a predetermined interval. Further, in order to increase the number of gel-filled parts per unit area, the outer diameter of the hollow fiber is preferably 1 mm or less, 0.3
More preferably, it is not more than mm.
【００１７】中空繊維の内壁表面は、無処理の状態でそ
のまま用いてもよいが、必要に応じて、プラズマ処理や
γ線、電子線などの放射線処理を施したものであっても
よい。さらに、中空繊維は、必要に応じて反応性官能基
を導入したものであってもよい。The inner wall surface of the hollow fiber may be used as it is without treatment, but may be subjected to plasma treatment or radiation treatment such as γ-ray or electron beam, if necessary. Further, the hollow fiber may have a reactive functional group introduced, if necessary.
【００１８】上記の通り調製された中空繊維は、複数の
中空繊維を配列してなる配列体を構成する基本単位とす
ることができる。そして、これらの中空繊維を集束した
後に接着して、繊維配列体（三次元配列体）となすこと
ができる。The hollow fiber prepared as described above can be a basic unit constituting an array body in which a plurality of hollow fibers are arrayed. Then, these hollow fibers can be bundled and then bonded to form a fiber array (three-dimensional array).
【００１９】上記の三次元配列体を、ミクロトームなど
の切片作製用の装置を用いて、繊維軸と交差する方向、
好ましくは繊維軸に対して垂直方向に切断することによ
り、中空繊維配列体断面を有する薄片（図１）を得るこ
とができる。薄片の厚みに関しては、通常１〜５０００
μｍ、好ましくは１０〜２０００μｍである。The above three-dimensional array is arranged in a direction intersecting the fiber axis by using a device for preparing a slice such as a microtome.
A thin piece (FIG. 1) having a hollow fiber array cross section can be obtained, preferably by cutting in a direction perpendicular to the fiber axis. Regarding the thickness of the flakes, usually 1 to 5000
μm, preferably 10 to 2000 μm.
【００２０】この際、中空繊維を規則的に配列し、樹脂
接着剤等で接着することにより、例えば、縦横に中空繊
維が整然と規則的に配列した三次元配列体を得ることが
できる。三次元配列体の形状は特に限定されるものでは
ないが、通常は、繊維を規則的に配列させることにより
正方形、長方形、円形、六角形、螺旋形等に形成され
る。「規則的に」とは、一定の大きさの枠の中に含まれ
る繊維の本数が一定となるように順序よく配列させるこ
とをいう。At this time, by arranging the hollow fibers regularly and adhering them with a resin adhesive or the like, it is possible to obtain, for example, a three-dimensional array in which the hollow fibers are regularly arranged in the vertical and horizontal directions. The shape of the three-dimensional array is not particularly limited, but it is usually formed by arranging fibers regularly to form a square, a rectangle, a circle, a hexagon, a spiral, or the like. The term “regularly” means that fibers are arranged in order so that the number of fibers contained in a frame having a constant size is constant.
【００２１】三次元配列体は、例えば、繊維を１本ずつ
通すことができる小孔を有する道具であって配列パター
ンが多数の小孔で形成されたもの（「治具」と呼ばれ
る）に繊維を通して繊維束を作製し、その繊維束に張力
を与えた状態で繊維の間隙に樹脂を充填して固定化する
ことにより作製することができる（WO00/53739号公報を
参照）。The three-dimensional array is, for example, a tool having small holes through which fibers can be passed one by one, and the array pattern is formed by a large number of small holes (called a "jig"). A fiber bundle can be prepared by filling the gap between the fibers with a resin in a state where tension is applied to the fiber bundle and fixing the resin through the fiber bundle (see WO00 / 53739).
【００２２】所定のパターンを形成し、くり貫かれた小
孔を有する治具（多孔板）を用いる場合は、繊維を治具
の孔に通した後、該治具同士の間隔を拡げる。間隔は特
に規定されるものではなく、適宜設定すればよい。間隔
を広く採れば、三次元配列体の長尺品を成型することが
でき、薄片に切断するなどの後の工程におけるロスを少
なくすることによって製造コストを小さくすることがで
きる。但し、間隔を過度に大きく採った場合、スパン中
央付近で繊維の拘束力が低下して配列が乱れる恐れがあ
るため、そのような乱れを生じない程度に適宜調節す
る。また、スパン中央付近の配列規制を強化する目的
で、治具の個数を適宜追加してもよい。In the case of using a jig (perforated plate) having a small hole formed by forming a predetermined pattern, the fibers are passed through the holes of the jig and then the distance between the jigs is expanded. The interval is not particularly specified and may be set appropriately. If the interval is wide, a long product of the three-dimensional array can be molded, and the manufacturing cost can be reduced by reducing the loss in the subsequent steps such as cutting into thin pieces. However, if the spacing is excessively large, the restraining force of the fibers may be reduced near the center of the span and the array may be disturbed. Therefore, the spacing is appropriately adjusted so as not to cause such disorder. Further, the number of jigs may be appropriately added for the purpose of strengthening the array regulation near the center of the span.
【００２３】次いで、治具を通した全ての繊維に張力を
かけ、その状態で繊維の間隙に樹脂を充填して固定化す
る。張力は、繊維の断面形状や材質、すなわち弾性係数
や伸張率等によって異なるが、繊維が弛まずかつ破断し
ない程度とする。そして、繊維を弛み無く張った状態を
維持するため、張力を維持する。Next, tension is applied to all the fibers that have passed through the jig, and in that state, the gap between the fibers is filled with resin and fixed. Although the tension varies depending on the cross-sectional shape and material of the fiber, that is, the elastic modulus, the elongation rate, etc., the tension is such that the fiber does not sag and does not break. Then, the tension is maintained in order to maintain the tension of the fibers without slack.
【００２４】また、本発明において繊維束を固定化する
樹脂は、各繊維間の空隙への充填が容易となるよう低粘
度液状を呈し、充填及び硬化が常温で行えるもの、例え
ば、ウレタン樹脂等の２液反応硬化性樹脂が好ましい。
本発明において、三次元配列体とする繊維の本数は１０
０本以上、好ましくは５００〜１０，０００本であり、
目的に応じて適宜設定することができる。上述したよう
な中空繊維を配列してなる配列体の詳細に関しては、WO
00/53736号公報及びWO00/53739号公報を参照されたい。Further, in the present invention, the resin for fixing the fiber bundle has a low-viscosity liquid so that the voids between the fibers can be easily filled, and can be filled and cured at room temperature, for example, urethane resin. The two-part reaction curable resin of is preferable.
In the present invention, the number of fibers forming a three-dimensional array is 10
0 or more, preferably 500 to 10,000,
It can be appropriately set according to the purpose. For details of the array body in which hollow fibers are arrayed as described above, see WO
See 00/53736 and WO00 / 53739.
【００２５】本発明においては、ゲル充填部、例えば上
述した中空繊維配列体の中空部にゲルを充填する。ここ
で用いることができるゲルの種類は特に限定されず、例
えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイ
ルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノ
プロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビ
ニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、
（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の
１種類又は２種類以上と、メチレンビス（メタ）アクリ
ルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレ
ート等との多官能性単量体を共重合した架橋ゲルや、ア
ガロースなどの多糖類などからなるゲルなどが挙げられ
る。In the present invention, the gel is filled in the gel filling portion, for example, the hollow portion of the above-mentioned hollow fiber array. The type of gel that can be used here is not particularly limited, and examples thereof include acrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-acryloylaminoethoxyethanol, N-acryloylaminopropanol, N-methylolacrylamide, N. -Vinylpyrrolidone, hydroxyethyl methacrylate,
Crosslinked gel obtained by copolymerizing one or more kinds of monomers such as (meth) acrylic acid and allyldextrin with a polyfunctional monomer such as methylenebis (meth) acrylamide and polyethylene glycol di (meth) acrylate. And gels composed of polysaccharides such as agarose.
【００２６】ゲル充填部にゲルを充填するには、ゲル構
成成分であるアクリルアミド等の単量体、多官能性単量
体及び開始剤を含む液を、該ゲル充填部に注入し、重
合、ゲル化させればよい。ゲル化は、多官能性単量体の
存在下に共重合させる方法の他、多官能性単量体の非存
在下に共重合させたのち架橋剤を用いて行ってもよい。
またアガロースゲルの場合には温度降下によってゲル化
を行ってもよい。To fill the gel in the gel filling part, a liquid containing a monomer such as acrylamide as a gel constituent, a polyfunctional monomer and an initiator is injected into the gel filling part to carry out polymerization, It may be gelled. The gelation may be carried out by using a cross-linking agent after the copolymerization in the absence of the polyfunctional monomer, as well as the copolymerization in the presence of the polyfunctional monomer.
In the case of agarose gel, gelation may be carried out by lowering the temperature.
【００２７】本発明において、配列体のゲルに固定化す
る対象となる生体関連物質としては、限定するものでは
ないが、核酸、タンパク質、糖類、生細胞等が挙げられ
る。本発明に用いる生体関連物質は、市販のものでもよ
いし、又は、生細胞などから調製したり、化学的に合成
したものでもよい。In the present invention, the bio-related substances to be immobilized on the array gel include, but are not limited to, nucleic acids, proteins, saccharides and living cells. The biological substance used in the present invention may be commercially available, or may be prepared from living cells or chemically synthesized.
【００２８】本発明において生体関連物質として用いる
核酸としては、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリ
ボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げ
られる。生体関連物質として核酸を用いる場合には、公
知の方法を用いて細胞からＤＮＡやＲＮＡを調製すれば
よい。例えば、ＤＮＡを調製する公知の方法としては、
Blinらの方法（Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2
303 (1976)）等を例示することができる。また、ＲＮＡ
を調製する公知の方法としては、Favaloroらの方法（Fa
valoro et al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等
を例示することができる。生体関連物質として用いる核
酸は、これらに代表される方法を適宜使用して調製すれ
ばよい。Examples of the nucleic acid used as a biological substance in the present invention include deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), peptide nucleic acid (PNA) and the like. When a nucleic acid is used as the biological substance, a known method may be used to prepare DNA or RNA from cells. For example, known methods for preparing DNA include
Blin et al. (Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2
303 (1976)) and the like. Also, RNA
As a known method for preparing the protein, the method of Favaloro et al. (Fa
valoro et al., Methods Enzymol. 65: 718 (1980)) and the like. The nucleic acid used as the biologically relevant substance may be prepared by appropriately using the methods typified by these.
【００２９】更に、核酸としては、鎖状若しくは環状の
プラスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素に
より若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で
酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学的に合成した
オリゴヌクレオチド等を用いることもできる。Further, as the nucleic acid, a linear or circular plasmid DNA, a chromosomal DNA, a DNA fragment obtained by chemically cutting these with a restriction enzyme, a DNA synthesized with an enzyme in a test tube, or a chemically synthesized DNA fragment is used. The oligonucleotides described above can also be used.
【００３０】本発明において生体関連物質として用いる
タンパク質とは、タンパク質、ポリペプチド又はペプチ
ドなどのアミノ酸から構成されるいずれのものも意味す
る。そのアミノ酸の長さは特に限定されるものではな
く、任意のものを選択することができる。例えば、アミ
ノ酸数２〜１０個のペプチド、１１個以上のポリペプチ
ド又はタンパク質などが挙げられる。これらの物質は、
通常のペプチド合成法により得ることができる。例え
ば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無
水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾー
ル法、酸化還元法、酵素合成法などが挙げられる。ま
た、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれを
も適用することができる。In the present invention, the protein used as a biological substance means any protein composed of amino acids such as proteins, polypeptides or peptides. The length of the amino acid is not particularly limited, and any one can be selected. For example, a peptide having 2 to 10 amino acids, a polypeptide or protein having 11 or more amino acids and the like can be mentioned. These substances are
It can be obtained by a conventional peptide synthesis method. Examples thereof include an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, a carboimidazole method, a redox method, and an enzymatic synthesis method. Further, for the synthesis, both solid phase synthesis method and liquid phase synthesis method can be applied.
【００３１】縮合方法や保護基の脱離としては、公知の
いずれの手法を用いてもよい。反応後は、通常の精製
法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィ
ー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせ
て目的のペプチドを精製することができる。また、生体
内から抽出・精製することにより得ることもできる。さ
らに、遺伝子組換え手法を利用してタンパク質を生産し
て得てもよい。Any known method may be used for the condensation method and the removal of the protecting group. After the reaction, the desired peptide can be purified by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. It can also be obtained by extracting and purifying from within the living body. Further, it may be obtained by producing a protein using a gene recombination technique.
【００３２】タンパク質として抗体を用いる場合には、
当技術分野で公知の抗体作製法に従って抗体を調製する
ことができる。例えば、公知の抗体作製法としては、免
疫した動物から採取したリンパ球とミエローマ細胞とを
融合してハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマか
らモノクローナル抗体を採取する方法、遺伝子組換え手
法により抗体を産生する方法などが挙げられる。本発明
において利用可能な抗体には、ポリクローナル及びモノ
クローナル抗体、抗体フラグメント、ヒト化抗体などの
あらゆる抗体が含まれる。When an antibody is used as the protein,
Antibodies can be prepared according to antibody production methods known in the art. For example, as a known antibody preparation method, a lymphocyte collected from an immunized animal and a myeloma cell are fused to prepare a hybridoma, and a monoclonal antibody is collected from the hybridoma, or an antibody is produced by a gene recombination technique. Method etc. are mentioned. Antibodies usable in the present invention include all antibodies such as polyclonal and monoclonal antibodies, antibody fragments, humanized antibodies and the like.
【００３３】本発明において生体関連物質として用いる
糖類としては、単体である単糖類、単糖が数個（２〜１
０個）縮合したオリゴ糖、さらに多数の単糖からなる多
糖類が挙げられ、糖タンパク質も含まれる。このような
糖としては、例えばプロテオグリカン、グリコサミノグ
リカン等、あるいは、γ-グルタミルトランスペプチダ
ーゼ、ムチン、グリコホリン等の糖タンパク質が挙げら
れる。In the present invention, the saccharides used as the biologically-relevant substance include monosaccharides which are simple substances and several monosaccharides (2-1.
(0) Condensed oligosaccharides, polysaccharides composed of a large number of monosaccharides, and glycoproteins are also included. Examples of such sugars include proteoglycans, glycosaminoglycans and the like, or glycoproteins such as γ-glutamyl transpeptidase, mucin and glycophorin.
【００３４】糖の調製は、レクチンカラムを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィー、CsCl沈降平衡遠心法、
ゾーン速度沈降遠心法、液体クロマトグラフィー、疎水
性カラムクロマトグラフィー、免疫沈降法等を単独で又
は適宜組み合わせることにより行うことができる。ま
た、市販品を使用することもできる。The sugar is prepared by affinity chromatography using a lectin column, CsCl sedimentation equilibrium centrifugation method,
The zone velocity sedimentation centrifugation method, liquid chromatography, hydrophobic column chromatography, immunoprecipitation method, etc. can be used alone or in combination. Moreover, a commercial item can also be used.
【００３５】本発明において生体関連物質として用いる
生細胞としては、特に限定するものではないが、細菌、
酵母、植物細胞、動物細胞（例えばＢ細胞）などが挙げ
られる。現在、生細胞を固定化した配列体としては、例
えば、酵母を固定化した配列体における２ハイブリッド
法を利用した相互作用タンパク質の同定（Uetz, P. et
al., Nature 403, 623 (2000)）、哺乳動物由来のＢ細
胞を固定化した配列体における病原体の検出（Pescovit
z, D., Sci. Am. 282, 35 (2000)）などが報告されてお
り、生細胞を固定化した配列体にもまた本発明の検出方
法を適用可能である。The living cells used as the biological substance in the present invention are not particularly limited, but bacteria,
Yeast, plant cells, animal cells (for example, B cells) and the like can be mentioned. Currently, as an array with immobilized live cells, for example, identification of an interacting protein using the two-hybrid method in an array with immobilized yeast (Uetz, P. et.
al., Nature 403, 623 (2000)), Detection of pathogens in B cell-immobilized arrays of mammalian origin (Pescovit
z, D., Sci. Am. 282, 35 (2000)) and the like have been reported, and the detection method of the present invention can also be applied to an array in which live cells are immobilized.
【００３６】生体関連物質の固定化は、従来より公知の
方法を適宜使用することができる。本発明において生体
関連物質の「固定化」とは、生体関連物質がゲル配列体
のゲル充填部に保持されることを指す。例えば生体関連
物質の一端に重合性の官能基を導入したものを調製し、
これらと上記単量体及び重合開始剤を含む溶液をゲル充
填部内で重合ゲル化することによって実施することがで
きる。For the immobilization of the biological substance, a conventionally known method can be appropriately used. In the present invention, “immobilization” of the bio-related substance means that the bio-related substance is retained in the gel-filled portion of the gel array. For example, prepare one with a polymerizable functional group introduced into one end of a biological substance,
It can be carried out by polymerizing a solution containing these and the above-mentioned monomer and a polymerization initiator in the gel filling part.
【００３７】本発明では、生体関連物質をそのまま配列
体のゲル部分に固定してもよく、また、生体関連物質に
化学的修飾を施した誘導体や、必要に応じて変性させた
生体関連物質を固定化してもよい。例えば、生体関連物
質として核酸を用いる場合には、核酸の化学的修飾とし
ては、アミノ化、ビオチン化、ディゴキシゲニン化等が
知られており、本発明ではこれらの修飾法を採用するこ
とができる。In the present invention, the bio-related substance may be fixed as it is to the gel portion of the array, or a derivative obtained by chemically modifying the bio-related substance or a bio-related substance denatured if necessary. It may be fixed. For example, when a nucleic acid is used as a biological substance, amination, biotinylation, digoxigenation, etc. are known as the chemical modification of nucleic acid, and these modification methods can be adopted in the present invention.
【００３８】さらに、ゲル充填部に固定化された生体関
連物質に対して、例えば、熱処理、アルカリ処理、界面
活性剤処理などを施すことにより、当該生体関連物質を
変性させることができる。これに加えて、生体関連物質
を細胞、菌体などの生材料から抽出した場合には、不要
な細胞成分等を除去するといった処理を行うことも好ま
しい。なお、生体関連物質を変性する処理と、不要な細
胞成分等を除去する処理とは、別々に実施してもよい
が、同時に実施してもよい。また、これらの処理は、生
体関連物質をゲルに固定化する前に適宜実施してもよ
い。Furthermore, the biomaterial can be denatured by subjecting the biomaterial immobilized in the gel-filled portion to heat treatment, alkali treatment, surfactant treatment, or the like. In addition to this, when the biological substance is extracted from a living material such as cells or cells, it is also preferable to perform a process of removing unnecessary cell components and the like. The treatment for denaturing the bio-related substance and the treatment for removing unnecessary cell components and the like may be performed separately or simultaneously. Further, these treatments may be appropriately performed before immobilizing the biological substance on the gel.
【００３９】配列体中の各一区画（例えば、100〜1000
個のゲル充填部）に固定化されている生体関連物質の種
類は同一でもよいが、それぞれ異なる種類の生体関連物
質とすることが可能である。すなわち、本発明によれ
ば、固定化された生体関連物質の種類と配列の順序に関
しては、目的に応じて任意に設定することが可能であ
る。Each section in the array (for example, 100 to 1000)
The types of bio-related substances immobilized in individual gel filling parts may be the same, but it is possible to use different types of bio-related substances. That is, according to the present invention, it is possible to arbitrarily set the types of immobilized bio-related substances and the order of arrangement according to the purpose.
【００４０】続いて、ゲル配列体に固定化された生体関
連物質とハイブリダイズする目的物質を含む可能性のあ
る試料をゲル配列体に添加する。本発明において「ハイ
ブリダイゼーション反応」とは、当技術分野で一般的な
一本鎖の核酸どうしの相補性な塩基対間の結合による二
本鎖形成を意図するにとどまらず、その他、固定化され
た生体関連物質と試料中に含まれる目的物質とが特異的
に結合して、その結合した目的物質を検出可能であれ
ば、そのような結合反応も全て「ハイブリダイゼーショ
ン反応」という用語に包含される。特異的に結合する生
体関連物質と試料中に含まれる目的物質との組み合わせ
の例としては、限定するものではないが、ＤＮＡ−ＤＮ
Ａ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−タンパ
ク質、ＲＮＡ−タンパク質、タンパク質−タンパク質、
タンパク質−生細胞、タンパク質−化学物質（有機及び
無機化合物）、タンパク質−糖類、糖類−糖類、糖類−
化学物質などが挙げられ、それらの間の特異的な結合を
本発明においては「ハイブリダイゼーション」といい、
それらの間で特異的に結合することを「ハイブリダイズ
する」という。Then, a sample which may contain a target substance which hybridizes with the bio-related substance immobilized on the gel array is added to the gel array. In the present invention, the term “hybridization reaction” is not limited to double-strand formation by binding between complementary base pairs of single-stranded nucleic acids, which is generally used in the art, and is not limited to immobilization. When the biologically relevant substance specifically binds to the target substance contained in the sample and the bound target substance can be detected, all such binding reactions are also included in the term "hybridization reaction". It As an example of a combination of a bio-related substance that specifically binds and a target substance contained in a sample, DNA-DN is not limited.
A, DNA-RNA, RNA-RNA, DNA-protein, RNA-protein, protein-protein,
Protein-live cells, protein-chemicals (organic and inorganic compounds), protein-sugars, sugars-sugars, sugars-
Chemical substances and the like, specific binding between them is referred to as "hybridization" in the present invention,
The specific binding between them is called "hybridize".
【００４１】また「試料」とは、固定化された生体関連
物質とハイブリダイズする目的物質が含まれているかど
うかを試験しようとする試料を指し、例えば、任意の細
胞から抽出した核酸、タンパク質、ペプチド、脂質など
が挙げられる。前記の試料は化学合成により調製された
ものでも良い。また目的物質は、固定化する生体関連物
質に応じて変化するが、該生体関連物質とハイブリダイ
ズするものであればいずれの物質でもよく、例えば生体
関連物質、化学化合物、病原体などが挙げられる。The term "sample" refers to a sample to be tested for the presence of a target substance that hybridizes with the immobilized biological substance, such as nucleic acid or protein extracted from any cell, Examples include peptides and lipids. The sample may be one prepared by chemical synthesis. The target substance changes depending on the biological substance to be immobilized, but may be any substance as long as it hybridizes with the biological substance, and examples thereof include biological substances, chemical compounds, and pathogens.
【００４２】生体関連物質が固定化されたゲルの配列体
は、例えば、固定化されている生体関連物質が核酸であ
る場合には、該核酸と、添加する試料中の目的物質とを
反応させてハイブリダイゼーション反応を行い、その反
応した目的物質を検出することによって、試料中の特定
のポリヌクレオチド（目的物質）の塩基配列を確認する
ことができる。従って、本発明において、配列体のゲル
に固定化されている生体関連物質は、試料中の目的物質
を特異的に検出することができる「プローブ」として機
能する。For example, when the immobilized bio-related substance is a nucleic acid, the array of gel on which the bio-related substance is immobilized is reacted with the nucleic acid and the target substance in the sample to be added. By carrying out a hybridization reaction by using the above-mentioned method and detecting the reacted target substance, the base sequence of the specific polynucleotide (target substance) in the sample can be confirmed. Therefore, in the present invention, the bio-related substance immobilized on the gel of the array functions as a "probe" capable of specifically detecting the target substance in the sample.
【００４３】本発明の配列体の用途としては、固定化さ
れた核酸（プローブ）とハイブリダイズする試料中の核
酸を検出するための用途だけではなく、固定化された生
体関連物質と特異的に結合する試料中のタンパク質や低
分子化合物等の各種目的物質を検出するための用途など
が挙げられる。The array of the present invention can be used not only for detecting a nucleic acid in a sample that hybridizes with an immobilized nucleic acid (probe), but also specifically for an immobilized bio-related substance. Examples include applications for detecting various target substances such as proteins and low molecular weight compounds in a sample to be bound.
【００４４】固定化された生体関連物質が核酸である場
合には、試料を、核酸をプローブとして固定化した配列
体に添加し、反応させ、試料中に存在する当該核酸と相
補的な核酸とのハイブリッドを形成させ、このハイブリ
ッドを形成した核酸を検出することにより、目的とする
塩基配列を有する試料中の核酸を検出することができ
る。In the case where the immobilized biological substance is a nucleic acid, the sample is added to the immobilized array using the nucleic acid as a probe and reacted to form a nucleic acid complementary to the nucleic acid present in the sample. The nucleic acid in the sample having the target nucleotide sequence can be detected by forming the hybrid of the above and detecting the nucleic acid forming the hybrid.
【００４５】ハイブリダイゼーションの条件は、ゲル配
列体に固定化した生体関連物質の種類等により最適化す
る必要がある。すなわち、ゲル配列体に固定化した生体
関連物質が、該生体関連物質に対し特異的に結合する物
質とのみハイブリダイズする条件を設定する必要があ
る。例えば、ハイブリダーゼーションを、ゲル配列体に
固定化した核酸により行う場合、ハイブリダーゼーショ
ン及び洗浄における溶液の塩濃度（例えばＮａＣｌ、ク
エン酸三ナトリウムの濃度など）、温度、時間などを当
該核酸が相同性の高い塩基配列とのみハイブリダイズす
るように設定する。ここで、塩濃度が低いほどまた温度
が高いほど、相同性の高いハイブリッド形成を促進する
ことができる。その他の生体関連物質のハイブリダイゼ
ーション条件は、当業者であれば、生体関連物質の種
類、検出の目的、特異性の程度などに応じて適切に決定
することができる。The hybridization conditions need to be optimized depending on the type of bio-related substance immobilized on the gel array. That is, it is necessary to set conditions under which the bio-related substance immobilized on the gel array hybridizes only with a substance that specifically binds to the bio-related substance. For example, when the hybridization is carried out with a nucleic acid immobilized on a gel array, the nucleic acid may be used to determine the salt concentration of the solution (eg, NaCl, trisodium citrate concentration, etc.), temperature, time, etc. in the hybridization and washing. It is set so that it will hybridize only with highly homologous base sequences. Here, the lower the salt concentration and the higher the temperature, the more highly homologous hybrid formation can be promoted. Those skilled in the art can appropriately determine the hybridization conditions for other bio-related substances depending on the type of the bio-related substance, the purpose of detection, the degree of specificity, and the like.
【００４６】上記ハイブリダイゼーション反応（特異的
結合）後の目的物質の検出には、このような目的物質を
特異的に認識することができる公知の手段を用いること
ができる。例えば、試料中に含まれる物質（目的物質を
含む試料中の全ての成分）に、蛍光物質、発光物質など
の標識体を作用させ、この標識体を検出することができ
る。蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴ
Ｃ）、スルホローダミン（ＴＲ）、テトラメチルローダ
ミン（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅなどを用いることがで
きる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いる
ことができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法
等に関しては、何ら制限されることはなく、従来公知の
各種手段を用いることができる。To detect the target substance after the above-mentioned hybridization reaction (specific binding), known means capable of specifically recognizing such target substance can be used. For example, a labeled substance such as a fluorescent substance or a luminescent substance is allowed to act on a substance contained in the sample (all components in the sample including the target substance), and this labeled substance can be detected. Examples of the fluorescent substance include fluorescein (FIT
C), sulforhodamine (TR), tetramethylrhodamine (TRITC), CyDye and the like can be used. Further, luciferin or the like can be used as the light emitting substance. There is no limitation on the type of the labeled body, the method of introducing the labeled body, and the like, and various conventionally known means can be used.
【００４７】従って、ゲル配列体に試料を添加し、固定
化されている生体関連物質と試料に含まれる目的物質と
のハイブリダイゼーション反応を行った後、ハイブリダ
イズしていない成分を洗浄などにより除去する。その
後、ハイブリダイゼーション反応により結合した、固定
化されている生体関連物質と目的物質との複合体を解離
させる。該複合体の解離は、例えば、系全体を加温した
り、ホルムアミドなどの変性剤や、有機溶媒等を添加す
ることにより行うことができる。Therefore, after the sample is added to the gel array to carry out the hybridization reaction between the immobilized bio-related substance and the target substance contained in the sample, the non-hybridized components are removed by washing or the like. To do. Then, the complex of the immobilized bio-related substance and the target substance bound by the hybridization reaction is dissociated. The dissociation of the complex can be carried out, for example, by heating the entire system or adding a denaturing agent such as formamide, an organic solvent or the like.
【００４８】本発明においては、ハイブリダイゼーショ
ン反応後に反応した目的物質を、例えばゲル配列体の１
つの領域に濃縮することによって、該目的物質を高感度
にかつ低ノイズで検出できるようにする。目的物質を濃
縮する手法としては、配列体の厚み方向に電気を印加す
る方法（すなわち電気泳動法）、水圧をかける方法、遠
心力をかける方法などが挙げられる。In the present invention, the target substance reacted after the hybridization reaction is, for example, one of the gel arrays.
By concentrating in one region, the target substance can be detected with high sensitivity and low noise. Examples of the method for concentrating the target substance include a method of applying electricity in the thickness direction of the array (that is, an electrophoresis method), a method of applying water pressure, a method of applying a centrifugal force, and the like.
【００４９】目的物質を、いわゆる電気泳動法により濃
縮する手法について以下に詳細に説明する。電気泳動と
は、正又は負に荷電している粒子に電気を印加すると、
その荷電と反対符号の電極に向かって粒子が移動する現
象を指す。一般に、タンパク質や核酸などの高分子、細
胞小器官及び細胞などの粒子は、水中において等電点と
呼ばれる特定のｐＨ以外においては、正又は負に荷電し
ていることが知られている。従って、本発明において
は、目的物質の正又は負の荷電を利用して、電気泳動に
よりそれを濃縮することができる。A method for concentrating the target substance by so-called electrophoresis will be described in detail below. Electrophoresis means that when electricity is applied to positively or negatively charged particles,
It refers to the phenomenon that particles move toward an electrode of the opposite sign to the charge. It is generally known that polymers such as proteins and nucleic acids, particles such as organelles and cells are positively or negatively charged in water except at a specific pH called isoelectric point. Therefore, in the present invention, the positive or negative charge of the target substance can be used to concentrate it by electrophoresis.
【００５０】例えば、核酸は負に荷電していることが知
られている。またタンパク質は、そのアミノ酸組成によ
り荷電が変化するが、各アミノ酸の等電点を計算するこ
とによりタンパク質全体としての荷電を知ることができ
る。濃縮対象の目的物質がいずれに荷電するかを予測で
きないような場合には、予めその目的物質に電気を印加
し、いずれの電極に移動するかを調べてもよい。以下
に、電極を用いて濃縮工程を行う場合の好ましい例を詳
細に説明する。For example, it is known that nucleic acids are negatively charged. The charge of a protein changes depending on its amino acid composition, but the charge of the entire protein can be known by calculating the isoelectric point of each amino acid. When it is not possible to predict which of the target substances to be concentrated will be charged, electricity may be applied to the target substance in advance to check which electrode the target substance moves to. Below, a preferable example in the case of performing a concentration process using an electrode is explained in detail.
【００５１】図２及び図３は、電極を用いてゲル配列体
に電気を印加する装置を示す図であり、図２は、装置の
構造をわかりやすく示すために電極及び配列体の配置関
係を表し、図３は、実際に濃縮する時の装置の構造を表
す。なお、図２及び図３は、濃縮工程の概要を表すもの
であり、本濃縮工程の装置としては濃縮効率、装置の製
造容易性及びコスト等を考慮して適切な構造の装置を構
築すればよい。図２及び図３においては、配列体の上の
面に目的物質を濃縮するものとして説明するが、配列体
の他の面や領域に該目的物質を濃縮することも可能であ
り、以下に記載する例に限定されるものではない。2 and 3 are views showing a device for applying electricity to a gel array using electrodes, and FIG. 2 shows the arrangement relationship of the electrodes and the array in order to clearly show the structure of the device. Figure 3 shows the structure of the device when it is actually concentrated. 2 and 3 show an outline of the concentration step, and if an apparatus having an appropriate structure is constructed in consideration of concentration efficiency, easiness of manufacturing the apparatus, cost, etc., as an apparatus for the main concentration step, Good. 2 and 3, the target substance is described as being concentrated on the upper surface of the array, but it is also possible to concentrate the target substance on another surface or region of the array, which will be described below. It is not limited to the example.
【００５２】図２に示す装置は、電極となる基板２０、
基板２０と対向配置された電極となる基板２１、基板２
０と基板２１との間に電気を印加する電源２２により構
成される。基板２１は、銅や銅合金等の導電性材料であ
ればどのような金属材料でもよい。例えば、以下に記載
するように、ゲル配列体上に電極を載せたまま、目的物
質を検出する場合には、基板２１が、光透過性の薄膜材
料から作製されていることが好ましい。本発明の電極の
材料としては、透明導電膜と呼ばれる材料が、光の吸収
を防ぐために約３ｅＶ以上の禁制帯幅を有しており、か
つ抵抗率が低く、導電性が高いため、特に適していると
考えられる。そのような光透過性の薄膜材料としては、
例えば、Ｉｎ2Ｏ3：Ｓｎ膜（ＩＴＯ）、ＳｎＯ2：Ｓｂ
膜（ＮＥＳＡ）、Ｃｄ2ＳｎＯ4膜、ＺｎＯ膜などが挙げ
られる。従って、上記光透過性の薄膜材料をガラス基板
などの上に蒸着させたものを本発明の電極（基板２１）
として用いることが好ましい。一方、基板２０は、銅や
銅合金等の導電性材料であればどのような金属材料でも
よい。The apparatus shown in FIG. 2 includes a substrate 20 which becomes an electrode,
Substrate 21 and substrate 2 which are electrodes arranged opposite to substrate 20
It is composed of a power source 22 for applying electricity between 0 and the substrate 21. The substrate 21 may be any metal material as long as it is a conductive material such as copper or a copper alloy. For example, as described below, when the target substance is detected while the electrodes are placed on the gel array, the substrate 21 is preferably made of a light transmissive thin film material. As a material for the electrode of the present invention, a material called a transparent conductive film is particularly suitable because it has a forbidden band width of about 3 eV or more to prevent absorption of light, has low resistivity and high conductivity. It is thought that As such a light-transmissive thin film material,
For example, In 2 O 3 : Sn film (ITO), SnO 2 : Sb
A film (NESA), a Cd 2 SnO 4 film, a ZnO film and the like can be mentioned. Therefore, the electrode (substrate 21) of the present invention is obtained by vapor-depositing the light-transmissive thin film material on a glass substrate or the like.
It is preferable to use as. On the other hand, the substrate 20 may be any metal material as long as it is a conductive material such as copper or a copper alloy.
【００５３】基板２０及び基板２１の形状は、電極とし
て電気を印加することが可能な形状で有れば、板状、棒
状又は点状などのいずれでもよい。基板２０及び基板２
１の大きさは、ゲル配列体全体に均一に電気を印加する
ために、ゲル配列体と同じ又はゲル配列体よりも大きい
ことが好ましいが、ゲル配列体よりも小さい場合には、
基板２０及び基板２１をゲル配列体上で移動させること
によってゲル配列体全体に電気を印加することも可能で
ある。また、ゲル配列体に含まれる各ゲルの位置及び大
きさに合わせて、複数の点状の電極を配置することも可
能である。The shapes of the substrate 20 and the substrate 21 may be plate-like, rod-like or dot-like as long as they can apply electricity as electrodes. Substrate 20 and substrate 2
The size of 1 is preferably the same as or larger than the gel array in order to uniformly apply electricity to the entire gel array, but when it is smaller than the gel array,
It is also possible to apply electricity to the entire gel array by moving the substrate 20 and the substrate 21 on the gel array. It is also possible to arrange a plurality of point electrodes in accordance with the position and size of each gel contained in the gel array.
【００５４】基板２０及び２１は、電気を印加する１対
の電極として機能するため、いずれか一方をカソード電
極とし、もう一方はアノード電極とする。いずれをカソ
ード電極又はアノード電極にするかは、濃縮する目的物
質の荷電により決定することができ、例えば核酸（負に
荷電している）を濃縮する場合には、濃縮する側、すな
わち図２及び図３においては基板２１をアノード電極と
する。反対に、正に荷電している目的物質を濃縮する場
合には、濃縮する側、すなわち図２及び図３においては
基板２１をカソード電極とする。図２に示すように、基
板２０上に、ゲル配列体１０を載せ、基板２０と基板２
１とを対向させる。Since the substrates 20 and 21 function as a pair of electrodes for applying electricity, one of them serves as a cathode electrode and the other serves as an anode electrode. Which one is the cathode electrode or the anode electrode can be determined by the charge of the target substance to be concentrated. For example, in the case of concentrating a nucleic acid (which is negatively charged), the concentration side, that is, FIG. In FIG. 3, the substrate 21 is used as an anode electrode. On the contrary, in the case of concentrating the positively charged target substance, the condensing side, that is, the substrate 21 in FIGS. 2 and 3 is used as the cathode electrode. As shown in FIG. 2, the gel array 10 is placed on the substrate 20, and the substrate 20 and the substrate 2
1 and face each other.
【００５５】次に、図３に示すように、ゲル配列体１０
表面に接触又は所定の微少間隙を保った状態となるま
で、基板２１を移動させる。基板２１は、ゲル充填部１
１になるべく近づけることが好ましい。基板２０と基板
２１とが離れて位置している場合には、ゲル配列体１０
に十分に電気を印加することができないためである。ゲ
ル充填部１１と基板２１とが直接接触する場合には、ゲ
ル配列体１０と基板２１との間に適度な間隙を保つよう
に、基板２１の対向面又はゲル配列体１０表面上にセル
ロース膜等で構成されるスペーサを設けることによっ
て、ゲル配列体１０上に基板２１を載せることができ
る。それにより基板２１をゲルで汚すことなく繰り返し
再利用することができる。特に高価なＩＴＯ電極を用い
る場合には、基板２１とゲル充填部１１とが接触しない
ようにする方が経済的で望ましい。Next, as shown in FIG. 3, the gel array 10 is
The substrate 21 is moved until it comes into contact with the surface or maintains a predetermined minute gap. The substrate 21 is the gel filling part 1
It is preferable to bring it as close as possible to 1. When the substrate 20 and the substrate 21 are located apart from each other, the gel array 10
This is because it is not possible to sufficiently apply electricity to the. When the gel filling part 11 and the substrate 21 are in direct contact with each other, a cellulose film is provided on the facing surface of the substrate 21 or the surface of the gel array 10 so that an appropriate gap is maintained between the gel array 10 and the substrate 21. The substrate 21 can be placed on the gel array 10 by providing a spacer composed of, for example. This allows the substrate 21 to be reused repeatedly without being contaminated with gel. Especially when an expensive ITO electrode is used, it is economical and desirable not to contact the substrate 21 and the gel filling part 11.
【００５６】このように、基板２０上に、ゲル充填部１
１が配列されたゲル配列体１０を載せ、基板２０と基板
２１とを対向配置して、電源２２により、例えば約０．
１〜１００Ｖ、好ましくは０．５〜２０Ｖの電圧を印加
する。これにより、ゲル配列体１０は電界に置かれ、ゲ
ル充填部１１に保持される目的物質が基板２１に向かっ
て移動し、濃縮される。Thus, the gel filling part 1 is formed on the substrate 20.
1 is placed, the substrate 20 and the substrate 21 are arranged so as to face each other, and the power source 22 supplies, for example, about 0.
A voltage of 1 to 100 V, preferably 0.5 to 20 V is applied. As a result, the gel array 10 is placed in an electric field, and the target substance held in the gel filling part 11 moves toward the substrate 21 and is concentrated.
【００５７】電気を印加した場合は、目的物質を、ゲル
配列体の一部の領域に濃縮することができるため、その
領域から目的物質をより高感度にかつ低ノイズで検出す
ることができる。さらに、少なくとも基板２１の電極が
光透過性の薄膜材料から作製されている場合には、基板
２１が透明であるため、基板２１をゲル配列体上に載せ
たまま、上から透かして目的物質の検出を実施すること
が可能となる。基板２１を載せたまま、例えば蛍光標識
した目的物質の検出を行う場合には、配列体上のゲルの
表面形状の影響を受けることがなくなるため、励起光及
び検出の散乱が抑制され、より効率的に検出光を取得す
ることができる。また、ハイブリダイゼーション反応
後、基板２１を移動させることなく直に検出工程を行う
ことができるため、移動にかかる時間を節約することが
できる。図２及び図３に示す装置においては、ゲル配列
体１０が１つ配置される装置の例を示したが、基板２０
上に、複数のゲル配列体を載せ、同様の方法で濃縮工程
を行うようにしてもよい。When electricity is applied, the target substance can be concentrated in a partial region of the gel array, so that the target substance can be detected from that region with higher sensitivity and lower noise. Furthermore, when at least the electrodes of the substrate 21 are made of a light-transmissive thin film material, the substrate 21 is transparent, and therefore, the substrate 21 is left on the gel array and is watermarked from above to obtain the target substance. It becomes possible to carry out the detection. When detecting, for example, a fluorescently labeled target substance with the substrate 21 still mounted, the influence of the surface shape of the gel on the array is eliminated, so that the scattering of the excitation light and the detection is suppressed and the efficiency is improved. It is possible to obtain the detection light. Further, after the hybridization reaction, the detection step can be performed directly without moving the substrate 21, so that the time required for the movement can be saved. In the apparatus shown in FIGS. 2 and 3, an example of the apparatus in which one gel array 10 is arranged is shown.
A plurality of gel arrays may be placed on the top and the concentration step may be performed by the same method.
【００５８】目的物質の濃縮を水圧を利用して行う場合
には、配列体の１つの面（表又は裏面）に吸水性物質
（例えばろ紙、スポンジ、吸水性樹脂等）を接触させる
ことによって、他方の面から吸水性物質に向かって水が
移動するため、該目的物質を濃縮することができる。特
に中空繊維を配列してなる配列体の場合には、より効率
的に濃縮することができる。When the target substance is concentrated by using hydraulic pressure, one surface (front or back surface) of the array is brought into contact with a water-absorbing substance (for example, filter paper, sponge, water-absorbing resin, etc.), Since water moves from the other surface toward the water-absorbing substance, the target substance can be concentrated. Particularly, in the case of an array body in which hollow fibers are arrayed, it is possible to more efficiently concentrate.
【００５９】また、目的物質の濃縮を遠心力を利用して
行う場合には、配列体の面に対し垂直に遠心力を加える
ことによって、該目的物質を濃縮することができる。ま
た、電極の表面にガラス基板や高分子の膜などを貼り付
けて、これに濃縮された目的物質を写し取って、配列体
そのものではなく、ガラス基板や膜などを観察する方法
をとることもできる。この際に用いるガラス基板として
は、カルボン酸、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシランカッ
プリング剤、カルボジイミド、ニトロセルロース等をコ
ーティングしたものを用いることができる。また高分子
膜としては、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ
（ポリフッ化ビニリデン）等を用いることができる。When the target substance is concentrated by utilizing the centrifugal force, the target substance can be concentrated by applying the centrifugal force perpendicular to the plane of the array. It is also possible to attach a glass substrate or polymer film to the surface of the electrode, copy the concentrated target substance onto this, and observe the glass substrate or film instead of the array itself. . As the glass substrate used at this time, a glass substrate coated with carboxylic acid, poly-L-lysine, an aminosilane coupling agent, carbodiimide, nitrocellulose or the like can be used. Further, as the polymer film, nitrocellulose, nylon, PVDF
(Polyvinylidene fluoride) or the like can be used.
【００６０】本発明において、濃縮された目的物質を観
察する方法としては、上述した標識体を検出するための
当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよ
い。例えば、標識体として蛍光を用いた場合には、蛍光
顕微鏡、蛍光プレートリーダー、蛍光レーザースキャナ
ー、一般的なＤＮＡチップ用のスキャナー等を用いるこ
とができる。これらの蛍光検出手段は、ゲル配列体にお
いて濃縮した目的物質に対して励起光を照射し、励起光
の一部が蛍光標識に吸収されて放出した蛍光を検出す
る。また、本発明においては、濃縮した目的物質を定量
的に検出することによって、ゲル配列体に固定化された
生体関連物質とハイブリダイズする目的物質を定量的に
検出することもできる。例えば標識として蛍光を利用し
た場合には、ゲル配列体における蛍光強度を、蛍光レー
ザー顕微鏡とＣＣＤカメラ及びコンピュータを連結した
装置で自動的に測定することにより、蛍光強度から目的
物質量を測定することができる。スキャナーは、各ゲル
充填部の直径が約０．０１〜１．０ｍｍで、充填部の間
の距離が約０．０１〜１．０ｍｍ程度のゲル充填部を定
量的に識別できるものが好ましい。さらに、複数種の標
識に対応できること、広範囲を高速でスキャンできるこ
と、ゲル配列体のミクロな歪みに対応可能なオートフォ
ーカス機能を有するものであることが好ましい。このよ
うな機能を備えたスキャナーとしては、例えばＧＭＳ
４１８ Ａｒｒａｙ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ社（ＧＭＳ社）製）などが挙げられる。また、
データの解析に用いるソフトは、変異や多型の解析のよ
うに、部分的に重複した配列のオリゴヌクレオチドが多
数含まれる複雑な解析にも対応できるものが好ましい。In the present invention, the method for observing the concentrated target substance may be any method known in the art for detecting the above-mentioned labeled substance. For example, when fluorescence is used as the labeling substance, a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, a fluorescence laser scanner, a scanner for a general DNA chip, or the like can be used. These fluorescence detection means irradiate the target substance concentrated in the gel array with excitation light, and detect fluorescence emitted by absorption of a part of the excitation light by the fluorescent label. Further, in the present invention, by quantitatively detecting the concentrated target substance, it is also possible to quantitatively detect the target substance which hybridizes with the bio-related substance immobilized on the gel array. For example, when fluorescence is used as a label, the amount of the target substance can be measured from the fluorescence intensity by automatically measuring the fluorescence intensity in the gel array with a device that connects a fluorescence laser microscope, a CCD camera and a computer. You can It is preferable that the scanner has a diameter of about 0.01 to 1.0 mm for each gel-filled portion and can quantitatively identify the gel-filled portions where the distance between the filled portions is about 0.01 to 1.0 mm. Further, it is preferable that it can handle a plurality of types of labels, can scan a wide range at high speed, and have an autofocus function that can cope with microscopic distortion of the gel array. As a scanner having such a function, for example, GMS
418 Array Reader (Micro Sys
tems company (made by GMS company) etc. are mentioned. Also,
The software used for data analysis is preferably software that can be used for complex analysis such as mutation and polymorphism analysis that includes a large number of oligonucleotides having partially overlapping sequences.
【００６１】本発明においては、上述したように目的物
質を検出することによって、ゲル配列体に固定化された
生体関連物質とハイブリダイズする目的物質を高感度に
かつ低ノイズで検出することができる。本発明において
は、例えばゲル配列体の１つの領域に、ハイブリダイゼ
ーション反応した目的物質を濃縮することによって、濃
度の高い状態が実現され、感度の高い検出が実現でき
る。例えば、蛍光ラベルを付加した試料を用いた場合、
濃縮した目的物質に、より高い強度の励起光を照射する
ことが可能となるので、その目的物質を効率良く検出す
ることができる。また、検出時に使用するゲルの領域が
表面近傍に限定されるため、検出時のノイズの原因とな
るゲル領域のバックグラウンド光の影響を最小限に留め
ることができ、Ｓ／Ｎ比の向上につながる。In the present invention, by detecting the target substance as described above, the target substance which hybridizes with the bio-related substance immobilized on the gel array can be detected with high sensitivity and low noise. . In the present invention, for example, by concentrating the target substance that has undergone the hybridization reaction in one region of the gel array, a high-concentration state is realized and highly sensitive detection can be realized. For example, when using a sample with a fluorescent label,
Since the concentrated target substance can be irradiated with excitation light of higher intensity, the target substance can be efficiently detected. In addition, since the gel area used during detection is limited to the vicinity of the surface, it is possible to minimize the influence of background light in the gel area that causes noise during detection, and to improve the S / N ratio. Connect
【００６２】また、ゲル配列体の１つの表面に目的物質
を濃縮する場合には、その表面近傍に検出対象の目的物
質が集中しているため、非常に高感度な検出手段を使用
することなく、例えば共焦点型の検出器などを用いても
検出を良好に実施することができる。すなわち、本発明
の検出方法では、ゲルに固定化された生体関連物質が微
量であっても、優れた検出感度で目的物質を検出するこ
とができる。Further, when the target substance is concentrated on one surface of the gel array, the target substance to be detected is concentrated near the surface of the gel array, so that it is not necessary to use very sensitive detection means. Also, the detection can be satisfactorily performed by using, for example, a confocal detector. That is, according to the detection method of the present invention, the target substance can be detected with excellent detection sensitivity even if the amount of the bio-related substance immobilized on the gel is small.
【００６３】以上のような方法によって、３次元にわた
ってゲルに保持される目的物質の全てを有効に活用し、
さらに検出時には配列体表面の目的物質を効率的に検出
することができるため、ゲル配列体に固定化された生体
関連物質とハイブリダイズする目的物質を高感度に検出
することができる。従って、本発明により、生体高分子
固定化３次元配列体と２次元配列体の長所を併せ持った
系を完成することができる。By the above method, all the target substances retained in the gel over three dimensions are effectively used,
Furthermore, since the target substance on the surface of the array can be efficiently detected at the time of detection, the target substance that hybridizes with the bio-related substance immobilized on the gel array can be detected with high sensitivity. Therefore, according to the present invention, it is possible to complete a system having the advantages of both a biopolymer-immobilized three-dimensional array and a two-dimensional array.
【００６４】[0064]
【実施例】本発明を以下の実施例により具体的に説明す
る。但し、本発明はこれらの実施例によりその技術的範
囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕ゲル配列体の作製
直径０．３２ｍｍの孔が５ｍｍ2四方に０．５ｍｍピッ
チで縦横各１０列に合計１００個配列された、厚さ０．
１ｍｍの多孔板２枚を用い、その多孔板の全ての孔に、
カーボンブラックを２．０質量％含有するポリカーボネ
ート中空繊維（外径０．２９ｍｍ、内径０．１８ｍｍ、
長さ６００ｍｍ）１００本を通過させることにより中空
繊維配列体を得た。EXAMPLES The present invention will be specifically described by the following examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples. [Example 1] Preparation of gel array A total of 100 holes each having a diameter of 0.32 mm were arranged in 5 mm 2 squares at a pitch of 0.5 mm in each of 10 rows and 10 columns, and a thickness of 0.
Using two 1 mm perforated plates, for all the holes of the perforated plate,
Polycarbonate hollow fiber containing 2.0% by mass of carbon black (outer diameter 0.29 mm, inner diameter 0.18 mm,
A hollow fiber array was obtained by passing 100 fibers (length 600 mm).
【００６５】２枚の繊維ガイド多孔板の間隔を５０ｍｍ
とし、その間をポリウレタン樹脂（日本ポリウレタン工
業社製）により固定化することにより、両端に樹脂で固
定化されない部分を有する中空繊維配列ブロックを得
た。次に、以下の組成からなる水溶液Ａを調製し、この
水溶液Ａを上記中空繊維配列ブロックを構成する各中空
繊維内部に導入した。水溶液Ａが各中空糸内部に導入さ
れた中空繊維配列ブロックを、内部が水蒸気で飽和され
た密閉ガラス容器に移し、８０℃で４時間放置すること
により重合反応を行った。The distance between the two fiber guide perforated plates is 50 mm.
Then, the space between them was fixed with a polyurethane resin (manufactured by Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd.) to obtain a hollow fiber array block having portions not fixed with the resin at both ends. Next, an aqueous solution A having the following composition was prepared, and this aqueous solution A was introduced into each hollow fiber constituting the hollow fiber array block. The hollow fiber array block in which the aqueous solution A was introduced into each hollow fiber was transferred to a closed glass container whose interior was saturated with water vapor, and left at 80 ° C. for 4 hours to carry out a polymerization reaction.
【００６６】
水溶液Ａ：
アクリルアミド ３．７質量部
メチレンビスアクリルアミド ０．３質量部
２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩 ０．１質量部
オリゴヌクレオチド ０．００５質量部
（プローブＡ又はプローブＢ）
アビジン化アガロース（６％）懸濁液 １．０質量部
この際に、プローブＡ及びプローブＢのオリゴヌクレオ
チドは、中空繊維配列体における配列が図４の如くにな
るように導入し、固定化した。Aqueous solution A: 3.7 parts by weight of acrylamide 0.3 parts by weight of methylenebisacrylamide 0.3 parts by weight of 2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride 0.1 part by weight of oligonucleotides 0.005 parts by weight of probe (probe A Or probe B) Avidinated agarose (6%) suspension 1.0 part by mass At this time, the oligonucleotides of probe A and probe B were introduced so that the arrangement in the hollow fiber arrangement was as shown in FIG. , Fixed.
【００６７】図４において、白丸（○）は、プローブＡ
が内部に固定化された中空繊維、黒丸（●）は、プロー
ブＢが内部に固定化された中空繊維を表す。ゲル含有中
空繊維配列ブロックを、ミクロトームで厚み５００ミク
ロンに切り出し、縦横各１０列、計１００個のオリゴヌ
クレオチドが規則的に正方に配列された、核酸固定化ゲ
ル保持中空繊維配列体薄片とした。In FIG. 4, a white circle (◯) indicates a probe A.
Indicates a hollow fiber having a fixed inside, and a black circle (●) indicates a hollow fiber having the probe B fixed inside. The gel-containing hollow fiber array block was cut with a microtome to a thickness of 500 μm to obtain a nucleic acid-immobilized gel-holding hollow fiber array thin piece in which a total of 100 oligonucleotides were arrayed in a regular and square manner in 10 rows and 10 columns.
【００６８】〔参考例〕プローブの調製と標識
(a) ５’末端にアクリルアミド基を有するオリゴヌクレ
オチドの調製
以下に示したオリゴヌクレオチド（プローブＡ及びプロ
ーブＢ）を合成した。
プローブＡ：GCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTC（配
列番号１）
プローブＢ：GATGAGGTGGAGGTCAGGGTTTGGGACAGCAG（配列
番号２）
(b) 核酸の標識
試料核酸のモデルとして、５’末端が蛍光色素で標識さ
れた、(a)で合成したオリゴヌクレオチド（プローブＡ
及びプローブＢ）の配列の一部に相補的なオリゴヌクレ
オチド（Ｃ及びＤ）を合成した。
オリゴヌクレオチドＣ（Ｃｙ３で標識）：GAGCCCTCGCTC
GTACAGCAAGGTTTCG（配列番号３）
オリゴヌクレオチドＤ（Ｃｙ５で標識）：CTGCTGTCCCAA
ACCCTGACCTCCACC（配列番号４）Reference Example Preparation of Probe and Labeling (a) Preparation of Oligonucleotide Having Acrylamide Group at 5 ′ End The oligonucleotides (probe A and probe B) shown below were synthesized. Probe A: GCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTC (SEQ ID NO: 1) Probe B: GATGAGGTGGAGGTCAGGGTTTGGGACAGCAG (SEQ ID NO: 2) (b) Nucleic acid labeled sample As a model of nucleic acid, 5 ′ end labeled with a fluorescent dye, oligonucleotide synthesized in (a) ( Probe A
And oligonucleotides (C and D) complementary to part of the sequence of probe B) were synthesized. Oligonucleotide C (labeled with Cy3): GAGCCCTCGCTC
GTACAGCAAGGTTTCG (SEQ ID NO: 3) Oligonucleotide D (labeled with Cy5): CTGCTGTCCCAA
ACCCTGACCTCCACC (SEQ ID NO: 4)
【００６９】〔実施例２〕ハイブリダイゼーション及び
洗浄
実施例１で作製した核酸固定化ゲル保持中空繊維配列体
薄片をハイブリダイゼーション用のバッグに入れ、以下
の組成からなるハイブリダイゼーション溶液を注ぎ込
み、５５℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行
った。参考例(b)で得られた蛍光色素標識ＤＮＡを加
え、５５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。その後、室温において一次洗浄用の溶液で３０分
間、さらに、５５℃において二次洗浄用の溶液で３０分
間洗浄を行った。[Example 2] Hybridization and washing The nucleic acid-immobilized gel-holding hollow fiber array thin piece prepared in Example 1 was placed in a hybridization bag, and a hybridization solution having the following composition was poured into the bag, and the temperature was 55 ° C. Pre-hybridization was performed for 30 minutes. The fluorescent dye-labeled DNA obtained in Reference Example (b) was added, and hybridization was carried out at 55 ° C. for 15 hours. Then, it was washed with the solution for primary cleaning at room temperature for 30 minutes, and further with the solution for secondary cleaning at 55 ° C. for 30 minutes.
【００７０】 （実験に用いた溶液の組成） プレハイブリダイゼーション溶液：５×ＳＳＣ ０．５％ＳＤＳ （１ｍｌ） ハイブリダイゼーション溶液：５×ＳＳＣ ０．５％ＳＤＳ （５０μｌ） 一次洗浄用溶液：２×ＳＳＣ ０．１％ＳＤＳ （５ｍｌ） 二次洗浄用溶液：０．２×ＳＳＣ ０．１％ＳＤＳ （５ｍｌ）[0070] (Composition of the solution used in the experiment) Pre-hybridization solution: 5 × SSC 0.5% SDS (1 ml) Hybridization solution: 5 × SSC 0.5% SDS (50 μl) Primary washing solution: 2 x SSC 0.1% SDS (5 ml) Secondary washing solution: 0.2 x SSC 0.1% SDS (5 ml)
【００７１】〔実施例３〕試料の濃縮及び検出
実施例２で洗浄した配列体をＩＴＯ透明電極（セントラ
ル硝子社製）で挟み込み、０．５Ｖ／ｍｍの電圧を１０
分間印加した後、正極側を上にして電極を付属したまま
の状態で、共焦点型顕微鏡にて観察を行った。その結
果、配列体のプローブＡが配置された場所には、オリゴ
ヌクレオチドＣが結合し、プローブＢが配置された場所
には、オリゴヌクレオチドＤが結合していることが確認
された。[Example 3] Concentration and detection of sample The array washed in Example 2 was sandwiched between ITO transparent electrodes (manufactured by Central Glass Co., Ltd.), and a voltage of 0.5 V / mm was applied to 10 times.
After being applied for a minute, observation was performed with a confocal microscope with the positive electrode side facing up and the electrode attached. As a result, it was confirmed that the oligonucleotide C was bound to the position where the probe A was arranged and the oligonucleotide D was bound to the position where the probe B was arranged in the array.
【００７２】〔比較例１〕実施例２で洗浄した配列体
を、そのまま共焦点型顕微鏡にて観察を行った。その結
果、配列体のプローブＡが配置された場所には、オリゴ
ヌクレオチドＣが結合し、プローブＢが配置された場所
には、オリゴヌクレオチドＤが結合していることが確認
されたが、実施例３に比べてＳ／Ｎは５０％減であっ
た。[Comparative Example 1] The array body washed in Example 2 was directly observed with a confocal microscope. As a result, it was confirmed that the oligonucleotide C was bound to the position where the probe A was arranged and the oligonucleotide D was bound to the position where the probe B was arranged. S / N was 50% less than that of No. 3.
【００７３】[0073]
【発明の効果】本発明により、生体関連物質が固定化さ
れたゲルの配列体において、該生体関連物質とハイブリ
ダイズする目的物質を高感度に検出する方法が提供され
るため、生体関連物質に関係する相互作用などを試験す
る上で有用である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a method for highly sensitively detecting a target substance that hybridizes with a bio-related substance in a gel array on which the bio-related substance is immobilized. It is useful for testing related interactions.
【００７４】[0074]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MITSUBISHI RAYON CO., LTD. <120> A process for sensitively detecting a substance of interest <130> P02-0115 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 1 gcgatcgaaa ccttgctgta cgagcgaggg ctc 33 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 2 gatgaggtgg aggtcagggt ttgggacagc ag 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 3 gagccctcgc tcgtacagca aggtttcg 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 4 ctgctgtccc aaaccctgac ctccacc 27 [Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> MITSUBISHI RAYON CO., LTD. <120> A process for sensitively detecting a substance of interest <130> P02-0115 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 1 gcgatcgaaa ccttgctgta cgagcgaggg ctc 33 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 2 gatgaggtgg aggtcagggt ttgggacagc ag 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 3 gagccctcgc tcgtacagca aggtttcg 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 4 ctgctgtccc aaaccctgac ctccacc 27
【００７５】[0075]
配列番号１：合成オリゴヌクレオチド 配列番号２：合成オリゴヌクレオチド 配列番号３：合成オリゴヌクレオチド 配列番号４：合成オリゴヌクレオチド SEQ ID NO: 1 synthetic oligonucleotide SEQ ID NO: 2: Synthetic oligonucleotide SEQ ID NO: 3: Synthetic oligonucleotide SEQ ID NO: 4: Synthetic oligonucleotide
【図１】複数の中空繊維を配列してなる配列体を示す部
分斜視図である。FIG. 1 is a partial perspective view showing an array body in which a plurality of hollow fibers are arrayed.
【図２】電極を用いてゲル配列体に電気を印加する装置
を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an apparatus for applying electricity to a gel array using electrodes.
【図３】電極を用いてゲル配列体に電気を印加する装置
を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an apparatus for applying electricity to a gel array using electrodes.
【図４】実施例において中空繊維配列体に固定化したプ
ローブの種類を模式的に示す図である。白丸（○）は、
プローブＡが内部に固定化された中空繊維、黒丸（●）
は、プローブＢが内部に固定化された中空繊維を表す。FIG. 4 is a diagram schematically showing types of probes immobilized on hollow fiber array bodies in Examples. White circle (○)
Hollow fiber with probe A fixed inside, black circle (●)
Represents a hollow fiber in which the probe B is immobilized.
１０ 配列体 １１ 中空部（ゲル充填部） １２ 中空繊維 ２０ 基板 ２１ 基板 ２２ 電源 10 array 11 Hollow part (gel filling part) 12 hollow fibers 20 substrates 21 board 22 power
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/447 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/566 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｋ ３２５Ａ ３０１Ａ (72)発明者 伊藤 千穂 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 三 菱レイヨン株式会社化成品開発研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA09 HA12 4B063 QA01 QQ03 QQ08 QQ41 QR32 QR56 QR84 QS11 QS34 QX02─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) G01N 27/447 C12N 15/00 A 33/566 G01N 27/26 315K 325A 301A (72) Inventor Chiho Ito Kanagawa Sanroku Rayon Co., Ltd. Chemical Product Development Laboratory F-term (reference) 10-1 Daikokucho, Tsurumi-ku, Yokohama-shi, Yokohama (reference) 4B024 AA11 AA19 CA09 HA12 4B063 QA01 QQ03 QQ08 QQ41 QR32 QR56 QR84 QS11 QS34 QX02
Claims (7)
体に試料を添加して、該生体関連物質と該試料に含まれ
る検出の目的物質とのハイブリダイゼーション反応を行
い、反応した目的物質を濃縮し、濃縮された目的物質を
検出することを特徴とする目的物質の検出方法。1. A sample is added to a gel array on which a bio-related substance is immobilized, and a hybridization reaction between the bio-related substance and a target substance for detection contained in the sample is performed, and the reacted target substance is reacted. A method for detecting a target substance, which comprises condensing a target substance and detecting the concentrated target substance.
り行われるものである請求項１記載の検出方法。2. The detection method according to claim 1, wherein the concentration is performed by applying electricity to the array.
請求項２記載の検出方法。3. The detection method according to claim 2, wherein electricity is applied via electrodes.
である請求項３記載の検出方法。4. The detection method according to claim 3, wherein the electrode is made of a light-transmissive thin film material.
である請求項３又は４記載の検出方法。5. The detection method according to claim 3, wherein at least one of the electrodes is an ITO electrode.
基板に転写した後に該目的物質を検出するものである請
求項１〜５のいずれか１項に記載の検出方法。6. The detection method according to claim 1, wherein the target substance is detected after the concentrated target substance is further transferred to a film or a glass substrate.
のいずれか１項に記載の検出方法。7. The biologically relevant substance is a nucleic acid.
The detection method according to any one of 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002128402A JP2003322650A (en) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | High sensitivity detection technology using concentration |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002128402A JP2003322650A (en) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | High sensitivity detection technology using concentration |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003322650A true JP2003322650A (en) | 2003-11-14 |
Family
ID=29542169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002128402A Pending JP2003322650A (en) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | High sensitivity detection technology using concentration |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003322650A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005345181A (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Sony Corp | Interaction detector between substances, bioassay substrate equipped with the detector, and method for detecting interaction between substances |
| JP2008534987A (en) * | 2005-04-05 | 2008-08-28 | プロテイン・デイスカバリー・インコーポレーテツド | Improved method and apparatus for analyte enrichment and fractionation for chemical analysis including matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) |
| JP2010122208A (en) * | 2008-10-20 | 2010-06-03 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Method for manufacturing gel-filled array and method for manufacturing biochip |
| JP2016512923A (en) * | 2013-03-15 | 2016-05-09 | インテル・コーポレーション | Logic chip with embedded magnetic tunnel junction |
| CN116348759A (en) * | 2020-08-19 | 2023-06-27 | 海伦娜实验室公司 | Absorbent pad for electrophoresis |
-
2002
- 2002-04-30 JP JP2002128402A patent/JP2003322650A/en active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005345181A (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Sony Corp | Interaction detector between substances, bioassay substrate equipped with the detector, and method for detecting interaction between substances |
| JP2008534987A (en) * | 2005-04-05 | 2008-08-28 | プロテイン・デイスカバリー・インコーポレーテツド | Improved method and apparatus for analyte enrichment and fractionation for chemical analysis including matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) |
| JP2010122208A (en) * | 2008-10-20 | 2010-06-03 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Method for manufacturing gel-filled array and method for manufacturing biochip |
| JP2016512923A (en) * | 2013-03-15 | 2016-05-09 | インテル・コーポレーション | Logic chip with embedded magnetic tunnel junction |
| US10644064B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-05 | Intel Corporation | Logic chip including embedded magnetic tunnel junctions |
| CN116348759A (en) * | 2020-08-19 | 2023-06-27 | 海伦娜实验室公司 | Absorbent pad for electrophoresis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11214796B2 (en) | Gene expression analysis ME1HOD using two dimensional cDNA library | |
| CN110079585A (en) | Gene expression analytic method, gene expression parsing equipment and gene expression resolver | |
| EP2674492B1 (en) | Method for detecting nucleic acid | |
| CN101591705B (en) | High-sensitivity high-flux DNA binding protein detection method | |
| CN1672050A (en) | Fluorescence polarization detection | |
| AU1384299A (en) | Multiple sequential polynucleotide displacement reactions for signal amplification and processing | |
| JP2003322650A (en) | High sensitivity detection technology using concentration | |
| CN101074950B (en) | Gel chip detection method and detection device | |
| JP2008035779A (en) | Method for measuring nucleic acid degradation and nucleic acid array | |
| CN1302285C (en) | Selectively hybridizable substance immobilization fiber, fiber array comprising bundle of such fibers, selective hybridizing method, device therefor and base | |
| JP4173375B2 (en) | Electrophoresis apparatus and method for detecting bio-related substance using the same | |
| JP2003329685A (en) | Method of processing detector having probe molecule fixed thereto and aqueous processing solution | |
| JP2000270878A (en) | Nucleic acid-immobilized gel-holding hollow fiber, hollow fiber array and flakes thereof | |
| JP2004298018A (en) | Method for separating and recovering nucleic acid with array for reaction to convert probe into solid phase | |
| JP2003344405A (en) | Probe-immobilized gel-holding microarray and sample detection method using the same | |
| WO2003052139A1 (en) | Discrimination method of hybridization between probes and nucleotides in sample on the bio chip using enzyme reaction | |
| JP2000270877A (en) | Nucleic acid-immobilized gel-supporting porous fiber, porous fiber array, and slice thereof | |
| KR101017199B1 (en) | Nucleic Acid Detection Method Using Nucleic Acid Microarrays | |
| EP1947456B1 (en) | Method of confirming probe-loading position in nucleic acid array | |
| JP2002022739A (en) | Bio-related substance immobilized microarray | |
| JP2003121439A (en) | Bio-related substance immobilized microarray | |
| JP2005211017A (en) | New microarray | |
| 최용성 et al. | Development of New Biochip and Genome Detection Using an Non-labeling Target DNA | |
| JP2008035801A (en) | Method for estimating the abundance of nucleic acids having highly homologous sequences using a microarray | |
| JP2002031637A (en) | Dna analytical element |