JP2003240781A - タンパク質アレイを作製するためのゼラチンベースの基体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 タンパク質捕捉剤の結合のための固体支持体
上のマトリックスとして機能する、他の低コストの、製
造の容易な物質を発見するニーズがある。当該分野で
は、タンパク質捕捉剤の固定化のための化学官能基を有
する基体を必要とするが、そのような基体は、タンパク
質捕捉剤が固定化されていないゼラチン表面上の領域
に、タンパク質を結合させてはならない。 【解決手段】 ゼラチンと３官能性化合物Ａ−Ｌ−Ｂを
含んでなる、タンパク質アレイを作製するためのゼラチ
ンベースの基体（ここでＡは、ゼラチンと相互作用する
ことができる官能基であり、Ｌは、ＡおよびＢと相互作
用することができる結合基であり、Ｂは、タンパク質捕
捉剤と相互作用することができる官能基であり、ＡはＢ
と同じかまたは異なってよい）。 【効果】 ゼラチンを含む基体を提供できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般にタンパク質
マイクロアレイの作製に関し、詳しくはゼラチンベース
の基体を利用する方法に関し、ここでゼラチン表面は、
生物学的分子の特異的結合を改良するように改変されて
いる。

【０００２】

【従来の技術】ヒトゲノム計画の完了により、プロテオ
ミクス（proteomics）という新しい学際的分野（ゲノム
によりコードされるタンパク質の完全なセットの同定と
性状解析、タンパク質の合成、翻訳後修飾、ならびに細
胞制御レベルでのタンパク質相互作用の詳細なマッピン
グを含む）が急速に成長してきた。

【０００３】質量スペクトル法と組合せた２次元ゲル電
気泳動がいまだにプロオミクス研究の主要な技術である
が、遺伝子プロフィール解析と遺伝子発見へのＤＮＡマ
イクロアレイ技術の導入と応用の成功により、科学者達
によるタンパク質マイクロアレイ技術の開発とプロテオ
ミクス分野へのその応用が促進された。例えば、ＷＯ０
０／０４３８２号とＷＯ００／０４３８９号には、タン
パク質マイクロアレイを作製する方法が開示されてい
る。この開示における主要な要素は、タンパク質または
タンパク質捕捉剤を固定化することができる有機薄膜の
単分子層がコーティングされた固体支持体からなる基体
である。

【０００４】ニトロセルロース膜は、ウェスタンブロッ
ティング法や酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に
おいて、タンパク質ブロッティング基体として広く使用
されている。ＷＯ０１／４０３１２号とＷＯ０１／４０
８０３号では、グリッディングロボット装置を使用し
て、ニトロセルロース膜上に抗体がスポットされる。ニ
トロセルロース膜基体上のそのようなスポットされた抗
体マイクロアレイは、ほぼ同様の方法でタンパク質混合
物を分析するのに有用であることが証明されている。

【０００５】ＷＯ９８／２９７３６号（メンドーサ（L.
G. Mendoza）ら）は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル
エステル改変ガラス基体に抗体が固定された抗体マイク
ロアレイを記載している。米国特許第５，９８１，７３
４号とＷＯ９５／０４５９４号では、ＤＮＡマイクロア
レイの作製のためのポリアクリルアミドベースのヒドロ
ゲル基体技術が記載されている。さらに最近では、Ana
l. Biochem. (2000) 278, 123-131において、同じヒド
ロゲル技術が、タンパク質マイクロアレイの作成におけ
るタンパク質の固定化のための基体として有用であるこ
とが、さらに証明された。

【０００６】上記引用例において、これらの異なるアプ
ローチの共通の特徴は、該支持体の表面へのタンパク質
またはタンパク質捕捉剤の共有結合的または非共有結合
的結合を可能にする固体支持体の必要性である。ＤＮＡ
マイクロアレイ技術では、あらかじめ合成したオリゴと
ＰＣＲ調製したｃＤＮＡプローブの沈積のために、種々
の表面が作成されている。しかしＤＮＡと異なり、タン
パク質は非共有的に表面に結合し、その過程で生物活性
を失う。すなわち、タンパク質マイクロアレイ基体は、
タンパク質捕捉剤と相互作用できる官能性を提供するの
みでなく、タンパク質捕捉剤が沈積されていない領域へ
の非特異的結合に対して抵抗しなければならないという
点で、タンパク質マイクロアレイ基体の特性は、ＤＮＡ
マイクロアレイ基体の特性とは異なる。

【０００７】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、非特異
的表面結合からタンパク質をブロックする有用な試薬で
あることが証明されている。ポリエチレングリコールと
リン脂質もまた、表面を皮膜保護し、非特異結合に耐性
の表面を提供するのに使用されている。しかしこれらの
方法はすべて、表面の調製に長時間かかるため、または
表面改変の方法が複雑で困難であり、大規模な工業的製
造には理想的ではないため、欠点がある。

【０００８】

【特許文献１】米国特許第５，１１０，８３３号明細書

【特許文献２】米国特許第５，９８１，７３４号明細書

【特許文献３】国際公開第００／０４３８２号パンフレ
ット

【特許文献４】国際公開第００／０４３８９号パンフレ
ット

【特許文献５】国際公開第０１／０４３１２号パンフレ
ット

【特許文献６】国際公開第０１／４０８０３号パンフレ
ット

【特許文献７】国際公開第９８／２９７３６号パンフレ
ット

【特許文献８】国際公開第９５／０４５９４号パンフレ
ット

【非特許文献１】Anal. Biochem., (2000) 278, 123-13
1

【非特許文献２】抗体の使用：実験室マニュアル、コー
ルドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press）、ハーロー（Harlow）
とレーン（David Lane）編、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク州、1999年、3-99頁

【非特許文献３】Science, Vol. 249, 509-510, 1990

【非特許文献４】Nature, Vol. 346, 818-822, 1990

【非特許文献５】Chem. Rev. Vol. 100, 2495-2504, 20
00

【非特許文献６】ローズ（P.I. Rose）、「写真プロセ
スの理論」、第４版、ジェームズ（T.H. James）編、51
-67頁

【非特許文献７】グトフ（Edgar B. Gutoff）、「現代
コーティングと乾燥技術」の第１章、（界面工学シリー
ズ（Interfacial Engineering Series） v.1）、（199
2）、ブイシーエィチパブリシャーズインク（VCH Publi
shers Inc.）、ニューヨーク、ニューヨーク州

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、タンパク質捕
捉剤の結合のための固体支持体上のマトリックスとして
機能する、他の低コストの、製造の容易な物質を発見す
るニーズがある。当該分野では、タンパク質捕捉剤の固
定化のための化学官能基を有する基体を必要とするが、
そのような基体は、タンパク質捕捉剤が固定化されてい
ないゼラチン表面上の領域に、タンパク質を結合させて
はならない。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は：ゼラチンと３
官能性化合物Ａ−Ｌ−Ｂを含んでなる、タンパク質アレ
イを作製するためのゼラチンベースの基体（ここでＡ
は、ゼラチンと相互作用することができる官能基であ
り、Ｌは、ＡおよびＢと相互作用することができる結合
基であり、Ｂは、タンパク質捕捉剤と相互作用すること
ができる官能基であり、ＡはＢと同じかまたは異なって
よい）を提供することにより、上記問題のいくつかを解
決することを目的とする。

【００１１】また、タンパク質アレイを作製するための
ゼラチンベースの基体の製造方法であって：支持体上に
ゼラチン含有組成物をコーティングし；ゼラチンの表面
に３官能性化合物Ａ−Ｌ−Ｂを固定する、支持体を提供
する工程を含んでなる方法（ここでＡは、ゼラチンと相
互作用することができる官能基であり、Ｌは、Ａおよび
Ｂと相互作用することができる結合基であり、Ｂは、タ
ンパク質捕捉物質と相互作用することができる官能基で
あり、ＡはＢと同じかまたは異なってよい）が提供され
る。

【００１２】本発明は特に、タンパク質マイクロアレイ
を作製するのに有用である。本発明は、ある種の官能基
が固定されている少なくとも１つの表面を有するゼラチ
ン基体を提供する。こうして処理または改変されたゼラ
チン表面は、非特異結合に対して実質的に抵抗性にな
る。さらに官能基は、接触することになるタンパク質捕
捉剤と特異的に相互作用することができる。すなわち、
本発明の基体は、改変ゼラチン表面とタンパク質捕捉剤
の間の高度な特異的結合を提供する。

【００１３】本発明に従って改変されたゼラチン基体
は、非改変ゼラチン基体と比較して、タンパク質マイク
ロアレイを作製するのに、非常に低濃度の生物的試料し
か必要としない。また本発明のゼラチン基体は、容易に
低コストで製造することができる。タンパク質結合のた
めの特許請求された基体の有用性は、いくつかの化学改
変法と酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用し
て、以下の実施例で証明される。

【００１４】

【発明の実施の形態】一般に、タンパク質マイクロアレ
イは、まず固体支持体（すなわち、タンパク質マイクロ
アレイ支持体）を改変し、次に改変した基体のあらかじ
め決められた位置に、種々のタンパク質捕捉剤を沈積す
ることにより調製することができる。タンパク質マイク
ロアレイ応用のための最適な支持体は、有機、無機また
は生物学的でもよい。いくつかの一般に使用された支持
体材料には、ガラス、プラスチック、金属、半導体があ
る。支持体は、透明または不透明、可撓性または剛性で
もよい。ある場合には、支持体は、多孔性膜（例えばニ
トロセルロースおよびポリビニリデンジフルオリド）で
もよく、タンパク質捕捉剤は、物理的吸着により膜上に
沈積される。しかし、頑強性と再現性を改良するため
に、化学的共有結合により基体にタンパク質捕捉剤を固
定化することが、より好ましい。

【００１５】タンパク質捕捉剤を固体支持体に固定化す
るために、支持体をいくつかの化学的官能基化剤で改変
する必要がある。一般に、化学的官能基化物質は、Ａ−
Ｌ−Ｂで示され得る２官能性分子であり、ここでＡとＢ
は、ゼラチンと基体上に固定化されるタンパク質捕捉剤
分子とに反応または相互作用することができる化学的官
能基であり、Ｌは結合基である。好ましくは、Ｌは、Ａ
をＢに連結する端の間の最も短い直通結合経路の長さが
１０原子以下であるジラジカルである。

【００１６】２官能性剤には２つのクラスがある：１）
Ａ＝Ｂなら、ホモ官能性剤；そして２）Ａ≠Ｂなら、ヘ
テロ官能性剤。いくつかの一般に使用されるＡ＝Ｂに
は、特に限定されないが、アルデヒド、エポキシ、ヒド
ラジド、ビニルスルホン、スクシニミジルエステル、カ
ルボジイミド、マレイミド、ジチオ、ヨードアセチル、
イソシアネート、イソチオシアネート、アジリジンがあ
る。結合基Ｌは、２つの官能基ＡとＢを連結するのに充
分な、比較的安定な共有結合した化学単位の任意の妥当
な組合せを含む。これらの化学単位は、特に限定されな
いが、単結合、炭素原子、酸素原子、イオウ原子、カル
ボニル基

【００１７】

【化１】

【００１８】、カルボン酸エステル基

【００１９】

【化２】

【００２０】、カルボン酸アミド基

【００２１】

【化３】

【００２２】、スルホニル基

【００２３】

【化４】

【００２４】、スルホンアミド基

【００２５】

【化５】

【００２６】、エチレンオキシ基、ポリエチレンオキシ
基、またはアミノ基

【００２７】

【化６】

【００２８】があり、ここで、置換基Ｘ、Ｙ、およびＺ
は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素原子１〜１
０個のアルキル基；および炭素原子１〜１０個の直鎖ま
たは分岐鎖、飽和または不飽和アルキル基（例えば、メ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチ
ル、ヘキシル、デシル、ベンジル、メトキシメチル、ヒ
ドロキシエチル、イソブチル、およびｎ−ブチル）；炭
素原子６〜１４個の置換または非置換アリール基（例え
ば、フェニル、ナフチル、アントリル、トリル、キシリ
ル、３−メトキシフェニル、４−クロロフェニル、４−
カルボメトキシフェニルおよび４−シアノメチル）；お
よび炭素原子５〜１４個の置換または非置換シクロアル
キル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、お
よびシクロオクチル）、置換または非置換、飽和または
不飽和複素環基（例えば、ピリジル、ピリミジル、モル
ホリノ、およびフラニル）；シアノ基、である。Ａ−Ｌ
−Ｂ中にいくつかの可溶化基を導入することができ、こ
れらの可溶化基の例には、特に限定されないが、カルボ
ン酸、スルホン酸、ホスホン酸、ヒドロキサム酸、スル
ホンアミド、およびヒドロキシ基（およびこれらの対応
する塩）がある。ＡとＢは、架橋剤に対して容易に反応
する官能基の形でもよく、例としては、特に限定されな
いが、カルボキシ、アミノ、およびクロロメチルなどが
ある。ＡとＢは、基体上に固定化する予定のタンパク質
捕捉剤と、非共有的に相互作用することができる親和性
標識物でもよい。例えばいくつかの一般に使用された標
識系には、特に限定されないが、ストレプトアビジンと
ビオチン、ヒスチジン標識とニッケル金属イオン、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとグルタチオンがあ
る。当業者は、組換えＤＮＡ技術を使用して融合タンパ
ク質捕捉剤を作成することができ、こうして標識認識単
位の成分をタンパク質捕捉剤中に導入することができ
る。

【００２９】タンパク質マイクロアレイ基体がいったん
改変されると、タンパク質捕捉剤は、基体上に置かれ
て、タンパク質マイクロアレイ内容物を生成する。タン
パク質捕捉剤は、高親和性かつ高特異性でタンパク質と
相互作用できる分子である。典型的には、タンパク質捕
捉物質と標的であるタンパク質との親和性結合定数は、
１０６Ｍ-1より大きいことが好ましい。タンパク質マイ
クロアレイでタンパク質捕捉剤として使用できるいくつ
かのクラス分子がある。抗体は、高親和性と特異性で標
的に結合することができる、天然に存在するタンパク質
分子のクラスである。抗体を使用する性質とプロトコー
ルは、「抗体の使用：実験室マニュアル」（コールドス
プリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press）、ハーロー（Ed Harlow）とレ
ーン（David Lane）編、コールドスプリングハーバー、
ニューヨーク州、1999年）に見いだされる。抗体が検出
のための標的なら、抗原はまたタンパク質捕捉剤として
使用することもできる。タンパク質／酵素全体またはそ
の断片のようなタンパク質足場も、タンパク質捕捉剤と
して使用することができる。例としては、ホスファター
ゼ、キナーゼ、プロテアーゼ、オキシダーゼ、ヒドロリ
アーゼ、サイトカイン、または合成ペプチドがある。核
酸リガンドは、いくつかの標的へのその結合親和性と特
異性について、インビトロ選択と濃縮後に、タンパク質
捕捉剤分子として使用することができる。そのような選
択法の原理は、Science, Vol. 249, 505-510, 1990、お
よび Nature, Vol. 346, 818-822, 1990 中に見いださ
れる。米国特許第５，１１０，８３３号は、抗体結合親
和性と特異性を模倣することができ、いわゆる分子イン
プリンティングポリマー（ＭＩＰ）により容易に調製す
ることができる別のクラスの合成分子を開示する。この
技術は、Chem. Rev. Vol. 100, 2495-2504, 2000に総説
がある。

【００３０】実際は、タンパク質マイクロアレイを生物
学的液体試料と接触させると、試料中のタンパク質は、
特異的タンパク質捕捉剤をスポットした領域とタンパク
質捕捉剤の無い領域の両方に吸着する。タンパク質マイ
クロアレイは、チップ上のタンパク質捕捉剤と生物学的
液体試料中のいくつかのタンパク質もしくは他の分子と
の特異的相互作用の測定に使用されるため、非スポット
領域への試料タンパク質の非特異結合は、高いバックグ
ランドノイズを発生させるであろう。非特異結合という
用語は、タンパク質分子が非選択的に固体表面に接着す
る傾向を意味する。非特異結合が適切な方法でブロック
されないなら、非特異結合から生じる高いバックグラン
ドノイズが、スポットした領域から検出されるレポータ
ーシグナルを妨害する。一般的には、タンパク質マイク
ロアレイは、目的のアナライト溶液と接触させる前に非
特異結合部位をブロックするために、ブロッキング剤を
含有する溶液中に浸漬される。タンパク質の非特異結合
をブロックするために一般的に使用される方法は、基体
の表面を大過剰のウシ血清アルブミンで処理することで
ある。非スポット表面領域はまた、非特異結合を防ぐた
めに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン脂質、
またはポリリジンで化学的に改変されてよい。

【００３１】ゼラチンは、写真業界で種々の化学成分の
結合剤として使用されており、高品質のゼラチンを作成
する方法が業界で確立している。ゼラチンは生物学的物
質から作成されるため、これは、タンパク質マイクロア
レイ上のタンパク質捕捉剤と生物学的に適合性がある。
ゼラチンコーティングした表面は、タンパク質マイクロ
アレイ上へのタンパク質捕捉剤の固定化のための、優れ
た表面を提供する。本発明で示すように、ゼラチンはま
た、表面を、非特異結合の結果であるバックグランドノ
イズを実質的に低下させるものにする。通常ゼラチン
は、基体上にコーティングされ、ゼラチン溶液またはゼ
ラチンの懸濁液および他の物質が、定常状態流を示さな
い３次元のネットワークを形成するプロセスにより、ゲ
ル化が起きる。これは、多官能性モノマーの存在下の重
合により、反応性側鎖を有する溶解ポリマーの共有結合
的架橋により、又は、例えば溶液中のポリマー分子間の
水素結合のような２次結合により、ポリマー中で起き
る。ゼラチンのようなポリマーは、後者のタイプの熱ゲ
ル化を示す。ゲル化または硬化プロセスは、粘度の不連
続な上昇が特徴である（ローズ（P.I. Rose）、「写真
プロセスの理論」、第４版、ジェームズ（T.H. James）
編、51-67頁を参照されたい）。

【００３２】本発明に記載のゼラチン基体は、任意の固
体支持体上のように、またはゲル中に混合した１つのま
たは複数の硬化剤の組合せで、コーティングできる。硬
化剤のレベルは、コーティングされる総ゼラチンの０〜
２０質量％、好ましくは０．５〜８質量％である。

【００３３】ゼラチンには２つの型がある：酸前処理ゼ
ラチンとアルカリ前処理ゼラチン。好適なゼラチンは、
ウシ骨髄からのアルカリ前処理ゼラチンであるが、他の
供給源からのゼラチンでもよい。例としては、特に限定
されないが、ブタゼラチン、ウオゼラチンがある。２官
能性物質Ａ−Ｌ−Ｂは、固体支持体へのゼラチンコーテ
ィング中または後に、導入することができる。

【００３４】コーティング法は、コーエン（Edward Coh
en）とグトフ（Edgar B. Gutoff）の「現代コーティン
グと乾燥技術」の第１章、（界面工学シリーズ（Interf
acial Engineering Series） v. 1）、（1992）、ブイ
シーエィチパブリシャーズインク（VCH Publishers In
c.）、ニューヨーク、ニューヨーク州、に広く記載され
ている。一般に、液体コーティング組成物は、結合剤、
成分を溶解または懸濁するための溶媒、および他の添加
物（例えば、界面活性剤、分散剤、可塑剤、殺生物剤、
強靭さと不溶性のための架橋剤、および静電気の蓄積を
最小にするための導電性物質）を含有する。すべての成
分を混合、分散し、コーティング液をアプリケータに送
り、ここでいくつかのコーティング法の１つにより基体
に適用される。次に、コーティングに熱を加えて、溶媒
を蒸発させて、所望の薄膜を生成させるか、または紫外
線照射もしくは電子線の作用により固化させる。

【００３５】最も適したコーティング方法（コーティン
グ速度を含む）は、所望の品質と官能性および使用され
る物質（例えば、コーティングの基体、溶媒、質量、お
よび粘度など）に依存する。単層フォーマットでは、適
切なコーティング方法には、浸漬コーティング、ロッド
コーティング、ナイフコーティング、ブレードコーティ
ング、エアナイフコーティング、グラビアコーティン
グ、前進および後退回転コーティング、およびスロット
と押出しコーティングがある。

【００３６】コーティング速度もまた、コーティング法
の選択において重要な決定因子である。ほとんどの方法
は低速で行うことができ、すべての方法は、上限速度が
あり、高速でよりうまく作動するものもある。カーテン
コーティングは、カーテンの完全性を維持するために最
小の流速が必要である。従って、薄いコーティングを得
たいなら、この方法は高速に限定される。多層のスライ
ドコーティングでは、層が非常に薄い場合は、界面の不
安定性が起きやすい。高速は、スライド上のより速い流
速と厚い層により、これらの不安定性を避ける傾向にあ
る。「現代コーティングと乾燥技術」（前述）、１２頁
を参照されたい。

【００３７】ゼラチンは、０．２〜１００g/m²、好まし
くは１０〜５０g/m²の層を有する。

【００３８】ゼラチン基体を調製するのに、任意の公知
のコーティング方法（例えば、ビーズコーティングまた
はカーテンコーティング）を使用することができる。ゼ
ラチンは、その物理的性質を調整するために、任意の他
のコーティング助剤（例えば、界面活性剤および増粘
剤）とともにコーティングすることができる。本発明で
使用されるゼラチンは、コーティングプロセス前、最
中、または後に化学改変されて、この基体上に結合すべ
き生物活性分子またはアセンブリーと反応もしくは相互
作用できる多くの化学的官能基を作成してもよい。

【００３９】

【実施例】本発明は、以下の具体例を参照することによ
り、より理解することができる。 実施例１ 本例は、ゼラチンメルトの調製物と、反射性支持体への
メルトのコーティング法を例示する。 調製物１−１：これは、９．１ｇの水中の３．０ｇのIV
型ゼラチン、０．３ｇの水中の０．０３２ｇのコーティ
ング助剤のノニルフェノキシポリグリセロール、０．８
ｇの水中の０．０６ｇのコーティング助剤のオクチルフ
ェノキシポリ（エテンオキシ）スルホン酸ナトリウム、
０．１５ｇのエテン、８．２５ｇの水中の１，１’−
（メチレンビス（スルホニル））ビス、および９８．３
ｇの蒸留水を加えることにより調製した。 調製物１−２：これは、９．１ｇの水中の３．０ｇのIV
型ゼラチン、０．３ｇの水中の０．０３２ｇのコーティ
ング助剤のノニルフェノキシポリグリセロール、０．８
ｇの水中の０．０６ｇのコーティング助剤のオクチルフ
ェノールポリ（エテンオキシ）スルホン酸ナトリウム、
０．３０ｇのエテン、１６．５ｇの水中の１，１’−
（メチレンビス（スルホニル））ビス、および８９．９
ｇの蒸留水を加えることにより調製した。 調製物１−３：これは、９．１ｇの水中の３．０ｇのIV
型ゼラチン、０．３ｇの水中の０．０３２ｇのコーティ
ング助剤のノニルフェノキシポリグリセロール、０．８
ｇの水中の０．０６ｇのコーティング助剤のオクチルフ
ェノールポリ（エテンオキシ）スルホン酸ナトリウム、
０．４５ｇのエテン、２４．７５ｇの水中の１，１’−
（メチレンビス（スルホニル））ビス、および８１．５
ｇの蒸留水を加えることにより調製した。 調製物１−４：これは、９．１ｇの水中の３．０ｇのIV
型ゼラチン、０．３ｇの水中の０．０３２ｇのコーティ
ング助剤のノニルフェノキシポリグリセロール、０．８
ｇの水中の０．０６ｇのコーティング助剤のオクチルフ
ェノールポリ（エテンオキシ）スルホン酸ナトリウム、
０．６０ｇのエテン、３２．９ｇの水中の１，１’−
（メチレンビス（スルホニル））ビス、および７３．２
ｇの蒸留水を加えることにより調製した。 調製物１−５：これは、９．１ｇの水中の３．０ｇのIV
型ゼラチン、０．３ｇの水中の０．０３２ｇのコーティ
ング助剤のノニルフェノキシポリグリセロール、０．８
ｇの水中の０．０６ｇのコーティング助剤のオクチルフ
ェノールポリ（エテンオキシ）スルホン酸ナトリウム、
０．７５ｇのエテン、４１．１５ｇの水中の１，１’−
（メチレンビス（スルホニル））ビス、および６４．８
ｇの蒸留水を加えることにより調製した。

【００４０】調製物１−１〜１−５を、コーティング装
置を使用して、反射性写真基体上にコーティングした。
調製物を４５℃のスロットコーティングダイを通して、
３．７m/分で動く幅１２．７cmのウェブ上に導入した。
８６．１g/m²のゼラチンカバーレベルが得られるよう
に、流速を調整した。温度４℃と５６．６％RHに維持し
た２．４ｍの長さの冷却セクションでコーティングを冷
却硬化させ、次に長さがそれぞれ９．８ｍと１１．６ｍ
の２つの乾燥セクションで乾燥した。第１の乾燥セクシ
ョンは、温度２１℃と３３．２％RHに維持し、第２のセ
クションは、温度３７．８℃と１８．６％RHに維持し
た。 実施例２ 本例は、改変型酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
を使用するゼラチンコーティングの評価法を例示する。

【００４１】改変型酵素結合免疫吸着測定法の実施方法
は、以下の通りである。

【００４２】１．シグマ（Sigma）のヤギ抗マウス抗体
ＩｇＧを、１mg/mlになるようにＰＢＳ（リン酸緩衝化
生理食塩水、ｐＨ７．４）に溶解した。一連の希釈した
ヤギ抗マウス抗体ＩｇＧを、ニトロセルロース膜とコー
ティングしたゼラチン基体上に用手法でスポットした。
スポットされた基体を、加湿チャンバー中で室温で１時
間インキュベートした。

【００４３】２．基体を、１％トリトンＸ１００（登録
商標）を有するＰＢＳ緩衝液中で、各回５分で振盪して
４回洗浄した。

【００４４】３．洗浄した基体を、１％グリシンを有す
るＰＢＳ緩衝液中で、絶えず振盪して１５分インキュベ
ートした。

【００４５】４．基体を、１％トリトンＸ１００（登録
商標）を有するＰＢＳ緩衝液中で、各回振盪して４回洗
浄した。

【００４６】５．シグマ（Sigma）のマウスＩｇＧを、
０．１％ツイーン（登録商標）２０を有するＰＢＳ緩衝
液中で１μg/mlに希釈して、基体の全表面をカバーし、
基体を室温で１時間インキュベートした。

【００４７】６．基体を、１％トリトンＸ１００（登録
商標）を有するＰＢＳ緩衝液中で、各回５分絶えず振盪
して４回洗浄した。

【００４８】７．基体をヤギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ結合体（１％グリシンを有するＰＢＳ
で適切な力価に希釈する）溶液中で、室温で１時間振盪
しながらインキュベートして、基体の全表面をカバーし
た。

【００４９】８．基体を、１％トリトンＸ１００（登録
商標）を有するＰＢＳ緩衝液中で、各回５分で振盪して
４回洗浄し、水で２回リンスした。

【００５０】９．シグマ（Sigma）の３，３’−ジアミ
ノベンジジン四塩酸（ＤＡＢ）を含有する西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ基質溶液中で、製造業者の勧めに従って
発色させた。

【００５１】その表面で発色した基体を風乾し、スポッ
ト領域と非スポット領域の反射密度を、ステータス（St
atus）「Ａ」ろ過を有するパーキンエルマー（Perkin E
lmer）ＰＤＳミクロデンシトメータで測定した。データ
を表１に示す。

【００５２】

【表１】

【００５３】基体の表面への非特異タンパク質結合によ
り、バックグランド密度が引き起こされた。結果は、５
つのすべての本発明の例が、ニトロセルロース膜上の対
照試料よりはるかに低いバックグランド密度を与えたこ
とを示す。 実施例３ 本例は、その表面タンパク質結合能力を改良するため
の、ホモ２官能性架橋剤を使用するコーティングされた
ゼラチンの改変を例示する。

【００５４】３−１：ゼラチンを、実施例１に従ってコ
ーティングし、コーティングを、１．２５％グルタルア
ルデヒドを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に浸漬した。室温で３時間反応を進ませ、コーティ
ングを水でリンスした。生じたシッフ塩基を、１０mg/m
lの水素化ホウ素ナトリウム溶液を使用して還元した。
コーティングを蒸留水で洗浄し、風乾した。そのような
処理基体上にヤギ抗マウス抗体をスポットし、実施例２
に記載のように評価した。

【００５５】３−２：実施例１に従ってゼラチンをコー
ティングし、コーティングを、１０mMビス（スルホスク
シニミジル）スベリン酸を含有する０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に浸漬した。室温で１時間反応を進
ませ、コーティングを蒸留水でリンスし、風乾した。そ
のような処理基体上にヤギ抗マウス抗体をスポットし、
実施例２に記載のように評価した。

【００５６】３−３：実施例１に従ってゼラチンをコー
ティングし、コーティングを、１０mM塩化シアヌールを
含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬
した。室温で１時間反応を進ませ、コーティングを蒸留
水でリンスし、風乾した。そのような処理基体上にヤギ
抗マウス抗体をスポットし、実施例２に記載のように評
価した。

【００５７】その表面タンパク質結合能力、実施例２に
記載のようにＥＬＩＳＡプロトコールに従って評価し
た。結果を表２に示す。 実施例４ 本例は、その表面タンパク質結合能力を改良するため
の、ヘテロ２官能性架橋剤を使用するコーティングされ
たゼラチンの改変を例示する。

【００５８】４−１：ゼラチンを、実施例１に従ってコ
ーティングし、コーティングを、１０mM Ｎ−（γ−マ
レイミドブチリルオキシ）スクシニミドエステルを含有
する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬し
た。室温で１時間反応を進ませ、コーティングを蒸留水
でリンスし、風乾した。

【００５９】ヤギ抗マウス抗体を０．０５Ｍ ＤＴＴ中
で還元し、室温で１０分放置した。使用直前に、還元し
た抗体溶液を酢酸エチルで４回抽出し、試料からＤＴＴ
を除去した。

【００６０】そのような処理基体上にヤギ抗マウス抗体
をスポットし、基本的に実施例２に記載のように評価し
たが、工程２と７においてグリシンの代わりにシステイ
ンを使用した。結果を表２に示す。

【００６１】

【表２】

【００６２】* これらのレベルのヤギ抗マウスＩｇＧで
は、スポットシグナルは検出できなかった。ホモ２官能
性およびヘテロ２官能性架橋剤でゼラチン表面を処理す
ると、タンパク質表面結合能力が改良され、検出抗体分
子のより低い層が可能になった（改変表面にスポットし
た１０ナノグラムのタンパク質で、シグナルが容易に検
出された）。 実施例５ 本例は、コーティングされたゼラチン表面のタンパク質
への非特異結合を例示する。

【００６３】シリコンウェーハーまたはガラスを、エタ
ノール中１０重量％ＮａＯＨで１０分処理し、５８０℃
で３０分アニーリングした。１重量％の３−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、セレスト社（Celest
Inc.）から）水溶液を調製し、酢酸を使用してｐＨ
３．５に調整した。処理したウェーハーまたはガラスを
ＡＰＳ溶液に入れた後、溶液のｐＨをＮａＯＨで５．５
に調整した。１時間反応させ、次に表面を水で完全にリ
ンスし、窒素で乾燥した。ガラスまたはウェーハー表面
に作成されたＡＰＳ層を偏光解析法（ゲートナー（GAER
TNER）（登録商標）L116B）で測定すると、厚さは８Å
であった。まずＡＰＳ表面をアセトニトリル溶液中１０
mM塩化シアン（アルドリッチ（Aldrich）（登録商標）
から）で１時間処理し、次にスライドをゼラチンとＰＥ
Ｉ（アルドリッチ（Aldrich）（登録商標）から、分子
量〜２０００）の０．１重量％溶液に一晩浸漬して、ゼ
ラチンとポリエチレンイミン（ＰＥＩ）表面を、さらに
誘導体化した。表面には、それぞれ４７Åと３０Åの厚
さのゼラチンとＰＥＩの層が結合していた。

【００６４】ＡＰＳ、ゼラチンおよびＰＥＩコーティン
グスライドを、ｐＨ７のリン酸緩衝液中１００μg/mlの
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ（Sigma）（登録
商標）から）溶液に６０分浸漬し、水で２分リンスし
て、３つのアミン官能基含有表面へのタンパク質の非特
異結合を試験した。表面に非特異的に吸着したＢＳＡの
量を、偏光解析法で測定した。結果を表４に示す。 表３：ゼラチン、ＡＰＳ、およびペプチドのアミン含有
表面へのＢＳＡの非特異結合

【００６５】

【表３】

【００６６】結果は、ゼラチン表面が、他のアミン官能
基含有物質より有意に低い非特異結合能を有することを
示す。例えば、ゼラチンコーティング表面が、アミンコ
ーティング表面より有意に少ないＢＳＡを吸収すること
に注意されたい。 本発明の他の特徴 １．表面に固定されたタンパク質捕捉剤を有する基体の
製造方法であって：ゼラチンを含む基体を提供し；ゼラ
チンの表面に３官能性化合物Ａ−Ｌ−Ｂを固定し（ここ
でＡは、ゼラチンと相互作用することができる官能基で
あり、Ｌは、ＡおよびＢと相互作用することができる結
合基であり、Ｂは、タンパク質捕捉剤と相互作用するこ
とができる官能基である）；そしてゼラチンの該表面を
タンパク質と接触させる、工程を含んでなる上記方法。

【００６７】２．ゼラチンと、３官能性化合物Ａ−Ｌ−
Ｂにより該ゼラチンに固定された複数のタンパク質捕捉
剤とを含む基体（ここでＡは、ゼラチンと相互作用する
ことができる官能基であり、Ｌは、ＡおよびＢと相互作
用することができる結合基であり、Ｂは、タンパク質捕
捉剤に結合した官能基である）。

フロントページの続き (72)発明者 クリシュナン チャリ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14450, フェアポート，カンタベリー トレイル 39 (72)発明者 トーマス ローン ペナー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14450, フェアポート，ツイン ブルックス ロー ド 11 (72)発明者 チハオ ヤン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14580, ウェブスター，ウッドフィールド ドライ ブ 65

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ゼラチンと３官能性化合物Ａ−Ｌ−Ｂを
   含んでなる、タンパク質アレイを作製するためのゼラチ
   ンベースの基体（ここでＡは、ゼラチンと相互作用する
   ことができる官能基であり、Ｌは、ＡおよびＢと相互作
   用することができる結合基であり、Ｂは、タンパク質捕
   捉剤と相互作用することができる官能基であり、ＡはＢ
   と同じかまたは異なってよい）。
2. 【請求項２】 タンパク質アレイを作製するためのゼラ
   チンベースの基体の製造方法であって：該支持体を提供
   し；該支持体上にゼラチン含有組成物をコーティング
   し；ゼラチンの表面に３官能性化合物Ａ−Ｌ−Ｂを固定
   する、工程を含んでなる方法（ここでＡは、ゼラチンと
   相互作用することができる官能基であり、Ｌは、Ａおよ
   びＢと相互作用することができる結合基であり、Ｂは、
   タンパク質捕捉剤と相互作用することができる官能基で
   あり、ＡはＢと同じかまたは異なってよい）。