JP2003235953A - フォスフォフォリンを含む複合生体材料 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体適合性および骨形成能（骨誘導能）に優
れた成形容易な人工骨材を安価に提供する。 【解決手段】 フォスフォフォリンとコラーゲンを含む
スポンジ状構造を有する複合生体材料、および該複合生
体材料上に骨髄由来細胞を培養して得られる人工骨材。
れた成形容易な人工骨材を安価に提供する。 【解決手段】 フォスフォフォリンとコラーゲンを含む
スポンジ状構造を有する複合生体材料、および該複合生
体材料上に骨髄由来細胞を培養して得られる人工骨材。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フォスフォフォリ
ンとコラーゲンを含む複合生体材料および該複合生体材
料上に骨髄由来細胞を培養して得られる人工骨材に関す
る。
ンとコラーゲンを含む複合生体材料および該複合生体材
料上に骨髄由来細胞を培養して得られる人工骨材に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、整形外科の領域における骨欠損部
の修復は、人工材料を用いた人工骨の移植が行われるこ
とが多い。こうした人工骨には生体骨類似の機械的特性
に加えて、生体適合性や骨誘導性−すなわち、生体適用
後徐々に吸収され、骨再生サイクルに取り込まれて自身
の骨に置換していく性質−が求められる。
の修復は、人工材料を用いた人工骨の移植が行われるこ
とが多い。こうした人工骨には生体骨類似の機械的特性
に加えて、生体適合性や骨誘導性−すなわち、生体適用
後徐々に吸収され、骨再生サイクルに取り込まれて自身
の骨に置換していく性質−が求められる。
【０００３】人工骨材料としては、セラミックス系材
料、有機材料等の種々の材料が考案されているが、骨再
生を積極的に誘導する材料としては、ＢＭＰ(BoneMorph
ogenicProtein)とコラーゲンとの複合材料が有力で、他
の材料にはその能力は小さい。しかし、ＢＭＰは強い骨
形成能を有しているが、水に溶解しにくく、コラーゲン
を担体として用いる試みがなされてはいるものの、最適
担体が未だ見つかっていない。また、ラット、マウスレ
ベルではＢＭＰによる骨形成能は高いが、ヒトでは有効
な骨形成を得るのに０.４ｍｇ/ｍｌ（担体体積）程度の
多量のＢＭＰが必要と考えられており、現状では高額医
療に治療が限定されると予想される。したがって、ＢＭ
Ｐに代わる、安全かつ安価な、骨形成能を有する生体吸
収性の骨修復材料の開発が望まれている。
料、有機材料等の種々の材料が考案されているが、骨再
生を積極的に誘導する材料としては、ＢＭＰ(BoneMorph
ogenicProtein)とコラーゲンとの複合材料が有力で、他
の材料にはその能力は小さい。しかし、ＢＭＰは強い骨
形成能を有しているが、水に溶解しにくく、コラーゲン
を担体として用いる試みがなされてはいるものの、最適
担体が未だ見つかっていない。また、ラット、マウスレ
ベルではＢＭＰによる骨形成能は高いが、ヒトでは有効
な骨形成を得るのに０.４ｍｇ/ｍｌ（担体体積）程度の
多量のＢＭＰが必要と考えられており、現状では高額医
療に治療が限定されると予想される。したがって、ＢＭ
Ｐに代わる、安全かつ安価な、骨形成能を有する生体吸
収性の骨修復材料の開発が望まれている。
【０００４】発明者らは、これまで、歯に含まれるリン
酸タンパク質である、フォスフォフォリンやフォスビチ
ンが単独で骨形成能を有することを見出している（Sait
o, et al.,Bone 21(4) 305-311 (1997))が、これらが実
際に骨形成や人工骨開発に応用されたとの報告はない。
酸タンパク質である、フォスフォフォリンやフォスビチ
ンが単独で骨形成能を有することを見出している（Sait
o, et al.,Bone 21(4) 305-311 (1997))が、これらが実
際に骨形成や人工骨開発に応用されたとの報告はない。
【０００５】一方、人工骨材は生体吸収性であると同時
に、複雑な形状の骨欠損部を適切に埋めるため、成形容
易であることが望まれる。これに対し、コラーゲンタイ
プＩは柔軟な構造を持ち、元来骨形成の核になる性質を
有しているため、３次元構造を持つ骨修復材料としての
有望な可能性を有している。また、多孔質の硬材料（ハ
イドロキシアパタイトやβＴＣＰ、ポリ乳酸等）と複合
化することにより、高品質の移植材料やスキャホールド
として使用できる可能性も有している。問題は、このコ
ラーゲンスポンジに骨形成能を付加することであり、Ｂ
ＭＰ以外の安価な活性成分を利用した方法の開発が望ま
れている。
に、複雑な形状の骨欠損部を適切に埋めるため、成形容
易であることが望まれる。これに対し、コラーゲンタイ
プＩは柔軟な構造を持ち、元来骨形成の核になる性質を
有しているため、３次元構造を持つ骨修復材料としての
有望な可能性を有している。また、多孔質の硬材料（ハ
イドロキシアパタイトやβＴＣＰ、ポリ乳酸等）と複合
化することにより、高品質の移植材料やスキャホールド
として使用できる可能性も有している。問題は、このコ
ラーゲンスポンジに骨形成能を付加することであり、Ｂ
ＭＰ以外の安価な活性成分を利用した方法の開発が望ま
れている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、骨形成能
（骨誘導能）が高く、Biodegradableで、かつ成形容易
な人工骨材を安価に提供することを目的とする。
（骨誘導能）が高く、Biodegradableで、かつ成形容易
な人工骨材を安価に提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】かかる課題を解決するた
めに本発明者らは鋭意検討した結果、フォスフォフォリ
ンと呼ばれるリン酸蛋白質をコラーゲンタイプＩに架橋
したスポンジ状構造を有する複合材料が、優れた骨形成
能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
めに本発明者らは鋭意検討した結果、フォスフォフォリ
ンと呼ばれるリン酸蛋白質をコラーゲンタイプＩに架橋
したスポンジ状構造を有する複合材料が、優れた骨形成
能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）
を提供するものである。 （１） フォスフォフォリンとコラーゲンを含む複合生
体材料。 （２） 前記コラーゲンがコラーゲンタイプＩである、
上記（１）記載の複合生体材料。 （３） 前記フォスフォフォリンがコラーゲンに架橋さ
れていることを特徴とする、上記（１）または（２）記
載の複合生体材料。 （４） 前記複合生体材料がスポンジ状構造を有するこ
とを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか１に記
載の複合生体材料。 （５） さらにハイドロキシアパタイト、βＴＣＰ、α
ＴＣＰ、ポリグリコール酸およびポリ乳酸から選ばれる
少なくとも１以上を含む、上記（１）〜（４）のいずれ
か１に記載の複合生体材料。 （６）さらに骨髄由来細胞を含む、上記（１）〜（５）
のいずれか1に記載の複合生体材料。 （７） 前記細胞が患者から採取された細胞である、上
記(６)記載の複合生体材料。 （８） 上記（１）〜（７）のいずれか１に記載の複合
生体材料からなる人工骨材。 （９） コラーゲン線維とフォスフォフォリンを、ジビ
ニルスルフォンまたは１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジアミドを用いて架橋後、凍結
乾燥することを特徴とする、複合生体材料の製造方法。
を提供するものである。 （１） フォスフォフォリンとコラーゲンを含む複合生
体材料。 （２） 前記コラーゲンがコラーゲンタイプＩである、
上記（１）記載の複合生体材料。 （３） 前記フォスフォフォリンがコラーゲンに架橋さ
れていることを特徴とする、上記（１）または（２）記
載の複合生体材料。 （４） 前記複合生体材料がスポンジ状構造を有するこ
とを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか１に記
載の複合生体材料。 （５） さらにハイドロキシアパタイト、βＴＣＰ、α
ＴＣＰ、ポリグリコール酸およびポリ乳酸から選ばれる
少なくとも１以上を含む、上記（１）〜（４）のいずれ
か１に記載の複合生体材料。 （６）さらに骨髄由来細胞を含む、上記（１）〜（５）
のいずれか1に記載の複合生体材料。 （７） 前記細胞が患者から採取された細胞である、上
記(６)記載の複合生体材料。 （８） 上記（１）〜（７）のいずれか１に記載の複合
生体材料からなる人工骨材。 （９） コラーゲン線維とフォスフォフォリンを、ジビ
ニルスルフォンまたは１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジアミドを用いて架橋後、凍結
乾燥することを特徴とする、複合生体材料の製造方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明の内容について詳述
する。 １．複合生体材料 本発明にかかる複合生体材料は、フォスフォフォリンと
コラーゲンを必須の構成成分とする複合生体材料であ
る。該複合生体材料において、フォスフォフォリンはコ
ラーゲン繊維に架橋されていることが好ましい。また、
該複合生体材料は、スポンジ状の微小多孔質構造を有す
ることが好ましい。この構造は、後述する細胞培養の足
場に適した特性を与える。なお、「スポンジ状構造」と
は、柔軟性を有する微小多孔質構造（数μm〜数10μ程
度の無数の孔（空隙）が存在する構造）を意味するもの
とする。
する。 １．複合生体材料 本発明にかかる複合生体材料は、フォスフォフォリンと
コラーゲンを必須の構成成分とする複合生体材料であ
る。該複合生体材料において、フォスフォフォリンはコ
ラーゲン繊維に架橋されていることが好ましい。また、
該複合生体材料は、スポンジ状の微小多孔質構造を有す
ることが好ましい。この構造は、後述する細胞培養の足
場に適した特性を与える。なお、「スポンジ状構造」と
は、柔軟性を有する微小多孔質構造（数μm〜数10μ程
度の無数の孔（空隙）が存在する構造）を意味するもの
とする。
【００１０】前記複合生体材料に含まれるフォスフォフ
ォリンは、哺乳類の歯に含まれるリン酸タンパク質であ
ることが知られている。また、本発明で用いられるコラ
ーゲンとしては、コラーゲンタイプＩを用いることが好
ましい。該コラーゲンタイプＩは、骨、歯の有機質の大
部分を占めており、生体親和性が高いからである。
ォリンは、哺乳類の歯に含まれるリン酸タンパク質であ
ることが知られている。また、本発明で用いられるコラ
ーゲンとしては、コラーゲンタイプＩを用いることが好
ましい。該コラーゲンタイプＩは、骨、歯の有機質の大
部分を占めており、生体親和性が高いからである。
【００１１】本発明の複合生体材料において、フォスフ
ォフォリンとコラーゲンの配合比（質量比）は、１：１
０〜１：５０であることが好ましく、１：２０〜１：４
０であることがより好ましい。また、本発明の複合生体
材料総量（合計質量）に対し、フォスフォフォリンは２
〜１０質量％（以下、単に「質量％」を％と記載す
る。）配合されることが好ましく、２．５〜５％配合さ
れることがより好ましい。フォスフォフォリンの量が少
なすぎると骨形成能が不十分となり、一方、フォスフォ
フォリンの量が多すぎると複合生体材料のコストが高く
なるからである。
ォフォリンとコラーゲンの配合比（質量比）は、１：１
０〜１：５０であることが好ましく、１：２０〜１：４
０であることがより好ましい。また、本発明の複合生体
材料総量（合計質量）に対し、フォスフォフォリンは２
〜１０質量％（以下、単に「質量％」を％と記載す
る。）配合されることが好ましく、２．５〜５％配合さ
れることがより好ましい。フォスフォフォリンの量が少
なすぎると骨形成能が不十分となり、一方、フォスフォ
フォリンの量が多すぎると複合生体材料のコストが高く
なるからである。
【００１２】本発明の複合生体材料において、空隙率は
好ましくは４０〜９０％、より好ましくは６０〜９０％
である。この範囲を超えると、生体適用後の細胞の侵入
が不十分となり骨誘導性が悪くなるとともに、複合生体
材料自体の強度が低下するからである。
好ましくは４０〜９０％、より好ましくは６０〜９０％
である。この範囲を超えると、生体適用後の細胞の侵入
が不十分となり骨誘導性が悪くなるとともに、複合生体
材料自体の強度が低下するからである。
【００１３】本発明の複合生体材料は、必須の成分であ
るフォスフォフォリンおよびコラーゲンに加えて、本発
明の目的・効果を損なわない範囲で、さらにハイドロキ
シアパタイト、βＴＣＰ、αＴＣＰ、ポリグリコール酸
およびポリ乳酸等の多孔質の硬材料を含んでいてもよ
い。
るフォスフォフォリンおよびコラーゲンに加えて、本発
明の目的・効果を損なわない範囲で、さらにハイドロキ
シアパタイト、βＴＣＰ、αＴＣＰ、ポリグリコール酸
およびポリ乳酸等の多孔質の硬材料を含んでいてもよ
い。
【００１４】２．複合生体材料の製造方法
(1) フォスフォフォリンの調製
本発明の複合生体材料に用いられるフォスフォフォリン
は、市販のもの（和光純薬社製等）を用いてもよいが、
例えば以下のようにして得ることができる。哺乳類（例
えば、ウシ等）の歯を抜歯し、軟組織、歯髄、エナメル
質、セメント質を除去する。残った象牙質を細かく粉砕
し、これを、蛋白質分解酵素を含む適当な緩衝液（例え
ば、0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4）を用いて脱
灰し、透析した後に凍結乾燥する。次に、得られた凍結
乾燥物を緩衝液（例えば20mM Tri-HCl, pH 7.4〔蛋白質
分解酵素含有〕）に溶解し、塩化カルシウムを添加す
る。生じた沈殿物を緩衝液（例えば、0.5M EDTA, 0.05M
Tris-HCl, pH 7.4〔蛋白質分解酵素含有〕）に溶解
し、透析後、再び凍結乾燥する。最後に、前記凍結乾燥
物を尿素溶液（例えば、4M Urea, 0.01M Tris-HCl, pH
8.0）に溶解後、イオン交換クロマトグラフィー（例え
ば、DEAE-Sepharose等）等により分離する。目的とする
フォスフォフォリンは、リン酸分析およびアミノ酸分析
により同定することができる。
は、市販のもの（和光純薬社製等）を用いてもよいが、
例えば以下のようにして得ることができる。哺乳類（例
えば、ウシ等）の歯を抜歯し、軟組織、歯髄、エナメル
質、セメント質を除去する。残った象牙質を細かく粉砕
し、これを、蛋白質分解酵素を含む適当な緩衝液（例え
ば、0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4）を用いて脱
灰し、透析した後に凍結乾燥する。次に、得られた凍結
乾燥物を緩衝液（例えば20mM Tri-HCl, pH 7.4〔蛋白質
分解酵素含有〕）に溶解し、塩化カルシウムを添加す
る。生じた沈殿物を緩衝液（例えば、0.5M EDTA, 0.05M
Tris-HCl, pH 7.4〔蛋白質分解酵素含有〕）に溶解
し、透析後、再び凍結乾燥する。最後に、前記凍結乾燥
物を尿素溶液（例えば、4M Urea, 0.01M Tris-HCl, pH
8.0）に溶解後、イオン交換クロマトグラフィー（例え
ば、DEAE-Sepharose等）等により分離する。目的とする
フォスフォフォリンは、リン酸分析およびアミノ酸分析
により同定することができる。
【００１５】(2)コラーゲンタイプＩの精製
本発明で用いられるコラーゲン（コラーゲンタイプＩ）
は、特に限定されず、市販のものを用いても、コラーゲ
ンを含む適当な材料（例えば、ウシ皮膚等の動物の結合
組織）から公知の方法に従い、抽出・精製して用いても
よい。
は、特に限定されず、市販のものを用いても、コラーゲ
ンを含む適当な材料（例えば、ウシ皮膚等の動物の結合
組織）から公知の方法に従い、抽出・精製して用いても
よい。
【００１６】(3) フォスフォフォリンとコラーゲンから
なる複合生体材料の調製 まず、コラーゲン線維を炭酸カリウム、炭酸ナトリウム
等の炭酸塩水溶液に溶かして室温でインキュベートす
る。該炭酸塩水溶液の濃度は、好ましくは０．１Ｍ〜
０．２Ｍ、より好ましくは０．４Ｍ〜０．５Ｍである。
これに、架橋剤、例えば、ジビニルスルフォン、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジア
ミド等を加え、予めコラーゲン繊維上に架橋鎖を導入す
る。添加する該架橋剤の量は、ジビニルスルフォンであ
れば５質量％程度が好ましい。
なる複合生体材料の調製 まず、コラーゲン線維を炭酸カリウム、炭酸ナトリウム
等の炭酸塩水溶液に溶かして室温でインキュベートす
る。該炭酸塩水溶液の濃度は、好ましくは０．１Ｍ〜
０．２Ｍ、より好ましくは０．４Ｍ〜０．５Ｍである。
これに、架橋剤、例えば、ジビニルスルフォン、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジア
ミド等を加え、予めコラーゲン繊維上に架橋鎖を導入す
る。添加する該架橋剤の量は、ジビニルスルフォンであ
れば５質量％程度が好ましい。
【００１７】次に、フォスフォフォリンを添加してイン
キュベートし、コラーゲンと架橋させる。添加するフォ
スフォフォリンの量は、コラーゲンに対して１／１０〜
１／５０が好ましく、１／２０〜１／４０がより好まし
い（質量比）。これを、蒸留水、続いて重炭酸塩（例え
ば、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等）溶液で洗浄
し、余剰のフォスフォフォリンや架橋剤を除去する。最
後に、重炭酸ナトリウムとメルカプトエタノールを添加
して架橋反応を止め、蒸留水でよく洗浄してから凍結乾
燥する。該凍結乾燥の条件（例えば、温度、凍結時間、
水中での凍結乾燥等）は、所望の複合生体材料の構造、
すなわち比表面積、空隙率、孔（空隙）の大きさ等に応
じて、適宜調整することができる。また、得られた凍結
乾燥物は、必要に応じて成形し、例えば後述する人工骨
材等として利用することができる。
キュベートし、コラーゲンと架橋させる。添加するフォ
スフォフォリンの量は、コラーゲンに対して１／１０〜
１／５０が好ましく、１／２０〜１／４０がより好まし
い（質量比）。これを、蒸留水、続いて重炭酸塩（例え
ば、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等）溶液で洗浄
し、余剰のフォスフォフォリンや架橋剤を除去する。最
後に、重炭酸ナトリウムとメルカプトエタノールを添加
して架橋反応を止め、蒸留水でよく洗浄してから凍結乾
燥する。該凍結乾燥の条件（例えば、温度、凍結時間、
水中での凍結乾燥等）は、所望の複合生体材料の構造、
すなわち比表面積、空隙率、孔（空隙）の大きさ等に応
じて、適宜調整することができる。また、得られた凍結
乾燥物は、必要に応じて成形し、例えば後述する人工骨
材等として利用することができる。
【００１８】３．人工骨材
(1) 複合生体材料からなる人工骨材
本発明により得られる複合生体材料は、水を吸うとスポ
ンジのような弾性を有し、優れた生体親和性、骨誘導能
ないしは骨伝導能を有する。すなわち、骨組織に埋入し
た場合は速やかに骨組織と結合し、ドナー側の硬組織と
本発明により得られる複合材料との界面は完全に一体化
しうる。したがって、本発明の複合生体材料は、それ自
体、骨欠損部の修復・再生させるための人工骨材として
利用することができる。
ンジのような弾性を有し、優れた生体親和性、骨誘導能
ないしは骨伝導能を有する。すなわち、骨組織に埋入し
た場合は速やかに骨組織と結合し、ドナー側の硬組織と
本発明により得られる複合材料との界面は完全に一体化
しうる。したがって、本発明の複合生体材料は、それ自
体、骨欠損部の修復・再生させるための人工骨材として
利用することができる。
【００１９】前記人工骨材の形態および形状は、特に限
定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディ
スク状、フィルム状、棒状、粒子状、およびペースト状
等、任意の形態および形状を用いることができる。こう
した形態や形状は、人工骨材の目的に応じて適宜選択す
ればよい。
定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディ
スク状、フィルム状、棒状、粒子状、およびペースト状
等、任意の形態および形状を用いることができる。こう
した形態や形状は、人工骨材の目的に応じて適宜選択す
ればよい。
【００２０】(2) 骨髄由来細胞を含む人工骨材
本発明の複合生体材料は、これに骨髄由来細胞を播種し
て、生体類似環境下あるいは生体内で組織培養を行うこ
とにより、より効果的に骨再生が可能な人工骨材として
利用することができる。
て、生体類似環境下あるいは生体内で組織培養を行うこ
とにより、より効果的に骨再生が可能な人工骨材として
利用することができる。
【００２１】前記人工骨材で用いられる細胞は、分化・
増殖能力を有する未分化の細胞であり、例えば、間葉系
幹細胞、造血幹細胞、骨格筋幹細胞、神経幹細胞および
肝臓幹細胞等を挙げることができる。特に、骨髄由来の
胚幹細胞（ＥＳ細胞）および間葉系幹細胞が好ましい。
また、細胞は、樹立された培養細胞株のほか、患者の生
体から単離された細胞を好適に用いることができる。
増殖能力を有する未分化の細胞であり、例えば、間葉系
幹細胞、造血幹細胞、骨格筋幹細胞、神経幹細胞および
肝臓幹細胞等を挙げることができる。特に、骨髄由来の
胚幹細胞（ＥＳ細胞）および間葉系幹細胞が好ましい。
また、細胞は、樹立された培養細胞株のほか、患者の生
体から単離された細胞を好適に用いることができる。
【００２２】前記増殖因子遺伝子を導入した細胞の培養
は、適当な生体適合性材料からなる足場に、該細胞を播
種して、通常の方法により行えばよい。細胞の播種は、
足場である生体適合性材料に単に播種するだけでもよ
く、あるいは、緩衝液、生理食塩水、注射用溶媒、ある
いはコラーゲン溶液等の液体とともに混合して播種して
もよい。また、材料によって、細胞が孔の中にスムーズ
に入らない場合は、引圧条件下で播種してもよい。
は、適当な生体適合性材料からなる足場に、該細胞を播
種して、通常の方法により行えばよい。細胞の播種は、
足場である生体適合性材料に単に播種するだけでもよ
く、あるいは、緩衝液、生理食塩水、注射用溶媒、ある
いはコラーゲン溶液等の液体とともに混合して播種して
もよい。また、材料によって、細胞が孔の中にスムーズ
に入らない場合は、引圧条件下で播種してもよい。
【００２３】播種する細胞の数（播種密度）は細胞の形
態を維持して組織再生をより効率よく行わせるため、用
いる細胞や足場材料に応じて適宜調整することが望まし
い。例えば、骨芽細胞であれば、播種密度は１００万個
／ｍｌ以上であることが望ましい。
態を維持して組織再生をより効率よく行わせるため、用
いる細胞や足場材料に応じて適宜調整することが望まし
い。例えば、骨芽細胞であれば、播種密度は１００万個
／ｍｌ以上であることが望ましい。
【００２４】細胞培養に用いられる培地としては、ＭＥ
Ｍ培地、α-ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等、公知の培地
を細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。ま
た、該培地には、ＦＢＳ（Sigma社製）、Antibiotic-An
timycotic（GIBCO BRL社製）等の抗生物質や抗菌剤、増
殖因子、転写因子等を添加しても良い。培養は、３〜１
０％ＣＯ2、３０〜４０℃、特に５％ＣＯ2、３７℃の条
件下で行うことが望ましい。培養期間は、特に限定され
ないが、少なくとも３日以上行うことが望ましい。この
ようにして作製された人工骨材は、骨欠損部に埋入ある
いは注入することで、患者体内に適用することができ
る。
Ｍ培地、α-ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等、公知の培地
を細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。ま
た、該培地には、ＦＢＳ（Sigma社製）、Antibiotic-An
timycotic（GIBCO BRL社製）等の抗生物質や抗菌剤、増
殖因子、転写因子等を添加しても良い。培養は、３〜１
０％ＣＯ2、３０〜４０℃、特に５％ＣＯ2、３７℃の条
件下で行うことが望ましい。培養期間は、特に限定され
ないが、少なくとも３日以上行うことが望ましい。この
ようにして作製された人工骨材は、骨欠損部に埋入ある
いは注入することで、患者体内に適用することができ
る。
【００２５】４．その他
本発明の複合生体材料は他の生理活性物質、薬剤等のス
キャホールドとして利用することもできる、例えば、骨
肉腫などの切除骨の再建に、本発明により得られる複合
材料に抗癌剤を含浸させたものを用いることで、癌再発
の防止とともに生体硬組織の誘導を行うことができる。
キャホールドとして利用することもできる、例えば、骨
肉腫などの切除骨の再建に、本発明により得られる複合
材料に抗癌剤を含浸させたものを用いることで、癌再発
の防止とともに生体硬組織の誘導を行うことができる。
【００２６】したがって、本発明によって得られる複合
生体材料の用途としては、骨誘導および骨伝導能を有す
る生体骨置換型骨再建材としての利用法、アミノ酸、糖
質、サイトカインを含有する組織工学に用いられる生体
活性基材、および生体融和型薬剤徐放性基材としての利
用法を挙げることができ、具体的には、人工骨、人工関
節、腱と骨との接合材、歯科用インプラント材、カテー
テル用経皮端子、薬剤徐放性基材、骨髄誘導チャンバ
ー、組織再建用チャンバー・基材等を挙げることができ
る。
生体材料の用途としては、骨誘導および骨伝導能を有す
る生体骨置換型骨再建材としての利用法、アミノ酸、糖
質、サイトカインを含有する組織工学に用いられる生体
活性基材、および生体融和型薬剤徐放性基材としての利
用法を挙げることができ、具体的には、人工骨、人工関
節、腱と骨との接合材、歯科用インプラント材、カテー
テル用経皮端子、薬剤徐放性基材、骨髄誘導チャンバ
ー、組織再建用チャンバー・基材等を挙げることができ
る。
【００２７】
【実施例】以下、実施例により本発明についてさらに詳
細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。実施例１：フォスフォフォリン/コラーゲン複合生体材
料の製造 (1) フォスフォフォリンの精製 まず、ウシ顎骨から永久歯を抜歯し、軟組織、歯髄、エ
ナメル質、セメント質を除去する。残った象牙質を液体
窒素下にて200メッシュ以下の細粒子に粉砕する。象牙
質粉を0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4［蛋白質分
解酵素：100mM 6-aminohexanoic acid（和光純薬社
製）, 5mM benzamidine-HCl, 1mM phenylmethylsulfony
l fluoride含有］で4℃にて脱灰する。
細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。実施例１：フォスフォフォリン/コラーゲン複合生体材
料の製造 (1) フォスフォフォリンの精製 まず、ウシ顎骨から永久歯を抜歯し、軟組織、歯髄、エ
ナメル質、セメント質を除去する。残った象牙質を液体
窒素下にて200メッシュ以下の細粒子に粉砕する。象牙
質粉を0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4［蛋白質分
解酵素：100mM 6-aminohexanoic acid（和光純薬社
製）, 5mM benzamidine-HCl, 1mM phenylmethylsulfony
l fluoride含有］で4℃にて脱灰する。
【００２８】つぎに、EDTA脱灰液を、4℃にて脱イオン
蒸留水に対し、透析膜(SPECTRUM MWCO 3500, 132725)を
用いて透析して、凍結乾燥（東京理科機械製： EYELA F
REEZDRYER 90500042）する。EDTA抽出物は20mM Tris-HC
l, pH 7.4（蛋白質分解酵素含有）に溶解し、最終濃度
が1MになるようにCaCl2を添加する。沈殿物を遠心分離
（日立工機製：HIMAC CENTRIFUGE345043）により回収
し、再び0.5M EDTA, 0.05MTris-HCl, pH 7.4（蛋白質分
解酵素を含有）に溶解し、脱イオン蒸留水に対して透析
して、凍結乾燥する。凍結乾燥物を4M Urea, 0.01M Tri
s-HCl, pH 8.0に溶解してDEAE-Sepharose(Sigma Chem.
Co. 製) Column Chromatographyにて、0-1M NaCl直線勾
配により溶出させる。最後に、リン酸分析およびアミノ
酸分析によりフォスフォフォリンを同定する。
蒸留水に対し、透析膜(SPECTRUM MWCO 3500, 132725)を
用いて透析して、凍結乾燥（東京理科機械製： EYELA F
REEZDRYER 90500042）する。EDTA抽出物は20mM Tris-HC
l, pH 7.4（蛋白質分解酵素含有）に溶解し、最終濃度
が1MになるようにCaCl2を添加する。沈殿物を遠心分離
（日立工機製：HIMAC CENTRIFUGE345043）により回収
し、再び0.5M EDTA, 0.05MTris-HCl, pH 7.4（蛋白質分
解酵素を含有）に溶解し、脱イオン蒸留水に対して透析
して、凍結乾燥する。凍結乾燥物を4M Urea, 0.01M Tri
s-HCl, pH 8.0に溶解してDEAE-Sepharose(Sigma Chem.
Co. 製) Column Chromatographyにて、0-1M NaCl直線勾
配により溶出させる。最後に、リン酸分析およびアミノ
酸分析によりフォスフォフォリンを同定する。
【００２９】(2)コラーゲンタイプＩの精製
ウシ皮膚を細切し、4℃にて蒸留水、20% NaCl, 0.05M T
ris-HCl, pH 7.4にて洗浄する。次に、1M NaCl, 0.05M
Tris-HCl, pH 7.4にてovernightで抽出し、遠心分離に
より上清を回収し、0.5M酢酸、1M NaClを加えovernight
で撹拌する。
ris-HCl, pH 7.4にて洗浄する。次に、1M NaCl, 0.05M
Tris-HCl, pH 7.4にてovernightで抽出し、遠心分離に
より上清を回収し、0.5M酢酸、1M NaClを加えovernight
で撹拌する。
【００３０】遠心分離により残渣を回収し、0.5M 酢酸
に溶かして、さらに遠心分離を行う。上清を5M NaOH,
4.4M NaClで中和し、overnightで撹拌し、遠心分離す
る。この残渣に4.4M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4を
添加しovernightで撹拌し、遠心分離する。
に溶かして、さらに遠心分離を行う。上清を5M NaOH,
4.4M NaClで中和し、overnightで撹拌し、遠心分離す
る。この残渣に4.4M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4を
添加しovernightで撹拌し、遠心分離する。
【００３１】残渣に2.4M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.
4を添加しovernightで撹拌し、遠心分離する。残渣に1.
7M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4を添加しovernightで
撹拌し、遠心分離する。得られた上清を0.1M 酢酸に対
して透析し、凍結乾燥する。凍結乾燥したコラーゲンと
50mM 酢酸を用いて、0.3%コラーゲン酢酸溶液を作成す
る。0.15M NaClに続き、0.6N NaOH, 0.1M Hepes（和光
純薬社製）を添加して３７℃にてインキュベートするこ
とにより、再構成コラーゲンタイプＩ線維が得られる。
4を添加しovernightで撹拌し、遠心分離する。残渣に1.
7M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4を添加しovernightで
撹拌し、遠心分離する。得られた上清を0.1M 酢酸に対
して透析し、凍結乾燥する。凍結乾燥したコラーゲンと
50mM 酢酸を用いて、0.3%コラーゲン酢酸溶液を作成す
る。0.15M NaClに続き、0.6N NaOH, 0.1M Hepes（和光
純薬社製）を添加して３７℃にてインキュベートするこ
とにより、再構成コラーゲンタイプＩ線維が得られる。
【００３２】(3) フォスフォフォリンのコラーゲンへの
架橋結合 (2)で得られたコラーゲン線維を0.5M 炭酸ナトリウムで
室温にてovernightでインキュベートする。さらにジビ
ニルスルフォン(Sigma Chem. Co. 製)を添加し、２時間
インキュベートする。0.5M 炭酸ナトリウムでコラーゲ
ン線維をよく洗浄後、フォスフォフォリンを添加し、ov
ernightでインキュベートして架橋させる。これを蒸留
水で洗い、さらに0.5M 重炭酸ナトリウムでよく洗浄し
て、過剰なフォスフォフォリンとジビニルスルフォンを
除去する。
架橋結合 (2)で得られたコラーゲン線維を0.5M 炭酸ナトリウムで
室温にてovernightでインキュベートする。さらにジビ
ニルスルフォン(Sigma Chem. Co. 製)を添加し、２時間
インキュベートする。0.5M 炭酸ナトリウムでコラーゲ
ン線維をよく洗浄後、フォスフォフォリンを添加し、ov
ernightでインキュベートして架橋させる。これを蒸留
水で洗い、さらに0.5M 重炭酸ナトリウムでよく洗浄し
て、過剰なフォスフォフォリンとジビニルスルフォンを
除去する。
【００３３】次いで、0.5M 重炭酸ナトリウムとメルカ
プトエタノールを添加し、overnightでインキュベート
して架橋反応を止める。得られた複合体は蒸留水で洗
い、さらに0.5M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4および
蒸留水で洗浄する。これを凍結乾燥し、コラーゲン−フ
ォスフォフォリン複合体（スポンジ状シート）を作製し
た。また、フォスフォオリンを加えないコラーゲン線維
のみを、蒸留水でよく洗った後、凍結乾燥し、フォスフ
ォフォリンを含まないコラーゲン複合体（スポンジ状シ
ート）を作製した。
プトエタノールを添加し、overnightでインキュベート
して架橋反応を止める。得られた複合体は蒸留水で洗
い、さらに0.5M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4および
蒸留水で洗浄する。これを凍結乾燥し、コラーゲン−フ
ォスフォフォリン複合体（スポンジ状シート）を作製し
た。また、フォスフォオリンを加えないコラーゲン線維
のみを、蒸留水でよく洗った後、凍結乾燥し、フォスフ
ォフォリンを含まないコラーゲン複合体（スポンジ状シ
ート）を作製した。
【００３４】実施例２：ラット大腿骨への移植実験
1．細胞培養
８週齢のFischer系ラットの大腿骨を摘出し、この大腿
骨より、骨髄中の細胞を常法に従い抽出した。抽出した
細胞は、以下の条件で、１０日間培養した。なお、培養
期間中は、２日おきに培地交換を行ない、浮遊する血球
系細胞を除去し、底面に接着する骨芽細胞を精製してい
った。 培養条件）温度：３７℃、ＣＯ2濃度：５％、培地：αM
EM（10％FBS＋1％グルタミン＋抗生物質） 上記のようにして１０日間培養した骨芽細胞を継代し
（細胞数：106cells/ml）、以下の条件で、コラーゲン
−フォスフォフォリンシート（10mmφ、５枚）またはコ
ラーゲンシート（10mmφ、５枚）とともに、２週間の共
存培養を行なった。 培養条件）温度：３７℃、ＣＯ2濃度：５％、培地：αM
EM(10％FBS＋1％グルタミン＋抗生物質)＋10mM β-Glyc
erophosphate＋50μg/ml Vitamin C phosphate+10-8 M
Dexamethasone こうして得られた、培養細胞を含むシートを、移植用サ
ンプルとした。
骨より、骨髄中の細胞を常法に従い抽出した。抽出した
細胞は、以下の条件で、１０日間培養した。なお、培養
期間中は、２日おきに培地交換を行ない、浮遊する血球
系細胞を除去し、底面に接着する骨芽細胞を精製してい
った。 培養条件）温度：３７℃、ＣＯ2濃度：５％、培地：αM
EM（10％FBS＋1％グルタミン＋抗生物質） 上記のようにして１０日間培養した骨芽細胞を継代し
（細胞数：106cells/ml）、以下の条件で、コラーゲン
−フォスフォフォリンシート（10mmφ、５枚）またはコ
ラーゲンシート（10mmφ、５枚）とともに、２週間の共
存培養を行なった。 培養条件）温度：３７℃、ＣＯ2濃度：５％、培地：αM
EM(10％FBS＋1％グルタミン＋抗生物質)＋10mM β-Glyc
erophosphate＋50μg/ml Vitamin C phosphate+10-8 M
Dexamethasone こうして得られた、培養細胞を含むシートを、移植用サ
ンプルとした。
【００３５】２．移植実験
８週齢のFischer系ラット（ｎ＝５）の大腿部に、ドリ
ルで穿孔した（直径２mm）。この穿孔部に、調製した移
植用サンプルを挿入可能な程度の大きさに切断して、移
植した。なお、各ラットの右脚にコラーゲンシートを、
左脚にコラーゲン・フォスフォフォリンシートを移植し
た。移植後、１、２、４、６、８週目に、移植した大腿
骨を摘出した。
ルで穿孔した（直径２mm）。この穿孔部に、調製した移
植用サンプルを挿入可能な程度の大きさに切断して、移
植した。なお、各ラットの右脚にコラーゲンシートを、
左脚にコラーゲン・フォスフォフォリンシートを移植し
た。移植後、１、２、４、６、８週目に、移植した大腿
骨を摘出した。
【００３６】３．移植部位の観察
移植用サンプルの摘出日数に達したラットを、７％包水
クロラールで麻酔した（ラット体重100ｇあたり、0.4ml
の包水クロラールを腹腔に静注）。麻酔したラットの胸
部を開き、心臓より固定液（４％パラホルムアルデヒド
／0.25％グルタールアルデヒド）を注入し、還流固定法
によりラットを固定した（還流時間：１５min）。還流
固定終了後、ラットより大腿骨を摘出した。摘出した大
腿骨に対し、脱脂、脱灰、アルコール脱水、透徹を施
し、サンプル面が見えるように、パラフィンで包埋し
た。包埋したサンプルは、ミクロトームで厚さ5μmに薄
切してスライドグラスに貼付し、パラフィン伸展器上で
伸展した。伸展したパラフィン切片は、ヘマトキシリン
・エオジン染色で染色し、顕微鏡下で観察した。組織像
を図１および図２に示す。
クロラールで麻酔した（ラット体重100ｇあたり、0.4ml
の包水クロラールを腹腔に静注）。麻酔したラットの胸
部を開き、心臓より固定液（４％パラホルムアルデヒド
／0.25％グルタールアルデヒド）を注入し、還流固定法
によりラットを固定した（還流時間：１５min）。還流
固定終了後、ラットより大腿骨を摘出した。摘出した大
腿骨に対し、脱脂、脱灰、アルコール脱水、透徹を施
し、サンプル面が見えるように、パラフィンで包埋し
た。包埋したサンプルは、ミクロトームで厚さ5μmに薄
切してスライドグラスに貼付し、パラフィン伸展器上で
伸展した。伸展したパラフィン切片は、ヘマトキシリン
・エオジン染色で染色し、顕微鏡下で観察した。組織像
を図１および図２に示す。
【００３７】４．結果（図１および図２）
コラーゲン−フォスフォフォリンシートを移植した大腿
骨では、１週目より、コラーゲンシートに比べて骨化が
進行し、２週目以降もコラーゲンシートに比較して骨化
が進行していた。コラーゲンシートのみの場合でも骨化
は若干起こるが、コラーゲン−フォスフォフォリンシー
トの方が骨化が進行していることが確認された。また、
炎症等の所見は特に認められなかった。
骨では、１週目より、コラーゲンシートに比べて骨化が
進行し、２週目以降もコラーゲンシートに比較して骨化
が進行していた。コラーゲンシートのみの場合でも骨化
は若干起こるが、コラーゲン−フォスフォフォリンシー
トの方が骨化が進行していることが確認された。また、
炎症等の所見は特に認められなかった。
【００３８】５．結論
以上のとおり、本発明のコラーゲン−フォスフォフォリ
ンシートは生体親和性が高く、コラーゲンシートに比較
して優れた骨形成能を有することが確認された。また、
移植後の炎症反応も認められず、本発明の複合生体材料
は安全性の面でも優れていることが確認された。
ンシートは生体親和性が高く、コラーゲンシートに比較
して優れた骨形成能を有することが確認された。また、
移植後の炎症反応も認められず、本発明の複合生体材料
は安全性の面でも優れていることが確認された。
【００３９】
【発明の効果】本発明によれば、生体適合性、骨誘導性
に優れた新規複合生体材料を提供することができる。
に優れた新規複合生体材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図１は、実施例２におけるコラーゲン−フォス
フォフォリンシートまたはコラーゲンシート移植１、２
週間後のHE染色した組織像を示す写真である。
フォフォリンシートまたはコラーゲンシート移植１、２
週間後のHE染色した組織像を示す写真である。
【図２】図２は、実施例２におけるコラーゲン−フォス
フォフォリンシートまたはコラーゲンシート移植６、８
週間後のHE染色した組織像を示す写真である。
フォフォリンシートまたはコラーゲンシート移植６、８
週間後のHE染色した組織像を示す写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 家島 大輔
茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法
人産業技術総合研究所 つくばセンター内
Ｆターム(参考） 4C081 AB03 CA17 CC05 CD11 CD12
CD34 CF03 EA05
Claims (9)
- 【請求項１】 フォスフォフォリンとコラーゲンを含む
複合生体材料。 - 【請求項２】 前記コラーゲンがコラーゲンタイプＩで
ある、請求項1記載の複合生体材料。 - 【請求項３】 前記フォスフォフォリンがコラーゲンに
架橋されていることを特徴とする、請求項１または２記
載の複合生体材料。 - 【請求項４】 前記複合生体材料がスポンジ状構造を有
することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に
記載の複合生体材料。 - 【請求項５】 さらにハイドロキシアパタイト、βＴＣ
Ｐ、αＴＣＰ、ポリグリコール酸およびポリ乳酸から選
ばれる少なくとも１以上を含む、請求項１〜４のいずれ
か１項に記載の複合生体材料。 - 【請求項６】 さらに骨髄由来細胞を含む、請求項１〜
５のいずれか1項に記載の複合生体材料。 - 【請求項７】 前記細胞が患者から採取された細胞であ
る、請求項６記載の複合生体材料。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の複
合生体材料からなる人工骨材。 - 【請求項９】 コラーゲン線維とフォスフォフォリン
を、ジビニルスルフォンまたは１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジアミドを用いて架橋
後、凍結乾燥することを特徴とする、複合生体材料の製
造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002041409A JP3646167B2 (ja) | 2002-02-19 | 2002-02-19 | フォスフォフォリンを含む複合生体材料 |
| AU2003208087A AU2003208087A1 (en) | 2002-02-19 | 2003-01-31 | Composite biomaterial containing phospholine |
| EP03703126A EP1477191A4 (en) | 2002-02-19 | 2003-01-31 | PHOSPHOPHORYN-CONTAINING BIOLOGICAL COMPOSITE MATERIAL |
| US10/504,959 US20050107286A1 (en) | 2002-02-19 | 2003-01-31 | Composite biomaterial comprising phospholine |
| PCT/JP2003/001004 WO2003070290A1 (fr) | 2002-02-19 | 2003-01-31 | Biomateriau composite contenant de la phospholine |
| US11/349,122 US20060188544A1 (en) | 2002-02-19 | 2006-02-08 | Periodontal tissue regeneration using composite materials comprising phosphophoryn |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002041409A JP3646167B2 (ja) | 2002-02-19 | 2002-02-19 | フォスフォフォリンを含む複合生体材料 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003235953A true JP2003235953A (ja) | 2003-08-26 |
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Family
ID=27750466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20050107286A1 (ja) |
| EP (1) | EP1477191A4 (ja) |
| JP (1) | JP3646167B2 (ja) |
| AU (1) | AU2003208087A1 (ja) |
| WO (1) | WO2003070290A1 (ja) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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| US8263135B2 (en) * | 2004-09-09 | 2012-09-11 | Ying Jackie Y | Process for isolating biomaterial from tissue and an isolated biomaterial extract prepared therefrom |
| DK1836239T3 (da) | 2005-01-13 | 2009-01-19 | Cinv Ag | Kompositmaterialer, der indeholder carbonnanopartikler |
| EP1898969A2 (en) * | 2005-07-01 | 2008-03-19 | Cinvention Ag | Medical devices comprising a reticulated composite material |
| JP5540301B2 (ja) * | 2005-09-20 | 2014-07-02 | 独立行政法人物質・材料研究機構 | 多孔質基盤体とその製造方法並びに多孔質基盤体の使用方法 |
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| PL2968284T3 (pl) | 2013-03-14 | 2021-09-27 | Osteoqc Inc. | Pochodne alkilo-amino harminy wspierające wzrost kości |
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| MX2021001710A (es) | 2018-08-14 | 2021-06-08 | Osteoqc Inc | Compuestos de fluoro ?-carbolina. |
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| EP0595863A1 (en) * | 1991-07-11 | 1994-05-11 | British Technology Group Ltd | Implant materials |
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-
2002
- 2002-02-19 JP JP2002041409A patent/JP3646167B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-01-31 WO PCT/JP2003/001004 patent/WO2003070290A1/ja active Application Filing
- 2003-01-31 AU AU2003208087A patent/AU2003208087A1/en not_active Abandoned
- 2003-01-31 US US10/504,959 patent/US20050107286A1/en not_active Abandoned
- 2003-01-31 EP EP03703126A patent/EP1477191A4/en not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-02-08 US US11/349,122 patent/US20060188544A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
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