JP2003102465A - Method for isolating target substance - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、標的物質（特に標
的細胞）の分離方法、分離された標的細胞を用いた核酸
含有液の調製方法、並びに調製された核酸含有液を用い
た標的核酸の増幅方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for separating a target substance (particularly target cells), a method for preparing a nucleic acid-containing solution using the separated target cells, and a target nucleic acid using the prepared nucleic acid-containing solution. It relates to an amplification method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、遺伝子解析は、医学分野、農学分
野、理学分野、薬学分野等のあらゆる分野で行なわれて
おり、その目的は、ゲノムシーケンシング、臨床診断、
農植物品種改良、食品菌検査、創薬等、多岐にわたる。
このように非常に適用分野が広く、また、その応用が期
待される遺伝子解析には、ポリメラーゼ連鎖反応（以下
「ＰＣＲ」という。）が頻繁に利用される。2. Description of the Related Art In recent years, gene analysis has been carried out in all fields such as the medical field, agricultural field, science field, and pharmaceutical field, and its purpose is genome sequencing, clinical diagnosis,
A wide range of fields including agricultural plant varieties improvement, food bacteria inspection, drug discovery, etc.
As described above, the polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) is frequently used for gene analysis, which has a very wide application field and is expected to be applied.
【０００３】ＰＣＲは、耐熱性ポリメラーゼとプライマ
ーとを利用し、温度の昇降によって標的核酸を増幅させ
る技術であり、その原理は、標的ＤＮＡ配列を含む２本
鎖ＤＮＡが１本鎖に解離する温度に維持する第１段階
と、解離した１本鎖ＤＮＡに正方向および逆方向のプラ
イマーがアニーリングする温度に維持する第２段階と、
ＤＮＡポリメラーゼによって１本鎖ＤＮＡに相補的なＤ
ＮＡ鎖が合成される温度に維持する第３段階、の３段階
に設定したサーマルプロフィール（温度昇降）に従った
サイクルを多数回繰り返すことによって標的ＤＮＡを幾
何級数的に増幅させる点にある。PCR is a technique for amplifying a target nucleic acid by raising and lowering the temperature by using a thermostable polymerase and a primer. The principle is that the temperature at which a double-stranded DNA containing a target DNA sequence is dissociated into a single strand. And a second step of maintaining a temperature at which the forward and reverse primers anneal to the dissociated single-stranded DNA,
D complementary to single-stranded DNA by DNA polymerase
The target DNA is exponentially amplified by repeating a large number of cycles according to the thermal profile (temperature increase / decrease) set in three steps of maintaining the temperature at which the NA chain is synthesized, the third step.
【０００４】ＰＣＲを利用する場合には、標的ＤＮＡを
含む細胞の分離・精製や、細胞からの標的ＤＮＡの抽出
等の作業を行なって、標的ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液を
調製することが必要となる。特に最近、遺伝子診断、ゲ
ノムプロジェクト等において多数の検体を効率よく処理
するために、標的ＤＮＡを含む細胞の分離・精製、細胞
からの標的ＤＮＡの抽出、ＰＣＲによる標的ＤＮＡの増
幅といった一連の作業を自動化し、多数の検体を並列的
に効率よく処理する必要性が高まっている。When PCR is used, it is necessary to carry out operations such as separation and purification of cells containing target DNA and extraction of target DNA from cells to prepare a PCR reaction solution containing target DNA. Become. In particular, in recent years, in order to efficiently process a large number of specimens in gene diagnosis, genome projects, etc., a series of operations such as separation / purification of cells containing target DNA, extraction of target DNA from cells, amplification of target DNA by PCR are performed. There is a growing need to automate and efficiently process a large number of samples in parallel.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、標的Ｄ
ＮＡを含む細胞の分離・精製や、細胞からの標的ＤＮＡ
の抽出の際に頻繁に利用されている遠心分離は、容器の
自動装填および取り出しの自動化が非常に難しいととも
に、遠心分離後に上清・沈澱の分画を機械的に行なうこ
とが非常に難しいため、遠心分離を利用する場合には、
標的ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液の調製及びＰＣＲによる
標的ＤＮＡの増幅といった一連の作業を自動化すること
は困難である。However, the target D
Separation / purification of cells containing NA, target DNA from cells
Centrifugation, which is frequently used in the extraction of agarose, is very difficult to automate the automatic loading and unloading of containers, and it is also very difficult to mechanically separate the supernatant / precipitate after centrifugation. , When using centrifugation,
It is difficult to automate a series of operations such as preparation of a PCR reaction solution containing the target DNA and amplification of the target DNA by PCR.
【０００６】そこで、本発明は、遠心分離を利用しなく
ても、細胞等の標的物質を分離することができる標的物
質の分離方法を提供することを目的とする。また、本発
明は、標的ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液の調製及びＰＣＲ
による標的ＤＮＡの増幅といった一連の作業を自動化す
るのに適した、標的細胞の分離方法、核酸含有液の調製
方法及び標的核酸の増幅方法を提供することを目的とす
る。[0006] Therefore, an object of the present invention is to provide a method for separating a target substance which can separate a target substance such as cells without using centrifugation. Further, the present invention provides the preparation of PCR reaction solution containing target DNA and PCR.
An object of the present invention is to provide a method for separating a target cell, a method for preparing a nucleic acid-containing solution, and a method for amplifying a target nucleic acid, which are suitable for automating a series of operations such as amplification of a target DNA by.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、以下の標的物質の分離方法、標的細胞の
分離方法、核酸含有液の調製方法及び標的核酸の増幅方
法を提供する。In order to achieve the above object, the present invention provides the following method for separating a target substance, a method for separating a target cell, a method for preparing a nucleic acid-containing solution and a method for amplifying a target nucleic acid. .
【０００８】（１）遠隔操作により位置制御可能な複数
の粒子と、液体中に分散した状態にある前記粒子を凝集
させ得る凝集剤とを用いた標的物質の分離方法であっ
て、前記粒子及び／又は前記凝集剤は、前記標的物質と
結合し得るものであり、前記標的物質と前記粒子と前記
凝集剤とを液体中に混在させることによって、前記標的
物質と前記粒子と前記凝集剤とを含む凝集物を形成させ
た後、前記粒子を遠隔操作により位置制御することによ
って、前記凝集物を前記液体から分離することを特徴と
する前記標的物質の分離方法。(1) A method for separating a target substance using a plurality of particles, the position of which can be controlled by remote control, and an aggregating agent capable of aggregating the particles dispersed in a liquid. / Or the aggregating agent is capable of binding to the target substance, by mixing the target substance, the particles and the aggregating agent in the liquid, the target substance, the particles and the aggregating agent The method for separating a target substance, wherein the aggregate is separated from the liquid by controlling the position of the particles by remote control after forming the aggregate containing the liquid.
【０００９】（２）前記凝集物を分離した後、前記凝集
物に含まれる前記標的物質を解離させることによって標
的物質含有液を得ることを特徴とする前記（１）記載の
分離方法。(2) The separation method according to (1), wherein the target substance-containing liquid is obtained by dissociating the target substance contained in the aggregate after separating the aggregate.
【００１０】（３）遠隔操作によって前記標的物質含有
液から前記粒子を除去することを特徴とする前記（２）
記載の分離方法。(3) The above-mentioned (2), wherein the particles are removed from the target substance-containing liquid by remote control.
Separation method described.
【００１１】（４）前記粒子が、前記凝集剤と結合し得
る官能基を表面に有しており、前記凝集剤が、前記官能
基に結合することによって液体中に分散した状態にある
前記粒子を凝集させ得ることを特徴とする前記（１）〜
（３）のいずれかに記載の分離方法。(4) The particles have a functional group capable of binding to the aggregating agent on the surface, and the aggregating agent is dispersed in a liquid by binding to the functional group. Can be aggregated (1) to
The separation method according to any one of (3).
【００１２】（５）前記標的物質が、前記粒子及び／又
は前記凝集剤との結合部位を複数有することを特徴とす
る前記（１）〜（４）のいずれかに記載の分離方法。(5) The separation method according to any one of (1) to (4), wherein the target substance has a plurality of binding sites for the particles and / or the aggregating agent.
【００１３】（６）以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む
ことを特徴とする標的細胞の分離方法。
（ａ）標的細胞が安定して存在し得る液体中に、前記標
的細胞と、遠隔操作により位置制御可能であって表面に
リン酸基を有する複数の粒子と、カルシウムイオンとを
混在させることによって、前記標的細胞と前記粒子と前
記カルシウムイオンとを含む凝集物を形成させる工程
（ｂ）前記粒子を遠隔操作により位置制御することによ
って、前記凝集物を前記液体から分離する工程(6) A method for separating a target cell, which comprises the following steps (a) and (b): (A) By mixing the target cells, a plurality of particles that can be position-controlled by remote control and have a phosphate group on the surface, and calcium ions in a liquid in which the target cells can stably exist Forming an aggregate containing the target cells, the particles and the calcium ions (b) separating the aggregate from the liquid by remotely controlling the position of the particles
【００１４】（７）前記工程（ａ）において、前記凝集
物を、前記標的細胞と前記粒子と前記カルシウムイオン
とを含むハイドロキシアパタイトゲルとして形成させる
ことを特徴とする前記（６）記載の標的細胞の分離方
法。(7) In the step (a), the aggregate is formed as a hydroxyapatite gel containing the target cells, the particles and the calcium ions, and the target cells according to the above (6). Separation method.
【００１５】（８）前記凝集物を分離した後、キレート
剤を用いて前記凝集物から前記標的細胞を解離させるこ
とによって標的細胞含有液を得る工程（ｃ）をさらに含
むことを特徴とする前記（６）又は（７）記載の標的細
胞の分離方法。(8) The method further comprising the step (c) of obtaining a target cell-containing liquid by separating the aggregate from the aggregate using a chelating agent after separating the aggregate. The method for separating a target cell according to (6) or (7).
【００１６】（９）遠隔操作によって前記標的細胞含有
液から前記粒子を除去する工程（ｄ）をさらに含むこと
を特徴とする前記（８）記載の標的細胞の分離方法。(9) The method for separating target cells according to (8) above, which further comprises a step (d) of removing the particles from the target cell-containing liquid by remote control.
【００１７】（１０）前記（８）又は（９）記載の標的
細胞の分離方法によって得られた標的細胞含有液中に含
有される標的細胞から核酸を抽出することによって核酸
含有液を調製することを特徴とする核酸含有液の調製方
法。(10) A nucleic acid-containing solution is prepared by extracting nucleic acid from target cells contained in the target cell-containing solution obtained by the method for separating target cells according to (8) or (9) above. A method for preparing a nucleic acid-containing liquid, comprising:
【００１８】（１１）前記（１０）記載の核酸含有液の
調製方法によって得られた核酸含有液中でＰＣＲを行な
うことによって標的核酸を増幅させることを特徴とする
標的核酸の増幅方法。(11) A method for amplifying a target nucleic acid, which comprises amplifying a target nucleic acid by performing PCR in the nucleic acid-containing solution obtained by the method for preparing a nucleic acid-containing solution according to (10) above.
【００１９】[0019]
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の標的物質の分離方法で用いる粒子は、遠隔操作
により位置制御可能な粒子である。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will be described in detail below.
The particles used in the method for separating a target substance of the present invention are particles whose position can be controlled by remote control.
【００２０】ここで、「遠隔操作により位置制御可能な
粒子」とは、遠隔からの作用（遠隔作用）を加えたとき
に、その遠隔作用に応じて位置を移動させることができ
る粒子を意味し、このような粒子の位置は、遠隔作用の
大きさ、向き等を調節することによって制御することが
できる。Here, the "particle whose position can be controlled by remote control" means a particle whose position can be moved according to the remote action when a remote action (remote action) is applied. The position of such particles can be controlled by adjusting the magnitude, orientation, etc. of the remote action.
【００２１】遠隔作用としては、例えば、磁場、電場、
光、温度勾配（温度場）、圧力勾配（圧力波）、音波等
が挙げられる。これらの遠隔作用により位置制御可能な
粒子としては、例えば、磁場に対しては磁性粒子、電場
に対しては荷電粒子や誘電体粒子、光や温度場に対して
は、光や熱により熱せられて体積を膨張させ、浮力によ
り上昇可能な気泡を有する粒子や吸熱粒子、超音波や圧
力波によって振動して移動可能な粒子等が挙げられる。
これらの粒子のうち、簡便かつ精度のよい位置制御の点
から、磁性粒子が好ましい。磁性粒子としては、例え
ば、水酸化鉄、酸化鉄水和物、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３
Ｏ４等の粒子が挙げられる。The remote action includes, for example, a magnetic field, an electric field,
Light, temperature gradient (temperature field), pressure gradient (pressure wave), sound wave and the like can be mentioned. Particles whose position can be controlled by remote action are, for example, magnetic particles for a magnetic field, charged particles or dielectric particles for an electric field, and light or heat for a light or temperature field. Particles having bubbles that can be expanded by buoyancy and endothermic particles, particles that can move by vibrating by ultrasonic waves or pressure waves, and the like can be given as examples.
Among these particles, magnetic particles are preferable from the viewpoint of simple and accurate position control. Examples of the magnetic particles include iron hydroxide, iron oxide hydrate, γ-Fe 2 O 3 , and Fe 3.
Examples include particles such as O 4 .
【００２２】本発明の標的物質の分離方法で用いる粒子
は、粒子が全体として遠隔操作により位置制御可能であ
ればよく、粒子が遠隔操作により位置制御し得ない部分
を有していてもよい。例えば、遠隔操作により位置制御
し得る物質と位置制御し得ない物質との混合物から形成
された粒子や、遠隔操作により位置制御し得ない物質を
表面に有する粒子も、その粒子が全体として遠隔操作に
より位置制御し得る限り、「遠隔操作により位置制御可
能な粒子」に含まれる。例えば、液体中に分散した状態
にある粒子の自発的な凝集や沈降を抑制し、粒子の分散
状態を安定化させ得る物質（分散媒と親和性の高い物
質）を表面に有する粒子や、所望の官能基（例えば、凝
集剤と結合し得る官能基、標的物質と結合し得る官能基
など）を有する物質を表面に有する粒子なども、その粒
子が全体として遠隔操作により位置制御可能である限
り、「遠隔操作により位置制御可能な粒子」に含まれ
る。The particles used in the method for separating a target substance according to the present invention may be such that the particles as a whole can be position-controlled by remote control, and the particles may have a part which cannot be position-controlled by remote control. For example, particles formed from a mixture of a substance whose position can be controlled by remote control and a substance whose position cannot be controlled by remote control, and a particle having a substance whose position cannot be controlled by remote control on its surface are also remote controlled as a whole. As long as the position can be controlled by, it is included in “particles whose position can be controlled by remote control”. For example, particles having a substance (a substance having a high affinity with a dispersion medium) on the surface that can suppress the spontaneous aggregation and sedimentation of particles dispersed in a liquid and stabilize the dispersed state of particles, or Particles having a substance having a functional group of (for example, a functional group capable of binding to an aggregating agent, a functional group capable of binding to a target substance, etc.) on the surface, as long as the particle as a whole can be position-controlled by remote control , "Particles whose position can be controlled by remote control".
【００２３】本発明の標的物質の分離方法においては、
粒子の凝集物を形成させるために、複数の粒子が用いら
れる。複数の粒子は、同一種類であっても異なる種類で
あっていてもよいが、遠隔操作による位置制御を簡便に
行なう点からは同一種類の粒子を用いることが好まし
い。In the method for separating a target substance of the present invention,
Multiple particles are used to form agglomerates of particles. The plurality of particles may be the same kind or different kinds, but it is preferable to use the same kind of particles from the viewpoint of easily performing position control by remote operation.
【００２４】本発明の標的物質の分離方法においては、
標的物質と複数の粒子と凝集剤とを液体に混在させるこ
とにより、標的物質と複数の粒子と凝集剤とを含む凝集
物を形成させるので、複数の粒子が、液体中において標
的物質及び凝集剤と十分に混ざり合うことが望ましい。
このような混合状態は、例えば、ミキサーによる液体の
攪拌、ピペットによる液体の吸引・吐出などによって複
数の粒子を強制的に液体中に分散させることによって達
成し得るので、粒子が安定して液体中に分散し得ること
は必ずしも必要ではない。すなわち、粒子と分散媒との
親和力が弱くてもよい（例えば、粒子の分散液が疎液ゾ
ルを形成している場合）。しかしながら、粒子と分散媒
との親和力が強い場合（例えば、粒子の分散液が親液ゾ
ルを形成している場合）には、粒子が安定して液体中に
分散し得るので、効率よく上記混合状態を達成すること
ができる。そこで、粒子と分散媒との親和力が弱い場合
には、粒子が安定して分散し得るように、粒子の表面に
分散媒と親和力の強い官能基を形成することが好まし
い。また、後述するように、粒子の表面に凝集剤と結合
し得る官能基を形成する場合には、その官能基は分散媒
と親和力の強い官能基であることが好ましい。In the method for separating a target substance of the present invention,
By mixing the target substance, the plurality of particles, and the aggregating agent in the liquid, an aggregate containing the target substance, the plurality of particles and the aggregating agent is formed, so that the plurality of particles are the target substance and the aggregating agent in the liquid. It should be mixed well with.
Such a mixed state can be achieved, for example, by forcibly dispersing a plurality of particles in the liquid by stirring the liquid with a mixer, sucking / discharging the liquid with a pipette, etc. It is not always necessary to be able to disperse. That is, the affinity between the particles and the dispersion medium may be weak (for example, when the dispersion liquid of the particles forms a lyophobic sol). However, when the particles and the dispersion medium have a strong affinity (for example, when the dispersion liquid of the particles forms a lyophilic sol), the particles can be stably dispersed in the liquid, so that the above-mentioned mixing can be performed efficiently. A state can be achieved. Therefore, when the affinity between the particles and the dispersion medium is weak, it is preferable to form a functional group having a strong affinity with the dispersion medium on the surface of the particles so that the particles can be stably dispersed. Further, as will be described later, when a functional group capable of binding to the aggregating agent is formed on the surface of the particles, the functional group is preferably a functional group having a strong affinity with the dispersion medium.
【００２５】粒子の表面における所望の官能基の形成
は、例えば、粒子の表面に所望の官能基を化学合成する
か、あるいは、所望の官能基を有する物質を粒子の表面
に吸着等により結合させることによって行なうことがで
きる。The formation of the desired functional group on the surface of the particle is performed, for example, by chemically synthesizing the desired functional group on the surface of the particle, or by binding a substance having the desired functional group to the surface of the particle by adsorption or the like. It can be done by
【００２６】分散媒と親和力の強い官能基は、分散媒
（標的物質と粒子と凝集剤とを混在させる液体）の種類
によって適宜選択することができる。例えば、分散媒が
有極性の場合（例えば水の場合）には有極性の基（分散
媒が水の場合には親水基）を、分散媒が無極性の場合に
は無極性の基を選択することができる。分散媒が水であ
る場合を例にとれば、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｍ（Ｍはア
ルカリ金属又は−ＮＨ４を表す。以下同じ。）、−ＯＳ
Ｏ３Ｈ、−ＯＳＯ３Ｍ、−ＣＯＯＭ、−ＮＲ３Ｘ（Ｒは
アルキル基、Ｘはハロゲンを表す。）、−ＣＯＯＨ、−
ＮＨ２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨＣＯＮＨ２、−(ＯＣ
Ｈ２ＣＨ２)ｎ−、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＯＣＨ３、−
ＣＯＯＣＨ３、−ＣＳ、−ＰＯ４、−ＯＨ、これらの基
の縮合によって生じる種々の基（例えば、−ＳＯ３ＮＨ
２ＣＯ−、−Ｎ(ＳＯ３Ｈ)−）等の親水基を選択するこ
とができる。親水基として例えば−(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｎ
−を選択する場合には、ｎの値を変化させることによっ
て粒子の親水性を自由に調節することができる。The functional group having a strong affinity with the dispersion medium can be appropriately selected depending on the kind of the dispersion medium (the liquid in which the target substance, the particles and the aggregating agent are mixed). For example, when the dispersion medium is polar (for example, water), a polar group (a hydrophilic group when the dispersion medium is water) is selected, and when the dispersion medium is nonpolar, a nonpolar group is selected. can do. Taking the case the dispersing medium is water as an example, -SO 3 H, -SO 3 M (M represents an alkali metal or -NH 4 or less the same..), - OS
O 3 H, -OSO 3 M, -COOM, -NR 3 X (R is an alkyl group, X represents a halogen.), - COOH, -
NH 2, -CN, -OH, -NHCONH 2, - (OC
H 2 CH 2) n -, - CH 2 OCH 3, -OCH 3, -
COOCH 3 , —CS, —PO 4 , —OH, various groups formed by condensation of these groups (eg, —SO 3 NH
A hydrophilic group such as 2 CO-, -N (SO 3 H)-) can be selected. As a hydrophilic group, for example,-(OCH 2 CH 2 ) n
When − is selected, the hydrophilicity of the particles can be freely adjusted by changing the value of n.
【００２７】本発明の標的物質の分離方法で用いる粒子
の直径は、通常５００ｎｍ〜１０μｍ程度であるが、粒
子を安定して分散させる点からは５００ｎｍ〜５μｍ程
度であることが好ましい。また、粒子の大きさは、コロ
イド粒子としての挙動を示す大きさ（コロイド次元）で
あってもよく、その場合の粒子の直径は１ｎｍ〜１００
ｎｍ程度である。粒子がコロイド粒子である場合、その
分散液は「ゾル」と呼ばれることもあり、本明細書にお
いて「分散液」という用語は、「ゾル」を含む意味で用
いられる。The diameter of the particles used in the method for separating a target substance of the present invention is usually about 500 nm to 10 μm, but it is preferably about 500 nm to 5 μm from the viewpoint of stably dispersing the particles. The size of the particles may be a size (colloidal dimension) that behaves as colloidal particles, and the diameter of the particles in that case is 1 nm to 100 nm.
It is about nm. When the particles are colloidal particles, the dispersion thereof may be referred to as “sol”, and the term “dispersion” is used in the present specification to include “sol”.
【００２８】本発明の標的物質の分離方法で用いる凝集
剤は、液体中に分散した状態にある複数の粒子を凝集さ
せ得るものである。The aggregating agent used in the method for separating a target substance of the present invention is capable of aggregating a plurality of particles dispersed in a liquid.
【００２９】ここで、「凝集剤」には、それ自体が粒子
を凝集させ得るものの他、粒子の分散液中において粒子
を凝集させ得る物質を生じ得るもの（例えば、粒子の分
散液中において電離し、電離して生じたイオンが粒子を
凝集させ得るもの）も含まれる。例えば、リン酸基を表
面に有する粒子はカルシウムイオンによって凝集し得る
ので、粒子の分散液中で電離してカルシウムイオンを生
じ得るカルシウム化合物は「凝集剤」に含まれる。The term "aggregating agent" as used herein means not only an agent capable of aggregating particles by itself, but also an agent capable of producing a substance capable of aggregating particles in a dispersion liquid of particles (for example, ionization in a dispersion liquid of particles). However, ions generated by ionization may aggregate the particles). For example, since particles having a phosphate group on the surface can be aggregated by calcium ions, a calcium compound that can ionize in the dispersion liquid of the particles to generate calcium ions is included in the “aggregating agent”.
【００３０】液体中に分散した状態にある複数の粒子の
凝集は、一の粒子が複数の凝集剤分子と結合するととも
に、一の凝集剤分子が複数の粒子と結合することによっ
て生じる。すなわち、異なる粒子同士が凝集剤によって
相互に（例えば網目状に）連結され、粒子が独立した運
動性を失うことによって生じる。このような凝集は、粒
子の分散液がゾルの場合には「ゲル化」と呼ばれること
もあり、本明細書において「凝集」という用語は、「ゲ
ル化」を含む意味で用いられる。また、複数の粒子が凝
集して生じる凝集物は、粒子がコロイド粒子である場合
には「ゲル」と呼ばれることもあり、本明細書において
「凝集物」という用語は、「ゲル」を含む意味で用いら
れる。また、「ゲル」という用語は、凝集物が分散媒を
含んだまま固化したもの（ゼリー）、及び凝集物が分散
媒より分離して固化したもの（コアゲル）のいずれをも
含む意味で用いられる。Aggregation of a plurality of particles dispersed in a liquid occurs when one particle binds to a plurality of aggregating agent molecules and one aggregating agent molecule binds to a plurality of particles. That is, different particles are connected to each other (for example, in a mesh shape) by an aggregating agent, and the particles lose independent mobility. Such aggregation is sometimes referred to as "gelling" when the dispersion liquid of particles is a sol, and the term "aggregation" is used in the present specification to include "gelling". In addition, an aggregate formed by aggregating a plurality of particles may be referred to as “gel” when the particles are colloidal particles, and the term “aggregate” in the present specification means to include “gel”. Used in. In addition, the term "gel" is used to include both solidified aggregates containing a dispersion medium (jelly) and solidified aggregates separated from a dispersion medium (core gel). .
【００３１】本発明の標的物質の分離方法においては、
一の粒子が複数の凝集剤分子と結合し得るとともに、一
の凝集剤分子が複数の粒子と結合し得るように、粒子と
凝集剤とを組み合わせて用いる。In the method for separating a target substance of the present invention,
The particles and the aggregating agent are used in combination so that one particle can bind to a plurality of aggregating agent molecules and one aggregating agent molecule can bind to a plurality of particles.
【００３２】このような粒子及び凝集剤の組み合わせ
は、特に限定されるものではなく、適宜選択することが
できる。例えば、粒子がその荷電を主因として液体に安
定して分散し得る場合、粒子の荷電と反対符号のイオン
を粒子に吸着させることによって、粒子の荷電が中和さ
れ、粒子は凝集する。したがって、この場合には、粒子
の荷電と反対符号のイオンを生じ得る電解質を凝集剤と
して用いることができる。特に、このような凝集効果
は、イオンの価数が大きいほど大きいので、価数の大き
いイオンを生じ得る電解質を凝集剤として用いる場合に
は、効率よく粒子を凝集させることができる。The combination of such particles and aggregating agent is not particularly limited and can be appropriately selected. For example, if a particle can be stably dispersed in a liquid due to its charge, adsorbing to the particle ions of the opposite sign to the particle charge neutralizes the particle charge and causes the particle to aggregate. Therefore, in this case, an electrolyte that can generate ions having the opposite sign to the charge of the particles can be used as the aggregating agent. In particular, such an aggregating effect is greater as the valence of the ion is larger. Therefore, when an electrolyte capable of producing an ion having a large valence is used as the aggregating agent, the particles can be efficiently aggregated.
【００３３】また、粒子の表面に適当な化学修飾を施す
ことにより粒子と凝集剤とを組み合わせることもでき
る。例えば、一の凝集剤分子がある官能基との結合部位
を複数有している場合には、その官能基を粒子の表面に
複数形成することによって、一の粒子が上記官能基を介
して複数の凝集剤分子と結合し得るとともに、一の凝集
剤分子が上記官能基を介して複数の粒子と結合し得るよ
うにすることができる。Further, the particles and the aggregating agent can be combined by appropriately modifying the surface of the particles. For example, when one coagulant molecule has a plurality of binding sites with a certain functional group, a plurality of the functional groups are formed on the surface of the particle so that one particle has a plurality of functional groups through the functional group. It is possible to bind to the aggregating agent molecule of No. 1 and to allow one aggregating agent molecule to bind to a plurality of particles through the functional group.
【００３４】粒子と凝集剤との結合様式は特に限定され
るものではなく、その具体例としては、電磁気力、静電
気力（クーロン力）、磁気力又は分子間力による結合、
水素結合、イオン結合、共有結合、配位結合、吸着等が
挙げられる。これらの結合様式のうち、粒子と凝集剤と
を含む凝集物から凝集剤を除去し得るような結合様式が
好ましい。粒子と凝集剤とを含む凝集物から凝集剤を除
去し得る場合には、凝集させた粒子を再度分散させるこ
とができ、これによって凝集物に保持された標的物質を
解離させることができる。The binding mode of the particles and the aggregating agent is not particularly limited, and specific examples thereof include binding by electromagnetic force, electrostatic force (Coulomb force), magnetic force or intermolecular force,
Examples include hydrogen bond, ionic bond, covalent bond, coordinate bond, adsorption and the like. Among these binding modes, a binding mode capable of removing the aggregating agent from the aggregate containing the particles and the aggregating agent is preferable. When the aggregating agent can be removed from the agglomerate containing the particles and the aggregating agent, the agglomerated particles can be dispersed again, whereby the target substance retained by the agglomerate can be dissociated.
【００３５】凝集剤を除去し得るような結合様式として
は、例えば、イオン結合が挙げられる。例えば、液体に
分散した状態にある複数の粒子が負の荷電を有する官能
基を表面に有している場合（例えば、リン酸基を表面に
有する粒子が水に分散している場合）、この粒子の分散
液に正の荷電を有する多価の金属イオン（例えば、Ｃａ
２＋、Ｍｇ２＋、Ｂｅ２＋、Ｓｒ２＋等の二価の金属イ
オン）を加えると、粒子と金属イオンとはイオン結合し
て凝集物が形成される。この場合には、キレート剤（例
えば、クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＨＩＤ
Ａ、ＨＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ）を用いて凝集物から金属イ
オンを除去することによって粒子を液体に分散させるこ
とができる。粒子と凝集剤との結合様式がイオン結合で
ある場合にはｐＨを変化させる（例えばｐＨを下げる）
ことにより、また、粒子と凝集剤との結合様式が水素結
合や疎水結合である場合には加熱することにより、凝集
物から凝集剤を解離させることができる。Examples of the binding mode capable of removing the aggregating agent include ionic bonding. For example, when a plurality of particles dispersed in a liquid have functional groups having a negative charge on the surface (for example, particles having a phosphate group on the surface are dispersed in water), A polyvalent metal ion having a positive charge (for example, Ca
2+ , Mg 2+ , Be 2+ , Sr 2+ and other divalent metal ions) are added, and the particles are ionically bonded to the metal ions to form an aggregate. In this case, chelating agents (eg sodium citrate, EDTA, NTA, HID
A, HEDTA, DTPA) can be used to disperse the particles in the liquid by removing the metal ions from the aggregate. If the binding mode between the particles and the aggregating agent is an ionic bond, change the pH (for example, lower the pH)
Accordingly, when the bonding mode between the particles and the aggregating agent is a hydrogen bond or a hydrophobic bond, the aggregating agent can be dissociated from the aggregate by heating.
【００３６】粒子がその表面に有する官能基は、一の凝
集剤分子が当該官能基との結合部位を複数有する限り特
に限定されるものではなく、凝集剤の種類等に応じて適
宜選択することができる。例えば、凝集剤が正の荷電を
有する多価の金属イオンである場合には、粒子表面の官
能基としてリン酸基を選択することができる。The functional group on the surface of the particle is not particularly limited as long as one aggregating agent molecule has a plurality of binding sites with the functional group, and may be appropriately selected depending on the type of aggregating agent. You can For example, when the aggregating agent is a polyvalent metal ion having a positive charge, a phosphate group can be selected as the functional group on the particle surface.
【００３７】粒子表面の官能基と凝集剤との組み合わせ
としては、リン酸基と粒子の分散液中で電離し得るカル
シウム化合物またはマグネシウム化合物との組み合わせ
等が挙げられる。粒子の分散液中で電離し得るカルシウ
ム化合物またはマグネシウム化合物としては、分散媒が
水である場合には、例えば、塩化カルシウム、臭化カル
シウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マグ
ネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝
酸マグネシウム等が挙げられる。Examples of the combination of the functional group on the particle surface and the aggregating agent include a combination of a phosphoric acid group and a calcium compound or a magnesium compound which can be ionized in a dispersion liquid of particles. As the calcium compound or magnesium compound which can be ionized in the dispersion liquid of particles, when the dispersion medium is water, for example, calcium chloride, calcium bromide, calcium iodide, calcium nitrate, magnesium chloride, magnesium bromide, Examples thereof include magnesium iodide and magnesium nitrate.
【００３８】これらの組み合わせのうち、リン酸基と粒
子の分散液中で電離し得るカルシウム化合物の組み合わ
せが好ましい。リン酸基は親水基であるので、粒子の分
散媒が水である場合に粒子を安定して分散させることが
できる。また、適当な条件下において粒子表面のリン酸
基とカルシウムイオンとを結合させることにより、標的
物質と複数の粒子とカルシウムイオンとを含むハイドロ
キシアパタイトゲルを形成させることができ、これによ
って標的物質をハイドロキシアパタイトゲル中にしっか
りと保持することができる。Among these combinations, a combination of a phosphate group and a calcium compound which can be ionized in a dispersion liquid of particles is preferable. Since the phosphate group is a hydrophilic group, the particles can be stably dispersed when the dispersion medium of the particles is water. Further, by binding the phosphate groups on the particle surface and calcium ions under appropriate conditions, it is possible to form a hydroxyapatite gel containing the target substance, a plurality of particles and calcium ions. It can be held firmly in the hydroxyapatite gel.
【００３９】本発明の標的物質の分離方法で用いる粒子
及び凝集剤のいずれか一方又は両方は、分離対象となる
標的物質と結合し得るものである。Either one or both of the particles and the aggregating agent used in the method for separating a target substance of the present invention can bind to the target substance to be separated.
【００４０】粒子及び凝集剤がそれ自体では標的物質と
結合し得ない場合には、粒子及び／又は凝集剤に化学修
飾を施すことによって標的物質と結合し得るようにする
ことができる。また、標的物質に化学修飾を施すことに
よって、粒子及び／又は凝集剤が標的物質と結合し得る
ようにすることもできる。したがって、粒子及び凝集剤
の組み合わせは、標的物質と結合し得るか否かの観点を
除いて選択してもよく、選択された粒子及び凝集剤の両
方が標的物質と結合し得ないような場合には、粒子及び
／又は凝集剤に化学修飾を施すか、あるいは標的物質に
化学修飾を施せばよい。例えば、粒子及び／又は凝集剤
の表面に標的物質と結合し得る官能基を形成させたり、
標的物質と結合し得る物質を結合させたりすることによ
り、粒子及び／又は凝集剤を標的物質と結合し得るよう
にすることができる。また、標的物質の表面に粒子及び
／又は凝集剤と結合し得る官能基を形成させたり、粒子
及び／又は凝集剤と結合し得る物質を結合させたりする
ことにより、粒子及び／又は凝集剤を標的物質と結合し
得るようにすることができる。When the particles and the aggregating agent cannot bind to the target substance by themselves, the particles and / or the aggregating agent can be chemically modified so that they can bind to the target substance. Further, the target substance may be chemically modified so that the particles and / or the aggregating agent can bind to the target substance. Therefore, the combination of the particles and the aggregating agent may be selected except for the possibility of binding to the target substance, and when both the selected particles and the aggregating agent cannot bind to the target substance. For the above, the particles and / or the aggregating agent may be chemically modified, or the target substance may be chemically modified. For example, a functional group capable of binding to a target substance is formed on the surface of the particles and / or the aggregating agent,
The particles and / or the aggregating agent can be bound to the target substance by binding a substance capable of binding to the target substance. Further, by forming a functional group capable of binding to the particles and / or the aggregating agent on the surface of the target substance or binding a substance capable of binding to the particles and / or the aggregating agent, It can be capable of binding to a target substance.
【００４１】粒子及び／又は凝集剤の表面に形成させる
官能基又は結合させる物質は、標的物質と結合し得る限
り特に限定されるものではなく、標的物質の種類等に応
じて適宜選択することができる。例えば、標的物質が抗
体又は抗原である場合には、それに特異的に結合する抗
原又は抗体を表面に結合させた粒子を用いることがで
き、この場合、粒子は抗原抗体反応によって標的物質に
結合する。抗原の代わりにハプテンを用いることもでき
る。また、標的物質が核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ等）であ
る場合には、それに相補的なプローブを表面に結合させ
た粒子を用いることができ、この場合、粒子は相補的な
核酸間のハイブリダイゼーションによって標的物質に結
合する。The functional group to be formed on the surface of the particles and / or the aggregating agent or the substance to be bound is not particularly limited as long as it can bind to the target substance, and may be appropriately selected according to the type of the target substance and the like. it can. For example, when the target substance is an antibody or an antigen, a particle having an antigen or an antibody that specifically binds thereto bound to the surface can be used, and in this case, the particle binds to the target substance by an antigen-antibody reaction. . A hapten can be used instead of the antigen. Further, when the target substance is a nucleic acid (DNA, mRNA, etc.), a particle having a probe complementary thereto bound to the surface can be used, and in this case, the particle is formed by hybridization between complementary nucleic acids. It binds to the target substance.
【００４２】また、標的物質の表面に形成させる官能基
又は結合させる物質は、粒子及び／又は凝集剤と結合し
得る限り特に限定されるものではなく、粒子及び／又は
凝集剤の種類等に応じて適宜選択することができる。例
えば、粒子の表面にビオチン又はアビジンを結合させて
ある場合には、標的物質にアビジン又はビオチンを結合
させることができ、この場合、粒子はビオチン−アビジ
ンの特異的結合によって標的物質に結合する。Further, the functional group formed on the surface of the target substance or the substance to be bound is not particularly limited as long as it can bind to the particles and / or the aggregating agent, and it depends on the type of the particles and / or the aggregating agent. Can be appropriately selected. For example, when biotin or avidin is bound to the surface of the particle, avidin or biotin can be bound to the target substance, and in this case, the particle is bound to the target substance by a specific biotin-avidin bond.
【００４３】もちろん、粒子及び／又は凝集剤が標的物
質と結合し得るように、粒子及び凝集剤の組み合わせを
選択することもできる。例えば、標的物質が細胞である
場合には、標的物質である細胞と結合し得る凝集剤とし
て細胞含有液中で電離し得るカルシウム化合物を用いる
ことができ、この場合、カルシウム化合物の電離によっ
て生じたカルシウムイオンは、細胞膜表面のリン酸やタ
ンパク質と結合する。Of course, the combination of particles and aggregating agent can also be selected so that the particles and / or aggregating agent can bind to the target substance. For example, when the target substance is a cell, a calcium compound that can be ionized in a cell-containing liquid can be used as an aggregating agent that can bind to the cell that is the target substance. Calcium ions bind to phosphate and proteins on the cell membrane surface.
【００４４】粒子と標的物質との結合様式及び凝集剤と
標的物質との結合様式は特に限定されるものではなく、
その具体例としては、電磁気力、静電気力（クーロン
力）、磁気力又は分子間力による結合、水素結合、イオ
ン結合、共有結合、配位結合、吸着等が挙げられる。こ
れらの結合様式のうち、標的物質を解離させ得るような
結合様式であることが好ましい。The binding mode between the particles and the target substance and the binding mode between the aggregating agent and the target substance are not particularly limited,
Specific examples thereof include electromagnetic force, electrostatic force (Coulomb force), bond by magnetic force or intermolecular force, hydrogen bond, ionic bond, covalent bond, coordinate bond, adsorption and the like. Among these binding modes, a binding mode that can dissociate the target substance is preferable.
【００４５】標的物質を解離させ得るような結合様式と
しては、例えば、イオン結合、疎水結合、吸着等が挙げ
られる。例えば、標的物質である細胞の細胞膜表面のリ
ン酸やタンパク質とカルシウムイオンとが結合している
場合、カルシウムイオンをＥＤＴＡ等のキレート剤によ
って除去することによって細胞を解離させることができ
る。また、吸着の場合には加熱することにより標的物質
を解離させることができる。Examples of the binding mode capable of dissociating the target substance include ionic bond, hydrophobic bond, adsorption and the like. For example, when the phosphate or protein on the cell membrane surface of the cell, which is a target substance, is bound to calcium ions, the cells can be dissociated by removing the calcium ions with a chelating agent such as EDTA. Further, in the case of adsorption, the target substance can be dissociated by heating.
【００４６】本発明の標的物質の分離方法においては、
粒子及び／又は凝集剤に適当な化学修飾を施すことによ
り、あるいは標的物質に適当な化学修飾を施すことによ
り、粒子及び／又は凝集剤と標的物質とを結合させるこ
とができるので、分離対象となる標的物質は特に限定さ
れない。In the method for separating a target substance of the present invention,
The particles and / or aggregating agent can be bound to the target substance by applying an appropriate chemical modification to the particles and / or the aggregating agent, or by subjecting the target substance to an appropriate chemical modification. The target substance is not particularly limited.
【００４７】標的物質は、有機物質、無機物質、低分
子、高分子等のいずれであってもよく、その具体例とし
ては、動物細胞、植物細胞、微生物、タンパク質、核
酸、生体高分子、ビタミン、ホルモン、活性ペプチド、
薬剤等が挙げられる。これらの標的物質のうち、粒子及
び／又は凝集剤との結合部位を複数有するものが好まし
い。例えば、標的物質が動物細胞である場合には、凝集
剤であるカルシウム化合物から生じるカルシウムイオン
との結合部位（細胞膜表面のリン酸イオン、表在タンパ
ク質）を複数有している。このように、標的物質が粒子
及び／又は凝集剤との結合部位を複数有する場合には、
標的物質と粒子と凝集剤とを含む凝集物が形成される
際、標的物質が粒子及び／又は凝集剤との結合によって
粒子及び／又は凝集剤に挟持された状態となり、標的物
質を凝集物にしっかりと保持することができる。The target substance may be any of an organic substance, an inorganic substance, a low molecule, a polymer and the like. Specific examples thereof include animal cells, plant cells, microorganisms, proteins, nucleic acids, biopolymers, vitamins. , Hormones, active peptides,
Examples include drugs. Among these target substances, those having a plurality of binding sites for the particles and / or the aggregating agent are preferable. For example, when the target substance is an animal cell, the target substance has a plurality of binding sites (calcium ion, phosphate on the cell membrane surface, surface protein) for binding to a calcium ion generated from a calcium compound which is an aggregating agent. Thus, when the target substance has a plurality of binding sites for particles and / or aggregating agents,
When an aggregate containing the target substance, particles, and an aggregating agent is formed, the target substance becomes a state of being sandwiched between the particles and / or the aggregating agent by the binding with the particles and / or the aggregating agent, and the target substance becomes an aggregate. Can be held firmly.
【００４８】本発明の標的物質の分離方法においては、
標的物質と粒子と凝集剤（以下「三成分」という場合が
ある。）とを液体中で混在させる。In the method for separating a target substance of the present invention,
A target substance, particles, and an aggregating agent (hereinafter sometimes referred to as “three components”) are mixed in a liquid.
【００４９】三成分を混在させる液体は特に限定される
ものではないが、標的物質が安定して存在し得る液体で
あることが好ましい。標的物質が破壊されたり変性した
りすると、標的物質を分離する意味がなくなってしまう
場合があるので、三成分を混在させる液体は標的物質の
分離目的に応じて適宜選択する。例えば、分離した標的
細胞から核酸を抽出する場合には、細胞膜が破壊されな
いような液体（例えばリン酸緩衝液）を用いることが好
ましい。また、標的物質がタンパク質である場合には、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液等を用いる
ことができ、標的物質が核酸である場合には、精製水、
純水、ＰＢＳ、ＴＥバッファー等を用いることができ
る。The liquid in which the three components are mixed is not particularly limited, but it is preferable that the target substance can exist stably. When the target substance is destroyed or denatured, it may be meaningless to separate the target substance. Therefore, the liquid in which the three components are mixed is appropriately selected according to the purpose of separating the target substance. For example, when the nucleic acid is extracted from the separated target cells, it is preferable to use a liquid that does not destroy the cell membrane (for example, phosphate buffer). When the target substance is a protein,
A borate buffer solution, a Tris buffer solution, a phosphate buffer solution or the like can be used. When the target substance is a nucleic acid, purified water,
Pure water, PBS, TE buffer or the like can be used.
【００５０】三成分を液体に混在させる際、その添加の
順序は特に限定されない。三成分を一度に液体に添加し
てもよいし、三成分のうち、いずれか一成分を含有する
液体に他の二成分を任意の順序で添加してもよいし、い
ずれか二成分を含有する液体に残りの一成分を添加して
もよい。三成分の添加の順序によっては、残りの一成分
を添加する際に先に添加された二成分が結合している場
合（例えば、粒子及び凝集剤を先に液体に添加した場
合、標的物質及び該標的物質と結合し得る粒子を先に液
体に添加した場合、標的物質及び該標的物質と結合し得
る凝集剤を先に液体に添加した場合）もあるが、最終的
に一の液体中に三成分が含有される限り、液体中での三
成分の状態に関わらず、本発明における「混在」に含ま
れる。When the three components are mixed in the liquid, the order of addition is not particularly limited. The three components may be added to the liquid at one time, or the two other components may be added in any order to the liquid containing any one of the three components, or any two components may be included. The remaining one component may be added to the liquid. Depending on the order of addition of the three components, when the remaining two components are combined when the remaining one component is added (for example, when the particles and the aggregating agent are first added to the liquid, the target substance and the (When the particles capable of binding to the target substance are added to the liquid first, the target substance and the aggregating agent capable of binding to the target substance are added to the liquid first). As long as the three components are contained, they are included in the “mixed” in the present invention regardless of the state of the three components in the liquid.
【００５１】例えば、標的物質が夾雑物を含む試料溶液
中に含有されており、この試料溶液から標的物質を分離
する際には、試料溶液に粒子及び凝集剤を一度に添加し
てもよいし、粒子及び凝集剤を含有する液体に試料溶液
を添加してもよいし、粒子又は凝集剤を含有する液体に
試料溶液を添加した後、残りの一成分（凝集剤又は粒
子）を添加してもよい。For example, the target substance is contained in a sample solution containing contaminants, and when separating the target substance from this sample solution, the particles and the aggregating agent may be added to the sample solution at once. The sample solution may be added to the liquid containing the particles and the aggregating agent, or the sample solution may be added to the liquid containing the particles or the aggregating agent, and then the remaining one component (aggregating agent or particles) may be added. Good.
【００５２】三成分を混在させる際には、三成分を含む
凝集物が形成されるように、三成分を十分に混じり合わ
せることが望ましい。例えば、三成分を含有する液体を
ミキサーにより攪拌したり、ピペットにより吸引・吐出
したりすることによって、強制的に三成分を混じり合わ
せることができる。三成分を混在させる際、粒子が安定
して液体中に分散していることが好ましい。例えば、粒
子がその表面に分散媒と親和力の強い官能基を有してい
る場合には、当該粒子は安定して分散することができ
る。粒子がそのような官能基を有していない場合には、
液体中に粒子の分散状態を安定化させる安定剤を添加し
てもよい。安定剤は、粒子の種類に応じて適宜選択する
ことができる。例えば、粒子の分散液が疎液ゾル（粒子
と分散媒との親和力が弱い分散系）である場合には、安
定剤として親液コロイドを選択することができる。この
ように疎液ゾルを安定化させる親液コロイドは保護コロ
イドと呼ばれており、その具体例として、ゼラチン、ア
ルブミン、アラビアゴム、プロタルピン酸、リサルピン
酸等が挙げられる。When the three components are mixed, it is desirable that the three components are sufficiently mixed so that an aggregate containing the three components is formed. For example, the three components can be compulsorily mixed by stirring the liquid containing the three components with a mixer or sucking and discharging the liquid with a pipette. When the three components are mixed, it is preferable that the particles are stably dispersed in the liquid. For example, when the particles have a functional group having a strong affinity for the dispersion medium on the surface, the particles can be stably dispersed. If the particles do not have such functional groups,
A stabilizer that stabilizes the dispersed state of the particles may be added to the liquid. The stabilizer can be appropriately selected depending on the type of particles. For example, when the dispersion liquid of particles is a lyophobic sol (dispersion system in which the affinity between the particles and the dispersion medium is weak), a lyophilic colloid can be selected as the stabilizer. The lyophilic colloid that stabilizes the lyophobic sol in this way is called a protective colloid, and specific examples thereof include gelatin, albumin, gum arabic, protarpic acid, lysalpic acid, and the like.
【００５３】標的物質と粒子と凝集剤とを液体中に混在
させると、粒子が凝集剤によって凝集するとともに、標
的物質が粒子及び／又は凝集剤と結合することによっ
て、標的物質と粒子と凝集剤とを含む凝集物が形成され
る。この凝集物には、標的物質が粒子及び／又は凝集剤
との結合によって保持されている。この際、標的物質
が、粒子及び／又は凝集剤との結合部位を複数有してい
れば、標的物質は粒子及び／又は凝集剤によって挟持さ
れた状態となり、標的物質は凝集物中にしっかりと保持
される。但し、凝集物中に含まれる標的物質の全てが粒
子及び／又は凝集剤によって挟持された状態となるわけ
ではなく、例えば、標的物質凝集物の表面に位置する標
的物質は挟持された状態にはない。When the target substance, the particles, and the aggregating agent are mixed in the liquid, the particles are aggregated by the aggregating agent, and the target substance is bound to the particles and / or the aggregating agent, so that the target substance, the particles, and the aggregating agent are combined. Aggregates containing and are formed. In this aggregate, the target substance is retained by binding with the particles and / or the aggregating agent. At this time, if the target substance has a plurality of binding sites with the particles and / or the aggregating agent, the target substance is sandwiched by the particles and / or the aggregating agent, and the target substance is firmly contained in the aggregate. Retained. However, not all the target substances contained in the aggregate are in a state of being sandwiched by the particles and / or the aggregating agent, and for example, the target substance located on the surface of the target substance aggregate is in a sandwiched state. Absent.
【００５４】例えば、標的物質が細胞であり、粒子がリ
ン酸基を表面に有する粒子であり、凝集剤がカルシウム
化合物である場合、三成分を生理食塩水中に混在させる
と、カルシウム化合物が電離してカルシウムイオンが生
じ、このカルシウムイオンが、細胞膜表面のリン酸やタ
ンパク質と結合するとともに粒子表面のリン酸基と結合
することにより粒子と細胞とが連結され、細胞が保持さ
れた凝集物が形成される。この凝集物を適当な条件下で
形成させることにより、細胞と粒子とカルシウムイオン
とを含むハイドロキシアパタイトゲルが形成される。For example, when the target substance is a cell, the particle is a particle having a phosphate group on the surface, and the aggregating agent is a calcium compound, when the three components are mixed in physiological saline, the calcium compound ionizes. Calcium ion is generated, and this calcium ion binds to the phosphate and protein on the cell membrane surface and also binds to the phosphate group on the particle surface to connect the particle and the cell, forming an aggregate that retains the cell. To be done. By forming these aggregates under appropriate conditions, a hydroxyapatite gel containing cells, particles and calcium ions is formed.
【００５５】標的物質が保持された凝集物中には、遠隔
操作により位置制御可能な粒子が含まれているので、こ
の粒子を遠隔操作により位置制御することによって、液
体から凝集物を分離することができる。Since the aggregate in which the target substance is retained contains particles whose position can be controlled by remote control, it is possible to separate the aggregate from the liquid by controlling the position of these particles by remote control. You can
【００５６】例えば、遠隔操作により位置制御可能な粒
子が磁性粒子である場合には、磁石（例えば、永久磁
石、ソレノイドを用いた電磁石、超伝導磁石）を用いて
位置制御することによって凝集物を分離することができ
る。For example, when the particles whose position can be controlled by remote control are magnetic particles, the position of the particles can be controlled by using a magnet (for example, a permanent magnet, an electromagnet using a solenoid, or a superconducting magnet) to form an aggregate. Can be separated.
【００５７】また、遠隔操作により位置制御可能な粒子
が誘導体粒子（例えばアルミナ粒子、シリコーンゴム粒
子）又は荷電粒子である場合には、電極間に発生する電
場を印加することによって位置制御することによって凝
集物を分離することができる。通常、電極間に大きな電
圧を印加した場合の電極反応（電気分解）の発生を防止
するため、電極間には交流高周波電場をかけ、交流電場
とそれにより対象に誘導される電気双極子との相互作用
を利用することによって誘電体粒子又は荷電粒子に運動
を引き起こすことができる。この際、一方の電極の形状
を尖った電極とすると、その電極の電場が強いので、誘
導体粒子又は荷電粒子は尖った電極方向へ移動させるこ
とができる。電極に印加される電圧の極性が反転して
も、誘導体粒子又は荷電粒子に誘導される分極の向きも
反対極性になるので、力の向きは変わらない。これによ
って誘導泳動を起こすことができる。誘電体粒子又は荷
電粒子の誘電率が該粒子の分散液よりも低い場合と高い
場合とでは、誘導される電荷の極性が反対となり、低い
場合には、誘導体粒子を電場の弱い方向へ働く力が強く
して、逆方向に移動させることができる。なお、粒子の
分散液中で電界効果を用いるには、過度のジュール損失
を防止するために、分散媒の導電率がある程度低い必要
がある。また、電極は必ずしも、一対のみならず、複数
対の電極を同期して制御することによって、回転等の複
雑な動きをさせることも可能である。When particles whose position can be controlled by remote control are derivative particles (eg, alumina particles, silicone rubber particles) or charged particles, the position can be controlled by applying an electric field generated between the electrodes. Aggregates can be separated. Usually, in order to prevent the occurrence of electrode reaction (electrolysis) when a large voltage is applied between the electrodes, an AC high-frequency electric field is applied between the electrodes, and the AC electric field and the electric dipole induced by the target are thereby generated. Motion can be induced in the dielectric particles or charged particles by utilizing the interaction. At this time, if one of the electrodes has a pointed shape, the electric field at that electrode is strong, so that the derivative particles or charged particles can be moved in the pointed electrode direction. Even if the polarity of the voltage applied to the electrodes is reversed, the direction of the polarization induced by the derivative particles or the charged particles also has the opposite polarity, so the direction of the force does not change. This allows induction migration to occur. When the dielectric constant of the dielectric particles or charged particles is lower and higher than that of the dispersion liquid of the particles, the polarities of the induced charges are opposite to each other. Is stronger and can be moved in the opposite direction. In order to use the electric field effect in the dispersion liquid of particles, the conductivity of the dispersion medium needs to be low to some extent in order to prevent excessive Joule loss. Further, the electrodes are not always limited to a pair, and a complicated movement such as rotation can be performed by controlling a plurality of pairs of electrodes in synchronization.
【００５８】また、遠隔操作により位置制御可能な粒子
が高分子微粒子である場合には、２本のレーザ光を対向
させて照射し、微粒子を挟み込むように捕捉することが
できる。この際、粒子が透明体であれば、屈折率の異な
る微粒子を通過することにより、屈折し、光の運動量が
入射前後で変化する。この変化した運動量は、保存則に
従い微粒子に受け渡され、結果として微粒子に放射圧が
発生し、微粒子の屈折率が周囲の媒質より高い場合、こ
れらの力の和はレーザの焦点位置方向を向き、その力が
ブラウン運動を抑え、重力等の外力と釣り合った位置で
微粒子が捕捉される。レーザ光の焦点位置を移動すれ
ば、捕捉されている微粒子はそれに追従する。これによ
って、例えば、光学的機器の焦点に微粒子を捕捉して、
１個の粒子に注目した観測等を行なうことが可能とな
る。When the particles whose position can be controlled by remote control are polymer particles, it is possible to irradiate two laser beams so as to face each other and capture the particles so as to sandwich them. At this time, if the particles are transparent, they pass through fine particles having different refractive indices to be refracted and the momentum of light changes before and after the incidence. This changed momentum is transferred to the fine particles according to the conservation law, and as a result, radiation pressure is generated on the fine particles, and when the refractive index of the fine particles is higher than that of the surrounding medium, the sum of these forces is directed toward the laser focus position direction. , The force suppresses Brownian motion, and the fine particles are captured at a position balanced with an external force such as gravity. If the focal position of the laser light is moved, the trapped particles will follow it. This allows, for example, to capture particles at the focal point of an optical instrument,
It becomes possible to perform observations, etc., focusing on one particle.
【００５９】また、遠隔操作により位置制御可能な粒子
が、分散媒よりも膨張率の高い物質（例えば、気体を弾
性のある膜で包んだ物質）からなる場合には、温度の上
昇によって粒子を上昇させ、温度の降下によって粒子を
下降させることができる。When the particles whose position can be controlled by remote control are made of a substance having a higher expansion coefficient than the dispersion medium (for example, a substance in which a gas is wrapped with an elastic film), the particles are increased by increasing the temperature. It is possible to raise and to lower the particles by lowering the temperature.
【００６０】凝集物を分離した後、凝集物に含まれる標
的物質を解離させることによって標的物質含有液を得る
ことができる。凝集物からの標的物質の解離は、粒子及
び／又は凝集剤と標的物質との結合様式に応じた方法に
よって行なうことができる。例えば、標的物質が金属イ
オンとの結合を介して凝集物に保持されている場合（例
えば、標的物質が細胞であり、凝集剤がカルシウム化合
物であって、カルシウム化合物が電離して生じたカルシ
ウムイオンが細胞膜表面のリン酸基と結合することによ
って細胞が凝集物に保持されている場合）には、キレー
ト剤によって金属イオンを捕獲することにより、凝集物
から標的物質を解離させることができる。After separating the aggregate, the target substance-containing liquid can be obtained by dissociating the target substance contained in the aggregate. The dissociation of the target substance from the aggregate can be performed by a method depending on the binding mode between the particles and / or the aggregating agent and the target substance. For example, when the target substance is retained in the aggregate through binding with a metal ion (for example, the target substance is a cell, the aggregating agent is a calcium compound, and the calcium compound is ionized to generate a calcium ion). When the cells are retained in the aggregate by binding to the phosphate group on the cell membrane surface), the target substance can be dissociated from the aggregate by capturing the metal ion with the chelating agent.
【００６１】凝集物から標的物質を解離させた後、遠隔
操作により標的物質含有液から粒子を除去することがで
きる。この際、粒子と凝集剤とが結合した状態であれ
ば、凝集剤も粒子とともに除去される。また、粒子と凝
集剤とが解離した状態であれば、粒子のみが除去され、
凝集剤は標的物質とともに液体中に残存することとな
る。凝集剤は必要に応じて常法に基づき除去することが
できる。After dissociating the target substance from the aggregate, the particles can be removed from the target substance-containing liquid by remote control. At this time, if the particles and the aggregating agent are bound together, the aggregating agent is also removed together with the particles. Further, if the particles and the aggregating agent are dissociated, only the particles are removed,
The aggregating agent remains in the liquid together with the target substance. The aggregating agent can be removed by a conventional method, if necessary.
【００６２】遠隔操作により位置制御し得る粒子であっ
てリン酸基を表面に有する前記粒子と、前記粒子を凝集
させる凝集剤としてカルシウム化合物を用いて、標的物
質である細胞を分離する方法（工程（ａ）及び（ｂ）を
含む方法）について、以下に説明する。A method for separating cells as a target substance by using particles having a phosphate group on the surface which can be position-controlled by remote control and a calcium compound as an aggregating agent for aggregating the particles (step The method including (a) and (b) will be described below.
【００６３】工程（ａ）
工程（ａ）では、標的細胞が安定して存在し得る液体中
に、標的物質と、遠隔操作により位置制御可能であって
表面にリン酸基を有する複数の粒子と、カルシウムイオ
ンとを混在させる。 Step (a) In step (a), a target substance and a plurality of particles each having a phosphate group on the surface, which can be position-controlled by remote control, are placed in a liquid in which the target cells can stably exist. , With calcium ions.
【００６４】「標的細胞が安定して存在し得る液体」と
は、標的細胞の細胞膜が破壊されないような液体であれ
ばよく、必ずしも標的細胞が生存し得るような液体であ
る必要はない。標的細胞が安定して存在し得る液体とし
ては、例えば、リン酸緩衝液、生理食塩水、ＰＢＳ等が
挙げられる。The “liquid in which the target cells can stably exist” may be any liquid that does not destroy the cell membrane of the target cells, and is not necessarily a liquid in which the target cells can survive. Examples of the liquid in which the target cells can stably exist include phosphate buffer, physiological saline, PBS and the like.
【００６５】標的細胞は、細胞表面が細胞膜によって構
成されている細胞であれば特に限定されるものではな
く、このような細胞としては、例えば、動物細胞、微生
物等が挙げられる。これらの細胞の表面を構成している
細胞膜の基本構造は、脂質二重層からなっている。この
脂質二重層は、その外側がリン脂質等の極性脂質の親水
性部分（リン酸部分など）から構成され、その内側が疎
水性部分（脂肪酸部分など）から構成されているので、
細胞膜表面にはリン酸（リン酸基）が露出している。し
たがって、カルシウムイオンは、粒子表面のリン酸基と
結合して粒子を凝集させるとともに、細胞膜表面のリン
酸と結合する。また、カルシウムイオンは、細胞膜表面
に存在するタンパク質とも結合する。さらに、二価の金
属イオンであるカルシウムイオンは、異なる粒子のリン
酸基と結合して粒子同士を連結するとともに、細胞膜表
面のリン酸やタンパク質及び粒子表面のリン酸基と結合
して標的細胞と粒子とを連結する。これによって、標的
細胞と粒子とカルシウムイオンとを含む凝集物が形成さ
れる。この凝集物はカルシウムイオンとリン酸又はリン
酸基との結合によって生じるリン酸カルシウムを含んで
おり、この凝集物を適当な条件下で形成させると、標的
細胞と粒子とカルシウムイオンとを含むハイドロキシア
パタイトゲルを形成させることができる。凝集物をハイ
ドロキシアパタイトゲルとして形成させることにより、
標的細胞を凝集物にしっかりと保持することができる。The target cell is not particularly limited as long as the cell surface is composed of a cell membrane, and examples of such cells include animal cells and microorganisms. The basic structure of the cell membrane that constitutes the surface of these cells consists of a lipid bilayer. This lipid bilayer is composed of hydrophilic portions (phosphoric acid moieties, etc.) of polar lipids such as phospholipids on the outside and hydrophobic moieties (fatty acid moieties, etc.) on the inside,
Phosphoric acid (phosphate group) is exposed on the cell membrane surface. Therefore, calcium ions combine with the phosphate groups on the particle surface to aggregate the particles, and also combine with the phosphate on the cell membrane surface. Calcium ions also bind to proteins present on the cell membrane surface. In addition, calcium ions, which are divalent metal ions, bind to the phosphate groups of different particles to connect the particles together, and also bind to phosphate and proteins on the cell membrane surface and phosphate groups on the particle surface to target cells. And the particles are connected. This results in the formation of aggregates containing the target cells, particles and calcium ions. This aggregate contains calcium phosphate generated by binding of calcium ion to phosphate or phosphate group, and when this aggregate is formed under appropriate conditions, a hydroxyapatite gel containing target cells, particles and calcium ions is formed. Can be formed. By forming the aggregate as a hydroxyapatite gel,
Target cells can be held tightly in aggregates.
【００６６】ハイドロキシアパタイトゲルは、標的細胞
と粒子とカルシウムイオンとを混在させる溶液のｐＨを
７〜８以上にすることによって形成させることができ
る。溶液のｐＨは、ｐＨ８以上の緩衝液やＮａＯＨ等の
アルカリ溶液を加えることによって７〜８以上にするこ
とができる。The hydroxyapatite gel can be formed by adjusting the pH of a solution in which target cells, particles and calcium ions are mixed to 7-8 or higher. The pH of the solution can be adjusted to 7 to 8 or more by adding a buffer solution having a pH of 8 or more and an alkaline solution such as NaOH.
【００６７】標的細胞と粒子とカルシウムイオンとを混
在させる際、これら三成分の添加順序は特に限定されな
い。標的細胞は、通常、夾雑物を含む試料液（例えば、
標的細胞が培養されている液体培地）中に含有されてい
るので、この試料液中に粒子とカルシウムイオンを生じ
得るカルシウム化合物とを一度に添加してもよいし、粒
子及び上記カルシウム化合物を任意の順序で添加しても
よい。また、粒子及び上記カルシウム化合物を含有する
液体に試料溶液を添加してもよいし、粒子又は上記カル
シウム化合物を含有する液体に試料溶液を添加した後、
残りの一成分（上記カルシウム化合物又は粒子）を添加
してもよい。また、表面のリン酸基にカルシウムイオン
を結合させた粒子を試料溶液に添加してもよい。粒子と
上記カルシウム化合物とを先に添加した後、標的細胞を
添加する場合には、標的細胞を添加する時点で既に粒子
とカルシウムイオンとが結合している可能性があるが、
この場合も本発明における「混在」に含まれる。また、
標的細胞と上記カルシウム化合物とを先に添加した後、
粒子を添加する場合も、粒子を添加する時点で既にカル
シウムイオンと標的細胞とが結合している可能性がある
が、この場合も本発明における「混在」に含まれる。す
なわち、標的物質と粒子とカルシウムイオンとが同一の
液体に含有される限り、これらの三成分の結合状態に関
わらず、本発明における「混在」に含まれる。When the target cells, particles and calcium ions are mixed, the order of adding these three components is not particularly limited. The target cell is usually a sample solution containing contaminants (for example,
Since the target cells are contained in the liquid medium in which the cells are cultured, the particles and the calcium compound capable of generating calcium ions may be added to this sample solution at one time, or the particles and the calcium compound may be arbitrarily added. You may add in order. Further, the sample solution may be added to the liquid containing the particles and the calcium compound, or after adding the sample solution to the liquid containing the particles or the calcium compound,
The remaining one component (the above calcium compound or particles) may be added. Further, particles in which calcium ions are bound to the phosphate groups on the surface may be added to the sample solution. After the particles and the calcium compound are added first, when the target cells are added, there is a possibility that the particles and calcium ions are already bound at the time of adding the target cells,
This case is also included in the “mixed” in the present invention. Also,
After first adding the target cells and the calcium compound,
Even when particles are added, calcium ions and target cells may already be bound at the time of adding particles, and this case is also included in the “mixing” in the present invention. That is, as long as the target substance, the particles, and the calcium ion are contained in the same liquid, they are included in the “mixed” in the present invention regardless of the binding state of these three components.
【００６８】工程（ｂ）
工程（ｂ）では、前記粒子を遠隔操作により位置制御す
ることによって、前記凝集物を前記液体から分離する。 Step (b) In step (b), the agglomerates are separated from the liquid by remotely controlling the position of the particles.
【００６９】工程（ａ）で形成させた凝集物には、遠隔
操作により位置制御可能な粒子が含まれているので、こ
の粒子を遠隔操作により位置制御することによって、凝
集物が含まれている液体から、凝集物を分離することが
できる。The agglomerates formed in the step (a) include particles whose position can be controlled by remote control. Therefore, by controlling the positions of these particles by remote control, the agglomerates are included. Aggregates can be separated from the liquid.
【００７０】工程（ａ）及び（ｂ）によって、標的細胞
を、標的細胞を含む凝集物として分離することができる
が、さらに標的細胞を精製して分離するために、必要に
応じて後述する工程（ｃ）及び工程（ｄ）を実施しても
よい。By the steps (a) and (b), the target cells can be separated as an aggregate containing the target cells. If necessary, in order to further purify and separate the target cells, the steps described below are carried out. You may implement (c) and a process (d).
【００７１】工程（ｃ）
工程（ｃ）は、前記凝集物を分離した後、キレート剤を
用いて前記凝集物から前記標的細胞を解離させることに
よって標的細胞含有液を得る工程である。 Step (c) Step (c) is a step of separating the aggregate and then dissociating the target cell from the aggregate using a chelating agent to obtain a target cell-containing liquid.
【００７２】キレート剤を用いることによって、凝集物
に含まれるカルシウムイオンを捕獲することができ、こ
れにより標的細胞とカルシウムイオンとの結合を切断す
ることができるので、凝集物から標的細胞を解離させる
ことができる。この際、粒子とカルシウムイオンとの結
合も切断されるので、粒子も標的細胞とともに解離す
る。凝集物がハイドロキシアパタイトゲルとして形成し
ている場合には、キレート剤によりハイドロキシアパタ
イトゲルはゾル化する。By using the chelating agent, the calcium ions contained in the aggregate can be captured, and thereby the bond between the target cell and the calcium ion can be cleaved, so that the target cell is dissociated from the aggregate. be able to. At this time, the bonds between the particles and calcium ions are also broken, so that the particles also dissociate together with the target cells. When the aggregate is formed as a hydroxyapatite gel, the chelating agent causes the hydroxyapatite gel to become a sol.
【００７３】分離した凝集物をキレート剤により解離さ
せる際には、例えば、分離した凝集物を別の容器に移
し、必要に応じて細胞が安定して存在し得る液体を添加
した後、その容器中で凝集物とキレート剤とを混在させ
ればよい。When dissociating the separated aggregate with a chelating agent, for example, the separated aggregate is transferred to another container, and if necessary, a liquid in which cells can stably exist is added, and then the container is Agglomerates and chelating agents may be mixed therein.
【００７４】工程（ｄ）
工程（ｄ）は、遠隔操作によって前記標的細胞含有液か
ら前記粒子を除去する工程である。標的細胞含有液中に
含有される粒子は、遠隔操作により位置制御することに
よって液体から除去することができる。 Step (d) Step (d) is a step of removing the particles from the target cell-containing liquid by remote control. The particles contained in the target cell-containing liquid can be removed from the liquid by controlling the position by remote control.
【００７５】工程（ｃ）又は（ｄ）によって得られた標
的細胞含有液に含有される標的細胞から核酸を抽出する
ことによって核酸含有液を調製することができる。核酸
の抽出は常法に従って行なうことができる。The nucleic acid-containing solution can be prepared by extracting nucleic acid from the target cells contained in the target cell-containing solution obtained in step (c) or (d). The nucleic acid can be extracted according to a conventional method.
【００７６】工程（ａ）〜工程（ｄ）は、具体的には、
図１に示す分注機を用いて行なうことができる。なお、
この場合の粒子は、磁性粒子である。Specifically, the steps (a) to (d) are as follows.
It can be performed using the dispenser shown in FIG. In addition,
The particles in this case are magnetic particles.
【００７７】図１に示す分注機は、液体を収容する１以
上の容器２１と、容器２１内に挿入して液体の吸引又は
吐出がされる先細りに形成された先端部２５、液体を貯
溜する太めの貯溜部２２、先端部２５及び貯溜部２２を
連通させる細めの液通路２３、並びに液通路２３内に磁
場作用が及ぼされる分離領域部２３１を有するピペット
チップＰと、貯溜部２２の開口にノズルＮを着脱自在に
嵌着してピペットチップＰ内を負圧又は加圧してピペッ
トチップＰに液を吸引し或いは吐出させる分注ユニット
（図示せず）と、液通路２３の外側面に対して近接離間
自在に設けた磁石（Ｍ）２４と、磁石２４を液通路２３
に近接離間させる磁石駆動装置（図示せず）と、分注ユ
ニットの動作や移動及びノズルＮとピペットチップＰと
の着脱並びに磁石駆動装置のピペットチップＰへの磁石
２４の近接離間を制御する制御装置（図示せず）とを有
するものである。なお、図１中、符号２６は、開口に剛
性を持たせるための縁部である。The dispenser shown in FIG. 1 has one or more containers 21 for containing a liquid, a tapered tip portion 25 which is inserted into the container 21 to suck or discharge the liquid, and a liquid reservoir. A pipette tip P having a thicker reservoir portion 22, a distal end portion 25 and a narrower liquid passage 23 for communicating the reservoir portion 22 and a separation region portion 231 in which the magnetic field action is exerted in the liquid passage 23, and an opening of the reservoir portion 22. A nozzle N is removably fitted to the pipette tip P to apply a negative pressure or pressure to the pipette tip P to suck or discharge the liquid into the pipette tip P, and to the outer surface of the liquid passage 23. On the other hand, the magnet (M) 24 provided so as to be close to and away from the liquid passage 23
And a magnet driving device (not shown) that moves the magnet 24 closer to and away from the nozzle, control that controls movement of the dispensing unit, attachment / detachment of the nozzle N and the pipette chip P, and proximity of the magnet 24 to the pipette chip P of the magnet driver. And a device (not shown). In FIG. 1, reference numeral 26 is an edge portion for giving rigidity to the opening.
【００７８】この分注ユニットは、ピペットチップＰの
上端部に着脱自在に設けられ、ピペットチップＰと連通
接続され、シリンダー等の液の吸引・吐出を行なう機構
である。もちろん、このピペットチップＰは、図１に示
す形状に限定されるものではなく、液がピペットチップ
Ｐに吸引されたとき、磁石２４によって液中の磁性体粒
子を保持した凝集物４０が確実に捕集される形状であれ
ば、どのような形状であってもよいが、磁石２４による
捕集の完全化を図るためには、磁石２４が接離する部分
の口径を細く形成し、かつ、吸引或いは吐出の流速を吸
着効率良く制御するのが望ましい。This dispensing unit is a mechanism that is detachably provided on the upper end of the pipette tip P, is connected to the pipette tip P for communication, and sucks and discharges a liquid such as a cylinder. Of course, the pipette tip P is not limited to the shape shown in FIG. 1, and when the liquid is sucked into the pipette tip P, the aggregate 40 holding the magnetic particles in the liquid by the magnet 24 is surely generated. Although any shape may be used as long as it is a shape to be collected, in order to complete the collection by the magnet 24, the diameter of the portion where the magnet 24 comes into contact with and separates is formed thin, and It is desirable to control the flow rate of suction or discharge with good adsorption efficiency.
【００７９】永久磁石２４が発生する磁場の大きさは、
永久磁石２４がピペットチップＰに最も近く接近した場
合に液通路２３に対し、磁性粒子３３及び標的細胞３４
を含む凝集物４０をピペットチップＰの液通路２３に接
する壁に付着保持させることができ、永久磁石２４がピ
ペットチップＰから最も離れた場合には、磁性体粒子３
３を含む凝集物４０に永久磁石２４による磁場の影響を
与えない程度の大きさである。磁場源としては、永久磁
石に限られず、ソレノイドを用いた電磁石、超伝導磁石
等を用いることもできる。The magnitude of the magnetic field generated by the permanent magnet 24 is
When the permanent magnet 24 comes closest to the pipette tip P, the magnetic particles 33 and the target cells 34 are supplied to the liquid passage 23.
The agglomerates 40 containing P can be adhered and held to the wall of the pipette tip P in contact with the liquid passage 23, and when the permanent magnet 24 is farthest from the pipette tip P, the magnetic particles 3
The size is such that the aggregate 40 containing 3 is not affected by the magnetic field of the permanent magnet 24. The magnetic field source is not limited to a permanent magnet, and an electromagnet using a solenoid, a superconducting magnet, or the like can be used.
【００８０】図１に示す分注機を用いて工程（ａ）〜工
程（ｄ）を行なう手順を、図２及び図３のステップ１〜
ステップ８に示す。The procedure of performing steps (a) to (d) using the dispenser shown in FIG.
This is shown in step 8.
【００８１】表面にリン酸基を有する複数の磁性粒子Ｒ
と、カルシウムイオンＩとを含む液体Ｌ１を含有する容
器２１ａから、所定量の液体Ｌ１をピペットチップＰで
吸引する（ステップ１）。A plurality of magnetic particles R having phosphoric acid groups on the surface
And a predetermined amount of the liquid L1 is sucked with the pipette tip P from the container 21a containing the liquid L1 containing the calcium ion I (step 1).
【００８２】このピペットチップＰを、標的細胞Ｔを含
有する液体Ｌ２が粗分注された容器２１ｂまで移送し、
ピペットチップＰ内の液体Ｌ１を容器２１ｂに吐出し、
液体Ｌ１と液体Ｌ２とを混合する（ステップ２）。The pipette tip P is transferred to the container 21b in which the liquid L2 containing the target cells T is roughly dispensed,
The liquid L1 in the pipette tip P is discharged into the container 21b,
The liquid L1 and the liquid L2 are mixed (step 2).
【００８３】容器２１ｂ内の混合液Ｌ３（液体Ｌ１と液
体Ｌ２との混合液）をピペットチップＰで繰り返し吸引
・吐出することによって、標的細胞Ｔと磁性粒子Ｒとカ
ルシウムイオンＩとを十分に混合し、これら三成分を含
む凝集物Ｇを形成する（ステップ３）。The target cell T, the magnetic particles R and the calcium ions I are sufficiently mixed by repeatedly sucking and discharging the mixed liquid L3 (mixed liquid of the liquid L1 and the liquid L2) in the container 21b with the pipette tip P. Then, an aggregate G containing these three components is formed (step 3).
【００８４】凝集物Ｇを含む混合液Ｌ３をピペットチッ
プＰで吸引する（ステップ４）。凝集物Ｇには磁性粒子
Ｒが含まれているので、凝集物Ｇは、ピペットチップＰ
の液通路２３内の分離領域部２３１を通過する際に、ピ
ペットチップＰの外側に配設された磁石２４の磁力によ
って液通路２３の内壁面に捕集される。磁石２４の磁場
の強さは、凝集物Ｇを液通路２３の内壁面に保持できる
が、数回繰り返し液体を吸引・吐出することによって保
持された凝集物Ｇが液通路２３の内壁面から剥がれる程
度の大きさである。このような磁場の大きさは、設置位
置、液通路２３の径の大きさ、凝集物Ｇに含まれる磁性
粒子Ｒの量等に応じて適宜設定することができる。The mixed solution L3 containing the aggregate G is sucked with the pipette tip P (step 4). Since the agglomerate G contains the magnetic particles R, the agglomerate G is
When passing through the separation area portion 231 in the liquid passage 23, the magnetic force of the magnet 24 arranged outside the pipette tip P collects it on the inner wall surface of the liquid passage 23. The strength of the magnetic field of the magnet 24 allows the aggregate G to be retained on the inner wall surface of the liquid passage 23, but the retained aggregate G is peeled from the inner wall surface of the liquid passage 23 by repeatedly sucking and discharging the liquid several times. It is about the size. The magnitude of such a magnetic field can be appropriately set according to the installation position, the diameter of the liquid passage 23, the amount of the magnetic particles R contained in the aggregate G, and the like.
【００８５】このようにして凝集物Ｇが捕集された後、
凝集物Ｇを除く混合液Ｌ３は、容器２１ｂに吐出されて
排液され、凝集物ＧのみがピペットチップＰに残る（ス
テップ５）。このとき、凝集物Ｇは濡れているので、混
合液Ｌ３が排出されてもピペットチップＰの液通路２３
内壁面に付着したまま保持され、ピペットチップＰを移
送したとしてもみだりに脱落しない。After the aggregate G is thus collected,
The mixed liquid L3 excluding the aggregate G is discharged to the container 21b and drained, and only the aggregate G remains in the pipette tip P (step 5). At this time, since the aggregate G is wet, even if the mixed liquid L3 is discharged, the liquid passage 23 of the pipette tip P is discharged.
The pipette tip P is kept attached to the inner wall surface and does not drop off even if the pipette tip P is transferred.
【００８６】次いで、ピペットチップＰは、凝集物Ｇを
保持したまま、キレート剤Ｋを含む液体Ｌ４を含有する
容器２１ｃまで移送され、容器２１ｃ内の液体Ｌ４を繰
り返し吸引・吐出する（ステップ６）。このとき、磁石
２４は、ピペットチップＰから離れる方向に移動して凝
集物Ｇの保持状態を解除し、容器２１ｃ内の液体Ｌ４が
吸引・吐出されることによって、凝集物Ｇは容器２１ｃ
内に吐出される。また、液体Ｌ４に含まれるキレート剤
Ｋによって凝集物Ｇに含まれるカルシウムイオンＩは捕
獲され、凝集物Ｇに含まれる標的細胞Ｔは解離する。Next, the pipette tip P is transferred to the container 21c containing the liquid L4 containing the chelating agent K while holding the aggregate G, and the liquid L4 in the container 21c is repeatedly sucked and discharged (step 6). . At this time, the magnet 24 moves in a direction away from the pipette tip P to release the holding state of the aggregate G, and the liquid L4 in the container 21c is sucked and discharged, so that the aggregate G is removed from the container 21c.
Is discharged inside. Further, the calcium ion I contained in the aggregate G is captured by the chelating agent K contained in the liquid L4, and the target cells T contained in the aggregate G are dissociated.
【００８７】液体Ｌ４の吸引・吐出が終了した後、ピペ
ットチップＰは、凝集物Ｇから解離した標的細胞Ｔを含
む容器２１ｃ内の液体Ｌ５をゆっくりと吸引する（ステ
ップ７）。このとき、磁石２４は、再びピペットチップ
Ｐに接近し、吸引された液体中に含まれる磁性粒子を全
て捕集する。After the suction / discharge of the liquid L4 is completed, the pipette tip P slowly sucks the liquid L5 in the container 21c containing the target cells T dissociated from the aggregate G (step 7). At this time, the magnet 24 again approaches the pipette tip P and collects all the magnetic particles contained in the sucked liquid.
【００８８】磁性粒子Ｒを除く液体Ｌ５（標的細胞Ｔを
含む。）は、容器２１ｃに吐出されて排液され、磁性粒
子ＲのみがピペットチップＰに残る（ステップ８）。こ
うして、標的細胞Ｔ含有液が容器２１ｃ内に調製され
る。The liquid L5 (including the target cells T) excluding the magnetic particles R is discharged to the container 21c and drained, and only the magnetic particles R remain on the pipette tip P (step 8). In this way, the target cell T-containing liquid is prepared in the container 21c.
【００８９】図１に示す分注機を用いて標的核酸からの
核酸の抽出を行なう手順を、図３のステップ９〜ステッ
プ１２に示す。A procedure for extracting nucleic acid from a target nucleic acid using the dispenser shown in FIG. 1 is shown in steps 9 to 12 of FIG.
【００９０】ステップ８の後に、ピペットチップＰは、
磁性粒子Ｒを保持したまま容器２１ｄまで移送され、容
器２１ｄ内の洗浄液Ｌ６を繰り返し吸引・吐出する（ス
テップ９）。このとき、磁石２４は、ピペットチップＰ
から離れる方向に移動して磁性粒子Ｒの保持状態を解除
し、容器２１ｄ内の洗浄液Ｌ６が吸引・吐出されること
によって、磁性粒子Ｒは容器２１ｄ内に吐出される。After step 8, the pipette tip P
The magnetic particles R are transferred to the container 21d while being held, and the cleaning liquid L6 in the container 21d is repeatedly sucked and discharged (step 9). At this time, the magnet 24 is connected to the pipette tip P.
The magnetic particles R are discharged into the container 21d by moving away from the magnetic particles R to release the holding state of the magnetic particles R and sucking and discharging the cleaning liquid L6 in the container 21d.
【００９１】洗浄されたピペットチップＰは、容器２１
ｅに移送し、容器２１ｅ内の核酸抽出液Ｌ７を吸引する
（ステップ１０）。核酸抽出液Ｌ７の組成は、例えば、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ ＳＤＳで
ある。核酸抽出液Ｌ７には、必要に応じてｐｒｏｔｅｉ
ｎａｓｅＫ溶液を添加しておく。The washed pipette tip P is stored in the container 21.
e, and the nucleic acid extract L7 in the container 21e is aspirated (step 10). The composition of the nucleic acid extract L7 is, for example,
150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (p
H8.0), 10 mM EDTA and 0.1% SDS. If necessary, the nucleic acid extract L7 may contain protei.
naseK solution is added.
【００９２】このピペットチップＰは、ステップ８で調
製された標的細胞Ｔ含有液を含む容器２１ｃまで移送さ
れ、ピペットチップＰ内の核酸抽出液Ｌ７を容器２１ｃ
内に吐出し、標的細胞Ｔ含有液と核酸抽出液Ｌ７とを混
合する（ステップ１１）。The pipette tip P is transferred to the container 21c containing the target cell T-containing liquid prepared in step 8 and the nucleic acid extract L7 in the pipette tip P is transferred to the container 21c.
Then, the target cell T-containing liquid and the nucleic acid extract L7 are mixed therein (step 11).
【００９３】容器２１ｃ内の混合液Ｌ８（標的細胞Ｔ含
有液と核酸抽出液Ｌ７との混合液）をピペットチップＰ
で繰り返し吸引・吐出することによって、標的細胞Ｔか
ら核酸Ｄを抽出する（ステップ１２）。こうして、核酸
Ｄ含有液が容器２１ｃ内に調製される。The mixed solution L8 (mixed solution of the target cell T-containing solution and the nucleic acid extract L7) in the container 21c is pipetted into a pipette tip P.
The nucleic acid D is extracted from the target cell T by repeatedly aspirating and discharging at (step 12). Thus, the nucleic acid D-containing liquid is prepared in the container 21c.
【００９４】核酸含有液に含有される核酸は、核酸含有
液中においてＰＣＲに供することによって増幅すること
ができる。もちろん、核酸含有液中に含有される核酸
に、フェノール抽出、エタノール沈殿等の処理を施すこ
とによって精製した後、ＰＣＲに供することによって増
幅することができる。The nucleic acid contained in the nucleic acid-containing solution can be amplified by subjecting it to PCR in the nucleic acid-containing solution. Of course, the nucleic acid contained in the nucleic acid-containing solution can be purified by subjecting it to treatments such as phenol extraction and ethanol precipitation, and then subjected to PCR for amplification.
【００９５】核酸含有液中においてＰＣＲを行なう際に
は、核酸含有液にＰＣＲバッファーを添加する。標準的
なＰＣＲバッファーの組成（最終濃度）は、５０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。When performing PCR in the nucleic acid-containing solution, a PCR buffer is added to the nucleic acid-containing solution. Standard PCR buffer composition (final concentration) is 50 mM
KCl, 10 mM Tris-HCl, 1.5 mM Mg
Cl 2, is 0.01% TritonX-100.
【００９６】ＰＣＲバッファーには、上記のように通常
ＭｇＣｌ２が含まれており、これは電離してマグネシウ
ムイオンを生じる。したがって、核酸含有液中にリン酸
が含まれている場合には、核酸含有液にＰＣＲバッファ
ーを添加することによって、リン酸とマグネシウムイオ
ンとが反応し、リン酸マグネシウムの沈殿を生じてしま
い、核酸含有液中でＰＣＲを行なうことが困難となる。As described above, the PCR buffer usually contains MgCl 2 , which ionizes to generate magnesium ions. Therefore, when phosphoric acid is contained in the nucleic acid-containing liquid, by adding a PCR buffer to the nucleic acid-containing liquid, phosphoric acid reacts with magnesium ions, resulting in precipitation of magnesium phosphate, It becomes difficult to perform PCR in a nucleic acid-containing solution.
【００９７】したがって、本発明の標的細胞の分離方
法、核酸含有液の調製方法及び標的核酸の増幅方法にお
いては、リン酸基を粒子の表面に共有結合を介して固定
化しておくことが好ましい。リン酸基が遊離可能な状態
で粒子の表面に結合している場合には、粒子の表面から
遊離したリン酸基がリン酸となって核酸含有液中に存在
することとなり、上記のように、核酸含有液中でＰＣＲ
を行なうことが困難となるからである。これに対して、
リン酸基を粒子の表面に共有結合を介して固定化してお
けば、リン酸は遠隔操作により粒子とともに除去するこ
とができるので、核酸含有液中にリン酸が存在すること
を防止することができ、ＰＣＲを効率よく行なうことが
可能となるとともに、標的細胞の分離、標的核酸の抽
出、ＰＣＲによる標的核酸の増幅といった一連の作業を
自動化することが可能となる。Therefore, in the method for separating a target cell, the method for preparing a nucleic acid-containing solution and the method for amplifying a target nucleic acid of the present invention, it is preferable to immobilize a phosphate group on the surface of a particle via a covalent bond. When the phosphate group is bound to the surface of the particle in a releasable state, the phosphate group released from the surface of the particle becomes phosphoric acid and is present in the nucleic acid-containing liquid. , PCR in nucleic acid-containing solution
Is difficult to do. On the contrary,
If the phosphate group is immobilized on the surface of the particle via a covalent bond, the phosphate can be removed together with the particle by remote control, so that the presence of phosphate in the nucleic acid-containing solution can be prevented. As a result, PCR can be performed efficiently, and a series of operations such as target cell separation, target nucleic acid extraction, and target nucleic acid amplification by PCR can be automated.
【００９８】リン酸基が共有結合を介して表面に固定化
された粒子は、例えば、リン酸基を有するポリマーと遠
隔操作により位置制御可能な物質とを混合する（練り込
む）ことにより、あるいは、遠隔操作により位置制御可
能な粒子の表面に、リン酸基を有するポリマーをコーテ
ィングすることにより得ることができる。リン酸基を有
するポリマーとしては、例えば、リン酸基がポリマーの
側鎖の末端基としてメチレン基（−ＣＨ２−）を介して
結合しているものが挙げられる。Particles having a phosphate group immobilized on the surface via a covalent bond can be prepared, for example, by mixing (kneading) a polymer having a phosphate group with a substance whose position can be controlled by remote control, or It can be obtained by coating the surface of particles whose position can be controlled by remote control with a polymer having a phosphate group. Examples of the polymer having a phosphoric acid group include those in which a phosphoric acid group is bonded as a terminal group of a side chain of the polymer through a methylene group (—CH 2 —).
【００９９】粒子の表面に共有結合を介して固定化され
たリン酸基には、オリゴヌクレオチドを結合させること
ができる。オリゴヌクレオチドは、リン酸基とオリゴヌ
クレオチドの水酸基とをリン酸エステル結合させること
によりリン酸基に結合させることができる。こうして表
面にオリゴヌクレオチドが固定化された粒子は、オリゴ
ヌクレオチドをプローブとして利用することにより標的
核酸の取得に用いることができる。このとき、オリゴヌ
クレオチドの塩基配列は標的核酸とハイブリダイズする
ように選択される。An oligonucleotide can be bound to the phosphate group immobilized on the surface of the particle via a covalent bond. The oligonucleotide can be bound to the phosphate group by forming a phosphate ester bond between the phosphate group and the hydroxyl group of the oligonucleotide. The particles thus immobilized with the oligonucleotide on the surface can be used for obtaining the target nucleic acid by using the oligonucleotide as a probe. At this time, the base sequence of the oligonucleotide is selected so as to hybridize with the target nucleic acid.
【０１００】[0100]
【実施例】ハイドロキシアパタイト（ＯＨ−ＡＰ）の結
晶をＨＣｌ（ｐＨ２．０）で溶液化した後、ハイドロキ
シアパタイト溶液にＮａＯＨを加えてｐＨを８．０にし
てゲル化させ、ハイドロキシアパタイトゲルを形成させ
た。これに磁性粒子を加えて超音波処理することによ
り、表面にハイドロキシアパタイトゲルの薄膜が形成さ
れた磁性粒子（０．３ｍｇＯＨ−ＡＰ／３ｍｇＦｅ２Ｏ
３〜０．６ｍｇＯＨ−ＡＰ／３ｍｇＦｅ２Ｏ３）を得
た。１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ）を添加
した滅菌蒸留水１００ｍｌに、カウント済のＡｍｐ耐性
大腸菌（２２０ｃｅｌｌｓ／１００ｍｌ）を加えた。こ
の大腸菌含有液に、上記磁性粒子を含有する溶液５ｍｌ
を加えた後、ＮａＯＨを用いて溶液のｐＨを８．５に
し、１０分間攪拌することによって上記大腸菌を含むハ
イドロキシアパタイトゲルを形成させた。磁力を加えて
上記ビーズを分離することによってハイドロキシアパタ
イトゲルを分離し、分離したハイドロキシアパタイトゲ
ルに５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ｍｌを加えた後、１０
分間攪拌することによってハイドロキシアパタイトゲル
をゾル化した。そして、上記ビーズを除去して得られる
溶液をプレート上にまき、細胞数をカウントした。その
結果、約２００ｃｅｌｌｓ／１００ｍｌの大腸菌が回収
された。この結果から、本発明による標的物質（標的細
胞）の分離方法によれば、効率よく標的物質（標的細
胞）を分離できることが示された。[Examples] Crystals of hydroxyapatite (OH-AP) were solubilized with HCl (pH 2.0), and then NaOH was added to the hydroxyapatite solution to adjust the pH to 8.0 for gelation to form a hydroxyapatite gel. Let By adding magnetic particles to this and subjecting to ultrasonic treatment, magnetic particles (0.3 mg OH-AP / 3 mg Fe 2 O) on which a thin film of hydroxyapatite gel was formed on the surface.
3 ~0.6mgOH-AP / 3mgFe 2 O 3) was obtained. Amp-resistant E. coli (220 cells / 100 ml) that had been counted was added to 100 ml of sterile distilled water supplemented with 100 μg / ml of ampicillin (Amp). 5 ml of a solution containing the above magnetic particles in this E. coli-containing liquid
Was added, the pH of the solution was adjusted to 8.5 with NaOH, and the mixture was stirred for 10 minutes to form a hydroxyapatite gel containing Escherichia coli. The hydroxyapatite gel is separated by applying a magnetic force to separate the beads, and 1 ml of 5 mM EDTA · 2Na is added to the separated hydroxyapatite gel, and then 10
The hydroxyapatite gel was sol-ized by stirring for a minute. Then, the solution obtained by removing the beads was spread on a plate and the number of cells was counted. As a result, about 200 cells / 100 ml of Escherichia coli was recovered. From this result, it was shown that the target substance (target cell) can be efficiently separated by the method for separating the target substance (target cell) according to the present invention.
【０１０１】[0101]
【発明の効果】本発明により、遠心分離を利用しなくて
も、細胞等の標的物質を分離することができる標的物質
の分離方法が提供される。また、本発明により、標的Ｄ
ＮＡを含むＰＣＲ反応液の調製、及びＰＣＲによる標的
ＤＮＡの増幅といった一連の作業を自動化するのに適し
た、標的細胞の分離方法、核酸含有液の調製方法、及び
標的核酸の増幅方法が提供される。EFFECTS OF THE INVENTION The present invention provides a method for separating a target substance which can separate a target substance such as cells without using centrifugation. Further, according to the present invention, the target D
A method for separating target cells, a method for preparing a nucleic acid-containing solution, and a method for amplifying a target nucleic acid, which are suitable for automating a series of operations such as preparation of a PCR reaction solution containing NA and amplification of target DNA by PCR, are provided. It
【図１】標的物質の分離を行なうための分注装置の概略
的な構成を示すブロック図である。FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of a dispensing device for separating a target substance.
【図２】同装置の作業ステップを示すフロー図である。FIG. 2 is a flowchart showing work steps of the apparatus.
【図３】同装置の作業ステップを示すフロー図（図２の
続き）である。FIG. 3 is a flow chart (continuation of FIG. 2) showing work steps of the apparatus.
Ｒ・・・磁性粒子（遠隔操作により位置制御可能な粒子
の一例）
Ｉ・・・カルシウムイオン（凝集剤の一例）
Ｔ・・・標的細胞（標的物質の一例）
Ｇ・・・凝集物（標的物質と粒子と凝集剤とを含む凝集
物の一例）R ... Magnetic particles (an example of particles whose position can be controlled by remote control) I ... Calcium ions (an example of aggregating agent) T ... Target cells (an example of target substance) G ... Aggregates (target An example of an aggregate containing a substance, particles, and an aggregating agent)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 4B065 AA01X AA57X AA87X BA22 BD14 BD16 CA23 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page F-term (reference) 4B024 AA20 BA80 CA01 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 4B065 AA01X AA57X AA87X BA22 BD14 BD16 CA23
Claims (11)
子と、液体中に分散した状態にある前記粒子を凝集させ
得る凝集剤とを用いた標的物質の分離方法であって、 前記粒子及び／又は前記凝集剤は、前記標的物質と結合
し得るものであり、 前記標的物質と前記粒子と前記凝集剤とを液体中に混在
させることによって、前記標的物質と前記粒子と前記凝
集剤とを含む凝集物を形成させた後、前記粒子を遠隔操
作により位置制御することによって、前記凝集物を前記
液体から分離することを特徴とする前記標的物質の分離
方法。1. A method for separating a target substance using a plurality of particles, the position of which can be controlled by remote control, and an aggregating agent capable of aggregating the particles dispersed in a liquid. Alternatively, the aggregating agent is capable of binding to the target substance, and by mixing the target substance, the particles, and the aggregating agent in a liquid, the target substance, the particles, and the aggregating agent are included. The method for separating a target substance, comprising forming the aggregate and then controlling the position of the particles by remote control to separate the aggregate from the liquid.
前記凝集物から前記標的物質を解離させることによって
標的物質含有液を得ることを特徴とする請求項１記載の
分離方法。2. After separating the aggregate from the liquid,
The separation method according to claim 1, wherein the target substance-containing liquid is obtained by dissociating the target substance from the aggregate.
ら前記粒子を除去することを特徴とする請求項２記載の
分離方法。3. The separation method according to claim 2, wherein the particles are removed from the target substance-containing liquid by remote control.
能基を表面に有しており、前記凝集剤が、前記官能基に
結合することによって液体中に分散した状態にある前記
粒子を凝集させ得ることを特徴とする請求項１〜３のい
ずれかに記載の分離方法。4. The particle has a functional group capable of binding to the aggregating agent on its surface, and the aggregating agent binds to the functional group to disperse the particle in a liquid. The separation method according to any one of claims 1 to 3, wherein the separation method is capable of aggregating.
記凝集剤との結合部位を複数有することを特徴とする請
求項１〜４のいずれかに記載の分離方法。5. The separation method according to claim 1, wherein the target substance has a plurality of binding sites for the particles and / or the aggregating agent.
を特徴とする標的細胞の分離方法。 （ａ）標的細胞が安定して存在し得る液体中に、前記標
的細胞と、遠隔操作により位置制御可能であって表面に
リン酸基を有する複数の粒子と、カルシウムイオンとを
混在させることによって、前記標的細胞と前記粒子と前
記カルシウムイオンとを含む凝集物を形成させる工程 （ｂ）前記粒子を遠隔操作により位置制御することによ
って、前記凝集物を前記液体から分離する工程6. A method for separating a target cell, which comprises the following steps (a) and (b): (A) By mixing the target cells, a plurality of particles that can be position-controlled by remote control and have a phosphate group on the surface, and calcium ions in a liquid in which the target cells can stably exist Forming an aggregate containing the target cells, the particles and the calcium ions (b) separating the aggregate from the liquid by remotely controlling the position of the particles
を、前記標的細胞と前記粒子と前記カルシウムイオンと
を含むハイドロキシアパタイトゲルとして形成させるこ
とを特徴とする請求項６記載の標的細胞の分離方法。7. The separation of target cells according to claim 6, wherein in the step (a), the aggregate is formed as a hydroxyapatite gel containing the target cells, the particles and the calcium ions. Method.
用いて前記凝集物から前記標的細胞を解離させることに
よって標的細胞含有液を得る工程（ｃ）をさらに含むこ
とを特徴とする請求項６又は７記載の標的細胞の分離方
法。8. The method further comprising the step (c) of obtaining a target cell-containing solution by separating the aggregates and then dissociating the target cells from the aggregates with a chelating agent. 6. The method for separating target cells according to 6 or 7.
ら前記粒子を除去する工程（ｄ）をさらに含むことを特
徴とする請求項８記載の標的細胞の分離方法。9. The method for separating target cells according to claim 8, further comprising a step (d) of removing the particles from the target cell-containing liquid by remote control.
方法によって得られた標的細胞含有液中に含有される標
的細胞から核酸を抽出することによって核酸含有液を調
製することを特徴とする核酸含有液の調製方法。10. A nucleic acid-containing solution is prepared by extracting nucleic acids from target cells contained in the target cell-containing solution obtained by the method for separating target cells according to claim 8 or 9. Method for preparing nucleic acid-containing liquid.
法によって得られた核酸含有液中でＰＣＲを行なうこと
によって標的核酸を増幅させることを特徴とする標的核
酸の増幅方法。11. A method for amplifying a target nucleic acid, which comprises amplifying a target nucleic acid by performing PCR in the nucleic acid-containing solution obtained by the method for preparing a nucleic acid-containing solution according to claim 10.
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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