JP2003081819A - 抗癌活性を有するフィトスフィンゴシン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】抗癌活性を有するフィトスフィンゴシン誘導体
を提供する。 【解決手段】下記一般式（Ｉ）で表されるものであっ
て、抗癌活性を有するフィトスフィンゴシン誘導体およ
びそれを有効成分として含む抗癌剤を提供する： 【化１】 （式中、Ｒ¹、Ｒ^２およびＲ^３は水素またはＣ_１〜Ｃ_８
のアルキル基を示し；Ｘはハロゲン、水酸化基、スルホ
ン酸アルキル基、スルホン酸アリール基を含む原子また
は原子団を示す）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗癌活性を示すフ
ィトスフィンゴシン誘導体に関し、さらに詳細には、下
記一般式（Ｉ）で表されるものであって、抗癌活性を示
すフィトスフィンゴシン誘導体とそれを有効成分として
含む抗癌剤に関する。

【化２】 （式中、Ｒ¹、Ｒ^２およびＲ^３は水素またはＣ_１〜Ｃ_８
のアルキル基を示し；Ｘはハロゲン、水酸化基、スルホ
ン酸アルキル基、スルホン酸アリール基を含む原子また
は原子団を示す）。

【０００２】

【従来の技術】一般に、細胞膜を構成する脂質は、リン
脂質(Phospholipid)、糖脂質(glycolipid)、スフィンゴ
リピド(sphingolipid)からなる。これらの分子は、両親
媒性(amphipathic)物質であって、水に分散すると自発
的に細胞膜と類似した閉鎖型小胞体を形成するが、これ
をリポソーム(liposomes)という。リポソームは、前述
の脂質のいずれかまたは種々の脂質に製造できるが、こ
れを医薬品に適用する場合、水溶性物質は主として内部
水相に封入され、脂溶性物質は膜の間に介されて種々の
医薬物質を伝達する媒介体として活用されている。ま
た、リポソームは、治療すべき患部に薬物を正確に伝達
し、リポソームによる薬物送達は小量でも可能であるた
め、多重薬剤耐性を克服するのに役立つ。最近は、薬
物、抗原、遺伝子の伝達媒体として脚光を浴びており、
特にリポソームを用いた薬物伝達媒体として抗癌剤であ
るドキソルビシン(doxorubicin)と抗真菌剤であるアム
ホテリシンＢ(amphotericin B)およびその他医薬品をリ
ポソーム製剤化し、商品として市販している趨勢であ
る。その他に、リポソームは化粧品にも広く用いられて
いる[M. Grunaug et al., Eur. J. Med. Res. 21, 13-1
9, 1998; D.S. Alberts abdD.J. Garcia, Drugs, 54, 3
0-35, 1997; F. Braun, et al., Transplant Proc.30,
1481-1483, 1998; V. Heinemann et al., Antimicrob.
Agents Chemother.41, 1275-1280, 1997; N. Weiner et
al., J. Drug. Target 2, 405-410, 1994]。

【０００３】人体に存在するスフィンゴイド塩基(sphin
goid base)としては、フィトスフィンゴシン(phytosphi
ngosine, PhytoS)、スフィンゴシン(sphingosine, SP
N)、スフィンガニン(sphinganine)がある。これらは、
構造的に１８個の炭素原子から構成された骨格を有する
アミノアルコール(amino alcohol)と特徴づけられる。
これらの化合物は、数個の立体中心を有しているが、こ
れらの３番位置にＤ−配列(D-erythro)が自然から発見
されている。ＳＰＮとスフィンガニンは体のすべての組
織から見出せることに対し、PhytoSは角質層でのみ限定
的に存在する。ＳＰＮとその誘導体に対する研究は１９
９０年代に始まり、ＰＫＣ(protein kinase C)活性の強
力な抑制剤という事実が明らかになった後活発に進行さ
れた。その後、ＳＰＮとその誘導体は低い濃度において
も数多くの細胞機能(cellular function)に関与すると
いう事実が明らかになった[D.J. Bibel et al., Clin.
Exper. Dermatol. 20, 395-400, 1995; D.J. Bibel, J.
Invest. Dermatol. 98, 269-273, 1992; Y.A. Hannun,
Science, 274, 1855-1859, 1996]。しかし、このよう
な活性は大部分角質層でのみ示されるのでPhytoSに対す
る関心は増加したが、非常に高値の商品化された試薬で
あるため、その誘導体合成とこれらの生理活性(biologi
cal activity)についてはほとんど知られていない。特
に、ＳＰＮ誘導体であるＮ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシ
ン(N,N-dimethyl sphingosine, DMS)とＮ，Ｎ，Ｎ−ト
リメチルスフィンゴシニウムハライド (N,N,N-trimethy
l sphingosinium halide, 以下「TMS・hal」)は、ＳＰＮ
よりＰＫＣに対してさらに強力な阻害活性を示し、in v
itro、in vivo系で種々の癌細胞の成長を抑制すると知
られている。特に、ＴＭＳ・ｈａｌは、卵黄ホスファチ
ジルコリン(egg phosphatidylcholine, egg PC)：コレ
ステロール(cholesterol, Chol)：ＴＭＳ・ｈａｌ＝
４．５：４．５：１(モル比)のリポソームを用いたB16/
BL6黒色腫細胞株(melanoma cell line)において抗癌(an
titumor)、転移抑制(antimetastasis)効果が確認された
例がある。しかし、ＴＭＳ・ｈａｌがこのような効果を
示すためには、０．１〜０．３mg/mouse程と相当多量の
薬物が要求されるため、溶血現状(hemolysis)、血色素
尿症(hemoglobinuria)、炎症反応(inflammatory respon
se)のような副作用が示される。このような毒性を減ら
すためにリポソーム技術を適用したが、in vivo系でリ
ポソームＴＭＳ・ｈａｌは毒性がなく、リポソームを用
いていないＴＭＳ・ｈａｌより癌細胞の成長と転移の防
止にさらに強力な抑制効果を示すことを観察することが
できた [Y.S. Park, S. Hakomori, S. Kawa, F. Ruan,a
nd Y. Igarashi. Cancer Res. 54, 2213-2217, 1994]。

【０００４】ＳＰＮとほとんど類似した構造を有するPh
ytoSに対する研究としては、in vitro系でKK-1、 COS-
7、そしてMSC-1細胞における遺伝子伝達(DNA transfect
ion)程度を観察し、補助脂質(helper lipid)のフォーム
レーションの違いによる効率性を比べて発表した例があ
る[T. paukku et al., Chem. Phys. Lipids, 87, 23-2
9, 1997]。また、PhytoSは種々の微細物(microorganis
m)において強力な抗菌活性(anti-microbial activity)
を示し、ＰＫＣ抑制剤としてインターロイキン(interle
ukin)分泌を増加させて皮膚刺激を減らすと知られてい
る。phytoS誘導体であるＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルフィト
スフィンゴシニウムハライド(N,N,N-trimethyl phytosp
hingosinium halide, 以下「TMP・hal」)は、国内外で
は最初に皮膚保護のための用途に限定して化粧品に添加
する組成物の一つとして特許出願、公開[韓国特許公開
番号第１９９９−００７８６１０号]されている状態で
あるが、ＴＭＰを抗癌剤として用いた例は国内・外的に
まだない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、前記一般式（Ｉ）で表されるフィトスフィンゴシン
誘導体を種々の組成のリポソームに製造し、その癌転移
および癌成長抑制効果を確認することによって、本発明
を完成するに至った。

【０００６】したがって、本発明は、前記一般式(Ｉ)で
表される抗癌活性を有するフィトスフィンゴシン誘導体
およびそれを有効成分として含む抗癌剤を提供すること
にその目的がある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、抗癌活性を有
し、下記一般式（Ｉ）で表されるフィトスフィンゴシン
誘導体およびそれを有効成分として含む抗癌剤をその特
徴とする：

【０００８】

【化３】

【０００９】式中、Ｒ¹、Ｒ^２およびＲ^３は水素または
Ｃ_１〜Ｃ_８のアルキル基を示し；Ｘはハロゲン、水酸化
基、スルホン酸アルキル基、スルホン酸アリール基を含
む原子または原子団を示す。

【００１０】また、前記フィトスフィンゴシン誘導体を
リポソームまたはエマルジョンの形態で含む抗癌剤およ
び、前記フィトスフィンゴシン誘導体とともに新生血管
形成抑制剤または既存の細胞毒性活性を有する抗癌剤で
あるドキソルビシンを含む抗癌剤を含む。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明をさらに詳細に説明
する。本発明は、抗癌活性を有する前記一般式（Ｉ）で
表されるフィトスフィンゴシン誘導体（以下、「ＴＭ
Ｐ」）をリポソームまたはエマルジョンの形態に製剤化
した抗癌剤に関する。本発明によるフィトスフィンゴシ
ン誘導体において、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルフィトスフ
ィンゴシニウムハライド（TMP・hal）が好ましく、Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリメチルフィトスフィンゴシニウムヨージド
(N,N,N-trimethylphytosphingosinium iodide、以下
「ＴＭＰ・Ｉ」)が特に好ましい。

【００１２】本発明においては、種々の組成の転移抑制
リポソームを製造したが、DPPC/Chol/TMPまたはDPPC/Ch
ol/PEG-PE/TMP組成は癌の転移抑制能に優れると判断さ
れ、新生血管抑制剤とともに使用する場合相乗効果があ
ることが分かった。DPPC/Chol/TMPリポソームは癌の転
移を抑制するだけでなく、ＬＬＣ肺癌細胞の成長を著く
抑制することが分かった。

【００１３】本発明においては、既存の細胞毒性活性を
有する抗癌剤(ドキソルビシン)とともに転移抑制を比べ
たとき、ドキソルビシン単独で使用した場合より、ＴＭ
Ｐリポソームとともに投与した場合その効能はさらに増
加することが分かった。

【００１４】本発明においては、ＴＭＰリポソームの細
胞毒性効果をヒトの肝癌細胞株とマウス黒色腫細胞株を
用いて観察した結果、ヒトの肝癌細胞株は細胞毒性効果
を示すが、黒色腫細胞株は細胞毒性効果を示さない。ま
た、マウスにおいて簡易急性毒性を測定したときに何ら
かの毒性が観察されなかった。

【００１５】本発明による抗癌剤は、前記一般式（Ｉ）
で表されるフィトスフィンゴシン誘導体を有効成分とし
て含み、薬剤学的に許容可能な担体(carrier)、賦形剤
(forming agent)、稀釈剤(diluent)などと混合して粉
末、顆粒、カプセルまたは注射剤などに製造し得る。ま
た、経口投与および非経口投与が可能であり、特にリポ
ソームとエマルジョンの形態に製剤化して投与する場
合、生体利用率においてさらに効果的である。本発明に
よる抗癌剤の投与量は、体内吸収度、体重、患者の年
齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄
率、疾患の重症度などによって異なり得る。前記抗癌剤
は、体重１ｋｇ当り約０．５〜１ｍｇを投与することが
好ましい。したがって、本発明による抗癌剤は有効量の
範囲を考慮して製造し、このように剤形化された単位投
与型製剤は必要に応じて薬剤の投与を監視するか、観察
する専門家の判断と個人の要求に応じて専門化された投
薬法を用いるか、一定時間間隔で数回投与することがで
きる。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を下記実施例によってさらに詳
細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されな
い。 実施例１：Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルフィトスフィンゴシ
ニウムヨージド(TMP・I)の合成

【００１７】フィトスフィンゴシン(phytosphingosine,
0.30 g, 0.946 mmol)とＫ_２ＣＯ_３(0.523 g, 3.79 mmo
l)をメタノール３mlに溶かし、攪拌しながらヨードメタ
ン(iodomethane, 0.298 ml, 4.73 mmol)を加えた後、５
０℃で４時間攪拌した。溶媒を減圧蒸留し、反応混合物
に蒸留水４mlを加えた後、酢酸エチル８mlで抽出してＮ
ａ_２ＳＯ_４で乾燥、濾過した。溶媒を減圧乾燥して白色
の固体生成物０．２６ｇを得た。 収率：７６％ 融点：２１０〜２１３℃ IR(KBr)υmax : 3309 (OH), 2918, 2850 (C-H) cm^{-1 1} H NMR (600MHz, DMSO-d₆) :δ 3.95 (dd, 1H, CH_２O,
J = 14.4 Hz), 3.89 (dd, 1H, CH_２O, J = 14.4 Hz),
3.76 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 3.6 (dd, 1H), 3.11(s, 9
H, N⁺CH_３), 1.68 (m, 1H, CH_２), 1.48 (m, 1H, C
H_２), 1.23 (s, 24H,CH_２), 0.84 (t, 3H, CH₃) ppm¹³ C NMR (600MHz, DMSO-d₆) : δ 76.80, 71.01, 55.6
9, 52.18, 33.21, 31.21,30.60, 29.15, 29.03, 28.99,
28.93, 28.62, 24.87, 22.00, 13.84 ppm MS (FAB, Glycerol, m/z) : 361 (M⁺). 実施例２：Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルフィトスフィンゴシ
ニウムパラトルエンスルホネート(N,N,N-trimethylphyt
osphingosinium p-toluenesulfonate)の合成

【００１８】フィトスフィンゴシン(phytosphingosine,
0.5 g, 1.575 mmol) とＫ_２ＣＯ _３(1.612 g, 9.449
mmol)をメタノール５mlに溶かし、攪拌しながらメチル
パラトルエンスルホネート(methyl p-toluenesulfonat
e, 1.188 ml, 7.874 mmol)を加えた後、５０℃で３時
間攪拌した。溶媒を減圧蒸留し、反応混合物に蒸留水５
mlを加えた後、酢酸エチル１０mlで抽出してＮａ_２ＳＯ
_４で乾燥、濾過した。溶媒を減圧乾燥して白色の固体生
成物０．４６０を得た。 収率：５５％ 融点：１８５〜１８６℃ IR (KBr) υmax : 3326 (OH), 2920, 2852 (C-H) cm^{-1 1} H NMR (500MHz, CD₃OD) : δ 7.70 (d, 2H, arom H, J
= 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H, arom H, J = 8.0 Hz), 4.16
(dd, 1H, CH₂O, J = 14.4 Hz), 4.09 (dd, 1H,CH₂O, J
= 14.4 Hz), 3.89 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 3.73 (dd, 1
H), 3.44 (t, 1H), 3.21 (s, 9H, N⁺CH₃), 2.37 (s, 3
H, Ph-CH₃), 1.81 (m, 1H, CH₂), 1.58 (m, 1H, CH₂),
1.29 (s, 24H, CH₂), 0.90 (t, 3H, CH₃) ppm¹³ C NMR (500MHz, CD₃OD) : δ 142.07, 140.16, 128.3
1, 125.45, 76.73, 71.56, 56.09, 52.21, 33.25, 31.5
6, 29.28, 29.26, 28.96, 25.03, 22.22, 19.81,12.93
ppm. 実施例３：リポソームの製造方法 （１）ＭＬＶ(multilamellar vesicles)とＳＵＶ(small
unilamellar vesicles)の製造

【００１９】リン脂質をガラス瓶(glass vial)に入れて
有機溶媒(クロロホルム、CHCl₃)に溶解した後、窒素ガ
スまたは減圧蒸留器(rotary evaporator)を用いて有機
溶媒を完全に取除きながらガラス瓶中に薄膜を形成さ
せ、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を加えて常温で弱く振り
ながら十分水和させた後、強く攪拌してリン脂質の膜を
分散させて多層ラメラリポソーム(MLV)を製造した。

【００２０】製造されたＭＬＶを超音波粉砕機(sonicat
or)を用いて単層ラメラリポソーム(ＳＵＶ)を製造し
た。この他にもＳＵＶを製造するために押出機(extrude
r)を用いて高圧で適切なメンブラン・フィルタ(memebra
ne filter)に通すことにより、所望するサイズのリポソ
ームを得て実験に用いた。 (２) 転移抑制リポソームの製造

【００２１】転移抑制物質であるＴＭＰと種々のリン脂
質から構成されたリポソームを製造した。ＴＭＰと中性
脂質であるＤＯＰＥを適切に混合(１：１重さ比)して２
０ｍｌガラス瓶に入れ、有機溶媒に溶かした後、窒素の
存在下に減圧蒸留した。この際、薄い脂質膜が形成する
と完全に乾燥した後、蒸留水または５％デキストロース
(dextrose)で水和させてボルテキシング(vortexing)、
超音波粉砕(sonication)などの方法でカチオン性リポソ
ームを製造した。鶏卵由来の７０％ホスファチジルコリ
ン(phosphtidylcholine, PC)、１００％鶏卵ＰＣとコレ
ステロール(cholesterol, Chol)の１：１モル比、ジパ
ルミトイルホスファチジルコリン(dipalmitoyl phospha
tidylcholine, DPPC)とCholの１：１モル比、DPPC：Cho
l：ポリエチレングリコールが結合したホスファチジル
エタノールアミン(phosphatidyl ethanolamine-polyeth
ylene glycol, PE-PEG)の５：５：１モル比の組成にＴ
ＭＰを加え、有機溶媒に溶かした後、減圧蒸留機を用い
て有機溶媒を完全に取除きながらガラス瓶の内部に薄膜
を形成させた。ＰＢＳ緩衝溶液を加えて常温で十分水和
させ、リン脂質の薄膜を分散させた後、強くボルテキシ
ングまたは超音波粉砕することによって転移抑制リポソ
ームを製造した。 実施例４：転移抑制活性を有するエマルジョンの製造お
よび物理的性質測定 （１）エマルジョンの製造

【００２２】７０％鶏卵ＰＣとＴＭＰをオリーブ油に分
散し、グリセロールと小量のツイーン２０を添加し、蒸
留水を加えた後、強く超音波粉砕してエマルジョンを製
造した。製造したエマルジョンを０．２μm膜(membran
e)に通して用いた。 （２）リポソームとエマルジョンの安定性測定

【００２３】ＴＭＰを含む種々の組成のリポソームとＴ
ＭＰを含むエマルジョンを製造し、４℃で保管しながら
リポソームのサイズ変化をジェタサイザー(zetasizer)
を用いて測定し、リン脂質の組成によるリポソームの安
定性とエマルジョンの安定性を測定した。 実施例５：In vivo癌転移抑制分析

【００２４】In vivo系における直接的な肺転移(direct
lung metastasis)を観察するためにB16F10黒色腫細胞
を用いてC57/BL6マウスで実験した。まず、投与すべき
黒色腫細胞の濃度を決定するために種々の濃度(PBS, 2
×10⁴, 2 ×10⁵, 2 ×10⁶)の癌細胞を尻尾静脈に注射
し、１５日後マウスを麻酔した状態で肺を切取り、肺に
発生した癌細胞のコロニー数を観察した。

【００２５】また、ＴＭＰを含む転移抑制リポソームと
エマルジョンの転移抑制効果を観察するために前記実験
で得られた適切な癌細胞濃度をC57/BL6マウスの尻尾静
脈に注射した。６０〜９０分後誘導体で作られた転移抑
制リポソーム２５０μgずつを投与し、２、３番目の薬
物の投与は癌細胞を注射してから各々３日と６日後に行
い、４番目の薬物を投与する場合９日後投与した。１５
日目にマウスの肺を切取った後、コロニー数を観察し
た。 実施例６：細胞毒性およびIn vivo 毒性測定

【００２６】癌細胞に対する細胞毒性効果を測定するた
めに、癌細胞株として肝癌細胞株であるＳＮＵ３９８と
黒色腫細胞株であるB16F10を用いた。癌細胞株(SNU 398
またはB16F10)をトリプシン化(trypsinization)した
後、serum-free media[RPMI-1640]で洗浄した。トリプ
トパンブルーで染色して細胞をカウンティングした後、
１ｘ１０⁵cell/mlで４８ウェルプレートにプレーティン
グし、ＴＭＰで作られたカチオン性リポソームを種々の
濃度で癌細胞に処理した。３日後、トリプトパンブルー
で染色し、細胞をカウンティングして細胞減少程度を観
察した。

【００２７】In vivo 毒性を観察するためにＴＭＰリポ
ソームをマウスに静脈注射または腹腔内注射してマウス
の致死率を測定することによってin vivo 毒性を測定し
た。 実施例７：In vivo 癌成長抑制分析

【００２８】In vivo 系における癌の成長抑制を観察す
るために、ルイス肺癌細胞株(LewisLung Carcinoma, LL
C)を用いてBDF1マウスで実験した。ＬＬＣ細胞濃度は、
マウス一匹当り百万個の細胞として皮下注射して癌を形
成させた。癌細胞投与後１日、３日、６日、９日にＴＭ
Ｐリポソームを１００μl（ＴＭＰ１００μg）ずつ腹腔
および静脈注射した。陽性対照群としては、ＭＭＰ−２
(matrix metaloproteinase-2)抑制剤として知られてい
るAG3340(Agouron Pharmaceuticals)を０．２％ツイー
ン／０．５％カルボキシメチルセルロースで懸濁して一
日一回２ｍｇずつを腹腔注射した。２１日後マウスを頸
椎脱骨して致死させた後、癌の体積変化を測定し、写真
撮影した。 実施例８：錠剤の製造

【００２９】 前記成分を細かく粉砕して混合した後、直打法(direct
tableting method)によって錠剤を製造した。各錠剤の
総量は５００ｍｇであり、そのうち有効成分の含量は５
０ｍｇである。 実施例９：粉末剤の製造

【００３０】 前記成分を細かく粉砕し、混合して粉末を製造した。硬
質カプセルに粉末５００mgを充填してカプセル剤を製造
した。 実験例１

【００３１】まず、in vivo 系におけるＴＭＰ・Ｉの転
移抑制効果を観察した。まず、転移が観察できる癌細胞
数を決定するためにマウスにB16F10黒色腫細胞を２ｘ１
０⁴、２ｘ１０^５、２ｘ１０^６およびＰＢＳの四つの群
に分けて癌の転移を測定した。癌細胞を尻尾静脈に注射
してから１５日後マウスの肺を切取って観察した結果、
２ｘ１０^６濃度においては肺のサイズが非常に大きくな
り、数えられないほど数多くのコロニーが形成された。
これに対し、ＰＢＳと１ｘ１０⁴を処理した場合は何ら
かの変化も示されず、２ｘ１０^５の場合は小量のコロニ
ーが観察され、２１日後までその数が増加した。

【００３２】したがって、ＴＭＰ・Ｉの転移抑制実験に
おいては、癌細胞濃度を２ｘ１０^５として固定して行っ
た。B16F10黒色腫細胞を接種してから１日、３日、そし
て６日後各々の誘導体３００μgを投与した。１５日後
マウスの肺を観察した結果、対照群に比べて肺の大きさ
が小さくなり、癌細胞のコロニー数も相当減少したこと
が確認できた[表１]。

【００３３】

【表１】 実験例２

【００３４】リポソームの組成を異にしてＴＭＰ・Ｉの
転移抑制活性を測定した。７０％鶏卵ＰＣと１００％鶏
卵ＰＣ／chol(１：１モル比)の組成にＴＭＰ・Ｉを加
え、リポソームを製造して転移抑制を行った。C57BL/6
マウスにB16F10黒色腫細胞を２ｘ１０^５濃度で尻尾静脈
を通じて注射した。注射してから１時間後ＴＭＰ・Ｉ２
５０μｇが含有されたリポソームを処理した。第二に、
黒色腫細胞を注射してから３日後尻尾静脈にさらに２５
０μgを処理した。最後に、７日後同様な方法で黒色腫
細胞を処理してから１５日後マウスを頸椎脱骨し、肺を
切取ってコロニー数を比べた[表２]。

【００３５】

【表２】 実験例３

【００３６】ＴＭＰ・Ｉ濃度による転移抑制効果を観察
するために７０％鶏卵ＰＣを適用したリポソームを製造
して実験に用いた。リポソームの安定性を高めるために
７０％鶏卵ＰＣにコレステロールを添加した。７０％鶏
卵ＰＣとCHOL、そしてＴＭＰ・Ｉを適切な比率で混合し
リポソームを製造して転移抑制実験を行った。ＴＭＰ・
Ｉ約５０μgを含むリポソームにおいては、癌の転移を
６０％以上抑制することが分かった[図１、表３]。既存
のＴＭＳ(trimethylsphingosine)リポソームにおいて
は、ＴＭＳ２５０μgを投与した場合、５０％程度の癌
転移抑制を示す[Y.S. Park et al., Cancer Res., 54,
2213-2217, 1994]。この結果から、ＴＭＰ・Ｉリポソー
ムはＴＭＳリポソームより癌転移抑制効果が格段に優れ
ることが分かる。

【００３７】

【表３】 実験例４

【００３８】転移抑制リポソームの組成による転移抑制
活性と、リポソーム中への新生血管形成抑制薬物(AG334
0, Agouron Pharmaceuticals)の添加による転移抑制活
性を測定した。種々の群にリポソームを製造して実験を
行った。リポソームを種々の組成に製造し、リポソーム
中の新生血管形成抑制薬物を採取してリポソームと薬物
の効果を比べた[表４]。対照リポソーム(control lipos
omes)は、７０％鶏卵ＰＣ／Chol／フィトスフィンゴシ
ン(４：４：１重さ比)の組成に製造した。脂質と薬物の
比は２０：１の重さ比にした。各々のリポソームの組成
と効果を次の表４に示す。投与するＴＭＰ・Ｉと薬物の
濃度は各々１００μgずつと一定にし、薬物がある場合
や薬物のない場合のいずれも投与されるＴＭＰ・Ｉの濃
度は一定であった。前記実施例５と同様な方法で実験を
行ったが、リポソームの投与回数は、黒色腫細胞を投与
してから１時間、３日、６日、９日の４回にした。

【００３９】フィトスフィンゴシンからなる対照リポソ
ームにおいてコロニー数が少しずつ減少する傾向がみら
れたが明らかな効果は認められず、薬物とＤＰＰＣリポ
ソームから構成された場合は転移抑制効果がほとんど認
められなかった。しかし、薬物とＴＭＰ・Ｉがともに含
まれているＴＭＰ・Ｉリポソームの場合は、１５個未満
のコロニー数を観察できるほど転移抑制効果が非常に優
れた。リポソームの血中残留時間を高めるためにＴＭＰ
・Ｉリポソームの組成に１０％PEG-PEを加えたＴＭＰ・
Ｉ＋ＰＥＧリポソームにおいても同様な効果が認められ
た[図２]。

【００４０】

【表４】 註）1) 70%PC/Chol/フィトスフィンゴシン(4 : 4 : 1
重さ比) 2) DPPC/Chol (1 : 1 モル比) 3) DPPC/Chol/TMP・I (5 : 5 : 1モル比) 4) DPPC/Chol/PEG-PE/TMP・I (5 : 5 : 1 : 1モル比) 実験例５

【００４１】転移抑制活性を有するＴＭＰ・Ｉを用いて
油エマルジョン製剤を製造し、転移抑制活性を測定し
た。転移抑制エマルジョンを腹腔に投与したことを除い
ては、前記実験例４と同様な方法で実験を行った。何も
処理していない群とＴＭＰ・Ｉエマルジョンを投与した
群の肺を観察した結果、無処理対照群におけるコロニー
数は２５０個程であり、ＴＭＰ・Ｉエマルジョンを腹腔
に投与した群においては７０±２０個程のコロニー数が
観察されたが、この数値は癌の転移が７０％以上抑制さ
れたことを意味する[図２]。 実験例６

【００４２】ＢＤＦ１マウスのルイス（Lewis Lung Car
cinoma, LLC）肺癌細胞に投与して癌を誘発させた後、
転移抑制活性を有するＴＭＰ・Ｉリポソーム（DPPC/Cho
l/TMP・I、5:5:1モル比）を投与して癌の成長抑制に関す
る効能を観察した。ＬＬＣ癌細胞の濃度をマウス一匹当
り百万個として皮下注射して腫瘍を形成させた。癌細胞
を皮下注射してから１日後ＴＭＰ・Ｉリポソームを静脈
注射と皮下注射した(ＴＭＰ含量：１００μg)。３日、
６日、９日後も同様な方法で投与し、２１日目にマウス
を頸椎脱骨して致死させた後、 癌の体積を次の数学式
１で測定し、その結果を次の表５に示す。

【００４３】

【数１】

【００４４】

【表５】

【００４５】前記表５から分かるように、対照群におい
ては癌の体積が非常に大きく成長し、癌の周囲に血管が
旺盛に形成された。ＴＭＰ・Ｉリポソームを腹腔注射し
た群においては腫瘍体積が顕著に減少し、癌の周囲に新
生血管の形成が著しく減少した。これに対し、MMP-2抑
制剤であるAG3340をツイーン／カルボキシメチルセルロ
ースに懸濁して一日一回ずつ２０日間２０００μgを投
与した群においては、腫瘍体積の変化が僅かに減少し
た。癌の体積変化を測定した結果、陽性対照群であるAG
3340を腹腔に投与した場合は、体積が約３０％減少し、
ＴＭＰリポソームを腹腔に投与した場合は、約８５％減
少し、ＴＭＰリポソームを静脈に注射した場合は約６０
％減少した。 実験例７

【００４６】ＴＭＰ・Ｉ転移抑制リポソームと既存の細
胞毒性活性を有する抗癌剤であるドキソルビシンとの効
能を観察するために、B16F10黒色腫細胞を用いてマウス
における癌転移抑制を測定した。マウス当り２ｘ１０^５
個の細胞数を静脈注射し、注射してから１時間後と３
日、６日、９日に各々３３μgのドキソルビシンを投与
し、他の群にはＴＭＰ・Ｉリポソームに２５μgドキソ
ルビシンを入れてともに投与した。その結果、ドキソル
ビシンを単独で投与した場合より、ＴＭＰ・Ｉリポソー
ムを用いた場合において、小量のドキソルビシンをもっ
てさらに優れた転移抑制効果を示すことが分かった[図
３]。 実験例８

【００４７】ＴＭＰ・Ｉリポソームの細胞毒性とin viv
o 毒性を観察するために二種類のリポソームを製造し
た。細胞毒性を観察するためにＴＭＰ・Ｉを含むカチオ
ン性リポソームを用いて癌細胞に対する細胞毒性効果を
観察した。ヒトの肝癌細胞株であるＳＮＵ３９８細胞と
マウス黒色腫細胞株であるB16F10細胞を培養した後、カ
チオン性リポソーム[TMP・I : DOPE = 1 : 1 (重さ比)]
を種々の濃度で処理して細胞毒性効果を測定した[図
４]。その結果、マウス黒色腫細胞株においては全く細
胞毒性効果が認められなかったが、ヒトの肝癌細胞にお
いては約１２．５μgで細胞死滅が認められ、約１００
μgではほとんど大部分の細胞が死んでいることが観察
できた。ＳＮＵ癌細胞の場合、ＬＤ_５０は約２５μgで
あった[図４]。

【００４８】マウス腹腔に ＴＭＰ・Ｉ含有カチオン性
リポソーム２０００μgを投与し、３日および６日後も
同様な方法で投与し、１５日後マウスを観察した結果、
ＴＭＰ・Ｉリポソームの投与によるマウスの死亡は観察
されず、マウス静脈にDPPC/Chol/TMP・Iリポソーム１０
００μgを投与し、３日および６日後同様な方法で投与
した場合にもマウスの死亡が観察されなかった[表６]。

【００４９】

【表６】 実施例９

【００５０】転移抑制リポソームとエマルジョンの安定
性は、ジェタサイザー3000を用いて試料を４℃で保管し
ながらリポソームとエマルジョンのサイズ変化から測定
した。その結果、カチオン性リポソームであるＴＭＰ・
Ｉは安定であり、蒸留水と５％デキストロース溶液にお
いても変化なく安定であった。ＰＣ basedリポソームの
場合、DPPCとPEG-PEを含むリポソームが最も安定な状態
を保っており、エマルジョンも２ヶ月間非常に安定な状
態を保った[図５]。

【００５１】

【発明の効果】以上述べたように、本発明では、種々の
リン脂質組成において癌の転移および成長を抑制し、他
の種類の抗癌剤とともに使用する場合その効果を極大化
させる、前記一般式(Ｉ)で表されるフィトスフィンゴシ
ン誘導体（ＴＭＰ）を含む多機能性リポソームを製剤化
した。このような転移抑制活性を有するリポソームは、
既存のリポソームとは異なりその自体のみで転移抑制を
示すので、抗癌活性を示す遺伝子の体内への導入または
抗癌剤の伝達において効用性の側面で非常に有用に活用
でき、また既存の抗癌物質の投与量を減らすことができ
る好適なモデルになり得ることと期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＭＰ・Ｉをリポソーム製剤化してＴＭＰ・Ｉ
含量による黒色腫(melanoma cell)の転移抑制能を示す
図である。

【図２】新生血管抑制薬物を含むＴＭＰ・Ｉリポソーム
およびＴＭＰ・Ｉエマルジョンの転移抑制能を比べた図
である。

【図３】ＴＭＰ・Ｉリポソームと抗癌剤であるドキソル
ビシンとの相互作用を示す図である。

【図４】ＴＭＰ・Ｉを含むカチオン性リポソームの細胞
毒性を示すグラフである。

【図５】ＴＭＰ・Ｉ誘導体を含む種々のリポソームとエ
マルジョンを４℃で保管した場合の安定性を示すグラフ
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/04 Ａ６１Ｐ 35/04 43/00 １２１ 43/00 １２１ (72)発明者 パク ソンイ 大韓民国 ソウル ノウォン−ク ハキェ −ドン ジャンミ アパートメント 603 −909 Ｆターム(参考） 4C076 AA17 AA19 BB01 BB13 CC27 DD38 EE31H EE38H FF43 FF68 4C084 AA19 MA02 MA22 MA24 MA52 MA66 NA05 NA10 ZB261 4C206 AA01 AA02 FA41 MA02 MA42 MA44 MA72 MA86 NA05 NA10 NA14 ZB26

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記一般式（Ｉ）で表されるフィトスフィ
   ンゴシン誘導体を有効成分として含むことを特徴とする
   抗癌剤： 【化１】 （式中、Ｒ¹、Ｒ^２およびＲ^３は水素またはＣ_１〜Ｃ_８
   のアルキル基を示し；Ｘはハロゲン、水酸化基、スルホ
   ン酸アルキル基、スルホン酸アリール基を含む原子また
   は原子団を示す）。
2. 【請求項２】前記フィトスフィンゴシン誘導体が、Ｎ，
   Ｎ，Ｎ−トリメチルフィトスフィンゴシニウムハライド
   (N,N,N-trimethylphytosphingosinium halide)であるこ
   とを特徴とする請求項１記載の抗癌剤。
3. 【請求項３】前記フィトスフィンゴシン誘導体が、リポ
   ソームまたはエマルジョンの形態で含まれることを特徴
   とする請求項１記載の抗癌剤。
4. 【請求項４】前記フィトスフィンゴシン誘導体に新生血
   管形成抑制剤または細胞毒性(cytotoxicity)を示す抗癌
   剤がともに含まれることを特徴とする請求項１記載の抗
   癌剤。