JP2003024064A - Method for detecting bonding reaction of receptor with substance to be tested - Google Patents
Method for detecting bonding reaction of receptor with substance to be testedInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、レセプターと被検
物質との結合反応を検出する方法に関する。本発明の検
出方法は、大量の被検物質の中から、レセプターに作用
しシグナルを誘発する物質を迅速にスクリーニングする
際（即ち、ハイスループットスクリーニングを行う際）
に特に有用である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting a binding reaction between a receptor and a test substance. The detection method of the present invention is used to rapidly screen a large amount of test substances for substances that act on receptors and induce signals (ie, when performing high-throughput screening).
Especially useful for.
【０００２】[0002]
【従来の技術】外界からの刺激に対する生体の様々な応
答反応は、細胞内におけるレセプター・リガンド結合反
応を介したシグナル伝達によって行われていることが近
年明らかになってきている。レセプターは、細胞膜に存
在するものと細胞核内に存在するものの主に２群に分け
られる。特に細胞核内に存在し、核内レセプターと呼ば
れるレセプター群は、脂溶性ホルモンやビタミンなどの
低分子化合物をリガンドとして特異的に受容し、様々な
遺伝子群の転写を直接調節する。ゆえに、核内レセプタ
ーに結合し得る化合物は、生体に対して直接的に種々の
薬理作用を持つことが期待され、それら化合物を高効率
で探索することは、創薬における重要課題となってい
る。2. Description of the Related Art In recent years, it has become clear that various response reactions of the living body to external stimuli are carried out by signal transduction via a receptor-ligand binding reaction in cells. Receptors are mainly divided into two groups, those existing in the cell membrane and those existing in the cell nucleus. Particularly, a group of receptors, which are present in the nucleus of cells and are called nuclear receptors, specifically accept low molecular weight compounds such as lipophilic hormones and vitamins as ligands, and directly regulate the transcription of various gene groups. Therefore, compounds capable of binding to nuclear receptors are expected to have various pharmacological actions directly on the living body, and searching for such compounds with high efficiency has become an important issue in drug discovery. .
【０００３】また近年、環境中に存在し、生物に対して
生殖器官の発達異常等の悪影響を及ぼす化学物質、即ち
内分泌攪乱物質が問題となっている。内分泌攪乱化学物
質の多くは、核内レセプターに特異的に受容されるリガ
ンドとして機能し、生体本来のリガンドとは無関係な偽
のシグナルを発することにより生体に悪影響を及ぼすと
いわれている。特に、既知の内分泌攪乱化学物質のおよ
そ９割が、核内レセプターの一つ、エストロゲンレセプ
ターのリガンドとして機能するといわれている。このよ
うな状況下、膨大な数にのぼる既存の化学物質につい
て、それらがエストロゲンレセプターのリガンドとなり
得るか、即ち同レセプターと結合するか否かをスクリー
ニングする必要性が認識され、世界的にも大規模なスク
リーニングが進行中である。Further, in recent years, chemical substances existing in the environment and exerting adverse effects on living things such as abnormal development of reproductive organs, that is, endocrine disrupting substances, have become a problem. It is said that many endocrine disrupting chemicals function as a ligand that is specifically accepted by a nuclear receptor, and adversely affect the living body by emitting a false signal that is unrelated to the original ligand of the living body. In particular, about 90% of known endocrine disrupting chemicals are said to function as a ligand for one of the nuclear receptors, the estrogen receptor. Under such circumstances, it has been recognized that a huge number of existing chemical substances need to be screened for their potential as ligands for the estrogen receptor, that is, whether or not they bind to the estrogen receptor. Extensive screening is in progress.
【０００４】これまでの解析から、多くの核内レセプタ
ーは、生体内で以下のように機能すると認識されている
（図１参照）。まず、特異的リガンドを受容して、レセ
プター・リガンド複合体となると２量体を形成する（段
階Ｉ）。この２量体は、核内ＤＮＡの特異的な塩基配列
（レセプター応答配列）を認識して結合し、レセプター
／ＤＮＡ複合体を形成する（段階II）。このレセプター
／ＤＮＡ複合体は、核内に存在するコアクチベーターに
より活性化され、下流に存在する遺伝子の転写を促進
し、様々な生理活性を誘導する（段階III）。From the analysis so far, it has been recognized that many nuclear receptors function in vivo as follows (see FIG. 1). First, it receives a specific ligand and forms a dimer when it becomes a receptor-ligand complex (step I). This dimer recognizes and binds to a specific base sequence (receptor response sequence) of nuclear DNA to form a receptor / DNA complex (step II). This receptor / DNA complex is activated by a coactivator existing in the nucleus, promotes transcription of genes existing downstream, and induces various physiological activities (step III).
【０００５】従来のリガンドスクリーニング法は、核内
レセプターの機能する最初の段階、即ちレセプターとリ
ガンドの結合を検出するものが多い。なかでも、レセプ
ター結合アッセイと呼ばれる手法が最も一般的である。
レセプター結合アッセイは、まず標的レセプターに対
し、既知の標識リガンドと標識されてない被検物質とを
競合的に反応させる。その後洗浄を行い、未反応の標識
リガンドを除去してから、結合した標識リガンド量を測
定する。このように標識リガンドのレセプターへの結合
量を計測することにより、被検物質の結合能の有無およ
び強弱を検出する。この手法は単純で実験系も組みやす
い。しかし、標識として放射性同位元素を用いた場合に
特別の施設を必要とすること、計測の前段階で洗浄工程
を必要とすることから、ハイスループットスクリーニン
グに必要な要件を満たしていない。また、既知の標識リ
ガンドをトレーサー物質として反応系に加える必要があ
るため、リガンド未知のレセプター（例えば、オーファ
ンレセプター）のアッセイには利用できない。これは、
オーファンレセプターに対するリガンドが新規薬物とし
て有効である事例が多い創薬場面において重大な難点と
なる。Many conventional ligand screening methods detect the initial stage of functioning of the nuclear receptor, that is, the binding between the receptor and the ligand. Among them, the method called receptor binding assay is the most common.
In the receptor binding assay, a known labeled ligand and an unlabeled test substance are competitively reacted with a target receptor. After that, washing is performed to remove unreacted labeled ligand, and then the amount of bound labeled ligand is measured. By measuring the binding amount of the labeled ligand to the receptor in this manner, the presence or absence and the strength of the binding ability of the test substance are detected. This method is simple and easy to set up an experimental system. However, when a radioisotope is used as a label, a special facility is required and a washing step is required before the measurement, and therefore, the requirements required for high throughput screening are not satisfied. In addition, since it is necessary to add a known labeled ligand to the reaction system as a tracer substance, it cannot be used for assaying a receptor (eg, orphan receptor) whose ligand is unknown. this is,
This is a serious difficulty in drug discovery where there are many cases where ligands for orphan receptors are effective as new drugs.
【０００６】このような状況下、既知のリガンド添加を
必要とせず、被検物質自体を蛍光標識して標的レセプタ
ーと反応させる手法が報告されている（特表平11-50260
8：生体高分子の適応度を評価するための方法および装
置）。この手法では、被検物質と標的レセプターとの結
合の有無を、反応前後での被検物質の反応液中での拡散
時間を計測することにより検出する。具体的には、予め
被検物質を蛍光標識し、これを細胞内もしくは試験管内
の標的レセプターに添加し反応させる。被検物質がレセ
プターと結合した場合には、比較的低分子の被検物質が
分子量の大きなレセプター蛋白質と複合体を形成するた
め、見かけ上の分子量が増大する。これにより溶液中で
の拡散速度が遅くなることが予想され、これを指標とし
て被検物質のレセプターへの結合性を検出する。Under such circumstances, a method has been reported in which a test substance itself is fluorescently labeled and reacted with a target receptor without requiring the addition of a known ligand (Japanese Patent Laid-Open No. 11-50260).
8: Method and apparatus for assessing fitness of biopolymers). In this method, the presence or absence of binding between the test substance and the target receptor is detected by measuring the diffusion time of the test substance in the reaction solution before and after the reaction. Specifically, the test substance is fluorescently labeled in advance, and this is added to the target receptor in the cell or in the test tube and reacted. When the test substance binds to the receptor, the test substance having a relatively low molecular weight forms a complex with a receptor protein having a large molecular weight, so that the apparent molecular weight increases. This is expected to slow the diffusion rate in the solution, and the binding of the test substance to the receptor is detected using this as an index.
【０００７】ここで被検物質の拡散速度は、ＦＣＳ（蛍
光相関分光法；Fluorescence Correlation Spectroscop
y）により計測される。ＦＣＳとは、レーザ照射により
反応溶液中に設定されるｆ(10-18)Ｌオーダーの微小な
共焦点領域において、蛍光標識した標的分子の媒質中の
ゆらぎ運動を計測し、個々の標的分子の微小運動を自己
相関関数を用いて測定する技術である。Here, the diffusion rate of the test substance is FCS (Fluorescence Correlation Spectroscop).
y). FCS is the f (10 -18 ) L-order minute confocal region set in the reaction solution by laser irradiation, measuring the fluctuation motion of the fluorescently labeled target molecule in the medium, and measuring the individual target molecule It is a technique for measuring minute movements using an autocorrelation function.
【０００８】この手法によれば、未反応の標識物質を反
応溶液中から分離・除去する必要がなく、更に、標識し
た既知のリガンドをトレーサーとして添加する必要もな
い。その上、反応溶液中の蛍光標識分子の拡散時間は、
ＦＣＳを用いれば数秒で計測可能であり、これらの点に
おいてハイスループット検出系としての要件を満たして
いる。一方でこの手法は、被検物質を蛍光標識する必要
があり、多種類の被検物質をスクリーニングする場合、
分子構造に影響を与えずに、それら全ての物質を蛍光標
識することは大変な困難とコストがかかると予想され
る。しかも、結合能の有無を分離良く検出するために
は、被検物質の蛍光標識の際の未反応な蛍光試薬をでき
るだけ除去し、バックグラウンドノイズを抑えることが
不可欠である。これらの手間を考えると、この手法もハ
イスループットスクリーニングに適していない面を有す
る。According to this method, it is not necessary to separate and remove the unreacted labeling substance from the reaction solution, and further it is not necessary to add a known labeled ligand as a tracer. Moreover, the diffusion time of the fluorescently labeled molecule in the reaction solution is
Measurement with FCS is possible in a few seconds, and in these respects, the requirements for a high-throughput detection system are satisfied. On the other hand, this method requires fluorescent labeling of the test substance, and when screening many types of test substances,
Fluorescent labeling of all of these substances without affecting the molecular structure is expected to be extremely difficult and costly. Moreover, in order to detect the presence or absence of the binding ability with good separation, it is essential to remove unreacted fluorescent reagent in the fluorescent labeling of the test substance as much as possible and suppress the background noise. Considering these efforts, this method also has an aspect not suitable for high throughput screening.
【０００９】また別の手法として、近年、センサー上に
固相化した標的レセプターに被検物質を反応させ、レセ
プターと被検物質との直接的な分子間相互作用を、表面
プラズモン共鳴あるいは質量分析により検出する方法も
開発されている。この手法は、既知のリガンドを添加す
る必要がない上に、被検物質を標識する必要もない。し
かし、未反応物を分離・除去する洗浄工程が必要である
こと、また標的レセプターを固相化したチップが高価で
コストがかかること等、ハイスループットスクリーニン
グに適していない面を有する。As another method, in recent years, a test substance is reacted with a target receptor immobilized on a sensor, and direct intermolecular interaction between the receptor and the test substance is analyzed by surface plasmon resonance or mass spectrometry. The method of detecting is also developed. This technique does not require the addition of known ligands nor labeling of the test substance. However, it is not suitable for high-throughput screening because it requires a washing step for separating and removing unreacted substances, and that a chip on which a target receptor is immobilized is expensive and costly.
【００１０】さらに別のスクリーニング法として、レセ
プター同士の２量体化を発光により検出する酵母two-hy
brid法や、核内レセプターの機能する最後の段階（即
ち、レセプター・リガンド複合体が標的ＤＮＡ配列に結
合し、下流遺伝子の発現を誘導する段階）を発光により
検出するレポーターアッセイが挙げられる。しかし、い
ずれも酵母、培養細胞等の生物を材料とするため、コス
トと手間がかかりハイスループットスクリーニングには
不向きである。As another screening method, yeast two-hy which detects dimerization between receptors by luminescence
The brid method and the reporter assay which detects the last step of the function of the nuclear receptor (that is, the step where the receptor-ligand complex binds to the target DNA sequence and induces the expression of the downstream gene) by luminescence are mentioned. However, since all of them are made of organisms such as yeast and cultured cells, they are costly and labor-intensive, and are not suitable for high-throughput screening.
【００１１】以上より、従来のいずれの手法も、被検物
質がレセプターのリガンドとなり得るか否かをハイスル
ープット検出するためのスクリーニング系としては問題
点を有している。As described above, any of the conventional methods has a problem as a screening system for high-throughput detection of whether a test substance can be a ligand for a receptor.
【００１２】[0012]
【発明が解決しようとする課題】上記事情に鑑み、本発
明は、被検物質がレセプターのリガンドとなり得るか否
かを検出する方法であって、ハイスループット検出に適
した方法を提供することを目的とする。In view of the above circumstances, the present invention provides a method for detecting whether or not a test substance can be a receptor ligand, which is suitable for high throughput detection. To aim.
【００１３】なお本明細書において、「ハイスループッ
ト検出」とは、多数の同一または異なる被検物質に由来
する反応の有無または量の決定を短時間に行うことをい
い、「ハイスループット検出系」とは、「ハイスループ
ット検出」を実行するステップ全体をいう。また、「ハ
イスループットスクリーニング」とは、「ハイスループ
ット検出」の実行によって特定の被検物質による反応が
有った場合または或る一定量以上の反応量が得られた場
合を、そうでない場合を含む多数の結果から短時間に選
別することをいう。また、「ハイスループット試験」と
は、「ハイスループット検出」の実行によって検査結果
を求めるあらゆる検査の総称である。In the present specification, the term "high throughput detection" means that the presence or the amount of the reaction derived from a large number of the same or different test substances is determined in a short time, that is, "high throughput detection system". Refers to the entire step of performing "high throughput detection". The term "high-throughput screening" refers to the case where there is a reaction by a specific test substance or the case where a reaction amount of a certain amount or more is obtained by the execution of "high-throughput detection", It means to select in a short time from a large number of results including. Further, the “high throughput test” is a general term for all tests that obtain test results by executing “high throughput detection”.
【００１４】本発明においてハイスループット検出に適
した方法とは、具体的に下記の要件を満たす必要があ
る。In the present invention, the method suitable for high-throughput detection must specifically meet the following requirements.
【００１５】被検物質のレセプターに対する結合能の
有無を、明確に分離よく検出できること、
様々なレセプターへの結合性に関し、容易に検査でき
ること、
検出までの過程でアッセイ系に添加した物質の分離・
洗浄等の煩雑な操作を必要としないこと、
検出に必要とされる時間が短時間であること、
アッセイ系に用いる試薬等は、容易に入手・操作で
き、コストも安価であること、
特に創薬の分野では、被検物質が製造・合成過程で極
少量しか得られないことも多く、そのような極少量の物
質についても充分にアッセイ可能であること。The presence or absence of the ability of the test substance to bind to the receptor can be clearly and well detected, the binding properties to various receptors can be easily tested, and the separation / addition of the substance added to the assay system in the process up to detection
It does not require complicated operations such as washing, the time required for detection is short, the reagents used in the assay system can be easily obtained and operated, and the cost is low. In the field of medicine, it is often the case that only a very small amount of a test substance can be obtained during the manufacturing / synthesis process, and it is possible to sufficiently assay such a very small amount of substance.
【００１６】[0016]
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため、以下のような検討を行った。その概略を
述べる。まず、大量の被検物質に対してハイスループッ
トスクリーニングを行うため、本発明の方法は、細胞内
で発現させた状態のレセプター分子ではなく、溶液中に
懸濁された状態のレセプター分子を使用することを前提
とした。The present inventor has conducted the following examinations in order to solve the above problems. The outline will be described. First, in order to perform high throughput screening on a large amount of test substance, the method of the present invention uses the receptor molecule suspended in a solution, not the receptor molecule expressed in the cell. I assumed that.
【００１７】核内レセプターは、図１に示すように、リ
ガンドを受容して２量体を形成し（段階Ｉ）、標的ＤＮ
Ａ配列に結合し（段階II）、下流遺伝子の転写活性化
（段階III）を引き起こす。ここで、レセプターと被検
物質の結合反応を、分子の拡散時間の違いにより検出す
る場合、レセプターが２量体化する段階Ｉ、レセプター
・ＤＮＡ複合体を形成する段階IIの何れにおいても検出
可能であると考えられる。しかし、レセプターと被検物
質の結合反応を、レセプター単量体と２量体の拡散時間
の差で検出する（段階Ｉ）より、レセプター単量体とレ
セプター・ＤＮＡ複合体の拡散時間の差で検出する方
（段階II）が、その差は大きいと理論的に考えられる。
従って、段階IIでの検出が、レセプター・被検物質の結
合反応を明確に分離よく検出できることに新たに着目し
た。The nuclear receptor accepts a ligand to form a dimer (step I), as shown in FIG.
It binds to the A sequence (step II) and causes transcriptional activation of downstream genes (step III). Here, when the binding reaction between the receptor and the test substance is detected by the difference in the diffusion time of the molecule, it can be detected at both stage I of receptor dimerization and stage II of receptor-DNA complex formation. Is considered to be. However, the binding reaction between the receptor and the test substance is detected by the difference in the diffusion time between the receptor monomer and the dimer (step I). It is theoretically considered that the difference is larger in the case of detection (stage II).
Therefore, it was newly noted that the detection in step II can clearly detect the binding reaction between the receptor and the test substance with good separation.
【００１８】なお、従来のレセプター・リガンド結合ア
ッセイは、その殆どが、被検物質とレセプターとの結合
の有無や結合親和性のみを検出しており、さらに反応が
進んだ段階の、レセプター・リガンド複合体の標的ＤＮ
Ａ配列への結合親和性については殆ど評価していない。
しかし、被検物質のリガンドとしての活性の強さは、該
物質のレセプターへの親和性よりむしろ、レセプター・
被検物質複合体の標的ＤＮＡ配列に対する親和性に相関
するとの報告も近年なされている（USP 5888738：Desig
n of Drugs Involving Receptor-Ligand-DNA Interacti
ons）。Most of the conventional receptor-ligand binding assays detect only the presence or absence of binding between the test substance and the receptor and the binding affinity, and the receptor-ligand at the stage of further reaction is detected. Target DN of complex
Almost no evaluation was made on the binding affinity to the A sequence.
However, the strength of the activity of the test substance as a ligand depends not on the affinity of the test substance for the receptor,
In recent years, it has been reported that it is correlated with the affinity of the test substance complex for the target DNA sequence (USP 5888738: Desig).
n of Drugs Involving Receptor-Ligand-DNA Interacti
ons).
【００１９】上記検討内容を踏まえ、本発明は、以下の
手段を採用する。Based on the contents of the above examination, the present invention adopts the following means.
【００２０】（１） レセプターと被検物質との結合反
応を検出する方法であって、レセプターとリガンドとが
複合体を形成することができ、且つ該レセプター・リガ
ンド複合体が、該複合体の結合可能な特異的核酸配列に
結合することができる所定の溶液中に、光信号を発生し
得るマーカー物質で標識されたレセプター、被検物質、
およびレセプター・リガンド複合体の結合可能な特異的
核酸配列を含む核酸断片を維持する工程と、レセプター
と被検物質とが複合体を形成し、該複合体が該核酸断片
に結合することにより形成されるレセプター・被検物質
・核酸断片複合体の有無を検出する工程とを含むことを
特徴とする方法。(1) A method for detecting a binding reaction between a receptor and a test substance, wherein the receptor and the ligand can form a complex, and the receptor-ligand complex is a complex of the complex. In a predetermined solution capable of binding to a specific nucleic acid sequence capable of binding, a receptor labeled with a marker substance capable of generating a light signal, a test substance,
And a step of maintaining a nucleic acid fragment containing a specific nucleic acid sequence capable of binding to the receptor-ligand complex, and forming by forming a complex between the receptor and a test substance, and the complex binding to the nucleic acid fragment And the step of detecting the presence or absence of the receptor / test substance / nucleic acid fragment complex as described above.
【００２１】（２） レセプター・被検物質・核酸断片
複合体の有無を、光信号を発生し得るマーカー物質で標
識されたレセプターの溶液中の拡散時間を計測すること
により検出する（１）に記載の方法。(2) The presence / absence of the receptor / test substance / nucleic acid fragment complex is detected by measuring the diffusion time in the solution of the receptor labeled with a marker substance capable of generating an optical signal. The method described.
【００２２】（３） 前記レセプターが核内レセプター
であることを特徴とする（１）または（２）に記載の方
法。(3) The method according to (1) or (2), wherein the receptor is a nuclear receptor.
【００２３】（４） 前記特異的核酸配列を含む核酸断
片が、レセプターの分子量と同じかもしくはそれ以上の
分子量を有することを特徴とする（１）ないし（３）の
何れか１に記載の方法。(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the nucleic acid fragment containing the specific nucleic acid sequence has a molecular weight equal to or higher than the molecular weight of the receptor. .
【００２４】（５） 前記特異的核酸配列を含む核酸断
片が、レセプターの有する拡散定数と同じかもしくはそ
れ以下の拡散定数を有することを特徴とする（１）ない
し（３）の何れか１に記載の方法。(5) In any one of (1) to (3), the nucleic acid fragment containing the specific nucleic acid sequence has a diffusion constant equal to or less than that of the receptor. The method described.
【００２５】（６） レセプター単量体とレセプター・
被検物質・核酸断片複合体との相対量を自己相関関数を
用いて算出することにより、レセプターと被検物質との
結合親和性を評価する（１）ないし（５）の何れか１に
記載の方法。(6) Receptor monomer and receptor
The binding affinity between the receptor and the test substance is evaluated by calculating the relative amount of the test substance / nucleic acid fragment complex using an autocorrelation function. (1) to (5) the method of.
【００２６】（７） 前記核酸がＤＮＡであることを特
徴とする（１）ないし（６）の何れか１に記載の方法。(7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the nucleic acid is DNA.
【００２７】（８） ハイスループット検出により行わ
れる（１）ないし（７）の何れか１に記載の方法。(8) The method according to any one of (1) to (7), which is performed by high throughput detection.
【００２８】[0028]
【発明の実施の形態】本発明を為すにあたり、検討した
内容について以下に詳細に説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The details examined in carrying out the present invention will be described below in detail.
【００２９】レセプターの２量体化の過程を検出する場
合、レセプター単量体と、レセプター２量体の分子の拡
散定数は、２倍以下の差しかなく両者を拡散時間の差で
検出するのは困難である。一方、レセプター単量体とレ
セプター・リガンド・ＤＮＡ複合体の拡散定数は、ＤＮ
Ａのサイズによっては、２倍以上の差を付けることが可
能である。ＤＮＡのサイズにより拡散定数に２倍以上の
差を付ければ、レセプターの結合反応を分離よく検出す
ることが期待できる。When detecting the process of receptor dimerization, the diffusion constants of the receptor monomer and the molecule of the receptor dimer are not more than two times, and both are detected by the difference in diffusion time. It is difficult. On the other hand, the diffusion constant of the receptor monomer and the receptor-ligand-DNA complex is
Depending on the size of A, it is possible to make a difference more than double. It is expected that the binding reaction of the receptor will be detected with good separation if the diffusion constant is more than doubled depending on the size of the DNA.
【００３０】一般に２種類のサイズの異なる分子を明確
に分離して検出するためには、これまでの知見により両
分子の拡散定数が少なくとも２倍より大きいひらきがあ
ることが重要であるといわれている。In general, in order to clearly separate and detect two kinds of molecules having different sizes, it is said that it is important that the diffusion constant of both molecules is at least twice as large as the knowledge obtained so far. There is.
【００３１】ここで拡散定数Ｄとは、分子を球状と仮定
したとき、その半径ｒを用いてアインシュタイン−スト
ークスの式として、次の式で表されるものである。
Ｄ＝（κＢＴ）/（６πηｒ） ・・・Ａ
κＢはボルツマン定数
Ｔは絶対温度
ηは溶媒溶液の粘性
レセプタータンパク質等のタンパク質は、一般的に球状
分子と考えられ、拡散定数は、上記式Ａに従うと考えら
れる。Here, the diffusion constant D is expressed by the following equation as Einstein-Stokes equation using the radius r when the molecule is assumed to be spherical. D = (κ B T) / (6πηr) ... A κ B is Boltzmann's constant T is absolute temperature η is a solvent solution. Viscosity receptor proteins and other proteins are generally considered to be spherical molecules, and the diffusion constant is It is considered to follow equation A above.
【００３２】一方、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片は
棒状分子と考えられ、その拡散定数Ｄは、次の式Ｂで表
される。
Ｄ＝（ＡκＴ）/（３πη０Ｌ） ・・・Ｂ
Ａ＝In(L/d)＋0.312＋0.565/(L/ｄ)−0.1/(L/d)2
ＬはＤＮＡの長さ（3.4Å×塩基対の数[bp]）
ｄはＤＮＡ棒状分子の径（23.8Å）
κはボルツマン定数
Ｔは絶対温度
η０は溶媒溶液の粘性
また、ＦＣＳ計測により得られる分子の拡散時間τ
ｄｉｆｆは、以下の式で表される。
τｄｉｆｆ＝ω2/４Ｄ
ωは、ＦＣＳ計測の際のレーザービームの径を表す。On the other hand, the DNA fragment containing the target DNA sequence is considered to be a rod-shaped molecule, and its diffusion constant D is represented by the following formula B. D = (AκT) / (3πη 0 L) ... B A = In (L / d) + 0.312 + 0.565 / (L / d) −0.1 / (L / d) 2 L is the length of the DNA ( 3.4 Å × number of base pairs [bp]) d is the diameter of the rod-shaped DNA molecule (23.8 Å) κ is the Boltzmann constant T is the absolute temperature η 0 is the viscosity of the solvent solution and the diffusion time τ of the molecule obtained by FCS measurement
diff is represented by the following formula. τ diff = ω 2 / 4D ω represents the diameter of the laser beam at the time of FCS measurement.
【００３３】同程度の分子量の分子を比較すると、棒状
分子であるＤＮＡの方が球状分子と考えられるレセプタ
ー蛋白分子より一般的に拡散定数は小さくなる（核酸時
間は長くなる）。例えば、核内レセプターの一種である
エストロゲンレセプターβは、分子量が約６０ｋDaの球
状分子と考えられ、その拡散定数は約7.5×10-11（ｍ 2/
Ｓ）と計算できる。同レセプターがリガンドと結合し、
２量体を形成したとすると、その２量体の拡散定数は、
5.9×10-11（ｍ2/Ｓ）と計算できる。よって、レセプタ
ー単量体と２量体とで拡散定数は２倍以下の差しかな
く、両者を拡散時間の差で検出するのは困難と考えられ
る。Comparing molecules having similar molecular weights, rod-shaped
Receptor in which molecule, DNA, is considered to be a spherical molecule
-In general, the diffusion constant is smaller than that of protein molecules (for nucleic acid
Interval will be long). For example, a type of nuclear receptor
Estrogen receptor β is a sphere with a molecular weight of about 60 kDa.
It is considered to be a molecule and its diffusion constant is about 7.5 × 10-11(M 2/
S) can be calculated. The receptor binds to the ligand,
If a dimer is formed, the diffusion constant of the dimer is
5.9 x 10-11(M2/ S) can be calculated. Therefore, the receptor
-Is the diffusion constant between the monomer and the dimer less than double?
Therefore, it is considered difficult to detect both due to the difference in diffusion time.
It
【００３４】一方、分子量が約６０ｋDaに相当する２本
鎖ＤＮＡは、およそ100ｂｐ長となるが、その拡散定数
は3.8×10-11（ｍ2/Ｓ）となり、同分子量の球状分子の
約１/２である。よって、レセプター・リガンド複合体
が、適切な長さのＤＮＡ断片と結合して複合体を形成す
れば、拡散定数をレセプター単量体より２倍以上小さく
することができる。On the other hand, double-stranded DNA having a molecular weight of about 60 kDa has a length of about 100 bp, but its diffusion constant is 3.8 × 10 -11 (m 2 / S), which is about 1 of the spherical molecules of the same molecular weight. / 2. Therefore, if the receptor-ligand complex binds to a DNA fragment of an appropriate length to form a complex, the diffusion constant can be made twice or more smaller than that of the receptor monomer.
【００３５】したがって、レセプター・リガンド・ＤＮ
Ａ断片複合体の存在を拡散時間の計測により検出すれ
ば、被検物質のレセプターへの結合反応を明確に検出す
ることができる。本発明において新たにこの点を見出
し、本発明を完成させるに至った。以下、本発明を説明
する。Therefore, the receptor / ligand / DN
If the presence of the A fragment complex is detected by measuring the diffusion time, the binding reaction of the test substance to the receptor can be clearly detected. In the present invention, this point was newly found and the present invention was completed. The present invention will be described below.
【００３６】本発明のレセプターと被検物質との結合反
応を検出する方法は、レセプターとリガンドとが複合体
を形成することができ、且つ該レセプター・リガンド複
合体が、該複合体の結合可能な特異的ＤＮＡ配列に結合
することができる所定の溶液中に、蛍光標識されたレセ
プター、被検物質、およびレセプター・リガンド複合体
の結合可能な特異的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を維持
する工程と、レセプターと被検物質とが複合体を形成
し、該複合体が該ＤＮＡ断片に結合することにより形成
されるレセプター・被検物質・ＤＮＡ断片複合体の有無
を検出する工程とを含むことを特徴とする。The method of detecting the binding reaction between the receptor and the test substance according to the present invention can form a complex between the receptor and the ligand, and the receptor-ligand complex can bind the complex. Maintaining a DNA fragment containing a fluorescently labeled receptor, a test substance, and a specific DNA sequence capable of binding to a receptor-ligand complex in a predetermined solution capable of binding to the specific DNA sequence. And a step of detecting the presence or absence of a receptor / test substance / DNA fragment complex formed by binding the receptor and a test substance to each other and binding the complex to the DNA fragment. Characterize.
【００３７】まず、本発明において使用されるレセプタ
ー、被検物質、特異的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片につ
いて説明する。First, the receptor, test substance, and DNA fragment containing a specific DNA sequence used in the present invention will be described.
【００３８】＜レセプター＞本発明においてレセプター
とは、生体内でリガンドを受容し、その後、核内の特異
的ＤＮＡ配列に結合し作用するものであれば特に限定さ
れない。<Receptor> In the present invention, the receptor is not particularly limited as long as it accepts a ligand in vivo and then binds to a specific DNA sequence in the nucleus to act.
【００３９】このようなレセプターの例として、特異的
ＤＮＡ配列に結合して転写制御因子として機能する、核
内ホルモンレセプタースーパーファミリーに属するレセ
プター（以下、核内レセプターともいう）が挙げられ
る。具体的には、エストロゲンレセプター、プロゲステ
ロンレセプター、甲状腺ホルモンレセプター、グルココ
ルチコイドレセプター等のリガンド既知のレセプター、
およびリガンド未知のレセプター（例えばオーファンレ
セプター）が挙げられる。とりわけ、リガンドとなり得
る物質の大規模ハイスループットスクリーニングが進行
中であるエストロゲンレセプターが挙げられる。An example of such a receptor is a receptor belonging to the nuclear hormone receptor superfamily (hereinafter, also referred to as a nuclear receptor) that binds to a specific DNA sequence and functions as a transcription control factor. Specifically, known receptors such as estrogen receptor, progesterone receptor, thyroid hormone receptor, and glucocorticoid receptor,
And receptors with unknown ligands (eg orphan receptors). Among them are estrogen receptors for which large-scale high-throughput screening of substances that can serve as ligands is in progress.
【００４０】本発明において、レセプター分子を標識す
るための「光信号を発生し得るマーカー物質」とは、検
出可能な光信号を発生し得るものであれば特に限定され
ず、例えば、蛍光を発生する物質、化学発光する物質を
使用することができる。「光信号を発生し得るマーカー
物質」として、好ましくは、蛍光を発生する任意の蛍光
物質を使用することができる。なかでも基質を加えるこ
となく光を発する蛍光蛋白質が好ましく、これにはＧＦ
Ｐ(Green Fluorescent Protein)、ＣＦＰ（Cyan Fluore
scent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protei
n）、およびＲＦＰ（Red Fluorescent Protein）等が含
まれる。レセプター分子を蛍光標識する手法としては、
化学反応による化学的修飾、遺伝子工学による手法が挙
げられる。特に標的とするレセプターの遺伝子が既知の
場合には、遺伝子工学により、ＧＦＰ等の蛍光蛋白質と
レセプターとの融合蛋白質をコードする融合遺伝子を作
製し、in vitro translation等の手法を用いて、融合タ
ンパク質を作製することができる。このような手法を用
いれば、ｍｇオーダーの量で蛍光標識レセプターを作製
できるため、スクリーニングに必要な量を容易に調達可
能である。なお、調製した蛍光標識レセプターは、レセ
プター本来の機能を保持しているか充分に確認して用い
ることが必要である。In the present invention, the “marker substance capable of generating a light signal” for labeling the receptor molecule is not particularly limited as long as it can generate a detectable light signal, and for example, fluorescence is generated. A substance that emits light and a substance that emits chemiluminescence can be used. As the "marker substance capable of generating an optical signal", any fluorescent substance capable of generating fluorescence can be preferably used. Among them, a fluorescent protein that emits light without adding a substrate is preferable, and GF is used as the fluorescent protein.
P (Green Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluore
scent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protei)
n), and RFP (Red Fluorescent Protein) and the like. As a method of fluorescently labeling the receptor molecule,
Examples include chemical modification by chemical reaction and genetic engineering techniques. In particular, when the gene of the target receptor is known, a fusion gene encoding a fusion protein of a fluorescent protein such as GFP and the receptor is prepared by genetic engineering, and the fusion protein is prepared by a technique such as in vitro translation. Can be produced. By using such a method, it is possible to produce the fluorescence-labeled receptor in an amount of the mg order, so that the amount required for screening can be easily procured. In addition, it is necessary to fully confirm whether the prepared fluorescence-labeled receptor retains the original function of the receptor before use.
【００４１】具体的に、エストロゲンレセプター（estr
ogen receptor α）と蛍光蛋白質ＧＦＰ（green fluore
scent protein）との融合蛋白質を遺伝子工学的手法に
より作成した例については、Han Htun, Laurel T.Holt
h, Dawn Walker, James R.Davie, and Gordon L.Hager
(1999) Direct Visualization of the Human EstrogenR
eceptorα Reveals a Role for Ligand in the Nuclear
Distribution of theReceptor., Mol.Biol.Cell, 10,
471-486を参照されたい。Specifically, the estrogen receptor (estr
ogen receptor α) and fluorescent protein GFP (green fluore
Han Htun, Laurel T. Holt for examples of fusion proteins with scent proteins) prepared by genetic engineering techniques.
h, Dawn Walker, James R. Davie, and Gordon L. Hager
(1999) Direct Visualization of the Human EstrogenR
eceptorα Reveals a Role for Ligand in the Nuclear
Distribution of the Receptor., Mol.Biol.Cell, 10,
See 471-486.
【００４２】このように蛍光標識されたレセプター分子
を使用することにより、従来のレセプター結合アッセイ
で必要とされていた既知の標識リガンドが不要になる。
従って本発明では、測定対象とするレセプターは、リガ
ンドが既知のものに限定されない。また、従来例におい
て行われていた手間やコストのかかる被検物質の蛍光標
識を行う必要もない。The use of such fluorescently labeled receptor molecules obviates the need for the known labeled ligands required in conventional receptor binding assays.
Therefore, in the present invention, the receptor to be measured is not limited to those having known ligands. In addition, it is not necessary to perform fluorescent labeling of the test substance, which is laborious and costly, which has been performed in the conventional example.
【００４３】＜被検物質＞本発明において、被検物質と
は、上記レセプターに対して内分泌攪乱性を有すること
が疑われている如何なる化学物質をも使用することがで
きる。<Test Substance> In the present invention, as the test substance, any chemical substance suspected of having endocrine disrupting properties with respect to the above-mentioned receptor can be used.
【００４４】＜特異的核酸配列を含む核酸断片＞本発明
において、レセプター・リガンド複合体の結合可能な特
異的核酸配列は、リガンドを受容したレセプターが認識
し結合する核酸配列であれば特に限定されない。<Nucleic Acid Fragment Containing Specific Nucleic Acid Sequence> In the present invention, the specific nucleic acid sequence capable of binding to the receptor-ligand complex is not particularly limited as long as it is a nucleic acid sequence which can be recognized and bound by the receptor which has received the ligand. .
【００４５】本明細書において「核酸」とは、一般にＤ
ＮＡやＲＮＡを構成するヌクレオチド（以下、単純ヌク
レオチドともいう）から構成されていてもよいし、修飾
ヌクレオチド（例えば、イノシン、メチルアデノシン、
メチルグアノシン等のリン酸エステル）を含んでいても
よい。本発明において「核酸」は、ＤＮＡを構成するヌ
クレオチドから構成されていることが好ましい。以下、
便宜的に、核酸はＤＮＡであるとして説明する。As used herein, the term "nucleic acid" generally refers to D
It may be composed of nucleotides constituting NA or RNA (hereinafter also referred to as simple nucleotides), or modified nucleotides (eg, inosine, methyladenosine,
Phosphoric acid ester such as methylguanosine) may be contained. In the present invention, the “nucleic acid” is preferably composed of nucleotides forming DNA. Less than,
For convenience, the nucleic acid will be described as being DNA.
【００４６】一般に核内レセプターが結合し得る塩基配
列モチーフは既に解析されている。典型的な配列モチー
フは、１５ｂｐからなり、６ｂｐの逆回文配列（invert
ed palindrome）に３ｂｐのスペーサー配列がはさまれ
た構成をもつ。例えば、リガンドを受容したエストロゲ
ンレセプターが結合可能な特異的ＤＮＡ配列は、５’-
ＡＧＧＴＣＡＮＮＮＴＧＡＣＣＴ-３’（Ｎは、単純ヌ
クレオチドおよび修飾ヌクレオチドを含む任意のヌクレ
オチドを示す）である。よって、レセプターの種類に応
じて、結合可能な特異的ＤＮＡ配列を適宜設計して使用
することもできる。In general, a nucleotide sequence motif to which a nuclear receptor can bind has already been analyzed. A typical sequence motif consists of 15 bp and a 6 bp reverse palindromic sequence (invert
ed palindrome) with a 3 bp spacer sequence sandwiched between them. For example, a specific DNA sequence capable of binding to an estrogen receptor that has received a ligand is 5'-
AGGTCANNNNTGACCT-3 ′ (N represents any nucleotide, including simple and modified nucleotides). Therefore, a specific DNA sequence capable of binding can be appropriately designed and used depending on the type of receptor.
【００４７】本発明において、上記ＤＮＡ配列を含むＤ
ＮＡ断片は、レセプター・リガンド複合体が結合可能な
特異的ＤＮＡ配列を含み、且つ適切な長さを有している
必要がある。すなわち、ここで適切な長さとは、レセプ
ター単量体と、レセプター・被検物質・ＤＮＡ断片複合
体とを、その拡散時間の差異により分離よく検出するた
めに必要な長さをいう。より具体的には、検出したい両
物質の拡散定数に少なくとも２倍以上の差をつけること
ができるような長さを意図している。In the present invention, D containing the above DNA sequence
The NA fragment needs to contain a specific DNA sequence to which the receptor-ligand complex can bind and has an appropriate length. That is, the term "appropriate length" as used herein means the length necessary for detecting the receptor monomer and the receptor / test substance / DNA fragment complex with good separation by the difference in their diffusion times. More specifically, the length is intended to allow the diffusion constants of both substances to be detected to be at least twice as different.
【００４８】適切なＤＮＡ断片の長さは、好ましくは下
記のとおり設定される。The length of the appropriate DNA fragment is preferably set as follows.
【００４９】前記ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片は、好ま
しくは、レセプターの分子量と同じかもしくはそれ以上
の分子量を有するように設定する。あるいは、前記ＤＮ
Ａ配列を含むＤＮＡ断片は、好ましくは、レセプターの
有する拡散定数と同じかもしくはそれ以下の拡散定数を
有するように設定する。The DNA fragment containing the above DNA sequence is preferably set so as to have a molecular weight equal to or higher than that of the receptor. Alternatively, the DN
The DNA fragment containing the A sequence is preferably set so as to have a diffusion constant equal to or less than that of the receptor.
【００５０】例えば、エストロゲンレセプターβ（約６
０ｋdaの球状分子）の場合、該レセプターと同程度の分
子量を有するＤＮＡ断片は、約100ｂｐの２本鎖ＤＮＡ
により得られる。従って、適切なＤＮＡ断片は、好まし
くは約100ｂｐ以上の長さを有するように設計される。
また、エストロゲンレセプターβの場合、その拡散定数
は約7.5×10-11(ｍ2/Ｓ)と計算され、該レセプターと同
程度の拡散定数を有するＤＮＡ断片は、約３０ｂｐの２
本鎖ＤＮＡにより得られる。従って、適切なＤＮＡ断片
は、好ましくは約３０ｂｐ以上の長さを有するように設
計される。ＤＮＡ断片の長さの上限は、一般に制限され
ないが、数ｋｂ程度までが適切と考えられる。For example, estrogen receptor β (about 6
In the case of a spherical molecule of 0 kda), a DNA fragment having the same molecular weight as the receptor is a double-stranded DNA of about 100 bp.
Is obtained by Therefore, suitable DNA fragments are preferably designed to have a length of about 100 bp or more.
In the case of estrogen receptor β, its diffusion constant is calculated to be about 7.5 × 10 -11 (m 2 / S), and a DNA fragment having a diffusion constant similar to that of the receptor is about 30 bp of 2
Obtained by double-stranded DNA. Therefore, suitable DNA fragments are preferably designed to have a length of about 30 bp or more. The upper limit of the length of the DNA fragment is not generally limited, but it is considered to be appropriate up to several kb.
【００５１】より具体的には、特異的ＤＮＡ配列を含む
ＤＮＡ断片は、好ましくは、100〜4500ｂｐ、より好ま
しくは100〜200ｂｐの長さを有する２本鎖ＤＮＡを使用
することができる。なお、１本鎖ＤＮＡ分子は、自己の
分子内で塩基対を形成し立体構造をとり得るため好まし
くない。More specifically, as the DNA fragment containing a specific DNA sequence, a double-stranded DNA having a length of preferably 100 to 4500 bp, more preferably 100 to 200 bp can be used. It should be noted that single-stranded DNA molecules are not preferable because they can form a base pair within their own molecules to form a three-dimensional structure.
【００５２】例えば、エストロゲンレセプターβを使用
した場合、特異的ＤＮＡ配列としてエストロゲン応答配
列｛５’-ＡＧＧＴＣＡＮＮＮＴＧＡＣＣＴ-３’（Ｎ
は、単純ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドを含む任
意のヌクレオチドを示す）｝を含み、その他任意の配列
から構成される100〜200ｂｐの長さを有する２本鎖ＤＮ
Ａ断片が好ましくは使用される。For example, when the estrogen receptor β is used, an estrogen responsive element {5'-AGGTCANNNNTGACCT-3 '(N
Represents any nucleotide, including simple nucleotides and modified nucleotides)} and has a length of 100 to 200 bp and is composed of any other sequence.
The A fragment is preferably used.
【００５３】特異的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片は、レ
セプター・リガンド複合体が結合可能な特異的ＤＮＡ配
列を有し、上述の所定の長さを有していさえすれば、そ
の他の塩基配列については任意である。すなわち、該Ｄ
ＮＡ断片は、レセプター単量体と分離よく検出され得る
ような長さに設定されていれば、特異的ＤＮＡ配列を除
くその他の配列については特に意味を有していない。The DNA fragment containing the specific DNA sequence has a specific DNA sequence to which the receptor-ligand complex can bind, as long as it has the above-mentioned predetermined length, other nucleotide sequences It is optional. That is, the D
The NA fragment has no particular meaning with respect to the other sequences except the specific DNA sequence as long as the NA fragment is set to have a length such that it can be easily separated from the receptor monomer.
【００５４】＜所定の溶液中に維持する工程＞次に、上
述のレセプター、被検物質、特異的ＤＮＡ配列を含むＤ
ＮＡ断片を所定の溶液中に維持する工程について説明す
る。<Step of Maintaining in Predetermined Solution> Next, D containing the above-mentioned receptor, test substance and specific DNA sequence
The step of maintaining the NA fragment in a predetermined solution will be described.
【００５５】所定の溶液とは、その溶液中で、レセプタ
ーとリガンドとが複合体を形成することができ、且つ該
レセプター・リガンド複合体が、該複合体の結合可能な
特異的ＤＮＡ配列に結合することができるものであれば
特に限定されない。所定の溶液としては、一般に、ゲル
シフトアッセイのＤＮＡ−タンパク質結合反応に使用さ
れる緩衝液を使用することができる。例えば、所定の溶
液として、20mM Tris-HCl（pH 7.9）、１mM DTT、１mM
EDTA（pH 8.0）、12.5％グリセロール、0.1％Triton X-
100、50μg/mL poly(dI-dC)、250μg/mL BSA、50〜100m
M KClを使用することができる。The predetermined solution means that the receptor and the ligand can form a complex in the solution, and the receptor-ligand complex binds to the specific DNA sequence capable of binding to the complex. There is no particular limitation as long as it can be done. As the predetermined solution, generally, a buffer solution used in a DNA-protein binding reaction of a gel shift assay can be used. For example, as a predetermined solution, 20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 1 mM DTT, 1 mM
EDTA (pH 8.0), 12.5% glycerol, 0.1% Triton X-
100, 50 μg / mL poly (dI-dC), 250 μg / mL BSA, 50-100 m
M KCl can be used.
【００５６】レセプター、被検物質、特異的ＤＮＡ断片
は、所定の溶液中に適切な濃度にて維持されるが、一般
に、精製レセプター蛋白質は、0.03〜５μg/mL、被検物
質は１０-12〜１０-6Ｍ、特異的ＤＮＡ配列を含むＤＮ
Ａ断片は50〜500ｎＭの濃度にて所定の溶液中に維持さ
れる。結合反応の条件（温度、ｐＨ、時間）は、レセプ
ター蛋白質に応じて適宜設定することができる。溶液中
に維持する工程は、好ましくは一定時間インキュベート
することにより行われる。The receptor, the test substance, and the specific DNA fragment are maintained in an appropriate concentration in a predetermined solution. Generally, the purified receptor protein is 0.03 to 5 μg / mL, and the test substance is 10 −12. -10 -6 M, DN containing specific DNA sequence
The A fragment is maintained in a given solution at a concentration of 50-500 nM. The conditions (temperature, pH, time) of the binding reaction can be appropriately set according to the receptor protein. The step of maintaining the solution is preferably carried out by incubating for a certain period of time.
【００５７】結合反応の例としては、例えば、20mM Tri
s-HCl（pH 7.9）、１mM DTT、１mMEDTA（pH 8.0）、12.
5％グリセロール、0.1％Triton X-100、50μg/mL poly
(dI-dC)、250μg/mL BSA、100mM KClの溶液中に、精製
レセプター蛋白質を0.03〜５μg/mL、被検物質を１０
-12〜１０-6Ｍになるように添加し、22℃で10分間イン
キュベートした後、特異的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片
を50〜500ｎＭになるように添加し、さらに30分〜１時
間インキュベートする。As an example of the binding reaction, for example, 20 mM Tri
s-HCl (pH 7.9), 1 mM DTT, 1 mM EDTA (pH 8.0), 12.
5% glycerol, 0.1% Triton X-100, 50 μg / mL poly
(dI-dC), 250 μg / mL BSA, 100 mM KCl solution, purified receptor protein 0.03-5 μg / mL, test substance 10
-12 to 10 -6 M, and incubate at 22 ° C for 10 minutes, and then add a DNA fragment containing a specific DNA sequence to 50 to 500 nM, and further incubate for 30 minutes to 1 hour .
【００５８】インキュベートするために、上記所定の溶
液に反応成分のセットを浮遊状態で含んでなる反応液
を、適宜の液体保持手段、例えば、試験管、ウエル、キ
ュベット、溝、管、平板、多孔体等に保持することがで
きる。ここで、液体保持手段の形状、材質、サイズ等
は、分注、攪拌、インキュベート、測定、搬送等の各種
検出ステップの一部または全てを迅速に行うように選択
するのが好ましい。例えば、ＦＣＳによる測定は、光学
的な焦点レベルの極微小な領域を測定場所とするので、
非常に小型の液体収容手段で有り得る。特に、光学的測
定による検出においては、測定用の光ビームがなるべく
反応成分と直接的に関係するように、液体保持手段は、
測定ビームが入射および/または出射するための開口部
を有するのが好ましい。In order to incubate, a reaction solution containing a set of reaction components in a floating state in the above predetermined solution is added to an appropriate liquid holding means such as a test tube, a well, a cuvette, a groove, a tube, a flat plate, and a porous plate. It can be held on the body or the like. Here, the shape, material, size and the like of the liquid holding means are preferably selected so that some or all of various detection steps such as dispensing, stirring, incubating, measuring, and transporting can be performed quickly. For example, the FCS measurement uses a very small area of the optical focus level as the measurement location,
It can be a very small liquid containment means. In particular, in the detection by optical measurement, the liquid holding means is so configured that the measurement light beam is directly related to the reaction component as much as possible.
It is preferable to have an opening for the measurement beam to enter and / or exit.
【００５９】上述のレセプター、被検物質、特異的ＤＮ
Ａ配列を含むＤＮＡ断片を、上記所定の溶液中に維持す
ることにより、以下の反応が起こる。The above-mentioned receptor, test substance, specific DN
The following reaction occurs by maintaining the DNA fragment containing the A sequence in the above-mentioned predetermined solution.
【００６０】被検物質が、特定のレセプターのリガンド
となり得ない場合の反応溶液モデル図を図２に示す。な
お図２において、レセプター１ａは追跡可能なように蛍
光物質１ｂにより標識されている。レセプター応答配列
を含むＤＮＡ断片３は、レセプターとリガンドとの複合
体が特異的に結合し得る配列を含むＤＮＡ断片のことで
ある。また、ここで「反応液」とは、所定の溶液に反応
成分のセットを浮遊状態で含んでいる液のことをいう。FIG. 2 shows a reaction solution model diagram when the test substance cannot be a ligand of a specific receptor. In FIG. 2, the receptor 1a is labeled with a fluorescent substance 1b so as to be traceable. The DNA fragment 3 containing the receptor responsive element is a DNA fragment containing a sequence capable of specifically binding to the complex of the receptor and the ligand. The term "reaction liquid" as used herein refers to a liquid containing a set of reaction components in a predetermined solution in a suspended state.
【００６１】図２の場合、被検物質２が蛍光標識レセプ
ター１のリガンドとなり得ないため、反応液中に含まれ
る蛍光標識レセプター１と結合できず、これにより、レ
セプター応答配列を含むＤＮＡ断片３とも反応しない。
よって一定時間インキュベートした後も、レセプター・
被検物質・ＤＮＡ断片複合体は形成されず、レセプタ
ー、被検物質、ＤＮＡ断片は、それぞれ単独で浮遊して
存在する。In the case of FIG. 2, since the test substance 2 cannot be a ligand of the fluorescent labeled receptor 1, it cannot bind to the fluorescent labeled receptor 1 contained in the reaction solution, whereby the DNA fragment 3 containing the receptor responsive sequence is formed. Does not react with.
Therefore, even after incubation for a certain period of time,
The test substance / DNA fragment complex is not formed, and the receptor, the test substance, and the DNA fragment exist independently in suspension.
【００６２】一方、被検物質が、特定のレセプターのリ
ガンドとなり得る場合の反応溶液モデル図を図３に示
す。同様に、レセプター１ａは追跡可能なように蛍光物
質１ｂにより標識されている。レセプター応答配列を含
むＤＮＡ断片３は、レセプターとリガンドとの複合体が
特異的に結合し得る配列を含むＤＮＡ断片のことであ
る。On the other hand, FIG. 3 shows a reaction solution model diagram in the case where the test substance can be a ligand of a specific receptor. Similarly, the receptor 1a is labeled with a fluorescent substance 1b so as to be traceable. The DNA fragment 3 containing the receptor responsive element is a DNA fragment containing a sequence capable of specifically binding to the complex of the receptor and the ligand.
【００６３】図３の場合、一定時間のインキュベートの
過程で、被検物質２は反応液中の蛍光標識レセプター１
と結合して、レセプター・被検物質複合体４を形成す
る。さらにその複合体が２量体を形成した後、レセプタ
ー応答配列を含むＤＮＡ断片３と結合して、レセプター
・被検物質・ＤＮＡ断片複合体５が形成される。In the case of FIG. 3, the test substance 2 is the fluorescent labeled receptor 1 in the reaction solution during the incubation for a certain period of time.
To form a receptor-test substance complex 4. Further, the complex forms a dimer and then binds to the DNA fragment 3 containing the receptor responsive element to form a receptor / test substance / DNA fragment complex 5.
【００６４】このとき形成されるレセプター・被検物質
・ＤＮＡ断片複合体５の構成を図４に示す。図４は、蛍
光標識レセプター２個により構成されるレセプター２量
体（ダイマー）と、レセプター応答配列を含むＤＮＡ断
片との複合体を示す。なお、図３では、レセプター・被
検物質複合体は２量体を形成した後にＤＮＡ断片に結合
しているが、２量体を形成しないで単量体のままＤＮＡ
断片に結合するレセプターも考えられる。The structure of the receptor / test substance / DNA fragment complex 5 formed at this time is shown in FIG. FIG. 4 shows a complex of a receptor dimer (dimer) composed of two fluorescently labeled receptors and a DNA fragment containing a receptor responsive element. In FIG. 3, the receptor-analyte complex is bound to the DNA fragment after forming a dimer, but the DNA remains as a monomer without forming a dimer.
Receptors that bind to the fragment are also contemplated.
【００６５】＜レセプター・被検物質・ＤＮＡ断片複合
体の有無を検出する工程＞上述のレセプター、被検物
質、レセプター応答配列を含むＤＮＡ断片を、上記所定
の溶液中に維持した後、レセプター・被検物質・ＤＮＡ
断片複合体の有無を検出する。この検出は、好ましく
は、蛍光標識レセプターの拡散時間をＦＣＳなどの手段
を用いて計測することにより行う。これにより、被検物
質が、標的レセプターのリガンドとなり得るか否かを検
出することができる。<Step of Detecting Presence / Absence of Receptor / Test Substance / DNA Fragment Complex> After maintaining the above-mentioned receptor, test substance, and DNA fragment containing the receptor response sequence in the above-mentioned predetermined solution, the receptor Test substance / DNA
The presence or absence of fragment complexes is detected. This detection is preferably performed by measuring the diffusion time of the fluorescent labeled receptor using a means such as FCS. This makes it possible to detect whether or not the test substance can be a ligand of the target receptor.
【００６６】ＦＣＳを用いた計測の具体的な手順を以下
に示す。ただし本発明は以下の計測法に限定されない。The specific procedure of measurement using FCS is shown below. However, the present invention is not limited to the following measuring method.
【００６７】まず、標的とするレセプターを蛍光標識
し、反応溶液中における該レセプター単量体での拡散時
間をＦＣＳにて計測しておく。次に、該レセプターを含
む反応溶液中に被検物質、該レセプター応答配列を含む
ＤＮＡ断片を添加し、一定時間インキュベートして結合
反応を行った後、反応溶液中の蛍光標識レセプターの拡
散時間を同様にＦＣＳにより計測する。First, the target receptor is fluorescently labeled, and the diffusion time of the receptor monomer in the reaction solution is measured by FCS. Next, a test substance and a DNA fragment containing the receptor responsive element are added to a reaction solution containing the receptor, incubated for a certain period of time to perform a binding reaction, and then the diffusion time of the fluorescent labeled receptor in the reaction solution is adjusted. Similarly, it is measured by FCS.
【００６８】ここで、被検物質が、レセプターのリガン
ドとなり得ない場合は、レセプターは、インキュベート
後も反応溶液中で単量体で存在するため、インキュベー
トの前後で拡散時間は変化しない（図２参照）。Here, when the test substance cannot be a ligand for the receptor, the receptor is present as a monomer in the reaction solution even after the incubation, so that the diffusion time does not change before and after the incubation (FIG. 2). reference).
【００６９】一方、被検物質がレセプターのリガンドと
なり得る場合は、インキュベート後にレセプター・被検
物質・ＤＮＡ断片複合体が形成される。このとき標識レ
セプターの見かけの分子量が増加し、レセプターは、単
量体で存在する場合と比べてその拡散時間が増大する
（図３参照）。ただし、このとき反応溶液中には、被検
物質を結合していない単量体のレセプター分子も混在し
ている。On the other hand, when the test substance can be a ligand for the receptor, a receptor-test substance-DNA fragment complex is formed after incubation. At this time, the apparent molecular weight of the labeled receptor increases, and the diffusion time of the receptor increases as compared with the case where it exists as a monomer (see FIG. 3). However, at this time, the reaction solution also contains monomer receptor molecules that are not bound to the test substance.
【００７０】よって、この段階で、蛍光標識レセプター
単量体の拡散時間を固定値として設定し、自己相関関数
を設定すれば、レセプター・被検物質・ＤＮＡ断片複合
体が形成されたことを検出することができる。更に、反
応溶液中のレセプター単量体、複合体それぞれにつき、
拡散時間および蛍光分子集団全体に占める割合を算出す
ることもできる。これにより、レセプター・被検物質・
ＤＮＡ断片複合体がどの程度形成されたかを検出するこ
とができ、レセプター・被検物質複合体の標的ＤＮＡ配
列への結合親和性についても評価することができる。こ
こで、拡散時間の計測は、数秒から数十秒で充分であ
る。また、必要とされる反応溶液も数十マイクロリット
ルで充分である。従って、ＦＣＳを用いる検出系を採用
すれば、多種類の被検物質について、それが微量であっ
ても迅速かつ高感度にアッセイできるという利点を有す
る。Therefore, at this stage, if the diffusion time of the fluorescence-labeled receptor monomer is set as a fixed value and the autocorrelation function is set, it is detected that the receptor-test substance-DNA fragment complex has been formed. can do. Furthermore, for each receptor monomer and complex in the reaction solution,
It is also possible to calculate the diffusion time and the ratio of the entire fluorescent molecule population. As a result, receptors, test substances,
The extent to which the DNA fragment complex is formed can be detected, and the binding affinity of the receptor / test substance complex to the target DNA sequence can also be evaluated. Here, it is sufficient to measure the diffusion time from several seconds to several tens of seconds. Also, the reaction solution required is several tens of microliters. Therefore, if a detection system using FCS is adopted, there is an advantage that many kinds of test substances can be assayed rapidly and with high sensitivity even if the amount thereof is a trace amount.
【００７１】[0071]
【発明の効果】以上説明したように、本発明のレセプタ
ーと被検物質の結合反応を検出する方法は、レセプター
が特異的に結合する標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を
検出系に添加し、レセプター・被検物質・ＤＮＡ断片複
合体が形成されるか否かを検出することを特徴としてい
る。よって、ＤＮＡ断片を加えた本発明の検出系によれ
ば、レセプター単量体とレセプター・被検物質・ＤＮＡ
断片複合体とを充分に区別して検出することができ、レ
セプターと被検物質の結合反応を明確に分離よく検出す
ることができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, the method of detecting the binding reaction between the receptor and the test substance of the present invention is the addition of a DNA fragment containing a target DNA sequence to which the receptor specifically binds to the detection system. It is characterized by detecting whether or not a test substance / DNA fragment complex is formed. Therefore, according to the detection system of the present invention to which a DNA fragment is added, the receptor monomer and the receptor / test substance / DNA
The fragment complex can be sufficiently distinguished and detected, and the binding reaction between the receptor and the test substance can be clearly detected with good separation.
【００７２】更に本発明の方法は、レセプター・被検物
質・ＤＮＡ断片複合体がどの程度形成されたかその相対
量を検出することが可能であるため、相対量の多少によ
り、リガンド・レセプター複合体と標的核酸との結合親
和性についても評価することができる。Furthermore, since the method of the present invention can detect the relative amount of the receptor / analyte / DNA fragment complex formed, the ligand / receptor complex can be detected depending on the relative amount. It is also possible to evaluate the binding affinity between the target nucleic acid and the target nucleic acid.
【００７３】また、本発明の方法は、そもそも溶液内で
の検出系であるため、ハイスループット試験に適してお
り、その上、ハイスループット試験に必要な要件を下記
のとおり満たしている。すなわち本発明は、被検物質を
結合していないレセプター分子（単量体）と、ＤＮＡ断
片と複合体を形成したレセプター分子とを別々に、反応
溶液中から分離することなく検出可能である。よって、
煩雑な分離・洗浄の工程を特に必要としない。また、既
知の標識リガンドを添加する必要や被検物質を逐一標識
する必要がない。その上、拡散時間の計測は、数秒から
数十秒で充分であり、更に、必要とされる反応溶液も数
十マイクロリットルで充分である。そのため、多種類の
被検物質について、それが微量であっても迅速かつ高感
度にアッセイを行うことが可能である。Since the method of the present invention is a detection system in a solution in the first place, it is suitable for a high throughput test, and further, the requirements necessary for the high throughput test are satisfied as follows. That is, according to the present invention, a receptor molecule (monomer) that does not bind to a test substance and a receptor molecule that forms a complex with a DNA fragment can be separately detected without separating from the reaction solution. Therefore,
No complicated separation / washing steps are required. Further, it is not necessary to add a known labeled ligand or label the test substance one by one. In addition, it is sufficient to measure the diffusion time from a few seconds to a few tens of seconds, and the required reaction solution is a few tens of microliters. Therefore, it is possible to carry out an assay for many types of test substances quickly and with high sensitivity even if the amount is small.
【００７４】以上、ＤＮＡ断片を加えた本発明の検出系
によれば、被検物質のリガンドとしての活性に相関する
とされる、レセプター・被検物質複合体の標的ＤＮＡ配
列に対する結合反応を、迅速かつ高感度に検出すること
が可能である。As described above, according to the detection system of the present invention to which a DNA fragment is added, the binding reaction of the receptor-test substance complex to the target DNA sequence, which is considered to correlate with the activity of the test substance as a ligand, can be performed rapidly. It is also possible to detect with high sensitivity.
【００７５】なお、本発明は、様々な配列をもつＤＮＡ
断片を結合反応液中に添加することにより、標的ＤＮＡ
配列が未知のレセプターについて、標的ＤＮＡ配列をス
クリーニング際にも有用である。The present invention is based on DNA having various sequences.
By adding the fragment into the binding reaction solution, the target DNA
It is also useful when screening target DNA sequences for receptors of unknown sequence.
【図１】 核内レセプターの作用機序を示す図。FIG. 1 is a view showing a mechanism of action of a nuclear receptor.
【図２】 被検物質がレセプターのリガンドとなり得な
い場合の反応溶液モデルを示す図。FIG. 2 is a diagram showing a reaction solution model when a test substance cannot be a ligand of a receptor.
【図３】 被検物質がレセプターのリガンドとなり得る
場合の反応溶液モデルを示す図。FIG. 3 is a diagram showing a reaction solution model in which a test substance can be a ligand of a receptor.
【図４】 レセプター・被検物質・ＤＮＡ断片複合体の
構成を示す図。FIG. 4 is a view showing the constitution of a receptor / test substance / DNA fragment complex.
１…蛍光標識レセプター １ａ…レセプター １ｂ…蛍光物質 ２…被検物質 ３…レセプター応答配列を含むＤＮＡ断片 ４…レセプター・被検物質複合体 ５…レセプター・被検物質・ＤＮＡ断片複合体 1. Fluorescent labeled receptor 1a ... Receptor 1b ... Fluorescent substance 2 ... Test substance 3 ... DNA fragment containing receptor responsive element 4 ... Receptor-analyte complex 5: Receptor-test substance-DNA fragment complex
Claims (8)
出する方法であって、 レセプターとリガンドとが複合体を形成することがで
き、且つ該レセプター・リガンド複合体が、該複合体の
結合可能な特異的核酸配列に結合することができる所定
の溶液中に、光信号を発生し得るマーカー物質で標識さ
れたレセプター、被検物質、およびレセプター・リガン
ド複合体の結合可能な特異的核酸配列を含む核酸断片を
維持する工程と、 レセプターと被検物質とが複合体を形成し、該複合体が
該核酸断片に結合することにより形成されるレセプター
・被検物質・核酸断片複合体の有無を検出する工程とを
含むことを特徴とする方法。1. A method for detecting a binding reaction between a receptor and a test substance, wherein the receptor and the ligand can form a complex, and the receptor-ligand complex binds to the complex. A specific nucleic acid sequence capable of binding to a receptor, a test substance, and a receptor-ligand complex labeled with a marker substance capable of generating an optical signal in a predetermined solution capable of binding to a possible specific nucleic acid sequence The step of maintaining a nucleic acid fragment containing a complex of a receptor and a test substance, and the presence or absence of a receptor / test substance / nucleic acid fragment complex formed by binding of the complex to the nucleic acid fragment And the step of detecting.
の有無を、光信号を発生し得るマーカー物質で標識され
たレセプターの溶液中の拡散時間を計測することにより
検出する請求項１に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the presence / absence of the receptor / analyte / nucleic acid fragment complex is detected by measuring the diffusion time in the solution of the receptor labeled with a marker substance capable of generating an optical signal. the method of.
ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。3. The method according to claim 1 or 2, wherein the receptor is a nuclear receptor.
レセプターの分子量と同じかもしくはそれ以上の分子量
を有することを特徴とする請求項１ないし３の何れか１
項に記載の方法。4. A nucleic acid fragment containing the specific nucleic acid sequence,
4. The polymer according to claim 1, which has a molecular weight equal to or higher than that of the receptor.
The method described in the section.
レセプターの有する拡散定数と同じかもしくはそれ以下
の拡散定数を有することを特徴とする請求項１ないし３
の何れか１項に記載の方法。5. A nucleic acid fragment containing the specific nucleic acid sequence,
4. A diffusion constant equal to or less than the diffusion constant of the receptor.
The method according to any one of 1.
質・核酸断片複合体との相対量を自己相関関数を用いて
算出することにより、レセプターと被検物質との結合親
和性を評価する請求項１ないし５の何れか１項に記載の
方法。6. The binding affinity between the receptor and the test substance is evaluated by calculating the relative amount of the receptor monomer and the receptor / test substance / nucleic acid fragment complex using an autocorrelation function. Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5.
る請求項１ないし６の何れか１項に記載の方法。7. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the nucleic acid is DNA.
求項１ないし７の何れか１項に記載の方法。8. The method according to claim 1, wherein the method is performed by high throughput detection.
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| US10/198,785 US20030022224A1 (en) | 2001-07-19 | 2002-07-19 | Method of detecting binding reaction between protein and test substance |
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| JP2001220444A JP2003024064A (en) | 2001-07-19 | 2001-07-19 | Method for detecting bonding reaction of receptor with substance to be tested |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2005229881A (en) * | 2004-02-18 | 2005-09-02 | Interaito:Kk | Method for screening intranuclear receptor decomposition inhibitory substance or intranuclear receptor decomposition promoting substance |
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2001
- 2001-07-19 JP JP2001220444A patent/JP2003024064A/en not_active Withdrawn
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