JP2003014742A - Biological material chip - Google Patents
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、プロテオーム解析
・プロテオミクスに非常に有用であるタンパク質又はタ
ンパク質結合物質（但し、核酸を除く）を固相表面に固
定化したチップ、および該チップを用いた検出方法、さ
らにはその製造方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a chip in which a protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid), which is very useful for proteome analysis / proteomics, is immobilized on a solid phase surface, and detection using the chip. The present invention also relates to a method and a manufacturing method thereof.
【０００２】[0002]
【従来の技術】多彩な生物の遺伝子機能を効率的に解析
するための技術開発が急速に進んでおり、それらのＤＮ
ＡもしくはＤＮＡ断片の塩基配列の解析のために、ＤＮ
Ａチップとよばれる、多数のＤＮＡ断片あるいは合成オ
リゴヌクレオチドなどのヌクレオチド誘導体を固相基板
の表面に固定した検出用具が用いられている。このよう
な固相基板の表面に結合固定されたヌクレオチド誘導体
などの、ＤＮＡもしくはその断片あるいは合成オリゴヌ
クレオチドのような検出用分子はプローブ分子とも呼ば
れる。代表的なＤＮＡチップは、スライドガラス等の固
相担体に多数のプローブ分子を整列固定させたマイクロ
アレイである。このＤＮＡチップの製造、そしてその使
用に関するＤＮＡチップ関連技術は、ＤＮＡ以外の生体
分子の検出にも利用可能であると考えられ、従って、創
薬研究、疾病の診断や予防法の開発等に新しい手段を提
供するものとして期待されている。2. Description of the Related Art Technological development for efficiently analyzing gene functions of various organisms is rapidly progressing.
For the analysis of the nucleotide sequence of A or DNA fragment, DN
A detection tool called a chip, which has a large number of DNA fragments or nucleotide derivatives such as synthetic oligonucleotides immobilized on the surface of a solid substrate, is used. A detection molecule such as DNA or a fragment thereof or a synthetic oligonucleotide, such as a nucleotide derivative bound and immobilized on the surface of a solid substrate, is also called a probe molecule. A typical DNA chip is a microarray in which a large number of probe molecules are aligned and immobilized on a solid phase carrier such as a slide glass. The DNA chip-related technology relating to the production and use of this DNA chip is considered to be applicable to the detection of biomolecules other than DNA. Therefore, it is new to drug discovery research, the diagnosis of diseases and the development of prevention methods. Expected to provide the means.
【０００３】一方、ゲノム解析もほぼ終わり、遺伝子情
報の持つ意味を最終的に理解し、細胞の生命活動をシミ
ュレートするために不可欠な情報を提供する「プロテオ
ーム・プロテオミクス」研究が進められている。プロテ
ロームとは、特定の細胞、器官、臓器の中で翻訳生産さ
れているタンパク質の全セットを意味し、さらには化学
構造、総量、発現時期、翻訳後修飾、集合体形成などの
高次情報解析の研究分野のことを「プロテオミクス」と
呼ぶ。On the other hand, the genome analysis is almost completed, and "proteome / proteomics" research is underway to provide essential information for finally understanding the meaning of genetic information and simulating the life activity of cells. . Protelome refers to the entire set of proteins translated and produced in specific cells, organs, and organs, as well as higher-level information analysis such as chemical structure, total amount, expression time, post-translational modification, and aggregate formation. This field of research is called "proteomics".
【０００４】プロテオーム研究は、タンパク質のプロフ
ァイリング、タンパク質の同定・精密分析、相互作用ネ
ットワーク解析、プロテオームデータベースの構築から
なり、それを生命科学研究への応用していくという分野
である。[0004] The proteome research consists of protein profiling, protein identification / precision analysis, interaction network analysis, and construction of a proteome database, which is applied to life science research.
【０００５】このうち、相互作用ネットワーク解析法と
しては、酵母ｔｗｏ？ｈｙｂｒｉｄ法やファージディス
プレイ法、アフィニティキャプチャーを利用した方法と
して免疫沈降法やＢＩＡ―ＭＳ法、カラムスイッチング
―質量分析法などが行われている（プロテオーム解析
法、１６３―２１１、羊土社、２０００）。以上に挙げ
た相互作用解析方法はいずれも、ハイスループット解析
には至っていない。Of these, yeast two? Immunoprecipitation method, BIA-MS method, column switching-mass spectrometry method and the like are performed as methods utilizing the hybrid method, phage display method and affinity capture (proteome analysis method, 163-121, Yodosha, 2000). . None of the above-mentioned interaction analysis methods has reached high throughput analysis.
【０００６】Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒらにより、ハイスルー
プットなタンパク質の相互作用解析のためのタンパク質
マイクロアレイに関する報告がなされた（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２８９，１７６０―１７６３、２０００）。これ
は、アルデヒド基をもったスライドガラス上にタンパク
質水溶液を点着し、ＢＳＡ溶液でブロッキング後、タン
パク溶液と反応させ蛍光スキャナーで検出するものであ
る。この場合はアルデヒド基とアミノ基との反応生成物
であるシッフ塩基の安定性が低い（通常、加水分解が起
こり易い）という問題点を有する。[0006] Schreiber et al. Reported on a protein microarray for high-throughput protein interaction analysis (Science).
e, 289, 1760-1763, 2000). In this method, an aqueous protein solution is spotted on a slide glass having an aldehyde group, blocked with a BSA solution, reacted with the protein solution, and detected by a fluorescence scanner. In this case, there is a problem that the Schiff base, which is a reaction product of an aldehyde group and an amino group, has low stability (usually, hydrolysis easily occurs).
【０００７】このほかタンパク質を固相に固定化される
方法として、特公平７―５３１０８号公報には、タンパ
ク質の末端に疎水性のポリペプチドを導入して、固相に
固定化する方法が記載されている。In addition, as a method for immobilizing a protein on a solid phase, Japanese Patent Publication No. 7-53108 describes a method of immobilizing a solid phase by introducing a hydrophobic polypeptide at the end of the protein. Has been done.
【０００８】特許２９２２０４０号には、プロテインＡ
分子膜による抗体タンパク質を固定化する方法が記載さ
れている。Japanese Patent No. 922040 discloses protein A
Methods for immobilizing antibody proteins with molecular membranes have been described.
【０００９】特公平７―４３３８０号公報（米国特許第
５０９４９６２号明細書に対応）には、リガンド―受容
体アッセイに用いる検出用具であって、表面に反応活性
基を有する微孔質ポリマー粒子の表面に受容体分子を結
合させた分析用具が記載されている。Japanese Patent Publication No. 7-43380 (corresponding to US Pat. No. 5,049,962) discloses a detection tool for use in a ligand-receptor assay, which comprises microporous polymer particles having reactive groups on the surface. Analytical devices having receptor molecules bound to the surface are described.
【００１０】国際公開ＷＯ００／６１２８２号には、多
孔性の固相担体に関する記載がある。主に無機物質の粒
子を表面に塗布することで、支持体からの厚みを０．０
１〜７０μｍとし、空隙率が１０〜９０％となってい
る。この多孔性固相担体を用いると、表面積が大きくな
るため生物ポリマーの固定量を上げられるメリットを有
する。しかしながら、この場合には、（１）蛍光、発
光、RI等で検出する場合、励起光や発光物質などによる
散乱が増大し、バックグラウンドが高くなる；（２）ス
ポット時の液の浸透が多いので、スポット径を小さくす
る事が困難で、高密度アレイを作成する事が困難であ
る；（３）標識検体が粒子間の空隙に入り込むため、洗
浄工程を十分に行う事が必要で、不十分な場合にはバッ
クグラウンドが高く事が良くある：といった問題があっ
た。International publication WO 00/61282 describes a porous solid phase carrier. By mainly applying particles of an inorganic substance to the surface, the thickness from the support is 0.0
It is 1 to 70 μm, and the porosity is 10 to 90%. The use of this porous solid phase carrier has an advantage that the amount of biological polymer immobilized can be increased because the surface area becomes large. However, in this case, (1) when detected by fluorescence, luminescence, RI, etc., scattering by excitation light, luminescent substance, etc. increases, and the background becomes high; (2) liquid permeation during spotting is large. Therefore, it is difficult to reduce the spot diameter, and it is difficult to create a high-density array; (3) Since the labeled sample enters the spaces between the particles, it is necessary to sufficiently perform the washing process, If it is enough, the background is high and things are common:
【００１１】[0011]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、迅速かつ安
定に結合固定可能な反応性固相担体に少なくとも一つの
タンパク質又はタンパク質結合物質（但し、核酸を除
く）が結合固定されてなるチップ、及びそのチップを用
いた特異的結合標的物質の検出方法を提供することを目
的とする。さらに本発明は、上記チップの製造方法を提
供することを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a chip in which at least one protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) is bound and immobilized on a reactive solid phase carrier which can be rapidly and stably bound and immobilized. And a method for detecting a specific binding target substance using the chip. A further object of the present invention is to provide a method for manufacturing the above chip.
【００１２】[0012]
【課題を解決するための手段】本発明の第１の側面によ
れば、有機物質により形成された凹凸を有する固相担体
に、少なくとも一つのタンパク質又はタンパク質結合物
質（但し、核酸を除く）の残基であるＡが、下記式
（Ｉ）のようにスルホニル基を介した共有結合により結
合していることを特徴とする生物学的素材チップが提供
される。
固相担体―Ｌ―ＳＯ2―Ｘ―Ａ （Ｉ）
［式（Ｉ）において、Ｌは連結基を表わし、Ｘは、−Ｃ
Ｒ1（Ｒ2）−ＣＲ3（Ｒ4）−を表わし；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3
及びＲ4は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数１乃
至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０のアリール
基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を有する合計
炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基を表し、Ａはタ
ンパク質又はタンパク質結合物質（但し、核酸を除く）
の残基を示す。］According to the first aspect of the present invention, at least one protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) is added to a solid-phase carrier having an unevenness formed of an organic substance. There is provided a biological material chip characterized in that the residue A is bound by a covalent bond via a sulfonyl group as in the following formula (I). In the solid-phase support -L-SO 2 -X-A ( I) [ formula (I), L represents a linking group, X is, -C
Represents R 1 (R 2 ) -CR 3 (R 4 )-; R 1 , R 2 , R 3
And R 4 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or a total carbon atom number of 7 having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms. To 26 aralkyl groups, A is a protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid)
Indicates the residue of. ]
【００１３】本発明の第２の側面によれば、上記した本
発明のチップと、該チップの表面に担持されたタンパク
質又はタンパク質結合物質（但し、核酸を除く）と特異
的に結合する標的物質を含む検体とを接触させる工程；
及び該タンパク質又はタンパク質結合物質と該標的物質
との間の相互の結合の形成を検出する工程；を含む、標
的物質を検出する方法が提供される。According to a second aspect of the present invention, the above-mentioned chip of the present invention and a target substance which specifically binds to a protein or a protein-binding substance (excluding nucleic acid) carried on the surface of the chip. Contacting with a sample containing:
And a step of detecting the formation of a mutual bond between the protein or protein-binding substance and the target substance.
【００１４】本発明の第３の側面によれば、下記式（Ｉ
Ｉ）で表されるビニルスルホニル基もしくはその反応性
前駆体基を表面に持ち、有機物質により形成された凹凸
を有する固相担体上に、該ビニルスルホニル基もしくは
その反応性前駆体基と反応して共有結合を形成する反応
性基を有する少なくとも一つのタンパク質又はタンパク
質結合物質（但し、核酸を除く）を接触させることを含
む、本発明のチップの製造方法が提供される。
−Ｌ―ＳＯ2―Ｘ’ （ＩＩ）
［上記の式において、Ｌは、―ＳＯ2―Ｘ’と固相担体
とを結合する連結基を示し；Ｘ’は、―ＣＲ1＝ＣＲ
2（Ｒ3）または―ＣＨ（Ｒ1）―ＣＲ2（Ｒ3）（Ｙ）を
表し；Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に、水素原子、炭
素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０
のアリール基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を
有する合計炭素原子数７乃至２６のアラルキル基を表
し、Ｙは、求核試薬によって置換される基、あるいは塩
基によって「ＨＹ」として脱離する基を表す］According to a third aspect of the present invention, the following formula (I
The vinylsulfonyl group represented by I) or its reactive precursor group is reacted on the surface with the vinylsulfonyl group or its reactive precursor group on a solid phase carrier having irregularities formed by an organic substance. There is provided a method for producing a chip of the present invention, which comprises contacting at least one protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) having a reactive group that forms a covalent bond. —L—SO 2 —X ′ (II) [In the above formula, L represents a linking group that binds —SO 2 —X ′ and the solid phase carrier; X ′ represents —CR 1 ═CR
2 (R 3 ) or —CH (R 1 ) —CR 2 (R 3 ) (Y) is represented; R 1 , R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. , 6 to 20 carbon atoms
Or an aralkyl group having a total of 7 to 26 carbon atoms having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms, Y is a group substituted by a nucleophile, or eliminated as "HY" by a base. Represents the group to
【００１５】本発明の好ましい態様を以下に記載する。
表面に固定されたタンパク質又はタンパク質結合物質
（但し、核酸を除く）が、抗体、抗体フラグメント、リ
ガンド、抗原、ハプテン、又はレセプターである態様；
表面に固定されたタンパク質又はタンパク質結合物質
（但し、核酸を除く）がアビジン類である態様；アビジ
ン類が、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチン
と安定な複合体を形成しうるこれらの改変体である態
様；表面に固定されたタンパク質が、核酸認識タンパク
質である態様；核酸認識タンパク質が２本鎖ＤＮＡ認識
タンパク質である態様；The preferred embodiments of the present invention are described below.
A mode in which the protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) immobilized on the surface is an antibody, an antibody fragment, a ligand, an antigen, a hapten, or a receptor;
Aspects in which the protein or protein-binding substance (excluding nucleic acids) fixed to the surface is avidins; aspects in which avidins are avidin, streptavidin, or modified forms thereof capable of forming a stable complex with biotin A mode in which the protein immobilized on the surface is a nucleic acid recognition protein; a mode in which the nucleic acid recognition protein is a double-stranded DNA recognition protein;
【００１６】２本鎖ＤＮＡ認識タンパク質が２本鎖ＤＮ
Ａ認識抗体である態様；２本鎖ＤＮＡ認識タンパク質が
ＤＮＡ転写因子である態様；２本鎖ＤＮＡ認識タンパク
質がＺｎフィンガーモチーフまたはリングフィンガーモ
チーフをもつタンパク質である態様；凹凸を形成する有
機物質が、高分子ポリマ−または高分子ポリマ−の凝集
体である態様；固相担体がガラス、プラスチック、電極
表面、センサーチップ表面である態様；標的物質が検知
可能なシグナルを生成しうる少なくとも一つの成分で標
識されている態様；チップをアミノ酸、ペプチドもしく
はタンパク質の水溶液でブロッキング処理する工程を含
む態様；Double-stranded DNA recognition protein is double-stranded DN
A mode which is an A-recognizing antibody; a mode in which the double-stranded DNA recognizing protein is a DNA transcription factor; a mode in which the double-stranded DNA recognizing protein is a protein having a Zn finger motif or a ring finger motif; An embodiment in which the polymer is a polymer or an aggregate of the polymer; an embodiment in which the solid phase carrier is glass, plastic, an electrode surface, a sensor chip surface; at least one component capable of generating a detectable signal by the target substance A labeled embodiment; an embodiment including a step of blocking the chip with an aqueous solution of an amino acid, peptide or protein;
【００１７】[0017]
【発明の実施の形態】本発明は、有機物質により形成さ
れた凹凸を有する固相担体に、少なくとも一つのタンパ
ク質又はタンパク質結合物質（但し、核酸を除く）の残
基であるＡが、下記式（Ｉ）のようにスルホニル基を介
した共有結合により結合していることを特徴とする生物
学的素材チップに関するものである。
固相担体―Ｌ―ＳＯ2―Ｘ―Ａ （Ｉ）
［上記の式において、Ｌは連結基を表わし、Ｘは、−Ｃ
Ｒ1（Ｒ2）−ＣＲ3（Ｒ4）−を表わし；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3
及びＲ4は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数１乃
至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０のアリール
基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を有する合計
炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基を表し、Ａはタ
ンパク質又はタンパク質結合物質（但し、核酸を除く）
の残基を示す。］BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention relates to a solid-phase carrier having irregularities formed by an organic substance, wherein A, which is a residue of at least one protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid), is represented by the following formula: The present invention relates to a biological material chip, which is bound by a covalent bond via a sulfonyl group as in (I). In the solid-phase support -L-SO 2 -X-A ( I) [ the above equation, L represents a linking group, X is, -C
Represents R 1 (R 2 ) -CR 3 (R 4 )-; R 1 , R 2 , R 3
And R 4 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or a total carbon atom number of 7 having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms. To 26 aralkyl groups, A is a protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid)
Indicates the residue of. ]
【００１８】固定するタンパク質又はタンパク質結合物
質（但し、核酸を除く）の代表的な例としては、限定さ
れるものでないが、抗体もしくは抗体フラグメント、リ
ガンド、抗原、ハプテンなどの抗原決定基をもつもの、
レセプター、リガンド、アビジン類、核酸認識タンパク
質が挙げられる。核酸認識タンパク質の代表的な例とし
ては、２本鎖認識タンパク質が挙げられる。Representative examples of proteins or protein-binding substances (excluding nucleic acids) to be immobilized include, but are not limited to, those having an antigenic determinant such as antibody or antibody fragment, ligand, antigen and hapten. ,
Examples include receptors, ligands, avidins, and nucleic acid recognition proteins. A typical example of the nucleic acid recognition protein is a double-stranded recognition protein.
【００１９】アビジン類としては、アビジン、ストレプ
トアビジンまたはビオチンと安定な複合体を形成しうる
これらの改変体が挙げられる。かような安定な複合体を
形成しうるとは、ビオチン−アビジン複合体の解離定数
（１０-15Ｍ）に近似する解離定数を有する複合体を形
成することができることを意味する。また改変体とは、
天然由来のアビジンまたはストレプトアビジンの修飾体
もしくは断片、あるいはそれらの組換え体を意味する。Examples of avidins include avidin, streptavidin, and modified forms thereof that can form a stable complex with biotin. The ability to form such a stable complex means that a complex having a dissociation constant close to that of the biotin-avidin complex (10 −15 M) can be formed. A variant is
It means a modified or fragment of naturally-occurring avidin or streptavidin, or a recombinant thereof.
【００２０】核酸認識タンパク質として特に限定される
ものではないが、２本鎖ＤＮＡ認識物質が挙げられる。
２本鎖ＤＮＡ認識物質としては、２本鎖ＤＮＡを認識
し、特異的に結合する物質を示す。２本鎖ＤＮＡ認識物
質の具体例としては、ＤＮＡ転写因子、ミスマッチ修復
タンパク質、２本鎖ＤＮＡ認識抗体、又はペプチド核酸
などを挙げることができる。さらに、２本鎖ＤＮＡ認識
物質としては、Ｚｎフィンガーモチーフまたはリングフ
ィンガーモチーフを持つものも挙げられる。The nucleic acid recognizing protein is not particularly limited, and examples thereof include double-stranded DNA recognizing substances.
The double-stranded DNA recognizing substance refers to a substance that recognizes double-stranded DNA and specifically binds to it. Specific examples of the double-stranded DNA recognizing substance include a DNA transcription factor, a mismatch repair protein, a double-stranded DNA recognizing antibody, and a peptide nucleic acid. Furthermore, examples of the double-stranded DNA recognizing substance also include those having a Zn finger motif or a ring finger motif.
【００２１】ＤＮＡ転写因子は、遺伝子上のプロモータ
ー領域に結合して、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を制御
する物質である（田村隆明著：転写因子（羊土社 １９
９５年））。従って、転写因子は特定の配列の２本鎖Ｄ
ＮＡに特異的に結合することが知られている。A DNA transcription factor is a substance that binds to a promoter region on a gene and controls transcription of DNA into mRNA (Tamura Takaaki: Transcription factor (Yodosha 19
1995)). Therefore, the transcription factor is a double-stranded D of a specific sequence.
It is known to specifically bind to NA.
【００２２】多数ある転写因子のうち、Ｚｉｎｃ Ｆｉ
ｎｇｅｒ ＰｒｏｔｅｉｎつまりＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅ
ｒやＲｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒモチーフをもつ転写因子群
は、真核生物における出現率は非常に高く、ゲノム中の
１％はこれをコードしているらしい。Ｐａｂｏ等はＺｉ
ｎｃ Ｆｉｇｅｒモチーフの３次構造を解析、ＤＮＡと
結合するメカニズムの解明した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５
２， ８０９（１９９１））。さらに、Ｃｈｏｏ等は、
遺伝子組換法により、特定の配列に結合する自然界には
ないＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ群を作製
することに成功している（Ｎａｔｕｒｅ ３７２，６４
２［１９９４］，ＰＮＡＳ９１，１１１６３（１９９
４））。さらに、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのグループはＰｈａｇｅ Ｄｉｓｐ
ｌａｙにより新規なＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ群の作製に成功している（ＰＮＡＳ９５，２８１
２，［１９９８］：９６，２７５８（１９９９））。こ
のように、Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎに
代表されるＤＮＡ転写因子群は、本来２本鎖ＤＮＡと結
合する性質をもっており、かつ近年の研究によれば、任
意のＤＮＡ配列を認識する組換体の作製も可能となって
きている。このような、タンパク質を固定化することに
より、２本鎖ＤＮＡを効率良く支持体上に捕捉すること
が可能である。Among many transcription factors, Zinc Fi
nger Protein or Zinc Finger
The transcription factor group having r or Ring Finger motif has a very high appearance rate in eukaryotes, and 1% in the genome seems to encode this. Pabo is Zi
The tertiary structure of the nc Figer motif was analyzed to elucidate the mechanism of binding to DNA (Science, 25.
2, 809 (1991)). Furthermore, Choo et al.
We have succeeded in producing a group of non-natural Zinc Finger Proteins that bind to a specific sequence by a gene recombination method (Nature 372, 64).
2 [1994], PNAS91, 11163 (199
4)). In addition, Scripts Research
The Institute group is Phase Disp
New Zinc Finger Prot by lay
Successful production of ein group (PNAS95,281
2, [1998]: 96, 2758 (1999)). Thus, the group of DNA transcription factors represented by Zinc Finger Protein originally has the property of binding to double-stranded DNA, and according to recent studies, it is also possible to produce recombinants that recognize arbitrary DNA sequences. Is becoming. By immobilizing such a protein, it is possible to efficiently capture the double-stranded DNA on the support.
【００２３】その他、核酸結合物質としてヘリックス・
ループ・ヘリックスタンパク質やＥｔｓドメインを持つ
ものも挙げられる。In addition, helices as nucleic acid binding substances
Examples also include those having loop helix proteins and Ets domains.
【００２４】また、固定するタンパク質結合物質（但
し、核酸を除く）としては、ハプテン、ビオチン類（ビ
オチン、ビオシチン、デスチオビオチン、オキシビオチ
ンまたはアビジンと安定な複合体を形成しうるこれらの
誘導体が挙げられる。このような安定な複合体を形成し
うるとは、ビオチン−アビジン複合体の解離定数 （１
０-15Ｍ）に近似する解離定数を有する複合体を形成す
ることができることを意味する。さらには、ペプチド、
糖類、ホルモン、医薬、抗生物質などが挙げられる。As the protein-binding substance to be immobilized (excluding nucleic acid), hapten, biotin (biotin, biocytin, desthiobiotin, oxybiotin, or a derivative thereof capable of forming a stable complex with avidin) is used. The stable dissociation constant of the biotin-avidin complex (1
It means that it is possible to form a complex with a dissociation constant close to 0 -15 M). Furthermore, peptides,
Examples include sugars, hormones, medicines, and antibiotics.
【００２５】凹凸を有する固相担体に固定するタンパク
質又は又はタンパク質結合物質は、その内在するアミノ
基もしくはメルカプト基によってスルホニル基を介した
共有結合を形成する。さらに、タンパク質にアミノ基、
イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノ
カルボニル基、メルカプト基、もしくはカルボキシイミ
ド基などを導入し、スルホニル基を介した共有結合を形
成させてもよい。The protein or the protein-binding substance to be immobilized on the solid phase carrier having irregularities forms a covalent bond via a sulfonyl group due to the amino group or mercapto group contained therein. Furthermore, amino groups on proteins,
An imino group, a hydrazino group, a carbamoyl group, a hydrazinocarbonyl group, a mercapto group, or a carboximide group may be introduced to form a covalent bond via a sulfonyl group.
【００２６】凹凸を有する固相担体にタンパク質又はタ
ンパク質結合物質（例えば、抗体やアビジン類、核酸認
識タンパク質）が固定されたチップは、水性媒体の存在
下、該固定タンパク質又はタンパク質結合物質と特異的
に反応する標的物質（例えばリガンドやビオチン類、核
酸）と接触させて、その標的物質を固定することができ
る。固定すべき特異的結合性の標的物質（例えばリガン
ドやビオチン類、核酸）はその固定を外部から検知する
ことが可能なように検知可能な標識（例、蛍光標識、酵
素標識など）が結合していることが望ましいA chip in which a protein or a protein-binding substance (for example, an antibody, avidins, a nucleic acid recognizing protein) is immobilized on a solid-phase carrier having irregularities is specific to the immobilized protein or the protein-binding substance in the presence of an aqueous medium. The target substance can be immobilized by bringing it into contact with a target substance that reacts with (for example, a ligand, biotin, or nucleic acid). The specific binding target substance to be immobilized (eg, ligand, biotin, nucleic acid) is bound to a detectable label (eg, fluorescent label, enzyme label, etc.) so that the immobilization can be detected from the outside. Is desirable
【００２７】固相担体としては、特異的結合パートナー
の一員相互間の結合形成に悪影響を及ぼさないものであ
れば、その形状は、例えば、平板、マイクロウエル、ビ
ーズ、スティック等のいずれをとることもできる。それ
らの表面の性状は、特に疎水性、あるいは親水性の低
い、表面が平滑な基板であることが好ましい。また、そ
の表面が凹凸を有する平面性の低い基板も用いることが
できる。固相担体の材質としては、ガラス、セメント、
陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、
ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフ
ェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメ
チルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、
多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、
多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブ
レンフィルターなどの各種の多孔質物質を挙げることが
できる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００
ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５００ｎｍの
範囲にあることが特に好ましい。固相担体の材質は、ガ
ラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これ
は、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容
易さによるものである。固相担体の厚さは、１００乃至
２０００μｍの範囲にあることが好ましい。また、操作
の便宜上、固相担体は磁性体や電極の形態に加工されて
いてもよい。As the solid phase carrier, if it does not adversely affect the bond formation between members of the specific binding partner, its shape may be, for example, flat plate, microwell, bead, stick or the like. You can also It is preferable that the surface of those substrates is a substrate having a particularly hydrophobic or hydrophilic surface and a smooth surface. Alternatively, a substrate having a surface with unevenness and low planarity can be used. As the material of the solid phase carrier, glass, cement,
Ceramics such as ceramics or new ceramics,
Polyethylene terephthalate, cellulose acetate, bisphenol A polycarbonate, polystyrene, polymers such as polymethylmethacrylate, silicon, activated carbon,
Porous glass, porous ceramics, porous silicon,
Various porous materials such as porous activated carbon, woven and knitted fabrics, non-woven fabrics, filter papers, short fibers and membrane filters can be mentioned. The pore size of the porous material is 2 to 1000.
It is preferably in the range of nm, particularly preferably in the range of 2 to 500 nm. The material of the solid phase carrier is particularly preferably glass or silicon. This is because surface treatment is easy and analysis by an electrochemical method is easy. The thickness of the solid phase carrier is preferably in the range of 100 to 2000 μm. Further, for convenience of operation, the solid phase carrier may be processed into a magnetic material or an electrode.
【００２８】本発明による有機物質により形成された凹
凸を有する固相担体としては、従来よりＤＮＡチップの
製造に用いられているか、あるいはＤＮＡチップの製造
用として提案されている各種の固相担体が好ましく、そ
のままタンパクチップとて利用することができる。その
ような固相担体の例としては、ガラス基板、樹脂基板、
シランカップリング剤で表面処理されたガラス基板、も
しくは樹脂基板、あるいは表面に被覆層を有するガラス
基板もしくは樹脂基板などをあげることができる。固相
担体としては、特に、ケイ酸ガラス基板、シランカップ
リング剤で表面処理されたケイ酸ガラス基板、あるいは
有機質被覆層で被覆されたケイ酸ガラス基板であること
が好ましい。また、電気化学的な分析方法に用いる電極
基板であってもよい。また、前述の表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）バイオセンサ用基板、電荷結合素子（ＣＣ
Ｄ）などの各種の機能性基板であってもよい。さらに、
これらの基板以外にも、粒子状の固相担体なども用いる
ことができる。As the solid phase carrier having an unevenness formed of an organic substance according to the present invention, various solid phase carriers which have been conventionally used for manufacturing a DNA chip or proposed for manufacturing a DNA chip can be used. Preferably, it can be directly used as a protein chip. Examples of such solid phase carriers include glass substrates, resin substrates,
Examples thereof include a glass substrate or a resin substrate surface-treated with a silane coupling agent, or a glass substrate or a resin substrate having a coating layer on the surface. The solid phase carrier is preferably a silicate glass substrate, a silicate glass substrate surface-treated with a silane coupling agent, or a silicate glass substrate coated with an organic coating layer. Further, it may be an electrode substrate used in an electrochemical analysis method. In addition, the aforementioned substrate for surface plasmon resonance (SPR) biosensor, charge coupled device (CC
Various functional substrates such as D) may be used. further,
In addition to these substrates, a particulate solid phase carrier or the like can be used.
【００２９】また、凹凸性の有機物質としては、グルコ
−ス、フルクト−ス等の単糖類またはその誘導体、デキ
ストラン、アミロ−ス、デンプン等の多糖類またはその
誘導体、例えばカルボキシメチルスタ−チ。ＰＶＡ、ポ
リアクリル酸、セルロ−ス、カルボキシメチルセルロ−
ス、ポリアセタ−ル、等の高分子ポリマ−が挙げられ
る。特に水酸基を持った有機物質は、シランカップリン
グ剤と併用する事で、凝集体を形成する事ができ、凹凸
を容易に形成する事ができる。凹凸の大きさ（高さ）は
50ミクロン以下が好ましい。アミノ化シランカップリン
グ剤を用いると、凹凸と同時に表面にアミノ基を導入す
ることができる。またＴＭＯＳ、ＴＥＯＳを用いて、ま
ず凹凸を形成して、次にアミノ化シランカップリング剤
を反応させ、表面にアミノ基を導入することも可能であ
る。Further, as the uneven organic substance, monosaccharides such as glucose and fructose or their derivatives, polysaccharides such as dextran, amyloses, starch and the like, such as carboxymethyl starch. PVA, polyacrylic acid, cellulose, carboxymethyl cellulose
Examples of the polymer include polymers such as polymers and polyacetal. In particular, when an organic substance having a hydroxyl group is used in combination with a silane coupling agent, it is possible to form an aggregate and easily form irregularities. The size (height) of the unevenness is
50 microns or less is preferable. When an aminated silane coupling agent is used, an amino group can be introduced into the surface at the same time as the unevenness. It is also possible to form irregularities first by using TMOS or TEOS and then react with an aminated silane coupling agent to introduce an amino group into the surface.
【００３０】本発明において、チップ上のタンパク質又
はタンパク質結合物質（但し、核酸を除く）Ａは下記の
式（Ｉ）のようにスルホニル基を介した共有結合によ
り、有機物質により形成された凹凸を有する固相担体に
結合されている。
固相担体−Ｌ−ＳＯ2−Ｘ−Ａ （Ｉ）In the present invention, the protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) A on the chip has the unevenness formed by the organic substance due to the covalent bond via the sulfonyl group as shown in the following formula (I). Bound to a solid phase carrier having. Solid phase carrier -L-SO 2 -X-A ( I)
【００３１】式（Ｉ）において、Ｌは連結基を表わし、
Ｘは、−ＣＲ1（Ｒ2）−ＣＲ3（Ｒ4）−を表わし；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立に、水素原子、炭
素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０
のアリール基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を
有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基を表
し、Ａはタンパク質又はタンパク質結合物質（但し、核
酸を除く）の残基を示す。In the formula (I), L represents a linking group,
X is, -CR 1 (R 2) -CR 3 (R 4) - a expressed;
R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are, independently of each other, a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and a carbon atom having 6 to 20 carbon atoms.
Or an aralkyl group having a total of 7 to 26 carbon atoms having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms, and A represents a residue of a protein or a protein-binding substance (excluding nucleic acid).
【００３２】式（Ｉ）において、Ｌは、―ＳＯ2―Ｘ―
Ａと固相担体とを結合する二価もしくはそれ以上の連結
基を示す。−Ｌ−の具体例としては、Ｌとしては、脂肪
族、芳香族、ヘテロ環、ヘテロ原子で中断されていても
よい炭化水素鎖から選ばれる任意の連結基、さらにこれ
らの組み合わせから選ばれる連結基を用いることがで
き、また、Ｌは単結合であってもよい。In the formula (I), L is --SO 2 --X--
A divalent or higher linking group that binds A to the solid phase carrier is shown. As a specific example of -L-, L is any linking group selected from an aliphatic group, an aromatic group, a heterocycle, and a hydrocarbon chain optionally interrupted with a hetero atom, and a linking group selected from a combination thereof. Groups can be used and L can be a single bond.
【００３３】式（Ｉ）において、炭素原子数１乃至６の
アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プ
ロピル基、ｎ−ブチル基、及びｎ−ヘキシル基を挙げる
ことができ、メチル基であることが特に好ましい。炭素
原子数６乃至２０のアリール基の具体例としては、フェ
ニル基及びナフチル基を挙げることができる。Ｒ1、Ｒ2
及びＲ3は共に水素原子であることが好ましい。炭素原
子数１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数７乃
至２６のアラルキル基の例としては、上記した炭素原子
数１乃至６のアルキル基の例と炭素原子数６乃至２０の
アリール基の例とを組み合わせたものが挙げられる。In the formula (I), examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group and n-hexyl group, A methyl group is particularly preferable. Specific examples of the aryl group having 6 to 20 carbon atoms include a phenyl group and a naphthyl group. R 1 and R 2
Both R and R 3 are preferably hydrogen atoms. Examples of the aralkyl group having 7 to 26 carbon atoms and having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms include the above-mentioned examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and the aryl group having 6 to 20 carbon atoms. A combination of these and examples is given.
【００３４】本発明はさらに、上記した本発明のチップ
と、該チップの表面に担持されたタンパク質又はタンパ
ク質結合物質（但し、核酸を除く）と特異的に結合する
標的物質を含む検体とを接触させる工程；及び該タンパ
ク質又はタンパク質結合物質と該標的物質との間の相互
の結合の形成を検出する工程；を含む、標的物質を検出
する方法に関する。The present invention further comprises contacting the above-mentioned chip of the present invention with a sample containing a target substance that specifically binds to the protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) carried on the surface of the chip. And a step of detecting the formation of mutual binding between the protein or protein-binding substance and the target substance.
【００３５】本発明でいう「検体」の種類は特に制限さ
れず、例えば、末梢静脈血のような血液、白血球、血
清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞の
ような組織細胞、その他核酸を含有する任意の試料を用
いることができる。検体は上記のような組織細胞などの
試料をそのまま使用してもよいが、好ましくは、検体試
料中の細胞を破壊して核酸、リガンドなどを遊離させた
ものを検体として使用する。検体試料中の細胞の破壊
は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音
波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。
また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Triton-X、Twee
n-20等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテ
ア―ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離
させることもできる。核酸抽出溶液を用いて核酸を溶出
する場合には、37℃以上の温度でインキュベ―トするこ
とにより反応を促進することができる。The type of "specimen" referred to in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include blood such as peripheral venous blood, white blood cells, serum, urine, feces, semen, saliva, cultured cells and tissues such as various organ cells. Any sample containing cells and other nucleic acids can be used. A sample such as the tissue cells as described above may be used as it is, but preferably, a sample in which the cells in the sample are destroyed to release nucleic acids, ligands, etc. is used as the sample. Destruction of cells in the specimen sample can be performed by a conventional method, for example, physical action such as shaking or ultrasonic wave can be applied from the outside.
In addition, nucleic acid extraction solutions (eg SDS, Triton-X, Twee
Nucleic acid can also be released from cells using a surfactant such as n-20 or a solution containing saponin, EDTA, protease and the like). When a nucleic acid is extracted using a nucleic acid extraction solution, the reaction can be promoted by incubating at a temperature of 37 ° C or higher.
【００３６】さらに本発明は、下記式（ＩＩ）で表され
るビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基を表
面に持ち、有機物質により形成された凹凸を有する固相
担体上に、該ビニルスルホニル基もしくはその反応性前
駆体基と反応して共有結合を形成する反応性基を有する
少なくとも一つのタンパク質又はタンパク質結合物質
（但し、核酸を除く）を接触させることを含む、本発明
のチップの製造方法に関する。
−Ｌ―ＳＯ2―Ｘ’ （ＩＩ）
［式（ＩＩ）において、Ｌは、―ＳＯ2―Ｘ’と固相担
体とを結合する連結基を示し；Ｘ’は、―ＣＲ1＝ＣＲ2
（Ｒ3）または―ＣＨ（Ｒ1）―ＣＲ2（Ｒ3）（Ｙ）を表
し；Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に、水素原子、炭素
原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０の
アリール基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を有
する合計炭素原子数７乃至２６のアラルキル基を表し、
Ｙは、求核試薬によって置換される基、あるいは塩基に
よって「ＨＹ」として脱離する基を表す］The present invention further provides a vinyl sulfonyl group represented by the following formula (II) or its reactive precursor group on the surface thereof, and the vinyl sulfonyl group is formed on a solid phase carrier having an irregularity formed of an organic substance. Manufacture of a chip of the present invention, which comprises contacting at least one protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) having a reactive group that reacts with a group or a reactive precursor group thereof to form a covalent bond. Regarding the method. —L—SO 2 —X ′ (II) [In the formula (II), L represents a linking group that bonds —SO 2 —X ′ and the solid phase carrier; X ′ represents —CR 1 ═CR 2
(R 3 ) or —CH (R 1 ) —CR 2 (R 3 ) (Y); R 1 , R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, Represents an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 26 total carbon atoms having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms,
Y represents a group that is substituted by a nucleophile or a group that is eliminated as "HY" by a base]
【００３７】式（ＩＩ）において、炭素原子数１乃至６
のアルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−
プロピル基、ｎ−ブチル基、及びｎ−ヘキシル基を挙げ
ることができ、メチル基であることが特に好ましい。炭
素原子数６乃至２０のアリール基の具体例としては、フ
ェニル基及びナフチル基を挙げることができる。Ｒ1、
Ｒ2及びＲ3は共に水素原子であることが好ましい。炭素
原子数１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数７
乃至２６のアラルキル基の例としては、上記した炭素原
子数１乃至６のアルキル基の例と炭素原子数６乃至２０
のアリール基の例とを組み合わせたものが挙げられる。In the formula (II), the number of carbon atoms is 1 to 6
Examples of the alkyl group of are methyl group, ethyl group, n-
Examples thereof include a propyl group, an n-butyl group, and an n-hexyl group, and a methyl group is particularly preferable. Specific examples of the aryl group having 6 to 20 carbon atoms include a phenyl group and a naphthyl group. R 1 ,
Both R 2 and R 3 are preferably hydrogen atoms. 7 total carbon atoms having an alkyl chain of 1 to 6 carbon atoms
Examples of the aralkyl group having 26 to 26 include the above-mentioned examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and 6 to 20 carbon atoms.
In combination with the example of the aryl group of.
【００３８】式（ＩＩ）において、Ｙは、―ＯＨ、―Ｏ
Ｒ0、―ＳＨ、ＮＨ3、ＮＨ2Ｒ0（但し、Ｒ0は、水素原
子を除く、アルキル基などの基である）などの求核試薬
によって置換される基、あるいは塩基によって「ＨＹ」
として脱離する基を表わし、その例としては、ハロゲン
原子、―ＯＳＯ2Ｒ11、―ＯＣＯＲ12、―ＯＳＯ3Ｍ、あ
るいは四級ピリジニウム基を表わす（Ｒ11は、炭素原子
数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０の
アリール基、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル
鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基
を表わし；Ｒ12は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基
あるいは炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基
を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子あるいは
アンモニウム基を表わす）を挙げることができる。In the formula (II), Y is --OH, --O.
“HY” by a group substituted by a nucleophile such as R 0 , —SH, NH 3 , NH 2 R 0 (wherein R 0 is a group other than a hydrogen atom, such as an alkyl group) or a base.
Is represented by a halogen atom, —OSO 2 R 11 , —OCOR 12 , —OSO 3 M, or a quaternary pyridinium group (R 11 has 1 to 6 carbon atoms). alkyl group, an aryl group or a total aralkyl group having a carbon number of 7 to 26 carbon atoms containing an alkyl chain having 1 to 6, carbon atoms is 6 to 20; R 12 has a carbon number of atoms 1 to 6 represents an alkyl group or a halogenated alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; M represents a hydrogen atom, an alkali metal atom or an ammonium group).
【００３９】Ｒ11のアルキル基、Ｒ11のアリール基、お
よびＲ11のアラルキル基は、置換基を持っていてもよ
い。このような置換基としては、水酸基、炭素原子数が
１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアル
ケニル基、炭素原子数が２乃至７のカルバモイル基、炭
素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が７乃至
１６のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリー
ル基、スルファモイル基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩
等）、スルホ基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、カル
ボン酸基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、ハロゲン原
子、炭素原子数が１乃至６のアルケニレン基、炭素原子
数が６乃至２０のアリーレン基、スルホニル基、および
これらの組み合わせからなる群より選ばれる原子もしく
は基を挙げることができる。The alkyl group of R 11, aralkyl group having an aryl group, and R 11 of R 11 may have a substituent. Examples of such a substituent include a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbamoyl group having 2 to 7 carbon atoms, and 1 to 6 carbon atoms. Alkyl group having 7 to 16 carbon atoms, aryl group having 6 to 20 carbon atoms, sulfamoyl group (or its Na salt, K salt, etc.), sulfo group (or its Na salt, K salt, etc.) ), A carboxylic acid group (or its Na salt, K salt, etc.), a halogen atom, an alkenylene group having 1 to 6 carbon atoms, an arylene group having 6 to 20 carbon atoms, a sulfonyl group, and a combination thereof. An atom or group selected from the group can be mentioned.
【００４０】式（ＩＩ）において、Ｌは、―ＳＯ2―
Ｘ’と固相担体とを結合する二価もしくはそれ以上の連
結基を示す。−Ｌ−の具体例としては、脂肪族、芳香
族、ヘテロ環、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭化
水素鎖から選ばれる任意の連結基、さらにこれらの組み
合わせから選ばれる連結基を用いることができ、また、
Ｌは単結合であってもよい。上記「―Ｘ’」基の好まし
い具体例を以下に示す。In the formula (II), L is --SO 2-
A divalent or higher-valent linking group that binds X ′ to the solid phase carrier is shown. As a specific example of -L-, use is made of an arbitrary linking group selected from an aliphatic group, an aromatic group, a heterocycle, and a hydrocarbon chain optionally interrupted by a hetero atom, and a linking group selected from a combination thereof. And again,
L may be a single bond. Preferred specific examples of the above-mentioned "-X '" group are shown below.
【００４１】[0041]
【化１】 [Chemical 1]
【００４２】「−Ｘ’」は、上記具体例中、（Ｘ１）、
（Ｘ２）、（Ｘ３）、（Ｘ４）、（Ｘ７）、（Ｘ８）、
（Ｘ１３）あるいは（Ｘ１４）であることが好ましく、
（Ｘ１）あるいは（Ｘ２）であることがさらに好まし
い。特に好ましいのは、（Ｘ１）で表わされるビニル基
である。"-X '" means (X1),
(X2), (X3), (X4), (X7), (X8),
(X13) or (X14) is preferable,
More preferably, it is (X1) or (X2). Particularly preferred is a vinyl group represented by (X1).
【００４３】本発明で利用するスルホニル基を介した共
有結合は、加水分解に対して高い抵抗性を有しているた
め、容易に安定に保存することができ、アミノ基やメル
カプト基をを予め備えているタンパク質と迅速に反応し
て、安定な共有結合を形成することができる。The covalent bond via a sulfonyl group used in the present invention has a high resistance to hydrolysis, and therefore can be easily and stably stored, and an amino group or a mercapto group can be stored in advance. It can react rapidly with the provided proteins to form stable covalent bonds.
【００４４】タンパク質はアミノ基またはメルカプト基
を有しているため通常は改めて別に反応性基を導入する
必要はない。しかしながら、タンパク質の３次元構造は
その機能に大きく関与しているので、タンパク質の活性
が低下する場合は活性とは関係のない特定の位置に反応
基を導入することが好ましい。Since the protein has an amino group or a mercapto group, it is usually not necessary to newly introduce a reactive group. However, since the three-dimensional structure of a protein is largely involved in its function, it is preferable to introduce a reactive group at a specific position unrelated to the activity when the activity of the protein decreases.
【００４５】タンパク質又はタンパク質結合物質（但
し、核酸を除く）を点着する場合は水性液を反応性固相
担体の表面に点着することにより実施される。具体的に
は、タンパク質又はタンパク質結合物質を水性媒体に溶
解あるいは分散して水性液としたのち、その水性液を、
９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注
し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて固相担
体表面上に滴下して行うことが好ましい。このようにタ
ンパク質又はタンパク質結合物質の点着にはスポッター
装置を用いることもできるが、ピンヘッドの性状によっ
てはタンパク質又はタンパク質結合物質の活性を低下さ
せる可能性もある。その場合は、インクジェット装置な
どを用いることが好ましい場合もありうる。When the protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) is spotted, it is carried out by spotting an aqueous liquid on the surface of the reactive solid phase carrier. Specifically, after dissolving or dispersing a protein or a protein-binding substance in an aqueous medium to prepare an aqueous liquid, the aqueous liquid is
It is preferable that the solution is dispensed into a 96-well or 384-well plastic plate, and the dispensed aqueous liquid is dropped onto the surface of the solid phase carrier using a spotter device or the like. As described above, a spotter device can be used for spotting the protein or protein-binding substance, but the activity of the protein or protein-binding substance may be reduced depending on the properties of the pin head. In that case, it may be preferable to use an inkjet device or the like.
【００４６】点着後のタンパク質又はタンパク質結合物
質の乾燥及び変性を防ぐために、高沸点の物質を添加し
てもよい。高沸点の物質としては、点着後のタンパク質
又はタンパク質結合物質が溶解あるいは分散してなる水
性液に溶解し得るものであって、検出対象の試料との反
応を妨げることがなく、かつ粘性があまり大きくない物
質であることが好ましい。このような物質としては、グ
リセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド
および低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。
親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエ
チレングリコール、そしてポリアクリル酸ナトリウム等
を挙げることができる。このポリマーの分子量は、１０
3乃至１０6の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質
としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用
いることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが
特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、点着後のタンパ
ク質の活性によって調節することができる。In order to prevent the protein or protein-binding substance from drying and denaturing after spotting, a substance having a high boiling point may be added. The substance having a high boiling point is a substance that can be dissolved in an aqueous liquid obtained by dissolving or dispersing the spotted protein or protein-binding substance, does not interfere with the reaction with the sample to be detected, and has a high viscosity. It is preferably a material that is not very large. Such substances include glycerin, ethylene glycol, dimethylsulfoxide and low molecular weight hydrophilic polymers.
Examples of hydrophilic polymers include polyacrylamide, polyethylene glycol, and sodium polyacrylate. The molecular weight of this polymer is 10
It is preferably in the range of 3 to 10 6 . As the substance having a high boiling point, it is more preferable to use glycerin or ethylene glycol, and it is particularly preferable to use glycerin. The concentration of the high-boiling substance can be adjusted by the activity of the protein after spotting.
【００４７】同じ目的のために、タンパク質又はタンパ
ク質結合物質を点着した後の固相担体を、９０％以上の
湿度および２０乃至４０℃の温度範囲の環境に置くこと
も好ましい。For the same purpose, it is also preferable to place the solid-phase carrier after spotting the protein or the protein-binding substance in an environment having a humidity of 90% or more and a temperature range of 20 to 40 ° C.
【００４８】タンパク質又はタンパク質結合物質の固定
量（数）は、固相担体表面に対して、１乃至１０5種類
／ｃｍ2の範囲にあることが好ましい。点着によって、
タンパク質又はタンパク質結合物質の水性液は、固相担
体表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、
ほとんど円形である。それぞれのドット間の距離、大き
さ、点着する際の水性液の容量はその用途によって変動
する。The fixed amount (number) of the protein or protein-binding substance is preferably in the range of 1 to 10 5 types / cm 2 with respect to the surface of the solid phase carrier. By spotting,
An aqueous liquid of a protein or a protein-binding substance is fixed on the surface of a solid support in the form of dots. The dot shape is
It is almost circular. The distance between the dots, the size, and the volume of the aqueous liquid when spotted vary depending on the application.
【００４９】図１に、本発明の代表的な態様であるタン
パク質チップの構成を模式的に示す。FIG. 1 schematically shows the structure of a protein chip which is a typical embodiment of the present invention.
【００５０】図１の有機物質により形成された凹凸を有
する固相担体（Ｐ１）の表面に反応性基（Ｚ）を有する
タンパク質Ａを点着させると、Ｘとタンパク質との反応
が起こるが、固相担体（Ｐ１）の表面には該タンパク質
が結合していない未反応のＸも存在する。このようなＸ
は、後に行なわれる標識されたリガンド等との反応にお
いて非特異的な反応を生じる可能性があり、非特異的な
結合を測定してしまうおそれがあるため、予め該Ｘをブ
ロッキング処理しておくことが好ましい。ブロッキング
処理は、固相担体（Ｐ２）の表面に、アミノ基もしくは
メルカプト基を有するものを接触させることによって行
うことが好ましい。反応させるリガンドの非特異的な結
合を防ぐためにはタンパク質ブロッキング剤、即ち、Ｂ
ＳＡやカゼイン、ゼラチンなどでブロッキング処理する
ことが好ましい。そうすることで、点着されている部分
以外の固相担体（Ｐ２）表面にはＢＳＡなどが存在する
こととなり、リガンドが結合することができなくなる。
また、核酸を反応させる場合には上記タンパク質ブロッ
キング剤のほかに、アミノ基またはメルカプト基を有す
るアニオン性化合物を接触させることによってブロッキ
ング処理することができる。タンパク質と反応するもの
が核酸の場合は、核酸は負の電荷を有するため、固相担
体（Ｐ２）表面にも負の電荷を発生させることによっ
て、核酸が未反応のＸと反応するのを防ぐことができ
る。このようなアニオン性化合物としては、Ｘと反応
し、かつ負の電荷（ＣＯＯ-、ＳＯ3-、ＯＳＯ3-、ＰＯ3
-、もしくはＰＯ2-）を有するものであれば何れのもの
も用いることができるが、アミノ酸であることが好まし
く、グリシンもしくはシステインであることが特に好ま
しい。また、タウリンも好ましく用いることができる。When the protein A having the reactive group (Z) is spotted on the surface of the solid phase carrier (P1) having the irregularities formed by the organic substance of FIG. 1, the reaction between X and the protein occurs, Unreacted X to which the protein is not bound is also present on the surface of the solid phase carrier (P1). X like this
May cause a nonspecific reaction in the subsequent reaction with a labeled ligand and the like, and may measure nonspecific binding. Therefore, the X is previously subjected to blocking treatment. It is preferable. The blocking treatment is preferably carried out by bringing the surface of the solid phase carrier (P2) into contact with one having an amino group or a mercapto group. To prevent non-specific binding of the reacting ligand, a protein blocking agent, namely B
Blocking treatment with SA, casein, gelatin or the like is preferable. By doing so, BSA and the like will be present on the surface of the solid phase carrier (P2) other than the spotted portion, and the ligand cannot be bound.
When reacting a nucleic acid, the blocking treatment can be carried out by bringing an anionic compound having an amino group or a mercapto group into contact with the protein blocking agent. When the nucleic acid reacts with the protein, the nucleic acid has a negative charge, so that the negative charge is also generated on the surface of the solid phase carrier (P2) to prevent the nucleic acid from reacting with unreacted X. be able to. Such anionic compounds include those which react with X and have negative charges (COO-, SO3-, OSO3-, PO3
-, Or PO2-) can be used, but amino acids are preferable, and glycine or cysteine is particularly preferable. Also, taurine can be preferably used.
【００５１】本発明の代表的な態様であるタンパク質チ
ップは、タンパク質相互作用解析、タンパク質発現解
析、創薬研究に利用される。さらに、タンパク質が核酸
結合タンパク質の場合は、その認識核酸配列によっては
変異解析や多型解析に利用することができる。The protein chip, which is a typical embodiment of the present invention, is used for protein interaction analysis, protein expression analysis and drug discovery research. Furthermore, when the protein is a nucleic acid binding protein, it can be used for mutation analysis or polymorphism analysis depending on the recognition nucleic acid sequence.
【００５２】検出原理は標識されたリガンドや核酸との
反応である。標識方法としてはＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光
法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られているが、
とくに限定されるものではない。例えば蛍光法の場合、
蛍光標識に利用される蛍光物質としては、核酸の塩基部
分やタンパク質アミノ酸残基と結合できるものであれば
何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、
市販のＣｙ ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、
ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ―アセトキシ―Ｎ2―アセチル
アミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦ
のヨウ素誘導体）を使用することができる。The detection principle is a reaction with a labeled ligand or nucleic acid. RI method and non-RI method (fluorescence method, biotin method, chemiluminescence method, etc.) are known as labeling methods.
It is not particularly limited. For example, in the case of the fluorescence method,
As the fluorescent substance used for the fluorescent label, any substance can be used as long as it can bind to a base portion of a nucleic acid or an amino acid residue of a protein, but a cyanine dye (for example,
Cy3, Cy5, etc. of commercially available Cy DyeTM series),
Rhodamine 6G reagent, N-acetoxy-N2-acetylaminofluorene (AAF) or AAIF (AAF
Iodine derivative) can be used.
【００５３】核酸認識タンパク質が固定されたタンパク
チップの場合、検体中の標的核酸は、ＰＣＲ法などで増
幅することなく直接検出するのが好ましいが、予め増幅
したのちに検出してもよい。標的核酸またはその増幅体
は、予め標識しておくことにより容易に検出可能であ
る。核酸を標識するには、酵素(Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ， ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｔｅｒｍｉｎａ
ｌｄｅｏｘｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅなど)を用いる方
法がよく用いられるが、化学反応により、直接標識物質
を結合させてもよい。このような標識方法については、
公知の技術として成書に記載されている（野村慎太郎著
脱アイソトープ実験プロトコール１、秀潤社１９９４
年、脱アイソトープ実験プロトコール２、秀潤社１９９
８年、村松正明著 ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ
法標識物質 秀潤社２０００年）。標識物質は、検出可
能なシグナルを作ることの可能な物質であることが好ま
しい。標識物質が、酵素や触媒のような、シグナルの増
幅能力のある物質である場合、ＤＮＡの検出感度は大き
く向上する。In the case of a protein chip on which a nucleic acid recognizing protein is immobilized, it is preferable that the target nucleic acid in the sample is directly detected without amplification by PCR method or the like, but it may be detected after being amplified in advance. The target nucleic acid or its amplified product can be easily detected by labeling it in advance. To label nucleic acids, use the enzyme (Reverse Tr
anscriptase, DNA polymer
se RNA Polymerase, Termina
A method using ldeoxytransferase, etc.) is often used, but a labeling substance may be directly bound by a chemical reaction. For such labeling methods,
It is described in a book as a known technique (Shintaro Nomura, Deisotope Experiment Protocol 1, Shujunsha 1994).
Year, Deisotope experiment protocol 2, Shujunsha 199
8 years, Masaaki Muramatsu DNA microarray and latest PCR
Law-marked substance Shujunsha 2000). The labeling substance is preferably a substance capable of producing a detectable signal. When the labeling substance is a substance capable of amplifying a signal, such as an enzyme or a catalyst, the detection sensitivity of DNA is greatly improved.
【００５４】しかしながら、前述の標識操作は、一般的
に煩雑であるので、さらに好ましい検出方法としては、
検体中の核酸を予め標識せずに測定する方法を挙げるこ
とができる。これには、例えば２本鎖ＤＮＡを認識する
ＤＮＡ挿入剤、いわゆるＤＮＡインターカレーターを用
いることができる。ＤＮＡインターカレーターの使用に
より、検出操作が簡単になるだけではなく、検出感度も
向上する。例えば、１０００ｂｐのＤＮＡを検出する場
合、いわゆる標識法は多くとも数個の標識物質しか導入
できないのであるが、インターカレーターを使用する場
合は１００個以上の標識物質を導入することが可能であ
る。However, since the above labeling operation is generally complicated, a more preferable detection method is as follows.
A method of measuring the nucleic acid in the sample without labeling it beforehand can be mentioned. For this, for example, a DNA intercalating agent that recognizes double-stranded DNA, a so-called DNA intercalator can be used. The use of the DNA intercalator not only simplifies the detection operation, but also improves the detection sensitivity. For example, when detecting 1000 bp of DNA, the so-called labeling method can introduce only a few labeling substances at most, but when using an intercalator, 100 or more labeling substances can be introduced.
【００５５】ＤＮＡインターカレーターは、そのもの自
体が検出可能なシグナルを形成できる物質であってもよ
いが、その側鎖にシグナル形成物質を結合していたり、
ビオチン―アビジン、抗原―抗体、ハプテン―抗体のよ
うな特異結合対を介してインターカレーターに結合して
いてもよい。本発明における、検出可能なシグナルは、
例えば、蛍光検出、発光検出、化学発光検出、生物発光
検出、電気化学発光検出、放射能検出、電気化学検出、
比色検出により検出可能なシグナルであることが好まし
いが、これらに限定されるものではない。The DNA intercalator may be a substance capable of forming a detectable signal itself, but may have a signal forming substance bound to its side chain,
It may be bound to the intercalator via a specific binding pair such as biotin-avidin, antigen-antibody, hapten-antibody. In the present invention, the detectable signal is
For example, fluorescence detection, luminescence detection, chemiluminescence detection, bioluminescence detection, electrochemiluminescence detection, radioactivity detection, electrochemical detection,
A signal that can be detected by colorimetric detection is preferable, but the signal is not limited thereto.
【００５６】リガンドが標的である場合は、内在してい
るアミノ基にシアニン色素（例えば、市販のＣｙ Ｄｙ
ｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試
薬、Ｎ―アセトキシ―Ｎ2―アセチルアミノフルオレン
（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）
のサクシンイミド体を反応させたものを使用することが
できる。本発明を以下の実施例により、さらに具体的に
説明するが、これらの実施例は、本発明の理解を容易に
するためのものであって、本発明をこれらに限定するこ
とを意図するものではない。When the ligand is the target, the cyanine dye (for example, commercially available Cy Dy
eTM series Cy3, Cy5, etc.), Rhodamine 6G reagent, N-acetoxy-N2-acetylaminofluorene (AAF) or AAIF (iodine derivative of AAF)
The product obtained by reacting the succinimide compound can be used. The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are intended to facilitate understanding of the present invention and are intended to limit the present invention thereto. is not.
【００５７】[0057]
【実施例】［実施例１］抗体固定化スライドによるリガ
ンドの検出
（１）ビニルスルホニル基が導入された凹凸性固相担体
（Ａ）の作製
ポリビニルアルコール７５mgを１０００mlの超純水に溶
かし、溶解後、シランカップリング剤(信越化学工業製KB
E903)を５００μl添加し、マグネチックスターラーで１
０分間攪拌する。この液にガラス基板(76mm×26mm)を30
秒間浸してから引き上げ、余分な液を切った後に45℃の
乾燥機で乾燥させる。次にこのガラス基板を110℃のオーフ
゛ンで10分間加熱してシランをガラス基板に固着させる。
さらに前述ガラス基板の冷却後、３重量％１，２−ビス
（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン／ｐＨ８．０
ほう酸緩衝溶液にスライドウォッシャーを使い、１２０
分間反応させる。反応終了後、超純水で２０秒間×３回
水洗する。乾燥は２５℃にセットした乾燥機で３０分間
行い、凹凸性固相担体（Ａ）が得られた。[Examples] [Example 1] Detection of ligand by antibody-immobilized slide (1) Preparation of uneven solid phase carrier (A) having vinylsulfonyl group introduced Dissolve 75 mg of polyvinyl alcohol in 1000 ml of ultrapure water, and dissolve. Later, a silane coupling agent (KB, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
Add 500 μl of E903) and add 1 with a magnetic stirrer.
Stir for 0 minutes. Add a glass substrate (76 mm × 26 mm) to this solution 30 times.
Soak for 2 seconds, pull up, remove excess liquid, and dry in a dryer at 45 ° C. Next, this glass substrate is heated in an oven at 110 ° C. for 10 minutes to fix silane to the glass substrate.
Further, after cooling the glass substrate, 3 wt% 1,2-bis (vinylsulfonylacetamide) ethane / pH 8.0.
Use a slide washer for borate buffer solution, and use 120
React for minutes. After the reaction is completed, the product is washed with ultrapure water for 20 seconds × 3 times. Drying was carried out for 30 minutes with a dryer set at 25 ° C. to obtain an uneven solid phase carrier (A).
【００５８】（２）抗体の固定
Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓ
ｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳにて希
釈し（１００，２０、４，０．８，０．１６ｎｇ／μ
Ｌ、１μＬ）、上記（１）にて作製した固相担体（Ａ）
に点着した。直ちに点着後の固相担体を２５℃、飽和食
塩水チャンバーにて３時間放置した後、１％ＢＳＡ／
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０―ＰＢＳ（ＰＢＳ―Ｔ）に１
時間浸積することでブロッキング処理し、抗体スライド
（Ｂ）を得た。(2) Immobilization of antibody Goat Anti-Human IgG (Jacks
on ImmunoResearch) is diluted with PBS (100, 20, 4, 0.8, 0.16 ng / μ)
L, 1 μL), the solid phase carrier (A) prepared in (1) above
Spotted on. Immediately after the solid-phase carrier after spotting was left in a saturated saline solution chamber at 25 ° C. for 3 hours, 1% BSA /
1 in 0.05% Tween20-PBS (PBS-T)
Blocking was carried out by immersing for a period of time to obtain an antibody slide (B).
【００５９】（３）リガンドとの反応及び検出
上記（２）で作製した抗体スライド（Ｂ）にＨｙｂｒｉ
Ｗｅｌｌ（ＧｒａｃｅＢｉｏ―Ｌａｂｓ）を密着させ
た。Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ―Ｃｙ５（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ―
Ｔにて２μｇ／ｍｌに希釈し、１００μＬをＨｙｂｒｉ
Ｗｅｌｌ内に添加後、モイスチャーチャンバー内にて２
５℃で１時間インキュベートした。次いでこのものを、
ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳでリンス後７００ｒｐ
ｍで５分間遠心処理することで乾燥させた。スライドガ
ラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定した
ところ、１００ｎｇ／μＬにて抗体をスポットした位置
では４０．２となりバックグランンド蛍光強度より大き
く増加した。従って、本発明の凹凸が有機物質よりなる
固相担体上にスルホニル基を介して抗体を結合させた抗
体固定固相担体を用いることによって、その抗体固定固
相担体に固定されている抗体と反応性を有するリガンド
を効率的に検出できることが分かる。(3) Reaction with Ligand and Detection The antibody slide (B) prepared in (2) above was hybridized.
Well (GraceBio-Labs) was adhered. Human IgG-Cy5 (Jackson I
mmunoResearch) with 1% BSA / PBS-
Dilute to 2 μg / ml with T and add 100 μL to Hybri
After adding to the well, 2 in the moisture chamber
Incubated at 5 ° C for 1 hour. Then this one,
Wash 3 times with PBS-T, rinse with PBS, 700 rp
It was dried by centrifuging at m for 5 minutes. When the fluorescence intensity on the surface of the slide glass was measured by a fluorescence scanning device, it was 40.2 at the position where the antibody was spotted at 100 ng / μL, which was much higher than the background fluorescence intensity. Therefore, by using the antibody-immobilized solid phase carrier in which the irregularities of the present invention are bound to the solid phase carrier made of an organic substance through the sulfonyl group, the reaction with the antibody immobilized on the antibody-immobilized solid phase carrier is achieved. It can be seen that a ligand having a property can be efficiently detected.
【００６０】［実施例２］抗体固定化スライドによるリ
ガンドの検出
（１）抗体の固定
Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ
（Ｐｏｌｙｓｉｅｎｃｅ）をＰＢＳにて希釈し（１００
ｎｇ／μＬ）、１０μＬずつ３８４プレートに分注し
た。カーテシアン製アレイヤー（ＰｉｘＳｙｓ５５０
０）を用いて上記実施例１（１）にて作製した固相担体
（Ａ）に点着した。直ちに点着後の固相担体を２５℃、
飽和食塩水チャンバーにて１時間放置した後、１／４×
ブロックエース（大日本製薬）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０―ＰＢＳ（ＰＢＳ―Ｔ）に１時間浸積することでブ
ロッキング処理し、抗体スライド（Ｃ）を得た。[Example 2] Detection of ligand by antibody-immobilized slide (1) Immobilization of antibody Rabbit Anti Streptavidin
Dilute (Polyscience) with PBS (100
ng / μL), 10 μL each was dispensed to a 384 plate. Cartesian Arlayer (PixSys550
0) was applied to the solid phase carrier (A) prepared in Example 1 (1) above. Immediately after applying the solid phase carrier at 25 ° C,
1/4 × after standing in saturated saline solution chamber for 1 hour
Block Ace (Dainippon Pharmaceutical) /0.05% Tween
Blocking was performed by immersing in 20-PBS (PBS-T) for 1 hour to obtain an antibody slide (C).
【００６１】（２）リガンドの標識
１ｍｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（和光純薬）を４０
０μｌの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．０）にて溶
解した。それをＣｙ３−ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ）のチューブに移し、室温にて３０分間インキュベ
ートした。そこに、１００μｌの１ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）を添加し、さらに室温にて３０分間イン
キュベートすることで反応を停止させた。この反応液を
ＮＡＰ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にて精製し、Ｃｙ３標識Ｓｔｒ
ｅｐｔａｖｉｄｉｎを得た。(2) Labeling of ligand 1 mg of Streptavidin (Wako Pure Chemical Industries) was used.
It was dissolved in 0 μl of 0.1 M NaHCO 3 (pH 8.0). Cy3-monofunctional
(Amersham Pharmacia Biote
ch) tube and incubated at room temperature for 30 minutes. There, 100 μl of 1M Tris · HCl
The reaction was stopped by adding (pH 8.0) and further incubating at room temperature for 30 minutes. This reaction solution was applied to a NAP-5 column (Amersham Pharmac).
IA Biotech), and Cy3 labeled Str
eptavidin was obtained.
【００６２】（３）リガンドとの反応および検出
上記（１）で作製した抗体スライド（Ｃ）にＳｅｃｕｒ
ｅＳｅａｌ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅ
ｒ（ＳＡ５００，Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ―Ｌａｂｓ）を密
着させた。上記（２）で標識したＣｙ３−Ｓｔｒｅｐｔ
ａｖｉｄｉｎを１／４×ブロックエース／ＰＢＳ―Ｔに
て２μｇ／ｍｌに希釈し、５００μＬをＳＡ５００内に
添加後、モイスチャーチャンバー内にて２５℃で１時間
インキュベートした。次いでこのものを、ＰＢＳ―Ｔで
３回洗浄し、ＰＢＳでリンス後７００ｒｐｍで５分間遠
心処理することで乾燥させた。スライドガラス表面の蛍
光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、２
６，３００となり、バックグランンド蛍光強度より大き
く増加した。従って、本発明の凹凸が有機物質よりなる
固相担体上にスルホニル基を介して抗体を結合させた抗
体固定固相担体を用いることによって、マイクロアレイ
の系でもその抗体固定固相担体に固定されている抗体と
反応性を有するリガンドを効率的に検出できることが分
かる。(3) Reaction with Ligand and Detection Secur on the antibody slide (C) prepared in (1) above.
eSeal Hybridization Chamber
r (SA500, Grace Bio-Labs) was brought into close contact. Cy3-Strept labeled in (2) above
Avidin was diluted to 1 μg / ml with 1/4 × Block Ace / PBS-T, and 500 μL was added to SA500, followed by incubation in a moisture chamber at 25 ° C. for 1 hour. Then, this was washed with PBS-T three times, rinsed with PBS, and then centrifuged at 700 rpm for 5 minutes to be dried. When the fluorescence intensity on the surface of the slide glass was measured with a fluorescence scanning device, it was 2
The intensity was 6,300, which was larger than the background fluorescence intensity. Therefore, by using the antibody-immobilized solid-phase carrier in which the irregularities of the present invention are bound to the solid-phase carrier made of an organic substance with an antibody through a sulfonyl group, even the microarray system can be immobilized on the antibody-immobilized solid-phase carrier. It can be seen that a ligand having reactivity with the existing antibody can be efficiently detected.
【００６３】［参考例１］抗体固定化スライドによるリ
ガンドの検出
（１）ビニルスルホニル基が導入された固相担体（Ｄ）
の作製
ＤＮＡマイクロアレイ用コートスライドグラス（Ｔｙｐ
ｅ２高密度化アミノ基導入タイプ［松浪硝子工業］）２
０枚を市販のバスケットに入れ、３重量％１，２−ビス
（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン／ｐＨ８．０
ほう酸緩衝溶液に浸積し、スライドウォッシャーを使
い、１２０分間反応させる。反応終了後、超純水で２０
秒間×３回水洗する。乾燥は２５℃にセットした乾燥機
で３０分間乾燥する。[Reference Example 1] Detection of ligand by antibody-immobilized slide (1) Solid support having vinylsulfonyl group introduced (D)
Preparation of coated glass slides for DNA microarray (Type
e2 Densified amino group introduction type [Matsunami Glass Industry]) 2
0 sheets were placed in a commercially available basket and 3% by weight of 1,2-bis (vinylsulfonylacetamide) ethane / pH 8.0
Immerse in a borate buffer solution and react for 120 minutes using a slide washer. After the reaction is complete, use ultrapure water for 20
Rinse with water 3 times per second. Drying is performed with a dryer set at 25 ° C. for 30 minutes.
【００６４】（２）抗体の固定
Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓ
ｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳにて希
釈し（５０ｎｇ／μＬ）、１０μＬずつ３８４プレート
に分注した。カーテシアン製アレイヤー（ＰｉｘＳｙｓ
５５００）を用いて上記実施例３（１）にて作製した固
相担体（Ｄ）に点着した。直ちに点着後の固相担体を２
５℃、飽和食塩水チャンバーにて１時間放置した後、１
／４×ブロックエース（大日本製薬）／０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に１時間浸積するこ
とでブロッキング処理し、抗体スライド（Ｅ）を得た。(2) Immobilization of antibody Goat Anti Human IgG (Jacks
on ImmunoResearch) was diluted with PBS (50 ng / μL) and dispensed in 10 μL aliquots to a 384 plate. Cartesian Arlayer (PixSys
5500) was applied to the solid phase carrier (D) prepared in Example 3 (1) above. Immediately 2
After leaving it in a saturated saline solution chamber at 5 ° C for 1 hour,
/ 4 × Block Ace (Dainippon Pharmaceutical) /0.05%Tw
It was immersed in een20-PBS (PBS-T) for 1 hour for blocking to obtain an antibody slide (E).
【００６５】（３）リガンドとの反応及び検出
上記（１）で作製した抗体スライド（Ｅ）にＳｅｃｕｒ
ｅＳｅａｌ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅ
ｒ（ＳＡ５００，Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）を密
着させた。Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−Ｃｙ５（Ｊａｃｋｓｏ
ｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１／４×ブロッ
クエース／ＰＢＳ―Ｔにて５，２，１， ０．２， ０．
１μｇ／ｍｌに希釈し、５００μＬをＳＡ５００内に添
加後、モイスチャーチャンバー内にて２５℃で１時間イ
ンキュベートした。次いでこのものを、ＰＢＳ―Ｔで３
回洗浄し、ＰＢＳでリンス後７００ｒｐｍで５分間遠心
処理することで乾燥させた。スライドガラス表面の蛍光
強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、５，
２， １， ０．２， ０．１μｇ／ｍｌのＨｕｍａｎ Ｉ
ｇＧ―Ｃｙ５を添加したスライドでそれぞれ、２０，５
３７、１３，４３４、１０，０６０、５，２１３、３，
５９２となり、０．２〜２μｇ／ｍｌの範囲ではほぼ直
線性が成り立った（図２）。(3) Reaction with Ligand and Detection Secur on the antibody slide (E) prepared in (1) above.
eSeal Hybridization Chamber
r (SA500, Grace Bio-Labs) was brought into close contact. Human IgG-Cy5 (Jackso
n ImmunoResearch) with ¼ × Block Ace / PBS-T 5, 2, 1, 0.2, 0.
After diluting to 1 μg / ml and adding 500 μL into SA500, it was incubated at 25 ° C. for 1 hour in a moisture chamber. Then use this with PBS-T 3
It was washed twice, rinsed with PBS, and then centrifuged at 700 rpm for 5 minutes to dry it. When the fluorescence intensity on the surface of the slide glass was measured with a fluorescence scanning device,
2, 1, 0.2, 0.1 μg / ml Human I
The slides containing gG-Cy5 were added to 20, 5 respectively.
37, 13, 434, 10,060, 5,213, 3,
It became 592, and almost linearity was established in the range of 0.2 to 2 μg / ml (FIG. 2).
【００６６】[0066]
【発明の効果】本発明により、迅速かつ安定に結合固定
可能な反応性固相担体に少なくとも一つの特異的結合パ
ートナーの一員が結合固定されてなる生物学的素材チッ
プを提供することが可能になった。Industrial Applicability According to the present invention, it is possible to provide a biological material chip in which at least one member of a specific binding partner is bound and immobilized on a reactive solid phase carrier which can be rapidly and stably bound and immobilized. became.
【図１】図1は、本発明の代表的態様であるタンパク質
チップの構成の模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram of the structure of a protein chip that is a typical embodiment of the present invention.
【図２】図２は、本発明による抗体固定化スライドを用
いてリガンドを検出した結果を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the results of detecting a ligand using the antibody-immobilized slide according to the present invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ (72)発明者 須藤 幸夫 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 (72)発明者 瀬志本 修 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 4H045 AA11 AA20 AA30 DA00 DA50 DA76 EA50 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) G01N 37/00 102 G01N 37/00 102 (72) Inventor Yukio Sudo 3-11-46 Izumi, Asaka City, Saitama Prefecture Fuji Photo Film Co., Ltd. (72) Inventor Hiroshi Shinoki 3-11-46 Izumi, Asaka-shi, Saitama Prefecture Fuji Photo Film Co., Ltd. (72) Osamu Soshimoto 3-11-46 Izumi, Asaka-shi, Saitama Prefecture Fuji Photo Film Co., Ltd. F-term (reference) 4H045 AA11 AA20 AA30 DA00 DA50 DA76 EA50
Claims (26)
固相担体に、少なくとも一つのタンパク質又はタンパク
質結合物質（但し、核酸を除く）の残基であるＡが、下
記式（Ｉ）のようにスルホニル基を介した共有結合によ
り結合していることを特徴とする生物学的素材チップ； 固相担体―Ｌ―ＳＯ2―Ｘ―Ａ （Ｉ） ［式（Ｉ）において、Ｌは連結基を表わし、Ｘは、−Ｃ
Ｒ1（Ｒ2）−ＣＲ3（Ｒ4）−を表わし；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3
及びＲ4は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数１乃
至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０のアリール
基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を有する合計
炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基を表し、Ａはタ
ンパク質又はタンパク質結合物質（但し、核酸を除く）
の残基を示す。］1. A solid-phase carrier having an irregularity formed of an organic substance, wherein at least one residue of protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid), A, is represented by the following formula (I): biological material chip, characterized in that it covalently bonded via a sulfonyl group; in the solid phase support -L-SO 2 -X-a ( I) [ formula (I), L a linking group Where X is -C
Represents R 1 (R 2 ) -CR 3 (R 4 )-; R 1 , R 2 , R 3
And R 4 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or a total carbon atom number of 7 having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms. To 26 aralkyl groups, A is a protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid)
Indicates the residue of. ]
ク質結合物質（但し、核酸を除く）が、抗体、抗体フラ
グメント、リガンド、抗原、ハプテン、又はレセプター
である、請求項１に記載のチップ。2. The chip according to claim 1, wherein the protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) immobilized on the surface is an antibody, an antibody fragment, a ligand, an antigen, a hapten, or a receptor.
ク質結合物質（但し、核酸を除く）がアビジン類であ
る、請求項１に記載のチップ。3. The chip according to claim 1, wherein the protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) immobilized on the surface is an avidin.
ビジンまたはビオチンと安定な複合体を形成しうるこれ
らの改変体である、請求項３に記載のチップ。4. The chip according to claim 3, wherein the avidins are avidin, streptavidin, or a modified form thereof capable of forming a stable complex with biotin.
識タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載
のチップ5. The chip according to claim 1, wherein the protein immobilized on the surface is a nucleic acid recognition protein.
タンパク質である請求項５に記載のチップ。6. The chip according to claim 5, wherein the nucleic acid recognition protein is a double-stranded DNA recognition protein.
ＮＡ認識抗体である、請求項６に記載のチップ。7. The double-stranded DNA recognition protein is double-stranded D
The chip according to claim 6, which is an NA-recognizing antibody.
写因子である、請求項６に記載のチップ。8. The chip according to claim 6, wherein the double-stranded DNA recognition protein is a DNA transcription factor.
ンガーモチーフまたはリングフィンガーモチーフをもつ
タンパク質である、請求項６に記載のチップ。9. The chip according to claim 6, wherein the double-stranded DNA recognition protein is a protein having a Zn finger motif or a ring finger motif.
分子ポリマ−の凝集体であることを特徴とする、請求項
１から９の何れかに記載のチップ。10. The chip according to claim 1, wherein the organic substance is a polymer or an aggregate of polymer.
極表面、センサーチップ表面である、請求項１から１０
の何れかに記載のチップ。11. The solid phase carrier is glass, plastic, an electrode surface, or a sensor chip surface, according to claim 1.
The chip according to any one of 1.
プと、該チップの表面に担持されたタンパク質又はタン
パク質結合物質（但し、核酸を除く）と特異的に結合す
る標的物質を含む検体とを接触させる工程；及び該タン
パク質又はタンパク質結合物質と該標的物質との間の相
互の結合の形成を検出する工程；を含む、標的物質を検
出する方法。12. A specimen comprising the chip according to claim 1 and a target substance that specifically binds to a protein or a protein-binding substance (excluding nucleic acid) carried on the surface of the chip. And a step of detecting the formation of a mutual bond between the protein or protein-binding substance and the target substance.
しうる少なくとも一つの成分で標識されていることを特
徴とする、請求項１２に記載の標的物質の検出方法。13. The method for detecting a target substance according to claim 12, wherein the target substance is labeled with at least one component capable of generating a detectable signal.
タンパク質の水溶液でブロッキング処理する工程を含
む、請求項１２又は１３に記載の標的物質の検出方法。14. The method for detecting a target substance according to claim 12, which comprises a step of blocking the chip with an aqueous solution of an amino acid, a peptide or a protein.
ホニル基もしくはその反応性前駆体基を表面に持ち、有
機物質により形成された凹凸を有する固相担体上に、該
ビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基と反応
して共有結合を形成する反応性基を有する少なくとも一
つのタンパク質又はタンパク質結合物質（但し、核酸を
除く）を接触させることを含む、請求項１に記載のチッ
プの製造方法。 −Ｌ―ＳＯ2―Ｘ’ （ＩＩ） ［上記の式において、Ｌは、―ＳＯ2―Ｘ’と固相担体
とを結合する連結基を示し；Ｘ’は、―ＣＲ1＝ＣＲ
2（Ｒ3）または―ＣＨ（Ｒ1）―ＣＲ2（Ｒ3）（Ｙ）を
表し；Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に、水素原子、炭
素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０
のアリール基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を
有する合計炭素原子数７乃至２６のアラルキル基を表
し、Ｙは、求核試薬によって置換される基、あるいは塩
基によって「ＨＹ」として脱離する基を表す］15. A vinylsulfonyl group represented by the following formula (II) or its reactive precursor group on the surface thereof, and the vinylsulfonyl group or its derivative on a solid phase carrier having irregularities formed by an organic substance. The production of a chip according to claim 1, which comprises contacting at least one protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) having a reactive group that reacts with a reactive precursor group to form a covalent bond. Method. —L—SO 2 —X ′ (II) [In the above formula, L represents a linking group that binds —SO 2 —X ′ and the solid phase carrier; X ′ represents —CR 1 ═CR
2 (R 3 ) or —CH (R 1 ) —CR 2 (R 3 ) (Y) is represented; R 1 , R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. , 6 to 20 carbon atoms
Or an aralkyl group having a total of 7 to 26 carbon atoms having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms, Y is a group substituted by a nucleophile, or eliminated as "HY" by a base. Represents the group to
パク質結合物質（但し、核酸を除く）が、抗体、抗体フ
ラグメント、リガンド、抗原、ハプテン、又はレセプタ
ーである、請求項１５に記載のチップの製造方法。16. The method for producing a chip according to claim 15, wherein the protein or protein-binding substance immobilized on the surface (excluding nucleic acid) is an antibody, an antibody fragment, a ligand, an antigen, a hapten, or a receptor. .
ン類である、請求項１６に記載のチップの製造方法。17. The method for producing a chip according to claim 16, wherein the protein immobilized on the surface is an avidin.
アビジンまたはビオチンと安定な複合体を形成しうるこ
れらの改変体である、請求項１７に記載のチップの製造
方法。18. The method for producing a chip according to claim 17, wherein the avidins are avidin, streptavidin, or modified forms thereof that can form a stable complex with biotin.
識タンパク質であることを特徴とする、請求項１５に記
載のチップの製造方法。19. The method for producing a chip according to claim 15, wherein the protein immobilized on the surface is a nucleic acid recognition protein.
識タンパク質である請求項１９に記載のチップの製造方
法。20. The method for producing a chip according to claim 19, wherein the nucleic acid recognition protein is a double-stranded DNA recognition protein.
ＤＮＡ認識抗体である、請求項２０に記載のチップの製
造方法。21. The method for producing a chip according to claim 20, wherein the double-stranded DNA recognizing protein is a double-stranded DNA recognizing antibody.
転写因子である、請求項２０に記載のチップの製造方
法。22. The double-stranded DNA recognition protein is DNA
The method for manufacturing a chip according to claim 20, which is a transcription factor.
ィンガーモチーフまたはリングフィンガーモチーフをも
つタンパク質である、請求項２０に記載のチップの製造
方法。23. The method for producing a chip according to claim 20, wherein the double-stranded DNA recognition protein is a protein having a Zn finger motif or a ring finger motif.
分子ポリマ−の凝集体であることを特徴とする、請求項
１５から２３の何れかに記載のチップの製造方法。24. The chip manufacturing method according to claim 15, wherein the organic substance is a polymer or an aggregate of polymer.
極表面、センサーチップ表面である、請求項１６から２
６記載のチップの製造方法。25. The solid phase carrier is glass, plastic, an electrode surface, or a sensor chip surface, according to claim 16 or 2.
6. The method for manufacturing a chip according to 6.
パク質結合物質（但し、核酸を除く）を接触させること
によって、有機物質により形成された凹凸を有する固相
担体上に固定した後、固相担体表面にあるフリーのビニ
ルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基をアミノ
酸、ペプチドもしくはタンパク質水溶液でブロッキング
処理することを特徴とする、請求項１５〜２５の何れか
に記載のチップの製造方法。26. At least one protein or protein-binding substance (excluding nucleic acid) is brought into contact with the surface of the solid-phase carrier after immobilization on the solid-phase carrier having irregularities formed by an organic substance. The method for producing a chip according to any one of claims 15 to 25, characterized in that a free vinylsulfonyl group or a reactive precursor group thereof is subjected to a blocking treatment with an amino acid, peptide or protein aqueous solution.
Priority Applications (5)
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