JP2003000295A

JP2003000295A - 光学活性２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸及びその対掌体エステルの製造方法

Info

Publication number: JP2003000295A
Application number: JP2001198722A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Kawano; 茂川野; Yoshihiko Yasohara; 良彦八十原
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2001-04-19
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2003-01-07

Abstract

(57)【要約】【課題】光学活性２−ヒドロキシメチル−３−アリー
ルプロピオン酸及びその対掌体エステルの簡便な製造方
法を提供する。【解決手段】一般式（１）【化１】で示される２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピ
オン酸エステルを酵素で不斉水解することにより、一般
式（２）【化２】で示される光学活性２−ヒドロキシメチル−３−アリー
ルプロピオン酸及びその対掌体エステルを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、光学活性２−ヒド
ロキシメチル−３−アリールプロピオン酸及びその対掌
体エステルの製造方法に関する。光学活性２−ヒドロキ
シメチル−３−アリールプロピオン酸、特に光学活性２
−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸は、エ
ンケファリナーゼ阻害剤、ＡＣＥ阻害剤などの医薬品製
造中間体として利用されている光学活性２−アセチルチ
オメチル−３−フェニルプロピオン酸の原料として非常
に有用な化合物である。

【０００２】

【従来の技術】光学活性２−ヒドロキシメチル−３−ア
リールプロピオン酸の一つである光学活性２−ヒドロキ
シメチル−３−フェニルプロピオン酸の製造法として
は、従来、以下に示すように種々な方法が知られてい
る。（ａ）２−ベンジル−１，３−プロパンジオールを酢酸
ビニル存在下、リパーゼで不斉エステル化を行うか、あ
るいは酢酸２−(アセトキシメチル)−３−フェニルプロ
ピルをリパーゼで不斉加水分解することにより得られる
光学活性酢酸−２−ベンジル−３−ヒドロキシプロピル
をクロム酸で酸化した後、脱アセチル化を行い、光学活
性２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸を
得る方法〔ＷＯ９７２９０８６、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎＬｅｔｔ.３１,１６０１(１９９０) 〕。（ｂ）（４Ｓ）−４−（１−メチルエチル）−２−オキ
サゾリジノンをｎ−ブチルリチウムおよび塩化３−フェ
ニルプロピオニルと反応させてフェニルプロピオニルア
ミドとした後、これにリチウムジイソプロピルアミドを
作用させて生成したエノラートにベンジルブロモメチル
エーテルを反応させて不斉アルキル化を行い、得られた
化合物をさらに２工程を経て光学活性２−ヒドロキシメ
チル−３−フェニルプロピオン酸を得る方法〔Ｃｈｅｍ
Ｌｅｔｔ．５０５(１９９０）〕。（ｃ）Ｌ−フェニ
ルアラニンより３工程で得られるギ酸（Ｓ）−２−イソ
シアノ−３−フェニルプロピルを高熱転位反応を起こさ
せ、得られた(Ｒ)−２−ベンジル−３−（ホルミルオキ
シ）プロピオニトリルを加水分解等により光学活性２−
ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸を得る方
法〔ＣｈｅｍＢｅｒ.１２３，６３５（１９９
０）〕。

【０００３】しかしながら、上記（ａ）の方法は酵素反
応で得られたアルコールをカルボン酸に酸化する際、有
毒なクロム酸を用いるなど工業化は困難である。また、
上記（ｂ）の方法は、工程数が多く、高価なｎ−ブチル
リチウムやリチウムジイソプロピルアミドを用いるこ
と、低温反応が必要であること等、工業的製法とは言い
難い。さらに、上記（ｃ）の方法も熱転位反応で５００
℃以上の高温が必要であり、工業的製法にはなり得な
い。このように、従来知られている方法は、いずれも工
業的製法としては問題を有するものであった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸エス
テルから１工程で光学純度よく光学活性２−ヒドロキシ
メチル−３−アリールプロピオン酸を製造し得る方法を
開発するべく鋭意検討した結果、２−ヒドロキシメチル
−３−アリールプロピオン酸エステルを酵素を用いて不
斉加水分解することにより、容易に光学純度よく光学活
性２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸及
びその対掌体エステルを製造できることを見い出し、本
発明に至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、一般
式（１）；

【０００６】

【化３】（式中、Ａｒは置換基を有していてもよいアリール基、
Ｒはアルキル基、アラルキル基またはアリール基を示
し、＊は不斉炭素原子を示す。）で示される２−ヒドロ
キシメチル−３−アリールプロピオン酸エステルに対し
て、不斉加水分解能を有する酵素を作用させることを特
徴とする、一般式（２）；

【０００７】

【化４】（式中、Ａｒ、＊はそれぞれ前記と同じ意味を示す。）
で示される光学活性２−ヒドロキシメチル−３−アリー
ルプロピオン酸及びその対掌体エステルの製造方法を提
供するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】一般式（１）で示される２−ヒド
ロキシメチル−３−アリールプロピオン酸エステルにお
いて、Ａｒはフェニル基、ナフチル基等のアリール基を
表し、置換基を有していてもよい。置換基としては、ア
ルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコ
キシ基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、ハロゲン原子等
が挙げられる。Ａｒとして、好ましくは上記置換基を有
していてもよいフェニル基であり、より好ましくはフェ
ニル基である。

【０００９】一般式（１）で示される２−ヒドロキシメ
チル−３−アリールプロピオン酸エステルにおいて、Ｒ
で示されるアルキル基としては例えばメチル基、エチル
基、プロピル基、ブチル基などの炭素原子数１〜８の低
級アルキル基が、アラルキル基としては例えばベンジル
基やアリールエチル基などが、アリール基としては例え
ばフェニル基などが挙げられる。好ましくはメチル基、
エチル基、プロピル基、ブチル基などの炭素原子数１〜
８の低級アルキル基が挙げられ、特に好ましくはメチル
基である。

【００１０】一般式（１）で示される２−ヒドロキシメ
チル−３−アリールプロピオン酸エステルには＊で示さ
れる不斉炭素原子を不斉中心とする２種類の光学活性体
が存在するが、本発明の方法に用いられる２−ヒドロキ
シメチル−３−アリールプロピオン酸エステル（１）は
これらの光学活性体をそれぞれ等量ずつ含むラセミ体で
あってもよいし、一方の光学活性体を過剰に含む光学活
性な化合物であってもよい。

【００１１】２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロ
ピオン酸エステル（１）は既知のいくつかの方法によっ
て合成可能である。例えば、β−プロピオラクトンをト
リエチルアミン存在下、メタノールで開環反応させて３
−ヒドロキシプロピオン酸メチルエステルとした後、リ
チウムジイソプロピルアミド及び臭化ベンジルによりα
−ベンジル化を行い、２−ヒドロキシメチル−３−フェ
ニルプロピオン酸メチルエステルを得る方法（Ｊ．Ｍｅ
ｄ．Ｃｈｅｍ．１９９３，３６，４０１５参照）などが
挙げられる。

【００１２】２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロ
ピオン酸エステル（１）に対して不斉加水分解能を有す
る酵素は、微生物起源の酵素であってもよいし、動物起
源の酵素であってもよいし、植物起源の酵素であっても
よい。

【００１３】微生物起源の酵素としては、例えばアクロ
モバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アスペ
ルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バシラス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）
属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ムコー
ル（Ｍｕｃｏｒ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属及びリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属の微生物を
起源とする酵素、またはこれらの微生物が有する酵素遺
伝子が導入されることによって形質転換された組み換え
微生物が産生する酵素などが挙げられ、好ましくは、ク
ロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属など
の微生物を起源とする酵素である。

【００１４】これらの微生物はいずれも通常の方法、例
えば滅菌した液体培地に該微生物を接種し、２０〜４０
℃で往復振とう培養する方法などによって容易に液体培
養することができる。また、必要に応じて固体培養して
もよい。

【００１５】動物起源の酵素としては、例えば豚や牛の
内蔵由来の酵素などが挙げられ、好ましくは豚や牛の膵
臓由来の酵素が好ましい。植物起源の酵素としては、例
えば小麦胚芽を起源とする酵素などが挙げられる。

【００１６】これらの酵素は市販品の中から選択して使
用することもできる。市販品の酵素としては、例えばリ
パーゼＡＬ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｓｐ．由
来、名糖産業社製）、ＰａｔａｌａｓｅＡ（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ由来、ＮＯＶＯ社製）、リパ
ーゼＳＰ５３９（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．由来、ＮＯ
ＶＯ社製）、ズブチリシンＡ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来、ＮＯＶＯ社製）、リパ
ーゼＯＦ（Ｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ由
来、名糖産業社製）、リパーゼＳＰ３９８（Ｃａｎｄｉ
ｄａｓｐ．由来、ＮＯＶＯ社製）、リパーゼＬ−０５
０（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｓｃｏｓｕ
ｍ由来、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社製）、リパーゼ
Ｌ−０５３（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ
由来、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社製）、リパーゼＬ
−１６６Ｐ（Ｍｕｃｏｒｊａｖａｎｉｃｕｓ由来、
Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社製）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ
１００００Ｌ（Ｍｕｃｏｒｍｅｉｈｅｉ由来、ＮＯＶ
Ｏ社製）、リパーゼＳＰ３８８（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈ
ｅｉ由来、ＮＯＶＯ社製）、リパーゼＬ−０５５Ｐ
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍｃｙｃｌｏｐｉｕｍ由来、
Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社製）、リパーゼＰＳ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ由来、天野製薬社
製）、リパーゼＬ−０５６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓ
ｔｓ社製）、リパーゼＤ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｄｅｌｅ
ｍａｒ由来、天野製薬社製）、リパーゼＦ−ＡＰ１５
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｊａｖａｎｉｃｕｓ由来、天野製
薬社製）、リパーゼ（豚膵臓由来、東洋醸造社製）、キ
モトリプシン（牛膵臓由来、ナカライテスク社製）など
が挙げられる。

【００１７】これらの酵素の純度あるいは形態について
は特に制限されるものではなく、精製酵素、粗酵素、酵
素含有物、微生物培養液、培養物、菌体、培養液および
それらの処理物などの種々の形態で用いることができ
る。ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセト
ン乾燥菌体、菌体摩擦物、菌体の自己消化物、菌体の超
音波破砕物、菌体抽出物またはアルカリ処理物などを言
う。更に上記のような種々の純度あるいは形態の酵素
を、例えばシリカゲルやセラミックスなどの無機担体、
セルロース、イオン交換樹脂などへの吸着法、ポリアク
リルアミド法、含硫多糖ゲル法（例えばカラギーナンゲ
ル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法などの公知の方
法により固定化して用いてもよい。

【００１８】かかる酵素は目的とする光学活性２−ヒド
ロキシメチル−３−アリールプロピオン酸（２）に応じ
て適宜選択される。

【００１９】不斉加水分解は、例えば水、２−ヒドロキ
シメチル−３−アリールプロピオン酸エステル及び上記
酵素を混合する方法により行われる。

【００２０】酵素の使用量は反応時間の遅延や選択性の
低下が起こらないように適宜選択され、例えば市販品を
用いる場合、その使用量は２−ヒドロキシメチル−３−
アリールプロピオン酸エステル（１）に対して通常は
０．００１〜２．０重量倍、好ましくは０．０１〜１．
０重量倍である。

【００２１】不斉加水分解に用いられる水は、緩衝水溶
液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸
ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などといった
リン酸アルカリ金属塩水溶液などの無機酸塩の緩衝水溶
液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液などと
いった酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩の緩衝水溶液
などが挙げられる。かかる水の使用量は２−ヒドロキシ
メチル−３−アリールプロピオン酸エステル（１）に対
して通常０．５モル倍以上であればよく、場合によって
は溶媒量用いられ、通常は１００重量倍以下である。

【００２２】反応系のｐＨは酵素による不斉加水分解が
選択性よく進行する値が適宜選択され、特に限定されな
いが、通常はｐＨ４〜１０の範囲である。反応温度は、
高すぎると酵素の安定性が低下する傾向にあり、また低
すぎると反応速度が低下する傾向にあるため、通常５〜
６５℃であり、好ましくは２０〜５０℃の範囲である。

【００２３】本発明においては、不斉加水分解によって
２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸エス
テル（１）の一方の光学活性体が、＊で示される不斉炭
素原子の周りの立体配置を維持したまま優先的に加水分
解されて、目的とする光学活性２−ヒドロキシメチル−
３−アリールプロピオン酸（２）が生成し、その対掌体
エステルが加水分解されずに残存する。

【００２４】反応後の反応液をアルカリ性に調整後、有
機溶媒を添加し、十分に攪拌したのちに、水層と有機層
とに分液し、水層として光学活性２−ヒドロキシメチル
−３−アリールプロピオン酸（２）の水溶液を、有機層
として対掌体エステルの溶解液を得ることができる。こ
の時使用しうる有機溶媒としては、例えばｔ−ブチルメ
チルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル
類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタンな
どの炭化水素類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ク
ロロホルム、クロロベンゼン、オルトジクロロベンゼン
などのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸メチ
ル、酢酸ブチルなどのエステル類などが挙げられる。

【００２５】次いで、得られた光学活性２−ヒドロキシ
メチル−３−アリールプロピオン酸（２）の水溶液から
水を留去することによって、もしくは水溶液を酸性条件
下で有機溶媒で抽出し、溶媒留去を行うことにより、目
的の光学活性２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロ
ピオン酸（２）を取得することができる。

【００２６】なお、加水分解されなかった対掌体エステ
ル２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸エ
ステル（１）は、分液後の有機層に含まれており、これ
は溶媒留去などの方法によって容易に有機層から取り出
すことができる。こうして得られた２−ヒドロキシメ
チル−３−アリールプロピオン酸エステル（１）につい
て、定法により加水分解を行い、酸で中和、有機溶媒で
の抽出及び溶媒留去を行うことにより光学活性２−ヒド
ロキシメチル−３−アリールプロピオン酸（２）を取得
することが可能である。加水分解の方法としては、通常
行う条件で加水分解することができ、例えばメタノール
に溶解後、水酸化ナトリウム水溶液を加える方法などが
挙げられる。

【００２７】以上のようにして得られた光学活性２−ヒ
ドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸（２）は更
に再結晶、カラムクロマトグラフ処理などによって精製
することができる。また、再結晶により光学純度を上げ
ることができる。

【００２８】

【実施例】以下、実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００２９】（実施例１〜７）ラセミ体の２−ヒドロキ
シメチル−３−フェニルプロピオン酸メチル１０ｍｇを
５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに懸濁し、表
１に示した種々の酵素５ｍｇを加えて、３０℃で１９時
間攪拌した。反応終了後、反応液に２Ｎ塩酸を加えて酸
性とし、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。抽出液
を適時濃縮後、高速液体クロマトグラフィー（カラム：
日本分光株式会社製ＦｉｎｅｐａｋＳＩＬＣ１８Ｔ
−５、溶離液：水（０．１％リン酸）／アセトニトリル
＝７／３、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２２０ｎ
ｍ、カラム温度：３５℃、溶出時間：２−ヒドロキシメ
チル−３−フェニルプロピオン酸６．６ｍｉｎ、２−ヒ
ドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸メチル１
２．７ｍｉｎ）にて分析し、２−ヒドロキシメチル−３
−フェニルプロピオン酸への変換率を求めた。また、生
成した２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン
酸を薄層クロマトグラフィーにより精製し、高速液体ク
ロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社
製ＣｈｉｒａｌｃｅｌＯＤ、溶離液：ヘキサン／イソ
プロパノール／トリフルオロ酢酸＝９５／５／０．０
５、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１５ｎｍ、カ
ラム温度：室温、溶出時間：Ｓ体１５．６ｍｉｎ、Ｒ体
１７．６ｍｉｎ）にて分析し光学純度を測定した。結果
を表１に示す。

【００３０】

【表１】（実施例８〜１８）ラセミ体の２−ヒドロキシメチル−
３−フェニルプロピオン酸メチル１０ｍｇを５００ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに懸濁し、表２に示した
種々の酵素１０ｍｇを加えて、３０℃で４８時間攪拌し
た。反応後、実施例１〜７と同様に抽出、分析を行い、
２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸への
変換率及び生成した２−ヒドロキシメチル−３−フェニ
ルプロピオン酸の光学純度を測定した。結果を表２に示
す。

【００３１】

【表２】（実施例１９）ラセミ体の２−ヒドロキシメチル−３−
フェニルプロピオン酸メチル１０ｍｇを５００ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに懸濁し、表３に示した酵素
５ｍｇを加えて、３０℃で５時間攪拌した。反応後、実
施例１〜７と同様に抽出、分析を行い、２−ヒドロキシ
メチル−３−フェニルプロピオン酸への変換率及び生成
した２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸
の光学純度を測定した。結果を表３に示す。

【００３２】

【表３】（実施例２０）ラセミ体の２−ヒドロキシメチル−３−
フェニルプロピオン酸メチル１．０ｇを５００ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７）１００ｍｌに懸濁し、リパーゼＬ−
０５０（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社製）０．５ｇを加
えて、３０℃で５時間攪拌した。反応終了後、濾過によ
り酵素を除去した。反応液に氷冷下で１規定水酸化ナト
リウム水溶液を加えることによりｐＨ９とし、ｔ−ブチ
ルメチルエーテル１００ｍｌを加えて攪拌後、有機層を
除去した。得られた水層に氷冷下で２規定塩酸を加える
ことによりｐＨ３とし、ｔ−ブチルメチルエーテル１０
０ｍｌで２回抽出した。有機層をあわせて無水硫酸ナト
リウムで脱水後、減圧下で溶媒を留去し、ジエチルエー
テル−ヘキサンより結晶化を行い、２−ヒドロキシメチ
ル−３−フェニルプロピオン酸の白色固体１４０ｍｇを
取得した。光学純度はＲ体で９８．０％ｅ．ｅ．であっ
た。融点：６７．５〜６８．５℃¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δｐｐｍ：
２．７５〜２．９３（ｍ，２Ｈ），２．９７〜３．１３
（ｍ，１Ｈ），３．６０〜３．８５（ｍ，２Ｈ），５．
１４（ｂｒｓ，２Ｈ），７．０６〜７．３４（ｍ，５
Ｈ）［α］_D ²⁰：＋１３．９°（ｃ＝０．９７，ＣＨＣｌ₃）

【００３３】

【発明の効果】本発明の方法によれば、１工程で光学純
度よく光学活性２−ヒドロキシメチル−３−アリールプ
ロピオン酸及びその対掌体エステルを製造することがで
きる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（１）；【化１】（式中、Ａｒは置換基を有していてもよいアリール基、
Ｒはアルキル基、アラルキル基またはアリール基を示
し、＊は不斉炭素原子を示す。）で示される２−ヒドロ
キシメチル−３−アリールプロピオン酸エステルに、不
斉加水分解能を有する酵素を作用させることを特徴とす
る、一般式（２）【化２】（式中、Ａｒ、＊はそれぞれ前記と同じ意味を示す。）
で示される光学活性２−ヒドロキシメチル−３−アリー
ルプロピオン酸及びその対掌体エステルの製造方法。
【請求項２】Ａｒが置換基を有していてもよいフェニ
ル基である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】Ａｒがフェニル基である請求項１記載の
製造方法。
【請求項４】Ｒが炭素数１〜８のアルキル基である請
求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】Ｒがメチル基である請求項１〜３に記載
の製造方法。
【請求項６】酵素が微生物起源の酵素、または、動物
起源の酵素の酵素である請求項１〜５に記載の製造方
法。
【請求項７】酵素がアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍ
ｏｂａｃｔｅｒ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、キャ
ンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロモバクテリウム
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フミコーラ
（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、シュード
モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属及びリゾプス（Ｒ
ｈｉｚｏｐｕｓ）属の微生物を起源とする酵素、豚膵臓
及び牛膵臓由来の酵素である請求項１〜５に記載の製造
方法。
【請求項８】酵素が、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏ
ｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生物もしく豚膵臓を起源とす
る酵素である請求項１〜５に記載の製造方法。