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JP2002539805A - 樹状細胞・腫瘍細胞または樹状細胞・ウイルス細胞由来免疫原を用いた抗原特異的ｔ細胞のインビトロ産生 - Google Patents

樹状細胞・腫瘍細胞または樹状細胞・ウイルス細胞由来免疫原を用いた抗原特異的ｔ細胞のインビトロ産生

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JP2002539805A
JP2002539805A JP2000607471A JP2000607471A JP2002539805A JP 2002539805 A JP2002539805 A JP 2002539805A JP 2000607471 A JP2000607471 A JP 2000607471A JP 2000607471 A JP2000607471 A JP 2000607471A JP 2002539805 A JP2002539805 A JP 2002539805A
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cell
tumor
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University of Pittsburgh
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Abstract

(57)【要約】 DCと腫瘍細胞またはウイルス感染細胞のいずれかとの組合せを含む製剤においてT細胞を培養することによって調製した抗原特異的T細胞を開示する。これらの製剤は一般的に、少なくとも１つの腫瘍細胞もしくは少なくとも１つのウイルス感染細胞のいずれかと融合した少なくとも１つの樹状細胞のハイブリドーマ、または樹状細胞と腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞のいずれかとの同時培養を含む。次に、得られたT細胞を、十分に確立された技術を用いて、腫瘍抗原を同定して、および動物モデルを確立するための物質として、自家抗原特異的T細胞の養子免疫細胞移入による免疫治療の方法において用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願の相互参照 本出願は、1997年２月27日に出願された米国特許出願第60/039,472号の優先権
を主張する、1998年２月26日に出願された米国特許出願第09/030,985号の一部継
続出願である。
【０００２】発明の分野 本発明は、一般的に、抗原特異的T細胞およびこの細胞を作製して用いる方法
に関する。より詳しく述べると、本発明は、樹状細胞と腫瘍細胞とのハイブリド
ーマ、または樹状細胞と腫瘍細胞との同時培養産物のいずれかを含む製剤に由来
する免疫原と共に同時培養することによって得られた抗原特異的T細胞に関する
。または、ウイルス感染細胞をこれらのハイブリドーマおよび同時培養において
腫瘍細胞の代わりに用いることができる。これらのT細胞を、腫瘍およびウイル
ス感染症に対する予防および治療物質として用いることもまた、本発明の主題で
ある。
【０００３】発明の背景 細胞障害性Tリンパ球（CTL）を含むT細胞は、腫瘍およびウイルス感染症に対
する有効なヒト免疫応答の重要な成分である。T細胞反応は、腫瘍およびウイル
スに対して保護するために十分であり、マウス腫瘍モデルおよびヒトにおいて確
立された癌でさえ消失させることができる。T細胞は、作用する標的細胞の表面
上のMHCクラスI分子によって提示された抗原性ペプチドの認識によって新生物細
胞またはウイルス感染細胞を破壊する。これらの抗原性ペプチドは、作用する細
胞のサイトゾルに存在する外来蛋白質の分解産物であり、これは内因性MHCクラ
スIプロセシング経路によって処理されてT細胞に提示される。CTLは、自己のMHC
クラスI分子とペプチド抗原からなるリガンドの認識によって腫瘍を標的とする
。したがって、CTL依存的抗腫瘍免疫方法の開発は、典型的にCTLによって認識さ
れる腫瘍抗原の同定と、有効な抗原輸送方法の開発の両者に依存する。
【０００４】 MHCクラスI分子の場合において外来蛋白質の認識は、CTLによる作用する標的
細胞の認識および破壊にとって十分である可能性があるが、Tリンパ球前駆細胞
から抗原特異的CTLを誘導するためには、さらなるシグナルを必要とする。専門
の抗原提示細胞（APC）は、抗原MHCクラスIリガンドとCTL媒介免疫の誘導におい
て必要な付属シグナルとを提供することができる。APCの全般的な特性には、MHC
クラスIおよびクラスII発現、APCリンパ球相互作用にとって重要な様々な接着分
子の発現、ならびにCD80およびCD86のような同時刺激分子の発現が含まれる。AP
Cには、例えば、マクロファージ、B細胞、皮膚表皮ランゲルハンス細胞、皮膚樹
状細胞、ならびにリンパ節および脾臓に常在する樹状細胞を含む樹状細胞が含ま
れる。樹状細胞（DC）は、最も強力なAPCであると考えられており、有効なCTL依
存的抗腫瘍免疫を誘導することができる。技法は、骨髄または末梢血由来前駆細
胞から樹状細胞の有意な量を得るために利用できる。
【０００５】 腫瘍細胞は、CTLによって認識されうる腫瘍特異的ペプチドMHC複合体のセット
を発現する可能性がある。しかし、進行性腫瘍は一般的に、少なくとも部分的に
、それらが同時刺激を提供することができないために、非免疫原性である。
【０００６】 グオら（Guo、Science 263：518〜520（1994））は、肝腫細胞と活性化B細胞
との融合によって生成された腫瘍ワクチンを開示する。活性化B細胞と腫瘍細胞
との融合は、腫瘍特異的な保護的腫瘍免疫を誘導することができる免疫原を産生
する。
【０００７】 メイヨドモら（Mayordomo、Nature Med. 1（12）：1297〜1302（1995））は、
関連する腫瘍のチャレンジに対して保護を提供するペプチドパルス樹状細胞のイ
ンビトロ培養を開示する。GM-CSF＋IL-4の存在下で培養して、ニワトリ卵白アル
ブミン（OVA）をトランスフェクトさせた樹状細胞は、OVA+腫瘍の確立を阻止す
ることができるが、トランスフェクトしていない親黒色腫は阻止することができ
ない。
【０００８】 フラマンドら（Flamand、Eur. J. Immunol. 24：605〜610（1994））は、ペプ
チド抗原BCL1によってパルスした樹状細胞のインビトロ培養と、その後のB細胞
腫瘍BCL1に対するT細胞依存的液性応答の誘導を開示した。類似の方法論は、セ
ルッチら（Celluzzi、J. Exp. Med. 183：203〜287（1996））によって報告され
ている。その場合、MHC Iペプチド抗原を樹状細胞上でパルスし；免疫した宿主
は、抗原遺伝子をトランスフェクトした腫瘍による致死的なチャレンジに対して
保護免疫を示した。
【０００９】 スら（Hsu、Nature Medicine 2：52〜58（1996））は、ワクチンとして腫瘍特
異的イディオタイプ蛋白質をパルスした樹状細胞を用いることを調べた。
【００１０】 セルッチ＆ファロ（Celluzzi ＆ Falo、J. Immunol. 3081〜3085（1998））は
、腫瘍細胞と融合した、または同時培養した樹状細胞を含む製剤を開示する。
【００１１】 ゴングら（Gong、Nature Med. 3：558（1997））は、樹状細胞とMC38癌細胞と
の融合を開示する。
【００１２】 米国特許第5,788,963号は、前立腺癌免疫治療のために樹状細胞の調製を開示
し；樹状細胞による抗原特異的T細胞の刺激を報告する。この特許は、樹状細胞
を、特異的な明確な前立腺癌抗原、またはこれらの抗原について可能性がある起
源として溶解物または分画溶解物に暴露することに限定しているように思われる
。この特許の方法論は、樹状細胞と腫瘍細胞全体もしくはウイルス感染細胞との
融合もしくは同時培養、または定義されていない抗原の使用を含まないように思
われる。
【００１３】 米国特許第5,846,827号は、CTLを活性化するためにペプチドをローディングし
た抗原提示細胞を用いる方法を報告する。この方法は、特異的な同定単離された
エピトープに暴露することによるインビボでの抗原提示細胞の改変に依存するよ
うに思われる。下記に開示するように、抗原特異的T細胞に関する如何なる開示
またはこれらのT細胞を産生する方法も存在しないように思われる。
【００１４】 上記の論文または特許のいずれも、本明細書に開示のような独自の抗原特異的
T細胞の産生を開示または示唆しないように思われる。さらに、これらのいずれ
も本発明の有意な長所、すなわち、特異的抗原を単離および／または同定する必
要がないという長所を提供しない。
【００１５】 多様な腫瘍タイプに対して保護的および治療免疫を提供する癌免疫療法が必要
とされている。多様なウイルス感染症に対して向けられるウイルス免疫治療も同
様に必要とされている。
【００１６】発明の概要 本発明は、抗原特異的T細胞およびこの細胞を作製および使用する方法を提供
することによって上記の必要性を満たしている。一般的に、T細胞は、樹状細胞
と腫瘍細胞またはウイルス感染細胞のいずれかとを含む製剤と共にT細胞を同時
培養することによって調製する。本発明の一つの態様は、１つまたはそれ以上の
ハイブリドーマを含む製剤を用い；それぞれのハイブリドーマはさらに、腫瘍細
胞またはウイルス感染細胞のいずれかの少なくとも１つと融合させた少なくとも
１つの樹状細胞を含む。本発明のもう一つの態様は、樹状細胞と腫瘍細胞または
ウイルス感染細胞のいずれかの同時培養産物を含む製剤を用いる。これらの製剤
はいずれも、製剤において用いられた腫瘍またはウイルスのタイプに対して特異
的な免疫原を産生する。これらの製剤のいずれかをT細胞と同時培養すると、抗
原特異的なT細胞が得られ、産生されたT細胞は、T細胞を同時培養した特定の抗
原を発現する細胞を認識して攻撃すると考えられる。腫瘍免疫治療の場合、産生
されたT細胞は、腫瘍チャレンジに対する保護と腫瘍増殖の退縮の双方を提供す
る。このように、本発明のT細胞は、製剤において用いられた腫瘍細胞によって
示されるタイプの腫瘍に対して予防的抵抗性を提供し、同様に、そのような腫瘍
を有する患者の治療的治療を提供する。同様に、ウイルス免疫治療の場合、産生
されたT細胞は、製剤において用いられるウイルス感染細胞によって引き起こさ
れるウイルス感染症に対して保護し、および／またはそのようなウイルス感染症
を有する患者にとって治療的軽減を提供する。
【００１７】 腫瘍細胞およびウイルス感染細胞は、T細胞によって標的とされうる抗原を発
現するが、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞そのものは、T細胞免疫を刺激しな
い。これは、腫瘍細胞とウイルス細胞が、おそらく同時刺激に関する適切な状況
において抗原または複数の抗原を提供することができないためであろう。その樹
状細胞（DC）が最も強力であると考えられる抗原提示細胞（APC）は、多様な同
時刺激分子とサイトカインを発現する。本発明は、腫瘍細胞またはウイルス感染
細胞のいずれかとDCを融合する、または同時培養する製剤を用いる。DCと腫瘍細
胞またはウイルス感染細胞との融合または同時培養によって、抗原は、「専門的
な」抗原提示細胞であるDCとの会合によってより免疫原性となる。融合産物と同
時培養産物は、DCと腫瘍またはウイルスのいずれかとの両者の特性を発現する。
次に、融合産物および同時培養産物をさらに、非刺激T細胞と同時培養する。こ
の同時培養のあいだに、T細胞を腫瘍細胞またはウイルス感染細胞のいずれかに
由来する抗原の完全なアレイに暴露する。その結果産生したT細胞は抗原特異的
であり、同じもしくは類似の腫瘍抗原発現する腫瘍細胞、または同じもしくは類
似のウイルス抗原を発現するウイルス感染細胞を破壊するであろう。
【００１８】 したがって、当業者によって理解されるように、本発明は、同時培養する抗原
を認識するように産生または操作されるT細胞を提供することによって、T細胞反
応を誘発する特異的抗原を同定する必要がない。腫瘍細胞またはウイルス感染細
胞によって産生された抗原のアレイ全体をT細胞に輸送および同時培養すること
によって、広い多価免疫治療のメカニズムが提供される。
【００１９】 したがって、本発明の目的は、抗原特異的T細胞を提供することである。
【００２０】 本発明のさらなる目的は、抗原特異的T細胞を含む薬学的組成物を提供するこ
とである。
【００２１】 本発明のさらなる目的は、抗原特異的T細胞によって患者の治療方法を提供す
ることである。
【００２２】 本発明のさらにもう一つの目的は、癌およびウイルス感染症の予防および／ま
たは治療的治療方法を提供することである。
【００２３】 本発明のもう一つの目的は、腫瘍またはウイルス抗原を同定するために用いる
ことができる抗原特異的T細胞を提供することである。
【００２４】 本発明のこれらおよびその他の目的は、下記に示す本発明の説明からより十分
に理解されるであろう。
【００２５】発明の詳細な説明 本発明は、患者からの樹状細胞、好ましくは同じ患者からの樹状細胞をインビ
トロで腫瘍細胞と組みあわせる段階；患者からのT細胞に、DCおよび腫瘍細胞を
組みあわせたものを加える段階；T細胞/DC/腫瘍細胞混合物を培養する段階；な
らびに同時培養からT細胞を回収する段階によって腫瘍抗原特異的T細胞を作製す
る方法に向けられる。本発明はさらに、ウイルス抗原特異的T細胞が得られる、
腫瘍細胞ではなくてウイルス感染細胞を使用する類似の方法に向けられる。これ
らの方法のいずれかに従って調製したT細胞もまた、本発明の範囲内である。本
発明に従って調製したT細胞は、腫瘍またはウイルス感染症のリスクがあるか、
またはそれらを有する患者に対する予防的および治療的軽減を提供する上で有効
性を示した。
【００２６】 本発明の第一の段階は、患者からの樹状細胞を、腫瘍細胞またはウイルス感染
細胞のいずれかと組みあわせる段階を含む。好ましくは腫瘍細胞またはウイルス
感染細胞は同じ患者から得る。細胞は、当技術分野で既知の任意の方法によって
組みあわせることができる。本発明の方法において用いることが好ましいのは、
DCと罹患細胞との融合およびDCと罹患細胞との同時培養である。本明細書に用い
られるように、「罹患細胞」または「複数の罹患細胞」という用語は、腫瘍細胞
またはウイルス感染細胞のいずれかを一般的に意味し；罹患細胞は、産生すべき
T細胞の特定のタイプおよび望ましい免疫治療のタイプに応じて、応用によって
変化するであろう。
【００２７】 したがって、一つの態様において、DCと罹患細胞を融合させてハイブリドーマ
を形成する。当業者によって認識されるように、ハイブリドーマは、少なくとも
２つの異なる種類の細胞の物理的組合せである。少なくとも２つの異なるハイブ
リドーマ、すなわち、少なくとも１つのDCと１つの腫瘍細胞とのハイブリドーマ
、および少なくとも１つのDCと少なくとも１つのウイルス感染細胞とのハイブリ
ドーマが本発明の範囲内に入る。
【００２８】 本発明の１つの態様に従って、本発明の方法の第一の段階において、１つまた
はそれ以上の樹状細胞を１つまたはそれ以上の腫瘍細胞と融合させて、ハイブリ
ドーマまたは融合産物を形成する。樹状細胞と腫瘍細胞との任意の開始比を用い
ることもできる。例えば、開始比は、１：10〜10：１、１：100〜100：１、また
はそれ以上となりうる。好ましい態様において、この融合産物は、樹状細胞対腫
瘍細胞の開始比が約６：１で作製され；この開始比はDC／腫瘍細胞ハイブリドー
マの十分数を提供することが判明した。好ましくは、DCの数が多ければ、腫瘍細
胞が少なくとも１つのDDと融合される確率が増加することから、DC腫瘍細胞比は
多数のDCを含む。当業者によって認識されるように、１つまたはそれ以上のDCは
、１つまたはそれ以上の腫瘍細胞と融合することができる。このように本発明の
第一の段階において調製したハイブリドーマは、一定範囲のDC：腫瘍細胞比を有
しうる。例えば、DC腫瘍細胞比６：１で開始すると、得られたハイブリドーマは
、約１：１〜10：１またはそれ以上のDC：腫瘍細胞比を有しうると思われる。
【００２９】 如何なるタイプのDCも用いることができる。DCは、抗原を提示することができ
る細胞である、抗原提示細胞（「APC」）の１つのタイプであると認識される。D
Cは、体内の至る所に認められ、これには、皮膚表皮ランゲルハンス細胞、皮膚
樹状細胞、リンパ節および脾臓に常在する樹状細胞、ならびに前駆体のインビト
ロ培養によって得られた樹状細胞が含まれる。樹状細胞は、当技術分野で既知の
如何なる手段によっても宿主から得ることができる。例えば、樹状細胞は、セル
ッチら（Celluzzi、J. Exp. Med. 183：283〜287（1996））の方法に従って骨髄
から得ることができる。DCはまた、末梢血および皮膚から得ることができる。血
液由来のDCは、本発明において用いられる好ましいDCである。
【００３０】 黒色腫、肺癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌および子宮頚癌を含むがこれらに限定
されることはない、如何なるタイプの腫瘍細胞も用いることができる。自己腫瘍
の単細胞懸濁液が得られる可能性がある腫瘍細胞が好ましい。さらに、自己腫瘍
細胞が好ましいが、同種異系腫瘍細胞株も腫瘍抗原の起源として用いることがで
きる。特定の腫瘍抗原が１人より多くの患者から得られた腫瘍細胞に存在するこ
とを認めうることは当技術分野で周知である。これらはしばしば、「共有」腫瘍
抗原と呼ばれる。本発明において、同種異系腫瘍細胞は、これらの細胞が患者の
腫瘍にも存在する「共有」腫瘍抗原を含みうるため、抗原の起源として用いるこ
とができる。本発明において用いる場合、腫瘍細胞は、例えば、放射線照射また
は類似の処置によって本製剤において用いられる前または後に処置することがで
きる。
【００３１】 本発明のもう一つの態様に従って、１つまたはそれ以上のDCは、１つまたはそ
れ以上のウイルス感染細胞と融合する。DC/腫瘍細胞融合に関して、DCとウイル
ス感染細胞との如何なる開始比も用いることができる。好ましくは、この比は、
ウイルス感染細胞の全てと１つまたはそれ以上のDCとの融合を可能にするように
十分である。インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、サイト
メガロウイルス（CMV）、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、および単純ヘルペスウイ
ルス（HSV）に感染した細胞を含むがこれらに限定されることはない如何なるウ
イルス感染細胞も用いることができる。
【００３２】 本発明のハイブリドーマまたは融合産物は、当技術分野で既知の如何なる方法
によっても作製することができる。好ましい態様において、DC腫瘍細胞またはDC
ウイルス感染細胞ハイブリドーマは、ポリエチレングリコール（PEG）によって
２つのタイプの細胞を融合することによって作製される。一般的に、この方法は
、DCと罹患細胞を同じ容器に加えて、細胞懸濁液を遠心してペレットを形成する
ことを含む。約37℃に加熱した50％PEG溶液約１ mlを徐々にペレットに加えなけ
ればならない。ペレット／PEGは緩く攪拌しながら、PBSによって徐々に希釈する
。次に、融合細胞を遠心によって洗浄して、上清をデカントして捨て、融合産物
を形成する。
【００３３】 本発明の方法における第一の段階は、DCと罹患細胞とをインビトロで組みあわ
せる段階、および２つの細胞タイプを共に融合するよりむしろ、混合物を同時培
養することによって得ることができる。本明細書において用いられるように、「
同時培養」という用語は、少なくとも２つの異なる細胞タイプを同時に培養する
ことを意味し、この場合DCと罹患細胞のみ、または非刺激T細胞とのさらなる組
み合わせも意味する。DCと腫瘍細胞またはウイルス感染細胞のいずれかとの同時
培養は、DCと腫瘍またはウイルス感染細胞のいずれかとを単純に培養することに
よって調製することができ；すなわち、２つの細胞タイプを単純に混合して共に
インキュベートすることができる。当技術分野で既知の細胞を同時培養する如何
なる方法も用いることができるが、好ましい方法論において、２つの細胞タイプ
を組み合わせて遠心させて、ペレットを形成する。次に、ペレットを培養培地、
好ましくはRPMIまたはAIM 5によって希釈して、約37℃で５％CO2インキュベータ
で一晩インキュベートする。ハイブリドーマ作製に関して、DCと罹患細胞との如
何なる比も用いることができ；約１：100〜100：１のあいだの比が好ましく、約
１：10〜10：１の比がより好ましく、約６：１の比が最も好ましい。同時培養産
物は、選択段階を行わずに、本発明の方法において用いることができることは、
当業者によって認識されるであろう。
【００３４】 本明細書において用いられるように、「同時培養産物」または「複数の同時培
養産物」という用語は、罹患細胞とDCとの同時培養から得られたものを意味し、
例えば、共に融合する腫瘍細胞と樹状細胞、内在化されるかもしくは抗原性の腫
瘍成分もしくは腫瘍細胞の他の成分に会合するようになる樹状細胞、内在化され
るかもしくは抗原提示機能に適切な関連する樹状細胞成分に、または上記の細胞
のいずれかに由来する非細胞成分を含みうる。したがって、これらの用語は、同
時培養の際に、腫瘍抗原と、T細胞に対する抗原提示にとって必要な分子とを含
む刺激物質細胞複合体が形成されることを反映していると理解される。同じこと
がウイルス感染細胞を用いる場合にも当てはまる。
【００３５】 DCと罹患細胞の融合産物または同時培養のいずれかの調製後、患者からのT細
胞を樹状細胞／罹患細胞の組合せに加えなければならない。DCと同様に、T細胞
、および好ましい態様において罹患細胞は、同じ患者に全て由来しなければなら
ない。このように、DC、罹患細胞、およびT細胞は好ましくは全て自己であり、
本発明に従って産生されたT細胞によって最終的に処置される患者から得られな
ければならない。自己細胞を用いることによって、患者毎に異なり、疾患毎に異
なりうる、様々な腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に独自の特異的抗原を同定お
よび特徴付けする必要がなくなる。本発明に従って調製されたT細胞は、それら
は抗原と共に同時培養されているために、各宿主によって産生された特定の抗原
のターゲティング能を有する。さらに、同種異系腫瘍細胞を用いれば、「共有」
抗原は同時培養に存在するであろう。
【００３６】 本明細書において用いられるように「T細胞」という用語は、当業者によって
理解されるであろう。この用語には、標的細胞を溶解することができる、または
その結果標的細胞死、または抗標的イフェクター活性の産生もしくは増強が起こ
りうるサイトカイン分泌のようなイフェクターまたはヘルパー機能を提供するこ
とができるCD8+またはCD4+ T細胞が含まれるがこれらに限定されることはない。
しかし、本発明は、これらの実施例に限定されると解釈されず、当技術分野で既
知の如何なるT細胞を本発明に従って用いることができる。好ましくはT細胞は非
刺激T細胞前駆体である。
【００３７】 T細胞は、脾臓組織、リンパ節、末梢血、腫瘍、腹水、皮膚生検、およびCNS液
体を含むがこれらに限定されることはない如何なる適した起源からも得ることが
できる。宿主からT細胞を回収する如何なる方法も用いることができる。例えば
、フィコール・パック（Ficoll-Paque）（ファルマシア社から販売）によって遠
心した末梢血単核球（PBMC）を用いることができる。またはMACまたはダイナビ
ーズを用いるような免疫アフィニティ技術によって単離された精製CD4+またはCD
8+ T細胞を用いることができる。T細胞を得る適当な方法は、例えば、チューテ
ィングら（Tuting、J. Immunol. 160：1139〜1147（1998））に開示されている
。
【００３８】 次に、回収されたT細胞を、樹状細胞と罹患細胞との融合産物または同時培養
産物を含む培地に加えなければならない。T細胞：樹状細胞の10：１から100：１
の比が好ましいが、他の適した比も本発明の範囲内に含まれる。
【００３９】 T細胞、樹状細胞、または腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞のいずれかの混
合物を培養しなければならない。細胞を培養培地において７〜10日培養して、同
一に調製したDC/罹患細胞刺激剤によって７〜10日間隔で再刺激することができ
る。培養物はこのプロトコールを用いて無限に維持してもよい。培養培地は好ま
しくは、FCSまたはHABS（０〜10％）およびインターロイキン-2（５〜100 IU/ml
）を加えたRPMIまたはAIM-V培地である。最後の刺激の約５〜10日後、T細胞は細
胞障害性およびサイトカイン放出アッセイ法に関して分析する、または増殖に基
づくアッセイ法の場合には最後の刺激から３〜５日後に分析する。
【００４０】 同時培養からT細胞を回収することは、当技術分野で既知の如何なる手段によ
っても行うことができる。例えば、回収は、フラスコまたはプレートからの培養
細胞を遠心管にピペットによって移すことによって単純に行うことができる。遠
心後、細胞をペレットから回収して、読み取りアッセイ法において用いる（すな
わち、細胞障害性、サイトカイン放出、および増殖アッセイ法）。より詳しく述
べると、CD4+およびCD8+ T細胞は、上記のように免疫アフィニティ技法を用いて
選択的に回収することができる。典型的に、インビトロ刺激の２〜３ラウンド後
では、T細胞のみが培養に存在する。T細胞は、特異的抗原のプローブとして患者
を治療する方法、および免疫学の技術分野の研究において有用な動物モデルを確
立する方法を含む、多様な如何なる方法でも用いることができる。
【００４１】 したがって、本発明は、患者からの樹状細胞を罹患細胞とインビトロで組み合
わせる段階；患者からの非刺激T細胞前駆体を樹状細胞／罹患細胞の組合せに加
える段階；混合物を同時培養する段階；混合物からT細胞を回収する段階；およ
び回収したT細胞の有効量を哺乳類宿主に投与する段階を含む、宿主において免
疫治療を行う方法にも向けられる。本明細書において用いられるように、「宿主
」、「哺乳類宿主」、および「患者」という用語は、ヒトを含むがこれらに限定
されることはない、適切な細胞が抽出される生物および／または本発明の方法に
よって処置される生物を意味する。「免疫治療」には、特定のタイプの癌の高リ
スク群の患者のように、腫瘍に対する感受性が高い患者の予防的治療が含まれる
と理解されるべきであり；「免疫治療」には、腫瘍を有する患者の治療的治療も
含まれる。上記のようにDCと腫瘍細胞を用いることができる。用いられる腫瘍細
胞のタイプは、治療が投与される癌のタイプに依存することはさらに認識される
であろう。例えば、黒色腫に対する予防的抵抗性を提供するように患者を治療す
る場合、黒色腫細胞を用いなければならない。患者自身の黒色腫細胞、または共
有抗原を含む同種異系黒色腫細胞を用いるべきである。「免疫治療」にはまた、
ウイルス感染症の前の患者の予防的治療と、ウイルス感染症を有する患者の治療
的治療の双方が含まれる。上記の如何なるDCおよびウイルス感染細胞も用いるこ
とができる。この場合も、ウイルス感染細胞のタイプは、治療を提供するウイル
ス感染症によって変化するであろう。
【００４２】 本発明の方法に従って産生したT細胞の有効量は、治療すべき宿主に投与すべ
きである。本明細書において用いられるように、「有効量」という用語は、患者
に望ましいレベルの予防的抵抗性または治療的軽減をもたらすT細胞の量のよう
な、望ましい免疫治療を得るためのT細胞の量を意味する。
【００４３】 当業者によって認識されるように、有効量は、使用が予防的または治療的であ
るか否かによらず、腫瘍もしくは複数の腫瘍のサイズおよび／または重症度、ウ
イルス感染症のタイプおよび／または重症度、患者の体格および体重等のような
変数に応じて患者毎に異なるであろう。抗原特異的T細胞の最小用量でさえ、患
者に対して恩典を提供するであろう。各患者にとって有効量を決定することは、
当業者の技術の範囲内であり；治療あたりの典型的な最高用量は、T細胞約1011
個であろう。治療される患者に応じて、これより高いまたは低い用量は、用いる
ことができる。治療回数はまた、治療される患者、治療される疾患、治療に対す
る患者の反応等に依存するであろう。この場合も、適当な回数治療を決定するこ
とは当業者の能力範囲内である。
【００４４】 T細胞は、T細胞と共に調製した薬学的組成物を用いることを含むがこれらに限
定されることはない、当技術分野で既知の如何なる手段によっても宿主に導入す
ることができる。例えば、T細胞は、適した薬学的担体と組み合わせることがで
きる。適合性の問題が生じない限り、如何なる適した薬学的担体も用いることが
できる。好ましい担体は、生理食塩液、燐酸緩衝生理食塩液（PBS）、およびT細
胞増殖因子を含む培地である。T細胞組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、リン
パ内、皮内、皮下、および腫瘍内に投与することができる。
【００４５】 本発明のT細胞はまた、腫瘍またはウイルス抗原を同定するためにも利用でき
る。T細胞を刺激するために腫瘍細胞を用いる場合、T細胞は、腫瘍抗原の同定に
おいて有用であり、T細胞を刺激するためにウイルス感染細胞を用いる場合、T細
胞はウイルス抗原を同定するために有用であると理解される。例えば、T細胞は
、ストークスら（Storkus、J. Immunol. 151：3719〜3727（1993））およびファ
ンデルブルッゲンら（van der Bruggen、Science 254：1643〜1647（1991））に
開示されるように、特異的腫瘍ペプチドまたは腫瘍遺伝子産物を同定するための
指標試薬として用いてもよい。抗原提示細胞（樹状細胞または形質転換細胞株）
に、腫瘍細胞から抽出した分画したペプチドをローディングして（ストークスら
（Storkus、1993）、本発明に従って調製したT細胞との反応性を分析してもよい
（細胞障害性、増殖、サイトカイン放出等）。T細胞によって認識されるペプチ
ドプールは、プール内の個々のペプチドの配列を同定するために、質量分析また
はエドマン分解シークエンシング法を用いて分析してもよい。これらの配列に類
似する合成ペプチドを作製してT細胞反応性に関して試験してもよく、明確に認
識されたペプチドは可能性があるワクチン成分を構成する。または、腫瘍由来DN
AもしくはcDNAをDCまたは形質転換細胞株（ファンデルブルッゲン（van der Bru
ggen）、1991）にトランスフェクトしてもよく、得られたトランスフェクタント
を、本発明の方法によって得られたT細胞によって認識されるか否かをスクリー
ニングしてもよい。T細胞によって認識される標的から抽出したトランスフェク
トDNAをシークエンシングしてもよく、得られた腫瘍関連遺伝子／遺伝子産物は
、可能性がある遺伝子ワクチン成分を構成する。さらに、これらの遺伝子産物に
由来するペプチドも同様に、ペプチドに基づくワクチンおよび治療の成分として
作用してもよい。
【００４６】 T細胞はまた、動物モデルを作製するために用いる場合にも、本発明に従って
作製することができる。そのようなモデルは、例えば、治療すべき宿主に対する
様々なタイプの免疫治療の様々な作用を調べるために有用であろう。例えば、T
細胞は、セルッチ＆ファロ（Celluzzi and Falo、J. Immunol. 3081〜3085（199
8））が概要するように、マウスにおいてインビボで誘導してもよく、それによ
って腫瘍のワクチン接種と治療が得られる。または、本発明を用いて、抗原特異
的T細胞はエクスビボで産生してもよく、増殖した細胞を担癌マウスもしくは患
者、またはウイルス感染患者に養子免疫細胞移入してもよい。マウスモデルは保
護的および治療的系の両者を評価できることから、このアプローチは様々な治療
の方法論の可能性がある臨床での有効性を確認するための代理系を定義するため
に役立つ。
【００４７】 本発明のT細胞を用いる場合、本発明の免疫治療によって、免疫した哺乳類宿
主における腫瘍特異的溶解活性の誘導が起こる。すなわち、予防的または治療的
治療は、DC/腫瘍細胞ハイブリドーマまたは同時培養において用いられる腫瘍の
タイプに対して特異的となるであろう。そのような免疫は、腫瘍のチャレンジか
ら患者を保護するおよび／または確立された腫瘍の退縮が起こる。同様に、予防
的または治療的治療は、用いられるウイルスのタイプに対して特異的となり、ウ
イルスチャレンジから患者を保護する、および／またはウイルス感染症の減少が
起こると考えられる。このように、免疫治療の本方法は、個々の抗原を単離およ
び特徴付けする必要がない。したがって、本発明は、抗原特異的T細胞をインビ
トロで産生するための迅速で、安価で有効な技術を提供する。これらのT細胞は
、腫瘍またはウイルス感染症を有する患者において、自己抗原特異的T細胞の養
子免疫細胞移入によって免疫治療として用いることができる。
【００４８】実施例 以下の実施例は、本発明を説明すると解釈され、いずれにせよ、本発明を制限
すると解釈してはならない。実施例において用いたマウスは、５〜８週齢の雌性
C57BL/6マウスであり、メイン州バーハーバーのジャクソンラボラトリーから購
入した。B16は、メリーランド州ロックビルのATCCから得たC57BL/6黒色腫（H-2b ）であり、3LLも同様にATCCから入手した肺癌である。細胞サブセットを枯渇す
るために用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマGK 1.5（抗-CD4、AT
CC T1B 207）、2.43（抗CD8、ATCC T1B 210）、30-H12（抗-Thy 1.2、ATCC T1B1
07）、B220（抗B細胞表面糖蛋白質、ATCC T1B 146）およびピッツバーグ大学医
学部のチャンバース（W. Cahmbers）から得たNK1.1から調製した。
【００４９】実施例１−DCと腫瘍細胞の融合 樹状細胞は、参考文献に記述するように、GM-CSFを用いてセルッチら（Celluz
zi、J. Exp. Med. 183：283〜287（1996））において一般的に記述されているよ
うに骨髄から調製した。簡単に説明すると、骨髄細胞は、リンパ球を枯渇して、
カリフォルニア州サンタアナのアーバイン・サイエンティフィック社から得た10
％FCS-含有RPMI 1640中で５×105個/mlで培養し、顆粒球・マクロファージコロ
ニー刺激因子（GM-CSF）は、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社から得
て103 U/mlの濃度で加えた。緩く接着した細胞を融合のために６日目に採取した
。フローサイトメトリーによって決定すると、約50〜75％のDCがCD86（B7.2）お
よびクラスII MHC（I-A+）抗原を発現した。
【００５０】 ６日目のDCを、DC対腫瘍細胞の比が６：１でB16または3LL細胞のいずれかと融
合した。遠心によって洗浄した後、融合細胞をRPMI 1640（10％FCS）中で37℃で
一晩培養した。
【００５１】実施例２−樹状細胞と腫瘍細胞同時培養の調製 樹状細胞は、実施例１の方法に従って調製した。６日目の樹状細胞を用いてB1
6細胞または3LL細胞のいずれかと同時培養を行った。各DC／腫瘍細胞同時培養は
、DCを各腫瘍細胞を含む試験管に加えることによって調製した。遠心によって細
胞のペレットを形成した。次に、ペレットをRPMI（10％FCS）によって希釈して
、５％CO2インキュベータ内で約37℃で一晩インキュベートした。DC：腫瘍細胞
比は、約６：１であった。同時培養産物を調製して、DCとの密接に会合した腫瘍
抗原が存在するか否かをさらに評価して、そしてDC上に存在する腫瘍から可溶性
の因子が放出されるか否かを評価した。
【００５２】実施例３−融合および同時培養の効率 融合と同時培養の効率を調べるために、細胞タイプのそれぞれ、DC、B16およ
び3LLを、融合前に異なる親油性蛍光色素によって染色して、フローサイトメト
リーによって分析した。腫瘍細胞はDiOによって染色したが、DCは、DiIによって
染色し、そのいずれもオレゴン州ユージーンのモレキュラープローブ社から得た
。十分に洗浄した後、細胞を融合または同時培養して、37℃で一晩インキュベー
トした。回収した細胞を２％パラホルムアルデヒド中で固定して、カリフォルニ
ア州サンホセのベクトン・ディッキンソンイムノサイトメトリーシステムズ社か
ら入手したアルゴン／HeNe２色レーザーを備えたベクトン・ディッキンソンファ
クスタープラスによって前方および側方散乱パターンを測定した。
【００５３】 各細胞タイプの散乱パターンを図１に示す。個々の細胞染色は、非染色対照（
示していない）と比較して、上方にシフトするDC（DiI）（図1Aの左上）または
右にシフトするB16腫瘍細胞（DiO）（図1Bの右下）の２つの明確なパターンを示
している。細胞を同時培養（図1C）または融合（図1D）すると、パターンはいず
れも右および上にシフトした。このことは、それらの細胞が二重染色されたこと
を示している。この右上４分の１を、腫瘍抗原と樹状細胞との会合の「効率」の
指標として用いた。左上または右下に存在する細胞は、単染色細胞として見なし
、測定に含めなかった。これらの標準物質によって、会合効率はかなり高く、同
時培養群での約70％から総ゲート細胞の融合群での約53％に及ぶ。
【００５４】実施例４−抗原特異的T細胞の調製 黒色腫は、ヒトHLA-A2+患者から切除して、消化して単細胞懸濁液を作製して
、凍結保存した。樹状細胞は、一般的にチューティングら（Tuting、J. Immunol
. 160：1139〜1147（1998））が述べた技法に従って、rhIL-4およびrhGmCSFを含
むAIM V培地中での培養によって末梢血に由来した。７日目、腫瘍細胞を融解し
、放射線を照射して（15,000 rad）、７日目のDC培養に加えた。腫瘍細胞とDCと
を37℃で24時間「同時培養」した。DC：腫瘍細胞比は、約10：１であった。同時
培養した細胞は、ピペットによって回収して、3,000 radで放射線照射した。回
収した細胞を、刺激物質として約10：１〜100：１の比で（T細胞：DC）T細胞培
養に毎週加えた。45日後、腫瘍ペプチドをパルスしたT2細胞（図２）または腫瘍
細胞株標的（図３）の溶解能に関して、T細胞を評価した。標的はHLA-A2マッチ
同種異系黒色腫標的であった（すなわち、Mc1526）。図２は、通常認識されない
T細胞株が、黒色腫によって発現された蛋白質（MART-1、gp100、チロシナーゼ等
）に由来するペプチドをローディングすると認識されるようになることを示して
いる。図２に示した結果は、本発明のDC・腫瘍刺激物質を用いて広いアレイの腫
瘍関連抗原を認識するT細胞の増殖を促進することができることを示している。
同じ考え方は、ウイルス関連抗原に対するDC・ウイルス感染細胞刺激物質にも当
てはまるであろう。このように、本発明のT細胞は、広い範囲の反応性を有し；
腫瘍細胞またはウイルス感染細胞は、インビボで免疫選択圧に基づいて個々の抗
原の発現を調節しようとする可能性があるため、これは臨床の状況において特に
適用可能である。図３は、本発明のT細胞をHLA-A2マッチ黒色腫標的（Mc1526）
の溶解能に関して評価した場合に得られた結果を示す。T細胞は標的を有効に殺
し；この殺作用は、HLA-2分子に結合する抗体（BB7.2およびW6/32）によって遮
断することができ、これらの増殖したT細胞培養におけるT細胞のHLA-A2クラス1
制限を示している。T-2細胞株はHLA-A2マッチ標的である。従って、図に示した
結果は、無傷の黒色腫およびHLA-A2によって提示された定義されたペプチドエピ
トープの両者に対して向けられたHLA-A2制限CTL活性の根拠となる。
【００５５】 本発明の特定の態様を説明を目的としてこれまで述べてきたが、本発明の詳細
に関しては多数の変更が含まれ、それらも添付の特許請求の範囲に定義される本
発明の範囲に含まれることは、当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例３に記載するように、腫瘍細胞成分と樹状細胞との会合の
効率を示すフロー標識パターンを示す。
【図２】 実施例４に記載するように、ペプチド負荷細胞の特異的溶解％を
示す。
【図３】 実施例４に記載するように、腫瘍細胞の溶解％を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 15/09 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/02 15/00 Ｂ 1/68 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ファロ ルイス ディ． ジュニア アメリカ合衆国 ペンシルベニア州 ウェ ックスフォード ティンバーグレン ドラ イブ 2698 (72)発明者 ストーカス ウォルター アメリカ合衆国 ペンシルベニア州 グレ ンシャウ マウント ロイヤル ブールバ ード 3303 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 GA04 GA11 4B063 QA05 QA18 QQ08 QQ13 QQ79 QR32 QR77 QR80 QS14 4B065 AA92X AA94X AB05 AB06 BA08 BB28 BC01 CA44 4C087 BB37 DA03 MA17 MA66 NA14 ZB26 ZB33

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の段階を含む、抗原特異的T細胞を産生する方法： a） 第一の細胞が自己樹状細胞であって、第二の細胞が腫瘍細胞およびウイ
    ルス感染細胞を含む群より選択される、少なくとも１つの第一の細胞を少なくと
    も１つの第二の細胞とインビトロで組み合わせる段階； b） 段階a）の組合せに自己T細胞を加える段階； c） 段階b）の混合物を培養する段階；および d） 段階c）の混合物からT細胞を回収する段階。
  2. 【請求項２】 樹状細胞が、皮膚表皮ランゲルハンス細胞、皮膚樹状細胞、
    リンパ節樹状細胞、脾臓樹状細胞、前駆細胞のインビトロ培養に由来する樹状細
    胞および血液由来樹状細胞を含む群より選択される、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 第二の細胞が自己細胞および同種異系細胞を含む群より選択
    される、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 腫瘍細胞が黒色腫癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細
    胞、結腸癌細胞、および子宮頚癌細胞を含む群より選択される、請求項１記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 ウイルス感染細胞が、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不
    全ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、および単純ヘルペス
    ウイルスに感染した細胞を含む群より選択される、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 第一の細胞と第二の細胞が融合してハイブリドーマが作製さ
    れる、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 ハイブリドーマが第一の細胞対第二の細胞を約１：100〜100
    ：１の比で含む、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 ハイブリドーマが第一の細胞対第二の細胞を約６：１の比で
    含む、請求項６記載の方法。
  9. 【請求項９】 第一の細胞および第二の細胞が同時培養される、請求項１記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】 同時培養が第一の細胞対第二の細胞を約１：100〜100：１
    の比で含む、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 同時培養が第一の細胞対第二の細胞を約６：１の比で含む
    、請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 T細胞がT細胞対樹状細胞の比約10：１〜100：１で加えら
    れる、請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 T細胞が非刺激T細胞前駆体である、請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１の方法に従って調製された抗原特異的T細胞。
  15. 【請求項１５】 樹状細胞が、皮膚表皮ランゲルハンス細胞、皮膚樹状細胞
    、リンパ節樹状細胞、脾臓樹状細胞、前駆細胞のインビトロ培養に由来する樹状
    細胞および血液由来樹状細胞を含む群より選択される、請求項14記載のT細胞。
  16. 【請求項１６】 第二の細胞が自己細胞と同種異系細胞とを含む群より選択
    される、請求項14記載のT細胞。
  17. 【請求項１７】 腫瘍細胞が、黒色腫細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌
    細胞、結腸癌細胞、および子宮頚癌細胞を含む群より選択される、請求項14記載
    のT細胞。
  18. 【請求項１８】 ウイルス感染細胞が、インフルエンザウイルス、ヒト免疫
    不全ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、および単純ヘルペ
    スウイルスに感染した細胞を含む群より選択される、請求項14記載のT細胞。
  19. 【請求項１９】 樹状細胞が血液由来樹状細胞であって、腫瘍細胞が自己腫
    瘍の単細胞懸濁液を得てもよい細胞である、請求項15記載のT細胞。
  20. 【請求項２０】 以下の段階を含む宿主において免疫治療を行う方法： 該宿主に請求項14記載のT細胞の有効量を投与する段階。
  21. 【請求項２１】 第二の細胞が腫瘍細胞であって、投与によって、宿主にお
    いて腫瘍細胞に対する免疫治療が行われる、請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】 第二の細胞がウイルス感染細胞であって、投与によって宿
    主においてウイルス感染細胞に対する免疫治療が行われる、請求項20記載の方法
    。
  23. 【請求項２３】 樹状細胞が、皮膚表皮ランゲルハンス細胞、皮膚樹状細胞
    、リンパ節樹状細胞、脾臓樹状細胞、前駆細胞のインビトロ培養に由来する樹状
    細胞および血液由来樹状細胞を含む群より選択される、請求項20記載のT細胞。
  24. 【請求項２４】 腫瘍細胞が、黒色腫細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌
    細胞、結腸癌細胞、および子宮頚癌細胞を含む群より選択される、請求項20記載
    のT細胞。
  25. 【請求項２５】 ウイルス感染細胞が、インフルエンザウイルス、ヒト免疫
    不全ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、および単純ヘルペ
    スウイルスに感染した細胞を含む群より選択される、請求項22記載の方法。
  26. 【請求項２６】 T細胞が適した薬学的担体に含まれる、請求項20記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 有効量が細胞1011個またはそれ未満である、請求項20記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】 以下の段階を含む、抗原を同定する方法： a） 腫瘍細胞から抽出したペプチドを抗原提示細胞にローディングする段階
    ； b） 請求項14記載のT細胞に対する抗原提示細胞の反応性を分析する段階；お
    よび c） T細胞によって認識されるペプチドを同定する段階。
  29. 【請求項２９】 以下の段階をさらに含む、請求項28記載の方法： d） 段階c）の個々のペプチドをシークエンシングする段階。
  30. 【請求項３０】 以下の段階をさらに含む、請求項29記載の方法： e） 段階d）の配列に対応する合成ペプチドを調製する段階。
  31. 【請求項３１】 以下の段階をさらに含む、請求項30記載の方法： f） 段階e）の合成ペプチドを含む製剤を調製する段階。
  32. 【請求項３２】 以下の段階を含む、抗原を同定する方法： a） 腫瘍由来DNAまたは腫瘍由来cDNAを細胞にトランスフェクトする段階； b） 請求項14記載のT細胞によって認識されうるか否かに関して段階a）のト
    ランスフェクトした細胞をスクリーニングする段階；および c） 段階b）の認識された細胞からトランスフェクトしたDNAまたはcDNAを抽
    出する段階。
  33. 【請求項３３】 以下の段階をさらに含む、請求項32記載の方法： d） 段階c）の抽出されたDNAをシークエンシングする段階。
  34. 【請求項３４】 以下の段階をさらに含む、請求項33記載の方法： e） 段階d）の配列に対応する合成ペプチドを調製する段階。
  35. 【請求項３５】 以下の段階をさらに含む、請求項34記載の方法： f） 段階e）の合成ペプチドを含む製剤を調製する段階。
  36. 【請求項３６】 請求項14記載の１つまたはそれ以上のT細胞を担癌宿主に
    移入する段階を含む、免疫治療を調べるための動物モデルを作製する方法。
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