JP2002539458A

JP2002539458A - 唾液中のａｐｏａおよびａｐｏｂ、ならびにそれらの比を検出するための方法およびデバイス

Info

Publication number: JP2002539458A
Application number: JP2000605216A
Authority: JP
Inventors: ジュディスフィッツパトリック，; レジーナビー．レンダ，; クリストファーエル．ジョーンズ，
Original assignee: セレックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-03-16
Filing date: 2000-03-16
Publication date: 2002-11-19
Also published as: US20030003501A1; WO2000055635A1; EP1161689A1; CA2366309A1; CA2366309C; US6808889B2; AU762931B2; AU3886100A

Abstract

(57)【要約】唾液中のアポリポタンパク質Ａ−１およびＢのレベル（これれは、それぞれ、血清中のＨＤＬおよびＬＤＬのレベルに関連する）を検出するための方法が開発された。刺激されていない唾液において、ＡｐｏＡ対ＡｐｏＢの比は、血清中のＨＤＬ対ＬＤＬの比に関連する。アルブミンを使用して、希釈のためのサンプルと正規化し得る。収集部位で実施され得る簡単で迅速な試験との組合せの高度の相関は、心臓疾患の個々の危険度をモニタリングするための費用効果のある患者に優しい手段を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明は一般に、唾液におけるアポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ）についてのアッセイの分野にある。

【０００２】冠状動脈疾患（ＣＡＤ）は、大部分の先進国における罹患率および死亡率の主
な原因である。危険性のある個体を同定するための多数のマーカーおよび試験が
利用可能であり、その中には、脂質マーカー（例えば、総コレステロールおよび
種々の循環タンパク質に結合したコレステロール）についての血液試験がある。
このような試験の結果に基づいて、適切な予防的または治療的な処置（食事の改
変および運動を含む）を開始して、より重篤なＣＡＤに進行するのを妨げ得るか
または逆転させ得る。

【０００３】血漿リポタンパク質は、合成部位および吸収部位から貯蔵部位および／または
利用部位への脂質のキャリアである。リポタンパク質は、トリグリセリドおよび
コレステロールエステルをそのコアに、ならびにリン脂質、非エステル化コレス
テロールおよびアポリポタンパク質の層を表面に有する、球状粒子である。これ
らは、水和密度に基づいて以下のような５つの主なクラスに分類される：カイロ
ミクロンとして公知の非常に大きなトリグリセリドリッチな粒子（０．９５ｇ／
ｍｌ未満）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ、０．９５ｇ／ｍｌ〜１．００
６ｇ／ｍｌ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ、１．００６ｇ／ｍｌ〜１．０
１９ｇ／ｍｌ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ、１．０１９ｇ／ｍｌ〜１．０
６３ｇ／ｍｌ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ、１．０６３ｇ／ｍｌ〜１
．２１０ｇ／ｍｌ）（ＯｓｂｏｒｎｅおよびＢｒｅｗｅｒ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．
Ｃｈｅｍ．３１：２５３−３３７（１９７７）；Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｃ．ら、Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：７５１−７７７（１９７８））。

【０００４】アポリポタンパク質は、以下の３つの主な機能を有するリポタンパク質のタン
パク質成分である：（１）リポタンパク質粒子の安定性維持、（２）リポタンパ
ク質に作用する酵素についての補因子としての作用、および（３）レセプター媒
介機構によるリポタンパク質の循環からの除去。４つの群のアポリポタンパク質
は、アポリポタンパク質Ａ（ＡｐｏＡ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ
）、アポリポタンパク質Ｃ（ＡｐｏＣ）およびアポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏ
Ｅ）である。３つの群Ａ、ＢおよびＣの各々は、２以上の別個のタンパク質から
なる。これらは、以下である：ＡｐｏＡについては：ＡｐｏＡ−Ｉ、Ａｐｏ
Ａ−ＩＩおよびＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢについては：ＡｐｏＢ−１００
およびＡｐｏＢ−４８；そしてＡｐｏＣについては：ＡｐｏＣ−Ｉ、Ａｐ
ｏＣ−ＩＩおよびＡｐｏＣ−ＩＩＩ。ＡｐｏＥとしては、いくつかのアイ
ソフォームが挙げられる。リポタンパク質の各々のクラスは、唯一のアポリポタ
ンパク質としてＡｐｏＢ−１００を含むＬＤＬを除いて異なった比率の種々の
アポリポタンパク質を含む。ＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−ＩＩは、ＨＤＬ
の約９０パーセントのタンパク質部分を構成し、他方、ＡｐｏＣおよびＡｐｏ
Ｅは、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＨＤＬ中に種々の比率で存在
する。ＡｐｏＢ−１００は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＩＤＬ中に存在する。Ａ
ｐｏＢ−４８は、カイロミクロンおよびいわゆるカイロミクロンレムナントの
みに存在する（Ｋａｎｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２９：
１２３−１２９（１９８６））。

【０００５】総血漿または血清コレステロール（Ｃ）は、伝統的にＣＡＤの主なスクリーニ
ングおよび指標であるが、血清リポタンパク質プロフィール（ＨＤＬ、ＬＤＬ、
ＶＬＤＬ、リポタンパク質Ａを含む）へと、特にＬＤＬ／ＨＤＬまたは総Ｃ／Ｈ
ＤＬ比（これらは、ＣＡＤの発生率および重篤度とより良好に相関すると示され
ている）へと近年重みが移っている。ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＶＬＤＬレムナン
トのアテローム発生可能性とは対照的に、ＨＤＬは、ＣＨＤと逆に相関し、その
結果、低濃度のＨＤＬ−Ｃを有する個体は、ＣＨＤの増加した発生率を有する（
Ｇｏｒｄｏｎ，Ｔ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，６２：７０７−７１４（１９７７
）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．Ｅ．ら，Ｌａｎｃｅｔ，１：９６５−９６８（１９７７
）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｊ．およびＭｉｌｌｅｒ，Ｎ．Ｅ．，Ｌａｎｃｅｔ，１
：１６−１９（１９７５））。

【０００６】これらのマーカーのスクリーニングおよびモニタリングについての非常に多数
の手動および自動の方法が利用可能である。しかし、これらの試験の全ては、注
射器によって採血された静脈血またはいくつかの場合には針（ｎｅｅｄｌｅｐ
ｒｉｃｋ）によって得られた毛細管血のいずれかを必要とする。両方の方法は侵
襲性であり、そして多くの個体に対して不快であり、そして（好ましくは医者の
オフィスにおける）訓練を受けたプロの人員によって最良に行われて、誤った結
果を最小にする。血液製剤の取り扱いおよび廃棄はまた、感染性因子および病原
体からの潜在的危険を含む。

【０００７】従って、侵襲性手順を必要としない、より安全な代替的標本を提供することが
非常に望ましい。さらに、理想的な分析方法またはデバイスは、収集点（「ＰＯ
Ｃ」）診断について最小のコストで迅速かつ信頼性の高い結果を提供するべきで
ある。

【０００８】血清中に出現する大部分の分析物はまた、唾液にも出現するが、そのレベルは
血清レベルのごく一部である。唾液への分析物の輸送は、細胞内輸送（拡散また
は受動輸送）または細胞外輸送（能動輸送）によって行われ得る。脂質溶解性で
ある物質は、細胞区画を通しての拡散によって唾液へと入る（Ｈａｅｋｃｅｌ，
Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９４，１２８−１４２（１９９３））。

【０００９】唾液は、診断液として利用されていない。なぜなら、唾液をアッセイ形態に適
応させる際に多くの問題が伴うからである。例えば、充分なサンプルを収集する
ことは困難である：大部分の試験は、少なくとも１ｍｌの唾液の収集を必要とす
る。なぜなら、濾過および取り扱いの間にかなりの損失が存在するからである。
これは、平均３〜５分間の唾液分泌を必要とし、このことを大部分の人は快く行
うわけではない。９５％の若者についての平均流速は、０．３５ｍｌ／分〜０．
３８ｍｌ／分である（Ｋ．Ｄｉｅｍら（編）ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴａｂｌｅ
ｓ（Ｃｉｂａ−ＧｅｉｇｙＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ１９７０）６４
３頁。さらに、アッセイのために唾液サンプルを調製する唾液サンプルの取り扱
いは、退屈でかつ不愉快の両方である。唾液は一般に、ムコ多糖を除去し、かつ
流動および取り扱いを可能にするために濾過しなければならない。利用可能な収
集デバイスは、コットンパッドを利用して、口内の唾液を吸収させる。従って、
このパッドは、唾液を収集しかつ加工するように作用し、唾液をアッセイのため
に調製する。次いで、このパッドは、保存剤を含む一定の容量の流体に入れられ
、そして分析のために研究室に輸送される。保存液は、（存在した場合）どれだ
けの量の唾液が収集されそしてこの保存剤に添加されたかを知るのを不可能にし
て定量を妨げる。このデバイスが研究室に届いたとき、技術者は、遠心分離また
は濾過のいずれかによってパッドおよびムコ多糖を除去しなければならない。こ
れは、時間がかかりかつ不快な仕事である。少量の唾液サンプルおよび唾液中の
低レベルの分析物は通常、唾液サンプルが、自動分析器によって分析できないが
、高感度のＥｌｉｓａまたはＲＩＡ（これらの方法はいずれも労力を要する試験
である）においてアッセイしなければならないことを意味する。

【００１０】唾液の多くの研究は、分析物のレベルが分泌腺および収集の方法（例えば、刺
激状態の流れ対正常な流れ）で変化することを示している。概説としては、Ｓａ
ｌｉｖａａｓａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＦｌｕｉｄ（Ｄ．Ｍａｌｍｕｄお
よびＬ．Ｔｏｂａｋ編、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第６９４Ｄ巻（１
９９３））ならびにＪ．Ｏ．Ｔｅｎｕｖｕｏ（編）ＨｕｍａｎＳａｌｉｖａ：
ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（
ＣＲＣＰｒｅｓｓＩｎｃ．１９８９）第Ｉ巻および第ＩＩ巻を参照のこと。
従って、唾液中で報告されている脂質レベルの有意な変動は、大部分が収集方法
に起因することが推定される。コレステロールのレベルもまた、血清中で見られ
るレベルの約１／４００から約１／５０のレベルまで低い。Ｂｒｏｎｉｓｌａｗ
ら「ＬｉｐｉｄｓｏｆＳａｌｉｖａａｎｄＳａｌｉｖａｒｙＣｏｎｃ
ｒｅｔｉｏｎｓ」、ＨｕｍａｎＳａｌｉｖａ：ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉ
ｓｔｒｙａｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＲＣＰｒｅｓｓＩｎｃ．
１９８９）第ＩＩ巻、１２１−１４５。従って、個々のサンプル中のレベルは、
唾液中の脂質の慣用的なアッセイにおける従来的な血清アッセイのためには低す
ぎ、従って、感受性の高いイムノアッセイの使用または大量の唾液のいずれかが
必要とされる。Ｊ．Ｃ．Ｔｏｕｃｈｓｔｏｎｅら、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ
ｏｆＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ」、Ａｄｖ．Ｔ
ｈｉｎ．ＬａｙｅｒＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、Ｐｒｏｃ．Ｂｉｅｎｎ．Ｓｙｍ
ｐ．ＭｅｅｔｉｎｇＤａｔｅ１９８０（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ第２版
、１９８２）は、全コレステロールおよび脂質を測定した。さらに、一日の中の
時刻に依存しそして日によるレベルの変動（８％未満）が存在し、朝の試料中で
最も高いレベルでありそして日中を通してはより低い。このことは、唾液中のコ
レステロール試験は、一日の同じ時刻に行うべきことを示唆する。

【００１１】唾液を使用することに伴う別の問題は、唾液が口腔微生物叢でひどく汚染され
ていることである。利用可能な収集デバイスは、細菌の増殖を遅らせる高レベル
の防腐剤を提供するが、サンプルが注意深く保存される場合（例えば、凍結によ
る）を除いては、サンプルはしばしば腐敗し、そして実験室の技術者は、しばし
ば、唾液を加工することを避ける。さらに、高レベルの防腐剤は多くのアッセイ
に干渉し得る。唾液はまた、唾液起源および細菌起源の両方の多くのタンパク質
および酵素を含む。時を経ると、これらの酵素およびタンパク質は、目的の分析
物と相互作用し得、そしていくつかの分析物のアッセイを不可能にし得る。従っ
て、原則として、貯蔵されたサンプルは、保存添加物および条件が分析物のため
に最適化されない限りは、正確な結果を生じることが期待され得ない。

【００１２】文献は、コレステロールが唾液中に存在するが、そのレベルは大きく変化する
ことを報告している。例えば、平均５．６ｍｇ／Ｌが、Ｂ．Ｌａｒｓｓｏｎら、
「ＬｉｐｉｄｓｉｎＨｕｍａｎＳａｌｉｖａ」、Ａｒｃｈｓ．Ｏｒａｌ．
Ｂｉｏｌ．４１（１）、１０５−１１０（１９９６）によって報告され；平均１
５ｍｇ／Ｌが耳下腺および顎下腺の唾液分泌物の両方について、Ｓｌｏｍｉａｒ
ｙら、Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．６１（１）、２４−２７（１９８３）によって報
告され；そして６９ｍｇ／ＬがＲａｂｉｎｏｗｉｔｚら、Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．
Ｂｉｏｌ．２０（７）、４０３−４０６（１９７５）によって報告された。

【００１３】上述のように、ＬＤＬ：ＨＤＬ比は、冠状動脈疾患の危険性の確立された予測
指標である。最近のＮＣＥＰガイドラインは、全コレステロールよりもむしろ比
の使用を要請している。受容可能な全コレステロールレベルを有するがＬＤＬ：
ＨＤＬの比が３．５より大きいヒトは、より低い比を有する対照よりも冠状動脈
疾患を有することが５０％よりありそうであることが報告された。総コレステロ
ールが比に取って代わられるのは時間の問題である。

【００１４】ＨＤＬおよびＬＤＬと結合するリポタンパク質についてのイムノアッセイは、
これらの２つの画分におけるコレステロールの比の測定と相関することが示され
た。Ｎ．Ｒｉｆａｉら（編）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
ｏｆＬｉｐｉｄｓ、ＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＡｐｏｌｉｐｏｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ（ＡＡＣＣＰｒｅｓｓ１９９４）１１４頁。この結果は、ＨＤ
Ｌ画分およびＬＤＬ画分が物理的に分離および測定される方法と相関する（Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＬｉｐｉｄｓ、Ｌｉｐｏｐ
ｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、１９９４、Ｎ．Ｒ
ｉｆａｉおよびＲ．Ｗａｒｎｉｃｋ編、ＡＡＣＣＰｒｅｓｓ）。

【００１５】唾液腺コレステロールが会合しているタンパク質は、血清中のタンパク質（す
なわち、ＡｐｏＡＩおよびＡＰｏＢＩＩ）と同様であるか否かは知られていない
。唾液脂質がリポタンパク質とともに腺により分泌されることは、すべての研究
から明らかである（Ｂｅｌｍｏｎｔ）（Ｍａｎｄｅｌら、Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．
Ｂｉｏｌ．１４（２）、２３１−２３３（１９６９））。Ｓｌｏｍｉａｎｙらも
また、唾液中の脂質がタンパク質と会合していることを実証した。しかし、唾液
中の脂質の起源またはそれらの物理的状態についての刊行された文献は存在しな
い（Ｌａｒｓｓｏｎら）。従って、初期の文献からは、唾液脂質が唾液腺におい
てデノボ合成されるのか、または血清に由来するのかどうかは明らかではなく；
そして、それらが血清由来である場合、唾液リポタンパク質が血清中のＬＤＬお
よびＨＤＬを結合するアポタンパクと同じであるか否かは明らかではない。脂質
ともまた会合する、他の唾液糖タンパク質が存在する。唾液中の脂質粒子の構造
が血清中の脂質粒子の構造と同じか否か、およびアポリポタンパク質のコンホメ
ーションが唾液中で血清中と同じであるか否かは文献からは明らかではない。Ｒ
ａｂｉｎｏｗｉｔｚは、腺によって分泌される脂質が、リポタンパク質と会合し
て分泌されることを示唆している。彼は、脂質レベルが刺激を受けた唾液におい
て下がるが、互いに同じ比を保持することを実証した。Ｌａｒｓｓｏｎは、唾液
リポタンパク質画分が、血清リポパク質よりもより高い密度であることを報告し
、そして唾液脂質は、異なって凝集すると結論付けている。

【００１６】種々の研究は、コレステロールの唾液レベルが血清コレステロールレベルと全
体的な相関を示すことを示した（Ｌｏｃｈｎｅｒ，Ａ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏ
ｎＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９８５）第４６巻、＃
５Ｂ）。高コレステロール血症を有する人物の間に、ポジティブな相関が存在す
ることもまた、観察された。Ｓｌｏｍｉａｎｙら、Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２７（１０）、８０３−８０８（１９８２）およびＭｕｒｔｙら、ＲＣＳ
Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１０（５）３５９（１９８２）。血清および唾液のコレステロ
ールを相関付ける研究が不十分であることは、コレステロールをアッセイするた
め、従って血清と唾液とを相関付けるための、利用可能な方法は、感度が低すぎ
るという事実に起因し得る。コレステロールを検出する酵素的方法およびクロマ
トグラフ的方法は、唾液中で利用可能ではない、高いレベルに依存する。従って
、これらの方法は、大量の唾液を必要とし、そして脂質の研究は、一般に、プー
ルしたものに対してなされた。唾液中のコレステロールの測定は、さらに複雑で
ある。なぜなら、唾液は、多量のペルオキシダーゼ（いくつかのコレステロール
アッセイの酵素成分）を含むからである。

【００１７】従って、本発明の課題は、ＣＡＤ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、および／またはＬＤＬ：
ＨＤＬの比のマーカーを検出するための、非侵襲性の、装置を用いない（ｎｏｎ
−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ）、正確な、単純な、かつ費用効果的な方法を提供
することである。

【００１８】（発明の要旨）唾液中のアポリポタンパク質Ａ−１およびＢのレベル（これは、それぞれ血清
中のＨＤＬおよびＬＤＬのレベルと相関する）を検出するための方法を開発した
。刺激されていない唾液中では、ＡｐｏＢに対するＡｐｏＡの比は、血清中
のＬＤＬに対するＨＤＬの比に相関する。刺激された唾液中では、アルブミンに
対して正規化されたＡｐｏＢのレベルは、血清ＡｐｏＢと血清ＬＤＬとの両
方に相関する。収集の部位において実施され得る単純な迅速な試験との組み合わ
せにおける高度な相関は、個体の心臓病の危険性をモニターするための、費用効
果的な、患者にフレンドリーな手段を提供する。好ましい実施形態において、唾
液生成は、ブレスミントまたはすっぱい溶液（例えば、レモン）のような手段に
より刺激され、そして希釈の効果は、アルブミンを参照して制御される。最も好
ましい実施形態においては、アッセイは、米国特許第５，７１０，００９号、同
第５，５００，３７５号、および同第５，４５１，５０４号に記載されるような
、Ｓｅｒｅｘ積層したストリップの形式を使用して実施される、免疫アッセイで
ある。これらのストリップは有利である。なぜなら、これらのストリップは、収
集およびアッセイのデバイスとして作用し、サンプルがストリップ試験に直接適
用され、そして分析手順の一体化した部分として処理されるので、取り扱いを非
常に単純化するからである。この方法は、２００マイクロリットル未満を必要と
し、これは、平均的な人物の口中でいつでも入手可能であるはずである。しかし
、さらなる唾液生成が、ブレスミントまたはすっぱい汁（例えば、レモン汁）を
使用して得られ得る。ＰＯＣにおける唾液のアッセイは、サンプルを貯蔵するた
めの防腐剤の必要性を排除し、そして口の微生物叢による汚染の問題を完全に回
避する。なぜなら、このアッセイは、唾液収集から１０分以内で完了し得るから
である。

【００１９】（発明の詳細な説明）ＡｐｏＡおよびＡｐｏＢの両方が唾液中に存在するが、これらのタンパク
質は、唾液酵素もしくは細菌または両方によるリポタンパク質の分解に恐らく起
因して、非常に新鮮なサンプル中を除いて、電気泳動によっても免疫アッセイに
よっても検出可能ではないことが、ここで実証された。このことは、他の研究が
なぜこれらのタンパク質を観察しなかったかを説明する；なぜなら、これらの方
法は、コレステロールを酵素的な方法により検出し、そしてこのために必要とさ
れる時間で、これらのタンパク質は分解したからである。

【００２０】（Ｉ．アポリポタンパク質の検出のための試薬）抗体は、文献において公知であり、そして市販の供給元およびＡＴＣＣから入
手可能である。

【００２１】（ＡｐｏＢに対する抗体）（ＰａｎＢに対する抗体）Ｄ₆ＭＡｂは、Ｋｏｒｅｎ，Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ．８７６：９１〜１００（１９８６）；Ｋｏｒｅｎ，Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．８７６：１０１〜１０７（１９８６）に記載さ
れるように、ヒト血漿中の全てのＡｐｏＢ含有リポタンパク質（詳細には、Ａ
ｐｏＢ−４８およびＡｐｏＢ−１００を含む）に等しく結合し、そして高親
和性である抗体である：Ｄ₆は、ＡｐｏＢのアミノ末端半分に位置するエピト
ープに結合し、そしてＢ−４８およびＢ−１００の両方を認識する。

【００２２】（ＡｐｏＢ−１００に対する抗体）ＡｐｏＢ−１００に対するモノクローナル抗体を産生する従来の様式として
は、ＬＤＬを用いるマウスの免疫が挙げられる。このアプローチは、都合がよい
。なぜなら、このアプローチは、ＬＤＬを単離するのが比較的簡単であるからで
ある。しかし、免疫原としてＬＤＬを使用して産生されたモノクローナル抗体は
、ＬＤＬ粒子の脂質の組成におけるバリエーションにより生じる、ＡｐｏＢ−
１００のコンホメーションの変化に感受性の傾向がある。例えば、ＡｐｏＢ−
１００エピトープは、種々の量のトリグリセリドの存在に起因して、多数の抗Ａ
ｐｏＢモノクローナル抗体とは、それほど反応性ではない（Ｋｅｉｄａｒ，Ｓ
．ら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，３９：２８１〜２８８（１９９０）；Ｇａｌｅａ
ｎｏ，Ｎ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：５１１〜５１９（１９９
４）；Ｈａｒｄｕｉｎ，Ｐ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．，１３
：５２９〜５３５（１９９３））。

【００２３】ＯｋｌａｈｏｍａＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏ
ｎによるＰＣＴＰＣＴ／ＵＳ９５／０８３３１「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ
ＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓａｎ
ｄＭｅｔｈｏｄｓｏｆＵｓｅｔｈｅｒｅｏｆ」は、それらの脂質の組成
および／またはコンホメーションにおける潜在的なバリエーションにもかかわら
ず、ＬＤＬの選択的な認識およびＬＤＬ粒子との高くかつ不変の反応性を提供す
る抗体（すなわち、脂質含量により影響されない、安定な、コンホメーションと
は無関係のエピトープを認識し、かつ全てのＬＤＬ粒子で等しく発現されるが、
ＶＬＤＬおよびカイロミクロンにおいて接近不能である抗体）を記載している。
ＨＢ₃ｃＢ₃は、Ｂ−１００のＴ２カルボキシ末端領域付近のエピトープに排他的
に結合し、そしてＢ−４８を認識しない。ＨＢ₃ｃＢ₃により認識されるエピトー
プは、ＶＬＤＬに存在する脂質および／または他のアポリポタンパク質によって
コンホメーション的に変化またはマスクされ得る。カイロミクロンは、ＨＢ₃ｃ
Ｂ₃によって認識されない。なぜなら、それらは、ＡｐｏＢ−１００を欠損す
るからである。ＨＢ₃ｃＢ₃抗体およびこの抗体から誘導されるＬＤＬ結合フラグ
メントが、ＬＤＬに対するその特異性および他のリポタンパク質との交叉反応性
の欠落のために、本明細書中に記載される全ての組成物および方法において、Ｌ
ＤＬ特異的結合分子として使用され得る。

【００２４】２つの他のＬＤＬ特異的モノクローナル抗体が、Ｍｉｌｎｅ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９７５４〜１９７６０（１９８９）；ならびにＬ
ａＢｅｌｌｅらによるＷＯ９３／１８０６７、およびＬａＢｅｌｌｅ，Ｍ．
ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９１：１５３〜１６０（１９９０）（８
Ａ２．１および４Ｂ５．６）によって記載されている。

【００２５】（ＡｐｏＡ−Ｉに対する抗体）ＡｐｏＡ−Ｉに対する２つの抗体（これは、高親和性でＨＤＬに結合し、そ
して任意の他のリポタンパク質密度クラスとの無視し得る反応性を示す）もまた
、ＯＭＲＦによるＰＣＴＰＣＴ／ＵＳ９５／０８３３１に記載されている。２
つの抗ＡｐｏＡ−Ｉモノクローナル抗体（ＡＩｂＤ₅およびＡＩｂＥ₂）は、立
体的に離れたエピトープに結合する。なぜなら、それらは、脂質除去ＡｐｏＡ
−Ｉおよび精製ＡｐｏＡ−ＩともインタクトなＨＤＬ粒子ともいずれかともそ
れらの結合において互いに競合しないからである。ＡｐｏＡ−Ｉに対する両方
のモノクローナル抗体は、脂質除去ＡｐｏＡ−ＩおよびＨＤＬに高親和性で結
合し、そしてＬＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロンおよびＡｐｏＡ−ＩＩ、Ｃ−
ＩＩＩおよびＥに対する無視し得る結合を示すか、またはそれらに対する結合を
示さない。

【００２６】（ＡｐｏＡ−ＩＩに対する抗体）ＡｐｏＡ−ＩＩに対するモノクローナル抗体ＣｄＢ₅（これは、ＨＤＬに
高親和性で結合し、そして血漿または血清由来のＡｐｏＡ−ＩＩを含む全ての
ＨＤＬ粒子（ＬＰ−Ａ−Ｉ：Ａ−ＩＩ粒子）を除去し得、ＡｐｏＡ−ＩＩを含
まないＨＤＬ粒子（ＬＰ−Ａ−Ｉ粒子）をインタクトなままにする）は、Ｋｏｒ
ｅｎ，Ｅ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，６：５２１ａ（１９８６）
；Ａｌａｕｐｏｖｉｃ，Ｐ．ら、Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．，３２：９〜１９（
１９９１）に記載されている。

【００２７】（ＡｐｏＣ−ＩＩＩに対する抗体）ＡｐｏＣ−ＩＩＩに対するＭＡｂであるＸｂＡ₃（これは、ＶＬＤＬ粒子の
定量に有用である）は、Ｋｏｒｅｎ，Ｅ．ら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ
，９５：１５７〜１７０（１９９２）により記載されている。

【００２８】（ＡｐｏＥに対する抗体）ＡｐｏＥに対する２つのモノクローナル抗体は、Ｋｏｒｅｎ，Ｅ．ら、Ａｔ
ｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，９５：１５７〜１７０（１９９２）により記載さ
れている。これらのうちの一方のＥｆＢ₁は、ＶＬＤＬに付随しているＡｐｏ
Ｅ（これは、ヘパリンにより沈殿される）を好ましく結合し、一方、他方（Ｅｆ
Ｄ₃）は、サンプルのヘパリン処理により沈殿しないＨＤＬ中のＡｐｏＥに優
先的に結合する。

【００２９】（ＩＩ．サンプルの調製）好ましい実施形態において、唾液は、収集され、ムコポリサッカリドを除去す
るために綿または類似の孔サイズのフィルターを通してろ過され、そしてアッセ
イされるまで４℃に冷やして維持される。好ましくは、このサンプルは、収集後
３時間以内にアッセイされる。保存剤およびプロテアーゼまたは他の酵素インヒ
ビターが、このサンプルに添加され得る。

【００３０】（ＩＩＩ．サンプルの同時の収集、調製およびアッセイ）代替の実施形態において、一体化した収集およびアッセイデバイスが、使用さ
れ得る。Ｓｅｒｅｘ，Ｉｎｃ．によるＰＣＴＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２５６「
ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎａｎｄＡｓｓａｙＤｅｖｉ
ｃｅｆｏｒＳａｌｉｖａａｎｄＢｌｏｏｄ」に記載されるように、この
デバイスは、流体コレクター、処理および計測パッドならびに／またはフィルタ
ー、および１以上のアッセイストリップを備え得る。流体コレクターは、唾液ま
たは血液の収集に適合され得る。アッセイストリップは、現在使用されている任
意の型であり得る。ニトロセルロースが、好ましい材料である。好ましくは、ア
ッセイストリップは、米国特許第５，５００，３７５号に記載されるような、積
層計量棒である。

【００３１】好ましい実施形態において、このデバイスは、ステム部分および漏斗部分を有
するホルダーを備える。１つの実施形態において、ホルダーは、ステム部分でと
もに積層される、プラスチックの二重シートであり得る。例えば、ホルダーは、
ポリエチレンまたは別の透明な可撓性プラスチックから作製され得る。漏斗部分
は、ステム部分に下に伸びる側方の封鎖を形成するように、縁上で封鎖される。
従って、開口端収集「漏斗」は、ステム部分と流体連絡している漏斗部分に形成
される。デバイスの頚部、または漏斗部分とステム部分との接合部は、処理およ
び計測パッドである。このパッドは、好ましくは、サンプルからの口腔片および
ムコポリサッカリドをろ過するように働く吸着パッドまたはスポンジである。こ
れは、任意の適切な材料、好ましくは、線維質、最も好ましくは、セルロースま
たはセルロース誘導体のような材料から形成され得る。いくつかの実施形態にお
いて、この材料は、荷電され得るか、またはフィルターを通して分離または通過
をもたらす物質を含み得る。例えば、パッドはまた、緩衝液および試薬（例えば
、解離剤または粘膜溶解剤）ならびに必要とされ得る界面活性剤を含み得る。パ
ッドはさらに、アッセイストリップに移されるサンプルの量を計測するように働
く。これは、パッドのサイズ、形状、間隙率および組成（サンプル容量の分離お
よび計測の最適化に必要とされるように調整され得る）の選択によって達成され
る。

【００３２】デバイスは、１以上のアッセイストリップを備える。これらは、サンプル中の
複数の検体の測定の場合には、同じ材料でも異なる材料でもよい。アッセイスト
リップは、パッドからステム部分に伸びている。アッセイストリップは、パッド
と流体連絡している膜を支持するキャリアを備える。アッセイストリップは、任
意のクロマトグラフィーアッセイストリップであり得るが、好ましくは、米国特
許第５，５００，３７５号および同第５，７１０，００９号に記載されるように
設計される。最も好ましい実施形態において、膜は、処理または計測パッドに隣
接するサンプル適用領域を備えるニトロセルロースストリップである。この膜は
さらに、例えば、可動域上に固定された、移動可能な標識された試薬を有する可
動域を備える。この膜はまた、１以上の捕捉域を備える。３つは、例えば、アッ
セイの設計に依存して、未反応の検体または標識された検体を捕捉するための種
々の試薬を含む。この好ましい実施形態において、この膜はさらに、１以上の捕
捉域と同じであり得る、１以上の検出域を備える。検出域に重なるホルダーの区
画は、好ましくは、アッセイの結果が読み取られ得るように透明である。

【００３３】（ＩＶ．他のイムノアッセイ）唾液中のアポリポタンパク質は、任意の多数の異なるアッセイ（ＥＬＩＳＡお
よび自動化免疫濁度測定アッセイ、ならびに従来の技術を使用して作製された計
量棒を含む）を使用して測定され得る。

【００３４】（ＥＬＩＳＡ）ＥＬＩＳＡにおいて、サンプルは、マイクロタイタープレートにおける別々の
ウェルに配置され、そしてこのウェルの壁に吸着させられる。次いで、このウェ
ルは、抗原により結合されないウェルの壁の領域を覆うために、ブロッキング剤
（例えば、ウシ血清アルブミンまたは脱脂乳タンパク質）で処理される。次いで
、抗体が、適切な緩衝液において、１以上の濃度でこのウェルに添加され、そし
てマイクロタイタープレートは、抗体が各々のウェルの壁に吸着された抗原を結
合することを可能にする適切な条件下でインキュベートされる。次いで、ウェル
中の抗原（すなわち、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＢなど）に結合した抗体の存在が
、ウェル中のアポリポタンパク質に結合した抗体を結合する、標準的な酵素結合
体化抗−抗体を使用して検出され得る。次いで、ウェル（その中で、抗体が抗原
に結合している）は、抗−抗体に結合体化した酵素に発色基質を添加すること、
および光学デバイス（例えば、ＥＬＩＳＡプレートリーダー）によって検出され
る発色によって同定される。

【００３５】他の検出系（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン系）もまた、使用され得
る。この系において、１つの抗体（アポリポタンパク質と免疫反応性の抗体、ま
たは特定の抗体と免疫反応性の抗体のいずれか）が、ビオチン化される。非ビオ
チン化抗体は、アポリポタンパク質またはリポタンパク質抗原でコーティングさ
れたウェルとインキュベートされる。コーティングされた抗原に結合したビオチ
ン化抗体の量は、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体および発色基質
を使用して決定される。

【００３６】あるいは、抗体は、イムノアッセイでの使用についての任意の多くの蛍光化合
物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ユーロピウム、ルシファーイ
エロー、ローダミンＢイソチオシアネート）を使用して標識され得る（Ｗｏｏｄ
，Ｐ．：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＩｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，３６５〜３
９２頁（１９９１））。抗体−抗原複合体の分離についての公知の技術とともに
、これらの蛍光団が、アポリポタンパク質を定量するために使用され得る。同じ
ものが、化学発光イムノアッセイに適用され、この場合、抗体またはアポリポタ
ンパク質は、イソルミノールまたはアクリジニウムエステルで標識され得る（Ｋ
ｒｏｄｅｌ，Ｅ．ら：ＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＣｈｅｍｉｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ＣｕｒｒｅｎｔＳｔａｔｕｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅ
ｙａｎｄＳｏｎｓＩｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ，１０７〜１１０頁（１９９
１）；Ｗｅｅｋｓ，Ｉ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９：１４８０〜１４８３（
１９８３））。ラジオイムノアッセイ（Ｋａｓｈｙａｐ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：１７１〜１８０（１９７７））は、抗体が放射性同
位体（例えば、¹²⁵Ｉ）での標識後に使用され得る別の技術である。これらのイ
ムノアッセイのいくつかは、適切な機器（例えば、蛍光イムノアッセイについて
は、ＩＭｘ^TM（Ａｂｂｏｔｔ，Ｉｒｖｉｎｇ，ＴＸ）、および化学発光イムノア
ッセイについては、ＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇＡＣＳ１８０^TM（Ｃｉｂａ
Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，ＭＡ））の使用によって容易に自動化され
得る。

【００３７】（免疫沈降）免疫沈降は、複合体混合物中の少量のタンパク質を、その抗体との相互作用に
よって同定する別の手段である。存在する抗原の量は、光学的検出手段（例えば
、分光光度計）を使用して、溶液の濁り度における変化によって決定され得るか
、またはその沈降物を単離し、そして抗体上の標識の検出（代表的には、ＥＬＩ
ＳＡを使用して）、蛍光標識の測定、または放射標識の測定によって測定され得
る。抗体が抗原を沈降させない場合、沈降は、第２の抗−抗体または同じ抗原と
免疫反応性の第２の抗体を使用して増強され得る。

【００３８】例えば、ＬＤＬについての免疫濁度（ｉｍｍｕｎｏｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉ
ｃ）アッセイにおいて、好ましくは、ＬＤＬを排他的に沈降させ得る単一のモノ
クローナル抗体を使用する。単一のモノクローナル抗体は、一般に、それらが免
疫反応性を示す抗原を沈降させない。従って、同じ抗原と免疫反応性である２以
上のモノクローナル抗体を使用して、抗原を沈降させ得る。ＬＤＬの定量のため
に、ＬＤＬに特異的な２つのモノクローナル抗体を使用する。有用な抗体として
は、Ｋｏｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６、２７３４−２７４０（１
９８７）によって記載される、ＷｂＡ５３ａＣ１−Ａ６のような別の抗体と組み
合わせたＨＢ３ｃＢ３が挙げられる。これは、他の血漿リポタンパク質（例えば
、ＶＬＤＬおよびＨＤＬ）に影響することなく、ＬＤＬの免疫沈降を生じる。

【００３９】さらに、上記のような、その特定のタンパク質への互いの結合に干渉しない、
２つの異なるモノクローナル抗体が利用可能であるか、またはＭＡｂおよびポリ
クローナル抗体が、その特定のタンパク質に利用可能であり、かつそのＭＡｂを
、そのポリクローナル抗体の前にその特定のタンパク質を結合させるか、のいず
れかの条件で、上記のサンドイッチ法を使用して、特定のサンプル中の目的の任
意の血液タンパク質を検出し得る。

【００４０】上記のように、抗ＬＤＬモノクローナル抗体（例えば、ＨＢ３ｃＢ３）が、抗
体−抗原沈降技術および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）における、Ｌ
ＤＬ−コレステロールの定量に有用である。例えば、沈降方法において、抗ＬＤ
ＬＭＡｂを、ヒト血清またはヒト血漿に添加し、そしてＬＤＬに結合させる。
次いで、抗−ＬＤＬＭＡｂに結合されたＬＤＬの免疫複合体を、過量のプロテ
インＡまたは抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体中に混合させることによって、
沈降させる。この複合体の沈降は、その混合物を遠心分離し、次いで上清を捨て
ることによって増強される。次いで、そのＬＤＬを含む沈降物を洗浄し、そして
ＰＢＳ中の８Ｍ尿素に溶解させるか、または界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００およびコール酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））で処理
する。この後、コレステロールについての酵素アッセイ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、ＬＤＬ−コレステロールを決定する。

【００４１】抗体は、本明細書中に記載のアッセイにおける使用のために、固相材料に結合
され得る。種々の型の吸着材料（例えば、ニトロセルロース、Ｉｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ^TM、ポリフッ化ビニリデン（全て、ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ製
））が、抗リポタンパク質抗体を結合するための固相材料として使用され得る。
他の固相材料（ポリスチレン、ポリプロピレンまたは他の合成ポリマー材料から
作製された、樹脂およびウェルプレートまたは他の材料を含む）もまた、使用さ
れ得る。リポタンパク質濃度をアッセイするための好ましい実施形態において、
これらの材料の小片またはストリップを、患者サンプルにおける使用のために、
ＨＤＬ、ＬＤＬ、他のリポタンパク質またはアポリポタンパク質の特異的エピト
ープに対する、１以上の抗体またはその機能的フラグメントでコートする。この
ようなストリップを、本明細書中で「ディップスティック」という。ディップス
ティックもまた、固体支持材料（例えば、プラスチック）のより大きいストリッ
プの一端に装着され、このストリップは、溶液またはサンプル中にディップステ
ィックを浸漬するためのハンドルとして機能し得る。このプラスチックハンドル
はまた、複数のディップスティックが、共通の支持体に装着され得るように、繋
ぎ部分（ｔｅｔｈｅｒ）として機能し得る。このようなマルチストリップ設計は
、複数のリポタンパク質および／またはアポリポタンパク質を同時に試験するた
めの構成において、特に有用である。

【００４２】種々のサイズのディップスティックが可能であり、代表的には、０．５ｃｍ×
０．５ｃｍの全体の寸法を有し、そして０．５ｃｍ×５ｃｍの全体の寸法を有す
る、より大きい支持ストリップに装着され得る、固相材料の小片である。このよ
うな寸法は、１００μｌ程度の少ないサンプル中のリポタンパク質またはアポリ
ポタンパク質の正確な決定を可能にする。

【００４３】本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによって、より理解される
。

【００４４】（実施例１：唾液中のアポリポタンパク質の存在の実証）（Ａ．ポリアクリルアミドゲル電気泳動）（サンプル調製）新鮮な唾液サンプルを試験管に収集し、そして３０分以内に分析するか、また
は０．１％アジ化ナトリウムと共に４℃で一晩維持した。血清サンプルを、分子
量マーカーとして使用した；これらは凍結保存し、そして分析前に融解させた。
ヒト血漿由来のリポタンパク質、ＨＤＬおよびＬＤＬ、ならびにアポリポタンパ
ク質、ＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＢは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＬａＪｏｌｌａ
，ＣＡ製であった。電気泳動の前に、全てのサンプルを、２．５％ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）で処理し、そして沸騰水浴中で５分間インキュベートした
。上記の処理の別の変形において、このインキュベーション混合物はまた、１％
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含んだ。ブロモフェノールブルー指示薬を、電
気泳動前に添加した。

【００４５】（電気泳動）電気泳動を、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃ
ｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、製造業者のプロトコルおよび材料
を使用して行った。このｐＨ４〜１５勾配のポリアクリルアミドゲルおよび緩衝
系は、０．５５％ＳＤＳと共に、０．２ＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．１からな
った。前処理したサンプルをゲルにアプライし、そしてゲルを、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａによって提供されたプロトコルに従う、自動分離に供した。電気泳動の完了
後、ゲルを、クマシーブリリアントブルーＲ−３５０で染色し、次いで脱色およ
び分析した。

【００４６】（結果）非還元サンプルの電気泳動の結果は、以下のとおりである：ＨＤＬサンプルお
よびＡｐｏＡＩサンプルは、単一のバンドとして移動した。ブロモフェノールブ
ルーマーカーを参照して測定した、相対移動度（Ｒｆ）は、各サンプルについて
０．９４であった。ＬＤＬサンプルについてのＲｆは、０．２４であり、Ａｐｏ
Ｂサンプルについては、０．２５であった。血清サンプルは、ＨＤＬに関する領
域で３つのバンド（Ｒｆは、０．９７；０．９４；および０．８８であった）お
よびＬＤＬに関する領域で１つのバンド（Ｒｆ＝０．２４）を示した。唾液サン
プルは、ＨＤＬに関する領域で２つのバンド（Ｒｆは、０．９４および０．９１
であった）およびＬＤＬに関する領域で１つのバンド（Ｒｆ＝０．２４（１つの
場合において、Ｒｆ＝０．２２））を示した。

【００４７】ＤＴＴ還元サンプルについての電気泳動は、各々についてＲｆ＝０．８５を有
する単一のバンドとして、ＨＤＬおよびＡｐｏＡＩを示した。ＬＤＬは、２つの
場ｂｂ度（Ｒｆ０．２６および０．２２）として現れ、そしてＡｐｏＢは、単
一のバンド（Ｒｆ＝０．２６）であった。血清サンプルは、ＨＤＬに関する領域
で２つのバンド（Ｒｆ０．８２および０．７９）を示し、ＬＤＬ領域には明確
なバンドは示されなかった。唾液サンプルは、ＨＤＬに関する領域で単一のバン
ド（Ｒｆ０．８２（各唾液サンプルについて））を示し、ＬＤＬ領域には明確
なバンドは示されなかった。

【００４８】タンパク質バンドは、新鮮な唾液サンプルを分析した場合にのみ、ゲル上に現
れた。

【００４９】（Ｂ．ウエスタンブロッティング）（タンパク質ブロッティング）タンパク質ブロッティングを、本質的に、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ^TM Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔＴｅｃｈｎｉｑｕｅＦｉｌｅ２２０に従って行った：
ニトロセルロース（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍユニットと共に供給される）を、
１×ＰＢＳで予め湿らせた。電気泳動の終了時に、このニトロセルロースを、勾
配ゲルの上に置き、そして温度を、７０℃に上昇させて、そして拡散媒介転写を
、２０〜３０分間行った。

【００５０】ニトロセルロースを、ＲＴで１時間、振盪しながらインキュベートし、その後
洗浄緩衝液（ＷＢ、１×ＰＢＳ、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）中
で５分間洗浄した。次いで、このブロットを、１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、１×Ｐ
ＢＳ中、１：１０００希釈のマウス抗アポリポタンパク質Ｂ（モノクローナルＷ _a Ｂ₂ｂＤ₆、脂質含量に非依存的にＡｐｏＢと反応性、Ｄｒ．ＥｕｇｅｎＫｏ
ｒｅｎ，ＯｋｌａｈｏｍａＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅｒａｃｈＦｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎ，ＯｋｌａｈｏｍａＣｉｔｙ，ＯＫより供与された）と共に、３０〜
６０分間、振盪しながらインキュベートした。ＷＢ中で５分間の洗浄後、このゲ
ルを、１：５００，０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ヤギ抗
マウス結合体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒｃｈ；ＷｅｓｔＧｒ
ｏｖｅ，ＰＡ）と共に振盪しながら、室温（ＲＴ）で３０〜６０分間インキュベ
ートし、その後６回洗浄した。このブロットを、製造業者の説明書どおりに、化
学発光性発色試薬ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬＢＬＡＳＴ^TM（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中に５分間浸し、透明なラミネート中に配置し、ＢＩＯＭ
ＡＸ^TM ＭＲ−２フィルム（Ｋｏｄａｋ；Ｒｏｃｈｅｓｔｅ，ＮＹ）に１０秒間
露光し、そしてＫＯＤＡＫ^TM現像液および定着液を用いて発色させた。

【００５１】（結果）非常に高分子量の、モノクローナル抗アポリポタンパク質Ｂで染色された材料
を、精製アポリポタンパク質Ｂおよび精製ＬＤＬの両方について観測した。これ
らのサンプルの各々は、約６０ｋｄ部位で弱いバンドを示した。唾液において、
優勢な染色が、約６０ｋｄｍｗでみられた。アポリポタンパク質Ｂを唾液サン
プルに添加し、電気泳動の前に室温にて１時間インキュベートする場合、高分子
量バンドの量における減少および約６０ｋｄｍｗでの免疫反応性材料における
明確な増加が、観測された。これは、ＡｐｏＢが唾液酵素によって分解される
ことを示す。

【００５２】血清サンプルは、抗ＡｐｏＢで反応させた３つのバンドを生じた。これらの
バンドは、精製ＬＤＬにおいてもみられる、非常に高分子量おける二重バンド、
ならびに約６０ｋｄおよび４５ｋｄｍｗ画分である。精製ＬＤＬは、非常に高
分子量のバンドのみを示した。ＡｐｏＡ１は、３０ｋｄ血清形態で唾液中に存
在した。抗体と免疫反応性のＡｐｏＢは、約６０ｋｄ形態で存在した：ＬＤＬ
またはＡｐｏＢを唾液に添加し、そしてインキュベートした場合、この同じ約
６０ｋｄの免疫反応性形態が生成された。これは唾液酵素によって分解されるこ
とを示す。

【００５３】ウエスタンブロットにより唾液中で測定されたＡｐｏＡ１およびＡｐｏＢ
のレベルは、血清中でみられる量の約１／５０に対応した。

【００５４】（実施例２：ＡｐｏＡ：ＡｐｏＢ唾液レベルとＡｐｏＡ：ＡｐｏＢ血
清レベルとの相関）（サンプル収集）唾液：刺激されたおよび刺激されてない唾液を収集し、そしてこれを分析した
。唾液の流れを、個体にレモンまたはスーパーミントのいずれかを吸引すること
を頼むことにより刺激した。刺激された唾液を、刺激されている、唾液の収集の
５分後にこの個体を刺激することにより収集した。唾液サンプルを、血清セパレ
ーターを通して即座に濾過し、次いで氷水浴中で冷却した。唾液サンプルを収集
の３時間以内にアッセイした。

【００５５】刺激された唾液は、優れた相関を提供した。スーパーミントは、優れた結果を
示し、そして唾液ドナーに対してより受容可能であった。

【００５６】血清：血清を１２個の絶食被験体から収集し、すぐに凍結し、試験のすぐ前に
解凍した。

【００５７】（血清脂質の分析）血清サンプルをＲｏｃｈｅＣｏｂａｓＭｉｒａ自動化学分析器（ソフトウ
ェアバージョン８７３５；ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍ，
Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）で血清脂質について分析した。ＲｏｃｈｅＡｐｏＡ−
１およびＡｐｏＢ試薬ならびにアポリポタンパク質標準物を使用して、血清お
よび唾液サンプルの両方においてＡｐｏＡ−１およびＢの決定についての較正
曲線を設定した。Ｒｏｃｈｅコレストロール試薬およびキャリブレータ血清を使
用して、総コレストロールのレベルを決定した。ＲｏｃｈｅＵｎｉｍａｔｅ
ＨＤＬダイレクトＨＤＬコレストロールキャリブレータおよびＨＤＬダイレクト
キャリブレータを使用して、ＨＤＬコレストロールのレベルを決定した。Ｒｏｃ
ｈｅトリグリセリド試薬（トリグリセリドの１／５である）およびキャリブレー
タを使用して、ＶＬＤＬコレストロールのレベルを決定した。ＬＤＬコレストロ
ールを、総コレストロールからの、ＶＬＤＬおよびＨＤＬコレストロールの決定
した和の差として決定した。

【００５８】アッセイの各々について、アッセイの精度を、実験値とＬｉｑｕｉｃｈｅｋお
よびＬｙｐｈｏｃｈｅｋコントロールレベルＩおよびＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｈ
ｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）ならびにＣａｒｄｉｏｌｉｐｉｄおよびＡｐｏｌｉｐｏ
ｐｒｏｔｅｉｎコントロールレベルＩおよびＩＩ（ＳｉｇｍａＤｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）についての公開値との比較によってモニタ
ーした。アッセイ精度を、Ｒｏｃｈｅ試薬を用いて、この同じサンプルの平均％
ＣＶを連日決定することにより評価し、さらにリポタンパク質のＥｌｉｓａ免疫
アッセイによってＡｐｏＡ１およびＡｐｏＢについてアッセイした。Ｅｌｉ
ｓａを用いるＲｏｃｈｅ血清アッセイの相関を使用して、このアッセイの相関を
実証した。

【００５９】（唾液中のＡｐｏＡ−１およびＢについてのＥＬＩＳＡ）マイクロタイタープレートを、ＲＴにて一晩コートし、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ，
Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡからのＡｐｏＡ−１またはＢを、１ウェルあたり１０
０μｌを添加した。ウェルをＲＴにて１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて２時間ブロ
ックした。１０μｌの唾液サンプルを、９０μｌの、１：３０,０００希釈のウ
サギポリクローナル抗ＡｐｏＡ−１（Ｅ.Ｋｏｒｅｎ,ＳａｎＦｒａｎｃｉｓ
ｃｏにより提供された抗体）または１：２５,０００希釈のヤギポリクローナル
抗ＡｐｏＢ（やはりＥ．Ｋｏｒｅｎ，ＯＭＲＦにより提供される）のいずれか
を用いてＲＴにて１５分間インキュベートした。ＲＴでの３０分のインキュベー
ションの後、プレートを０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて２回洗浄した。１０
０μｌの、ＨＲＰヤギ抗ウサギ（ＡｐｏＡ−１決定）またはＨＲＰウサギ抗ヤ
ギ（ＡｐｏＢ決定）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、
ＲＴにて３０分にわたって振りながら添加した。これに続いて、ＢＳＡ／ＰＢＳ
を用いて２回洗浄し、続いて１５０μｌの３，３’,５，５’−テトラメチル−
ベンジジン（ＴＭＢ）を１５分にわたって振りながら添加した。比色分析反応を
、２Ｎの硫酸を用いて止め、そしてプレートを４５０ｎｍにてＴｉｔｅｒｔｅｋ
ＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒにより読み出し、最終吸光度を決定した。吸光度の
読み出し値を、異なる希釈の血清サンプルプールから構成される、ＡｐｏＡ−
１およびＢについての較正曲線を参照することにより、ｍｇ／ｄＬのＡｐｏＡ
−１およびＢに変換した。希釈されてないサンプルプールについてのＡｐｏＡ
−１およびＢの値を、Ｒｏｃｈｅ自動分析器アッセイから決定した。

【００６０】（アルブミンについてのＥＬＩＳＡ）マイクロタイタープレートを、１ウェルあたり１００μｌのヒト血清アルブミ
ン（２μｇ／ｍｌ）（ＳｉｇｍａＡ１１５１、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で室
温（ＲＴ）にて一晩コーティングした。ウェルを、室温（ＲＴ）にて２時間、１
％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。１：１０の唾液１０μｌおよび１：１００の
１０μｌを、９０μｌのヤギ抗ヒトアルブミンＡ１：１００Ｋと共に室温にて１
５分間インキュベートし、次いで、プレートに移した。室温での３０分間のイン
キュベーションの後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いてプレートを２回洗浄した
。１００μｌのＨＲＰウサギ抗ヤギ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａ
ｒｃｈ）を、室温で３０分間振盪しながら添加した。これに次いで、ＢＳＡ／Ｐ
ＢＳを用いて２回洗浄し、次いで、１５０μｌの３，３’５，５’テトラメチル
−ベンジジン（ＴＭＢ）を振盪しながら１５分間添加した。比色反応を２Ｎ硫酸
で停止し、そしてＴｉｔｅｒｔｅｋＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒにおいて４５０
ｎｍでプレートを読み取り、最終吸光度を決定した。吸光度の示度を、種々の希
釈のＳｉｇｍａＨｕｍａｎ血清アルブミンから作成された較正曲線を参照する
ことにって、ｍｇ／ｄＬのアルブミンに変換した。

【００６１】（結果）血清および唾液のサンプル中のリポタンパク質は、図１に示されるように、抗
アポリポタンパク質抗体結合について、プレート上にコーティングされたリポタ
ンパク質と競合した。サンプル中のリポタンパク質の量が増加するにつれて、よ
り少ない抗体がプレートに結合し、そしてシグナルの減少が観察された。７つの
唾液サンプルが、測定されたリポタンパク質の異なるレベルを示した。唾液サン
プル中でＥＬＩＳＡによって測定されたＡｐｏＡ１のレベルは、予期されたＡ
ｐｏＡ１の血清レベルの１０％未満であった。唾液サンプル中でＥＬＩＳＡに
よって測定されたＡｐｏＢのレベルは、ＡｐｏＢの血清レベルの１％未満で
あった。

【００６２】ＡｐｏＡおよびＡｐｏＢについて、市販のＲｏｃｈｅアッセイを使用して
血清サンプル中で測定された値と、ＥＬＩＳＡを使用して血清サンプル中で測定
された値との間の相関を表１に示す。ＲｏｃｈｅアッセイによってＡｐｏＡ１
およびＡｐｏＢについて血清サンプル中で測定された値と、ＥＬＩＳＡによっ
て測定された血清ＬＤＬおよびＨＤＬについて血清サンプル中で測定された値と
の間の相関を表２に示す。

【００６３】ＥＬＩＳＡによって測定された唾液ＡｐｏＢ／Ａ１と血清ＡｐｏＢ／Ａ１
との間の相関を表３に示す。刺激した唾液サンプルでは、ＡｐｏＢと同じ様式
でアルブミンを分泌した。結果として、アルブミンは、唾液サンプルの希釈度を
補正するために使用され得る。唾液におけるＡｐｏＢレベルおよびアルブミン
を参照して希釈度について正規化されたＡｐｏＢレベルは、血清ＡｐｏＢお
よびＬＤＬのレベルと高度に相関する。

【００６４】刺激された唾液を用いて得られたＡｐｏＡ：ＡｐｏＢの比についての相関
係数は、刺激されていない唾液における相関係数ほど高くはなく、発現された場
合、ＡｐｏＡ／ＡｐｏＢにおいて刺激された唾液は、刺激されていない唾液
ほど良好には相関しなかった。ＡｐｏＡリポタンパク質レベルは、ｍｇ／ｄＬ
として表現されるか、または唾液アルブミンに対して正規化されるか（図１ａお
よび１ｂ）に関わらず、ＡｐｏＢレベルと高度にｒ＝０．９５および０．９２
で相関する。対照的に、これらの同じサンプルについての血清ＡｐｏＡ：Ｂの
レベルは、０．０４未満のｒを有した。従って、刺激された唾液および（刺激さ
れていない）唾液のフローの間、ＡｐｏＢ分泌は、図２ａおよび２ｂに示され
るように、ＡｐｏＡ−１の量に関連して増加し、血清ＡｐｏＢ／ＡｐｏＡ
の比（０．３６〜１．４の範囲である）と対照的に、ＡｐｏＡの３〜４倍のオ
ーダーの量のＡｐｏＢである。従って、血清において観測されるよりもずっと
高いＡｐｏＢ：ＡｐｏＡの比が存在することが明かである。これは、Ａｐｏ
Ｂの唾液における選択的により高い分泌を反映するか、または部分的にフラグ
メント化されたＡｐｏＢがインタクトなＢタンパク質よりも免疫反応性である
ことを反映するアーチファクトであり得る。

【００６５】

【表１】（実施例３：競合的形式のイムノクロマトグラフィーストリップにおけるＡｐ
ｏＢおよびＡｐｏＡ−１の唾液レベルの検出）（イムノクロマトグラフィーストリップの調製）５ミクロンのニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏ
ｎ、Ｍａｓｓ．）を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡからのヒ
トＨＤＬまたはＬＤＬを用いて、２ｍｇ／ｍｌの濃度で、３マイクロリットル／
３ｍｍ幅のストリップの量で、ＣａｍａｇＬｉｎｏｍａｔＩＶ（ＣＡＭＡＧ
、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してコーティングした。金粒子を、モノクロ
ーナルＬｐａｌＨＢ４（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を有する抗ＡｐｏＡ１を用いて
、またはＷａＢ２ｂＤ６（Ｋｏｒｅｎ博士、ＯＭＲＦ）を有する抗ＡｐｏＢを
用いてコーティングした。

【００６６】（サンプルの調製）アッセイするために、血清サンプルを、ＰＢＳ中に１：２０００、１：６００
、１：１００、１：７５、１：２５および１：１０５０に希釈した。５０マイ
クロリットルのサンプルを、５マイクロリットルの金結合体および５マイクロリ
ットルの５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）を含む試験チュー
ブにピペットした。サンプルをボルテックスし、ストリップをチューブに挿入し
た。流体をストリップの端に移した後、ストリップをチューブから除き、乾燥さ
せ、バンドの強度を、ＧｒａｙｔａｇＤ１９Ｃ／Ｄ１９６ｒｅｍｉｓｓｉｏ
ｎＤｅｎｓｉｏｍｅｔｅｒ（Ｇｒｅｙｔａｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使
用して測定した。

【００６７】（結果）図３ａおよび図３ｂは、色強度が１：２０００希釈の血清および１：１００希
釈のＡｐｏＢによって強く阻害されることを示した。結合について良好な用量
依存性阻害が存在した。唾液が平均１：５０の量のＡｐｏＡ１および少なくと
もその量のＡｐｏＢを有するので、この結果は、唾液タンパク質中のＡｐｏ
Ａ１およびＡｐｏＢのアッセイが定量的なイムノクロマトグラフィー検出が
でき、米国特許第５，４５１，５０４号、同第５，５００３７５号、および同第
５，７１０，００号に記載されるＳｅｒｅｘリランド（ｒｅｌａｎｄ）形式に適
用され得ることを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、コントロールとして様々な希釈（１×、１：１０、１：１００）の血
清およびＡｐｏＡ１を使用して、ＨＤＬの存在に関してＥＬＩＳＡによりアッ
セイした唾液サンプルの吸光度のグラフである。

【図２】図２は、コントロールとして様々な希釈（１×、１：１０、１：１００）の血
清およびＡｐｏＢを使用して、ＬＤＬの存在に関してＥＬＩＳＡによりアッセ
イした唾液サンプルの吸光度のグラフである。

【図２ａ】図２ａは、レモンで刺激した唾液中の、ＡｐｏＡ１（ｍｇ／ｄｌ）に対する
ＡｐｏＢ（ｍｇ／ｄｌ）のグラフである。

【図２ｂ】図２ｂは、レモンで刺激した唾液中の、１ｍｇのアルブミンあたりのＡｐｏ
Ａ１に対するＡｐｏＢ（ｍｇ／ｄｌ）のグラフである。

【図３ａ】図３ａは、１：１００、１：７５、１：２５および１：１０の希釈における血
清中のＬＤＬに関するストリップ免疫アッセイにおける、色密度のグラフである
。

【図３ｂ】図３ｂは、１：１，２００、１：６００、１：１００および１：１０の希釈に
おける血清中のＨＤＬに関するストリップ免疫アッセイにおける、色密度のグラ
フである。

【図４ａ】図４ａは、血清中の、ＡｐｏＡに対するＡｐｏＢの比の相関のグラフであ
る。

【図４ｂ】図４ｂは、Ｒｏｃｈｅの市販のＣｏｂａｓＭｉｒａアッセイと比較した、本
明細書中に記載のＥＬＩＳＡにより測定した血清中のＡｐｏＢの比の相関のグ
ラフである。

【図４ｃ】図４ｃは、レモンで刺激した唾液中の、ＡｐｏＡに対するＡｐｏＢの比の
相関のグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジョーンズ，クリストファーエル．アメリカ合衆国ニュージャージー 07457−0303，リバーデイル，ピー．オー．ボックス 303

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】唾液をアポリポタンパク質と免疫反応性の抗体と反応させる
工程を包含する、アポリポタンパク質を検出するための方法。
【請求項２】前記アポリポタンパク質が、ＡｐｏＡ、ＡｐｏＢ、Ａｐ
ｏＣ、ＡｐｏＥ、およびそれらの成分からなる群から選択される、請求項１
に記載の方法。
【請求項３】前記アポリポタンパク質が、ＡｐｏＡ１、およびＡｐｏ
Ｂからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記抗体が、検出可能な標識で標識される、請求項１に記載
の方法。
【請求項５】前記唾液が、収集後３時間未満で試験される、請求項１に記
載の方法。
【請求項６】前記唾液が、ムコ多糖類を除去するために、試験の前に調製
される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記唾液が刺激後に収集される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記唾液中に存在するアルブミンの量を決定する工程をさら
に包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記唾液中に存在するアルブミンの量に対して、前記アポリ
ポタンパク質の量を正規化する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記唾液がデバイスに収集され、該デバイスがムコ多糖類
を濾去し、そして１つ以上のアポリポタンパク質と免疫反応性の抗体を含む、請
求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記アポリポタンパク質が、ＡｐｏＡ１またはＡｐｏ
Ｂのいずれかである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】唾液サンプル中のアポリポタンパク質の量を決定するため
のアッセイデバイスまたはキットであって、唾液の収集のための手段、およびア
ポリポタンパク質と免疫反応性の抗体を含む、アッセイデバイスまたはキット。
【請求項１３】前記唾液からムコ多糖類を除去するための濾過手段をさら
に備える、請求項１２に記載のアッセイデバイスまたはキット。
【請求項１４】前記抗体が、ＡｐｏＡ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、Ａｐ
ｏＥ、およびそれらの成分からなる群から選択されるアポリポタンパク質と反
応性である、請求項１２に記載のアッセイデバイスまたはキット。
【請求項１５】アルブミンと免疫反応性の抗体をさらに含む、請求項１２
に記載のアッセイデバイスまたはキット。
【請求項１６】前記抗体が固体支持体上に含有されるか、または固体支持
体に固定化される、アッセイデバイスまたはキット。
【請求項１７】前記アポリポタンパク質と前記抗体との複合体を検出する
ための試薬を含む、請求項１６に記載のアッセイデバイスまたはキット。
【請求項１８】アポリポタンパク質を検出するためのリランドシステムを
備える、アッセイデバイスまたはキット。
【請求項１９】アポリポタンパク質に対する抗体、およびアルブミンに対
する抗体を別個の試薬として含む、アッセイデバイスまたはキット。
【請求項２０】唾液中のリポタンパク質またはコレステロールの量、ある
いは脂質障害の存在または心臓血管疾患の危険度を定量するための方法であって
、該方法が、唾液サンプルを、ＡｐｏＡ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、Ａｐｏ
Ｅ、およびそれらの成分からなる群から選択されるアポリポタンパク質と特異的
に免疫反応性の抗体と反応させる工程を包含する、方法。