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JP2002538827A - 細胞内リン酸化反応のレギュレータ - Google Patents

細胞内リン酸化反応のレギュレータ

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Publication number
JP2002538827A
JP2002538827A JP2000605750A JP2000605750A JP2002538827A JP 2002538827 A JP2002538827 A JP 2002538827A JP 2000605750 A JP2000605750 A JP 2000605750A JP 2000605750 A JP2000605750 A JP 2000605750A JP 2002538827 A JP2002538827 A JP 2002538827A
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JP
Japan
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hrip
polynucleotide
sequence
polypeptide
seq
Prior art date
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Application number
JP2000605750A
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バンドマン、オルガ
タング、ワイ・トム
ユエ、ヘンリー
ヒルマン、ジェニファー・エル
ボーグン、マライア・アール
アジムザイ、ヤルダ
リュ、デュング・アイナ・エム
オウ−ヤング、ジャニス
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Incyte Corp
Original Assignee
Incyte Pharmaceuticals Inc
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Publication date
Application filed by Incyte Pharmaceuticals Inc filed Critical Incyte Pharmaceuticals Inc
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトの細胞内リン酸化反応のレギュレータ（HRIP）と、HRIPを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明は、HRIPの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、細胞内リン酸化反応のレギュレータの核酸配列およびアミノ酸配列
に関し、神経疾患、細胞増殖異常及び自己免疫／炎症疾患の診断、治療並びに予
防におけるこれらの配列の利用に関する。
【０００２】 （発明の背景） タンパク質の可逆リン酸化反応は、真核細胞の活性を制御するための主要なス
トラテジーである。キナーゼ及びホスファターゼは可逆リン酸化反応を調節する
。それゆえにキナーゼ及びホスファターゼは細胞内シグナル形質導入経路の重要
な構成要素である。プロテインキナーゼは、細胞外シグナル（ホルモン、神経伝
達物質、成長因子、分化因子等）、細胞周期チェックポイント（例えば有糸分裂
イベントに関連するシグナル）及び環境または栄養ストレスに応じて、アデノシ
ン３リン酸（ATP）から特定タンパク質ターゲットへ高エネルギーリン酸を移転
させる。プロテインホスファターゼは、タンパク質からリン酸基を除去すること
によってキナーゼ効果を仲介する。
【０００３】 通常哺乳動物細胞内で活性である１０，０００のタンパク質のうち１，０００
以上のタンパク質がリン酸化すると推定されている。一般に、タンパク質活性は
リン酸化によって誘導されるものであり、これは分子のスイッチをオンにするの
と類似している。スイッチをオンにすると、適正なプロテインキナーゼが代謝性
酵素、調節タンパク質、受容体、細胞骨格タンパク質、イオンチャネルまたはポ
ンプ、或いは転写因子を活性化する。シグナル経路の下方制御が必要な場合には
、脱リン酸化によってタンパク質活性が抑制される。キナーゼ及びホスファター
ゼの座標活性は、細胞増殖、細胞分化、細胞と細胞のコミュニケーション及び細
胞周期等の基本過程を調整する。抑制されていないシグナル伝達は、炎症、癌、
動脈硬化症、乾癬を含む様々な病状に関係してきた。
【０００４】 プロテインキナーゼは、ヒドロキシル化したアミノ酸上でタンパク質受容体分
子をリン酸化する。これらのキナーゼは、かなりよく知られているタンパク質群
即ち著しく多彩な機能及び特異性を有するような酵素のスーパーファミリーから
構成されている。プロテインキナーゼは通常、基質、調節分子または突然変異表
現型のアスペクトに因んで命名される。基質に関しては、プロテインキナーゼは
、チロシン残基（プロテインチロシンキナーゼ (PTK)）をリン酸化するものと、
セリンまたはトレオニン残基（セリン／トレオニンキナーゼ (STK)）をリン酸化
するものとの２つに大別することができる。二重特異性及びホスホリラーゼセリ
ン、トレオニン及びチロシン残基を有するプロテインキナーゼは殆どない。STK
及びPTKには、両ファミリーの構造特性を有するものがある（Hardie, G. and S.
Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, Vol. I:7-20, Academic Press
, San Diego CA）。
【０００５】 保存された２５０〜３００アミノ酸キナーゼドメインは殆ど全てのキナーゼに
含まれており、このドメインは２葉構造に折り重なっている。キナーゼドメイン
の１次構造は保存されており、更に１１サブドメインに細分することが可能であ
る。キナーゼドメインの小さな方のＮ末端葉は、サブドメインIからIVを有し、
主としてATP（またはGTP）ドナー分子の結合及び配向に関与している。大きな方
のＣ末端葉は、サブドメインVIからXIを有し、タンパク質基質を結合し、γリン
酸をATPからセリン、トレオニンまたはチロシン残基のヒドロキシル基へと移転
させる。サブドメインVは、２葉の橋渡しをする。１１サブドメインには各々、
固有のサブドメインに特有の固有のアミノ酸残基及びモチーフが含まれており、
高度に保存されている。（Hardie, G. and S. Hanks (1995) The Protein Kinas e Facts Book , Vol. 1:7-20, Academic Press, San Diego CA）。特に２つのプ
ロテインキナーゼサイン配列は、キナーゼドメイン内で同定されていた。第１の
配列にはATP結合に関与する活性部位リシン残基（サブドメインII）が、第２の
配列には触媒活性に重要なアスパラギン酸残基（サブドメインVI）が含まれてい
る。キナーゼは、キナーゼドメインの側面に位置する或いはキナーゼドメインに
挿入されたような種々のアミノ酸配列（通常５〜１００残基）によってファミリ
ーに分類することもできる。キナーゼは、標的タンパク質を認識し、相互作用を
及ぼすので、これら追加のアミノ酸配列は各キナーゼの調節に関与する。
【０００６】 PTKは、膜内外または非膜内外のいずれかに分類し得る。膜内外PTKは、殆どの
成長因子に対して受容体として機能する。成長因子は受容体チロシンキナーゼ（
RTK）に結合し、RTKにRTK自体をリン酸化（自動リン酸化）させ且つ特定細胞内
第２メッセンジャータンパク質もリン酸化させる。RTKを結合する成長因子には
、表皮成長因子、血小板派生成長因子、線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、
インスリン及びインスリン様成長因子、神経成長因子、血管内皮成長因子及びマ
クロファージコロニー刺激因子がある。
【０００７】 非膜内外PTKは、原形質膜受容体のサイトソルドメインを用いてシグナル伝達
複合体を形成する。非膜内外PTKを介してシグナルを送る受容体には、サイトカ
イン及びホルモンのための受容体（成長ホルモン、プロラクチン等）及びＴ及び
Ｂリンパ球上の抗原特異受容体がある。多数の非膜内外PTKは、癌細胞内で突然
変異型腫瘍遺伝子産物として先ず認識された。癌細胞内では、正常細胞の制御は
もはやPTK活性化の条件ではなかった。公知の腫瘍遺伝子の約３分の１がPTKをコ
ードする。細胞形質転換（腫瘍形成）がしばしばチロシンリン酸化活性の増加に
よって達成されることはよく知られている（Charbonneau Hand N.K. Tonks (199
2) Anno. Rev. Cell Biol. 8:463-493）。従って、或る種の癌を制御する際にPT
K活性の調節は重要なストラテジーとなり得る。
【０００８】 STKは、非膜内外タンパク質である。STKは第２メッセンジャー依存プロテイン
キナーゼを有している。第２メッセンジャー依存プロテインキナーゼは、cAMP、
cGMP、イノシトールトリリン酸、ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリリン酸
、cADPリボース、アラキドン酸、ジアシルグリセロール、カルシウム-カルモジ
ュリン（CaM）等の第２メッセンジャーの効果を主として仲介する。STKには、ホ
ルモン誘導細胞反応の仲介に関与するcAMP依存プロテインキナーゼ（PKA）と、
平滑筋構造の調節、グリコーゲン破壊及び神経伝達に関与するCaM依存プロテイ
ンキナーゼと、リン酸化カスケードを介して細胞表面から核へのシグナル形質導
入を仲介するマイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼと、グリコーゲン
破壊及び種々の転写因子の活性化を仲介するジアシルグリセロール活性化プロテ
インキナーゼＣ（PKC）がある。PKC muは、他のPKCと同様にPKCファミリーの新
規メンバーであり、亜鉛フィンガー様の、エステル結合に必要なＮ末端領域に多
システインモチーフを有し、ホルボールエステル独立キナーゼ活性の能力もある
（Johannes, F.J. ら (1994) J. Biol. Chem. 269:6140-6148）。
【０００９】 PKAは、ホルモン刺激作用に応じて細胞内で作製したcAMPによって活性化され
る。変異PKA発現は、癌、甲状腺障害、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、心血
管疾患を含む種々の疾病及び疾患に関係している（Isselbacher, K.J. ら (1994
) Harrison's Princinles of internal Medicine, McGraw-Hill, New York NY,
pp. 416-431, 1987）。CaM依存プロテインキナーゼは、細胞内の遊離カルシウム
濃度に応じて、細胞内カルシウム受容体であるカルモジュリンによって活性化さ
れる。CaMキナーゼI及びCaMキナーゼIIは神経伝達の調節において重要な役割を
果たしている。キナーゼは、アルツハイマー病等の神経疾患と、老化の認知効果
に関連していた（Lynch, M.A. (1998) Prog. Neurobiol. 56:571-589 and Bonka
le, W.L.ら (1999) Brain Ret. 818:383-396等を参照）。CASKは、カルモジュリ
ン依存プロテインキナーゼドメインを含む神経細胞表面タンパク質（ニューレキ
シン）であり、脳シナプス原形質膜に比較的高濃度で存在している（ハラ, Y.ら
(1996) J. Neurosci. 16:2488-2494）。CASKは、アルツハイマー病に関係する
アミロイド前駆体タンパク質（APP）を結合することが可能な複合体の一部を形
成し、APP処理において重要な役割を果たし得る（Borg, J.P.ら (1998) J. Biol
, Chem. 273:31633-31636）。
【００１０】 サイクリン依存プロテインキナーゼ（CDK）は、細胞周期を通じて細胞の進行
を制御するSTKである。サイクリンは、CDKに結合し、CDKを活性化する小調節タ
ンパク質である。次にサイクリンは有糸分裂過程に関与する選択されたタンパク
質をリン酸化し、活性化する。CDKは、活性化されるために多数の入力を必要と
する点で独特である。サイクリンに加えて、CDK活性化には特定のトレオニン残
基のリン酸化及び特定のチロシン残基の脱リン酸化が必要である。細胞周期に関
連するSTKの別のファミリーは、NIMA（never in mitosis）関連キナーゼ（Nek）
である。CDK及びNekは共に、動物細胞における微小管組織の中心即ち中心体の複
製、成熟及び分離に関与している（Fry, A.M. ら (1998) EMBO J. 17:470-481）
。
【００１１】 MAPキナーゼは、細胞内シグナル伝達経路を調整する別のSTKファミリーからな
る。MAPキナーゼは、リン酸化カスケードを介して細胞表面から核へのシグナル
形質導入を仲介する。MAPキナーゼ経路を活性化する細胞外刺激には、表皮成長
因子、紫外線、高浸透圧性媒体、熱ショック、内毒素性リポ多糖体、及び腫瘍ネ
クローシス因子及びインターロイキン-１等のプロ炎症性サイトカインがある。
変異したMAPキナーゼの発現は、癌、炎症、免疫異常症、成長及び発達に影響す
る障害を含む種々の病状に関係している。
【００１２】 アポプトーシスは、細胞死へと導くような高度に調整されたシグナル伝達経路
である。細胞死は、組織発達及びホメオスタシスにおいて重大な役割を果たす。
本過程の統制解除は、自己免疫疾患、神経変性疾患及び癌を含む多数の疾患の病
因に関連している。種々のSTKは、本過程において鍵となる役割を果たす。ZIPキ
ナーゼは、Ｎ末端プロテインキナーゼドメインに加えてＣ末端ロイシンジッパー
ドメインを含むSTKである。このＣ末端ドメインは活性化転写因子ATF4等の転写
因子との相互作用と同様にキナーゼのホモ二量体化および活性化を仲介する外観
を呈し、活性化転写因子ATF4は、転写因子のタンパク質（ATF/CREB）ファミリー
を結合するようなcAMP応答要素のメンバーである（サンジョウ, H. ら (1998) J
. Biol. Chem, 273:29066-29071）。DRAK１及びDRAK2は、死に関連するプロテイ
ンキナーゼ（DAPキナーゼ）と相同性を共有するSTKであり、インターフェロン-
γ誘導アポプトーシスにおいてそのように機能することが知られている（前出の
サイジョウらの文献）。ZIPキナーゼと同様に、DAPキナーゼにはＮ末端キナーゼ
ドメインに加えてＣ末端タンパク質-タンパク質相互作用ドメインがアンキリン
反復の形で含まれている。このタイプのキナーゼ、ZIP、DAP及びDRAKは、NIH3T3
細胞に形質移入された場合にアポプトーシスに関連する形態学的変化を誘導する
（前出のサンジョウらの文献）。しかしながら、これらのタンパク質のＮ末端キ
ナーゼ触媒ドメインまたはＣ末端ドメインのいずれかが欠失しているとアポトー
シス活性が完全に無くなり、アポプトーシスには、恐らくはレギュレータまたは
特定の基質との相互作用ドメインとしてＣ末端ドメインにおける活性もキナーゼ
活性に加えて必要である。
【００１３】 RICKは、死受容体CD95に関与する特定のアポトーシス経路を仲介するものとし
て最近同定されたもう１つのSTKである（イノハラ, N. ら (1998) J. Biol. Che
m. 273:12296-12300）。CD95は、腫瘍ネクローシス因子受容体スーパーファミリ
ーのメンバーであり、免疫系の調節及びホメオスタシスにおいて重要な役割を果
たしている（ナガタ, S. (1997) Cell 88:355-365）。CD95受容体シグナル伝達
経路は、リガンド結合に続く受容体複合体への種々の細胞内分子の漸増に関与し
ている。これにはシステインプロテアーゼカスパーゼ-８が含まれ、カスパーゼ-
８は細胞死へ導くカスパーゼカスケードを活性化する。RICKは、Ｎ末端キナーゼ
触媒ドメイン及びＣ末端「カスパーゼ漸増」ドメインからなる。Ｃ末端「カスパ
ーゼ漸増」ドメインはカスパーゼ様ドメインと相互作用し、RICKがカスパーゼ-
８の漸増において役割を果たしていることを示している。この解釈は、ヒト293T
細胞におけるRICKの発現が、CD95アポトーシス経路に関与する種々のタンパク質
によってカスパーゼ-８の活性化を促進してアポプトーシスの誘導を強化すると
いう事実に裏付けられている（前出のイノハラらの文献）。
【００１４】 プロテインホスファターゼは、キナーゼにより活性化した分子からリン酸基を
除去することによってプロテインキナーゼの効果を調整する。ホスファターゼは
、ホスファターゼの好適なホスホアミノ酸基質に基づいてチロシン特異またはセ
リン／トレオニン特異のいずれかとして特徴付けられる。尤も、セリン／トレオ
ニン基及びチロシン基の両方に対して二重特異性を有するプロテインホスファタ
ーゼもある。セリン／トレオニンホスファターゼは、ホスホセリン及びホスホト
レオニン残基を脱リン酸化し、また多数のcAMP仲介ホルモン反応の重要なレギュ
レータでもある（Cohen, P. (1989) Annu. Rev. Biochem. 58:453-508）。セリ
ン／トレオニンホスファターゼは、通常２以上のサブユニットからなり、広範且
つ重畳するタンパク質基質特異性を有する。
【００１５】 チロシンホスファターゼは通常、主として原形質膜全域におけるシグナルの形
質導入において機能する単遺伝子性タンパク質であり、膜内外受容体様タンパク
質または可溶性非膜内外タンパク質のいずれかに分類される。チロシンホスファ
ターゼは、PTKの効果を逆にするもので、リン酸化タンパク質のチロシン残基か
らリン酸基を除去し、細胞周期及び細胞シグナル伝達過程、リンパ球活性化及び
細胞接着において重大な役割を果たす（Charbonneau, H. and N.K. Tonks (1992
) Annu. Rev. Cell Biol. &463-493）。細胞分裂の過程で、例えば、Ｍ期誘導ホ
スファターゼと呼ばれる特定のチロシンホスファターゼが、細胞分裂特異PTKで
あるCDC2の脱リン酸化及び活性化により、有糸分裂の誘導の際に鍵となる役割を
果たしている（Krishna, S.ら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5139-51
43）。
【００１６】 チロシンホスファターゼは、活性部位を含む約２５０アミノ酸の保存触媒ドメ
インを共有する。活性部位コンセンサス配列は、ホスファターゼ活性に必須のシ
ステイン残基を含む１３アミノ酸を有する。更に、リンパ腫、小細胞肺癌、腺癌
及び神経芽細胞腫を含む種々の腫瘍条件で転座または転位された染色体領域に、
少なくとも８のチロシンホスファターゼをコードするような遺伝子がマッピング
されていた。（Charbonnean, H. and N.K. Tonks (1992) Annu. Rev. Cell Biol
. 8:463-493）。既述の通り、多数のPTKが腫瘍遺伝子にコードされ、腫瘍はしば
しばチロシンリン酸化活性の増加によって形成される。従って、細胞におけるチ
ロシンリン酸化レベルを制御することによって、チロシンホスファターゼは細胞
形質転換及び種々の癌の成長を予防または逆行させることが可能である。この仮
説は、チロシンホスファターゼの過剰発現が細胞内で形質転換を抑制すること及
びチロシンホスファターゼの固有の阻害剤が細胞形質転換を増進することを示す
研究によって裏付けられている（前出のCharbonneau and Tonksの文献）。
【００１７】 タンパク質リン酸化に加えて、脂質リン酸化も或る種のシグナル伝達経路にお
いて役割を果たす。ホスファチジルイノシトールのリン酸化は、PKCシグナル伝
達経路の活性化に関与している。最近では、スフィンゴリピド代謝物質即ちスフ
ィンゴシン-1-リン酸（SPP）が、細胞外作用及び細胞内作用を伴なう新規な脂質
第２メッセンジャーとして浮上してきた（コハマ, T. ら (1998) J. Biol. Chem
. 273:23722-23728）。細胞外では、SPPはGプロテイン結合受容体EDG-l（内皮由
来Gプロテイン結合受容体）に対するリガンドである。細胞内では、SPPは細胞の
成長、生存、運動性及び細胞骨格変化を調整する。SPPレベルは、特にD-エリト
ロ-スフィンゴシンをSPPにリン酸化するようなスフィンゴシンキナーゼが調整す
る。細胞シグナル伝達におけるスフィンゴシンキナーゼの重要性は、血小板派生
成長因子（PDGF）、神経成長因子及びPKCの活性化を含む種々の刺激がスフィン
ゴシンキナーゼの活性化によってSPPの細胞レベルを増加させるという事実と、
酵素の拮抗阻害剤がPDGFによって細胞増殖誘導を選択的に阻害するという事実に
よって示される（前出のコハマの文献）。
【００１８】 細胞内リン酸化の新規なレギュレータ及びそれをコードするポリヌクレオチド
の発見は、神経疾患、細胞増殖異常及び自己免疫／炎症疾患の診断、予防並びに
治療の際に有益な新規な成分を与えることによって本技術分野における要求に応
える。
【００１９】 （発明の概要） 本発明は、集合的には「HRIP」、個別には「HRIP-1」、「HRIP-2」、「HRIP-3」、「H
RIP-4」、「HRIP-5」、「HRIP-6」、「HRIP-7」、「HRIP-8」、「HRIP-9」、「HRIP-10」、「HR
IP-11」、「HRIP-12」、「HRIP-13」及び「HRIP-14」と呼ばれるような、実質上精製さ
れたポリペプチドである細胞内リン酸化反応のレギュレータに特徴がある。或る
側面において本発明は、（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミ
ノ酸配列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少
なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１
４からなる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列
番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実
質上単離されたポリペプチドを提供する。或る例では、配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドを提供する。
【００２０】 また、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドをコードする実質上単離されたポリヌクレオチドを提供す
る。別の実施例では、ポリペプチドは配列番号１５乃至２８からなる群から選択
される。
【００２１】 更に、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドをコードする実質上単離されたポリヌクレオチドと機能的
に結合したプロモータ配列からなる組換えポリヌクレオチドを提供する。或る例
では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。
また別の例では、本発明は組換えポリヌクレオチドからなる遺伝形質転換体を提
供する。
【００２２】 また、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポ
リヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下
で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを受容する過程とか
らなり、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に機能的に結合したプロモータ配列からなる。
【００２３】 更に、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドに特異結合する実質上単離された抗体を提供する。
【００２４】 更に、本発明は（ａ）配列番号１５乃至２８からなる群から選択したポリヌク
レオチド配列、（ｂ）配列番号１５乃至２８からなる群から選択したポリヌクレ
オチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、または（ｄ）（ｂ）に相補的な
ポリヌクレオチド配列からなる実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。
或る例では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドからな
っている。
【００２５】 更に、本発明はサンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する
。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）配列番号１５乃至２８からなる群から
選択したポリヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号１５乃至２８からなる群から選
択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポリヌ
クレオチド配列、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、または（ｄ）
（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド配列を有する
。検出方法は、（ａ）サンプル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からな
る少なくとも１６の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプル
をハイブリダイズする過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不
存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程か
らなり、プローブと標的ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合体
が形成されるような条件下で、プローブはポリヌクレオチドに特異的にハイブリ
ダイズする。或る例では、プローブは少なくとも３０の連続したヌクレオチドか
らなっている。別の実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレ
オチドからなっている。
【００２６】 更に本発明は、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とからな
る医薬品成分を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）配列番号１乃至１４
からなる群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群か
ら選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配
列、（ｃ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の生物学的
活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列の免疫原性断片からなる。更に本発明は、機能性HRIPの発現低下に関連する疾
患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して
医薬品成分を投与する過程からなる方法を提供する。
【００２７】 また、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をス
クリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチド
からなるサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を
検出する過程とからなる。或る例では、本発明は機能性HRIPの発現低下に関連す
る疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対
して医薬品成分を投与する過程からなる方法を提供する。
【００２８】 更に、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物
をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプ
チドからなるサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活
性を検出する過程とからなる。或る例で本発明は、この方法によって同定したア
ンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とからなる医薬品成分を提供
する。別の例では、機能性HRIPの過剰発現に関連する疾患又は病状を治療する方
法であって、そのような治療を必要とする患者に対して医薬品成分を投与する過
程からなる方法を提供する。
【００２９】 更に本発明は、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化
合物をスクリーニングする方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、配列番号
１５乃至２８からなる群から選択した配列からなる。スクリーニング方法は、（
ａ）標的ポリヌクレオチドからなるサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）標的
ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程とからなる。
【００３０】 （発明を実施するための形態） 本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前
に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改
変可能であるということを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定
の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定され
る本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解された
い。
【００３１】 請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す
場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と
記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」
と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等
価物等についても言及しているのである。
【００３２】 本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合
を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説
明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実
施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について
説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本
発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及
び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本
発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられ
ていないことを認めるものではない。
【００３３】 定義 「HRIP」は、実質上精製されたHRIPのアミノ酸配列であって、任意の種、特に
ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物の種から得たもので
、任意の天然物、合成物、半合成物或いは組換え物を起源とするものを指す。
【００３４】 「アゴニスト」の語は、HRIPの生物学的活性を強化または擬態する分子を指す
。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合
物や成分を挙げることができるが、これらはHRIPと直接相互作用することによっ
て、或いはHRIPが関与する生物学的経路の構成要素に作用することによって、HR
IPの活性を調節する。
【００３５】 「対立遺伝子変異体」は、HRIPをコードする遺伝子の別の形態である。対立遺
伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１の突然変異から作製し得る。また
、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。ポリペプチドの構造または機
能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を
全く有しないか、１若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に
対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠
失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化
と共に、所定の配列内で1若しくは数回生じ得る。
【００３６】 HRIPをコードする「変異(altered)」核酸配列は、種々のヌクレオチドを欠失
、挿入または置換する核酸配列を有し、HRIPと同一またはHRIPの機能的特徴を少
なくとも１つ有するポリペプチドを産出する。この定義に含まれるのは、HRIPを
コードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易
に検出可能或いは検出困難な多型現象と、HRIPをコードするポリヌクレオチド配
列のための正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座に占めるような、対立遺伝子変
異体に対する不適切或いは不測のハイブリダイゼーションである。コードされた
タンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に
機能的に等価なHRIPとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得
る。計画的アミノ酸置換は、HRIPの生物学的または免疫学的活性が保持される限
りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒
性特性の類似性に基づき行い得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラ
ギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニ
ンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アス
パラギンとグルタミン、セリンとスレオニンがある。親水性値が近似している非
荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンと
アラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００３７】 「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポ
リペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分
子を指す。ここで、「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を
指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙した
タンパク質分子に会合する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするもので
はない。
【００３８】 「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅は通常、当業者によく知ら
れたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行う。
【００３９】 「アンタゴニスト」の語は、HRIPの生物学的活性を阻害或いは弱める分子を指
す。アンタゴニストとしては、抗体などのタンパク質、核酸、糖質、小分子また
はその他の任意の化合物や成分を挙げることができるが、これらはHRIPと直接相
互作用することによって、或いはHRIPが関与する生物学的経路の構成要素に作用
することによって、HRIPの活性を調節する。
【００４０】 「抗体」の語は、無損傷免疫グロブリンやその断片、例えばFa、F(ab')2 及びF
vフラグメントを指すが、これらはエピトープの決定基と結合することができる
。HRIPポリペプチドを結合する抗体は、無損傷ポリペプチドを用いるか或いは免
疫抗原として感心のある小ペプチドを含む断片を用いるかして調製することがで
きる。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチ
ドまたはオリゴペプチドは、翻訳または化学合成されたRNAに由来し得るもので
、好みに応じて担体タンパク質に接合することも可能である。通常用いられる担
体であってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブ
リン及びキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）等がある。結合ペプチドは
、動物を免疫化するために用いる。
【００４１】 「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域（即ちエピトー
プ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場
合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３
次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合
するための無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競
合し得る。
【００４２】 「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」鎖と塩基対を形成する
ことが可能な任意の成分を指す。アンチセンス成分には、DNAや、RNAや、ペプチ
ド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン
酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドや、2'-メトキ
シエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌ
クレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2
'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。
アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することがで
きる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成し
た天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成す
る。「負」若しくは「マイナス（−）」の語がアンチセンス鎖を、「正」若しく
は「プラス（＋）」がセンス鎖を指すことがある。
【００４３】 「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的
機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、天然、組換えま
たは合成のHRIP、或いはその任意のオリゴペプチドの能力であって、適切な動物
または細胞において特定の免疫反応を誘導して特定の抗体と結合し得る能力を指
す。
【００４４】 「相補(的)」または「相補性」の語は、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド
の、塩基対形成による自然結合を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配
列「3'T-C-A5'」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が
結合しているだけの「部分的」なものであるか、或いは一本鎖分子間に完全な相
補性が存在するような「完全」なものであり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、
核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しい影響を与える。この
ことは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において、またペプチド核酸（PNA
）分子の設計及び使用において特に重要である。
【００４５】 「所定のポリヌクレオチド配列からなる成分」及び「所定のアミノ酸配列から
なる成分」は、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列からなる
任意の成分を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。HRIPま
たはHRIP断片をコードするポリヌクレオチドからなる成分は、ハイブリダイゼー
ションプローブとして利用することができる。このプローブは凍結乾燥状態で保
存し得るものであり、糖質等の安定化剤と会合し得る。ハイブリダイゼーション
においては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；
SDS）及びその他の構成要素（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA
等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００４６】 「コンセンサス配列」は、不必要な塩基を分離するために再配列し、XL-PCRキ
ット（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）を用いて５'方向、３'方向のいずれか一方
向或いは両方向に伸長させ、更に再配列した核酸配列を指す。或いは、断片アセ
ンブルのコンピュータプログラムを用いて、１若しくは数個のIncyteクローンの
、場合によっては１若しくは数個のパブリックドメインESTの、オーバーラップ
した配列から組み立てた核酸配列を指す。コンピュータプログラムの例としては
、GELVIEW断片アセンブルシステム（GCG, Madison WI）が挙げられる。伸長及び
アセンブルの両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。
【００４７】 「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆
ど損なわないような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのよ
うな置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミ
ノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示し
ている。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile, Leu, Thr 保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボ
ーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の
電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【００４８】 「欠失」は、結果的に１若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドが失われ
てなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【００４９】 「誘導体」の語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾
を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による
水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチ
ド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持し
ているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリ
エチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘
導起源のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保
持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００５０】 「断片」は、HRIPまたはHRIPをコードするポリヌクレオチドの固有部分であっ
て、親配列と同一配列であるが親配列よりも長さが短い配列を指す。断片は、画
定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも
短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチド
またはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子とし
て、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５
、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しく
は５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、
分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の
配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最
初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得
る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例で
は、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００５１】 配列番号１５乃至２８の断片には、固有のポリヌクレオチド配列領域が含まれ
る。この領域は、配列番号１５乃至２８を特異的に同定するものであり、例えば
同一ゲノム中の配列番号１５乃至２８以外の配列とは異なるものである。配列番
号１５乃至２８の断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技術におい
て、或いは関連するポリヌクレオチド配列から配列番号１５乃至２８を区別する
類似の方法において有用である。配列番号１５乃至２８の断片の正確な長さ及び
断片に対応する配列番号１５乃至２８の領域は、断片に対する意図した目的に基
づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００５２】 配列番号１乃至１４の断片は、配列番号１５乃至２８の断片によってコードさ
れる。配列番号１乃至１４の断片には、配列番号１乃至１４を特異的に同定する
固有のアミノ酸配列領域が含まれている。例えば、配列番号１乃至１４の断片は
、配列番号１乃至１４を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドと
して有用である。配列番号１乃至１４の断片及び断片に対応する配列番号１乃至
１４の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的
に決定することが可能である。
【００５３】 「類似性」の語は、相補性の程度を指す。類似性には、部分類似性と完全類似
性がある。「類似性」の語の代わりに「相同性」を用いることもある。同一の配
列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するような部分
相補配列は、「実質上類似」と称する。完全相補配列の標的配列へのハイブリダ
イゼーションの阻害は、緩やかなストリンジェント条件下で、ハイブリダイゼー
ションアッセイ（サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーシ
ョン等）を用いて検定し得る。実質上類似の配列またはハイブリダイゼーション
プローブは、緩やかなストリンジェント条件下で、完全類似（同一）配列が標的
配列に結合することに対して競合し、この結合を阻害し得る。これは、緩やかな
ストリンジェント条件が非特異結合を許容することを意味するものではない。緩
やかなストリンジェント条件では、２つの配列相互の結合が特異的（即ち選択的
）相互作用であることが必要なためである。非特異結合の不存在下では、部分的
に相補性が欠失している（例えば類似性または相同性が約３０％以下である）よ
うな第２標的配列を用いて試験することができる。非特異結合の不存在下では、
実質上類似の配列またはプローブは第２非相補的標的配列にハイブリダイズしな
い。
【００５４】 ポリヌクレオチド配列に適用される「相同率」または「相同％」の語は、標準
化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２以上のポリヌ
クレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは
、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化
された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比
較できる。
【００５５】 ポリヌクレオチド配列間の相同率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメ
ントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトパ
ラメータを用いて決定できる。このプログラムはLASERGENEソフトウェアパッケ
ージの一部であり、一式の分子生物学分析プログラム（DNASTAR, Madison WI）
である。CLUSTAL Vについては、Higgins, D.G. and P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153及びHiggins, D.G. ら (1992) CABIOS 8:189-191の文献に記載されて
いる。ポリヌクレオチド配列の対をなすアラインメントの場合、デフォルトパラ
メータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定
する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。CLUS
TAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として
相同率を報告する。
【００５６】 或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Al
ignment Search Tool（BLAST）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配
列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. ら (1990) J. Mol. B
iol. 215:403-410）。このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり
、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nl
m.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な
配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデー
タベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」も
その１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列を対で直接比較するため
に用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2
Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして
対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blast
n と blastp（後述）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的
には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。
例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとし
て設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用
いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: −2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on
【００５７】 相同率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）配列長さ
と比較して測定し得る。或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配
列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００
または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して相同率を測定し
てもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リ
ストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を
用いて、相同率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００５８】 高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重
が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸
配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコード
するような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【００５９】 ポリペプチド配列に適用される「相同率」または「相同％」の語は、標準化さ
れたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２以上のポリペプチ
ド配列間で一致する残基の割合を意味する。ポリペプチド配列アラインメントの
方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。
既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存
するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【００６０】 ポリペプチド配列間の相同率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメント
プログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラ
メータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL
Vを用いて、ポリぺプチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルト
パラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と
設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポ
リヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされた
ポリペプチド配列対間の「類似率」として相同率を報告する。
【００６１】 或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えばポリペプチド配
列を２つ１組で比較をする場合、デフォルトパラメータとして設定されたblastp
と共に「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を使用して
もよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on
【００６２】 相同率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプ
チド配列の長さと比較して測定し得る。相同率は、配列或いは、より短い長さ、
例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なく
とも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）
の長さと比較して相同率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的な
ものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付
けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して相
同率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００６３】 「ヒト人工染色体」（HAC）は直鎖状の小染色体であり、６kb〜１０Mbのサイ
ズのDNA配列を含み、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要
素が含まれている。
【００６４】 「ヒト化抗体」の語は、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列はヒト抗体によ
り近づくように変異させた抗体分子であって、本来の結合能力はそのまま保持し
ているような抗体分子を指す。
【００６５】 「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基
対を形成することによって、一本鎖ポリヌクレオチドが相補的鎖とアニーリング
するプロセスを指す。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い
相同性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体
は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダ
イズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのス
トリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件
では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。
核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例
的に決定する。許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗
浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーショ
ン特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリング許容条件は
、例えば約6×SSC、約１％（w/v）のSDS及び約１００μg/mlの変性サケ精子DNA
の存在下で温度６８℃において成立する。
【００６６】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステ
ップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常
、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低く
なるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致す
るプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する
式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook ら (1
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring H
arbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【００６７】 本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに
対する高ストリンジェンシー条件には、約０.２×SSC及び約１％のSDS存在下で
約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。或いは、６５℃、６０℃、５５
℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、
約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、遮断剤を用いて非特異ハイブリ
ダイゼーションを阻止する。このような遮断剤には、例えば、約１００〜２００
μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダ
イゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用
いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろ
う。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオ
チド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及び
ヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆してい
る。
【００６８】 「ハイブリダイゼーション複合体」の語は、相補的塩基対間の水素結合の形成
力によって２つの核酸配列間に形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーショ
ン複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。或いは、一方の核
酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、
フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって
細胞若しくはその核酸が固定される基質）に固定されているような２つの核酸配
列間に形成され得る。
【００６９】 「挿入」及び「付加」の語は、１若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオ
チド配列を各々付加するようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を
指す。
【００７０】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関
連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種
々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現
によって特徴づけることができる。
【００７１】 「マイクロアレイ」の語は、基質上の異なるポリヌクレオチドの配置を指す。
【００７２】 「要素」または「アレイ要素」の語は、マイクロアレイの環境において、基質
の表面上に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。
【００７３】 「調節(する)」の語は、HRIPの活性の変化を指す。調節することによって例え
ば、HRIPのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的
特性が増大または低下し得る。
【００７４】 「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲ
ノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或
いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド
核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【００７５】 「機能的に結合した」は、第１核酸配列が第２核酸配列と機能的な関係がある
ように配置された状態を指す。例えば、プロモータがコード配列の転写または発
現に影響を及ぼす場合には、そのプロモータはそのコード配列に機能的に結合し
ている。同一の読み枠内で２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場
合、一般に、機能的に結合したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続し得る
。
【００７６】 「ペプチド核酸」（PNA）は、アンチセンス分子または抗遺伝子物質であって
、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なく
とも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなるものを指す。末端の
リジンは、成分に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的
に結合して転写の拡張を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細
胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【００７７】 「プローブ」は、HRIP、HRIPの相補配列またはこれらの断片をコードする核酸
配列を指し、同一核酸配列、対立遺伝子核酸配列または関連する核酸配列の検出
に用いられる。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典
型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある
。
【００７８】 「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的
塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライ
マーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に延在し得る。プライマー
対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び同定）
に用い得る。
【００７９】 本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくと
も１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプロ
ーブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、
４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオ
チドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり
長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に
裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解された
い。
【００８０】 プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. ら (1
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring H
arbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. ら, (1987) Current Protocols in Molecular Biology , Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York
NY、Innisら (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Ac
ademic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的
のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehe
ad Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知
の配列から得ることができる。
【００８１】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のため
に本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06
ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用で
あり、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチド
であって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを
分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力の
ための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（
テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから
一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択すること
が可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である
。Primer3プライマー選択プログラム（マサチューセッツ州ケンブリッジのWhite
head Institute／MITゲノム研究センターから一般向けに入手可能）ではユーザ
ーが「ミスプライミング・ライブラリ」をインプットすることができ、ここでプ
ライマー結合部位として避けたい配列はユーザーが指定する。Primer3は特に、
マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプ
ライマー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有
のニーズを満たすように変更してもよい。）PrimerGenプログラム（英国ケンブ
リッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般
向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し
、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存
領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従っ
て、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌ
クレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定し
たオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション
技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロ
アレイ要素として、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリ
ヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの
選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【００８２】 「組換え核酸」は天然の配列ではない配列であり、或いは人為的に組み合わせ
なければ離隔している配列の２以上のセグメントを人為的に組み合わせて産出し
た配列を有する配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成
するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばの
Sambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達
成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核
酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモータ配列に機能的に結合した核酸配
列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不可欠な要素であって例え
ばある細胞を形質転換するために用いられるようなものであり得る。
【００８３】 或いはこのような組換え核酸は、ウィルスベクターの不可欠な要素であって例
えばワクシニアウィルスに基づくものであり得る。ワクシニアウィルスは組換え
核酸が発現する哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防御免疫応
答を誘導する。
【００８４】 DNA配列に関する「RNA等価物」は、発生した窒素塩基チミンが全てウラシルに
置換されていることと、糖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボース
から構成されていることを除いて、参照DNA配列と同一のヌクレオチド線形配列
から構成されている。
【００８５】 「サンプル」の語は、その最も広い意味で用いられる。HRIPをコードする核酸
若しくはその断片、またはHRIP自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞
から単離された細胞、染色体、細胞小器官または膜からの抽出物や、細胞や、溶
解しているか基質に結合しているゲノムDNA、RNAまたはcDNAや、組織や、組織プ
リント等から構成され得る。
【００８６】 「特異結合」または「特異的に結合する」の語は、タンパク質またはペプチド
と、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、任意の天然成分または合成結
合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例
えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか
否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対
して特異的である場合、標識された遊離したＡ及びその抗体を含む反応において
、エピトープＡ（つまり遊離し、標識されていないＡ）を含むポリヌクレオチド
の存在が、抗体に結合している標識されたＡの量を低減させる。
【００８７】 「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分
離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合するその他の構成要素の
少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましいのは少なく
とも約９０％が遊離しているものを指す。
【００８８】 「置換」は、１若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドを各々別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置換することを意味する。
【００８９】 「基質」は、任意の好適な固体または半固体の支持体を指すものであって、膜
、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性非磁性ビーズ、ゲル
、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管が含まれる。基質は、壁、溝、ピン
、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面にはポリヌク
レオチドやポリペプチドが結合する。
【００９０】 「形質転換」は、外来性のDNAが宿主細胞に入り込み、宿主細胞を変化させる
プロセスを表す。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自
然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または
真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形
質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換
方法には、ウィルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック
、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞
の語には、限られた時間内に挿入されたDNAやRNAを発現するような一時的に形質
転換された細胞のみならず、安定的に形質転換された細胞であってその中に挿入
されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主の染色体の一部とし
て複製可能であるものも含まれる。
【００９１】 ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものでは
ないが動植物を含み、有機体の１若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、
例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸
を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入
することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或
いは組換えウィルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種
或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものであ
る。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバク
テリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知ら
れている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿
主に導入することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術は
よく知られており、前出のSambrook ら (1989) 等の参考文献に与えられている
。
【００９２】 特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸
配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。その際、
デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（
1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに
対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９８％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対
立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多形
性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を
有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通
常多数の或いは僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリ
ペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが
欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列で
ある。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有
する。多形性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチ
ド配列が異なる。また、多形性変異体は、１つのヌクレオチド塩基によってポリ
ヌクレオチド配列が変化する「単一ヌクレオチド多形性」（SNP）を含み得る。S
NPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【００９３】 特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体
で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプ
チド配列として画定される。ここで、デフォルトパラメータに設定した「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する
。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％
、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の
相同性を示し得る。
【００９４】 発明 本発明は、新規なヒトの細胞内リン酸化反応のレギュレータ（HRIP）、HRIPを
コードするポリヌクレオチド、並びにこれらの成分を神経疾患、細胞増殖異常及
び自己免疫／炎症不全の診断、治療又は予防のために利用する方法の発見に基づ
くものである。
【００９５】 表１は、HRIPをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたIncyteク
ローンを示す。列１及び列２は、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの配列番号
（SEQ ID NO）を各々示している。列３はIncyteクローンを示しており、各HRIP
をコードする核酸はここで同定されたものである。列４はcDNAライブラリを示し
ており、列３のクローンはここから単離したものである。列５は、Incyteクロー
ン及びこれに対応するcDNAライブラリを示している。cDNAライブラリが示されて
いないIncyteクローンは、プールされているcDNAライブラリから得た。列５のIn
cyteクローンを用いて各HRIPのコンセンサスヌクレオチド配列を構築した。列５
のIncyteクローンは、ハイブリダイゼーション技術における断片として有用であ
る。
【００９６】 表２の列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示している。列１は配列
番号（SEQ ID NO）を、列２は各ポリペプチド中のアミノ酸残基の数を、列３は
潜在的なリン酸化部位を、列４は潜在的なグリコシル化部位を、列５はサイン（
signature）配列及びモチーフを有するアミノ酸残基を、列６はBLAST分析によっ
て同定された相同配列、列７は分析方法と場合によってはその分析方法が利用で
きる検索可能なデータベースを示している。列７の分析方法を用いて、配列相同
性及びタンパク質モチーフから各ポリペプチドの特徴付けを行った。
【００９７】 表３の列は、組織特異性と、HRIPをコードするヌクレオチド配列に関係がある
疾患、障害または症状とを示している。表３の列１はヌクレオチドの配列番号を
、列２は列１のヌクレオチド配列の断片を示している。これらの断片は例えば、
配列番号１５乃至２８を同定し、配列番号１５乃至２８と関連するポリヌクレオ
チド配列を区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅の技術において有
用である。配列番号１５乃至２７では、これら断片によりコードされるポリヌク
レオチドは、例えば免疫原性ペプチドとして有用である。列３は、HRIPを発現す
る組織全体に対するHRIP発現割合として、組織カテゴリーを示している。列４は
、HRIPを発現する組織全体に対する割合として、HRIPをコードするヌクレオチド
配列に関係がある疾患、障害または症状を示している。列５は、各cDNAライブラ
リをサブクローニングするために用いたベクターを示している。
【００９８】 表４の列ではcDNAライブラリの作製に用いた組織の説明を示している。HRIPを
コードするcDNAのクローンはcDNAライブラリから単離したものである。列１は、
ヌクレオチドの配列番号を、列２はクローン単離起源であるcDNAライブラリを、
列３は列２のcDNAライブラリに関連する組織の起源その他の記述的情報を示して
いる。
【００９９】 本発明には、HRIPの変異体も含まれる。好適なHRIPの変異体のアミノ酸配列は
、HRIPアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、或いは
約９５％もの相同性を有し、HRIPの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ
有するような変異体である。
【０１００】 本発明には、HRIPをコードするポリヌクレオチドも含まれる。或る例では、HR
IPをコードする配列番号１５乃至２８からなる群から選択された配列を有するポ
リヌクレオチド配列が本発明に含まれている。配列番号１５乃至２８のポリヌク
レオチド配列は、配列表に示されているように等価RNA配列と同等の価値を有し
ているが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデ
オキシリボースではなくシリボースから構成されている。
【０１０１】 本発明には、HRIPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列も含まれる。
具体的には、そのようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、HRIPをコードする
ポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、或い
は約９５％もの相同性を有する。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、HR
IPの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし
得る。
【０１０２】 当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、HRIPをコードする多数のポリヌクレ
オチド配列（既知の遺伝子または天然の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないポリヌクレオチド配列もある）が作り出され得ることは理解
できよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によっ
て作り出され得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異
体を網羅し得る。これらの組合せは、天然のHRIPのポリヌクレオチド配列に適用
されるような標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような
変異は全て明確に開示されているものと考えられる。
【０１０３】 HRIP及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は通常、好適に選択された
ストリンジェントな条件下で天然のHRIPのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可
能であるが、HRIPまたはその誘導体であって実質上異なるコドンの使用法がある
もの、例えば天然に存在しないコドンの封入があるものをコードするヌクレオチ
ド配列を作り出すことは有益であろう。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基
づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコ
ドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなく
HRIP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由に
は、天然の配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長いなどの
特性を有するRNA転写物の作製がある。
【０１０４】 本発明には、HRIP、HRIP誘導体及びこれらの断片をコードするDNA配列又はそ
れらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後、本技術
分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な
発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてHRIPまたはそ
の任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【０１０５】 更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のポリヌ
クレオチド配列、特に配列番号１５乃至２８で示される配列及びそれらの断片に
ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列も含まれる。（Wahl, G.M. and S.L
. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399-407、Kimmel. A.R. (1987) Method
s Enzymol. 152:507-511.等を参照。）ハイブリダイゼーション条件は、アニー
リング条件及び洗浄条件を含めて「定義」に記載した。
【０１０６】 DNAシークエンシングの方法は本技術分野でよく知られており、本発明の何れ
の実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシ
ング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片
、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elm
er）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ
）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technol
ogies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソ
ヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システ
ム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Waterto
wn MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）等の装置を
用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシン
グシステム（Perkin-Elmer）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（M
olecular Dynamics, Sunnyvale CA）または本技術分野でよく知られている他の
方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を本技術分野で
よく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。（Ausubel, F.M. (199
7) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY,
unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wile
y VCH, New York NY, pp. 856-853.等を参照。）
【０１０７】 HRIPをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ本技術分
野でよく知られているPCR法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロ
モータ及び調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る
方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプ
ライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅す
る方法である。（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322等を参照）
。別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用い
て環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム
遺伝子座及びその周辺の配列からなる制限断片から得る（Triglia, T.ら (1988)
Nucleic Acids Res 16:8186等を参照）。第３の方法としてキャプチャPCR法が
あり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPC
R増幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.ら(1991) PCR Methods Applic
1:111-119等を参照。）この方法では、PCRを行う前に多重制限酵素の消化及び
連結反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能で
ある。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については本技術分
野で知られている。（Parker, J.D.ら (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-306
0等を参照）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ラ
イブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングするこ
とができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イント
ロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対
して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウ
ェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用
いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８
℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１０８】 完全長cDNAをスクリーニングする際は、大きめのcDNAを含むようにサイズ選択
されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムに初回抗原刺激を受け
たライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ラ
イブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラ
リは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１０９】 市販されているキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングま
たはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することが
できる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離の
ための流動性ポリマーと、４つの異なったヌクレオチドに特異的であるような、
レーザーで活性化される蛍光色素と、放出された波長の検出に利用するCCDカメ
ラとを有し得る。出力及び光の強度は、適切なソフトウェア（Perkin-Elmer社の
GENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプル
のロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュ
ータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存
在しないようなDNAの小片のシークエンシングに特に適している。
【０１１０】 本発明の別の実施例では、HRIPをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を、適切な宿主細胞内でHRIP、HRIPの断片またはその機能的等価物を発現さ
せるような組換えDNA分子内でクローニングし得る。遺伝暗号固有の宿重に起因
して、実質的同一或いは機能的等価のアミノ酸配列をコードするような別のDNA
配列を作製してHRIPの発現に利用し得る。
【０１１１】 種々の目的でHRIPがコードする配列を変えるために、本発明のヌクレオチド配
列を本技術分野で一般的に知られている方法を用いて組み換えることができる。
ここで目的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッ
シング、発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダム
なフラグメンテーション及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、
ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド
仲介定方向突然変異誘導を利用して、新規な制限部位の生成、グリコシル化パタ
ーンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を行う突然変異を導
入し得る。
【０１１２】 本発明のヌクレオチドは、MolecularBreedingTM（Maxygen Inc., Santa Clara
CA。米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:79
3-797、Christians, F.C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264、Crameri, A
. ら (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319に記載）等のDNAシャッフリング技術
の対象となり、HRIPの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子
や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝
子断片のPCR仲介再組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセ
スである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するよう
な選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、
更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。こ
のように、遺伝の多様性は「人為的」品種改良及び急速な分子の進化を経て創生
される。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を再結
合し、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリング
することができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た
同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と再結合し、それによって天然に存在する複
数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることがで
きる。
【０１１３】 別の実施例によれば、本技術分野でよく知られている化学的方法を用いて、HR
IPをコードする配列の全部或いは一部を合成し得る。（Caruthers. M.H.ら (198
0) Nucleic. Acids Symp. Ser 7:215-223、Horn, T.ら (1980) Nucleic. Acids
Symp. Ser. 7:225-232等を参照。）或いは、化学的方法を用いてHRIPそれ自体ま
たはその断片を合成し得る。例えば、種々の固相技術を用いてペプチド合成を行
うことができる。（Roberge, J.Y.ら (1995) Science 269:202-204等を参照。）
自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る
。更にHRIPのアミノ酸配列またはその任意の一部は、直接合成する間、または他
のタンパク質から得た配列またはその任意の一部と結合する間、或いはその両方
を行っている間に変更し、変異型ポリペプチドを生成することが可能である。
【０１１４】 ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能であ
る。（Chiez, R.M.and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421等
を参照。）合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによっ
て確認することができる。（Creighton. T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York, NY等を参照。）
【０１１５】 生物学的に活性なHRIPを発現させるために、HRIPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な発現
ベクターとは即ち好適な宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の
調節に必要な要素を含むベクターである。必要な要素には、ベクター及びHRIPを
コードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型
プロモータ、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列がある。このような要素は
、長さ及び特異性が様々である。固有開始シグナルを用いて、HRIPをコードする
配列をより効果的に翻訳することが可能もある。このようなシグナルには、ATG
開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。HRIPをコードする配
列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合
は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しか
しながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレ
ームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれ
るようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び
合成物を起源とし得る。発現の効率は、用いられる特定の宿主細胞系に好適なエ
ンハンサーを包含することによって高めることができる。（Scharf, D. ら (199
4) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.等を参照。）
【０１１６】 当業者によく知られている方法を用いて、HRIPをコードする配列と、好適な転
写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。この方
法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術及びin vivo遺伝子組換え技術がある
。（Sambrook, J. ら (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Press, Plainview NYの4, 8, 16-17章、Ausubel, F.M. ら. (199
5) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York N
Yの9, 13, 16章等を参照。）
【０１１７】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、HRIPをコードする配列を保持及び発
現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換
えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換
させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウィルス発現ベ
クター（例えばバキュロウィルス）に感染した昆虫細胞系や、ウィルス発現ベク
ター（例えばカリフラワーモザイクウィルスCaMVまたはタバコモザイクウィルス
TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転換
させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある。本発明は、使用する宿主
細胞によって限定されるものではない。
【０１１８】 細菌系では、HRIPをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多数
のクローニングベクター及び発現ベクターを選択し得る。例えば、HRIPをコード
するポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング及び増殖
には、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（Li
fe Technologies）などの多機能大腸菌ベクターを用いることができる。HRIPを
コードする配列の、ベクターの多数のクローニング部位への連結反応によって、
lacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌を同定するため
の比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニング
された配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーフ
ァージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう。（Van
Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.等を参照
。）多量のHRIPが必要な場合、例えば抗体を生成する場合などには、HRIPの発現
をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導T5バクテリ
オファージプロモータまたは誘導T7バクテリオファージプロモータを含むベクタ
ーが使用できる。
【０１１９】 酵母の発現系を使用してHRIPを生成し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ
、PGHプロモータ等の構成型或いは誘導型のプロモータを含む多数のベクターが
、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可能である
。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質を分泌或いは細胞内への保
持のいずれかに誘導し、安定した増殖のために外来配列の宿主ゲノムへの組込み
を可能にする。（前出のAusubel (1995) の文献、Bitter, G.A. ら (1987) Meth
ods Enzymol.153:516-544、Scorer. C. A. ら (1994) Bio/Technology 12:181-1
44.等を参照。）
【０１２０】 植物系を使用してHRIPを発現することも可能である。HRIPをコードする配列の
転写は、ウィルスプロモータ、例えば単独或いはTMV（タカマツ, N. (1987) EMB
O J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaM
V由来の35S及び19Sプロモータによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユ
ニット等の植物プロモータまたは熱ショックプロモータを用いてもよい。（Coru
zzi, G. ら (1984) EMBO J. 3:1671-1680、Broglie, R. ら (1984) Science 224
:838-843、Winter, J. ら (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105.等
を参照。）これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とするトラ
ンスフェクションによって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科
学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992)
McGraw Hill New York NY, pp.191-196等を参照。）
【０１２１】 哺乳動物細胞においては、多数のウィルスベースの発現系を利用し得る。発現
ベクターとしてアデノウィルスを用いる場合、HRIPをコードする配列は、後発プ
ロモータ及び３連リーダー配列からなるアデノウィルス転写／翻訳複合体に連結
反応され得る。可欠E1またはE3領域へウィルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でHR
IPを発現する感染ウィルスを得ることが可能である。（Logan, J.and T. Shenk
(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照。）更に、ラウス肉腫ウィ
ルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞に
おける発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタ
ンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１２２】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発
現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療目的のために約
６kb〜１０MbのHACを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミ
ノポリマー、またはベシクル）で供給する。（Harrington. J.J. ら (1997) Nat
Genet.15:345-355.等を参照。）
【０１２３】 長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内
のHRIPの安定発現が望ましい。例えば、発現ベクターであって複製発現因子、内
在性発現因子、或いはその両者のウィルス起源を含むものと、同一或いは別のベ
クター上の選択可能マーカー遺伝子とを用いて、HRIPをコードする配列を細胞株
に形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化
培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は
選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することによ
り、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。
安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技
術を用いて増殖可能である。
【０１２４】 任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものでは
ないがこのような選択系には、tk−単純細胞のために用いられるヘルペスウィル
スチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられるアデニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある。（Wigler, M. ら (1977) Cell 11:223
-232、Lowy, I. ら (1980) Cell 22:817-823等を参照。）また、選択の基礎とし
て代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えば
dhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマ
イシン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、
patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与え
る。（Wigler, M. ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570、Colb
ere-Garapin, F. ら (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14 等を参照。）この他の選
択可能遺伝子、例えば、代謝のための細胞要求を変えるtrpB及びhisDは、文献に
記載されている。（Hartman, S.C.and R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 85:8047-8051等を参照。）可視マーカー、例えばアニトシアニン、
緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグ
ルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい
。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特
定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量すること
が可能である。（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参
照。）
【０１２５】 マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されて
も、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、HRIPをコー
ドする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、HRIPをコードする配列を
含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能であ
る。または単一プロモータ制御下で、HRIPをコードする配列とタンデムにマーカ
ー遺伝子を配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝
子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１２６】 一般に、HRIPをコードする核酸配列を含み且つHRIPを発現する宿主細胞は、当
業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定す
るものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNA或いはDNA-RNAハ
イブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはそ
の両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク
質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術がある。
【０１２７】 特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてHRIPの発
現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、本技術分野で公知である。この
ような技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）
、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などが挙げられ
る。HRIP上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、
２部位モノクローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based i
mmunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらの
アッセイ及びこれ以外のアッセイは、本技術分野で公知である。（Hampton. R.
ら (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul.
MN, Sect. IV、Coligan, J. E. ら (1997) Current Protocols in Immunology,
Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D.
(1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照。）
【０１２８】 多岐にわたる標識方法及び結合方法が、当業者に知られており、様々な核酸ア
ッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。HRIPをコードするポ
リヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼー
ションプローブ或いはPCRプローブを産出する方法には、オリゴ標識化、ニック
トランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR
法がある。或いは、HRIPをコードする配列またはその任意の断片を、mRNAプロー
ブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このような
ベクターは、本技術分野において知られており、市販もされており、T7、T3また
はSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vit ro でRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmers
ham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemical等から市販
されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするため
に用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、阻害剤
、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤等があ
る。
【０１２９】 HRIPをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培
地からのタンパク質の回収及び発現に適した条件下で培養し得る。形質転換細胞
から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列
、ベクター、或いはその両者に依存する。当業者であれば理解し得るように、HR
IPをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核
細胞膜を透過するHRIPの直接分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計でき
る。
【０１３０】 更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現し
たタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではな
いがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコ
シル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」また
は「プロ」形を切断するような翻訳後処理を利用して、タンパク質のターゲティ
ング、折りたたみ、及び／または活性を特定することも可能である。翻訳後の活
性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えば
CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（A
TCC、Bethesda, MD）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処
理を確実にするように選択し得る。
【０１３１】 本発明の別の実施例では、HRIPをコードする天然の核酸配列、変更核酸配列ま
たは組換え核酸配列を、上記任意の宿主系において融合タンパク質の翻訳をもた
らす異種配列に連結反応させることができる。例えば、市販されている抗体を用
いて認識可能な異種部分を含むキメラHRIPタンパク質は、HRIP活性阻害剤に対す
るペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部
分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質
の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレ
ドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、
赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上
で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-
Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG
、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識す
る市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タ
ンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質を遺伝子操作し
、HRIPが精製後に異種部分から切断され得るように、HRIPコード配列と異種タン
パク質配列の間にタンパク質分解切断部位を含めることもできる。融合タンパク
質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販
されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進すること
もできる。
【０１３２】 本発明の更に別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚
芽抽出系（Promega）を用いて、放射能標識したHRIPの合成がin vitroで可能で
ある。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモータと機能的に結合したタンパク
質コード配列の転写及び翻訳を結合する。翻訳は、放射能標識したアミノ酸前駆
体、例えば35Sメチオニンの存在の下で起こる。
【０１３３】 HRIPの断片は、組換え手法によって作製するのみならず、固相技術を用いた直
接ペプチド合成によっても作製し得る（前出のCreighton, pp.55-60.等を参照。
）タンパク質合成は、手作業で行うか自動化し得る。自動化合成は、例えば431A
ペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能である。HRIPの
種々の断片は別々に合成し、後から結合させて完全長分子を形成する。
【０１３４】 （治療） 化学的及び構造的類似性、例えば配列及びモチーフとの関連における類似性が
、HRIPの領域と細胞内リン酸化反応のレギュレータ間に存在する。更にHRIPの発
現は、神経組織と、癌その他の細胞増殖異常症と、炎症及び免疫応答とに密接に
関連している。従ってHRIPは、神経疾患、細胞増殖異常症及び自己免疫異常症／
炎症性疾患において或る役割を果たすものと考えられる。HRIPの発現または活性
の増大に関連する疾患の治療においては、HRIPの発現または活性を低下させるこ
とが望ましい。また、HRIPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療におい
ては、HRIPの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１３５】 従って、或る実施例において、HRIPの発現または活性の低下に関連した疾患の
治療または予防のために、患者にHRIPまたはその断片や誘導体を投与することが
可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として神経疾患が含ま
れ、その中には癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー
病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋
萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網
膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウィルス性
髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄
炎及び神経根炎、ウィルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐
ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン
病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬
化症、小脳網膜性血管芽腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳
３叉神経血管症候群、精神薄弱その他の中枢神経系の発達障害、脳性麻痺、神経
骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフ
ィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、
代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、
気分障害、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害（SAD）
と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥
症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、
進行性核上麻痺、皮質基底核変性症（corticobasal degeneration）、家族性前
頭側頭骨痴呆が含まれ、また細胞増殖異常症も含まれ、その中には日光性角化症
、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組
織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、
原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌
を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、
消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、
唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、また自己免疫
異常症／炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジ
ソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血
、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎
、自己免疫多発性内分泌腺障害症（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、
クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一
時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッド
パスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏
性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、
骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、
強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全
身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌
合併症、血液透析、体外循環、ウィルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生
虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれる。
【０１３６】 別の実施例では、HRIPまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に
投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むHRIPの発現または活性の
低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１３７】 更に別の実施例では、実質的に精製されたHRIPを含む医薬品成分を好適な医薬
用担体と共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むHRIP
の発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である
。
【０１３８】 更に別の実施例では、HRIPの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限
定するものではないが上記した疾患を含むHRIPの発現または活性の低下に関連し
た疾患を治療または予防することも可能である。
【０１３９】 更に別の実施例では、患者にHRIPのアンタゴニストを投与して、HRIPの発現ま
たは活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限定す
るものではないがこのような疾患の例には、上記した神経疾患、細胞増殖異常症
及び自己免疫異常症／炎症性疾患がある。一実施態様においては、アンタゴニス
トとして直接的に、或いはHRIPを発現する細胞または組織に薬剤を輸送するター
ゲティングまたは輸送機構として間接的にHRIPと特異結合する抗体を用いること
ができる。
【０１４０】 別の実施例では、HRIPをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベク
ターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むHRIPの発現
または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１４１】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与する
こともできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従
ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治
療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各
薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減
し得る。
【０１４２】 HRIPのアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製
造し得る。具体的には、精製されたHRIPを用いて抗体を作るか、治療薬のライブ
ラリをスクリーニングして、HRIPと特異結合するものを同定することが可能であ
る。HRIPの抗体も、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造するこ
とが可能である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片及びFab発現ライ
ブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害
する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０１４３】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む
種々の宿主は、HRIP、またはHRIPの任意の断片またはオリゴペプチドであって免
疫原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。宿
主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。
限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバント
と、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プル
ロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペット
ヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられる
アジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウ
ム‐パルヴムが特に好ましい。
【０１４４】 HRIPに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断
片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には少なくとも約１０のアミ
ノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。これらのオリゴペプチド、
ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり且
つ小さな天然の分子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。HRIPアミノ酸の短
い伸長部は、別のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシニアンの配列
と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１４５】 HRIPに対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて
、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのよ
うな技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハ
イブリドーマ技術がある。（Kohler, G. ら. (1975) Nature 256:495-497、Kozb
or, D. ら (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. ら (1983) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. ら (1984) Mol. Cell Bio
l. 62:109-120等を参照。）
【０１４６】 更に、「キメラ抗体」を作製するために開発した技術、例えば好適な抗原特異
性及び生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝
子へのスプライシングを用いることが可能である。（Morrison, S.L.ら. (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Neuberger, M.S.ら (1984) Natur
e 312:604-608、タケダ, S.ら (1985) Nature 314:452-454等を参照。）或いは
、一本鎖抗体を産生するために説明された技術を適用し、本技術分野で知られて
いる方法を用いて、HRIP特異性一本鎖抗体を産生し得る。関連特異性を有するが
イディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリン
ライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる。（Burt
on D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照。） 抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免
疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高
特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る。（Orlandi, R. ら
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. ら (1991) N
ature 349:293-299等を参照。）
【０１４７】 HRIPのための特異結合部位を有する抗体を産生することもできる。例えば、限
定するものではないがこのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作
製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を減らすことによっ
て作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによ
って、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが
可能となる（Huse, W.D. ら (1989) Science 256:1275-1281等を参照。）
【０１４８】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射線アッセイまたは競合結合アッセ
イに対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイ
ムノアッセイは通常、HRIPとその特異性抗体間の複合体形成の計測に関与してい
る。２つの非干渉性HRIPエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いるよう
な、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合
結合アッセイを利用してもよい（前出のPoundの文献）。
【０１４９】 ラジオイムノアッセイ技術と共に様々な方法、例えばスキャッチャード分析を
用いて、HRIPに対する抗体の親和性を評価する。親和性は結合定数Kaで表す。Ka
は、平衡状態においてHRIP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃
度で除した値であると定義する。ポリクローナル抗体は多様なHRIPエピトープに
対する親和性が不均一であり、ポリクローナル抗体試薬のために決定したKaは、
HRIP抗体の平均親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は特定のHRIP
エピトープに対して単一特異的であり、モノクローナル抗体試薬のために決定し
たKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が約１０9〜１０12 L/molの範囲にあ
るような高親和性抗体試薬は、HRIP抗体複合体が激しい操作に耐えなければなら
ないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が約１０6〜１０7 L/molの範囲
にあるような低親和性抗体試薬は、HRIPが抗体から最終的に活性化状態で解離す
る必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい（Catty, D. (1988)
Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC、
Liddell, J. E.and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antib odies , John Wiley & Sons, New York NY）。
【０１５０】 ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、或る下流の適
用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、
少なくとも１〜２mg/ml、好ましくは５〜１０mg/mlの特異抗体を含むポリクロー
ナル抗体試薬は、HRIP抗体複合体を沈殿させる必要がある処理において通常用い
られる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や
使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のCattyの文献、
同Coligan らの文献等を参照）。
【０１５１】 本発明の別の実施例では、HRIPをコードするポリヌクレオチド、HRIPの任意の
断片または相補配列を治療目的で使用することができる。ある実施形態では、HR
IPをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止するのに好適で
ある場合にこれを使用し得る。具体的には、HRIPをコードするポリヌクレオチド
に相補的な配列で細胞を形質転換し得る。従って、相補的分子または断片は、HR
IP活性を調節するため、または遺伝子機能を調節するために使用し得る。このよ
うな技術は既に本技術分野ではよく知られており、センスまたはアンチセンスオ
リゴヌクレオチドまたは大きな断片を、HRIPをコードする配列のコード領域また
は制御領域に延在する様々な位置から設計することが可能である。
【０１５２】 レトロウィルス、アデノウィルス、ヘルペスまたはワクシニアウィルス由来の
発現ベクターまたは様々な細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、標的
器官、組織または細胞集団にヌクレオチド配列を輸送することができる。当業者
によく知られている方法を用いて、HRIPをコードするポリヌクレオチドに相補的
な核酸配列を発現するようなベクターを作製することができる。（前出のSambro
ok らの文献、同Ausubel らの文献等を参照。） HRIPをコードする高レベルのポリヌクレオチドまたはその断片を発現するよう
な発現ベクターを用いて細胞または組織を形質転換することによって、HRIPをコ
ードする遺伝子を遮断することができる。このような作製物を用いて、翻訳不可
能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞内に導入することができる。この
ようなベクターは、DNA内に統合されない場合であっても内在性ヌクレアーゼに
よって機能が損なわれるまでmRNA分子を転写し続けることができる。一過性の発
現は、非複製ベクターを用いた場合には１か月間以上続き、好適な複製要素がベ
クター系の一部である場合には更に長い間続くことがある。
【０１５３】 上記した通り、遺伝子発現の調節は、HRIPをコードする遺伝子の５'即ち調節
領域を制御するべく相補配列またはアンチセンス分子（DNA、RNAまたはPNA）を
設計することによって得ることが可能である。転写開始部位由来のオリゴヌクレ
オチドを用いることが可能であり、転写開始部位とは例えば開始部位から数えて
約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて
阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子、または
調節分子の結合のために十分に広がる二重らせんの能力を阻止するので、三重ら
せん塩基対形成は有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩につい
ては文献に記載されている。（Gee, J.E. ら (1994) in: Huber, B.E.and B.I.
Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. K
isco, NY, pp.163-177等を参照。）相補配列またはアンチセンス分子もまた、転
写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべ
く設計することができる。
【０１５４】 リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザ
イムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切
断に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーシ
ョンが関与している。例えば、組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子は、
HRIPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒する。
【０１５５】 任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を
含む、リボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同
定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する、リ
ボヌクレオチドが１５〜２０の短いRNA配列を、オリゴヌクレオチドを機能不全
にするような２次的構造の特徴に対して評価することが可能になる。候補標的の
適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うこ
とができる。
【０１５６】 本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために本技術分
野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。
或いは、HRIPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子
を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロ
モータを用いて多様なベクター内に組み入れることが可能である。或いは、相補
的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA作製物を、細胞株、細
胞または組織内に導入することができる。
【０１５７】 細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することがで
きる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５'末端、３'末端、ある
いはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホ
スホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2' Oメチルを使用し
たりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら
全ての分子に拡大することができる。それには、内在性エンドヌクレアーゼによ
って容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジ
ンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものに加えて、非従来
型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine
）等を包含することによる。
【０１５８】 ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo
、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合
、ベクターを患者から採取した肝細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患
者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入また
はポリカチオンアミノポリマーによる輸送は、本技術分野でよく知られている方
法を用いて実行することができる。（Goldman, C.K. ら (1997) Nat. Biotechno
l. 15:462-466.等を参照。） 上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ
、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０１５９】 本発明の追加実施例は、薬剤として許容できる担体と併せて、上記の任意の治
療効果を得るための医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬
品成分は、HRIP、HRIPに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、また
はHRIP阻害剤から構成し得る。成分は、単体で投与するか、或いは少なくとも１
の別の薬剤（例えば安定剤）と共に投与し得る。薬剤は、限定するものではない
が生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水など、任意の無菌の生体適合性医薬品
担体中で投与し得る。成分は、患者に単独で、或いは他の薬剤、薬物またはホル
モンと共に投与し得る。
【０１６０】 本発明に用いられる医薬品成分は、任意の数の経路によって投与することがで
き、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内
、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下また
は直腸がある。
【０１６１】 活性成分に加えてこれらの医薬品成分には、活性化合物を薬剤として許容でき
る好適な担体を有し得る。担体は、薬剤として使用可能なプレパラートへの活性
化合物の処理を促進するような医薬品添加物及び補助剤からなる。製剤及び投与
の技術については、Remington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing,
Easton PA）の最新版に詳細に記載されている。
【０１６２】 経口投与の医薬品成分は、本技術分野でよく知られている、薬剤として許容で
きる担体を用いて、経口投与に適した量で調剤することが可能である。このよう
な担体を用いることによって、医薬品成分を患者が摂取できるように錠剤、丸薬
、糖衣剤、カプセル剤、液状薬、ゲル状薬、シロップ剤、泥状物、懸濁液等とし
て製剤することが可能となる。
【０１６３】 経口投与の医薬品製剤は、活性化合物を固形の薬品添加物と結合させ、その結
果として得られた顆粒の混合物を（オプションで、すりつぶした後で）タブレッ
トまたは糖衣錠のコアが得られるように処理することによって、得ることができ
る。所望に応じて好適な医薬品添加物を加えることができる。好適な医薬品添加
物には糖質またはタンパク質賦形剤があり、具体例としてはラクトース、スクロ
ース、マンニトール、ソルビトールを含む糖類と、トウモロコシ、小麦、米、ジ
ャガイモその他の植物から採取されるでんぷんと、メチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム等の
セルロースと、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴムと、ゼラチン及び
コラーゲン等のタンパク質とが挙げられる。例えば架橋結合したポリビニルピロ
リドン、かんてん、アルギン酸またはアルギン酸塩（例えばアルギン酸ナトリウ
ム）等の崩壊剤または可溶化剤を所望に応じて添加してもよい。
【０１６４】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤等の好適なコーティングと共に用い得る。好適なコ
ーティングにも、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（
carbopol）ゲル、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカ
ー溶剤及び好適な有機溶媒または溶剤混合液等がある。製品の同定のため或いは
活性化合物の量即ち投与量を示すために、染料または色素を錠剤または糖衣錠に
添加してもよい。
【０１６５】 経口投与に用いることができる医薬品製剤には、ゼラチンでできた密封ソフト
カプセル及びグリセロールやソルビトール等のコーティングのみならず、ゼラチ
ンでできたプッシュ−フィット型（push-fit）カプセルもあり得る。プッシュ−
フィット型カプセルには、ラクトースまたはスターチ等の賦形剤や結合材と、タ
ルクまたはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤と、更にオプションで安定剤と
混合されたような活性成分を含めることが可能である。ソフトカプセルにおいて
は、安定剤を用いて或いは安定剤を用いずに、脂肪油、溶液またはポリエチレン
グリコール溶液等の好適な溶液中で活性化合物が溶解或いは懸濁し得る。
【０１６６】 非経口投与に適した医薬品製剤は、水溶液中で、好適にはハンクス液、リンガ
ー液、生理緩衝食塩水等の生理学的に適合性のあるバッファ中で製剤することが
できる。水性の注入懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビ
トール、デキストラン等の懸濁液の粘性を高める物質を有し得る。更に好適な油
性の注入懸濁液として活性化合物の懸濁液を製剤し得る。好適な親水性溶液また
は培地には、ごま油等の脂肪油またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、リボ
ソーム等の合成脂肪酸エステルがある。輸送のために非脂質ポリカチオンアミノ
ポリマーを用いてもよい。高濃度溶液の調剤が可能となるように、化合物の溶解
性を高める好適な安定剤または薬剤をオプションで懸濁液に含めてもよい。
【０１６７】 局所または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用
いられる。このような浸透剤は、本技術分野で通常に知られている。
【０１６８】 本発明の医薬品成分は、本技術分野でよく知られている方法、例えば従来の混
合、溶解、顆粒化、糖衣化、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥
処理等を用いて製造し得る。
【０１６９】 医薬品成分は塩として製剤され、限定するものではないが、塩酸、硫酸、酢酸
、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩は
、対応する遊離塩基形に比べて水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別
の場合では、薬剤は、１mM〜５０mMヒスチジン、０.１％〜２％スクロース、及
び／または２％〜７％マンニトールを含み、pHの範囲が４.５〜５.５であり、使
用前に緩衝剤と結合するような凍結乾燥粉末とすることができる。
【０１７０】 医薬品成分は、調合が完了した後に、指定された症状の治療のために適当な容
器に詰めて標識することができる。HRIPを投与するための投与の量、頻度及び方
法がラベルに書かれることになる。
【０１７１】 本発明に用いるのに適した医薬品成分には、意図する目的を達成するために効
果的な量の活性成分を含む組成物が含まれる。効果的な服用量は、当業者が自己
の能力の範囲内で決定する。
【０１７２】 任意の組成物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養ア
ッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ
等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた
、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を
用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０１７３】 治療上の有効投与量は、症状や容態を回復させるような活性成分量を参考にす
る。そのような活性成分の例としては、HRIPまたはその断片、HRIPの抗体、HRIP
のアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤がある。薬用有効度及び毒性は、細
胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の
５０％の医薬的有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）を測定するなどし
て決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数
であり、LD50／ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような医薬
品成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒト
に用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含
まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範
囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路に
よって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０１７４】 正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が
決定するであろう。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持
するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重
症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度
、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い
医薬品成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１
度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与してよい。
【０１７５】 通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、
合計で約１gまでとする。特定の投与量及び輸送方法に関するガイダンスは文献
に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、
タンパク質または阻害剤に対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を
利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの輸送は、
特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなることになる。
【０１７６】 （診断） 別の実施例では、HRIPの発現によって特徴付けられる疾患の診断のために、或
いはHRIPやHRIPのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤で治療を受けている
患者をモニターするためのアッセイにおいて、HRIPを特異的に結合する抗体が用
いられることがある。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方
法と同じ方法で調合される。HRIPの診断アッセイには、抗体及び標識を利用して
ヒトの体液において或いは細胞や組織のエキスにおいてHRIPを検出する方法が含
まれる。抗体は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポーター分子の共有結
合性或いは非共有結合性の接着によって標識化し得る。多様なレポーター分子が
本技術分野で知られており、それらを用いることができる。幾つかのレポーター
分子については上記した。
【０１７７】 HRIPを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が本技術
分野において知られており、HRIP発現の修正レベル或いは異常レベルを診断する
基準を提供する。複合体の形成に適した条件下でヒト対象等の正常な哺乳動物対
象から採取した体液または細胞とHRIPに対する抗体とを結合させることにより、
HRIP発現の正常値または標準値が決定される。標準複合体形成量は、種々の方法
、例えば測光法で定量できる。対象内で発現したHRIPの量、制御、検体からの病
変サンプルを標準値と比較する。標準値と対象との偏差が疾患を診断するパラメ
ータとなる。
【０１７８】 別の実施例によれば、HRIPをコードするポリヌクレオチドを診断目的に用いる
こともできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオ
チド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。ポリヌクレオチドは
、検体におけるHRIPの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現
の検出及び定量に用いることができる。診断アッセイは、HRIPの不在、存在及び
過剰発現を測定するために、そして治療インターベンション中にHRIPレベルの調
製を監視するために用いることができる。
【０１７９】 ある実施形態では、HRIPをコードする核酸配列を同定するために、HRIPまたは
近縁の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能な
PCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いることができる。プローブが同
定するのはHRIP、突然変異体または関連配列をコードするような、天然に存在す
る配列のみであるか否かは、プローブの特異性及びハイブリダイゼーション或い
は増幅のストリンジェンシーによって決定されることになる。ここで、プローブ
の特異性とは、プローブが高特異領域（例えば５'調節領域）からなるのか、低
特異領域（例えば保存されたモチーフ）からなるのかということである。
【０１８０】 プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はHRIP
をコードする任意の配列と少なくとも５０％の相同性を有し得る。本発明のハイ
ブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAとすることができ、配列番号１５乃
至２８の配列、或いはHRIP遺伝子のプロモータ、エンハンサー、イントロンを含
むゲノム配列に由来し得る。
【０１８１】 HRIPをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製
する方法には、HRIPまたはHRIP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、mR
NAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。mRNA
プローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好
適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって
、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーシ
ョンプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集
団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合
系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙
げられる。
【０１８２】 HRIPの発現に関連する疾患を診断するために、HRIPをコードするポリヌクレオ
チド配列を用いることができる。限定するものではないがこのような疾患の例と
して限定するものではないがこのような疾患の例として神経疾患が含まれ、その
中には癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピッ
ク病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側
策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺
伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウィルス性髄膜炎、
脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神
経根炎、ウィルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病
及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致
死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小
脳網膜性血管芽腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経
血管症候群、精神薄弱その他の中枢神経系の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常
症、自律神経系障害、脳神経障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその
他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、
内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害
、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害（SAD）と、静座
不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、
ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核
上麻痺、皮質基底核変性症（corticobasal degeneration）、家族性前頭側頭骨
痴呆が含まれ、また細胞増殖異常症も含まれ、その中には日光性角化症、動脈硬
化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MC
TD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血
小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌
、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、
心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、
皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、また自己免疫異常症／
炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病、
成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、
アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免
疫多発性内分泌腺障害症（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン
病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リン
パ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャ
ー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症
候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょ
う症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、
シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化
症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、
血液透析、体外循環、ウィルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症
、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれる。 HRIPをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン法、ノーザン法、ドットブロ
ット法やその他の膜ベースの技術と、PCR法と、ディップスティック（dipstick
）法、ピン及びマルチフォーマットELISA様アッセイと、変異HRIPの発現を検出
するために患者から採取した体液または組織を利用するマイクロアレイとにおい
て使用し得る。このような定性または定量方法は、本技術分野で公知である。
【０１８３】 或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて
、HRIPをコードするヌクレオチド配列が有効であろう。HRIPをコードするヌクレ
オチド配列は標準法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適
な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することができ
る。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを
定量して標準値と比較する。患者サンプルのシグナル量が制御サンプルと比べて
著しく変化している場合は、サンプル内のHRIPをコードするヌクレオチド配列の
変異レベルは関連する疾患の存在を示している。このようなアッセイは、動物実
験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療
を監視するために用いることもできる。
【０１８４】 HRIPの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現のための正常あ
るいは標準概要を確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適
な条件下で、動物或いはヒトの正常な対象から抽出した体液或いは細胞を、HRIP
をコードする配列またはその断片と結合させることにより達成され得る。実質的
に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な対
象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量するこ
とができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサン
プルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在
を確定する。
【０１８５】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正
常な対象に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリ
ダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返されるであろう。連続アッセイか
ら得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すこと
ができる。
【０１８６】 癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現また
は過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる
前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、
医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生ま
たは更なる進行を防止することが可能となる。
【０１８７】 HRIPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドを追加的に診断上利
用することは、PCRの利用に関与し得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成
するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、
好ましくはHRIPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはHRIPをコードする
ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドの断片を含み、最適条件下で特定の
遺伝子や条件を識別するべく利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリ
ンジェント条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその両方の
ため用いることが可能である。
【０１８８】 HRIPの発現を定量するためにも用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標
識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）及び標準曲線
から得た結果の補間が含まれる。（Melby, P.C.ら (1993) J. Immunol. Methods
, 159:235-244、Duplaa, C.ら (1993) Anal. Biochem. 212:229-236等を参照。
）目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または非色応答によ
って定量が迅速になるようなハイスループットフォーマットのアッセイを行うこ
とによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０１８９】 更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来の
オリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発現レベルを同
時に監視し、遺伝的変異体、突然変異及び多型現象を同定することができる。こ
の情報は、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、治
療薬剤の活性を開発及び監視するために有用である。
【０１９０】 マイクロアレイは本技術分野でよく知られている方法を用いて準備し、使用し
、そして分析する。（Brennan, T.M. ら (1995) の米国特許第5,474,796号、Sch
ena, M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschwei
ler ら (1995) のPCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.ら (1995) のPCT出願第W
O95/35505号、Heller, R.A. ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2
155、Heller, M.J. ら (1997) の米国特許第5,605,662号等を参照。） 本発明の別の実施例では、天然のゲノム配列をマッピングする際に有効なハイ
ブリダイゼーションプローブを産出するため、HRIPをコードする核酸配列を用い
ることが可能である。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工
形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌
人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマ
ッピングされる。（Harrington, J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345-355、Pric
e, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:
149-154等を参照。）
【０１９１】 蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的染色体マッピング技術
及び遺伝地図データと相関し得る。（Heinz-Ulrich, ら (1995) 前出のMeyers,
pp. 965-968.等を参照。）遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnli
ne Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる
。物理的染色体地図上のHRIPをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性
、或いは特定の疾患に対する素因が、その疾患に関係するDNAの領域を画定する
のに役立つであろう。健常者、保有者、感染者の三者間における遺伝子配列の相
違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０１９２】 確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色
体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。
マウス等、別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、特定のヒト
染色体の数或いはアームが分かっていない場合でも関連するマーカーが明らかに
なるであろう。新規の配列は、物理的マッピングによって染色体アームに割付け
可能である。このことは、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて遺
伝的疾患を調査する研究者にとって価値ある情報である。疾患または症候群が、
血管拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって
大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなるマッピングも、更なる
調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる。（Gatti, R.A.
ら (1988) Nature 336:577-580等を参照。）転座、反転等に起因する、健常者、
保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌ
クレオチド配列を用いてもよい。
【０１９３】 本発明の別の実施例では、種々の薬剤スクリーニング技術を以って化合物のラ
イブラリをスクリーニングするために、HRIP、HRIPの触媒作用断片、免疫原断片
、またはそのオリゴペプチドを用いることができる。薬剤スクリーニングに用い
る断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に
保持されるか、細胞内に位置することになろう。HRIPとテストされる薬剤との結
合複合の形成は計測できる。
【０１９４】 別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性
を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる。（Geys
en,ら (1984) のPCT出願番号 WO84/03564等を参照。）この方法においては、多
数の異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、HRIP
或いはその断片と反応させ、洗浄する。次に、本技術分野でよく知られている方
法で、結合したHRIPを検出する。精製したHRIPはまた、上記した薬剤のスクリー
ニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別
法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定す
ることもできる。
【０１９５】 別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。この
アッセイでは、HRIPを結合することができる中和抗体が、HRIPを結合するための
試験化合物と特異的に競合する。この方法では、抗体が、１若しくは数個の抗原
決定因子をHRIPと共有するペプチドの存在を検出する。
【０１９６】 別の実施例では、新規技術が現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定
するものではないがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対の相互作用等を含む
）に依存するのであれば、依然として発展すべきいかなる分子生物学技術におい
ても、HRIPをコードするヌクレオチド配列を用いることができる。
【０１９７】 詳細説明を追加しなくとも、本技術分野の技術者であれば以上の説明を以って
本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単
なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０１９８】 本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第
60/125,593号、同第60/135,049号、同第60/143,188号は、言及することをもって
本明細書の一部となす。
【０１９９】 （実施例） １ cDNAライブラリの作製 RNAは、Clontech社から購入し、或いは表４に列記した組織から単離した。ホ
モジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、
また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織
もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネ
ートの単相溶液であるTRIZOL（Life Technologies）等である。結果として得ら
れた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。
イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別
の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０２００】 RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰
り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは
、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, V
alencia CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RN
Aを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キッ
ト（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２０１】 場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをS
tratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、本技術分野で公知の
推奨方法または類似の方法を用いて、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）ま
たはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いてcDNAを合成
し、cDNAライブラリを作製した。（前出のAusubel, 1997, unit 5.1-6.6等を参
照。）逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成
オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素で
cDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（３００〜１０００
bp）選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムク
ロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは調製用アガロースゲ
ル電気泳動法を用いて行った。cDNAは、好適なプラスミドのポリリンカーの適合
性制限酵素部位に連結反応させた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプ
ラスミド（Stratagene）、pSPORT1プラスミド（Life Technologies）またはplNC
Y（Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA）等である。組換えプラスミドは、S
tratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社
のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に形質転
換した。
【０２０２】 ２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或い
は細胞溶解によって、プラスミドを宿主細胞から回収した。MagicまたはWIZARD
Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Bios
ystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus P
lasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミ
ドキットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミドを精製した。沈殿させた
後、０.１mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに、４℃
で保管した。
【０２０３】 別法では、ハイスループットフォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿
主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem.
216:1-14）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で
行った。サンプルを処理し、それを384穴プレート内で保管し、増幅したプラス
ミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFluoroska
n II蛍光スキャナー（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的
に定量した。
【０２０４】 ３ シークエンシング及び分析 cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いはハイスループット装置、例えば
ABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）またはPTC-200 サーマ
ルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scient
ific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した
。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬ま
たはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle s
equencing ready reaction kit（Perkin-Elmer）に与えられた試薬を用いて準備
した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチド
の検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamic
s）か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM
373または377シークエンシングシステム（Perkin-Elmer）か、或いはその他の本
技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。cDNA配列の読み枠は、
標準的方法（前出のAusubel, 1997, unit 7.7）を用いて決定した。cDNA配列の
幾つかを選択して、本実施例５に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２０５】 cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、当業者によく知られたアルゴリ
ズムを利用するソフトウェアの組合せを用いて構築し、解析した。利用したツー
ル、プログラム及びアルゴリズムの概略、適用可能な説明、引用文献、閾値パラ
メータを表５に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表５の列１
に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な引用文献であり、全文献は
そっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列
４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他の
パラメータを示す（スコアが高ければ高いほど２配列間の相同性が高くなる）。
配列の解析は、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリン
グ, South San Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて
行った。
【０２０６】 ポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリA配列を除去すること
により、またあいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。そ
の際、BLAST、動的プログラミング、及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づく
アルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、BLAST、FASTA及びBLIMPSに基づく
プログラムを用いて、プログラム中の注釈を得るべく、公共のデータベース、例
えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベ
ースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMの選択に対する配列を問い合わ
せした。配列はPhred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて完全長のポ
リヌクレオチド配列に構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを
用いてオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完
全長アミノ酸配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、その後
、GenBankデータベース（上記）、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及
びProsite等のデータベース、PFAM等のHidden Markov Model（HMM）ベースのタ
ンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長配列を分析した
。HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を解析する確率的アプロー
チである。（Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参
照。）
【０２０７】 完全長ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記のプロ
グラムは、配列番号１５乃至２８からのポリヌクレオチド配列の断片を同定する
ためにも使用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅に有用な約２０〜約４０
００のヌクレオチドの断片は、上記「発明」の項で説明した。
【０２０８】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験
技術であり、標識されたヌクレオチド配列の、特定の細胞種または組織からのRN
Aが結合される膜へのハイブリダイゼーションに関与している。（前出のSambroo
k, 7章、同Ausubel. F.M. ら, 4章及び16章等を参照。）
【０２０９】 BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyt
e Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分
子を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも断然
速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決
定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準はプ
ロダクトスコアであり、次式で定義される。 （％配列一致率×％最大BLASTスコア）／１００ プロダクトスコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考
慮している。例えば、プロダクトスコアが４０であれば誤差１〜２％以内の精度
で一致し、プロダクトスコアが７０であれば正確に一致することになる。類似分
子は通常、１５〜４０のプロダクトスコアを示す分子を選択することにより同定
する。それ以下のスコアでは、関連分子を同定し得る。
【０２１０】 ノーザン分析の結果は、HRIPをコードする転写物が作出されたライブラリの分
布パーセンテージとして報告される。分析は、器官／組織及び疾患によるcDNAラ
イブラリのカテゴリー分類に関与している。器官／組織のカテゴリーには、心血
管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖及び泌尿器が
ある。疾患／病状のカテゴリーには、癌、炎症、外傷、細胞増殖、神経、貯留（
pooled）が含まれる。カテゴリー毎に目的の配列を発現するライブラリ数を数え
、それを全カテゴリーのライブラリ数で除した。組織特異発現及び疾患／病状特
異発現のパーセント値を表３に示す。
【０２１１】 ５ ポリヌクレオチドをコードするHRIPの伸長 配列番号１５乃至２８の完全長の核酸配列は、完全長分子の適切な断片から設
計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一
方のプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマ
ーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、
長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が５０％以上となり、約６８〜７２
℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（Nati
onal Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。
ヘアピン構造及びプライマー-プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの
伸長は全て回避した。
【０２１２】 配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。２段階以上
の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネ
ステッドセットを設計した。
【０２１３】 高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって
得られた。PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて
96穴プレート内で行った。反応混合液には、DNA鋳型、各プライマー２００nmol
と、Mg2+、(NH4)2SO4 及びβ-メルカプトエタノールを含む反応バッファと、Taq
DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）と、ELONGASE酵素（Life Tec
hnologies）と、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）が含まれていた。プライマ
ー対PCI A、PCI Bに対して用いたパラメータは次の通りである。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ６０℃で１分間 ステップ４： ６８℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： ６８℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存 プライマー対T7、SK+に対しては、上記パラメータに代えて以下のパラメータを
用いた。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ５７℃で１分間 ステップ４： ６８℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： ６８℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存
【０２１４】 1X TEに溶解したPICOGREEN定量試薬（０.２５％(v/v) PICOGREEN、Molecular
Probes, Eugene OR）１００μlと、希釈していないPCR産物０.５μlとを不透明
な蛍光光度計プレート（Coming Costar, Acton MA）の各穴に分配し、DNAを試薬
と結合可能なようにさせることによって各穴内のDNA濃度の測定を行った。サン
プルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するべくプレートをFluoroskan II （Lab
systems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコート５
〜１０μlを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応
が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０２１５】 伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコ
レラウィルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）
を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結反
応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、
消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し
、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローン
をT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（A
mersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）
で処理して制限部位の張出部（overhang）を満たし、コンピテント大腸菌細胞に
形質移入した。形質移入した細胞を抗生物質含有培地上で選択し、個々のコロニ
ーを選択してLB/2x carb液体培地の384穴プレート内において３７℃で一晩培養
した。
【０２１６】 細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）及びPfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いてPCRによってDNAを増幅した。その際用
いたパラメータは次の通りである。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ６０℃で１分間 ステップ４： ７２℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２９回繰り返す ステップ６： ７２℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存 DNAは、上記のPICOGREEN試薬（Molecular Probes）によって定量した。DNAの回
収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０
％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC energy transfer
sequencing primer及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）ま
たはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Per
kin-Elmer）を用いてシークエンシングした。
【０２１７】 同様に、上記手順と、伸長のために設計されたオリゴヌクレオチドと、適切な
ゲノムライブラリを用いて、５'調節配列を得るべく、配列番号１５乃至２８の
ヌクレオチド配列が用いられる。
【０２１８】 ６ 個々のハイブリダイゼーションの標識及び使用 配列番号１５乃至２８から得たハイブリダイゼーションプローブを利用して、
cDNA、ゲノムDNAまたはmRNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリ
ゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に
対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソ
フトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各
オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸 （Amersham Pharmacia Bi
otech）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）
を結合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-2
5超細繊分子サイズ排除デキストランビードカラム（Amersham Pharmacia Biotec
h）を用いて実質的に精製する。 Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１
つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイ
ブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを
含むアリコットを用いる。
【０２１９】 各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ny
tran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーショ
ンは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１x
クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件
下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代
わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比
較する。
【０２２０】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基質の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である。（前出のBaldeschweiler等を参照。）ドットブロッ
ト法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、機
械的または化学的結合手順を用いて基質の表面に要素を配置及び結合させてもよ
い。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作製でき
、任意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーション後にハイブリダイ
ズされていないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパタ
ーンを決定する。スキャンしたイメージを分析することで、マイクロアレイ上で
要素にハイブリダイズする各プローブの相補性の度合い及び相対発生量を算定で
きる。
【０２２１】 完全長のcDNA、発現遺伝子標識（EST）またはこれらの断片は、マイクロアレ
イの要素を構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、LASERGENEソ
フトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択する
ことが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のcDNA、EST、ま
たはこれらの断片、或いは本発明に関連するcDNAライブラリから任意に選択した
cDNAを、ガラススライド等の好適な基質に配置する。cDNAは、例えばＵＶ架橋剤
を利用してスライドに固定してから、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥さ
せる（Schena, M. ら. (1995) Science 270:467-470、Shalon, D. ら (1996) Ge
nome Res. 6:639-645等を参照。）蛍光プローブを調製して、基質上の要素にハ
イブリダイゼーションするために用いる。基質は、上記した方法で分析する。
【０２２２】 ８ 相補的ポリヌクレオチド HRIPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的配列は、天然のHR
IPの発現を検出し、低下させ、または阻害するために用いられる。約１５〜約３
０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或い
は大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4
.06ソフトウェア（National Biosciences）、及びHRIPをコードする配列を用い
て、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特
な５' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモータが
コーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的オ
リゴヌクレオチドを設計して、HRIPをコードする転写物にリボソームが結合する
のを阻害する。
【０２２３】 ９ HRIPの発現 HRIPの発現及び精製は、細菌またはウィルスをベースにした発現系を用いて行
うことができる。細菌でHRIPが発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レ
ベルを高める誘導性のプロモータを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニン
グする。このようなプロモータには、lacオペレーター調節要素に関連するT5ま
たはT7バクテリオファージプロモータ及びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモータ
が含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21(DE3)
等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピル
β-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されるとHRIPを発現する。真核細胞
でのHRIPの発現は、一般にバキュロウィルスとして知られているAutographica c alifornica 核多面性ウィルス（AcMNPV）を昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に感
染させて行う。バキュロウィルスの可欠ポリヘドリン遺伝子を、相同的組換え、
或いは転移プラスミドの仲介に関与する細菌仲介遺伝子転移のどちらかによって
、HRIPをコードするcDNAと置換する。ウィルスの感染力は維持され、強いポリヘ
ドリンプロモータによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロ
ウィルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞に感染に用い
られるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、
バキュロウィルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（Engelhard. E. K.ら (19
94) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. G
ene Ther. 7:1937-1945.等を参照。）
【０２２４】 殆どの発現系では、融合タンパク質としてHRIPを合成するのに例えばグルタチ
オンSトランスフェラーゼ（GST）またはペプチドエピトープ標識、例えばFLAGや
6-Hisを用いる。これらを用いることにより、未精製細胞溶解物から組換え融合
タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に１ステップで行うことができる。GST
は日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持
した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Amer
sham Pharmacia Biotech）。精製後、GSTの部分を特定の開発部位においてHRIP
からタンパク分解的に切断することが可能である。FLAGは８アミノ酸のペプチド
であり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体（Eastma
n Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して
伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂（QIAGEN）上での精製を可能にする。タン
パク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載され
ている。これらの方法で精製したHRIPを直接用いて以下のアッセイを行うことが
できる。
【０２２５】 １０ HRIP活性の実証 HRIPのキナーゼ活性は、γ-標識32P-ATPを用いた好適な基質のリン酸化反応と
、βラジオアイソトープカウンタを用いた摂取放射能の定量によって決定する。
HRIPは、タンパク質基質、32P-ATP及び好適なキナーゼバッファを用いてインキ
ュベートする。産物内に取り込まれた32Pは電気泳動によって遊離32P-ATPから離
隔され、取り込まれた32Pを計数する。回収された32Pの量は、このアッセイにお
けるHRIPのキナーゼ活性に比例する。プロテインキナーゼによってリン酸化され
た特定のアミノ酸残基は、加水分解されたタンパク質のホスホアミノ酸分析によ
って決定する。
【０２２６】 或いは、HRIPのプロテインホスファターゼ活性を、p-ニトロフェニルリン酸（
PNPP）の加水分解によって決定する。HRIPは、３７℃で０.１％ｂ-メルカプトエ
タノールの存在下で、pH７.５のHEPESバッファ内でPNPPと共に６０分間インキュ
ベートする。この反応は１０NのNaOHを添加することで停止する。PNPPの加水分
解によって生じた４１０nmにおける光の吸光度の増加は、分光光度計を用いて測
定する。光の吸光度の増加は、本アッセイのHRIP活性に比例する（Diamond, RH.
ら (1994) Mol. Cell Biol. 14:3752-3762）。
【０２２７】 １１ 機能的アッセイ HRIP機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのHR
IPをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現
する強いプロモータを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選り
抜きのベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びpCR 3.1
プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウィルスプロモータ
を有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの組換えベ
クターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形質移
入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラスミド
を同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移
入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、cD
NAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば
緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質か
ら選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメ
トリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同
定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死
に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出し
て計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によ
るDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、ブロモデオキシウリジンの取
込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によっ
て計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光
複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組
成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994
) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。
【０２２８】 遺伝子発現におけるHRIPの影響は、HRIPをコードする配列とCD64またはCD64-G
FPのいずれかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価すること
ができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫
グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質転換細胞と非形質転換細胞は、
ヒトIgGまたはCD64に対する抗体（DYNAL, Lake Success. NY）で覆われた磁気ビ
ーズを用いて有効に分離することができる。mRNAは、本技術分野で公知の方法で
細胞から精製することができる。HRIPその他の目的の遺伝子をコードするmRNAの
発現は、ノーザン分析或いはマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０２２９】 １２ HRIP特異抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；Harrington, M.G. (1990) Method
s Enzymol. 182:488-495等を参照）または他の精製技術を用いて実質上精製され
たHRIPを用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産出する。
【０２３０】 或いは、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてHRIPアミノ酸配列を解析
し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、
このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。
適切なエピトープ、例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピトー
プの選択については、本技術分野で公知である。（前出のAusubel, 1995, 11章
等を参照。）
【０２３１】 通常、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、ABI 431A ペプチドシンセサイザ
（Perkin-Elmer）を用いてFmocケミストリを用いて合成し、N-マレイミドベンゾ
イル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（S
igma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusube
l, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド-KLM
複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗HR
IP活性を検査するには、ペプチドまたはHRIPを基質に結合し、１％BSAを用いて
ブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素で標識した
ヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０２３２】 １３ 特異抗体を用いた天然のHRIPの精製 天然または組換えHRIPを、HRIP特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマ
トグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗HRIP抗
体を活性化クロマトグラフィー用樹脂、例えばCNBr活性化セファロース（Amersh
am Pharmacia Biotech）と共有結合させることにより構築する。結合後に、製造
者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０２３３】 HRIPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、HRIPを優先的に吸着
する条件下（例えば、界面活性剤が存在する高イオン強度バッファ）でカラムを
洗浄する。抗体とHRIPの結合を破壊する条件（例えばpH２〜３のバッファ、或い
は尿素またはチオシアン酸塩イオン等の高濃度のカオトロープ剤）でカラムを溶
出させ、HRIPを回収する。
【０２３４】 １４ HRIPと相互作用する分子の同定 HRIPまたは生物学的に活性であるHRIP断片を、125Iボルトンハンター試薬で標
識する。（Bolton A.E.and W.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539等を
参照。）マルチウェルプレートの穴の中に予め配列しておいた候補分子を、標識
したHRIPと共にインキュベートして洗浄し、標識したHRIP複合体を有する全ての
穴をアッセイする。HRIP濃度を変えて得たデータを用いて、候補分子とのHRIPの
数、親和性及び会合の値を計算する。
【０２３５】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の
好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施
例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学ま
たは関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方
法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０２３６】 （表の簡単な説明） 表１は、HRIPをコードする完全長の配列をアセンブルするために用いた、ポリ
ペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号（SEQ ID NO）、クローン識別番
号（クローンID）、cDNAライブラリ及びcDNA断片を示す。
【０２３７】 表２は、潜在モチーフと、相同配列と、HRIPの解析に用いた方法、アルゴリズ
ム及び検索可能なデータベースとを含む各ポリペプチド配列の特徴を示す。
【０２３８】 表３は、各核酸配列の選択された断片と、ノーザン分析によって決定された各
核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、異常症ま
たは症状と、各DNAのクローニング先のベクターとを示す。
【０２３９】 表４は、cDNAライブラリの作製に用いた組織を示す。HRIPをコードするcDNAク
ローンはここから単離した。
【０２４０】 表５は、HRIPの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能
な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１３年９月２６日（２００１．９．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、細胞内リン酸化反応のレギュレータの核酸配列およびアミノ酸配列
に関し、神経疾患、細胞増殖異常及び自己免疫／炎症疾患の診断、治療並びに予
防におけるこれらの配列の利用に関する。
【０００２】 （発明の背景） タンパク質の可逆リン酸化反応は、真核細胞の活性を制御するための主要なス
トラテジーである。キナーゼ及びホスファターゼは可逆リン酸化反応を調節する
。それゆえにキナーゼ及びホスファターゼは細胞内シグナル形質導入経路の重要
な構成要素である。プロテインキナーゼは、細胞外シグナル（ホルモン、神経伝
達物質、成長因子、分化因子等）、細胞周期チェックポイント（例えば有糸分裂
イベントに関連するシグナル）及び環境または栄養ストレスに応じて、アデノシ
ン３リン酸（ATP）から特定タンパク質ターゲットへ高エネルギーリン酸を移転
させる。プロテインホスファターゼは、タンパク質からリン酸基を除去すること
によってキナーゼ効果を仲介する。
【０００３】 通常哺乳動物細胞内で活性である１０，０００のタンパク質のうち１，０００
以上のタンパク質がリン酸化すると推定されている。一般に、タンパク質活性は
リン酸化によって誘導されるものであり、これは分子のスイッチをオンにするの
と類似している。スイッチをオンにすると、適正なプロテインキナーゼが代謝性
酵素、調節タンパク質、受容体、細胞骨格タンパク質、イオンチャネルまたはポ
ンプ、或いは転写因子を活性化する。シグナル経路の下方制御が必要な場合には
、脱リン酸化によってタンパク質活性が抑制される。キナーゼ及びホスファター
ゼの座標活性は、細胞増殖、細胞分化、細胞と細胞のコミュニケーション及び細
胞周期等の基本過程を調整する。抑制されていないシグナル伝達は、炎症、癌、
動脈硬化症、乾癬を含む様々な病状に関係してきた。
【０００４】 プロテインキナーゼは、ヒドロキシル化したアミノ酸上でタンパク質受容体分
子をリン酸化する。これらのキナーゼは、かなりよく知られているタンパク質群
即ち著しく多彩な機能及び特異性を有するような酵素のスーパーファミリーから
構成されている。プロテインキナーゼは通常、基質、調節分子または突然変異表
現型のアスペクトに因んで命名される。基質に関しては、プロテインキナーゼは
、チロシン残基（プロテインチロシンキナーゼ (PTK)）をリン酸化するものと、
セリンまたはトレオニン残基（セリン／トレオニンキナーゼ (STK)）をリン酸化
するものとの２つに大別することができる。二重特異性及びホスホリラーゼセリ
ン、トレオニン及びチロシン残基を有するプロテインキナーゼは殆どない。STK
及びPTKには、両ファミリーの構造特性を有するものがある（Hardie, G. and S.
Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, Vol. I:7-20, Academic Press
, San Diego CA）。
【０００５】 保存された２５０〜３００アミノ酸キナーゼドメインは殆ど全てのキナーゼに
含まれており、このドメインは２葉構造に折り重なっている。キナーゼドメイン
の１次構造は保存されており、更に１１サブドメインに細分することが可能であ
る。キナーゼドメインの小さな方のＮ末端葉は、サブドメインIからIVを有し、
主としてATP（またはGTP）ドナー分子の結合及び配向に関与している。大きな方
のＣ末端葉は、サブドメインVIからXIを有し、タンパク質基質を結合し、γリン
酸をATPからセリン、トレオニンまたはチロシン残基のヒドロキシル基へと移転
させる。サブドメインVは、２葉の橋渡しをする。１１サブドメインには各々、
固有のサブドメインに特有の固有のアミノ酸残基及びモチーフが含まれており、
高度に保存されている。（Hardie, G. and S. Hanks (1995) The Protein Kinas e Facts Book , Vol. 1:7-20, Academic Press, San Diego CA）。特に２つのプ
ロテインキナーゼサイン配列は、キナーゼドメイン内で同定されていた。第１の
配列にはATP結合に関与する活性部位リシン残基（サブドメインII）が、第２の
配列には触媒活性に重要なアスパラギン酸残基（サブドメインVI）が含まれてい
る。キナーゼは、キナーゼドメインの側面に位置する或いはキナーゼドメインに
挿入されたような種々のアミノ酸配列（通常５〜１００残基）によってファミリ
ーに分類することもできる。キナーゼは、標的タンパク質を認識し、相互作用を
及ぼすので、これら追加のアミノ酸配列は各キナーゼの調節に関与する。
【０００６】 PTKは、膜内外または非膜内外のいずれかに分類し得る。膜内外PTKは、殆どの
成長因子に対して受容体として機能する。成長因子は受容体チロシンキナーゼ（
RTK）に結合し、RTKにRTK自体をリン酸化（自動リン酸化）させ且つ特定細胞内
第２メッセンジャータンパク質もリン酸化させる。RTKを結合する成長因子には
、表皮成長因子、血小板派生成長因子、線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、
インスリン及びインスリン様成長因子、神経成長因子、血管内皮成長因子及びマ
クロファージコロニー刺激因子がある。
【０００７】 非膜内外PTKは、原形質膜受容体のサイトソルドメインを用いてシグナル伝達
複合体を形成する。非膜内外PTKを介してシグナルを送る受容体には、サイトカ
イン及びホルモンのための受容体（成長ホルモン、プロラクチン等）及びＴ及び
Ｂリンパ球上の抗原特異受容体がある。多数の非膜内外PTKは、癌細胞内で突然
変異型腫瘍遺伝子産物として先ず認識された。癌細胞内では、正常細胞の制御は
もはやPTK活性化の条件ではなかった。公知の腫瘍遺伝子の約３分の１がPTKをコ
ードする。細胞形質転換（腫瘍形成）がしばしばチロシンリン酸化活性の増加に
よって達成されることはよく知られている（Charbonneau Hand N.K. Tonks (199
2) Anno. Rev. Cell Biol. 8:463-493）。従って、或る種の癌を制御する際にPT
K活性の調節は重要なストラテジーとなり得る。
【０００８】 STKは、非膜内外タンパク質である。STKは第２メッセンジャー依存プロテイン
キナーゼを有している。第２メッセンジャー依存プロテインキナーゼは、cAMP、
cGMP、イノシトールトリリン酸、ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリリン酸
、cADPリボース、アラキドン酸、ジアシルグリセロール、カルシウム-カルモジ
ュリン（CaM）等の第２メッセンジャーの効果を主として仲介する。STKには、ホ
ルモン誘導細胞反応の仲介に関与するcAMP依存プロテインキナーゼ（PKA）と、
平滑筋構造の調節、グリコーゲン破壊及び神経伝達に関与するCaM依存プロテイ
ンキナーゼと、リン酸化カスケードを介して細胞表面から核へのシグナル形質導
入を仲介するマイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼと、グリコーゲン
破壊及び種々の転写因子の活性化を仲介するジアシルグリセロール活性化プロテ
インキナーゼＣ（PKC）がある。PKC muは、他のPKCと同様にPKCファミリーの新
規メンバーであり、亜鉛フィンガー様の、エステル結合に必要なＮ末端領域に多
システインモチーフを有し、ホルボールエステル独立キナーゼ活性の能力もある
（Johannes, F.J. ら (1994) J. Biol. Chem. 269:6140-6148）。
【０００９】 PKAは、ホルモン刺激作用に応じて細胞内で作製したcAMPによって活性化され
る。変異PKA発現は、癌、甲状腺障害、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、心血
管疾患を含む種々の疾病及び疾患に関係している（Isselbacher, K.J. ら (1994
) Harrison's Princinles of internal Medicine, McGraw-Hill, New York NY,
pp. 416-431, 1987）。CaM依存プロテインキナーゼは、細胞内の遊離カルシウム
濃度に応じて、細胞内カルシウム受容体であるカルモジュリンによって活性化さ
れる。CaMキナーゼI及びCaMキナーゼIIは神経伝達の調節において重要な役割を
果たしている。キナーゼは、アルツハイマー病等の神経疾患と、老化の認知効果
に関連していた（Lynch, M.A. (1998) Prog. Neurobiol. 56:571-589 and Bonka
le, W.L.ら (1999) Brain Ret. 818:383-396等を参照）。CASKは、カルモジュリ
ン依存プロテインキナーゼドメインを含む神経細胞表面タンパク質（ニューレキ
シン）であり、脳シナプス原形質膜に比較的高濃度で存在している（ハラ, Y.ら
(1996) J. Neurosci. 16:2488-2494）。CASKは、アルツハイマー病に関係する
アミロイド前駆体タンパク質（APP）を結合することが可能な複合体の一部を形
成し、APP処理において重要な役割を果たし得る（Borg, J.P.ら (1998) J. Biol
, Chem. 273:31633-31636）。
【００１０】 サイクリン依存プロテインキナーゼ（CDK）は、細胞周期を通じて細胞の進行
を制御するSTKである。サイクリンは、CDKに結合し、CDKを活性化する小調節タ
ンパク質である。次にサイクリンは有糸分裂過程に関与する選択されたタンパク
質をリン酸化し、活性化する。CDKは、活性化されるために多数の入力を必要と
する点で独特である。サイクリンに加えて、CDK活性化には特定のトレオニン残
基のリン酸化及び特定のチロシン残基の脱リン酸化が必要である。細胞周期に関
連するSTKの別のファミリーは、NIMA（never in mitosis）関連キナーゼ（Nek）
である。CDK及びNekは共に、動物細胞における微小管組織の中心即ち中心体の複
製、成熟及び分離に関与している（Fry, A.M. ら (1998) EMBO J. 17:470-481）
。
【００１１】 MAPキナーゼは、細胞内シグナル伝達経路を調整する別のSTKファミリーからな
る。MAPキナーゼは、リン酸化カスケードを介して細胞表面から核へのシグナル
形質導入を仲介する。MAPキナーゼ経路を活性化する細胞外刺激には、表皮成長
因子、紫外線、高浸透圧性媒体、熱ショック、内毒素性リポ多糖体、及び腫瘍ネ
クローシス因子及びインターロイキン-１等のプロ炎症性サイトカインがある。
変異したMAPキナーゼの発現は、癌、炎症、免疫異常症、成長及び発達に影響す
る障害を含む種々の病状に関係している。
【００１２】 アポプトーシスは、細胞死へと導くような高度に調整されたシグナル伝達経路
である。細胞死は、組織発達及びホメオスタシスにおいて重大な役割を果たす。
本過程の統制解除は、自己免疫疾患、神経変性疾患及び癌を含む多数の疾患の病
因に関連している。種々のSTKは、本過程において鍵となる役割を果たす。ZIPキ
ナーゼは、Ｎ末端プロテインキナーゼドメインに加えてＣ末端ロイシンジッパー
ドメインを含むSTKである。このＣ末端ドメインは活性化転写因子ATF4等の転写
因子との相互作用と同様にキナーゼのホモ二量体化および活性化を仲介する外観
を呈し、活性化転写因子ATF4は、転写因子のタンパク質（ATF/CREB）ファミリー
を結合するようなcAMP応答要素のメンバーである（サンジョウ, H. ら (1998) J
. Biol. Chem, 273:29066-29071）。DRAK１及びDRAK2は、死に関連するプロテイ
ンキナーゼ（DAPキナーゼ）と相同性を共有するSTKであり、インターフェロン-
γ誘導アポプトーシスにおいてそのように機能することが知られている（前出の
サイジョウらの文献）。ZIPキナーゼと同様に、DAPキナーゼにはＮ末端キナーゼ
ドメインに加えてＣ末端タンパク質-タンパク質相互作用ドメインがアンキリン
反復の形で含まれている。このタイプのキナーゼ、ZIP、DAP及びDRAKは、NIH3T3
細胞に形質移入された場合にアポプトーシスに関連する形態学的変化を誘導する
（前出のサンジョウらの文献）。しかしながら、これらのタンパク質のＮ末端キ
ナーゼ触媒ドメインまたはＣ末端ドメインのいずれかが欠失しているとアポトー
シス活性が完全に無くなり、アポプトーシスには、恐らくはレギュレータまたは
特定の基質との相互作用ドメインとしてＣ末端ドメインにおける活性もキナーゼ
活性に加えて必要である。
【００１３】 RICKは、死受容体CD95に関与する特定のアポトーシス経路を仲介するものとし
て最近同定されたもう１つのSTKである（イノハラ, N. ら (1998) J. Biol. Che
m. 273:12296-12300）。CD95は、腫瘍ネクローシス因子受容体スーパーファミリ
ーのメンバーであり、免疫系の調節及びホメオスタシスにおいて重要な役割を果
たしている（ナガタ, S. (1997) Cell 88:355-365）。CD95受容体シグナル伝達
経路は、リガンド結合に続く受容体複合体への種々の細胞内分子の漸増に関与し
ている。これにはシステインプロテアーゼカスパーゼ-８が含まれ、カスパーゼ-
８は細胞死へ導くカスパーゼカスケードを活性化する。RICKは、Ｎ末端キナーゼ
触媒ドメイン及びＣ末端「カスパーゼ漸増」ドメインからなる。Ｃ末端「カスパ
ーゼ漸増」ドメインはカスパーゼ様ドメインと相互作用し、RICKがカスパーゼ-
８の漸増において役割を果たしていることを示している。この解釈は、ヒト293T
細胞におけるRICKの発現が、CD95アポトーシス経路に関与する種々のタンパク質
によってカスパーゼ-８の活性化を促進してアポプトーシスの誘導を強化すると
いう事実に裏付けられている（前出のイノハラらの文献）。
【００１４】 プロテインホスファターゼは、キナーゼにより活性化した分子からリン酸基を
除去することによってプロテインキナーゼの効果を調整する。ホスファターゼは
、ホスファターゼの好適なホスホアミノ酸基質に基づいてチロシン特異またはセ
リン／トレオニン特異のいずれかとして特徴付けられる。尤も、セリン／トレオ
ニン基及びチロシン基の両方に対して二重特異性を有するプロテインホスファタ
ーゼもある。セリン／トレオニンホスファターゼは、ホスホセリン及びホスホト
レオニン残基を脱リン酸化し、また多数のcAMP仲介ホルモン反応の重要なレギュ
レータでもある（Cohen, P. (1989) Annu. Rev. Biochem. 58:453-508）。セリ
ン／トレオニンホスファターゼは、通常２以上のサブユニットからなり、広範且
つ重畳するタンパク質基質特異性を有する。
【００１５】 チロシンホスファターゼは通常、主として原形質膜全域におけるシグナルの形
質導入において機能する単遺伝子性タンパク質であり、膜内外受容体様タンパク
質または可溶性非膜内外タンパク質のいずれかに分類される。チロシンホスファ
ターゼは、PTKの効果を逆にするもので、リン酸化タンパク質のチロシン残基か
らリン酸基を除去し、細胞周期及び細胞シグナル伝達過程、リンパ球活性化及び
細胞接着において重大な役割を果たす（Charbonneau, H. and N.K. Tonks (1992
) Annu. Rev. Cell Biol. &463-493）。細胞分裂の過程で、例えば、Ｍ期誘導ホ
スファターゼと呼ばれる特定のチロシンホスファターゼが、細胞分裂特異PTKで
あるCDC2の脱リン酸化及び活性化により、有糸分裂の誘導の際に鍵となる役割を
果たしている（Krishna, S.ら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5139-51
43）。
【００１６】 チロシンホスファターゼは、活性部位を含む約２５０アミノ酸の保存触媒ドメ
インを共有する。活性部位コンセンサス配列は、ホスファターゼ活性に必須のシ
ステイン残基を含む１３アミノ酸を有する。更に、リンパ腫、小細胞肺癌、腺癌
及び神経芽細胞腫を含む種々の腫瘍条件で転座または転位された染色体領域に、
少なくとも８のチロシンホスファターゼをコードするような遺伝子がマッピング
されていた。（Charbonnean, H. and N.K. Tonks (1992) Annu. Rev. Cell Biol
. 8:463-493）。既述の通り、多数のPTKが腫瘍遺伝子にコードされ、腫瘍はしば
しばチロシンリン酸化活性の増加によって形成される。従って、細胞におけるチ
ロシンリン酸化レベルを制御することによって、チロシンホスファターゼは細胞
形質転換及び種々の癌の成長を予防または逆行させることが可能である。この仮
説は、チロシンホスファターゼの過剰発現が細胞内で形質転換を抑制すること及
びチロシンホスファターゼの固有の阻害剤が細胞形質転換を増進することを示す
研究によって裏付けられている（前出のCharbonneau and Tonksの文献）。
【００１７】 タンパク質リン酸化に加えて、脂質リン酸化も或る種のシグナル伝達経路にお
いて役割を果たす。ホスファチジルイノシトールのリン酸化は、PKCシグナル伝
達経路の活性化に関与している。最近では、スフィンゴリピド代謝物質即ちスフ
ィンゴシン-1-リン酸（SPP）が、細胞外作用及び細胞内作用を伴なう新規な脂質
第２メッセンジャーとして浮上してきた（コハマ, T. ら (1998) J. Biol. Chem
. 273:23722-23728）。細胞外では、SPPはGプロテイン結合受容体EDG-l（内皮由
来Gプロテイン結合受容体）に対するリガンドである。細胞内では、SPPは細胞の
成長、生存、運動性及び細胞骨格変化を調整する。SPPレベルは、特にD-エリト
ロ-スフィンゴシンをSPPにリン酸化するようなスフィンゴシンキナーゼが調整す
る。細胞シグナル伝達におけるスフィンゴシンキナーゼの重要性は、血小板派生
成長因子（PDGF）、神経成長因子及びPKCの活性化を含む種々の刺激がスフィン
ゴシンキナーゼの活性化によってSPPの細胞レベルを増加させるという事実と、
酵素の拮抗阻害剤がPDGFによって細胞増殖誘導を選択的に阻害するという事実に
よって示される（前出のコハマの文献）。
【００１８】 細胞内リン酸化の新規なレギュレータ及びそれをコードするポリヌクレオチド
の発見は、神経疾患、細胞増殖異常及び自己免疫／炎症疾患の診断、予防並びに
治療の際に有益な新規な成分を与えることによって本技術分野における要求に応
える。
【００１９】 （発明の概要） 本発明は、集合的には「HRIP」、個別には「HRIP-1」、「HRIP-2」、「HRIP-3」、「H
RIP-4」、「HRIP-5」、「HRIP-6」、「HRIP-7」、「HRIP-8」、「HRIP-9」、「HRIP-10」、「HR
IP-11」、「HRIP-12」、「HRIP-13」及び「HRIP-14」と呼ばれるような、実質上精製さ
れたポリペプチドである細胞内リン酸化反応のレギュレータに特徴がある。或る
側面において本発明は、（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミ
ノ酸配列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少
なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１
４からなる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列
番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実
質上単離されたポリペプチドを提供する。或る例では、配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドを提供する。
【００２０】 また、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドをコードする実質上単離されたポリヌクレオチドを提供す
る。別の実施例では、ポリペプチドは配列番号１５乃至２８からなる群から選択
される。
【００２１】 更に、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドをコードする実質上単離されたポリヌクレオチドと機能的
に結合したプロモータ配列からなる組換えポリヌクレオチドを提供する。或る例
では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。
また別の例では、本発明は組換えポリヌクレオチドからなる遺伝形質転換体を提
供する。
【００２２】 また、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポ
リヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下
で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを受容する過程とか
らなり、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に機能的に結合したプロモータ配列からなる。
【００２３】 更に、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドに特異結合する実質上単離された抗体を提供する。
【００２４】 更に、本発明は（ａ）配列番号１５乃至２８からなる群から選択したポリヌク
レオチド配列、（ｂ）配列番号１５乃至２８からなる群から選択したポリヌクレ
オチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、または（ｄ）（ｂ）に相補的な
ポリヌクレオチド配列からなる実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。
或る例では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドからな
っている。
【００２５】 更に、本発明はサンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する
。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）配列番号１５乃至２８からなる群から
選択したポリヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号１５乃至２８からなる群から選
択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポリヌ
クレオチド配列、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、または（ｄ）
（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド配列を有する
。検出方法は、（ａ）サンプル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からな
る少なくとも１６の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプル
をハイブリダイズする過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不
存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程か
らなり、プローブと標的ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合体
が形成されるような条件下で、プローブはポリヌクレオチドに特異的にハイブリ
ダイズする。或る例では、プローブは少なくとも３０の連続したヌクレオチドか
らなっている。別の実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレ
オチドからなっている。
【００２６】 更に本発明は、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とからな
る医薬品成分を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）配列番号１乃至１４
からなる群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群か
ら選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配
列、（ｃ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の生物学的
活性断片、または（ｄ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列の免疫原性断片からなる。更に本発明は、機能性HRIPの発現低下に関連する疾
患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して
医薬品成分を投与する過程からなる方法を提供する。
【００２７】 また、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をス
クリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチド
からなるサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を
検出する過程とからなる。或る例では、本発明は機能性HRIPの発現低下に関連す
る疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対
して医薬品成分を投与する過程からなる方法を提供する。
【００２８】 更に、本発明は（ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配
列、（ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくと
も９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１乃至１４から
なる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）配列番号１
乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる実質上単
離されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物
をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプ
チドからなるサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活
性を検出する過程とからなる。或る例で本発明は、この方法によって同定したア
ンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とからなる医薬品成分を提供
する。別の例では、機能性HRIPの過剰発現に関連する疾患又は病状を治療する方
法であって、そのような治療を必要とする患者に対して医薬品成分を投与する過
程からなる方法を提供する。
【００２９】 更に本発明は、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化
合物をスクリーニングする方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、配列番号
１５乃至２８からなる群から選択した配列からなる。スクリーニング方法は、（
ａ）標的ポリヌクレオチドからなるサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）標的
ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程とからなる。
【００３０】 （発明を実施するための形態） 本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前
に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改
変可能であるということを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定
の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定され
る本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解された
い。
【００３１】 請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す
場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と
記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」
と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等
価物等についても言及しているのである。
【００３２】 本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合
を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説
明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実
施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について
説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本
発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及
び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本
発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられ
ていないことを認めるものではない。
【００３３】 定義 「HRIP」は、実質上精製されたHRIPのアミノ酸配列であって、任意の種、特に
ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物の種から得たもので
、任意の天然物、合成物、半合成物或いは組換え物を起源とするものを指す。
【００３４】 「アゴニスト」の語は、HRIPの生物学的活性を強化または擬態する分子を指す
。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合
物や成分を挙げることができるが、これらはHRIPと直接相互作用することによっ
て、或いはHRIPが関与する生物学的経路の構成要素に作用することによって、HR
IPの活性を調節する。
【００３５】 「対立遺伝子変異体」は、HRIPをコードする遺伝子の別の形態である。対立遺
伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１の突然変異から作製し得る。また
、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。ポリペプチドの構造または機
能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を
全く有しないか、１若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に
対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠
失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化
と共に、所定の配列内で1若しくは数回生じ得る。
【００３６】 HRIPをコードする「変異(altered)」核酸配列は、種々のヌクレオチドを欠失
、挿入または置換する核酸配列を有し、HRIPと同一またはHRIPの機能的特徴を少
なくとも１つ有するポリペプチドを産出する。この定義に含まれるのは、HRIPを
コードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易
に検出可能或いは検出困難な多型現象と、HRIPをコードするポリヌクレオチド配
列のための正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座に占めるような、対立遺伝子変
異体に対する不適切或いは不測のハイブリダイゼーションである。コードされた
タンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に
機能的に等価なHRIPとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得
る。計画的アミノ酸置換は、HRIPの生物学的または免疫学的活性が保持される限
りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒
性特性の類似性に基づき行い得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラ
ギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニ
ンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アス
パラギンとグルタミン、セリンとスレオニンがある。親水性値が近似している非
荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンと
アラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００３７】 「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポ
リペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分
子を指す。ここで、「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を
指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙した
タンパク質分子に会合する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするもので
はない。
【００３８】 「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅は通常、当業者によく知ら
れたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行う。
【００３９】 「アンタゴニスト」の語は、HRIPの生物学的活性を阻害或いは弱める分子を指
す。アンタゴニストとしては、抗体などのタンパク質、核酸、糖質、小分子また
はその他の任意の化合物や成分を挙げることができるが、これらはHRIPと直接相
互作用することによって、或いはHRIPが関与する生物学的経路の構成要素に作用
することによって、HRIPの活性を調節する。
【００４０】 「抗体」の語は、無損傷免疫グロブリンやその断片、例えばFa、F(ab')2 及びF
vフラグメントを指すが、これらはエピトープの決定基と結合することができる
。HRIPポリペプチドを結合する抗体は、無損傷ポリペプチドを用いるか或いは免
疫抗原として感心のある小ペプチドを含む断片を用いるかして調製することがで
きる。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチ
ドまたはオリゴペプチドは、翻訳または化学合成されたRNAに由来し得るもので
、好みに応じて担体タンパク質に接合することも可能である。通常用いられる担
体であってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブ
リン及びキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）等がある。結合ペプチドは
、動物を免疫化するために用いる。
【００４１】 「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域（即ちエピトー
プ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場
合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３
次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合
するための無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競
合し得る。
【００４２】 「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」鎖と塩基対を形成する
ことが可能な任意の成分を指す。アンチセンス成分には、DNAや、RNAや、ペプチ
ド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン
酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドや、2'-メトキ
シエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌ
クレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2
'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。
アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することがで
きる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成し
た天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成す
る。「負」若しくは「マイナス（−）」の語がアンチセンス鎖を、「正」若しく
は「プラス（＋）」がセンス鎖を指すことがある。
【００４３】 「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的
機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、天然、組換えま
たは合成のHRIP、或いはその任意のオリゴペプチドの能力であって、適切な動物
または細胞において特定の免疫反応を誘導して特定の抗体と結合し得る能力を指
す。
【００４４】 「相補(的)」または「相補性」の語は、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド
の、塩基対形成による自然結合を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配
列「3'T-C-A5'」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が
結合しているだけの「部分的」なものであるか、或いは一本鎖分子間に完全な相
補性が存在するような「完全」なものであり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、
核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しい影響を与える。この
ことは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において、またペプチド核酸（PNA
）分子の設計及び使用において特に重要である。
【００４５】 「所定のポリヌクレオチド配列からなる成分」及び「所定のアミノ酸配列から
なる成分」は、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列からなる
任意の成分を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。HRIPま
たはHRIP断片をコードするポリヌクレオチドからなる成分は、ハイブリダイゼー
ションプローブとして利用することができる。このプローブは凍結乾燥状態で保
存し得るものであり、糖質等の安定化剤と会合し得る。ハイブリダイゼーション
においては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；
SDS）及びその他の構成要素（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA
等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００４６】 「コンセンサス配列」は、不必要な塩基を分離するために再配列し、XL-PCRキ
ット（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）を用いて５'方向、３'方向のいずれか一方
向或いは両方向に伸長させ、更に再配列した核酸配列を指す。或いは、断片アセ
ンブルのコンピュータプログラムを用いて、１若しくは数個のIncyteクローンの
、場合によっては１若しくは数個のパブリックドメインESTの、オーバーラップ
した配列から組み立てた核酸配列を指す。コンピュータプログラムの例としては
、GELVIEW断片アセンブルシステム（GCG, Madison WI）が挙げられる。伸長及び
アセンブルの両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。
【００４７】 「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆
ど損なわないような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのよ
うな置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミ
ノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示し
ている。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile, Leu, Thr 保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボ
ーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の
電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【００４８】 「欠失」は、結果的に１若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドが失われ
てなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【００４９】 「誘導体」の語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾
を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による
水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチ
ド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持し
ているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリ
エチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘
導起源のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保
持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００５０】 「断片」は、HRIPまたはHRIPをコードするポリヌクレオチドの固有部分であっ
て、親配列と同一配列であるが親配列よりも長さが短い配列を指す。断片は、画
定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも
短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチド
またはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子とし
て、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５
、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しく
は５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、
分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の
配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最
初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得
る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例で
は、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００５１】 配列番号１５乃至２８の断片には、固有のポリヌクレオチド配列領域が含まれ
る。この領域は、配列番号１５乃至２８を特異的に同定するものであり、例えば
同一ゲノム中の配列番号１５乃至２８以外の配列とは異なるものである。配列番
号１５乃至２８の断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技術におい
て、或いは関連するポリヌクレオチド配列から配列番号１５乃至２８を区別する
類似の方法において有用である。配列番号１５乃至２８の断片の正確な長さ及び
断片に対応する配列番号１５乃至２８の領域は、断片に対する意図した目的に基
づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００５２】 配列番号１乃至１４の断片は、配列番号１５乃至２８の断片によってコードさ
れる。配列番号１乃至１４の断片には、配列番号１乃至１４を特異的に同定する
固有のアミノ酸配列領域が含まれている。例えば、配列番号１乃至１４の断片は
、配列番号１乃至１４を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドと
して有用である。配列番号１乃至１４の断片及び断片に対応する配列番号１乃至
１４の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的
に決定することが可能である。
【００５３】 「類似性」の語は、相補性の程度を指す。類似性には、部分類似性と完全類似
性がある。「類似性」の語の代わりに「相同性」を用いることもある。同一の配
列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するような部分
相補配列は、「実質上類似」と称する。完全相補配列の標的配列へのハイブリダ
イゼーションの阻害は、緩やかなストリンジェント条件下で、ハイブリダイゼー
ションアッセイ（サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーシ
ョン等）を用いて検定し得る。実質上類似の配列またはハイブリダイゼーション
プローブは、緩やかなストリンジェント条件下で、完全類似（同一）配列が標的
配列に結合することに対して競合し、この結合を阻害し得る。これは、緩やかな
ストリンジェント条件が非特異結合を許容することを意味するものではない。緩
やかなストリンジェント条件では、２つの配列相互の結合が特異的（即ち選択的
）相互作用であることが必要なためである。非特異結合の不存在下では、部分的
に相補性が欠失している（例えば類似性または相同性が約３０％以下である）よ
うな第２標的配列を用いて試験することができる。非特異結合の不存在下では、
実質上類似の配列またはプローブは第２非相補的標的配列にハイブリダイズしな
い。
【００５４】 ポリヌクレオチド配列に適用される「相同率」または「相同％」の語は、標準
化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２以上のポリヌ
クレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは
、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化
された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比
較できる。
【００５５】 ポリヌクレオチド配列間の相同率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメ
ントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトパ
ラメータを用いて決定できる。このプログラムはLASERGENEソフトウェアパッケ
ージの一部であり、一式の分子生物学分析プログラム（DNASTAR, Madison WI）
である。CLUSTAL Vについては、Higgins, D.G. and P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153及びHiggins, D.G. ら (1992) CABIOS 8:189-191の文献に記載されて
いる。ポリヌクレオチド配列の対をなすアラインメントの場合、デフォルトパラ
メータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定
する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。CLUS
TAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として
相同率を報告する。
【００５６】 或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Al
ignment Search Tool（BLAST）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配
列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. ら (1990) J. Mol. B
iol. 215:403-410）。このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり
、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nl
m.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な
配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデー
タベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」も
その１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列を対で直接比較するため
に用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2
Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして
対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blast
n と blastp（後述）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的
には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。
例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとし
て設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用
いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: −2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on
【００５７】 相同率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）配列長さ
と比較して測定し得る。或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配
列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００
または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して相同率を測定し
てもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リ
ストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を
用いて、相同率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００５８】 高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重
が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸
配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコード
するような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【００５９】 ポリペプチド配列に適用される「相同率」または「相同％」の語は、標準化さ
れたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２以上のポリペプチ
ド配列間で一致する残基の割合を意味する。ポリペプチド配列アラインメントの
方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。
既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存
するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【００６０】 ポリペプチド配列間の相同率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメント
プログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラ
メータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL
Vを用いて、ポリぺプチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルト
パラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と
設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポ
リヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされた
ポリペプチド配列対間の「類似率」として相同率を報告する。
【００６１】 或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えばポリペプチド配
列を２つ１組で比較をする場合、デフォルトパラメータとして設定されたblastp
と共に「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を使用して
もよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on
【００６２】 相同率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプ
チド配列の長さと比較して測定し得る。相同率は、配列或いは、より短い長さ、
例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なく
とも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）
の長さと比較して相同率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的な
ものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付
けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して相
同率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００６３】 「ヒト人工染色体」（HAC）は直鎖状の小染色体であり、６kb〜１０Mbのサイ
ズのDNA配列を含み、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要
素が含まれている。
【００６４】 「ヒト化抗体」の語は、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列はヒト抗体によ
り近づくように変異させた抗体分子であって、本来の結合能力はそのまま保持し
ているような抗体分子を指す。
【００６５】 「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基
対を形成することによって、一本鎖ポリヌクレオチドが相補的鎖とアニーリング
するプロセスを指す。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い
相同性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体
は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダ
イズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのス
トリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件
では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。
核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例
的に決定する。許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗
浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーショ
ン特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリング許容条件は
、例えば約6×SSC、約１％（w/v）のSDS及び約１００μg/mlの変性サケ精子DNA
の存在下で温度６８℃において成立する。
【００６６】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステ
ップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常
、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低く
なるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致す
るプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する
式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook ら (1
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring H
arbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【００６７】 本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに
対する高ストリンジェンシー条件には、約０.２×SSC及び約１％のSDS存在下で
約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。或いは、６５℃、６０℃、５５
℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、
約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、遮断剤を用いて非特異ハイブリ
ダイゼーションを阻止する。このような遮断剤には、例えば、約１００〜２００
μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダ
イゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用
いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろ
う。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオ
チド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及び
ヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆してい
る。
【００６８】 「ハイブリダイゼーション複合体」の語は、相補的塩基対間の水素結合の形成
力によって２つの核酸配列間に形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーショ
ン複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。或いは、一方の核
酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、
フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって
細胞若しくはその核酸が固定される基質）に固定されているような２つの核酸配
列間に形成され得る。
【００６９】 「挿入」及び「付加」の語は、１若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオ
チド配列を各々付加するようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を
指す。
【００７０】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関
連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種
々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現
によって特徴づけることができる。
【００７１】 「マイクロアレイ」の語は、基質上の異なるポリヌクレオチドの配置を指す。
【００７２】 「要素」または「アレイ要素」の語は、マイクロアレイの環境において、基質
の表面上に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。
【００７３】 「調節(する)」の語は、HRIPの活性の変化を指す。調節することによって例え
ば、HRIPのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的
特性が増大または低下し得る。
【００７４】 「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲ
ノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或
いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド
核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【００７５】 「機能的に結合した」は、第１核酸配列が第２核酸配列と機能的な関係がある
ように配置された状態を指す。例えば、プロモータがコード配列の転写または発
現に影響を及ぼす場合には、そのプロモータはそのコード配列に機能的に結合し
ている。同一の読み枠内で２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場
合、一般に、機能的に結合したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続し得る
。
【００７６】 「ペプチド核酸」（PNA）は、アンチセンス分子または抗遺伝子物質であって
、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なく
とも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなるものを指す。末端の
リジンは、成分に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的
に結合して転写の拡張を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細
胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【００７７】 「プローブ」は、HRIP、HRIPの相補配列またはこれらの断片をコードする核酸
配列を指し、同一核酸配列、対立遺伝子核酸配列または関連する核酸配列の検出
に用いられる。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典
型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある
。
【００７８】 「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的
塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライ
マーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に延在し得る。プライマー
対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び同定）
に用い得る。
【００７９】 本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくと
も１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプロ
ーブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、
４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオ
チドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり
長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に
裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解された
い。
【００８０】 プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. ら (1
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring H
arbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. ら, (1987) Current Protocols in Molecular Biology , Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York
NY、Innisら (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Ac
ademic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的
のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehe
ad Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知
の配列から得ることができる。
【００８１】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のため
に本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06
ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用で
あり、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチド
であって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを
分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力の
ための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（
テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから
一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択すること
が可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である
。Primer3プライマー選択プログラム（マサチューセッツ州ケンブリッジのWhite
head Institute／MITゲノム研究センターから一般向けに入手可能）ではユーザ
ーが「ミスプライミング・ライブラリ」をインプットすることができ、ここでプ
ライマー結合部位として避けたい配列はユーザーが指定する。Primer3は特に、
マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプ
ライマー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有
のニーズを満たすように変更してもよい。）PrimerGenプログラム（英国ケンブ
リッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般
向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し
、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存
領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従っ
て、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌ
クレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定し
たオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション
技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロ
アレイ要素として、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリ
ヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの
選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【００８２】 「組換え核酸」は天然の配列ではない配列であり、或いは人為的に組み合わせ
なければ離隔している配列の２以上のセグメントを人為的に組み合わせて産出し
た配列を有する配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成
するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばの
Sambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達
成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核
酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモータ配列に機能的に結合した核酸配
列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不可欠な要素であって例え
ばある細胞を形質転換するために用いられるようなものであり得る。
【００８３】 或いはこのような組換え核酸は、ウィルスベクターの不可欠な要素であって例
えばワクシニアウィルスに基づくものであり得る。ワクシニアウィルスは組換え
核酸が発現する哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防御免疫応
答を誘導する。
【００８４】 DNA配列に関する「RNA等価物」は、発生した窒素塩基チミンが全てウラシルに
置換されていることと、糖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボース
から構成されていることを除いて、参照DNA配列と同一のヌクレオチド線形配列
から構成されている。
【００８５】 「サンプル」の語は、その最も広い意味で用いられる。HRIPをコードする核酸
若しくはその断片、またはHRIP自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞
から単離された細胞、染色体、細胞小器官または膜からの抽出物や、細胞や、溶
解しているか基質に結合しているゲノムDNA、RNAまたはcDNAや、組織や、組織プ
リント等から構成され得る。
【００８６】 「特異結合」または「特異的に結合する」の語は、タンパク質またはペプチド
と、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、任意の天然成分または合成結
合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例
えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか
否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対
して特異的である場合、標識された遊離したＡ及びその抗体を含む反応において
、エピトープＡ（つまり遊離し、標識されていないＡ）を含むポリヌクレオチド
の存在が、抗体に結合している標識されたＡの量を低減させる。
【００８７】 「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分
離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合するその他の構成要素の
少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましいのは少なく
とも約９０％が遊離しているものを指す。
【００８８】 「置換」は、１若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドを各々別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置換することを意味する。
【００８９】 「基質」は、任意の好適な固体または半固体の支持体を指すものであって、膜
、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性非磁性ビーズ、ゲル
、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管が含まれる。基質は、壁、溝、ピン
、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面にはポリヌク
レオチドやポリペプチドが結合する。
【００９０】 「形質転換」は、外来性のDNAが宿主細胞に入り込み、宿主細胞を変化させる
プロセスを表す。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自
然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または
真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形
質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換
方法には、ウィルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック
、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞
の語には、限られた時間内に挿入されたDNAやRNAを発現するような一時的に形質
転換された細胞のみならず、安定的に形質転換された細胞であってその中に挿入
されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主の染色体の一部とし
て複製可能であるものも含まれる。
【００９１】 ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものでは
ないが動植物を含み、有機体の１若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、
例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸
を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入
することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或
いは組換えウィルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種
或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものであ
る。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバク
テリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知ら
れている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿
主に導入することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術は
よく知られており、前出のSambrook ら (1989) 等の参考文献に与えられている
。
【００９２】 特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸
配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。その際、
デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（
1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに
対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９８％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対
立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多形
性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を
有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通
常多数の或いは僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリ
ペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが
欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列で
ある。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有
する。多形性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチ
ド配列が異なる。また、多形性変異体は、１つのヌクレオチド塩基によってポリ
ヌクレオチド配列が変化する「単一ヌクレオチド多形性」（SNP）を含み得る。S
NPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【００９３】 特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体
で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプ
チド配列として画定される。ここで、デフォルトパラメータに設定した「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する
。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％
、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の
相同性を示し得る。
【００９４】 発明 本発明は、新規なヒトの細胞内リン酸化反応のレギュレータ（HRIP）、HRIPを
コードするポリヌクレオチド、並びにこれらの成分を神経疾患、細胞増殖異常及
び自己免疫／炎症不全の診断、治療又は予防のために利用する方法の発見に基づ
くものである。
【００９５】 表１は、HRIPをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたIncyteク
ローンを示す。列１及び列２は、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの配列番号
（SEQ ID NO）を各々示している。列３はIncyteクローンを示しており、各HRIP
をコードする核酸はここで同定されたものである。列４はcDNAライブラリを示し
ており、列３のクローンはここから単離したものである。列５は、Incyteクロー
ン及びこれに対応するcDNAライブラリを示している。cDNAライブラリが示されて
いないIncyteクローンは、プールされているcDNAライブラリから得た。列５のIn
cyteクローンを用いて各HRIPのコンセンサスヌクレオチド配列を構築した。列５
のIncyteクローンは、ハイブリダイゼーション技術における断片として有用であ
る。
【００９６】 表２の列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示している。列１は配列
番号（SEQ ID NO）を、列２は各ポリペプチド中のアミノ酸残基の数を、列３は
潜在的なリン酸化部位を、列４は潜在的なグリコシル化部位を、列５はサイン（
signature）配列及びモチーフを有するアミノ酸残基を、列６はBLAST分析によっ
て同定された相同配列、列７は分析方法と場合によってはその分析方法が利用で
きる検索可能なデータベースを示している。列７の分析方法を用いて、配列相同
性及びタンパク質モチーフから各ポリペプチドの特徴付けを行った。
【００９７】 表３の列は、組織特異性と、HRIPをコードするヌクレオチド配列に関係がある
疾患、障害または症状とを示している。表３の列１はヌクレオチドの配列番号を
、列２は列１のヌクレオチド配列の断片を示している。これらの断片は例えば、
配列番号１５乃至２８を同定し、配列番号１５乃至２８と関連するポリヌクレオ
チド配列を区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅の技術において有
用である。配列番号１５乃至２７では、これら断片によりコードされるポリヌク
レオチドは、例えば免疫原性ペプチドとして有用である。列３は、HRIPを発現す
る組織全体に対するHRIP発現割合として、組織カテゴリーを示している。列４は
、HRIPを発現する組織全体に対する割合として、HRIPをコードするヌクレオチド
配列に関係がある疾患、障害または症状を示している。列５は、各cDNAライブラ
リをサブクローニングするために用いたベクターを示している。
【００９８】 表４の列ではcDNAライブラリの作製に用いた組織の説明を示している。HRIPを
コードするcDNAのクローンはcDNAライブラリから単離したものである。列１は、
ヌクレオチドの配列番号を、列２はクローン単離起源であるcDNAライブラリを、
列３は列２のcDNAライブラリに関連する組織の起源その他の記述的情報を示して
いる。
【００９９】 本発明には、HRIPの変異体も含まれる。好適なHRIPの変異体のアミノ酸配列は
、HRIPアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、或いは
約９５％もの相同性を有し、HRIPの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ
有するような変異体である。
【０１００】 本発明には、HRIPをコードするポリヌクレオチドも含まれる。或る例では、HR
IPをコードする配列番号１５乃至２８からなる群から選択された配列を有するポ
リヌクレオチド配列が本発明に含まれている。配列番号１５乃至２８のポリヌク
レオチド配列は、配列表に示されているように等価RNA配列と同等の価値を有し
ているが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデ
オキシリボースではなくシリボースから構成されている。
【０１０１】 本発明には、HRIPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列も含まれる。
具体的には、そのようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、HRIPをコードする
ポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、或い
は約９５％もの相同性を有する。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、HR
IPの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし
得る。
【０１０２】 当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、HRIPをコードする多数のポリヌクレ
オチド配列（既知の遺伝子または天然の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないポリヌクレオチド配列もある）が作り出され得ることは理解
できよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によっ
て作り出され得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異
体を網羅し得る。これらの組合せは、天然のHRIPのポリヌクレオチド配列に適用
されるような標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような
変異は全て明確に開示されているものと考えられる。
【０１０３】 HRIP及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は通常、好適に選択された
ストリンジェントな条件下で天然のHRIPのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可
能であるが、HRIPまたはその誘導体であって実質上異なるコドンの使用法がある
もの、例えば天然に存在しないコドンの封入があるものをコードするヌクレオチ
ド配列を作り出すことは有益であろう。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基
づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコ
ドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなく
HRIP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由に
は、天然の配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長いなどの
特性を有するRNA転写物の作製がある。
【０１０４】 本発明には、HRIP、HRIP誘導体及びこれらの断片をコードするDNA配列又はそ
れらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後、本技術
分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な
発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてHRIPまたはそ
の任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【０１０５】 更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のポリヌ
クレオチド配列、特に配列番号１５乃至２８で示される配列及びそれらの断片に
ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列も含まれる。（Wahl, G.M. and S.L
. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399-407、Kimmel. A.R. (1987) Method
s Enzymol. 152:507-511.等を参照。）ハイブリダイゼーション条件は、アニー
リング条件及び洗浄条件を含めて「定義」に記載した。
【０１０６】 DNAシークエンシングの方法は本技術分野でよく知られており、本発明の何れ
の実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシ
ング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片
、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elm
er）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ
）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technol
ogies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソ
ヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システ
ム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Waterto
wn MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）等の装置を
用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシン
グシステム（Perkin-Elmer）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（M
olecular Dynamics, Sunnyvale CA）または本技術分野でよく知られている他の
方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を本技術分野で
よく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。（Ausubel, F.M. (199
7) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY,
unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wile
y VCH, New York NY, pp. 856-853.等を参照。）
【０１０７】 HRIPをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ本技術分
野でよく知られているPCR法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロ
モータ及び調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る
方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプ
ライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅す
る方法である。（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322等を参照）
。別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用い
て環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム
遺伝子座及びその周辺の配列からなる制限断片から得る（Triglia, T.ら (1988)
Nucleic Acids Res 16:8186等を参照）。第３の方法としてキャプチャPCR法が
あり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPC
R増幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.ら(1991) PCR Methods Applic
1:111-119等を参照。）この方法では、PCRを行う前に多重制限酵素の消化及び
連結反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能で
ある。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については本技術分
野で知られている。（Parker, J.D.ら (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-306
0等を参照）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ラ
イブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングするこ
とができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イント
ロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対
して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウ
ェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用
いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８
℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１０８】 完全長cDNAをスクリーニングする際は、大きめのcDNAを含むようにサイズ選択
されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムに初回抗原刺激を受け
たライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ラ
イブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラ
リは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１０９】 市販されているキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングま
たはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することが
できる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離の
ための流動性ポリマーと、４つの異なったヌクレオチドに特異的であるような、
レーザーで活性化される蛍光色素と、放出された波長の検出に利用するCCDカメ
ラとを有し得る。出力及び光の強度は、適切なソフトウェア（Perkin-Elmer社の
GENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプル
のロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュ
ータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存
在しないようなDNAの小片のシークエンシングに特に適している。
【０１１０】 本発明の別の実施例では、HRIPをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を、適切な宿主細胞内でHRIP、HRIPの断片またはその機能的等価物を発現さ
せるような組換えDNA分子内でクローニングし得る。遺伝暗号固有の宿重に起因
して、実質的同一或いは機能的等価のアミノ酸配列をコードするような別のDNA
配列を作製してHRIPの発現に利用し得る。
【０１１１】 種々の目的でHRIPがコードする配列を変えるために、本発明のヌクレオチド配
列を本技術分野で一般的に知られている方法を用いて組み換えることができる。
ここで目的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッ
シング、発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダム
なフラグメンテーション及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、
ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド
仲介定方向突然変異誘導を利用して、新規な制限部位の生成、グリコシル化パタ
ーンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を行う突然変異を導
入し得る。
【０１１２】 本発明のヌクレオチドは、MolecularBreedingTM（Maxygen Inc., Santa Clara
CA。米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:79
3-797、Christians, F.C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264、Crameri, A
. ら (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319に記載）等のDNAシャッフリング技術
の対象となり、HRIPの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子
や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝
子断片のPCR仲介再組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセ
スである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するよう
な選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、
更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。こ
のように、遺伝の多様性は「人為的」品種改良及び急速な分子の進化を経て創生
される。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を再結
合し、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリング
することができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た
同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と再結合し、それによって天然に存在する複
数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることがで
きる。
【０１１３】 別の実施例によれば、本技術分野でよく知られている化学的方法を用いて、HR
IPをコードする配列の全部或いは一部を合成し得る。（Caruthers. M.H.ら (198
0) Nucleic. Acids Symp. Ser 7:215-223、Horn, T.ら (1980) Nucleic. Acids
Symp. Ser. 7:225-232等を参照。）或いは、化学的方法を用いてHRIPそれ自体ま
たはその断片を合成し得る。例えば、種々の固相技術を用いてペプチド合成を行
うことができる。（Roberge, J.Y.ら (1995) Science 269:202-204等を参照。）
自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る
。更にHRIPのアミノ酸配列またはその任意の一部は、直接合成する間、または他
のタンパク質から得た配列またはその任意の一部と結合する間、或いはその両方
を行っている間に変更し、変異型ポリペプチドを生成することが可能である。
【０１１４】 ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能であ
る。（Chiez, R.M.and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421等
を参照。）合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによっ
て確認することができる。（Creighton. T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York, NY等を参照。）
【０１１５】 生物学的に活性なHRIPを発現させるために、HRIPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な発現
ベクターとは即ち好適な宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の
調節に必要な要素を含むベクターである。必要な要素には、ベクター及びHRIPを
コードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型
プロモータ、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列がある。このような要素は
、長さ及び特異性が様々である。固有開始シグナルを用いて、HRIPをコードする
配列をより効果的に翻訳することが可能もある。このようなシグナルには、ATG
開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。HRIPをコードする配
列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合
は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しか
しながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレ
ームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれ
るようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び
合成物を起源とし得る。発現の効率は、用いられる特定の宿主細胞系に好適なエ
ンハンサーを包含することによって高めることができる。（Scharf, D. ら (199
4) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.等を参照。）
【０１１６】 当業者によく知られている方法を用いて、HRIPをコードする配列と、好適な転
写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。この方
法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術及びin vivo遺伝子組換え技術がある
。（Sambrook, J. ら (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Press, Plainview NYの4, 8, 16-17章、Ausubel, F.M. ら. (199
5) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York N
Yの9, 13, 16章等を参照。）
【０１１７】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、HRIPをコードする配列を保持及び発
現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換
えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換
させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウィルス発現ベ
クター（例えばバキュロウィルス）に感染した昆虫細胞系や、ウィルス発現ベク
ター（例えばカリフラワーモザイクウィルスCaMVまたはタバコモザイクウィルス
TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転換
させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある。本発明は、使用する宿主
細胞によって限定されるものではない。
【０１１８】 細菌系では、HRIPをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多数
のクローニングベクター及び発現ベクターを選択し得る。例えば、HRIPをコード
するポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング及び増殖
には、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（Li
fe Technologies）などの多機能大腸菌ベクターを用いることができる。HRIPを
コードする配列の、ベクターの多数のクローニング部位への連結反応によって、
lacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌を同定するため
の比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニング
された配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーフ
ァージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう。（Van
Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.等を参照
。）多量のHRIPが必要な場合、例えば抗体を生成する場合などには、HRIPの発現
をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導T5バクテリ
オファージプロモータまたは誘導T7バクテリオファージプロモータを含むベクタ
ーが使用できる。
【０１１９】 酵母の発現系を使用してHRIPを生成し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ
、PGHプロモータ等の構成型或いは誘導型のプロモータを含む多数のベクターが
、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可能である
。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質を分泌或いは細胞内への保
持のいずれかに誘導し、安定した増殖のために外来配列の宿主ゲノムへの組込み
を可能にする。（前出のAusubel (1995) の文献、Bitter, G.A. ら (1987) Meth
ods Enzymol.153:516-544、Scorer. C. A. ら (1994) Bio/Technology 12:181-1
44.等を参照。）
【０１２０】 植物系を使用してHRIPを発現することも可能である。HRIPをコードする配列の
転写は、ウィルスプロモータ、例えば単独或いはTMV（タカマツ, N. (1987) EMB
O J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaM
V由来の35S及び19Sプロモータによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユ
ニット等の植物プロモータまたは熱ショックプロモータを用いてもよい。（Coru
zzi, G. ら (1984) EMBO J. 3:1671-1680、Broglie, R. ら (1984) Science 224
:838-843、Winter, J. ら (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105.等
を参照。）これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とするトラ
ンスフェクションによって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科
学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992)
McGraw Hill New York NY, pp.191-196等を参照。）
【０１２１】 哺乳動物細胞においては、多数のウィルスベースの発現系を利用し得る。発現
ベクターとしてアデノウィルスを用いる場合、HRIPをコードする配列は、後発プ
ロモータ及び３連リーダー配列からなるアデノウィルス転写／翻訳複合体に連結
反応され得る。可欠E1またはE3領域へウィルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でHR
IPを発現する感染ウィルスを得ることが可能である。（Logan, J.and T. Shenk
(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照。）更に、ラウス肉腫ウィ
ルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞に
おける発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタ
ンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１２２】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発
現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療目的のために約
６kb〜１０MbのHACを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミ
ノポリマー、またはベシクル）で供給する。（Harrington. J.J. ら (1997) Nat
Genet.15:345-355.等を参照。）
【０１２３】 長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内
のHRIPの安定発現が望ましい。例えば、発現ベクターであって複製発現因子、内
在性発現因子、或いはその両者のウィルス起源を含むものと、同一或いは別のベ
クター上の選択可能マーカー遺伝子とを用いて、HRIPをコードする配列を細胞株
に形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化
培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は
選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することによ
り、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。
安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技
術を用いて増殖可能である。
【０１２４】 任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものでは
ないがこのような選択系には、tk−単純細胞のために用いられるヘルペスウィル
スチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられるアデニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある。（Wigler, M. ら (1977) Cell 11:223
-232、Lowy, I. ら (1980) Cell 22:817-823等を参照。）また、選択の基礎とし
て代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えば
dhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマ
イシン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、
patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与え
る。（Wigler, M. ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570、Colb
ere-Garapin, F. ら (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14 等を参照。）この他の選
択可能遺伝子、例えば、代謝のための細胞要求を変えるtrpB及びhisDは、文献に
記載されている。（Hartman, S.C.and R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 85:8047-8051等を参照。）可視マーカー、例えばアニトシアニン、
緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグ
ルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい
。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特
定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量すること
が可能である。（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参
照。）
【０１２５】 マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されて
も、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、HRIPをコー
ドする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、HRIPをコードする配列を
含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能であ
る。または単一プロモータ制御下で、HRIPをコードする配列とタンデムにマーカ
ー遺伝子を配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝
子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１２６】 一般に、HRIPをコードする核酸配列を含み且つHRIPを発現する宿主細胞は、当
業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定す
るものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNA或いはDNA-RNAハ
イブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはそ
の両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク
質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術がある。
【０１２７】 特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてHRIPの発
現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、本技術分野で公知である。この
ような技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）
、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などが挙げられ
る。HRIP上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、
２部位モノクローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based i
mmunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらの
アッセイ及びこれ以外のアッセイは、本技術分野で公知である。（Hampton. R.
ら (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul.
MN, Sect. IV、Coligan, J. E. ら (1997) Current Protocols in Immunology,
Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D.
(1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照。）
【０１２８】 多岐にわたる標識方法及び結合方法が、当業者に知られており、様々な核酸ア
ッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。HRIPをコードするポ
リヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼー
ションプローブ或いはPCRプローブを産出する方法には、オリゴ標識化、ニック
トランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR
法がある。或いは、HRIPをコードする配列またはその任意の断片を、mRNAプロー
ブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このような
ベクターは、本技術分野において知られており、市販もされており、T7、T3また
はSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vit ro でRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmers
ham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemical等から市販
されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするため
に用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、阻害剤
、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤等があ
る。
【０１２９】 HRIPをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培
地からのタンパク質の回収及び発現に適した条件下で培養し得る。形質転換細胞
から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列
、ベクター、或いはその両者に依存する。当業者であれば理解し得るように、HR
IPをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核
細胞膜を透過するHRIPの直接分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計でき
る。
【０１３０】 更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現し
たタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではな
いがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコ
シル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」また
は「プロ」形を切断するような翻訳後処理を利用して、タンパク質のターゲティ
ング、折りたたみ、及び／または活性を特定することも可能である。翻訳後の活
性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えば
CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（A
TCC、Bethesda, MD）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処
理を確実にするように選択し得る。
【０１３１】 本発明の別の実施例では、HRIPをコードする天然の核酸配列、変更核酸配列ま
たは組換え核酸配列を、上記任意の宿主系において融合タンパク質の翻訳をもた
らす異種配列に連結反応させることができる。例えば、市販されている抗体を用
いて認識可能な異種部分を含むキメラHRIPタンパク質は、HRIP活性阻害剤に対す
るペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部
分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質
の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレ
ドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、
赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上
で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-
Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG
、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識す
る市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タ
ンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質を遺伝子操作し
、HRIPが精製後に異種部分から切断され得るように、HRIPコード配列と異種タン
パク質配列の間にタンパク質分解切断部位を含めることもできる。融合タンパク
質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販
されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進すること
もできる。
【０１３２】 本発明の更に別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚
芽抽出系（Promega）を用いて、放射能標識したHRIPの合成がin vitroで可能で
ある。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモータと機能的に結合したタンパク
質コード配列の転写及び翻訳を結合する。翻訳は、放射能標識したアミノ酸前駆
体、例えば35Sメチオニンの存在の下で起こる。
【０１３３】 HRIPの断片は、組換え手法によって作製するのみならず、固相技術を用いた直
接ペプチド合成によっても作製し得る（前出のCreighton, pp.55-60.等を参照。
）タンパク質合成は、手作業で行うか自動化し得る。自動化合成は、例えば431A
ペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能である。HRIPの
種々の断片は別々に合成し、後から結合させて完全長分子を形成する。
【０１３４】 （治療） 化学的及び構造的類似性、例えば配列及びモチーフとの関連における類似性が
、HRIPの領域と細胞内リン酸化反応のレギュレータ間に存在する。更にHRIPの発
現は、神経組織と、癌その他の細胞増殖異常症と、炎症及び免疫応答とに密接に
関連している。従ってHRIPは、神経疾患、細胞増殖異常症及び自己免疫異常症／
炎症性疾患において或る役割を果たすものと考えられる。HRIPの発現または活性
の増大に関連する疾患の治療においては、HRIPの発現または活性を低下させるこ
とが望ましい。また、HRIPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療におい
ては、HRIPの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１３５】 従って、或る実施例において、HRIPの発現または活性の低下に関連した疾患の
治療または予防のために、患者にHRIPまたはその断片や誘導体を投与することが
可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として神経疾患が含ま
れ、その中には癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー
病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋
萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網
膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウィルス性
髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄
炎及び神経根炎、ウィルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐
ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン
病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬
化症、小脳網膜性血管芽腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳
３叉神経血管症候群、精神薄弱その他の中枢神経系の発達障害、脳性麻痺、神経
骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフ
ィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、
代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、
気分障害、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害（SAD）
と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥
症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、
進行性核上麻痺、皮質基底核変性症（corticobasal degeneration）、家族性前
頭側頭骨痴呆が含まれ、また細胞増殖異常症も含まれ、その中には日光性角化症
、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組
織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、
原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌
を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、
消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、
唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、また自己免疫
異常症／炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジ
ソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血
、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎
、自己免疫多発性内分泌腺障害症（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、
クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一
時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッド
パスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏
性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、
骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、
強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全
身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌
合併症、血液透析、体外循環、ウィルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生
虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれる。
【０１３６】 別の実施例では、HRIPまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に
投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むHRIPの発現または活性の
低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１３７】 更に別の実施例では、実質的に精製されたHRIPを含む医薬品成分を好適な医薬
用担体と共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むHRIP
の発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である
。
【０１３８】 更に別の実施例では、HRIPの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限
定するものではないが上記した疾患を含むHRIPの発現または活性の低下に関連し
た疾患を治療または予防することも可能である。
【０１３９】 更に別の実施例では、患者にHRIPのアンタゴニストを投与して、HRIPの発現ま
たは活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限定す
るものではないがこのような疾患の例には、上記した神経疾患、細胞増殖異常症
及び自己免疫異常症／炎症性疾患がある。一実施態様においては、アンタゴニス
トとして直接的に、或いはHRIPを発現する細胞または組織に薬剤を輸送するター
ゲティングまたは輸送機構として間接的にHRIPと特異結合する抗体を用いること
ができる。
【０１４０】 別の実施例では、HRIPをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベク
ターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むHRIPの発現
または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１４１】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与する
こともできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従
ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治
療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各
薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減
し得る。
【０１４２】 HRIPのアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製
造し得る。具体的には、精製されたHRIPを用いて抗体を作るか、治療薬のライブ
ラリをスクリーニングして、HRIPと特異結合するものを同定することが可能であ
る。HRIPの抗体も、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造するこ
とが可能である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片及びFab発現ライ
ブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害
する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０１４３】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む
種々の宿主は、HRIP、またはHRIPの任意の断片またはオリゴペプチドであって免
疫原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。宿
主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。
限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバント
と、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プル
ロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペット
ヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられる
アジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウ
ム‐パルヴムが特に好ましい。
【０１４４】 HRIPに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断
片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には少なくとも約１０のアミ
ノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。これらのオリゴペプチド、
ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり且
つ小さな天然の分子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。HRIPアミノ酸の短
い伸長部は、別のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシニアンの配列
と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１４５】 HRIPに対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて
、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのよ
うな技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハ
イブリドーマ技術がある。（Kohler, G. ら. (1975) Nature 256:495-497、Kozb
or, D. ら (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. ら (1983) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. ら (1984) Mol. Cell Bio
l. 62:109-120等を参照。）
【０１４６】 更に、「キメラ抗体」を作製するために開発した技術、例えば好適な抗原特異
性及び生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝
子へのスプライシングを用いることが可能である。（Morrison, S.L.ら. (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Neuberger, M.S.ら (1984) Natur
e 312:604-608、タケダ, S.ら (1985) Nature 314:452-454等を参照。）或いは
、一本鎖抗体を産生するために説明された技術を適用し、本技術分野で知られて
いる方法を用いて、HRIP特異性一本鎖抗体を産生し得る。関連特異性を有するが
イディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリン
ライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる。（Burt
on D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照。） 抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免
疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高
特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る。（Orlandi, R. ら
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. ら (1991) N
ature 349:293-299等を参照。）
【０１４７】 HRIPのための特異結合部位を有する抗体を産生することもできる。例えば、限
定するものではないがこのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作
製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を減らすことによっ
て作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによ
って、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが
可能となる（Huse, W.D. ら (1989) Science 256:1275-1281等を参照。）
【０１４８】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射線アッセイまたは競合結合アッセ
イに対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイ
ムノアッセイは通常、HRIPとその特異性抗体間の複合体形成の計測に関与してい
る。２つの非干渉性HRIPエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いるよう
な、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合
結合アッセイを利用してもよい（前出のPoundの文献）。
【０１４９】 ラジオイムノアッセイ技術と共に様々な方法、例えばスキャッチャード分析を
用いて、HRIPに対する抗体の親和性を評価する。親和性は結合定数Kaで表す。Ka
は、平衡状態においてHRIP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃
度で除した値であると定義する。ポリクローナル抗体は多様なHRIPエピトープに
対する親和性が不均一であり、ポリクローナル抗体試薬のために決定したKaは、
HRIP抗体の平均親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は特定のHRIP
エピトープに対して単一特異的であり、モノクローナル抗体試薬のために決定し
たKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が約１０9〜１０12 L/molの範囲にあ
るような高親和性抗体試薬は、HRIP抗体複合体が激しい操作に耐えなければなら
ないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が約１０6〜１０7 L/molの範囲
にあるような低親和性抗体試薬は、HRIPが抗体から最終的に活性化状態で解離す
る必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい（Catty, D. (1988)
Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC、
Liddell, J. E.and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antib odies , John Wiley & Sons, New York NY）。
【０１５０】 ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、或る下流の適
用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、
少なくとも１〜２mg/ml、好ましくは５〜１０mg/mlの特異抗体を含むポリクロー
ナル抗体試薬は、HRIP抗体複合体を沈殿させる必要がある処理において通常用い
られる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や
使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のCattyの文献、
同Coligan らの文献等を参照）。
【０１５１】 本発明の別の実施例では、HRIPをコードするポリヌクレオチド、HRIPの任意の
断片または相補配列を治療目的で使用することができる。ある実施形態では、HR
IPをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止するのに好適で
ある場合にこれを使用し得る。具体的には、HRIPをコードするポリヌクレオチド
に相補的な配列で細胞を形質転換し得る。従って、相補的分子または断片は、HR
IP活性を調節するため、または遺伝子機能を調節するために使用し得る。このよ
うな技術は既に本技術分野ではよく知られており、センスまたはアンチセンスオ
リゴヌクレオチドまたは大きな断片を、HRIPをコードする配列のコード領域また
は制御領域に延在する様々な位置から設計することが可能である。
【０１５２】 レトロウィルス、アデノウィルス、ヘルペスまたはワクシニアウィルス由来の
発現ベクターまたは様々な細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、標的
器官、組織または細胞集団にヌクレオチド配列を輸送することができる。当業者
によく知られている方法を用いて、HRIPをコードするポリヌクレオチドに相補的
な核酸配列を発現するようなベクターを作製することができる。（前出のSambro
ok らの文献、同Ausubel らの文献等を参照。） HRIPをコードする高レベルのポリヌクレオチドまたはその断片を発現するよう
な発現ベクターを用いて細胞または組織を形質転換することによって、HRIPをコ
ードする遺伝子を遮断することができる。このような作製物を用いて、翻訳不可
能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞内に導入することができる。この
ようなベクターは、DNA内に統合されない場合であっても内在性ヌクレアーゼに
よって機能が損なわれるまでmRNA分子を転写し続けることができる。一過性の発
現は、非複製ベクターを用いた場合には１か月間以上続き、好適な複製要素がベ
クター系の一部である場合には更に長い間続くことがある。
【０１５３】 上記した通り、遺伝子発現の調節は、HRIPをコードする遺伝子の５'即ち調節
領域を制御するべく相補配列またはアンチセンス分子（DNA、RNAまたはPNA）を
設計することによって得ることが可能である。転写開始部位由来のオリゴヌクレ
オチドを用いることが可能であり、転写開始部位とは例えば開始部位から数えて
約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて
阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子、または
調節分子の結合のために十分に広がる二重らせんの能力を阻止するので、三重ら
せん塩基対形成は有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩につい
ては文献に記載されている。（Gee, J.E. ら (1994) in: Huber, B.E.and B.I.
Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. K
isco, NY, pp.163-177等を参照。）相補配列またはアンチセンス分子もまた、転
写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべ
く設計することができる。
【０１５４】 リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザ
イムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切
断に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーシ
ョンが関与している。例えば、組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子は、
HRIPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒する。
【０１５５】 任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を
含む、リボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同
定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する、リ
ボヌクレオチドが１５〜２０の短いRNA配列を、オリゴヌクレオチドを機能不全
にするような２次的構造の特徴に対して評価することが可能になる。候補標的の
適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うこ
とができる。
【０１５６】 本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために本技術分
野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。
或いは、HRIPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子
を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロ
モータを用いて多様なベクター内に組み入れることが可能である。或いは、相補
的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA作製物を、細胞株、細
胞または組織内に導入することができる。
【０１５７】 細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することがで
きる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５'末端、３'末端、ある
いはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホ
スホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2' Oメチルを使用し
たりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら
全ての分子に拡大することができる。それには、内在性エンドヌクレアーゼによ
って容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジ
ンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものに加えて、非従来
型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine
）等を包含することによる。
【０１５８】 ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo
、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合
、ベクターを患者から採取した肝細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患
者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入また
はポリカチオンアミノポリマーによる輸送は、本技術分野でよく知られている方
法を用いて実行することができる。（Goldman, C.K. ら (1997) Nat. Biotechno
l. 15:462-466.等を参照。） 上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ
、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０１５９】 本発明の追加実施例は、薬剤として許容できる担体と併せて、上記の任意の治
療効果を得るための医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬
品成分は、HRIP、HRIPに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、また
はHRIP阻害剤から構成し得る。成分は、単体で投与するか、或いは少なくとも１
の別の薬剤（例えば安定剤）と共に投与し得る。薬剤は、限定するものではない
が生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水など、任意の無菌の生体適合性医薬品
担体中で投与し得る。成分は、患者に単独で、或いは他の薬剤、薬物またはホル
モンと共に投与し得る。
【０１６０】 本発明に用いられる医薬品成分は、任意の数の経路によって投与することがで
き、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内
、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下また
は直腸がある。
【０１６１】 活性成分に加えてこれらの医薬品成分には、活性化合物を薬剤として許容でき
る好適な担体を有し得る。担体は、薬剤として使用可能なプレパラートへの活性
化合物の処理を促進するような医薬品添加物及び補助剤からなる。製剤及び投与
の技術については、Remington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing,
Easton PA）の最新版に詳細に記載されている。
【０１６２】 経口投与の医薬品成分は、本技術分野でよく知られている、薬剤として許容で
きる担体を用いて、経口投与に適した量で調剤することが可能である。このよう
な担体を用いることによって、医薬品成分を患者が摂取できるように錠剤、丸薬
、糖衣剤、カプセル剤、液状薬、ゲル状薬、シロップ剤、泥状物、懸濁液等とし
て製剤することが可能となる。
【０１６３】 経口投与の医薬品製剤は、活性化合物を固形の薬品添加物と結合させ、その結
果として得られた顆粒の混合物を（オプションで、すりつぶした後で）タブレッ
トまたは糖衣錠のコアが得られるように処理することによって、得ることができ
る。所望に応じて好適な医薬品添加物を加えることができる。好適な医薬品添加
物には糖質またはタンパク質賦形剤があり、具体例としてはラクトース、スクロ
ース、マンニトール、ソルビトールを含む糖類と、トウモロコシ、小麦、米、ジ
ャガイモその他の植物から採取されるでんぷんと、メチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム等の
セルロースと、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴムと、ゼラチン及び
コラーゲン等のタンパク質とが挙げられる。例えば架橋結合したポリビニルピロ
リドン、かんてん、アルギン酸またはアルギン酸塩（例えばアルギン酸ナトリウ
ム）等の崩壊剤または可溶化剤を所望に応じて添加してもよい。
【０１６４】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤等の好適なコーティングと共に用い得る。好適なコ
ーティングにも、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（
carbopol）ゲル、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカ
ー溶剤及び好適な有機溶媒または溶剤混合液等がある。製品の同定のため或いは
活性化合物の量即ち投与量を示すために、染料または色素を錠剤または糖衣錠に
添加してもよい。
【０１６５】 経口投与に用いることができる医薬品製剤には、ゼラチンでできた密封ソフト
カプセル及びグリセロールやソルビトール等のコーティングのみならず、ゼラチ
ンでできたプッシュ−フィット型（push-fit）カプセルもあり得る。プッシュ−
フィット型カプセルには、ラクトースまたはスターチ等の賦形剤や結合材と、タ
ルクまたはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤と、更にオプションで安定剤と
混合されたような活性成分を含めることが可能である。ソフトカプセルにおいて
は、安定剤を用いて或いは安定剤を用いずに、脂肪油、溶液またはポリエチレン
グリコール溶液等の好適な溶液中で活性化合物が溶解或いは懸濁し得る。
【０１６６】 非経口投与に適した医薬品製剤は、水溶液中で、好適にはハンクス液、リンガ
ー液、生理緩衝食塩水等の生理学的に適合性のあるバッファ中で製剤することが
できる。水性の注入懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビ
トール、デキストラン等の懸濁液の粘性を高める物質を有し得る。更に好適な油
性の注入懸濁液として活性化合物の懸濁液を製剤し得る。好適な親水性溶液また
は培地には、ごま油等の脂肪油またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、リボ
ソーム等の合成脂肪酸エステルがある。輸送のために非脂質ポリカチオンアミノ
ポリマーを用いてもよい。高濃度溶液の調剤が可能となるように、化合物の溶解
性を高める好適な安定剤または薬剤をオプションで懸濁液に含めてもよい。
【０１６７】 局所または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用
いられる。このような浸透剤は、本技術分野で通常に知られている。
【０１６８】 本発明の医薬品成分は、本技術分野でよく知られている方法、例えば従来の混
合、溶解、顆粒化、糖衣化、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥
処理等を用いて製造し得る。
【０１６９】 医薬品成分は塩として製剤され、限定するものではないが、塩酸、硫酸、酢酸
、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩は
、対応する遊離塩基形に比べて水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別
の場合では、薬剤は、１mM〜５０mMヒスチジン、０.１％〜２％スクロース、及
び／または２％〜７％マンニトールを含み、pHの範囲が４.５〜５.５であり、使
用前に緩衝剤と結合するような凍結乾燥粉末とすることができる。
【０１７０】 医薬品成分は、調合が完了した後に、指定された症状の治療のために適当な容
器に詰めて標識することができる。HRIPを投与するための投与の量、頻度及び方
法がラベルに書かれることになる。
【０１７１】 本発明に用いるのに適した医薬品成分には、意図する目的を達成するために効
果的な量の活性成分を含む組成物が含まれる。効果的な服用量は、当業者が自己
の能力の範囲内で決定する。
【０１７２】 任意の組成物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養ア
ッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ
等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた
、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を
用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０１７３】 治療上の有効投与量は、症状や容態を回復させるような活性成分量を参考にす
る。そのような活性成分の例としては、HRIPまたはその断片、HRIPの抗体、HRIP
のアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤がある。薬用有効度及び毒性は、細
胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の
５０％の医薬的有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）を測定するなどし
て決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数
であり、LD50／ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような医薬
品成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒト
に用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含
まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範
囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路に
よって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０１７４】 正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が
決定するであろう。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持
するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重
症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度
、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い
医薬品成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１
度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与してよい。
【０１７５】 通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、
合計で約１gまでとする。特定の投与量及び輸送方法に関するガイダンスは文献
に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、
タンパク質または阻害剤に対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を
利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの輸送は、
特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなることになる。
【０１７６】 （診断） 別の実施例では、HRIPの発現によって特徴付けられる疾患の診断のために、或
いはHRIPやHRIPのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤で治療を受けている
患者をモニターするためのアッセイにおいて、HRIPを特異的に結合する抗体が用
いられることがある。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方
法と同じ方法で調合される。HRIPの診断アッセイには、抗体及び標識を利用して
ヒトの体液において或いは細胞や組織のエキスにおいてHRIPを検出する方法が含
まれる。抗体は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポーター分子の共有結
合性或いは非共有結合性の接着によって標識化し得る。多様なレポーター分子が
本技術分野で知られており、それらを用いることができる。幾つかのレポーター
分子については上記した。
【０１７７】 HRIPを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が本技術
分野において知られており、HRIP発現の修正レベル或いは異常レベルを診断する
基準を提供する。複合体の形成に適した条件下でヒト対象等の正常な哺乳動物対
象から採取した体液または細胞とHRIPに対する抗体とを結合させることにより、
HRIP発現の正常値または標準値が決定される。標準複合体形成量は、種々の方法
、例えば測光法で定量できる。対象内で発現したHRIPの量、制御、検体からの病
変サンプルを標準値と比較する。標準値と対象との偏差が疾患を診断するパラメ
ータとなる。
【０１７８】 別の実施例によれば、HRIPをコードするポリヌクレオチドを診断目的に用いる
こともできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオ
チド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。ポリヌクレオチドは
、検体におけるHRIPの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現
の検出及び定量に用いることができる。診断アッセイは、HRIPの不在、存在及び
過剰発現を測定するために、そして治療インターベンション中にHRIPレベルの調
製を監視するために用いることができる。
【０１７９】 ある実施形態では、HRIPをコードする核酸配列を同定するために、HRIPまたは
近縁の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能な
PCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いることができる。プローブが同
定するのはHRIP、突然変異体または関連配列をコードするような、天然に存在す
る配列のみであるか否かは、プローブの特異性及びハイブリダイゼーション或い
は増幅のストリンジェンシーによって決定されることになる。ここで、プローブ
の特異性とは、プローブが高特異領域（例えば５'調節領域）からなるのか、低
特異領域（例えば保存されたモチーフ）からなるのかということである。
【０１８０】 プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はHRIP
をコードする任意の配列と少なくとも５０％の相同性を有し得る。本発明のハイ
ブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAとすることができ、配列番号１５乃
至２８の配列、或いはHRIP遺伝子のプロモータ、エンハンサー、イントロンを含
むゲノム配列に由来し得る。
【０１８１】 HRIPをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製
する方法には、HRIPまたはHRIP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、mR
NAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。mRNA
プローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好
適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって
、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーシ
ョンプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集
団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合
系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙
げられる。
【０１８２】 HRIPの発現に関連する疾患を診断するために、HRIPをコードするポリヌクレオ
チド配列を用いることができる。限定するものではないがこのような疾患の例と
して限定するものではないがこのような疾患の例として神経疾患が含まれ、その
中には癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピッ
ク病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側
策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺
伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウィルス性髄膜炎、
脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神
経根炎、ウィルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病
及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致
死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小
脳網膜性血管芽腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経
血管症候群、精神薄弱その他の中枢神経系の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常
症、自律神経系障害、脳神経障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその
他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、
内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害
、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害（SAD）と、静座
不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、
ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核
上麻痺、皮質基底核変性症（corticobasal degeneration）、家族性前頭側頭骨
痴呆が含まれ、また細胞増殖異常症も含まれ、その中には日光性角化症、動脈硬
化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MC
TD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血
小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌
、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、
心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、
皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、また自己免疫異常症／
炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病、
成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、
アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免
疫多発性内分泌腺障害症（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン
病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リン
パ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャ
ー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症
候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょ
う症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、
シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化
症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、
血液透析、体外循環、ウィルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症
、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれる。 HRIPをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン法、ノーザン法、ドットブロ
ット法やその他の膜ベースの技術と、PCR法と、ディップスティック（dipstick
）法、ピン及びマルチフォーマットELISA様アッセイと、変異HRIPの発現を検出
するために患者から採取した体液または組織を利用するマイクロアレイとにおい
て使用し得る。このような定性または定量方法は、本技術分野で公知である。
【０１８３】 或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて
、HRIPをコードするヌクレオチド配列が有効であろう。HRIPをコードするヌクレ
オチド配列は標準法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適
な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することができ
る。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを
定量して標準値と比較する。患者サンプルのシグナル量が制御サンプルと比べて
著しく変化している場合は、サンプル内のHRIPをコードするヌクレオチド配列の
変異レベルは関連する疾患の存在を示している。このようなアッセイは、動物実
験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療
を監視するために用いることもできる。
【０１８４】 HRIPの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現のための正常あ
るいは標準概要を確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適
な条件下で、動物或いはヒトの正常な対象から抽出した体液或いは細胞を、HRIP
をコードする配列またはその断片と結合させることにより達成され得る。実質的
に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な対
象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量するこ
とができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサン
プルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在
を確定する。
【０１８５】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正
常な対象に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリ
ダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返されるであろう。連続アッセイか
ら得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すこと
ができる。
【０１８６】 癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現また
は過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる
前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、
医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生ま
たは更なる進行を防止することが可能となる。
【０１８７】 HRIPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドを追加的に診断上利
用することは、PCRの利用に関与し得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成
するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、
好ましくはHRIPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはHRIPをコードする
ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドの断片を含み、最適条件下で特定の
遺伝子や条件を識別するべく利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリ
ンジェント条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその両方の
ため用いることが可能である。
【０１８８】 HRIPの発現を定量するためにも用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標
識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）及び標準曲線
から得た結果の補間が含まれる。（Melby, P.C.ら (1993) J. Immunol. Methods
, 159:235-244、Duplaa, C.ら (1993) Anal. Biochem. 212:229-236等を参照。
）目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または非色応答によ
って定量が迅速になるようなハイスループットフォーマットのアッセイを行うこ
とによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０１８９】 更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来の
オリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発現レベルを同
時に監視し、遺伝的変異体、突然変異及び多型現象を同定することができる。こ
の情報は、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、治
療薬剤の活性を開発及び監視するために有用である。
【０１９０】 マイクロアレイは本技術分野でよく知られている方法を用いて準備し、使用し
、そして分析する。（Brennan, T.M. ら (1995) の米国特許第5,474,796号、Sch
ena, M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschwei
ler ら (1995) のPCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.ら (1995) のPCT出願第W
O95/35505号、Heller, R.A. ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2
155、Heller, M.J. ら (1997) の米国特許第5,605,662号等を参照。） 本発明の別の実施例では、天然のゲノム配列をマッピングする際に有効なハイ
ブリダイゼーションプローブを産出するため、HRIPをコードする核酸配列を用い
ることが可能である。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工
形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌
人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマ
ッピングされる。（Harrington, J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345-355、Pric
e, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:
149-154等を参照。）
【０１９１】 蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的染色体マッピング技術
及び遺伝地図データと相関し得る。（Heinz-Ulrich, ら (1995) 前出のMeyers,
pp. 965-968.等を参照。）遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnli
ne Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる
。物理的染色体地図上のHRIPをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性
、或いは特定の疾患に対する素因が、その疾患に関係するDNAの領域を画定する
のに役立つであろう。健常者、保有者、感染者の三者間における遺伝子配列の相
違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０１９２】 確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色
体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。
マウス等、別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、特定のヒト
染色体の数或いはアームが分かっていない場合でも関連するマーカーが明らかに
なるであろう。新規の配列は、物理的マッピングによって染色体アームに割付け
可能である。このことは、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて遺
伝的疾患を調査する研究者にとって価値ある情報である。疾患または症候群が、
血管拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって
大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなるマッピングも、更なる
調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる。（Gatti, R.A.
ら (1988) Nature 336:577-580等を参照。）転座、反転等に起因する、健常者、
保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌ
クレオチド配列を用いてもよい。
【０１９３】 本発明の別の実施例では、種々の薬剤スクリーニング技術を以って化合物のラ
イブラリをスクリーニングするために、HRIP、HRIPの触媒作用断片、免疫原断片
、またはそのオリゴペプチドを用いることができる。薬剤スクリーニングに用い
る断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に
保持されるか、細胞内に位置することになろう。HRIPとテストされる薬剤との結
合複合の形成は計測できる。
【０１９４】 別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性
を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる。（Geys
en,ら (1984) のPCT出願番号 WO84/03564等を参照。）この方法においては、多
数の異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、HRIP
或いはその断片と反応させ、洗浄する。次に、本技術分野でよく知られている方
法で、結合したHRIPを検出する。精製したHRIPはまた、上記した薬剤のスクリー
ニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別
法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定す
ることもできる。
【０１９５】 別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。この
アッセイでは、HRIPを結合することができる中和抗体が、HRIPを結合するための
試験化合物と特異的に競合する。この方法では、抗体が、１若しくは数個の抗原
決定因子をHRIPと共有するペプチドの存在を検出する。
【０１９６】 別の実施例では、新規技術が現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定
するものではないがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対の相互作用等を含む
）に依存するのであれば、依然として発展すべきいかなる分子生物学技術におい
ても、HRIPをコードするヌクレオチド配列を用いることができる。
【０１９７】 詳細説明を追加しなくとも、本技術分野の技術者であれば以上の説明を以って
本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単
なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０１９８】 本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第
60/125,593号、同第60/135,049号、同第60/143,188号は、言及することをもって
本明細書の一部となす。
【０１９９】 （実施例） １ cDNAライブラリの作製 RNAは、Clontech社から購入し、或いは表４に列記した組織から単離した。ホ
モジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、
また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織
もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネ
ートの単相溶液であるTRIZOL（Life Technologies）等である。結果として得ら
れた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。
イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別
の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０２００】 RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰
り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは
、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, V
alencia CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RN
Aを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キッ
ト（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２０１】 場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをS
tratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、本技術分野で公知の
推奨方法または類似の方法を用いて、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）ま
たはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いてcDNAを合成
し、cDNAライブラリを作製した。（前出のAusubel, 1997, unit 5.1-6.6等を参
照。）逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成
オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素で
cDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（３００〜１０００
bp）選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムク
ロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは調製用アガロースゲ
ル電気泳動法を用いて行った。cDNAは、好適なプラスミドのポリリンカーの適合
性制限酵素部位に連結反応させた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプ
ラスミド（Stratagene）、pSPORT1プラスミド（Life Technologies）またはplNC
Y（Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA）等である。組換えプラスミドは、S
tratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社
のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に形質転
換した。
【０２０２】 ２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或い
は細胞溶解によって、プラスミドを宿主細胞から回収した。MagicまたはWIZARD
Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Bios
ystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus P
lasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミ
ドキットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミドを精製した。沈殿させた
後、０.１mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに、４℃
で保管した。
【０２０３】 別法では、ハイスループットフォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿
主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem.
216:1-14）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で
行った。サンプルを処理し、それを384穴プレート内で保管し、増幅したプラス
ミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFluoroska
n II蛍光スキャナー（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的
に定量した。
【０２０４】 ３ シークエンシング及び分析 cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いはハイスループット装置、例えば
ABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）またはPTC-200 サーマ
ルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scient
ific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した
。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬ま
たはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle s
equencing ready reaction kit（Perkin-Elmer）に与えられた試薬を用いて準備
した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチド
の検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamic
s）か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM
373または377シークエンシングシステム（Perkin-Elmer）か、或いはその他の本
技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。cDNA配列の読み枠は、
標準的方法（前出のAusubel, 1997, unit 7.7）を用いて決定した。cDNA配列の
幾つかを選択して、本実施例５に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２０５】 cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、当業者によく知られたアルゴリ
ズムを利用するソフトウェアの組合せを用いて構築し、解析した。利用したツー
ル、プログラム及びアルゴリズムの概略、適用可能な説明、引用文献、閾値パラ
メータを表５に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表５の列１
に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な引用文献であり、全文献は
そっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列
４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他の
パラメータを示す（スコアが高ければ高いほど２配列間の相同性が高くなる）。
配列の解析は、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリン
グ, South San Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて
行った。
【０２０６】 ポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリA配列を除去すること
により、またあいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。そ
の際、BLAST、動的プログラミング、及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づく
アルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、BLAST、FASTA及びBLIMPSに基づく
プログラムを用いて、プログラム中の注釈を得るべく、公共のデータベース、例
えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベ
ースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMの選択に対する配列を問い合わ
せした。配列はPhred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて完全長のポ
リヌクレオチド配列に構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを
用いてオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完
全長アミノ酸配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、その後
、GenBankデータベース（上記）、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及
びProsite等のデータベース、PFAM等のHidden Markov Model（HMM）ベースのタ
ンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長配列を分析した
。HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を解析する確率的アプロー
チである。（Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参
照。）
【０２０７】 完全長ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記のプロ
グラムは、配列番号１５乃至２８からのポリヌクレオチド配列の断片を同定する
ためにも使用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅に有用な約２０〜約４０
００のヌクレオチドの断片は、上記「発明」の項で説明した。
【０２０８】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験
技術であり、標識されたヌクレオチド配列の、特定の細胞種または組織からのRN
Aが結合される膜へのハイブリダイゼーションに関与している。（前出のSambroo
k, 7章、同Ausubel. F.M. ら, 4章及び16章等を参照。）
【０２０９】 BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyt
e Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分
子を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも断然
速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決
定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準はプ
ロダクトスコアであり、次式で定義される。 （％配列一致率×％最大BLASTスコア）／１００ プロダクトスコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考
慮している。例えば、プロダクトスコアが４０であれば誤差１〜２％以内の精度
で一致し、プロダクトスコアが７０であれば正確に一致することになる。類似分
子は通常、１５〜４０のプロダクトスコアを示す分子を選択することにより同定
する。それ以下のスコアでは、関連分子を同定し得る。
【０２１０】 ノーザン分析の結果は、HRIPをコードする転写物が作出されたライブラリの分
布パーセンテージとして報告される。分析は、器官／組織及び疾患によるcDNAラ
イブラリのカテゴリー分類に関与している。器官／組織のカテゴリーには、心血
管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖及び泌尿器が
ある。疾患／病状のカテゴリーには、癌、炎症、外傷、細胞増殖、神経、貯留（
pooled）が含まれる。カテゴリー毎に目的の配列を発現するライブラリ数を数え
、それを全カテゴリーのライブラリ数で除した。組織特異発現及び疾患／病状特
異発現のパーセント値を表３に示す。
【０２１１】 ５ ポリヌクレオチドをコードするHRIPの伸長 配列番号１５乃至２８の完全長の核酸配列は、完全長分子の適切な断片から設
計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一
方のプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマ
ーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、
長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が５０％以上となり、約６８〜７２
℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（Nati
onal Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。
ヘアピン構造及びプライマー-プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの
伸長は全て回避した。
【０２１２】 配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。２段階以上
の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネ
ステッドセットを設計した。
【０２１３】 高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって
得られた。PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて
96穴プレート内で行った。反応混合液には、DNA鋳型、各プライマー２００nmol
と、Mg2+、(NH4)2SO4 及びβ-メルカプトエタノールを含む反応バッファと、Taq
DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）と、ELONGASE酵素（Life Tec
hnologies）と、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）が含まれていた。プライマ
ー対PCI A、PCI Bに対して用いたパラメータは次の通りである。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ６０℃で１分間 ステップ４： ６８℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： ６８℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存 プライマー対T7、SK+に対しては、上記パラメータに代えて以下のパラメータを
用いた。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ５７℃で１分間 ステップ４： ６８℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： ６８℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存
【０２１４】 1X TEに溶解したPICOGREEN定量試薬（０.２５％(v/v) PICOGREEN、Molecular
Probes, Eugene OR）１００μlと、希釈していないPCR産物０.５μlとを不透明
な蛍光光度計プレート（Coming Costar, Acton MA）の各穴に分配し、DNAを試薬
と結合可能なようにさせることによって各穴内のDNA濃度の測定を行った。サン
プルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するべくプレートをFluoroskan II （Lab
systems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコート５
〜１０μlを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応
が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０２１５】 伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコ
レラウィルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）
を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結反
応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、
消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し
、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローン
をT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（A
mersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）
で処理して制限部位の張出部（overhang）を満たし、コンピテント大腸菌細胞に
形質移入した。形質移入した細胞を抗生物質含有培地上で選択し、個々のコロニ
ーを選択してLB/2x carb液体培地の384穴プレート内において３７℃で一晩培養
した。
【０２１６】 細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）及びPfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いてPCRによってDNAを増幅した。その際用
いたパラメータは次の通りである。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ６０℃で１分間 ステップ４： ７２℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２９回繰り返す ステップ６： ７２℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存 DNAは、上記のPICOGREEN試薬（Molecular Probes）によって定量した。DNAの回
収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０
％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC energy transfer
sequencing primer及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）ま
たはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Per
kin-Elmer）を用いてシークエンシングした。
【０２１７】 同様に、上記手順と、伸長のために設計されたオリゴヌクレオチドと、適切な
ゲノムライブラリを用いて、５'調節配列を得るべく、配列番号１５乃至２８の
ヌクレオチド配列が用いられる。
【０２１８】 ６ 個々のハイブリダイゼーションの標識及び使用 配列番号１５乃至２８から得たハイブリダイゼーションプローブを利用して、
cDNA、ゲノムDNAまたはmRNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリ
ゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に
対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソ
フトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各
オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸 （Amersham Pharmacia Bi
otech）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）
を結合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-2
5超細繊分子サイズ排除デキストランビードカラム（Amersham Pharmacia Biotec
h）を用いて実質的に精製する。 Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１
つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイ
ブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを
含むアリコットを用いる。
【０２１９】 各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ny
tran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーショ
ンは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１x
クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件
下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代
わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比
較する。
【０２２０】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基質の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である。（前出のBaldeschweiler等を参照。）ドットブロッ
ト法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、機
械的または化学的結合手順を用いて基質の表面に要素を配置及び結合させてもよ
い。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作製でき
、任意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーション後にハイブリダイ
ズされていないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパタ
ーンを決定する。スキャンしたイメージを分析することで、マイクロアレイ上で
要素にハイブリダイズする各プローブの相補性の度合い及び相対発生量を算定で
きる。
【０２２１】 完全長のcDNA、発現遺伝子標識（EST）またはこれらの断片は、マイクロアレ
イの要素を構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、LASERGENEソ
フトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択する
ことが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のcDNA、EST、ま
たはこれらの断片、或いは本発明に関連するcDNAライブラリから任意に選択した
cDNAを、ガラススライド等の好適な基質に配置する。cDNAは、例えばＵＶ架橋剤
を利用してスライドに固定してから、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥さ
せる（Schena, M. ら. (1995) Science 270:467-470、Shalon, D. ら (1996) Ge
nome Res. 6:639-645等を参照。）蛍光プローブを調製して、基質上の要素にハ
イブリダイゼーションするために用いる。基質は、上記した方法で分析する。
【０２２２】 ８ 相補的ポリヌクレオチド HRIPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的配列は、天然のHR
IPの発現を検出し、低下させ、または阻害するために用いられる。約１５〜約３
０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或い
は大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4
.06ソフトウェア（National Biosciences）、及びHRIPをコードする配列を用い
て、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特
な５' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモータが
コーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的オ
リゴヌクレオチドを設計して、HRIPをコードする転写物にリボソームが結合する
のを阻害する。
【０２２３】 ９ HRIPの発現 HRIPの発現及び精製は、細菌またはウィルスをベースにした発現系を用いて行
うことができる。細菌でHRIPが発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レ
ベルを高める誘導性のプロモータを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニン
グする。このようなプロモータには、lacオペレーター調節要素に関連するT5ま
たはT7バクテリオファージプロモータ及びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモータ
が含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21(DE3)
等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピル
β-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されるとHRIPを発現する。真核細胞
でのHRIPの発現は、一般にバキュロウィルスとして知られているAutographica c alifornica 核多面性ウィルス（AcMNPV）を昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に感
染させて行う。バキュロウィルスの可欠ポリヘドリン遺伝子を、相同的組換え、
或いは転移プラスミドの仲介に関与する細菌仲介遺伝子転移のどちらかによって
、HRIPをコードするcDNAと置換する。ウィルスの感染力は維持され、強いポリヘ
ドリンプロモータによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロ
ウィルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞に感染に用い
られるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、
バキュロウィルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（Engelhard. E. K.ら (19
94) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. G
ene Ther. 7:1937-1945.等を参照。）
【０２２４】 殆どの発現系では、融合タンパク質としてHRIPを合成するのに例えばグルタチ
オンSトランスフェラーゼ（GST）またはペプチドエピトープ標識、例えばFLAGや
6-Hisを用いる。これらを用いることにより、未精製細胞溶解物から組換え融合
タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に１ステップで行うことができる。GST
は日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持
した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Amer
sham Pharmacia Biotech）。精製後、GSTの部分を特定の開発部位においてHRIP
からタンパク分解的に切断することが可能である。FLAGは８アミノ酸のペプチド
であり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体（Eastma
n Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して
伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂（QIAGEN）上での精製を可能にする。タン
パク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載され
ている。これらの方法で精製したHRIPを直接用いて以下のアッセイを行うことが
できる。
【０２２５】 １０ HRIP活性の実証 HRIPのキナーゼ活性は、γ-標識32P-ATPを用いた好適な基質のリン酸化反応と
、βラジオアイソトープカウンタを用いた摂取放射能の定量によって決定する。
HRIPは、タンパク質基質、32P-ATP及び好適なキナーゼバッファを用いてインキ
ュベートする。産物内に取り込まれた32Pは電気泳動によって遊離32P-ATPから離
隔され、取り込まれた32Pを計数する。回収された32Pの量は、このアッセイにお
けるHRIPのキナーゼ活性に比例する。プロテインキナーゼによってリン酸化され
た特定のアミノ酸残基は、加水分解されたタンパク質のホスホアミノ酸分析によ
って決定する。
【０２２６】 或いは、HRIPのプロテインホスファターゼ活性を、p-ニトロフェニルリン酸（
PNPP）の加水分解によって決定する。HRIPは、３７℃で０.１％ｂ-メルカプトエ
タノールの存在下で、pH７.５のHEPESバッファ内でPNPPと共に６０分間インキュ
ベートする。この反応は１０NのNaOHを添加することで停止する。PNPPの加水分
解によって生じた４１０nmにおける光の吸光度の増加は、分光光度計を用いて測
定する。光の吸光度の増加は、本アッセイのHRIP活性に比例する（Diamond, RH.
ら (1994) Mol. Cell Biol. 14:3752-3762）。
【０２２７】 １１ 機能的アッセイ HRIP機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのHR
IPをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現
する強いプロモータを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選り
抜きのベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びpCR 3.1
プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウィルスプロモータ
を有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの組換えベ
クターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形質移
入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラスミド
を同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移
入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、cD
NAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば
緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質か
ら選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメ
トリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同
定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死
に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出し
て計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によ
るDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、ブロモデオキシウリジンの取
込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によっ
て計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光
複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組
成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994
) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。
【０２２８】 遺伝子発現におけるHRIPの影響は、HRIPをコードする配列とCD64またはCD64-G
FPのいずれかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価すること
ができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫
グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質転換細胞と非形質転換細胞は、
ヒトIgGまたはCD64に対する抗体（DYNAL, Lake Success. NY）で覆われた磁気ビ
ーズを用いて有効に分離することができる。mRNAは、本技術分野で公知の方法で
細胞から精製することができる。HRIPその他の目的の遺伝子をコードするmRNAの
発現は、ノーザン分析或いはマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０２２９】 １２ HRIP特異抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；Harrington, M.G. (1990) Method
s Enzymol. 182:488-495等を参照）または他の精製技術を用いて実質上精製され
たHRIPを用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産出する。
【０２３０】 或いは、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてHRIPアミノ酸配列を解析
し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、
このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。
適切なエピトープ、例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピトー
プの選択については、本技術分野で公知である。（前出のAusubel, 1995, 11章
等を参照。）
【０２３１】 通常、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、ABI 431A ペプチドシンセサイザ
（Perkin-Elmer）を用いてFmocケミストリを用いて合成し、N-マレイミドベンゾ
イル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（S
igma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusube
l, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド-KLM
複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗HR
IP活性を検査するには、ペプチドまたはHRIPを基質に結合し、１％BSAを用いて
ブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素で標識した
ヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０２３２】 １３ 特異抗体を用いた天然のHRIPの精製 天然または組換えHRIPを、HRIP特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマ
トグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗HRIP抗
体を活性化クロマトグラフィー用樹脂、例えばCNBr活性化セファロース（Amersh
am Pharmacia Biotech）と共有結合させることにより構築する。結合後に、製造
者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０２３３】 HRIPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、HRIPを優先的に吸着
する条件下（例えば、界面活性剤が存在する高イオン強度バッファ）でカラムを
洗浄する。抗体とHRIPの結合を破壊する条件（例えばpH２〜３のバッファ、或い
は尿素またはチオシアン酸塩イオン等の高濃度のカオトロープ剤）でカラムを溶
出させ、HRIPを回収する。
【０２３４】 １４ HRIPと相互作用する分子の同定 HRIPまたは生物学的に活性であるHRIP断片を、125Iボルトンハンター試薬で標
識する。（Bolton A.E.and W.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539等を
参照。）マルチウェルプレートの穴の中に予め配列しておいた候補分子を、標識
したHRIPと共にインキュベートして洗浄し、標識したHRIP複合体を有する全ての
穴をアッセイする。HRIP濃度を変えて得たデータを用いて、候補分子とのHRIPの
数、親和性及び会合の値を計算する。
【０２３５】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の
好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施
例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学ま
たは関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方
法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０２３６】 （表の簡単な説明） 表１は、HRIPをコードする完全長の配列をアセンブルするために用いた、ポリ
ペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号（SEQ ID NO）、クローン識別番
号（クローンID）、cDNAライブラリ及びcDNA断片を示す。
【０２３７】 表２は、潜在モチーフと、相同配列と、HRIPの解析に用いた方法、アルゴリズ
ム及び検索可能なデータベースとを含む各ポリペプチド配列の特徴を示す。
【０２３８】 表３は、各核酸配列の選択された断片と、ノーザン分析によって決定された各
核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、異常症ま
たは症状と、各DNAのクローニング先のベクターとを示す。
【０２３９】 表４は、cDNAライブラリの作製に用いた組織を示す。HRIPをコードするcDNAク
ローンはここから単離した。
【０２４０】 表５は、HRIPの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能
な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 7/06 ４Ｃ０８４ 7/04 9/10 ４Ｈ０４５ 7/06 11/00 9/10 11/06 11/00 13/12 11/06 17/00 13/12 17/06 17/00 19/02 17/06 19/10 19/02 21/00 19/10 21/04 21/00 25/00 21/04 １０１ 25/00 25/08 １０１ 25/18 25/08 25/22 25/18 25/28 25/22 27/00 25/28 29/00 27/00 １０１ 29/00 31/10 １０１ 31/12 31/10 33/00 31/12 35/00 33/00 35/02 35/00 37/08 35/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/08 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 37/00 １０２ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 37/00 １０２ Ａ６１Ｋ 37/54 (31)優先権主張番号 ６０／１４３，１８８ (32)優先日 平成11年７月９日(1999．7．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 タング、ワイ・トム アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94545・ ヘイワード・ロックスプリングスドライブ 2045 (72)発明者 リュ、デュング・アイナ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州95136・ サンノゼ・パークベルモントプレイス 55 (72)発明者 オウ−ヤング、ジャニス アメリカ合衆国カリフォルニア州94005・ ブリスベーン・ゴールデンイーグルレーン 233 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB07 HA10 4B024 AA01 AA11 BA21 BA43 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA01 HA14 HA15 4B063 QA01 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA17 BA15 BA16 BA17 BA18 CA56 MA52 MA55 NA14 ZA012 ZA022 ZA062 ZA162 ZA592 ZA752 ZA892 ZA942 ZA962 ZB072 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZB272 ZB312 ZB322 ZB332 ZB352 ZB372 ZC352 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA20 CA40 DA01 DA75 EA22 EA50 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の（ａ）乃至（ｄ）からなる群から選択したアミノ酸
    配列からなる単離されたポリペプチド。 （ａ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも
    ９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列 （ｃ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活
    性断片 （ｄ）配列番号１乃至１４からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断
    片
  2. 【請求項２】 配列番号１乃至１４からなる群から選択した請求項１に記
    載の単離されたポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチド。
  4. 【請求項４】 配列番号１５乃至２８からなる群から選択した請求項３に
    記載の単離されたポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に結合したプ
    ロモータ配列からなる組換えポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転
    換した細胞。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載の組換えポリヌクレオチドからなる遺伝形
    質転換体。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、 （ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を前記ポリペプチド
    の発現に適した条件下で培養する過程と、 （ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを受容する過程とからなり、 前記組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコード
    するポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモータ配列からなることを特徴と
    する方法。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離
    された抗体。
  10. 【請求項１０】 以下の（ａ）乃至（ｄ）からなる群から選択したポリヌ
    クレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチド。 （ａ）配列番号１５乃至２８からなる群から選択したポリヌクレオチド配列 （ｂ）配列番号１５乃至２８からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と
    少なくとも９０％の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列 （ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列 （ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の或るポリヌクレオチドの少なくとも
    ６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１０に記載のポリヌクレオチドの或る配列を有す
    る標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、 （ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少
    なくとも１６の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハ
    イブリダイズする過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体
    が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合
    体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特
    異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。
  13. 【請求項１３】 前記プローブが少なくとも３０の連続したヌクレオチド
    からなることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチド
    からなることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 有効量の請求項１のポリペプチドと薬剤として許容でき
    る賦形剤とからなることを特徴とする医薬品成分。
  16. 【請求項１６】 機能性HRIPの発現低下に関連する疾患又は病状を治療す
    る方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項１５に記載の
    医薬品成分を投与する過程からなることを特徴とする方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効
    性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドからなるサンプルを化合物に曝す過程と
    、 （ｂ）前記サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とからなることを特徴
    とする方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法によって同定したアゴニスト化
    合物と薬剤として許容できる賦形剤とからなることを特徴とする医薬品成分。
  19. 【請求項１９】 機能性HRIPの発現低下に関連する疾患又は病状を治療す
    る方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項１８に記載の
    医薬品成分を投与する過程からなることを特徴とする方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして
    有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドからなるサンプルを化合物に曝す過程と
    、 （ｂ）前記サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とからなることを
    特徴とする方法。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の方法によって同定したアンタゴニス
    ト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とからなることを特徴とする医薬品成分
    。
  22. 【請求項２２】 機能性HRIPの過剰発現に関連する疾患又は病状の治療方
    法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項２１に記載の医薬
    品成分を投与する過程からなることを特徴とする方法。
  23. 【請求項２３】 請求項４に記載の配列からなる標的ポリペプチドの発現
    を変異させる際に有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であ
    って、 （ａ）前記標的ポリペプチドからなるサンプルを化合物に曝す過程と、 （ｂ）前記標的ポリペプチドの変異した発現を検出する過程とからなることを
    特徴とする方法。
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