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JP2002536428A - タンパク質結合のための改良化化合物 - Google Patents

タンパク質結合のための改良化化合物

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Publication number
JP2002536428A
JP2002536428A JP2000598469A JP2000598469A JP2002536428A JP 2002536428 A JP2002536428 A JP 2002536428A JP 2000598469 A JP2000598469 A JP 2000598469A JP 2000598469 A JP2000598469 A JP 2000598469A JP 2002536428 A JP2002536428 A JP 2002536428A
Authority
JP
Japan
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compound according
compound
group
binding
membrane
Prior art date
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Pending
Application number
JP2000598469A
Other languages
English (en)
Inventor
ピン・ウィン
クリストファー・ジョン・バーンズ
マシュー・ピーター・ウィルキンソン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Sydney
Original Assignee
University of Sydney
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Sydney filed Critical University of Sydney
Publication of JP2002536428A publication Critical patent/JP2002536428A/ja
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規な結合化合物、特にタンパク質結合化合物に関する。上記新規な化合物は特に、膜を含む表面に対するタンパク質の結合に対して有用である。好ましい形態として本発明は、これらのタンパク質結合化合物を取り込んだバイオセンサーを提供する。本発明はまた、本発明の結合タンパク質の合成における使用のための中間体化合物に及ぶ。それ故本発明は、式（ＩＩＩ）：Ｗ−Ｘ−Ｙ（Ｚ）ｎ[式中、Ｙは分枝部分であり、Ｚは金属イオンを配位する多座配位子キレート剤を表し、Ｘはスペーサー部分であり；ｎは少なくとも２の整数であり、Ｗは他の分子に対する結合、表面に対する結合、または膜への挿入を可能にする基である]の、新規なタンパク質結合化合物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な結合化合物、特にタンパク質結合化合物に関する。上記新規
な化合物は特に、膜を含む表面に対するタンパク質の結合に対して有用である。
好ましい形態として本発明は、これらのタンパク質結合化合物を取り込んだバイ
オセンサーを提供する。本発明はまた、本発明の結合タンパク質の合成における
使用のための中間体化合物に及ぶ。
【０００２】
【従来の技術】
三成分金属錯体は文献において周知であり（１）、金属に対する二つの別個の
金属キレート基の配位にとして記載可能である。三成分錯体において通常観察さ
れる金属は、Ｃｏ2+，Ｎｉ2+，Ｃｕ2+，Ｚｎ2+である。典型的な金属配位基は、
ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、イミノジ酢酸（ＩＤＡ）、カテコール、およびイ
ミダゾールのような複素環を含む芳香族窒素である。三成分錯体は、電位差計算
（２）およびＸ線結晶解析（３）を含む数多くの方法によって特徴付けされてい
る。これらの研究は、単純な三成分錯体の安定性について、１０3−１０4Ｍ-1で
ある平均安定度定数（Ｋａ）として測定可能にする（４）。
【０００３】 １９７５年に、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）と
して周知な方法において、分画化および精製タンパク質のための方法で金属−Ｉ
ＤＡ錯体の使用が報告された（５）。この方法において、ＩＤＡの誘導体がセフ
ァロースのような固相の支持体に結合され、上記セファロースがカラムに充填さ
れた。金属イオンがＴＤＡ部分に加えられ（カラムを通じた金属イオンの希釈溶
液の通過によって）、ついでタンパク質混合物が加えられた。カラムを通じたタ
ンパク質混合物の希釈は、金属−ＩＤＡ種と相互作用したものを除き、全てのタ
ンパク質を除去した。ついでこのタンパク質若しくはタンパク質類を、イミダゾ
ール溶液の添加によって、ＥＤＴＡ若しくはＥＧＴＡのような強力な金属キレー
ト剤の添加によって、またはｐＨを４．５−５．３に下げることによって、カラ
ムから溶出させた（６）。
【０００４】 １９８７年に、Hochuliおよび共同研究者は、タンパク質（７）、特に組み換
え的に操作された6-Hisタグ化タンパク質（８）の精製における使用のために、
Ｎｉ−ＮＴＡを使用した。ＮＴＡを有する固相の支持体に対するHis-タグ化タン
パク質のアフィニティーは、約１０13Ｍ-1と測定されている（９）。
【０００５】 １９９６年に、ＮＴＡの誘導体を使用して、ポリスチレンマイクロウェルプレ
ートのウェルに対してHis-タグ化タンパク質を結合する方法が報告された（１０
）。
【０００６】 １９９７年に、表面にタンパク質を結合する方法として、石英ミクロスコープ
スライドに結合した複数のＮＴＡの使用が記載された。１９９８年に、全内部反
射蛍光による研究のためのこの技術によって、石英スライドに対するレポーター
であるHisタグ化５ＨＴの結合が報告された（１２）。
【０００７】 １９９５年に、分析物を検出する方法として、二座性、三座性および四座性金
属キレート基を有する表面の誘導化が記載された（１３）。１９９６年に、表面
プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による研究のための、ペンダントＮＴＡ部分を有する
金上の混合自己集合単分子相に対するHis-タグ化タンパク質の結合が報告された
（１４）。
【０００８】 １９９７年に、測定プロコールとしてＳＰＲを使用する商業的に入手可能な検
出装置による、ＮＴＡ−ニッケル部分を展示する表面に対するHis-タグ化タンパ
ク質の結合が報告された（１５）。
【０００９】 １９９７年に、ＦＴＩＲによる研究のための金皮膜表面に対するＦａｂ断片の
結合のための、ＮＴＡ部分を提示するＳＡＭの使用が報告された（１６）。ＮＴ
Ａ部分を提示するＳＡＭの使用を通じた金属イオンの検出もまた報告された（１
７）。
【００１０】 Ｘ線結晶解析（１８）および電子顕微鏡による研究のための単分子相に対する
ストレプタビジンの結合のためのＩＤＡ−Ｃｕ2+部分を提示する単分子相の使用
が報告された（１９）。
【００１１】 ＮＴＡ基を有する脂質の使用を通じた、金属感受性脂質フィルムの調製は、１
９９４年に報告された（２０）。
【００１２】 １９９６年に、エキシマー蛍光によるHisリッチタンパク質の検出のための二
重分子相表面に提示されたピレン部分とＩＤＡ−Ｃｕ2+部分を有する脂質を含む
二重分子膜の使用が報告された（２１）。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
上述の報告において使用された材料に関する数多くの欠点が存在する。第一に
、三成分錯体の安定性、すなわち金属キレート、金属およびタンパク質の間の相
互作用は、しばしば非常に弱いため、タンパク質が観察および研究のために十分
に長い期間で固定化できない。第二に、使用される金属キレートは、他の非タグ
化タンパク質と非特異的な態様で相互作用する。さらに上記三成分錯体は、特定
のアッセイ系において未知ではない濃度での特定の妨害物の存在下で機能できな
くなる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、文献においてすでに開示された化合物に対して、改良された特徴
を有する化合物を開発した。これらの化合物は、共有結合した複数の金属キレー
ト基を有する。上記化合物は、物質および表面にタンパク質を結合するために使
用できる。
【００１５】 従って本発明は、以下の一般式Ｉを有する化合物を提供する： Ｙ−（Ｚ）n 式Ｉ 式中、Ｙは分枝部分であり、Ｚは金属イオンを配位する多座配位子キレート剤を
表し；ｎは少なくとも２、好ましくは２から９の整数である。
【００１６】 Ｚは、Ｃｏ2+，Ｎｉ2+，Ｃｕ2+，Ｚｎ2+のような金属イオンを配位する多座配
位子であってもよい。Ｚの電子供与原子は、σ−電子供与原子またはπ−電子供
与原子であってもよい。電子供与原子は、Ｎ，Ｏ，Ｓ，ＰおよびＳｉから選択さ
れてもよい。好ましくは電子供与原子はＮである。Ｚは、二座性、三座性（例え
ばＩＤＡ）または四座性（例えばＮＴＡ）であってもよい。好ましくはＺは、環
式または多環式以外である。好ましくはＺは、ＮＴＡのような四座配位子である
。
【００１７】 好ましくはＹは、Ｚに対して、直接、または任意の結合基を通じて間接に、共
有結合のための少なくとも３つの部分を提供する。分枝基Ｙの骨格は、化合物、
オリゴマー、またはポリマーの残基でもよい。より好ましくは結合基は、直鎖状
骨格を有する。
【００１８】 さらなる特徴点として、本発明は、以下の式ＩＩの化合物を提供する： Ｘ−Ｙ−（Ｚ）n 式ＩＩ 式中、Ｙ，Ｚおよびｎは上述の通りであり、Ｘはスペーサー部分である。
【００１９】 Ｘは親水性、疎水性でもよく、親水性および疎水性領域の両者を有してもよい
。Ｘは、任意に一つ以上のヘテロ原子（例えばＯ，Ｎ，Ｓまたは二つ以上のこれ
らの組み合わせ）を含む、置換化または非置換化アルキル、例えばオリゴエチレ
ングリコール、または他のオリゴアルキレングリコール、アミノ酸配列、ポリペ
プチド、またはポリ若しくはオリゴアミド（例えばアミノカプロイルオリゴマー
）であってもよく、またはそれらを含んでもよい。Ｘは脂質であってもよく、ま
たは脂質を含んでもよい。脂質は、膜貫通脂質（ＭＳＬ）であってもよい。好ま
しい態様として、Ｘは、例えばポリアルキレンオリゴマーといった親水性領域を
含み、且つ例えば脂質といった疎水性領域を含み、この場合Ｘは任意にスペーサ
ーを介して疎水性領域を介してＹに結合する。
【００２０】 さらなる特徴点として、本発明は以下の式ＩＩＩの化合物を提供する： Ｗ−Ｘ−Ｙ−（Ｚ）n 式ＩＩＩ 式中、Ｘ，Ｙ，Ｚおよびｎは上述の通りであり、Ｗは他の分子に対する結合、表
面に対する結合、または膜内への埋め込みを可能にする基である。
【００２１】 好ましい実施態様として、Ｗは、セファロースのようなポリマーを含む他の分
子に対する結合を可能にする基（アミン官能基、カルボン酸官能基、アルコール
官能基、ハライド官能基）、または表面に対する結合を可能にする基（金若しく
は他の合金表面に対する結合のためのチオールまたはジスルフィド、またはオキ
シド表面に対する結合のためのシラン誘導体のような）、または膜内への挿入を
可能にする基（脂質基、またはグラミシジンのような膜可溶性タンパク質のよう
な）である。Ｗはまた、ストレプタビジンに対するビオチンのような非共有結合
を可能にする基であってもよい。
【００２２】 好ましくはＹは、Ｚの共有結合のための複数の部分と、Ｘの共有結合のための
単一の部分を提供する分枝部分である。Ｙの非制限的な説明の例は、以下のもの
を含む： ＴＲＩＳ、ビス−ホモトリスのようなアミノ−ポリオール、 3,5-ジアミノ安息香酸、5-アミノイソフタル酸、
【化２】 のようなアミノ酸、 例えば
【化３】 といった、複数の遊離酸および／またはアミン部分を有数ペプチド。
【００２３】 別の実施態様として、Ｙは、ＺおよびＸの共有結合のための複数の部分が存在
する分枝基である。Ｙの非制限的な説明の例は、以下のものを含む： スペルミジン、スペルミン、ペンタエチレンヘキサミンのようなポリアミン、 酒石酸、トリメシン酸、クエン酸、ケンプストリ酸のようなポリ酸、 糖のようなポリヒドロキシル化物質、 商業的に入手可能な"Starburst"化合物のようなデンドロン、
【化４】 複数のエポキシド部分を有する化合物、または求核原子によって容易に置換され
る基（ハライド、トシレートのような）、若しくは求核原子が容易に付加する基
（α,β-不飽和ケトンのような）を有する化合物、またはそれらの組み合わせ。
【００２４】 特にそれらは、表面にタンパク質および他の生物学的マクロ分子の結合のため
に有用である。このことは、多数の検出装置およびアッセイに必要であると理解
されよう。
【００２５】 本発明の化合物は、特にバイオセンサーにおける応用が見出されるであろうと
解される。バイオセンサーは、当該技術分野で周知であり、PCT/AU93/00620、PC
T/AU96/00482、PCT/AU95/00763、PCT/AU96/00368、PCT/AU97/00071、PCT/AU98/0
0423、PCT/AU98/00424、PCT/AU97/00294、PCT/AU93/00509、PCT/AU96/00304、PC
T/AU89/00352、PCT/AU97/00014、PCT/AU92/00132、PCT/AU97/00316、PCT/AU90/0
0025、PCT/AU98/00417、PCT/AU96/00369、およびPCT/AU94/00202に記載されてお
り、これらの開示は参考として取り込まれる。
【００２６】 これらのバイオセンサーにおいて、イオノフォアおよびレセプターを含む膜が
提供される。レセプターに対する分析物の結合は、膜の伝導性若しくはインピー
ダンスの検出可能な変化を引き起こす。これらのバイオセンサーは、特定の分析
物の存在の感度のよい検出を提供する。
【００２７】 典型的に、興味ある分析物に対して向けられたレセプターは、イオノフォアに
結合されて膜に結合される。しばしば上記レセプターは、抗体、若しくはＦａｂ
’といったその抗原結合断片のようなタンパク質である。本発明の結合化合物は
、イオノフォアおよびバイオセンサーの膜に対する上記レセプターの結合におい
て有用であると解される。
【００２８】 従って、好ましい実施態様として、本発明は以下のものよりなる。
【００２９】 この明細書を通じて、用語「含む」または「含む」若しくは「含んでいる」と
いった変異形は、述べられている要素、数字若しくは工程、または要素、数字若
しくは工程の群を含むものとして企図されるように解され、いずれかの他の要素
、数字若しくは工程、または要素、数字若しくは工程の群を排除するものとは解
されない。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明の性質をより明白に理解するために、本発明の好ましい形態が、以下の
実施例を参考としてここで記載されるであろう。
【００３１】 要約 triNTAに対する6HIS.CD40の結合は、NTAに対するものより１２倍高いアフィニ
ティーを有する。これは主に、速度（ｋa）について１０倍高い結果であろう。
しかしながら、金チップに対するtriNTAと比較して（絶対的な結合レベルを比較
して）、BIAcore NTAチップに対するNTA分子のより高い密度のため、NTA結合に
ついての解離速度（ｋd）は、誇張されているようである。
【００３２】 数多くの変形および／または修正が、広く記載される本発明の精神または範囲
から離れることなく、特異的な実施態様において示された本発明に対してなすこ
とができるであろうことは、当業者に予測されるであろう。それ故、この実施態
様は、全ての面で説明のためのものとして考慮され、制限的なものとしては考慮
されない。
【００３３】
【実施例】
１．一般的方法 N6-カルボベンジルオキシ-L-リジン、2-トリメチルシリルエタノール、1-(3-
ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドハイドロクロリド(EDC)、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N-ヒドロキシスクシンアミド(NHS)および
6-アミノカプロン酸(X)を、Sigma-Aldrich chemical社から入手した。XBoc NHS
エステル（それ自体は標準的な条件の下でBocONでXのアミノ基を保護し、その後
DCCを使用してNHSとカップリングすることによって得た）をXと反応させること
によって、XXBocを調製した。ジクロロメタンを、使用の直前にP2O5で希釈した
。
【００３４】 ２．Z-LysNTAの合成
【化５】 Z-LysNTAを、Schmitt等1の方法に従って合成した。
【００３５】 ブロモ酢酸(4.17g, 30.0mmol)を、水性NaOH(1.5M, 15ml)中に溶解し、０℃に
冷却した。水性NaOH(1.5M, 25ml)中のNε-Z-(L)-リジンを、２時間かけて反応混
合物に滴定して加えた。上記溶液を室温に温め、室温で一晩攪拌した。反応混合
物を２時間５０℃で加熱し、ついで室温に冷却した。HCl(1M, 40ml)の水溶液を
反応混合物に滴定して加え、生成した白色沈殿を濾過し、HCl(0.1M, 20ml)で洗
浄し、水(2×20ml)で希釈した。生成した白色の固体を、数日間高真空下で乾燥
し、白色の固体としてZ-LysNTAを得た(2.68g, 95%収率)。
【００３６】
【００３７】 ３．ZLysNTA.TMSE3の合成 ZLysNTA.TMSE3を、Gao等2によって記載された方法を使用して合成した。
【化６】
【００３８】 ０℃で新たに希釈した乾燥ジクロロメタン(60ml)中のZ-LysNTA(0.05g, 1.25mm
ol)、2-トリメチルシリルエタノール(1.50g, 12.5mmol)および4-ジメチルアミノ
ピリジン(0.50g, 4.15mmol)の溶液に対し、EDC(1.25g, 12.5mmol)を加えた。反
応物を０℃で１時間攪拌し、ついで室温に温め、室温で一晩攪拌した。蒸留水(5
0ml)を反応混合物に加え、有機相を分離した。水相をジクロロメタン(2×50ml)
で抽出し、有機抽出物を組み合わせ、無水炭酸ナトリウムで乾燥した。混合物を
濾過し、全ての揮発物を減圧下で除去して、無色の油を得た。ジクロロメタンか
らジクロロメタン中の５％メタノールまでの溶媒勾配を使用した、フラッシュシ
リカでのカラムクロマトグラフィーによる精製によって、無色の油としてZLysNT
A.TMSE3を得た(0.75g, 86%)
【００３９】
【００４０】 ４．LysNTA.TMSE3の合成
【化７】
【００４１】 ZLysNTA.TMSE3(0.167, 0.24mmol)をメタノール(5ml)中に溶解し、10% Pd/Cの
スパチュラチップを加え、反応容器をH2ガスを含むバルーンでフィットした。反
応混合物を室温で７５分攪拌し、ついで濾過して、全ての揮発物を減圧下で除去
した。1H NMRによる分析により、完全な水素化が生じたことが示され、無色の油
としてLysNTA.TMSE3を得た(0.127g, 定量的収率)。
【００４２】
【００４３】 ５．ZtriNTA.TMSE9の合成
【化８】 ZLysNTA(60mg, 0.15mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(60mg, 0.51mmol)およ
びLysNTA.TMSE3(0.37g, 0.66mmol)を、ジクロロメタン(50ml)中に溶解し、反応
混合物を０℃に冷却した。EDC(0.15g, 0.75mmol)を加え、反応物を０℃で１時間
攪拌し、ついで室温に温め、室温で一晩攪拌した。蒸留水(40ml)を反応混合物に
加え、有機相を分離した。水相をジクロロメタン(2×40ml)で抽出し、有機抽出
物を組み合わせ、無水炭酸ナトリウムで乾燥した。混合物を濾過し、全ての揮発
物を減圧下で除去して、無色の油を得た。１００％ジクロロメタンからジクロロ
メタン中の５％メタノールまでの溶媒勾配を使用した、フラッシュシリカでのカ
ラムクロマトグラフィーによる精製によって、無色の油としてZtriNTA.TMSE9を
得た(0.235g, 76%)。
【００４４】
【００４５】 ６．ZtriNTAの合成
【化９】
【００４６】 ZtriNTA.TMSE9を得た(0.12g, 0.06mmol)を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸(3
ml)を加えた。反応混合物を０℃で３時間攪拌し、その後全ての揮発物を減圧下
で除去した。反応混合物を、100%H2O/0.05%TFAからH2O/0.05%TFA中の50%アセト
ニトリル/0.05%TFAまでの溶媒勾配を使用して、４０分間逆相HPLCによって精製
した。２１分での溶出時間を有する、HPLCクロマトグラム中の主要ピークを集積
して、白色の固体として精製ZtriNTAを得た(20mg, 30%収率)。
【００４７】
【００４８】 ７．triNTA.TMSE9の合成
【化１０】 ZtriNTA.TMSE9(38mg, 0.0187mmol)をメタノール(10ml)中に溶解し、触媒量の
木炭上のパラジウム(10%)を加えた。混合物を真空下で水素で処理し、２時間水
素ガス環境で攪拌した。反応混合物を濾過し、濾過物を蒸発して、triNTA.TMSE9 (34mg, 96%)の透明な油を得た。
【００４９】
【００５０】 ８．triNTA.TMSE9ヘミスクシンアミドの合成
【化１１】 ジクロロメタン中のtriNTA.TMSE9(0.5g)、ベンジルヘミスクシナート(71mg)、
DMAP(64mg)の溶液を、０℃で攪拌した。EDC(101mg)を反応混合物に加え、室温で
１６時間攪拌を継続した。溶媒を減圧下で除去し、CH2Cl2-MeOH(96:4)を使用し
て残余物をクロマトグラフィーにかけ、537mgのベンジルエステル中間体を分離
した。500mgのこの物質を、メタノール(60ml)中に溶解し、触媒として10% Pd/C(
60mg)を使用して４時間大気圧下で水素化した。精製産物を、474mgで得た。
【００５１】
【００５２】 ９．triNTAの合成
【化１２】 triNTA.TMSE9(34mg, 0.0179mmol)をトルエンで摩砕し、蒸発させ、高真空下で
乾燥した。トリフルオロ酢酸(1ml)を加え、窒素環境下の０−５℃で２時間攪拌
し、ついで室温で一晩攪拌した。トリフルオロ酢酸を蒸発し、残余物をトルエン
で再び摩砕し、蒸発させて乾燥し、triNTA(20mg, 100%)を得た。
【００５３】
【００５４】 １０．グラミシジンスクシナートの調製 グラミシジン(75mg, 0.0398mmol)をピリジン(0.5ml)中に溶解し、コハク酸無
水物(20mg, 0.200mmol)を加えた。混合物を窒素環境下で５０℃で２０時間攪拌
し、蒸発させた。粗産物をメタノール中でセファデックスLH-20カラムを通過さ
せ、溶出物を蒸発させ、ジクロロメタン／メタノール／水／酢酸(400:50:4:1)を
使用するフラッシュシリカカラムで精製した。水で遠心分離することによって、
産物をさらに精製した。水をデキャントし、産物を高真空下で乾燥し、グラミシ
ジンスクシナート(53mg, 67%)を得た。
【００５５】
【００５６】 １１．グラミシジンスクシナートNHSエステルの調製 グラミシジンスクシナート(21mg, 0.0105mmol)、N-ヒドロキシスクシンアミド
(12mg, 0.1042mmol)および4-ジメチルアミノピリジン(2.5mg, 0.0204mmol)を、
蒸留テトラヒドロフラン(10ml)と組み合わせた。窒素下で攪拌しながら、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド(22mg, 0.1066mmol)を加えた。混合物を１時間還流し
て加熱した。混合物を蒸発させ、メタノール中でセファデックスLH-20カラムを
通過させた。適切な分画を蒸発させ、乾燥して、グラミシジンスクシナートNHS(
22mg, 100%)を得た。
【００５７】
【００５８】 １２．グラミシジンスクシナートtriNTAの調製
【化１３】 リジンtriNTA(20mg, 0.0201mmol)をメタノール(1ml)中に溶解し、トリエチル
アミン（２滴）を加えて中和した。ついでグラミシジンスクシナートNHS(15mg,
0.0072mmol)をメタノール(2ml)中に加えた。反応混合物を５０℃で２４時間加熱
し、ついでメタノール中でセファデックスLH-20カラムで精製した。グラミシジ
ンスクシナートリジンtriNTA(14mg, 65%)を得た。
【００５９】
【００６０】 １３．gAリジン-XXBOCの調製
【化１４】 グラミシジンリジン(15mg, 0.0076ml)をメタノール(2ml)中に溶解し、一当量
のトリエチルアミンを加え、これをXXBOCのN-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル(10mg, 0.0226mmol)（乾燥ジクロロメタン中の１当量のDCCとNHSと１当量のDM
APで、XXBOCを反応させることによって調製した）と反応させた。反応混合物を
、室温で１８時間攪拌した。混合物を蒸発し、メタノール中でセファデックスLX
-20カラムを通過させた。適切な分画を含む溶出物を蒸発させ、ジクロロメタン
／メタノール／水／酢酸(400:40:4:1)を使用してフラッシュシリカカラムで精製
して、gAリジン2XBOC(12mg, 68%)を得た。
【００６１】
【００６２】 １４．gAリジンXXBOCヘミスクシナートの調製
【化１５】 グラミシジンリジン2XBOC(12mg, 0.0052mmol)をトルエンで摩砕し、蒸発させ
、高真空下で乾燥した。トリフルオロ酢酸(1ml)を加え、窒素下で蒸発させ、乾
燥させた。再びトルエンを加え、蒸発させ、高真空下で乾燥させた。粗アミンを
ピリジン(0.5ml)中に溶解し、コハク酸無水物(2.6mg, 0.0259mmol)と反応させた
。反応混合物を、室温で２０時間攪拌した。ピリジンを高真空下で除去し、残余
物をメタノール中でセファデックスLH-20カラムを通過させた。メタノールで溶
出したフラッシュシリカカラムで産物をさらに精製し、gAリジン2Xスクシナート
(10mg, 83%)を得た。
【００６３】
【００６４】 １５．gAリジン2XtriNTAの合成
【化１６】 グラミシジンリジン2Xスクシナート(8.5mg, 0.037mmol)、N-ヒドロキシスクシ
ンアミド(4.2mg, 0.0364mmol)および4-ジメチルアミノピリジン(1mg, 0.0081mmo
l)を、蒸留テトラヒドロフラン(5ml)中で攪拌し、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド(7.5mg, 0.0363mmol)を加えた。混合物を窒素下で１時間還流した。混合物
を蒸発させ、メタノール中でセファデックスLH-20カラムで精製した。適切な分
画を蒸発させ、リジンtriNTA(8.5mg, 0.0085mmol)に加えた。混合物を室温で１
８時間攪拌した。反応混合物を蒸発させ、メタノール中でセファデックスLH-20
カラムで精製した(2X)。グラミシジンリジン2XtriNTA(2.6mg, 19%)を得た（低溶
解性のため、いくらかの化合物を失った）。
【００６５】
【００６６】 １６．triNTA.TMSE9の合成
【化１７】 ZtriNTA.TMSE9(0.1g, 50umol)の溶液をメタノール(10ml)中に溶解した。木炭
上のパラジウム(10%)を加え(約10mg)、水素ガスを含むバルーンでフィットした
。反応混合物を室温で９０分攪拌し、その後TLC分析により、開始物質の完全な
消失が示された。反応混合物をセリットの短いプラグを通じて濾過し、全ての揮
発物を減圧下で反応混合物から除去し、無色の油としてtriNTA.TMSE9を得た(0.0
9g, 定量的)。
【００６７】
【００６８】 １７．ビオチンtriNTA.TMSE9の合成
【化１８】 ビオチン(20mg, 0.08mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(12mg, 0.1mmol)およ
びtriNTA.TMSE9(0.10g, 0.1mmol)を、乾燥した新たに蒸留されたジクロロメタン
に加え、反応混合物を０℃に冷却した。EDC(40mg, 0.2mmol)を加え、反応物を０
℃で１時間攪拌し、室温で温め、室温で３時間攪拌した。全ての揮発物を減圧下
で反応混合物から除去し、溶剤としてMeOHを使用してセファデックスLH20カラム
を使用して混合物を精製した。5%メタノール/ジクロロメタン中でRf=0.1を有す
るスポットを含む分画を組み合わせた。ビオチンtriNTA.TMSE9が無色の油として
得られた(73mg, 0.03mmol, 34%)。
【００６９】
【００７０】 １８．ビオチンtriNTAの合成
【化１９】 トリフルオロ酢酸(2ml)を、０℃でビオチンtriNTA.TMSE9(19mg, 9umol)に加え
た。反応混合物を０℃で３時間攪拌し、その後全ての揮発物を減圧下で除去した
。100%溶媒Ａから溶媒Ａ中に50%溶媒Ｂ（溶媒Ａ：H2O/0.05%TFA；溶媒Ｂ：アセ
トニトリル/0.05%TFA）までの勾配を使用して４０分でVydac C18カラムでの逆送
HPLCによる反応混合物の分析により、Rt=24.1分での溶出時間で一つの主となる
ピークが示された。予備的逆相HPLCによる反応混合物の分離により、白色の固体
としてビオチンtriNTAが得られた(1.0mg, 0.8umol, 9%)。
【００７１】
【００７２】 １９．脂質-triNTAの合成
【化２０】 CH2Cl2中のジテトラデシルアミン(100mg)の溶液を、室温でCH2Cl2(5ml)中のコ
ハク酸無水物(120mg)とトリエチルアミン(40mg)の溶液に加えた。反応物を一晩
攪拌し、溶媒を真空下で除去し、CH2Cl2-MeOH(95:5〜85:5)を使用した残余物の
クロマトグラフィーにより、60mgのジテトラデシルアミンヘミスクシンアミドを
得た。この物質をCH2Cl2(10ml)中のtriNTA.TMSE9の溶液に加え、次にDMAP(14mg)
を加えた。反応混合物を０℃に冷却し、EDC(22mg)を加え、混合物を室温で３日
間攪拌した。ついで溶媒を除去し、メタノールで溶出するセファデックスLH-20
を通じて残余物を精製し、97mgの精製物質を得た。10mgのこの物質をTFA(1mg)に
溶解し、窒素下で３時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、固体残余物を水(1ml
)で洗浄し、真空下で乾燥した。物質を予備的HPLC(C18 Alltimaカラム, CH3CN中
に1% TFA)によって精製し、所望の産物(4mg)を分離した。
【００７３】
【００７４】 ２０．膜貫通脂質ホスファチルコリン(MSL-PC)の合成
【化２１】 MSL-OH3(865mg, 0.44mmol)を、キノリン(0.12mL, 2.2当量, 硫酸ナトリウムで
乾燥し、ついで使用前に亜鉛パウダーで蒸留した)を含むクロロホルム(6mL)中に
溶解した。これを室温で新たに蒸留したPOCl3(0.09mL, 2.2当量)に加えた。混合
物を４５℃で３０分攪拌した。冷却後、乾燥ピリジン(1mL)中に溶解したコリン
トシラート(363mg, 1.3mmol)を加え、反応混合物を室温で一晩攪拌した。水(0.5
mL)を加え、混合物をさらに１時間攪拌した。反応混合物をクロロホルム(50mL)
と加え、ついで40mLの部分の水(X2)、3%炭酸カリウム(X2)、水(X2)、5%HCl(X2)
および水(X2)で連続的に洗浄した。（注意：連続的な洗浄のそれぞれでのエマル
ション形成のため、相分離は非常に遅かった。方法を改良するため、メタノール
の添加が必要であった。）有機相を組み合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶
媒を減圧下で除去し、残余物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精
製した[溶剤；ジクロロメタン：アセトン：メタノール：水酸化アンモニウム(8:
5:5:3)]。122mgの無色のワックス状物質が得られた。
【００７５】
【００７６】 ２１．ビス(N-メチル)-C38ジアミンの合成
【化２２】 ０℃に冷却したTHF(10ml)中のボラ-アンフィフィリンC38-ジオール3(300mg)に
対して、トリエチルアミン(92ul)とメタンスルホニルクロリド(51ul)を加えた。
溶液を室温で一晩攪拌し、エーテル(30ml)で希釈した。有機相を飽和NaHCO3(2X3
0mL)と水(2X60ml)で洗浄し、乾燥して(Na2SO4)、真空下で濃縮した。得られた物
質(315mg)を圧力チューブに加え、−８０℃に冷却し、冷却したメチルアミン(12
ml)を加えた。圧力チューブを密封し、混合物を室温に温めた。室温で一晩放置
した後、過剰なメチルアミンを蒸発し、残余物をCH2Cl2に溶解し、K2CO3で攪拌
した。固体を濾過によって取り出し、濾過物を真空下で乾燥した。残余物をCH2C
l2-MeOH-NH3(96:4:0.1〜92:8:0.1)を使用してクロマトグラフィーにかけ、242mg
の純粋な産物を分離した。
【００７７】
【００７８】 ２２．XXFmocの合成
【化２３】 2X-Bocを窒素環境下で２０分TFA(5mL)で処理した。TFAを減圧下で除去し、高
真空下で乾燥した。ついでこの残余物を9%水性炭酸ナトリウム溶液(6mL)中に溶
解し、溶液を０℃に冷却した。DMF(3mL)中に溶解したFmoc-NMSエステル(CALBIOC
HEMから購入した)(420mg)を０℃で上述の攪拌溶液に加え、室温で３０分攪拌し
た。水(100mL)を加え、水溶液を酢酸エチル(2X50mL)で抽出し、有機抽出物を廃
棄した。水相を濃縮塩酸(2-3mL)で酸性化し、氷冷バスで冷却して、沈殿が出現
した。この沈殿を濾過し、乾燥して白色の粉体を得た(210mg)。
【００７９】
【００８０】 ２３．C38(NCH3)2モノBOCの合成
【化２４】 C38ジアミン(320mg)、BOC-ON(63mg)、トリエチルアミン(37mg)、THF(3mL)およ
び水(2mL)の懸濁液を、室温で一晩攪拌した。反応混合物を水(50mL)で希釈し、
ジクロロメタン(2X80mL)で抽出した。組み合わせた有機抽出物を塩水(50mL)で洗
浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。粗物質をクロマト
グラフィーにより精製した（ジクロロメタン中に5-7%メタノール）。粘性の液体
として精製物質を得た(150mg)。
【００８１】
【００８２】 ２４．Boc-C38-2X-Fmocの合成
【化２５】 2X-Fmoc(47mg)、DCC(35mg)、DMAP(3mg)、C38-モノBoc(150mg)およびDCM(10mL)
の混合物を、室温で２４時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗物質をカラム
クロマトグラフィー（ジクロロメタン中に5%メタノール）により精製して、純粋
な産物を得た(200mg)。
【００８３】
【００８４】 ２５．MSL-tri-NTAの合成
【化２６】 Fmoc保護物質(200mg)を、ピペリジン：DMF(20:80)の溶液に溶解し、室温で１
０分攪拌した。DMFを減圧下で除去し、粗物質をカラムクロマトグラフィーによ
り精製した（メタノール：水性アンモニア：DCm 10:2:88）。純粋な産物を無色
の半固体として単離した(148mg)。
【００８５】 このC38-誘導体(210mg)、triNTA誘導体(135mg)、DCC(33mg)およびDMAP(3mg)の
一部を、乾燥ジクロロメタン(3mL)中に溶解し、室温で１８時間放置した。溶媒
を減圧下で除去し、粗物質をカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の粘
性液として純粋な物質を得た(179mg)。
【００８６】 BocとTMSF保護物質(100mg)をTFA(2mL)に溶解し、室温で４時間攪拌した。TFA
を減圧下で除去し、サンプルを高真空下で乾燥した。以下に示されるジスルフィ
ドの合成は、いずれかの文献で報告されている4。
【化２７】
【００８７】 この物質のＮＨＳエステルを、CH2Cl2(3ml)中のDCC(15mg)およびDMAP(2.6mg)
の存在下でNHS(8mg)と酸(50mg)の４時間の反応によって調製し、メタノールで溶
出するセファデックスLH-20カラムを通じて精製した。
【００８８】 この活性エステルを、上記調製された十分に保護されたC38ジアミン-triNTA物
質(100mg)とメタノール中で反応させた。室温で１６時間の攪拌の後、溶媒を除
去し、粗物質をメタノールで溶出するセファデックスLH-20カラムを通じて部分
的に精製した。得られた物質を、予備的HPLC(C18 Alltimaカラム, 0.05%でのTFA
でのMeOH-CH2Cl2)によってさらに精製した。
【００８９】 ２６ ．triNTAに結合する6His-タグ化タンパク質の速度論分析 結合の表面プラスモン分析(SPR)を、BIAcore法を使用して実施した。商業的に
入手可能なJ1チップ(BIAcore, Uppsala, Sweden)を、脂質層のコーティングによ
り修飾した。ラミナーフローフードにおいて、BIAcore JIチップを露出させ、金
表面にさらした。エタノール中の1.2uM MSLtriNTA、24uM MSLPCを含む溶液(100u
L)を、金に直接浸液した。１時間のインキュベーションの間、エタノールを１０
−１５分ごとに加え、エタノールの完全な蒸発を防いだ。ついで金表面を表面を
横切るように10X100uLをピペッティングすることによってエタノールで洗浄し、
ラミナーフロフードにおいて風乾した。ついでチップを再びしまい、プラスチッ
クフィルム（パラフィン）で密封した。
【００９０】 このJ1.triNTAチップをBIAcore2000器械内に納め、ポンプを稼働し、２１℃で
40ul/分の流速で、HBS/EDTAランニングバッファー(50mM HEPES, 300mM NaCl, 50
uM EDTA, pH8.0)を使用して実験を実施した。フローセル２(Fc2)を、コントロー
ルフローセル１(Fc1)に対して試験セルとして使用した。ついで500uM NiCl2を含
むランニングバッファーをFc2のみを通じて注入し、ついでFc2を５分間ランニン
グバッファーで洗浄した。ついで、興味あるタンパク質(100-600nM)を、３−７
分間Fc1およびFc2を通じて注入し（KINJECT機能を使用して）、引き続き７−１
５分間解離フェーズを実施した。ついで表面をNiCl2を除く350mM EDTAを含むラ
ンニングバッファーを使用して再生し、triNTA分子から6His-タグ化タンパク質
を放出させた。工程２−４を、示された濃度の範囲で各タンパク質について繰り
返した（図１，２）。使用したネガティブコントロールは、6Hisタグが存在しな
い同一のタンパク質であった。その結果は、triNTAが高アフィニティーで6His-
タグ化タンパク質を結合することを示した（図１，２）；6His.Rubiscoおよび6H
is.CD40は、それぞれ300pMおよび2.9nMの平衡定数でtriNTAに結合した。これら
のタンパク質は、Ni2+の不存在下ではtriNTAを結合せず、6Hisタグを含まないタ
ンパク質もまた、triNTAを結合しなかった。
【００９１】
【参考文献】
【００９２】 数多くの変形および／または修正が、広く記載された本発明の精神または範囲
から離れることなく、特異的な実施態様において示された本発明になすことがで
きることは、当業者に予測されるであろう。それ故本実施態様は、全ての観点で
説明的なものとして考慮され、制限的なものとは考慮されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、J1.triNTAチップに対する6His.Rubiscoの結合を示す
図である。１００，２００および４００ｎＭの結合曲線が示されている（下から
上へ）。結合曲線は、Ｆｃ１から差し引かれたＦｃ２（コントロール、−Ｎｉ2+ ）から由来する反応である。
【図２】 図２は、J1.triNTAチップに対する6His.CD40の結合を示す図で
ある。１００，２００，４００，６００および８００ｎＭの結合曲線が示されて
いる（下から上へ）。結合曲線は、Ｆｃ１から差し引かれたＦｃ２（コントロー
ル、−Ｎｉ2+）から由来する反応である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年５月８日（２００１．５．８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 糖、デンドロン、およびα,β-不飽和ケトンより成る群から選択される、請求項
１９記載の化合物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｆ 7/10 Ｃ０７Ｆ 7/10 Ｃ ４Ｈ０４９ Ｄ ４Ｈ０５０ Ｌ Ｖ 9/10 9/10 Ｂ Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 14/32 14/32 Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｚ // Ｃ０７Ｂ 61/00 ３００ Ｃ０７Ｂ 61/00 ３００ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ピン・ウィン オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2096・クイーンズクリフ・クラウ ン・ロード・59・ユニット・７ (72)発明者 クリストファー・ジョン・バーンズ オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2026・ボンディ・ミデルトン・アヴ ェニュ・20 (72)発明者 マシュー・ピーター・ウィルキンソン オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2121・エッピング・カーリンゴー ド・ロード・31・ユニット・６ Ｆターム(参考） 4B029 AA07 BB15 BB17 CC03 CC11 4B063 QA01 QQ20 QQ91 QR48 QR51 QS32 QS36 QS39 QX04 4H006 AA01 AA03 AB91 BS10 BU32 RA06 TA04 4H039 CA71 CE40 4H045 AA10 BA13 BA50 BA51 BA52 CA11 EA50 FA30 4H049 VN01 VP03 VP09 VQ35 VQ37 VQ38 VU31 VW01 4H050 AA01 AA03 AB80 AB99

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の一般式Ｉ： Ｙ−（Ｚ）n Ｉ [式中、Ｙは分枝部分であり、Ｚは金属イオンを配位する多座配位子キレート剤
    を表し；ｎは少なくとも２の整数である] を有する化合物。
  2. 【請求項２】 ｎが２から９の整数である、請求項１記載の化合物。
  3. 【請求項３】 ｎが少なくとも３である、請求項２記載の化合物。
  4. 【請求項４】 ｎが４である、請求項１から３のいずれか一項記載の化合物
    。
  5. 【請求項５】 Ｚの電子供与原子がＮである、請求項１から４のいずれか一
    項記載の化合物。
  6. 【請求項６】 Ｚが四座配位子である、請求項５記載の化合物。
  7. 【請求項７】 ＺがＮＴＡ残基である、請求項７記載の化合物。
  8. 【請求項８】 Ｙが少なくとも３つの部分を提供し、各部分が、Ｚに対して
    、直接、または任意の結合基を通じて間接に、共有結合している、請求項１から
    ７のいずれか一項記載の化合物。
  9. 【請求項９】 Ｙが、オリゴマーまたはポリマーから形成された骨格を有す
    る、請求項１から８のいずれか一項記載の化合物。
  10. 【請求項１０】 上記骨格が直鎖状である、請求項９記載の化合物。
  11. 【請求項１１】 Ｙが、アミノ−ポリオール、アミノ酸、アミノポリカルボ
    ン酸、ポリアミン、ポリ酸、およびポリヒドロキシル化化合物より成る群から選
    択される、請求項１から８のいずれか一項記載の化合物。
  12. 【請求項１２】 Ｚが、ペプチドおよびデンドロンより成る群から選択され
    る、請求項９記載の化合物
  13. 【請求項１３】 以下の式ＩＩ： Ｘ−Ｙ−（Ｚ）n ＩＩ [式中、Ｙ，Ｚおよびｎは上述の通りであり、Ｘはスペーサー部分である] を有する、請求項１から１２のいずれか一項記載の化合物。
  14. 【請求項１４】 Ｘが、親水性、疎水性であり、または親水性および疎水性
    領域の両者を有する、請求項１３記載の化合物。
  15. 【請求項１５】 Ｘが、任意に一つ以上のヘテロ原子を含む、置換化または
    非置換化アルキル、オリゴアルキレンオキシド、アミノ酸配列、ポリペプチド、
    オリゴアミド、ポリアミド、および脂質より成る群から選択される部分である、
    または上記部分を含む、請求項１４記載の化合物。
  16. 【請求項１６】 Ｘが、オリゴエチレングリコール、アミノカプロイルオリ
    ゴマー、および膜貫通脂質(MSL)より成る群から選択される、請求項１５記載の
    化合物。
  17. 【請求項１７】 Ｘが、親水性領域、疎水性領域を含む、請求項１３から１
    ６のいずれか一項記載の化合物。
  18. 【請求項１８】 Ｙが、Ｚの共有結合のための複数の部分、およびＸに対す
    る共有結合のための単一の部分を提供する分枝部分である、請求項１３から１７
    のいずれか一項記載の化合物。
  19. 【請求項１９】 Ｙが、アミノポリオール、アミノ酸、複数の遊離酸および
    ／またはアミン部分を有するペプチド、ポリヒドロキシル化物質、および求核原
    子によって容易に置換される基若しくは求核原子が容易に付加する基を有する化
    合物、またはそれらの組み合わせより成る群から選択される、請求項１８記載の
    化合物。
  20. 【請求項２０】 Ｙが、ＴＲＩＳ、ビス−ホモトリス、3,5-ジアミノ安息香
    酸、5-アミノイソフタル酸、 【化１】 糖、デンドロン、およびα,β-不飽和ケトンより成る群から選択される、請求項
    １９記載の化合物。
  21. 【請求項２１】 以下の式ＩＩＩ： Ｗ−Ｘ−Ｙ−（Ｚ）n ＩＩＩ [式中、Ｘ，Ｙ，Ｚおよびｎは上述の通りであり、Ｗは他の分子に対する結合、
    表面に対する結合、または膜内への埋め込みを可能にする基である] を有する、請求項１３から２０のいずれか一項記載の化合物。
  22. 【請求項２２】 Ｗが、アミン官能基、カルボン酸官能基、アルコール官能
    基、ハライド官能基、チオール、ジスルフィド、シラン誘導体、膜可溶性タンパ
    ク質、非共有結合を可能にする基、イオノフォア、または脂質基の一つ以上から
    選択される官能基を含む、請求項２１記載の化合物。
  23. 【請求項２３】 Ｗが、グラミシジンまたはビオチンである、請求項２２記
    載の化合物。
  24. 【請求項２４】 Ｗが膜に埋め込まれるイオノフォアである、請求項１３か
    ら２３のいずれか一項記載の式ＩＩＩの複数の結合化合物を膜が備える、自己集
    合膜を備えるバイオセンサー。
  25. 【請求項２５】 上記イオノフォアがグラミシジンである、請求項２４記載
    のバイオセンサー。
  26. 【請求項２６】 Ｗが膜に埋め込まれる両親媒性化合物である、式ＩＩＩの
    第二の複数の結合化合物を膜が備える、請求項２４または２５記載のバイオセン
    サー。
  27. 【請求項２７】 金属アフィニティークロマトグラフィーにおける、請求項
    １から２３のいずれか一項記載の化合物の使用。
  28. 【請求項２８】 請求項１から２３のいずれか一項記載の化合物を備えた、
    金属アフィニティークロマトグラフィーカラム。
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