JP2002536023A - 富化された中枢神経系の幹細胞および始原細胞の集団、ならびにこのような集団を同定、単離、および富化するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 富化された神経幹細胞および始原細胞の集団、ならびに細胞表面マーカーに結合する試薬を使用する、神経幹細胞を同定、単離、および富化するための方法が、提供される。詳細には、ニューロスフェア（ＮＳ−ＩＣ）を開始し得るヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団を産生するための方法を提供し、この方法は、神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （優先権の請求） 本発明は、１９９９年２月１２日に出願された米国特許仮出願第６０／１１９
，７２５号に対して；１９９９年１０月２１日に出願された米国特許出願第０９
／４２２，８４４号に対して；および１９９９年１２月１日に出願された米国特
許仮出願第６０／１６８，４０７号に対して、優先権を請求する。

【０００２】 （技術分野） 本発明は、一般的には、富化された神経幹細胞および始原細胞の集団、ならび
に神経幹細胞および始原細胞（詳細には、中枢神経系の神経幹細胞および始原細
胞）について同定、単離、および富化するための方法に関し、そして最も詳細に
は、ニューロスフェアを開始する細胞（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ ｉｎｉｔｉａ
ｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）（ＮＳ−ＩＣ）の富化された集団に関する。

【０００３】 （発明の背景） 幹細胞の集団は、細胞の総数の低い割合のみを構成するが、それらの体に再配
置する能力に起因してすばらしい目的である。幹細胞の寿命および幹細胞の子孫
の散布（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）は所望される特徴である。これらの方法
においては、有意な商業的な目的が存在する。なぜなら、幹細胞は多数の臨床的
な用途を有するからである。遺伝子治療のためのビヒクルとしての幹細胞の使用
においては、医学的な目的もまた存在する。

【０００４】 幹細胞および始原細胞の集団上に見出されるタンパク質および他の細胞表面マ
ーカーは、これらの集団の分離および単離のための試薬を調製することにおいて
有用である。細胞表面のマーカーもまた、これらの重要な細胞のさらなる特徴付
けにおいて有用である。

【０００５】 本明細書中で参考として援用されるＹｉｎらの米国特許第５，８４３，６３３
号は、ＡＣ１３３と呼ばれるモノクローナル抗体を記載している。この抗体は、
造血幹細胞および始原細胞上の表面マーカーの糖タンパク質に結合する。ＡＣ１
３３抗原は、１１７ｋＤａの分子量を有する５−膜貫通細胞表面抗原である。こ
の抗原の発現は、高度に組織特異的であり、そしてヒトの骨髄、胎児の骨髄およ
び肝臓、臍帯血、ならびに成体の末梢血に由来する、造血系の始原細胞のサブセ
ット上で検出されている。ＡＣ１３３抗体によって認識される細胞のサブセット
は、ＣＤ３４^brightであり、そしてＣＤ３４⁺集団中に存在するＣＦＵ−ＧＭ活
性の実質的に全てを含み、これによってＡＣ１３３を、ヒトの造血性の始原細胞
および幹細胞の単離および特徴付けのための試薬として有用にする。

【０００６】 しかし、非造血性の幹細胞および始原細胞、ならびに特に、中枢神経系の神経
幹細胞および始原細胞に特異的な表面マーカーは、同定されていない。さらに、
ＡＣ１３３抗体は、非造血性の幹細胞または始原細胞、特に、中枢神経系（ＣＮ
Ｓ）の神経幹細胞および始原細胞について、同定、単離、または富化するための
方法においては、使用されていない。ヒトの非造血性の始原細胞および幹細胞、
そして特に、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞および始原細胞を単離および特
徴付けることにおいて有用であるモノクローナル抗体のような、ツールについて
の必要性が残されている。

【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、ヒトの非造血性の始原細胞および幹細胞、そして特に、ニューロス
フェア（ＮＳ−ＩＣ）を開始し得る中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞、および
始原細胞を、同定、単離、および富化するための方法を提供する。本発明はまた
、ニューロスフェアを開始し得るＣＮＳの神経幹細胞、および始原細胞を含有し
ている富化された集団を提供する。「ニューロスフェア開始細胞（ＮＳ−ＩＣ）
」は、長期間のニューロスフェア培養を開始し得る細胞である。次に、「ニュー
ロスフェア」は、細胞の凝集物またはクラスターであり、これは、神経幹細胞お
よび初期始原細胞を含む。ニューロスフェアの同定、培養、増殖、および使用は
、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号、およびＷｅｉｓｓら、米国
特許第５，８５１，８３２号（両方とも、本明細書中で参考として援用される）
に開示されている。用語「ＮＳ−ＩＣ」は、ニューロスフェアを形成するその細
胞の能力または機能によって定義されるが、これらの細胞は、付着性の培養地に
おいて適切に増殖され得（例えば、Ｊｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号
（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、そして本明細書中に記
載されている方法および集団が、ＮＳ−ＩＣの懸濁培養物に限定されないことが
留意されるはずである。ＮＳ−ＩＣは、ネスチン⁺であり、そしてニューロン、
星状細胞、および稀突起神経膠細胞への適切な分化条件下で分化する能力を有す
る。

【０００８】 本発明の１つの実施形態に従って、非造血性の幹細胞および始原細胞（好まし
くは、ＮＳ−ＩＣを含有しているＣＮＳの神経幹細胞、および始原細胞）の富化
された集団、およびこのような細胞を同定、単離、または富化するための方法は
、少なくとも１つの幹細胞もしくはＮＳ−ＩＣ、または始原細胞を含有している
細胞の集団を、ＡＣ１３３抗体によって認識される表面マーカーの糖タンパク質
抗原（「ＡＣ１３３抗原」）に結合する試薬と接触させることによって達成され
る。好ましい実施形態においては、試薬は、ＡＣ１３３抗体である（ＡＣ１３３
抗体は、あるいは、「５Ｆ３」と本明細書中で呼ばれる）。次いで、免疫選択（
例えば、ＦＡＣＳ）のような細胞の選別のための伝統的な技術の使用によって、
試薬とＡＣ１３３抗原との間での接触が検出される細胞の、同定、単離、および
／または富化が可能になる。

【０００９】 別の実施形態においては、本発明は、本明細書中で５Ｅ１２と呼ばれる、新規
の抗体を提供する。この抗体は、非造血性の幹細胞および始原細胞（好ましくは
、ニューロスフェアを開始し得る、ＣＮＳの神経幹細胞および始原細胞）の富化
された集団を提供するために使用され得、そして少なくとも１つの幹細胞ＮＳ−
ＩＣ、または始原細胞を含有している細胞の集団をＡＣ１３３抗原以外の表面マ
ーカーの糖タンパク質抗原に結合する５Ｅ１２抗体と接触させることによってこ
のような細胞について同定、単離、または富化する方法において使用され得る。

【００１０】 好ましい実施形態においては、本発明の細胞（好ましくは、ＣＮＳの神経幹細
胞）は、ＣＤ４５およびＣＤ３４についての細胞表面マーカーを欠失していると
してさらに特徴付けられる。

【００１１】 さらなる実施形態においては、本発明は、本明細書中で８Ｇ１と呼ばれる、新
規の抗体を提供する。この抗体は、ＣＮＳの神経幹細胞の集団（８Ｇ１^-/loとし
て特徴付けられる）とＣＮＳの始原細胞の集団（８Ｇ１⁺として特徴付けられる
）との間での部分選択を可能にするＣＤ２４を認識すると考えられている。

【００１２】 （発明の詳細な説明） 細胞の集団は、成体の中枢神経系（ＣＮＳ）中に存在する。これは、成体のＣ
ＮＳの分化した成熟細胞の表現形を自己更新し、そしてそれを生じるそれらの能
力において、幹細胞の特性を示す。これらの幹細胞は、ＣＮＳを通じて見出され
、そして特に、脳室下の領域、および海馬の歯状回において見出される。

【００１３】 増殖因子応答性の幹細胞は、中枢神経軸の多くの領域から、そしてマウス、げ
っ歯類、およびヒトのＣＮＳ組織の発達の異なる段階で、単離され得る。これら
の細胞は、ＥＧＦ、塩基性のＦＧＦ（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）、および形質転換
増殖因子α（ＴＧＦα）のような増殖因子に対するそれらの応答において変化し
、そして長期間、分化していない状態で培養物中で維持され、そして拡大され得
る。成体および胚性のマウスの始原細胞の両方が、ＥＧＦに対して応答し、そし
て未分化の細胞のスフェアとして増殖した。これらの細胞は、それらが多能性で
ある点で幹細胞の特徴を示し、そして血清を含有している条件下では、ニューロ
ン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化し得、ＥＧＦの投与下では未分化
のままでありそして増殖し続ける部分集団を維持する。マウスのＥＧＦ応答性の
始原細胞は、インビトロでＥＧＦレセプターについてのｍＲＮＡを発現する。ヒ
トのＣＮＳの神経幹細胞培養物はもまた、同定された。ヒトを含む哺乳動物の神
経幹細胞培養物（懸濁培養物または付着培養物のいずれかとして）の同定、培養
、増殖、および使用は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および
Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，８５１，８３２号（両方とも、本明細書中で参考
として援用される）に開示されている。同様に、Ｊｏｈｅ、米国特許第５，７５
３，５０６号（本明細書中で参考として援用されている）は、付着ＣＮＳ神経幹
細胞培養物について言及している。懸濁物中で培養された場合には、ＣＮＳの神
経幹細胞培養物は、代表的には、ニューロスフェアを形成する。

【００１４】 図１は、ＮＳ−ＩＣがニューロスフェアに発達し、そして続いてニューロンお
よびグリアの表現形への分化、ならびにＮＳ−ＩＣの子孫の生成に発達するよう
な、ＮＳ−ＩＣの増殖を示す。１つ以上の増殖を誘導する増殖因子の存在下では
、ＮＳ−ＩＣは分裂し、そしてさらなる幹細胞および始原細胞から構成される未
分化の細胞のスフェア（「ニューロスフェア」）を生じる。クローンに由来する
ニューロスフェアが解離させられ、そして単一の細胞として、１つ以上の増殖を
誘導する増殖因子の存在下に置かれる場合には、それぞれのＮＳ−ＩＣが新規の
ニューロスフェアを生じ得る。単一のニューロスフェアの細胞は、天然において
はクローンである。なぜなら、これらは、単一の神経幹細胞の子孫であるからで
ある。ＥＧＦなどのような増殖を誘導する増殖因子の持続的な存在下では、ニュ
ーロスフェア中の前駆細胞は分裂し続け、それによって、ニューロスフェアの大
きさの増大を生じ、そして多数の未分化の神経細胞を生じる。ニューロスフェア
は、グリア筋原線維の酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；星状細胞についてのマーカー
）、神経フィラメント（ＮＦ；ニューロンについてのマーカー）、ニューロン特
異的エノラーゼ（ＮＳＥ；ニューロンについてのマーカー）、またはミエリン塩
基性タンパク質（ＭＢＰ；稀突起神経膠細胞についてのマーカー）に対しては免
疫反応性ではない。しかし、ニューロスフェア中の細胞は、未分化のＣＮＳ細胞
の多くの型において見出される中間体フィラメントタンパク質であるネスチンに
ついて免疫反応性である（Ｌｅｈｎｄａｈｌら、６０、Ｃｅｌｌ ５８５−５９
５（１９９０）、本明細書中で参考として援用される）。Ｒａｔ４０１と呼ばれ
るラットの抗体を含む抗体が、ネスチンを同定するために利用可能である。ニュ
ーロスフェアが、分化を可能にする条件下で培養される場合には、始原細胞は、
ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化する。神経幹細胞の子孫
に由来し得る分化した細胞型に関連する成熟表現形は、ネスチンの表現形につい
ては圧倒的にネガティブである。

【００１５】 未分化の、多能性の、自己更新する神経細胞に使用される専門用語は、これら
の細胞が、「神経幹細胞」と本明細書中で呼ばれるように、展開される。神経幹
細胞は、分裂することが可能であるクローン原性の多能性の幹細胞であり、そし
て適切な条件下では、ＮＳ−ＩＣについて自己更新する能力を有し、そして最終
的にニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化し得るその子孫の娘
細胞を含み得る。従って、神経幹細胞は、幹細胞の子孫が多数の分化の経路を有
するので、「多能性」である。神経幹細胞は、自己維持することが可能であり、
このことは、それぞれの細胞の分裂を伴って、１つの娘細胞もまた幹細胞に平均
されることを意味する。

【００１６】 神経幹細胞の非幹細胞の子孫は、代表的には、「始原」細胞と呼ばれる。これ
は、１つ以上の系統において種々の細胞型を生じ得る。用語「神経の始原細胞」
は、神経幹細胞に由来する未分化の細胞をいい、そして幹細胞自体ではない。い
くつかの始原細胞は、１つより多くの細胞型に分化し得る子孫を生じ得る。例え
ば、Ｏ−２Ａ細胞は、グリア始原細胞である。これは、稀突起神経膠細胞および
ＩＩ型星状細胞を生じ、従って、「二官能性の」始原細胞と呼ばれ得る。始原細
胞の識別特性は、幹細胞とは異なり、それが自己維持を示さないこと、そして代
表的には、分化の特定の経路を約束されていないと考えられ、そして最終的には
、適切な条件下で、グリアまたはニューロンに分化する。

【００１７】 用語「前駆細胞」は、神経幹細胞の子孫をいい、従って、始原細胞および娘神
経幹細胞の両方を含む。

【００１８】 （細胞マーカー）本発明は、ニューロスフェアを形成し得る（ＮＳ−ＩＣ）神
経幹細胞の、同定、単離、富化、および培養を提供する。ＮＳ−ＩＣは、ＮＳ−
ＩＣの表面上に見出される抗原の、細胞表面抗原を特異的に結合する試薬への結
合を通じて同定されるか、または選択される。

【００１９】 これらの抗原の１つは、ＡＣ１３３モノクローナル抗体に結合する抗原である
。ＡＣ１３３抗体（本明細書中では、５Ｆ３抗体と呼ばれる）は、プロミニンと
呼ばれるヒトの細胞マーカーを認識する試薬の抗体の実施形態の例である。プロ
ミニンは、種々の上皮細胞中で発現される多局所性（ｐｏｌｙｔｏｐｉｃ）膜タ
ンパク質である（Ｗｅｉｇｍａｎｎら、９４（２３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１２４２５−３０（１９９７）；Ｃｏｒｂｅｉｌら、１
１２（Ｐｔ７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２３−３３（１９９９）；Ｃｏｒｂ
ｅｉｌら、９１（７）Ｂｌｏｏｄ ２６２５−６（１９９８）；Ｍｉｒｉｇｌｉ
ａら、９１（１１）Ｂｌｏｏｄ ４３９０−１（１９９８））。種々のＡＣ１３
３抗体が、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，８４３，３３３
号に記載されている。マウスのハイブリドーマ細胞株ＡＣ１３３の寄託は、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｍｄ．２０８５２に、１
９９７年４月２４日に行われ、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３４６が与えら
れた。これらのＡＣ１３３抗体は、本発明の目的のヒト細胞のサブセットについ
て免疫選択され得る。好ましいＡＣ１３３モノクローナル抗体は、Ｍｉｌｔｅｎ
ｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）から商業的に得られ得る
。これには、ＡＣ１３３／１−ＰＥ抗体（Ｃａｔ＃８０８−０１）およびＡＣ１
３３／２−ＰＥ抗体（Ｃａｔ＃８０９−０１）が含まれる。ＭＡＣＳ分離につい
ては、モノクローナル抗体の５０：５０混合物が好ましい。ＡＣ１３３発現の高
い組織特異性は、高度に精製されたＮＳ−ＩＣ集団についての富化の間に特に有
利である。

【００２０】 ５Ｅ１２は、酵素的に解離させられたヒトの胎児の脳細胞に対して生成された
新規のモノクローナル抗体である。５Ｅ１２モノクローナル抗体は、Ｙｉｎ、米
国特許第５，８４３，６３３号（本明細書中で参考として援用される）に記載さ
れている対側性の（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）免疫化方法に実質的に従って
生成された。５Ｅ１２が結合する抗原は、推定のＭＷ１２５ｋＤを有し、そして
プロミニンに由来する別の抗原であると、現在考えられている。

【００２１】 ＣＤ４５は、Ｔ２００／白血球共通抗原である。ＣＤ４５に対する抗体は、市
販されている。好ましい実施形態においては、本発明の細胞およびそれらを含有
している培養物は、ＣＤ４５のような細胞表面マーカーを欠失しているとして（
プロミンポジティブであることに加えて）さらに特徴付けられる。

【００２２】 ＣＤ３４もまた、ｇｐ１０５−１２０として公知である。ＣＤ３４に対するモ
ノクローナル抗体は市販されており、そしてＣＤ３４モノクローナル抗体は、研
究のため、および臨床的な骨髄移植のために、リンパ造血性幹細胞／始原細胞を
定量および精製するために使用されている。

【００２３】 モノクローナル抗体８Ｇ１は、ＣＤ２４を認識する（ＣＤ２４に対する抗体は
市販されている）と考えられ、そして、５１５キロダルトン（細胞型の制限され
たスペクトルにおいて発現されるヒトのＬＲＰ／Ａ２ＭＲの鎖）と特異的に反応
する。強力な免疫組織化学的反応が、肝細胞、組織マクロファージ、中枢神経系
におけるニューロンおよび星状細胞のサブセット、繊維芽細胞、平滑筋細胞、な
らびに動脈壁中のアテローム性動脈硬化症の病変中の単球に由来する泡沫細胞に
おいて見られる。抗体はまた、慢性および球性の白血病（ＣＤ９１）の骨髄単球
性サブタイプのサブセットの特徴付けに使用され得る。ＣＤ９１に対する抗体は
市販されている。

【００２４】 （細胞の蓄積）５Ｅ１２．５および８Ｇ１．７被検培養物は、特許および登録
商標の特許庁長官によって決定されたものに対して、米国特許法施行規則§１．
１４および米国特許法§１２２のもとでそれに対して権利を与えられた、それら
を開示する特許出願の系属中に、利用可能である培養物に入手することを確実に
する条件下で、寄託される。寄託物は、本出願の相当部分、またはその子孫が提
出された国の外国の特許法によって必要とされる場合は、入手可能である。しか
し、寄託物の利用可能性は、政府による指令によって特許権を与えられた特例に
おいて、本発明の実施のための特許使用権は構成しない。

【００２５】 さらに、５Ｅ１２．５および８Ｇ１．７の本発明の培養寄託物は、微生物の寄
託についてのブダペスト条約の規則に従って、公に保存され、そして利用可能に
される。すなわち、これらは、寄託の日から少なくとも３０年間、またはこの培
養物を開示している発行し得る任意の特許の施行可能期間および寄託物のサンプ
ルについての最新の請求後５年間の間、それらを生存可能かつ未混入の状態で維
持するために必要な全ての注意を伴って保存される。寄託者は、寄託物を後継す
る義務を認識し、寄託機関は、寄託物の状態に起因して、請求された場合にサン
プルを提供することが可能でないべきである。本発明の培養寄託物の公に対する
入手可能性の全ての制限は、これらを開示する特許の認可に際して確定的に排除
される。

【００２６】 （細胞の単離、富化、および選択）ＮＳ−ＩＣが単離される細胞の集団は、神
経組織であり得、細胞の集団は、神経組織または細胞培養物中の細胞の集団（例
えば、ニューロスフェア培養物中の細胞、または接着性神経幹細胞培養物中の細
胞）から解離される。

【００２７】 本発明は、ＮＳ−ＩＣの単離および同定を提供する。ニューロスフェアを開始
する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）の同定は、神経細胞の集団（または神経細胞もしくは
神経に由来する細胞を含有している集団）にＡＣ１３３抗原に結合する試薬を接
触させる工程、およびＡＣ１３３抗原に結合する試薬と細胞表面上のＡＣ１３３
抗原との間の接触を検出する工程を包含する。試薬が結合するこれらの細胞は、
ＮＳ−ＩＣとして同定される。これらの細胞の同定は、これら細胞が実際に、ニ
ューロスフェアの開始、自己再生および多能性が可能であるＮＳ−ＩＣであるこ
とを実証するアッセイによって確認され得る。

【００２８】 本発明の方法はまた、ＡＣ１３３抗体を使用して、ＡＣ１３３―細胞からＡＣ
１３３⁺細胞を単離するために使用され得る。これは、ＮＳ−ＩＣの画分を含有
する神経細胞の集団を、ＡＣ１３３抗原に特異的に結合する試薬と混合し、次い
で、ＡＣ１３３⁺細胞についてＡＣ１３３⁺ＮＳ−ＩＣにおいて富化された選択さ
れた集団を生じる。選択することにより、それによって、選択前の神経細胞の集
団と比較した場合に、 従って、本発明はさらに、神経組織または神経幹細胞培養物（例えば、ニュー
ロスフェア懸濁培養物または神経幹細胞接着性培養物）由来のＮＳ−ＩＣの富化
を提供する。従って、本発明は、幹細胞および始原細胞が低頻度で生じるか、あ
るいは枯渇され得る神経組織（例えば、後期胚、若年性組織、および成体組織）
に由来するＮＳ−ＩＣの富化に有用である。当業者は、ＮＳ−ＩＣの画分を含有
している神経細胞の集団をＡＣ１３３抗原に特異的に結合する試薬と混合し；そ
してＡＣ１３３⁺細胞を選択し得る。この方法において、選択されたＡＣ１３３⁺ 細胞は、神経細胞の集団と比較した場合に、そのＮＳ−ＩＣの画分において富化
される。

【００２９】 細胞の選択は、フローサイトメトリー（例えば、蛍光色素結合体化ＡＣ１３３
抗体を使用する蛍光活性化細胞選別による）を含む、当該分野で公知の任意の適
切な手段により得る。選択はまた、磁性粒子に結合体化されたＡＣ１３３抗体を
使用する、高勾配磁気的選択により得る。固相への接着および固相からの脱接着
を含む任意の他の適切な方法もまた、本発明の範囲内で意図される。

【００３０】 当業者は、ＡＣ１３３抗体を使用する免疫選択によって細胞の集団を誘導し得
る。細胞の集団は、少なくとも３０％のＡＣ１３３⁺ＮＳ−ＩＣ、好ましくは、
少なくとも５０〜７０％のＡＣ１３３⁺ＮＳ−ＩＣ、そしてより好ましくは、９
０％以上のＡＣ１３３⁺ＮＳ−ＩＣを含むはずである。最も好ましくは、ＡＣ１
３３⁺ＮＳ−ＩＣの実質的に純粋な集団であり、これは、少なくとも９５％のＡ
Ｃ１３３⁺ＮＳ−ＩＣを含む。得られ、そして実際に使用される富化の程度は、
選択の方法、増殖の方法、およびニューロスフェアの開始のために培養物中に配
置される細胞の細胞用量を含む、多数の因子に依存する。

【００３１】 細胞の集団は、後期胚、若年性または成体の哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）組
織から誘導され得るか、あるいは、Ｗｅｉｓｓ、米国特許第５，７５０，３７６
号またはＪｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号に記載されているような、
神経幹細胞の既存の培養物から誘導され得る。最も好ましい実施形態においては
、ＮＳ−ＩＣはヒトである。いくつかの実施形態においては、集団中のＡＣ１３
３⁺細胞は、内皮細胞に複合体化され得る。

【００３２】 富化されたＡＣ１３３⁺ＮＳＩＣの集団を含有している本明細書中で記載され
るインビトロでの細胞培養物は、一般的には、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）につい
てポジティブであり、そして分化を誘導する条件の存在下で、ニューロン、星状
細胞、および稀突起神経膠細胞に分化する始原細胞を生じる点で、特徴付けられ
る。

【００３３】 当業者は、単離されたＡＣ１３３⁺細胞を培養培地に導入し得、培養物中で単
離されたＡＣ１３３⁺細胞を；特に、ニューロスフェアとして増殖させ得；単離
されたＡＣ１３３⁺細胞がニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分
化する条件下でこの単離されたＡＣ１３３⁺細胞の子孫を培養し得；次いで、ニ
ューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞の存在を検出し得る。ニューロン
、星状細胞、および稀突起神経膠細胞の存在は、単離されたＡＣ１３３⁺細胞を
ＮＳ−ＩＣとして特徴付ける。

【００３４】 代表的には、ＡＣ１３３⁺ＮＳ−ＩＣは、ニューロスフェアの成長および増殖
を可能にする培地中で培養される。単離されたＡＣ１３３⁺細胞が増殖する培養
物は、多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するために有効な１つ以上の予め決定さ
れた増殖因子を含有する無血清培地であり得る。培養培地は、白血球阻害因子（
ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２；
ｂＦＧＦ）、またはそれらの組合せから選択される増殖因子で補充され得る。培
養培地は、神経生存因子（ＮＳＦ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、ＣＡ）でさらに補充
され得る。ＡＣ１３３⁺細胞がニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞
に分化する条件は、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２またはＬＩＦを含有しないウシ胎児血清
（ＦＢＳ）を含有する培養培地中で、ラミニンでコーティングされた表面上でＡ
Ｃ１３３⁺細胞の子孫を培養し得る。

【００３５】 本発明はまた、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える増殖因子の存在を同定するた
めの方法を提供する。当業者は、ＮＳ−ＩＣを含有する組成物と、ＮＳ−ＩＣの
増殖をもたらす少なくとも１つの増殖因子を含有することが予想される組成物を
混合し、次いで、ＮＳ−ＩＣの増殖を決定組成物の存在の関数として決定する。
変更された（増大した、減少したなど）ＮＳ−ＩＣの増殖は、ＮＳ−ＩＣの増殖
をもたらす増殖因子の組成物中の存在を示す。次いで、当業者はさらに、増殖因
子を同定し得る。

【００３６】 （ＡＣ１３３に対する抗体）ＡＣ１３３に対する抗体は、米国特許第５，８４
３，６３３号（本明細書中で参考として援用されている）において議論されてい
るように、入手され得るかまたは調製され得る。ＡＣ１３３抗原は、種々のＡＣ
１３３モノクローナル抗体（これは、ＡＣ１３３抗原に対して特異性を有する）
のような抗体と接触させられ得る。ＡＣ１３３抗体は、還元性のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲルによるウェスタンブロット条件下でＡＣ１３３タンパク質に結合すること
によって特徴付けられる。ＡＣ１３３抗原は、市販のスタンダードに基づいて、
約１１７ｋＤａの範囲の分子量を有する。ＡＣ１３３抗原は、ヒト骨髄、胎児骨
髄および肝臓、臍帯血、ならびに生体の末梢血に由来する始原細胞のサブセット
上で発現される。

【００３７】 ＡＣ１３３抗原に対する抗体は、異種免疫応答性を有する哺乳動物宿主（マウ
ス、げっ歯類、ウサギ目、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含む）を、ヒト始原細胞で
免疫することによって得られ得る。特定の宿主の選択は、主に簡便なものであり
得る。免疫化のために適切な始原細胞の集団は、サイトカインが動員された末梢
血、骨髄、胎児臓肝臓などからＣＤ３４⁺細胞を単離することによって得られ得
る。免疫化のために適切な始原細胞の集団は、ＣＮＳ神経幹細胞または他のＮＳ
−ＩＣから得られ得る。免疫化は、細胞が、皮下、筋肉内、腹膜内、脈管内など
で注射され得る、従来技術に従って行われる。通常は、約１０⁶から１０⁸個まで
の細胞が、使用される。これは、１回以上の注射に分けられ得、通常は、約８回
以下の注射に分けられ、約１から３週間までの期間にわたる。注射は、例えば、
アジュバント（完全または不完全フロイトアジュバント、スペコール（ｓｐｅｃ
ｏｌ）、ミョウバンなど）を伴って、または伴わずに行われ得る。

【００３８】 免疫化スケジュールの完了後、抗血清は、始原細胞の表面膜タンパク質（ＡＣ
１３３抗原を含む）に特異的な多角形（ｐｏｌｙｇｏｎａｌ）の抗血清を提供す
るための従来の方法に従って、回収され得る。リンパ球は、適切なリンパ系組織
（例えば、脾臓、流入領域リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ
）など）から回収され、そして適切な融合パートナー（通常は、骨髄腫株）と融
合され、それによって特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを
産生する。目的の抗原特異性についてのハイブリドーマのクローンのスクリーニ
ングは、従来の方法に従って行われる。

【００３９】 ＡＣ１３３抗体は、通常の多量体構造の代わりに、単鎖として産生され得る。
単鎖抗体は、Ｊｏｓｔら、２６９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２６７−７３
（１９９４）（本明細書中で参考として援用されている）などに記載されている
。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、グリシンま
たはセリンを含む、少なくとも約４個のアミノ酸の小さい中性のアミノ酸をコー
ドするスペーサーに対して連結される。この融合体によってコードされるタンパ
ク質は、元々の抗体の特異性および親和性を保持する機能的な可変領域のアセン
ブリを可能にする。

【００４０】 ＡＣ１３３抗体は、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ ｃＤＮ
Ａの使用によって産生され得る（Ｌｉｕら、８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．３４３９（１９８７）および１３９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５２
１（１９８７）（本明細書中に参考として援用されている））。ｍＲＮＡは、抗
体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、そしてｃＤＮＡを産
生するために使用される。目的のｃＤＮＡは、特異的プライマーを使用してポリ
メラーゼ連鎖反応によって増幅され得る（米国特許第４，６８３，１９５号およ
び同第４，６８３，２０２号）。あるいは、ライブラリーを作製し、そして目的
の配列を単離するためにスクリーニングする。次いで、この抗体の可変領域をコ
ードするＤＮＡ配列が、ヒトの定常領域配列に対して融合される。ヒトの定常領
域遺伝子の配列は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎ．Ｉ．Ｈ．ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）に見出され得る。ヒトＣ
領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手可能である。次いで、キメラのヒ
ト化抗体が、従来の方法によって発現される。

【００４１】 ＡＣ１３３抗体は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦａｂのような抗体フラグ
メントとして産生され得る。抗体フラグメントは、インタクトなタンパク質の切
断によって（例えば、プロテアーゼによるか、または化学的な切断による）調製
され得る。あるいは、短縮型の遺伝子が設計される。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂フ
ラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒ
ンジ領域をコードするＤＮＡ配列、それに続く翻訳終止コドンを含み、短縮の分
子を生じる。

【００４２】 （免疫染色）生物学的サンプルは、対象の抗体によって結合された表面分子を
発現する細胞の存在についての任意の従来のイムノアッセイ方法によって、ＡＣ
１３３⁺細胞の存在についてアッセイされる。アッセイは、細胞の溶解物、イン
タクトな細胞、凍結切片などについて行われ得る。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔ
ｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）から入手可能な抗体は、細胞の直接的な
免疫蛍光染色に適切である。

【００４３】 （細胞の選別）ＮＳ−ＩＣ細胞に対する細胞表面抗原の使用は、始原細胞集団
のポジティブな免疫選択ならびにフローサイトメトリーを使用する始原細胞集団
の表現型分析のための手段を提供する。ＡＣ１３３抗原の発現について選択され
た細胞は、さらに、他の幹細胞および始原細胞マーカーについての選択によって
精製され得る。

【００４４】 実質的に純粋な始原細胞および幹細胞の調製のために、始原細胞のサブセット
が、ＡＣ１３３結合に基づいて他の細胞から分離される。始原細胞および幹細胞
は、当該分野で公知の他の表面マーカーに結合させることによって、さらに分離
され得る。

【００４５】 分離のための手順は、磁気的分離（抗体でコーティングされた磁性ビーズを使
用する）、アフィニティークロマトグラフィー、および固体マトリクス（例えば
、プレート）に結合された抗体での「パニング」、または他の従来技術を含み得
る。正確な分離を提供する技術として、蛍光活性化細胞選別機が挙げられる。こ
れは、複数の色のチャネル、鋭角および鈍角の光の散乱を検出するチャネル、イ
ンピーダンスチャネルなどのような、種々の程度の精巧性を有し得る。死細胞は
、死細胞に関連する色素（ヨウ化プロピジウム［ＰＩ］、ＬＤＳ）での選択によ
って排除され得る。選択された細胞の生存性について過度に有害でない任意の技
術が、使用され得る。

【００４６】 簡便には、抗体は、特定の細胞型の分離を容易にすることを可能にするための
標識（例えば、磁性ビーズ；ビオチン（これは、アビジンまたはストレプトアビ
インに対して高い親和性を有して結合する）；蛍光色素（これは、蛍光活性化細
胞選別機とともに使用され得る）；ハプテンなど）と結合体化され得る。多色分
析は、ＦＡＣＳとともに、または免疫磁気的分離とフローサイトメトリーとの組
合せにおいて使用され得る。多色分析は、複数の表面抗原（例えば、ＡＣ１３３ ⁺ ＣＤ４５^-、ＡＣ１３３ーＣＤ３４⁺など）に基づく細胞の分離のために関心深い
。多色分析における使用を見出されている蛍光色素として、フィコビリンタンパ
ク質（例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン）；フルオレセイン
、およびテキサスレッドが挙げられる。ネガティブな指示は、染色のレベルが、
アイソタイプ適合ネガティブコントロールの明るさ以下であることを示す。かす
かな指示は、染色のレベルが、ネガティブの株のレベルに近く得るが、またアイ
ソタイプ適合コントロールよりも明るくあり得ることを示す。

【００４７】 １つの実施形態においては、ＡＣ１３３抗体は、磁性試薬（例えば、超常磁性
微粒子（微小粒子）に対して直接的または間接的に結合体化される。磁性粒子へ
の直接的な結合体化は、当該分野で公知の種々の化学連結基の使用によって達成
される。抗体は、側鎖のアミノ基またはスルフヒドリル基、ならびにヘテロ官能
性の交差連結試薬を介して、微粒子にカップリングされ得る。多数のヘテロ官能
性の化合物が、実体への連結のために利用可能である。好ましい連結基は、抗体
上の反応性スルフヒドリル基および磁性粒子上の反応性アミノ基を用いる、３−
（２−ピリジジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓ
ＰＤＰ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン
酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）である。

【００４８】 あるいは、ＡＣ１３３抗体は、磁性粒子に対して間接的にカップリングされる
。この抗体は、ハプテンに対して直接的に結合体化され、そしてハプテン特異的
な第２段階の抗体が、粒子に結合体化される。適切なハプテンとして、ジゴキシ
ン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン
、ビオチンなどが挙げられる。タンパク質へのハプテンの結合体化のための方法
（すなわち、当該分野で公知である）、およびこのような結合のためのキットは
、商業的に入手可能である。

【００４９】 この方法を実行するために、ＡＣ１３３抗体が細胞のサンプルに対して添加さ
れる。特定の細胞のサブセットに対して結合するために必要なＡＣ１３３ Ａｂ
の量は、試験分離および分析を実行することによって経験的に決定される。細胞
およびＡＣ１３３抗体は、複合体が形成させるために十分な時間（通常は少なく
とも５分間、より通常は少なくとも１０分間、そして通常は１時間以下、より通
常は約３０分以下）でインキュベートされる。

【００５０】 さらに、細胞は、始原細胞または幹細胞上に存在するかまたは存在しないこと
が公知である細胞表面マーカーに対して特異的な抗体または結合分子とともにイ
ンキュベートされる。

【００５１】 標識された細胞は、特異的な抗体の調製に従って分離される。蛍光色素で標識
された抗体は、ＦＡＣＳ分離、免疫磁気的選択（特に、高勾配の磁気的選択（Ｈ
ＧＭＳ））のための磁性粒子などに有用である。例示的な磁気的分離デバイスは
、ＷＯ９０／０７３８０、ＰＣＴ／ＵＳ９６／００９５３、およびＥＰ４３８，
５２０に記載されている。ＡＣ１３３ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）は、ＡＣ
１３３⁺細胞のポジティブ選択のために使用され得る。このキットは、ＡＣ１３
３⁺細胞の単一の工程での単離のためのツールを提供する。ＡＣ１３３ Ｃｅｌ
ｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、ＦｃＲブロック試薬（ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋ
ｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）およびモノクローナルマウス抗ヒトＡＣ１３３抗体に
結合体化されたＭＡＣＳコロイド状マイクロビーズ（ＭＡＣＳ ｃｏｌｌｏｉｄ
ａｌ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）を含む。

【００５２】 精製された細胞の集団は、任意の適切な培地中に回収され得る。ダルベッコ改
変イーグル培地（ｄＭＥＭ）、ハンクス塩基性塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコ
リン酸緩衝化生理食塩水（ｄＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ改変ダルベ
ッコ培地（ＩＭＤＭ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ
）などを含む、種々の培地が商業的に入手可能であり、そして使用され得る。こ
れらはしばしば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒ
ト血清アルブミン（ＨＳＡ）などで補充される。

【００５３】 ヒトの始原細胞または幹細胞について高度に富化された集団は、この様式にお
いて達成される。所望される細胞は、３０％以上の細胞の組成物であり、好まし
くは、５０％以上の細胞集団、より好ましくは、９０％以上の細胞集団であり、
そして最も好ましくは、９５％以上（実質的に純粋な）の細胞集団である。

【００５４】 （精製された幹細胞／始原細胞の使用）ＡＣ１３３⁺幹細胞／始原細胞が、種
々の方法において有用である。ＡＣ１３３⁺細胞は、その細胞が疾患または損傷
によって失われた宿主を再構成するために使用され得る。細胞に関連する遺伝的
な疾患は、遺伝的な欠損を修正するか、または疾患に対して防御するように処置
するために、自己幹細胞または同種異系幹細胞の遺伝的改変によって処置され得
る。あるいは、正常な同種異系の始原細胞が移植され得る。ホルモン、酵素、増
殖因子などの特定の分泌された生成物の欠損に関連する、細胞に関連する疾患以
外の疾患もまた、処置され得る。ＣＮＳ障害は、神経変性性の疾患（例えば、ア
ルツハイマー病およびパーキンソン病）、急性脳損傷（例えば、発作、頭部の損
傷、脳性麻痺）、および多数のＣＮＳ不全（例えば、うつ病、てんかん、および
精神分裂病）のような多数の苦痛を含む。最近の数年間においては、神経変性性
の疾患は、これらの障害についてのもっとも大きな危険性を有する高齢者の集団
が増大しつつあることに起因して、重要な関心となっている。アルツハイマー病
、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキ
ンソン病を含むこれらの疾患は、ＣＮＳの特定の位置における神経細胞の変性に
関連しており、これによって、これらの細胞または脳領域が、それらの意図され
る機能を実行することを不可能にする。特異的な異なる増殖因子による１つ以上
の選択された系統への成熟、増殖、および分化を提供することによって、始原細
胞は、約束された細胞の供給源として使用され得る。ニューロスフェアはまた、
種々の血液細胞型（骨髄性細胞およびリンパ系細胞、ならびに初期の造血細胞を
含む）を産生するためにも使用され得る（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、２８３、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ５３４（１９９９）（本明細書中で参考として援用されている）を参
照のこと）。

【００５５】 ＡＣ１３３⁺細胞もまた、細胞の分化および成熟に関連する因子の単離および
評価において使用され得る。従って、細胞は、培地（例えば、馴化培地）の活性
を決定するためのアッセイ、増殖因子活性、系統の専門性（ｄｅｄｉｃａｔｉｏ
ｎ）との関係などについて、体液を評価するためのアッセイなどにおいて使用さ
れ得る。

【００５６】 ＡＣ１３３⁺細胞は、液体窒素温度で凍結させられ得、そして長期間貯蔵され
得、融解され得、そして再度使用され得る。細胞は、通常は、５％のＤＭＳＯお
よび９５％のウシ胎児血清中で保存される。一旦融解されると、細胞は、幹細胞
の増殖および分化に関連する増殖因子または間質細胞の使用によって、拡大され
得る。

【００５７】 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために示さ
れる。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような、本
発明の範囲を限定するようには決して解釈されないべきである。

【００５８】 （実施例１） （ＡＣ１３３磁気的細胞選別（ＭＡＣＳ）でポジティブ選択された胎児脳細胞
は、ニューロスフェア惹起細胞（ＮＳ−ＩＣ）活性を含む） ＡＣ１３３⁺細胞は、以下の方法によって調製される：ヒト胎児脳（ＦＢＲ１
０〜２０妊娠週数［「ｇ．ｗ．」］）を、インフォームドコンセントを得た後で
、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，ＩＮＣ（Ｏａ
ｋｌａｎｄ、ＣＡ）から得た。ヒト胎児脳組織をメスを使用して１〜３ｍｍの立
方体の切片に切断し、５０ｍＬの遠心分離チューブ中に移し、そして０．０２％
のＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で１回洗浄した。組織を、コラゲナーゼおよびヒアルロ
ニダーゼの存在下で３７℃で１時間酵素的に解離させた。細片および凝集物を、
７０ミクロンのフィルターカップを通して細胞懸濁物を濾過することによって除
去した。

【００５９】 ＡＣ１３３⁺のヒト胎児脳細胞を、常磁性抗体マイクロビーズ、ＡＣ１３３／
１ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．＃５０８−０１、Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用することによって分離
した。ＭＡＣＳ分離を、キットに添付されている説明書に基づいて行った。代表
的なＡＣ１３３⁺の単離物からの代表的なフローサイトメトリー性ＭＡＣＳ分離
において、約４４％の細胞がＡＣ１３３⁺ＣＤ４５^-であり、一方、約２％がＣＤ
３４⁺であった（これらのＣＤ３４⁺細胞は、精製されたＮＳ−ＩＣに複合体化さ
れた内皮細胞であった）。

【００６０】 上記の方法（１８ｇ．ｗ．の脳を使用する）によって得られたＡＣ１３３⁺選
択細胞は、なお異種であった。この細胞は、内皮細胞と複合体を形成する傾向に
あった。内皮細胞を、ＣＤ３４⁺またはＣＤ１０５⁺として同定した。ＡＣ１３３
ＭＡＣＳ分離はまた、ＡＣ１３３⁺細胞に関連するＣＤ３４⁺内皮細胞を富化す
る（継代後、ＮＳ−ＩＣは複合体化した内皮細胞から分離し、そして精製された
ＮＳ−ＩＣが得られ得る）。

【００６１】 ＡＣ１３３⁺のＭＡＣＳ分離された細胞を、上記のように、ＥＧＦ、ＦＧＦ−
２、およびＬＩＦを含有している培地の存在下で培養した。一般的には、初期の
妊娠期間の胎児脳（５〜１２ｇ．ｗ．）に由来する細胞を、ＮＳ−ＩＣについて
富化し、そして富化は、ニューロスフェア培養物を開始するためには必要ではな
かった。一方、より高週齢の胎児脳サンプル（１６〜２０ｇ．ｗ．）に由来する
細胞は、はるかに低いＮＳ−ＩＣ活性を含み、そしてニューロスフェア培養物を
開始するために富化を必要とした。換言すると、ＡＣ１３３⁺は、より妊娠期間
の長いヒト脳組織からのＮＳ−ＩＣの富化に有用である。胎児脳（１８ｇ．ｗ．
）に由来するＡＣ１３３⁺のＭＡＣＳ分離された細胞は、ＮＳ−ＩＣ活性につい
て富化されたが、一方、ＡＣ１３３⁺のＭＡＣＳ分離を伴わない全ヒト胎児脳細
胞（１８ｇ．ｗ．）は、ニューロスフェア培養物を開始しなかった。

【００６２】 ＡＣ１３３ ＭＡＣＳ細胞から樹立されたニューロスフェア細胞は、培養物中
で約７日目以後に試験し、そしてウサギ抗ヒトネスチンポリクローナル抗体によ
って検出されたように、ネスチンを発現した。例えば、Ｃｙｔｏ Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から入手可能であるニューロスフェ
ア細胞の中でも、ＦＢＲ １０６９（１８ｇ．ｗ．）、およびＦＢＲ １０７０
（２０ｇ．ｗ．）がネスチンを発現した。分化が誘導された場合は、ＡＣ１３３ ⁺ ＭＡＣＳ由来ニューロスフェア細胞は、ニューロンについてのβ−チューブリ
ン染色および星状細胞についてのＧＦＡＰ染色によって検出されるように、ニュ
ーロンおよび星状細胞に分化し得る。この特定の分化アッセイにおいて、ニュー
ロスフェア細胞を、１％のＦＢＳの存在下で、そしてＥＧＦ、ＦＧＦ−２、およ
びＬＩＦを含まない、ラミニンコーティングした表面上で培養した。

【００６３】 他の分化アッセイが、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞へのＮ
Ｓ−ＩＣの分化を誘導するために使用され得る。

【００６４】 （実施例２） （ＡＣ１３３は長期間のニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）培養に
よって細胞上に発現される重要な細胞表面マーカーである） 長期間のニューロスフェア細胞の培養物である、８．５ ＦＢＲを、Ｃｙｔｏ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）から入
手した。８．５ ＦＢＲニューロスフェア細胞は、比較的均質にＡＣ１３３を発
現する。これらの８．５ＦＢＲ細胞はまた、Ｔｈｙ−１⁺、ＣＤ１６６⁺、および
ＨＬＡ−ＤＲ⁺でもある。基本的な培地としてＥｘ Ｖｉｖｏ １５を使用した
場合は、高い割合のニューロスフェア培養が、１８ｇ．ｗ．に由来する初代の脳
組織から開始された。従って、発達しつつあるニューロスフェア培養物中の細胞
のＡＣ１３３⁺画分を評価することが可能である。ＡＣ１３３⁺細胞の割合は、ニ
ューロスフェアの発達に伴って増大した。一旦、ニューロスフェア細胞が十分に
確立されると、ニューロスフェアを形成する実質的に全ての細胞がＡＣ１３３を
発現した。

【００６５】 （実施例３） （ニューロスフェアを開始する細胞はモノクローナル抗体ＡＣ１３３、フロー
サイトメトリーによる細胞選別（ＦＡＣＳ）アプローチを使用して分離され得る
） この実施例の目的は、ＡＣ１３３⁺細胞が多能性のＮＳＣ活性を有する脳中の
唯一の細胞であるかどうかを試験することである。ヒトのＣＤ４５に対するｍＡ
ｂを、胎児の組織中の血液細胞の混入物を除くために使用した。いくつかの場合
においては、ヒトのＣＤ３４に対する抗体を、内皮細胞および内皮性の神経先祖
複合体（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｏ
ｍｐｌｅｘ）を排除するために使用した。従って、胎児の脳細胞を、ＣＤ４５^-
ＣＤ３４^-と定義した。神経幹細胞および最初の先祖（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）
活性を測定するために、ＮＳ−ＩＣアッセイを、所定の集団中のＮＳ−ＩＣの頻
度を決定するために確立した。ＮＳ−ＩＣが稀であり、そしてＡＣ１３３抗原を
均一に発現する場合には、ＮＳ−ＩＣを、ＡＣ１３３⁺選択によって富化し得、
そして他の画分においては同様に枯渇し得た。

【００６６】 （モノクローナル抗体の供給源）ＡＣ１３３抗原を、２つのｍＡｂ（ＡＣ１３
３／１およびＡＣ１３３／２）によって定義した。これらの両方ともが、フィコ
エリトリンと結合している。これらはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂ
ｕｒｎ，ＣＡ）を通じて入手可能である。抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびグリ
コフィリン（Ｇｌｙｃｏｐｈｒｉｎ）Ａ−ＦＩＴＣを、ＣＡＬＴＡＧ（Ｂｕｒｌ
ｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびＣｏｕｌｔｅｒ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）からそれぞれ
入手した。抗ヒトアロフィコシアニン結合ＣＤ３４を、ＢＤＩＳ（Ｓａｎ Ｊｏ
ｓｅ，ＣＡ）から入手した。

【００６７】 （細胞調製物）ＦＢＲを、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼによって解離
させ、そしてこれらはなお内皮性の先祖複合体を含んだ。これは、単一の細胞懸
濁物中の候補のＮＳＣの単離を妨げた（内皮細胞はＣＤ４５⁺である）。この内
皮細胞−ＮＳ−ＩＣ複合体を解離させるために、上記のように処理したＦＢＲ細
胞をさらに、１０〜１５分間、トリプシンで処理した。ＡＣ１３３抗原、ＣＤ４
５抗原、およびＣＤ３４抗原は、トリプシン処理について耐性であったが、一方
グリコフィリンＡは感受性であった。

【００６８】 トリプシン消化後、細胞を洗浄し、そしてＣＤ４５、グリコフィリンＡ、ＡＣ
１３３、およびＣＤ３４に対するｍＡｂで染色した。免疫磁気性のビーズでの選
択は使用しなかった。細胞を、氷上で２０〜６０分間インキュベートした。最後
の洗浄後に、細胞を、１μｇ／ｍＬのよう化プロピジウム（ＰＩ）を含有してい
るＨＢＳＳ溶液中に再懸濁した。標識した細胞を分析し、そして二重レーザーＦ
ＡＣＳ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）で選別した
。死亡した細胞を、それらのＰＩ染色特性によって分析から排除した。選別した
後、選別した細胞の集団の純度を、ＦＡＣＳ再分析によってチェックした。ＡＣ
１３３⁺ＣＤ４５^-細胞（ＮＳ−ＩＣ、約５％の出発細胞）およびＡＣ１３３^-Ｃ
Ｄ４５^-細胞（約８７％の出発細胞）の、選別の前および選別の後での代表的な
ＦＡＣＳプロフィールを行った。

【００６９】 （ＮＳ−ＩＣ活性はＡＣ１３３⁺サブセットにおいては高度に富化されるが、
ＡＣ１３３^-サブセットにおいては高度には富化されない）ＦＢＲ細胞（代表的
には、１６〜２０ｇ．ｗ．）を、代表的には、ＣＤ４５^-ＣＤ３４^-ＡＣ１３３^-
およびＣＤ４５^-ＣＤ３４^-ＡＣ１３３⁺画分に選別した。有意なＮＳ−ＩＣ活性
は、ＦＢＲ中のＣＤ４５⁺またはＣＤ４５^-ＣＤ３４⁺の集団中には残っていなか
った。

【００７０】 選別した細胞を、上記のニューロスフェア培地中で培養した。代表的には、Ｅ
ｘ Ｖｉｖｏ １５またはＥｘ Ｖｉｖｏ １５、Ｄ−ＭＥＭ、Ｆ−１２培地の
組合せを、基本的な培地として使用した。ニューロスフェアの発達を最大にする
ために、選別した細胞を、代表的には、ＬＩＦ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、および神
経生存因子ＮＳＦ（Ｃａｔ．ＣＣ−４３２３，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で培養した。

【００７１】 単一の細胞懸濁物を、細胞の選別後に得た。インビトロでの培養の４〜５日後
に、ＡＣ１３３⁺細胞は増殖を開始し、そして小さいニューロスフェアが培養の
開始後８〜１０日で観察された。細胞は、ＮＳＦを伴わないＬＩＦ、ＦＧＦ−２
、ＥＧＦの存在下で培養した場合に、ニューロスフェアを開始し得た。ニューロ
スフェア培養物は、ＡＣ１３３⁺ＣＤ４５^-またはＡＣ１３３⁺ＣＤ４５―ＣＤ３
４^-に選別された４つのＦＢＲ組織（１８−２０ｇ．ｗ．）のうちの４つから開
始した。

【００７２】 対照的に、ＡＣ１３３^-ＣＤ４５^-ＦＢＲ細胞を、ＬＩＦ、ＦＧＦ−２、および
ＥＧＦの存在下で培養物中に配置した場合には、ごくわずかなニューロスフェア
の形成が見られ、そして新しいフラスコに継代することはできなかった。さらに
ＮＳＦを増殖培地に添加した場合には、いくつかのニューロスフェアの開始が観
察された。従って、ＡＣ１３３^-ＣＤ４５^-ＦＢＲ細胞を、ＮＳ−ＩＣの有意な量
で枯渇させた。

【００７３】 （実施例４） （ＮＳ−ＩＣ細胞について富化させるためのＡＣ１３３⁺細胞の分離） ＡＣ１３３⁺細胞の分離は、組織に由来するＮＳ−ＩＣ細胞を富化させるため
に有効に使用され得る。さらに、ＡＣ１３３⁺細胞の分離は、確立された調製物
に由来するＮＳ−ＩＣについてさらに富化し得る。１つの試験においては、解離
させられたニューロスフェア（Ｃｙｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐｒｏｖ
ｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）のＡＣ１３３⁺細胞の選別は、大きく富化されたＮＳ−Ｉ
Ｃ培養物を提供し、そして増大したニューロスフェアの確立を示す。この培養物
を使用すると、それぞれのウェル中でニューロスフェアを開始するために必要と
される細胞用量（すなわち、１００％ポジティブ）は、３，０００〜１０，００
０個の細胞から約３０個の細胞にまで減少させることができる（以下の表１を参
照のこと）。

【００７４】

【表１】 表１に示すように、本明細書中で使用した（ｇ．ｗ．２０）富化していない新
しい脳組織（「ＦＢＲ」）は、全てのウェル中でニューロスフェアを開始するた
めの、３，０００から１０，０００個の間の細胞用量を必要とするそのような数
で、ＮＳ−ＩＣを含み得る。本発明の方法を使用することによって、富化された
集団を得ることができ、その結果、１，０００個またはそれ未満の細胞およびよ
り好ましくは富化された集団の用量が必要とされ、その結果、１００個の細胞未
満である細胞用量が必要とされる。表１に示すように、本明細書中では富化は、
わずか約３０個の細胞の細胞用量がそれぞれのウェル中でのニューロスフェア培
養物を確立するために１つのウェル当たりに必要とされるように、達成されてい
る。表１はまた、集団をＡＣ１３３⁺細胞中で枯渇させる場合（ＦＢＲ １１０
４ ＡＣ１３３ｎｅｇ．に選択された細胞）には、これらの集団からのニューロ
スフェア培養物の確立が明らかに減少することを示す。

【００７５】 （定量的なＮＳ−ＩＣアッセイ）ＮＳ−ＩＣの存在についてアッセイするため
に、多能性のＮＳ−ＩＣを含有していると予想される細胞の集団を、クローンの
発達に供する。細胞を、ニューロスフェアを形成するように増殖培地中で増殖さ
せ、次いで、ニューロン、星状細胞、およびオリゴ樹状細胞を形成するように分
化を誘導する。ニューロン、星状細胞、およびオリゴ樹状細胞の存在は、免疫染
色によって示され得る。例えば、β−チューブリンの存在についてのニューロン
の染色；ＧＦＡＰの存在についての星状細胞の染色；およびＯ４の存在について
のオリゴ樹状細胞の染色。

【００７６】 定量的なＮＳ−ＩＣアッセイを、精製していない組織細胞に対して、ＡＣ１３
３⁺に選別した細胞に対して、そしてクローンのニューロスフェア細胞株に対し
て行い得る。

【００７７】 （実施例５） （ＮＳ−ＩＣの増殖および継代のための細胞培養培地） Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号およびＷｅｉｓｓら、米国特
許第５，８５１，８３２号は、「多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するのに有効
な１つ以上の予め決定された増殖因子を含有している培養培地」、および「分化
を誘導する条件」を開示している。しかし、以下を含むが、これらに限定されな
い、異なる基本的な培地を使用し得る： Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
）； Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌ
ｌｅ，ＭＤ）； 神経先祖基本培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；また
は、 上記の基本培地の組合せ。

【００７８】 ヒトのニューロスフェア細胞を培養するための代表的な培地処方物を、表２に
提供する。

【００７９】

【表２】 ＥＧＦを、培地を濾過した後に、ヒトのニューロスフェアについての１００ｍ
ｌの基本培地に添加する。ＥＧＦは、培地中では比較的安定である、ＦＧＦ−２
およびＬＩＦを、使用するために培地を準備するときに添加する。補充試薬の最
終濃度は以下のとおりである： ５ｍｇ／ｍｌ インシュリン １００ｇ／ｍｌ ヒトのトランスフェリン ６．３ｎｇ／ｍｌ プロゲステロン １６．１ｎｇ／ｍｌ プトラシン（Ｐｕｔｒａｓｃｉｎｅ） ５．２ｎｇ／ｍｌ セレナイト ２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ ２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２ １０ｎｇ／ｍｌ ＬＩＦ ２ｇ／ｍｌ ヘパリン ２ｍＭ Ｌ−グルタミン ６ｍｇ／ｍｌ グルコース 培地処方物の最適化は、確立される初代の脳組織から開始される高い割合のニ
ューロスフェアを可能にする。本発明者らは、Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５培地を好む
。培地処方物の最適化もまた、より一定のニューロスフェアの増殖可能にする。
ニューロスフェアの発達を最大にするためには、ＮＳ−ＩＣを、代表的には、Ｌ
ＩＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、および神経生存因子ＮＳＦ（Ｃａｔ．ＣＣ−４３２３
，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で培養する。１つ
の試験においては、トリプシン処理したＦＢＲ １１０１神経細胞およびトリプ
シン処理したＦＢＲ １１０４神経細胞（Ｃｙｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ
，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）の両方が、ＬＩＦ，ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、およびＮ
ＳＦを有するＥｘ Ｖｉｖｏ １５培地中で培養した場合に、増大した増殖を示
す。

【００８０】 （実施例６） （細胞の選別による胎児の脳に由来するヒトの神経幹細胞の直接的な単離） 広範囲のニューロンを再生し得る高度に定義された移植可能なヒト細胞の大量
の供給源は、神経退行性の障害の処置のための有効な治療用産物であり得る。ヒ
トの神経幹細胞（ＮＳＣ）の富化のための再現性のある方法を定義するために、
本発明者らは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってＮＳＣを同定しそして
精製するための、ヒトの神経細胞の表面マーカーに対して指向されたモノクロー
ナル抗体（ｍＡｂ）を開発し、そして使用した。ＦＡＣＳおよび免疫組織化学的
分析に基づいて、２つのｍＡｂ（５Ｆ３および５Ｅ１２）を同定した。これらは
、胎児の脳細胞の小さなサブセットを定義し、そしてＣＮＳ幹細胞を含有するこ
とが公知の部位である、脊髄（１２ｇ．ｗ．）の底板および上衣層中の細胞に対
して特異的な反応性を提示した。これらのｍＡｂは、ＦＢＲ細胞の５％未満を染
色し、そして長期間のニューロスフェアの培養物に由来する９５％以上の細胞が
ポジティブであった。

【００８１】 一例として、２つの細胞の集団（５Ｆ３⁺ＣＤ３４^-ＣＤ４５^-（５Ｆ３⁺）およ
び５Ｆ３^-ＣＤ３４^-ＣＤ４５^-（５Ｆ３^-））を選別し、そしてニューロスフェア
の培養を開始するそれらの能力について試験した。５Ｆ３⁺サブセットは、ニュ
ーロスフェアを開始する細胞活性について高度に富化された；これらは、培養物
中で８〜１０日までに小さいニューロスフェアを形成するように増殖した。対照
的に、選別された５Ｆ３^-細胞は、単細胞懸濁物のままであり、ニューロスフェ
アを開始できず、そして最終的に死亡した。拡大した５Ｆ３⁺に選別されたニュ
ーロスフェア細胞は、ネスチンの発現についてポジティブであり、そして分化条
件への曝露後に、ニューロンおよびグリアに分化した。ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス
を使用するインビボでの研究は、移植後８週間で、５Ｆ３⁺ニューロスフェア細
胞が植え付けられ得、そして移動し得ることを示す。これらの研究は、本発明者
らが、細胞表面マーカーおよびフローサイトメトリーに基づいて人のＮＳＣを同
定しそれを富化したこと、ならびにインビトロおよびインビボでのアッセイを使
用してそれらの活性を実証したを示す。

【００８２】 さらなる試験においては、本発明者らは、種々の在胎齢にわたって脳および脊
髄組織を試験した。初期（５〜１２ｗｋの妊娠期間）の在胎齢は、後期の在胎齢
（１６〜２０ｗｋの妊娠期間）よりも高い頻度のニューロスフェアを開始する細
胞（ＮＳ−ＩＣ）を有する。例えば、図５を参照のこと。これらの組織に由来す
る細胞の直接の培養は、ニューロスフェアの開始を導く。

【００８３】 本発明者らのデータ（以下の表３に示す）は、５Ｆ３⁺細胞について富化され
た神経細胞の細胞の集団が、ＮＳ−ＩＣ活性について２３倍も富化されることを
実証する。

【００８４】

【表３】 さらに、図２に示すように、ニューロスフェアを、単一の細胞に選別した５Ｆ
３⁺細胞にから誘導し得る。本発明者らはまた、５Ｆ３⁺に選別した細胞から誘導
されたニューロスフェア細胞の自己更新が、単一の細胞に由来するニューロスフ
ェアの再開始によって達成され得ることを実証した（データは示さない）。逆に
、本発明者らのデータは、５Ｆ３⁺細胞を除去された細胞の集団もまた、ＮＳ−
ＩＣ活性について枯渇されることを示す。

【００８５】 （実施例７） （異なるマーカーによるＮＳ−ＩＣの単離） 第２の実施例として、本発明者らは、本明細書中に記載する新規のモノクロー
ナル抗体５Ｅ１２を使用して細胞の集団を選別した。５Ｅ１２⁺サブセットを、
以下の表４に示すように、ニューロスフェアを開始する細胞活性について富化し
た。図３をもまた参照のこと。本発明者らのデータは、５Ｅ１２抗体に対する抗
原が、５Ｆ３⁺細胞上のＡＣ１３３抗原と同時に発現されることを示唆する。

【００８６】 本発明者らはまた、以下の表４に示すように、神経幹細胞についてのサブセレ
クターとして８Ｇ１モノクローナル抗体を評価した。５Ｆ３⁺および８Ｇ１^-/lo
である細胞は、より幹細胞様の特性を提示し、一方、５Ｆ３⁺および８Ｇ１^{med/h i} である細胞は、より始原細胞様の特性を示した。

【００８７】

【表４】 （実施例９） （ＮＳ−ＩＣのインビボでの研究） 本発明者らは、従来技術を使用して、新生児の免疫不全マウスの側脳室に、５
Ｆ３⁺−に選別したＮＳ−ＩＣ（上記のように得た）を移植した。ヒトのニュー
ロスフェア細胞の植え付けおよび移動を、ヒト特異的Ｔｈｙ−１抗体を使用して
、注射後の４〜８週間の間に検出した（図６を参照のこと）。図７に示すように
、ヒトβ−チューブリン（ニューロンのマーカー）およびヒト核抗原（ヒト細胞
の局在について）での染色は、嘴側の移動性の流れ（ＲＭＳ）を通じるヒトのニ
ューロスフェア細胞の移動を明らかにした。さらに、図８に示すように、ヒト核
抗原を使用する局在化は、ヒトのニューロスフェア細胞が、ＲＭＳを通じて嗅球
に移動したことを実証した。

【００８８】 （実施例１０） （ヒトの中枢神経系の幹細胞の直接的な単離および移植） （序章および要約）自己更新特性および多重系列の分化特性を有する、幹細胞
、クローン原性細胞は、損傷した組織を置換するかまたは修復するための能力を
有する。この実施例においては、本発明者らは、クローン原性のヒトの脳の幹細
胞（ＣＮＳ−ＳＣ）を単離した。これは、ニューロスフェアの培養を開始し、そ
して自己更新、ならびにニューロンおよびグリアへの分化の両方を示す。これら
の遺伝的に改変されていないヒトのＣＮＳ−ＳＣは、表面マーカーについてのモ
ノクローナル抗体によってマークされる。細胞は、５Ｆ３（ＡＣ１３３）⁺、５
Ｅ１２⁺、ＣＤ３４^-ＣＤ４５^-、およびＣＤ２４^-/loである。単一のＡＣ１３３⁺ ＣＤ３４^-ＣＤ４５^-選別された細胞は、ニューロスフェアの培養を開始し、そし
て多重系列の分化を提示した。一旦、免疫不全新生児マウスの脳に移植されると
、選別されそして拡大されたＣＮＳ−ＳＣは、強力な植え付け、増殖、移動、お
よび分化を、部位特異的な様式で示す。

【００８９】 この実施例においては、本発明者らは、ｍＡｂ ５Ｆ３および新規のｍＡｂで
ある５Ｅ１２が、ヒトの胎児の脳（ＦＢｒ）細胞の異なるサブセットを検出する
ことを示す。混入している血液および内皮細胞をマークするｍＡｂ（ＣＤ３４お
よびＣＤ４５）と組合せてこれらのｍＡｂを使用する蛍光活性化細胞選別は、ヒ
トのＦＢｒ細胞の、ＡＣ１３３⁺ＣＤ３４^-ＣＤ４５^-のサブセットを生じる。細
胞の選別後、選別された細胞は、単細胞のレベルで、ニューロスフェアを開始し
得、自己更新し得、そして多重系列の分化をし得る、本発明者がヒトのＣＮＳ−
ＳＣと指名する細胞であり得る。これらの候補のヒトのＣＮＳ−ＳＣは、自己更
新し、そしてニューロスフェア培養物中で有意に拡大し、そしてインビトロでニ
ューロンおよびグリアに分化した。選別されそして拡大された候補のＣＮＳ−Ｓ
Ｃは、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの脳の側脳室に移植され得る。ここでは
これらは、明らかに適切な部位特異的植え付け、持続的な自己更新、移動、およ
び分化を、少なくとも７ヶ月間受ける。

【００９０】 （ＣＮＳ神経幹細胞のマーカーについての検索；ストラテジー）本発明者らは
、候補のＣＮＳ−ＳＣマーカーが、ＦＢｒ細胞の主要ではないサブセットのみに
おいて発現されるはずであるという仮説をたてた。ニューロスフェア培養物が幹
／始原細胞の富化された集団を含むという証拠が存在するので、本発明者らは、
候補の神経幹細胞マーカーが、これらの細胞上でより豊富に発現されるはずであ
るという仮説をたてた。従って、本発明者らは、ヒトの造血幹細胞（ＨＳＣ）を
定義するために以前に使用したｍＡｂを通じてスクリーニングした。

【００９１】 選別した集団を、それらがニューロスフェアを開始する細胞（ＮＳ−ＩＣ）に
ついて富化されたかどうかを決定するために試験した。２つの画分（１つの画分
は確立されたニューロスフェア培養物であり、そして１つはそうではない）に清
潔にＦＢｒを分離する任意のｍＡｂを、ＮＳ−ＩＣを同定することを助けるため
の候補のｍＡｂと考えた。最初のスクリーニングにおいては、ｍＡｂを、ＦＢｒ
のポジティブに染色された小さな画分、および長期間培養されたニューロスフェ
ア細胞の大きな画分と考え、そして他のｍＡｂ（ネガティブ選択のための）を、
ほとんどのＦＢｒ細胞を染色するが、ニューロスフェア細胞の小さな画分は染色
しないと考えた。酵素によって解離させられたＦＢｒおよび長期間培養されたニ
ューロスフェア細胞を、５０個以上の既知のｍＡｂで染色した。

【００９２】 長期間のニューロスフェア培養物である、８．５ＦＢｒが、以前に記載されて
いる（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、１５８ Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２６５−７８（
１９９９））。これらの細胞を、以下の標準的なヒトのニューロスフェア培地中
で培養した：ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、およ
びＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、Ｎ−２補充（Ｇｉｂｃｏ）、３％のグ
ルコース、０．２Ｍのグルタミン、および０．２ｍｇ／ｍｌのヘパリンを有する
、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２基本培地。培養した細胞を回収し、そしてコラゲナーゼの
存在下で、継代のために５〜１０分間酵素的に解離させるか、またはｍＡｂの染
色のための単一の細胞懸濁物を得るためにトリプシン処理した。

【００９３】 ニューロスフェア細胞は、血管および造血性のマーカーであるＣＤ３４または
ＣＤ４５を発現しなかった。対照的に、マウスおよびヒトのＨＳＣの両方を同定
した重要な細胞表面マーカーであるＴｈｙ−１は、実質的に全てのＦＢｒ細胞お
よびニューロスフェア細胞上で高レベルで発現され、そして従って、有用ではな
かった。興味深いことに、最初の抗体スクリーニングは、別のＨＳＣマーカーで
あるＡＣ１３３が、１６〜２０の妊娠週数（ｇ．ｗ．）の組織に由来するＦＢｒ
細胞のわずかに１〜５％において、そして培養されたニューロスフェア細胞の約
９０％において発現されたことを明らかにした。

【００９４】 （モノクローナル抗体ＡＣ１３３は、ヒトのＣＮＳ−ＳＣについて富化する）
ヒトのＦＢｒ組織を、ＮＩＨのガイドラインに従って、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．から１６〜２０の妊娠週（ｇ
．ｗ．）の胎児の残りから得た。ＦＢｒ組織を、１〜３ｍｍの切片に、小刀を使
用して切断し、５０ｍＬの遠心分離チューブに移し、そして０．０２％のＥＤＴ
Ａ／ＰＢＳ溶液で１回洗浄した。組織を、０．１％のコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ
，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および０．１％のヒアルロニダーゼ（Ｓｉ
ｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、０．１％のＢＳＡ、１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ，およびＤＮａｓｅを補充したＨＢＳＳ中で３７℃にて１時間、酵素
的に解離した。単一の細胞の懸濁物を得るために、解離させたＦＢｒ細胞をさら
に、０．０５％のトリプシン、５３ｍＭのＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて１０〜１５分間処理した。破片および凝集物を、
７０ミクロンのフィルターユニットに通して細胞懸濁物を濾過することによって
除去した。

【００９５】 単一の細胞懸濁物を、コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ処理、続くトリプシン
処理後に得た。従って、スクリーニングによって、トリプシン耐性の細胞表面エ
ピトープに限定した。

【００９６】 ＦＢｒに由来する選別したＣＤ４５⁺またはＣＤ３４⁺細胞の塊の培養物は、ニ
ューロスフェアの培養を開始することができなかった。従って、ＣＤ３４および
ＣＤ４５の両方が、ヒトのＣＮＳ−ＳＣについてのネガティブセレクターとして
使用され得た。

【００９７】 ＣＮＳ−ＳＣが、ＡＣ１３３の発現に基づいて単離され得るかどうかを試験す
るために、ヒトのＦＢｒ細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ４５，およびＡＣ１３３に対す
る抗体を用いて染色した。ＡＣ１３３抗原を、両方ともフィコエリスリン（ＰＥ
）に結合させた、２つのｍＡｂ（ＡＣ１３３／１およびＡＣ１３３／２）によっ
て規定した。これらは、Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）
を通じて入手可能である。抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ、アロフィコシアニン（ａ
ｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｎｉｎ）（ＡＰＣ）と結合させた抗ヒトＣＤ３４を、
ＣＡＬＴＡＧ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびＢＤＩＳ（Ｓａｎ Ｊｏｓ
ｅ，ＣＡ）からそれぞれ得た。解離させたＦＢＲ細胞を、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、
ＡＣ１３３／１ ＡＣ１３３／２−ＰＥ、およびＣＤ３４−ＡＰＣに対するｍＡ
ｂとともに、氷上で２０〜６０分間インキュベートした。最後の洗浄後、細胞を
、０．５ｇ／ｍＬのヨー化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｎｅ）
（ＰＩ）を含むＨＢＳＳ溶液中に再懸濁した。標識された細胞を分析し、そして
二重レーザーのＶａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤＩＳ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）を用いて
選別した。死細胞を、それらのＰＩ染色特性によって分析から排除した。混入し
ている血液細胞および内皮細胞を、ＣＤ４５⁺細胞ＣＤ３４⁺細胞をそれぞれゲー
トで制御することによって排除した。選別した後、選別した細胞集団の純度をチ
ェックした。

【００９８】 ２つの細胞の集団（ＡＣ１３３^-ＣＤ３４^-ＣＤ４５^-（ＡＣ１３３^-）およびＡ
Ｃ１３３⁺ＣＤ３４^-ＣＤ４５^-（ＡＣ１３３⁺））を選別し、そしてＮＳ−ＩＣ活
性について培養した。ＡＣ１３３の発現は、連続的出ることが最初に明らかにな
ったが（図９Ａ）、ＡＣ１３３⁺細胞のＦＡＣＳでの予備富化、続く２回目の細
胞の選別は、別のＡＣ１３３⁺集団を明らかにした（図９Ａ）。全ての続く試験
において、ＡＣ１３３^-およびＡＣ１３３⁺サブセットの両方を２回選別し、それ
によって高純度で、ＡＣ１３３^-およびＡＣ１３３⁺ＦＢｒ細胞の画分を得た（図
９Ａ）。

【００９９】 ニューロスフェアの条件下で培養したＡＣ１３３⁺の単一の細胞懸濁物は、芽
細胞様（ｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ）になり、プラスチックプレート上に接着し、そ
して細胞分裂を開始し始めた。培養物中での４〜５日後、ＡＣ１３３⁺細胞の大
きな画分は増殖を開始し、そして数個の細胞のクラスターとして浮遊し始めた。
小さなニューロスフェアは、培養の開始後７〜１０日のような初期に観察された
（図９Ｃ）。対照的に、選別されたＡＣ１３３^-細胞は、単一の細胞懸濁物のよ
うなままであり、ニューロスフェアを開始することはできず、そして最終的には
死亡した（図９Ｂ）。従って、ＮＳ−ＩＣ活性は、ＣＤ４５^-ＣＤ３４^-ＦＢｒ細
胞の、ＡＣ１３３⁺のサブセット中では見出されるが、ＡＣ１３３^-のサブセット
中では見出されなかった。

【０１００】 （ＡＣ１３３⁺のヒトＦＢｒ細胞のみがＮＳ−ＩＣ活性を含む）定量的なＮＳ
−ＩＣアッセイが、ＡＣ１３３^-およびＡＣ１３３⁺サブセット間での増殖におい
て衝撃的な差異を示したので、本発明者らは、分画していない（すなわち、細胞
の処理後）、および種々の分化したＦＢｒ細胞懸濁物中のＮＳ−ＩＣの頻度を決
定することを望んだ。分画していないＦＢｒ細胞を、ＦＡＣＳ自動細胞沈着ユニ
ット（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ−ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）（Ａ
ＣＤＵ）を使用して９６ウェルプレート中に限界稀釈（１００〜１０，０００細
胞／ウェル）によってプレートした。これらのプレートを６〜８週間培養し、そ
してニューロスフェアを含むウェルをポジティブとして記録した。

【０１０１】 選別したＦＢｒ細胞を、ＦＧＦ−１（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／
ｍＬ）、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、神経生存因子−１（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、および６０ｇ／ｍＬのＮ−アセチルシスチン（Ｓ
ｉｇｍａ）の存在下で、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）を含むＥｘ Ｖｉｖｏ
１５（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｅ，ＭＤ）培地（
ニューロスフェア開始培地）中のニューロスフェア培養物中で培養した。培地処
方物を、ＦＢｒ細胞の限界稀釈の頻度分析に基づいて最適化した。培養物に、毎
週栄養を補給し、そしてニューロスフェアが大きくなった場合、継代した。いく
つかの場合には、選別したＦＢｒ細胞を、ニューロスフェアの培養を開始する前
駆体の頻度を評価するために、自動化された細胞蓄積ユニット（ＡＣＤＵ）によ
って９６ウェルプレート中に再度選別した。これらの９６ウェルプレートを、毎
週栄養を補給し、そしてウェル中のニューロスフェアの存在を、培養の開始後６
〜８週間で記録した。それぞれの細胞濃度でのネガティブなウェルの割合の直線
状の退行の分析を、ＮＳ−ＩＣの頻度を決定するために使用した。

【０１０２】 多数のニューロスフェアを、高い細胞用量（すなわち、１ウェルあたり１０，
０００細胞）でプレートしたウェル中で検出した。それにもかかわらず、低い細
胞用量（すなわち、３００〜１０００細胞／ウェル）でプレートしたウェルにお
いては、ポジティブなウェルは、わずかに１つのニューロスフェアを含んだ。１
ウェルあたり１００〜３００個の細胞では、極まれなウェルが、単一のニューロ
スフェアを含んだ。ネガティブなウェルの対数を、１ウェル当たりにプレートし
た細胞の数に対してプロットした場合には、直線状の関数が見出された；３７％
のネガティブなウェルで、ＮＳ−ＩＣについて単一のヒットを決定した（図１０
Ａ）。図１０Ａに示される代表的な組織においては、コントロールの処理された
脳細胞は、８８０個の細胞中１個の頻度でＮＳ−ＩＣ活性を含んだ。ＡＣ１３３ ^- のサブセットにおいては、４８６０個の細胞中１個のＮＳ−ＩＣの頻度が減少
した。対照的に、ＮＳ−ＩＣ活性は、３２個の細胞中１個の頻度で、ＡＣ１３３ ⁺ のサブセットにおいて高度に富化された（図１０Ａ）。８つの異なるＦＢｒ組
織（１６〜２０の妊娠週）に由来するＮＳ−ＩＣの頻度を、図１０Ｂおよび表５
にまとめるように評価した。

【０１０３】

【表５】 ^*全ての選別された集団がまた、ＣＤ３４^-ＣＤ４５^-についてゲート（ｇａｔｅ
）され、これは９８〜９９％のＦＢｒを示す。^** 実際に算出されたＮＳ−ＩＣ頻度のような１回の試験を除外したデータは、括
弧中に示した。ほとんどのウェルがネガティブであったことに起因した。

【０１０４】 分画していない胎児の脳細胞においては、７３０個の細胞中の約１個が、ＮＳ
−ＩＣ活性を含む。＞９５％のＦＢｒを示すＡＣ１３３^-のサブセットは、ＮＳ
−ＩＣを有する４３００個の細胞中に＜１個を含み、そして従って、約６倍減少
された。対照的に、ＮＳ−ＩＣ活性は、ニューロスフェアを開始し得る新しいＦ
Ｂｒ細胞の約１／３１（１／６から１／７２の範囲）で、平均で、ＡＣ１３３⁺
サブセットにおいて２３倍富化された。ＡＣ１３３⁺細胞は、約４．６％のＦＢ
ｒを示した（すなわち、２２個の細胞のうちの１個）ので、ＮＳ−ＩＣ活性の富
化は実質的には、ＦＢｒ中のＡＣ１３３⁺細胞の頻度に相当した。従って、ＡＣ
１３３⁺細胞は、１６〜２０の妊娠週のＦＢｒ細胞懸濁物中の全ての検出可能な
ＮＳ−ＩＣ活性を含んだ。

【０１０５】 （単一のＡＣ１３３⁺に選別された細胞からの、クローンのニューロスフェア
の拡大、自己更新および分化）ニューロスフェアのクローナリティー（ｃｌｏｎ
ａｌｉｔｙ）を確認するために、単一のＦＢｒに由来するＡＣ１３３―に選別さ
れた細胞を、ＡＣＤＵによって９６ウェルプレートのウェル中に直接プレートし
た。８週間後、いくつかのウェルは、単一のニューロスフェアを含み、これらが
単一のＡＣ１３３⁺に選別された細胞に由来することを確認した（図１０Ｃ）。

【０１０６】 ＡＣ１３３⁺に由来するニューロスフェアの自己更新活性を、ニューロスフェ
アの培養を再度開始する能力について試験した。例えば、ＡＣ１３３⁺に選別さ
れたＦＢｒ細胞によって開始された最初のニューロスフェア培養物を解離させ、
そして１ウェル当たり１つの細胞として再度プレートした。９個の９６ウェルが
、単一のニューロスフェアの発達を示した。１つの試験においては、ニューロス
フェアは、ＡＣ１３３⁺に選別されたニューロスフェア細胞から約１０％の播種
効率を伴って、クローン的に（ｃｌｏｎａｌｌｙ）誘導された。結果として、Ａ
Ｃ１３３^-になるニューロスフェア細胞は、二次的なニューロスフェア培養を再
度開始することはできなかった。従って、これらの定量的な結果は、ＮＳ−ＩＣ
活性が、ＦＢｒ細胞のＡＣ１３３⁺のサブセットにおいては高度に富化され、そ
してＦＢｒ細胞のＡＣ１３３^-のサブセットにおいては除去されることを実証し
た。

【０１０７】 クローン的に誘導されたニューロスフェア細胞の分化能力を試験するために、
単一のニューロスフェアを回収し、プレートし、そして神経栄養因子であるＢＤ
ＮＦおよびＧＤＮＦの存在下で分化を誘導した。ニューロスフェア細胞を回収し
、そしてコラゲナーゼを用いて解離させ、そしてポリオルニチンでコーティング
したチャンバースライド上に置いた。これらを、ニューロスフェア開始培地中で
、それらがプレート上に播種されるまで１日間培養した。培養物を、Ｅｘ Ｖｉ
ｖｏ−１５，Ｎ２、ＮＡＣ、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ
／ｍＬ）およびラミニン（１ｇ／ｍＬ）から構成される分化培地に再度プレート
した。１〜２週間後、チャンバースライドをＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデ
ヒドで固定し、そしてニューロンおよび星状細胞への分化を検出するために、チ
ューブリンおよびグリア菌原繊維（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ）酸性タ
ンパク質（ＧＦＡＰ）に対するｍＡｂで染色した。

【０１０８】 これらの条件下では、ＡＣ１３３⁺に由来するニューロスフェアは、ニューロ
ンおよび星状細胞に分化した（図１０Ｄ）。まとめると、データは、ｍＡＢ Ａ
Ｃ１３３がＮＳ−ＩＣについてのマーカーであり、そしてヒトＣＮＳ−ＳＣにつ
いて富化するために使用され得ることを示唆する。これらのＡＣ１３３⁺に由来
するニューロスフェア培養物は、連続的に継代されている（凍結前に＞Ｐ１５）
。大まかな推定においては、ＡＣ１３３⁺細胞の絶対数は、５回の継代によって
少なくとも１０００倍に増大し（表６）、そしてこれらは、ニューロスフェアを
再現的に再度開始し得る。従って、ＡＣ１３３は、インビトロで連続的に拡大し
、そして自己更新する神経細胞の集団を規定する。

【０１０９】

【表６】 （ＮＳ−ＩＣもまた、５Ｅ１２⁺および８Ｇ１^-/lo細胞において富化される；
新規のｍＡｂの生成）利用可能なｍＡｂの有用性のスクリーニングと同時に、本
発明者らは、ヒトの神経細胞上の新規の細胞表面マーカーを同定しようとした。
ＦＢｒ細胞を、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼの組合せを用いて解離させ
、そして、組織特異的ｍＡｂを惹起するためのおとりの（ｄｅｃｏｙ）ストラテ
ジーを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用した。約１９００個
のウェルの増殖しつつあるハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、そしてハイ
ブリドーマを選択し、拡大し、そしてヒトの脳に対する特異的反応性についてさ
らに試験した。ヒトの神経細胞に対するモノクローナル抗体を、Ｙｉｎら、９０
Ｂｌｏｏｄ ５００２−１２（１９９７）によって以前に記載されたおとりの
免疫化ストラテジーを使用して産生した。簡潔には、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、お
とりのヒトの白血球を富化させた末梢血で１回のフットパッド（ｏｎｅ ｆｏｏ
ｔｐａｄ）において免疫し、そして酵素で解離させたヒトの胎児の脳細胞で反対
側にフットパッドした。ヒトＦＢｒ細胞免疫を排出させたドナーのリンパ節の細
胞を回収し、細胞懸濁物について処理し、そしてマウスの骨髄腫細胞株と融合さ
せた。マウスの骨髄腫株に対するこの融合は、１９００個のウェルの増殖しつつ
あるハイブリドーマ細胞を生じた。約１８０個のハイブリドーマを選択し、拡大
し、そしてヒトの脳細胞に対する特異的反応性についてさらに試験した。

【０１１０】 上記のように、ＣＮＳ−ＳＣを、ＡＣ１３３⁺サブセットにおいて高度に富化
した。ＣＮＳ−ＳＣの表現型をさらに特徴付けるために、本発明者らは、ＡＣ１
３３⁺細胞が表現型的には不均質であるかどうかを試験した。従って、ＡＣ１３
３⁺細胞を、新規のｍＡｂのパネルに由来する他のマーカーの同時発現について
スクリーニングした。２つの新規のｍＡｂである５Ｅ１２および８Ｇ１を、同定
した。Ｍａｂ ５Ｅ１２は、ＡＣ１３３⁺細胞および長期間のニューロスフェア
細胞を同時染色する。５Ｅ１２⁺ＦＢｒ細胞を富化し、そして５Ｅ１２^-細胞をＮ
Ｓ−ＩＣ活性において除去する（表５）。

【０１１１】 胎児の脳の発達においては、ＦＢｒ細胞の大部分（＞９０％）が、高レベルの
８Ｇ１マーカーを発現した（図４）。ＡＣ１３３⁺細胞は、８Ｇ１の発現におい
て不均質であった；ほとんどの８Ｇ１^-/lo、いくつかの８Ｇ１^mid、および数個
の８Ｇ１^hi細胞（図１２）。興味深いことに、長期間培養したヒトのニューロス
フェア細胞上での８Ｇ１の発現もまた、不均質であった。免疫沈降およびブロッ
キングの研究によって、８Ｇ１が抗ＣＤ２４ ｍＡｂであることを決定した。組
織学的には、ＣＤ２４は、熱安定性の抗原（ＨＳＡ）として公知であり、そして
血液のリンパ球産生においてマーカーとして広範に使用される（Ａｌｔｅｒｍａ
ｎら、２０ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９７−６０２（１９９０））。
ＨＳＡは、マウスのＨＳＣ上で低レベルで発現され（ＳｈｉｈおよびＯｇａｗａ
、８１ Ｂｌｏｏｄ １１５５−６０（１９９３））；Ｓｐａｎｇｒｕｄｅおよ
びＳｃｏｌｌａｙ、１８ Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．９２０−６（１９９０））
、そしてプロＢ細胞およびプレＢ細胞、ならびに胸腺細胞上で高レベルで発現さ
れ、そしてこれらの細胞が成熟リンパ球になる場合、完全に下方調節される（Ａ
ｌｔｅｒｍａｎら、２０ Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１５９７−６０２（１
９９０））。表５に示すように、ＮＳ−ＩＣの頻度は、ＡＣ１３３⁺ＣＤ２４^{mid /hi} のサブセットと比較して、ＡＣ１３３⁺ＣＤ２４^-/lo画分においてより高い。

【０１１２】 （ＡＣ１３３⁺に由来するヒトのニューロスフェア細胞の強力な植え付け能力
）ヒトの選別され／拡大されたＣＮＳ−ＳＣの、インビボでの移植、移動、およ
び分化の能力を試験するために、１０⁵個または１０⁶個のニューロスフェア細胞
（ＡＣ１３３⁺に選別されたＦＢｒ細胞から開始された）を、新生児のＮＯＤ−
ＳＣＩＤマウスの脳の側方の脳室に注射した。

【０１１３】 ６〜１０の継代で拡大したＡＣ１３３＋に選別されたニューロスフェア細胞を
回収し、そして細胞の小さなクラスターを得るためにコラゲナーゼで穏やかに乖
離させた。細胞を、０．２５×１０⁵または２．５×１０⁵／Ｌの等量で再懸濁し
た。新生児のマウス（＜生後２４時間）を、氷を使用して低温麻酔した；一旦麻
酔がかかると、定位的なデバイス上に新生児を置いた。小さな穴を針で軟骨にド
リルで穴をあけ、そして細胞懸濁物を、両方の側方の脳室のスペースにＨａｍｉ
ｌｉｔｏｎシリンジによって導入した。新生児のマウスを、１０⁵〜１０⁶個の細
胞／注射の範囲の細胞の２１個を用いて注射した。新生児を、外科手術の回復に
ついてモニターするために暖めることによって観察し、次いで、母親に返した。
注射したマウスを、ヒトの細胞の植え付け（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）を試験す
る前に７ヶ月間維持した。

【０１１４】 新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、神経学的な系に注射される細胞の参加を
最大にするためのレシピエントとして選択した。なぜなら、細胞の形成が、新生
児のマウスの脳のいくつかの部分における進行において、なお活性であるからで
ある。さらに、免疫不全マウスは、ヒトの組織を拒絶せず、そしてＳＣＩＤおよ
びＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、ヒトの血球形成および組織の植え付けのインビボ
での研究のための宿主として使用されている（ＭｃＣｕｎｅら、２４１ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ １６３２−９（１９８８）；Ｋａｍｅｌ−ＲｅｉｄおよびＤｉｃｋ、
２４２ Ｓｃｉｅｎｃｅ １７０６−９（１９８８）；Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅら
、２ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３２９−３７（１９９６））。移植の７ヶ月後、動物
を屠殺し、そして矢状方向の切片を、Ｎ−ＣＡＭおよびＴｈｙ−１、ならびにヒ
ト核抗原に対するヒト特異的ｍＡｂで染色した。

【０１１５】 移植の７ヶ月後に、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、Ａｖｅｒｔｉｎで深く麻酔し
、そしてＰＢＳで灌流し、続いてリン酸緩衝液中の４％のパラホルムアルデヒド
で灌流した。その後、脳を、一晩固定し、３０％のスクロース溶液中に置き、そ
してＯＣＴ化合物中で凍結させた。脳を、さらなる免疫組織化学のために５μｍ
の厚みに矢状方向に切断した。移植されたマウスの脳中のヒト細胞を検出するた
めに、切片を、ヒトＴｈｙ−１に対するマウスのモノクローナル抗体（Ｐｈａｅ
ｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｎ−ＣＡＭに対するモノクローナ
ル抗体、チューブリンに対するモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）、または核抗
原に対するモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で、続いて、Ａｌｅｘａ
４８８に結合させたヤギ抗マウスＩＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕ
ｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色した。

【０１１６】 マウスの脳のコントロールに対するこれらのｍＡｂの染色は、交差反応性を示
さなかった。ＧＦＡＰおよびβ−チューブリンに対するＭａｂは、ヒトおよびマ
ウスの細胞の両方を染色し、そして抗ヒト核抗体でのこのような二重の標識を、
ヒトの系統特異的細胞の集団を実証するために使用した。詳細な分析は、特に、
活性な神経形成の部位であることが以前に示されている脳の２つの部位（側方の
脳室の脳室下の領域（ＳＶＺ）、および海馬の歯状回）に集中した（図１２Ａ）
。

【０１１７】 ヒトの細胞は、マウスの脳全体にわたって見出され、そして注射の７ヶ月後に
、ＳＶＺにおいて豊富であった（図１２）。例えば、１つの領域においては、ヒ
トの核⁺である多くの細胞を、ＧＦＡＰ⁺細胞によって取り囲んだ（図１２Ｂ）。
コンフォーカルな顕微鏡試験は、ヒトの細胞のほとんどが、ＧＦＡＰ^-であるが
、時折、ヒトのＧＦＡＰ⁺細胞もまた検出されたことを示した（図１２Ｂ、矢印
）。

【０１１８】 移植されたマウスの脳を、ミクロトーム上で４０マイクロメートルの厚みの切
片にし、そしてｍＡｂで染色し、そしてＳｕｈｏｎｅｎら、３８３ Ｎａｔｕｒ
ｅ ６２４−７（１９９６）によって以前に記載されているように、Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄコンフォーカル散乱光顕微鏡を使用して分析した。

【０１１９】 ＳＶＺ中の幹細胞／始原細胞が持続的な増殖を示しているので、本発明者らは
、移植されたヒトのＡＣ１３３⁺に選別され／拡大されたニューロスフェア細胞
の子孫がなお増殖しているかどうかを、インサイチュで試験した。移植された脳
の１つの切片を、細胞増殖に関連するマーカーであるＫｉ６７で染色した。著し
く、ＧＦＡＰ⁺細胞中に入れ子（ｎｅｓｔ）にされたＳＶＺ中のヒトの細胞のク
ラスターは、Ｋｉ−６７を同時発現し、このことは、ＳＶＺ中のヒトの細胞が、
それらのマウスの対応する部分と同様に、ＳＶＺ中での移植後７ヶ月間増殖し続
けることを示した（図１２Ｃ）。

【０１２０】 げっ歯類の嗅覚の系においては、ＳＶＺ中で増殖した幹細胞／始原細胞の子孫
は、吻方の移動性の流れ（ｒｏｓｔｒａｌ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｓｔｒｅａｍ
）（ＲＭＳ）に入り、そして嗅球に移動する（ＬｏｉｓおよびＡｌｖａｒｅｚ−
Ｂｕｙｌｌａ、２６４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４５−８（１９９４））。ＲＭＳ
中の内因性のげっ歯類の先祖の「神経芽細胞の鎖」は、β−チューブリンおよび
Ｎ−ＣＡＭを発現する（Ｆｒｉｃｋｅｒら、１９ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５９
９０−６００５（１９９９）；ＧａｇｅおよびＣｒｉｓｔｅｎ、Ｉｓｏｌａｔｉ
ｏｎ、ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ＣＮＳ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ
ｇ，１９９７））。ＲＭＳを含有している矢状方向の切片を、ヒトの神経細胞の
存在について試験した。ＡＣ１３３⁺に選別されたニューロスフェア細胞を移植
したマウスにおいては、多数のヒト細胞が検出され、これはＳＶＺで開始し、そ
してＲＭＳ全体に拡大している（図１３Ａ）。これらのクラスターを形成するヒ
ト細胞の多くは、β−チューブリンと同時に局在するがこのようなクラスター中
で二重ポジティブの細胞を同定することは困難であった。数個のヒト細胞を含有
している組織の注意深い試験によって、β−チューブリンおよびヒト核抗原の両
方について二重ポジティブである複数の細胞が明らかになった（図１３Ｂ、矢印
）。さらに、ＲＭＳ中のこれらの細胞の多くは、ヒト特異的マーカーであるＮ−
ＣＡＭを発現した（図１３Ｃ）。

【０１２１】 ＲＭＳを通じる移動の後、幹／始原細胞の子孫は、嗅球に侵入し、そして嗅覚
の糸球体に向かって嗅球のペリ糸球体（ｐｅｒｉｇｌｏｍｅｌｕｌａｒ）層にま
で拡大すると予期される（ＬｏｉｓおよびＡｌｖｅｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ、２６
４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４５−８（１９９４））。図１３Ｄに示すように、移
植されたヒト細胞の子孫は、糸球体ならびにペリ糸球体層に分布した。これらの
細胞のいくつかは、ヒトのＮ−ＣＡＭを発現し、このことは、これらの細胞が神
経系統に拘束されていたことを示す。従って、移植された、選別され／拡大され
たヒトのＣＮＳ−ＳＣの子孫は、ＲＭＳに移動し、分布し、そして嗅球中の神経
系統に分化する。いくつかの例においては、チロシンヒドロキシラーゼポジティ
ブであるヒト細胞が観察された。

【０１２２】 神経形成が成体の生活において起こる別の部位は、海馬の歯状回である（Ｇａ
ｇｅら、９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１８７９−
８３（１９９５））。この実施例においては、本発明者らは、海馬の歯状回にお
いて多数のヒト核細胞を見出した。やや顆粒状の細胞（ｓｕｂｇｒａｎｕｌａｒ
ｃｅｌｌ）帯中のヒトの細胞でいくつかは、Ｋｉ−６７を同時発現し、このこ
とは、これらの細胞が移植の７ヶ月後に増殖することがなお可能であることを示
す（図１４Ａ）。異なる分析においては、いくつかの他のヒト細胞は、海馬の門
に向かって拡大するそれらのプロセスを有する、顆粒状のニューロンを発達させ
ることが予期されるような、β−チューブリンであった（図１４Ｂ）。これらの
結果は、これらの選別され／拡大されたヒトのＣＮＳ−ＳＣ移植片が、移動し、
増殖しつづけ、そして分化するだけではなく、それらの挙動および細胞の運命も
また、部位特異的様式において宿主の合図によって調節することを示す。注射さ
れた細胞は、腫瘍を形成しない。

【０１２３】 （考察）この実施例の目的は、候補のヒトＣＮＳ−ＳＣの予想される単離を可
能にする、ヒトの脳細胞上の表面マーカーを見出すことであった。本発明者らは
、ヒトのニューロスフェア培養物が、ＣＮＳ−ＳＣからクローン的に開始され得
ると仮定し、そして新しいヒトのＦＢｒ細胞懸濁物からＮＳ−ＩＣを単離にする
ことに着手した。本発明者らは、１６〜２０ｇ．ｗ．のヒトのＦＢｒ細胞がまれ
にクローン原性のＡＣ１３３⁺、５Ｅ１２⁺、８Ｇ１^-/loＣＤ３４^-ＣＤ４５^-細胞
のサブセットを含むことを実証した。このサブセットは、ニューロスフェアの培
養を開始し得、これらの培養物中で広範囲にわたって自己更新し得、そしてニュ
ーロンおよびグリアにインビトロで分化し得る。免疫不全の新生児のマウスの側
方の脳室への移植の際には、これらの細胞は、少なくとも７ヶ月間植え付け（ｅ
ｎｇｒａｆｔ）、そして分化し、移動し、そしてそのいくつかは増殖し続ける、
子孫を生じる（すなわち、ＳＶＺおよび歯状回中でのＫｉ−６７⁺のヒトの神経
細胞の存在）。植え付けされたヒトの細胞は、それらが、同じ事象を受けた内因
性のマウスの神経細胞に対応する部位中に見出される。

【０１２４】 図１０および表５中のデータは、ヒトの胎児の脳中にＡＣ１３３⁺サブセット
の外側には他の検出可能なＮＳ−ＩＣ細胞が存在しないことを実証する。

【０１２５】 ＡＣ１３３染色パターンの分析の間には、本発明者らは、約０．２％のＦＢｒ
細胞がＣＤ３４を発現し、そしてＡＣ１３３⁺ＣＤ３４^-である細胞に接着したま
まであることに注目した。これらのＣＤ３４⁺細胞は、既知の内皮細胞マーカー
であるＣＤ１０５およびＣＤ３１を同時に発現し、そしてトリプシン処理後にも
、塊の培養物中に高密度で配置された場合に、いくつかのニューロスフェアから
非効率的に形成され得る細胞の複合体として残っていた。本発明者らは、ＣＤ３
４を発現する細胞についてのポジティブな選択の後、同様に複合体を観察した。
従って、ＡＣ１３３⁺ＣＮＳ−ＳＣおよび天然に存在するＣＤ３４⁺内皮細胞の頻
繁な連合が存在する。ＡＣ１３３⁺ＣＮＳ−ＳＣが血管周囲にあるという知見は
、神経形成が、血管形成と同時に進行するという仮説に一致する。

【０１２６】 候補のヒト胎児のＣＮＳ−ＳＣが、新生児のマウスの側方の脳室中への注射後
に植え付けし、そしてマウスの脳全体にわたって拡大することは、驚くべきこと
である。これはマウスの持続的な神経形成の段階であるが、これらの細胞が分布
する程度は、当業者が予期したよりも大きい。詳細には、ヒトの細胞は、脳室の
空間に隣接して、海馬中、大脳皮質中、脳梁中、ならびに脳の小脳の領域に見出
された（図１１）。さらに、細胞は、ＳＶＺ（自己更新しそして複製する領域）
においておよびＲＭＳ（分化および移動の領域）沿っての両方で、ならびに嗅球
内および嗅覚の糸球体周辺に直接、見出される。従って、注射されたヒトＣＮＳ
−ＳＣは、これらの部位で神経形成のプロセスを継続している。

【０１２７】 Ｓｙｎｄｅｒらは、ｖ−ｍｙｃで固定したマウスおよびヒトの神経細胞株を使
用して、細胞のこの広範な（「全体的な」）分布を実証した（Ｙａｎｄａｖａら
、９６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７０２９−３４（１
９９９））。本明細書中では、本発明者らは、これが、マウス起源のｍｙｃ固定
された細胞の特性だけではなく、非遺伝的に改変されたヒトのＣＮＳ−ＳＣの特
性でもあることを示す。

【０１２８】 奇形癌細胞の移植とは対照的に（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉら、１２２ Ｅｘｐ
Ｎｅｕｒｏｌ ２８３−９４（１９９３））、ＣＮＳ−ＳＣ細胞は、完全に許
容性の微環境中での注射の７ヶ月後に試験した場合でさえも、腫瘍性凝集物また
は増殖性凝集物を形成しない。従って、ＣＮＳ−ＳＣ細胞は、腫瘍遺伝子の機能
によって改変されていないヒトの神経系、またはすでに腫瘍性に形質転換された
細胞株において本来備わっている発生的経路および機能的経路を明らかにし得る
。ＣＮＳ−ＳＣの単離は、以下の科学的な発見のためのいくつかの機会を提供す
る：（ｉ）特定の段階または分化の細胞に由来する系統を直接描写すること；（
ｉｉ）ＣＮＳ−ＳＣの遺伝子発現プロフィールおよびインビトロまたはインビボ
でそれらのすぐ下流の子孫を得ること；（ｉｉｉ）細胞の特異的な遺伝子の改変
がそれらの植え付け、移動、分化、および／または機能的な組込みを可能にする
かどうかを試験すること。ヒトのＣＮＳ幹細胞の単離は、それらの移植可能性、
分化能力、および腫瘍形成の欠失についての前臨床試験としての、ヒトの疾患の
マウスのアナログにおいてこれらの細胞の移植を可能にする。

【０１２９】 上記の記載は、説明の目的のためのみに示されており、そして、開示される正
確な形態に本発明を限定するようには意図されないが、本明細書中に添付される
特許請求の範囲によって限定されるように意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＮＳ−ＩＣの増殖および分化を説明する図である。

【図２】 図２は、ニューロスフェアの培養が、単一の細胞に選別された５Ｆ３⁺細胞か
ら開始され得ることを示す一連の写真である。

【図３】 図３は、モノクローナル抗体５Ｅ１２を使用する細胞表面マーカーを使用する
、ヒトのＣＮＳ神経幹細胞の単離を示す、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）デー
タのドットプロットである。ｘ軸は、ＣＤ３４およびＣＤ４５に対する抗体につ
いての細胞の染色を示す。ｙ軸は、５Ｅ１２抗体での細胞の染色を示す。

【図４】 図４は、細胞表面マーカーによるヒトの神経幹細胞の単離を示す、ＦＡＣＳ選
別データの２つのパネルのドットプロットである。ヒトの胎児の脳の細胞を、記
載されているように酵素的に解離した。パネルＡは、５Ｆ３⁺細胞が、５Ｅ１２
抗体についての抗原を同時発現することを示す。パネルＢは、５Ｆ３⁺細胞が、
代表的には、８Ｇ１（ＣＤ２４）抗体についての抗原を発現しないことを示す。

【図５】 図５は、妊娠週数の関数としての、胎児の脳中の５Ｆ３⁺細胞の分布を示すチ
ャートである。

【図６】 図６は、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスへのヒトの神経細胞の移植の結果を示す、一
連の写真である。

【図７】 図７は、げっ歯類モデルに移植された場合に、５Ｆ３⁺に選別された細胞の子
孫が吻方の移動性の流れ（ＲＭＳ）を通じて移動することを示す、一連の写真で
ある。

【図８】 図８は、げっ歯類モデルに移植された場合に、５Ｆ３⁺に選別された細胞の子
孫が嗅球中に（ＲＭＳ）を通じて移動することを示す、一連の写真である。

【図９】 図９は、ＡＣ１３３＋細胞の特徴を示す。図９Ａは、ＡＣ１３３の発現に基づ
く新しい胎児の脳細胞のフローサイトメトリーによる分離である。ヒトの胎児の
脳細胞を、酵素的に解離した。細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＡＣ１３３
に対するｍＡｂで染色し、そしてＡＣ１３３^-画分およびＡＣ１３３⁺画分に分離
した。残りの造血性の細胞および内皮細胞を、ＣＤ４５^-およびＣＤ３４^-をそれ
ぞれ通過させることによって、排除した。選別されたＡＣ１３３^-（図９Ｂ）お
よびＡＣ１３３⁺（図９Ｃ）のサブセットを、血清を含有していない培地中で培
養し、そしてこれらの選別された細胞の増殖を、１５日間モニターした。

【図１０】 図１０は、限界稀釈および単一の細胞の選別による、ＮＳ−ＩＣ活性の定量的
な分析を示す。図１０Ａは、細胞選別後の限界稀釈分析による、ＮＳ−ＩＣ活性
の定量的な分析である。選別された細胞を、ＦＡＣＳ−ＡＣＤＵによって９６ウ
ェルプレート中に一連の限界細胞容量で配置した。図１０Ｂは、神経幹細胞／始
原細胞のクローンの拡大を示す。ニューロスフェアは、胎児の脳から直接単離さ
れた単一の選別されたＡＣ１３３⁺細胞に、または選別され／拡大された培養さ
れたニューロスフェアに由来する単一のＡＣ１３３⁺細胞に由来し得る。図１０
Ｃは、クローンに由来するニューロスフェア細胞の分化能力を示す。単一の細胞
に由来するニューロスフェアの子孫は、ニューロン（−チューブリン、緑）、お
よび星状細胞（ＧＦＡＰ、赤）に分化され得る。

【図１１】 図１１は、非神経形成性部位中のヒトの神経細胞の検出を示す。いくつかの場
合においては、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの新生児の脳に注入されたヒトの神経細
胞が、脳梁、大脳皮質、および小脳において検出された。

【図１２】 図１２は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのＳＶＺ中に移植されたヒトのニューロス
フェア細胞の子孫の、インビボでの長期間の増殖を示す。ＡＣ１３３⁺に選別さ
れ／拡大されたヒトのニューロスフェア細胞は、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウ
スの側方の脳室に移植された。ヒトの細胞の移植片を、移植から７ヶ月後に分析
した。図１２Ａは、成体のマウスの脳の模式図である。ヒトの細胞の移植片が評
価された部位を、図に示す。ＳＶＺ、脳室下の領域；ＲＭＳ（吻方の移動性の流
れ）。図１２Ｂは、ＳＶＺ中でのヒトの神経細胞の検出を示す。移植されたマウ
スの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核抗原（ＦＩＴＣ、緑）およびＧＦＡＰ（Ｃ
ｙ−５、青）で染色した。図１２Ｃは、ＳＶＺ中での増殖しつつあるヒトの神経
細胞の検出を示す。移植されたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核抗原（
ＦＩＴＣ、緑）、Ｋｉ６７（Ｃｙ−３、赤）、およびＧＦＡＰ（Ｃｙ−５、青）
で染色した。ＳＶＺ中のヒト核抗原ポジティブ細胞のほとんどはまた、増殖マー
カーであるＫｉ６７を同時発現した。

【図１３】 図１３は、ＲＭＳおよび嗅球に移植されたヒトのニューロスフェア細胞の、イ
ンビボでの移動および分化を示す。ＡＣ１３３⁺に選別され／拡大されたヒトの
ニューロスフェア細胞を、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤの側方の脳室に移植した。
ヒトの細胞の移植片を、移植から７ヶ月後に分析した。図１３Ａは、ＡＣ１３３ ⁺ 選別され／拡大されたニューロスフェア細胞の子孫がＲＭＳを通じて移動する
ことを示す。ＲＭＳにおいては、ヒト核抗原⁺細胞の整列もまた、Ｈｏｅｃｈｓ
ｔ３３２３４カウンター染色でポジティブ（ピンク）であった（ｉ）。ＲＭＳ中
のヒトの核抗原ポジティブ細胞（Ｃｙ−３、赤）は、β−チューブリンの発現（
Ａｌｅｘｉａ ４８８、緑）と共局在化された（ｉｉ）。これらの細胞のいくつ
かは、明らかに二重ポジティブであった（ｉｉ、矢印）。別の切片においては、
ＲＭＳ中の細胞を、ヒト特異的Ｎ−ＣＡＭ（ＦＩＴＣ、緑）およびＧＦＡＰ（Ｃ
ｙ−５、青）で染色した（ｉｉｉ）。図１３Ｂは、嗅球へのヒトの神経細胞の移
動および分化を示す。嗅球においては、ヒト核抗原ポジティブ細胞は、嗅球の糸
球体層中に分布された（ｉおよびｉｉ）。いくつかの場合においては、ヒトのＮ
−ＣＡＭ⁺ニューロン細胞を検出した（ｉｉｉ）。

【図１４】 図１４は、海馬の歯状回中に移植されたヒトのニューロスフェア細胞の子孫の
、インビボでの長期間の増殖および分化を示す。ＡＣ１３３⁺によって選別され
／拡大されたヒトのニューロスフェア細胞を、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス
の側方の脳室に移植した。ＡＣ１３３⁺に選別され／拡大されたヒトのニューロ
スフェア細胞の新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの側方の脳室への移植の７ヶ月
後に、増殖しているヒトの細胞が、海馬において見出され得る。図１４Ａは、歯
状回の顆粒状の領域の下での増殖しているヒトの神経細胞の検出を示す。移植さ
れたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核（ＦＩＴＣ、緑）、Ｋｉ６７（Ｃ
ｙ−３、赤）、およびＧＦＡＰ（Ｃｙ−５、青）で染色した。いくつかのヒト核
抗原⁺細胞を、Ｋｉ６７で同時に染色した（矢印）。図１４Ｂは、歯状回でのヒ
トのニューロンの検出を示す。移植されたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒ
ト核抗原（Ｃｙ−３、赤）、および抗チューブリン（Ａｌｅｘｉａ４８８、緑）
で染色した。２つのヒト核抗原ポジティブ細胞の１つもまた、抗チューブリンに
ついてポジティブであった（矢印）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/18 Ａ６１Ｐ 25/24 25/24 25/28 25/28 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (31)優先権主張番号 ６０／１６８，４０７ (32)優先日 平成11年12月１日(1999．12．1) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウェイスマン， アービング アメリカ合衆国 カリフォルニア 94062， レッドウッド シティー， ジェファー ソン アベニュー 4147 Ｆターム(参考） 4B063 QA05 QA18 QQ08 QR48 QR69 QS24 4B065 AA90 BA25 BB23 BB32 BB34 CA44 4C087 AA01 AA02 AA05 BB45 BB64 NA14 ZA02 ZA06 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA94 ZB21

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ニューロスフェア（ＮＳ−ＩＣ）を開始し得るヒトの中枢神
   経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団を産生するための
   、方法であって、以下： （ａ）神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクロー
   ナル抗体ＡＣ１３３またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞
   表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程；および （ｂ）該試薬と工程（ａ）の細胞の表面上の該決定基との間で接触している細
   胞について選択して、ＣＮＳ−ＳＣについて高度に富化された集団を産生する工
   程、 包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記試薬が、モノクローナル抗体ＡＣ１３３によって認識さ
   れる前記細胞表面マーカー上の決定基を認識する抗体である、請求項１に記載の
   方法。
3. 【請求項３】 前記試薬が、ＡＣ１３３モノクローナル抗体またはポリクロ
   ーナル抗体である、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記試薬が、ＡＣ１３３抗体または５Ｅ１２抗体によって認
   識される前記細胞表面マーカーに対して結合するリガンドまたは低分子である、
   請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記試薬が、５Ｅ１２モノクローナル抗体によって認識され
   る前記細胞表面マーカー上の決定基を認識する抗体である、請求項１に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 前記試薬が、５Ｅ１２モノクローナル抗体またはポリクリロ
   ーナル抗体である、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記試薬が蛍光色素を結合されている、請求項１に記載の方
   法。
8. 【請求項８】 前記試薬が磁気粒子に対して結合されている、請求項１に記
   載の方法。
9. 【請求項９】 前記選択工程がフローサイトメトリーによる、請求項１に記
   載の方法。
10. 【請求項１０】 前記選択工程が、蛍光活性化細胞選別または高勾配磁気選
    択による、請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記選択工程が、物理的陽性選択デバイスによる、請求項
    １に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集
    団が、神経組織を生じる任意の組織から得られる、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集
    団が、神経組織から解離されている、請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集
    団が、胎児の脳、成体の脳、胎児の脊髄、または成体の脊髄に由来する、請求項
    １に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集
    団が、神経細胞培養物から得られる、請求項１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集
    団が、ニューロスフェア培養物または付着性の単層から得られる、請求項１に記
    載の方法。
17. 【請求項１７】 請求項１に記載の方法であって、 （ｃ）前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、ＣＤ４
    ５抗原に結合する試薬と接触させる工程；および （ｄ）該細胞と、前記モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクロ
    ーナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する
    試薬との間で接触している細胞について選択し、そして該細胞と該ＣＤ４５抗原
    に結合する試薬との間での減少した接触について選択する工程であって、その結
    果、ＡＣ１３３⁺ＣＤ４５^-である細胞、または５Ｅ１２⁺ＣＤ４５^-である細胞、
    またはＡＣ１３３⁺５Ｅ１２⁺ＣＤ４５^-である細胞が選択される、工程、 をさらに包含する、方法。
18. 【請求項１８】 請求項１に記載の方法であって、以下： （ｃ）前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、ＣＤ４
    ５抗原に結合する試薬と接触させる工程； （ｄ）該神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、ＣＤ３４
    抗原に結合する試薬と接触させる工程；および （ｅ）該細胞と、前記モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクロ
    ーナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する
    試薬との間で接触している細胞について、ならびに該細胞と該ＣＤ４５抗原に結
    合する試薬との間、および該細胞と該ＣＤ３４抗原に結合する試薬との間での減
    少した接触について選択する工程であって、その結果、ＡＣ１３３⁺ＣＤ４５^-Ｃ
    Ｄ３４^-である細胞、または５Ｅ１２⁺ＣＤ４５^-ＣＤ３４^-である細胞、またはＡ
    Ｃ１３３⁺５Ｅ１２⁺ＣＤ４５^-ＣＤ３４^-である細胞が選択される、工程、 をさらに包含する、方法。
19. 【請求項１９】 請求項１に記載の方法であって、以下： （ｃ）前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノク
    ローナル抗体８Ｇ１によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する
    試薬と接触させる工程； （ｂ）該細胞と、前記モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクロ
    ーナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する
    試薬との間で接触している細胞について、ならびに該細胞と該モノクローナル抗
    体８Ｇ１によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間
    での減少した接触について選択する工程であって、その結果、ＡＣ１３３⁺８Ｇ
    １^-/loである細胞、または５Ｅ１２⁺８Ｇ１^-/loである細胞、またはＡＣ１３３⁺ ５Ｅ１２⁺８Ｇ１^-/loである細胞が選択される、工程、 をさらに包含する、方法。
20. 【請求項２０】 集団のニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）
    の画分について神経細胞の集団を富化するための方法であって、以下： （ａ）ＮＳ−ＩＣの画分を含む、神経細胞または神経に由来する細胞を含有す
    る集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３またはモノクローナル抗体５Ｅ１２に
    よって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と混合する工程；
    および （ｂ）ＡＣ１３３⁺および／または５Ｅ１２⁺細胞について選択する工程であっ
    て、ここで、ＡＣ１３３⁺または５Ｅ１２⁺細胞は、該神経細胞の集団と比較した
    場合に、該ＮＳ−ＩＣの画分が富化されている、工程、 を包含する、方法。
21. 【請求項２１】 ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を同定
    するための方法であって、 （ａ）神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクロー
    ナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識さ
    れる細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程；および （ｂ）該神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団の細胞と、該
    モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によ
    って認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間での接触を検
    出する工程であって、ここで、ＡＣ１３３⁺または５Ｅ１２⁺であるとの細胞の同
    定により、ＮＳ−ＩＣとして細胞を同定する、工程、 を包含する、方法。
22. 【請求項２２】 ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を単離
    するための方法であって、以下： （ａ）ＮＳ−ＩＣの画分を含む、神経細胞または神経に由来する細胞を含有す
    る集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５
    Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と混合す
    る工程； （ｂ）ＡＣ１３３⁺または５Ｅ１２⁺細胞を選択する工程であって、ここで、該
    選択されたＡＣ１３３⁺細胞または５Ｅ１２⁺細胞は、該神経細胞の集団と比較し
    た場合に、該ＮＳ−ＩＣの画分において富化される、工程； （ｃ）ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地に、少なくとも１つのＡＣ１３
    ３⁺細胞または５Ｅ１２⁺細胞を導入する工程；および （ｄ）該培養培地中で該ＡＣ１３３細胞⁺または該５Ｅ１２⁺細胞を増殖させる
    工程、 を包含する、方法。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法によって産生された、細胞の集団
    。
24. 【請求項２４】 前記ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地が、多能性の
    神経幹細胞の増殖を誘導しそして／または可能にするために有効な、１つ以上の
    予め決定された増殖因子を含有する無血清培地を含む、請求項２２に記載の方法
    。
25. 【請求項２５】 前記ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地が、さらに、
    白血球阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因
    子（ＦＧＦ−２）、およびそれらの組合せからなる群より選択される増殖因子を
    含む、請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地が、神経生存
    因子（ＮＳＦ）をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物： （ａ）ＡＣ１３３⁺ＣＤ４５^-細胞、または５Ｅ１２⁺ＣＤ４５^-細胞において富
    化された集団；および （ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
28. 【請求項２８】 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物： （ａ）ＡＣ１３３⁺ＣＤ４５^-ＣＤ３４^-細胞、または５Ｅ１２⁺ＣＤ４５^-ＣＤ
    ３４^-細胞において富化された集団；および （ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
29. 【請求項２９】 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物： （ａ）ＡＣ１３３⁺８Ｇ１^-/lo細胞、または５Ｅ１２⁺８Ｇ１^-/lo細胞において
    富化された集団；および （ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
30. 【請求項３０】 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物： （ａ）ＡＣ１３３⁺８Ｇ１^hi細胞、または５Ｅ１２⁺８Ｇ１^hi細胞において富化
    された集団；および （ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
31. 【請求項３１】 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物： （ａ）ネスチンについてポジティブに染色し、そして分化を誘導する条件の存
    在下で、ニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞に分化する子孫細胞を産生
    する、少なくとも５０％のＡＣ１３３⁺、または５Ｅ１２⁺ニューロスフェア開始
    細胞（ＮＳ−ＩＣ）を含有する集団；ならびに （ｂ）ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培地。
32. 【請求項３２】 ＮＳ−ＩＣが付着される固体支持体をさらに含有する、請
    求項３１に記載の組成物。
33. 【請求項３３】 前記細胞の集団が、少なくとも７０％のＡＣ１３３⁺細胞
    または５Ｅ１２⁺細胞を有する、請求項３１に記載の組成物。
34. 【請求項３４】 前記細胞の集団が、少なくとも９０％のＡＣ１３３⁺細胞
    または５Ｅ１２⁺細胞を有する、請求項３１に記載の組成物。
35. 【請求項３５】 前記ＡＣ１３３⁺細胞または５Ｅ１２―細胞の集団が、実
    質的に純粋な集団である、請求項３１に記載の組成物。
36. 【請求項３６】 前記培地が、多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するために
    有効な、１つ以上の予め決定された増殖因子を含有する無血清培地を含む、請求
    項３１に記載の組成物。
37. 【請求項３７】 前記培地が、さらに、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増
    殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびそれらの
    組合せからなる群より選択される増殖因子を含む、請求項３１に記載の組成物。
38. 【請求項３８】 前記培地が、さらに、神経生存因子を含む、請求項３１に
    記載の組成物。
39. 【請求項３９】 前記ＮＳ−ＩＣがヒトＮＳ−ＩＣである、請求項３１に記
    載の組成物。
40. 【請求項４０】 ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を特徴
    付けるための方法であって、以下： （ａ）単離されたＡＣ１３３⁺細胞または５Ｅ１２⁺細胞を、ＮＳ−ＩＣの増殖
    を支持し得る培養培地に対して導入する工程； （ｂ）該培養培地中で該ＡＣ１３３⁺細胞または５Ｅ１２⁺細胞を増殖させる工
    程； （ｃ）該単離されたＡＣ１３３⁺細胞または５Ｅ１２⁺細胞がニューロン、星状
    細胞、および稀突起膠細胞に分化する条件下で、該単離されたＡＣ１３３⁺細胞
    または５Ｅ１２⁺細胞の子孫を培養する工程；ならびに （ｄ）ニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞の存在を検出する工程であ
    って、ここで、ニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞の存在は、該単離さ
    れたＡＣ１３３⁺細胞または５Ｅ１２⁺細胞をＮＳ−ＩＣとして特徴付ける、工程
    、 を包含する、方法。
41. 【請求項４１】 前記単離されたＡＣ１３３⁺細胞または５Ｅ１２⁺細胞の子
    孫がニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞に分化する前記条件が、ウシ胎
    児血清（ＦＢＳ）を含有し、そして有糸分裂促進性の増殖因子を含有しない培養
    培地中、ラミニンでコーティングされた表面上で、該単離されたＡＣ１３３⁺ま
    たは５Ｅ１２⁺細胞の子孫を培養することを含む、請求項４０に記載の方法。
42. 【請求項４２】 ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）の増殖
    に影響を与える増殖因子の存在を同定するための方法であって、該方法は、以下
    ： （ａ）ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える少なくとも１つの増殖因子を含有する
    と予想される組成物を、ＮＳ−ＩＣを含有している組成物と混合する工程であっ
    て、ここで、該ＮＳ−ＩＣは、ＡＣ１３３⁺または５Ｅ１２⁺、ネスチン⁺として
    特徴付けられ、そしてニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞系統に分化し
    得る、工程；ならびに （ｂ）該組成物中の少なくとも１つの増殖因子の存在の関数として、該ＮＳ−
    ＩＣの増殖を決定する工程であって、ここで、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える
    少なくとも１つの増殖因子を含有していると予想される組成物と接触させていな
    いＮＳ−ＩＣの増殖と比較した場合に、変化したＮＳ−ＩＣの増殖は、ＮＳ−Ｉ
    Ｃの増殖に影響を与える増殖因子の組成物中の存在を示す、工程、 を包含する、方法。
43. 【請求項４３】 前記増殖因子が神経生存因子である、請求項４２に記載の
    方法。
44. 【請求項４４】 哺乳動物への移植のための、ニューロスフェアを開始し得
    る（ＮＳ−ＩＣ）ヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富
    化された集団の、使用。
45. 【請求項４５】 前記集団が、培養培地中で増殖させられた、請求項４３に
    記載の使用。
46. 【請求項４６】 前記集団が、フローサイトメトリーによって選択された、
    請求項４３に記載の使用。
47. 【請求項４７】 前記集団が、単離されたＮＳ−ＩＣを含む、請求項４３に
    記載の使用。
48. 【請求項４８】 前記移植が、中枢神経系に対してである、請求項４３に記
    載の使用。
49. 【請求項４９】 前記移植が、哺乳動物の中枢神経系の外側の領域に対して
    である、請求項４３に記載の使用。
50. 【請求項５０】 中枢神経系の障害のための医薬品の製造における、ニュー
    ロスフェアを開始し得る（ＮＳ−ＩＣ）ヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−Ｓ
    Ｃ）について高度に富化された集団の、使用。
51. 【請求項５１】 造血性障害のための医薬品の製造における、ニューロスフ
    ェアを開始し得る（ＮＳ−ＩＣ）ヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）に
    ついて高度に富化された集団の、使用。