JP2002536014A

JP2002536014A - ポリケチドシンターゼモジュールの有効性を媒介する方法

Info

Publication number: JP2002536014A
Application number: JP2000598624A
Authority: JP
Inventors: ラジェシュエス．ゴカーレ，; スチュアートワイ．ツジ，; チャイタンコースラ，
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1999-02-09
Filing date: 2000-02-09
Publication date: 2002-10-29
Also published as: WO2000047724A2; CA2359801A1; US6753173B1; WO2000047724A3; EP1153124A2; AU2876300A

Abstract

(57)【要約】Ｉ型ポリケチドシンターゼのモジュール間のクロストークを調節する結合配列が、同定された。従って、任意に選択されたモジュールは、所望のポリケチドシンターゼおよび新規なポリケチドを得るために、適切なリンカーを供給することによって混合および適合され得る。このモジュールは、ポリケチド鎖が正確な順番で１つのモジュールから他のモジュールに渡されるように適切なリンカーと提供される。個々のモジュールから所望のポリケチドシンターゼを調製する方法もまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、１９９９年２月９日に
出願された仮出願番号６０／１１９，３６３（この内容は、本明細書中で参考と
して援用される）から優先権を主張する。

【０００２】本明細書中の発明は、少なくとも一部、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ）からの助成金（ＣＡ−６６７３６お
よびＧＭ−２２１７２）、ならびに全米科学財団（ＮａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅ
ｃｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）からの助成金（ＢＥＳ−９８０６７７４）に
よる支援に基づいてなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する
。

【０００３】（技術分野）本発明は、新生のポリケチド鎖のポリケチドシンターゼモジュールによる使用
法を容易にすることに関する。より詳細には、本発明は、所望のポリケチドの合
成のための構築において、モジュール間リンカーおよびモジュール内リンカーを
含むことに関する。

【０００４】（発明の背景）ポリケチドは、一連の縮合および続く修飾を通じて２個の炭素単位から合成さ
れる化合物のクラスである。ポリケチドは、多くの型の生物において生じ、これ
らの生物には、真菌および菌糸細菌、特に放線菌類が含まれる。ポリケチドは、
広範な種々の構造を有する生物学的に活性な分子であり、そしてこのクラスは、
多様な活性を有する多くの化合物を含む。テトラサイクリン、エリスロマイシン
、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、ＦＫ−５０６、ＦＫ−５２０、ナルボ
マイシン（ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）、ピクロマイシン（ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）
、ラパマイシン、スピノシン（ｓｐｉｎｏｃｙｎ）、およびタイロシン（ｔｙｌ
ｏｓｉｎ）が、ポリケチドの例である。伝統的な化学方法論によりポリケチド化
合物を産生する困難性、および代表的には、野生型細胞におけるポリケチドの低
い産生を考えると、ポリケチド化合物を産生する改善された手段または代替の手
段を見出すことに考慮すべき興味が存在している。

【０００５】ポリケチドの生合成の多様性は、脂肪酸シンターゼを模倣するポリケチドシン
ターゼ（ＰＫＳ）酵素による単純なモノマーの反復性の縮合によって生成される
。例えば、デオキシエリスロノライド（ｄｅｏｘｙｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ
）−Ｂシンターゼは、いくつかのメチルマロニル補酵素Ａ（ＭｅＭａｌＣｏＡ）
伸長単位を用いるプライマーの鎖伸長を触媒して、エリスロマイシンコアを産生
する。

【０００６】ＰＫＳ酵素をコードする遺伝子のクローニング、分析、および組換えＤＮＡ技
術は、天然においてまたは宿主（そうでなければ、ポリケチドを産生しない）の
いずれかにおいて生じるよりも高いレベルでそのＰＫＳにより合成されるポリケ
チドを産生する、既知のＰＫＳ遺伝子クラスターを操作することを可能にする。
この技術はまた、既知のＰＫＳ遺伝子クラスターから産生されるポリケチドに構
造的に関連するがそれとは異なる分子を産生することを可能にする。例えば、Ｐ
ＣＴ公開番号ＷＯ９３／１３６６３；同第９５／０８５４８；同第９６／４０９
６８；同第９７／０２３５８；同第９８／２７２０３；および同第９８／４９３
１５；米国特許第４，８７４，７４８号；同第５，０６３，１５５号；同第５，
０９８，８３７号；同第５，１４９，６３９号；同第５，６７２，４９１号；同
第５，７１２，１４６号；同第５，８３０，７５０号；および同第５，８４３，
７１８号；ならびにＦｕら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：９３
２１〜９３２６；ＭｃＤａｎｉｅｌら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１
５４６〜１５５０；ならびにＲｏｈｒ、１９９５、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎ
ｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４（８）：８８１〜８８８（これらの各々は、本明細書
中に参考として援用される）を参照のこと。

【０００７】ＰＫＳは、アシルチオエステルビルディングブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇｂ
ｌｏｃｋ）間の、反復性の脱カルボキシル性クライゼン縮合を通じてポリケチド
の生合成を触媒する。複合体ポリケチドを形成するために使用されるビルディン
グブロックは、代表的には、アシルチオエステル（例えば、アセチル、ブチリル
、プロピオニル、マロニル、ヒドロキシマロニル、メチルマロニル、およびエチ
ルマロニルＣｏＡ）である。２つの主要な型のＰＫＳ酵素が既知であり；これら
は、それらの組成および合成されるポリケチドの合成の様式において異なる。こ
れらの２つの主要な型のＰＫＳ酵素は、通常、Ｉ型（すなわち「モジュラー」）
ＰＫＳ酵素およびＩＩ型（すなわち「反復性」）ＰＫＳ酵素といわれる。

【０００８】本発明は、モジュラーＰＫＳに関する。Ｉ型、すなわちモジュラーＰＫＳ酵素
群において、別々の触媒活性部位のセット（各々の活性部位は、「ドメイン」と
呼ばれ、そしてそれらのセットは、「モジュール」と呼ばれる）は、ポリケチド
合成経路における炭素鎖延長および修飾の各々のサイクルに存在する。代表的な
モジュラーＰＫＳは、いくつかの大きなポリペプチドから構成され、これらは、
アミノ末端からカルボキシ末端まで、ローディングモジュール、複数の伸長モジ
ュール、および放出（またはチオエステラーゼ）ドメインに分離され得る。６−
デオキシエリスロノライドＢシンターゼ（ＤＥＢＳ）として既知のＰＫＳ酵素は
、代表的なＩ型ＰＫＳである。ＤＥＢＳでは、ローディングモジュール、６個の
伸長モジュール、およびチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインが存在する。ＤＥＢ
Ｓのローディングモジュール、６個の伸長モジュール、およびＴＥは、３つの別
々のタンパク質（ＤＥＢＳ−１、ＤＥＢＳ−２、およびＤＥＢＳ−３（１つのタ
ンパク質あたり２つの伸長モジュールを有する）と命名される）に存在する。各
々のＤＥＢＳポリペプチドは、別々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
すなわち遺伝子によってコードされ；これらの遺伝子は、ｅｒｙＡＩ、ｅｒｙＡ
ＩＩ、およびｅｒｙＡＩＩＩとして既知である。図１を参照のこと。モジュラー
ＰＫＳの遺伝的および化学的な再プログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ
）において考慮すべき興味が存在する（例えば、Ｋｈｏｓｌａ、１９９７、Ｃｈ
ｅｍ．Ｒｅｖ．９７：２５７７〜２５９０、およびＳｔａｕｎｔｏｎら、１９９
７、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２６１１〜２６２９（これらの各々は、本明細書中で参
考として援用される）を参照のこと）。

【０００９】一般に、このローディングモジュールは、ポリケチドを合成するために使用さ
れる第１のビルディングブロックを結合し、そして第１のビルディングブロック
を第１の伸長モジュールに転移することを担う。ＤＥＢＳのローディングモジュ
ールは、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインおよびアシルキャリアタン
パク質（ＡＣＰ）ドメインからなる。ローディングモジュールの別の型は、不活
性化されたＫＳ、ＡＴおよびＡＣＰを利用する。この不活性化されたＫＳは、い
くつかの場合に、ＫＳ^Q（ここでこの上付き文字は、アミノ酸であるグルタミン
についての略語であり、これは、ケトシンターゼ活性に必要とされる活性部位シ
ステインの代わりに存在する）と呼ばれる。他のＰＫＳ酵素（ＦＫ−５２０ＰＫ
Ｓを含む）では、このローディングモジュールは、珍しい開始単位を取り込み、
そしてＣｏＡリガーゼ活性ドメインから構成される。いくつかの事象では、この
ローディングモジュールは、特定のアシルＣｏＡ（通常、アセチルまたはプロピ
オニルであるが、時折、ブチリルである）を認識し、そしてローディングモジュ
ールのＡＣＰにチオールエステルとしてそれを転移する。

【００１０】各々の伸長モジュール上のＡＴは、特定の伸長ＣｏＡ（マロニルまたはα置換
型マロニル、すなわち、メチルマロニル、エチルマロニル、およびヒドロキシマ
ロニル）を認識し、そしてその伸長モジュールのＡＣＰへとそれを転移して、チ
オエステルを形成する。各々の伸長モジュールは、先行モジュールからの化合物
を受容し、ビルディングブロックを結合し、先行モジュールからの化合物にビル
ディングブロックを付着し、必要に応じて、１以上のさらなる機能を行い、そし
て得られた化合物を次のモジュールに転移することを担う。モジュールへの転移
は、残りの触媒ドメインの上流にあるＫＳドメインによって媒介される。さらな
る機能は、酵素（これは、縮合により生成されるカルボニル基をアルコールに還
元するケトレダクターゼ（ＫＲ）、そのアルコールを二重結合に変換するデヒド
ラーゼ（ＤＨ）、およびその二重結合を単結合に還元するエノイルレダクターゼ
（ＥＲ）を含む）によって実施される。これらの触媒ドメインは、直ちに隣接さ
れ、そして任意の結合配列によって分離されないようである。集合的に、これら
は、「β−カルボニル修飾」ドメインと呼ばれ得る。従って、特定のモジュール
は、これらの活性、ＫＲのみ、またはＫＲ＋ＤＨ、あるいはＫＲ＋ＤＨ＋ＥＲの
いずれもを含み得ない。従って、特定のモジュールのＮ末端からのドメインの順
序は、ＫＳ、ＡＴ、β−カルボニル修飾ドメイン（存在するならば）、ＡＣＰで
ある。この順序（β−カルボニル修飾酵素のＮ→Ｃ）は、ＤＨＥＲＫＲであ
る。

【００１１】従って、モジュラーＰＫＳの各伸長モジュールは、０、１、２または３つの酵
素を含み、この酵素は、ＡＴ触媒ドメインの下流で生長するポリケチド鎖のβ炭
素を修飾する。代表的な（非ローディング）最小のＩ型ＰＫＳ伸長モジュールは
、ＤＥＢＳの伸長モジュール３によって例示され、これは、ＫＳドメイン、ＡＴ
ドメイン、およびＡＣＰドメインのみを含む。次の伸長モジュール（モジュール
４）は、３つ全てのβ−カルボニル修飾酵素を含む（β−カルボニル修飾酵素は
、先のモジュールによって付加された伸長単位に対してこのような修飾をもたら
す）。

【００１２】一旦、ＰＫＳが、アシルＡＣＰおよびマロニルＡＣＰで開始されると、ローデ
ィングモジュールのアシル基は、第１の伸長モジュールのＫＳでチオールエステ
ルを形成（トランス−エステル化）するために転移され；この段階で、伸長モジ
ュール１は、マロニル（または置換型マロニル）ＡＣＰに隣接してアシルＫＳを
保有する。次いで、このローディングモジュール由来のアシル基は、マロニル基
のα炭素に共有結合的に付着され、炭素間結合を形成し（同時脱カルボキシル化
により駆動される）、そしてこのローディングビルディングブロックよりも２つ
の炭素が長い骨格を有する新たなアシルＡＣＰを生成する（延長または伸長）。

【００１３】最終伸長モジュールを横切った後に、ポリケチドは、ＰＫＳからこのポリケチ
ドを切断し、そして代表的には、ポリケチドを環化する放出ドメインに遭遇する
。例えば、６−ｄＥＢの最終合成は、伸長モジュール６の末端に位置するＴＥド
メインによって調節される。６−ｄＥＢの合成では、ＴＥドメインは、エステル
結合の形成によってマクロライド環の環化を触媒する。ＦＫ−５０６、ＦＫ−５
２０、ラパマイシン、および同様のポリケチドでは、ＴＥ活性によって形成され
るエステル結合は、ピペコリン酸（ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅａｃｉｄ）残基の取
り込みによって形成される結合に置換される。ラパマイシン酵素についてこの取
り込みを触媒する酵素活性は、ｒａｐＰ遺伝子によってコードされるＲａｐＰと
して既知である。このポリケチドは、酵素を仕立てること（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ
）によってさらに修飾され得；これらの酵素は、ポリケチドのコア分子に対して
、糖質基またはメチル基を加えるか、あるいは他の修飾（すなわち、酸化または
還元）を作製する。例えば、６−ｄＥＢは、エリスロマイシンＡの合成において
、Ｃ−６およびＣ−１２でヒドロキシル化され、そしてＣ−３およびＣ−５でグ
リコシル化される。

【００１４】ＰＫＳポリペプチドにおいて、酵素的活性（ドメイン）をコードする領域は、
リンカー（すなわち「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」）をコードする領域によって
分離される。これらの足場領域は、適切な距離および正確な順序でドメインを間
隔を空けて配置するアミノ酸配列をコードする。従って、ＰＫＳタンパク質のリ
ンカー領域は、集合的に、種々のドメイン（従って、足場）が特定の順序および
特殊な配置で置かれる足場をコードするとみなされ得る。一般に、この組織は、
異なるかまたは同一の基質特異性のＰＫＳ触媒ドメインが、種々の利用可能な方
法論によってＰＫＳ酵素間で（通常、ＤＮＡレベルで）置換されること可能にす
る。従って、既知のポリケチドがより効果的に産生され得る結果を有する新たな
ＰＫＳ酵素の設計において、考慮すべき可撓性が存在し、そして医薬品としてか
または他の目的のために有用な新規なポリケチドが、作製され得る。

【００１５】ＰＣＴ公開ＷＯ９８／４９３１５（この内容は、本明細書中で参考として援用
される）は、足場をインタクトに維持するが、触媒ドメインを異なる触媒ドメイ
ンと置換することによって、ＰＫＳのモジュール内に含まれる酵素的活性を修飾
するためのアプローチを記載する。米国出願番号０９／３４６，８６０（１９９
９年７月２日出願）および対応するＰＣＴ公開ＷＯ００／０１８３８（これもま
た同日に出願され、そして本明細書中で参考として援用される）は、伸長単位に
対する特異性およびコントロール立体化学に対するＫＳドメインの変更を変更す
るように、ＡＴドメインの超可変性領域を変更することによる代替方法を記載す
る。本発明は、モジュールを操作するアプローチを利用し、その結果、モジュー
ル全体の触媒性活性が適切な配列に置かれて、所望のポリケチドを構築する。こ
のアプローチを利用する能力は、生長するポリケチド鎖を組み込むためにモジュ
ールに適切な手段をもたらすことに依存し、この能力は、適切なリンカー領域が
含まれると仮定することを包含する。本出願が優先権を主張する仮出願の出願以
来、関連する論文は、Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ａ．ら、Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏ
ｌ．（１９９６）６：７３１〜７４１によって公開されている。この論文におい
て、ポリペプチド内結合は、対応する上流モジュールと異種モジュール中のＫＳ
ドメインの下流の位置との間のキメラにおいて、ネイティブな下流モジュールの
ＫＳ領域を含むことにより、キメラモジュールに対して偶発的に供給される。あ
るいは、この下流モジュールは、このキメラ中の異種モジュール上流の残りに融
合される、ネイティブな上流モジュールのＡＣＰ触媒ドメインを含む。

【００１６】（発明の開示）本発明は、任意に選択されたポリケチドシンターゼを構築するための効率的な
方法、および従って、Ｉ型ポリケチドシンターゼのモジュール全体を操作するこ
とによる所望のポリケチドに関する。本発明は、ケトシンターゼ（ＫＳ）に対し
て適切な「導入（ｌｅａｄｉｎ）」配列またはリンカー配列を有するモジュー
ルを提供することによって、このアプローチを可能にする。出願人らは、このモ
ジュールを許容して新生のポリケチド鎖を受容するために、モジュール間に適切
なリンカーが関連するＫＳの上流に必要とし、そして、分子間転移の場合におい
て、Ｎ末端領域およびＣ末端領域の適切な対は、適切な転移を保証することを発
見した。このリンカーの性質は、このモジュールが別のモジュールからの下流を
共有結合的に結合するか否か、またはこのモジュールがポリペプチドのＮ末端を
形成するか否かに依存して、変化する。

【００１７】従って、１つの局面において、本発明は、機能性ポリケチドシンターゼを構築
するための方法に関し、この方法は、モジュールが、異なるＰＫＳ由来のモジュ
ール由来の同じポリペプチドの下流にある場合に、適切なポリペプチド内リンカ
ー（ＲＡＬ）を有し、そしてモジュールが、このモジュールがポリペプチドのＮ
末端モジュールであるＰＫＳ由来である場合に適切なポリペプチド間リンカー（
ＥＲＬ）を有する、所望のポリペプチドシンターゼ中に含まれる各モジュールを
提供する工程を包含する。ポリペプチドのＮ末端でこのモジュールが上流モジュ
ールから新生のポリケチド鎖を受容することが意図される場合、ポリペプチド間
リンカーは、新生の鎖を提供するモジュールのＣ末端で適切なアミノ酸配列を含
むことを必要とする。

【００１８】リンカーによって提供される「モジュール」を記載する際に、用語「モジュー
ル」とは、ＫＳ触媒ドメインのＮ末端からＡＣＰのＣ末端に、適切に伸長する機
能性部分をいう（すなわち、モジュールの部分とみなされる以外のリンカー部分
を除外する）。

【００１９】以下でさらに記載されるように、所望の特異性のモジュールの任意の順序は、
分子間的または分子内的のいずれかの適切なリンカーを提供することによって保
証され得る。従って、ポリケチドシンターゼは、ポリケチド鎖が１つのモジュー
ルから次のモジュールへ正確な配列を通過することを保証するために適切なリン
カーを提供することによって、ならびにそれらを含むポリペプチドを直接的に提
供することによるかあるいはヌクレオチド配列を同時発現するかまたは宿主細胞
中にそれらをコードすることによるかのいずれかにより、これらのモジュールを
構築することによって、個々のモジュールから構築され得る。

【００２０】他の局面において、本発明は、本方法を実施するために有用な材料および組成
物に関し、特に、適切なポリペプチド内リンカーおよびポリペプチド間リンカー
を含む単離されたＤＮＡフラグメントに関する。本発明はまた、モジュールのラ
イブラリーから機能性ポリケチドシンターゼを構築するための方法、および再構
築されたポリケチドシンターゼに対する適切な基質を供給することにより調製さ
れるポリケチドに関する。従って、ポリケチドは、単離された酵素を使用するか
、またはこれらの酵素を含む生物にポリケチドを与えることのいずれかで「仕立
て（ｔａｉｌｏｒ）」られて、これらの酵素を、他の活性（例えば、ヒドロキシ
ル化およびグリコシル化のようなポリケチド修飾後によるモトライド（ｍｏｔｏ
ｌｉｄｅ））の抗感染剤（ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ）または化合物に変換
し得る。ケチドまたはケトライド（ｋｅｔｏｌｉｄｅ）あるいはこれらの修飾形
態はまた、化学合成方法を使用してさらに誘導体化され得る。

【００２１】（発明を実施する様式）本発明は、ポリケチドのための合成スキームにおいてモジュールの位置に依存
するＩ型ＰＫＳのモジュール間の適切なリンカーを供給するためのアミノ酸配列
の同定を利用する。モジュールが、このモジュールが存在するポリペプチドのＮ
末端にある場合（すなわち、このモジュールに対して上流に共有結合されたさら
なるモジュールは存在しない）、「ポリペプチド間リンカー（ＥＲＬ）」は、Ｋ
Ｓ触媒ドメインの上流に置かれる。逆に、モジュールが、このモジュールの上流
にさらなるモジュールが存在するポリペプチド内に存在し、そして融合タンパク
質としてこのモジュールに共有結合される場合、この２つのモジュールは、「ポ
リペプチド内リンカー（ＲＡＬ）」によって分離されるべきである。ポリペプチ
ドのＮ末端に存在するモジュールが、ポリケチドのための合成プロセスにおいて
下流にある場合（すなわち、同じモジュール上でない異なるモジュールから新生
のポリペプチド鎖を受容しなければならない）、同様に、順序正しい転移を保証
するために、新生のポリケチド鎖を提供するモジュールのＣ末端でポリペプチド
間リンカーの一部を供給することが必要であり得る。

【００２２】以下で議論されるように、ポリケチドシンターゼは、タンパク質レベルまたは
ＤＮＡレベルのいずれかで議論される。同様に理解されるように、ポリケチドシ
ンターゼタンパク質中のアミノ酸の配列の操作は、組換え技術を使用して最も簡
便に行われる。従って、例えば、適切なリンカー配列は、適切な遺伝子を修飾し
、そして適切な宿主中でその遺伝子を発現することによって、既存のモジュール
の配列に対して導入または修飾され得る。リンカーの内部変化もまた、この様式
において間Ｇ弁に行われる。さらに、「改変体」を得るためのアミノ酸配列の修
飾は、遺伝子を変異することによってもたらされる。参照ポリケチドシンターゼ
は、タンパク質レベルおよび核酸レベルの両方で存在すると理解されるべきであ
り、そして議論されている形態は、その状況から明らかであるべきである。

【００２３】さらに、ポリケチドシンターゼのその適切な基質に対する作用は、単離された
酵素を使用することによって細胞外的にもたらされ得るか、または細胞内的にそ
の酵素を産生することによってもたらされ得るかのいずれかであり得る。「適切
な基質」は、カルボン酸のチオエステルであるか、または部分的に合成されたポ
リケチド（例えば、ジケチド）のいずれかであるＰＫＳおよび「スターター（ｓ
ｔａｒｔｅｒ）」単位中の種々のモジュールによって認識される、それらのチオ
エステル形態中の伸長単位を意味する。例えば、ＰＣＴ公開ＰＣＴ／ＵＳ９６／
１１３１７に記載されるように、モジュール１のケトシンターゼドメインは、共
有結合的に不活性化され、従って、モジュール２によってジケチドの有用性をよ
り効率的にする。

【００２４】リンカーは、制限酵素の使用および一般に実施される連結手順を通して、従来
の組換えＤＮＡ操作によって供給され得る。本発明のＰＫＳ中のリンカーは、そ
れらの天然の環境から「単離される」。「単離される（単離された）」は、本明
細書中で使用される場合、その参照物が、通常会合されない部分と会合して結合
されるか、または天然に見出されない環境において結合されることが見出される
ことを、単に意味する。ヌクレオチド配列の場合には、通常結合されないさらな
る配列、またはペプチドの場合には、通常結合されないさらなるアミノ酸配列が
、結合されてもよいし、あるいは、通常会合されるさらなる部分から単に脱着さ
れてもよい。

【００２５】図３からわかるように、本発明のペプチド内リンカー（ＲＡＬ）は、約１６〜
２０アミノ酸を含み、そして代表的に、配列のほぼ中央にプロリン残基を含む。
一方、Ｎ末端上流ポリペプチド間リンカーは、長さでほぼ２倍であり、そしてそ
の分子の上流半分の位置で、保存された酸性アミノ酸残基および塩基性アミノ酸
残基を含むようである。従って、代表的なＮ末端上流ポリペプチド間リンカー（
ＥＲＬ）は、最初の３〜１０残基内に酸性アミノ酸、続いて８〜１０残基後ろに
塩基性アミノ酸、次いで、さらに２〜５アミノ酸残基後ろにさらなる酸性アミノ
酸を、含む。さらなる酸性残基および塩基性残基はまた、これらのリンカー中に
存在し得る。

【００２６】図３に示されるペプチド内リンカーまたはペプチド間リンカーは、本発明で以
下に記載されるように使用され得るか、あるいは、一般にネイティブＩ型ＰＫＳ
由来の対応するアミノ酸配列が、使用され得る。天然に存在する配列に加えて、
「改変体」が、使用され得る。これらの改変体は、重要でない方法（リンカーが
該当のモジュールに対して新生のポリケチド鎖を「与える（ｆｅｅｄ）」能力に
影響を及ぼさない）でリンカーのアミノ酸配列を変更することによって得られる
。代表的に、このような「改変体」は、アミノ酸の置換、欠失または挿入によっ
て、ネイティブ配列から得られる；好ましくは、この置換は、「保存的」置換（
すなわち、酸性アミノ酸の異なる酸性アミノ酸への置換、塩基性アミノ酸の異な
る塩基性アミノ酸への置換など）である。好ましくは、改変体は、せいぜい３つ
、好ましくは、たった２つ、そしてより好ましくは、たった１つののアミノ酸の
変更を含む。

【００２７】１つより多いポリペプチドを含むポリケチドシンターゼの構築のために、適切
な転移の配列は、ドナー（ｄｏｎａｔｉｎｇ）モジュールの適切なＣ末端アミノ
酸配列を、アクセプター（ａｃｃｅｐｔｉｎｇ）モジュールのポリペプチド間リ
ンカーの適切なＮ末端アミノ酸配列と適合することによって確実にされる。これ
は、例えば、それらが、ネイティブＰＫＳにおいて存在するような対を選択する
ことによって、容易に行われ得る。例えば、２つの任意に選択されたモジュール
は、ＤＥＢＳのモジュール４のＣ末端部分およびＤＥＢＳのモジュール５につい
てのリンカー配列のＮ末端の部分を使用して結合され得る。

【００２８】一般に、本発明の方法は、ポリペプチド間リンカーの適切なＮ末端上流部分（
Ｎ−ＥＲＬ）、ポリペプチド間リンカーのＣ末端下流部分（Ｃ−ＥＲＬ）、また
はいずれかの末端でポリペプチド内リンカー（ＲＡＬ）との、所望のポリケチド
の合成のために、ＰＫＳにおいて使用されるモジュールに供給する工程を包含す
る。上述のように、モジュールがポリペプチドのＮ末端部分にある場合、Ｎ末端
上流ポリペプチド間リンカーは、そのＮ末端で付加されるべきである。モジュー
ルが、そのモジュールから上流に融合されるさらなるモジュールが存在するポリ
ペプチド中に存在する場合、２つのモジュールは、ポリペプチド内リンカーによ
って分離されるべきである。

【００２９】構築の容易さのために、機能性モジュールのライブラリーは、ＰＫＳの構築の
ために適切な所望のモジュールを提供するために維持され得る。適切な配列のポ
リケチド鎖の生長を確実にする１つの方法は、共有結合的にモジュールを結合す
ることであり、その結果、第１のモジュールを除く全てが、上流ポリペプチド内
リンカーを含む。あるいは、および好ましくは、別々のポリペプチド分子上に非
共有結合的に会合した機能性モジュール間の適切な連絡は、新生ポリケチド鎖に
寄与するモジュールに会合するポリペプチド間リンカーのＣ末端下流部分と、こ
の新生ポリケチドを受け入れかつ伸長するモジュールの上流に配置されるポリペ
プチド間リンカーのＮ末端上流部分との間の適切な適合を提供することによって
、達成され得る。従って、生長するポリケチド鎖がモジュールＡからモジュール
Ｂに（これらのモジュールは、共有結合されていない）渡すことを確実にするた
めに適切なリンカーは、例えば、エリスロマイシン由来のモジュール４のＣ末端
足場部分をモジュールＡに結合し、そしてエリスロマイシンＰＫＳのモジュール
５由来のＮ末端ポリペプチド間リンカー（足場）部分をモジュールＢのＫＳのＮ
末端に結合する。

【００３０】ＰＫＳを設計および構築するために、１つの直接のアプローチは、ネイティブ
ＰＫＳ（例えば、エリスロマイシンＰＫＳ）の既存のリンカー領域を利用するこ
とであり、そして、例えば、ライブラリー由来のモジュールを単に「接続する（
ｐｌｕｇｉｎ）」ことである。

【００３１】 β−カルボニル修飾の全ての改変体と組み合わせられるネイティブＰＫＳにお
いて使用される全ての代替の伸長単位を組み込むモジュールを含む、天然に存在
するＰＫＳ由来のモジュールのライブラリーは、大きくない。天然に組み込まれ
る伸長単位としては、マロニル−ＣｏＡ、メチルマロニル−ＣｏＡ、エチルマロ
ニル−ＣｏＡ、およびヒドロキシマロニル−ＣｏＡが挙げられる。これらの各々
の組込みのために適切なネイティブ分子は、容易に見出され得る。メチルマロニ
ル−ＣｏＡ伸長単位は、例えば、エリスロマイシンＰＫＳのモジュールによって
組み込まれる。ピクロマイシンＰＫＳの特定のモジュールは、マロニル−ＣｏＡ
を組み込み、一方、エポチロンＰＫＳのモジュールは、エチルマロニル−ＣｏＡ
またはヒドロキシマロニル−ＣｏＡを組み込む。特定の伸長特異性と特定のβ−
カルボニル修飾活性とを結び付けることが望ましい程度に、β−カルボニル修飾
活性の十分な範囲を含むモジュールが、天然に存在し、これは、触媒ドメインそ
れ自体を、上記で再び言及されるＰＣＴ公開ＷＯ９８／４９３１５に記載される
ように変更することによって達成され得る。従って、全てのβ−カルボニル修飾
の選択との、伸長単位の選択の完全な組合せは、総じて４×４、すなわち、１６
モジュールのみである。ＫＳ単位がモジュールの立体選択性を決定するので、モ
ジュールライブラリーにおいてＫＳドメインを調整することによって前駆体の種
々の立体異性体形態について、適応がなされ得る。これは、必要なモジュールの
総数をたった３２まで拡大する。任意の数のモジュールは、特定のＰＫＳ構築物
に含まれ得、従ってまた、ポリケチド鎖の長さおよびマクロライド産物のサイズ
を決定する。当然のことながら、このマクロライド産物は、所望であれば、既知
の仕立て酵素（ｔａｉｌｏｒｉｎｇｅｎｚｙｍｅ）（これは、天然に存在する
マクロライドをヒドロキシル化形態および／またはグリコシル化形態などに変換
する）によって修飾され得る。当該分野で十分に理解されるように、このような
修飾は、種々の方法において（化学的修飾によって、適切な酵素を用いるインビ
トロ処理によって、または適切な仕立て酵素を含む宿主生物にこのポリケチドを
与えることによって）達成され得る。

【００３２】所望のＰＫＳを構築するために、モジュールがライブラリーから選択され、そ
してポリペプチド内リンカーまたはポリペプチド間リンカーの適切な上流に提供
される。適切なリンカーは、図３に示されるリンカー（任意のＩ型ＰＫＳ由来の
対応する配列）からなる群より選択され得るか、または天然に保存的であるこれ
らの示された配列の改変体を含み得、そしてリンカーが新生のポリペプチド鎖の
効率的な取り込みを可能にする能力を妨げない。リンカーは、ライブラリー中の
モジュールに対して標準的な組換え技術によって付加され得るか、またはこのラ
イブラリーは、各モジュールがポリペプチド内リンカーもしくはポリペプチド間
リンカーのいずれかを含むようにさらに操作されたモジュールの集合から構成さ
れ得る。例えば、ポリペプチド内リンカーを有する各型の伸長モジュール（通常
そのリンカーと会合されるリンカーを保持する可能性を含む）を提供することが
、望ましくあり得る。リンカーが、モジュールのＮ末端に置かれる場合、そのモ
ジュールは、単一のポリペプチド中のさらなるモジュールの下流の共有結合に適
切である。ポリペプチド内リンカーがＣ末端にある場合、モジュールは、通常さ
らなるモジュールの上流に置かれ、そして共有結合される。いずれの場合におい
ても、モジュールは、最終的に構築されるべきＰＫＳ中に置かれる場所に依存し
て、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかでポリペプチド内リンカー（ＲＡＬ）とと
もに任意に提供され得るか、あるいは、ＰＫＳ中のポリペプチドのＮ末端に置か
れる場合にポリペプチド間リンカーのＮ末端上流部分（Ｎ−ＲＥＬ）とともにか
、またはポリペプチドのＣ末端に置かれる場合にポリペプチド間リンカーのＣ末
端部分（Ｃ−ＥＲＬ）とともに提供され得、そして新生のポリケチド鎖を続くモ
ジュールに転移することを、意図する。

【００３３】次いで、適切なリンカーを有する種々のモジュールは、所望のポリケチドシン
ターゼへと構築される。上述のように、ＰＫＳの構築は、モジュールの活性部分
を既存のリンカーアレイに接続することに基づき得る。この構築物は、モジュー
ルを含むペプチドを単に混合することによって実施され得るか、または宿主細胞
中の発現構築物から組換え的に産生され得る。細胞は、ＰＫＳに適切な基質を提
供し得るか、あるいはこの基質は、ポリペプチドを含む反応混合物にかまたはポ
リペプチドが生成される細胞に提供されることが必要であり得る。宿主の選択に
依存して、提供は、これらの基質を提供するためになされることが必要であり得
る。

【００３４】この方法において、モジュールは、所望のように「混合および適合」されて、
所望の伸長単位から、そして所望のβ−カルボニル修飾を有する、ポリケチド産
物を構築し得、ポリペプチド中のモジュールの位置に従ってリンカーを選択し、
そしてモジュールの数が、所望されるように変更され得る。

【００３５】このようなモジュールの構築物のために好ましいスターター単位は、この対象
物を達成するために伸長単位とともにスターター単位を組み込むためのローディ
ングドメインを含むモジュールを含むことによって、インサイチュで形成される
ジケチドチオエステルであるか、あるいは、このジケチドは、ＰＫＳに対する基
質として独立して合成され、そして使用され得る。合成されたジケチドは、チオ
エステル（例えば、Ｎ−アシルシステアミンチオエステル）として供給され得る
。これらのチオエステルのための調製方法は、上記に参照される米国出願番号０
９／３４６，８６０（１９９９年７月２日出願）および対応するＰＣＴ出願、な
らびに米国出願番号（代理人事件番号３００６２−２００３２．００）（２００
０年１月２７日出願）に記載される。

【００３６】従って、本発明の技術を使用してモジュール全体を操作すること、および効率
的なクロストーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）をもたらすことを可能にして、所望
のマクロライドの産生を確実にする。このような技術は、例えば、エリスロマイ
シン遺伝子クラスターのモジュール２の代わりにチロシン遺伝子クラスターのモ
ジュール２を用いて、または（そのチオエステル配列とともに）エリスロマイシ
ンモジュール６の代わりにナルボマイシン（ｎａｒｂｏｍｙｓｉｎ）の対応する
モジュール６を用いて、例えば、マクロライド抗感染剤の構造を変更するために
、使用され得る。

【００３７】さらに、１４員環のマクロライドは、エリスロマイシンシンターゼのモジュー
ル１〜３の間に、タイロシンのモジュール２〜３、スピラマイシンまたはニダマ
イシン（ｎｉｄｄａｍｙｓｉｎ）のモジュール２〜３を融合することによってか
、あるいはエリスロマイシンの産生のためにシンターゼに他のＩ型ＰＫＳクラス
ターから任意に選択されたモジュールを付加することによって、１６員環のマク
ロライドになるように伸長され得る。あるいは、エリスロマイシンのモジュール
１〜２は、欠失され得るか、あるいはタイロシン、スピラマイシンまたはニダマ
イシンのモジュール１〜３によって置換され得る。

【００３８】さらに、新たな置換基は、例えば、置換モジュールが不活性化されたエノイル
レダクターゼ触媒活性を有する場合、エリスロマイシンＰＫＳの第２のモジュー
ルの代わりにタイロシンＰＫＳ由来のモジュール５を用いることによって、ＰＫ
Ｓエリスロマイシンまたはその前駆体に導入され得る。これは、１０位において
エチル基で置換されたエリスロマイシンを生じる。あるいは、エリスロマイシン
のモジュール５は、５−デスメチル−４−ＯＨエリスロマイシンを得るために、
スピラマイシンのモジュール６によって置換され得る。

【００３９】ＦＫ−５０６の改善された形態は、ラパマイシンのモジュール２〜１０の代わ
りにＦＫ−５０６のモジュール２〜６を用いることによってか、またはラパマイ
シンのモジュール２〜１１の代わりにＦＫ−５０６のモジュール２〜７を用いる
ことによってか、またはラパマイシンのモジュール２〜１２の代わりにＦＫ−５
０６のモジュール２〜８を用いることによってか、またはラパマイシンのモジュ
ール１１〜１４の代わりにＦＫ−５０６のモジュール７〜１０を用いることによ
って、得られる。上記の任意の組合せまたはサブセットもまた、利用され得る。
ＦＫ−５２０の改善された形態は、類似の様式で作製され得る。ラパマイシンの
代替の形態は、ラパマイシンのモジュール１の代わりにＦＫ−５０６／５２０の
モジュール１で置換することによって合成される。

【００４０】前述は、利用され得る操作の型の単なる例示である。次いで、インビトロまた
はインビボのいずれかで適切な基質を供給することによって得られるポリケチド
は、所望される場合、所望の産物を得るためにヒドロキシル化、グリコシル化な
どによって、さらに修飾され得る。さらに、化学合成操作もまた、利用され得る
。

【００４１】上記の得られた化合物のいくつかは、以前に開示された代替技術（例えば、Ｐ
ＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２８８６またはＰＣＴ／ＵＳ９９／２４４８３）
によって調製され得る。しかし、上記の手順（これは、モジュール全体を操作す
る）は、より良好な収率またはより簡便な合成を生じ得る。

【００４２】以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定することを意図し
ない。

【００４３】（調製Ａ）（単一モジュールに基づく系の構築）（単一モジュール遺伝子構築物）ＤＥＢＳ遺伝子クラスター由来の単一モジュール遺伝子構築物を、以下のよう
にモジュール２、３、５および６について調製した。ＴＥドメインをモジュール
に融合して、終結を容易にする。（Ｍ３＋ＴＥ）遺伝子を、ＤＥＢＳ−２遺伝子
の始めで操作されたＮｈｅＩ部位を有する、トリモジュラー（ｔｒｉ−ｍｏｄｕ
ｌａｒ）構築物ｐＫＡＯ３１８（ＭｃＤａｎｉｅｌ，Ｒ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｌ．（１９９７）４：６６７）から調製した。ＡＣＰ３の末端でのＴＥ遺伝子の
融合を、Ｃｏｒｔｅｓ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６８：１４８７
；Ｋａｏ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９５）１１７：９
１０５およびＫａｏ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｊ．Ａｍ．ＣＨｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９６）
１１８：９１８４（集合的に、「Ｃｏｒｔｅｓ−Ｋａｏの文書」）として以下に
引用される）において、ｐＣＫ１３の構築に関して記載した。ＮｈｅＩ−Ｅｃｏ
ＲＩフラグメントを、ｐＥＴ２１ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングして
、ｐＲＳＧ３４を構築した。このＥｃｏＲＩ部位を使用して、ＴＥドメインの停
止コドンを欠失させ、その結果、タンパク質を、カルボキシ末端に（Ｈｉｓ）₆
をタグ化した融合タンパク質として過剰産生し得た。

【００４４】（Ｍ５＋ＴＥ）を、ｐＪＲＪ１０由来の操作したＮｄｅｌ部位（Ｊａｃｏｂｓ
ｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９＿＿）３７：４９２８）と、ｐＣＫ１５由来のＥ
ｃｏＲＩ部位（Ｃｏｒｔｅｓ−Ｋａｏの文書）とを組み合わせることによって構
築した。Ｎｄｅ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＥＴ２１ｃ中にクローニングし
て、発現プラスミドｐＲＳＧ４６を得た。（Ｍ２＋ＴＥ）および（Ｍ６＋ＴＥ）
についての発現構築物を、対応するＫＳ（７５７０位（５’−ＧＣＴＡＧＣＧＡ
ＧＣＣＧＡＴＣ−３’）で、および２８７１０位（５’−ＧＣＴＡＧＣＧＡＣＣ
ＣＧＡＴＣ−３’）で）の直ぐ上流の操作したＮｈｅ部位を使用して同様に構築
した。

【００４５】これらの構築物を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓｆｐホスホパンテテイニル
（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ）トランスフェラーゼについての発
現系とともに、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させ、その同時発現
は、Ｌａｍｂａｌｏｔ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）３：９
２３によって記載される。ｓｆｐ遺伝子の構築について、ｐＵＣ８−ｓｆｐ（Ｎ
ａｋａｎｏら、Ｍａｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９＿＿）２３２：３１３）由
来のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、カナマイシン耐性遺伝子を有す
るｐＥＴ２８中にクローニングして、得られるプラスミドｐＲＳＧ５６を得た。
次いで、得られたタンパク質を、以下の実施例に記載される反応混合物において
使用するために単離した。

【００４６】より詳細には、その発現を、１ｍＭイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシドを用いて誘導し、そして細胞を、遠心分離によって１０時間後に収集し、
そして破壊緩衝液（２００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、２００ｍＭ塩
化ナトリウム、２．５ｍＭジチオトレイトール、２．５ｍＭエチレンジアミン四
酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１．５ｍＭベンズアミジン、２ｍｇ／Ｌペプスタ
チンおよびロイペプチンならびに３０ｖ／ｖグリセロール）中に再懸濁した。細
胞を、フレンチプレスを通過させることによって溶解し、そしてその溶解産物を
、遠心分離後に収集した。核酸を、ポリエチレンイミン（０．１５％）を用いて
沈殿させ、そして遠心分離によって除去した。その上清を、硫酸アンモニウムを
用いて５０％（ｗ／ｖ）飽和させ、そして一晩沈殿させた。遠心分離後、タンパ
ク質を含有するペレットを、緩衝液Ａ（１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．
２）、２．５ｍＭＤＴＴ、２ｍＭＥＤＴＡおよび２０％グリセロール（ｖ／
ｖ））中に再溶解し、そして−８０℃で保存した。クロマトグラフィーのために
、この緩衝液を、ゲル濾過ＰＤ１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを使用して、
緩衝液Ａ＋１Ｍ硫酸アンモニウムに交換した。得られたサンプルを、Ｂｕｔｙｌ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにロードした。ＤＥＢＳタ
ンパク質を含む画分をプールし、そして陰イオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ
Ｑ；６ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。精製したタンパク質画分をプ
ールし、そしてＡｍｉｃｏｎｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０を使用して濃縮した。
代表的な精製したタンパク質の収率は、約３〜４ｍｇ／Ｌ培養物である。９０％
より多いタンパク質が、ｓｆｐホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの過剰
発現の結果として、インビボにおいてホスホパンテテイニル化された。このタン
パク質を、（Ｈｉｓ）₆タグ化タンパク質として発現したが、それらは、実験条
件下でＮｉ−カラムに結合しなかった。このタンパク質がＮｉ−アガロースカラ
ムに結合できないことが立体効果に起因するか否か、または（Ｈｉｓ）₆ペプチ
ドが精製の間に失われるかどうかは、明確ではない。

【００４７】（実施例１）（個々のモジュールによる、トリケチドの無細胞合成のための要件−リンカー
領域の同定）２Ｓ，３Ｒ−２−メチル−３−ヒドロキシペンタン酸のシステアミンチオエス
テル（図２中、化合物２）を変換する能力について試験された、無細胞系は、１
００μｌの反応中に、０．５〜１０ｍＭ濃度のチオエステル、２．５ｍＭ ¹⁴Ｃ
−標識化メチルマロニルＣｏＡおよび実施例１において調製した１００ｐモルの
精製したタンパク質からなった。いくつかの場合において、１ｍＭのＮＡＤＰＨ
を添加した；これを、（Ｍ２＋ＴＥ）タンパク質、（Ｍ５＋ＴＥ）タンパク質お
よび（Ｍ６＋ＴＥ）タンパク質を含むアッセイ混合物中で行った。このタンパク
質は、各々の場合において、モジュール６のチオエステラーゼ（ＴＥ）末端領域
に融合したＤＥＢＳＰＫＳの単一モジュールであった。

【００４８】反応混合物をクエンチし、そして酢酸エチルによって抽出し、そして薄層クロ
マトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離して、３０分後にトリケチドケトラクト
ン３およびトリケチドラクトン４（図２において両方とも示される）の形成を見
分けた。結果を、表１において最初の４つの項目として示す。

【００４９】

【表１】表１に示されるように、予測されるトリケチドは、（Ｍ３＋ＴＥ）および（Ｍ
５＋ＴＥ）（それらのそれぞれのポリペプチドの上流部分に存在するモジュール
）から形成されたが、（Ｍ２＋ＴＥ）または（Ｍ６＋ＴＥ）（それらのポリペプ
チドのＣ末端部分に存在するモジュール）からトリケチドは形成されなかった。
これらの後者は、予想外であった。なぜなら、このジケチドは、完全なポリペプ
チドＤＥＢＳ−１の一部として供給される場合に、モジュール２によって組み込
まれ得るからである。ＡＣＰドメインをモジュール２およびモジュール６におい
てパンテテイニル化したこと、および（Ｍ２＋ＴＥ）について、ＫＳドメインを
放射標識化ジケチドを用いてアシル化し得なかったことが、確認された。

【００５０】（実施例２）（リンカー配列を用いる単一モジュールの修飾）（Ｍ２＋ＴＥ）および（Ｍ６＋ＴＥ）についての構築物を、ＫＳ触媒ドメイン
のアミノ酸上流をコードする配列を欠失させること、ならびにポリペプチド間リ
ンカーのＮ末端部分（Ｎ−ＥＲＬ）を含む（Ｍ５＋ＴＥ）由来の最初の３９アミ
ノ酸を置換することにより、修飾した。関連する構築物を、ｐＲＳＧ４６中のＢ
ｓａＢＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＣＫ４由来の対応するフラグメントに置
換することにより調製して、プラスミドｐＲＳＧ６４中に（Ｎ−ＥＲＬ−Ｍ２＋
ＴＥ）を得たか、またはＢｓａＢＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＪＰＪ１０由
来の対応するフラグメントに置換することにより調製して、プラスミドｐＲＳＧ
５４中に（Ｎ−ＥＲＬ−Ｍ６＋ＴＥ）を得た。これらの構築物は、モジュール５
由来の上流の３９アミノ酸を含むモジュールを生じる。この構築物を、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中で発現させ、そしてタンパク質を、調製Ａにおいて記載されるように得た
。これらのタンパク質は、表１の項目５および６に示されるように、実施例１の
無細胞系においてジケチドからトリケチド産物を産生し得た。

【００５１】次いで、ジケチドをトリケチドに首尾よく変換する種々の構築物を、反応速度
定数ｋ_catおよびＫ_Mについて評価した。これらの結果を、表２に示す。表２に示
されるように、この結果は、モジュール３からの結果が他のモジュールと比較し
た場合に、ｋ_catにおいて数倍の減少を示すことを除いて、全ての構築物につい
てまったく同様である。このことは、明らかに、（Ｎ−ＥＲＬ−Ｍ６＋ＴＥ）の
反応混合物からのＮＡＤＰＨ（このようなモジュールの活性のために必要である
）の除去もまた低いＫ_catを生じるという事実によって確認されるように、モジ
ュール３におけるβ−カルボニル修飾酵素の非存在に起因する。

【００５２】

【表２】これらの結果から、ポリペプチドのＮ末端部分に位置するモジュールに会合す
るＮ末端上流配列の存在は、モジュールが、生長するポリケチド鎖をこの位置に
組み込むことを可能にするために必須であることが、明らかである。

【００５３】（実施例３）（（Ｍ１−ＲＡＬ−Ｍ３＋ＴＥ）および（Ｍ１−ＲＡＬ−Ｍ６＋ＴＥ）の構築
）それぞれ、モジュール３およびモジュール６を含むＢｓａＢＩ−ＥｃｏＲＩフ
ラグメントを、Ｍ１とＭ２との間にネイティブに存在するポリペプチド内リンカ
ー（ＲＡＬ）を含むＭ１モジュールの後ろに、それぞれクローニングした。次い
で、得られたＭ１−ＲＡＬ−Ｍ３＋ＴＥ遺伝子およびＭ１−ＲＡＬ−Ｍ６＋ＴＥ
遺伝子を、ＰａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り出し、そしてｐＣＫ１
２中に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＳＴ９７およびプラスミドｐＳＴ９６
を得た。対応するタンパク質を、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＣＨ９９９中に形
質転換することによって産生した。得られたＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの株は、
表１の項目７および８によって示されるように、ジケチドチオエステルをトリケ
チド中に組み込み得た（産生したトリケチドは、図２中のケトラクトン３である
）。

【００５４】（実施例４）（さらなるポリペプチド内媒介性転移）ＤＥＢＳＰＫＳクラスター（ｅｒｙ）の第１のモジュール（エリスロマイシ
ンＰＫＳ由来の対応するＭ１−Ｍ２ポリペプチドのポリペプチド内リンカーを含
む）が、リファマイシンＰＫＳ（ｒｉｆ）の第５のモジュールに融合される構築
物を、ｒｉｆＡＣＰ５（５’−ＣＧＣＧＡＣ−３’）の２８０２４位の天然配
列と、ＳｐｅＩ認識配列５’−ＡＣＴＡＧＴ−３’とを置換することによって構
築した。ｒｉｆＭ５を含むＢｓａＢＩ−ＳｐｅＩフラグメントを切り出し、そし
てｐＣＫ１２中の対応するｅｒｙＭ１−ＲＡＬ−フラグメントと置換して、プラ
スミドｐＳＴ１１０を得た。このプラスミド（ｅｒｙＭ１−ＲＡＬ−ｒｉｆ−Ｍ
５＋ＴＥを含む）を、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＣＨ９９９中に形質転換し、
そして得られた株は、表１の項目９に示されるように、ジケチドを、トリケチド
ラクトンに組込み得た。その量は、ＤＥＢＳ−１＋ＴＥを用いて形質転換したこ
の株において産生される量に匹敵する。

【００５５】（実施例５）（分子間転移のためのモジュールの構築）ｐＳＴ１１０のＰａｃＩ−ＳｐｅＩフラグメントを、ＡＣＰ２のポリペプチド
の下流のカルボキシ末端において足場配列の始めに操作されたＳｐｅＩ部位を有
する、ｐＣＫ７の誘導体（Ｋａｏ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｓｃｅｉｎｃｅ（１９９４）２
６５：５０９）中に挿入した。得られたｐＳＴ１１３構築物は、なお、ｅｒｙ分
子１とｅｒｙ分子２との間の天然のポリペプチド内リンカーを介してｒｉｆＭ
５に結合されるｅｒｙＭ１を含み、そしてまたここで、ｅｒｙＭ２由来のＥ
ＲＬの下流のＣ末端部分に共有結合されるｒｉｆＭ５を含む。従って、ｐＳＴ
１１３によって生成されるポリペプチドと、ＤＥＢＳ−２を生成する構築物によ
って生成されるタンパク質との間の完全ＥＲＬは、ｅｒｙＰＫＳ中のネイティ
ブＥＲＬに対応する。すなわち、ｒｉｆＭ５は、ｅｒｙ分子２とｅｒｙ分子３
との間の天然のポリペプチド間リンカーを介してｅｒｙＭ３に会合する。ＤＥ
ＢＳ−２およびＤＥＢＳ−３を産生する構築物を伴うｐＳＴ１１３のＳ．ｃｏｅ
ｌｉｃｏｌｏｒへの同時形質転換は、表１の項目１０によって示されるように、
６−ｄＥＢの産生を生じる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、６−ｄＥＢ（エリスロマイシンのコア前駆体）を形成するエリスロマ
イシンＰＫＳの図である。示されるように、ＰＫＳは、３つの遺伝子（一般に、
ｅｒｙＡＩ、ｅｒｙＡＩＩおよびｅｒｙＡＩＩＩと呼ばれる）によってコードさ
れる、３つのタンパク質（ＤＥＢＳ−１、ＤＥＢＳ−２およびＤＥＢＳ−３）か
ら構成される。

【図２】図２は、ジケチドチオエステルの、エリスロマイシンＰＫＳのＤＥＢＳ−１に
よって産生されるトリケチドに対応するトリケチドへの変換を示す。

【図３】図３は、種々のＩ型ＰＫＳ由来の、ポリペプチド内リンカー、およびポリペプ
チド間リンカーのＮ末端部分の構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ゴカーレ，ラジェシュエス．インド国 110091 デリー，マユールヴィハールフェイズファースト（イーエックスティーエヌ），サダールアパートメンツ 88 (72)発明者ツジ，スチュアートワイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 94305，スタンフォード，キャンパスドライブ 121 (72)発明者コースラ，チャイタンアメリカ合衆国カリフォルニア 94306，パロアルト，ラパラアベニュー 740 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA67 CA02 CA07 DA06 DA08 EA04 GA11 HA01 4B050 CC04 CC05 DD02 EE01 LL01 LL05 4B064 AF54 CA02 CA04 CA19 CC01 CC24 DA02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】個々のモジュールから所望のポリケチドシンターゼを調製す
る方法であって、該方法は、以下：該ＰＫＳのモジュールから該ＰＫＳの次のモジュールへの新生ポリケチド鎖の
転移を促進するために、ポリペプチド内リンカー（ＲＡＬ）を含む連続的に共有
結合するモジュール、およびポリペプチド間リンカー（ＥＲＬ）を含む連続的に
非共有結合するモジュールを提供する工程；ならびに該モジュールを構築する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記構築する工程が、反応混合物中に前記モジュールを含む
ポリペプチドをインキュベートすることによってである、請求項１に記載の方法
。
【請求項３】前記構築する工程が、前記モジュールをコードする構築物を
宿主細胞中に発現させることによってである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記所望のポリケチドシンターゼ中の前記モジュールのうち
の少なくともいくつかが、Ｉ型ＰＫＳモジュールのライブラリーに由来し、そし
て該ポリケチドシンターゼ中の少なくとも１つのモジュールが、残りのモジュー
ルに対して異種である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】各ＲＡＬが、図３に示されるアミノ酸配列またはその改変体
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、そして各ＥＲＬのＮ末端部分が
、図３に示されるアミノ酸配列またはその改変体を有する、請求項１に記載の方
法。
【請求項６】請求項４に記載の方法によって調製される、ポリケチドシン
ターゼ。
【請求項７】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、エリスロ
マイシンモジュール１および３〜６、ならびにタイロシンモジュール２を含み、
そして前記ポリケチド鎖が、ｅｒｙモジュール１からｔｙｌモジュール２に、次
いでｅｒｙモジュール３〜６に転移される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項８】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、エリスロ
マイシンモジュール１〜５およびナルボマイシンモジュール６を含み、前記ポリ
ケチド鎖がｅｒｙモジュール１〜５からｎａｒモジュール６に渡される、ポリケ
チドシンターゼ。
【請求項９】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、エリスロ
マイシンのモジュール１および３〜６、ならびにタイロシン、スピラマイシンま
たはニダマイシンのモジュール２〜３を含み、前記ポリケチド鎖が、ｅｒｙモジ
ュール１からタイロシン、スピラマシインまたはニダマイシンのモジュール２〜
３に、次いでｅｒｙモジュール３〜６に渡される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１０】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、タイロ
シン、スピラマイシンまたはニダマイシンのモジュール１〜３、およびエリスロ
マシンのモジュール３〜６を含み、そして前記ポリケチド鎖が、該タイロシン、
該スピラマシインまたは該ニダマイシンのモジュール１〜３からｅｒｙモジュー
ル３〜６に渡される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１１】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、タイロ
シン、スピラマイシンまたはニダマイシンのモジュール、ならびにエリスロマシ
ンのモジュール１〜２および３〜６を含み、前記ポリケチド鎖が、ｅｒｙモジュ
ール１〜２から該タイロシン、該スピラマシインまたは該ニダマイシンのモジュ
ールに、次いでｅｒｙモジュール３〜６に渡される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１２】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、エリス
ロマシンのモジュール１および３〜６、ならびにエノイルレダクターゼ触媒活性
を不活性化された、タイロシン、スピラマイシンまたはニダマイシンのモジュー
ル５を含み、前記ポリケチド鎖が、ｅｒｙモジュール１からタイロシン、スピラ
マシインまたはニダマイシンのモジュール５に、次いでｅｒｙモジュール３〜６
に渡される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１３】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、エリス
ロマシンのモジュール１〜４および６、ならびにスピラマイシンまたはニダマイ
シンのモジュール６を含み、前記ポリケチド鎖が、ｅｒｙモジュール１〜４から
スピラマシインまたはニダマイシンのモジュール６に、次いでｅｒｙモジュール
６に渡される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１４】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、ＦＫ−
５０６／５２０のモジュール１およびラパマイシンのモジュール２〜１４を含み
、前記ポリケチド鎖が、ＦＫ−５０６／５２０のモジュール１から次いでラパマ
シンのモジュール２〜１４に渡される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１５】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、ラパマ
イシンのモジュール１および１１〜１４、ならびにＦＫ−５０６／５２０のモジ
ュール２〜６を含み、前記ポリケチド鎖が、ラパマシインのモジュール１からＦ
Ｋ−５０６／５２０のモジュール２〜６に、次いでラパマイシンのモジュール１
１〜１４に渡される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１６】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、ラパマ
イシンのモジュール１、ＦＫ−５０６／５２０のモジュール２〜７、およびラパ
マイシンのモジュール１２〜１４を含み、前記ポリケチド鎖が、ラパマシインの
モジュール１からＦＫ−５０６／５２０のモジュール２〜７に、次いでラパマイ
シンのモジュール１２〜１４に渡される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１７】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、ラパマ
イシンのモジュール１、ＦＫ−５０６／５２０のモジュール２〜８、およびラパ
マイシンのモジュール１３〜１４を含み、前記ポリケチド鎖が、ラパマシインの
モジュール１からＦＫ−５０６／５２０のモジュール２〜８に、次いでラパマイ
シンのモジュール１３〜１４に渡される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１８】請求項６に記載のポリケチドシンターゼであって、ラパマ
イシンのモジュール１〜１０、およびＦＫ−５０６／５２０のモジュール７〜１
０を含み、前記ポリケチド鎖が、ラパマシインのモジュール１〜１０からＦＫ−
５０６／５２０のモジュール７〜１０に渡される、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１９】所望のポリケチドを調製する方法であって、該方法は、必
要とされる基質と、請求項６に記載のポリケチドシンターゼとをインキュベート
する工程を包含する、方法。
【請求項２０】前記基質が、必要とされる伸長ユニットの１つのジケチド
チオエステルおよび複数のジケチドチオエステルを含む、請求項１９に記載の方
法。
【請求項２１】前記伸長ユニットがマロニルチオエステル、メチルマロニ
ルチオエステル、エチルマロニルチオエステルまたはヒドロキシマロニルチオエ
ステルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】請求項１９の方法を包含する方法によって合成される、ポ
リケチドまたはポリケチド誘導体。