JP2002536009A - ヒト脱共役タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 治療、診断及び薬理遺伝学的適用が可能な、新規なヒトポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】概論 本発明は、新規なヒトポリヌクレオチド配列およびそれによってコードされる
新規なポリペプチドの発見、同定および特性に関する。本発明は、本明細書に記
載するポリヌクレオチド、宿主細胞発現系、コードされるタンパク質またはポリ
ペプチド、およびそれらに由来する融合タンパク質およびペプチド、コードされ
るタンパク質またはペプチドに対する抗体、および開示する配列からの機能産物
を産生しない遺伝子操作動物、または開示する配列を過剰発現する遺伝子操作動
物、並びに記載するタンパク質のアンタゴニストとアゴニスト、並びに診断、薬
物スクリーニング、臨床試験モニタリング、生理的障害または行動異常の治療、
または生活の質を改善することに使用することができる開示ポリヌクレオチドに
よってコードされるタンパク質の発現または活性を調節する他の化合物を包含す
る。背景技術 脱共役タンパク質（ＵＣＰｓ）は、ミトコンドリアに存在するが、核内でコー
ドされている。ミトコンドリアにてＵＣＰｓは、細胞／体内におけるエネルギー
生産を起こすグラジエントを脱共役または調節する。このように、ＵＣＰｓは効
果的に体内のエネルギー生産効率を調節し、それ故に体代謝を調節する。体内で
ＵＣＰｓの与えられた役割から、ＵＣＰｓは熱発生、肥満、カヘキシー、および
他の代謝と関連した生理作用、疾患、および異常の研究における重要なターゲッ
トと考えられている。発明の概要 本発明は、新規なヒトタンパク質をコードするヌクレオチド、およびそれらの
タンパク質の相当するアミノ酸配列の発見、同定および特性に関する。新規なヒ
トタンパク質（ＮＨＰｓ）は、種々の動物種から得た脱共役タンパク質と構造上
の類似性を有することを本明細書に初めて記載した。

【０００２】 新規なヒト核酸（ｃＤＮＡ）配列は、タンパク質／２９１のオープンリーディ
ングフレーム（ＯＲＦｓ）および２９３個のアミノ酸（それぞれ配列番号２およ
び４参照）をコードすることを本明細書に記載した。

【０００３】 本発明は下記のものを包含する。小型分子、大型分子、変異ＮＨＰｓ、または
天然ＮＨＰｓと競合するその部分を含む前記ＮＨＰｓのアゴニストおよびアンタ
ゴニスト、ＮＨＰペプチド、および抗体、並びに前記ＮＨＰｓの発現を阻害する
ために（例えば、アンチセンスおよびリボザイム分子、および遺伝子または調節
配列の置換構築体）、または前記ＮＨＰｓの発現を高めるために（例えば、強力
なプロモーター系の制御下に前記遺伝子をおく発現構築体）使用することができ
るヌクレオチド配列、およびＮＨＰトランスジーンを発現するトランスジェニッ
ク動物、または機能性ＮＨＰを発現しない（条件付きであってもよい）“ノック
アウト体”。前記配列のネズミオーソログの変異した、遺伝子トラップされたノ
ックアウト胚幹細胞セルラインを作製した。

【０００４】 更に、本発明は、前記ＮＨＰおよび／またはＮＨＰ生成物の精製物、またはそ
れを発現している細胞を利用する、ＮＨＰ発現および／またはＮＨＰ活性を調節
する化合物、すなわちアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物を
同定する方法に関する。そのような化合物は、生物学的異常または平衡異常に関
連した多様な症状のいずれかを処置するための治療薬として使用しうる。配列表と図面の説明 配列表に、前記ＮＨＰアミノ酸配列をコードするＮＨＰのＯＲＦｓ配列を示す
。発明の詳細な記述 記載したＮＨＰｓのｃＤＮＡ配列（配列番号１および３）および推定されるア
ミノ酸配列（配列番号２および４）を配列表に示した。ＮＨＰｃＤＮＡ配列は、
ヒトリンパ節、腎臓、および胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Edge Biosystems, G
aithersburg,MD）から、記載したＮＨＰｓの遺伝子トラップした配列タグおよび
ヒトホモログから得たプローブおよび／またはプライマーを使用して取得した。
逆転写ＰＣＲ解析は、記載したＮＨＰｓの発現を、とりわけヒト小脳、脊髄、胸
腺、脾臓、リンパ節、骨髄、気管、肺、腎臓、胎児肝臓、前立腺、精巣、甲状腺
、唾液腺、胃、心臓、子宮、および乳腺において、特に腎臓、副腎、および骨格
筋において強く発現していることを検出することができることを示唆している。
上記の発現研究は、大部分ノーザン解析によっても確かめられ、特にヒト骨格筋
、心臓、副腎、および腎臓において強い発現を検出した。

【０００５】 本発明は下記のものを包含する。配列表に示したヌクレオチド、それらのヌク
レオチドを発現する宿主細胞、およびそれらのヌクレオチドの発現生成物、なら
びに：（ａ）特に前記ＮＨＰｓを含む前記遺伝子生成物の哺乳動物相同体をコー
ドするヌクレオチドおよびＮＨＰ生産物；（ｂ）ＮＨＰの機能性ドメインに相当
するＮＨＰの１以上の部分をコードするヌクレオチド、およびそれらのヌクレオ
チド配列により特定されるポリペプチド生成物（いずれかの活性ドメイン（１以
上の）の新規領域が含まれるが、それらに限定されない）；（ｃ）前記ＮＨＰの
遺伝子工学的に形成した変異形または天然の変異形であって、少なくとも１つの
ドメインの全部または一部が欠失または変化したものをコードする単離ヌクレオ
チド、およびそれらのヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド生成物（
シグナル配列の全部または一部を欠失する可溶性タンパク質およびペプチドが含
まれるが、それらに限定されない）；（ｄ）ＮＨＰのコード領域の全部または一
部、または他のペプチドまたはポリペプチドに融合したそのドメインの一つ（た
とえば受容体／リガンド結合ドメイン、アクセサリータンパク質／自己結合ドメ
インなど）を含むキメラ融合タンパク質をコードするヌクレオチド；または（ｅ
）オリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、二本鎖Ｒ
ＮＡ、または配列表に開示した新規配列を含む遺伝子治療構成物のような、前記
ポリヌクレオチドの治療上または診断上の派生物、を含む。上述のように、本発
明は、（ａ）配列表に示したヒトＤＮＡ配列（および、それを含むベクター）、
および配列表に示したＤＮＡ配列の相補配列に高緊縮条件下で［たとえば０．５
Ｍ ＮａＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ
中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×
ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ
ａｌ．編，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ社，ニュ
ーヨーク，ｐ．２．１０．３）］ハイブリダイズし、機能的に均等な遺伝子生成
物をコードする、連続したＮＨＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコ
ードする、いかなるヌクレオチド配列、または配列表に示した新規連続エクソン
スプライスジャンクションをコードするいかなるヌクレオチド配列も考慮される
。

【０００６】 さらに、配列表に示したアミノ酸配列をコードおよび発現するＤＮＡ配列の相
補配列に中等度緊縮条件下でハイブリダイズし［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．
１％ ＳＤＳ中、４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，前
掲）］、なおかつ機能的に均等なＮＨＰ遺伝子生成物をコードする、いかなるヌ
クレオチド配列も考慮される。ＮＨＰの機能均等物には、他の種に存在する天然
ＮＨＰ、および天然の、または遺伝子工学的に作成した変異ＮＨＰ（部位特異的
変異誘発、遺伝子シャフリング、たとえばＵＳＰ５，８３７，４５８に記載され
る特異的進化による）が含まれる。本発明には、開示したＮＨＰポリヌクレオチ
ド配列の縮重核酸バリアントも含まれる。

【０００７】 更に、ＮＨＰ ＯＲＦをコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等
のものであり、配列表に示したヌクレオチド配列の相当する部分とと約９９、９
５、９０、または約８５パーセント類似または同一であるポリヌクレオチド配列
によってコードされている（ＢＬＡＳＴ配列比較解析によって測定した結果であ
って、例えば、標準デフォルト設定によるＧＣＧ配列解析パッケージを使用）。

【０００８】 本発明には、前記ＮＨＰ遺伝子ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、した
がって前記ＮＨＰ遺伝子の相補配列である核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含
まれる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、前記のように高緊縮であっ
てもよく、または緊縮度がより低くてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレ
オチド（”ＤＮＡオリゴ体”）である場合、その分子は一般的に約１６〜約１０
０塩基、約２０〜約８０塩基、または約３４〜約４５塩基の長さ、または本発明
の配列表に初めて開示した配列の連続領域を含む、そこに示すサイズの任意の変
更または組合わせである。そのようなオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）に関連して用いて、ライブラリーのスクリーニング、クローンの
単離、クローニングおよび配列決定の鋳型調製などができる。

【０００９】 あるいは、そのようなＮＨＰオリゴヌクレオチドを、ライブラリーのスクリー
ニングおよび遺伝子発現パターンの評価のためのハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いることができる（特にマイクロアレイまたはハイスループット”チ
ップ”フォーマットを用いて）。さらに、一連の前記ＮＨＰオリゴヌクレオチド
配列またはその相補配列を用いて、前記ＮＨＰ配列の全部または一部を発現させ
ることができる。一般に長さ約１６〜約４０（または前記範囲のうちの任意の自
然数）ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが互いに部分的にオーバーラップして
もよく、および／またはオーバーラップしないオリゴヌクレオチドを用いてＮＨ
Ｐ配列を発現させることができる。したがって前記ＮＨＰポリヌクレオチド配列
は一般に、それぞれ本明細書の配列表に初めて開示した、少なくとも約１８、好
ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの長さの別個のオリゴヌクレオチドを少
なくとも約２つまたは３つ含むはずである。そのようなオリゴヌクレオチド配列
は、配列表中の配列内に存在するいずれかのヌクレオチドから始まり、前記配列
に対してセンス（５’−から−３’へ）配向またはアンチセンス配向のいずれで
進行してもよい。

【００１０】 オリゴヌクレオチドプローブに関して、高緊縮条件とは、たとえば６×ＳＳＣ
／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基オリゴ体について）、
４８℃（１７塩基オリゴ体について）、５５℃（２０塩基オリゴ体について）、
および６０℃（２３塩基オリゴ体について）での洗浄を表す。これらの核酸分子
は、たとえばＮＨＰ遺伝子調節に有用なＮＨＰ遺伝子アンチセンス分子をコード
し、またはそれらの分子として作用することができる（ＮＨＰ遺伝子核酸配列の
増幅反応におけるアンチセンスプライマーを得るために、および／またはアンチ
センスプライマーとして）。ＮＨＰ遺伝子調節に関しては、それらの方法を用い
て生物学的機能を調節することができる。さらに、そのような配列を、同様にＮ
ＨＰ遺伝子調節に有用なリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として
使用できる。

【００１１】 阻害的アンチセンスまたは二本鎖オリゴヌクレオチドは、下記を含めた群（こ
れらに限定されない）から選択される少なくとも１個の修飾塩基部分を含むこと
ができる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、
５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５
−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチ
ル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロ
ウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペン
テニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル
グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５
−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメ
チルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マ
ンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキ
シウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−
オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−
チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウ
ラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラ
シル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミ
ノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，
６−ジアミノプリン。

【００１２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノー
ス、キシルロースおよびヘキソースを含めた（これらに限定されない）群から選
択される少なくとも１個の修飾糖部分を含むこともできる。

【００１３】 さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオ
エート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデー
ト、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル
およびホルムアセタール、またはその類似体よりなる群から選択される少なくと
も１個の修飾リン酸主鎖を含む。

【００１４】 さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマーオ
リゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ−単位
と異なり、鎖が互いに平行に走行する特異的な二本鎖ハイブリッドを相補的ＲＮ
Ａと形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは２’−
Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−
ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２
１５：３２７−３３０）である。あるいは、二本鎖ＲＮＡは標的ＮＨＰの発現お
よび作用を破壊するために使用しうる。

【００１５】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準法により、たとえば
自動ＤＮＡ合成装置（たとえばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されているもの）を用いて合成できる。一例として、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳｔｅｉｎらの方法（１９８８，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：３２０９）により合成でき、メチルホスホ
ネートオリゴヌクレオチドは制御ポアガラスポリマー支持体を用いて製造できる
（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：７４４８−７４５１）など。

【００１６】 低緊縮条件は当業者に周知であり、ライブラリーおよび標識配列が由来する個
々の生物に応じて異なるが、推定可能であろう。そのような条件に関する手引き
については、たとえば下記を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，
１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（およびその定期的改訂版），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１
９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓおよ
びＷｉｌｅｙ ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク。

【００１７】 あるいは、適切な緊縮条件を採用し、またはＰＣＲにより、ヒトゲノムライブ
ラリーをスクリーニングするために、適切に標識したＮＨＰヌクレオチドプロー
ブを用いることができる。ヒトゲノムクローンの同定および解明は、多型性の確
認（ヌクレオチドリピート、ミクロサテライト対立遺伝子、単一ヌクレオチド多
型性、またはコーディング単一ヌクレオチド多型性に限定されないが、これらを
含む。）、特定の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造の決定、および診断試験の
設計に有用である。たとえばヒト遺伝子のイントロン／エクソン境界に隣接する
領域に由来する配列を用いて、エクソン、イントロン、スプライス部位（たとえ
ばスプライスアクセプターおよび／またはドナー部位）内などの変異を検出する
ための増幅アッセイに用いるプライマーを設計し、これらを診断および薬理ゲノ
ミックに使用できる。

【００１８】 さらに、本明細書に記載するＮＨＰ産物内のアミノ酸配列に基づいて設計した
２つの縮重または“オブル（ｗｏｂｂｌｅ）”オリゴヌクレオチドプライマープ
ールを用いてＰＣＲを行うことにより、目的生物の核酸からＮＨＰ遺伝子相同配
列を単離できる。反応の鋳型は、ＮＨＰ遺伝子／対立遺伝子を発現することが分
かっているかまたは推測される、ヒトまたは非ヒト細胞系または組織から調製し
たｍＲＮＡの逆転写により得られる全ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ
であってよい。

【００１９】 増幅配列が目的ＮＨＰ遺伝子の配列であることを確認するために、ＰＣＲ生成
物をサブクローニングして配列決定することができる。次いでそのＰＣＲフラグ
メントを用いて多様な方法で全長ｃＤＮＡクローンを単離できる。たとえば増幅
フラグメントを標識し、ｃＤＮＡライブラリー、たとえばバクテリオファージｃ
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用できる。あるいは、標識フラグメン
トを用いて、ゲノムライブラリーのスクリーニングによりゲノムクローンを単離
することができる。

【００２０】 ＰＣＲ法を利用して、全長ｃＤＮＡ配列を単離することもできる。たとえば標
準法により、適切な細胞源または組織源（すなわち、ＮＨＰ遺伝子を発現するこ
とが分かっているかまたは推測されるもの、たとえば精巣組織）からＲＮＡを単
離できる。このＲＮＡについて、最も５’末端の増幅フラグメントに特異的なオ
リゴヌクレオチドプライマーを第１鎖合成のプライミングに用いて、逆転写（Ｒ
Ｔ）反応を行うことができる。次いで得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを標
準的なターミナルトランスフェラーゼ反応により”テイル形成”し、このハイブ
リッドをＲＮａｓｅ Ｈで消化し、次いで相補プライマーにより第２鎖合成をプ
ライミングすることができる。こうして、増幅フラグメントの上流のｃＤＮＡ配
列を単離できる。使用できるクローニング方式の概説については、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９（前掲）を参照されたい。

【００２１】 変異ＮＨＰ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、たとえばＰＣＲを用いて単離でき
る。この場合、第１ｃＤＮＡ鎖は、変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有すると推定され
る個体において発現することが分かっているかまたは推測される組織から単離し
たｍＲＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、この新
たな鎖を逆転写酵素で延長することにより合成できる。次いで正常遺伝子の５’
末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて、第２ｃＤＮＡ
鎖を合成する。次いでこれら２プライマーを用いて、生成物をＰＣＲにより増幅
させ、所望により適切なベクター中へクローニングし、当業者に周知の方法でＤ
ＮＡ配列分析を行う。変異ＮＨＰ対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常なＮＨＰ対立遺
伝子のものと比較することにより、変異ＮＨＰ遺伝子生成物の機能の喪失または
変化に関与する変異（１以上）を確認できる。

【００２２】 あるいは、変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有することが推測されるかもしくは分か
っている個体（例えば、肥満、高血圧、結合組織疾患、不妊症などのＮＨＰ関連
表現形を呈示しているヒト）から得たＤＮＡを用いてゲノムライブラリーを構築
することができ、または変異ＮＨＰ対立遺伝子を発現することが分かっているか
もしくは推測される組織からのＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築する
ことができる。次いで、正常なＮＨＰ遺伝子、またはそのいずれか適切なフラグ
メントを標識してプローブとして用い、そのようなライブラリー中の対応する変
異ＮＨＰ対立遺伝子を同定することができる。次いで、確立されている方法で変
異ＮＨＰ遺伝子配列を含むクローンを精製し、配列分析することができる。

【００２３】 さらにたとえば、変異対立遺伝子を保有することが推測されるかまたは分かっ
ている個体の、変異ＮＨＰ対立遺伝子を発現することが分かっているかまたは推
測される組織より単離したＲＮＡから合成したｃＤＮＡを利用して、発現ライブ
ラリーを構築できる。この方法で、推定変異組織が形成した遺伝子生成物を発現
させ、正常ＮＨＰ生成物に対して産生された抗体と組み合わせた標準抗体スクリ
ーニング法を用いてスクリーニングすることができる（スクリーニング法につい
ては、たとえばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ編，１９８８，”Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，コールド・スプリング・ハーバー，参照）
。

【００２４】 さらに、標識ＮＨＰ融合タンパク質、たとえばＡＰ−ＮＨＰまたはＮＨＰ−Ａ
Ｐ融合タンパク質を用いてスクリーニングを行うことができる。ＮＨＰ融合によ
り機能の変化した遺伝子生成物が発現する場合（たとえばミスセンス変異または
フレームシフト変異の結果）、ＮＨＰに対するポリクローナル抗体が対応する変
異ＮＨＰ遺伝子生成物と交差反応すると思われる。それらとそのような標識抗体
との反応により検出されるライブラリークローンを当業者に周知の方法で精製し
、配列分析することができる。

【００２５】 本発明は下記のものをも包含する：（ａ）前記ＮＨＰコード配列および／また
はそれらの相補配列（すなわちアンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター
；（ｂ）コード配列の発現を指令する調節要素に機能可能な状態で結合した前記
ＮＨＰコード配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター（例えば、参照により本
明細書中に援用する米国特許番号５８６９３３６に記載されているバキュロウイ
ルス）；（ｃ）宿主細胞におけるコード配列の発現を指令する調節要素に機能可
能な状態で結合した前記ＮＨＰコード配列のいずれかを含む、遺伝子工学的に処
理した宿主細胞；ならびに（ｄ）内因性ＮＨＰ遺伝子を外から導入した調節要素
による制御（すなわち遺伝子活性化）下で発現する、遺伝子工学的に処理した宿
主細胞。本明細書中で用いる調節要素には、誘導性および非誘導性のプロモータ
ー、エンハンサー、オペレーター、ならびに発現を駆動および調節することが当
業者に知られている他の要素が含まれるが、これらに限定されない。それらの調
節要素には、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：サイトメガロウ
イルスｈＣＭＶ極初期遺伝子の調節可能なウイルス（特にレトロウイルスＬＴＲ
プロモーター）、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａ
ｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ｔｅｃ系、ファージラムダの主オペレー
ターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグ
リセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモー
ター、ならびに酵母α−接合因子のプロモーター。

【００２６】 本発明は下記のものをも包含する：抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂ
フラグメントが含まれる）、ＮＨＰのアンタゴニストおよびアゴニスト、ならび
にＮＨＰ遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはヌクレオチド構築体（転写因子
阻害薬、アンチセンス分子およびリボザイム分子、または遺伝子もしくは調節配
列置換構築体）、またはＮＨＰの発現を促進する化合物もしくはヌクレオチド（
たとえばＮＨＰのコード配列がプロモーター、プロモーター／エンハンサーなど
の発現制御要素と機能可能な状態で結合した発現構築体など）。

【００２７】 ＮＨＰｓもしくはＮＨＰペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、およびＮＨＰヌク
レオチド配列、抗体、アンタゴニストおよびアゴニストは、疾病の診断のために
変異ＮＨＰｓまたは不適正発現したＮＨＰｓを検出するのに有用となりうる。前
記ＮＨＰタンパク質またはペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチ
ド配列、宿主細胞発現系、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、および遺伝子工
学的に処理した細胞および動物は、体内における正常なＮＨＰ機能の撹乱の症候
性発現または表現型発現を処理するのに有効な候補を同定する薬物スクリーニン
グ（またはコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニング）
にも使用できる。遺伝子工学的に処理した宿主細胞および／または動物の使用は
、それらの系によりＮＨＰに対する内在性受容体と結合できる化合物を同定でき
るだけでなく、ＮＨＰ仲介活性、またはプロセスの引金を引く（トリガーする）
化合物をも同定できるという点で、有利である。

【００２８】 最後に、ＮＨＰ生成物は治療として用いることができる。例えば、ＮＨＰに対
応するＮＨＰペプチド／ドメインのような可溶性誘導体、ＮＨＰ融合タンパク質
生成物（特にＮＨＰ−Ｉｇ融合タンパク質、すなわちＩｇＦｃへのＮＨＰの融合
またはドメイン）、ＮＨＰ抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメン
トを含める）、アンタゴニストまたはアゴニスト（これらはＮＨＰ仲介信号伝達
経路における下流ターゲットを調節する、または該ターゲットに作用する化合物
を含める。）を用いて、疾病または障害を直接に処置することができる。たとえ
ば、有効量の可溶性ＮＨＰ、またはＮＨＰを模倣するＮＨＰ−ＩｇＦｃ融合タン
パク質もしくは抗イディオタイプ抗体（またはそのＦａｂフラグメント）の投与
により、内因性ＮＨＰ受容体またはＮＨＰアクセサリータンパクを活性化または
中和することができるであろう。そのようなＮＨＰ生成物をコードするヌクレオ
チド構築体を用いて、そのような生成物をインビボで発現するように宿主細胞を
遺伝子工学的に処理することができる；遺伝子工学的に処理したこれらの細胞は
体内で”バイオリアクター”として作用し、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチド、またはＮ
ＨＰ融合タンパク質を身体に連続的に供給する。機能性ＮＨＰ、変異ＮＨＰ、な
らびにアンチセンス分子およびリボザイム分子をコードするヌクレオチド構築体
は、ＮＨＰ発現を調節する”遺伝子療法”方式にも使用できる。したがって本発
明は、生物学的障害を処置するための医薬配合物および方法をも包含する。

【００２９】 本発明の多様な態様について、以下の各サブセクションにさらに詳細に記載す
る。 ５．１ ＮＨＰ配列 前記ＮＨＰのｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を配列表に示す。ＮＨＰヌ
クレオチドはヒトのｃＤＮＡライブラリーから、ヒト遺伝子トラップした配列タ
グに由来するプローブおよび／またはプライマーを用いて得られた。発現解析に
より、前記ＮＨＰは様々なヒト細胞並びに遺伝子トラップヒト細胞において発現
可能であることが示された。ＮＨＰｓは、脱共役タンパクと配列上および構造上
の類似性を有する。同様のタンパクは、代謝、脂肪産生、および体重の制御に関
係していることが示されている。

【００３０】 ５．２ ＮＨＰｓおよびＮＨＰポリペプチド ＮＨＰｓ、ＮＨＰポリペプチド、ＮＨＰペプチドフラグメント、変異、トラン
ケートもしくは欠失形のＮＨＰ、および／またはＮＨＰ融合タンパク質を、多様
な用途のために調製することができる。これには、抗体産生、診断アッセイにお
ける試薬として、ＮＨＰに関連した他の細胞遺伝子生成物の同定、精神的、生物
学的または医学的な障害および疾病の療法処置に有用な医薬となりうる化合物の
スクリーニングのためのアッセイにおける試薬としての用途が含まれるが、これ
らに限定されない。

【００３１】 配列表に、前記ＮＨＰポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を開
示する。ＮＨＰｓは、翻訳開始部位に一致するＤＮＡ配列コンテクストにイニシ
エーターメチオニンをもち、明らかに前記ＮＨＰｓ ＯＲＦｓが分泌タンパクま
たは膜結合タンパクであることを示唆する、シグナル配列を有する。

【００３２】 本発明のＮＨＰアミノ酸配列には、配列表に示したアミノ酸配列、ならびにそ
の類似体および誘導体、並びに配列表に開示した新規な少なくとも約１０−４０
、一般的には１２−３５、または約１６−３０アミノ酸長のいずれかのオリゴヌ
クレオチド配列を含む。さらに、他の種に由来する対応するＮＨＰ相同配列も本
発明に包含される。事実、上述のＮＨＰヌクレオチド配列によってコードされる
いずれかのＮＨＰは、本発明の範囲に含まれ、配列表に示したアミノ酸配列の全
部またはいずれかの新規部分をコードする新規ポリヌクレオチド配列も同様に本
発明に含まれる。遺伝子コードの縮重性は周知であり、したがって配列表に示し
た各アミノ酸はそのアミノ酸をコードしうる周知の核酸”トリプレット”コドン
（または多くの場合コドン類）の一般的代表例である。したがって、本明細書で
意図するように、配列表に示したアミノ酸配列は、遺伝子コード（たとえば”Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９８６，Ｊ．Ｄａｒｎｅｌ
ｌら編，ｐ．１０９，表４−１参照，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク州ニューヨーク；本明細書に参考として援用）を合
わせて考慮すると、そのようなアミノ酸配列をコードしうる核酸配列の種々の変
形および組合わせすべてのうちの一般的代表例である。

【００３３】 本発明は、多数の基準のいずれかにより判定して、本明細書に記載したヌクレ
オチド配列がコードするＮＨＰに機能的に均等なタンパク質をも包含する。これ
らの基準には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ＮＨＰ基質と結
合または開列する能力；均等もしくは相補的な信号伝達、細胞代謝の変化（たと
えば、蛋白分解活性、イオンフラックスまたはグラジエント、チロシンリン酸化
など）。そのような機能的に均等なＮＨＰタンパク質には、上述のＮＨＰヌクレ
オチド配列がコードするアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加体または置換体で
あって、ただしサイレント変化を生じ、したがって機能的に均等な遺伝子生成物
を産生するものが含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸置換は、関与す
る残基の極性、電荷、溶解度、疎水度、親水度および／または両親媒性の類似性
に基づいて行うことができる。たとえば非極性（疎水性）アミノ酸残基にはアラ
ニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプ
トファンおよびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、
トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ；
正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンが含
まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアルギニン酸およびグルタミン酸が含
まれる。

【００３４】 多様な宿主発現ベクター系を利用して、本発明のＮＨＰヌクレオチド配列を発
現させることができる。ＮＨＰ生産物またはＮＨＰポリペプチドが可溶型または
分泌型（適切であれば、１またはそれ以上の膜貫通ドメイン除去することによっ
て）であれば、ペプチドまたはポリペプチドを培地から、採集することができる
。しかしそのような発現系には、ＮＨＰまたはその機能均等物をｉｎ ｓｉｔｕ
で発現する、工学的に処理した宿主細胞も包含される。そのような発現系からの
ＮＨＰの精製または富化は、適切な界面活性剤および脂質ミセル、ならびに当業
者に周知の方法を用いて行うことができる。しかし、ＮＨＰの構造特性および機
能特性を維持するだけでなく、たとえば薬物スクリーニングアッセイにおいて生
物学的活性を評価することが重要である場合、そのような工学的に処理した宿主
細胞自体を使用できる。

【００３５】 本発明の目的に使用できる発現系には下記のものが含まれるが、それらに限定
されない：ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プ
ラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した微生物、た
とえば細菌（たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
））；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵
母（たとえばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃ
ｈｉａ））；ＮＨＰ配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロ
ウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコ
モザイクウイルス，ＴＭＶ）を感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベク
ター（たとえばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細
胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）
または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（たとえばアデノウイルス後期
プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構
築体を宿した哺乳動物細胞系（たとえばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２３９、３Ｔ
３）。

【００３６】 細菌系では、発現するＮＨＰ生成物について意図する用途に応じて、多数の発
現ベクターを有利に選択できる。たとえばＮＨＰを含有する医薬組成物を調製す
るために、あるいはＮＨＰに対する抗体を産生させるために、そのようなタンパ
ク質を大量に製造したい場合、容易に精製される融合タンパク質生成物の高レベ
ル発現を指令するベクターが望ましいことがある。そのようなベクターには下記
のものが含まれるが、それらに限定されない：大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８
（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ Ｊ．，２：１７９１）、
この場合、ＮＨＰコード配列を個々に、融合タンパク質が産生されるようにｌａ
ｃＺコード領域と読み枠を一致させて、ベクターにライゲートさせることができ
る；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆
Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５５０３
−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（ファルマシアもしくはアメリカンタイプ
カルチャーコレクション）を用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。
一般にそのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞からグルタチオン−
アガロースビーズへの吸着、次いで遊離グルタチオンの存在下での溶離によって
、容易に精製できる。ＰＧＥＸベクターがトロンビンまたはＸａ因子プロテアー
ゼ開裂部位を含むように設計し、これにより、クローン化したターゲット遺伝子
生成物をＧＳＴ部分から放出させることができる。

【００３７】 昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヒドロー
シスウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｉｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（Ａ
ｃＮＰＶ）を外来遺伝子発現のためのベクターとして用いる。ウイルスはＳｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖する。ＮＨＰ遺伝子コード
配列を個々にウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）内へクロー
ン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御
下におく。ＮＨＰ遺伝子コード配列の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺伝子が
不活性化され、ノンオクルーデッド（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換えウイル
ス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子がコードするタンパク質性コートをもたない
ウイルス）が産生されるであろう。次いでこれらの組換えウイルスをＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の感染に用い、ここで挿入遺伝子を発現
させる（たとえばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６
：５８４；Ｓｍｉｔｈ，ＵＳＰ４，２１５，０５１参照）。

【００３８】 哺乳動物宿主細胞の場合、多数のウイルス性発現系を利用できる。アデノウイ
ルスを発現ベクターとして用いる場合、目的とするＮＨＰ遺伝子ヌクレオチド配
列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーターおよび三
部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートさせることができる。
次いでこのキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイル
スゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ
３）に挿入すると、生存可能な、感染宿主においてＮＨＰ生成物を発現しうる組
換えウイルスが得られる（たとえばＬｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９）。
挿入したＮＨＰ遺伝子ヌクレオチド配列の効率的翻訳には、特異的開始シグナル
が必要な可能性もある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配
列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全ＮＨＰ遺伝子また
はｃＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入する場合、追加の翻訳制御シグナルは必
要ないかもしれない。しかしＮＨＰコード配列の一部のみを挿入する場合、外因
性翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）を供給しなければな
らない。さらに、挿入配列全体を確実に翻訳するためには、開始コドンが目的コ
ード配列の読み枠と一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル
および開始コドンは、天然および合成のいずれでも、多様な由来のものであって
よい。適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを取り込ませるこ
とにより、発現効率を高めることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６−５４４）
。

【００３９】 さらに、挿入配列の発現を調節し、または遺伝子生成物を目的とする特定の様
式で修飾およびプロセシングする、宿主細胞系統を選ぶことができる。タンパク
質生成物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）およびプロセシング（たと
えば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タン
パク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセシングおよび修飾に特徴的かつ特異的
な機序をもつ。発現した外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実
にするために、適切な細胞系または宿主系を選ぶことができる。このために、一
次転写体の適正なプロセシング、遺伝子生成物のグリコシル化およびリン酸化の
ための細胞機構をもつ真核宿主細胞を使用できる。そのような哺乳動物宿主細胞
にはＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３
、ＷＩ３８、特にヒト細胞系が含まれるが、これらに限定されない。

【００４０】 組換えタンパク質の長期高収率産生のためには、安定な発現が好ましい。たと
えば前記ＮＨＰ配列を安定に発現する細胞系を工学的に作成することができる。
ウイルス起源の複製を含む発現ベクターを用いるのではなく、適切な発現制御要
素（たとえばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデ
ニル化部位など）により制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができ
る。外来ＤＮＡの導入後、工学的に作成した細胞を富化培地で１〜２日間増殖さ
せ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択性マーカーが選択
に対する耐性を与え、細胞はそのプラスミドを細胞の染色体に安定に組み込むこ
とができ、増殖してフォーカスを形成する。次いでこれをクローン化し、細胞系
に拡張することができる。この方法は、目的ＮＨＰ生成物を発現する細胞系を工
学的に作成するのに有利に使用できる。このような工学的に作成した細胞系は、
ＮＨＰ生成物の内因活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価に特
に有用である。

【００４１】 多数の選択系を使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定さ
れない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．
，１９７７，Ｃｅｌｌ，１１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９
６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６）、お
よびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ ａｌ．，１
９８０，Ｃｅｌｌ，２２：８１７）遺伝子を、それぞれｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-また
はａｐｒｔ^-細胞に使用できる。代謝拮抗物質耐性を下記の遺伝子の選択の基礎
として用いることもできる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する耐性を
与える（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７）；ｇｐｔ、これはミ
コフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，１９
８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２）；ｎ
ｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒ
ｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１
５０：１）；およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える
（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ，３０：１４７）。

【００４２】 あるいは、発現する融合タンパク質に特異的な抗体を利用することにより、い
かなる融合タンパク質も容易に精製できる。たとえばＪａｎｋｎｅｃｈｔらが記
載した系は、ヒト細胞系において発現した非変性融合タンパク質を容易に精製で
きる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８９７２−８９７６）。この系では、目的遺伝
子をその遺伝子のオープンリーディングフレームが翻訳可能な状態で６ヒスチジ
ン残基からなるアミノ末端タグに融合するように、ワクシニア組換えプラスミド
内へサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞からの
抽出物をＮｉ²⁺・ニトリロ酢酸−アガロースカラムに装填し、ヒスチジンタグ付
きタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶離する。

【００４３】 ５．３ ＮＨＰ産物に対する抗体 １以上のＮＨＰのエピトープ、またはＮＨＰの保存バリアントのエピトープ、
またはＮＨＰのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体も、本発明に包含
される。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’
）₂フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗
イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および前記のいずれかのエピトープ結合性フ
ラグメントが含まれるが、それらに限定されない。

【００４４】 本発明の抗体は、たとえば生物学的試料中のＮＨＰの検出に使用でき、したが
って患者を異常な量のＮＨＰについて調べる診断法または予後法の一部として使
用できる。そのような抗体を、たとえば化合物スクリーニング法と組み合わせて
、またはＮＨＰ遺伝子生成物の発現および／または活性に対する被験化合物の作
用を評価するのにも利用できる。さらに、そのような抗体を遺伝子療法と組み合
わせて用いて、たとえば正常な、および／または工学的に処理したＮＨＰ発現細
胞を患者に導入する前に評価することができる。そのような抗体をさらに、異常
なＮＨＰ活性の阻害方法として使用できる。したがって、たとえばそのような抗
体を治療法の一部として利用できる。

【００４５】 抗体産生のためには、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチド（たとえばＮＨＰの機能性ドメ
インに相当するもの）、トランケートＮＨＰポリペプチド（１以上のドメインが
欠失したＮＨＰ）、ＮＨＰの機能均等物、またはＮＨＰの変異配列を注射するこ
とにより、種々の宿主動物を免疫化することができる。数例を挙げると、そのよ
うな宿主動物にはブタ、ウサギ、マウス、ヤギおよびラットが含まれるが、これ
らに限定されない。宿主の種に応じて、免疫応答を高めるために種々のアジュバ
ントを使用でき、これにはフロイントアジュバント（完全および不完全）、鉱物
ゲル、たとえば水酸化アルミニウム、界面活性剤、たとえばリゾレシチン、プル
ロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリ
ンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール
、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、たとえばＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ
Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐａｒｖｕｍが含まれるが、これらに限定されない。ポリクローナル抗体は免疫
化動物の血清から得られる不均一な抗体分子集団である。

【００４６】 特定の抗原に対する均一な抗体集団であるモノクローナル抗体は、連続した培
養細胞系により抗体分子を産生するいかなる方法によっても得ることができる。
これらには下記の方法が含まれるが、これらに限定されない：Ｋｏｈｌｅｒおよ
びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４
９５−４９７；およびＵＳＰ４，３７６，１１０）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａ
ｙ，４：７２；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリ
ドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉ
ｓｓ社，ｐｐ．７７−９６）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれかのサブクラスを含めた、いかなる免疫グロブリ
ンクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマをインビト
ロまたはインビボで培養することができる。インビボで高力価のｍＡｂを産生で
きるので、これは現在好ましい産生方法である。

【００４７】 さらに、”キメラ抗体”（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；
Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５
４）の産生のために開発された、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子からの
遺伝子を適切な生物学的活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシ
ングすることによる方法を使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物
種に由来する分子、たとえばネズミｍＡｂ由来の可変部とヒト免疫グロブリン定
常部をもつものである。

【００４８】 あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された方法（ＵＳＰ４，９４６，７
７８；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓ
ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，
Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５４４−５４６）を、ＮＨＰ遺伝子生成物に対する一本
鎖抗体の産生に適合させることができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ部のＨ鎖およびＬ
鎖フラグメントをアミノ酸橋により結合させ、一本鎖ポリペプチドにすることに
より形成される。

【００４９】 特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の方法で形成できる。
たとえばそのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により調製でき
るＦ（ａｂ’）₂フラグメント、およびＦ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィ
ド橋を還元することにより調製できるＦａｂフラグメントが含まれるが、これら
に限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１２７５−１２８１）、目的
とする特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定す
ることができる。

【００５０】 次いでＮＨＰに対する抗体を利用し、当業者に周知の方法を用いて、そのＮＨ
Ｐを”模倣”した抗イディオタイプ抗体を産生させることができる（たとえばＧ
ｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ ａｎｄ Ｂｏｎａ，１９９３，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５
）：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１４７（８）：２４２９−２４３８参照）。たとえば、ＮＨＰドメインに
結合し、ＮＨＰがそのコグネイト受容体に結合するのを競合阻害する抗体を用い
て、ＮＨＰを”模倣”する、したがって受容体に結合して活性化または中和する
抗イディオタイプ抗体を産生させることができる。そのような抗イディオタイプ
抗体またはそのような抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントは、ＮＨＰ調
節またはシグナリング経路を伴う療法に使用できる。

【００５１】 本発明の範囲は本明細書に記載した具体的態様により限定されない。これらの
態様は本発明の個々の態様を説明するために示したにすぎず、機能的に均等な方
法および成分は本発明の範囲に含まれる。実際に、本明細書に例示および記載し
たもののほか本発明の種々の変更が、以上の記載および添付の図面からから当業
者に明らかになるであろう。そのような変更も本発明の範囲に含まれる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マター，ブライアン アメリカ合衆国テキサス州77380，ザ・ウ ッドランズ，ソーミル・ロード 12000， ナンバー 2014 (72)発明者 ザンブロウィックス，ブライアン アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ファイアソーン・プレース 18 (72)発明者 サンズ，アーサー・ティー アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ブリストル・ベンド・サーク ル 163 Ｆターム(参考） 4B024 BA80 CA04 4H045 AA10 BA10 CA40

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載の新規ＮＨＰ配列中の少なくとも２４連続
   塩基のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
2. 【請求項２】 （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードし；かつ （ｂ）緊縮条件下で配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイ
   ブリダイズする ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
3. 【請求項３】 配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする単離核酸分子。
4. 【請求項４】 配列番号２に記載の新規配列中の少なくとも約１２アミノ酸
   を含む、単離オリゴペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする単離核酸分子。