JP2002533357A

JP2002533357A - 疾病の治療に有用なペプチドミミック

Info

Publication number: JP2002533357A
Application number: JP2000590480A
Authority: JP
Inventors: フェローン，ソルダノ
Original assignee: New York Medical College
Current assignee: New York Medical College
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1998-12-24
Publication date: 2002-10-08
Also published as: EP1161147A4; AU2016199A; WO2000038515A1; CA2334958A1; EP1161147A1

Abstract

(57)【要約】【解決手段】本発明は、疾患に関連する標的分子に対し免疫応答を誘導する有効量のペプチドミミックで哺乳動物を治療することを特徴とする哺乳動物におけるメラノーマ等の疾患を治療する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】

メラノーマなどの疾患の治療における現行の免疫療法的アプローチでは、ＨＭ
Ｖ−ＭＡＡや腫瘍関連抗原などの血管新生促進標的に対し、大量の抗体を受動投
与する方法がとられている。この治療戦略には、患者に対し大量のモノクロナー
ル抗体を投与することや長期間に亘り一定の高濃度抗体を患者に維持しつづける
ことの難しさのため、限界がある。

【０００２】近年、あらゆる癌や一般の疾患の他、悪性メラノーマにも能動特異的免疫療法
を応用開発するべく関心が高まっている。この傾向は、少なくとも過去において
は、いったんこの疾患が転移を起こしたら効果的治療法がないことと、抗体を用
いた受動免疫療法の臨床治験結果が余り思わしくなかったことを反映したもので
ある。種々の利用可能な免疫原には、Ｔ細胞で決定されるエピトープを発現する
ヒトメラノーマ関連抗原に由来するペプチドが科学領域において最も一般的であ
る。このアプローチへの関心は、ｉ）免疫応答の発達やＣＴＬによる標的細胞の
認識および破壊へと導く分子段階について、近年我々の知見が飛躍的に進歩した
こと、ｉｉ）メラノーマ細胞を認識するためにＣＴＬが利用するペプチドの同定
、を反映している。ペプチドを用いた免疫療法の有効性について現在多くの臨床
試験で評価が進められているが、免疫療法を受ける患者のおよそ４０%に臨床応
答が認められたことからもその有効性は明らかである。しかし、もっぱらＴ細胞
に媒介されたメラノーマ細胞の破壊にのみ依存した治療戦略は成功しているとは
いえ、メラノーマ病巣や特に転移においてよく見られるＨＬＡクラスＩ抗原及び
／又は抗原プロセシング機構の構造及び／又は機能的な異常には有効ではないと
思われる。現在Ｔ細胞に基づく免疫療法の治験の多くが転移性患者のみに対して
行われていることから、後者の所見が特に重要である。

【０００３】Ｔ細胞免疫にもっぱら依存している能動特異的免疫療法では、ＨＬＡクラスＩ
抗原及び／又は抗原プロセシング機構の異常が、その成否にマイナス効果を与え
ると考えられ、その潜在的なマイナス効果のため、ＨＭＷ−ＭＡＡに対し液性お
よび細胞性免疫の双方を誘導する必要がある。

【０００４】ＨＭＷ−ＭＡＡはメラノーマ患者においては免疫原ではないが、能動特異的免
疫療法のために選択されている。その理由は、ＨＭＷ−ＭＡＡは異質性の少ない
メラノーマ病変に高率で発現し、正常組織における分布は限定されており、その
認識はメラノーマ患者の免疫系に発現し、メラノーマ細胞の転移の潜在能力に一
定の役割を果たしているためである。故に、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体はメラノーマ
細胞の免疫破壊を媒介するのみならず、メラノーマ細胞の生物学的観点において
ＨＭＷ−ＭＡＡの機能を妨げることによりこの疾患の臨床経過上有益な効果を示
すであろう。

【０００５】

【課題を解決するための手段】

本発明は、疾患に関連する標的分子に対し免疫応答を誘導(elicit)する有効量
のペプチドミミック(peptide mimic)で哺乳動物を治療することを特徴とする。
哺乳動物におけるメラノーマ等の疾患を治療する方法を提供をするものである。また本発明は、標的分子に対し、免疫応答を誘導するペプチドミミックを提供
するものである。また本発明は、疾患に関連する標的分子に対し免疫応答を誘導できるペプチド
ミミックを発現する有効量のベクターで哺乳動物を治療することを特徴とする。
哺乳動物における疾患を治療する方法を提供するものである。更に本発明は、疾患に関連する標的分子に対し免疫応答を誘導するペプチドミ
ミックをコードする核酸分子を提供するものである。

【０００６】

【発明の実施の形態】

本発明は、哺乳動物におけるメラノーマ等の疾患の治療法を提供する。本発明
方法は疾患に関連する標的分子に対し免疫応答を誘導する有効量のペプチドミミ
ック(peptide mimic)で哺乳動物を治療することを特徴とする。対象となる疾患
は癌、関節炎、黄斑変性症、乾癬、虚血及びその他の病態であることができる。
動物は好ましくは哺乳動物であり、ヒト、又はマウス、ラット、ウサギ等の通常
の実験動物、又はウシ、ウマ、ブタ等の家畜である。

【０００７】上記の本発明方法の他に、本発明は上記方法において使用するペプチドミミッ
クも提供する。本発明のペプチドミミックは適切に免疫系に提示した場合、有効
な免疫応答を誘導する。免疫応答は好ましくは腫瘍の増殖等の疾患を妨害し、遅
延させ、阻止することで、疾患に関連する病状を阻害し又は除去する。

【０００８】本発明のペプチドミミックは、高分子量メラノーマ関連抗原等の、疾患経過に
関連するいかなる標的分子をも擬態化(mimic)することができるが、これらに限
定されない。更に本発明ペプチドミミックは疾患経過に関連するレセプター、例
えばｆｌｋ−１、ｆｌｔ−１、及びＫＤＬ；又はビトロネクチンレセプターαｖ
β３等のインテグリン；又は血管内皮カドヘリン類（ＶＥ−カドヘリン−１とＶ
Ｅ−カドヘリン−２）；及びＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２／Ｔｅｋ、ＥＧＦｒ、ＰＤ
ＧＦ、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−４、Ｆｌｔ−４を擬態化する。しかしこれらは分子
やレセプターの例であり、疾患に関与するどのような標的分子も本発明において
利用する事ができる。ここで標的分子を、疾病状態の間、哺乳動物に存在する分
子として定義する。標的分子は疾病状態の間、異常に発現するかもしれないが、
必ずしも異常発現しなくてもよい。標的分子はグリコシル化又は非グリコシル化
ポリペプチド；又はｇｄ3等の糖脂質であることができるが、これらに限定され
ない。

【０００９】ペプチドミミックは、ファージライブラリーから得たり、又は合成で得ること
ができる。ペプチドミミックは抗原のフラグメント、エピトープ又は抗原決定基
に関連したものであることができる。

【００１０】ＨＭＷ-ＭＡＡやＧＤ₃ガングリオシドは免疫療法に有用な標的である。しかし
疾患に関連したどのような標的分子も本発明に使用することができる。さらに、
各抗原は独立にメラノーマ病変の少なくとも６０％に発現する。したがってそれ
らを組み合わせて使用することによりメラノーマの免疫療法の成否に関し、メラ
ノーマ細胞の抗原多様性によるマイナス効果を最小化することが期待できる。最
後にこれら２つのメラノーマ関連抗原（ＭＡＡ）に対する免疫は、異なる機能的
および免疫媒介機構を通してメラノーマ細胞に影響を与えると考えられ、メラノ
ーマ細胞に対して付加的障害効果が期待できる。

【００１１】悪性メラノーマの臨床過程において、抗イディオタイプ(anti-id)ｍＡｂで誘
導される液性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫には有益な効果がある。これらの発見はＭＡ
Ａミミックによる能動特異的免疫療法の有効性を裏付けている。しかしながら、
ＨＭＷ-ＭＡＡやＧＤ₃ガングリオシド分子の内部イメージを保持する抗ｉｄｍ
Ａｂを用いた免疫療法には主として次に記す限界がある：ｉ）ＨＬＡクラスＩ拘
束性の(HLA Class I restricted)、ＨＭＷ-ＭＡＡ特異的ＣＴＬを生成できない
こと、ｉｉ）Ｔ細胞依存性抗ＧＤ₃ガングリオシド免疫応答を誘導できないこと
、及びｉｉｉ）元来の(original)抗原と抗−抗ｉｄ抗体との低反応性。従って、
ｉ）ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックの使用はＨＬＡクラスＩ拘束性のＨＭＷ-
ＭＡＡ特異的ＣＴＬの誘導のみならず、抗ＨＭＷ-ＭＡＡ抗体を誘導することが
でき、ｉｉ）ＧＤ₃ガングリオシドのペプチドミミックはＴ細胞依存性抗ＧＤ₃ガ
ングリオシド免疫応答を誘導することができ、更に、ｉｉｉ）対応するペプチド
ミミックにより引き起こされる自己ＨＭＷ−ＭＡＡとＧＤ₃ガングリオシドへの
免疫応答を、元来の抗原と併せることでブースティングホストによって著しく高
めることができる。

【００１２】元来の抗原を伴ったブースティングホストによる自己ＭＡＡへの免疫応答増大
と同様、ＨＭＷ-ＭＡＡやＧＤ₃ガングリオシドペプチドミミックの免疫原性を同
定することは、メラノーマ患者の能動特異的免疫療法に関する新規戦略の開発に
貢献すると考えられる。

【００１３】本発明は免疫原としてヒト高分子量メラノーマ関連抗原ＨＭＷ-ＭＡＡのペプ
チドミミックを用いて悪性メラノーマに対する能動特異的免疫療法を提供する。
この抗原はメラノーマ病変の少なくとも８０％に発現し、正常細胞における分布
は少なく、その認識がメラノーマ患者の免疫レパートリーに現われるため、メラ
ノーマ患者において免疫原ではないとはいえ、この抗原が能動特異的免疫療法の
ために選択された。

【００１４】ＨＭＷ-ＭＡＡペプチドミミック、また、どのような抗原も、ヒトおよびマウ
ス抗ＨＭＷ−ＭＡＡのファージディスプレイペプチドライブラリーのパンニング
によって得られる。ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックはメラノーマ患者で自己抗
原に対し免疫を誘導することができるが、元来の抗原によっては誘導できない。
ＨＭＷ-ＭＡＡペプチドミミックはＨＭＷ-ＭＡＡに類似しているが同一ではない
。従ってＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックはＨＭＷ-ＭＡＡを認識するクローン
を刺激するが、自己同一性を確立している期間は抗原に対する親和性が低下して
いるため除去されない。このアプローチの一例として、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ
）をミミックする抗イディオタイプ(anti-id)モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で
免疫した患者においてＣＥＡ抗体が誘導されるが、ＣＥＡで免疫した患者では誘
導されないことが挙げられる。さらにメラノーマ患者の腫瘍関連抗体と定義され
た抗体に対する同時的に誘導する液性および細胞性免疫応答に関する最近の報告
では、ＨＬＡクラスＩ抗原結合モチーフを持ったＨＭＷ-ＭＡＡペプチドミミッ
クが、液性のみならず細胞性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導できることが証明
されている。したがってＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックは内部イメージを保持
する抗ｉｄｍＡｂよりもメラノーマ免疫療法の免疫原として有効である。

【００１５】このペプチドミミックの利用はメラノーマ治療に限定されないが、標的分子が
利用可能であるどのような疾患治療にも有用である。そのようなペプチドミミッ
クは哺乳動物の免疫系に正しく提示した場合、液性および細胞性両方の免疫応答
を誘導する。

【００１６】自己抗原であるＨＭＷ−ＭＡＡを認識するＴおよびＢ細胞クローンは、自己同
一性の確立の期間に除去されるので、ＨＭＷ−ＭＡＡと同一配列を有するペプチ
ドはメラノーマ患者のＨＭＷ−ＭＡＡに対するトレランスを打ち破ることができ
ない。これに対し、ファージディスプレイペプチドライブラリーを用いて同定し
たＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックは、ＨＭＷ−ＭＡＡと同一ではなく類似のも
のであるという性質のために、ＨＭＷ−ＭＡＡを認識するクローンを刺激するこ
とができるが、自己同一性の確立の期間にＨＭＷ−ＭＡＡに対する親和性が低下
するので除去されない。その一例としては、ＣＥＡを擬態化する抗ｉｄｍＡｂ
は結腸直腸癌患者におけるＣＥＡのトレランスを破壊することができるが、ＣＥ
Ａそれ自体はトレランスを破壊できない。さらにＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミ
ックはメラノーマ患者において能動特異的免疫療法を実施する上で、内部イメー
ジを保持する抗ｉｄｍＡｂより有効である。なぜなら、ｉ）ＨＭＷ−ＭＡＡペ
プチドミミックは抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体のほかに、ＨＬＡクラスＩに拘束された
ＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを誘導でき、またｉｉ）免疫原性の増大をもたらす
サイトカインとペプチドとを融合して得られる免疫原の開発を容易にし、ｉｉｉ
）免疫を行った患者の、液性および特に細胞性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫の発達を試
験するアッセイ法の開発を非常に容易にするからである。

【００１７】ヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体を用いたファージディスプレイペプチ
ドライブラリーのパンニングにより、我々はＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミック
を同定した。このペプチドはＨＬＡ−Ｂ２７抗原に対する結合モチーフを有する
。我々が開発したヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体の規模の大きなパネル
を用いれば、その他のＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドも利用可能である。ＨＬＡ-Ａ
２抗原などの、メラノーマ患者において高頻度のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対
する結合モチーフを有するＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミック。例えばＨＭＷ−Ｍ
ＡＡペプチドミミックの免疫原性をマウスとウサギで試験を行う。その他の抗原
系において幾つかの変数が合成ペプチドの免疫原性を増大させることを示してい
るので、ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックの免疫原性を最適化するために、多
価抗原ペプチド（ＭＡＰ）を使用することも含めてそれら変数について調べる。

【００１８】抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体によって同定したペプチドをヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞は認識
できる。我々は最初にバイオインフォーマティクスと分子解析ソフトウェア（Ｂ
ＩＭＡＳ）を用いて、抗体で同定したペプチドが結合することのできるＨＬＡク
ラスＩ同種特異性を同定する。次に我々は選択したＨＬＡクラスＩ同種特異性と
同定したペプチドとの結合を測定して、予測の有効性を見積もる。最後に我々は
同定したペプチドがＨＬＡクラスＩ抗原トランスジェニックマウス、およびｉｎ
ｖｉｔｒｏでＨＬＡクラスＩに拘束されたＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを産生
できるかどうか試験する。我々はまた、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体によって同定した
ペプチドとＨＭＷ−ＭＡＡに由来するペプチドは互いにアミノ酸配列ホモロジー
はないが、両者の間にＴ細胞による決定エピトープが共有されているかどうか試
験する。単一のＴ細胞レセプターが２つの構造的に異なるＭＨＣペプチド複合体
を認識できるという最近発見された事実からもその可能性が推測される。ＨＬＡ
クラスＩ抗原トランスジェニックマウスおよびｉｎｖｉｔｒｏで、ＨＬＡクラ
スＩに拘束されたＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを産生すると判明したペプチドと
ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックは、メラノーマ患者において液性と細胞性免疫
を誘導する能力を有する。

【００１９】このアプローチは、Ｔ細胞抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫がある場合、統計学的に有意
な生存延長が起こることがすでに示されている液性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答の
誘導を併せて行うと利点がある。したがって我々のアプローチでは、メラノーマ
病巣において頻繁に見られるＨＬＡクラスＩ抗原と抗原プロセッシング機構の異
常による影響は少ないはずである。

【００２０】本発明は、ヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体によってファージディスプ
レイペプチドライブラリーよりパンニングによって同定したＨＭＷ−ＭＡＡペプ
チドミミックの免疫原性を予測する手段を提供する。この情報は液性および細胞
性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫の両方を誘導できる免疫原をデザインする上で新しい戦
略の最適化に役立つと考えられる。免疫原の特性を改良することでメラノーマ能
動特異的免疫療法の効能が増幅できると期待される。

【００２１】本発明は疾患を阻害するために標的分子に対する能動特異的免疫療法を用いて
これらの問題点を克服するものである。そのような標的分子に対するそのような
免疫療法の方法は分子に対し免疫応答を引き起こす免疫原の修飾を含む。標的抗
原の修飾は他の様々な方法があるが、例えば、抗原に免疫原性試薬を結合する（
米国特許第５，３３４，３７９号参照）；抗原のハプテン化（米国特許第４，７
７８，７５２号と第５，２９０，５５１号参照）；標的抗原へのアジュバント結
合又はアジュバントとの併用投与；抗原に対する結合ペプチドフラグメント；Ｍ
ＨＣクラスＩとクラスＩＩ拘束抗原への標的抗原の結合（米国特許第４，４７８
，８２３号参照）；標的抗原の糖鎖結合パターンを変えること（米国特許第５，
４８４，７３５号参照）により達成できる。

【００２２】標的抗原による免疫を誘導する他の方法は標的抗原のペプチドミミックである
。ペプチドミミックは標的「自己」抗原を完全に擬態化できないようであり、ペ
プチドミミックは自己抗原へのトレランスを破壊するが、自己抗原の投与では破
壊できない。以前にも示した通り、発癌胎児抗原（ＣＥＡ）の内部イメージを保
持する抗イディオタイプは結腸直腸癌患者で抗ＣＥＡ抗体を誘導できるが、いっ
ぽうＣＥＡそれ自身はできない。したがって実際の「自己」血管新生促進標的抗
原をワクチンとして使用するもう一つの方法は、抗原を擬態化する、抗原の内部
イメージを保持する抗イディオタイプ抗体を用いて免疫応答を誘導することであ
る。しかし抗イディオタイプ抗体の使用は完全ではない。

【００２３】イディオタイプの関係とネットワークの理論はＪｅｒｎｅモデル（Ｊｅｒｎｅ
，Ｎ．Ｋ．（１９７４）Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１２５Ｃ：３
７３；Ｊｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．ら（１９８２ＥＭＢＯ１：２３４）に基づいて
いる。このように抗原に対するパラトープ（抗原結合部位）を発現している抗体
による免疫は抗−抗体（抗イディオタイプ）を産生し、そのうち幾つかは抗原と
パラトープに対する相補的構造を共有する。それら抗イディオタイプは抗原とし
て働き、例えば抗原を擬態化することができるであろう。このように免疫系は抗
原の内部イメージ、抗イディオタイプを伝播すると考えられる。

【００２４】本発明に用いたペプチドミミックは哺乳動物に由来しない小分子又は哺乳動物
に由来しない核酸分子であることができる。そうした小分子又は核酸は合成又は
哺乳動物以外の生物体から単離することができる。本発明の免疫原は、疾患に関
与する分子に対し免疫応答を誘導できるペプチド分子、偽ペプチド分子又はペプ
チドミミックであることができる。そうしたペプチドミミックは合成又は哺乳動
物以外の生物体から単離することができる。小分子、核酸分子、ペプチド分子お
よびペプチドミミックのスクリーニング法は当技術分野でよく知られている（例
えば、Ｊ．ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇ、１（１）、ｐｇ２
７−３１、１９９６）。

【００２５】本発明におけるペプチドミミックは当技術分野で知られた様々な方法、例えば
免疫原性試薬にペプチドミミックを遺伝子的に結合又は融合して改変する。免疫
原性の試薬へペプチドミミックを結合又は融合することでペプチドミミックに対
する免疫応答を刺激することができる。本発明の結合し融合した分子は、キャリ
アー又は融合分子に対し抗原をカップリング又は融合すると知られているどのよ
うな方法によっても調製できる。結合の望ましい方法は抗原を直接、免疫原性試
薬に結合する共有結合である。望ましい免疫原性試薬は多糖（米国特許第５，６
２３，０５７号）とペプチドグリカン（米国特許第５，１５３，１７３号）を含
む。本明細書に示された全ての米国特許と同様、これらの米国特許を本明細書の
一部を構成するものとしてここに援用する。

【００２６】本発明におけるペプチドミミックを改変する他の方法は、それらをサイトカイ
ン、リンホカイン、ホルモン又は成長因子と結合又は遺伝子的に融合することで
ある（米国特許第５，３３４，３７９号）。それら分子の例としてはインターフ
ェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、
ＩＬ−６およびＩＬ−７があげられるがこれらに限定されない（米国特許第５，
３３４，３７９号）。これらの米国特許、および本明細書に言及する同様の特許
を、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。

【００２７】本発明におけるペプチドミミックを改変するもう一つの方法は、ペプチドミミ
ックのハプテン化（化学的リンク）である。ハプテンはタンパク質と結合した時
、免疫応答を誘導する能力を持つ物質を総称する。本発明におけるペプチドミミ
ックはそれ自身がハプテン化でき、又はハプテン修飾化タンパク質と結合するこ
とができる（米国特許第４，７７８，７５２号と第５，２９０，５５１号）。

【００２８】本発明におけるペプチドミミックを改変する他の方法は、ペプチドのグリコシ
レーション又はペプチドミミックのキャリアー分子のグリコシレーションである
（米国特許第５，４８４，７３５号と第４，６２９，６９２号）。

【００２９】さらにペプチドの活性を模倣したペプチドミミック化合物又は偽ペプチド等の
化合物を、本発明における免疫原の改変に用いることができる（米国特許第５，
３８６，０１１号、第５，１５３，１７３号と第４，６３１，２７０号）。

【００３０】ペプチドミミックを主組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原と結合して複合体を形成
することにより本発明のペプチドミミックの改変を行うこともまた本発明におい
て有用である（米国特許第４，４７８，８２３号）。そうしたＭＨＣ抗原の源お
よび本発明におけるペプチドミミックをＭＨＣに結合する方法については、米国
特許第４，４７８，８２３号に記載されており、これを本明細書の一部を構成す
るものとしてここに援用する。

【００３１】同等なタンパク質は同等なアミノ酸配列を有する。ある１つの配列と物質的に
同等であるが、それとは別の配列とは１つ又はそれ以上の置換、付加及び／又は
欠失のため異なるアミノ酸配列は、同等な配列であるとみなせる。本発明のタン
パク質に対して配列中のアミノ酸数の置換、付加、欠失が少なくとも２５％以下
であるのが好ましく、さらに好ましくは１０％以下であり、最も好ましくは５％
以下である。

【００３２】例えば、ある配列中のアミノ酸を等価なアミノ酸で置換することが知られてい
る。一般に等価であると考えられているアミノ酸グループは：

【００３３】（ａ）Ａｌａ（Ａ）Ｓｅｒ（Ｓ）Ｔｈｒ（Ｔ）Ｐｒｏ（Ｐ）Ｇｌｙ
（Ｇ）；（ｂ）Ａｓｎ（Ｎ）Ａｓｐ（Ｄ）Ｇｌｕ（Ｅ）Ｇｌｎ（Ｑ）；（ｃ）Ｈｉｓ（Ｈ）Ａｒｇ（Ｒ）Ｌｙｓ（Ｋ）（ｄ）Ｍｅｔ（Ｍ）Ｌｅｕ（Ｌ）ＩＩｅ（Ｉ）Ｖａｌ（Ｖ）；および（ｅ）Ｐｈｅ（Ｆ）Ｔｙｒ（Ｙ）Ｔｒｐ（Ｗ）。

【００３４】本発明におけるペプチドミミックおよび改変ペプチドミミックは動物体内にお
いて標的分子に対して免疫応答を誘導する。その動物は好ましくはウサギ、ラッ
ト、あるいはマウス等の哺乳動物である。好ましくはヒトである。免疫応答とは
液性の抗体産生及び／又はヘルパーおよび細胞障害性Ｔ細胞反応を含むＴ細胞反
応等の細胞媒介応答を意味する。

【００３５】当技術分野で知られている方法によってペプチドミミックをコードした核酸分
子を哺乳動物細胞内に導入することができる。例えば、哺乳動物細胞に遺伝子導
入を行うためのＭｕｌｌｉｇａｎら、米国特許第５，６７４，７２２号に記載さ
れている、遺伝子を哺乳類細胞に導入するために有用なベクターの調製方法を本
明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。

【００３６】ペプチドミミックはベヒクル（担体）によって免疫系に提示してもよい。例え
ば、ペプチドミミックは抗原提示細胞の表面に存在するか、薬理学的に許容でき
るキャリアー又はアジュバントに結合していてもよい。

【００３７】抗原提示細胞は主組織適合複合体（ＭＨＣ）の好ましくはクラスＩＩ遺伝子産
物を細胞表面に持つ遺伝学的に真核細胞である。本明細書の目的のために、抗原
提示細胞はまた末梢血球細胞等のリコンビナント真核細胞およびリコンビナント
細菌細胞等を含む。本明細書によって定義する抗原提示細胞の例として樹状細胞
、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ陽性のマクロファージ、好ましくはＭＨＣクラス
ＩＩ陽性の単核球およびリンパ球を含む（米国特許第５，５９７，５６３号もま
た参照のこと）。

【００３８】本発明の一実施例において、抗原提示細胞は本発明の抗原をコードした外来性
ＤＮＡを発現する真核細胞である。リコンビナント真核細胞はｉｎｖｉｖｏ又
はｉｎｖｉｔｒｏで調製することができる。

【００３９】真核細胞にＤＮＡを挿入するのに適したクローニング／発現ベクターは周知の
ＳＶ−４０、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびレトロウ
イルス由来のＤＮＡ配列の誘導体を含む。プラスミドとファージＤＮＡのコンビ
ネーションから得られたベクターとカップリングした場合、そうしたベクターの
いずれも、例えばシャトルベクターは、原核細胞と真核細胞の両方においてタン
パク質コード配列のクローニングおよび／また発現を行うことができる。

【００４０】その他の真核性発現ベクターは当技術分野で知られている。即ち、Ｐ．Ｊ．Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎとＰ．Ｂｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２
７−３４１（１９８２）；Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１，８５４−８６４（１９８１）；Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎｎとＰ．Ａ．
Ｓｈａｒｐ、”ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＡｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ＯｆＳｅｑｕｅｎｃｅｓＣｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＡＭｏ
ｄｕｌａｒＤｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅＲｅｄｕｃｔａｓｅＣｏｍｐｌ
Ｇｅｎｅ、”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９，６０１−６２１（１９８２）；Ｒ
．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎｎＰ．Ａ．とＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１５９，６０１−６６４（１９８２）；Ｓ．Ｉ．Ｓｃａｈｉｌｌら、
”ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ
ｔｈｅＰｒｏｄｕｃｔｏｆａＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｅＩｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎＤＮＡＧｅｎｅｉｎＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖｅ
ｒｙＣｅｌｌｓ、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０、４６５４−４６５９（１９８３）；Ｇ．ＵｒｌａｕｂとＬ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７、４６１６−４２２０（
１９８０）。

【００４１】本発明のペプチドミミックはまたリコンビナント細菌細胞の表面で免疫系に提
示することもできる。適したリコンビナント細菌細胞はＭｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓの非ビルレント株、例えばｂａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ
−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、又はサルモネラの非ビルレント株、例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである。リコンビナント細菌細胞は、当技術分野で知られ
ている非ビルレント株の抗原の活性部位からなるクローニングＤＮＡによって調
製することができる。例えば、リコンビナントサルモネラの調製には、Ｃｕｒｔ
ｉｓｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ６、１５５−１６０（１９８０）Ｇａｌａｎ、Ｇｅ
ｎｅ９４、２９−３５（１９９０）、リコンビナントＢＣＧの調製には、Ｓｔ
ｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．、Ｖａｃｃｉｎｅｓ９１、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏａｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ｐｐ．３９３−３９８（１
９９１）が挙げられる。

【００４２】クローニングベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列の各セグメン
トから構成される。幾つかの適した原核細胞クローニングベクターはｃｏｌＥ１
、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭおよびＲＰ４等のＥ．
ｃｏｌｉ由来のプラスミドを含む。原核細胞ベクターはまたＭ１３、ｆｄおよび
その他のフィラメント単鎖ＤＮＡファージ等のファージＤＮＡの誘導体を含む。

【００４３】細菌、特にＥ．ｃｏｌｉでタンパク質発現を行うベクターもまた知られている
。そうしたベクターはｐＫ２３３（あるいはプラスミドのｔａｃファミリーのい
ずれも）、Ｔ７およびＰ_Lを含む。融合タンパク質を発現するベクターの例は、
ＤｉｅｃｋｍａｎｎとＴｚａｇｏｌｏｆｆＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０、
１５１３−１５２０（１９８５）。これらのベクターはアントラニル酸シンター
ゼ（ＴｒｐＥ）をコードしたＤＮＡ配列に続けてカルボキシ末端のポリリンカー
を含む。その他の発現ベクター系はベータガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）に基づい
ている；ラムダＰ_L；マルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ）；グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）。Ｇｅｎｅ６７、３１（１９８８）とＰｅ
ｐｔｉｄｅｒｅｓｅａｒｃｈ３、１６７（１９９０）を参照のこと。本発明において有用な発現ベクターは、ＤＮＡ配列又はフラグメントのオペレ
ーター部位にリンクしている、少なくとも１つの発現コントロール配列を含んで
いる。コントロール配列はクローン化したＤＮＡ配列の発現をコントロール又は
制御するためにベクターに挿入する。有用な発現コントロール配列の例は、ｌａ
ｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主たるオペレーターと
プロモーター領域、ｆｄコートタンパク質のコントロール領域、そしてポリオー
マ、アデノウイルス、レトロウイルス、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター
等のシミアンウイルス由来のプロモーター、および原核細胞又は真核細胞で遺伝
子発現をコントロールすると知られているその他の配列、そのウイルス又はウイ
ルスのコンビネーションである。

【００４４】本発明のペプチドミミックはまた適切な培養液と組み合わせることができる。
適切な培養液はリン酸緩衝生理食塩水、リポソームおよび乳剤等の薬理学的に許
容できるキャリアーを含む。

【００４５】ペプチドミミックはまた、ムラミルペプチド、インターフェロン、インタロイ
キン−１などのリンホカイン、又は細菌性アジュバントなどの免疫応答を増大さ
せる薬理学的に許容できるアジュバントと組み合わせることができる。アジュバ
ントは免疫原が表面に吸収されるような、酸化アルミウム粒子などの適切な粒子
から構成される。これらのアジュバントを含む組成物は当技術分野で知られてい
る方法で調製できる。

【００４６】細菌性アジュバントの例はＢＣＧである。上記のように抗原提示細胞として用
いる場合、リコンビナントＢＣＧは自らのアジュバントとしても作用するであろ
う。この場合、一以上のアジュバントがオプションとして添加されていたとして
も、あえてアジュバントの添加は必要ではないかもしれない。その自然な（非リ
コンビナント）状態で用いられた時、ＢＣＧは免疫原又は抗ｉｄ抗体と組み合わ
すことで効果的な免疫応答を誘導する形を形成し、ただアジュバントとしてのみ
働く。

【００４７】ペプチドミミック又はペプチドミミック組成物は当技術分野で知られる方法に
よって哺乳動物に投与できる。そのような方法は、例えば、静脈、腹腔内、皮下
、筋肉内、局所又は皮内投与を含む。

【００４８】

【実施例】

ヒト抗ＨＭＷ−ＭＡＡ単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）Ｃ２１を用いたファージディスプレ
イペプチドライブラリーのパンニングによるＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックの
同定メラノーマ細胞Ｃｏｌｏ３８を用いてヒト半合成ファージディスプレイｓｃＦ
ｖライブラリーのパンニングによって単離したｓｃＦｖＣ２１は、メラノーマ細
胞抽出物からＨＭＷ−ＭＡＡの２つの特徴的なコンポーネント（２５０ｋＤおよ
び＞４５０ｋＤ）を免疫沈降させることから、ＨＭＷ−ＭＡＡを認識している。
Ｂｏｎｎｙｃａｓｔｌｅらの方法に従って抗ＨＭＷ−ＭＡＡｓｃＦｖＣ２１
を用いてファージディスプレイペプチドライブラリーＬＸ−８およびＸ₁₅からパ
ンニングによってクローンを単離し、免疫スクリーニングを行った結果、陽性ク
ローンはＸ₁₅ライブラリーから単離したペプチドクローンのみから単離できた。
ｓｃＦｖＣ２１に対するクローンの反応性はＥＬＩＳＡによって確認した。ジ
デオキシヌクレオチド鎖終止法によってＸ₁₅ライブラリーからランダムに選択し
た１６個の陽性クローンについて塩基配列解析を行った結果、１４個のクローン
においてアミノ酸配列ＳＰＳＷＹＣＰＤＣＤＫＲＰＬＶ、１個のクローンにおい
てＲＰＹＲＹＤＰＬＧＤＬＫＳＲＨ、１個のクローンにおいてＥＡＲＮＷＨＤＦ
ＰＩＨＰＲＴＬの挿入が認められた。配列ＳＰＳＷＹＣＰＤＣＤＫＲＰＬＶに対
応する合成ペプチド（合成ペプチド＃１）およびＥＡＲＮＷＨＤＦＰＩＨＰＲＴ
Ｌ（合成ペプチド＃２）は結合アッセイにおいてｓｃＦｖＣ２１に反応した。
しかし合成ペプチド＃１だけがメラノーマ細胞Ｃｏｌｏ３８上に発現するＨＭＷ
−ＭＡＡへのｓｃＦｖＣ２１の結合を阻害した。これらの結果は、合成ペプチ
ド＃１はｓｃＦｖＣ２１の抗原結合部位に結合し、一方ペプチド＃２はｓｃＦ
ｖＣ２１の抗原結合部位の外側に結合することを示唆する。（ジスルフィド結
合を分解するために）ジチオスレイトールによって線状化したペプチドはｓｃＦ
ｖＣ２１と反応しなかったことから、ペプチド＃１とｓｃＦｖＣ２１の反応
性はコンフォメーション依存性である。ペプチド＃１とＨＭＷ−ＭＡＡのアミノ
酸配列を比較しても全くホモロジーが存在しなかったことから、ペプチド＃１は
ｓｃＦｖＣ２１によって認識される決定基のミモトープであることがわかる。

【００４９】マウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂ１４９．５３、２２５．２８、７６３．７４
およびＴＰ６１．５を用いたファージディスプレイペプチドライブラリーのパン
ニングによるＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックの同定モノクローナル抗体マウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂ１４９．５３、２２５．２８、７６３．７
４およびＴＰ６１．５はそれぞれＨＭＷ−ＭＡＡの異なる決定基と反応する。

【００５０】ｍＡｂ１４９．５３によって同定したＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミック抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂ１４９．５３を用いてファージディスプレイペプ
チドライブラリーＬＸ−８およびＸ₁₅のパンニングを行い、両ライブラリーから
ファージディスプレイペプチドを濃縮した。４回目のパンニングの最後に、２つ
のライブラリーから得られたクローンについて免疫スクリーニングを行った結果
、両ライブラリーから単離したファージの中に陽性ファージを検出した。ｍＡｂ
１４９．５３によるファージディスプレイペプチドの反応性をＥＬＩＳＡによ
って確認した。各ライブラリーからランダムに選択した５個の陽性クローンにつ
いて塩基配列解析を行った結果、ＬＸ−８ライブラリーからアミノ酸配列ＳＣＲ
ＷＶＧＩＤＬＹＣＰ、Ｘ₁₅ライブラリーからＥＥＬＨＰＰＧＳＲＡＰＳＩＲＫの
挿入が認められた。発表されているＨＭＷ−ＭＡＡのアミノ酸配列とこれらの配
列を比較すると、Ｘ₁₅ライブラリーからｍＡｂ１４９．５３を用いて同定した
アミノ酸ＧＳＲＡＰはＨＭＷ−ＭＡＡの配列中のアミノ酸残基１８４６−１８５
０と相同であることが判明した。

【００５１】ｍＡｂ２２５．２８により同定したＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミック抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂ２２５．２８を用いてファージディスプレイペプ
チドライブラリーＬＸ−８およびＸ₁₅からパンニングを行い、続いて4回目のパ
ンニングの最後に得られたクローンについて免疫スクリーニングを行った結果、
Ｘ₁₅ライブラリーから単離したファージの中に陽性ファージを検出した。ｍＡｂ
２２５．２８によるファージディスプレイペプチドの反応性をＥＬＩＳＡによ
って確認した。現在、陽性クローンの塩基配列を同定中である。

【００５２】ｍＡｂ７６３．７４により同定したＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミック抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂ７６３．７４を用いたファージディスプレイペプ
チドライブラリーＬＸ−８およびＸ₁₅のパンニングを行い、両ライブラリーから
ファージディスプレイペプチドを濃縮した。４回目のパンニングの最後に、２つ
のライブラリーから得られたクローンについて免疫スクリーニングを行った結果
、両ライブラリーから単離したファージの中に陽性ファージを検出した。ｍＡｂ
７６３．７４によるファージディスプレイペプチドの反応性をＥＬＩＳＡによ
って確認した。ＬＸ−８ライブラリーからランダムに選択した８個の陽性クロー
ンについて塩基配列解析を行った結果、６個のクローンにおいてアミノ酸配列Ｑ
ＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲ、１個のクローンにおいてＴＣＮＧＰＳＶＹＭＮＣＬ、
１個のクローンにおいてＱＣＴＧＰＮＦＡＴＮＣＲの挿入が認められた。このよ
うに後者のアミノ酸配列は、最も頻繁に現われたクローンのアミノ酸配列と比べ
ると１残基だけが異なっていた。したがってクローンによって同定したコンセン
サス配列はＸＣＸＧＰＸ（Ｈｙ）ＸＸＮＣＸであり、ここでＨｙは疎水性アミノ
酸を示す。ファージディスプレイペプチドとｍＡｂ７６３．７４との反応性を
確認するために合成ペプチドとｍＡｂ７６３．７４との反応性について結合ア
ッセイと阻害アッセイによって試験した。結合アッセイでは、合成ペプチドＱＣ
ＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲはＮ末間隙アーム（合成ペプチド＃６）が存在する時のみ
ｍＡｂ７６３．７４と反応性を示した。さらにペプチドは抗ＨＭＷ−ＭＡＡ
ｍＡｂ１４９．５３、２２５．２８、ＴＰ４１．２（４６）およびＴＰ６１．
５に反応せず、これら全てはｍＡｂ７６３．７４によって認識されるものとは
異なる決定基を認識した。合成ペプチド＃３（ＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲ）はｍ
Ａｂ７６３．７４のＨＭＷ−ＭＡＡに対する反応性を阻害した。ジチオスレイ
トールによって線状化したペプチドはｍＡｂ７６３．７４に反応しなかったこ
とから、ペプチド＃３（ＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲ）とｍＡｂ７６３．７４の
反応性はコンフォメーション依存性である。合成ペプチド＃５（ＱＣＴＧＰＮＦ
ＡＴＮＣＲ）がｍＡｂ７６３．７４とＨＭＷ−ＭＡＡとの反応性を阻害しなか
ったことは特筆すべきである。ここでアミノ酸ＶａｌはｍＡｂ７６３．７４の
ＨＭＷ−ＭＡＡに対する結合において重要な役割を果たしているように思われる
。同定したペプチド配列とＨＭＷ−ＭＡＡについての刊行物記載のアミノ酸配列
との比較の結果、ホモロジーは存在しなかったが、ＨＭＷ−ＭＡＡの配列を通し
てアミノ酸残基ＧＰの反復がみられた。このように、ファージディスプレイペプ
チドライブラリーからｍＡｂ７６３．７４によって認識される決定基はミモト
ープであると考えられる。ペプチドＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲの免疫原性は現在
マウスにおいて検討中である。

【００５３】ｍＡｂＴＰ６１．５によって同定したＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミック抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂＴＰ６１．５を用いてファージディスプレイペプ
チドライブラリーＬＸ−８およびＸ₁₅からパンニングを行い、４回目のパンニン
グの最後に得られたクローンについて免疫スクリーニングを行った結果、Ｘ₁₅ラ
イブラリーから単離したファージの中に陽性ファージを検出した。現在、陽性ク
ローンの反応性を確認するためＥＬＩＳＡと塩基配列解析を行っている。

【００５４】抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂ７６３．７４により明らかになった決定基のペプチ
ドミミックのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫原性ＢＡＬＢ／ｃマウスを０、１４、２８、４２および６３日目にＧＭ−ＣＳＦ（
１０ｇ／注射；ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ワシントン州シアト
ル）およびフロインドアジュバント（ＩＦＡ；ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．，ミズーリ州セントルイス）と混合したペプチドＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣ
Ｒ（２５又は５０μｇ／注射）を皮下注射により免疫した。マウスは免疫の前、
および２１、３５、４９、５６および７０日目に後眼窩洞より採血した。免疫血
清は結合アッセイにおいてＨＭＷ−ＭＡＡ陰性Ｂリンパ球細胞Ｌ１４よりもＨＭ
Ｗ−ＭＡＡ発現メラノーマ細胞Ｃｏｌｏ３８と高い結合を示した。試験を行った
２用量のペプチドも同様の免疫応答を示した。代表的な結果を図６に示す。この
図はメラノーマ細胞と反応する抗体の発達キネティクスも併せて示している。こ
れらは用いた抗体が抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体を誘導していることを証明していると
はいえないにしろ示唆する結果である。これらの可能性を証明するために現在、
免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる免疫血清の解析を行っている。ｇｄ３

【００５５】ヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体、ｓｃＦｖＣ２１およびｍＡｂ１４
９．５３と７６３．７４によって同定したペプチド中に存在する妥当なＨＬＡク
ラスＩ抗原結合モチーフの予測解析ヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体、ｓｃＦｖＣ２１およびｍＡｂ１
４９．５３と７６３．７４によって同定したペプチド配列が細胞障害性Ｔ細胞反
応を刺激するかどうかを決定するため、まず最初にＨＬＡクラスＩアロ特異性に
結合するペプチドのモチーフについてＢＩＭＡＳを用いて解析を行った。

【００５６】ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックは自己抗原に対するトレランスを破壊する
上でより効果的であると期待される。そのためメラノーマ患者において能動特異
的免疫療法に効果を発揮する免疫原として、ＨＭＷ−ＭＡＡアミノ酸配列から得
られたペプチドの代わりにＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックを選別した。ペプ
チドミミックはＨＭＷ−ＭＡＡと同一ではないが非常に酷似しているために、Ｈ
ＭＷ−ＭＡＡを認識でき、かつＨＭＷ−ＭＡＡに比べアフィニティーが減少する
ので自己同一性の確立の期間に消去されなかったＴおよびＢ細胞クローンを刺激
することができると期待される。

【００５７】ヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体によって同定したペプチドのアミノ酸
配列に基づいて合成されたペプチドは、マウスとウサギで免疫原性がある。以下
の理由により、マウスを用いることとした。ｉ）大規模な量のペプチドおよび免
疫原性に影響を及ぼすかもしれない変異ペプチドをスクリーニングする上で適し
ている、ｉｉ）ホストにおける免疫応答の変動を最小限化する、標準化され確立
された遺伝的背景を持つホスト源を提供する、ｉｉｉ）まだ試薬および／また方
法論が確立されていない他の動物種では試験できないサイトカイン、樹状細胞等
の変数の試験を行うことができる。しかしマウスはＨＭＷ−ＭＡＡを発現してい
ない。ヒト抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂを用いた免疫化学染色は、この抗原がウサ
ギにおいてヒトと同様な分布を示して発現していることを示していた。従ってＨ
ＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックがＨＭＷ−ＭＡＡに対するトレランスを破壊で
きるかどうか調べる目的にはウサギがモデル動物として適している。

【００５８】マウスにおける免疫原性免疫戦略基本的な免疫のデザインは以下の通りである：ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０／群
）に対し０、７および２８日目に皮下注射により免疫を行う。ペプチドはＫＬＨ
に対して結合したもの又は非結合のものを用い、試験対象のアジュバントの一つ
と混合し、指示どおりの用量をもって注射する。別法として樹状細胞を刺激した
ペプチドを注射することもできる。免疫前および１３、２７、３４および４１日
目に後眼窩洞から血清を採取する。液性および細胞性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫の解
析結果に基づいて追加の免疫および／また採血を行う。

【００５９】ペプチドの用量、免疫の回数、キャリアーおよびアジュバントの免疫応答に対す
る効果これらの実験はペプチドの用量、免疫の回数、キャリアーおよび様々なアジュ
バントとの結合によるペプチドの免疫原性に対する効果を試験するものである。ｉ）予備試験結果の項目に示したように、予備試験結果において２５および５
０ｇ／注射の用量が免疫応答を誘導したため、ペプチドは２５〜１２５μｇ／注
射の用量を皮下に投与する。ｉｉ）ペプチドは２週間間隔で、２回又は３回投与する。もし免疫応答が誘導
できなかった場合、免疫応答が検出できるまで追加免疫を２週間間隔で行う。ｉｉｉ）ＫＬＨに結合したペプチドと結合していないペプチドの免疫原性を比
較して、キャリアー（例えばＫＬＨ）との結合がペプチドの免疫原性に与える効
果を見積もる。ペプチドはクロスリンク反応にグルタルアルデヒドを用いてＫＬ
Ｈ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合する。即ち、ペプチドを
ＫＬＨと１：１の割合で混合して室温で１時間放置する。引き続き０．２５％グ
ルタルアルデヒドを添加し、溶液を２時間、室温で攪拌する。反応は１Ｍグリシ
ンと混合して３０分間インキュベーションを行って終止する。ペプチド−ＫＬＨ
結合物をＰＢＳ溶液中で４℃、一晩透析を行う。結合物を−２０℃で貯蔵する。ｉｖ）ペプチドの免疫原性に対するアジュバントの効果を見積もるため、総用
量２００μｌ又は総用量２００μｌ中でペプチドとフロインドアジュバント（プ
ライミング用に完全アジュバント、ブースティング用に不完全アジュバント）を
混合し、１０μｇのＱＳ２１（ＡｑｕｉｌａＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌｓ、Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、ウォーセスター）と共に注射する。ｖ）既に述べたように骨髄から樹状細胞を調製して、これを用いて樹状細胞に
よって呈される免疫原性を測定する。即ち、同系マウスの後肢から採取した骨髄
から樹状細胞を採取する。１０％ＦＣＳ、リコンビナントマウスＩＬ−４（２０
００ＩＵ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＩｎｃ．、ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、Ｎ
Ｊ）およびリコンビナントマウスＧＭ−ＣＳＦ（２００ＩＵ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏ
ＴｅｃｈＩｎｃ．）を添加したＩＭＤＭ培溶液中で、細胞を５日間、３７℃
で培養する。インキュベーション終了時、樹状細胞の表現型をＦＡＣＳ解析によ
って確認する。血清を減少したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州、グランドアイランド）中にペプチド（１０ｇ／ｍ
ｌ）を添加し、樹状細胞（１×１０⁶／ｍｌ）を２時間、３７℃でインキュベー
ションする。その後、ＨＢＳＳで洗浄し、樹状細胞（１×１０⁵／マウス）を尾
の根の皮下に注射する。ペプチド刺激した樹状細胞の注射を１週間後に繰り返す
。ｖｉ）合成ペプチドの免疫原性に対するＭＡＰの効果を試験する目的で、ＨＭ
Ｗ−ＭＡＡを模倣した合成ペプチドからなる１０ｇのＭＡＰをユニバーサルＴ^H
エピトープの共存下又は非共存下で、フロインドアジュバントと混合して皮下に
注射する。

【００６０】合成ペプチドによって誘導される液性免疫応答液性免疫応答を解析するために用いた方法は、我々の以前の研究において広汎
に用いてきたものである。以下に簡略に説明する。ｉ）抗ペプチド抗体のレベルを決定するため、合成ペプチドで免疫したマウス
から連続採血したものの連続２倍希釈液を用い、合成ペプチドをコートしたマイ
クロタイタープレート上で、¹²⁵Ｉ−標識抗マウスＩｇＧおよび抗マウスＩｇＭ
異種抗体を用いて結合アッセイ試験を行う。結合の特異性は、無関係のペプチド
で免疫した血清を用いてマイクロタイタープレート上で試験を行い、また免疫前
の血清、およびＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックと共に無関係のペプチドで免
疫したマウスから採った血清を試験して測定する。ｉｉ）ＨＭＷ−ＭＡＡ結合抗体のレベルを測定するため、ＨＭＷ−ＭＡＡを発
現したヒトメラノーマ細胞で免疫したマウスから連続採血した血清の連続２倍希
釈液を用いて、¹²⁵Ｉ−標識抗マウスＩｇＧおよび抗マウスＩｇＭ異種抗体を用
いて結合アッセイ試験を行う。結合の特異性は免疫血清のＨＭＷ−ＭＡＡ陰性リ
ンパ球細胞への結合を試験し、また免疫前の血清およびＨＭＷ−ＭＡＡを発現し
た培養ヒトメラノーマ細胞と共に無関係のペプチドで免疫したマウスから採った
血清を試験して測定する。ＨＭＷ−ＭＡＡへの免疫特異性を、¹²⁵Ｉ−又は³⁵Ｓ−標識メラノーマ細胞か
ら免疫沈降するコンポーネントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および、連続免疫沈降試験
によって測定する。連続免疫沈降試験は、抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂを用いてあ
らかじめ免疫枯渇を行ったメラノーマ細胞抽出物からは免疫血清でＨＭＷ−ＭＡ
Ａを免疫沈降できないことを示すものである。我々が広汎に用いてきた方法（４
６）によって、細胞の放射標識、細胞の溶解度、免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラジオグラフィー又はフルオログラフィーを測定する。免疫したマウスの血清が低い力価及び／又は抗体アビディティーを示すため放
射標識したメラノーマ細胞から何のコンポーネントも免疫沈降しなかった場合は
、抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂのＦ（ａｂ’）₂フラグメントでコートしたマイク
ロタイタープレートへの結合を利用しメラノーマ細胞抽出物から精製を行ったＨ
ＭＷ−ＭＡＡを用いて血清を試験する。ＨＭＷ−ＭＡＡに対する抗体の結合を¹² ⁵ Ｉ−標識抗マウスＩｇＧＦｃ異種抗体によって検出する。結合の特異性は無
関係の抗原によってコートしたプレートを用いて測定する。抗体がｉｎｖｉｖｏで抗原と反応することを証明するために、免疫ペルオキ
シダーゼ反応中でメラノーマ病変を染色し、ＨＭＷ−ＭＡＡ結合抗体を含有する
血清の試験を行う。ｉｉｉ）免疫血清中に存在する抗体によって認識される抗原決定基をマッッピ
ングする目的でクロスブロッキングテストを行う。この終わりに抗ＨＭＷ−ＭＡ
ＡｍＡｂのＦ（ａｂ’）₂フラグメントの飽和量（２０μｇ／ｗｅｌｌ）と共
にメラノーマ細胞をインキュベートする。洗浄に続いて、細胞に免疫血清を加え ¹²⁵ Ｉ−標識抗マウスＩｇＧＦｃ異種抗体を用いて抗体の結合を検出する。逆
にメラノーマ細胞への¹²⁵Ｉ−標識抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂの結合を免疫血清
が阻害する能力を試験する。これらのアッセイの特異性はｍＡｂおよび無関係の
抗原を認識する抗血清を用いて見積もった。

【００６１】合成ペプチドにより誘導されるＴ細胞媒介免疫応答ｉ）リンパ球の増殖反応を試験するため、９６穴平底組織培養プレート中で
合成ペプチド（１μＭと５０μＭの範囲の）の存在下に、免疫したマウスから採
取した末梢リンパ節細胞を３７℃、５％ＣＯ₂を含んだ湿潤環境でインキュベー
トしてトリプリケートで測定する。４、５日間のインキュベーション後に、０．
５μＣｉ［Ｈ³］チミジンを添加し、１６時間、３７℃でインキュベーションを
行った後、細胞をセルハーベスターによって回収する。細胞増殖は細胞ＤＮＡへ
の［Ｈ³］チミジンの取り込み量として見積もり、ベータシンチレーションカウ
ンターで試料を測定し、ｃｐｍ±ＳＤとして表示する。ｉｉ）マウスの右肢パッドにおいて、放射線照射（２０Ｋｒａｄ）したＨＭＷ
−ＭＡＡ発現培養メラノーマ細胞（５×１０⁵／１００μｌ）、又は免疫化ペプ
チド（７５μｇ／１００μｌ又は１２５μｇ／１００μｌ）で免疫刺激して遅延
型過敏（ＤＴＨ）反応を試験する。細胞又はペプチドを注射した後、肢パッドの
厚さを０、２４、４８および７２時間後に測定する。結果は少なくとも５頭のマ
ウスから得られた厚さの増加の平均値±ＳＤとして表示する。放射線照射（２０
Ｋｒａｄ）ＨＭＷ−ＭＡＡ陰性ヒトＢリンパ球細胞（５×１０⁵／１００μｌ）
又は無関係のペプチド（７５μｇ／１００μｌ又は１２５μｇ／１００μｌ）を
左後肢パッドに注射したものを特異性コントロールとする。

【００６２】統計学的解析値が標準的な分布をしているか、していないかに依存して、様々なプロトコル
によって免疫を行ったマウス群の免疫学的アッセイの結果を比較する目的で、２
サンプルｔ検定又は２サンプルＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定などの２サンプル
統計手法を用いる。

【００６３】ウサギにおける免疫原性免疫化戦略マウスで得られた結果を応用し、ウサギでのＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミッ
クの免疫原性を解析する戦略をデザインする。ペプチドはＫＬＨに対して結合し
たもの又は非結合のものを用い、最も効果的であると判明したアジュバントの一
つと混合し、指示どおりの用量を注射する。血清を免疫前、および免疫後１３、
２７、３４および４１日目に後縁耳静脈から採取する。液性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免
疫の発達に基づいて追加の免疫および／また採血を行う。

【００６４】ペプチドの用量、免疫の回数、キャリアーおよびアジュバントの免疫応答に対す
る効果合成ペプチドの免疫原性に対するペプチドの用量、免疫の回数、キャリアー、
アジュバントおよび多抗原ペプチドの効果について、マウスにおいて記載した方
法と同様にして解析する。

【００６５】合成ペプチドによって誘導される液性免疫応答抗ペプチド抗体と抗ＭＷ−ＭＡＡ抗体の発達、およびその精密な特異性の血清
学的および免疫化学的同定を行うために、ペプチドで免疫したマウスに関して記
載した液性免疫応答の特性化と同様にして解析する。

【００６６】統計学的解析マウスの免疫応答の解析に関して記載した統計学的解析法と同様の方法を用い
て、様々なプロトコルで免疫したウサギにおける免疫応答の解析を行う。

【００６７】ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックが、ＨＬＡクラスＩ抗原に拘束されたＨＭＷ
−ＭＡＡ特異的ＣＴＬをｉｎｖｉｔｒｏにおいて誘導できるか、および免疫化
ペプチドに結合するＨＬＡクラスＩ同種特異性をトランスジェニックであるマウ
スにおいて誘導できるかどうかの決定ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックはマウスとウサギにおいて液性抗ＨＭＷ−
ＭＡＡ免疫と、マウスにおいてＴ細胞増殖性の抗ＨＭＷ−ＭＡＡ反応を誘導する
。ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックはまたＨＬＡクラスＩ抗原に拘束されたＨ
ＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを誘導する。この可能性は我々が同定した２つのペプ
チドがＨＬＡ−Ｂ２７．５結合モチーフを有するという『予備的結果』の項で述
べた我々の予備的な結果によって支持されている。また、ＣＴＬと抗体による同
一の抗原決定基の認識によって（３３、３４）、およびメラノーマ患者における
腫瘍関連性抗原を定義する抗体に対する液性と細胞性免疫の両者の発達により支
持されている。さらにＣＴＬはＨＬＡクラスＩ抗原拘束を受けながらＨＭＷ−Ｍ
ＡＡを認識する能力を有するが、その能力に基づいてＣＴＬを試験することがで
きる。ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックと、ＨＭＷ−ＭＡＡから得られるかも
しれない、予備的結果の項に述べた、おそらくＨＬＡクラスＩ抗原として標的細
胞上に提示されているであろうペプチドとの間の部分的なアミノ酸配列のホモロ
ジーのために、そうしたことが起こるかもしれない。あるいは抗ＨＭＷ−ＭＡＡ
ｍＡｂによって同定したペプチド、およびＨＬＡクラスＩ抗原によって提示さ
れるＨＭＷ−ＭＡＡから得られるペプチドは構造的なホモロジーによってＣＴＬ
が定義する決定基を共有するかもしれない。

【００６８】ｉｎｖｉｖｏでＨＬＡクラスＩ拘束を受けたＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを
刺激できるかどうか決定するためにＨＬＡクラスＩ抗原トランスジェニックマウ
スは有益なモデルを提供する。すでに述べたように、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体を用
いてパンニングによって我々が同定したペプチドの２つはＨＬＡ−Ｂ２７．５に
対する結合モチーフを有することが判明した。これらの２つのペプチドの免疫原
性の試験をＨＬＡ−Ｂ２７．５トランスジェニックマウスを用いて行う。

【００６９】抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂを用いて同定したペプチドがＨＬＡクラスＩ拘束を
受けたＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを産生するかどうか試験する目的で、我々は
以下の戦略を用いる：ｉ）同定したＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックからＨＬ
ＡクラスＩ同種特異性に対する結合モチーフを有するペプチドの選択；ｉｉ）選
択されたペプチドの選択されたＨＬＡクラスＩ同種特異性に対する予測される結
合の測定；ｉｉｉ）選択されたペプチドによって刺激された自己樹状細胞を用い
た、適切なＨＬＡ表現型の末梢血リンパ球のｉｎｖｉｔｒｏ感作；ｉｖ）適切
なＨＬＡクラスＩ同種特異性のトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬの誘導
；ｖ）ペプチドを発現するＴＡＰ欠乏細胞とＨＭＷ−ＭＡＡ発現メラノーマ細胞
を溶解する能力の試験による、ＨＬＡクラスＩ抗原拘束を受けたＣＴＬ産生の測
定。

【００７０】ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックにおけるＨＬＡクラスＩ同種特異性結合モチ
ーフの同定抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体を用いてファージディスプレイペプチドライブラリーの
パンニングによって単離したペプチドについて、その様々なＨＬＡクラスＩ同種
特異性への結合をバイオインフォーマティクスと分子解析ソフトウェア（ＢＩＭ
ＡＳ）を用いて評価を行う。

【００７１】ＨＬＡクラスＩ同種特異性に対するペプチドの予測された結合の測定選択されたＨＬＡクラスＩ同種特異性に対するペプチドの相対結合親和性は、
ＨＬＡクラスＩ同種特異性をコードした遺伝子を導入したリンパ球細胞株Ｔ２を
用いて、再構成アッセイによって測定することができる。即ち、ＨＬＡクラスＩ
抗原導入Ｔ２リンパ球細胞を氷冷クエン酸−Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液（同量の０．２
６３Ｍクエン酸と０．１２３ＭＮａ₂ＨＰＯ₄の混合）、ｐＨ３．３で、９０
秒間、処理することによって実施する。細胞は次に冷却Ｉｓｃｏｖｅ’ｓｍｏ
ｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）で緩衝し、Ｉ
ＭＤＭで洗浄し、１００ｎＭヒト₂−μ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏ．）と、２μｇの抗ＨＬＡ−Ａ２、Ａ２８ｍＡｂＣＲ１１−３５１あるい
は抗ＨＬＡ−Ｂ２７ｍＡｂＫＳ４（試験を行うペプチドによる）のいずれか
、およびペプチド無し（ネガティブコントロール）、標準ペプチド（１０μＭ）
又は試験ペプチド（１０Ｍ）のいずれか、と共にインキュベーションする。ＨＬ
Ａ−Ａ^*０２０１とＨＬＡ−Ｂ^*２７０５結合に用いた標準ペプチドの配列はそれ
ぞれ配列ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶとＲＲＹＱＫＳＴＥＬである。室温での４時間の
インキュベーションに続き、細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ
−結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体で３０分間、４℃にてインキュベーションを行う
。洗浄に引き続き、細胞を０．５％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ−１％Ｂ
ＳＡ中に再び懸濁し、ＦＡＣｓｃａｎにて解析を行う。結果は以下の計算の通り
、蛍光強度（ＦＩ）の増加を倍数として表わす：ＦＩサンプル／ＦＩコントロー
ル。

【００７２】ペプチド刺激をした樹状細胞を用いたｉｎｖｉｔｒｏにおけるＣＴＬの誘導樹状細胞を、メラノーマ患者又は適切なＨＬＡ表現型を持つ健康なボランティ
アの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からすでに述べた方法によって調製する。Ｆｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ分離の後、ＰＢＭＣ（１−３×１０⁸）を７５ｃｍ²培
養フラスコ中で３７℃にて３時間、培養する。非接着性の細胞を除去し、接着性
細胞を１０％熱不活化ヒトＡＢ血清、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン−ストレプトマイシン、０．５ｍｇ／ｍｌアンホテリシンＢおよ
び０．０３％Ｌ−グルタミン酸を添加した２０ｍｌのＩＭＤＭ培養液中で無菌
的条件下で５−７日間培養する。ヒトリコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（１０００
ＩＵ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＩｎｃ．）とヒトリコンビナントＩＬ−
４（１０００ＩＵ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＩｎｃ．）を培養の０日目か
ら２−３日間隔で添加する。樹状細胞（１×１０⁶／ｍｌ）をペプチド（１ｇ／
ｍｌ）で２時間、３７℃で刺激する。非接着性ＰＢＭＣからバイオマグネティク
分離ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ＤｙｎａｌＩｎｃ．、ＬａｋｅＳｕ
ｃｃｅｓｓ、ＮＹ）を用いたポジティブ選択により自己ＣＤ８⁺Ｔ細胞を調製
する。９５％以上であると期待されるＣＤ８⁺Ｔ細胞集団の精製度をＦＡＣＳ解
析によって確認する。

【００７３】ＣＤ８⁺Ｔ細胞（４−５×１０⁶／ｗｅｌｌ）を２４穴組織培養プレート中でペ
プチド刺激を行った樹状細胞（１×１０⁶）と共に７日間、３７℃でインキュベ
ーションを行い、次に１週間後にペプチド刺激をした樹状細胞を用いて再刺激を
行う。ＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ、ＨｏｆｆｍａｎＬａＲｏｃｈｅ、ニュ
ージャージー州、ナットレー）を各刺激後２４時間後に添加し、その後は２−３
日置きに添加する。最初の刺激から７〜９日後、および再刺激の後７日後にＣＴ
Ｌの特異性の試験を行う。

【００７４】ＨＬＡクラスＩ抗原トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬの導入ヒトＨＬＡＢ^*２７０５又はキメラＨＬＡＡ^*０２０１／Ｋ^dを発現したト
ランスジェニックマウスをｉｎｖｉｖｏＣＴＬ産生の目的に用いる。Ａ／Ｋ ^d トランスジェニックマウスを用いるのは、マウスＭＨＣクラスＩ３ドメイン
が胸腺において低アビディティーＣＴＬの選択を増幅することが示されたからで
ある。０および７日目にトランスジェニックマウス（３匹／群）に対して、ペプ
チド刺激をした樹状細胞（１×１０⁵／０．２ｍｌＰＢＳ）を皮下に注射し免
疫を行う。２度目の注射の１０日後、マウスを安楽死させ、ペプチドによるｉｎｖｉｔｒｏ再刺激のために胸腺をＩＬ−２含有培養液（６０ＩＵ／ｍｌ）
中に回収する。機能試験のためにＣＴＬを維持する目的で、ペプチド刺激をした
樹状細胞、又は胸腺細胞のいずれかによる再刺激を毎週行う。

【００７５】ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ感作に用いたペプチドに特異的なＣ
ＴＬの産生の評価ｉｎｖｉｔｒｏ感作およびｉｎｖｉｖｏ誘導されたＣＤ８⁺Ｔ細胞が、適
切なＨＬＡ表現型を持つペプチド刺激をした標的細胞を認識する能力について、
サイトカイン放出および細胞障害性アッセイにて試験を行う。機能アッセイにお
いてペプチド特異的反応に対する標的として、遺伝子型あるいは対応する遺伝子
の導入により適切なＨＬＡクラスＩ拘束エレメントを発現したＴＡＰ欠損Ｔ２細
胞を用いる。Ａ／Ｋ^dトランスジェニックマウスから得たマウスＣＴＬのアッセ
イにおいて、キメラＨＬＡクラスＩ特異性に拘束されたＣＴＬのアッセイ感受性
を改善する目的で（６１）、Ｔ２細胞にキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｋ^d遺伝子を導入
する。細胞障害性アッセイでは標的細胞を１μＭペプチドで３７℃、１時間、刺
激を行い、洗浄し、次にＮａ⁵¹ＣｒＯ₄（１５０μＣｉ／１０⁶ ｃｅｌｌｓ）で
３７℃で１２時間、標識を行う。次に細胞を洗浄し、９６穴丸底プレートにて最
終総量０．２ｍｌで１０％ヒトＡＢ血清又はＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６
４０培養液中で効果細胞（効果細胞／標的細胞比は２０：１から２．５：１の範
囲で）と混合する。５％ＣＯ₂の環境下で３７℃、４時間のインキュベーション
の後、トリプリケートの培養について各上清を１００μｌ回収し、測定する。
データは標的細胞のＣｒ⁵¹の特異的放出の平均パーセントとして表現する。サイ
トカイン放出アッセイにおいて、刺激細胞（１×１０⁵）と反応細胞（１×１０⁵ ）を９６穴プレートにて２４時間、共培養する。培養上清を回収し、ＩＮＦ−ｇ
ａｍｍａ（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）の存在下でＥＬＩＳＡに
よって試験を行う。無関係のペプチドで刺激したＴＡＰ欠損標的細胞を用いてＣＴＬの抗原特異性
の評価を行う。ＨＬＡクラスＩ抗原拘束を、拘束エレメントとして用いたＨＬＡ
クラスＩ対立遺伝子に対するｍＡｂを用い、ブロッキング実験によって測定する
。また、ＣＴＬの誘導に用いた、ＨＬＡクラスＩ拘束エレメントを欠如したペプ
チドで刺激をした標的細胞を用いて測定する。

【００７６】ＨＬＡクラスＩ抗原に拘束された、ＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬの産生の評価ｉｎｖｉｔｒｏ感作およびｉｎｖｉｖｏ誘導されたＣＤ８⁺Ｔ細胞の、適
切なＨＬＡ表現型を持つメラノーマ細胞上のＨＭＷ−ＭＡＡを認識する能力につ
いてサイトカイン放出および細胞障害性アッセイにて試験を行う。ＨＬＡクラス
Ｉ拘束エレメントを発現しているがＨＭＷ−ＭＡＡを発現していない腫瘍細胞を
用いて、ＨＭＷ−ＭＡＡに対するＣＴＬの特異性を測定する。ＨＬＡクラスＩ拘
束をブロッキング実験によって測定する。ブロッキング実験には、拘束エレメン
トとして用いたＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対するｍＡｂと、ＨＭＷ−ＭＡＡを
発現するがＨＬＡクラスＩ拘束エレメントは発現していないメラノーマ細胞を用
いる。

【００７７】実施例２抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂによって認識される抗原決定基のペプチドミミック同定ＨＭＷ−ＭＡＡ結合抗−抗−ｉｄｍＡｂＧＨ３６８、ＧＨ４６４、ＧＨ５
８６、ＧＨ７０４、ＧＨ７８６およびＧＨ１１１５を用いたパンニングによって
ＬＸ−８およびＸ₁₅ライブラリーの両方から、そして抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂ
７６３．７４を用いたパンニングによってＬＸ−８ライブラリーからそれぞれ
陽性クローンを単離した。ファージは異なる配列を持つペプチドをディスプレイ
した。ファージディスプレイペプチド挿入片に対応する合成ペプチドの結合をパ
ンニングに用いた対応するｍＡｂを用いて測定した。ｍＡｂ７６３．７４によ
って同定した合成環状ペプチド＃１ＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲは、ｍＡｂ７
６３．７４と反応し、そのＨＭＷ−ＭＡＡと抗ｉｄｍＡｂＭＫ２−２３に対
する結合を用量依存性に阻害した。ジチオスレイトールによってペプチドを線状
化すると反応性が失われることから、ｍＡｂ７６３．７４とペプチド＃１の反
応性はコンフォメーション依存性である。合成ペプチド＃３（ＱＣＴＧＰＮＦＡ
ＴＮＣＲ）はｍＡｂ７６３．７４のＨＭＷ−ＭＡＡと抗ｉｄｍＡｂＭＫ２
−２３との反応性を阻害しなかったので、位置７にある残基Ｖａｌがペプチド＃
１のｍＡｂ７６３．７４との反応性において重要な役割を果たしていることは
特筆すべきである。それぞれｍＡｂＧＨ３６８とＧＨ７８６によって同定した
合成ペプチド＃５（ＧＣＩＫＳＨＰＦＶＲＣＰ）と＃７（ＮＱＬＰＱＹＭＧＰＡ
ＰＡＹＭＲ）はＨＭＷ−ＭＡＡに対する対応するｍＡｂの結合を阻害した。

【００７８】ＨＭＷ−ＭＡＡとのアミノ酸ホモロジーｍＡｂＧＨ３６８とＧＨ７０４によって同定したペプチドと、ｍＡｂＧＨ
１１５１によって同定したペプチドは、それぞれモチーフ、ＳＨＰＦとＰＰＴＦ
ＸＳを、発表されているＨＭＷ−ＭＡＡコアタンパク質のアミノ酸配列の残基１
４５７−１４６０と８１８−８２３と共有する。ｍＡｂＧＨ７８６とＧＨ１１
５１によって同定したＬＸ−８ペプチドはＰＦＱモチーフをＨＭＷ−ＭＡＡコア
タンパク質のアミノ酸残基１４５８−１４６０に共有する。同様にｍＡｂＧＨ
３６８、ＧＨ５８６とＧＨ７０４によって同定したペプチドは相互にＨＰＦモチ
ーフを共有する。これら２つのモチーフにおいてアミノ酸ＰＦが共有されている
ことは、これらの残基が抗−抗ｉｄｍＡｂによって認識される決定基の発現に
重要な役割を果たしていることを示唆する。

【００７９】抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂとの反応性パターンｍＡｂのパネルによって同定したファージディスプレイペプチド間の構造的関
連性を、ｍＡｂ７６３．７４、８つのＨＭＷ−ＭＡＡ結合の抗−抗ｉｄｍＡ
ｂ、そして３つのＨＭＷ−ＭＡＡ非結合の抗ｉｄｍＡｂを用いた結合アッセイ
および阻害アッセイの測定によって解析した。ｍＡｂ７６３．７４によって同
定したファージディスプレイペプチドは抗−抗ｉｄｍＡｂとは全く反応しなか
った。逆にｍＡｂ７６３．７４はｍＡｂＧＨ３６８、ＧＨ４６４およびＧＨ
７０４によって同定したファージディスプレイペプチドと反応した。抗−抗ｉｄ
ｍＡｂＧＨ３６８、ＧＨ７０４およびＧＨ１１５１は、各々を用いて同定を
行ったファージディスプレイペプチドと反応した。さらにｍＡｂＧＨ４６４
とＧＨ５８６は、ｍＡｂＧＨ３６８とＧＨ７０４によって同定したファージデ
ィスプレイペプチドと反応した。ｍＡｂＧＨ５８６はｍＡｂＧＨ７８６によ
って同定したファージディスプレイペプチドとも弱く反応した。後者のファージ
ディスプレイペプチドの内、いくつかはｍＡｂＧＨ５１８と弱く反応した。合
成ペプチド＃５の反応性は、ｍＡｂ７６３．７４とｍＡｂＧＨ４６４を除く
全てのｍＡｂとの反応性において、対応するファージディスプレイペプチドと同
様の結果を示した。ｍＡｂ７６３．７４とｍＡｂＧＨ４６４はファージディ
スプレイペプチドと反応したが、対応する合成ペプチドとは反応しなかった。こ
れは我々の仮説であるが、ペプチド配列だけではなく、ファージのｐＶＩＩＩメ
ジャーコートタンパク質のアミノ酸残基もｍＡｂ７６３．７４とＧＨ４６４と
の反応性に寄与している。この仮説を検証するために現在、実験を進めている。

【００８０】ＨＬＡ−Ａ^*０２０１とＨＬＡ−Ｂ^*２７０５抗原に対する結合バイオインフォマティクスと分子解析ソフトウェア（ＢＩＭＡＳ）を用いた解
析によって抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂによって同定したいくつかのペプチド中
に、ＨＬＡ−Ａ^*０２０１、−Ａ^*６８０１と−Ｂ^*２７０５抗原結合モチーフを
同定した。

【００８１】抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂはまた、ＨＭＷ−ＭＡＡ由来ペプチドＬＬＧＨＳＩ
ＶＡＶに対してホモロジーのあるペプチドも同定した。後者はＨＬＡ−Ａ^*０２
０１抗原結合モチーフを有する。ペプチドを同定したｍＡｂのＨＬＡ−Ａ^*０２
０１抗原への結合を増加させるために、我々は位置２、５および９に変異を導入
することを計画している。

【００８２】同定したペプチドのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対する結合予測値が妥当であ
るかどうかについて、安定化アッセイを用いて試験を行う。ｍＡｂＧＨ７８６
とＧＨ７０４によって同定したペプチド、それぞれＹＭＧＰＡＰＡＹＭとＣＲＶ
ＥＬＮＨＰＲは、ＨＬＡ−Ｂ^*２７０５導入ＴＡＰ欠損Ｔ２（Ｔ２−Ｂ^*２７０５
）細胞においてそれぞれＨＬＡ−Ａ^*０２０１とＨＬＡ−Ｂ^*２７０５抗原の発現
を安定化させた。ＨＬＡ−Ｂ^*２７０５とＨＬＡ−Ａ^*０２０１抗原結合ペプチド
は、Ｔ２−ＨＬＡ−Ｂ^*２７０５細胞においてそれぞれＨＬＡ−Ａ^*０２０１とＨ
ＬＡ−Ｂ^*２７０５抗原の発現量を変えなかったため、安定化は特異的であると
いえる。ＨＬＡ−Ｂ^*２７０５結合ペプチドであるＣＲＶＥＬＮＨＰＲは、リフ
ァレンスペプチドＲＲＹＱＫＳＴＥＬを導入した場合とほぼ同じ程度にまでＨＬ
Ａ−Ｂ^*２７０５の発現を安定化させる。

【００８３】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫ｍＡｂ７６３．７４（ＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲ）、ｍＡｂＧＨ３６８（
ＧＣＩＫＳＨＰＦＶＲＣＰ）およびｍＡｂＧＨ７８６（ＴＣＲＬＰＦＱＮＶＡ
ＣＨ）を用いてＬＸ−８ペプチドライブラリーから、そしてｍＡｂＧＨ７８６
（ＮＱＬＰＱＹＭＧＰＡＰＡＹＭＲ）を用いてＸ₁₅ライブラリーから単離したフ
ァージディスプレイペプチドでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。ｍＡｂＧＨ３
６８によって同定した幾つかのペプチドを除く残り全てのファージディスプレイ
ペプチドで免疫したマウス血清は、結合アッセイにおいてＨＭＷ−ＭＡＡ陰性Ｂ
リンパ球細胞よりもＨＭＷ−ＭＡＡ発現メラノーマ細胞Ｍｅｌｕｒに対してより
高い反応性を示した。

【００８４】同定したファージディスプレイペプチドを用いたＨＭＷ−ＭＡＡ結合ｍＡｂのデ
ィファレンシャル反応性の分子学的基礎抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂパネルによって認識されるペプチドは多様であり、
互いにメラノーマ細胞への結合を阻害する能力を持つが、これはＨＭＷ−ＭＡＡ
上で空間的に近接しているが互いに個別である抗原決定基の認識に適合している
。

【００８５】抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂの重鎖（Ｖ_H）と軽鎖（Ｖ_L）可変部のアミノ酸配列
の比較によって、ｍＡｂＧＨ３６８、ＧＨ７０４、ＧＨ７８６およびＧＨ１１
５１のＶ_HとＶ_L ＣＤＲのアミノ酸配列に高いホモロジーが存在することが判明
した。これら４つのｍＡｂは、これまでに同定したファージディスプレイペプチ
ドに非常に類似した反応性パターンを示している。抗−抗ｉｄｍＡｂＧＨ３
６８、ＧＨ７０４およびＧＨ７８６によって単離されたファージディスプレイペ
プチドとｍＡｂＧＨ５８６との反応性は、Ｖ_H−ＣＤＲ２における２つのアミ
ノ酸残基が異なるために減少する。さらにＶ_H−ＣＤＲ３におけるＴｙｒ残基を
Ａｌａに置換すると、ｍＡｂＧＨ３６８、ＧＨ７０４およびＧＨ７８６によっ
て同定したファージディスプレイペプチドとｍＡｂＧＨ１４９の反応性は失わ
れる。最後にｍＡｂＧＨ３６８、ＧＨ７０４、ＧＨ７８６およびＧＨ１１５１
によって同定したファージディスプレイペプチドとｍＡｂＧＨ４６４と７６３
．７４の反応性は、そのＶ_HとＶ_L−ＣＤＲ３のアミノ酸配列が幾つか異なると失
われる。

【００８６】実施例３抗ＧＤ₃ガングリオシドｍＡｂによって認識される抗原決定基のペプチドミミッ
ク同定５つの抗ＧＤ₃ガングリオシドｍＡＢを用い、ファージディスプレイペプ
チドライブラリーＬＸ−８およびＸ₁₅のパンニングにより、ｍＡｂＭＧ２１
ＩｇＧを用いてＬＸ−８ペプチドライブラリーから、およびｍＡｂＭＢ３．６
とＭＧ２２を用いてＸ₁₅ペプチドライブラリーからファージクローンを単離した
。ｍＡｂＭＧ２１ＩｇＧ３とＲ２４を用いた２つのライブラリーのパンニン
グではクローンは同定できなかった。

【００８７】ランダムに選択した陽性クローンの塩基配列解析によって、ｍＡｂＭＧ２１
ＩｇＧ１によって同定したクローンから１つの配列を同定し（クローン＃１と
称す）、ｍＡｂＭＧ２２によって同定したクローンから１つの配列を同定し（
クローン＃４と称す）、ｍＡｂＭＢ３．６によって同定したクローンから２つ
の配列を同定した（クローン＃２と＃３と称す）。４つのアミノ酸配列にはＰｒ
ｏ残基が好まれて使われている点を除けば、全くホモロジーは存在しなかった。
この発見は、炭水化物にミミックしたペプチドにおいて同定した短いコンセンサ
ス配列が一般に芳香族アミノ酸及び／又はプロリンに富んでいる事実というに一
致する。

【００８８】クローン＃１と＃４はそれぞれｍＡｂＭＧＩｇＧ１とＭＧ２２のＧＤ₃ガ
ングリオシドに対する結合を阻害した。対応する５０％阻害濃度は１．３と１２
．３Ｍであった。対照的にクローン＃２と＃３はＧＤ₃ガングリオシドに対する
ｍＡｂＭＢ３．６の結合に対してわずかに境界的効果が観察されただけであっ
た。

【００８９】クローン＃１を除いて、４つのクローンはパンニングに用いたｍＡｂとのみ反
応した。クローン＃１はｍＡｂＭＧ２１ＩｇＧ３とも反応したが、ｍＡｂ
ＭＧ２１ＩｇＧ１との反応に比べるとわずかであった。

【００９０】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫原性ｍＡｂＭＧ２２によって同定したファージディスプレイペプチドを用いて免
疫を行った１４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのうち６匹が、ＧＤ₂とＧＭ₃ガングリオ
シドと交叉反応をするＧＤ₃ガングリオシド抗体を産生した。これらの抗体のＧ
Ｄ₃ガングリオシドとの反応性はｍＡｂＭＧ２２によって同定したファージデ
ィスプレイペプチドに対応する合成ペプチドによって阻害された。ＧＤ₃ガング
リオシドと免疫血清の反応性は、ｍＡｂＭＢ３．６によって同定した合成ペプ
チド＃３によって影響されなかったので、この阻害は特異的であると考えられる
。抗体の発達のキネティクスとそのタイターは６匹の免疫応答のあるマウスにお
いて多様に異なっていた。マウス＃３から採取した血清はまたドットブロットア
ッセイにおいてＧＤ₃ガングリオシドと反応し、ＧＤ₃ガングリオシド陰性リンパ
球細胞Ｌ１４よりもＧＤ₃ガングリオシドを発現するメラノーマ細胞Ｍｅｌｕｒ
とより高い反応性を示した。

【００９１】実施例４ファージディスプレイペプチドライブラリージスルフィド結合ペプチドＸＣＸ₈ＣＸ、単一のシステインペプチドＸＣＸ₁₅
およびランダム／リニアペプチドＸ₁₅を示すファージディスプレイペプチドライ
ブラリーＬＸ−８、ＸＣＸ₁₅およびＸ₁₅のそれぞれはＤｒ．Ｊ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔ
（ＳｉｍｏｎＦｒａｓｅｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｂｕｒｎａｂｙ、Ｂ
Ｃ、Ｃａｎａｄａ）の好意によって提供された（６６）。ファージディスプレ
イペプチドライブラリーのスクリーニングとパンニングの方法は当技術分野でよ
く知られている。例として、米国特許第５，７６３，１６４号；第５，８３４，
３１８号；第５，７３３，７３１号；第５，７２３，２８６号；第５，５６５，
３２５号；第５，４９８，５３０号；第５，７５０，３７３号；および第５，８
０７，９８６号を参照のこと。これら米国特許の全てを本明細書の一部を構成す
るものとしてここに援用する。

【００９２】ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックを抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂ７６３．７
４と８つのＨＭＷ−ＭＡＡ結合抗−抗ｉｄｍＡｂを用いてファージディスプレ
イペプチドライブラリーのパンニングによって単離する。単離したファージの反
応性について、パンニングに使用したｍＡｂを用いて結合アッセイにて試験する
。パンニングに用いたｍＡｂに反応性があると判明したファージの中からランダ
ムにファージを選択し、その挿入片のアミノ酸配列を合成ペプチドを利用して決
定することができる。次に後者の、ｍＡｂ７６３．７４および抗−抗ｉｄｍ
Ａｂ結合ＨＭＷ−ＭＡＡのパネルとの反応性について試験を行う。さらにホモロ
ジーの度合いを決定するために、そのペプチド配列を発表されているＨＭＷ−Ｍ
ＡＡのアミノ酸配列と比較する。

【００９３】抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂによるファージディスプレイペプチドライブラリーの
パンニングパンニングに用いるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）はカプリル酸とアンモニウ
ム硫酸による連続沈殿によってマウス腹水から精製する。ｍＡｂの精製度はＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥでモニターする。精製したｍＡｂはＮＨＳ−ＬＣビオチン（Ｐｉｅ
ｒｃｅ、イリノイ州、ロックフォール）を用いて製造者のインストラクションに
従ってビオチン化する。ビオチン化したｍＡｂを用いて、増幅したファージディ
スプレイペプチドライブラリーＬＸ−８、ＸＣＸ₁₅およびＸ₁₅からのマイクロパ
ンニングをＢｏｎｎｙｃａｓｔｌｅらの方法に従い９６穴マイクロタイタープレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州
、リンカーンパーク）中で実施する。即ち、パンニングの第一回目は１ウェルあ
たり１０ｇのビオチン化ｍＡｂと１×１０¹²ファージ粒子を利用して実施する。
引き続いて、１×１０¹⁰ファージ粒子を添加し、ビチオン化ｍＡｂの量を１ウェ
ル当たり０．１０ｇに減少させて３回のパンニングを実施する。各回のパンニン
グで溶出したファージをＳｍｉｔｈとＳｃｏｔｔの方法に従って調製したＥ．ｃ
ｏｌｉＫ９１Ｋａｎ中で増幅し、次の回のパンニングの添加ファージとして用
いる。各回のパンニングの後に溶出ファージ／添加ファージの％として定義され
るファージ濃縮、例えば％収量を、テトラサイクリン（Ｔｃ）（２０ｕｇ／ｍｌ
）を含むＮＺＹプレート上のスポットタイタリングによって決定する。

【００９４】抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂのパネルを用いた単離されたファージディスプレイペ
プチドの反応性抗ＨＭＷ−ＭＡＡｍＡｂ７６３．７４とＨＭＷ−ＭＡＡ結合抗−抗ｉｄ
ｍＡｂを用いた４回目のパンニングの後、リコンビナントペプチドライブラリ
ーから単離したファージディスプレイペプチドについて特異的反応性の試験を行
う。試験はパンニングに使用したｍＡｂを用い、第一回目は免疫スクリーニング
によって、次にＥＬＩＳＡによって行う。免疫スクリーニングではペプチドライ
ブラリーから単離したランダムファージクローンを試験する。各ウェルにパンニ
ングに用いた１００ｕｌのｍＡｂ溶液（０．０５ＭＮａＨＣＯ₃の１００ｕｇ
／ｍｌ、ｐＨ９．６）を添加することによりｍＡｂによってすでにコートされ
た、フレキシブル、Ｕ−型底９６穴マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｋ
、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）中でＥＬＩＳＡを実施する。室温で１８時間
のインキュベーションの後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳでウェルをブロッキング
する。次に、免疫スクリーニングにおいて陽性であると判明したクローンの一夜
培養から採取した１００ｕｌのファージ上清を各ウェルに添加する。４℃での一
夜のインキュベーションの後、ビオチン化した抗Ｍ１３ヒツジ抗体（５ｐｒｉ
ｍｅ−３ｐｒｉｍｅＩｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を添加し、インキ
ュベーションを室温でさらに２時間行う。ビオチン化した抗Ｍ１３ヒツジ抗体の
結合は、ＳＡ−ＨＲＰ溶液の１：２５００希釈液を用い、室温で１時間、ウェ
ルをインキュベーションして検出する。反応はフェニレンジアミン−Ｈ₂Ｏ₂基質
を用いて開始し、２ＭＨ₂ＳＯ₄で止める。ＥＬＩＳＡリーダー（ＥＬ３１１
，Ｂｉｏ−ＴｅｃｈＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、
ＶＴ）によって４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。結果は４９０ｎｍにお
ける吸光度の値によって表示する。

【００９５】反応の特異性は、マウスＩｇに一致したイソタイプを有するファージ上清の反
応性を試験してモニターする。パンニングに用いたｍＡｂによって陽性であると
判明したクローンについて、他の抗−抗ｉｄｍＡｂを用いて試験する。

【００９６】パンニングに用いたｍＡｂと反応するファージ挿入片の塩基配列パンニングに用いたｍＡｂと反応すると判明したクローンの内から１０クロー
ンを得て、この１０クローンの間の平均のペプチド挿入片の塩基配列を、以下の
変法が施行されたジデオキシヌクレオチド鎖終止法によって決定する。ＰＥＧ／
ＮａＣｌ沈殿法によって個々のクローンのファージ上清からファージを精製し、
調製する。シーケンシング反応は、マイクロタイターウェル（ＧｅＮｕｎｃ；Ｎ
ｕｎｃＲｏｃｋｉｌｄｅＤｅｎｍａｒｋ）中で２×１０¹¹ファージ粒子につ
いて、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥｋｉｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０、Ｕｎｉｔｅ
ｄｓｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）
と³²Ｐ−エンド標識ｆ８８．４シンケンシングプライマー、５’−ＣＴＧ
ＡＡＧＡＧＡＧＴＣＡＡＡＡＧＣ−３’を用いて実施する。解析を行ったクロー
ンの塩基配列はアミノ酸配列に翻訳される。コンセンサス配列、および最も頻繁
に観察されたアミノ酸配列を同定するためアミノ酸配列を比較する。このインフ
ォメーションを基にしてアミノ酸配列を選択し、自動ペプチドシンセサイザー（
９０５０Ｐｌｕｓ；マサチューセッツ州、パーセプティブ）中で標準９−フ
ルオレニル−メトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成器（ＳＰＰＳ
）を用いてペプチドを合成する。指示がある場合、合成ペプチドは５％ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて環状化し、高性能液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）によって精製を行う。ペプチドの環状化はマススペクトロスコピーに
よって確認する。ペプチドは水で５ｍＭの濃度に再構成し、少量づつ分注し、−
２０℃にて貯蔵する。もしペプチドが水に難溶性である場合はＤＭＳＯ中に５０
ｍＭの濃度で溶解し、使用に際し緩衝液で希釈を行う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA36 CA04 CA05 DA03 4C076 CC07 CC27 4C084 AA02 AA03 AA06 AA13 AA17 BA02 BA18 BA23 CA27 CA53 CA56 CA59 DA01 DA27 MA05 NA14 ZB011 ZB012 ZB261 ZB262 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA13 ZB01 ZB26 4H045 AA11 BA16 BA17 CA40 DA01 DA75 DA86 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】疾患に関連する標的分子又はそのフラグメントに対する免疫
応答を誘導する有効量のペプチドミミックによって、治療を必要とする哺乳動物
を治療することを特徴とする哺乳動物の治療方法。
【請求項２】前記疾患が癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記癌がメラノーマである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記標的分子が高分子量のメラノーマ関連抗原である、請求
項１に記載の方法。
【請求項５】前記標的分子がガングリオシドｇｄ３である、請求項１に記
載の方法。
【請求項６】前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記ペプチドミミックがアミノ酸配列ＳＰＳＷＹＣＰＤＣＤ
ＫＲＰＬＶを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記ペプチドミミックがアミノ酸配列ＲＰＹＲＹＤＰＬＧＤ
ＬＫＳＲＨを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記ペプチドミミックがアミノ酸配列ＥＡＲＮＷＨＤＦＰＩ
ＨＰＲＴＬを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記ペプチドミミックがアミノ酸配列ＳＣＲＷＶＧＩＤＬ
ＹＣＰを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記ペプチドミミックがアミノ酸配列ＥＥＬＨＰＰＧＳＲ
ＡＰＳＩＲＫを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記ペプチドミミックがアミノ酸配列ＱＣＴＧＰＮＶＡＴ
ＮＣＲを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記ペプチドミミックがアミノ酸配列ＱＣＴＧＰＮＦＡＴ
ＮＣＲを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】前記ペプチドミミックがアミノ酸配列ＴＣＮＧＰＳＶＹＭ
ＮＣＬを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】前記ペプチドミミックがアミノ酸配列ＲＰＹＲＹＤＰＬＧ
ＤＬＫＳＲＨを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項１６】前記ペプチドミミックが免疫原性化合物と結合している、
請求項１に記載の方法。
【請求項１７】前記ペプチドミミックがアジュバントと結合している、請
求項１に記載の方法。
【請求項１８】前記ペプチドミミックがＭＣＨクラスＩ拘束性の抗原に結
合して複合体を形成している、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】前記ペプチドミミックがＭＣＨクラスＩＩ拘束性の抗原に
結合して複合体を形成している、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】前記ペプチドミミックが合成ペプチドである、請求項１に
記載の方法。
【請求項２１】前記ペプチドミミックが擬ペプチドである、請求項１に記
載の方法。
【請求項２２】前記ペプチドミミックが抗原提示細胞上に発現される、請
求項１に記載の方法。
【請求項２３】前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２２に記載の
方法。
【請求項２４】疾患に関連する標的分子又はそのフラグメントに対する免
疫応答を誘導するペプチドミミック。
【請求項２５】前記疾患が癌である、請求項２４に記載のペプチドミミッ
ク。
【請求項２６】前記癌がメラノーマである、請求項２５に記載のペプチド
ミミック。
【請求項２７】前記標的分子が高分子量のメラノーマ関連抗体である、請
求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項２８】前記標的分子がガングリオシドｇｄ３である、請求項２４
に記載のペプチドミミック。
【請求項２９】アミノ酸配列ＳＰＳＷＹＣＰＤＣＤＫＲＰＬＶを含む、請
求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項３０】アミノ酸配列ＲＰＹＲＹＤＰＬＧＤＬＫＳＲＨを含む、請
求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項３１】アミノ酸配列ＥＡＲＮＷＨＤＦＰＩＨＰＲＴＬを含む、請
求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項３２】アミノ酸配列ＳＣＲＷＶＧＩＤＬＹＣＰを含む、請求項２
４に記載のペプチドミミック。
【請求項３３】アミノ酸配列ＥＥＬＨＰＰＧＳＲＡＰＳＩＲＫを含む、請
求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項３４】アミノ酸配列ＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲを含む、請求項２
４に記載のペプチドミミック。
【請求項３５】アミノ酸配列ＱＣＴＧＰＮＦＡＴＮＣＲを含む、請求項２
４に記載のペプチドミミック。
【請求項３６】アミノ酸配列ＴＣＮＧＰＳＶＹＭＮＣＬを含む、請求項２
４に記載のペプチドミミック。
【請求項３７】アミノ酸配列ＲＰＹＲＹＤＰＬＧＤＬＫＳＲＨを含む、請
求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項３８】前記ペプチドミミックが免疫原化合物とコンジュゲートし
ている、請求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項３９】前記ペプチドミミックがアジュバントと結合している、請
求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項４０】前記ペプチドミミックがＭＣＨクラスＩ拘束性の抗原に結
合して複合体を形成している、請求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項４１】前記ペプチドミミックがＭＣＨクラスＩＩ拘束性の抗原に
結合して複合体を形成している、請求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項４２】前記ペプチドミミックが擬ペプチドである、請求項２４に
記載のペプチドミミック。
【請求項４３】前記ペプチドミミックが抗原提示細胞上に発現される、請
求項２４に記載のペプチドミミック。
【請求項４４】前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項４３に記載の
ペプチドミミック。
【請求項４５】疾患に関連する標的分子又はそのフラグメントに対する免
疫応答を誘導するペプチドミミックを発現する有効量のベクターによって、治療
を必要とする哺乳動物を治療することを特徴とする哺乳動物の治療方法。
【請求項４６】前記疾患が癌である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】前記癌がメラノーマである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】前記標的分子が高分子量のメラノーマ関連抗体である、請
求項４５に記載の方法。
【請求項４９】前記標的分子がガングリオシドｇｄ３である、請求項４５
に記載の方法。
【請求項５０】疾患に関連する標的分子又はそのフラグメントに対する免
疫応答を誘導するペプチドミミックを発現するベクター。
【請求項５１】前記疾患が癌である、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５２】前記癌がメラノーマである、請求項５１に記載のベクター
。
【請求項５３】前記標的分子が高分子量のメラノーマ関連抗体である、請
求項５０に記載のベクター。
【請求項５４】前記標的分子がガングリオシドｇｄ３である、請求項５０
に記載のベクター。
【請求項５５】疾患に関連する標的分子又はそのフラグメントに対する免
疫応答を誘導するペプチドミミックをコードする核酸分子。
【請求項５６】前記疾患が癌である、請求項５５に記載の核酸分子。
【請求項５７】前記癌がメラノーマである、請求項４６に記載の核酸分子
。
【請求項５８】前記標的分子が高分子量のメラノーマ関連抗体である、請
求項５５に記載の核酸分子。
【請求項５９】前記標的分子がガングリオシドｇｄ３である、請求項５５
に記載の核酸分子。