JP2002532514A

JP2002532514A - 主要組織適合性複合体クラスｉ拘束抗原提示の増強のための、組成物および方法

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Publication number: JP2002532514A
Application number: JP2000588205A
Authority: JP
Inventors: レイナーラウス，; イザークヘイキム，; ダミアーバイドビック，
Original assignee: デンドレオンコーポレイション
Priority date: 1998-12-14
Filing date: 1999-12-14
Publication date: 2002-10-02
Also published as: NZ512807A; EP1141007A1; EP1141007B1; WO2000035949A1; AU775767B2; AU2053800A; HK1038754A1; CA2353816A1; CA2353816C

Abstract

(57)【要約】改変された可溶性タンパク質抗原に対するインビボの細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発するための、組成物および方法が開示される。改変された可溶性タンパク質抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）への改変された抗原の進入を容易にする付加されたペプチド配列を含む。いくつかの場合において、付加されたペプチド配列は、Ｎ末端システイン残基を有しても有さなくてもよい、約２０〜２５のアミノ酸残基を有するペプチドである。ペプチド配列は、可溶性タンパク質抗原に、および１つ以上の他のペプチド配列に化学的に結合され得るか、または可溶性タンパク質抗原と１つ以上のこのようなペプチド配列との結合体は、連続した核酸コード配列の発現により形成される。本発明はまた、哺乳動物のインビボでの免疫治療のための、各々が付加されたペプチド配列を有する１つ以上の改変抗原を含む、抗原性組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ）に関連し
て可溶性タンパク質抗原を提示可能にするように改変された可溶性タンパク質抗
原（Ａｇ）の組成物、このような改変されたＡｇ組成物のインビボでの免疫治療
のために有効なワクチンとしての使用のための方法、およびこれらＡｇの組成物
を含む薬学的組成物に関する。

【０００２】さらに本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を処理するための方法に関し、ここ
でこのような処理は、ＭＨＣクラスＩに関連して可溶性タンパク質抗原の提示を
増強する。

【０００３】（発明の背景）腫瘍特異的ＣＤ８⁺細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、動物モデルの研究に
よって示されたような抗腫瘍免疫応答の重要なエフェクター要素（ｅｆｆｅｃｔ
ｏｒｌｉｍｂ）を構成するようである（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、１９９１、Ａｄ
ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１）。従って、ＣＴＬにより認識される腫瘍特
異的Ａｇは、おそらく腫瘍拒絶Ａｇとして機能し、インビボで防御免疫を誘導す
ることが可能である。

【０００４】ＡＰＣ上で構成的に発現する、ＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子は、
それぞれＣＤ８⁺ＣＴＬおよびＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）に対する非重複Ａ
ｇ由来ペプチドの提示を担う（Ｒｏｔｈｂａｒｄら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ
３２６：８８１；Ｂａｂｂｉｔｔら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１７：３５９
）。ＣＴＬは、クラスＩ分子のＭＨＣ分子への移行の前に、小胞体に輸送された
細胞内タンパク質のペプチドフラグメントを含むクラスＩ分子を認識し（Ｇｅｒ
ｍａｉｎ、１９９５、Ａｎｎ、ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７５４：１１４；Ｈｅ
ｅｍｅｌｓおよびＰｌｏｅｇｈ、１９９５、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．６４：４６３）、一方Ｔｈ細胞に提示される大部分のクラスＩＩ複合体化ペプ
チドは、エンドサイトーシスおよびその後のリソソームとの融合を介して、クラ
スＩＩ分子の生合成経路に入る外因性タンパク質または細胞表面タンパク質の分
解産物である（Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ、１９９４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１２：２５９）。Ａｇ提示のこの２分は、なぜＡｇ特異的ＣＤ８⁺ＣＴＬ
が細胞内Ａｇに対して最も有効に生成されるのか、または細胞外Ａｇがいつサイ
トゾルに送達されるのかを説明する。細胞外培地におけるインタクトなタンパク
質は、通常サイトゾルに浸透しないので、可溶性タンパク質は代表的に、ＣＴＬ
応答を誘発しない（Ｂｒａｃｉａｌｅら、１９８７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．
９８：９５）。

【０００５】従って、可溶性タンパク質に対するＣＴＬ応答を誘発するための方法を提供す
ることが望ましい。

【０００６】（発明の要旨）本発明は、可溶性タンパク質抗原に対するインビボの細胞傷害性リンパ球（Ｃ
ＴＬ）応答を誘発するための新規の組成物および方法を提供する。

【０００７】１つの局面において、増強されたＣＴＬ応答を誘発することが可能な、改変さ
れた可溶性タンパク質抗原が、本発明によって提供される。改変は、抗原提示細
胞（ＡＰＣ）への改変された抗原の進入を容易にする、抗原に対するペプチド配
列の共有結合的付加を含む。

【０００８】いくつかの場合において、付加されたペプチド配列は、Ｎ末端システイン残基
を有しても有さなくてもよい、約２０〜２５のアミノ酸残基を有するペプチドで
ある。

【０００９】ペプチド配列は、可溶性タンパク質抗原に、および１つ以上の他のペプチド配
列に化学的に結合され得るか、または可溶性タンパク質抗原と１つ以上のこのよ
うなペプチド配列との結合体は、連続した核酸コード配列の発現により形成され
る。

【００１０】本発明はまた、哺乳動物のインビボでの免疫治療のための、各々が付加された
ペプチド配列を有する１つ以上の改変抗原を含む、抗原性組成物を提供する。

【００１１】１つの局面において、本発明の１つ以上の改変されたタンパク質抗原は、所定
の腫瘍または病原体に対して特異的であり、そして哺乳動物における悪性腫瘍の
処置のために使用され得る。

【００１２】さらなる局面において、本発明は、（例えば、癌治療ための）免疫方法を提供
し、ここでこの方法は、被験体からＤＣのサンプルを得る工程、免疫応答が所望
される１つ以上のペプチド抗原の細胞表面提示を誘導するのに有効な様式におい
て、改変された可溶性タンパク質抗原へインビトロでＤＣを曝露する工程、およ
び曝露されかつ刺激されたＤＣを被験体に戻す工程を包含する。

【００１３】本発明のこれらの目的および特徴ならびに他の目的および特徴は、以下の詳細
な説明が、添付の図面と関連して読まれる場合、より十分に明らかになる。

【００１４】（発明の詳細な説明）（Ｉ．定義）他に示されない限り、以下の用語が、以下の意味を有する：本明細書中で使用される場合、「主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣ
Ｉ）に関連する可溶性タンパク質抗原の提示」は、そのフラグメントの可溶性
タンパク質抗原またはそのフラグメントが、細胞表面上の主要組織適合性複合体
クラスＩ分子とともに提示され、そしてクラスＩ拘束抗原特異的ＣＴＬのインデ
ューサーおよび標的として役立ち得ることを意味する。

【００１５】本明細書中で使用される場合、用語「パルス刺激（ｐｕｌｓｅ）」は、ＡＰＣ
の表面上のその抗原の提示を促進するのに十分な時間にわたる、抗原へのＡＰＣ
の曝露を意味する。パルス刺激されてそしてＡＰＣ表面上に抗原を提示するＡＰ
Ｃは、「刺激された」と言われる。

【００１６】「前駆体抗原提示細胞」は、Ａｇまたはペプチドに曝露された場合、ＡＰＣに
なり、そしてＡｇをＴ細胞に提示することが可能な細胞である。

【００１７】本明細書中で使用される場合、「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、Ａｇまたはペ
プチドがパルス刺激された後に、免疫応答においてＣＤ８⁺細胞傷害性Ｔリンパ
球（ＣＴＬ）またはＣＤ４⁺ヘルパーＴリンパ球を活性化し得る任意の細胞であ
る。

【００１８】「樹状細胞前駆体」、すなわち「ＤＣＰ」は、適切な条件下でＤＣへと成熟し
得る末梢血細胞である。ＤＣＰは代表的に、非樹状形態を有し、そして抗原提示
細胞として一次免疫応答を誘発する能力を有さない。

【００１９】「樹状細胞」、すなわち「ＤＣ」は、成熟したＤＣＰであり、これは代表的に
、樹状細胞形態を有し、つまり、それらはインビトロで培養される場合、樹状突
起を広げる大きなベール細胞である。Ａｇまたはペプチドがパルス刺激された場
合、このようなＤＣは、未処理（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞にＡｇを提示可能である。

【００２０】本明細書中で使用される場合、用語「改変された抗原提示細胞」（改変された
ＡＰＣ）とは、ＡＰＣの集団が、改変されていないＡＰＣと比較して増強された
、ＭＨＣクラスＩに関連する抗原を提示する能力を有するようにエキソビボで処
理されたＡＰＣの集団をいう。

【００２１】同様に、本明細書中で使用される場合、用語「改変された樹状細胞」（改変さ
れたＤＣ）とは、ＤＣの集団が、改変されていないＤＣと比較して増強された、
ＭＨＣクラスＩに関連する抗原を提示する能力を有するようにエキソビボで処理
されたＤＣの集団をいう。

【００２２】可溶性タンパク質抗原の提示に関して本明細書中で使用される場合、用語「さ
らに効果的に」は、ＡＰＣによる可溶性タンパク質抗原の提示後の、検出可能な
Ｔ細胞応答の大きさにおける、少なくとも５倍の増加を意味する。例えば、１つ
の場合において、これは、基準の細胞集団由来の同じ数のＡＰＣが、同じ培養条
件下で同じ抗原を提示する場合に得られる検出可能な応答細胞の数と比較して、
指定された数のＡＰＣによる所定の抗原の提示後に、応答細胞の数における少な
くとも５倍の増加が検出されることを意味する。別の場合において、これは、異
なる抗原または改変された抗原が、同じ培養条件下でかつ等モル濃度のＡｇ濃度
において、同じ数のＡＰＣにより提示される場合に得られるＴ細胞応答の大きさ
と比較して、指定された数のＡＰＣによる所定の抗原の提示後に、Ｔ細胞応答の
大きさにおける少なくとも５倍の増加が検出されることを意味する。

【００２３】本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍」および「癌」は、交換可能に使用
され、そして増殖制御の欠如を表し、そして細胞の異常に大きなクローンを形成
する細胞をいう。腫瘍細胞または癌細胞は、一般に、接触阻害を失っており、そ
して侵襲性であり得、そして／または転移する能力を有し得る。

【００２４】（ＩＩ．可溶性タンパク質抗原に対する免疫応答）実験系において、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、腫瘍の
除去のためのもっとも強力な免疫学的メカニズムである。ＣＴＬは、ワクチンを
用いてインビボで誘導され得るか、またはインビトロで生成され、次いで、腫瘍
保持（ｂｅａｒｉｎｇ）生物に再注入され得るかのいずれかであり得る。ＣＴＬ
のインビボでの誘導は、代表的に、生ウイルスまたは生細胞を用いて免疫するこ
とにより、達成される（Ｔａｎａｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９１）
、１４７、３６４６−５２、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９５）
、４６８５−４６９２）。

【００２５】数個の特別なウイルスタンパク質（例えば、ＳＶ−４０ラージＴ抗原およびＢ
型肝炎表面抗原）を除いて、単離されたタンパク質または可溶性タンパク質の注
入は、ＣＴＬの誘導を生じない（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．、（１９９３）、２３、１５２８−３４）。ＣＴＬは、タンパク質が
、抗原プロセシングの主要組織適合性複合体クラスＩ（「ＭＨＣＩ」または「
クラスＩ」）経路に入る場合に誘導される。この経路に入るために、タンパク質
は抗原提示細胞（ＡＰＣ）のサイトゾルに存在しなければならない。そこでは、
そのタンパク質は、ペプチドへと分解され、次いでこれは小胞体に輸送され、そ
こでそのペプチドはＨＬＡクラスＩ分子と会合する。次いで、これらのペプチド
は、細胞表面上にクラスＩ分子と共に提示され、そしてクラスＩ拘束抗原特異的
ＣＴＬのインデューサーおよび標的として役立ち得る。生理学的に、ＡＰＣによ
り内因的に合成されたタンパク質のみ、この経路に入る。

【００２６】免疫応答のプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）は拡大し、そして「未処理」リン
パ球、すなわち、以前には免疫原に会っていないリンパ球を活性化して、活発に
応答する「エフェクター」細胞にならせる。各々の未処理細胞は、唯一つの抗原
エピトープと会う能力を有する（鍵が錠に合うのと類似の状況）。それらの同族
のエピトープを認識する細胞のみが、エフェクター細胞になる。

【００２７】Ｔ細胞は、「ヘルパー」型または「細胞傷害性」（細胞傷害性）型であり得る
。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞の活性化および機能を刺激する、リン
パ系細胞についての増殖因子を分泌する。細胞傷害性Ｔ細胞は、特定の抗原を発
現する細胞を認識し、そして直接的または間接的のいずれかで、この細胞を殺傷
する。Ｂ細胞のように、各Ｔ細胞は、唯一の抗原エピトープについて特異的なレ
セプターを有する。Ｔ細胞レセプターは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によ
り細胞表面上に提示されるタンパク質フラグメントを認識する。

【００２８】２つの異なる型のＭＨＣタンパク質（クラスＩおよびクラスＩＩ）があり、こ
れらの両方は、タンパク分解性的に分解されたタンパク質のフラグメントをＴ細
胞に対して提示する。身体のほとんどの細胞上で発現されるクラスＩ分子は、内
因的に合成されたタンパク質のフラグメントを細胞傷害性Ｔ細胞に提示する。特
殊化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞
およびＢ細胞）上に発現されるクラスＩＩ分子は、タンパク質フラグメントをＴ
ヘルパー細胞に提示する（Ｃｈｅｎ，ＣＨおよびＷｕ，ＴＣ、ＪＢｉｏｍｅｄ
Ｓｃｉ．、５（４）：２３１−５２１９９８）。

【００２９】ほとんどの場合において、クラスＩ分子は、細胞中で合成された外来タンパク
質を提示する。クラスＩＩによる提示について、外来タンパク質は、細胞中にお
いて合成され得るか、または外側から細胞によって取り込まれ得るかのいずれか
である（すなわち、遊離タンパク質または遊離ペプチドの形態で提示される）。
抗原が細胞中で合成され、そしてクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方によ
って提示される場合、抗体産生Ｂ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方が、産生さ
れる。しかし、抗原が細胞の外側で生じ、そしてクラスＩＩによってのみ発現さ
れる場合、特異的な免疫応答は、大体、Ｔヘルパー細胞および抗原産生に限定さ
れる［ＴＨＥＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＦＵＴＵＲＥＯＦＤＮＡＦＯＲ
ＩＭＭＵＮＩＺＡＴＩＯＮ、ＡｍｅｒｉｃａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１−２９、１９９７］。

【００３０】従って、可溶性タンパク質抗原に対する代表的な応答は、クラスＩＩ媒介応答
である。本発明は、可溶性タンパク質抗原が、外来細胞抗原のために代表的に備
えられたクラスＩ経路に入ることを可能にする組成物および方法を示す。

【００３１】さらに、抗原刺激Ｔ細胞のいくつかの子孫は、エフェクターへと発達しないが
、さらなる抗原チャレンジのない長い期間の間にわたって生存可能である記憶細
胞になる。このような記憶細胞は休止しており、そしてそれらは抗原によって刺
激されているにもかかわらず、エフェクター分子を産生しない（例えば、Ａｂｂ
ａｓ，ＡＫら編、ＣＥＬＬＵＬＡＲＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＩＭＭＵＮ
ＯＬＯＧＹ、Ｗ．Ｂ．ＳａｕｎｄｅｒｓＣｏ．、１１６−１２３頁；１３０−
１３４頁、１９９７を参照のこと）。

【００３２】未処理Ｔ細胞（すなわち、所定の抗原に以前に曝露されていないＴ細胞）は、
生存するために正確なＭＨＣＩ拘束分子のみを必要とするが、しかし増殖する
ためには、それらはまた抗原に曝露されなければならない。対照的に、記憶Ｔ細
胞は、未処理Ｔ細胞の応答よりも迅速でかつ強い２次応答を容易にする、より低
い機能活性化閾値を有する。

【００３３】（ＩＩＩ．改変された可溶性タンパク質抗原組成物）本発明は、ｐＫ（配列番号１）およびｐＥＡ（配列番号２）として提示される
ペプチド配列のようなペプチド配列が、共有結合的に抗原に連結される場合、そ
の抗原は、インビボで未処理ＣＴＬ応答を誘発することを可能にし、そして対応
するクラスＩ拘束記憶Ｔ細胞をインビトロで刺激することにおいて、約１００倍
効率が高いという知見に基づく。

【００３４】付加されたペプチド配列は、一般に、約２０〜２５個のアミノ酸残基を有する
ペプチドを含む。１つの好ましい実施形態において、ペプチド配列は、リジン残
基およびアルギニン残基の組み合わせ（配列番号７）を含む。いくつかの場合に
おいて、この配列は、化学的連結の目的のために、付加されたＮ末端システイン
残基（配列番号６）を有する。

【００３５】別の好ましい実施形態において、ペプチド配列は、１つのサブユニットあたり
約６個のアミノ酸を有する反復（ｒｅｐｅａｔｉｎｇ）サブユニットを含み、こ
こで所定の配列は、３以上のこのようなサブユニットを有し、そして付加された
Ｎ末端システインを有しても、または有さなくてもよい。例示的なペプチドは、
ＣＹＳ−［Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｙ］_n（ここで、Ｘ＝ｇｌｕまたはａｓｐ、Ｙ
＝ａｌａ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｐｈｅ、ｇｌｙ、ｃｙｓ、ｍｅｔまたはｖａｌ、そ
してｎは、３以上である（指定された配列８））として提示され、特定の例は配
列番号２として提示されるｐＥＡペプチドにより提供される。

【００３６】改変された可溶性タンパク質抗原は、１つ以上のペプチド配列と化学的に連結
され得るか、または配列番号４および配列番号５により例示されるような、１つ
以上の上記ペプチド配列を含む連続した核酸コード配列の発現により形成され得
る。

【００３７】このようなペプチド配列は、１つ以上の他のペプチド配列と化学的に連結され
る場合、この配列は、Ｎ末端システインを有してもまたは有さなくてもよい。

【００３８】別の好ましい実施形態において、本発明は、インビボでの投与のための抗原組
成物を提供し、この組成物は、ｐＫ、ｐＥＡ、ＨＡ、タンデムｐＥＡ／ｐＫ、タ
ンデムＨＡ／ｐＫペプチドからなる群から選択されたペプチド、リジン残基およ
びアルギニン残基を含むペプチド、ならびにそれぞれ配列番号１、配列番号２、
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８お
よび配列番号９と指定された配列（表１）として提示される反復サブユニットを
含むペプチドと共有結合的に結合体化される１つ以上の可溶性タンパク質抗原を
含む。

【００３９】さらに好ましい実施形態において、１つ以上の可溶性タンパク質抗原は、結合
体がクラスＩＭＨＣ提示経路に入り、結果的に抗原特異的にＣＤ８⁺ＣＴＬを
刺激するように、ｐＫペプチド（配列番号１）およびｐＥＡペプチド（配列番号
２）と、共有結合的に結合体化される。

【００４０】付加されたペプチド配列を有する、改変された可溶性タンパク質抗原はまた、
当業者に公知で、さらに以下に記載されるような方法に従って、融合タンパク質
として組換え的に形成され得る。

【００４１】増強された抗原提示活性を有する例示的な組成物は、実施例１に詳述するよう
に、抗原と共有結合的に結合体化される以下の表１に、配列番号６、配列番号７
として提示される配列ならびに配列番号８および配列番号９として指定される配
列を有するペプチドを含むが、他のペプチドは、インビボにおける未処理ＣＴＬ
応答に対して同じ効果を得るため、およびインビトロでクラスＩ拘束記憶Ｔ細胞
を得るために使用され得ることが理解される。

【００４２】本発明の抗原組成物の例示的な適用は、癌患者に投与するための抗原性組成物
（すなわち、「ワクチン」）における、腫瘍細胞によって発現され、そして腫瘍
細胞から単離された抗原のｐＥＡ／ｐＫ結合体化形態の使用である。このような
抗原性組成物は、種々の腫瘍（例えば、前立腺癌および乳癌、多発性の骨髄腫な
どが挙げられるがこれらに限定されない）についての有効な免疫治療を提供し得
る。

【００４３】実施例２において示されるように、この処置は、ｐＫ（配列番号１）およびｐ
ＥＡペプチド（配列番号２）が、エキソビボで腫瘍細胞を活性化するためにＤＣ
とと共存培養された腫瘍細胞により発現され、そして単離された抗原に結合体化
され、続いて被験体に投与される場合、特に有効である。

【００４４】（ＩＶ．組換え融合タンパク質の産生）１つ以上の付加されたペプチド配列を有する改変された可溶性タンパク質抗原
はまた、当該分野で公知の方法に従って、連続的な核酸コード配列の発現によっ
て融合タンパク質として組換え産生され得る。

【００４５】そうではないと言及しない限り、本明細書において使用されるすべての用語は
、本発明の分野の当業者にとって有するのと同じ意味を有する。実施者は、当業
者によって慣用される定義および技術について、特に、以下を参照されたい：Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ（第二版）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌＦ
Ｍら（１９８９）ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ、Ｎ．Ｙ．。

【００４６】本発明は、組換え技術を用いて産生された改変された可溶性抗原融合タンパク
質を包含する。そのような融合タンパク質は、その融合タンパク質をコードする
核酸配列を含む組換えの原核生物もしくは真核生物の宿主細胞をその融合タンパ
ク質の発現を促進する条件下で培養すること、続いてその改変された可溶性抗原
融合タンパク質をその宿主細胞もしくはその細胞培養培地から回収することによ
って、産生される。

【００４７】この融合タンパク質をコードする核酸配列は、それがその宿主内で複製可能で
ありかつ生存性である限り、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクター
のいずれか１つへと挿入され得る。一般に、ＤＮＡを、慣用技術を用いて適切な
制限エンドヌクレアーゼ部位へと挿入する。そのような手順および関連するサブ
クローニング手順は、当業者の範囲内であるとみなされる。そのベクターは、以
下を含む調節配列を含み得る：例えば、非コード配列（例えば、イントロンおよ
び制御エレメント）（すなわち、プロモーターおよびターミネーターのエレメン
トまたは５’および／もしくは３’の非翻訳領域）（この制御エレメントは、適
切な宿主および／またはその改変された可溶性タンパク質抗原コード配列が通常
発現されていないベクターもしくは宿主環境におけるそのコード配列の発現に有
効で、かつ、そのコード配列に作動可能に連結されている）。多数の適切なベク
ターおよびプロモーターは、当業者に公知であり、市販されており、そしてＳａ
ｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されている。

【００４８】本発明はまた、組換え技術によって本発明の改変された可溶性抗原融合タンパ
ク質を生成するに有用なベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞に関する。
宿主細胞は、適切なベクター（これは、例えば、クローニングベクターもしくは
発現ベクターであり得る）を用いて、遺伝子操作される（すなわち、形質導入、
形質転換またはトランスフェクトされる）。そのベクターは、プラスミド、ウイ
ルス粒子、ファージなどの形態を採り得る。その培養条件（例えば、温度、ｐＨ
など）は、発現のために選択された宿主細胞について以前に使用された条件であ
り、そしてそれは、当業者に明白である。

【００４９】異種タンパク質の発現のために細胞に核酸を導入する方法もまた、当業者に公
知であり、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘ
ｔｒａｎ媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、核内微量注入、
インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン（例えば、
ポリブレン、ポリオルニチン）の使用などが使用され得る。哺乳動物細胞を包含
する形質転換の一般的な局面は、米国特許第４，３９９，２１６号、およびＫｅ
ｏｗｎら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７−５
３７（１９９０）に記載されている。

【００５０】本明細書におけるベクター中でＤＮＡをクローニングまたは発現するために適
切な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物の細胞を包含する。適切な
原核生物としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：真正細菌（例え
ば、グラム陰性生物またはグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））。

【００５１】グリコシル化された可溶性抗原融合タンパク質の発現のために適切な宿主細胞
は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（例えば、
ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）、ならびに
植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャイニーズ
ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。適切な宿主細胞
の選択は、当該分野の技術範囲内であるとみなされる。

【００５２】そのような可溶性抗原融合タンパク質を産生するためのプロセスは、宿主細胞
をその融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程、およびその融合タ
ンパク質をその細胞培養物から回収する工程を包含する。一般に、細胞培養の生
産性を最大化するための原理、プロトコルおよび実際の技術は、以下に見出され
得る：ＭＡＭＭＡＬＩＡＮＣＥＬＬＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＡＰＲ
ＡＣＴＩＣＡＬＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編（ＩＲＬＰｒｅｓｓ
、１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出。より詳細には、バキュロウイル
ス系における発現のための技術は、以下に記載されている：Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ
ＥＫらＰｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７，
１９９４。

【００５３】本発明の可溶性抗原融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いて形
質転換された宿主細胞は、細胞培養物からのコードされたタンパク質の発現およ
び回収に適切な条件下で培養され得る。組換え細胞によって産生されたタンパク
質は、使用される配列および／またはベクターに依存して、分泌され得、膜結合
され得、または細胞内に含まれ得る。

【００５４】当業者に理解されるように、本発明の改変された可溶性タンパク質抗原をコー
ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞
膜を通じたそのような改変された抗原の分泌を指向するシグナル配列を用いて設
計され得る。

【００５５】本発明の改変された可溶性タンパク質抗原は、化学的カップリングによって産
生されるのであれ、連続したコード配列の発現によって組換え融合タンパク質と
して産生されるのであれ、ＡＰＣをパルス刺激するために使用され得、またはＭ
ＨＣＩに関連してそのようなＡＰＣによって提示され得る。

【００５６】（Ｖ．抗原提示細胞）（Ａ．ＤＣの富化）例示される方法は、ＤＣの富化を達成する組織培養プラスチックへの細胞接着
を包含するが、他のアプローチを使用して、そのような細胞画分を入手し得るこ
とも理解される。例えば、組み合わされた密度勾配遠心分離およびアフィニティ
ー細胞分離が使用され得る。

【００５７】ＤＣは、例えば、多工程密度勾配ベースの単離、モノクローナル抗体パニング
、系統陽性細胞の涸渇、および血清補充培養物を取り込んだ、種々の方法論を使
用して単離および精製されている（Ｍａｃａｔｏｎｉａ、Ｓ．Ｅ．ら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ７４：３９９−４０６、１９９１；Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ、Ｓ．お
よびＥｎｇｌｅｍａｎ、Ｅ．Ｇ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９５５
−９６１，１９９０；Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．およびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｒ．Ｍ．
、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１６７−１８２，１９８７）。

【００５８】１つの例示的な方法において、ＤＣを、以下の工程を行うことによって、末梢
血から得る：（１）標準的な白血球搬出法；（２）１工程または連続的な２工程
のいずれかの手順を用いた浮遊密度遠心分離；および（３）外的に添加されたサ
イトカインの非存在下で、４０時間に亙って無血清培地における細胞のエキソビ
ボでの培養。所望の場合、ＤＣは、さらに、以下によってさらに富化され得る：
（４）浮遊密度遠心分離による培養後富化；ならびに（５）ＣＤ１４およびＣＤ
１９免疫磁性ビーズを用いた単球／マクロファージおよびＢリンパ球の枯渇（例
えば、共有に係り、同時係属中のＵＳＳＮ６０／０８７，７６４号を参照のこと
）。

【００５９】そのように単離されたＤＣを、その樹状形態によって、ならびにＨＬＡ−ＤＲ
（ヒト白血球抗原、ＤＲ）の表面発現について陽性、および特定の細胞系統に特
異的な表面抗原（すなわち、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０
およびＣＤ５６の陰性；本明細書において、「ｌｉｎ−」と称する）についての
陰性である表現型、ならびにヒトリンパ球とともに共存培養される場合に一次お
よび二次の免疫応答を惹起する能力によって、特徴付ける。（例えば、共有に係
り、同時係属中のＵＳＳＮ６０／１５８，６１８を参照のこと）。

【００６０】（Ｂ．抗原提示の評価）抗原提示アッセイを用いて、ＡＰＣ（またはＤＣ）の抗原提示能力を評価し、
そして種々の抗原の提示を評価する。例示的なアッセイは、実施例１に記載され
ている。そこでは、ＡＰＣ（ＥＬ４細胞によって例示される）が抗原を用いて、
続いて、応答細胞（Ｂ３Ｚ細胞によって例示される）へのＡＰＣによる抗原提示
によってパルス刺激される。ここで、応答増殖の評価は³Ｈの取り込みによる。
本明細書において記載されるアッセイ形式を用いて、ＡＰＣの滴定またはそれら
を活性化するための種々の処置に供された固定数のＡＰＣの添加をともに用いた
パルス刺激工程において固定量の抗原を用いて、ＡＰＣの抗原提示能力を評価し
得る。あるいは、このアッセイ形式を用いて、固定数のＡＰＣをともに用いた抗
原の滴定を用いることによって種々の抗原が提示される能力を評価し得る。各々
の場合、終点は、³Ｈ取り込みによって示される応答細胞の対応する増殖の尺度
である。

【００６１】実施例１に記載されるように、ＥＬ−４ＡＰＣを、非刺激（すなわち、最適
未満）の用量のネイティブＯＶＡに等価な濃度でＯＶＡ抗原に連結された、ｐＫ
ペプチド（配列番号１）およびｐＥＡペプチド（配列番号２）、またはｐＫペプ
チド（配列番号１）およびＨＡペプチド（配列番号３）を含む結合体を用いてパ
ルス刺激した場合、両方の結合体は、陽性の応答を誘発した。この２つのうちで
は、ＯＶＡ−ｐＫ／ｐＥＡ結合体がより強力であった。

【００６２】ＥＬ−４ＡＰＣを、広い範囲の抗原濃度で予備パルス刺激した場合、ＯＶＡ
のｐＥＡ／ｐＫ結合体が、抗原提示を刺激することにおいて、結合されていない
ＯＶＡよりも、約１００倍効率が高いことが観察された。（図２Ａ−Ｃを参照の
こと）。

【００６３】ＡＰＣの強力なサブセットであるＤＣの特徴は、抗原を用いてパルス刺激した
後の、未処理のＣＤ８⁺細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のインビボ応答を誘発
する能力である（Ｒｉｄｇｅら１９９８Ｎａｔｕｒｅ３９３：４７４）。
本明細書において例示するように、ＤＣは、その抗原がｐＥＡ／ｐＫとの結合体
化によって改変されるときに可溶性タンパク質抗原に以前に曝露されていない哺
乳動物においてＣＴＬ応答を誘導し得るが、その抗原の改変されていない形態を
用いてそのＤＣをパルス刺激したときにはそうではない。

【００６４】ｐＫペプチド（配列番号１）およびｐＥＡペプチド（配列番号２）への結合体
化によって改変されたＯＶＡ抗原の優れた免疫原性は、ＣＤ８⁺媒介性免疫応答
の刺激によって決定されるように、さらに、実施例２に詳述される。この実施例
は、ＯＶＡ単独を用いて予備パルス刺激したＤＣへの応答に比較して、注射前の
ｐＥＡ／ｐＫ結合体化したＯＶＡを用いて予備パルス刺激したＤＣが注射された
場合に、ＯＶＡ発現腫瘍細胞を有するマウスの増加した生存を記載する（図６Ａ
およびＢを参照のこと）。

【００６５】多数の方法のいずれかを使用して、抗原を用いてＡＰＣをパルス刺激して、Ｍ
ＨＣＩに関連して抗原を提示するに有効であるようにＡＰＣをさせ得ることが理
解される。本明細書において詳述される実験は、改変された抗原ペプチドに対す
る曝露によるＤＣの活性化によって、「内在性」クラスＩ経路によるそのペプチ
ドのプロセシングが容易になり、その結果、それらのペプチドは、ＭＨＣクラス
Ｉ分子と会合して提示され、そして従って、ＣＤ８⁺ ＣＴＬを活性化し得るこ
とを実証する。

【００６６】（ＶＩ．免疫治療および癌治療のための組成物および方法）本発明の抗原性組成物の有用な特徴の一つは、ＣＤ８⁺ＣＴＬ媒介性およびＣ
Ｄ４⁺媒介性の両方のＴｈ細胞増殖応答の誘導についての抗原を、そのように改
変されていないＡＰＣよりも、より有効に提示し得ることである。

【００６７】それ自体、本発明の抗原性組成物は、普遍的に有用であり、そして広汎な免疫
治療法、免疫予防法および癌治療適用（これは、一次免疫応答および二次免疫応
答の生成を包含する）において使用され得る。

【００６８】本発明はまた、ＭＨＣクラスＩに関連して提示される改変された可溶性タンパ
ク質抗原を提供する。

【００６９】好ましい実施形態において、本発明の改変された可溶性タンパク質抗原での免
疫は、改変されていない形態で提供される場合には細胞性免疫応答を惹起しない
可溶性タンパク質抗原に対するＭＨＣクラスＩ媒介性細胞免疫応答を生じる。さ
らなる好ましい実施形態において、そのような改変された可溶性タンパク質抗原
での免疫化は、ＭＨＣクラスＩ媒介性細胞免疫応答を生じ、これは、改変されて
いない形態で提供される場合の同じ抗原に対する細胞性免疫応答よりも大きさが
大きく、従ってより高い保護を提供する。

【００７０】好ましい実施形態において、本発明は、抗原性組成物を提供する。この組成物
は、上記のように改変された抗原およびＡＰＣを含み、そしてこれは、そのよう
に改変されていない抗原を含む抗原性組成物よりも、より有効にＴ細胞応答を惹
起し得る。

【００７１】改変された抗原およびＡＰＣの組合せを含む抗原性組成物は、新規の抗原性組
成物を生じ、これは、哺乳動物の免疫治療において有用性を見出し、そしてワク
チンとして機能し得る。

【００７２】関連する局面において、本発明は、抗原（例えば、公知の癌または病原体に特
異的な抗原もしくは免疫原）に対して被験体を免疫する方法を包含する。本発明
の方法は、ＡＰＣまたはＤＣを、選択された抗原または免疫原を用いてパルス刺
激する工程であって、その抗原または免疫原は、ＡＰＣまたはＤＣをその改変さ
れた抗原に対して、その抗原または免疫原に特異的な１つ以上のペプチド抗原の
細胞表面提示を誘導するに有効な様式で曝露することによって、付加されたペプ
チド配列を有する（これは、ＡＰＣまたはＤＣへの抗原または免疫原の侵入を容
易にする）、工程、ならびにそのパルス刺激されたＡＰＣまたはＤＣをその被験
体へと戻す工程を包含する。

【００７３】その曝露工程は、インビトロ（エキソビボ）またはインビボのいずれかで達成
され得る。例えば、その改変された抗原は、被験体へと直接注射され得るか、あ
るいは、被験体のＡＰＣまたはＤＣがその改変された抗原にインビトロ（エキソ
ビボ）曝露され得、ここで、その刺激されたＡＰＣまたはＤＣはその被験体へと
戻され得る。

【００７４】さらなる好ましい実施形態において、抗原性組成物におけるその改変された可
溶性タンパク質抗原は、癌特異的抗原または腫瘍抗原である。当業者に公知の例
示的な癌特異的抗原または腫瘍抗原としては以下が挙げられるがそれらに限定さ
れない：ＰＡＰ、ＨＥＲ２、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥおよびＧＡＧＥ
。

【００７５】関連する局面において、この癌特異的抗原または腫瘍抗原は、ｐＫ、ｐＥＡ、
ＨＡ、タンデムｐＥＡ／ｐＫ、タンデムＨＡ／ｐＫペプチド、リジン残基および
アルギニン残基を含むペプチド、ならびにそれぞれ配列番号１、配列番号２、配
列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、ならびに配列番
号８および配列番号９と称される配列のように提示される反復サブユニットを含
むペプチドからなる群より選択される群から選択されるペプチドに共有結合的に
結合体化されることによって改変される。

【００７６】好ましい実施形態において、その癌特異的抗原または腫瘍抗原は、ｐＫペプチ
ド（配列番号１）およびｐＥＡペプチド（配列番号２）に対して共有結合的な結
合体化によって改変される。

【００７７】単独または改変されたＡＰＣとの組合せで改変された抗原を含む、そのような
抗原性組成物は、例えば、直接インビボ投与、エキソビボ体細胞治療、インビボ
移植可能なデバイスおよびエキソビボ体外デバイスで使用され得る。

【００７８】本発明の関連する局面は、公知の、腫瘍または病原体に特異的な抗原を有する
、腫瘍または病原体に対して被験体を免疫化する方法を包含する。これは、以下
の工程を包含する：患者（被験体）からとった血液サンプルから、ＡＰＣまたは
ＤＣの集団を入手する工程、改変された、腫瘍または病原体に特異的な抗原に対
して、インビトロで、免疫応答が所望される１つ以上のペプチド抗原の細胞表面
提示を誘導するに有効な様式でこのＡＰＣまたはＤＣを曝露する工程；ならびに
その被験体にそのパルス刺激されたＡＰＣまたはＤＣを戻す工程。

【００７９】上記より、本発明は、可溶性タンパク質抗原のプロセシングが、ＭＨＣクラス
ＩＩではなく、ＭＨＣクラスＩ経路を介して生じるという独特な特徴を有する組
成物および方法を提供することが認識される。

【００８０】本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記載されているが、種々の改
変および変更が本発明を逸脱することなくなされ得ることが認識される。

【００８１】（実施例１）（ＯＶＡペプチド結合体のインビトロ提示の評価）ＩＬ−２分泌マウスＴ細胞ハイブリドーマＢ３Ｚ（これは、マウスＭＨＣクラ
スＩ（Ｈ２−Ｋ^b）に結合されたＯＶＡ由来のペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶ
Ａ_257-264；Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１５４１，１９
９３）に応答する）を用いて、胸腺腫細胞株ＥＬ−４による種々のＯＶＡペプチ
ド結合体の提示効力を評価した。

【００８２】Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した等級ＶＩ（９９％純粋）
ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）を、そのネイティブ形態または結合体化され
た形態のいずれかにおいて使用した。ペプチド結合体ＯＶＡ−ｐＥＡ、ＯＶＡ−
ｐＫ、ＯＶＡ−ＨＡ、ＯＶＡ−ＨＡ／ｐＫおよびＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫを、標準
的な方法に従って、商業的製造者（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｉｎｃ、Ｌｅｗ
ｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）によって、カスタム試薬として調製した。Ｅ．Ｇ７−Ｏ
ＶＡは、全長ＯＶＡｃＤＮＡでトランスフェクトしたＥＬ−４細胞株である（
Ｂｒｏｓｓａｒｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３２７０，１９９７）。

【００８３】手短に述べると、ペプチドＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（「ｐＫ」、配列番号１）
、Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ（「ｐＥＡ」、配
列番号２）ならびにＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（「ＨＡ
」配列番号３）を、ＳＰＡＲ５０ポリアミド樹脂においてＦｍｏｃ化学によって
合成した。ペプチドを、ＨＰＬＣで精製し、そしてスルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）を用いてＯＶ
Ａに対して結合体化させた。

【００８４】図１に示されるような実験について、細胞培養物を、３７℃で、１０％ＣＯ２
を含む加湿した雰囲気内で１０％ＦＣＳ、２９２ μｇ／ｍｌのＬ−グルタミン
、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５
５μＭの２−ＭＥ（Ｇｉｂｃｏ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補充した
ＤＭＥＭ培地中で維持した。マウス胸腺腫細胞ＥＬ−４を、２μＭの各抗原を用
いて１×１０⁶の細胞を共存培養することによって、３７℃で、示された抗原を
用いて一晩パルス刺激した。続いて、パルス刺激されたＡＰＣを洗浄し、そして
γ照射（３０Ｇｙ）し、そしてＩＬ−２分泌アッセイを以前に記載されるように
行った（Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、１９９８、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１：３．１４）。すなわち、１×１０⁵Ｂ３Ｚハイブリドーマ
細胞を、所定数のＡＰＣの存在下で０．２ｍｌのマイクロウェル中で培養した（
図１に記載されるように）。１日後、培養上清を採取し、そして２４時間にわた
って１０⁴のＨＴ−２細胞（ＩＬ−２依存性細胞株）の増殖を支持するそれらの
能力について試験した。細胞増殖を、最後の６時間培養時間の間の［³Ｈ］チミ
ジンの取り込みによって測定した。

【００８５】ＥＬ−４細胞を、非刺激性（すなわち、最適未満）の用量のネイティブＯＶＡ
と等価の濃度での抗原を用いてパルス刺激したときは、ＯＶＡでも、ＯＶＡ−ｐ
ＥＡでも、ＯＶＡ−ＨＡでもＯＶＡ−ｐＫでも、バックグラウンドを超えてＢ３
Ｚを刺激せず、ｐＫペプチド（配列番号１）およびｐＥＡペプチド（配列番号２
）に結合体化されたＯＶＡならびにｐＫペプチドおよびＨＡペプチド（配列番号
３）に対して結合体化されたＯＶＡは、陽性の応答を誘発した。この２つのうち
、ＯＶＡ−ｐＫ／ｐＥＡ結合体がより強力であった。本発明の方法および組成物
における可溶性タンパク質抗原への添加について例示的なペプチド配列に関して
は、以下の表１を参照のこと。

【００８６】図２〜５に示す実験についての組織培養物を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭＬ
−グルタミン、０．１ｍｇ／ｍｌ硫酸カナマイシンおよび３×１０^-5Ｍ２−
ＭＥ（Ｇｉｂｃｏ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補充したＩＭＤＭ培地
中に３７℃で５％ＣＯ₂を含む加湿雰囲気（組織培養インキュベータ）中で維持
した。１０⁵のハイブリドーマ細胞を、Ａｇパルス刺激された３×１０⁴のＡＰＣ
の存在下で０．２ｍｌのマイクロウェル中で培養した。１日後、培養上清を採取
し、そして２４時間にわたる１０⁴のＨＴ−２細胞の増殖を支持するそれらの能
力について５０％の濃度で試験した（最後の６時間の培養時間の間に存在する［ ³ Ｈ］チミジンの取り込みによって測定した）。

【００８７】

【表１】広汎な抗原濃度で予備パルス刺激したＥＬ−４ＡＰＣへのＢ３Ｚ応答の分析
は、ＯＶＡのｐＥＡ／ｐＫ結合体が、Ｂ２Ｚを刺激することにおいてＯＶＡ自体
よりも約１００倍効率が高いことを示す（図２Ａ〜Ｃを参照のこと）。

【００８８】上記の証拠は、クラスＩ依存性Ａｇプロセシングおよび提示の経路へのｐＥＡ
／ｐＫ結合体化したＯＶＡの浸透の改善を反映するようである。その結合体にお
いてＡｇ由来のペプチド（これは、インターナリゼーションもプロセシングも必
要としない）がＢ３Ｚ応答において観察された改善を担っていた可能性を除去す
るために、さらなる実験を行った。細胞を、上記のように培養し、そしてＥＬ−
４細胞を０．０２５％のグルタルアルデヒド（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉ
ｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＡｇパルス刺激前に固定した。ＡＰＣを、Ａｇパル
ス刺激前にグルタルアルデヒドで固定し、それによって、Ａｇのインターナリゼ
ーションおよびプロセシングを妨害した場合、固定されたＥＬ−４細胞は、免疫
原性ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを、刺激的様式でＢ３Ｚに対して提示することが
観察された。しかし、それがＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫを提示する能力は、固定の際
に完全に失われていた（図３を参照のこと）。ＳＩＩＮＦＥＫＬは、ＯＶＡ由来
のペプチド（ＯＶＡ_257-264）であり、Ｔ細胞ハイブリドーマＢ３Ｚによって認
識される。（Ｊａｍｅｓｏｎら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１５
４１）。改変されていないＯＶＡを用いてパルス刺激され、固定されたＥＬ−４
に対して残留する（約７％）Ｂ３Ｚ応答が観察された。これは、後者が９９％純
粋（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とはいえ、微量の分解産物を含み得
ることを示す。これは、ｐＥＡ／ｐＫへの結合体化の際に除去される。

【００８９】（実施例２）（ＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫ結合体のインビボ提示の評価）一般に、Ｔ細胞ハイブリドーマは、非常に活性化された記憶Ｔ細胞を表す。こ
こで、活性化閾値は、未処理のＴ細胞を誘発するに必要とされるよりも有意に低
い（Ｒｉｄｇｅら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ３９３：４７４）。非常に活性化
されたＤＣのみが、その抗原に対してそれまでに曝露されていない動物における
有効なＣＴＬ応答を誘発し得ることが見出されている。従って、本発明者らは、
ｐＫおよびｐＥＡに結合体化されたＯＶＡが有効なＣＴＬ応答を惹起し得るか否
かを試験するために、用いられたことのない（ｖｉｒｇｉｎ）実験用マウスを、
Ａｇでパルス刺激したＤＣで免疫した。

【００９０】樹状細胞を、ＯＶＡ（５μＭ）またはＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫ（０．５μＭ）の
いずれかを用いて１６時間共存培養することによってパルス刺激し、２回洗浄し
、そしてマウス中に注射した。雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、処置されないまま
であったか、または２回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射（０．１ｍｌリン酸緩衝化生
理食塩水（ＰＢＳ）中のＡｇパルス刺激された５×１０⁵の細胞）を２週間間隔
で用いて免疫したかのいずれかであった。最後のインビボ免疫の２週間後、脾細
胞を各群あたり２匹のマウスからプールし、そしてそれらを、４×１０⁶細胞／
ｍｌの密度で、γ照射した（２００Ｇｙ）Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡとともに、５×１０ ⁵ 細胞／ｍｌで、組換えヒトＩＬ−２（１０ｕ／ｍｌ；Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の存在下で共存培養することによってインビトロで再刺激
した。６日後、その培養物を、標準的な細胞媒介性細胞傷害性アッセイにおいて
、それが⁵¹Ｃｒ標識したＥ．Ｇ７−ＯＶＡ標的細胞およびＥＬ−４標的細胞を溶
解する能力について試験した（ＷｕｎｄｅｒｌｉｃｈおよびＳｈｅａｒｅｒ１
９９８、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＷｉｌｅｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ、１：３．１１）
。

【００９１】図４に示すように、ｐＥＡおよびｐＫと結合体化されたＯＶＡで以前にパルス
刺激されたＤＣでプライム刺激されたマウスのみが、ＯＶＡでトランスフェクト
された標的細胞（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ）に対して有意なＣＴＬ応答を生じた。他方
、ＯＶＡでパルス刺激されたＤＣで免疫されたマウスのそれに対応する応答は、
実質的により低かった。

【００９２】腫瘍特異的なＣＴＬは、抗腫瘍免疫応答の重要なエフェクター要素を構成する
（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、１９９１、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１）。
従って、ＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫでパルス刺激されたＤＣでの免疫の、ＯＶＡ発現
自己腫瘍のインビボ増殖の抑制に対する効果を評価した。

【００９３】２８週齢の無作為化した雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍｌのＰＢＳ中
のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を各々腹腔内注射した（図５Ａ：２５×１０⁶細胞／マ
ウス；図５Ｂ：２×１０⁶細胞／マウス）。２日後および再び２週間後、そのマ
ウスに、パルス刺激されていないＤＣ、ＯＶＡパルス刺激したＤＣ、ＯＶＡ−ｐ
ＥＡ／ｐＫでパルス刺激したＤＣ（０．１ｍｌ注射あたり５×１０⁵細胞）また
はＰＢＳのいずれかの腹腔内注射を受けさせた。マウスを毎日モニターし、そし
てその生存を記録した。

【００９４】図５に示すように、ｐＫおよびｐＥＡと結合体化したＯＶＡを用いてパルス刺
激したＤＣでの処置は、顕著な治療効果を示し、腫瘍を有するマウスの生存をか
なり延長した（ステューデントのｔ検定に従った統計学的有意性：ｐ＜０．０１
）。

【００９５】本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記載されてきたが、種々の改
変および変更が本発明を逸脱することなく、なされ得ることが理解される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、同系のＡＰＣ株ＥＬ−４により提示される、インターロイキン−２（
ＩＬ−２）を分泌するマウスＴ細胞ハイブリドーマＢ３Ｚ（Ｊａｍｅｓｏｎら、
１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１５４１）の、オボアルブミン（ＯＶ
Ａ）の種々の形態への応答を示す。Ｃｐｍとは、１分あたりの回数をいう；ＨＡ
とは、インフルエンザウイルス血球凝集素由来ペプチドをいい、ＯＶＡとは、ネ
イティブなオボアルブミンをいい；ＯＶＡ−ＨＡとは、ＯＶＡのＨＡ結合体化形
態をいい；ＯＶＡ−ｐＥＡは、ＯＶＡのｐＥＡ結合体化形態をいい；ＯＶＡ−ｐ
Ｋとは、ＯＶＡのｐＫ結合体化形態をいい；ＯＶＡ−ＨＡ／ｐＫとは、ＯＶＡの
ＨＡおよびｐＫ結合体化形態をいい；そしてＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫとは、ＯＶＡ
のｐＥＡおよびｐＫ結合体化形態をいう。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡは、全長ＯＶＡｃ
ＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＥＬ−４細胞株である（Ｂｒｏｓｓａｒ
ｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３２７０、１９９７）。

【図２Ａ】図２Ａ〜Ｃは、異なるＡｇ濃度でＯＶＡ調製物またはＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫ調
製物が事前にパルス刺激されたＥＬ−４ＡＰＣへのＢ３ＺＴ細胞ハイブリド
ーマの応答を示す。図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃの各々は、独立した実験を表す
。各々の場合において、ｃｐｍは、最終の６時間の培養期間の間に存在する［³
Ｈ］チミジンの取り込みによって測定される細胞増殖を表す。「ＥＬ−４」株お
よび「Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ」株は、さらなる可溶性Ａｇの不在下で、それぞれ陰性
コントロールＡＰＣおよび陽性コントロールＡＰＣに対するＢ３Ｚ応答のレベル
を示す。

【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｃは、異なるＡｇ濃度でＯＶＡ調製物またはＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫ調
製物が事前にパルス刺激されたＥＬ−４ＡＰＣへのＢ３ＺＴ細胞ハイブリド
ーマの応答を示す。図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃの各々は、独立した実験を表す
。各々の場合において、ｃｐｍは、最終の６時間の培養期間の間に存在する［³
Ｈ］チミジンの取り込みによって測定される細胞増殖を表す。「ＥＬ−４」株お
よび「Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ」株は、さらなる可溶性Ａｇの不在下で、それぞれ陰性
コントロールＡＰＣおよび陽性コントロールＡＰＣに対するＢ３Ｚ応答のレベル
を示す。

【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｃは、異なるＡｇ濃度でＯＶＡ調製物またはＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫ調
製物が事前にパルス刺激されたＥＬ−４ＡＰＣへのＢ３ＺＴ細胞ハイブリド
ーマの応答を示す。図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃの各々は、独立した実験を表す
。各々の場合において、ｃｐｍは、最終の６時間の培養期間の間に存在する［³
Ｈ］チミジンの取り込みによって測定される細胞増殖を表す。「ＥＬ−４」株お
よび「Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ」株は、さらなる可溶性Ａｇの不在下で、それぞれ陰性
コントロールＡＰＣおよび陽性コントロールＡＰＣに対するＢ３Ｚ応答のレベル
を示す。

【図３】図３は、それぞれの最適な濃度で、ＳＩＩＮＦＥＫＬ、またはＯＶＡまたはＯ
ＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫが事前にパルス刺激されたＡＰＣへのＢ３ＺＴ細胞ハイブ
リドーマの応答を示す。ｃｐｍは、図２Ａ〜Ｃについて、上記に記載されるよう
な細胞増殖に対応する。

【図４】図４は、Ａｇをパルス刺激されたＤＣによって事前に免疫化されたマウスのク
ラスＩ拘束ＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答を示す。この富化されたＤＣは、調製され、
ＯＶＡ（５μＭ）またはＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫ（０．５μＭ）のいずれかがパル
ス刺激され、そして実施例２に記載されるようにマウスに注入された。６日後、
その培養は、標準的な細胞媒介細胞傷害アッセイにおいて、⁵¹Ｃｒ標識Ｅ．Ｇ７
−ＯＶＡおよびＥＬ−４標的細胞を溶解する能力について試験した。

【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂは、Ａｇパルス刺激（Ａｇ−ｐｕｌｓｅｄ）ＡＰＣにより処置され
たＥ．Ｇ７−ＯＶＡ注入マウスの生存を示す。２８週齢の無作為化された雌Ｃ５
７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍｌのＰＢＳ中の２５×１０⁶および２×１０⁶のＥ
．Ｇ７−ＯＶＡ細胞が腹腔内に注入された（それぞれ、図５Ａおよび図５Ｂ）。
２日後およびさらに２週間後（矢印）、マウスは、ＤＣ、ＯＶＡパルス刺激ＤＣ
、ＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫパルス刺激ＤＣ（０．１ｍｌの注入あたり５×１０⁵細
胞）、またはＰＢＳの腹腔内への注入を受けた。マウスは、毎日モニターされ、
そしてそれらの生存が、示されているように記録された。

【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｂは、Ａｇパルス刺激（Ａｇ−ｐｕｌｓｅｄ）ＡＰＣにより処置され
たＥ．Ｇ７−ＯＶＡ注入マウスの生存を示す。２８週齢の無作為化された雌Ｃ５
７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍｌのＰＢＳ中の２５×１０⁶および２×１０⁶のＥ
．Ｇ７−ＯＶＡ細胞が腹腔内に注入された（それぞれ、図５Ａおよび図５Ｂ）。
２日後およびさらに２週間後（矢印）、マウスは、ＤＣ、ＯＶＡパルス刺激ＤＣ
、ＯＶＡ−ｐＥＡ／ｐＫパルス刺激ＤＣ（０．１ｍｌの注入あたり５×１０⁵細
胞）、またはＰＢＳの腹腔内への注入を受けた。マウスは、毎日モニターされ、
そしてそれらの生存が、示されているように記録された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者バイドビック，ダミアーアメリカ合衆国カリフォルニア 94043，マウンテンビュー，パルマーアベニュー 155 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA45 4C085 AA02 BB11 EE01 4C087 AA01 BB37 BB64 NA14 ZB26 4H045 AA11 AA30 BA41 CA40 DA86 EA28 EA31 EA51 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】主要組織適合性複合体のクラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ）に
関連して、増強された細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発することが可能な抗原組成物
であって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）への該抗原の進入を容易にする付加されたペ
プチド配列を有する抗原を含む、抗原組成物。
【請求項２】前記付加されたペプチド配列が、配列番号１、配列番号２、
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群
から選択された１つ以上の配列を含む、請求項１に記載の抗原組成物。
【請求項３】前記付加されたペプチド配列が、Ｘ＝ｇｌｕもしくはａｓｐ
、Ｙ＝ａｌａ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｐｈｅ、ｇｌｙ、ｃｙｓ、ｍｅｔもしくはｖａ
ｌ、そしてｎは３以上であるＣＹＳ−［Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｙ］_n、またはＸ
＝ｇｌｕもしくはａｓｐ、Ｙ＝ａｌａ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｐｈｅ、ｇｌｙ、ｃｙ
ｓ、ｍｅｔ、もしくはｖａｌ、そしてｎは３以上である［Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−
Ｙ］_nとして示される配列を含む、請求項１に記載の抗原組成物。
【請求項４】前記抗原が、可溶性タンパク質抗原である、請求項２に記載
の抗原組成物。
【請求項５】腫瘍または病原体に対して、被験体を免疫することにおいて
使用するための請求項４に記載の抗原組成物であって、ここで該組成物は、該腫
瘍または該病原体に対して特異的である、抗原組成物。
【請求項６】前記１つ以上の付加されたペプチド配列が、前記抗原に共有
結合的に連結される、請求項２に記載の抗原組成物。
【請求項７】前記抗原が、連続したヌクレオチドコード配列の翻訳によっ
て産生される融合タンパク質である、請求項２に記載の抗原組成物。
【請求項８】請求項１に記載の改変された抗原へのインビトロにおける曝
露により刺激された、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む組成物であって、ここで該刺激されたＡＰＣは、Ｔ細胞を活性化して、該抗原単独により刺激さ
れるそのようなＡＰＣにより産生されるＴ細胞活性化レベルより高いＴ細胞活性
化レベルで該抗原に対する細胞傷害性細胞免疫応答を産生するために有効である
、組成物。
【請求項９】前記付加されたペプチド配列が、配列番号１、配列番号２、
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群
から選択される１つ以上の配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】前記付加されたペプチド配列が、Ｘ＝ｇｌｕもしくはａｓ
ｐ、Ｙ＝ａｌａ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｐｈｅ、ｇｌｙ、ｃｙｓ、ｍｅｔ、もしくは
ｖａｌ、そしてｎは３以上であるＣＹＳ−［Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｙ］_n、また
はＸ＝ｇｌｕもしくはａｓｐ、Ｙ＝ａｌａ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｐｈｅ、ｇｌｙ、
ｃｙｓ、ｍｅｔ、もしくはｖａｌ、そしてｎは３以上である［Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−
Ｙ−Ｙ］_nとして示される配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】前記抗原が、可溶性タンパク質抗原である、請求項８に記
載の組成物。
【請求項１２】腫瘍または病原体に対して、被験体を免疫することにおい
て使用するための請求項８に記載の組成物であって、ここで該抗原は、該腫瘍ま
たは該病原体に対して特異的である、組成物。
【請求項１３】前記１つ以上の付加されたペプチド配列が、前記抗原に共
有結合的に連結される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１４】前記抗原が、連続したヌクレオチドコード配列の翻訳によ
って産生される融合タンパク質である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１５】可溶性タンパク質抗原に対する免疫応答を促進するための
薬剤を調製するための細胞培養組成物の使用であって、以下：（ａ）被験体から血液サンプルを得る工程；（ｂ）該血液サンプルから単球画分を単離する工程；（ｃ）該単球画分を富化してＤＣの集団を得る工程；および（ｄ）免疫応答が所望される１つ以上のペプチド抗原の細胞表面提示を誘導す
るのに有効な様式において、該ＤＣを該抗原に曝露することにより、該抗原のＤ
Ｃへの進入を容易にする付加されたペプチド配列を有する選択された抗原を、イ
ンビトロで該ＤＣにパルス刺激する、工程、を包含する、使用。
【請求項１６】前記被験体が、癌患者であり、そして前記選択された抗原
が、癌特異的抗原または病原体特異的抗原である、請求項１５に記載の使用。