JP2002530051A

JP2002530051A - 血清フルクトース１，６−ビスホスファターゼを用いての肝細胞障害の診断方法

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Publication number: JP2002530051A
Application number: JP2000567736A
Authority: JP
Inventors: モロヴァートアリレザ; ケイトルルアンドリュー; エーマグワイアージェラルド
Original assignee: ケンブリッジライフサイエンシズパブリックリミテッドカンパニー
Priority date: 1998-08-27
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2002-09-17
Also published as: EP1105524A1; WO2000012753A1; GB2340939A; GB9818569D0; GB2340939B

Abstract

(57)【要約】この開示は、ヒト患者における肝細胞性疾患の診断方法に関し、この方法は、患者から血清試料を得て、試料をアッセイし試料中のＦＢＰアーゼ量を測定し、これを同様の患者からの既試料中のＦＢＰアーゼ量および／または健康体に求められるＦＢＰアーゼ量を有する試料中のＦＢＰアーゼ量と比較し、かつ比較に基づいて診断することを含み、かつこの方法を実施するためのキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、疾病の診断方法および特にヒト被験者における肝臓障害の診断方法
に関し、かつこの方法を実施するための試験キットに関する。

【０００２】背景技術広く用いられている「肝臓機能」の通常の試験は、アスパルテート（ＡＳＴ）
およびアラニン（ＡＬＴ）トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、ビリルビン、アルブ
ミンおよび凝固因子の血清レベルの測定を含む。前記試験は、肝臓の疾病に対し
て特異的なものではなく、かつ酵素およびビリルビンの高められた血清レベル、
ならびにアルブミンおよび凝固因子の減少した濃度は、他の状況中でも生じうる
。この理由のために、試験結果パターンは、しばしは肝細胞障害、機能の損失ま
たは胆管閉塞の検出に使用される。たとえ肝臓障害の評価が難しいものであると
されていても、これは主に通常の肝臓機能試験の乏しい感度のためである。これ
は、急性肝細胞性障害、場合によっては例えばパラセタモール中毒に引き続いて
の血清トランスアミナーゼ増加の遅延によって例証される。

【０００３】従来の研究では、急性肝細胞性障害の極めて感度の高いマーカーであるグルタ
チオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が示されている。ＧＳＴは、被肝移
植者での急性同種間移植拒絶反応の検出に関して評価されている。前記患者のう
ち、同種間移植された器官の拒絶反応の危険性は、移植後２、３週目において特
に高く（Esquivel et al. 1985）、かつ早期診断は、同種間移植に対する免疫的
損傷を制限するであろう早期指標を満たすために必要不可欠である（Trull et a
l. 1994; Rees et al. 1995; Hughes et al. 1997）。GSTは、急性発作後の血清
中でのその速い増加のために、肝細胞性障害の評価において特別な価値を有する
。また、ＧＳＴは、生体内での短い半減期を有し、その結果、成功的な処置に呼
応してその血清濃度の急激な低下を生じ（Trull et al. 1994）、拒絶反応の発
作が解消されるやいなや、潜在的に有害な免疫抑制剤を退薬することができる。
しかしながら、患者の診断および管理における臨床的利点にもかかわらず、異な
るイソホーム（isoform）の存在、ならびに血清中の低い酵素活性から、ＧＳＴ
アッセイは免疫学的方法に基づくものであり、この場合、この方法はかなり時間
を浪費し、手間がかかり、かつ高価である。前記理由のために、ＧＳＴアッセイ
は、通常の臨床生化学において依然として適所が見出されていなかった。

【０００４】急性肝臓障害の検出での、ＧＳＴの高い感度および特異性を提供しうる酵素法
の探究において、グルコキナーゼ、グルタミンシンセターゼ、カルバモイルホス
フェートシンターゼおよびピルベートキナーゼを含む多くのシトソルおよびミト
コンドリア肝臓酵素を、予備試験において、急性肝細胞性障害を有する患者から
の血清試料を用いて分析した。前記試験では、診断的使用に適しているとみなす
ための十分な感度および血清からの著しい干渉の十分な回避が証明されなかった
。

【０００５】発明者によって試験されたもう一つの酵素は、フルクトース−１．６−ビスホ
スファターゼ（EC 3.1.3.11; FBPase）である。ＦＢＰアーゼは糖新生酵素であ
り、この場合、これは主に肝臓中で見出されるが、その一方でまた腎皮質、筋肉
および膵臓中でも少ないが生じる（Mizunuma & Tashima 1990; Saez et al. 199
6）。筋肉中では、その活性によって定められた酵素の濃度は、極めて低いこと
が報告されている（Mizumura & Tashima, 1986）。肝臓中の酵素の濃度および活
性の双方は、グルコースの恒常性を作用するホルモンに影響される。したがって
、インスリンは、ラット中でのＦＢＰアーゼ遺伝子発現を減少させ（el Maghrab
i et al. 1991）、かつ培養された肝細胞中での酵素Ｋ_ｍを増加させる（Ekdahl
& Ekman 1987）。グルカゴンは、酵素のＶ_ｍａｘを増加させ（Casteleijn et al
. 1986）、かつこのホルモンおよびアドレナリンの双方は、酵素Ｋ_ｍ（Ekdahl &
Ekman 1987）上のインスリンの作用を排除する能力を有する。

【０００６】細胞下分別（subcellular fractionation）試験によって、細胞質中での細胞
下粒子構造と関連する肝細胞性ＦＢＰアーゼの大部分が明らかにされており、こ
の場合、これは、酵素が、古典的概念において可溶なものとしてみなされないこ
とが示唆されている（Saez et al. 1996）。

【０００７】肝臓中でわずかに静脈周囲優勢で、広範囲の分散を有するＧＳＴとは異なり、
ＦＢＰアーゼは、主に、肝臓の門脈周囲領域に局在している（Kress & Katz 199
3; Saez et al. 1996）。静脈周囲領域および門脈周囲領域からの酵素放出パタ
ーンは、種々の型の肝臓障害で異なっていてもよい。例えば、ハロゲン化炭化水
素での低酸素症または中毒は、静脈周囲の肝性疾患を生じるのに対して、慢性活
動性肝炎またはアリルアルコール中毒の間の典型的な断片壊死は主に門脈領域に
局在する（Thurman et al. 1986）。また、急性同種間移植拒絶反応は、しばし
ば最初に門脈周囲領域において生じはじめてもよく、この場合、ＦＢＰアーゼは
より優勢である。

【０００８】肝臓障害中の血清ＦＢＰアーゼの変化に関する知識は極めて制限されている。
前記の先駆的研究において、カルドアおよびシャボーネ（Kaldor & Schiavone）
（１９６８）およびナースおよびゴッシュ（Nath & Gosh）（１９６７）は、血
清酵素活性を測定するための粗方法を使用した。数年の後に、ホン・リッヘンベ
ルグら（von Rechenberg et al.（１９８４ｂ））は、試みにおいて、血清ＦＢ
Ｐアーゼ測定と一緒にＡＳＴおよびグルタメートデヒドロゲナーゼ測定を使用
することを提案し、慢性持続性肝炎（chronic persistent hepatitis）と慢性活
動性肝炎（chronic aggressive hepatitis）とを識別するための診断指標を導い
た。ホン・リッヘンベルグらは、指標が“健康な人々と炎症性肝臓障害を有する
患者との識別を提案しているのではなく、この課題はＡＳＴおよびＡＬＴによっ
て達成される”と強調している。ラットへの三塩化炭素の投与後の血清ＦＢＰア
ーゼ活性の増加は、モラータら（Morata et al.）（１９９０）によって記載さ
れており、その一方でジムネス−ジャチーヴァら（Jimenez-Jativa et al.）（
１９９２）は胆管結紮が血清酵素レベルを減少させることを報告している。

【０００９】発明の開示第１に、本発明はヒト患者での肝細胞性障害の診断方法を提供し、この場合、
この方法は、患者から血清試料を得て；試料をアッセイし、試料中のＦＢＰアー
ゼ量を測定し；試料中のＦＢＰアーゼ量と同患者からの既試料および／または健
康体に求められるＦＢＰアーゼ量を比較し；かつこの比較に基づいて診断を行う
ことを含む。

【００１０】本発明の方法は、慢性または急性の肝細胞性障害の診断に使用されてもよい。
本発明の方法よる診断に適しているであろう慢性肝細胞性障害を引き起こす状況
は、例えば、肝硬変、慢性活動性肝炎、閉塞性黄疸等を含む。急性肝細胞性障害
を引き起こす状況は、例えば急性ウイルス性肝炎、有害物質の摂取または投与（
特に医薬物質、例えばパラセタモールの有害な過剰投与）および肝移植の免疫拒
絶反応の発作を含む。

【００１１】当業者は、肝臓機能の通常試験および他の診断方法（例えば物理的試験）が、
臨床医によって、本発明の方法と組み合わせることで診断を達成するのに使用さ
れてもよいことを高く評価するであろう。さらに、当業者は、血清試料よりもむ
しろ患者からの血漿試料が、本発明の方法で、同等の効果で使用されてもよいこ
とを評価するであろうが、それというのも、血清は実施においてより一般的に使
用されているからである。したがって、本発明で使用される“血清”の用語は、
血漿に等しいとされる。

【００１２】試料中のＦＢＰアーゼ量を測定するための種々の方法が使用されてもよい。例
えば、免疫学的試験（例えばＥＬＩＳＡ）はＦＢＰアーゼ抗原量を測定するため
に使用されてもよい。しかしながら、より好ましくは生化学的方法が使用され（
すなわち、ＦＢＰアーゼの免疫学的特性よりもむしろ生化学的特性を信頼した方
法）、この場合、生化学的試験は、一般に免疫学的検定法よりも実施が迅速であ
り、かつ安価である。このような生化学的検定法は、試料中のＦＢＰアーゼ酵素
活性量を測定することによって、ＦＢＰアーゼの量を測定することができる。

【００１３】本発明のアッセイ方法は、酵素結合型生化学的検定法（enzyme linked bioche
mical assay mothods）（すなわち、ＦＢＰアーゼの酵素特性が一連の結合反応
工程の一つとして使用される検定法）が好ましい。好ましくはアッセイ方法は、
アッセイ結果が吸光分光分析学的に読みとることができる程度のものである（例
えば、アッセイ中の反応は、着色生成物を製造し、および／または着色物質を使
い果たしてもよく、反応混合物中での色変化を生じる）。アッセイ法は、例えば
、アッセイ結果が特定の時点（通常はアッセイ反応が平衡状態に達した時点）に
おいて読みとられるエンドポインド検定法（end-point assay）である。しかし
ながら、より好ましくは、アッセイ法は、読みとりが幾つかの時点でおこなわれ
る速度論的検定法（kinetic assay）であってもよい。このような速度論的検定
法は、反応速度の測定を可能にし、かつエンドポイント検定法よりも臨床的な実
施においてより広く使用され、この場合、これはより感度が高く、かつ情報量が
多い。ＦＢＰアーゼ活性のための適した酵素結合型生化学的試験は従来技術で開
示されており（von Rechenberg et al, 1984）、かつさらに以下の例に記載され
ている。ＦＢＰアーゼ活性を測定するための他の生化学的検定法は当業者に明ら
かであろう。

【００１４】本発明の方法が、肝臓機能に関する通常の生化学的検定法（アラニントラン
スアミナーゼ［ＡＬＴ］の血清レベル、あるいはアスパルテートトランスアミ
ナーゼ［ＡＳＴ］活性に基づく）上で幾つかの利点を提供することが見出された
。特に、肝細胞性障害の後に、血清ＦＢＰアーゼ活性が血清ＡＬＴ活性よりもよ
り急速に増加することが見出され、この場合、これは早期診断を可能にした。さ
らに、成功的な処置の後に、血清ＦＢＰアーゼレベルは血清ＡＬＴレベルよりも
急速に正常の状態に戻り、したがって、治療上の管理様式（regim）の進行は、
より接近して行われてもよい。さらに、血清ＦＢＰアーゼレベルは、血清ＡＬＴ
よりも感度の高い、急性肝細胞性障害の指標であることが見出され、したがって
、増加したＦＢＰアーゼレベルは、正常な血清ＡＬＴレベルが正常なままである
肝臓障害を有する幾らかの患者中で検出されてもよい。本発明の方法は、部分的
にＦＢＰアーゼの生体内での短い血清半減期のおかげで、急性肝細胞性障害、例
えば肝臓移植患者の免疫拒絶反応の発作の診断および監視に特に適用可能である
。

【００１５】他の診断的特徴の有無は、診断を補助するであろうが、しかしながら一般には
、それぞれが前記試料と比較してＦＢＰアーゼの増加したレベルを示す患者から
の２つまたはそれ以上の血清試料を得ることが、肝細胞性障害の指標として挙げ
られてもよい。二者択一的に、例えば患者からの早期血清試料が入手不可能であ
る場合には、ＦＢＰアーゼアッセイの結果は、健康な被験者（例えば、年齢、性
別、人種等が合致する）に求められる血清ＦＢＰアーゼ量を提供する対照例と比
較されてもよく、この場合、前記対照例の値は、一般的に肝細胞性障害の指標と
して挙げられてもよい。発明者は、ヒトの健康体の血清ＦＢＰアーゼ活性レベル
の典型的な最大値が、以下に記載された試験条件下（例えば、ｐＨ７．５等）で
、典型的には約０．６ＩＵ／Ｌ（通常、０．５８〜０．６５ＩＵ／Ｌの範囲であ
る）であるとみなしているが、それにもかかわらず、当業者は、この値を指針と
してのみ役立つものであるいうのは、臨床医が、ヒトの健康体のＦＢＰアーゼ活
性の血清レベルの典型的最大値としてみなすレベルを自由に決定することを認識
しているからであろう。特に、異なる試験条件下での検定の実施は、異なる結果
を生じ、したがって、異なる標準範囲が使用されてもよい。本開示によって、当
業者は異なるアッセイ条件のための適切な対照値を、通常の試験によって確かめ
ることが可能であろう。

【００１６】第二に、本発明はヒト患者での肝細胞性障害の診断のための診断試験キットを
提供し、この場合、このキットは患者からの血清試料中のＦＢＰアーゼ量を測定
するための試薬を含み、その際、この試薬は好ましくは使用説明書と一緒に容器
中に包装されている。

【００１７】キットのアッセイ試薬および／または他の成分は、液体の形（例えば溶液中）
で、周囲温度またはそれ以下（例えば凍結されたもの）で提供されていてもよい
。より有利には、アッセイ試薬および／または他の試験キット成分は、使用前に
再懸濁するための凍結乾燥固体として提供されていてもよい。このような実施態
様において、凍結乾燥固体は、蒸留水かまたは適切な緩衝液（好ましい場合には
キットの一部分として供給されてもよい）中で再懸濁されてもよい。

【００１８】キットと一緒に提供された使用説明書では、典型的には、本発明の第１の部分
による方法が記載されている。また、このキットは一つまたはそれ以上の次の成
分：ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール；対照試料
：緩衝液；および品質保持剤を含んでいてもよい。典型的な品質保持剤は公知量
のＦＢＰアーゼを含有する血清試料（または血漿試料）を含んでいてもよい。

【００１９】さらに幾つかの実施態様において、キットはＦＢＰアーゼの特異的阻害剤を、
患者からの試料中での非特異的なホスファターゼ活性量を測定することができる
程度に含有する。試料中の非特異的ホスファターゼ活性量は、その後に、特異的
ＦＢＰアーゼ活性の結果を提供する程度に全酵素活性から引くことができる。キ
ット中に包含されるのに適したこのような特異的ＦＢＰアーゼ阻害剤の一つは、
アデノシン一リン酸（AMP）である。

【００２０】二者択一的な試みは、血清アルカリホスファターゼによって、試料中で非特異
的ホスファテート活性を抑制する物質（例えば、キット中に包含されるのに適し
たブロモテラミゾール、ＢＴＯ）を使用することである。また、本発明の方法は
、ＦＢＰアーゼ阻害剤、例えばＡＭＰ、またはアルカリホスファターゼ阻害剤、
例えばＢＴＯの使用を含んでいてもよい。通常、試料は、相当する阻害剤の存在
下または不在下で、試料中のＦＢＰアーゼ特異的活性のための値が提供される程
度に同時に試験されてもよい。

【００２１】一つの実施態様において、キット中のアッセイ試薬は、通常はフルクトース１
，６−ビスリン酸を公知の濃度で含んでいてもよい。さらに、通常、キットは、
“結合（liked）”アッセイを実施するために、例えば従来技術から公知の型の
付加的な試薬を含むことができる。したがって、キットは試薬として：イソメラ
ーゼ（例えば、ホスホグルコースイソメラーゼ）；グルコース６−リン酸−
脱水素化酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）およびＮＡＤＰを含んでいてもよい。このよう
な結合型の検定において、ＦＢＰアーゼ活性は間接的に測定され、この場合、こ
れはＮＡＤＰＨ生成の速度に比例しており、有利には、３４０ｎｍでの吸光度の
測定によって吸光分光分析的に測定されてもよい。しかしながら、ＦＢＰアーゼ
活性を検定するための他の多くの方法は公知であり、かつしたがって他の相当す
る試薬を含む同等のキットは当業者には明らかであろう。例えば、二者択一的な
実施態様は、以下の結合反応式：

【００２２】

【外１】

【００２３】（ＮＡＤＨの濃度は、吸光分光分析的に３４０ｎｍで測定され、かつＦ−１，６
−ビスＰ、ＡＴＰ、ＰＦＫ、ＰＥＰ、ＰＫ、ＮＡＤＨおよびＬＤＨの濃度が最適
である場合には、これはＦＢＰアーゼ活性に直接的に比例するものである。）に
したがって、酵素ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、ピルベートキナーゼ（Ｐ
Ｋ）、ならびにラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の使用を含んでいてもよ
い。

【００２４】発明者によって行われた予備試験は、特異的または非特異的亜鉛キレート剤、
例えば１，１０−フェナントロリンまたはＥＤＴＡの使用によって血清から亜鉛
を除去し、ＦＢＰアーゼ血清活性を増加させることを示した。したがって、本発
明による診断キットは、キットのアッセイ試薬を含有する溶媒の一部分としてか
、あるいは試験試料に添加するための別個の成分として組み込まれている亜鉛キ
レート剤を含んでいてもよい。

【００２５】さらに本発明は、実施例および以下の付随する図によって説明されるであろう
。

【００２６】図１は、ＦＢＰアーゼアッセイ混合物の吸光度の速度論的変化を示すグラフ図
（時間、１秒で３４０ｎｍでの吸光度）である。吸光値はアッセイ試薬が全量１
５０μｌで、種々のＦＢＰアーゼ活性を有する４個の血清試料それぞれ２０μｌ
と混合させた後２０分間に亘って示されている。反応はＡＭＰの不含下で３７℃
で実施された。

【００２７】図２は、血清試料の４℃での保存時間の長さ（日数）に対する酵素活性（ＩＵ
／Ｌ）のグラフ図であり、新鮮なアッセイ試薬を用いて一つのアッセイ用回分中
でアッセイされた。

【００２８】図３は、時間（日数）に対するＦＢＰアーゼ活性のグラフ図であり、この場合
、これはアッセイ実施前８日間まで４℃でアッセイ試薬を保存することによって
、アッセイ結果が影響されないことを示している。

【００２９】図４は、試料溶血％（相当するヘモグロビン濃度（ｇｍｓ／Ｌ）と一緒に）に
対するＦＢＰアーゼ活性の実測値／予測値の割合（％）のグラフ図であり、溶血
の存在がＦＢＰアーゼレベルの過大評価をまねくことが明かにされた。

【００３０】図５は、異なる患者群に関する血清ＦＢＰアーゼレベル（ＩＵ／Ｌ）の散布グ
ラフ図を示し、この場合、正常ＦＢＰアーゼレベルの上限は、水平な波線によっ
て示されている。

【００３１】図６は、被肝移植者の相当する血清酵素レベルの顕著な増加が示された場合の
、急性移植拒絶反応の発作の処置日（ｄａｙ０）に対する日数を示すチャート図
である。横線は９５％の信頼レベルを示している。パネルＡ（低いパネル）に示
された結果は、ＧＳＴが測定された前記試料に関し、その一方でパネルＢの結果
は試験されたすべての患者すべてにから導かれた。

【００３２】図７は、急性同種間移植拒絶反応の発作が起こる典型的な患者中の種々な酵素
の時間（日数）に対しての血清レベル（正常範囲の上限“ＵＬＮ”の倍数（mult
iple）として表された）のグラフ図である。

【００３３】図８は、入院患者中のパラセタモール過剰投与の後に、種々の酵素の時間（日
数）に対する血清レベル（正常範囲の上限“ＵＬＮ”の倍数として表された）の
グラフ図である。

【００３４】例例１：血清ＦＢＰアーゼ活性の特徴付け１．１血清ＦＢＰアーゼの測定血清ＦＢＰアーゼ酵素アッセイおよびその評価のための化学製品および試薬の
すべてはシグマケミカルカンパニー（Sigma Chemical Company）（Poole, D
orset, England.）から購入した。血清ＦＢＰアーゼをホン・レッヘンベルグら
（von Rechenberg et al.）（1984a）の方法にしたがって酵素的に測定した。こ
れは、以下の反応による結合型速度論的酵素アッセイ技術（linked kinetic enz
yme assay technique）を使用した：

【００３５】

【外２】

【００３６】基質、イソメラーゼ、Ｇ−６−ＰＤＨおよび酵素補助因子の適正濃度の存在下
で、ＦＢＰアーゼ活性は直接的にＮＡＤＰＨ生成速度に比例し、この場合、これ
は３４０ｎｍ中での吸光度の増加によって測定された。血清酵素活性を３７℃で
、１０分間に亘って反応媒体の吸光度の変化速度を測定するためにプログラムし
た、モナーハ自動化学分析装置（Monarch autoanalyser）（Instrumentation
Laboratories）を用いて測定した。最終的な反応混合物は、トリス０．１ｍｏ
ｌ／Ｌ、ｐＨ７．５（３７℃）、フルクトース−１，６−ビスリン酸０．６２
５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ_２１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ホスホグルコースイソメラ
ーゼ５０００ＩＵ／Ｌ、ＮＡＤＰ−Ｎａ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、グルコース−
６−リン酸脱水素化酵素５００ＩＵ／Ｌ、２−メルカプトエタノール５．５
ｍｍｏｌ／Ｌおよび３０％Ｂｒｉｊ３５２００μｌ／Ｌを含んでいた。

【００３７】測定は、アデノシン−５−一リン酸（ＡＭＰ）の存在下および不在下で実施さ
れ、この場合、これは反応媒体中に最終濃度１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．５
に調整した）でのＦＢＰアーゼの特異的なアロステリック阻害剤である。ＡＭＰ
の使用は、非特異的ホスファターゼ活性の定量を可能にし、この場合、この値は
その後に全活性から引かれ、試料のＦＢＰアーゼ活性を得た。モナーハ装置は全
量１５０μＬ中で、試薬７５μＬ（基質およびＡＭＰを除く）、基質２０
μＬ（ＡＭＰを含むかまたは含まないもの）および血清２０μＬを混合させる
ことがプログラムされた。

【００３８】１．２ＦＢＰアーゼアッセイの速度論前記ＦＢＰアーゼアッセイプロトコールの使用によって、肝臓障害を有する多
くの患者からの血清試料を、それぞれの反応が開始された後に３４０ｎｍで、２
０分間に亘って６０秒間隔での吸光度の変化を評価するために使用した。ＦＢＰ
アーゼ活性による吸光度の変化を評価するために、ＡＭＰをアッセイ試薬から除
去した。

【００３９】図１は、試料およびアッセイ試薬（ＡＭＰを除く）を混合した後に、２０分間
に亘って、４個の血清試料の時間に対する吸光度の変化を示した。前記のものお
よび種々のＦＢＰアーゼ活性を有する他の幾つかの試料から得られた同様の結果
は、酵素測定速度論中の誘導期を示していた。時間に対する吸光度の変化速度は
、最初の１０分間の終わり頃に向かってより直線的になることが表された。第１
図に存在するデータの回帰分析は、最初の１０分間後の吸光度の変化速度に関す
る標準的なエラーが、高い活性を有する試料に関しては０．１５％、かつ他の３
個の試料に関してはそれぞれ０．０６％であったことを示している。

【００４０】しかしながら、さらに前記データによれば、最初の１０分の後に、時間に対す
る吸光度の変化速度の極めて少ない増加がみられた。したがって、５分間毎の吸
光度の変化速度が、血清ＦＢＰアーゼ活性を算定するために使用された場合には
、反応開始後１０分から１５分までの間（１５．４１±５．６８；平均±Ｓ．Ｅ
．Ｍ．）で測定された活性と、１５分から２０分までの間（１６．２９±５．８
４;平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）に測定された活性との間に顕著な相違が見出された（
ｎ＝１５；Ｐ＝０．００２６）。

【００４１】これは、本発明中で使用された、１０〜２０分よりも遅い時間窓（time windo
w）での吸光度の読みとりが、ＦＢＰアーゼ酵素活性をより正確に測定すること
を指摘している。しかしながら、遅い時間窓に亘って得られた測定された酵素活
性の、精度における改善は極めて少ないことが記載され、かつこのような時間窓
は、高いＦＢＰアーゼ活性を有する試料中での基質の消費によって、アッセイの
使用範囲が減少され、この場合、反応開始後１０〜２０分の吸光度の読みとりは
、試料中のＦＢＰアーゼ活性の測定のための許容可能な歩み寄りであってもよい
。使用された条件下でこの時間窓を使用することによって、吸光度変化速度の直
線化は、１００ＩＵ／Ｌまでの血清ＦＢＰアーゼ活性で保持されるが、しかしな
がら、感知しうる制限の範囲内での窓の選択は、重要ではない。

【００４２】１．３ｐＨの作用測定されたＦＢＰアーゼ活性上の水素イオン濃度の影響は、７．２〜７．８の
範囲の種々のｐＨ値に調整された試薬の使用によって試験された。４患者からの
４個の血清試料を評価のために使用した。また、同様の試験をブロモテラミゾー
ル（ＢＴＯ）の存在下で実施し、この場合、これはＡＬＰの阻害剤である。ＢＴ
Ｏをアッセイ媒体中で最終濃度１２５μｍｏｌ／Ｌで使用した。

【００４３】要するに、発明者は、ｐＨが７．２〜７．８単位の範囲ｐＨを超えて増加する
につれて、ＦＢＰアーゼアッセイの測定された活性が増加することを見出した。
ｐＨが増加するにつれて、測定された全活性および空活性（blank activity）の
双方が増加した（ＡＭＰの存在下）。

【００４４】ＦＢＰアーゼアッセイ中で最も多い非特異的ホスファターゼ活性は、血清中の
ＡＬＰによるものと考えられている（von Rechenberg et al., 1984a）。したが
って、ｐＨの増加によって見出された、測定された活性の増加の少なくとも一部
分は、ＡＬＰの影響によるものであってもよく、この場合、これは高い最適ｐＨ
を有する。この理由のために、ＡＬＰの特異的阻害剤であるブロモテラミゾール
（ＢＴＯ；オキサレート塩）は、１２５μｍｏｌ／Ｌの最終濃度で使用され、Ｆ
ＢＰアーゼ活性上のｐＨの影響を再評価する。この結果は少ないが、しかしなが
ら、ｐＨ増加を伴う測定されたＦＢＰアーゼ活性の増加上で不完全な制限作用を
有するＡＬＰ阻害を示した。

【００４５】測定された非特異的活性を制限する方法として、標準化されたｐＨ値７．５が
選択され、従来の刊行物（Jimenez-jative et al. 1992）で使用されたものと同
様に、後の試験で血清ＦＢＰアーゼ活性を測定した。しかしながら、時間窓と同
様に、使用されたｐＨ条件は、それが感知しうる制限の範囲内である限りは重要
ではない。しかしながら、当業者は、アッセイのための異なるｐＨ条件の選択が
、本発明中に詳細に記載されたＦＢＰアーゼの値とは全く異なる値を生じうるこ
とを認識するであろう。

【００４６】１．４異なる血清濃度での直線化酵素活性の再現は、１００ＩＵ／Ｌに近いＦＢＰアーゼを有する３個の血清試
料を使用し、かつ試料の種々の希釈での活性を再測定することによって測定され
た。血清試料は急性肝臓障害の患者からのものであり、かつリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中であるか、あるいは肝臓疾患の生化学的な証拠の
ない患者からの血清中で連続的に希釈された。

【００４７】ＰＢＳでの試料の希釈は、血清での希釈のものと合致する結果を生じた。一般
に、１００ＩＵ／Ｌよりも大きい活性を有する試料は、酵素活性中で、増加量を
より正確に評価するために希釈され（血清中のＦＢＰアーゼの標準範囲参照）、
かつ、後の試料中で時間に対する活性の変化を直接的に評価することが可能であ
る。結果は、血清中の試料がそれぞれ４倍、１６倍および６４倍希釈された場合
には、それぞれ予測値の平均値１１２．３、１００．６および９９．１％の回復
を示した。試料がＰＢＳ中で同様に希釈される場合には、相当する値はそれぞれ
予測値の１０２．６％、８３．７％および９７．４％である。ＰＢＳ中で試料を
希釈することで、一般に試料が血清中で希釈された場合に得られる結果よりも低
い結果が得られた。それにもかかわらず、これらの値は、アッセイが極めて高い
活性を有する試料の希釈が必要とされる場合に良好に実施されることを指摘して
いる。

【００４８】１．５生体内での血清ＦＢＰアーゼの安定性新鮮な６個の血清試料のアリコートを−２０℃で保存した。１週間に亘って、
分離された試料のアリコートを異なる日数で溶解し、かつ４℃で保存した。この
期間の終了時に、９日間までの期間に亘って４℃に保存されたすべてのアリコー
トのＦＢＰアーゼ活性を、要事調整された試薬を用いて一つの分析回分中で測定
した。

【００４９】結果は図２に示されている。保存の最初の日において、試料の酵素活性の顕著
な変化はみられなかった。しかしながら、１週間を超えると活性の減少がみられ
、この場合、これは開始時に測定された活性の平均２６％であった。ＦＢＰアー
ゼ活性（平均±S.E.M.）は６試料に関して、０日目における百分率として、第１
日目で１０２±３．６％、第５日目で８２．０±３．４％ＩＵ／Ｌであり、かつ
第９日目で６０．３±６．５％であった。前記値は、４℃での試料の保存の後に
、血清ＦＢＰアーゼの経時的な連続的低下を示した。

【００５０】血清中のＦＢＰアーゼの安定性上の温度圧力の影響は、高いＦＢＰアーゼ活性
を有する血清試料の異なるアリコートを提供し、凍結および融解サイクルの回数
を増加させ（５回まで）、かつ一つの分析回分中のアリコートの酵素活性を測定
することによって試験された。この結果は以下の第１表に示されている。表は試
料の凍結／融解の後にＦＢＰアーゼ活性の損失がないことを明らかにした。

【００５１】

【表１】

【００５２】時間に対する凍結試料の血清ＦＢＰアーゼ安定性を評価するために、種々の酵
素活性を有する４個の血清標本はアリコートされ、かつ−２０℃で保存された。
４ヶ月までの期間において、それぞれの試料のアリコートは融解され、かつ調整
以来凍結されていたアッセイ試薬の同回分を用いて、２、３日間隔でアッセイさ
れた。

【００５３】最初の２ヶ月間の保存に対して、試料の測定された活性は顕著に変化しないこ
とが見出された。しかしながら、１２０日間に亘って保存された試料の一つにお
いて、測定された活性の劇的な減少が、最初の２ヶ月間の後に示され、したがっ
て、第８２日目から第１２０日目の間に得られた値は、第１日目から第６７日目
の間に得られた値よりも顕著に低い（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．値それぞれ１．７６
±０．０４および２．２４±０．１０；Ｐ＝０．０００３）。

【００５４】１．６４℃におけるアッセイ試薬の安定性第１日目に満たない３試料のアリコートを−２０℃で保存した。分離日が１週
間を超えた時に、それぞれの血清試料のアリコートの一つを融解し、かつそのＦ
ＢＰアーゼ活性を４℃に保存されている試薬を用いて測定した。結果は図３に示
されている。要するに、アッセイ試薬を４℃で８日間まで保存した場合には、変
化が検出されなかった。

【００５５】１．７分析的干渉多くの試験は、基質による干渉の可能性に対してＦＢＰアーゼアッセイの感度
を試験し、この場合、この基質は、臨床的な血清試料において一様にかまたは時
々存在することが予測されうる。

【００５６】ビリルビン肝細胞性障害を有する患者がしばしば黄疸性の血清を有することから、血清Ｆ
ＢＰアーゼ測定上のビリルビンの効果を試験した。種々のＦＢＰアーゼ活性を有
する血清試料は、ＦＢＰアーゼ測定に取りかかる前に、８７６μｍｏｌ／Ｌまで
の濃度（かつ、０．７６ＩＵ／Ｌに満たないＦＢＰアーゼ活性）でビリルビンを
含有するＰＢＳ（コントロール群）または血清を加えた。

【００５７】要するに、高いビリルビン濃度の存在はアッセイによって測定されるＦＢＰア
ーゼレベル上で影響を及ぼさない。これは高いビリルビン含量を有する血清試料
の希釈によって確認され、この場合、この希釈系は、ＦＢＰアーゼに対して一定
の値を与えるものである。

【００５８】溶血通常使用される多くの生化学的アッセイでの溶血の干渉は公知の現象（Brady
& O′Leary 1998; Donnelly 1998）であり、したがって、ＦＢＰアーゼ上での任
意の影響が試験された。

【００５９】ＥＤＴＡ含有管中に採取された血液試料（独立した通常の研究として肝臓障害
の生化学的証拠がみられない糖尿病患者からの得たもの）を、赤血球の溶血血液
調製に使用した。血液試料を３０００ｇで１０分間に亘って遠心分離し、上清を
デカントし、かつ細胞をＰＢＳ中に懸濁した。その後に懸濁液を再度遠心分離し
、かつ洗浄工程を５回に亘って繰り返した。最終的な遠心分離の後に、細胞を蒸
留水中に溶解し、この場合、これは、元試料の２倍量に調整するために添加した
。その後に赤血球溶解物で１７，０００ｇで１０分間に亘って遠心分離し、かつ
上清を、ＦＢＰアーゼアッセイ中の溶血の干渉の評価のために使用した。

【００６０】赤血球溶解物をＰＢＳ中で希釈し、ヘモグロビン濃度２．０〜８０ｇ／Ｌの溶
液を生じた。これは、おおよそ赤血球１．０〜５０％の溶血に相当する。赤血球
溶解物の希釈物を、種々の酵素活性を有する血清試料に１：３の比で添加した。
ＦＢＰアーゼ活性をこれら標本中で測定し、かつＰＢＳを用いて同様の方法で希
釈された相当する血清試料中のものと比較した。結果は図４に示されている。

【００６１】赤血球溶解物（１ＩＵ／Ｌを下廻る活性）中での測定可能なＦＢＰアーゼの著
量がみられないにもかかわらず、溶血は、測定された血清ＦＢＰアーゼ活性を増
加させ、この場合、これは赤血球成分からの干渉を示した。図４に存在するデー
タは、試料中の赤血球１％の溶解物に相当する溶血度を明らかにし、血清ＦＢＰ
アーゼ活性の増加は約４０％であった。臨床試料における溶血量は典型的には０
．５％未満であることが強調されるべきである。

【００６２】一個または複数個の干渉物の性質を評価するために、赤血球溶解物は３回に亘
って、それぞれ４℃で４時間に亘って、１００倍量のＰＢＳに対して透析された
。酵素アッセイ上の透析された溶血血液の影響をその後に試験した。別個の試験
において、赤血球溶解物を１０分間に亘って５６℃の恒温槽中に配置し、かつ熱
処理された溶解物の血清ＦＢＰアーゼ上の影響を評価した。前記試験の結果は、
一個または複数個の干渉物が透析膜によって保持され、かつそれが熱変性可能で
あることを示した。これらは、干渉物がおそらくはタンパク質および酵素に類似
するものであることを示唆した。

【００６３】赤血球が、高い濃度のＧ６ＰＤＨおよび中程度のレベルのホスホグルコース
イソメラーゼを含有するので、双方がＦＢＰアーゼ酵素アッセイ中で使用され、
ＦＢＰアーゼ活性の測定に使用される反応割合上でのこれら２つの酵素の過剰量
の影響を評価した。しかしながら、アッセイ中で使用されたＧ６ＰＤＨまたはイ
ソメラーゼの濃度は制限されることがないことが見出され、この場合、これは前
記２個の酵素とは異なる赤血球干渉物源を示唆した。

【００６４】さらに、アデニンヌクレオチド間のリン酸部分をトランスファーさせるアデ
ニレートキナーゼ（ＡＫ；myokinase; EC 2.7.4.3）の影響を試験した。血清に
添加された外因性ＡＫは、ＦＢＰアーゼ活性の測定された速度（データーは示さ
れていない）を増加させた。しかしながら、測定速度の増加は、試験された１０
ｋＩＵ／Ｌまでの範囲のＡＫ濃度中では飽和されなかった。Ｐ^１Ｐ^５−ジ（アデ
ノシン−５’）５リン酸（Ａｐ５Ａ）、ＡＫの競合的阻害剤がアッセイ混合物中
で、１μｍｏｌ／Ｌ（ＡＫ活性９８％を抑制する報告がされた；Lienhard et al
. 1973）および１０μＭの最終濃度で使用される場合には、測定された活性上の
ＡＫ作用の大きさの減少がないことが示された。しかしながら、高い濃度でのＡ
ｐ５Ａは、測定されたＦＢＰアーゼ活性上での溶血作用を減少させたが、しかし
ながら、完全な干渉の根絶はされなかった（データは示されていない）。

【００６５】赤血球細胞がペントースリン酸経路の酵素中に富んでいることから、前記経路
の特別なＮＡＤＰＨの源として酵素の改善の可能性が試験された。これは最終濃
度０．４３ｍｍｏｌ／Ｌでピリドキサル−５−リン酸を使用することによるホス
ホグルコネートデヒドロゲナーゼの阻害によって実施された。この結果は赤血
球溶解物からの干渉が阻害剤の使用によって阻害されないことを示した。

【００６６】ＦＢＰアーゼアッセイ中で、溶血介在型干渉を防ぐのは難しいことが明らかｎ
される一方で、実施において、これは溶血された血清試料が０．５ｇｍｓ／Ｌ前
後の血清ヘモグロビン濃度（Sonntag, 1986）で容易に認識されるような深刻な
困難性が存在すべきではなく、したがって固有検定の指示および実施は、溶血に
よって引き起こされるＦＢＰアーゼ活性の過大評価に関して保護されるべきであ
る。

【００６７】例２標準範囲血清ＦＢＰアーゼの臨床的評価における使用の実施標準範囲を確立するために
、健康な被験者からの試料を試験した。

【００６８】男女を含む、１８歳から６５歳までの９４人の健康な血液提供者からの試料中
の血清ＦＢＰアーゼ活性の測定では、成人で０．０３〜０．６５ＩＵ／Ｌの範囲
が示された。値の頻繁なプロットはわずかな負のゆがみを有するデータの正規分
布を示した（正中値は０．２８ＩＵ／Ｌであった）。傾斜のない（detrended）
正規Ｐ−Ｐプロット（累積確率が観察されたものに対する通常のものからの偏差
）は、データの変換が、標準範囲を確立するためのゆがみの補正において利点を
提供しないことを示している。このデータから、標準範囲０．０３〜０．５８Ｉ
Ｕ／Ｌが導かれた。酵素活性中での増加のみが臨床的意義を有し、かつ極めて低
い酵素活性でのアッセイのかなりの不正確性を考慮にいれると、実施目的におい
て、０．５８ＩＵ／Ｌに満たない標準範囲が、後の試験での患者からの結果を評
価するために採用された。

【００６９】例３ＦＢＰアーゼアッセイの特異性血清ＦＢＰアーゼ活性上での慢性腎不全、ならびに心筋および骨格筋の損傷の
影響が試験された。さらに、血清酵素活性を、糖新生が作用する条件下で測定し
た。この条件は、管理の困難な真性糖尿病、および治療不能なアジソン病および
クッシング症候群を含んだ。

【００７０】慢性腎不全ＦＢＰアーゼ活性を、慢性腎不全を患い、８００〜１２６２μｍｏｌ／Ｌの範
囲の血清クレアチン濃度を有するが、肝臓疾患の生化学的証拠はない２２人の患
者からの血清試料中で測定した。結果は血清酵素アッセイのための標準範囲と比
較された。

【００７１】急性心筋梗塞（ＡＭＩ）ＡＭＩを患う２３人の患者からの血清試料をＦＢＰアーゼ活性の測定のために
使用した。これら患者の選択のための診断基準は、２５０ＩＵ／Ｌを上廻る全血
清ＣＫ（クレアチンキナーゼ）活性（標準範囲は、男性の場合には２４〜１９
５ＩＵ／Ｌおよび女性の場合には２４〜１７０ＩＵ／Ｌである）であり、全ＣＫ
の６％を上廻るＣＫＭＢ（ＣＫのＭＢ同位体）画分および肝臓障害の生化学的な
確証のないことである。患者から一つ以上の試料が入手可能である場合には、最
も高いＣＫ活性を有する試料を選択した。血清ＣＫレベルは正中値４４４ＩＵ／
Ｌでの２５０〜３７４４ＩＵ／Ｌの範囲である。

【００７２】筋変性血清ＦＢＰアーゼ上の急性骨格筋損傷の影響を、３５０ＩＵ／Ｌを上廻る血清
ＣＫ活性および０時間（no time）で、全ＣＫの６％を上廻るＣＫＭＢ画分を示
す２０人の患者で試験した。ＣＫ値は、正中値５６０ＩＵ／Ｌでの３５０〜３１
２，０００ＩＵ／Ｌの範囲であった。

【００７３】糖尿病血清ＦＢＰアーゼを、全ヘモグロビンＡ_１の１０％を上廻る血液ヘモグロビン
Ａ_１ｃ画分を有する２１人の糖尿病患者からの血液試料中で測定した。前記患者
の血液中の血漿グルコース濃度は、サンプリング時において１０．９〜２５．８
ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であった。前記患者は、通常の肝臓機能試験結果に基づく肝
臓疾患の生化学的確証を示さなかった。

【００７４】アジソン病治療不可能なアジソン病を患う２０人の患者からの血清試料は、ＦＢＰアーゼ
に関してアッセイされた。患者は、投与後３０〜６０分で、４５０ｎｍｏｌ／Ｌ
に満たない、共同作用（synacthen）に応答する血清コルチゾールを有し、この
場合、この値は、基線（baseline）値と比較して２００ｎｍｏｌ／Ｌに満たない
増加分を有する。基線試料をＦＢＰアーゼ測定に使用した。

【００７５】クッシング病治療不可能なクッシング病またはクッシング症候群を患う１３人の患者からの
血清試料は、ＦＢＰアーゼ活性に関してアッセイされる。すべての患者は、２４
時間に亘って排尿なしのコルチゾール排泄２７０ｎｍｏｌ以上を有し、かつ肝臓
障害の生化学的確証を示さなかった。前記試験結果は、以下の第２表に示され、
かつ図５に図示された。

【００７６】

【表２】

【００７７】略語：ｎ＝それぞれの群における患者数；ＵＬＮ＝標準の上限（０．５８ＩＵ／
Ｌ、確立された標準範囲に基づく）；ＣＲＦ＝慢性腎不全；ＡＭＩ＝急性心筋梗
塞；ＤＭ＝真性糖尿病。

【００７８】結果は、試験された１１９患者中１１２人が、標準範囲内の血清ＦＢＰアーゼ
値を有することを示した。アッセイの標準上限を上廻る血清ＦＢＰアーゼ活性を
有する７人の患者のうち、サンプリングの時点で、血清Ｃ反応性タンパク質濃度
２００ｍｇ／Ｌを有する、全身性の炎症を有する慢性腎不全の患者一人および高
められた血清ＦＢＰアーゼを有するアジソン病患者は、さらに糖尿病であること
が見出された。高められたＦＢＰアーゼ活性を有する他の患者のうち、該当する
臨床的または生化学的病歴は見出されなかった。血清ＦＢＰアーゼのための平均
値は種々の群で比較可能であった。しかしながら、慢性腎不全および糖尿病を有
する患者は、他の４群と比較して最も高い正中値を有していた（第３表）。

【００７９】例４被肝移植者における肝細胞性障害検出のための、血清ＦＢＰアーゼとＡＬＴおよ
びＧＳＴとの比較同種移植器官の拒絶反応発作が確認されている２５人の被肝移植者からの一連
の試料をＦＢＰアーゼおよび他の肝臓機能試験のために使用した。また、ＧＳＴ
測定は１３人の患者からの試料で実施された。拒絶反応発作は、生検によってか
、あるいは肝臓機能試験を劣化させることに基づく臨床的背景で、生検が禁忌で
ある場合には、増加されたプロトロンビン時間および好酸球数増加（Hughes et
al., 1998）によって診断された。

【００８０】試験された２５患者のうちの２０人は肝臓生検を受け、そのうちの１５人は急
性肝細胞性拒絶反応のための特別な処置をうけ、この場合、これは通常はメチル
プレドニゾロン（methyprednisolone）１ｇを静脈内へ３日間投与する形であっ
た。２５患者のうち５患者は、急性拒絶反応のための処置を受けたが、しかしな
がら、臨床的理由のために、治療前または治療後すぐの期間において生検はされ
なかった。処置された４患者の場合には、生検は一連の処置終了後のみに実施さ
れ、肝臓の生検が禁忌である場合、例えば血小板減少症の場合には制限された。

【００８１】拒絶反応発作に伴う血清ＦＢＰアーゼ、ＡＬＴまたはＧＳＴの顕著な増加を定
義するために、簡便な診断基準が採用された。したがって、酵素の血清活性の著
しい増加の開始は、従来の２つの値の一つに対して血清活性中で少なくとも５０
％の増加である場合に定義された。しかしながら、血清酵素レベルで従来的に連
続的な減少がみられた場合には、少なくとも２５％の増加が考えられる（少なく
とも２日間において１日当たり少なくとも１０％減少）。ピークは、著しい増加
の後に、少なくとも２日間に亘って酵素活性が後に減少した場合に、酵素の血清
活性中の最大値として記載される。

【００８２】血清ＦＢＰアーゼ、ＡＬＴおよびＧＳＴの変化は、急性肝細胞拒絶反応および
発作に対する特異的な処理の開始時間に関して比較された。関連性は、生検によ
ってもたらされた拒絶反応または特別な処置の４日前から３日後の間に、血清酵
素が増加する場合に存在するものとみなされる。また、酵素レベル増加速度、互
いに関連する試験された酵素のピーク時間、および血清中の酵素の減少速度が試
験された。

【００８３】試験された急性肝細胞性拒絶反応の２５例の発作のうち、１５例のみにおいて
、血清ＡＬＴ活性の著しい増加が示された。しかしながら、血清ＦＢＰアーゼ活
性は２４例の拒絶反応の発作に関して増加することが見出された。さらに、血清
ＦＢＰアーゼが増加しない患者は、血清ＡＬＴの増加を示さなかった。血清ＧＳ
Ｔは、測定された１３発作中の１２例で増加した。ＡＬＴではなく血清ＦＢＰア
ーゼは、血清ＧＳＴの増加のない患者中で増加した。

【００８４】前記結果にしたがって、急性肝細胞性拒絶反応の検出に関する血清ＡＬＴの感
度は６０％であった。ＦＢＰアーゼ９６％およびＧＳＴ９２％で、前記酵素に基
づく試験の感度は、血清ＡＬＴに基づくものよりも著しく良好であった。ＡＬＴ
と比較して、血清ＦＢＰアーゼは、急性拒絶反応発作に関してははやく、平均０
．８日（−１〜＋３日の範囲；９５％信頼間隔は０．４〜１．３日）で増加し始
め、かつそのピーク値はすぐに平均０．９日で達成された（−１〜＋２日の範囲
；９５％信頼間隔は０．２〜１．５日）。血清ＦＢＰアーゼとＧＳＴレベルとの
比較は、血清ＧＳＴが２人の患者において、１〜３日はやく増加し始めることが
示された。しかしながら、他の２患者の場合において、血清ＧＳＴの増加は血清
ＦＢＰアーゼの増加よりも１日遅く生じた。血清中のＧＳＴの顕著な増加を示し
た他の８患者のうち、血清ＦＢＰアーゼの増加開始は、ＧＳＴと同時に起こった
。血清ＦＢＰアーゼおよびＧＳＴのピークは、同日に一人を除いたすべての患者
で達成され、残りの一人の血清ＧＳＴは血清ＦＢＰアーゼよりも２日先立ってピ
ークをむかえた。３つの測定された酵素の血清中の最も高いピークに関して関連
性はなかった。

【００８５】急性拒絶反応の特別な処置開始に関連して、３つの酵素の血清レベル中での顕
著な増加の開始は、図６で比較されている。試料ＧＳＴを測定した患者のうち、
血清ＦＢＰアーゼおよびＧＳＴはそれぞれ血清ＡＬＴよりもはやく平均０．６お
よび０．７日で増加を開始した。この群の２患者は、拒絶反応発作に関して血清
ＡＬＴの任意の顕著な増加を示さなかった。７つの拒絶反応発作中で、血清ＡＬ
Ｔ活性中の増加はないが、しかしながらＦＢＰアーゼ活性の顕著な増加がみられ
た。残りの患者において、血清ＦＢＰアーゼは血清ＡＬＴよりもはやく平均０．
９日間で増加した（９５％Ｃ．Ｉ．＝０．２〜１．６日）。

【００８６】図７は、急性同種間拒絶反応発作の間に、一人の典型的な患者におけるＦＢＰ
アーゼ、ＧＳＴおよびＡＬＴの血清レベルにおける変化を例証している。横軸は
、強めた免疫抑制による拒絶反応処置の継続時間を示している。ＦＢＰアーゼの
レベルは○記号、ＧＳＴは◇記号およびＡＬＴは□記号によって示されている。

【００８７】３つの血清酵素に対する増加および減少の正中速度および平均速度は、第３表
に示されている。ＡＬＴと比較して、血清ＦＢＰアーゼ活性は血清中で、拒絶反
応発作に対してすばやく増加し、かつ処置開始の後に急速に減少された。しかし
ながら、ＧＳＴと比較してＦＢＰアーゼは、血清中でのより緩慢な増加平均速度
および減退正中速度を有していた。

【００８８】以下の第３表は、被肝移植患者における、急性同種間移植拒否反応の発作に対
する血清ＡＬＴ、ＦＢＰアーゼおよびＧＳＴの増加および減少速度の比較を示す
。増加および減少速度は日数に対する平均速度であり、かつ増加開始からピーク
まで、かつピークから最下点までまたはサンプリング期間の終了までものに関し
、いずれにせよ相当する血清の酵素に関してすぐに生じる。

【００８９】

【表３】

【００９０】例５パラセタモール過剰投与患者における血清ＦＢＰアーゼおよびＡＬＴの比較パラセタモールを過剰に投与された全３２患者が試験された。患者すべては、
投与後に採取された最初の血液試料中で０．１ｍｍｏｌ／Ｌを上廻る血清パラセ
タモール濃度を有した。前記患者の入院期間は１日から１３日間であった。ＦＢ
ＰアーゼおよびＡＬＴの血清活性の変化が比較され、かつデータはその存在なら
びに増加速度、血清酵素濃度、互いに関連する試験された酵素のピーク時間、お
よび血清中の酵素活性減少速度に関して分析した。血清酵素の増加開始は、前記
結果に対して５０％を上廻る活性増加時として記載された。酵素の血清活性中の
最大値として定義されたピークは、著しい増加の後に、酵素活性が低下した後に
達成された。

【００９１】血清ＦＢＰアーゼおよびＡＬＴの測定は、２つの酵素中の少なくとも一つが、
一つ以上の試料が得られた２３患者のうち１４患者からの血清中での増加してい
ることが示された。これら１４患者のうち一人で、血清ＡＬＴの増加がみられな
い５人の患者と比較して血清ＦＢＰアーゼの上昇がみられなかった。血清ＦＢＰ
アーゼの増加速度は、血清ＡＬＴに関する一日当たり平均３５１％（正中値１
８８％）の平均増加速度と比較して、一日当たり平均４６４２％であった（正中
値１１６７％）。

【００９２】一人の患者において、血清ＦＢＰアーゼのピークはＡＬＴのピークより一日は
やく達成された。もう一人の患者において、血清ＦＢＰアーゼのピークは、サン
プリング期間の終わり前２日に達成され、それにもかかわらず、試料が採取され
た期間において、血清ＡＬＴのピークのないものが観察された。血清ＦＢＰアー
ゼが減少される場合には、その平均減少速度は、血清ＡＬＴが一日当たり２７．
０％の平均減少速度（正中値２８．１％）であることに対して、一日当たり５
４．４％の平均減少速度（正中値５４．５％）であった。

【００９３】１個以上の血清試料が得られた２３人の患者において、血清ＦＢＰアーゼは、
一人の患者おいてのみ、前記標準範囲の上限を上廻って増加することはなく、こ
の場合、この患者の血清ＦＢＰアーゼおよびＡＬＴの双方は、最初の試料が採取
された場合には減少していた。しかしながら、血清ＡＬＴ活性は、一連の試料が
採取された３患者からのすべての血清試料において正常であった。

【００９４】試験された３２患者のうち９患者の場合には、一つの血清試料のみがそれぞれ
の患者から採取された。前記試料では血清ＦＢＰアーゼまたはＡＬＴの標準範囲
を上廻っての増加はみられなかった。

【００９５】一人の典型的な患者からのデータは図８に示されている。図は、入院１日目の
患者におけるパラセタモール過剰投与に付随するＦＢＰアーゼ（×記号）および
ＡＬＴ（○記号）の血清レベルの変化を示している。

【００９６】考察本明細書中に記載されたデータは、血清ＦＢＰアーゼが肝細胞性障害のマーカ
ーとして有用であってもよく、かつ、肝細胞性障害の検出のためのＧＳＴに近く
、かつＡＬＴまたはＡＳＴに関する通常のアッセイの感度を上廻る感度が提供さ
れていてもよい。酵素アッセイは容易にオートメーション化することが可能であ
り、この場合、これは通常および緊急の臨床的な生化学の現代的方法が要求され
る。血清ＦＢＰアーゼは４℃で、一日以下の試料で実施すべき既往分析に対して
十分に安定である。この時間の後に、血清中の酵素活性は著しく減少する。

【００９７】この研究から、また血清ＦＢＰアーゼは肝臓障害に対して高い特異性を有する
ことが明らかにされる。

【００９８】ＡＬＴと比較して、ＦＢＰアーゼの血清活性は、同種間移植された肝臓の拒絶反
応発作に関して平均約１日間速く増加することが見出された。すべてのしかしな
がら２患者において、血清ＦＢＰアーゼレベルの増加は、血清ＧＳＴの増加と同
時期に生じた（および２つの場合においてはよりはやく）。相違点は、血清条件
中の増加パターン中で観察され、ならびに３つの酵素の最も高いピークはこれら
の正常化された標準範囲に対して関係がないという事実は、肝臓中のこれらの酵
素の分散パターン、肝細胞性障害の部位および３つの酵素の放出速度の相違によ
るものであってよい。

【００９９】ＡＬＴと比較して血清ＦＢＰアーゼ中の減退は極めて急速である。血清中のＦ
ＢＰアーゼの減少はＧＳＴの減少と同時に生じ、この場合、双方の酵素の減少速
度は類似する。これらは、生体内における血清ＦＢＰアーゼの半減期が、ＡＬＴ
の半減期よりも長いＧＳＴ（Trull et al. 1994）のものにより近いことを示唆
する。肝臓障害の検出のために短い半減期を有する酵素の使用は、多くの潜在的
な利点を有する。血清酵素レベルの新たな安定状態はより速く達成される事実に
よって、血清酵素活性は、任意の場合においてより正確に肝臓障害の最近の発作
の有無を表す（Hughes et al. 1997）。重要なことは、このような発作後に血清
レベルがよりはやく正常化するので、任意の後の肝臓障害および特には小さい障
害を、短い半減期を有する酵素の測定が使用される場合により容易に検出するこ
とができる。

【０１００】パラセタモール過剰投与の患者の研究において、ＦＢＰアーゼは患者の多くにお
いて血清ＡＬＴアーゼと比較して増加がみられた。この増加された感度は、部分
的に血清ＦＢＰアーゼの増加速度がＡＬＴよりも早いことによってであってもよ
い。

【０１０１】

【外３】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＢＰアーゼアッセイ混合物の吸光度の速度論的変化を示すグラフ図（１秒に
対して３４０ｎｍでの吸光度）。

【図２】血清試料の４℃での保存時間の長さ（日数）に対する酵素活性（ＩＵ／Ｌ）を
示すグラフ図。

【図３】時間（日数）に対するＦＢＰアーゼ活性のグラフ図。

【図４】試料溶血％（ならびに相当するヘモグロビン濃度（ｇｍｓ／Ｌ））に対するＦ
ＢＰアーゼ活性の実測値／予測値の割合（％）を示すグラフ図。

【図５】異なる患者群に関する血清ＦＢＰアーゼレベル（ＩＵ／Ｌ）の分散グラフ図。

【図６】急性移植拒絶反応の発作の処置日（ｄａｙ０）に対する、被肝移植者に相当す
る血清酵素レベルの顕著な増加が示された場合の日数を示すチャート図。

【図７】急性同種間移植拒絶反応の発作が生じる典型的な患者中の種々な酵素の時間（
日数）に対しての血清レベル（正常範囲の上限“ＵＬＮ”の倍数として表された
）のグラフ図。

【図８】入院患者へのパラセタモール過剰投与後に、種々の酵素の時間（日数）に対す
る血清レベル（正常範囲の上限“ＵＬＮ”の倍数として表された）のグラフ図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジェラルドエーマグワイアーイギリス国ケンブリッジグレイトシェルフォードヒントンウェイ 231 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ33 QR54 QR58 QS26 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト患者における肝細胞性障害の診断方法において、患者か
ら血清試料得て、試料をアッセイして試料中のＦＢＰアーゼ量を測定し、試料中
のＦＢＰアーゼの量と、同患者からの既試料中のＦＢＰアーゼ量および／または
健康体に求められるＦＢＰアーゼ量とを比較し、かつこの比較に基づいて診断を
行うことを特徴とする、肝細胞性障害の診断方法。
【請求項２】試料中のＦＢＰアーゼ量が、ＦＢＰアーゼ活性の生化学的測
定によってアッセイされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】ＦＢＰアーゼ活性が、酵素結合型生化学的検定によってアッ
セイされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】試料中のＦＢＰアーゼ活性が、酵素結合型生化学的検定によ
ってアッセイされ、かつ検定結果が吸光分光分析的に測定される、請求項１から
３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】試料中のＦＢＰアーゼ量が、健康な被験者に関して確立され
ている標準範囲の上限を超える場合に、肝細胞性障害の診断がなされる、請求項
１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】試料中のＦＢＰアーゼ量が、同患者からの既試料中のＦＢＰ
アーゼ量を超える場合に、肝細胞性障害の診断がなされる、請求項１から４まで
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】肝細胞性障害が急性の状況によって引き起こされる、請求項
１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】被肝移植者における同種間移植拒絶反応の発作を診断するた
めの、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】アッセイ試薬として、フルクトース−１，６−ビスリン酸、
イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素化酵素およびＮＡＤＰＨの一つま
たはそれ以上を使用する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】特異的ＦＢＰアーゼ阻害剤、および／または血清アルカリ
ホスファターゼ阻害剤を使用する、請求項１から９までのいずれか１項に記載の
方法。
【請求項１１】アデノシン一リン酸および／またはブロモテラミゾールを
使用する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】特異的または非特異的亜鉛キレート剤、例えば１，１０−
フェナントロリンまたはＥＤＴＡを使用する、請求項１から１１までのいずれか
１項に記載の方法。
【請求項１３】ヒト患者での肝細胞性障害を診断するための診断試験キッ
トにおいて、このキットが、患者からの血清試料中のＦＢＰアーゼ量を測定する
ための試薬を含み、その際、試薬は容器中に一緒に包装されている、肝細胞性障
害を診断するための診断試験キット。
【請求項１４】請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法による
使用のための説明書を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコント
ロール、対照試料、ホスファターゼ阻害剤、亜鉛キレート剤、緩衝液および品質
保持材料の一つまたはそれ以上をさらに含む、請求項１３または１４に記載のキ
ット。
【請求項１６】キットの試薬および／または他の成分が凍結乾燥固体とし
て供給されている、請求項１３、１４または１５のいずれか１項に記載のキット
。
【請求項１７】フルクトース−１，６−ビスリン酸を公知の濃度で含む、
請求項１３から１６までのいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８】イソメラーゼ；グルコース−６−リン酸脱水素化酵素およ
びＮＡＤＰＨの一つまたはそれ以上をさらに含む、請求項１３から１７までのい
ずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】特異的ＦＢＰアーゼ阻害剤を含む、請求項１３から１８ま
でのいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】アデノシン一リン酸を含む、請求項１３から１９までのい
ずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】血清アルカリホスファターゼ阻害剤を含む、請求項１３か
ら２０までのいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】ブロモテラミゾールを含む、請求項１３から２２までのい
ずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】実質的に、請求項１から１２までのいずれか１項に記載さ
れた方法。
【請求項２４】実質的に、請求項１３から２２までのいずれか１項に記載
された診断キット。